CN1906211A

CN1906211A - 新的肌肉生长调节物

Info

Publication number: CN1906211A
Application number: CNA2004800410301A
Authority: CN
Inventors: 姆里杜拉·沙马; 卡罗尔·贝里; 马克·托马斯; 拉维·坎巴德; 罗伯特·S·鲍尔
Original assignee: Ovita Ltd
Current assignee: Ovita Ltd
Priority date: 2003-11-28
Filing date: 2004-11-26
Publication date: 2007-01-31
Also published as: NZ529860A; EP1692166A4; EP1692166A1; AU2004293358A1; US20080051328A1; JP2008507251A; CA2547326A1; WO2005051993A1

Abstract

本发明涉及一种新的肌肉生长调节因子，包括多核苷酸和多肽序列，启动子序列，含有序列的构建体，以及调节肌肉生长和治疗与肌肉生长相关的疾病的组合物。本发明还涉及本发明所述序列在识别具有改变的肌肉重量的动物，以及用于选择性育种程序以获得具有改变的肌肉重量的动物中的应用。

Description

新的肌肉生长调节物

技术领域

本发明涉及一种与调节肌肉生长有关的新的蛋白以及该新蛋白在调节或促进肌肉生长和治疗与肌肉生长或肌肉萎缩(muscle wasting)相关的疾病中的用途。

发明背景

肌肉组织包括大的、多核细胞。这些细胞中的大部分，大约三分之二，是肌原纤维(myofiril)或可收缩性单元(contractile unit)。肌原纤维由肌球蛋白粗肌丝(myosin th)和肌动蛋白细肌丝(actin thin filament)组成。

肌细胞的发育开始于成肌细胞或前体细胞。成肌细胞经过分化和融合过程形成肌管，其随后进一步分化成为肌纤维。

蛋白肌肉抑制素(myostatin)(或生长分化因子8)被认为是一种调节肌肉生长和发育的主要因子。肌肉抑制素表现出对肌肉生长的负调节(Kambadur等1997)。已显示肌肉抑制素中11bp的缺失在牛中导致Belgian Blue(比利时蓝)(或双肌(double-muscled))表型。Belgian Blue牛在肌肉重量上增加了20％到30％。

肌肉抑制素延缓肌肉生长的准确机理仍然有待阐明。

在长时间的停止使用(如卧床休息、太空飞行)的过程中，或者在肌肉萎缩疾病(如肌肉营养不良)的情况下，骨骼肌发生萎缩，其主要是由于肌蛋白的降解增强以及蛋白合成的减少。杜兴肌营养不良(Duchenne musculardystrophy)是肌肉营养不良的最常见的形式之一。肌纤维发生坏死(necrosis)并且丧失了再生的能力。最近在mdx小鼠中显示，一种杜兴肌营养不良模型，肌肉无法再生是由于卫星细胞的衰竭，更确切的说是纤维化所导致的。肌肉减少症(sarcopenia)是与正常的年龄增长相关的肌肉重量和性能的降低。骨骼肌仍然能够自我再生但是显示老年肌肉中的环境对肌肉卫星细胞的活化、增殖和分化的支持较差。

许多生长因子涉及调节新生儿的骨骼肌生长和发育，例如IGF、HGF和FGF。没有已知的生长因子对骨骼肌的发育具有比肌肉抑制素(GDF-8)更强的负效果。肌肉抑制素或生长和分化因子8(GDF-8)首先在小鼠中被表征。无肌肉抑制素小鼠显示显著增加的肌肉发育，比野生型小鼠重2到3倍。显示肌肉重量的增加是由于肌肉增生(hyperplasia)和肥大(hypertrophy)。这些数据表明肌肉抑制素在控制肌肉重量中具有重要的作用以及肌肉抑制素是肌肉生长的强的负调节剂。

因此，识别其它涉及调节肌肉生长的因子，包括能够促进肌肉生长的因子是有益的。至今，没有鉴定出更多的能够调节肌肉生长的因子。

发明概述

本发明是基于与促进肌肉生长有关的多肽的识别。该肌肉生长促进物被称为“mighty”。术语mighty在整个说明书中使用以表示本发明所述的新的肌肉生长促进物。

本发明还基于编码mighty蛋白的DNA和相应的mighty基因启动子的鉴定。

本发明提供含有选自SeQ ID No：2或SEQ ID No：4的序列的多肽。

本发明还提供多核苷酸序列，其编码含有选自SeQ ID No：2或SEQ ID No：4的序列的多肽。该多核苷酸序列包括选自SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的序列。

本发明还提供多核苷酸，其含有选自下列的核苷酸序列：

a)SEQ ID No：1或SEQ ID No：3的互补序列，

b)SEQ ID No：1或SEQ ID No：3的反向互补序列，和

c)SEQ ID No：1或SEQ ID No：3的反向序列。

本发明的多核苷酸包含由于沉默取代或导致所产生氨基酸中保守取代的取代，而与SEQ ID No：1或3不同的核苷酸序列。

本发明的多肽包括由本发明所述多核苷酸编码的多肽。还提供含有至少一个多肽或其片段的融合蛋白。

本发明还提供一种或多种含有本发明序列的载体，以及一种或多种含有该载体的宿主细胞。该载体沿5’-3’方向含有：a)基因启动子序列；b)本发明所述的多核苷酸序列；和c)基因终止序列。该多核苷酸可以处于有义或反义方向。

本发明还提供调节肌肉生长的组合物。

一方面，该组合物包含下述任意一个：

a)包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的多核苷酸，

b)(a)的片段或变体，

c)与(a)有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸，

d)(a)到(c)中任意一个的互补序列，

e)(a)到(c)中任意一个的反向互补序列，

f)(a)到(c)中任意一个的反义多核苷酸，

g)由(a)到(c)中任意一个编码的多肽，

h)包含SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽，

i)(g)或(h)的片段或变体，和

j)相对(g)或(h)有至少95％，90％或70％序列同一性的多肽。

在另一方面，组合物可以包含mighty基因启动子，其包括SEQ ID No.5的序列、与SEQ ID No.5有至少95％、90％或70％同一性的多核苷酸、或其片段或变体。

在又一方面，组合物可以包含mighty基因表达或mighty蛋白活性的调节物。

mighty基因表达或mighty蛋白活性的调节物可以特异地结合于选自下列任意一个的多核苷酸：

a)SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5，

b)编码SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽的多核苷酸，

c)与(a)或(b)有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸，

d)(a)到(c)中任意一个的互补序列，

e)(a)到(c)中任意一个的反向互补序列，和

f)(a)到(e)中任意一个的片段或变体。

mighty基因表达的调节物可以是反义多核苷酸。mighty基因表达的调节物也可以是干扰RNA分子。具体地，mighty基因表达的调节物可以是RNAi或siRNA分子。

调节物也可以是肌肉抑制素或肌肉抑制素的模拟物(mimetic)。该模拟物可以是C-末端在氨基酸位置330和350或两者之间截断的肌肉抑制素肽。该截断可以在330、335或350的任意一个位置。

在另一方面，本发明的组合物可以用于治疗或预防与肌肉生长相关的疾病。该疾病可以是导致肌肉萎缩(muscle atrophy)的疾病。该疾病可以选自肌营养不良(muscular dystrophy)、肌肉恶病(muscle cachexia)、萎缩、肥大、与癌症或HIV有关的肌肉萎缩、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateralsclerosis)(ALS)或与心肌生长相关的疾病，包括梗死(infarct)。该组合物还可以用于在肌肉损伤后促进肌肉再生。

本发明还提供使用本发明所述的组合物调节或促进肌肉生长、治疗或预防与肌肉生长或损伤后肌肉再生相关的疾病的方法。该方法可用于生产具有增加的肌肉重量的动物。

本发明的组合物还可以被用于生产调节肌肉生长、治疗或预防与肌肉生长或损伤后肌肉再生相关的疾病的药物。

本发明还提供用本发明所述的组合物转染的转基因动物。该转基因动物可以导致具有增加的肌肉重量的动物。该转基因动物可以选自绵羊、母牛、公牛、鹿、家禽、火鸡、猪、马、小鼠、大鼠、鱼或人。

本发明还提供预测动物肌肉重量的方法，其包括如下步骤：

i)从动物中获得样品，

ii)测定具有序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的多核苷酸、与SEQ IDNo.1或SEQ ID No.3有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸、或其片段或变体的基因表达水平；或测定具有序列SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽、与SEQ ID No.2或SEQ ID No.4有至少95％、90％或70％序列同一性的多肽、或其片段或变体的量。

iii)将基因表达水平或多肽的量与平均值进行比较；和

iv)预测所述动物的肌肉重量。

基因表达水平可以使用RTPCR或northern分析进行测定。多肽可以使用ELISA或Western印迹分析进行测定。

在另一方面，本发明提供了检测mighty变体的方法，其包括使用选自下列的核苷酸序列：

a)SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5，

b)编码SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽的多核苷酸，

c)与(a)或(b)有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸，

d)(a)到(c)中任意一个的互补序列，

e)(a)到(c)中任意一个的反向互补序列，和

f)(a)到(e)中任意一个的片段或变体，

以从来自生物体的样品中筛选mighty的变体。

mighty的变体可以是多态性(polymorphism)的，尤其可以是单核苷酸多态性的。mighty变体也可以与改变的肌肉表型相关。

本发明还提供改善动物肌肉重量的方法，其包括如下步骤：

i)选择一个或多个根据本发明预测具有增加的肌肉重量的动物，和

ii)繁殖一个或多个预测具有增加的肌肉重量的动物以产生具有改善的肌肉重量的动物。

本发明所述的动物可以选自绵羊、母牛、公牛、鹿、家禽、火鸡、猪、马、小鼠、大鼠、鱼或人。

本发明还提供抗体，其优先结合具有序列SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4的多肽或与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4有至少95％、90％或70％序列同一性的多肽。

本发明还提供具有序列SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4的多肽的抗原性片段在生产抗体中的应用，所述抗体优先结合具有序列SEQ ID NO.2或SEQID NO.4的多肽或与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4有至少95％、90％或70％序列同一性的多肽。

本发明还提供含有序列SEQ ID No：5的分离的多核苷酸，其含有鼠类mighty基因的启动子区域，与SEQ ID No：5有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸，或其片段或变体。

片段可以包含mighty起始位点上游至少200个核苷酸，可以包含mighty起始位点上游209、287、315、400、600、1000和2100个核苷酸中任意一个。

本发明还提供一种或多种载体，其含有SEQ ID No.5的多核苷酸、与SEQID No.5有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸、或其片段或变体，以及一种或多种含有该载体的宿主细胞。

本发明还提供筛选一种或多种在抑制或促进肌肉生长中潜在有效的化合物的方法，其包括如下步骤：

i)将具有序列SEQ ID No：5的多核苷酸、与SEQ ID No.5有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸、或其片段或变体插入到连接有合适的标记基因的合适的载体中；

ii)用该载体转化合适的宿主细胞；

iii)对该宿主细胞施用感兴趣的化合物；和

iv)测定标记基因表达水平的任何差异。

载体可以包括任何合适的载体，而且可以包括原核质粒、真核质粒或病毒载体。标记基因可以包括任何合适的标记基因，而且可以包括编码绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶或β-半乳糖苷酶的多核苷酸。

本发明还提供在肌细胞中表达所需蛋白的方法，其包括如下步骤：

i)分离编码待表达的基因的多核苷酸序列；

ii)将具有序列SEQ ID No：5的多核苷酸、或与SEQ ID No.5有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸、或其片段或变体插入到载体中，其沿5’-3’的方向与待表达的蛋白的多核苷酸序列可操作地相连，和

iii)将载体导入肌肉宿主细胞。

载体可以包括真核载体、病毒载体或任何适于基因治疗的载体。

宿主细胞可以包括原代成肌细胞系、转化的成肌细胞系或mighty启动子在其中有活性的任何细胞系。宿主细胞还可以包括宿主动物的体内骨骼肌或心肌细胞。

宿主动物可以包括绵羊、母牛、鹿、公牛、家禽、火鸡、猪、马、小鼠、大鼠、鱼或人。

定义：

术语“多核苷酸”是应当理解为脱氧核糖核酸或核糖核酸的聚合物，包括单链和双链聚合物，包括DNA、RNA、cDNA、基因组DNA、重组DNA和多核苷酸的所有其它已知形式。多核苷酸可以是从天然来源中分离的、使用重组或分子生物学技术产生的、或者合成产生的。多核苷酸可以包括整个基因或其任意部分，并且不是必须具有开放读码框。

本发明的所有多核苷酸的使用都包括任意或所有的开放读码框。开放读码框可以使用本领域已知的技术构建。这些技术包括分析序列以鉴定已知的起始和终止密码子。许多能够实现该功能的计算机软件程序在本领域是公知的。

术语“多肽”应当理解为共价连接的氨基酸的聚合物。多肽包括从天然来源中分离的多肽、使用重组技术生产的多肽、或合成生产的多肽。可意识到的是含有在体外被切除的前导序列或前序列的多肽、或含有连接物或任何其它序列的多肽、或经过翻译后修饰的多肽被确定涵盖在多肽的定义中。

术语“片段或变体”应当理解为任何部分序列或通过取代、插入或缺失一个或多个核苷酸或一个或多个氨基酸残基而修饰的序列，但是其具有基本相同的活性。

多核苷酸片段还包括足够长并且其在严格条件下特异性地与SEQ ID No：1或SEQ ID No：3的序列杂交的多核苷酸片段。“严格条件”的例子包括用5XSSC，0.2％SDS在65℃预杂交；在65℃于5X SSC，0.2％SDS中杂交过夜；用1X SSC，0.1％SDS在65℃洗涤两次，每次30分钟；而后进一步用0.2X SSC，0.1％SDS在65℃洗涤两次，仍然是每次30分钟。

多肽片段还包括保留有mighty蛋白活性的片段。该片段可以具有增强的活性并且因此，当导入或在细胞中表达时，导致mighty蛋白活性的增加。可选地，片段可以具有显著的负效果。

“Mighty基因”被定义为SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的多核苷酸，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.3有95％、90％或70％同一性的多核苷酸或其片段。

“基因表达”被定义为转录的起始、mighty基因转录为mRNA以及mRNA翻译为多肽。“mighty基因表达的调节物”被定义为任何能够导致mighty基因表达增加或减少的化合物。

“Mighty蛋白”被定义为具有序列SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽、与SEQ ID No.2或SEQ ID No.4有95％、90％或70％同一性的多肽、或其片段或变体。

“Mighty蛋白活性”被定义为mighty蛋白刺激肌肉生长的能力。

“肌肉生长”被定义为肌细胞的分裂和/或分化并且包括任何肌肉前体细胞的分裂和/或分化。

“mighty蛋白活性的调节物”被定义为能够增加或降低mighty蛋白活性的化合物。

“mighty基因启动子”被定义为SEQ ID No.5的多核苷酸，与SEQ ID No.5有95％、90％或70％同一性的多核苷酸、或其片段或变体。

通过如下仅作为实例给出的附图及说明，本发明的其它方面将显而易见。

附图说明

本发明现在通过例示的方式仅参考下列附图进行说明：

图1：显示来自双肌牛和正常肌肉的牛的mighty的PCR扩增结果。

图2：(A)显示来自正常肌肉的牛(wt，泳道1)和双肌表型(BB，泳道2)的心脏组织的mighty的PCR扩增结果。(B)显示来自羊骨骼肌(泳道4)的mighty的PCR扩增结果。

图3：(A)和(B)显示mighty启动子序列和鉴定的转录因子结合位点。

图4：显示成肌细胞C2C12细胞增殖中mighty的表达结果。

图5：显示以MHC抗体对对照和mighty过表达肌管的免疫染色。

图6：显示活跃生长的C2C12克隆7和11和lacZ对照的测量结果，测量是通过(A)细胞面积的定量显像分析。(B)FACScan流式细胞术测量前向角光散射(forward angle light scatter)(FALS)(在克隆7和克隆11中观察到的右移表明了细胞尺寸的增大)以及通过定量显像分析测量的含3个核的肌管的长度(C)、宽度(D)和面积(E)。

图7：显示：(A)将mighty过表达的C2C12克隆7和11、和对照的C2C12成肌细胞在分化培养基(DMEM 2％HS)中培养48、60和72小时。固定成肌细胞并用抗MHC抗体免疫染色，用Gills苏木精(Gills haematoxylin)轻微复染。(B)mighty过表达的C2C12克隆7和11、和对照C2C12的Western印迹分析。成肌细胞在分化培养基(DMEM 2％HS)中培养0、24、48和72小时。从细胞中提取的总蛋白(15μg)用4-12％的SDS-PAGE分析，转移到硝化纤维素滤膜，并用小鼠单克隆抗p21、兔多克隆抗MyoD或小鼠单克隆抗MHC抗体为探针探测。滤膜还用小鼠单克隆抗-α-微管蛋白抗体为探针探测以表明相等的加载(equal loading)。

图8：显示在静止(quiescent)和活性卫星细胞中mighty蛋白的检测。来自静止和活性卫星细胞的蛋白用SDS-PAGE分析并转移到硝化纤维素滤膜。通过兔抗mighty抗体检测mighty蛋白。在活性卫星细胞中可检测到mighty蛋白，但是在静止卫星细胞没有检测到。

图9：显示在骨骼肌再生的过程中mighty的表达。将虎蛇毒素(Notexin)注射到TA肌肉中以诱导肌肉损伤并且收集在损伤后第0、1、5、14和28天的TA肌肉以进行mighty的免疫组织化学检测。(A)在第0天的无损伤对照TA肌肉。(B)损伤后第1天。(C)损伤后第5天。(D)损伤后第7天。(G)损伤后第28天。绿色，Mighty；蓝色，DNA。

图10：显示在梗死形成后(post-infarction)的心脏组织中mighty的表达。进行在未梗死(第0天)和梗死形成后(第2天和第6天)的心脏组织中mighty的免疫组织化学检测。(A)未梗死对照心脏组织。B)梗死形成后第2天。(C)梗塞形成后第6天。

图11：显示在mighty和对照转染的人成肌细胞中MHC阳性肌管的数量。人成肌细胞用mighty-pcDNA3或仅用pcDNA3(对照)转染，在分化条件下培养12个小时。然后进行肌管中肌球蛋白重链(MHC)表达的免疫组织化学(ICC)。以穿过整孔的间隔拍摄连续无重叠的照片，并且计数MHC阳性肌管/孔的数目。

图12：显示(A)每个肌管的肌核(myonuclei)频率和(B)含有5，6，7，8和9个肌核的肌管宽度。用mighty-pcDNA3或仅用pcDNA3(对照)转染人成肌细胞，在分化条件下培养12h，并进行用于MHC表达的ICC。测量含有5，6，7，8和9个肌核(n＝53)的MHC阳性肌管的最大宽度。

图13：显示在条件培养基处理的人成肌细胞中肌核/MHC阳性肌管的数量。用来自mighty稳定转染的C2C12细胞或LacZ(对照)转染的C2C12细胞的条件培养基处理人成肌细胞。细胞用条件培养基培养48h，然后进行MHC表达的ICC。在每显微区域(n＝245个肌管)的5个肌管中计数肌核/MHC阳性肌管的数量。(A)具有1-3，4-6，和7-9个肌核的肌管的数量。(B)肌核/肌管的平均数。

图14：显示条件培养基处理的含有8个肌核的肌管的宽度。用来自mighty稳定转染的C2C12细胞或LacZ(对照)转染的C2C12细胞的条件培养基处理人成肌细胞。细胞用条件培养基培养48h，然后进行用于MHC表达的ICC。测量含有8个肌核的MHC阳性肌管的最大宽度。

图15：显示在条件培养基处理的人横纹肌肉瘤(RD)细胞中MHC阳性肌管的数量。用来自mighty稳定转染的C2C12细胞或LacZ(对照)转染的C2C12细胞的条件培养基处理人RD细胞。细胞用条件培养基培养72h，然后进行用于MHC表达的ICC。计数MHC阳性肌管/孔的数目。

图16：显示鼠类mighty启动子在各种细胞系中具有活性。将(A)C2C12成肌细胞、原代羊成肌细胞、NIH3T3成纤维细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)和(B)人RD(横纹肌肉瘤)细胞用1kb mighty启动子/报道基因构建体瞬间转染24小时。然后在生长或分化培养基中进一步培养24个小时。测定荧光素酶活性并根据来自共转染的pCH110的β-半乳糖苷酶(β-gal)活性进行标准化。

图17：显示mighty启动子被肌肉抑制素剂量依赖性地抑制。C2C12成肌细胞被用方法中所述的1kb启动子瞬间转染。转染后24小时，细胞在生长培养基中用4和8μg/ml的重组肌肉抑制素处理。处理24小时后收获细胞。根据β-半乳糖苷酶活性标准化荧光素酶活性。

图18：显示肌肉抑制素模拟物(myostatin mimetics)能回复(rescue)肌肉抑制素介导的mighty启动子抑制。X-轴是根据β-半乳糖苷酶活性标准化的mighty启动子的相对荧光素酶活性。Ctrl条表示对照羊成肌细胞；wt条表示用野生型肌肉抑制素(3μg)处理的羊成肌细胞；335条表示用15μg肌肉抑制素模拟物335处理的羊成肌细胞；335+wt表示用3μg肌肉抑制素和15μg肌肉抑制素模拟物处理的羊成肌细胞。

图19.显示mighty基因上游片段的启动子活性。C2C12成肌细胞用方法中所述的启动子片段报道基因构建体瞬间转染。然后在生长或分化培养基中进一步培养24小时。测定荧光素酶活性并根据来自共转染的pCH110的β-半乳糖苷酶(β-gal)活性进行标准化。

图20：显示抗mighty蛋白抗体的应用。泳道表示：M，标记；1，由肽特异性的mighty抗体识别的纯化的重组小鼠mighty蛋白；2，由牛蛋白抗体识别的纯化的重组牛mighty蛋白；3，从诱导mighty表达的含有mighty表达质粒的大肠杆菌细胞中提取的蛋白(使用牛蛋白抗体)；和4，从含有mighty表达质粒(未诱导)的大肠杆菌细胞中提取的蛋白(使用牛蛋白抗体)。

发明详述

本发明基于涉及肌肉发育和再生的新蛋白。该蛋白称为“mighty”。

已从羊(SEQ ID No：1)和牛(SEQ ID No：3)中鉴定并克隆了Mighty基因。在一个方面，本发明提供了从牛和绵羊中分离的mighty多核苷酸。具体地，本发明提供来自羊，SEQ ID No.1，和牛的SEQ ID No.3的多核苷酸序列，其包括反义多核苷酸和可操作的反义片段。

本发明还提供从牛和羊分离的多肽序列。具体地，本发明提供来自羊，SEQ ID No.2和牛SEQ ID No.4的多肽，以及编码SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的多肽的多核苷酸。

可以理解，多核苷酸由于遗传编码的冗余可以包含沉默取代或在所得的氨基酸中导致保守取代的取代。此外，还预期基本上没改变蛋白活性的本发明的多核苷酸和多肽的片段和变体。

本发明还提供含有本发明多核苷酸的载体。使用载体储存(store)、复制和表达多核苷酸序列是本领域公知的。一般载体包括，以5’-3’方向：基因启动子序列、本发明的多核苷酸序列、和基因终止序列。载体意指包括将本发明的序列并入质粒和/或病毒中以帮助在宿主细胞中导入和/或保持序列。宿主细胞可以包括原核或真核细胞。真核细胞可以是体内的，或可以是原代或转化的细胞系。

本发明人已显示mighty蛋白在双肌的牛中高表达(参见图1和图2)，其表明mighty在促进肌肉生长中发挥作用。还显示Mighty上调成肌细胞C2C12细胞的生长，其确定了mighty在促进肌肉生长中的作用(图4)。对过表达mighty的C2C12细胞的进一步研究显示mighty诱导肌细胞的肥大。这通过过表达mighty的细胞中核数量的增加(图5)和细胞尺寸的增大(图6)表明。此外，如图7所示，过表达mighty的C2C12细胞比对照细胞更早分化。原代成肌细胞(活性卫星细胞)也显示出比卫星细胞(静止细胞)具有更高水平的mighty。

这些结果证实了mighty在肌肉生长和发育中的作用，并且表明mighty可以用于调节或促进肌肉生长和发育。Mighty提供了用于生产具有增加的肌肉重量的动物的有用工具，其具有农业效益。另外，mighty提供了用于治疗与肌肉生长和尤其是与肌肉萎缩相关的疾病的组合物开发。所述疾病包括，但不限于：肌营养不良、肌肉恶病、萎缩、肥大、与癌症或HIV有关的肌肉萎缩、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)或与心肌生长相关的疾病，包括梗死。

因此包括用于调节肌肉生长的组合物。“调节肌肉生长”意指包括肌肉生长和/或发育速度的任何改变并且包括任何肌前体细胞的生长和/或分化。这包括前体肌细胞分裂速度的任何改变，和/或前体肌细胞分化速度的任何改变。这种改变可以是增加或者降低。

该组合物是基于mighty基因序列，其包括来自羊SEQ ID No.1或牛SEQID No.3的序列，与SEQ ID No.1或SEQ ID No.5有至少95％、90％或75％序列同一性的多肽，或其片段或变体。可以通过并入启动子，mighty启动子(SEQ ID No：5)或其它合适的启动子调控下的合适载体将序列导入细胞。启动子可用于导致mighty蛋白的表达，从而增加细胞中基因的表达和mighty蛋白的活性。

组合物还可以包含与本发明多核苷酸序列有至少95％、90％或70％序列同一性的序列。序列同一性可以通过比对序列并检测相同核苷酸的数目进行测定。已知许多计算机算法用于测定序列同一性，例如BLASTN算法。

组合物还可以包含本发明所述多核苷酸的互补、反向互补或反义多核苷酸。

组合物还可以包含本发明的mighty多肽。多肽可以来自羊SEQ ID No.2或牛SEQ ID No.4、与SEQ ID No.2或SEQ ID No.4有至少95％、90％或70％序列同一性的多肽、或其片段或变体。

组合物还可以包含与本发明多肽序列有至少95％、90％或70％序列同一性的序列。序列同一性可以通过比对序列并检测相同残基的数目进行测定。本领域已知有许多计算机算法用于测定序列同一性，例如BLASTP算法。

调节肌肉生长的组合物还可以包含mighty基因表达的调节物。

调节肌肉生长的组合物还可以包含mighty蛋白活性的调节物。

Mighty基因表达的调节物可以是能够特异性结合于本发明所述多核苷酸的化合物。具体地，所述mighty基因表达的调节物可以与mighty基因启动子结合，从而影响转录起始或维持的速度。可替换地，启动子或其片段可用于将特殊的改变引入细胞的天然启动子中以增强或者抑制野生型mighty基因的表达。改变可以包括一个或多个核苷酸的取代、插入或缺失。

Mighty基因表达的另一种调节物也可以结合mighty基因，从而直接影响基因表达的速度。

Mighty基因表达的另一种调节物也可以通过结合到mighty基因并向序列中引入改变，例如通过同源重组来起作用，其可以影响基因表达的速度或者改变mighty蛋白的活性。序列的改变包括核苷酸的改变、插入或缺失，其能够或者不能导致产生的多肽中氨基酸的改变、插入或缺失。改变的例子可以包括插入终止密码子从而产生截短的多肽，或者改变一个或多个密码子从而改变一个或多个氨基酸残基。可替换地，变异可以是删除野生型mighty基因的一部分或者是插入一部分到mighty野生型基因中。产生这些改变的技术是本领域公知的。另外，将这些改变导入mighty基因中以及随后测定mighty活性的改变都属于本领域技术人员的常规技术，例如使用实施例4中所述的成肌细胞增殖试验。

还可以通过导入干扰转录和/或翻译的多核苷酸改变mighty基因的表达。例如可以导入反义多核苷酸，其可以包括：反义表达载体、反义寡脱氧核糖核苷酸、反义硫代磷酸寡脱氧核糖核苷酸、反义寡核糖核苷酸、反义硫代磷酸寡核苷酸，或任何其它本领域已知的方法，其包括使用化学修饰以增强反义多核苷酸的效率。

可以理解，任何反义多肽不需要与所述多核苷酸100％互补，而只需要具有足够的同一性以使得反义多核苷酸与基因或mRNA结合从而干扰基因表达，并且基本不干扰其它基因的表达。还可以理解的是与基因互补的多核苷酸，包括5’非翻译区域也可以用来干扰mighty蛋白的翻译。同样的，这些互补多核苷酸不需要100％互补，而是足以结合mRNA和干扰翻译，并且基本不干扰其它基因的翻译即可。

基因表达的调节也可以包含使用本领域已知的干扰RNA分子，并包括RNA干扰(RNAi)和小分子干扰RNA(siRNA)。

基因表达的调节也可以通过使用催化性RNA分子或核酶获得。本领域已知所述核酶可以被设计用于与特异靶向的RNA分子配对。核酶结合并裂解该靶向的RNA。

任何其它本领域已知的调节基因表达的技术也可以用于调节mighty基因表达。

组合物还可以包含mighty活性的调节物。Mighty的调节物包括mighty蛋白的优势负突变体(dominant negative mutant)。当突变体产生妨碍野生型蛋白生理学活性的效果时，即表现出优势负效果。这可以通过优势负蛋白与受体结合但不激活受体，同时也阻止野生型蛋白结合而发生。可替换地，优势负效果可以通过直接结合野生型蛋白并且使其失活而发生作用。

因此本发明的多核苷酸可用于制备合适的组合物，或用于设计合适的组合物，其调节mighty基因的表达，从而调节肌肉生长。该技术可用于调节细胞内，例如原代或转化细胞系中mighty基因的表达，或者调节动物的肌肉生长。

本发明组合物的一种可能的应用是促进或抑制肌细胞的生长和/或分化。肌细胞可以是原代或转化的细胞系，或者细胞可以是宿主动物的体内细胞。合适的宿主动物可以包括羊、母牛、公牛、鹿、家禽、猪、鱼、马、小鼠、大鼠或人。

本发明的组合物也可用于治疗与肌肉组织相关的疾病。所述疾病或损伤包括肌营养不良、肌肉共济失调(muscle ataxia)或与心肌生长相关的疾病。类似的，组合物也可以用于在肌肉损伤后促进肌肉再生。

如图9所示，肌肉受损后在肌肉再生过程中细胞内的mighty表达增加。而且，显示在梗死后羊心脏组织中的mighty表达增加(图10)。这些结果表明mighty也参与肌肉再生。因此，组合物不仅可以用于治疗与肌肉生长相关的疾病，还可以用于治疗受伤后的肌肉损伤。

图11到15的结果表明本发明的组合物也可用于刺激人类肌肉的生长和分化，进一步证明了本发明在人类医药应用中的潜力。

类似地，组合物可用于产生转基因动物。组合物可用于生产肌肉重量增加的转基因动物。合适的动物可以包括羊、母牛、公牛、鹿、家禽、猪、鱼、马、小鼠、大鼠或人。可以使用本领域已知的许多用于产生转基因动物的技术，和任何合适的方法。

本发明的另一应用是预测动物的肌肉重量。为此从动物中获得样品。然后分析样品的mighty基因表达或mighty蛋白的水平。本领域已知许多用于测量基因表达或蛋白量的技术。例如，基因表达可以使用定量RTPCR或northern分析进行测定。蛋白含量可以使用ELISA(酶联免疫吸附试验)或Western印迹分析进行测定。

然后将mighty基因表达的水平、或mighty蛋白的量与平均值比较。Mighty基因表达的平均水平是从平均肌肉重量的动物样本中获得的平均水平。类似地，mighty蛋白的平均量是在平均肌肉重量的动物样本中观测到的蛋白量。

与平均值相比，增高水平的mighty基因表达或mighty蛋白是指动物的肌肉重量将被预测为高于平均的肌肉重量。与平均值相比，降低水平的mighty基因表达或mighty蛋白是指动物的肌肉重量将被预测为低于平均值。

可以理解，天然发生的mighty基因的变体可以存在。该变体可以包括多态性，例如单核苷酸多态性(SNPs)。本领域技术人员将能够使用本发明的序列筛选该变体。例如，序列可用于设计在聚合酶链式反应(PCR)中使用的合适引物以扩增mighty基因或mighty基因的片段从而在各种不同的生物体中筛选该变体。筛选可能包括，例如直接测序或单链构像多态性分析(SSCP)的方法。还可理解的是mighty的变体可与生物体改变的肌肉重量相关。

上述测定mighty表达水平或检测与改变的肌肉重量相关的mighty变体的方法可用于挑选参与繁殖程序的动物，从而产生具有增加或减少的肌肉重量的后代。

发明还提供抗mighty蛋白的抗体。使用本说明书公开的序列，本领域技术人员将能够产生抗mighty蛋白的抗体。如何产生抗体的实例，其中包括杂交瘤的生产，可以在Eryl Liddell and Cryer(1996)或Javois(1999)中找到。还可理解的是抗体的结合区被认为属于抗体的定义。

如实施例16所描述以及图20所示，可以在合适的动物中产生抗整个mighty蛋白的多克隆抗体。可替换地，抗原性片段可以用于产生特异的肽。这表明了本发明的抗体如何能够使用本领域已知的技术产生。

该抗体可以被用于检测、和/或在样本中定量mighty蛋白。可替换地，本发明的抗体可用于结合和调节mighty活性。

可理解的是可产生其它类型的抗体和结合蛋白并预期为本发明的一部分。这些包括，但不限于，非哺乳动物抗体，例如来自鲨鱼的IgNAR类抗体；细菌免疫蛋白(bacterial immunity protein)，例如来自大肠杆菌的IMM7免疫蛋白，或本领域已知的其它类型的结合蛋白。使用本说明书公开的序列，本领域技术人员将能够产生该多肽或者筛选已知结合多肽的文库以获得优选与本发明多肽结合的多肽。

也分离和克隆了小鼠mighty启动子(SEQ ID No：5)，并且也构成本发明的一部分。本发明还提供一种或多种含有小鼠mighty启动子的多核苷酸。mighty启动子是SEQ ID No：5的多核苷酸、与SEQ ID No：5有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸、或其片段或衍生物。

启动子序列的分析，图3，显示了已知的转录因子结合位点。

含有mighty基因启动子的载体可以使用已知的技术产生。载体意指包括将多核苷酸并入质粒和/或病毒中以帮助将多核苷酸导入和/或保持在宿主细胞中。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞、体内或原代或转化的细胞系。

如图16所示，mighty启动子可用于驱动基因在包括人的各种细胞系中表达。而且，如图19所示，小至mighty起始位点上游200个核苷酸的片段能够驱动基因的表达。

mighty基因启动子可用于筛选能够有效调节mighty基因表达，并因而能够有效调节肌肉生长的化合物。为此，可将mighty启动子置于带有合适标记基因的合适表达载体中。“标记基因”是表达产物可被识别和定量的基因。已知许多合适的标记基因，并可包括例如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶或β-半乳糖苷酶。

然后使用已知的转染技术将载体置于合适的宿主细胞中。合适的宿主细胞包含细胞，其中mighty基因启动子被激活，导致标记基因表达，并且能够检测标记基因表达产物的水平。然后将目标化合物施用于宿主细胞，检测标记基因中的任何改变。

与基线(base line)相比，标记基因表达产物量的增加表明所述化合物能够通过mighty基因启动子增强基因表达，因而可用于促进肌肉生长。与基线相比，标记基因表达产物量的减少表明所述化合物能够通过mighty基因启动子抑制基因表达，因而可用于抑制肌肉生长。

如图17所示，该方法能用于表明mighty启动子被肌肉抑制素调节。因为肌肉抑制素是已知的肌肉负调节物，该结果进一步证明了mighty在促进和调节肌肉生长和发育中的活性。肌肉抑制素的优势负模拟物也是已知的。WO01/53350，C末端截断(在位置330和350之间)的肌肉抑制素肽产生具有优势负效果的肌肉抑制素模拟物。如图18所示，肌肉抑制素模拟物335(在位置335截断)能够回复肌肉抑制素介导的mighty启动子抑制。结合来看，图17和图18显示肌肉抑制素和肌肉抑制素模拟物能够分别被用于下调或上调mighty表达，并因而能够在本发明的组合物中使用。

might基因启动子也可用于表达肌细胞中的指定基因。指定基因可以包含本发明的多核苷酸，或可以是任何其它多核苷酸，例如编码肌肉抑制素蛋白的多核苷酸。为此，将mighty基因启动子连同目的基因插入合适的载体。本领域已知许多合适的载体，并可包括真核载体、病毒载体或任何适于基因治疗的载体。

然后可使用已知的转染技术将载体导入合适的宿主细胞。

合适的宿主细胞可为任何肌肉细胞或哺乳动物细胞，其中mighty启动子被激活。宿主细胞可包括，例如原代或成肌细胞系，或转化的成肌细胞系，或宿主动物的骨骼肌或心肌细胞。

可使用任何mighty启动子有活性的宿主动物，而可以包括例如羊、母牛、公牛、鹿、家禽、火鸡、猪、鱼、马、小鼠、大鼠或人。

实施例1：分离mighty cDNA

RNA纯化：根据制造商的规程使用TRIZOL(Invitrogen)从羊和牛的骨骼肌和心脏组织样本中纯化RNA。

mighty cDNA的扩增：mighty cDNA的扩增通过联合反转录PCR进行。根据制造商的指示使用Superscript preamplification试剂盒(Invitrogen)在来自5μg总RNA的20μl反转录反应混合物中合成第一链cDNA。用于扩增的PCR条件和特异引物如下：

羊和牛骨骼肌mighty cDNA和牛心脏mighty cDNA的扩增使用如下引物：

正向引物5’CACCATGGCGTGCGGGGCGACACTG 3’(SEQ ID No.6)

反向引物5’GGATACATAGCTTGTTGGCCT 3’(SEQ ID No.7)

PCR在存在Q溶液(Qiagen)的情况下进行，并在94℃起始变性1分钟，然后以下述步骤进行35个循环，94℃ 15秒，60℃ 45秒，72℃ 1分钟，和最后延伸的1个循环72℃ 5分钟。

来自Belgian Blue牛和正常肌肉的牛的mighty片段的PCR扩增(图1)。

使用的引物：

bcoo3291Fwd 5’TGAAGCGGCCCATGGAGTTC 3’(SEQ ID No.8)

bcoo3291Rev2 5’GGTGGGCTGGTCCTTCTTCATC 3’(SEQ ID No.9)

PCR在存在Q溶液(Qiagen)和Taq聚合酶的情况下进行，开始94℃变性1秒钟，然后进行35个循环的94℃ 15秒，62℃ 30秒，72℃ 45秒和最后延伸的1个循环72℃ 5分钟。

PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙锭染色和显像。图1的结果显示与正常肌肉的动物相比mighty在双肌牛中过表达。该结果表明mighty在促进肌肉生长中起作用。图2的A部分显示在双肌动物的心脏组织中mighty基因的表达也上调，这表明mighty也能够调节心肌生长和发育以及骨骼肌生长和发育。图2的B部分显示在羊骨骼肌中存在mighty表达。

PCR产物的纯化：在0.8％低熔点琼脂糖凝胶上电泳PCR反应物，切下含有目的条带的凝胶。使用Wizard PCR preps DNA纯化系统(Promega)从凝胶中纯化DNA。

实施例2：mighty cDNA的克隆

根据制造商的规程将纯化的cDNA连接到pGEM-T easy载体(Promega)中。根据制造商的规程将连接反应物转化到感受态的大肠杆菌DH 5alpha细菌(Invitrogen)中。将转化的细菌置于含有氨苄青霉素(50mg/升)、IPTG和X-gal的Lennox L broth(LB)琼脂平板上。将白色菌落接种到LB加氨苄青霉素培养基中，培养过夜。使用Qiagen mini质粒试剂盒(Qiagen)从培养物中纯化质粒DNA。用限制性酶EcoRI消化质粒DNA，并在琼脂糖凝胶上分析。通过大小正确的片段的存在来鉴定阳性克隆。将阳性克隆进行测序以进一步确认。羊mighty多核苷酸序列在SEQ ID No.1中给出，相应的多肽序列在SEQ ID No.2中给出。牛mighty多核苷酸序列在SEQ ID No.3中给出，相应的多肽序列为SEQ ID No.4。

实施例3：产生鼠类mighty稳定细胞系

用下列引物PCR扩增鼠类mighty的ORF：

Fwd 5’CACCATGGCGTGCGGGGCGACACTG 3’(SEQ ID No.6)

Rev 5’GGATACATAGCTTGTTGGCCT 3’ (SEQ ID No.7)

根据制造商的建议，将Pwo聚合酶(Roche)、Q溶液(Qiagen)和作为模板的小鼠EST克隆(Resgene)用于PCR反应。PCR条件如下：35个循环的94℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 1分钟和一个循环的72℃ 5分钟。

根据各制造商的规程，通过Wizard PCR preparations DNA纯化系统(Promega)纯化小鼠mighty基因的cDNA，将其克隆到pcDNA3.1D/V5HisTOPO载体(Invitrogen)的TOPO位点。重组体通过限制性消化进行分析，并将阳性重组体测序。

为了用小鼠mighty构建体稳定转染C2C12成肌细胞，将C2C12成肌细胞(1×107)在冰冷的1xHBS(140mM NaCl，0.77mM Na₂HPO₄，25mM Hepes(7.1))中洗涤两次，重悬于0.5ml冰冷的1xHBS中，并转移到预冷的0.4cm间隙的小池(cuvette)(BioRad)中。加入10μg线性化的质粒DNA(用Sca I线性化)。置于冰上5分钟后，通过搅动混合细胞，将小池以0.24kV 960μF电容及设为200Ω的电阻进行脉冲。时间常数是平均36ms。细胞在冰上保温10分钟，转移到10cm皿上的10ml DMEM 10％FBS中，上下研磨以破坏细胞碎片。用遗传霉素(geneticin)(600μg/ml)选择细胞，选择单个克隆。表达转基因的克隆通过质粒中V5标记的Western印迹进行鉴定。

实施例4：成肌细胞增殖试验

在检测C2C12细胞(Yaffe和Saxel)前，转染的C2C12克隆在DMEM培养基(Life Technologies，Grand Island，NY.USA)中培养，用NaHCO₃(41.9mmol/l，Sigma Cell Culture Ltd，St Louis，MO，USA)和气态CO₂缓冲。酚红(7.22hmol/l，Sigma)被用作pH指示剂。将青霉素(1×10⁵IU/l)和链霉素(100mg/l，Sigma)常规地加入10％胎牛血清培养基(Life Technologies Ltd)。

细胞增殖试验在无涂层的96孔Nunc微量滴定板中进行。C2C12培养物以3×10³细胞/cm²接种到增殖培养基中。24小时的连接阶段(attachmentperiod)后，倒出培养基，并将新鲜的增殖培养基重新加回平板。

然后在37℃和5％CO₂的气氛中温育平皿。在培养基改变后的0、24、48和72个小时固定试验的平板，并通过Oliver等(1989)的方法测定增殖。简要地，倒出生长培养基，将细胞用PBS洗一次，然后在10％甲醛盐水(formolsaline)中固定30分钟。固定的细胞在0.01M硼酸盐缓冲液(pH8.5)中用10g/l的亚甲蓝染色30分钟。通过在硼酸盐缓冲液连续洗涤四次除去多余的染料。然后通过加入100ml的1∶1(v/v)的乙醇和0.1M的HCl从固定细胞上洗脱亚甲蓝。然后轻轻摇动平皿，通过微板光度计(microplate photometer)(BioRadmodel 3550 microplate reader，BioRad，Hercules，CA，USA)测量每个孔在655nm的吸光率。

图4的结果显示，用mighty基因转染的细胞具有更高的吸光度，这表示与正常C2C12细胞相比更快的生长速度。该结果显示mighty上调成肌细胞的生长。

实施例5：Mighty诱导的肥大

为评价mighty在促进肌发生中的功能，将稳定表达mighty的成肌细胞在低血清培养基中进行分化。进行MHC的免疫染色以评估肌管的形态学。

mighty过表达的细胞和亲代细胞系；将在DMEM 2％马血清中分化72小时的C2C12在PBS中洗一次，然后用70％的乙醇∶甲醛∶冰醋酸(20∶2∶1)固定30秒，再用PBS漂洗三次。然后将细胞在含有1％正常羊血清(NSS)的TBS中在4℃封闭过夜。将细胞与第一抗体(primary antibody)，1∶100稀释的抗MHC抗体在TBS/1％NSS中培养1小时。将细胞用TBST洗涤(3×5min)并与第二抗体(secondary antibody)，1∶100稀释的羊抗小鼠IgG在TBS/1％NSS中培养30分钟。将细胞像前述一样洗涤，并与第三抗体(tertiaryantibody)，1∶100稀释的抗生蛋白链菌素-生物素过氧化物酶复合物(RPN1051，Amersham)在TBS/1％NSS中培养30分钟。将细胞然后像前述一样再次洗涤。使用3，3-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB；Invitrogen)显现MHC免疫染色，其用0.0375％CoCl₂增强，然后用Gills苏木精(Gills haematoxylin)复染、固定和拍照。

如图5所示，mighty的表达导致肌核数量的增加，因而表明mighty也促进肌细胞的肥大。

实施例6：mighty诱导肥大的分析

方法：

细胞培养

将C2C12细胞或两个Mighty过表达C2C12克隆；克隆7和克隆11以15,000细胞/cm²置于permanox盖玻片(Nunc)上DMEM 10％FB S(Invitrogen)中，用于分析活性生长的细胞，并以25,000细胞/cm²用于分化研究。

在5％CO₂/37℃的气氛中的24小时连接阶段后，将培养基改变为生长培养基(DMEM/10％FBS)或变为DMEM/2％HS(分化培养基)(Invitrogen)，并使细胞分化60和72小时。为了显现细胞，将培养物在合适的时间点用20份的70％乙醇/2份的40％甲醛/1份的冰醋酸固定，然后用Gills苏木精(1∶1)染色5分钟，用1％曙红(Eosin)染色1分钟。然后将盖玻片在100％乙醇中脱水、清洁并用DPX在载玻片上永久固定。

人成肌细胞培养

从Clonetics，Cambrex NJ，USA获得人骨骼肌成肌细胞。根据各制造商的说明，将细胞常规地在含有rhEGF、地塞米松(Dexamethasone)、FBS、Glutimine和GA-1000的SkGM-2培养基中生长。

为了转染和条件培养基试验，将细胞以30,000细胞/cm²的密度铺平板。24小时连接阶段后，将培养物用mighty-pCDNA3和对照载体转染或者获得条件培养基。条件培养基由DMEM/2％HS组成，其用mighty克隆11或对照细胞进行48小时条件化。

转染后24小时，培养基改变为DMEM/2％HS。培养物用20∶2∶1的固定液(fixative)在12、24、36、48小时固定。

C2C12克隆中肥大的定量

在设置在Olympus显微镜上的SPOT RT相机上，使用为Windows和MAC设计的SPOT RT软件v 3.5捕获图像。对于活性生长的细胞，以40x的放大倍率测量每个细胞系中40个随机选择的细胞的面积。对于肌管，也以40x的放大倍率测量每个细胞系40个随机选择的分别具有3个和4个核的肌管的面积、宽度和长度。数据表示为平均值+/-标准差(Standard Deviation)。

FACS分析

于10cm皿中的DMEM 10％FBS中培养Mighty过表达的C2C12克隆7和11，以及lacZ对照C2C12成肌细胞。使用胰蛋白酶(trypsin)收集细胞，然后离心并在800μl 70％乙醇/PBS中固定。在室温下将固定的细胞重悬于50μlPBS+500μl DNA提取缓冲液(200mM Na₂HPO₄；100mM柠檬酸)中10分钟。将DNA提取缓冲液替换为DNA染色缓冲液(PBS中50μg/ml碘化丙锭(propidium iodide)；50μg/ml无DNase的RNase A)，简单旋转以重悬细胞并在黑暗中在室温培养30分钟。然后用Becton-Dickinson FACScan流式细胞计数器(Becton-Dickinson)检测细胞的碘化丙锭荧光，用CellFit软件(Becton-Dickinson)分析前向角光散射，一种细胞大小的量度，和DNA含量，用于细胞周期分析。

Western印迹

在转到分化培养基(DMEM 2％HS)中培养0、24、48、72和96个小时前，将mighty过表达的C2C12克隆7和11，以及lacZ表达C2C12成肌细胞在10cm皿中在DMEM 10％FBS中培养24小时。通过胰蛋白酶化收集细胞，并且重悬在300μl的裂解缓冲液中(50mM Tris(pH7.5)；250mM NaCl；5mMEDTA；0.1％NP-40；1×蛋白酶抑制剂(Complete；Roche))。细胞提取物通过0.5mm注射器针头十次，离心(14,000g 10分钟)沉淀细胞碎片，并将上清用于Western印迹。使用Bio-Rad蛋白分析试剂(Bio-Rad)检测蛋白浓度，15μg的蛋白在预制的NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)中在45mA下电泳。然后使用Mini-ProteanII转移系统(Bio-Rad)在50-60V下处理2小时将蛋白凝胶转移到Trans-blot转移膜(Bio-Rad)。将该膜在TBST中的5％牛奶中封闭过夜。在TBST中的5％牛奶中稀释如下第一抗体：p21，1∶400稀释的纯化的小鼠单克隆抗p21抗体(SX118；PharMingen)；MyoD，1∶200稀释的纯化的兔多克隆抗MyoD抗体(sc-304；Santa Cruz)；MHC，1∶2000稀释的纯化的小鼠多克隆抗MHC抗体(MF-20；Donald Fischman博士馈赠)；α-微管蛋白，1∶4000稀释的纯化的小鼠单克隆抗α-微管蛋白抗体(DM1A；Sigma)；并在室温下培养3小时。将膜在TBST中洗涤5次每次5分钟，进一步在室温下于TBST中的5％牛奶中培养1小时，其中含有1∶2000稀释的抗小鼠IgG HRP结合物(P0447；Dako)或抗兔IgG HRP结合物(P0448；Dako)。然后将膜在TBST中洗涤5次每次5分钟，并使用Western Lightning ChemiluminescenceReagent Plus(Perkin Elmer)检测HRP活性。

结果：

Mighty过表达的成肌细胞和肌管显示比对照细胞肥大

活性生长的mighty过表达克隆当与对照细胞比较时显示出肥大。使用定量图像分析，活性生长的mighty过表达克隆具有比对照细胞明显更大的面积(图6A)。为确认该结果，，通过流式细胞术采用前向角光散射测定成肌细胞肥大，或相对细胞大小。该分析表明克隆11和克隆7的细胞分别具有比对照细胞增加的细胞大小(图6B)。

分化的mighty过表达克隆与对照细胞相比也显示肥大。假定肥大的解释可以是每个肌管融合细胞数量的增加，进行分析比较mighty过表达克隆和对照细胞之间具有同样数量核的肌管的大小。使用定量图像分析，在mighty过表达克隆中明显肌管肥大。比较三和四核肌管的肌管面积、宽度和长度。在三和四核肌管中mighty过表达克隆都显示出比对照细胞在面积、宽度和长度上的增加(图6C-6E)。

Mighty过表达克隆分化早于对照细胞

使用MHC的免疫细胞化学检测mighty过表达克隆的分化表型以显现肌管形成。将mighty过表达克隆转到分化培养基时，60个小时后在mighty过表达克隆中明显出现多核肌管，而对照培养物中直到72小时多核肌管也不明显。72小时后mighty过表达显示基本完全分化，而对照细胞显示仅形成初生肌管(nascent myotube)(图7A)。使用分化标记的Western印迹证实了这些结果。早期、中期和晚期分化标记p21、myoD和MHC分别用于研究肌原性(myogenic)分化基因表达(图7B)。p21的表达在所有的时间点增加，表明p21表达在mighty过表达克隆中发生较早并且达到较高的程度。MyoD表达在mighty过表达克隆中增加较早，在分化的0、24和48小时，myoD表达超过对照细胞。72小时后在所有细胞系中MyoD水平同样高。在克隆11中24小时后出现MHC表达，并在48小时其在两个克隆中都表达到更高的水平。72小时后该表达在所有细胞中相同。肌原性分化标记较早的和增加的表达是与组织化学结果同时发生的。该结果表明过表达mighty导致增强的分化表型。

实施例7：肌肉发育中的mighty

方法：

分离卫星细胞(静止的)

通过Percoll密度离心从4周大的野生型小鼠的后肢肌肉中分离卫星细胞(SC)。肌肉被切碎，在0.2％的胶原酶1A中消化90分钟。通过轻柔的研碎和随后的过滤(70μm)从基底层下释放细胞。然后将细胞悬浮液覆盖在70％/40％的Percoll梯度上，并以1,600rpm离心20分钟。回收含有卫星细胞的70％和40％Percoll溶液之间的分界面，将细胞在PBS中洗涤。为提取用于Western印迹的蛋白，将细胞重悬于裂解缓冲液中，并通过0.45mm计量注射针(gaugeneedle)以裂解细胞。通过在10,000rpm离心10分钟去除细胞碎片，并将获得的蛋白溶液在-80℃保存。

分离原代成肌细胞(活化的卫星细胞)

从4周大小鼠上移除后肢肌肉，将其完全切碎，37℃下在DMEM(无血清)中用0.2％的胶原酶1A振荡(70rpm)消化90分钟。消化物用10ml吸液管反复粉碎直至看不见块状。然后将悬浮液通过100μm和随后70μm的滤器过滤。过滤的缓冲液在4,000rpm离心10分钟，并将沉淀在8ml温暖的增殖培养基[DMEM，20％胎牛血清(FCS)，10％马血清(HS)，1％鸡胚胎提取物(CEE)]中重悬。将细胞悬浮物在无涂层的10cm的平板上预涂布1.5h，然后转换到10％基质胶(matrigel)平板，并在37℃培养48h。48h后将培养基换为DMEM+10％FCS。活性生长条件中24h后收集细胞。为提取用于蛋白质印迹的蛋白，将细胞重悬于裂解缓冲液中，并通过0.45mm计量注射针以裂解细胞。通过在10,000rpm离心10分钟去除细胞碎片，并将获得的蛋白溶液在-80℃保存。

mighty的Western分析

将预制的聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，NuPage 4-12％Bis-Tris)用于蛋白分离。将15μg的蛋白通过SDS-PAGE(4-12％)分离并通过电印迹(electroblotting)转换到硝化纤维膜。使用丽春红S染料检测硝化纤维膜上存在的蛋白以保证出现同等负载。将膜在RT在0.3％BSA/1％PVP/1％PEG/TBS-T中培养3h以阻断非特异性抗体的结合。然后将膜与1∶5000稀释的兔抗mighty抗体在0.3％BSA/1％PVP/1％PEG/TBS-T中在4℃轻微振荡培养过夜。抗体培养之间将膜在TBS-T中洗涤5次每次5分钟。然后将硝化纤维膜与1∶2000稀释的与辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔(HRP)(Amersham)在0.3％BSA/1％PVP/1％PEG/TBS-T中培养1h。用ECL试剂(Western LightningChemiluminescense Reagent Plus)测定HRP活性。

结果：

might在鼠类卫星细胞中的表达

为测定mighty蛋白表达的模式，从静止的卫星细胞、活性生长的成肌细胞中提取总蛋白。通过Western印迹分析mighty蛋白表达水平(图8)。在静止的卫星细胞中，没有检测到mighty蛋白表达。然而，在活性生长的成肌细胞(活化的卫星细胞)中检测到mighty蛋白。

实施例8：肌肉再生中的Mighty

方法：

虎蛇毒素(Notexin)诱导的再生

通过腹膜内注射氯胺酮(ketamine)/甲苯噻嗪(rompun)(盐酸氯胺酮100mg/ml，盐酸甲苯噻嗪20mg/m，以0.1ml/6gm体重)麻醉六周大的野生型小鼠。修剪毛皮，露出右胫骨前肌(TA)肌肉区域，并且在肌肉上做一小切口。使用100μl注射器(Hamilton Co.)将10μl的0.1μg虎蛇毒素(Notechis scutatus scutatus)(Venom Supplies Pty.Ltd.，Tanunda，South Aust)注射至右TA。切口用Michelle夹闭合。将小鼠在损伤后不同的天数通过CO₂窒息无痛处死，然后脱颈(cervical dislocation)。右侧和左侧的TA肌肉被仔细剖开，称重并且进行免疫组织化学分析。

mighty的免疫组织化学

将小鼠TA肌肉和羊心脏组织分离，植入OCT中并且冷冻于液氮冷却的异戊烷中。将冷冻部分(cryosection)在10μm切断并且将载片在-20℃冷冻直至使用。这些部分在PBS，0.1％Triton X-100中在室温下渗透30分钟，并且与1∶100稀释的第一抗mighty抗体在PBS，10％标准驴血清，1％BSA，0.1％Triton X-100中4℃培养过夜。在PBS中洗涤3x4分钟后，将载片在PBS、5％标准驴血清，1％BSA，0.1％Triton X-100中温育1小时以减少与第二抗体的非特异性结合。该部分与1∶300稀释的生物素化的抗兔第二抗体(Amersham，UK)室温培养1小时。在PBS中洗涤后，将该部分最后在抗生蛋白链菌素结合的Alexa fluor 488-标记的第三抗体(Molecular Probes，USA)中在室温温育1小时，在PBS中洗涤，用DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚，二氢氯化物，Molecular Probes，USA)复染，固定在DAKO荧光固定培养基中并且分析migty表达。对照部分与非第一抗体或者兔对照IgG温育并且随后如上所述进行。

结果：

小鼠TA肌肉再生过程中mighty的表达

为了调查在野生型大鼠的肌肉再生过程中mighty的表达，通过注射虎蛇毒素至右胫骨前肌(TA)肌肉来诱导损伤。在注射后的各天，将小鼠无痛致死并且收集TA肌肉。为了确定mighty表达的模式，进行免疫组织化学(图9)。在受伤后的第一天，对肌肉纤维整体有大量的损伤，观察到mighty表达的水平未发生变化。到第5天mighty表达水平相对于第0天已经大量增加，在受伤后的第7天水平达到峰值。到在第28天mighty表达的水平可与对照的未受伤肌肉相比较。

实施例9：在羊的梗死后心脏组织中表达Mighty

方法：

通过Sharma等，1999中所述的公开方法诱导羊心脏中的心肌梗死。在梗死后第0天(无梗死)、第2天和第6天收集心脏组织。为了确定mighty表达的模式，如肌肉再生实施例(实施例8)中所述进行心脏组织部分的免疫组织化学。

结果：

在无梗死心脏组织中，mighty的表达为均匀的并且限于位于心肌细胞周围小间隙(interstitium)中的细胞。未显示心肌细胞表达Mighty。梗死后两天，mighty的表达与对照的心类似。到梗死后的第6天，浸润性(infiltrating)细胞的数量主要在梗死区中大量增加。mighty的表达限于位于最接近坏死的心肌区域的浸润性细胞。在浸润性细胞邻近存活心肌之处，表达水平仍保持与对照物相类似。远离梗死区域的浸润性细胞不表达mighty(图10)。

mighty在间隙成纤维细胞中以及坏死心肌区域中浸润性细胞中的存在证实了mighty参与愈合(healing)的过程。

实施例10：Mighty对于人成肌细胞的分化和肥大的影响

结果：

在用mighty转染的人成肌细胞中的分化增加

为确定mighty过表达对于在人成肌细胞中分化的影响，使用mighty-pcDNA3或者单独使用pcDNA3(对照)转染人成肌细胞并且在分化培养基中培养12小时。为了确定分化肌管的数量，使用肌球蛋白重链(MHC)特异性抗体进行免疫组织化学。在处于分化条件下12个小时后，与对照成肌细胞相比，在mighty转染的人成肌细胞中MHC阳性肌管的数量更多(图11)。

用Mighty转染的人成肌细胞的肥大

用Mighty-pcDNA3或单独用pcDNA3(对照)转染人成肌细胞并且在分化条件下培养12小时。为了确定肥大，使用肌球蛋白重链(MHC)特异性抗体进行免疫组织化学，并且计数每个MHC阳性肌管的肌核数量(图12A)。结果显示与对照相比，更少mighty转染的人肌管只含有1-3个肌核，更多数量的肌管含有4-9个肌核。也通过测定含有5-9个肌核的肌管宽度来评估MHC表达肌管的肥大(图12B)。mighty转染的肌管的平均宽度与对照肌管相比更大(图12B)。

用来自mighty过表达的C2C12细胞的条件培养基处理的人成肌细胞的肥大

为了证明由mighty引起的加速分化和肥大的现象，在分化条件下用来自Mighty过度表达C2C12细胞和LacZ(对照)C2C12细胞的条件培养基培养人成肌细胞48小时。如上所述评估肥大的水平。用来自mighty过表达的C2C12细胞的条件培养基培养的人成肌细胞与对照处理的成肌细胞相比含有更少的仅有1-5个肌核的肌管以及更大量带有16-25个肌核的肌管(图13A)。用来自mighty过表达的C2C12细胞的条件培养基处理的人成肌细胞中，肌核的平均数与对照相比更多(图13B)。

MHC表达肌管的肥大还通过测定肌管的宽度再次评估。测量含有8个肌核的MHC表达肌管(图13)。用来自mighty过度表达的C2C12细胞的条件培养基处理的肌管的平均宽度与对照肌管相比更大。

用来自mighty的条件培养基处理的人横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)(RD)细胞中的增加的分化

方法：

从ATCC(Rockville，MD.)获得人RD(人横纹肌肉瘤)细胞。检测前将RD细胞在Dulbecco改进的Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(DMEM；Invitrogen)中生长，用41.9mM的NaHCO₃(Sigma Cell Culture Ltd)和5％气态CO₂缓冲。7.22nM的酚红(Sigma)作为pH指示剂。在培养基中加入1×10⁵IU/L青霉素(Sigma)，100mg/L链霉素(Sigma)和10％胎牛血清(FBS；Invitrogen)。将RD细胞以30,000细胞/cm的密度置于permanox chamber玻片上。24小时后将它们如所述对人成肌细胞一样用条件培养基处理(mighty克隆11)并将细胞在72小时后固定。进行MHC的免疫组织化学。

结果：

用mighty条件培养基和对照培养基处理人RD细胞，并且进行72小时的分化。将细胞对于MHC免疫染色以评估分化的程度。处理的细胞中的MHC阳性肌管的数量与对照细胞相比更高，这表明来自mighty过度表达克隆的条件培养基能够加速分化(图15)。

实施例11：鼠类Mighty启动子的克隆

方法：

用小鼠基因组DNA和下面的引物扩增2.1kb的5’上游序列：

Rev 5’AGA TCT GAT CCA ACT CTT CAG CTA C 3’(SEQ ID No.10)

Fwd 5’GCT AGC CCA CAT TCA CTG TGC AAG 3’ (SEQ ID No.11)

根据制造商的规程，使用Q溶液(Qiagen)和Expand long DNA聚合酶(Roche)进行PCR。PCR条件为，35个循环的95℃ 15s，52℃ 30s，68℃ 3min和最后延伸的1个循环68℃ 7min。

将PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上分析并且通过Wizard纯化柱(Promega)纯化。将纯化的DNA片段如上所述克隆到pGEM-T easy载体中。通过限制性消化和测序选择和分析阳性重组体。通过BglII和NheI酶从pGEM-T easy载体中切下2.1kb片段以克隆至荧光素酶报道载体pGL3B。用BglII和NheI消化pGL3B并且用T4连接酶将2.1kb mighty启动子片段与其连接。用连接反应物转化大肠杆菌DH 5α并涂布于LB琼脂加氨苄青霉素平板。培养物在LB加氨苄青霉素培养基中生长并且如前所述纯化质粒DNA。通过限制性消化分析质粒DNA并鉴定阳性重组体。通过测序被确认阳性重组体(2.1构建体)(SEQ ID No.5)。对于转染实验，使用Qiagen Maxi Prep试剂盒(Qiagen)纯化DNA。

mighty启动子序列如SEQ ID No.5中所示。也分析了mighty启动子序列已知的转录因子结合位点(图3)。这些位点显示启动子序列的关键部分。

实施例12：Mighty启动子活性在包括人的不同细胞系中的实例方法：

将1kb的mighty上游序列(2.1kb mighty启动子的片段)克隆至荧光素酶报道载体pGL3-basic(Promega)。通过限制性消化从2.1kb启动子序列中获得1kb mighty启动子片段。在2.1mighty启动子构建体上进行Scal，BglII消化以切除该～1kb片段。然后将这个片段以正确方向克隆到pGL3b的多克隆位点中的SmaI和BglII位点从而驱动荧光素酶的表达。

用2μg的该启动子构建体和用于转染效率标准化的0.5或1μg的β-半乳糖苷酶(β-gal)表达质粒pCH110(Amersham)进行转染。根据制造商的规程，使用LipofectAMINE 2000试剂(LF2000，Invitrogen)用上述载体转染C2C12成肌细胞，NIH3T3，CHO，RD(人横纹肌肉瘤细胞系)以及原代羊成肌细胞。简要地，在转染之前将细胞系以15,000细胞/cm²涂布于6孔细胞培养皿(Nunc)上合适的生长培养基中并且在37℃，在5％CO₂中温育过夜。每孔中将LF2000以5-8ul在250μl不含血清的DMEM中稀释。然后将稀释的DNA和LF2000混合并且在室温温育20分钟。然后将DNA/LF2000混合物加入含有2ml适当生长培养基中的细胞的孔中。将细胞系与转染混合物在37℃，在5％CO₂中温育过夜，之后用生长或者分化培养基替换培养基。然后将细胞以每孔5ml PBS漂洗两次并且在300-500μl的报道裂解缓冲液(Promega)中裂解。10μl的细胞裂解物用于使用荧光素酶分析系统(Promega)根据每个制造商的规程探测荧光素酶活性。50μl的细胞裂解物用于使用含有报道裂解缓冲液(Promega)的β-半乳糖苷酶分析系统根据每个制造商的规程进行β-gal分析。将荧光素酶值根据β-gal值以对于转染效率进行标准化。

结果：

将1kb的鼠类mighty上游序列转染至各种细胞系。这些包括C2C12成肌细胞、原代羊成肌细胞、NIH3T3成纤维细胞、以及中华仓鼠卵巢(CHO)细胞(图16A)和人RD细胞(图16B)。鼠类mighty启动子在所有这些细胞系中显示出强烈活性。因此mighty启动子在源自不同组织类型和包括人在内的物种的细胞系中显示出强表达。

实施例13：肌肉抑制素对Mighty启动子的剂量依赖性抑制

方法：

在C2C12成肌细胞中mighty启动子的转染方法如上所述，除了用肌肉抑制素蛋白处理转染细胞。转染后24小时，在生长培养基中用4和8μg/ml的重组肌肉抑制素处理细胞。处理24小时后收获细胞。如上所述测定荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性。

结果：

将1kb鼠类mighty启动子转染至C2C12成肌细胞并且用增加浓度的4和8μg/ml的重组肌肉抑制素蛋白处理。1kb mighty启动子的活性在4和8μg/ml的肌肉抑制素蛋白(分别为39.23+/-0.99％和58.22+/-1.00％)的存在下被抑制。而且增加浓度的肌肉抑制素在更大程度上抑制mighty启动子(图17)。因此肌肉抑制素以剂量依赖的方式抑制mighty启动子。

实施例14：肌肉抑制素模拟物(335)回复肌肉抑制素对Mighty启动子的作用

羊卫星细胞的转染

如上所述将羊卫星细胞在DMEM+10％FBS中生长。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)根据制造商的说明，在24孔板中用0.4μg 1kb小鼠mighty启动子构建体和0.1μg的pCH110(SV40β-半乳糖苷酶对照载体，Amersham)转染细胞。24小时后将培养基变为DMEM+10％FBS+3μg/ml野生型重组肌肉抑制素或335(15mg)，或者肌肉抑制素和335。在更换培养基24小时后，制备细胞提取物并按照确定的规程进行荧光素酶试验(Promega)。按照规程(Promega)进行β-半乳糖苷酶活性的试验。将荧光素酶活性根据β-半乳糖苷酶活性进行标准化。

结果

用1kb mighty启动子和β-半乳糖苷酶载体转染羊成肌细胞，并且用肌肉抑制素或者肌肉抑制素模拟物或者二者共同进行处理。如图18中所示，对于用野生型肌肉抑制素的处理可以看到mighty启动子活性的33％的抑制。当细胞用肌肉抑制素和5摩尔过量的优势负模拟物335处理时，仅观察到mighty启动子活性的19％的抑制。因此优势负肌肉抑制素模拟物335能够回复mighty启动子的肌肉抑制素介导的抑制作用。

实施例15：Mighty启动子的截断分析(Truncation Analysis)

方法：

用含有NheI限制位点的正向引物5’-GCTAGCGTGATCCGATTAATGGCC-3’以及含有BglII限制位点的反向引物5’-AGATCTGATCCAACTCTTCAGCTAG-3’扩增Mighty 0.6kb启动子。用含有NheI限制位点的正向引物5’-GCTAGCCCCTTTAGAATCACCTC-3’和含有BglII限制位点的反向引物5’-AGATCTGATCCAACTCTTCAGCTAG-3’扩增Mighty 0.4kb启动子。用含有NheI限制位点的正向引物5’-GCTAGCCGCAGGTGCGAAAGACCTC-3’和含有BglII限制位点的反向引物5’-AGATCTGATCCAACTCTTCAGCTAG-3’扩增Mighty 0.315kb启动子。用含有NheI限制位点的正向引物5’-GCTAGCTCCGGCAGAGAGCGTGAAG-3’和含有BglII限制位点的反向引物5’-AGATCTGATCCAACTCTTCAGCTAG-3’扩增Mighty 0.287kb启动子。用含有NheI限制位点的正向引物5’-GCTAGCAGACCGGCCTACTTCTTC-3’和含有BglII限制位点的反向引物5’-AGATCTGATCCAACTCTTCAGCTAG-3’扩增Mighty 0.209kb启动子。将这些截断片段(truncations)以正确方向克隆至pGL3b的NheI和BglII限制位点以驱动荧光素酶的表达。

结果

将mighty启动子片段(从0.2kb至2.1kb)转染至C2C12成肌细胞并检测荧光素酶活性。将荧光素酶活性根据β-半乳糖苷酶的活性进行标准化。结果如图19(A和B)中所示，其表明从300bp至1kb的mighty启动子的启动子活性最大。显示出在1kb和2.1kb之间的启动子活性有轻微降低。

实施例16：Mighty抗体的生产

方法

在兔子中产生抗全长牛mighty蛋白的多克隆抗体。首先，将牛mightycDNA克隆至pRSET B载体(Invitrogen)中，并且最终按照制造商的规程转化入大肠杆菌BL21 star(Invitrogen)。通过加入0.5mM IPTG诱导重组蛋白的表达并且连续培养两个半小时。通过离心收集细菌，重悬于40ml裂解缓冲液(6M盐酸胍(guanidine HCl)，20mM Tris pH8.1，5mM 2-巯基乙醇)中，然后进行声处理。将裂解产物在10,000g离心30分钟，使用Ni-琼脂糖亲和操作(Qiagen，Valencia，CA)从上清液中纯化重组蛋白。收集级分并且对两个改变的含有200mM NaCl和5％甘油的50mM Tris pH8.0在4℃透析90分钟。用Freund‘s佐剂乳化纯化的mighty蛋白并注射至每个兔子(341□g/兔子)。随后给予每只兔子含有170□g mighty蛋白/注射液的两份加强剂量(booster dose)。

从接种兔子中采集血并且在4℃在2000rpm离心15分钟。从凝血(clot)中分离血清。用2.5ml的蛋白-A琼脂糖(Protein-AAgarose)装填柱以纯化抗体的IgG级分。用25ml 100mM Tris pH8.0洗涤柱子。用1/10体积的1.0M Tris(pH8.0)调节血清的pH，并且将5.5ml的血清流过柱子。将回收的级分再次流过柱子。接下来，用25ml的100mM Tris(pH8.0)洗涤柱子。用25ml的10mM Tris(pH8.0)第二次洗涤。用100mM甘氨酸(pH3.0)洗脱抗体。在含有50μl的1M Tris(pH8.0)的管中收集洗脱液并轻轻混合。通过使用Bradford方法鉴定含有免疫球蛋白的级分以用于蛋白评估。

肽特异性mighty抗体

在我们的说明书中，通过QED Bioscience，Inc.，CA，USA产生抗18mermighty肽(173-190AA)的抗体。

Western印迹

进行Western印迹分析以验证产生的抗全长牛mighty蛋白和18mermighty肽(173-190)的抗体。具体地，将来自表达牛重组mighty蛋白的大肠杆菌细胞的蛋白提取物或纯化的重组mighty蛋白按照制造商的说明在4-12％的NuPAGE(Invitrogen)凝胶上分析。mighty蛋白抗体以1∶10,000用于Western印迹，而1∶5000的稀释用于肽抗体。

结果

肽和mighty蛋白抗体在Western印迹中都特异性识别预期的35kd大小的蛋白条带，这表明这些抗体对于mighty蛋白是特异的(图20)。

其中，前述说明参考文献已经成为具有公知等同物的整体或者组成部分，并且将所述等同物在此并入如同单独列出。

尽管本发明已通过实施例并参考其可能的实施方案进行了描述，但是可以理解，在不背离其范围的前提下可以对其进行改进和修饰。

参考文献：

Eryl LiddeII，J.and Cryer，A.(1996)A Practical Guide to MonoclonalAntibodies.Wiley.

Javois，Lorette C.(1999)Immunocytochemical Methods and Protocols.Humana Press.

Kambadur，R.，Sharma，M.，Smith，T.P.L.and Bass，J.J.(1997)Mutationsin myostatin(GDF-8)in doubled muscled Belgian Blue and Piedmontese Cattle.Genome Res.7.910-916.

Michael P.Spiller，Ravi Kambadur，Ferenc Jeanplong，Mark Thomas，Julie K.Martyn，，John J.Bass and Mridula Sharma(2002).Myostatin is adownstream target gene of basic helix loop helix transcription factor，MyoD.Mol& Cellular Biology 22：7066-7082.

Oliver，M.H.，Harrison，N.K.，Bishop，J.E.，Cole，P.J.and Laurent，G.J.(1989).A rapid and convenient assay for counting cells cultured in microwellplates：application for assessment of growth factors.Journal of Cell Science 92，513-518.

Yaffe，D.and Saxel，O.(1977).Serial passaging and differentiation ofmyogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.Nature 270，725-727.

序列表

<110>奥维塔有限公司(Ovita Limited)

<120>新的肌肉生长调节物

<130>JC218744-142

<150>NZ529860

<151>2003-11-27

<160>11

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>576

<212>DNA

<213>羊(ovine)

<400>1

atggcgtgcg gggcgacact gaagcggccc atggagttcg aggcggcgct gctgagccct 60

ggctctccga agcggcggcg ctgcgcccct ctgtccggcc ccactccggg cctcaggccc 120

ccggacgccg aaccgccgcc gctgcttcag acgcagaccc caccgccgac tctgcagcag 180

cccgccccgc ccggcagcga gcggcgcctt ccaactccgg agcaaatttt tcagaacata 240

aaacaagaat atagtcgtta tcagaggtgg agacatttag aagttgttct taatcagagt 300

gaagcttgta cttcggaaag tcagcctcac tcctcagcac tcacagcacc tagttctcca 360

ggttcctcct ggatgaaaaa ggaccagccc acctttaccc tccgacaagt tggaataata 420

tgtgagcgtc tcttaaaaga ctatgaagat aaaattcggg aggaatatga gcaaatcctc 480

aatactaaac tagcagaaca atatgaatct tttgtgaaat tcacacatga tcagattatg 540

cgacgatatg ggacaaggcc aacaagctat gtatcc 576

<210>2

<211>192

<212>PRT

<213>羊(ovine)

<400>2

Met Ala Cys Gly Ala Thr Leu Lys Arg Pro Met Glu Phe Glu Ala Ala

1 5 10 15

Leu Leu Ser Pro Gly Ser Pro Lys Arg Arg Arg Cys Ala Pro Leu Ser

20 25 30

Gly Pro Thr Pro Gly Leu Arg Pro Pro Asp Ala Glu Pro Pro Pro Leu

35 40 45

Leu Gln Thr Gln Thr Pro Pro Pro Thr Leu Gln Gln Pro Ala Pro Pro

50 55 60

Gly Ser Glu Arg Arg Leu Pro Thr Pro Glu Gln Ile Phe Gln Asn Ile

65 70 75 80

Lys Gln Glu Tyr Ser Arg Tyr Gln Arg Trp Arg His Leu Glu Val Val

85 90 95

Leu Asn Gln Ser Glu Ala Cys Thr Ser Glu Ser Gln Pro His Ser Ser

100 105 110

Ala Leu Thr Ala Pro Ser Ser Pro Gly Ser Ser Trp Met Lys Lys Asp

115 120 125

Gln Pro Thr Phe Thr Leu Arg Gln Val Gly Ile Ile Cys Glu Arg Leu

130 135 140

Leu Lys Asp Tyr Glu Asp Lys Ile Arg Glu Glu Tyr Glu Gln Ile Leu

145 150 155 160

Asn Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Glu Ser Phe Val Lys Phe Thr His

165 170 175

Asp Gln Ile Met Arg Arg Tyr Gly Thr Arg Pro Thr Ser Tyr Val Ser

180 185 190

<210>3

<211>576

<212>DNA

<213>牛(bovine)

<400>3

atggcgtgcg gggcgacact gaagcggccc atggagttcg aggcggcgct gctgagccct 60

ggctctccga agcgacggcg ctgcgcccct ctgtccggcc ccactccggg cctcaggccc 120

ccggacgccg aaccgccacc gctgcttcag acgcagatcc caccgccgac tctgcagcag 180

cccgccccgc ccggcagcga ccggcgcctt ccaactccgg agcaaatttt tcagaacata 240

aaacaagaat atagtcgtta tcagaggtgg agacatttag aagttgttct taatcagagt 300

gaagcttgta cttcggaaag tcagcctcac tcctcaacac tcacagcacc tagttctcca 360

ggttcctcct ggatgaaaaa ggaccagccc acctttacgc tccgacaagt tggaataata 420

tgtgagcgtc tcttaaaaga ctatgaagat aaaattcggg aggaatatga gcaaatcctc 480

aatactaaac tagcagaaca atatgaatct tttgtgaaat tcacacatga tcagattatg 540

cgacgatatg ggacaaggcc aacaagctat gtatcc 576

<210>4

<211>192

<212>PRT

<213>牛(boyine)

<400>4

Met Ala Cys Gly Ala Thr Leu Lys Arg Pro Met Glu Phe Glu Ala Ala

1 5 10 15

Leu Leu Ser Pro Gly Ser Pro Lys Arg Arg Arg Cys Ala Pro Leu Ser

20 25 30

Gly Pro Thr Pro Gly Leu Arg Pro Pro Asp Ala Glu Pro Pro Pro Leu

35 40 45

Leu Gln Thr Gln Ile Pro Pro Pro Thr Leu Gln Gln Pro Ala Pro Pro

50 55 60

Gly Ser Asp Arg Arg Leu Pro Thr Pro Glu Gln Ile Phe Gln Asn Ile

65 70 75 80

Lys Gln Glu Tyr Ser Arg Tyr Gln Arg Trp Arg His Leu Glu Val Val

85 90 95

Leu Asn Gln Ser Glu Ala Cys Thr Ser Glu Ser Gln Pro His Ser Ser

100 105 110

Thr Leu Thr Ala Pro Ser Ser Pro Gly Ser Ser Trp Met Lys Lys Asp

115 120 125

Gln Pro Thr Phc Thr Leu Arg Gln Val Gly Ile Ile Cys Glu Arg Leu

130 135 140

Leu Lys Asp Tyr Glu Asp Lys Ile Arg Glu Glu Tyr Glu Gln Ile Leu

145 150 155 160

Asn Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Glu Ser Phe Val Lys Phe Thr His

165 170 175

Asp Gln Ile Met Arg Arg Tyr Gly Thr Arg Pro Thr Ser Tyr Val Ser

180 185 190

<210>5

<211>2071

<212>DNA

<213>小鼠(mouse)

<400>5

ccacattcac tgtgcaagtc gtggggaaat acagatgaat aaaggcttcc ttgttattct 60

caaggaatgt atggttttga agcacagtta gacatatatt caaattacag cttcctcctt 120

taaaacacta atattccaag gcacactcaa tgttttaaag gatcacagag tgactaccaa 180

agcacgtagc aaaaccctac taagagaggt gtgtttaaaa tgactaccca agggacatac 240

ttttcaagtc ttctaatcgt tcactttgga tctgtttata ccacaagaaa acaatttact 300

tgatgctctt aggtcccctt aaaaaataac catcgtgaag tggcttttca tgtccttggc 360

ttttattgaa catagaaaca gccatgcaag cggtcttaaa ggctttatta catcattgtt 420

tcctaataaa gtcatgacag tctacctttg gaattaaagt gatacacaaa atgatggtct 480

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tttttcttta gccttcaaga agctcagaac tgaattttaa attcagtcat ttaccaccaa 600

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ctaaccccaa gtgtgttgaa gtactgtgac agccatcttg gcaattagaa atgagtatct 1020

aaaatttgga ctgttctaga aaaatctgtt acagagataa tgttaaagcc agattacagg 1080

aatcacagcc actaatatac aaataattac agaaaggctt tgaatgtgga ggtgttgttc 1140

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gtatcacttg gttagacagt ttaagccagt gagttttctg gtaggattgt tttttggttt 1440

tttttttttc cttttaatcc ttttttgcgt aacacatatc catttagtga tccgatta8t 1500

ggccgggtca tctatcccca aaatacattc atttgtaaca cacctcccct tccaattttg 1560

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ccagaccggc ctacttcttc cgcagggggc gccatgggcc gagcccaggc tcgcgggcct 1920

cccggatcgg cccttttccg acttcttccc ctctgccggg cggtggcgca cgcccgtgac 1980

gtcacaggag gcggggccag cgcggctgcc gggtgccgga ggcgccattg gagccggctt 2040

ggcttgggag ccgtagctga agagttggat c 2071

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>PCR引物

<400>6

caccatggcg tgcggggcga cactg 25

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>PCR引物

<400>7

ggatacatag cttgttggcc t 21

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>PCR引物

<400>8

tgaagcggcc catggagttc 20

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>PCR引物

<400>9

ggtgggctgg tccttcttca tc 22

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>PCR引物

<400>10

agatctgatc caactcttca gctac 25

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>PCR引物

<400>11

gctagcccac attcactgtg caag 24

Claims

1.含有选自SEQ ID No.2或者SEQ ID No.4的序列的多肽。

2.编码权利要求1所述多肽的多核苷酸。

3.权利要求2所述的多核苷酸，其选自SEQ ID No.1或者SEQ ID No.3。

4.含有选自下列的核苷酸序列的多核苷酸：

a)SEQ ID No：1或SEQ ID No：3的互补序列，

b)SEQ ID No：1或SEQ ID No：3的反向互补序列，和

c)SEQ ID No：1或SEQ ID No：3的反向序列。

5.多核苷酸，其包含由于沉默取代或导致所产生氨基酸中保守取代的取代而与SEQ ID No：1或3不同的核苷酸序列。

6.权利要求4或5的多核苷酸编码的多肽。

7.含有至少一种权利要求1或权利要求6所述多肽或其片段的融合蛋白。

8.含有权利要求2至5中任意一个所述多核苷酸的载体。

9.一种载体，以5’-3’方向含有：

a)基因启动子序列；

b)权利要求2至5任意一个所述的多核苷酸序列；以及

c)基因终止序列。

10.权利要求8或者权利要求9所述的载体，其中多核苷酸为有义方向。

11.权利要求8或者权利要求9所述的载体，其中多核苷酸为反义方向。

12.含有权利要求8至11中任一项所述载体的宿主细胞。

13.用于调节肌肉生长的组合物，含有下述任一：

a)含有SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的多核苷酸，

b)(a)的片段或变体，

c)与(a)有至少95％，90％或70％序列同一性的多核苷酸，

d)(a)至(c)中任意一个的互补序列，

e)(a)至(c)中任意一个的反向互补序列，

f)(a)至(c)中任意一个的反义多核苷酸，

g)(a)至(c)中任意一个所编码的多肽，

h)含有SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽，

i)(g)或(h)的片段或变体，和

j)相对(g)或(h)有至少95％，90％或70％序列同一性的多肽。

14.调节肌肉生长的组合物，含有下述任意一种：

a)SEQ ID No.5的序列，

b)与SEQ ID No.5有至少95％，90％或70％序列同一性的多核苷酸，和

c)(a)或(b)的片段或变体。

15.调节mighty基因表达的组合物，含有能够结合至选自下述任意一种的多核苷酸的化合物：

a)SEQ ID No.1，SEQ ID No.3，或SEQ ID No.5，

b)编码SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽的多核苷酸，

c)与(a)或(b)有至少95％，90％或70％序列同一性的多核苷酸，

d)(a)至(c)中任意一种的互补序列，

e)(a)至(c)中任意一种的反向互补序列，和

f)(a)至(c)中任意一种的片段或变体。

16.按照权利要求15的组合物，其中化合物为反义多核苷酸。

17.按照权利要求15或者权利要求16的组合物，其中化合物为干扰RNA分子。

18.按照权利要求17的组合物，其中干扰RNA分子为RNAi或siRNA分子。

19.按照权利要求15的组合物，其中化合物为肌肉抑制素。

20.按照权利要求15的组合物，其中化合物为肌肉抑制素类似物。

21.按照权利要求20的组合物，其中肌肉抑制素类似物为C-末端在氨基酸位置330和350或者在它们之间被截断的肌肉抑制素肽。

22.按照权利要求20或者权利要求21的组合物，其中肌肉抑制素类似物为C-末端在氨基酸位置330、335和350中的任一位置被截断的肌肉抑制素肽。

23.按照权利要求15的组合物，其中化合物为抗体。

24.按照权利要求13至23中任一的组合物，用于治疗或预防与肌肉生长相关的疾病。

25.按照权利要求24的组合物，其中疾病与肌肉萎缩相关。

26.按照权利要求24或权利要求25的组合物，其中疾病选自肌营养不良、肌肉恶病、萎缩、肥大、与癌症或HIV有关的肌肉萎缩、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，或者与心肌生长相关的疾病，包括梗塞。

27.按照权利要求13至23中任意一种的组合物，用于在肌肉损伤后促进肌肉再生。

28.调节生物体肌肉生长的方法，包括给药至所述生物体权利要求13至权利要求23中任一项所述的组合物。

29.按照权利要求28的方法，用于生产具有增加的肌肉重量的动物

30.按照权利要求28的方法，用于与肌肉增长相关的疾病的治疗或预防。

31.按照权利要求30的方法，其中疾病与肌肉萎缩相关。

32.按照权利要求30或31的方法，其中疾病选自肌营养不良、肌肉恶病、萎缩、肥大、与癌症或HIV有关的肌肉萎缩、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，或者与心肌增长相关的疾病，包括梗塞。

33.按照权利要求28的方法，用于在肌肉损伤后促进肌肉再生。

34.按照权利要求13至23中任意一种的组合物在制备调节肌肉生长的药物中的应用。

35.按照权利要求13至23中任一种的组合物在制备用于治疗或预防与肌肉生长相关的疾病的药物中的应用。

36.按照权利要求35的应用，其中疾病与肌肉萎缩相关。

37.按照权利要求35或权利要求36的应用，其中疾病选自肌营养不良、肌肉恶病、萎缩、肥大、与癌症或HIV有关的肌肉萎缩、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，或者与心肌增长相关的疾病，包括梗塞。

38.按照权利要求13至23中任一种的组合物在制备用于在肌肉损伤后促进肌肉再生的药物中的应用。

39.转基因动物，其含有按照权利要求8至11任一种的载体，或者含有按照权利要求13至18中任一种的组合物。

40.按照权利要求39的转基因动物，其中所述动物具有增加的肌肉重量。

41.按照权利要求39或权利要求40的转基因动物，选自羊、母牛、公牛、鹿、家禽、火鸡、猪、马、小鼠、大鼠或人类。

42.预测动物肌肉重量的方法，包括步骤：

i)从动物中获取样本，

iv)测定具有序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的多核苷酸、与SEQ IDNo.1或SEQ ID No.3有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸、或其片段或变体的基因表达水平；或测定具有序列SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽、与SEQ ID No.2或SEQ ID No.4有至少95％、90％或70％序列同一性的多肽、或其片段或变体的数量。

v)将基因表达水平或多肽的量与平均值进行比较；和

vi)预测所述动物的肌肉重量。

43.按照权利要求2的方法，其中用RTPCR或者northern分析测定基因表达的水平。

44.按照权利要求43的方法，其中用ELISA或者蛋白质印迹分析测定多肽的量。

45.检测mighty的变体的方法，包括使用选自下列的核苷酸序列：

a)SEQ ID No.1，SEQ ID No.3，或SEQ ID No.5，

b)编码SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽的多核苷酸，

c)与(a)或(b)有至少95％，90％或70％序列同一性的多核苷酸，

d)(a)至(c)中任意一种的互补序列，

e)(a)至(c)中任意一种的反向互补序列，和

f)(a)至(c)中任意一种的片段或变体，

在从生物体获得的样品中筛选mighty的变体。

46.按照权利要求45的方法，其中变体具有多态性。

47.按照权利要求46的方法，其中多态性为单核苷酸多态性。

48.按照权利要求45至47的任意一种的方法，其中mighty的变体与改变的肌肉表型相关。

49.繁殖具有增长的肌肉重量的动物的方法，包括步骤：

i)选择采用按照权利要求42至44或48的任意一种方法预测肌肉重量有所增加的一种或多种动物，和

ii)繁殖该一个或多个被预测具有增加的肌肉重量的动物以产生具有改善的肌肉重量的动物。

50.按照权利要求49的方法，其中动物选自羊、母牛、公牛、鹿、家禽、火鸡、猪、马、小鼠、大鼠或人类。

51.优先结合具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4的序列的多肽或者与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4有至少95％、90％或70％序列同一性的多肽的抗体。

52.含有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4的序列的多肽的抗原性片段，其用于制备优先结合SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4序列或者与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4有至少95％、90％或70％序列同一性的多肽的抗体。

53.分离的多核苷酸，包含如下任一：

a)SEQ ID No：5的序列，

b)与SEQ ID No.5具有95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸，

c)其具有启动子活性的片段或变体。

55.按照权利要求54的分离的核苷酸，包含mighty起始位点上游至少200个核苷酸。

56.按照权利要求54或权利要求55的分离的多核苷酸，包含mighty起始位点上游209，287，315，400，600，1000和2100个核苷酸中任一片段。

57.含有按照权利要求54至56中任一种的多核苷酸的载体。

58.含有按照权利要求57的载体的宿主细胞。

59.筛选一种或多种在抑制或促进肌肉生长中潜在有效的化合物的方法，包括步骤：

i)插入按照权利要求54至56中任一种的多核苷酸至连接有合适标记基因的合适的载体中，

ii)用载体转化合适的宿主细胞，

iii)对该宿主细胞施用感兴趣的化合物，和

iv)测定标记基因表达水平的任何差异。

60.按照权利要求59的方法，其中载体为原核质粒、真核质粒或病毒载体中的任意一种。

61.按照权利要求59或权利要求60的方法，其中标记基因为编码绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶，或者β半乳糖苷酶中任意一种的任一多核苷酸。

62.在肌细胞中表达预期的蛋白的方法，包括步骤：

i)分离编码要表达的基因的多核苷酸序列；

ii)插入按照权利要求54至56中任意一种的多核苷酸到合适的载体，其以5-3的方向可操作地与要表达的蛋白的多核苷酸序列连接，和

iii)将载体导入肌肉宿主细胞。

63.按照权利要求62的方法，其中载体为真核载体、病毒载体，或者适用于基因治疗的任意载体中的任意一种。

64.按照权利要求62或权利要求63的方法，其中宿主细胞为原代成肌细胞系、转化的成肌细胞系或mighty启动子在其中有活性的任何细胞系。

65.按照权利要求62或权利要求63的方法，其中宿主细胞为宿主动物的体内骨骼肌或心肌细胞。

66.按照权利要求65的方法，其中宿主动物为羊、母牛、公牛、鹿、家禽、火鸡、猪、马、小鼠、大鼠或人中的任意一种。