CN104946654A - 抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列及其应用，所述shRNA序列选自下列核苷酸序列中的一种：(1)如SEQ ID NO.1-2所示的DNA序列；(2)如SEQ ID NO.3-4所示的DNA序列；(3)如SEQ ID NO.5-6所示的DNA序列。所述shRNA序列用于促进鸭成肌细胞的增殖。本发明首次报道了抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列。上述三种抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列均可明显抑制鸭成肌细胞中MSTN基因在mRNA水平的表达，并且，通过抑制鸭成肌细胞中MSTN的表达促进了鸭成肌细胞的增殖，上调生肌调节因子Myf5基因的表达，下调生肌调节因子MyoD1基因的表达。本发明的鸭MSTN基因的三种shRNA序列均能有效抑制鸭成肌细胞中MSTN基因的表达，在基因水平的抑制效率分别达到了61.6％、79.1％和76.9％。

Description

抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列及其应用。

背景技术

肌肉生长抑制素(Myostain，MSTN)，又称生长因子-8(GDF-8)，属转化生长因子-(TGF-)超家族，发现于1997年，是一种骨骼肌生长发育的负调控因子。其活性的丧失或降低会引起肌肉的过度增长，导致双肌性状。鸭MSTN基因含有375个氨基酸，其功能和表达量的变化可能会通过调节生肌因子(MRF)等基因的表达而调节肌肉的生长发育。该基因的表达抑制有助于研究该基因的功能。

RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的，由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的，同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)是可以克隆到表达载体并表达短的干扰RNA(siRNA，19-21个核苷酸的RNA双链)的DNA分子，包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，由polIII启动子控制，随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子。通过载体将“短干涉RNA”输送入细胞或活体组织中，被细胞机制切割成siRNA，由siRNA发挥作用达到沉默靶基因表达的作用。

目前，缺乏一种有效抑制鸭MSTN基因表达的shRNA的序列及其应用。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种抑制鸭MSTN基因表达的shRNA的序列及其应用。

本发明的一种抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列，所述shRNA序列选自下列核苷酸序列中的一种：

(1)如SEQ ID NO.1-2所示的DNA序列；

(2)如SEQ ID NO.3-4所示的DNA序列；

(3)如SEQ ID NO.5-6所示的DNA序列。

一种包含抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列的重组表达载体。

所述重组表达载体是基于PLL3.7载体构建的载体。

所述重组表达载体用于促进鸭成肌细胞的增殖。

所述shRNA序列用于促进鸭成肌细胞的增殖。

本发明的有益效果为：首次报道了抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列。上述三种抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列均可明显抑制鸭成肌细胞中MSTN基因在mRNA水平的表达，并且，通过抑制鸭成肌细胞中MSTN的表达促进了鸭成肌细胞的增殖，上调生肌调节因子Myf5基因的表达，下调生肌调节因子MyoD1基因的表达。本发明所述的鸭MSTN基因的三种shRNA序列均能有效抑制鸭成肌细胞中MSTN基因的表达，在基因水平的抑制效率分别达到了61.6％、79.1％和76.9％。

附图说明

图1是本发明抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列重组慢病毒侵染鸭成肌细胞的侵染效率照片；

图2是本发明shRNA序列重组慢病毒对鸭成肌细胞中MSTN基因表达的抑制效果图；

图3是本发明shRNA序列重组慢病毒影响鸭成肌细胞的增殖结果图；

图4是本发明shRNA序列重组慢病毒影响鸭成肌细胞中生肌因子表达结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细地解释说明。

实施例1

shRNA序列的设计和合成：

(1)通过GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)查询鸭MSTN基因的mRNA信息，根据shRNA设计原则，设计了针对鸭MSTN基因的MSTN-shRNA序列，同时设计了1条无关的对照shRNA序列，作为对照组(control)。上述设计完成的shRNA序列交由中美泰和生物技术有限公司合成。3条shRNA分别靶向鸭MSTN基因(EU336991.1)的318位点、767位点以及1096位点，长为21个碱基。

其中，本发明所涉及的MSTN-shRNA-318的作用位点序列为：

5’-GGAAGACGATGACTATCATGC-3’

MSTN-shRNA-767的作用位点序列为：

5’-GAGTTACAGACACACCGAAAC-3’

MSTN-shRNA-1096的作用位点序列为：

5’-GCCATGGTTGTAGATCGTTGC-3’

对照shRNA序列(Control-shRNA)为：

5’-GATGGATCGATAGGTAACGGAG-3’

针对上述3种shRNA及Control-shRNA的作用位点序列设计合成相应的shRNA正义链与反义链DNA序列：

MSTN-shRNA-318正义链：

5’-GGAAGACGATGACTATCATGCtcaagagGCATGATAGTCATCGTCTTCCTTTTTc-3’(SEQ ID NO.1)

MSTN-shRNA-318反义链：

5’-tcgagAAAAAGGAAGACGATGACTATCATGCctcttgaGCATGATAGTCATCGTCTTCC-3’(SEQ ID NO.2)

MSTN-shRNA-767正义链：

5’-GAGTTACAGACACACCGAAACtcaagagGTTTCGGTGTGTCTGTAACTCTTTTTc-3’(SEQ ID NO.3)

MSTN-shRNA-767反义链：

5’-tcgagAAAAAGAGTTACAGACACACCGAAACctcttgaGTTTCGGTGTGTCTGTAACTC-3’(SEQ ID NO.4)

MSTN-shRNA-1096正义链：

5’-GCCATGGTTGTAGATCGTTGCtcaagagGCAACGATCTACAACCATGGCTTTTTc-3’(SEQ ID NO.5)

MSTN-shRNA-1096反义链：

5’-tcgagAAAAAGCCATGGTTGTAGATCGTTGCctcttgaGCAACGATCTACAACCATGGC-3’(SEQ ID NO.6)

Control-shRNA正义链：

5’-GATGGATCGATAGGTAACGGAGcgaaCTCCGTTACCTATCGATCCATCTTTTTc-3’(SEQ ID NO.7)

Control-shRNA反义链：

5’-tcgagAAAAAGATGGATCGATAGGTAACGGAGttcgCTCCGTTACCTATCGATCCATC-3’(SEQ ID NO.8)

上述正义链模板的3’端添加了c，反义链模板的5’端均添加了tcgag，与XholI形成粘端互补。

(2)将等量的正义链(100μM，2μl)和反义链(100μM，2μl)DNA混合，加入10×shDNA Annealing Buffer(2μl)，再加双蒸水14μl，总体积20μl。在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95℃5min；72℃10min；放室温60min。退火处理后获得10μM的shRNA模板。取5μl模板加水95μl作为退火产物工作浓度用，工作浓度为500nM。

(3)将PLL3.7载体进行Hpal和Xhol双酶切，进行载体的线性化处理，酶切条件如下所述：取10μl的PLL3.7载体，1μl的HpalI内切酶、1μl的XholI内切酶、6μl的10×buffer，ddH₂O 42μl，总体积60μl，与37℃酶切3h，回收纯化后做连接反应。

(4)将线性化的PLL3.7载体3μl、经退火处理的shRNA模板2μl(500nM)，T4连接酶1μl、10×T4连接缓冲液1μl，双蒸水3μl，共10μl，混匀，于22℃连接过夜。取10μl连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，将细胞均匀涂布于含50μg/ml Ampicillin的LB培养基平板上，平板倒置于37℃培养箱中，培养16小时。从每块平板上分别挑取5个菌落，接种到含50μg/ml Ampicillin的LB培养基中，37℃培养16小时。使用碱裂解法提取质粒，所得质粒用Xhol进行单酶切鉴定，同时进行测序鉴定后大量制备重组质粒PLL3.7-MSTN-shRNA。

(5)将重组载体PLL3.7-MSTN-shRNA-318、PLL3.7-MSTN-shRNA-767、PLL3.7-MSTN-shRNA-1096和PLL3.7-Control-shRNA分别与含VSV-g的PMD2.G及含gag/pol的psPAX2包装质粒在生理盐水中混合，并加入转染试剂Fitran，孵化20min后缓慢均匀滴入含293T细胞的培养皿中。放置37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中过夜培养。转染4-6小时后换液，分别在转染48h和72h收集上清，3000rpm 4℃离心10min，取上清用0.45μm微孔滤器过滤。给慢病毒上清铺上20％蔗糖垫50000g超高速离心浓缩2h，用PBS重溶慢病毒颗粒。

实施例2

重组慢病毒感染鸭成肌细胞：

将上述3种shRNA重组慢病毒和Control-shRNA的慢病毒颗粒转染鸭原代成肌细胞，利用荧光显微镜技术检测不同shRNA的感染效率。

(1)实验分组：实验分PLL3.7-Control-shRNA对照组(Control)、PLL3.7-MSTN-shRNA-318感染组、PLL3.7-MSTN-shRNA-767感染组、PLL3.7-MSTN-shRNA-1096感染组，共4组，所有组的细胞数量和培养条件均相同。

(2)细胞感染实验方法：将鸭原代成肌细胞以1×10⁶细胞/孔接种于6孔板中，混匀后37℃、5％CO₂培养箱培养24h；24h后更换为无抗生素的培养基，取慢病毒原液以MOI＝10的比例加入慢病毒，同时加入终浓度为0.5μg/ml的聚凝胺(Polybrene)以促进慢病毒感染。于37℃、5％CO₂条件下培养6h，更换培养基，然后继续培养至96h。

(3)细胞感染的48h，采用荧光显微镜进行观察并拍照，同时采用明场观察总细胞并拍照。如图1所示，各组细胞在48h的感染效率达70％左右。以上说明含有所设计合成的三种shRNA及control-shRNA的慢病毒均能有效地感染鸭成肌细胞。

实施例3

重组慢病毒对鸭成肌细胞中MSTN基因表达的抑制作用：

采用real-time PCR检测三种shRNA对鸭成肌细胞中MSTN基因表达水平的影响。

(1)实验分组：实验分为对照组(PLL3.7-Control-shRNA)、PLL-3.7-MSTN-shRNA-318感染组、PLL-3.7-MSTN-shRNA-767感染组、PLL-3.7-MSTN-shRNA-1096感染组，共4组，所有组的细胞数量及培养条件均相同。

(2)RNA提取及real-time PCR检测：细胞感染96h后，采用TrizolA+裂解细胞，并采用氯仿-异丙醇法提取每组细胞的总RNA，并将所提取的mRNA逆转录为cDNA，逆转录条件为：37℃ 60min。取各组细胞的cDNA作为模板，以β-actin作为内参，采用Real-time PCR检测MSTN的基因表达。所用MSTN与β-actin的引物序列如下：

MSTN Forward Primer：5'-GCACTGGTATTTGGCAGAGTATT-3'(SEQID NO.9)

MSTN Reverse Primer：5'-TCACCTGGTCCTGGGAAAGT-3'(SEQ IDNO.10)

β-actin Forward Primer：5'-TGAGAGTAGCCCCTGAGGAGCAC-3'(SEQID NO.11)

β-actin Reverse Primer：5'-TAACACCATCACCAGACTCCATCAC-3'(SEQ ID NO.12)

Real-time PCR反应条件为：①95℃5min，变性；②95℃25s；60℃25s；72℃25s 40个cycle；③95℃25s；60℃25s；72℃25s收集溶解曲线。

如图2所示，三种shRNA序列均对鸭成肌细胞中MSTN的表达表现出抑制作用，分别为61.6％，79.1％和76.9％。

实施例4

PLL3.7-MSTN-shRNA抑制MSTN的表达对鸭成肌细胞增殖的影响：

采用酶标仪检测鸭成肌细胞不同时间的OD值，以衡量MSTN-shRNA抑制MSTN表达后对鸭成肌细胞增殖的影响，具体方法如下：

以2×10⁴/孔的细胞数接种于96孔板中，每组10个复孔，共铺6块板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。24h后分别将PLL3.7-MSTN-shRNA-138，PLL3.7-MSTN-shRNA-767和PLL3.7-MSTN-shRNA-1096和PLL3.7-Control-shRNA慢病毒感染每块板的鸭成肌细胞，分别于感染后的1d、2d、3d、4d、5d和6d采用酶标仪对细胞数量进行检测，结果如图3所示。从图中可以看出，与PLL3.7-Control-shRNA组相比，PLL3.7-MSTN-shRNA-138感染组细胞数在感染后3d和4d显著增加；PLL3.7-MSTN-shRNA-767感染组在感染后4d、5d和6d显著增加；PLL3.7-MSTN-shRNA-1096感染组在3d显著增加，4d和5d极显著增加。结果表明，三种PLL3.7-MSTN-shRNA慢病毒均能显著促进鸭成肌细胞的增殖。

实施例5

PLL3.7-MSTN-shRNA对鸭成肌细胞中生肌因子表达的影响：

采用Real-time PCR的方法检测PLL3.7-MSTN-shRNA抑制MSTN表达后对鸭成肌细胞中生肌因子表达的影响，具体方法如下：

(1)实验分组：实验分为对照组(PLL3.7-Control-shRNA)、PLL-3.7-MSTN-shRNA-318感染组、PLL-3.7-MSTN-shRNA-767感染组、PLL-3.7-MSTN-shRNA-1096感染组，共4组，所有组的细胞数量均为1×10⁶/孔，细胞接种于6孔板中，每组设3个复孔，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养,于感染后96h收集细胞。

(2)RNA提取及real-time PCR检测：采用TrizolA+裂解收集的细胞，并采用氯仿-异丙醇法提取每组细胞的总RNA，将所提取mRNA逆转录为cDNA，逆转录条件为：37℃60min。取各组细胞的cDNA作为模板，以β-actin作为内参，采用Real-time PCR检测MyoD1、Myf5、Myf6、MyoG四个生肌因子的表达情况。所用MyoD1、Myf5、Myf6、MyoG与β-actin的引物序列如下：

MyoD1 Forward Primer：5'-AAGGCGTGCAAGAGGAAGAC-3'(SEQ IDNO.13)

MyoD1 Reverse Primer：5'-TGGTTGGGGTTGGTGGA-3'(SEQ IDNO.14)

Myf5-Forward Primer：5'-AGGAGGAGGCTGAAGAAAGTG-3'(SEQ IDNO.15)

Myf5-Reverse Primer：5'-GCTCTGTCTCGGCAGGTGATA-3'(SEQ IDNO.16)

Myf6-Forward Primer：5'-GGAGCGCCATCAGCTACATC-3'(SEQ IDNO.17)

Myf6-Reverse Primer：5'-CGAGGAAGTCCGAGCCAT T-3'(SEQ IDNO.18)

MyoG-Forward Primer：5'-CGG ATCACCTCCTGCCTGA-3'(SEQ IDNO.19)

MyoG-Reverse Primer：5'-CGTCCTCTACGGCGATGC T-3'(SEQ IDNO.20)

β-actin Forward Primer：5'-TGAGAGTAGCCCCTGAGGAGCAC-3'(SEQID NO.11)

β-actin Reverse Primer：5'-TAACACCATCACCAGACTCCATCAC-3'(SEQ ID NO.12)

Real-time PCR反应条件为：95℃ 5min，变性；95℃ 25s；63℃25s；72℃25s 40个cycle；③95℃ 25s；63℃25s；72℃ 25s收集溶解曲线。

结果如图4所示，与PLL3.7-Control-shRNA组相比，在感染后96h，PLL-3.7-MSTN-shRNA-318感染组的Myf5显著增加；PPLL-3.7-MSTN-shRNA-767和PLL-3.7-MSTN-shRNA-1096感染组的MyoD1表达量均显著降低，Myf5的表达量均显著增加；三组感染组中Myf6和MyoG的表达量变化均不显著。说明鸭成肌细胞中MSTN基因被抑制后会影响MyoD1和Myf5的表达，对Myf6和MyoG的表达影响不显著。

本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列，其特征在于所述shRNA序列选自下列核苷酸序列中的一种：

(1)如SEQ ID NO.1-2所示的DNA序列；

(2)如SEQ ID NO.3-4所示的DNA序列；

(3)如SEQ ID NO.5-6所示的DNA序列。

2.一种包含权利要求1所述的抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是基于PLL3.7载体构建的载体。

4.一种权利要求2或3所述重组表达载体的应用，其特征在于，所述重组表达载体用于促进鸭成肌细胞的增殖。

5.一种权利要求1所述的抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列的应用，其特征在于，所述shRNA序列用于促进鸭成肌细胞的增殖。