CN108949832A - 一种用于敲除猪ghr基因的打靶载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体公开一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体及其应用。所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，其中，sgRNA的靶标序列分别位于猪GHR基因的第10外显子和3′UTR上。利用本发明所述打靶载体对猪GHR基因进行靶向敲除，敲除效率可达到12.7％，将GHR基因敲除成功的体细胞通过体细胞核移植技术还可进一步构建GHR基因敲除猪模型，为研究GHR基因的生理作用和分子机制提供材料。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体及敲除GHR基因的猪细胞系的制备方法。
背景技术
莱伦氏综合征(Laron syndrome)是一种生长激素受体(Growthhormonereceptor,GHR)突变造成的罕见常染色体隐性遗传病。这一突变造成生长激素通过GHR的信号转导出现障碍，进而影响胰岛素样生长因子1(Insulin like growth factor 1,IGF1)的产生，最终影响生长激素对机体的促生长、代谢、发育作用。该病主要病症是(1)侏儒；(2)体内低水平的生长激素，高水平的IGF1。目前临床上主要通过给患者补充IGF1来治疗该疾病，但长期补充IGF1不可避免的会产生一系列的副作用，例如肥胖、低血糖、头痛、颅内高血压、淋巴结肿胀和雄激素增多等。随着研究人员对该病的研究，发现罹患该病的患者具有极低几率患癌症的特点，多发展为脂肪肝，并且以GHR缺陷的小鼠为研究对象，发现GHR缺陷可能与肥胖、低血脂症、心血管等疾病相关。
为了研究莱伦氏综合征的致病机理及筛选治疗药物，人们建立大量的小鼠模型，用于研究GHR在繁殖、生长、糖脂代谢、寿命和肥胖等方面的作用。但由于小鼠与人存在的差异，在研究骨骼生长和脂肪代谢方面与人类差别巨大。而猪与人具有相似的大小和生理状态，猪的器官发育及疾病进展也与人类似，并且猪的基因组序列及染色体结构与人具有高度同源性，更有利于疾病机理的探究。
因此，急需提供一种可高效构建GHR敲除猪疾病模型的方法，为莱伦氏综合征的治疗提供良好的研究基础。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体及其应用，所述打靶载体可实现对猪GHR基因的高效敲除。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，其中，sgRNA的靶标序列分别位于猪GHR基因的第10外显子和3′UTR上。
作为优选，所述靶标序列符合5′-N(20)NGG-3′的排列规则，其中N(20)表示20个连续的碱基，每个N表示A或T或C或G中的任意一个碱基。
所述sgRNA表达载体是将sgRNA的靶标序列的5′端加上BbsI酶切位点序列，并人工合成其互补序列，将两条互补序列形成的双链DNA，与经过BbsI酶切的初始载体相连接。
优选所述初始载体为本领域常用的pX330。
进一步优选，靶标序列位于猪GHR基因第10外显子的sgRNA序列如下：
U1-F：caccgTCATATAGTACAGTCTCCAC；
U1-R：aaacGTGGAGACTGTACTATATGAc；
靶标序列位于猪GHR基因3′UTR区sgRNA序列如下：
D3-F：caccgAATAGGGCTAGGAAGGAGGC；
D3-R：aaacGCCTCCTTCCTAGCCCTATTc。
本发明还进一步提供了所述打靶载体在制备猪GHR基因敲除细胞或GHR基因敲除猪方面的应用。
所述应用具体表现为，利用本发明所述打靶载体转染猪体细胞系，筛选获得GHR基因敲除的细胞，或进一步将获得的GHR基因敲除的细胞，通过体细胞核移植技术制备GHR基因敲除猪。
所述体细胞系为成纤维细胞系或肾细胞系，为后续验证更为方便，选取增殖能力较好的猪肾细胞系进行实验。
本发明还提供了一种制备猪GHR基因敲除细胞的方法，将前述打靶载体转染猪体细胞系，筛选获得GHR基因敲除的细胞。
本发明还提供了一种制备GHR基因敲除猪的方法，将前述打靶载体转染猪成纤维细胞系，筛选获得GHR基因敲除的成纤维细胞，并将所获得的GHR基因敲除的成纤维细胞，通过体细胞核移植技术制备GHR基因敲除猪。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明采用新型基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统，在中国实验用小型猪(Chinese Experimental Mini pig,CEMP)GHR基因上及其附近设计敲除靶位点，利用构建好的GHR基因敲除打靶载体，通过电击法转染猪肾细胞系，筛选获得GHR基因敲除的猪肾细胞共71个克隆，其中GHR敲除纯合子克隆1个，杂合子克隆8个，敲除效率达到12.7％。在此基础上，还可进一步筛选GHR基因敲除的成纤维细胞系，通过体细胞核移植技术获得GHR基因敲除猪。
本发明的有益效果在于：本发明利用CRISPR/Cas9系统能够快速高效地将目的基因大片段敲除，且不留下外源基因片段。本发明利用CRISPR/Cas9系统可以快速高效的构建GHR基因敲除猪模型，为研究GHR基因的生理作用和分子机制提供材料，通过观察GHR基因敲除猪的生理生化指标，以及转录组分析等，研究人员可以更深入地对GHR基因的作用机制和机理展开探究。
附图说明
图1为实施例1中针对GHR基因第10外显子和3′UTR设计的基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体在猪成纤维细胞中的突变效率验证，其中U1、U2、U3、D1、D2、D3表示所设计sgRNA的T7E1酶切实验；WT表示未转染猪成纤维细胞PCR产物。
图2为实施例1中绿色荧光观察电击转染效率。
图3为实施例1中细胞单克隆荧光素酶活性分析。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的pEGFP载体和pX330载体为Addgene公司产品。
实施例1
本实施例采用CRISPR/Cas9技术制备猪GHR基因敲除细胞，具体实验步骤如下：
一、表达载体构建
所用骨架载体为pX330载体，针对部分第10外显子设计U1-U3sgRNA，针对3′UTR设计D1-D3sgRNA，此外为了区分是部分第10外显子缺失或3′UTR区缺失造成侏儒表型，在第10外显子第一个polyA之后设计M1-M4sgRNA，其中sgRNA表达载体具体构建过程如下：
将表1中每个靶序列的两条寡核苷酸片段稀释到200mM后混合，退火形成双链，连接到经BbsI酶(NEB(USA)公司)酶切后得到的pX330骨架载体上，并测序验证得到序列正确的10个重组载体。
表1靶向猪GHR基因的sgRNA序列
二、载体效率验证
通过电击法将构建好的10个重组载体分别和pEGFP载体共转入猪胎儿成纤维细胞(12CEPEF2)中，检验各载体的靶点相对切割效率，实验重复三次。72小时后收集细胞，提取基因组，用高保真KOD-Plus对上游和中游靶点使用Exon10-F1/R1进行PCR扩增。对下游靶点使用Exon10-F2/R2进行PCR扩增。利用Surveyor法(错配酶法)—T7ENI酶(NEB(USA)公司)酶切验证，通过跑PAGE胶来检测Px330载体骨架上sgRNA的突变效率。结果表明设计的M1-M4靶点没有发生突变，上游和下游的靶点中都有可以成功突变基因的有效的sgRNA，突变效率分别为U1(23％)、U2(20％)、U3(17％)、D3(17％)(图1)，因此选择效率较高的U1及D3，同时删除GHR基因部分第10外显子和3′UTR区，构建GHR缺失细胞系。
表2效率验证引物
三、GHR敲除细胞单克隆筛选
培养实验室现有的猪肾细胞系：通过购自北京协和细胞库的IBRS和PK15采用本领域常规的细胞系培养方法得到，待长到106时，采用电击法共转4μg pX330-U1和pX330-D3，48h后分盘。并分别转染GFP质粒观察细胞转染效率。24h后观察荧光，结果表明IBRS电转效率非常高(图2)。接着，将细胞稀释后接种到培养皿中(200cell/10cm2皿)，各铺10盘，待7-10天后即可挑选单克隆。对于形成的单克隆细胞，经传代扩大培养后，一部分冻存留作后续功能验证，另一部分细胞提取基因组利用引物F1/R1和F2/R2进行PCR鉴定。此次IBRS挑选23个单克隆，PK15挑选48个单克隆。所用引物如下：
F1：CCAGGAAGACATTTACATCACC；
R1：AGCCCGCATTAACTACAGGACA；
F2：AATATCCTGCTGGCTTGTCTGG；
R2：TCATAAGGCTGAGTCCCGTGTT。
结果显示，利用CRISPR/Cas9系统，在以上的单克隆细胞中，有1个纯合子，1个杂合子来源于PK15细胞系，6个杂合子来源于IBRS细胞系，阳性克隆率为12.7％。
将阳性克隆的PCR产物进行测序，结果发现，所有的阳性克隆中的GHR基因均有不同程度的缺失。
四、GHR敲除功能验证
构建GHR功能验证的荧光素酶报告载体
选取三种基因型的细胞系，分别共转Spi-F2-pGL3-Basic和pRL-TK，稳定转染后添加50nM rhGH进行诱导，分别诱导15min,30min,1h,3h,5h,并且以不添加rhGH为空白对照，检测萤火虫荧光素酶活性。
实验结果显示，在没有激素的作用下，报告质粒在三种细胞系中都有不同程度的表达,而在PK15-21#单等位敲除GHR部分exon 10和3′UTR的细胞系中的表达要较双敲的PK15-17#和野生型的高(图3)。从三种细胞系来看，在50nM rhGH的作用下PK15-21#和PK15-WT细胞系中的报告质粒的相对表达量有着显著水平的提高，双敲的PK15-17#中报告质粒的表达却没有太大变化。实验结果证明GHR+/-在高浓度rhGH诱导条件下还可以发挥功能，但GHR-/-功能已丧失(图3)，因此通过杂合猪自然交配的方式优先选择双敲猪进行后续功能等相关研究。
应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体及其应用
<141> 2018-07-11
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caccgtcata tagtacagtc tccac 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaacgtggag actgtactat atgac 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccgtcagg caagggcagg gctg 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaaccagccc tgcccttgcc tgac 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccgggctg tggcattgag tacg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaaccgtact caatgccaca gccc 24
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caccgtccat gagctacctg tttaa 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaacttaaac aggtagctca tggac 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caccgccaac cctttgccat taaac 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaacgtttaa tggcaaaggg ttggc 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caccggtcag gcaagggcag ggctg 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaaccagccc tgcccttgcc tgacc 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caccgaacaa tgtttaaacc ttttg 25
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaaccaaaag gtttaaacat tgttc 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caccgatcca attttgctgc gatgt 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aaacacatcg cagcaaaatt ggatc 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
caccggacca taaaaagaga aaaat 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aaacattttt ctctttttat ggtcc 25
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
caccgaatag ggctaggaag gaggc 25
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aaacgcctcc ttcctagccc tattc 25
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ccaggaagac atttacatca cc 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
agcccgcatt aactacagga ca 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aatatcctgc tggcttgtct gg 22
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tcataaggct gagtcccgtg tt 22
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccaggaagac atttacatca cc 22
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agcccgcatt aactacagga ca 22
<210> 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatatcctgc tggcttgtct gg 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tcataaggct gagtcccgtg tt 22
Claims (10)
1.一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，其中，sgRNA的靶标序列分别位于猪GHR基因的第10外显子和3′UTR上。
2.根据权利要求1所述的打靶载体，其特征在于，所述靶标序列符合5′-N(20)NGG-3′的排列规则，其中N(20)表示20个连续的碱基，每个N表示A或T或C或G中的任意一个碱基。
3.根据权利要求2所述的打靶载体，其特征在于，所述sgRNA表达载体是将sgRNA的靶标序列的5′端加上BbsI酶切位点序列，并人工合成其互补序列，将两条互补序列形成的双链DNA，与经过BbsI酶切的初始载体相连接。
4.根据权利要求3所述的打靶载体，其特征在于，所述初始载体为pX330。
5.根据权利要求1～4任一项所述的打靶载体，其特征在于，靶标序列位于猪GHR基因第10外显子的sgRNA序列如下：
U1-F：caccgTCATATAGTACAGTCTCCAC；
U1-R：aaacGTGGAGACTGTACTATATGAc；
靶标序列位于猪GHR基因3′UTR区sgRNA序列如下：
D3-F：caccgAATAGGGCTAGGAAGGAGGC；
D3-R：aaacGCCTCCTTCCTAGCCCTATTc。
6.权利要求1～5任一项所述的打靶载体在制备猪GHR基因敲除细胞或GHR基因敲除猪方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用所述打靶载体转染猪体细胞系，筛选获得GHR基因敲除的细胞，或进一步将获得的GHR基因敲除的细胞，通过体细胞核移植技术制备GHR基因敲除猪。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述体细胞系为成纤维细胞系或肾细胞系。
9.一种制备猪GHR基因敲除细胞的方法，其特征在于，将权利要求1～5任一项所述的打靶载体转染猪体细胞系，筛选获得GHR基因敲除的细胞。
10.一种制备GHR基因敲除猪的方法，其特征在于，将权利要求1～5任一项所述的打靶载体转染猪成纤维细胞系，筛选获得GHR基因敲除的成纤维细胞，并将所获得的GHR基因敲除的成纤维细胞，通过体细胞核移植技术制备GHR基因敲除猪。
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