CN113774087A

CN113774087A - 一种侏儒综合征动物模型的构建方法

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Publication number: CN113774087A
Application number: CN202111119066.9A
Authority: CN
Inventors: 朱向星; 唐冬生; 严爱芬; 冯娟; 刘连; 张晓莉; 盘家圣; 林子盛; 文健聪
Original assignee: Foshan University
Current assignee: Foshan University
Priority date: 2021-09-24
Filing date: 2021-09-24
Publication date: 2021-12-10

Abstract

本发明公开了一种侏儒综合征动物模型的构建方法。本发明利用“All‑in‑one”改良型ABE质粒，其包含行使单碱基编辑的ABE和sgRNA表达元件，来对猪GHR基因进行单个腺嘌呤碱基编辑，从而制备出能够发生针对外显子6跳跃的单细胞集落。经Western Blotting鉴定所述单细胞集落表明发生了GHR蛋白缺失，经基因测序没有检出sgRNA依耐性基因组脱靶，表明成功在猪细胞内精准引发了ABE介导的外显子跳跃并实现基因敲除。

Description

一种侏儒综合征动物模型的构建方法

技术领域

本发明涉及遗传工程技术领域，特别涉及一种侏儒综合征动物模型的构建方法。

背景技术

生长激素受体基因(Growth hormone receptor,GHR)是细胞接受生长激素的细胞膜受体，生长激素通过与GHR结合来触发细胞内信号，发挥刺激细胞生长和分裂的生物学效应。人类GHR功能缺失性突变将引发Laron综合征(Laron syndrome)，猪GHR功能缺失性突变将引发类似Laron综合征的身材矮小和发育迟缓等表型，因此GHR基因敲除猪是模拟人类Laron综合征的理想大动物模型。

猪的传统遗传改良受育种周期长和遗传资源局限等因素的限制，凸显出基因修饰技术在猪遗传改良中的巨大潜力。通过基因修饰技术能够只经一个世代就可使猪的某项可遗传生产性状得到显著提升。利用基因修饰技术，国内外科技工作者们先后培育出多种具有优良生产性状的基因修饰猪，使得猪的饲料利用率、瘦肉率、抗病力以及脂肪酸健康品质等得到显著改善。除了在农业生产领域具有巨大应用潜力之外，基因修饰猪作为一种理想的动物模型也具有重要的生物医学研究利用价值。与其它哺乳动物(如啮齿类、反刍类等)相比，猪具有许多优势。首先，在身体尺寸、生理学、器官发育、疾病进程、基因序列和染色体结构等方面均与人类高度相似，因而能够更好地模拟人类疾病；其次，猪具有较高的繁殖性能，如性成熟早(5～8月)、世代间隔短(10～12月可繁殖一代)、产仔数多(平均每窝10～12头)以及全年可发情繁殖等，因而能够快速获得大量的实验材料；最后，随着以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术在猪基因修饰上的高效应用，使得构建精准模拟人类疾病的基因修饰猪变得更为容易和便捷。

CRISPR/Cas9的作用机制是Cas9蛋白与向导RNA(Single guide RNA，sgRNA)融合后，能够在sgRNA匹配的目标基因位点处切割DNA，产生DNA双链断裂(Double strandbreak，DSB)，由此激活细胞内非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)或同源重组(Homology directed recombination，HDR)这两种DNA损伤修复机制。NHEJ是一种DNA发生DSB后的紧急修复策略，在拼接断裂的DNA双链的同时，通常会在断裂处发生插入或删除一定数量的碱基对，即引入indel(insertion and deletion)突变，当indel为非三的整数倍时，将引发移码突变使得编码蛋白质功能丧失，即基因敲除(Gene knockout)。HDR是一种更为精确的修复方式，在存在同源修复模板的情况下实现对DSB的精确修复，并向基因组中引入外源基因序列，实现基因敲入(Gene knockin)。CRISPR/Cas9基因编辑技术已经在包括猪在内的众多物种上实现高效基因改造。但近年的研究表明，CRISPR/Cas9引发的DNA双链断裂，可能导致基因编辑后的细胞出现不可预期的混乱，如但经NHEJ所致的基因插入/缺失突变不可控，还能引发脱靶效应、基因组大范围删除或重排，以及诱导抑癌基因p53介导DNA损伤等。

为了避免制造DSB引发副作用，科学家开发出不依赖DSB并仅导致单个碱基突变的基因编辑工具，如胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine Base Editor,CBE)、腺嘌呤碱基编辑器(Adenine Base Editor,ABE)。其中ABE是将仅能产生DNA单链缺口的切口Cas9蛋白(Nickase Cas9，nCas9)与大肠杆菌RNA腺嘌呤脱氨酶TadA融合，在sgRNA的引导下将4-8位的A·T碱基对定向转换成G·C碱基对，实现对基因组点突变的定点矫正修复。由于ABE不导致DNA双链断裂，能有效规避CRISPR/Cas9引发的副作用，行使单个碱基定向转换，且被证明具有更高的DNA和RNA水平的基因编辑精准性，因而在农业和医学领域具有巨大应用潜力。如将ABE用来对猪进行基因编辑，就能在造成最低限度DNA改变的基础上实现目标基因修饰，因而在猪遗传改良和疾病模型构建上具有更高的精准性和生物安全性。

在存在protospacer adjacent motif(PAM)序列的情况下，ABE可被用于在猪基因组特定位置引入A·T→G·C转换，从而模拟单碱基突变遗传病。但要实现基因敲除，一般只能靶向基因起始密码子ATG，进行ATG→GTG转换，或靶向反向互补序列实现ATG→ACG转换，使得该基因在RNA水平无法启动翻译或发生移码突变，从而达到基因敲除的目的。由于ABE的作用依赖于NGG模式的PAM序列，且其编辑窗口在sgRNA的4-8位，因此理论上针对起始密码子ATG具有合适PAM序列的概率为62.5％(10/16)，亦即有约近四成的概率无法利用ABE介导的基因起始密码子破坏来实现基因敲除，因此ABE在猪遗传修饰中的应用大幅度受限。

发明内容

本发明目的在于提供一种侏儒综合征动物模型的构建方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。

碱基编辑器介导的外显子跳跃能够制造新的mRNA，若跳跃的外显子长度为非三的整数倍，则将引发移码突变导致基因敲除。由于真核生物基因通常由数个乃至数十个外显子组成，因而碱基编辑介导的外显子跳跃将显著拓展其开展基因敲除的潜力。

一种侏儒综合征动物模型的构建方法，以猪GHR基因6号外显子为跳跃目标，通过腺嘌呤碱基编辑器介导的外显子跳跃实现猪GHR基因敲除，从而构建侏儒综合征动物模型。具体包括以下步骤：

1)由NCBI GenBank Gene ID:397488获取猪GHR基因全序列(GHR growth hormonereceptor[Sus scrofa(pig)])，根据其6号外显子剪接受体或剪接供体合成sgRNA引物对并形成引物二聚体；

2)用限制性内切酶将PX-ABEmaxAW质粒线性化，与所述引物二聚体混合后用DNA连接酶于反应，得到连接产物；

3)将所述连接产物转染猪成纤维细胞，获得基因敲除细胞；

4)将所述基因敲除细胞的单细胞通过体细胞核移植技术克隆得到所述侏儒综合征动物模型。

本发明利用“All-in-one”改良型ABE质粒，其包含行使单碱基编辑的ABE和sgRNA表达元件，来对猪GHR基因进行单个腺嘌呤碱基编辑，从而制备出能够发生针对6号外显子跳跃的单细胞集落。经Western Blotting鉴定所述单细胞集落表明发生了GHR蛋白缺失，经基因测序没有检出sgRNA依耐性基因组脱靶，表明成功在猪细胞内精准引发了ABE介导的外显子跳跃并实现基因敲除。

进一步，根据猪GHR基因6号外显子剪接受体合成的sgRNA引物对为上游引物sgRNA1-F和下游引物sgRNA1-R：

sgRNA1-F：5’-CACCGATTTCAGGAGCACTCAAGAG-3’(SEQ ID NO.5)；

sgRNA1-R：5’-AAACCTCTTGAGTGCTCCTGAAATC-3’(SEQ ID NO.6)。

根据猪GHR基因6号外显子剪接供体合成的sgRNA引物对为上游引物

sgRNA2-F和下游引物sgRNA2-R：

sgRNA2-F：5’-CACCGTGATTTACCTATTTCCTCAA-3’(SEQ ID NO.7)；

sgRNA2-R：5’-AAACTTGAGGAAATAGGTAAATCAC-3’(SEQ ID NO.8)。

猪GHR基因6号外显子的剪接受体处具有PAM序列(5’-ATTTCAGGAGCACTCAAGAGTGG-3’，序列中加粗碱基为PAM序列，单下划线为sgRNA靶标，双下划线序列为剪接受体的保守序列)。ABE与上游引物sgRNA1-F和下游引物sgRNA1-R能对猪GHR基因6号外显子的剪接受体保守序列(AG)和6号外显子的剪接供体保守序列(GT)进行单个腺嘌呤碱基(反向互补序列为胸腺嘧啶)编辑，制备出携带GHR基因6号外显子剪接受体保守序列(AG)纯合突变为(3’-GG)的单细胞集落。

猪GHR基因6号外显子的PAM序列后具有剪接供体(5’-CCGTTGAGGAAATAGGTAAATCA-3’，序列中加粗碱基为PAM序列，单下划线为sgRNA靶标，双下划线序列为剪接供体的保守序列)。ABE与上游引物sgRNA2-F和下游引物sgRNA2-R能对猪GHR基因6号外显子的剪接受体保守序列(AG)和6号外显子的剪接供体保守序列(GT)进行单个腺嘌呤碱基(反向互补序列为胸腺嘧啶)编辑，制备出携带GHR基因6号外显子剪接受体保守序列(AG)纯合突变为(3’-GG)的单细胞集落。

进一步，步骤2)所述PX-ABEmaxAW质粒具有Bbs I酶切位点，因此使用Bbs I限制性内切酶进行位点的切割，切割后的线性化PX-ABEmaxAW质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

进一步，步骤3)所述连接产物转染猪成纤维细胞前先转化感受态细胞，涂板筛选培养，挑阳性菌扩大培养，对阳性菌液抽提质粒，经基因测序确定gRNA引物连接无误，将质粒于-20℃冰箱保存，将用于细胞转染。

进一步，步骤3)采用Lipofectamine 3000试剂进行细胞转染，所述猪成纤维细胞经所述连接产物转染24～36h后，将细胞以约10000/35mm培养皿的密度传代培养，传代培养48～60h后加入嘌呤霉素进行抗性培养7～10天，直至长出单细胞集落。

本发明包括以下有益效果：

提取单细胞集落的总RNA，用试剂盒将中RNA反转录成cDNA，使用如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的猪GHR基因mRNA特异性引物对进行扩增，扩增产物测序后与野生型相比缺失约170bp，同时基因测序表明实现了6号外显子跳跃。利用该单细胞集落克隆所得动物模型出现了身材矮小和发育迟缓等表型，即成功构建侏儒综合征动物模型。

附图说明

图1：培养猪细胞中GHR基因剪接受体的腺嘌呤碱基编辑介导的碱基转化效率鉴定。碱基编辑诱导的A-to-G(转换用红色箭头指示，PAM序列用红色框标记。给出了Sanger-DNA测序结果中具有代表性的A-to-G碱基编辑诱导的杂峰和二代测序的频率分析。

图2：培养猪细胞中GHR基因剪接供体的腺嘌呤碱基编辑介导的碱基转化效率鉴定。碱基编辑诱导的A-to-G(在互补链中是T-to-C)转换用红色箭头指示，PAM序列用红色框标记。给出了Sanger-DNA测序结果中具有代表性的A-to-G(互补链中为T-to-C)碱基编辑诱导的杂峰和二代测序的频率分析。

图3：4个猪单细胞集落实现了ABE介导的GHR基因剪接受体双等位基因A-to-G转化(红色箭头所示)。

图4：碱基编辑细胞GHR mRNA的RT-PCR结果，RT-PCR产物电泳条带表明碱基编辑细胞的GHR mRNA片段相比野生型缺失173bp.

图5：碱基编辑细胞GHR mRNA的RT-PCR产物经基因测序表明实现了外显子6跳跃。

图6：碱基编辑细胞经Western Blotting分析表明GHR蛋白表达被破坏。

具体实施方式

下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1，猪GHR基因敲除载体的构建

(1-1)选择猪GHR基因(NCBI GenBank Gene ID:397488)的6号外显子为ABE介导的外显子跳跃目标。该外显子长度为173bp，如成功实现跳跃将导致移码突变，使得猪GHR基因敲除。

(1-2)用猪GHR基因特异性上游引物5’-TCTGACTGTCAAGCACCTTG-3’(SEQ ID NO.1)和猪GHR基因特异性下游引物

5’-GTTCACCAGCTGATCTCATG-3’(SEQ ID NO.2)对猪基因组模板进行PCR扩增，得到野生型扩增片段为410bp，经基因测序确定其序列组成。

(1-3)序列分析发现，猪GHR基因6号外显子剪接受体和猪GHR基因6号外显子剪接供体均有一个sgRNA靶标，能够用于ABE介导的保守序列突变来实现外显子跳跃，分别为：

sgRNA1：5’-ATTTCAGGAGCACTCAAGAGTGG-3’(SEQ ID NO.3)；

sgRNA2：5’-CCGTTGAGGAAATAGGTAAATCA-3’(SEQ ID NO.4)；

sgRNA1序列中第6位碱基(A)以及sgRNA2序列中第17位(T)即为ABE编辑靶标，序列中加粗碱基为PAM序列，单下划线为sgRNA靶标，双下划线序列为剪接受体(AG)和供体(TA)的保守序列。

(1-4)根据sgRNA靶标序列分别合成sgRNA引物对：

sgRNA1-F：5’-CACCGATTTCAGGAGCACTCAAGAG-3’(SEQ ID NO.5)；

sgRNA1-R：5’-AAACCTCTTGAGTGCTCCTGAAATC-3’(SEQ ID NO.6)；

sgRNA2-F：5’-CACCGTGATTTACCTATTTCCTCAA-3’(SEQ ID NO.7)；

sgRNA2-R：5’-AAACTTGAGGAAATAGGTAAATCAC-3’(SEQ ID NO.8)；

将同组的上/下游引物高温退火形成引物二聚体。

(1-5)用BbsI限制性内切酶将ABE质粒PX-ABEmaxAW线性化(线性化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)，琼脂糖凝胶电泳分裂基因片段，切胶回收，与引物二聚体混合后用DNA连接酶于4℃反应过夜，得到连接产物。

(1-6)将连接产物转化感受态细胞，涂板筛选培养，挑阳性菌扩大培养，对阳性菌液抽提质粒，经基因测序确定gRNA引物连接无误，将质粒于-20℃冰箱保存，将用于细胞转染。

(1-7)培养低代次巴马香猪成纤维细胞，采用Lipofectamine 3000试剂进行细胞转染。

(1-8)转染24小时后，将细胞以1万/35mm培养皿的密度传代。

(1-9)细胞传代培养培养2天后，加入1μg/mL嘌呤霉素进行抗性筛选72小时。

(1-10)进行抗性筛选后，撤除抗生素继续培养6-8天，消化收集细胞，提取细胞基因组DNA，然后用猪GHR基因特异性上游引物和猪GHR基因特异性下游引物对猪基因组模板进行PCR扩增，片段为410bp，经二代基因测序确定碱基编辑效率。如图1和图2所示，测得针对sgRNA1的编辑效率为18.4％，针对sgRNA2的编辑效率为35.7％。

(1-11)确定sgRNA1的编辑窗口仅存在单个预期的A碱基，而sgRNA2的位点存在旁观者效应(bystander effect)A碱基。

实施例2，制备基因敲除细胞

(2-1)用BbsI限制性内切酶将ABE质粒PX-ABEmaxAW线性化(线性化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)，琼脂糖凝胶电泳分裂基因片段，切胶回收，与sgRNA1-F及sgRNA1-R高温退火形成的引物二聚体混合后用DNA连接酶于4℃反应过夜，得到连接产物。

(2-2)培养低代次巴马香猪成纤维细胞，采用Lipofectamine 3000试剂进行细胞转染。

(2-3)转染24小时后，将细胞以1万/35mm培养皿的密度传代。

(2-4)细胞传代培养培养2天后，加入1μg/mL嘌呤霉素培养7～10天，直至长出单细胞集落，挑去单细胞集落至4孔皿培养，每个单集落接种1孔，长满后传至35mm培养皿继续培养，待长满后冷冻保存，取部分细胞提取基因组DNA进行鉴定。

(2-5)挑取27个单细胞集落，其中12个培养起来并表现出较好的细胞活性和细胞形态，取部分细胞提取基因组DNA进行鉴定，如图3所示，基因测序表明4个单细胞集落(33.3％，4/12)发生了ABE介导的纯合A·T→G·C转换，确认为阳性基因敲除细胞。

(2-6)培养阳性基因敲除细胞，提取总RNA，用试剂盒将总RNA反转录成cDNA，使用猪GHR基因mRNA特异性上游引物

5’-CCTAAATTCACCAAGTGCCG-3’(SEQ ID NO.10)和下游引物

5’-TACTCCAGGACTATCCATCC-3’(SEQ ID NO.11)

进行扩增，将PCR产物送测序公司进行基因测序。如图4所示，RT-PCR产物电泳条带表明碱基编辑细胞的GHR mRNA片段相比野生型缺失173bp，同时基因测序表明实现了6号外显子跳跃(图5)。

(2-7)培养阳性基因敲除细胞，提取总蛋白，经Western Blotting检测蛋白表达，用GAPDH作为内参，如图6所示，在碱基编辑细胞中GHR蛋白表达未检出。表明实现了GHR敲除。

实施例3，构建基因敲除猪模型

(3-1)通过体细胞核移植技术来生产GHR基因敲除猪模型，从屠宰场收集新鲜猪卵巢，用39℃生理盐水清洗数次，用带有1.2mm直径针头的10ml注射器抽取3～6mm直径卵泡内的卵泡液，用39℃预热的PBS混匀，然后在体视显微镜下挑选具有紧密多层卵丘细胞的卵丘细胞-卵细胞复合体，清洗后用卵母细胞成熟液于38.5℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养38～40h，用0.1％透明质酸酶去除卵丘细胞，在体视镜下挑选形态正常、质膜完整、胞质均匀且排出第一极体的MII期卵母细胞作为核移植受体，放回成熟培养液置培养箱中备用。

(3-2)在体细胞核移植操作前3天复苏冻存的GHR基因纯合敲除细胞，培养24h后换成含0.5％血清的培养液进行血清饥饿1～2d，用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞悬液经1000rpm离心5min，用核移植操作液重悬备用。

(3-3)在60mm细胞培养皿上制作操作液滴并用矿物油覆盖，向操作液滴中移入挑选好的MII期卵母细胞和供体细胞悬液，然后在显微操作仪上进行体细胞核移植操作，将卵母细胞极体调至钟表4点钟方向，用固定针(外径约100μm，内径约20μm)在9点钟方向固定，然后用去核针(外径约20μm)从3点钟方向进针，慢慢吸取极体和极体后方的部分胞质，再慢慢退针排出去核物，下移视野和去核针，吸取一个光泽圆润的体细胞到针尖处，将体细胞移入透明带下，再用去核针挤压透明带使体细胞紧贴卵质膜，然后释放卵母细胞，然后进行下一个操作。

(3-4)将构建好的核移植胚胎放入胚胎培养液中存放约1h后进行融合/激活操作，将胚胎转入融合/激活液中平衡1min，然后用细胞融合仪进行融合/激活(电压参数：2次直流脉冲，30μs冲程，120v/mm电压)。融合/激活操作完毕，将胚胎转入胚胎培养液置胚胎培养箱中存放，约1h后检查融合，将融合的胚胎继续培养1-2天后进行胚胎移植。

(3-5)选用母性好、体型适中的健康后备或经产母猪作为代孕母猪，常规饲养并观察其发情周期。胚胎移植于发情(静立反射)次日进行，此时卵巢上出现大卵泡，壁薄而发红，即将排卵。每头代孕母猪移植培养1～2天的克隆胚胎200～300枚。手术方法简述如下：静脉推注戊巴比妥钠麻醉剂(每千克体重静注约25mg)，将受体母猪放到手术台上，左侧侧卧，伸展四肢，注意不要压住鼻子以免窒息。清除手术部位污垢后，分别用碘酊和75％酒精消毒，盖上创布，准备手术。手术时，利用手术刀在侧腹部表皮划开7～10cm的切口，用刀柄钝性分离脂肪和肌肉。将手探入腹腔内寻找子宫，然后将子宫角和卵巢轻轻拉出腹腔。整理输卵管伞，然后将装有克隆胚胎的胚胎移植管从输卵管开口处轻轻插入输卵管，行至壶腹部(约5～7cm)后缓慢注入内容物，边注边慢慢退管，直至将所有内容物注入完毕后退出。将子宫和卵巢还纳腹腔，用生理盐水冲洗血迹后进行缝合。

(3-6)术后代孕母猪单栏饲养，术后3天给予高营养、易消化食物，并施与抗菌消炎药。移植后密切观察发情，术后30天行B超诊断妊娠。妊娠母猪应精心饲养，术后110天后转入产房待产，代孕母猪妊娠期多在114～120天。分娩以自然分娩为宜，如遇超期怀孕或有难产迹象，应行激素催产或剖腹产术。待克隆猪出生后，细致护理，按程序注射疫苗。

(3-7)待克隆猪7日龄后进行基因编辑鉴定，剪取小块耳组织，分别提取基因组DNA、总RNA和总蛋白。用猪GHR基因特异性上游引物5’-TCTGACTGTCAAGCACCTTG-3’(SEQ IDNO.1)和猪GHR基因特异性下游引物5’-GTTCACCAGCTGATCTCATG-3’(SEQ ID NO.2)对猪基因组模板进行PCR扩增，得到扩增片段为410bp，经基因测序确定目标基因突变；用试剂盒将总RNA反转录成cDNA，使用猪GHR基因mRNA特异性上游引物5’-CCTAAATTCACCAAGTGCCG-3’(SEQID NO.10)和下游引物5’-TACTCCAGGACTATCCATCC-3’(SEQ ID NO.11)进行扩增，将PCR产物送测序公司进行基因测序；对总蛋白经Western Blotting检测GHR蛋白表达。

(3-8)将符合预期基因编辑的克隆猪精心饲养，监控生长发育，记录体重，分析其与正常猪体型差异，定期体检。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

SEQUENCE LISTING

<110> 佛山科学技术学院

<120> 一种侏儒综合征动物模型的构建方法

<130> 2021

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

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aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360

agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420

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ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540

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aggcatgaac caccgggtag aaatcacaga aggcatattg gcggacgaat gtgcggcgct 1680

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ctctactgac tctggtggtt cttctggtgg ttctagcggc agcgagactc ccgggacctc 1800

agagtccgcc acacccgaaa gttctggtgg ttcttctggt ggttcttccg aagtcgagtt 1860

ttcccatgag tactggatga gacacgcatt gactctcgca aagagggctc gagatgaacg 1920

cgaggtgccc gtgggggcag tactcgtgct caacaatcgc gtaatcggcg aaggttggaa 1980

tagggcaatc ggactccacg accccactgc acatgcggaa atcatggccc ttcgacaggg 2040

agggcttgtg atgcagaatt atcgacttat cgatgcgacg ctgtacgtca cgtttgaacc 2100

ttgcgtaatg tgcgcgggag ctatgattca ctcccgcatt ggacgagttg tattcggtgt 2160

tcgcaacgcc aagacgggtg ccgcaggttc actgatggac gtgctgcatt acccaggcat 2220

gaaccaccgg gtagaaatca cagaaggcat attggcggac gaatgtgcgg cgctgttgtg 2280

ttactttttt cgcatgccca ggcaggtctt taacgcccag aaaaaagcac aatcctctac 2340

tgactctggt ggttcttctg gtggttctag cggcagcgag actcccggga cctcagagtc 2400

cgccacaccc gaaagttctg gtggttcttc tggtggttct gataaaaagt attctattgg 2460

tttagccatc ggcactaatt ccgttggatg ggctgtcata accgatgaat acaaagtacc 2520

ttcaaagaaa tttaaggtgt tggggaacac agaccgtcat tcgattaaaa agaatcttat 2580

cggtgccctc ctattcgata gtggcgaaac ggcagaggcg actcgcctga aacgaaccgc 2640

tcggagaagg tatacacgtc gcaagaaccg aatatgttac ttacaagaga tcttcagcaa 2700

cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 2760

agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta 2820

ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa 2880

ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt 2940

cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct 3000

ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc 3060

caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca 3120

gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga gcctgggcct 3180

gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa 3240

ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga 3300

cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt 3360

gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat acgacgagca 3420

ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg agaagtacaa 3480

agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg gcggagccag 3540

ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg gcaccgagga 3600

actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg 3660

cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc ggcaggaaga 3720

tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga ccttccgcat 3780

cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa 3840

gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg gcgcttccgc 3900

ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct 3960

gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga ccaaagtgaa 4020

atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga aaaaggccat 4080

cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta 4140

cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag atcggttcaa 4200

cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg acttcctgga 4260

caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac tgtttgagga 4320

cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat 4380

gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa 4440

cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt 4500

cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat 4560

ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg ccaatctggc 4620

cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg acgagctcgt 4680

gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca 4740

gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg aagagggcat 4800

caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa 4860

cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact 4920

ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga gctttctgaa 4980

ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg gcaagagcga 5040

caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc agctgctgaa 5100

cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct 5160

gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac 5220

aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg agaatgacaa 5280

gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa 5340

ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta 5400

cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt 5460

cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 5520

aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact ttttcaagac 5580

cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga caaacggcga 5640

aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga aagtgctgag 5700

catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga 5760

gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg actgggaccc 5820

taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg tggtggccaa 5880

agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg ggatcaccat 5940

catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca agggctacaa 6000

agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg agctggaaaa 6060

cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg aactggccct 6120

gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc 6180

ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact acctggacga 6240

gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg ctaatctgga 6300

caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc aggccgagaa 6360

tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca agtactttga 6420

caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat 6480

ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggcga 6540

caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagg aattcggcag 6600

tggagagggc agaggaagtc tgctaacatg cggtgacgtc gaggagaatc ctggcccaat 6660

gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg 6720

caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg 6780

ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat 6840

cggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag 6900

cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc 6960

ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc 7020

cgcgtggttc ctggccaccg tcggagtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag 7080

cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga 7140

gacctccgcg ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga 7200

cgtcgaggtg cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgaga 7260

attctaacta gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 7320

gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 7380

taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 7440

ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaga atagcaggca tgctggggag 7500

cggccgcagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc 7560

actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg 7620

agcgagcgag cgcgcagctg cctgcagggg cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat 7680

ctgtgcggta tttcacaccg catacgtcaa agcaaccata gtacgcgccc tgtagcggcg 7740

cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgcct 7800

tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc 7860

gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg 7920

accccaaaaa acttgatttg ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg 7980

tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg 8040

gaacaacact caactctatc tcgggctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt 8100

cggtctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa 8160

tattaacgtt tacaatttta tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt 8220

taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc 8280

cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt 8340

caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg 8400

ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc 8460

gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 8520

aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 8580

tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 8640

aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg 8700

aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 8760

tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc 8820

aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag 8880

tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa 8940

ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc 9000

taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg 9060

agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa 9120

caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa 9180

tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg 9240

gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg aagccgcggt atcattgcag 9300

cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg 9360

caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt 9420

ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt 9480

aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac 9540

gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 9600

atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 9660

tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 9720

gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 9780

actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 9840

gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 9900

agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 9960

ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 10020

aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 10080

cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 10140

gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 10200

cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgt 10245

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cctaaattca ccaagtgccg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tactccagga ctatccatcc 20

Claims

1.一种侏儒综合征动物模型的构建方法，其特征在于，以猪GHR基因6号外显子为跳跃目标，通过腺嘌呤碱基编辑器介导的外显子跳跃实现猪GHR基因敲除，从而构建侏儒综合征动物模型。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)根据猪GHR基因6号外显子剪接受体或剪接供体合成sgRNA引物对并形成引物二聚体；

3)将所述连接产物转染猪成纤维细胞，获得基因敲除细胞；

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，根据猪GHR基因6号外显子剪接受体合成的sgRNA引物对为上游引物sgRNA1-F和下游引物sgRNA1-R，根据猪GHR基因6号外显子剪接供体合成的sgRNA引物对为上游引物sgRNA2-F和下游引物sgRNA2-R；

所述sgRNA1-F如SEQ ID NO.5所示，所述sgRNA1-R如SEQ ID NO.6所示；所述sgRNA2-F如SEQ ID NO.7所示，所述sgRNA2-R如SEQ ID NO.8所示。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA引物对为上游引物sgRNA1-F和下游引物sgRNA1-R，所述基因敲除细胞中的猪GHR基因自5’端第263720位碱基由A突变为G。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA引物对为上游引物sgRNA2-F和下游引物sgRNA2-R，所述基因敲除细胞中的猪GHR基因自5’端第263896或263900位碱基由T突变为C。

6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤2)所述PX-ABEmaxAW质粒线性化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤2)所述PX-ABEmaxAW质粒的酶切位点为Bbs I。

8.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤3)所述连接产物转染猪成纤维细胞前先转化感受态细胞，涂板筛选培养，挑阳性菌扩大培养，对阳性菌液抽提质粒，经基因测序gRNA引物序列正确。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，步骤3)所述猪成纤维细胞经所述连接产物转染24～36h后，传代培养48～60h，加入嘌呤霉素进行抗性培养至长出单细胞集落。