CN102021201A - 一种肌肉生成抑制素基因敲除猪的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肌肉生成抑制素基因敲除猪的制备方法。属于生物技术领域。在293Ft细胞中生产能表达靶向猪肌肉生成抑制素(myostatin)基因的shRNA的病毒颗粒，然后用生产出的这种慢病毒感染猪胎儿成纤维细胞，48小时后通过荧光定量PCR检测发现有效地抑制了细胞中Myostatin基因的表达。本发明慢病毒颗粒可以用于显微注射猪受精卵卵周隙，使病毒核酸整合到胚胎基因组并表达shRNA，经胚胎移植后可以生产Myostatin敲除转基因猪。该慢病毒颗粒还可以用于精子载体法制作转基因猪。可避开传统的同源打靶基因敲除的繁琐操作，病毒消耗少而且可稳定传代。

Description

一种肌肉生成抑制素基因敲除猪的制备方法

技术领域

本发明涉及一种利用慢病毒载体介导RNAi制备肌肉生成抑制素(Myostatin)基因敲除猪的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

我国是世界第一养猪大国，也是猪肉消费第一大国。但与之不相称的是现代猪育种工作比较落后，迄今还没有完全国产化的现代化商品瘦肉型猪种(甄云肖.猪肉进出口情况及对策[J].中国牧业通讯，2003，(12)；王爱国.对我国养猪业的回顾与展望[J].当代畜牧，2004，(01).)。因此，培育瘦肉率高、节粮型猪品种是国家的重大需求，亦是猪遗传育种领域的重点与难点。转基因及基因敲除技术的发展为培育瘦肉率高、节粮型猪种提供了快速高效的途径。转基因技术是起始于20世纪70年代的高新技术，它是将外源基因或体外重组的基因转移到动物的受精卵内，使其在随后发育的动物体内得到整合和表达，以产生具有新的遗传特征或性状的动物个体的过程，或者是将外源基因在特定调控元件作用下在某些宿主组织中进行独立的复制，并在一定的时间内表达外源蛋白的过程。1997年2月，英国罗斯林研究所Wilmut等人，利用绵羊乳腺细胞进行核移植试验，并成功地获得了世界上第一只体细胞克隆绵羊——多利(Dolly)；这一成果开创了哺乳动物细胞核移植的新的里程碑，并使处于徘徊阶段的哺乳动物胚胎细胞核移植技术走上了一个新台阶。从这项技术诞生起，就在改良畜禽生产性状、提高畜禽抗病力以及利用转基因畜禽生产非常规畜牧产品(如人药用蛋白和工业用酶)等方面显示了广阔的应用前景。

肌肉生成抑制素(Myostatin，缩写MSTN)是Mcpherron等研究小鼠转化生长因子-β(TGF-β)超家族时发现的一种新的生长因子，经研究发现，其对骨骼肌的生长具有负调控作用，因此命名为肌肉生成抑制素(McPherron AC，Lawler AM，Lee SJ.Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member.Nature 1997；387：83-90)。MSTN作为一种肌肉生长的负性调控因子，将其突变可引起肌细胞的增生和肥大，肌肉质量增加，另外，由于它是一个肌肉发育特定的因子，对它的基因工程操作不会影响其他组织，因此，在农业、渔业、畜牧业和医药等很多方面都有广泛的应用前景和商业价值。1997年，Mcpherron等通过基因打靶技术敲除小鼠体内MSTN基因使其不能发挥作用，结果发现突变小鼠显著大于野生型，突变型骨骼肌较野生型重约3倍，并于1997年刊登在著名的《Nature》杂志上而引起了轰动。自此以后，开始了MSTN基因的突变研究，并且逐步向应用型转化。比利时蓝牛和皮尔蒙特牛是两个最著名的双肌型牛品种，它们以高产肉量和精良肉质而闻名。许多研究发现，这两个品种的双肌型优良性状是由MSTN基因突变造成的(McPherron AC，Lee SJ.Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997；94：12457-12461)。特克塞尔羊(Texel)体躯肌肉丰满，肌肉生长速度快，是理想的肉羊生产的终端父本。研究发现，特克塞尔羊MSTN等位基因的3’非翻译区发生一处G→A的碱基转换，这一点突变产生了两种microRNA(miR1，miR206)作用的靶位点，这使得虽然特克塞尔MSTN转录产生的mRNA水平较其他品种没有差异，但两种microRNA可以对mRNA进行翻译水平上的修饰，抑制具有活性的MSTN产生，使特克塞尔羊的肌肉量显著增加(A.Clop，F.Marcq，H.Takeda，D.Pirottin，X.Tordoir，B.Bibe，J.Bouix，F.Caiment，J.M.Elsen and F.Eychenne et al.，A mutation creating a potential illegitimate microRNA target site in the myostatin gene affects muscularity in sheep，Nat.Genet.2006；38：813-818)。此外，人和狗上都发现了MSTN基因突变导致的肌肉量上显著增加等表型(Schuelke M，Wagner KR，Stolz LE，Hubner C，Riebel T，et al.Myostatin mutation associated with gross muscle hypertrophy in a child.N.Engl.J.Med.2004；350：2682-2688；Mosher DS，Quignon P，Bustamante CD，Sutter NB，Mellersh CS，et al.A mutation in the myostatin gene increases muscle mass and enhances racing performance in heterozygote dogs.PloS Genet.2007；3：e79)。因此，MSTN基因是重要的农业资源，通过研究和操纵MSTN基因，有可能培育经济效益更好的优良猪品种，对我国肉食生产具有特殊意义。

1987年，Capecchi研究小组报道根据同源重组的原理，实现了导入外源基因的定点整合，这一技术也被称为“基因打靶”(gene targeting)。基因同源重组是指外来的含已知序列的DNA片段通过同源关系与受体细胞基因组的相应片段发生交换、产生重组，并在受体细胞染色体上形成有活性的基因的过程。因此，基因打靶就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因为目的的一项技术，它克服了随机整合的盲目性和危险性。这一技术也可用于定点灭活某个内源基因，即“基因敲除”(gene knock-out)。这种方法是完全基因敲除，也就是通过同源重组直接将靶基因在细胞或者是动物个体内的活性完全消除。目前基因敲除研究中存在的主要问题有以下几个方面：①基因定向敲除的成功率很低，检测发生同源重组干细胞的工作比较困难；②哺乳动物的繁殖周期较长，一般为数周至数年。因此，定向敲除干细胞基因到筛选出具备理想基因型的基因敲除哺乳动物模型依旧耗时极长。③基因敲除后的功能可能被其它基因的代偿作用。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)分子诱导细胞内与其序列同源的基因mRNA降解而引起的基因转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)的现象，是普遍存在生物体的一种古老、保守而又极其重要的遗传行为(Gregory J.Hannon.RNA interference.Nature 2002；418：244-251)。RNAi的主要功能性物质是小的双链干扰RNA(siRNA)，siRNA作为识别及剪切互补靶mRNA的小分子，被导入细胞诱导RNAi。虽然siRNA可通过化学合成、体外转录或核酸内切酶降解等途径生成，但化学合成价格昂贵，内切酶切割又会导致非特异性效应，而且siRNA瞬时转染导致的沉默效应持续时间短(刘军，郭颖，等.哺乳动物细胞siRNA表达载体的构建及鉴定[J].第四军医大学学报，2003，24(24)：2235-2237)，为了在细胞和动物体内获得持久的干扰效果，因此众多研究者采用将靶向特异基因的干扰表达质粒导入细胞，再在polⅢ(H1或U6)启动子控制下体内表达短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)，shRNA在Dicer酶作用下转化成21～25nt的siRNA，可导致细胞靶基因持续、特异的改变。由此产生的RNAi可克服瞬时转染沉默效应持续时间短的缺点，而且基因抑制效果显著。shRNA是由长度为50～70个核苷的单链分子产生的具有茎环结构的特殊小分子RNA。其结构特点是：5～10个核苷的环连接两条19～29个核苷的互补长链RNA片段，这两条片段通过碱基配对形成双链茎干。利用质粒表达shRNA由此介导的RNAi效果显著，流程设计简便，而且经过合适的抗药性筛选，可以获得稳定表达株并用于长期功能缺失研究。利用RNAi技术在mRNA水平抑制基因的表达，并不是真正意义上的基因敲除，但是可以达到相同的效果。该技术比基因敲除更省时，可以同时导入多种引发物，抑制多个基因的表达，从而成为研究基因功能的良好工具(李敏，郝林琳，刘松财，张永亮.生长抑素受体基因特异性shRNA慢病毒表达质粒的构建[J].现代生物医学进展，2008，8(3)：421-423)。

由于质粒介导RNAi有一定的局限性，转染哺乳动物细胞的效率低，而且无法转染非分裂相细胞，不适合体内实验(Imamura，T.，F.Kanai，T.Kawakami，J.Amarsanaa，H.Ijichi，Y.Hoshida，Y.Tanaka，T.Ikenoue，K.Tateishi，T.Kawabe，Y.Arakawa，M.Miyagishi，K.Taira，O.Yokosuka，and M.Omata.Proteomic analysis of the TGF-beta signaling pathway in pancreatic carcinoma cells using stable RNA interference to silence Smad4 expression.Biochem.Biophys.Res.Commun.2004；318：289-96.)，因此越来越多的研究者开始采用慢病毒载体介导RNAi。慢病毒载体是一种复制缺陷型逆转录病毒载体，以HIV-1为基础发展而得，作为常用的病毒载体之一，其特点为免疫原性低，能感染分裂相和非分裂相细胞，能将自身携带片断整合到宿主细胞基因组，稳定表达外源基因。慢病毒载体介导的RNA干扰，就是将慢病毒载体的高感染效率和高整合率的特性与RNA干扰特异性地抑制靶基因表达的特点相结合(An，D.S.，Y.Xie，S.H.Mao，K.Morizono，S.K.Kung，and I.S.Chen.Efficient lentiviral vectors for short hairpin RNA delivery into human cells.Hum.Gene.Ther.2003；14：1207-12.)。用慢病毒载体介导RNAi作用持久，同时扩大了载体感染细胞的范围。目前通过基因打靶技术敲除猪Myostatin基因尚未见报道，利用RNAi技术沉默该基因不失为一种便捷的途径，而且猪Myostatin基因相关的基因工程研究还很少，急需加大相关研究力度。

发明内容

技术问题：

本发明所要解决的技术问题是对现有的基因敲除转基因猪制备方法进行改进，缩短研究周期，进一步增加其便利性，降低成本，提供一种以慢病毒载体介导的RNAi，特异性地抑制猪Myostatin基因的表达，达到提高猪瘦肉率的目的。本发明是利用慢病毒载体表达靶向猪Myostatin的shRNA特异性沉默细胞中Myostatin的表达及其应用，该病毒颗粒可显微注射受精卵卵周隙，经胚胎移植后可获得Myostatin敲除的转基因猪。

技术方案：

本发明先构建了一个含有人源U6启动子的真核表达载体pBluescript-U6，然后利用在线工具设计了两个靶向猪Myostatin基因的shRNA，将这两个shRNA送上海英骏生物技术有限公司合成，经退火后连接到pBluescript-U6载体的U6启动子下游，该shRNA在人U6启动子驱动下表达，转录产物结构见附图2。为了筛选能有效抑制Myostatin的shRNA，我们将两个shRNA表达质粒用脂质体包裹转染猪胎儿成纤维细胞，48小时后提取细胞总RNA并反转录成cDNA，通过RealtimePCR检测细胞中Myostatin表达水平变化，从而筛选出能有效抑制Myostatin的shRNA质粒。然后将该质粒上的U6-shRNA结构通过基因工程操作连接到慢病毒表达系统(pLenti6/V5-GW/LacZ，购自Invitrogen公司)，用得到的重组慢病毒质粒pLenti-U6-shRNA与慢病毒载体系统的其他三个辅助质粒一起转染293Ft细胞生产出病毒颗粒，进而利用病毒感染细胞并在细胞内稳定表达shRNA，达到长期抑制细胞中Myostatin基因表达的目的。

一种肌肉生成抑制素基因敲除猪的制备方法，其特征是，

①从人血基因组中经PCR扩增得到的U6启动子序列连入pBluescript ⅡKS(+)质粒(购自Stratagene)的EcoRⅠ与ClaⅠ位点之间，得到pBluescript-U6载体。

②设计靶向猪Myostatin的siRNA序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，加上一个Loop序列(SEQ ID NO.3)后转换成shRNA序列并交给公司合成，得到的shRNA经退火后连接到前面构建的pBluescript-U6载体的U6启动子下游，得到能表达shRNA的质粒；

③将步骤②中构建的表达shRNA的质粒用Pst I和Xho I进行双酶切，酶切产物经浓度1.5％琼脂糖胶电泳分离后切胶回收429bp的U6-shRNA片段；

④先以pLenti6/V5-GW/LacZ慢病毒系统的表达质粒为模板，设计引物序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，用高保真酶进行PCR扩增，得到的PCR产物为6558bp的慢病毒载体骨架片段，将该产物胶回收后用Pst I和Xho I进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后再次切胶回收；

⑤将U6-shRNA片段和慢病毒载体骨架片段按3∶1摩尔比混合，在T4连接酶作用下16℃连接过夜，然后转化至JM109感受态细胞中，37℃培养过夜，次日挑选单克隆菌落，构建的质粒命名为pLenti-U6-shRNA；

⑥将重组慢病毒表达质粒pLenti-U6-shRNA与ViraPower^TM Packaging Mix按1∶3质量比例混合，质粒混合物与脂质体Lipofectamine^TM 2000按1μg∶3μl的比例混合孵育制作DNA-脂质体转染复合物，共转染293Ft细胞生产病毒；将生产的病毒进行超速离心浓缩，病毒沉淀用PBS重悬；

⑦病毒悬液用于猪受精卵卵周隙注射，每枚注射100pl(病毒滴度1×10⁹IU/ml)，注射后的受精卵在体外培养72小时，然后移植到代孕母猪子宫制备转基因猪。病毒悬液也可以通过与猪精子共孵育后人工受精制备转基因猪。

所述的重组慢病毒表达质粒pLenti-U6-shRNA可以在制备Myostatin基因敲除猪方面的得到应用。

有益效果：

本发明公开的利用慢病毒载体介导RNAi制备肌肉生成抑制素基因敲除猪的方法，与传统方法相比具有以下优点：

(1)与基于同源重组原理的基因打靶技术相比，本发明利用RNAi抑制Myostatin基因表达可以避开构建打靶载体的繁琐过程，同时慢病毒还可以把外源基因高效整合进靶细胞基因组，对转基因效率提高有显著效果。

(2)与基于同源重组原理的基因敲除技术相比，本发明操作相对简单，不涉及卵母细胞去核及核移植等高难度技术。

(3)本发明中表达shRNA的慢病毒还可以用于慢病毒介导的精子载体法制作转基因猪，即将慢病毒颗粒与猪精子共孵育，处理后的精子用于人工授精，无需大型高精密设备，生产实用价值高，有望广泛应用于猪的遗传改良。

(4)本发明具有高效、安全及技术难度低等特点，使转基因猪的大范围生产成为可能，可促进相关产业的快速发展。

(5)与逆转录病毒(慢病毒以外)介导法、脂质体介导法相比，慢病毒可以某种未知的机制克服转录沉默现象，保证整合的外源目的基因得以有效的表达，防止出现嵌合体或整合而不表达现象的发生。

(6)本发明使用的慢病毒载体为第三代复制缺陷型慢病毒，已经对其基因组结构做了重大改进，安全可靠。

附图说明

图1：表达shRNA的慢病毒载体-pLenti-U6-shRNA示意图

图2：shRNA的预测转录结构

图3：瞬时转染干扰质粒后猪胎儿成纤维细胞中Myostatin基因表达水平变化

图4：对表达shRNA的慢病毒质粒pLenti-U6-shRNA的大小鉴定

图5：pLenti-U6-shRNA用AflII/Xho I双酶切的结果

图6：慢病毒感染猪胎儿成纤维细胞48小时后细胞中Myostatin表达水平变化

具体实施方式

(一)含人源U6启动子的pBluescript-U6载体构建

通过PCR技术从人血基因组(TaKaRa)中扩增得到U6启动子序列，所用引物和PCR程序参照文献(Ohkawa，J.and K.Taira，Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter.Hum Gene Ther，2000；11(4)：577-85.)，得到的PCR产物和pBluescriptⅡ KS(+)质粒(购自Stratagene)均用EcoRⅠ与ClaⅠ(TaKaRa)进行双酶切消化，酶切产物在琼脂糖凝胶中分离并回收需要的片段，然后将回收的插入片段(U6启动子)和pBluescriptⅡ KS(+)骨架片段按3∶1摩尔比混合，在T4连接酶(TaKaRa)作用下16℃连接过夜，然后取10微升连接产物转化至JM109感受态细胞(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)中，37℃培养过夜，次日挑选单克隆菌落，做质粒大小快速鉴定和双酶切鉴定，最后测序，得到载体命名为pBluescript-U6。

(二)靶向猪Myostatin基因的shRNA设计及其表达载体构建

首先从NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因数据库中检索猪Myostatin的mRNA序列(登录号AF188638)，然后根据该序列保守区域利用在线设计软件Dharmacon siDESIGN Center(http://www.dharmacon.com/sidesign/)来设计siRNAs，选取2个得分较高的siRNA(序列见SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2)，选取一个4-nt的Loop(序列见SEQ IDNO.3)作为shRNA的环状部分，然后将siRNA转换成shRNA的茎环结构并在两端加上相应的酶切位点(Bbs I和Xho I)，最后将转换后的序列交给上海英骏生物技术有限公司合成。合成的shRNA经退火后克隆到pBluescript-U6载体的U6启动子下游的Bbs I和Xho I位点之间，根据shRNA靶位点不同将得到的两个重组质粒分别命名为MSTN-451和MSTN-974。

(三)shRNA表达载体的功能验证和筛选

1)猪胎儿成纤维细胞的培养

从50胎龄的约克夏猪胎儿耳部剪取面积3cm×3cm大小的全层皮肤，放入含250U/ml青霉素(Gibco)和250μg/ml链霉素(Gibco)的无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)浸泡，移入无菌超净台操作，具体步骤根据文献(孙兴参，伊亚玲，刘颖，于玲珠，刘娣.猪胎儿成纤维细胞制作方法的改进及应用[J].东北农业大学学报.2002，33(3)：209～212)上的描述进行操作，最后得到的原代猪胎儿成纤维细胞可以进行传代培养或放入液氮长期保存。

2)shRNA表达载体瞬时转染猪胎儿成纤维细胞

先分别从含MSTN-451和MSTN-974的菌液中提取高纯度无内毒素的质粒，操作步骤按照无内毒素小量提取质粒试剂盒E.Z.N.A.Plasmid Miniprep Kit II(OMEGA Bio-Tec，USA)的说明书操作，经紫外分光光度计测定浓度和纯度并符合要求后(浓度＞350ng/μl，A260/280介于1.7～1.9之间)，即可以用于转染细胞。转染前一天将细胞以3×10⁵密度重悬在无抗生素的培养基中，接种到六孔板中，保证转染时细胞汇合达到瓶底面积的90-95％。转染步骤完全参照脂质体Lipofectamine^TM2000(Invitrogen)说明书。

3)转染后细胞中Myostatin表达水平的检测

shRNA表达载体转染猪胎儿成纤维细胞48小时后，用TRIzol(Invitrogen)提取细胞总RNA，步骤参照TRIzol说明书。提取的RNA立即反转录成cDNA，用于Realtime PCR。下面是检测Myostatin的定量引物序列(SEQ IDNO.6，SEQ IDNO.7)及内参GAPDH引物序列(SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9)：

Real-Time在ABI 7300荧光定量分析仪上完成，步骤参照FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(Roche)的说明书进行。PCR程序如下：95℃预变性10min，接着是40个循环的扩增包括95℃变性15s，60℃退火/延伸1min，最后加上绘溶解曲线步骤，以监测PCR扩增的特异性。PCR结束后取产物跑琼脂糖电泳确保产物单一且大小正确。得到的PCR结果与持家基因GAPDH校正并采用2^-ΔΔCt法(Kenneth J.Livak and Thomas D.Schmittgen.Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2^-ΔΔCt Method.METHODS.2001；25：402-408)分析。最后分析结果显示，与未转染质粒的细胞(图中的Mock组)相比，转染了MSTN-974的猪胎儿成纤维细胞中Myostatin mRNA水平下降达97％(p＜0.05)，见图3。

(四)表达shRNA的慢病毒载体构建

1)将步骤三中筛选到的能起显著抑制作用的shRNA质粒(即MSTN-974)用Pst I和Xho I(TaKaRa)进行双酶切，酶切产物经1.5％琼脂糖胶电泳分离后切胶回收429bp的U6-shRNA片段。

2)对慢病毒系统表达质粒pLenti6/V5-GW/LacZ(Invitrogen)进行改造。先以pLenti6/V5-GW/LacZ为模板，用高保真酶PrimeSTAR^TMHS(TaKaRa)进行PCR扩增，下游引物(Lenti-R)加了PstI酶切位点(下划线部分)，得到的PCR产物为6558bp的慢病毒载体骨架片段。引物序列如下：

PCR程序：94℃预变性4min，98℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸6min 30s，35个循环后，72℃延伸10min。将PCR产物经1.0％琼脂糖电泳分离后切胶回收目的片段，步骤参照胶回收试剂盒(Axygen)。胶回收产物用Pst I和Xho I进行双酶切，再跑琼脂糖胶电泳回收6267bp慢病毒载体骨架片段。

3)将回收的插入片段(U6-shRNA)和慢病毒载体骨架片段按3∶1摩尔比混合，在T4连接酶(TaKaRa)作用下16℃连接过夜，然后取10微升连接产物转化至JM109感受态细胞(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)中，37℃培养过夜，次日挑选单克隆菌落，做质粒大小快速鉴定和双酶切(AflII/Xho I)鉴定(见图4、5)，最后测序。

(五)慢病毒生产与浓缩

生产病毒步骤具体如下：

1)转染前一天，用0.25％胰酶消化293Ft细胞，按1∶3的比例传到3个T75cm²培养瓶中，加入约10ml 293Ft培养基(不含抗生素)，放入37℃含5％CO₂培养箱进行培养。

2)转染当天，待细胞汇合达到瓶底面积的90％时，移除培养液，加入6ml 293Ft培养基(无抗生素)。

准备DNA-脂质体转染复合物(以一个T75cm²培养瓶用量为例)：

A：在一个无菌的5ml离心管中，将9μg ViraPower^TM Packaging Mix(Invitrogen)及3μgpLenti-U6-shRNA质粒，共12μg DNA，加入到1.9ml 293Ft无血清无双抗培养基中，轻轻混匀，待用。

B：取另一无菌5ml离心管，将36μl的脂质体Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen)加入1.9ml293FT无血清无双抗培养基中，轻轻吹吸混匀。迅速与A步的混合液混合，并轻轻混匀。

C：室温孵育20分钟，以形成DNA-脂质体转染复合物。

3)将转染复合物逐滴加入培养瓶中，并来回轻摇以混匀。37℃培养6～12小时后，换上10ml新的完全培养基(无抗生素)。

4)转染后72小时收集含病毒的上清到无菌有盖的15ml的尖底离心管内。此期注意实验安全。

5)4℃3000rpm离心15分钟，以去除细胞沉淀。

6)取上清，用孔径0.45μm的滤器(Millipore)小心地抽滤，不要产生气泡。

7)抽滤过的病毒原液经4℃5×10⁴g离心2h，弃上清，用100μl PBS 4℃重悬病毒沉淀，然后分装成小份放-80℃保存备用。不要反复冻融病毒，否则会导致病毒滴度下降。

(六)慢病毒转导猪胎儿成纤维细胞

1)转导前一天，将猪胎儿成纤维细胞以5×10⁴的密度接种到六孔板中。

2)当细胞汇合至瓶底面积的80％时开始转导，每个孔加入1ml病毒原液，再加1ml正常培养基，轻轻晃动混匀。待病毒原液侵染细胞12小时后换上新鲜的正常培养基继续培养。

3)病毒转导48小时后提取猪胎儿成纤维细胞总RNA，并反转录成cDNA。

4)以cDNA为模板，做Real-time PCR检测细胞中Myostatin mRNA水平变化。结果(图6)：与未用病毒处理的细胞(Mock组)相比，感染过表达shRNA的慢病毒的细胞中Myostatin表达水平下降了76.2％(P＜0.05)，差异显著，说明生产出的这种慢病毒颗粒能发挥抑制作用。

Claims (3)

1.一种肌肉生成抑制素基因敲除猪的制备方法，其特征是，

①从人血基因组中经PCR扩增得到的U6启动子序列连入pBluescript ⅡKS(+)质粒，得到pBluescript-U6载体；

②设计靶向猪Myostatin的siRNA序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，加上一个Loop序列SEQID NO.3转换成shRNA序列并交给公司合成，得到的shRNA经退火后连接到pBluescript-U6载体的U6启动子下游，得到能表达shRNA的质粒；

③将步骤②中构建的表达shRNA的质粒用Pst I和Xho I进行双酶切，酶切产物经浓度为1.5％琼脂糖胶电泳分离后切胶回收429bp的U6-shRNA片段；

④先以pLenti6/V5-GW/LacZ慢病毒系统的表达质粒为模板，设计引物序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，用高保真酶进行PCR扩增，得到的产物为6558bp的慢病毒载体骨架片段，将该产物胶回收并用Pst I和Xho I进行双酶切，酶切产物经浓度1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后再次切胶回收；

⑤将U6-shRNA片段和慢病毒载体骨架片段按3∶1摩尔比混合，在T4连接酶作用下16℃连接过夜，然后转化至JM109感受态细胞中，37℃培养过夜，次日挑选单克隆菌落，构建的质粒命名为pLenti-U6-shRNA；

⑥将重组慢病毒表达质粒pLenti-U6-shRNA与ViraPower^TM Packaging Mix按1∶3质量比例混合，质粒混合物再与脂质体按1μg∶3μl的比例混合孵育制作DNA-脂质体转染复合物，共转染293Ft细胞生产病毒；将生产的病毒进行超速离心浓缩，病毒沉淀用PBS重悬；

⑦病毒悬液用于猪受精卵卵周隙注射，每枚注射滴度为1×10⁹IU/ml的病毒液100pl，注射后的受精卵在体外培养72小时，然后移植到代孕母猪子宫制备转基因猪；或将病毒悬液通过与猪精子共孵育后人工受精制备转基因猪。

2.权利要求1所述的重组慢病毒表达质粒pLenti-U6-shRNA。

3.权利要求2所述的慢病毒表达质粒pLenti-U6-shRNA在制备Myostatin基因敲除猪方面的应用。

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