CN102243240A - 非小细胞肺癌分子标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及非小细胞肺癌分子标志物及其应用，具体涉及人富亮氨酸α2糖蛋白或其片段、人C4结合蛋白或其片段、人血清淀粉样蛋白或其片段、或其组合在制备用于检测对象是否患有非小细胞肺癌或对患有非小细胞肺癌患者进行预后的制剂中的应用。

Description

非小细胞肺癌分子标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体地说，本发明涉及人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4结合蛋白和人血清淀粉样蛋白这三种蛋白质或单独或联合用作非小细胞肺癌分子标记物以及用作非小细胞肺癌预后的指标的应用。
背景技术
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全部恶性肿瘤中占第一位。在我国，肺癌已成为恶性肿瘤死亡的首位，占全部恶性肿瘤死亡病例的22.7％，且发病率和死亡率仍在继续上升。2000-2005年间，我国肺癌患者增加了12万，如不及时采取有效的控制措施，预计到2025年，患者人数将达到100万，成为世界第一肺癌大国。
肺癌可以分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中后者占大约80％。非小细胞肺癌又可以分为三类：鳞癌、腺癌和大细胞癌。导致肺癌发生的因素有很多，吸烟、遗传因素，放射性氡气、石棉等都是风险因素。
肺癌的死亡率高，五年生存率不足15％。一个重要的原因是早期诊断率低，不足2％，80％以上患者就诊时已在晚期。目前的诊断方法有X-射线检查、CT扫描、支气管镜检、痰细胞学检查以及肺癌生物标志物检测等。这些方法都存在各自的缺陷，如影像学技术难以发现瘤体较小的肿瘤，早期普查的漏检率较高。已有的肺癌标志物是广谱的，无法确诊肺癌，因此寻找特异性的肺癌生物标志物具有重要的意义。
除了诊断方法上的不足外，肺癌的转移和复发也是一个突出的问题。肺癌的转移部位多，转移途径也很多，有淋巴转移、局部直接蔓延、血行转移和局部种植等。而复发的原因也很不明确，目前报道可能与手术效果，肺癌类型、分期以及患者的免疫力强弱等因素有关。目前尚未见有关用作肺癌预后的生物标志物的报道。如果能在手术之前预测不同病人的预后效果，将可以针对病人的情况优化治疗方法，对预后差的病人采取保守治疗，具有十分重要的临床意义和实际应用价值。
发明内容
针对上述问题，本发明找到了三个肺癌特异相关的生物标志物，分别为人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4结合蛋白和人血清淀粉样蛋白。统计结果还发现，这三种蛋白质在血液中的水平可用作非小细胞肺癌预后的指标。本发明者利用MRM技术结合绝对定量法，实现了对对象是否患有非小细胞肺癌的检测以及对患有非小细胞肺癌患者进行预后。
本发明第一方面涉及人富亮氨酸α2糖蛋白或其片段、人C4结合蛋白或其片段、人血清淀粉样蛋白或其片段、或其组合在制备用于检测对象是否患有非小细胞肺癌或对患有非小细胞肺癌患者进行预后的制剂中的应用。
本发明另一方面涉及与人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4结合蛋白或人血清淀粉样蛋白特异性结合的物质或其组合在制备用于检测对象是否患有非小细胞肺癌或对患有非小细胞肺癌患者进行预后的制剂中的应用。
本发明另一方面还提供了一种用于对患有非小细胞肺癌患者进行预后的试剂盒，所述试剂盒包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其组合。
本发明的其它方面和优点可通过参阅以下具体实施方案的描述并结合附图来知晓。
附图说明
图1为C4BP、LRG1和SAA三种蛋白质对应肽段的Transition的线性检测范围。其中图1A为C4BP蛋白对应肽段的Transition的线性检测范围；图1B为LRG1蛋白对应肽段的Transition的线性检测范围；图1C为SAA蛋白对应肽段的Transition的线性检测范围。
图2为利用多重反应监控技术检测非小细胞肺癌(NSCLC)血液样品和正常对照血液样品中C4BP、LRG1和SAA三种蛋白质的水平。图2A为非小细胞肺癌血液样品和正常对照血液样品中C4BP蛋白的水平；图2B为非小细胞肺癌血液样品和正常对照血液样品中LRG1蛋白的水平；图2C为非小细胞肺癌血液样品和正常对照血液样品中SAA蛋白的水平。
图3为根据70例肺癌样本和25例正常对照样本绘制的C4BP蛋白、LRG1蛋白和SAA蛋白单独以及联合的ROC曲线。
图4为根据20对肺鳞癌样本绘制的C4BP蛋白、LRG1蛋白和SAA蛋白单独以及联合的ROC曲线(上)与对应的KM曲线(下)。(A)C4BP蛋白；(B)LRG1蛋白；(C)SAA蛋白；(D)三种蛋白质联合。
具体实施方式
虽然之前的研究分别发现了这三种蛋白质在肺癌患者的血浆中上调，但目前还没有研究工作同时对这三种蛋白质进行分析，也没有将这三种蛋白质联合用作分子标记物，更没有一篇报道或单独或联合利用这三种蛋白质进行预后研究。另外，早前的研究，或仅利用蛋白质组学技术发现了差异表达，或仅利用免疫印迹的方法进行验证，而本发明利用最新的MRM技术结合绝对定量法准确测定了这三种蛋白质在肺癌患者血液或正常对照血清中的浓度，证明了它们之间存在显著差异(肺癌患者血清中上调)。另外，统计发现它们在血液中的水平可以用做非小细胞肺癌(尤其是肺鳞癌和肺腺癌)的预后指标。
因此，本发明第一方面涉及人富亮氨酸α2糖蛋白或其片段、人C4结合蛋白或其片段、人血清淀粉样蛋白或其片段、或其组合在制备用于检测对象是否患有非小细胞肺癌或对患有非小细胞肺癌患者进行预后的制剂中的应用。
人富亮氨酸α2糖蛋白(Leucine-rich alpha-2-glycoprotein，LRG1)的Swiss-Prot号为P02750，IPI号为IPI00022417。LRG1是一个存在于血液中的糖蛋白，人们目前对它的功能了解还不多。它在中性粒细胞的分化早期表达上调(O′Donnell，L.C.，L.J.Druhan，and B.R.Avalos，Molecular characterization and expression analysis ofleucine-rich alpha2-glycoprotein，a novel marker of granulocytic differentiation.JLeukoc Biol，2002.72(3)：p.478-85.)。研究发现它可以作为某些微生物感染和癌症的标志物。如该蛋白在胰腺癌患者的血清中呈现上调(Kakisaka，T.，et al.，Plasmaproteomics of pancreatic cancer patients by multi-dimensional liquid chromatographyand two-dimensional difference gel electrophoresis(2D-DIGE)：up-regulation ofleucine-rich alpha-2-glycoprotein in pancreatic cancer.J Chromatogr B Analyt TechnolBiomed Life Sci，2007.852(1-2)：p.257-67)。它在肺癌患者的血清中也呈现上调(Okano，T.，et al.，Plasma proteomics of lung cancer by a linkage of multi-dimensionalliquid chromatography and two-dimensional difference gel electrophoresis.Proteomics，2006.6(13)：p.3938-48)。
人C4结合蛋白(C4b-binding protein alpha chain，C4BPA)的Swiss-Prot号为P04003，IPI号为IPI00021727。C4BPA是一种糖蛋白，参与补体活化的经典途径。早前的研究发现，C4BPA蛋白在肺癌患者的血清中高表达(Ueda，K.，et al.，Comparative profiling of serum glycoproteome by sequential purification ofglycoproteins and 2-nitrobenzensulfenyl(NB S)stable isotope labeling：a new approachfor the novel biomarker discovery for cancer.J Proteome Res，2007.6(9)：p.3475-83.)。
人血清淀粉样蛋白(Serum amyloid A protein precursor，SAA)的Swiss-Prot号为P02735，IPI号为IPI00552578。利用蛋白质组学技术分析鳞癌患者的血浆和正常人血浆，发现SAA在鳞癌患者的血清中上调(Dowling，P.，et al.，2-D difference gelelectrophoresis of the lung squamous cell carcinoma versus normal sera demonstratesconsistent alterations in the levels of ten specific proteins.Electrophoresis，2007.28(23)：p.4302-10.)。
本发明所用的人富亮氨酸α2糖蛋白(也称为LRG1)、人C4结合蛋白(也称为C4BP)、人血清淀粉样蛋白(也称为SAA)的含义还包括了这些蛋白的具有相同或相似生物活性或功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：相对于所述多肽的氨基酸序列有若干个(较佳地1-10个，更佳为1-5个，最佳为1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代。另外，所述缺失或插入(增加)也可发生在C末端和/或N末端(通常有20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内的氨基酸缺失或增加)。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。上述变异形式还包括上述蛋白的类似物。这些类似物与天然蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异和/或不影响序列的修饰形式上的差异。
在一个优选的实施方案中，宜采用所述蛋白的片段。所述片段应当与样品中的蛋白或其经过酶解(如胰蛋白酶酶解)后得到的片段的序列完全一致。为方便操作，所述片段的长度宜为5-50个氨基酸，优选6-30个氨基酸，更优选为6-25个氨基酸。此外，所述片段的最佳Transition应有较好的信噪比。所述宜经过重同位素(例如13C)标记，以便将其与未经标记的样品相区分。
在一个更优选的实施方案中，所述人富亮氨酸α2糖蛋白片段为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；所述人C4结合蛋白片段为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；所述人血清淀粉样蛋白片段为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。所述片段经同位素13C标记。
本文所用的术语“人富亮氨酸α2糖蛋白或其片段、人C4结合蛋白或其片段、人血清淀粉样蛋白或其片段、或其组合”指的是人富亮氨酸α2糖蛋白或其片段、人C4结合蛋白或其片段、人血清淀粉样蛋白或其片段中两者或三者的组合。一个特别优选的实施方案是将上述三种蛋白片段联合用于检测对象是否患有非小细胞肺癌或对患有非小细胞肺癌患者进行预后。
对患有非小细胞肺癌患者进行预后的步骤包括将一定量的经过重同位素标记的片段加入经酶(如胰蛋白酶)消化的患者血清样品中，用多重反应监控技术检测患者血清中所述片段的水平，从而确定患者血清中人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4结合蛋白或人血清淀粉样蛋白的水平；将所测得的水平与根据未复发病人的水平确定的临界值比较，如果所测得的水平高于临界值，则表示该非小细胞肺癌患者的预后差。
所述临界值可以由本领域技术人员根据常规手段来确定。例如，本领域技术人员可以根据测得的未复发病人(组)的血清蛋白质含量数据来绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)，随后确定临界值(cut-off)。
多重反应监控(Multiple Reaction Monitoring，MRM)技术又称作多重SRM技术(Selected reaction monitoring)，该技术充分利用了三级四极杆型(triple quadrupole，QQQ)质谱的优势。在MRM模式中，第一个和第三个四极杆充当了指定m/z的分子的筛选工具，在一级质谱和二级质谱的层次上，分别对指定肽段和指定肽段的指定碎片离子进行两个水平的筛选；而第二个四极杆则作为碎裂池(collision cell)负责碎裂肽段母离子。在肽段和肽段碎片两个层次通过很窄的分子量窗口(一般是0.7Da)进行筛选，可以将同时间内共洗脱的背景杂质进行过滤，具有很高的选择性。MRM扫描模式不同于全扫描等其他模式，可以将传统的全扫描模式的灵敏度提高一至两个数量级。这种模式下的线性范围可以达到5个数量级。这些性质使得对高复杂度的样品中某些低丰度的蛋白质的检测成为可能。
在更优选的实施方案中，所述多重反应监控技术可以和以合成肽段为基础的绝对定量技术(absolute quantification analysis，AQUA)相结合，这样就可以直接对多个样品中的某个或某些蛋白质直接进行绝对含量的检测。
因此，本发明还提供了一种检测样品中某多肽含量的方法，该方法包括：用诸如多肽合成仪来合成所述多肽，并用重同位素(如13C)对其进行标记；然后将一定量的所述经重同位素标记的片段加入样品中，用多重反应监控技术检测样品中所述多肽(或其碎片)的强度，通过比较未标记多肽(即样品中的多肽)或其碎片的强度与经重同位素标记的多肽的强度，确定样品中所述多肽的含量。
上述MRM结合绝对定量技术也可用于检测非小细胞肺癌，其步骤包括将一定量的所述经过重同位素标记的片段加入经胰蛋白酶消化的患者血清样品中，用多重反应监控技术检测患者血清中所述片段的水平，从而确定患者血清中人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4结合蛋白或人血清淀粉样蛋白的水平；将所测得的水平与正常对照血清的水平比较，如果所测得的水平高于正常对照血清的水平，则表示该对象患有非小细胞肺癌。
本发明另一方面还涉及与人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4结合蛋白或人血清淀粉样蛋白特异性结合的物质或其组合在制备用于检测对象是否患有非小细胞肺癌或对患有非小细胞肺癌患者进行预后的制剂中的应用。
在本发明的技术方案中，所述非小细胞肺癌患者可以是肺鳞癌患者、肺腺癌患者或大细胞肺癌患者。
在一个优选的实施方案中，所述与人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4结合蛋白或人血清淀粉样蛋白特异性结合的物质是抗体。此处的术语“抗体”具有最广义地含义，其具体地包括：单克隆抗体(包括全长的单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)。术语“抗体”还包括完整分子的片段，例如能够结合响应抗原的Fab和F(ab′)2。Fab和F(ab′)2片段缺少完整抗体的Fc片段，能够更迅速地从循环系统中清除，并且与完整抗体相比具有更低的非特异性组织结合性。本发明中有用的Fab和F(ab′)2以及其他抗体片段也可用于检测和定量测定人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4结合蛋白或人血清淀粉样蛋白，只要它们表现出所需的特异性结合的活性。这些片段通常可用木瓜酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab′)2片段)通过蛋白酶水解切割产生。
用于本发明的多克隆抗体和单克隆抗体可用常规方法制得。通常，首先用蛋白来免疫合适的动物，较佳的是小鼠、大鼠、家兔或山羊。由于可获得的血清体积多，能获得标记的抗家兔和抗山羊抗体，因此对于制备多克隆抗血清来说，家兔和山羊是较佳的。免疫通常这样进行：将蛋白以盐水(较佳的以佐剂如弗氏完全佐剂)混合或乳化，然后肠胃外(通常是皮下或肌内)注射该混合物或乳剂。2-6周后用盐水(较佳的是用弗氏不完全佐剂)配的蛋白质注射一次或多次以强化免疫。将免疫后的动物血液抽取到玻璃或塑料容器中，25℃培育该血液1小时，然后4℃培育2-18小时，获得多克隆抗血清。单克隆抗体可用Kohler和Milstein的标准方法[Nature(1975)256：495-96]或其改进方法制得。通常，如上所述对小鼠或大鼠免疫。然而，并非是对动物取血然后抽提血清，而是取出脾脏(以及任选地取出几个大的淋巴结)，将其分散成单细胞。如果需要，可将细胞悬液(在除去非特异性粘附的细胞后)加入包被了蛋白质抗原的板或孔中，对脾细胞进行筛选。表达抗原特异性的膜结合免疫球蛋白的B细胞结合到板上，不象悬液其它物质那样被洗去。然后对所得B细胞或所有解离的脾细胞进行诱导，使其与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤，培养在选择性培养基(如次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷培养基，“HAT”)中。通过有限稀释接种所得杂交瘤，并测定特异性结合免疫抗原(且不结合无关抗原)的抗体的产生。然后，体外(例如在组织培养瓶或中空纤维反应器中)或体内(如小鼠腹水中)培养所选的分泌单克隆抗体的杂交瘤。
本发明所述的与人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4结合蛋白或人血清淀粉样蛋白特异性结合的物质(如其抗体)中任一种均能用于本发明，然而优选的是所述物质中的两者或更多者的组合。一个具体的优选实施方案是将与人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4结合蛋白或人血清淀粉样蛋白特异性结合的物质(例如它们的单克隆抗体)同时用于检测对象是否患有非小细胞肺癌或对患有非小细胞肺癌患者进行预后的制剂中的应用。
和前文描述相类似的，在本发明一个优选的实施方案中，对患有非小细胞肺癌患者进行预后的步骤包括利用所述抗体来测定患者血清中人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4结合蛋白或人血清淀粉样蛋白的水平；将所测得的水平与根据未复发病人的水平确定的临界值比较，如果所测得的水平高于临界值，则表示该非小细胞肺癌患者的预后差。
所述临界值可以由本领域技术人员根据常规手段来确定。例如，本领域技术人员可以根据测得的未复发病人(组)的血清蛋白质含量数据来绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)，随后确定临界值(cut-off)。
用抗体测定血清中抗原可用免疫荧光技术，利用荧光标记的抗体并结合光学显微术、流式细胞计量术或荧光计量术检测而实现。试验方法例如包括使生物样品(如生物液体如血清)在能够鉴别可检测标记抗体存在下进行培育，然后用本领域熟知的众多方法中的任一种方法检测抗体。
生物样品可以用固相支持物或载体(如硝酸纤维素)、或能固定细胞、细胞颗粒或可溶蛋白的其他固相支持物或载体来处理。然后用合适的缓冲液洗涤支持物或载体，再根据本发明上述那样用可检测的标记的抗体处理。再用缓冲液第二次洗涤固相支持物或载体，除去未结合的抗体。然后可用常规方法检测所述固相支持物或载体上所结合的标记的量。熟知的支持物或载体包括：玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙淀粉酶、天然的和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁石。支持物或载体的结构可以是球形(如在玻珠内)、圆柱形(如试管的内表面或棒的外表面)。另外，表面可以是平坦的，例如板、测试条带等。较佳的支持物或载体包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员可知道用于结合抗体或抗原的其他许多合适的载体，或者能够通过常规实验来确定这些载体。
在本发明中，可将抗体与酶相连，然后用于酶免疫分析(EIA)。然后，当该酶与合适的底物接触时，酶会与底物反应，从而产生可被检测(例如通过分光光度分析、荧光分析、或肉眼观察)的化学物。可用于可检测地标记抗体的酶包括(但不局限于)：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。采用酶的生色团底物，利用比色方法就可以完成检测。检测还可以通过将酶与底物反应的程度与类似制备的标准物进行肉眼比较来实现。
检测可用其他各种免疫试验实现。例如，通过放射性标记抗体，就可以通过采用放射免疫分析(RIA)来检测。放射性同位素可用闪烁计数器等设备或通过放射性自显影来进行检测。
还可以用荧光化合物来标记本发明的抗体。当荧光标记的抗体被暴露于适当波长的光时，就能因荧光而检测出它的存在。最常用的荧光标记化合物有异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。抗体还可用发出荧光的金属(如152E或其他镧系金属)进行可检测地标记。这些金属可通过这些金属的螯合基团(如二乙三胺五乙酸(ETPA))与抗体连接。还可以将抗体偶联化学发光化合物，对抗体进行可检测标记。然后，检测在化学反应过程中发光的存在来检测带有化学发光标记的抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子是鲁米诺、异鲁米诺、热吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。同样，还可以用生物发光化合物来标记本发明抗体。生物发光是在生物系统中发现的一种化学发光，其中催化性蛋白提高了化学发光反应的效率。生物发光蛋白的存在可通过检测发光来确定。用于标记目的的重要的生物发光化合物是萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。
本发明的抗体也可用于免疫测定试验，如夹心试验。在典型的免疫测定试验中，将一定量的未标记抗体(或抗体片段)结合于固相支持物或载体上，加入一定量的带可检测标记的可溶抗体，从而可以检测和/或定量分析在固相抗体、抗原和标记抗体之间形成的三元复合物。典型的且较佳的免疫测量试验包括“正向”试验，在该试验中与固相结合的抗体先与待测试样品接触，通过形成二元固相抗体-抗原复合物从而将抗原从样品中抽提出。在培育合适的时间后，洗涤固相支持物或载体以去除液体样品残余物(包括未反应的抗原，如果有的话)，然后再与含有未知量的标记抗体的溶液接触。在第二次培育使标记抗体通过未标记抗体与结合于固相支持物或载体上的抗原复合之后，第二次洗涤固相支持物或载体，除去未反应的标记抗体。
本发明第三方面提供了一种用于检测对象是否患有非小细胞肺癌或对患有非小细胞肺癌患者进行预后的试剂盒，所述试剂盒包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其组合。
在一个优选的实施方案中，所述氨基酸序列还可携带标记。所述标记优选同位素标记。所述试剂盒还可包含说明书，该说明书提供了指导使用者如上所述应用上述多肽序列来检测对象是否患有非小细胞肺癌或对患有非小细胞肺癌患者进行预后的说明。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本申请的发明人采用溶液内酶解的方法制备了肺癌患者(包括鳞癌和腺癌)的血液样品和正常对照的血液样品，接着采用在线一体柱色谱分离技术和液相色谱串联质谱对肽段样品进行分析，质谱数据用SEQUEST软件搜索人International ProteinIndex(IPI)数据库(版本号3.22)，然后用本实验室的Buildsummary软件搜索正反库评估和控制数据质量。利用基于肽段Hits数的半定量方法，找到了三个在肺癌患者血液和正常对照血液间差异表达的蛋白质——人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4结合蛋白和人血清淀粉样蛋白。MRM技术结合绝对定量法检测肺癌患者血液和正常对照血液中这三种蛋白质的浓度，结果表明这三种蛋白质的浓度在肺癌患者血液与正常对照血液间存在显著差异(在肺癌患者的血液中上调)。数据统计发现，这三种蛋白质的水平可以用作非小细胞肺癌患者的预后指标。
实施例1、非小细胞肺癌患者血液样品和正常对照血液样品的处理以及肽段制备
本实施例中所使用的尿素、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-1-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)均购自Bio-Rad公司。
收集新近诊断为腺癌(lung adenocarcinoma，AD)或鳞癌(squamous cellcarcinoma，SCC)的患者的血液(未接受治疗前收集)，以及正常对照的血液。样本具体信息分别见表1、表2和表3。其中表1的20对样本根据性别、年龄、吸烟情况和TNM分期等因素两两配对，这些样本的MRM数据用于肺鳞癌的预后分析。表2为另外30例非小细胞肺癌样本的信息，其中包括15例腺癌和15例肺鳞癌。表3为25例正常对照样本的信息。
血液样品放置室温30分钟，4℃，3000g离心20分钟。收集上清，每管1mL分装，-80℃保存，临用前取出，避免反复冻融。
乙醇沉淀法除去脂类和白蛋白。具体如下：50μL血清，加入250μL缓冲液(10mM NaCl，100mM HEPES，pH 7.4)。0.22μm滤管(Millipore公司)，4℃，10000g离心30分钟以除去脂类物质。260μL去脂血清，加入180μL预冷的乙醇，4℃旋转混合1小时。4℃，16000g离心45分钟。收集沉淀，冻干，100μL裂解缓冲液复溶(8M尿素，4％CHAPS，40mM Tris，65mM DTT，加入1×Cocktail蛋白酶抑制剂(罗氏公司))。
溶液内酶解法制备肽段样品。具体如下：取蛋白质样品，加入10mM DTT，37℃放置2.5小时。加入50mM IAA，室温避光反应45分钟。加入5倍体积的蛋白沉淀液(丙酮∶乙醇＝1∶1，v/v，0.1％三氟乙酸)，-20℃放置12小时。蛋白沉淀用50mM碳酸氢铵溶液(pH 8.3)复溶，按25∶1加入测序级胰酶(Promega公司)，37℃酶解20小时。
表1、20对肺鳞癌样品信息
  编号   性别   年龄   吸烟史   TNM   1年随访 转移/复发时间(术后X月)  转移/复发部位   死亡时间(术后X月)   分类
  A1   女   59   无   T3N1M0   DOD 3  骨   8   快速复发
  B1   女   58   无   T3N1M0   NED 无  无   无   NED
  A2   男   60   有   T2N2M0   DOD 3  骨   6   快速复发
  B2   男   59   有   T2N2M0   NED 无  无   无   NED
  A3   男   64   有   T2N1M0   DOD 5  肺   9   快速复发
  B3   男   63   有   T2N1M0   NED 无  无   无   NED
  A4   男   65   有   T2N2M0   AWD 9  脑   无   快速复发
  B4   男   66   有   T2N2M0   NED 无  无   无   NED
  A5   男   68   无   T3N2M0   AWD 5  脑   无   快速复发
  B5   男   67   无   T3N2M0   NED 无  无   无   NED
  A6   女   55   无   T3N1M0   AWD 10  骨   无   快速复发
  B6   女   56   无   T3N1M0   NED 无  无   无   NED
  A7   男   67   有   T2N2M0   AWD 9  骨   无   快速复发
  B7   男   68   有   T2N2M0   NED 无  无   无   NED
  A8   男   66   有   T3N1M0   AWD 6  肺   无   快速复发
  B8   男   67   有   T3N1M0   NED 无  无   无   NED
  A9   男   71   有   T2N1M0   AWD 5  脑   无   快速复发
  B9   男   72   有   T2N1M0   NED 无  无   无   NED
  A10   女   72   无   T3N1M0   AWD 9  骨   无   快速复发
  B10   女   70   无   T3N1M0   NED 无  无   无   NED
  A11   女   41   无   T2N2M0   AWD 6  骨   无   快速复发
  B11   女   43   无   T2N2M0   NED 无  无   无   NED
  A12   男   49   有   T3N1M0   AWD 6  骨   无   快速复发
  B12   男   50   有   T3N1M0   NED 无  无   无   NED
  A13   男   63   有   T2N1M0   AWD 9  脑   无   快速复发
  B13   男   61   有   T2N1M0   NED 无  无   无   NED
  A14   男   50   有   T3N1M0   AWD 5  纵隔   无   快速复发
  B14   男   52   有   T3N1M0   NED 无  无   无   NED
  A15   男   64   有   T3N1M0   AWD 10  纵隔   无   快速复发
  B15   男   62   有   T3N1M0   NED 无  无   无   NED
  A16   女   71   无   T2N2M0   AWD 5  肺   无   快速复发
  B16   女   72   无   T2N2M0   NED 无  无   无   NED
  A17   男   72   有   T2N1M0   AWD 6  脑   无   快速复发
  B17   男   70   有   T2N1M0   NED 无  无   无   NED
  A18   男   55   有   T2N2M0   AWD 5  纵隔   无   快速复发
  B18   男   56   有   T2N2M0   NED 无  无   无   NED
  A19   男   67   有   T3N2M0   AWD 9  纵隔   无   快速复发
  B19   男   68   有   T3N2M0   NED 无  无   无   NED
  A20   男   66   有   T3N1M0   AWD 6  肺   无   快速复发
  B20   男   67   有   T3N1M0   NED 无  无   无   NED
注释：
DOD：dead of disease复发因病死亡
AWD：alive with disease已复发尚带病存活
NED：no evidence of disease尚无复发和转移证据
数据在一年内通过各时间点CT扫描和电话随访(仅对死亡病例)获取
表2、30例非小细胞肺癌样品信息
  编号   性别   年龄   分型   分期   吸烟史   分布
  1   女   42   腺癌   Ⅲa   否   右肺
  2   男   64   腺癌   Ⅲ   是   左肺
  3   女   50   腺癌   Ⅰ   否   右肺
  4   男   53   腺癌   Ⅲ   是   左肺
  5   男   73   腺癌   Ⅰ   是   右肺
  6   女   63   腺癌   Ⅲ   否   右肺
  7   女   69   腺癌   Ⅳ   否   右肺
  8   女   49   腺癌   Ⅲa   否   右肺
  9   女   52   腺癌   Ⅲ   否   右肺
  10   女   74   腺癌   Ⅰ   否   右肺
  11   女   70   腺癌   Ⅲ   否   右肺
  12   男   64   腺癌   Ⅰa   是   左肺
  13   男   42   腺癌   Ⅲa   是   右肺
  14   男   68   腺癌   Ⅲ   是   左肺
  15   男   51   腺癌   Ⅰ   是   右肺
  16   男   62   鳞癌   Ⅲ   是   右肺
  17   男   61   鳞癌   Ⅱa   是   左肺
  18   男   59   鳞癌   Ⅰ   是   右肺
  19   女   72   鳞癌   Ⅱ   否   右肺
  20   女   72   鳞癌   Ⅱ   否   右肺
  21   男   70   鳞癌   Ⅲb   是   右肺
  22   男   74   鳞癌   Ⅰ   否   右肺
  23   男   61   鳞癌   Ⅲ   是   右肺
  24   男   58   鳞癌   Ⅰ   是   右肺
  25   男   55   鳞癌   Ⅲ   是   左肺
  26   男   74   鳞癌   Ⅲ   是   右肺
  27   男   70   鳞癌   Ⅲa   是   右肺
  28   男   74   鳞癌   Ⅱa   是   左肺
  29   男   70   鳞癌   Ⅰa   是   右肺
  30   男   71   鳞癌   Ⅲa   是   右肺
表3、25例正常对照样品信息
  编号   性别   年龄
  1   女   26
  2   男   48
  3   女   26
  4   女   22
  5   男   28
  6   女   52
  7   女   23
  8   女   25
  9   女   25
  10   女   31
  11   女   26
  12   女   21
  13   女   23
  14   女   24
  15   女   27
  16   男   33
  17   男   37
  18   男   22
  19   男   25
  20   男   26
  21   男   26
  22   男   25
  23   男   27
  24   男   28
  25   男   29
实施例2、在线一体柱色谱分级、液相色谱串联质谱分析、蛋白质鉴定和数据分析
在线一体柱色谱分级和液相色谱串联质谱分析的方法如下：利用11个pH梯度在强阳离子交换柱(Column Technology公司)上进行分级。接着在反相柱(ColumnTechnology公司)上进一步分级，流动相为0.1％甲酸(v/v)溶液(溶液A)和0.1％甲酸/乙腈(v/v)溶液(溶液B)，115分钟内溶液B从2％增加到40％，检测在LTQ质谱(Thermo Finnigan)上进行。
质谱数据用SEQUEST软件搜索人International Protein Index(IPI)数据库(版本号3.22)，然后用本实验室的Buildsummary软件搜索正反库评估和控制质量数据。
利用肽段数进行蛋白质的定量。人富亮氨酸α2糖蛋白(LRG1)在非小细胞肺癌血清样品(8例腺癌、5例鳞癌)中的平均数为63.2，而在正常对照血清样品(5例)中的平均数为24，p值为0.001488，两者间存在显著差异。人C4结合蛋白(C4BP)的α链在非小细胞肺癌血清样品(8例腺癌、5例鳞癌)中的平均数为274.2，而在正常对照血清样品(5例)中的平均数为136.4，p值为0.002718，两者间存在显著差异。人C4结合蛋白(C4BP)的β链在非小细胞肺癌血清样品(8例腺癌、5例鳞癌)中的平均数为11.1，而在正常对照血清样品(5例)中的平均数为6.2，p值为0.039054，两者间存在显著差异。人血清淀粉样蛋白(SAA)在非小细胞肺癌血清样品(8例腺癌、5例鳞癌)中的平均数为68.9，而在正常对照血清样品(5例)中的平均数目为2.4，p值为0.00312，两者间存在显著差异。具体资料见表3。由此找到了人富亮氨酸α2糖蛋白(LRG1)、人C4结合蛋白(C4BP)和人血清淀粉样蛋白(SAA)这三个在非小细胞肺癌患者血液和正常对照血液间存在显著水平差异的蛋白质。
表4、LRG1、C4BP和SAA肽段Hits数定量结果
 蛋白质   非小细胞肺癌样品   Hits数   正常对照样品   Hits数   p值
 LRG1   AD1   115   N1   22
  AD2   86   N2   28
  AD3   67   N3   25
  AD4   42   N4   25
  AD5   21   N5   20
  AD6   125
  AD7   49
  AD8   88
  SCC1   15
  SCC2   34
  SCC3   66
  SCC4   35
  SCC5   78
  平均值   63.2   平均值   24   0.001488
 C4BP_α   AD1   356   N1   62
  AD2   254   N2   117
  AD3   307   N3   184
  AD4   228   N4   168
  AD5   142   N5   151
  AD6   537
  AD7   376
  AD8   263
  SCC1   260
  SCC2   360
  SCC3   140
  SCC4   111
  SCC5   231
 平均值   平均值   274.2   平均值   136.4   0.002718
 C4BP_β   AD1   9   N1   6
  AD2   14   N2   4
  AD3   9   N3   11
  AD4   16   N4   7
  AD5   8   N5   3
  AD6   14
  AD7   17
  AD8   25
  SCC1   8
  SCC2   4
  SCC3   7
  SCC4   5
  SCC5   8
  平均值   11.1   平均值   6.2   0.039054
 SAA   AD1   220   N1   5
  AD2   169   N2   2
  AD3   112   N3   4
  AD4   64   N4   1
  AD5   3   N5   0
  AD6   24
  AD7   48
  AD8   40
  SCC1   4
  SCC2   7
  SCC3   58
  SCC4   62
  SCC5   85
  平均值   68.9   2.4   0.00312
实施例3、肽段的筛选、合成以及母离子子离子对(Transition)检测条件的优化与定量性能分析
根据实施例2的结果，结合肽段的筛选标准，确定三种蛋白质对应的候选肽段以及Transition。接着用安捷伦公司的optimizer软件优化Transition的实验条件，同时挑选信号强度比较好的Transition用于蛋白质的定量。结果见表4。通过对混合肽段样品做5次实验重复，计算得到相应的变异系数，结果见表4。
同位素标记的重标肽段13C标记的亮氨酸([13C6]Leucine)和丙氨酸([13C3]Alanine)，购自Sigma-Aldrich公司)和未标记的轻标肽段由吉尔生化(上海)有限公司负责合成，纯度＞95％。
接着测定Transition的检测限、定量限以及变异系数。方法如下：取一样本，酶解制得肽段后掺入一定量的轻标合成肽段，以此作为起始样品，做一系列的3倍稀释，得到不同稀释的样品。这些样品掺入固定量的重标合成肽段后进行MRM分析，每个分析重复四次。根据轻比重的峰面积比值在1左右处的数值，计算内源肽段的含量。以log3(轻比重的浓度比)为横坐标，以测得的log3(轻比重峰面积比)为纵坐标，作图以确定方法的线性检测范围，结果见图1。同时，根据实验重复计算变异系数。将满足信噪比大于等于3的最低检测浓度定义为检测限。符合标准曲线的皮尔森相关系数大于0.99，变异系数小于20％的最低浓度定义为定量限。结果见表4。从表中可以看出，C4BP、LRG1和SAA这三种蛋白质对应肽段的最佳Transition都有很好的信噪比和定量能力，保证后续绝对定量实验的准确性和可靠性。
表5、肽段、Transition、检测限、定量限和变异系数
Figure GSA00000119671000171
1黑体下划线L或A用13C标记的亮氨酸或丙氨酸即得重同位素标记的肽段
实施例4、MRM技术结合绝对定量法测定样品中LRG1、C4BP和SAA这三种蛋白质的浓度以及后续的数据分析
将血清肽段样品复溶于0.1％甲酸溶液中，掺入一定量的重标肽段，进行在线的反相色谱(安捷伦1200HPLC系统)分离。流动相为0.1％甲酸(溶液A)和0.1％甲酸/90％乙腈(溶液B)，根据分离情况优化流动相梯度。MRM分析在安捷伦6410QQQ质谱仪上进行。
多重反应监控实验的结果表明：C4BP蛋白在非小细胞肺癌和正常对照的血清间存在显著的差异(在非小细胞肺癌中上调)，在非小细胞肺癌的血清样本中，平均浓度为481.5μg/mL；而在正常对照的血清中，平均浓度为349.9μg/mL，p值为3.55E-6，具有极显著性，具体见图2(A)。LRG1蛋白在非小细胞肺癌和正常对照的血清间存在显著的差异(在非小细胞肺癌中上调)。在非小细胞肺癌的血清样本中，平均浓度为79.0μg/mL；而在正常对照的血清中，平均浓度为41.4μg/mL，p值为1.55E-6，具有极显著性，具体见图2(B)。SAA蛋白在非小细胞肺癌和正常对照的血清间存在显著的差异(在非小细胞肺癌中上调)。在非小细胞肺癌的血清样本中，平均浓度为129.7μg/mL；而在正常对照的血清中，平均浓度为14.9μg/mL，p值为1.64E-4，具体见图2(C)。
利用MRM测定的蛋白质水平数据，绘制受试者工作特征曲线(receive operatingcharacteristic curve，ROC曲线，结果见图3。ROC曲线下面积(AUC)反映诊断指标的准确性。其中LRG1蛋白的AUC值为0.785；C4BP蛋白的AUC值为0.782；SAA的AUC值为0.787。如果将这三种蛋白质指标联合用作分子标记物，可以提高诊断的准确度，其AUC值达到0.830。
20对肺鳞癌样本根据术后信息分成两组，一组是术后死亡或复发的，另一组是未复发的。为排除其他因素的干扰，我们采用的未复发病人组的各种临床指标均与术后死亡或复发组的个体相匹配，包括完全一致的肺癌亚型，TNM分期，性别，吸烟状况以及相近的年龄(差距不超过2岁)。然后用MRM测定蛋白质水平绘制ROC曲线，结果见图4。
C4BP蛋白的ROC图见图4A(上)，其AUC值为0.753。根据ROC曲线，得到一个合理的cut-off值为397.33μg/mL。接着以这个cut-off值，将40例肺鳞癌样本分成两组(低于C4BP蛋白阈值的13例，高于C4BP蛋白阈值的27例)。根据治疗后3月、5月、6月、9月、12月CT扫描和追踪访问得到的信息，绘制KM曲线图4A(下)。由图可见，根据C4BP蛋白的cut-off值划分的两组病例，他们的术后表现具有显著的差异，p值为0.0004。因此，C4BP蛋白可以用于预测肺鳞癌患者的术后表现。如果患者的术前血液中C4BP蛋白水平高于cut-off值，则病人术后的情况较差，复发或死亡的概率较高。而C4BP蛋白水平低于cut-off值，则病人术后的情况较好，复发或死亡的概率较低。
LRG1蛋白的ROC图见图4B(上)，其AUC值为0.965。根据ROC曲线，得到一个合理的cut-off值为47.82μg/mL。接着以这个cut-off值，将20对肺鳞癌样本(40例)分成两组(低于LRG1蛋白阈值的20例，高于LRG1蛋白阈值的20例)。根据治疗后3月、5月、6月、9月、12月CT扫描和追踪访问得到的信息，绘制KM曲线图4B(下)。由图可见，根据LRG1蛋白的cut-off值划分的两组病例，他们的术后表现具有显著的差异，p值为8.08E-7。因此，LRG1蛋白可以用于预测肺鳞癌患者的术后表现。如果患者的术前血液中LRG1蛋白水平高于cut-off值，则病人术后的情况较差，复发或死亡的概率较高。而LRG1蛋白水平低于cut-off值，则病人术后的情况较好，复发或死亡的概率较低。
SAA蛋白的ROC图见图4C(上)，其AUC值为0.893。根据ROC曲线，得到一个合理的cut-off值为18.42μg/mL。接着以这个cut-off值，将20对肺鳞癌样本(40例)分成两组(低于SAA蛋白阈值的22例，高于SAA蛋白阈值的18例)。根据治疗后3月、5月、6月、9月、12月CT扫描和追踪访问得到的信息，绘制KM曲线图4C(下)。由图可见，根据SAA蛋白的cut-off值划分的两组病例，他们的术后表现具有显著的差异，p值为0.0002。因此，SAA蛋白水平可以用于预测肺鳞癌患者的术后表现。如果患者的术前血液中SAA蛋白水平高于cut-off值，则病人术后的情况较差，复发或死亡的概率较高。而SAA蛋白水平低于cut-off值，则病人术后的情况较好，复发或死亡的概率较低。
综合考虑这三种蛋白质得到一个联合指标，绘制得到的ROC曲线见图4D(上)，其AUC值为0.975。根据ROC曲线，得到一个合理的cut-off值，接着以这个cut-off值，将20对肺鳞癌样本(40例)分成两组(低于该阈值21例，高于该阈值19例)。根据治疗后3月、5月、6月、9月、12月CT扫描和追踪访问得到的信息，绘制KM曲线图4D(下)。由图可见，根据这个cut-off值划分的两组病例，他们的术后表现具有显著的差异，p值为1.50E-7，比单独使用LRG1蛋白的结果还要好。因此，综合考虑这三种蛋白质的水平可以用于预测肺鳞癌患者的术后表现。如果患者的术前血液中这三种蛋白质的水平高于cut-off值，则病人术后的情况较差，复发或死亡的概率较高。而水平低于cut-off值，则病人术后的情况较好，复发或死亡的概率较低。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作参考。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>非小细胞肺癌分子标志物及其应用
<130>101698
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>LRG1片段
<400>1
Asp Leu Leu Leu Pro Gln Pro Asp Leu Arg
1               5                   10
<210>2
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>C4BP片段
<400>2
Glu Asp Val Tyr Val Val Gly Thr Val Leu Arg
1               5                   10
<210>3
<211>20
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>SAA片段
<400>3
Phe Phe Gly His Gly Ala Glu Asp Ser Leu Ala Asp Gln Ala Ala Asn
1               5                   10                  15
Glu Trp Gly Arg
            20

Claims (10)

1.人富亮氨酸α2糖蛋白或其片段、人C4结合蛋白或其片段、人血清淀粉样蛋白或其片段、或其组合在制备用于检测对象是否患有非小细胞肺癌或对患有非小细胞肺癌患者进行预后的制剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人富亮氨酸α2糖蛋白片段为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；所述人C4结合蛋白片段为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；所述人血清淀粉样蛋白片段为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列联合用于制备用于对患有非小细胞肺癌患者进行预后的制剂。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述片段经过重同位素标记。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，对患有非小细胞肺癌患者进行预后的步骤包括将一定量的所述经过重同位素标记的片段加入经胰蛋白酶消化的患者血清样品中，用多重反应监控技术检测患者血清中所述片段的水平，从而确定患者血清中人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4结合蛋白或人血清淀粉样蛋白的水平；将所测得的水平与根据未复发病人的水平确定的临界值比较，如果所测得的水平高于临界值，则表示该非小细胞肺癌患者的预后差。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，检测非小细胞肺癌的步骤包括将一定量的所述经过重同位素标记的片段加入经胰蛋白酶消化的患者血清样品中，用多重反应监控技术检测患者血清中所述片段的水平，从而确定患者血清中人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4结合蛋白或人血清淀粉样蛋白的水平；将所测得的水平与正常对照血清的水平比较，如果所测得的水平高于正常对照血清的水平，则表示该对象患有非小细胞肺癌。
7.与人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4结合蛋白或人血清淀粉样蛋白特异性结合的物质或其组合在制备用于检测对象是否患有非小细胞肺癌或对患有非小细胞肺癌患者进行预后的制剂中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述与人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4结合蛋白或人血清淀粉样蛋白特异性结合的物质是抗体。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，对患有非小细胞肺癌患者进行预后的步骤包括利用所述抗体来测定患者血清中人富亮氨酸α2糖蛋白、人C4结合蛋白或人血清淀粉样蛋白的水平；将所测得的水平与根据未复发病人的水平确定的临界值比较，如果所测得的水平高于临界值，则表示该非小细胞肺癌患者的预后差。
10.一种用于检测对象是否患有非小细胞肺癌或对患有非小细胞肺癌患者进行预后的试剂盒，所述试剂盒包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其组合。
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