CN102321669A - 一种促进动物生长的新型shRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进动物生长的新型shRNA慢病毒干扰载体LV-shRNA-86C，其基因序列包含序列Sequnence NO.3。本发明针对绵羊MSTN基因的核苷酸序列设计合成多条shRNA单链寡核苷酸，构建了shRNA表达载体，通过功能性筛选实验，得到了抑制效果较强的pENTR/U6-86-C，包含基因序列Sequnence NO.3，进一步将基因序列Sequnence NO.3构建到shRNA慢病毒干扰载体。本发明还公开了上述新型shRNA的应用。

Description

一种促进动物生长的新型shRNA及其应用

技术领域

本发明涉及一种新型shRNA的构建。具体而言，本发明针对绵羊肌肉生长抑制素基因MSTN的核苷酸序列设计合成shRNA单链寡核苷酸，构建了shRNA慢病毒干扰载体，得到了具有良好应用前景的新型shRNA。

背景技术

肌肉是动物胴体的重要组成部分，是畜牧生产中的重要经济性状之一。为此，科学界在对增加肌肉量、提高肌肉品质等方面的探索从未停止过。首先被用来生产转基因动物的是生长激素(GH)基因，其次还有生长激素调节轴上的相关基因，比如生长激素释放因子(GRF)基因和类胰岛素生长因子(IGF-1)基因等。总体上说，这类激素基因能够刺激动物生长，增加瘦肉量和提高饲料转化率，但会引起各种副作用，也没有产生理想的表型性状。

1997年美国霍普金斯大学的Mcpherron等[McPherron，A.C.，Lawler，A.M.&Lee，S.J.Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamilymember.Nature 1997；387，83-90]利用简并引物在小鼠身上偶然发现了myostatin基因，经蛋白质同源分析和核酸序列比对，证明其属于TGF-β(transforminggrowthfactorβ)超家族成员，故又称GDF-8(growth differentiation factor 8)。该家族成员在调节胚胎发育和维持组织稳态及调控骨骼肌生长发育方面均发挥着重要的作用，另外通过对非双肌牛myostatin基因的分析表明，该基因的突变是造成双肌现象的重要的原因之一。2001年，由Michel Georges领导的研究小组，历经十余年的研究发现比利时蓝牛(Belginm Blue)的双肌性状是由于肌肉生长抑制素基因突变造成的[Hughes SM.Running without regulators.Nature，1992，360：536-537.]。与此同时，由美国农业部的Tim Smith领导的研究小组和由霍普金斯大学的Sejin Lee领导的研究小组也发现比利时蓝牛及皮尔蒙特牛(Piedmontese)的双肌性状是肌肉生长抑制素基因突变造成的[Jeanplong F，Sharma M，SomersW G，et a.l Genomic organization and neonatal expression of the bovine myostatingene.Molecular and Cellular Biochemistry，2001，200：31-37.]。通过基因敲除，反义核酸及体内表达肌肉生长抑制素基因拮抗因子的实验，证明肌肉生长抑制素基因是限制肌肉超常发育的负调控基因。MSTN的活性降低或丧失，使得肌肉与其他组织的比例大大提高，因此在畜牧生产上有良好的应用前景。这在脂肪比例较大的家畜中应用潜力很大。

1998年Fire等发现双链短RNA(dsRNA)序列与靶基因外显子互补时，基因的表达受到抑制，而与启动子和内含子互补时不能引起基因沉默，于是将这种由dsRNA基因沉默现象称为RNAi。RNAi的作用多是在转录后的水平实现其基因“剔除”效应的。具体的过程可以分为三个阶段：①起始阶段：外源性的dsRNA进入细胞后在Dicer酶的作用下被剪切成21-23nt且带有3’端单链尾巴及磷酸化5’端的siRNA。②效应阶段：siRNA解链成单链与Dicer结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex，RISC)，活化的RISC在siRNA引导下通过碱基互补配对与靶mRNA结合，接着内切核酸酶将mRNA切割成21-23nt的片段，特异性的抑制靶基因的表达。③扩增阶段：在RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRPs)的作用下，以siRNA为引物，mRNA为模版，合成更多的dsRNA，进一步放大这种特定的降解靶mRNA的作用，使基因表达持续受到抑制。siRNA还可以在RNA依赖的RNA聚合酶的作用下大量扩增并转运出细胞，使RNAi扩散到整个机体并传代。

RNAi是21-23个核苷酸的小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)诱导细胞同源基因mRNA降解、从而特异性抑制基因表达的过程。其作为一项可以高效、特异地降解靶基因mRNA的实验技术已被广泛应用于基因功能的研究[Arziman Z，Horn T，Boutros M.E-RNAi：a web application to design optimizedRNAi constructs.Nucleic Acids Res 2005；33：W582-W588]。

shRNA即小发卡或短发卡RNA(a small hairpin RNA or short hairpin RNA，shRNA)是一段具有紧密发卡环(tight hairpin turn)的RNA序列，常被用于RNA干扰沉默靶基因的表达。利用载体把shRNA导入细胞，载体中的U6启动子确保shRNA总是表达，这种装载了shRNA载体可被传递到子代细胞中去，从而使基因的沉默可被遗传。shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA，然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上(RNA-induced silencing complex，RISC)，该复合物能够结合到目的mRNAs并将其降解。

慢病毒(Leniivirus)载体是以HIV-I(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。它的转染效率高，可使目的基因持续、稳定地表达，被较早的应用于转基因动物的制备技术中。Michael等[Michael J，Fiona M，Simon G，et al.Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors.EMBOreports，2004；5：728-733]将报告基因LacZ及GFP同时构建到慢病毒载体Pony-GFP-Lacz，并注射到新生鸡蛋的囊胚腔中，在子一代、子二代各组织中均检测到目的基因的表达。慢病毒载体也可与精子介导基因转移(SMGT)技术相结合，将携带外源基因的重组载体注射曲细精管感染动物的精原干细胞，使外源DNA整合到动物精原干细胞上，通过自然受精产生转基因动物。慢病毒载体通过结合RNA干扰(RNAi)等有效的技术手段对许多遗传性疾病及肿瘤的基因治疗都已取得了很大的进步。

为促进动物生长、提高瘦肉率和高瘦肉率的优良性状得到稳定遗传，本发明构建了针对绵羊MSTN基因的shRNA慢病毒载体，利用shRNA慢病毒载体制备相应的慢病毒，并转入绵羊的基因组，获得了MSTN低表达的转基因绵羊，为培育高瘦肉率的绵羊新品种奠定了基础。

发明内容

本发明根据GenBank数据库中绵羊MSTN基因的mRNA序列，设计了4条针对MSTN基因的shRNA oligo，其序列为Sequnence NO.1、Sequnence NO.2、Sequnence NO.3、Sequnence NO.4另外还设计了阴性对照。并将干扰效果最好的包含Sequnence NO.3的干扰序列克隆到慢病毒干扰载体上，得到慢病毒干扰载体LV-shRNA-86C。

本发明将设计的4条MSTN基因的shRNA，克隆到shRNA干扰载体pENTR/U6上，得到4个干扰质粒分别为：pENTR/U6-86-A，pENTR/U6-86-B，pENTR/U6-86-C，pENTR/U6-86-D。其中pENTR/U6-86-A包含序列SequnenceNO.1，pENTR/U6-86-B包含序列Sequnence NO.2，pENTR/U6-86-C包含序列Sequnence NO.3，pENTR/U6-86-D包含序列Sequnence NO.4。

本发明全合成了MSTN基因并构建了所述基因的高表达载体pcDNA3.1-MSTN。

本发明将上述的4个MSTN基因的shRNA干扰质粒与MSTN高表达载体共转染HEK293细胞。48小时收集样品，通过qPCR的方法检测干扰载体对靶基因的干扰效果。结果显示上述构建的pENTR/U6-86-C干扰质粒的干扰效果最好，其对MSTN基因的沉默效率达60.13％。

本发明将干扰效果最好的pENTR/U6-86-C干扰质粒，用Eag I酶切，纯化酶切产物，再经BP重组和LR重组得到包含Sequnence NO.3的慢病毒干扰载体LV-shRNA-86C。

本发明将上述慢病毒干扰载体LV-shRNA-86C转染HEK293细胞，制备病毒原液并且滴定所得病毒的滴度。包装所得的携带MSTN-shRNA的慢病毒滴度达8.8×10⁹TU/ml。

将所述shRNA慢病毒干扰表达载体LV-shRNA-86C与脂质体和台酚蓝混合，制备成转染液。然后采用微创手术，将上述转染液分多点注射入绵羊两侧的睾丸中。采集处理后公羊的精液，对母羊进行人工授精，得到MSTN基因低表达的转基因绵羊。

附图说明

图1内参基因扩增曲线。共转染干扰质粒和高表达MSTN基因质粒的HEK293细胞其内参基因的扩增情况。

图2内参基因溶解曲线。共转染干扰质粒和高表达MSTN基因质粒的HEK293细胞其内参基因的检测引物的溶解曲线。

图3MSTN基因扩增曲线。共转染干扰质粒和高表达MSTN基因质粒的HEK293细胞其MSTN基因的扩增情况，包含所有的样品：转染干扰质粒、对照质粒和空白对照。

图4MSTN基因溶解曲线。共转染干扰质粒和高表达MSTN基因质粒的HEK293细胞其MSTN基因检测引物的溶解曲线，其只有一个峰，证明该对引物扩增特异性很好。

图5各shRNA干扰质粒对MSTN基因的沉默效率。NC：阴性对照shRNA干扰载体与MSTN高表达载体共转染HEK293细胞，干扰载体对MSTN基因的沉默效率。A、B、C、D组的shRNA干扰载体依次为pENTR/U6-86-A，pENTR/U6-86-B，pENTR/U6-86-C，pENTR/U6-86-D，其它条件与阴性对照组相同。

图6慢病毒干扰质粒病毒包装后24h细胞情况(A：荧光视野；B：可见光视野)。

图7病毒浓缩液稀释10³转染HEK293细胞，96小时后HEK293细胞荧光表达情况(荧光视野)。

图8病毒浓缩液稀释10⁴转染HEK293细胞，96小时后HEK293细胞荧光表达情况(荧光视野)。

图9病毒浓缩液稀释10⁵转染HEK293细胞，96小时后HEK293细胞荧光表达情况(荧光视野)。

图10病毒浓缩液稀释10⁶转染HEK293细胞，96小时后HEK293细胞荧光表达情况(荧光视野)。

图11病毒浓缩液稀释10⁷转染HEK293细胞，96小时后HEK293细胞荧光表达情况(荧光视野)。

实施例1 慢病毒干扰载体的构建

一材料和方法

1、材料

DH5alpha感受态细胞购于TaKaRa公司；pDONR221、pLenti6.3/V5-DEST、包装质粒、pCDNA3.1(+)载体，购于Invitrogen公司。

HEK293细胞、293FT细胞，购于北京协和医院；DMEM、0.05％Trypsin，购于Gibco公司；胎牛血清购于hyclone公司；OptiMEM培养液购于Invitrogen公司。

T4DNA ligase(1U/μl)购于Invitrogen公司；EcoR I、Xho I、Ligase、EagI，购于NEB公司；lipofectamine 2000、Trizol、LR clonase II，购于Invitrogen公司。

2、方法

2.1、构建shRNA

检索GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide)：获取sheepmyostatin基因的cDNA序列，根据ambion的shRNA设计系统，针对靶基因设计并合成4条shRNA oligo，其序列为Sequnence NO.1、Sequnence NO.2、Sequnence NO.3、Sequnence NO.4，设计的基因序列由ambion公司完成。

2.2、MSTN基因全合成及高表达载体构建

1)序列QC：对所需合成的全序列进行分析，检查基因内部有无特别复杂二级结构和重复序列；

2)根据基因序列分析的结果，进行单链oligo的设计及合成；

3)利用PCR将合成的oligo拼接成完整的基因；

4)将合成好的序列装入pMD-18T载体并转化至感受态细胞DH5α；

5)测序验证重组克隆中基因序列是否与要求相符；

6)将测序正确的全长片段和载体pCDNA3.1(+)用XhoI和EcoRI酶切，酶切后琼脂糖电泳回收MSTN基因和目的载体pCDNA3.1(+)，将上述两片段连接并转化到感受态细胞DH5α中；

7)挑单克隆于2YT培养基中培养，提取质粒测序验证重组克隆中目的基因片段的序列信息。

2.3、干扰载体的筛选

1)干扰质粒和MSTN基因高表达载体的制备

a)接种干扰质粒和高表达载体菌液至5ml LB培养液中，37度摇床(220rpm)过夜；

b)用HQ高纯度质粒抽提试剂盒制备提取干扰质粒和MSTN基因高表达载体。

2)干扰载体和MSTN基因高表达载体瞬时共转染靶细胞

a)将状态良好，处于对数生长期的细胞用0.25％胰酶消化，用完全培养基悬浮成单细胞悬液，细胞计数后，按照每孔5×105个细胞接种于六孔板的每个孔中；

b)培养过夜，观察细胞生长状态。在细胞覆盖率80％左右时，进行转染实验；

c)用无血清Opti-MEM轻洗细胞两次，加入1.5ml Opti-MEM；

d)分别用250μl Opti-MEM稀释3ug干扰质粒MR085-1、MR085-2、MR085-3、MR085-4以及阴性对照质粒shRNA013，轻轻混匀，加入1ug的高表达载体pcDNA3.1-Ovis aries MSTN；

e)用250μl Opti-MEM稀释10μl lipofectamine 2000试剂，轻轻混匀，室温孵育5min；

f)轻轻混合已稀释质粒和lipofectamine 2000稀释液，室温放置20分钟；

g)将每管500μl脂质体-质粒复合物慢慢加入到各细胞孔中，轻轻混匀；在37℃，5％的CO2的培养箱中培养4～6小时后，换上完全培养液(不含抗生素)，放置在37℃，5％的CO2的培养箱中继续培养过夜；

h)第二天观察是否有荧光表达。

3)通过qPCR方法检测干扰载体对靶基因的干扰效果

A.细胞样品总RNA的提取

a)1.1时转染48小时后，轻轻吸净培养液，用PBS轻洗两遍，每孔细胞样品中各加入1ml Trizol液，用枪头吹吸混匀，尽量让细胞全部裂解，室温放置5分钟；.

b)1.2中各加入0.2ml氯仿，盖紧离心管，反复颠倒混匀15秒，12000g，4℃离心10分钟；

c)1.3上层水相于一新的离心管中，每管中各加0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温放置10分钟，12000g，4℃离心10分钟；

d)1.4去上清液，每管中加入1ml的75％的酒精轻轻洗涤沉淀，12000g，4℃离心10分钟；

e)1.5心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，55℃-60℃水溶10分钟。

B.反转录cDNA

a)灭菌的无RNA酶的eppendorf管，每个样本加入如下组分得到Mix1：

b)Mix1 65℃水浴5分钟后，立即放置冰上2分钟；

c)下组分加入到Mix1中，得到Mix2共20μl体系：

d)50℃水浴50分钟后，85℃水浴5分钟，立即放置到冰上2分钟；

e)2.5每管Mix 2中加入1μl的RNase H，37℃处理20分钟，所得到的cDNA保存在-20℃备用。

C.qPCR检测目的基因的表达情况

通过qPCR检测细胞样品中目的基因和内参基因的表达量，根据qPCR反应曲线得到各样品目的基因和内参基因的Ct值(threshold cycle number.域值循环数)，采用ΔΔCt的方法进行相对定量。使用转染阴性干扰载体的样品作为对照样品，比较各瞬时转染干扰载体组样品目的基因的表达，并计算干扰效果。

ΔΔct＝(待测样品的目的基因的ct平均值--待测样本的内参基因的ct的平均)-(对照样品的目的基因的ct的平均值-对照样本的看家基因的ct的平均值)

基因的表达量F＝2^-ΔΔct，目标基因的沉默效率为1-2^-ΔΔct

a)目的基因的检测用引物序列见Sequnence NO.5、Sequnence NO.6。

b)PCR体系中各组分的体积：

c)PCR反应条件：

4.干扰效果最佳的载体构建为慢病毒干扰载体

用Eag I将筛选出的干扰质粒pENTR/U6-86-C酶切，纯化酶切产物，最终溶于15μl elution Buffer中，经过2次重组反应-BP重组和LR重组后，取5μl重组反应液转化100μl的stbl3感受态细胞，细胞涂布于含有100ug/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，从平板挑取单克隆接种于4ml含100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养。提取质粒。质粒测序验证(Invitrogen)。

5.慢病毒的包装和病毒滴度的测定

1)慢病毒包装

a)取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6x10⁶个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO₂的培养箱中培养过夜；

b)第二天转染前移去培养液，换5ml Opti-MEM培养液；

c)取9ug Packaging Mix(Invitrogen)和3ug慢病毒表达质粒加入1.5mlOpti-MEM(经37℃预热)中，轻轻混匀；

d)取36μl lipofectamine2000加入1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5min；

e)轻轻混合质粒溶液(3)和lipofectamine 2000稀释液(4)，置室温20min；

f)将3ml质粒脂质体复合物(5)小心地加入到细胞培养皿中，轻轻混匀，37℃，5％CO2的培养箱中孵育6个小时后，更换完全培养液DMEM+10％FBS；

g)48h后收集细胞培养上清，3000rpm离心10min，去除细胞和碎片，并用0.45um的滤器过滤；

h)将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于500μl DMEM培养液中，分装小管，放置于-80℃保存备用。并留少量慢病毒测定物理滴度和活性滴度

2)慢病毒液滴度测定

将HEK293细胞培养至对数生长期，病毒稀释用培养液为含8ug/mlpolybrene和2％FBS的细胞培养基。

a)第一天，细胞胰酶消化计数后，按照每孔8000细胞接种96孔板，37度培养过夜，感染时细胞长至30-50％的融合密度；

b)第二天，当天转染时，将保存于-80度冰箱中病毒液冰水浴融化，用含有8ug/ml polybrene和2％FBS的细胞培养液进行梯度稀释：

1号稀释液  25μl病毒液+225μl病毒稀释用培养基，

2号稀释液  25μl 1号稀释液+225μl病毒稀释用培养基，

3号稀释液  25μl 2号稀释液+225μl病毒稀释用培养基，

4号稀释液  25μl 3号稀释液+225μl病毒稀释用培养基，

5号稀释液  25ul 4号稀释液+225ul病毒稀释用培养基，

小心吸去96孔板中的培养基，轻轻混匀各管慢病毒稀释液，各取100ul加入每孔细胞中，每个稀释度两个复孔，放入37度的细胞培养箱中过夜培养；

c)第三天，去除含慢病毒的培养基，加入100ul的完全培养基；

d)第5、6天，在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量，病毒滴度为表达荧光的细胞数乘以相应稀释倍数。

二结果

1.干扰载体的构建

针对靶基因构建的四个干扰质粒分别为：pENTR/U6-86-A，pENTR/U6-86-B，pENTR/U6-86-C，pENTR/U6-86-D。其中pENTR/U6-86-A包含序列SequnenceNO.1，pENTR/U6-86-B包含序列Sequnence NO.2，pENTR/U6-86-C包含序列Sequnence NO.3，pENTR/U6-86-D包含序列Sequnence NO.4。测序结果显示与设计的基因序列完全一致。

2.MSTN全基因合成及高表达载体构建

对所需合成的全序列进行分析，设计及合成单链oligo，利用PCR将合成的oligo拼接成完整的基因，然后装入pMD-18T载体并转化至感受态细胞DH5α，测序结果显示重组克隆中插入片段序列与MSTN基因序列完全一致。MSTN高表达载体pCDNA3.1(+)-MSTN测序结果显示，MSTN基因序列完全正确。

3.干扰载体在HEK293细胞中的干扰评价

干扰载体和高表达干扰序列的载体共转染HEK293细胞，瞬时转染48h后收集样品qPCR检测目的基因的表达情况，shRNA-86C对于目的基因的Knockdown效果最佳，干扰效率为60.13％。

1)内参定量结果见表1

表1 内参定量结果

2)内参扩增曲线、熔解曲线、目的基因扩增曲线和熔解曲线分别见图1、图2、图3和图4。

3)目的基因定量结果

以shRNA013作为阴性对照，基因定量结果见表2

表2 目的基因定量结果

由上表结果可知，shRNA-86C组干扰效果较好，基因沉默效率为60.13％，各组shRNA干扰载体对MSTN基因的沉默效率见图5。

4.干扰效果最佳的质粒载体转为慢病毒载体

用Eag I将筛选出的干扰质粒pENTR/U6-86-C酶切，酶切后，经BP重组和LR重组、转化，提取质粒。质粒测序验证序列比对完全正确，慢病毒载体构建成功。

5 慢病毒的包装和滴度的测定

1)慢病毒包装

转染24小时后，进行慢病毒包装。在荧光显微镜下同一视野的荧光(图6A)和可见光照片(图6B)。

2)慢病毒原液滴度测定

将HEK293细胞培养至对数生长期，按照每孔8000细胞接种96孔板，细胞长至30％-50％的融合密度时进行感染。第3天，去除含慢病毒的培养基，加入100μl的完全培养基，第5、6天，在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量，病毒滴度为表达荧光的细胞数乘以相应稀释倍数。七号孔的稀释度为10^-7，七号孔中观察到表达绿色荧光的细胞分别为90个和86个，则病毒的滴度为：8.8×10⁹TU/ml。

感染细胞后96小时各孔的荧光照片如图7、图8、图9、图10、图11。

实施例2 慢病毒干扰载体在培育绵羊新品种中的应用

将所述MSTN基因shRNA慢病毒干扰表达载体LV-shRNA-86C包装表达的慢病毒与台酚蓝混合，制备成转染液。然后采用微创手术，将其注射到公羊睾丸的曲细精管部位和附睾尾中，注射时采用多点注射，使慢病毒液均匀分布于睾丸的生精组织中，还要注意注射的深度，不能过深也不能过浅。注射完毕后，再次对公羊的睾丸用碘酊擦拭，出血严重的部位进行按压止血。采集处理后公羊的精液，对母羊进行人工授精。

对出生后4～5月龄的小羊采集肌肉进行检测，每个肌肉样品中加入RNAlater，以防止RNA的降解。提取肌肉的RNA，通过定量PCR技术检测MSTN基因的表达量，初步实验结果表明转基因绵羊MSTN基因的表达显著低于非转基因绵羊，结果见表3。

表3 MSTN基因表达检测

Claims (4)

1.一种促进动物生长的新型shRNA干扰载体LV-shRNA-86C，其特征在于，所述载体包含基因序列Sequnence NO.3。

2.根据权利要求1所述的促进动物生长的新型shRNA干扰载体，其特征在于，所述载体可以制备包含基因序列Sequnence NO.3的慢病毒。

3.根据权利要求1所述的促进动物生长的新型shRNA干扰载体，其特征在于，所述载体可以降低绵羊组织细胞MSTN基因mRNA的水平。

4.根据权利要求1所述的促进动物生长的新型shRNA干扰载体，其特征在于，所述载体可以应用于培养生长快、瘦肉率高的绵羊新品种。

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