CN104368001B - 抑制calm1与egfr在协同抑制肿瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抑制CALM1与EGFR在协同治疗肿瘤中的应用。具体地，本发明提供了一种抑制剂组合的用途所述抑制剂组合包括钙调蛋白的编码基因CALM1（calmodulin1）抑制剂和表皮生长因子受体（epidermalgrowth factor receptor,EGFR）抑制剂，并且所述组合用于制备协同治疗肿瘤的药物组合物。本发明抑制剂组合能够有效地协同抑制肿瘤(尤其是肺癌和肠癌)的生长，可在靶向治疗肿瘤中得到广泛应用。

Description

抑制CALM1与EGFR在协同抑制肿瘤中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及人CALM1与EGFR基因或其蛋白的协同肿瘤治疗用途及其相关药物。

背景技术

目前肿瘤的基因治疗已经取得了蓬勃快速的发展，但是迄今为止，仍然存在很多需要解决的问题。目前用于肿瘤基因治疗的基因太少，能抑制肿瘤生长的基因为数不多，急需提供更多可利用的基因。另外，由于肿瘤的发生、发展、转移等过程是一个多基因参与、涉及多条信号通路的复杂网络系统，因此单个基因治疗或单一治疗方法往往疗效有限。

因此，本领域迫切需要开发、挖掘并鉴定在临床上有重要价值的基因，探索多个具有不同抗肿瘤作用机理的基因联合治疗以及将多基因靶向药物联合治疗。

发明内容

本发明提供了一种CALM1基因协同EGFR治疗肿瘤的用途。

本发明的第一方面，提供了一种抑制剂组合的用途，所述抑制剂组合包括钙调蛋白的编码基因CALM1(calmodulin 1)抑制剂和表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactor receptor,EGFR)抑制剂，并且所述组合用于制备协同治疗肿瘤的药物组合物。

在另一优选例中，所述的CALM1来自于哺乳动物，更佳地为啮齿类动物(如小鼠、大鼠)或人；和/或

所述的EGFR来自于哺乳动物，更佳地为啮齿类动物(如小鼠、大鼠)或人。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括肺癌、肠癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、甲状腺癌。

在另一优选例中，所述的CALM1抑制剂包括：CALM1的抗体、CALM1核酸的反义RNA、siRNA、shRNA以及CALM1的活性抑制剂；和/或

所述的EGFR抑制剂包括EGFR的抗体、EGFR核酸的反义RNA、siRNA、shRNA以及EGFR的活性抑制剂。

在另一优选例中，所述的CALM1抑制剂为siRNA、shRNA。

在另一优选例中，所述的CALM1抑制剂序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述的EGFR抑制剂序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述的EGFR抑制剂包括西妥昔、吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)。

在另一优选例中，所述的化疗剂包括顺铂、紫杉醇、阿霉素。

本发明第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括CALM1抑制剂、EGFR抑制剂和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物还包括化疗剂。

在另一优选例中，所述的CALM1抑制剂包括：CALM1的抗体、CALM1核酸的反义RNA、siRNA、shRNA以及CALM1的活性抑制剂；和/或

所述的EGFR抑制剂包括EGFR的抗体、EGFR核酸的反义RNA、siRNA、shRNA以及EGFR的活性抑制剂。

在另一优选例中，所述的CALM1抑制剂为siRNA、shRNA。

在另一优选例中，所述的CALM1抑制剂序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述的EGFR抑制剂序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述的EGFR抑制剂包括西妥昔、吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)。

在另一优选例中，所述的化疗剂包括顺铂、紫杉醇、阿霉素。

本发明第三方面，提供了一种抑制剂组合，所述组合由钙调蛋白的编码基因CALM1抑制剂和表皮生长因子受体抑制剂构成。

在另一优选例中，所述的CALM1抑制剂包括表达靶向于CALM1的siRNA或shRNA的表达盒或载体；和/或所述的EGFR抑制剂包括表达靶向于CALM1的siRNA或shRNA的表达盒或载体。

在另一优选例中，所述的表达盒或载体同时表达一种以上的抑制剂。

在另一优选例中，所述的表达盒自5'端至3'依次可操作性连接有以下元件

启动子-X-Y-终止密码子；

其中，所述的X或Y元件为选自SEQ ID NO.:1-2的siRNA；

且X与Y不相同。

在另一优选例中，所述的载体含有本发明第三方面所述的表达盒。

在另一优选例中，所述的载体包括质粒、病毒载体。

在另一优选例中，所述的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、或腺相关病毒载体。

在另一优选例中，所述的表达载体还包括一个或多个选自下组的表达调控元件：复制起点、选择标记、报告基因、终止子或其组合。

在另一优选例中，所述的选择标记为药物抗性基因。

在另一优选例中，所述的药物抗性基因是耐受选自下组的抗生素的基因：氨苄西林、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素、四环素、氯霉素以及新霉素。

在另一优选例中，所述的报告基因为编码选自下组蛋白的基因：绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(dsRFP)、荧光素酶(Luc)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)以及β-葡萄糖醛酸酶(Gus)。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括肺癌、肠癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、甲状腺癌。

本发明第四方面，提供了一种体外非治疗性的协同抑制肿瘤细胞生长的方法，包括步骤：向肿瘤细胞培养体系中加入如本发明第三方面所述抑制剂组合和/或本发明第二方面所述的药物组合物，从而协同抑制肿瘤细胞生长。

本发明第五方面，提供了一种治疗肿瘤方法，其特征在于，向所需对象施用安全有效量的本发明第二方面所述的药物组合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了GV115质粒DNA图谱。

图2显示了GV113质粒DNA图谱。

图3显示了CALM1shRNA质粒鉴定图：

1#：阴性对照(ddH2O)；2#：阴性对照(空载自连对照组)

3#：Marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp

4#～8#：CALM1shRNA 1-5号转化子鉴定。

图4显示了EGFR shRNA质粒鉴定图：

1#：阴性对照(ddH2O)

2#：阴性对照(空载自连对照组)

3#：Marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp

4#～8#：EGFR shRNA 1-5号转化子鉴定。

图5显示了CALM1shRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒同时浸染人肺癌H1299细胞5天后，显著抑制细胞增殖。

图6显示了CALM1shRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒同时浸染人结肠癌RKO细胞5天后，显著抑制细胞增殖。

图7显示了对比例中测试同时抑制EGFR基因和PAK7基因对肿瘤抑制结果，显示二者并不具备协同作用。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了抑制CALM1基因与EGFR基因在治疗肿瘤方面(尤其是肺癌和肠癌)有良好的协同作用。联合运用CALM1与EGFR的抑制剂能够有效抑制肿瘤的生长，其效果远优于二者的加合作用，而将CALM1抑制剂与其他癌症相关基因的抑制剂联用，并无良好的协同作用。本发明人还提供了一种新的抑制CALM1和EGFR的载体。在此基础上，完成了本发明。

CALM1基因

钙调蛋白的编码基因CALM1(calmodulin 1)位于14号染色体q24-q31(NM_006888)，含有6个外显子，总长度约为11Kb。CALM1蛋白是钙结合受体蛋白，是生物体内钙离子进行细胞间信息传递、完成细胞的运动、分化、增殖及神经递质、血管和肌肉等生理生化活性所必须结合的受体蛋白。

EGFR

表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor receptor,EGFR)EGFR是一种跨膜蛋白质(NM_201282)，属于ErbB受体家族成员，其配体(EGF、TGF-α等)与EGFR胞外段结合使之二聚化，由此导致胞内段酪氨酸激酶活化以及一系列信号转导的级联反应，促进细胞增殖，血管生成，转移并抑制细胞凋亡(梁后杰,邹岚.EGFR靶向药物治疗晚期结直肠癌最新进展.中国处方药2009；84:58-61.)，从而导致肿瘤的发生。大量研究发现EGFR基因在多种肿瘤组织中过表达或异常活化，从而使肿瘤细胞增殖、侵袭和转移能力增强。EGFR已成为经临床验证的多种类型肿瘤的治疗靶点(Ciardiello F,Tortora G.EGFR antagonists incancer treatment.N Engl J Med 2008；358:1160-1174.)。

PAK7基因

p21活化激酶(p21-activated kinase,PAK)家族是进化上高度保守的苏氨酸/丝氨酸激酶。PAK家族蛋白参与许多重要的细胞活动，如细胞骨架的动力学调节、细胞运动、生存和凋亡、细胞周期、基因转录调节、细胞生长信号转导和转化等。

根据PAK家族成员的同源程度可将其分为两个亚组：A组(包括PAK1-3)和B组(包括PAK4-6)。PAK5也称作PAK7，是最后被克隆的PAK家族成员，定位于染色体20p12位，编码80kD蛋白。该蛋白含CDC42/Rac1相互作用样式和GTPase结合结构域。PAK7可被p21激活并进一步激活下游的MAPK信号通路，具有自我磷酸化和自我激活的能力。PAK7蛋白定位在线粒体膜上，于112位丝氨酸磷酸化BAD蛋白,也能在激活蛋白激酶AKT后于136位丝氨酸磷酸化Bcl-2家族的促凋亡蛋白BAD，从而实现直接和间接对细胞凋亡的抑制。研究还发现，PAK7蛋白可在细胞核和线粒体之间穿梭，而精确的亚细胞定位对其发挥抑制凋亡作用至关重要。

在临床中发现PAK7在结直肠癌中高表达，且随着恶性程度增加表达水平提高，并通过调节细胞粘附和迁移促进结肠癌转移。

有研究发现联合抑制PAK7、MAP3K7和CK2，可获得累加的凋亡诱导效应，PAK7有望成为胰腺癌的一个有效治疗靶点。

然而本发明实验证明，同时抑制EGFR基因与PAK7基因，并无任何协同抑制肿瘤作用。

RNAi、siRNA、shRNA

如本文所用，术语“RNAi”(RNA interference,RNA干扰)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、高效特异性降解同源mRNA的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。dsRNA介导的RNAi现象在真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中均有发现，而且在植物中的转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)、共抑制(cosuppression)及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制(quelling)现象也均属于RNAi在不同物种的表现形式。

如本文所用，术语“siRNA”(Small interfering RNA,siRNA)是指一种小RNA分子(约21-25个核苷酸)，可由Dicer(RNA酶Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶)从其前体(比如dsRNA、shRNA等)加工而成，也可由化学方法合成或由其它蛋白加工产生。siRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA被迅速切割降解，导致目标基因的沉默，因此成为RNAi中的关键功能分子。

本文所用的术语“表达盒”是指包含本发明RNAi前体的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号的表达盒，所述表达盒在转录后产生本发明的RNAi前体。本文所用的术语“RNAi前体”是指可以在哺乳动物细胞中加工产生siRNA的RNA分子，具体地说，是由Dicer、Ago2或其它类似蛋白选择性加工从而产生成熟的siRNA，进而实施RNAi。

本文所用的术语“shRNA”是short hairpin RNA的缩写，即，“短发夹RNA”。shRNA包括两个短反向互补序列，中间由一顶端环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由细胞内源的RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymeraseⅢ)启动子控制转录，shRNA序列的末端连接5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。在活体中产生“小干扰RNA”(siRNA)的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”的一部分克隆进质粒载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个带有顶端环结构的“双链RNA”(shRNA)，被细胞内的Dicer和Ago2等蛋白所识别和加工，产生有功能的siRNA。

本文所用的术语“miRNA”(microRNA)是一类由内源基因编码的长度约20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子，在动植物中参与对大量基因的表达调控。到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现四千多种miRNA分子。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster)的形式存在于基因组中。每种miRNA可以调控多个靶基因，而几种miRNA也可以共同参与调节同一基因，组成复杂的调节网络。据推测，miRNA调节着人类一半以上基因的表达。miRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA；pri-miRNA经过Drosha加工后，成为pre-miRNA，即miRNA前体，长度大约为50-90个核苷酸；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20-24个核苷酸的成熟miRNA。miRNA主要通过抑制翻译和加速mRNA的脱腺苷酸化抑制靶基因表达，其机制有别于siRNA介导的mRNA降解。

表达载体

如本文所用，术语“表达载体”指的是能将感兴趣的多聚核苷酸序列转移到目标细胞的载体。此类载体能自我复制或结合进宿主细胞染色体(宿主细胞有，例如原核细胞、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物个体、和植物个体等)，并可在适合本发明多聚核苷酸转录的位点含有启动子。表达载体可包含结构基因和调控其表达的启动子，此外，还有能在宿主细胞中起作用的各种调控元件。本领域熟知，生物活体(如动物)的表达载体类型及所用调控元件的种类可根据所用宿主细胞的类型而改变。

可用于本发明的病毒载体没有特别限制，可以是任何能够利用病毒具有传送其基因组的特点，将遗传物质带入其他细胞，进行感染的病毒载体。可发生于完整活体或是细胞培养中。包括慢病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体。在本发明中，一种优选的表达载体是慢病毒载体。

药物组合物以及给药方式

本发明还提供一种可用于协同治疗肿瘤的组合物。

本发明药物组合物包括本发明上述的，(a)药学上可接受的载体；和

选自下组的物质作为活性成分：

(b)CALM1抑制剂和EGFR抑制剂；或

(c)上述的表达载体。

此外，本发明药物组合物还可以包括任选的实体肿瘤化疗剂。所述的化疗剂包括(但不限于)顺铂、紫杉醇、阿霉素等。

“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。

通常，将所述表达载体或假病毒颗粒和药学上可接受的载体混合后，即可获得的本发明的药物组合物。

本发明所述的组合物的给药方式没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：静脉注射、皮下注射、肌肉注射等。

本发明的有益效果：

1.共同抑制CALM1基因和EGFR基因能够协同作用于抗肿瘤治疗，较抑制CALM1和EGFR的加合作用而言，具有更显著的抑制肿瘤生长的作用。

2.CALM1基因可以作为EGFR基因协同治疗靶标，CALM1靶向慢病毒可以作为EGFR基因靶向药物的协同治疗药物，将二者的抑制剂作为靶向治疗肿瘤的药物，可有效地协同抑制肿瘤的生长，促进肿瘤凋亡。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1：针对人CALM1基因和EGFR基因RNAi慢病毒的制备

构建针对人CALM1基因和EGFR基因RNAi慢病毒载体

从Genbank调取CALM1(NM_006888)和EGFR基因(NM_201282)信息；利用上海吉凯基因化学技术有限公司的设计软件Genechem设计针对CALM1基因和EGFR基因的有效的siRNA靶点。初步筛选得到具有明显抑制CALM1基因表达功能的siRNA(SEQ ID NO.1)和明显抑制EGFR基因表达功能的siRNA序列(SEQ ID NO.2)。通过Genbank数据库进行进行BLAST分析，确定其不对任何其它基因产生干扰作用。

表1siRNA序列(正义链)

针对siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表2)；以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于GV115载体(载体带绿色荧光标记，购自上海吉凯基因化学技术有限公司，图1)，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。

针对siRNA靶点(SEQ ID NO：2)合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表3)。以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于GV113载体(载体带红色荧光标记，购自上海吉凯基因化学技术有限公司，图2)，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。

表2两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo

表3两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo

通过T4DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示，37℃，反应1h)的载体DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接，在适当的缓冲体系(连接体系如表5所示)中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页)。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μlLB培养基，混匀取1μl作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游，设计通用PCR引物上游引物序列：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’(SEQ ID NO.:7)；下游引物序列：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’(SEQ ID NO.:8)，进行PCR鉴定实验(PCR反应体系如表6，反应条件如表7)。

表4载体质粒酶切反应体系

试剂	体积(μl)
		载体质粒(1μg/μl)	2.0
10×buffer	5.0
		100×BSA	0.5
Age I(10U/μl)	1.0
		EcoR I(10U/μl)	1.0
dd H2O	40.5
		Total	50.0

表5载体DNA和双链DNA Ol igo连接反应体系

试剂	阳性对照(μl)	自连对照(μl)	连接组(μl)
				线性化的载体DNA(100ng/μl)	1.0	1.0	1.0
退火的双链DNA Oligo(100ng/μl)	1.0	-	1.0
				10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液	1.0	1.0	1.0
T4噬菌体DNA连接酶	1.0	1.0	1.0
				dd H2O	16.0	17.0	16.0
Total	20.0	20.0	20.0

表6PCR反应体系

试剂	体积(μl)
		10×buffer	2.0
dNTPs(2.5mM)	0.8
		上游引物	0.4
下游引物	0.4
		Taq聚合酶	0.2
模板	1.0
		ddH2O	15.2
Total	20.0

表7PCR反应体系程序设定

对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的RNAi载体，分别命名为CALM1-shRNA-plasmid和EGFR-shRNA-plasmid。PCR鉴定结果分别见图3和图4。

构建GV115阴性对照质粒，阴性对照siRNA序列(正义链)为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.:9)。构建阴性对照质粒时，针对Scr siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表8),其余构建方法、鉴定方法及条件均同CALM1-shRNA-plasmid和EGFR-shRNA-plasmid。

表8两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo

实施例2包装CALM1shRNA慢病毒和EGFR shRNA

1)CALM1基因干扰慢病毒

以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒分别提取RNAi质粒CALM1-shRNA-plasmid和EGFR-shRNA-plasmid的DNA，配制成100ng/μl储存液。转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×10⁵细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5％CO₂培养箱内培养。待细胞密度达70％-80％时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix(PVM)20μl，PEI 12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中，37℃，5％CO₂培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。

收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置(Millipore)纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：(1)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；(2)0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；(3)4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；(4)离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；(5)把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。

对照慢病毒Scr shRNA的包装过程同CALM1-siRNA慢病毒和EGFR-shRNA慢病毒。

2)EGFR基因干扰慢病毒的包装过程同CALM1基因干扰慢病毒。

3)阴性对照慢病毒包装过程同CALM1基因干扰慢病毒。

实施例3CALM1基因干扰慢病毒和EGFR基因干扰慢病毒的肿瘤治疗协同作用

3.1.实验方法

分别对处于对数生长期的人肺癌H1299细胞(ATCC)和结肠癌RKO细胞(ATCC)进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×10⁴/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据感染复数(H1299MOI为5，RKO的MOI为5)，同时设置实验组和对照组，实验组以0.03uL的滴度为5×10⁸TU/mL的CALM1基因干扰慢病毒和0.03uL的滴度为5×10⁸TU/mL EGFR基因干扰慢病毒加入到癌细胞培养液中，对照组以0.03uL的滴度为5×10⁸TU/mL的对照病毒加入到癌细胞培养液中。

培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集处于对数生长期的各实验组和对照组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(2×10⁴/ml)，以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5％CO₂培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Cellomics ArrayScan VTI高内涵筛选分析仪(Thermo Fisher)检测读板一次，连续检测读板5天。通过调整Cellomics arrayscan的输入参数，准确地计算出各实验组和对照组中每次扫描孔板中的同时带绿色荧光和红色荧光的细胞的数量(同时感染CALM1基因干扰慢病毒和EGFR基因干扰慢病毒的细胞)，单独带绿色荧光细胞的数量(仅感染CALM1基因干扰慢病毒的细胞)，单独带红色荧光的细胞的数量(仅感染EGFR基因干扰慢病毒的细胞)，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线。

3.2结果

细胞增殖曲线的结果见图5-6，结果表明：同时感染上CALM1shRNA慢病毒和EGFRshRNA慢病毒的人肺癌H1299细胞在体外培养5天后，活力细胞增殖倍数与对照组相比较下降了88.6％，单独感染上EGFR shRNA慢病毒的H1299细胞在体外培养5天后，活力细胞增殖倍数与对照组相比较下降了17.9％，单独感染上CALM1shRNA慢病毒的H1299细胞在体外培养5天后，活力细胞增殖倍数与对照组相比较下降了34.3％。

同时感染上CALM1shRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒的人结肠癌RKO细胞在体外培养5天后，活力细胞增殖倍数与对照组相比较下降了71.2％，单独感染上EGFR shRNA慢病毒的RKO细胞在体外培养5天后，活力细胞增殖倍数与对照组相比较下降了26.7％，单独感染上CALM1shRNA慢病毒的RKO细胞在体外培养5天后，活力细胞增殖倍数与对照组相比较下降了32.1％。(见表9)

表9

CALM1基因和EGFR基因的干扰慢病毒同时感染肿瘤细胞后抑制细胞增殖的结果

3.3结论：该实验结果表明，双基因敲减后的细胞生长抑制率明显大于单基因敲减组的加和，表明CALM1基因shRNA慢病毒能与EGFR基因shRNA慢病毒协同抑制肿瘤细胞的增殖。

对比例1测试同时抑制EGFR基因和PAK7基因对肿瘤抑制是否有协同作用

C1.1.PAK7shRNA慢病毒载体的制备

PAK7shRNA慢病毒载体的构建和病毒包装过程同CALM1基因慢病毒的制备过程，PAK7基因靶点序列为5‘-gagctctctcctaccttcata-3’(SEQ ID NO.:12)。

C1.2PAK7基因干扰慢病毒和EGFR基因干扰慢病毒的肿瘤治疗协同作用

C1.2.1方法：

对处于对数生长期的结肠癌RKO细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×10⁴/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据感染复数(RKO的MOI为5)，同时设置实验组和对照组，实验组以0.03uL的滴度为5×10⁸TU/mL的PAK7基因干扰慢病毒和0.03uL的滴度为5×10⁸TU/mL EGFR基因干扰慢病毒加入到癌细胞培养液中，对照组以0.03uL的滴度为5×10⁸TU/mL的对照病毒加入到癌细胞培养液中。

培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集处于对数生长期的各实验组和对照组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(2×10⁴/ml)，以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5％CO₂培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Cellomics ArrayScan VTI高内涵筛选分析仪(Thermo Fisher)检测读板一次，连续检测读板5天。通过调整Cellomics arrayscan的输入参数，准确地计算出各实验组和对照组中每次扫描孔板中的同时带绿色荧光和红色荧光的细胞的数量(同时感染PAK7基因干扰慢病毒和EGFR基因干扰慢病毒的细胞)，单独带绿色荧光细胞的数量(仅感染PAK7基因干扰慢病毒的细胞)，单独带红色荧光的细胞的数量(仅感染EGFR基因干扰慢病毒的细胞)，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线。

C1.2.2结果：由图7可见，同时感染上PAK7shRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒的人结肠癌好RKO细胞在体外培养5天后，活力细胞增殖倍数与对照组相比较下降了58.6％，单独感染上EGFR shRNA慢病毒的RKO细胞在体外培养5天后，活力细胞增殖倍数与对照组相比较下降了30.5％，单独感染上CALM1shRNA慢病毒的RKO细胞在体外培养5天后，活力细胞增殖倍数与对照组相比较下降了43.8％。

C1.2.3结论：该实验结果表明，PAK7基因和EGFR基因同时敲减后的细胞生长抑制率没有大于单基因敲减组的加和，表明PAK7基因shRNA慢病毒与EGFR基因shRNA慢病毒之间可能没有协同效应。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种抑制剂组合的用途，其特征在于，所述抑制剂组合包括钙调蛋白的编码基因CALM1(calmodulin 1)抑制剂和表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor receptor,EGFR)抑制剂，并且所述组合用于制备协同治疗肿瘤的药物组合物，

其中，所述的CALM1抑制剂为siRNA或其前体，且所述siRNA的正义链序列如SEQ IDNO.:1所示；且

所述EGFR抑制剂为siRNA或其前体，且所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.:2所示。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的CALM1来自于人；和/或

所述的EGFR来自于人。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自肺癌、肠癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌或甲状腺癌。

4.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括CALM1抑制剂、EGFR抑制剂和药学上可接受的载体，

其中，所述的CALM1抑制剂为siRNA或其前体，且所述siRNA的正义链序列如SEQ IDNO.:1所示；且

所述EGFR抑制剂为siRNA或其前体，且所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.:2所示。

5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包括化疗剂。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的化疗剂选自顺铂、紫杉醇或阿霉素。

7.一种体外非治疗性的协同抑制肿瘤细胞生长的方法，其特征在于，包括步骤：向肿瘤细胞培养体系中加入权利要求4所述的药物组合物，从而协同抑制肿瘤细胞生长。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤选自肺癌、肠癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌或甲状腺癌。