CN103249835B - 猪肌抑素基因座位及其应用 - Google Patents
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Abstract
提供了一种猪肌抑素基因座位及其应用。还提供了一种表达盒，由启动子、外源基因和终止子组成：所述启动子为如下1）--3）中任一项所述的DNA分子：1）序列表的序列1自5’末端第2642-3778位核苷酸；2）序列表的序列1所示的核苷酸；3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子。本发明的猪肌抑素基因座位为在该位点处进行基因打靶、转入并表达外源基因提供了有价值的基因资源。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种猪肌抑素基因座位及其应用。
背景技术
近十年来，转基因技术得到迅猛发展和广泛应用，特别是基因打靶与体细胞克隆技术的结合，使得转基因动物的基因定点修饰成为现实。该技术的关键是使外源基因在转基因动物基因组的特定位置定点整合并且稳定表达。该“特定位置”需满足如下条件：(1)该处基因序列的缺失或突变不引起宿主动物死亡；(2)该处基因序列的缺失或突变不引起宿主动物生长和发育异常或畸形；(3)该处基因序列的缺失或突变不引起宿主动物的不育；(4)该处基因序列受DNA甲基化水平的影响较小，特别是不存在印记修饰，以保证外源基因能够有效表达。因此，找到满足上述条件的理想“特定位置”是基因打靶和体细胞克隆成功应用的先决条件。
肌抑素基因最早于1997年由McPherron等人从小鼠肌肉组织cDNA文库中克隆。该基因属于TGF-β家族，是一种转化生长因子。基因敲除证明此基因的失活引起小鼠肌肉组织增生，体重增大；而且小鼠可以正常存活，也具有生育能力。随后在牛、羊等动物中发现，肌抑素基因的主要功能是负调控肌肉生长发育，而且肌抑素的失活并未导致上述动物的生理功能出现异常。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种表达盒。
本发明提供的表达盒，由启动子、外源基因和如下所述终止子组成；
所述启动子为如下1）-4）中任一所述的DNA分子：
1）序列表的序列1自5’末端第2642-3778位核苷酸；
2）序列表的序列1所示的核苷酸；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；
4）与1）或2）限定的DNA分子序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子；
所述终止子的核苷酸序列为序列表的序列3。
所述严格条件为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
所述外源基因为猪肌抑素基因或绿色荧光蛋白编码基因；
所述猪肌抑素基因的核苷酸序列为序列表的序列2；
所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列5；
所述绿色荧光蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列4。
含有所述表达盒的重组载体、重组菌、转基因细胞系、转基因动物胚胎或转基因动物也是本发明保护的范围。
所述重组载体为将所述表达盒插入pUC19载体的KpnI和HindIII酶切位点间得到的重组载体；
所述转基因细胞系为将所述重组载体导入宿主细胞中，得到的转基因细胞系，所述宿主细胞具体为C2C12细胞。
本发明的另一个目的是提供一种终止子。
本发明提供的终止子，为如下1）-3）中任一所述的DNA分子：
1）序列表的序列3所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；
3）与1）限定的DNA分子序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。
所述的终止子在终止外源目的基因表达中的应用。也是本发明保护的范围。
除非特别指出或是单独定义,本文所使用的科学和技术术语具有本发明所属领域技术人员共知的、无歧义的相同含义。另外,本文所述的材料、方法以及实施案例本意在于说明和阐述而非限制或限定。
本发明提供了猪肌抑素基因座位，包含了肌抑素基因编码区上游3778bp的5’非翻译区、4916bp的编码区和下游1446bp的3’非翻译区。通过荧光素酶报告基因测试证明，猪肌抑素基因座位5’非翻译区具有起始转录的活性，3’非翻译区具有终止转录的活性，二者与肌抑素基因编码区构成一个完整的表达单元，即基因座位。同时，本发明以该基因座位为基础构建了绿色荧光蛋白报告载体，证明在离体实验条件下，该基因座位能够有效启动外源基因的表达。该基因座位具有如下用途：(1)将外源基因插入到该基因座位肌抑素基因编码区，利用5’非翻译区和3’非翻译区调控其表达，构成相应的重组质粒、重组菌、转基因细胞系或是转基因动物；(2)以5’非翻译区或3’非翻译区为打靶位点失活肌抑素，或是失活肌抑素的同时插入外源基因，构成相应的重组质粒、重组菌、转基因细胞系或是转基因动物；(3)以5’非翻译区、编码区、3’非翻译区的任意二者的部分或全部序列为打靶位点，失活肌抑素，或是失活肌抑素的同时转入外源基因，构成相应的重组质粒、重组菌、转基因细胞系或是转基因动物；(4)以整个猪肌抑素基因座位为打靶位点，失活肌抑素，或是失活肌抑素的同时转入外源基因，构成相应的重组质粒、重组菌、转基因细胞系或是转基因动物。本发明为解决转基因猪外源基因表达不稳定性以及位置效应的不可预知性等问题，提供了可靠、有价值的基因资源。
附图说明
图1为猪肌抑素基因座位5’端序列扩增
图2为猪肌抑素基因座位5’端序列克隆
图3为猪肌抑素基因座位5’端序列转录活性检测
图4为猪肌抑素基因座位3’端序列扩增
图5为猪肌抑素基因座位3’端序列克隆
图6为猪肌抑素基因座位3’端序列转录活性检测
图7为扩增猪肌抑素基因编码区PCR产物电泳图
图8为猪肌抑素基因座位载体pUC19-3酶切鉴定图
图9为猪肌抑素基因座位载体pUC19-53酶切鉴定图
图10为猪肌抑素基因座位载体pUC19-5MSTN3酶切鉴定图
图11为猪肌抑素基因座位组织结构示意图
图12为绿色荧光蛋白编码区PCR扩增产物电泳图
图13为pUC19-5EGFP3载体的酶切鉴定图
图14为pUC19-5EGFP3载体的表达检测
图15为pUC19-5EGFP3绿色荧光蛋白的相对表达强度
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔等著,黄培堂等译，科学出版社，2002，分子克隆实验指南第三版所建议的条件。
实施例1、猪肌抑素基因座位调控区域的克隆与活性鉴定
一、猪肌抑素基因座位5’非翻译区的克隆及活性验证
1、猪肌抑素基因座位5’非翻译区的克隆
表1实验材料
1）猪基因组DNA提取
取仔猪的离体猪耳肌肉组织样0.1克，洗净，剪碎，提取猪基因组DNA。
2）猪肌抑素基因座位5’非翻译区片段的PCR扩增
以上述得到的基因组DNA为模板，带有预设酶切位点的特异引物（MSTN-5F和MSTN-5R）扩增猪肌抑素基因座位5’非翻译区，反应结束后，以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图1所示，M为1kb DNA分子量标准，长度大小依次为0.5kb，1kb，1.5kb，2kb，3kb，4kb，5kb，6kb，8kb，10kb，PCR扩增得到3778bp片段。
将该PCR产物送至华大基因测序，测序引物为Glprimer2，结果为该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，将该PCR产物命名为DNA片段A，即为猪肌抑素基因座位5’非翻译区序列。根据真核生物基因转录的普遍特征，可知从该序列5’末端第3646-3650位为5’端转录必需元件CAAT盒(5’端CAAT盒)，从5’末端第3687-3693位为上游转录必需元件TATA盒，从5’末端第3710-3716位为下游转录必需元件TATA盒。
序列1也可人工合成。
3）猪肌抑素基因座位5’非翻译区的克隆与鉴定
将上述2）得到的PCR产物经MluI和XhoI酶切得到的片段与经过同样酶切得到的报告载体pGL3-basic片段以下述体系做连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜，得到转化子。以MSTN-5F和MSTN-5R引物对上述获得的转化子进行菌落PCR鉴定，能够得到3778bp扩增产物的重组子即为阳性质粒，将阳性质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表的序列1插入pGL3-baisc的MluI和XhoI酶切位点得到的质粒，将该质粒命名为pGL3-5’MSTN，序列1插入pGL3-baisc的萤火虫荧光素酶的上游。
在所克隆的猪肌抑素基因座位5’非翻译区内部有一个天然的BglII酶切位点，而在基础载体pGL3-basic的多克隆位点处有另外一个BglII酶切位点。用限制性内切酶BglII单酶切pGL3-5’MSTN，结果如图2所示，“-”表示未酶切的pGL3-5’MSTN，“BglII”表示BglII单酶切pGL3-5’MSTN。可以看出，经BglII酶切后，该载体释放出2.7kb的片段，与理论分析完全吻合，证明该载体含有猪肌抑素基因5’非翻译区序列。
2、猪肌抑素基因座位5’非翻译区的转录活性鉴定
表2实验材料
1）、细胞转染
转染前一天,将4×104C2C12细胞铺到24孔板中,隔夜生长后按照表中所列体系配制转染复合物,滴于24孔板中，补加400μl完全培养基，置于37℃,5%CO2的条件下培养。在转染48h后收集细胞。按照Promega公司的DLRMAssay试剂盒说明书进行荧光素酶活性测定。
转染体系如下：
表3转染体系
实验设置三个生物学重复，结果取平均值,结果如表4和图3所示。
表4报告载体的酶活绝对值与相对比值
如表4及图3所示，本发明所克隆的猪肌抑素基因座位5’非翻译区因含有真核生物转录所需的转录起始元件，经荧光素酶报告基因测试，证明其确实具有一定的转录活性；其活性相比于阳性对照质粒pGL3-promoter的SV40启动子较弱，但是相对于无启动子的阴性对照质粒pGL3-basic，其活性仍然较强。*，p<0.05,差异显著。这一方面说明本发明得到的猪肌抑素基因座位5’非翻译区包含了猪肌抑素基因的启动子元件，另一方面也说明该非翻译区可作为基因打靶的靶点，用于失活猪肌抑素基因的转录和表达；再者，该序列也可作为基因打靶的同源臂，在发挥同源重组作用的同时，驱动外源基因的原位表达。5’非翻译区即为启动子。
二、猪肌抑素基因座位3’非翻译区的克隆及活性鉴定
1、猪肌抑素基因座位3’非翻译区的克隆
表5实验材料
1）猪基因组DNA提取
提取仔猪的离体猪耳肌肉组织的基因组DNA。
2）猪肌抑素基因座位3’非翻译区片段的PCR扩增
以上述得到的基因组DNA为模板，带有预设酶切位点的特异引物（MSTN-UTR-F和MSTN-UTR-R）扩增猪肌抑素基因座位3’非翻译区，反应结束后，以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图4所示，M为1kb DNA分子量标准，长度大小依次为0.5kb，1kb，1.5kb，2kb，3kb，4kb，5kb，6kb，8kb，10kb，PCR扩增得到1446bp片段。
将该PCR产物送至华大基因测序，测序引物为UTR-S，结果为该PCR产物具有序列表中序列3所示的核苷酸，将该PCR产物命名DNA片段C，即为猪肌抑素基因座位3’非翻译区序列。根据真核生物基因转录终止的普遍特征，可知从该序列5’末端第183-188位、597-602、921-926、1282-1287为猪肌抑素基因信使mRNA多聚腺苷化所必需的AATAAA信号序列。
序列3也可人工合成。
3）猪肌抑素基因座位3’非翻译区的克隆与鉴定
将上述2）得到的PCR产物经HpaI和SalI酶切得到的片段与经过同样酶切得到的报告载体pGL3-promoter片段以下述体系做连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜，得到转化子。以MSTN-UTR-F和MSTN-UTR-R引物对上述获得的转化子进行菌落PCR鉴定，能够得到1446bp扩增产物的重组子即为阳性质粒，将阳性质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列3插入pGL3-promoter的HpaI和SalI酶切位点间得到的质粒，将该质粒命名为pGL3-3’MSTN，序列3插入pGL3-promoter的萤火虫荧光素酶的下游。
在所克隆的猪肌抑素基因座位3’非翻译区内部有一个天然的XbaI酶切位点，而在基础载体pGL3-promoter的海肾荧光素酶基因末端有另外一个XbaI酶切位点。用限制性内切酶XbaI单酶切pGL3-3’MSTN，结果如图5所示，“-”为质粒，“XbaI”为酶切后的质粒，可以看出，经XbaI酶切后，pGL3-3’MSTN释放出0.75kb的片段，与理论分析完全吻合，证明该载体含有猪肌抑素基因3’非翻译区序列。
2、猪肌抑素基因座位3’非翻译区的转录活性鉴定
1）、细胞转染
转染前一天,将4×104C2C12细胞铺到24孔板中,隔夜生长后按照表中所列体系配制转染复合物,滴于24孔板中，补加400μl完全培养基，置于37℃,5%CO2的条件下培养。在转染48h后收集细胞。按照Promega公司的DLRMAssay试剂盒说明书进行荧光素酶活性测定。
转染体系同上述表3，实验设置三个生物学重复，结果取平均值,如表6和图6所示。
表6报告载体的酶活绝对值与相对比值
如表6及图6所示，本发明所克隆的猪肌抑素基因座位3’非翻译区因含有真核生物转录所需的转录终止元件，经荧光素酶报告基因测试，证明其确实具有一定的转录终止活性。*，p<0.05,差异显著。这一方面说明本发明得到的猪肌抑素基因座位3’非翻译区包含了猪肌抑素基因的终止元件，另一方面也说明该非翻译区可作为基因打靶的靶点，用于失活猪肌抑素基因的转录和表达；再者，该序列也可作为基因打靶的同源臂，在发挥同源重组作用的同时，用于终止外源基因的转录和促进翻译。3’非翻译区即为终止子。
实施例2、猪肌抑素基因座位全序列的获得及其功能研究
一、猪肌抑素基因座位全序列的获得
1、实验材料
表7实验材料
2、实验方法
1）猪肌抑素基因座位5’非翻译区、猪肌抑素基因、猪肌抑素基因座位3’非翻译区的获得
提取仔猪的离体猪耳肌肉组织样的基因组DNA；以上述得到的基因组DNA为模板，用MSTN-F和MSTN-R为引物进行PCR扩增，结果如图7所示，得到5kb的PCR产物为DNA片段B，经过测序，其核苷酸序列为序列2，与理论分析相符，证明本发明获得了猪肌抑素基因MSTN的编码区全序列。
提取仔猪的离体猪耳肌肉组织样的基因组DNA；以上述得到的基因组DNA为模板，用MSTN-5’F和MSTN-5’R为引物进行PCR扩增，得到PCR产物为DNA片段A，即为猪肌抑素基因座位5’非翻译区（序列1，启动子）；
以上述得到的基因组DNA为模板，用MSTN-3’F和MSTN-3’R为引物进行PCR扩增，得到PCR产物为DNA片段C，即为猪肌抑素基因座位3’非翻译区（序列3，终止子）。
2）将3’非翻译区插入pUC19载体
将上述1）得到的3’非翻译区DNA片段C经PstI和HindIII酶切，与经相同酶切pUC19载体连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜，得到转化子。以MSTN-3’F和MSTN-3’R引物对上述获得的转化子进行菌落PCR鉴定，能够得到1446bp扩增产物的重组子即为阳性质粒，将阳性质粒用PstI与HindIII双酶切，结果如图8所示，其中“+”为酶切后质粒，“-”为质粒，可以看出得到1446bp，与理论分析相符。M为Lamda DNA/Eco91I分子量标准，片段长度从小到大依次为702bp，1264bp，1371bp，1929bp，2323bp，3675bp，4324bp，4822bp，6369bp，7242bp，14140bp。经过测序，该质粒为将序列表中的序列3插入将pUC19的PstI和HindIII位点得到的载体，该质粒命名为pUC19-3。
3）将5’非翻译区插入pUC19-3载体
将上述1）得到的5’非翻译区DNA片段A经KpnI和BamHI酶切，与经相同酶切的步骤2）得到的pUC19-3载体连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜，得到转化子。以MSTN-5’F和MSTN-5’R引物对上述获得的转化子进行菌落PCR鉴定，能够得到3778bp扩增产物的重组子即为阳性质粒。将阳性质粒用BamHI与KpnI双酶切，释放出3778bp，结果如图9所示，其中“+”为酶切后质粒，“-”为质粒，与理论分析相符。将该质粒命名为pUC19-53。M为1kb DNA分子量标准，长度大小依次为0.5kb，1kb，1.5kb，2kb，3kb，4kb，5kb，6kb，8kb，10kb。
4）猪肌抑素基因表达框克隆进pUC19-53载体
将上述1）得到的猪肌抑素基表达框PCR产物（DNA片段B）经BamHI和PstI酶切，与经过同样酶切的pUC19-53载体片段连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜，得到转化子。以MSTN-F和MSTN-R引物对上述获得的转化子进行菌落PCR鉴定，能够得到5Kb扩增产物的重组子即为阳性质粒。将该质粒用BamHI和PstI双酶切，载体释放出5kb的片段，结果如图10所示，其中“+”为酶切后质粒，“-”为质粒，与理论分析相符，命名为pUC19-5MSTN3。将该质粒测序发现，其含有依次由5’非翻译区DNA片段A（序列1）、猪肌抑素基因DNA片段B（序列2）、3’非翻译区DNA片段C（序列3）组成的DNA分子，即为猪肌抑素基因座位，且该DNA分子插入pUC19的KpnI和HindIII酶切位点间。
该猪肌抑素基因座位示意图为图11。可以看出，猪肌抑素基因座位包含三个部分：5’非翻译区，肌抑素基因编码区，3’非翻译区。本发明确定猪肌抑素基因座位5’非翻译区的长度为3776bp，该序列包含了猪肌抑素基因的所有转录起始元件，如TATA盒(2个)与CAAT盒(1个)，以及MEF(myocyte enhancer factor，肌肉细胞增强因子)结合序列等。肌抑素基因编码区包含三个外显子和两个内含子，全长3789bp。外显子长度分别为373bp、374bp和381bp；内含子长度分别为1809bp和1980bp。本发明确定3’非翻译区的长度为1446bp，该序列包含了肌抑素信使RNA(messenger RNA,mRNA)翻译所必需的多聚腺苷化信号(polyAsignal)。
也可人工合成该基因座。
二、利用猪肌抑素基因座位离体表达外源基因
1、报告载体pUC19-5EGFP3的获得
1）绿色荧光蛋白表达框的获得
以pIRES2-EGFP为模板，用EGFP-F和EGFP-R为引物，进行PCR，得到PCR产物经过测序，以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图12所示，M为DL2000DNA分子量标准，长度大小依次为0.1kb，0.25kb，0.5kb，0.75kb，1kb，2kb。PCR扩增得到绿色荧光蛋白720bp的片段，经测序，其核苷酸序列为序列4（绿色荧光蛋白表达框），其氨基酸序列为序列5。
2）pUC19-5EGFP3的获得
将上述1）得到的绿色荧光蛋白表达框（序列4）经BamHI和SalI酶切，与经过同样酶切的由上述一得到的pUC19-5MSTN3载体片段连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜，得到转化子。以EGFP-F和EGFP-R引物对上述获得的转化子进行菌落PCR鉴定，能够得到720bp扩增产物的重组子即为阳性质粒，将该阳性质粒利用BamHI与SalI双酶切，结果如图13所示，其中“+”为酶切后质粒，“-”为质粒，可以看出，酶切后该载体释放出720bp的片段，与理论分析相符。M为1kb plus DNA分子量标准，各条片段的长度分别为100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，650bp，850bp，1000bp，1650bp，2000bp，3000bp，4000bp，5000bp，6000bp，7000bp，8000bp，9000bp，10000bp，12000bp。再将该阳性质粒送去测序，该质粒为将序列表中的序列4插入pUC19-5MSTN3的BamHI和SalI酶切位点得到的质粒，且替换掉MSTN（序列2），将该质粒命名为pUC19-5EGFP3，即为将启动子、绿色荧光蛋白表达框和终止子插入pUC19的KpnI和HindIII酶切位点间。
2、报告载体pUC19-5EGFP3的表达检测
转染前一天,将4×104C2C12细胞铺到24孔板中,隔夜生长后按照表中所列体系配制转染复合物,滴于24孔板中，补加400μl完全培养基，置于37℃,5%CO2的条件下培养。24小时后用德国Leika显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。
转染体系如下：
表8转染体系
结果如图14所示，可以看出，阳性对照pIRES2-EGFP表达较强的绿色荧光蛋白，阴性对照pUC19-5MSTN3不表达绿色荧光蛋白，pUC19-5EGFP3转染肌肉细胞后，能够观察到该载体表达较强的绿色荧光蛋白。
采用ImageJ(http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html)软件分析上述图14中pIRES2-EGFP（阳性对照）、pUC19-5MSTN3(阴性对照)和pUC19-5EGFP3的荧光强度，结果如图15所示（以pUC19-5MSTN3(阴性对照)为基础），说明本发明提供的猪肌抑素基因座位在离体实验条件下能够表达外源基因。
Claims (11)
1.一种表达盒，由启动子、外源基因和终止子组成；
所述启动子为如序列表中序列1所示的核苷酸所组成的DNA分子；
所述终止子的核苷酸序列为序列表的序列3。
2.根据权利要求1所述的表达盒，其特征在于：
所述外源基因为猪肌抑素基因或绿色荧光蛋白编码基因；
所述猪肌抑素基因的核苷酸序列为序列表的序列2；
所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列5。
3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于：所述绿色荧光蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列4。
4.含有权利要求1-3任一所述表达盒的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求1-3任一所述表达盒插入pUC19载体的多克隆位点得到的重组载体。
6.含有权利要求1-3任一所述表达盒的重组菌。
7.含有权利要求1-3任一所述表达盒的转基因细胞系。
8.根据权利要求7所述的转基因细胞系，其特征在于：所述转基因细胞系为将权利要求4或5所述重组载体导入宿主细胞中，得到的转基因细胞系。
9.根据权利要求8所述的转基因细胞系，其特征在于：所述宿主细胞为C2C12细胞。
10.权利要求1-3任一所述的表达盒或权利要求4或5所述的重组载体在促进外源基因在离体细胞中表达的应用，所述离体细胞为C2C12细胞。
11.一种终止子在终止外源目的基因表达中的应用，所述终止子为序列表的序列3所示的DNA分子。
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