CN109943563A - CRISPR-Cas9系统介导的狂犬病病毒基因组敲除的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供CRISPR‑Cas9系统介导的狂犬病病毒基因组敲除的方法。其是根据狂犬病病毒基因G、N的基因序列，设计基于CRISPR‑Cas9系统的gRNA序列，并将设计好的gRNA序列连接到CRISPR‑Cas9载体中，然后将上述连接好的载体转入感染狂犬病毒的细胞中，用于阻断病毒的复制。本发明通过构建新型的CRISPR‑Cas9载体为狂犬病的治疗提供有效的解决方案。通过构建进行基因修饰的CRISPR‑Cas9系统，阻断糖蛋白表达，抑制病毒入侵，实现细胞内病毒的清除。实验表明，本发明的CRISPR‑Cas9系统对狂犬病毒有明显的抑制效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种CRISPR-Cas9系统介导的狂犬病病毒基因组敲除从而抑制病毒复制的方法。
背景技术
狂犬病广泛分布在世界各地，据世界卫生组织(WHO)统计，全球每年超过55000人死于狂犬病，其中大约95％发生在亚洲和非洲的发展中国家，是一中严重危害全球公共卫生的人畜共患传染病。狂犬病病毒(Rabies virus RV)为单股负链RNA病毒，属于弹状病毒科狂犬病病毒属成员，病毒粒径大小约75nm，长度约为100-300nm，形态呈典型的子弹状，其基因组是一条不分节段的单股负链RNA，约为12000nt，包含5种结构蛋白，从3’到5’的方向一次是：核蛋白(N)、基质蛋白(M)、磷酸化蛋白(P)、糖蛋白(G)和转录酶蛋白(L)。不同的蛋白具有不同的生物学特性。其中，糖蛋白被认为是唯一能够诱导机体产生狂犬病病毒中和抗体的结构蛋白。因此，选用糖蛋白作为疫苗研究的目的基因。而目前狂犬病的防控需要在感染后及时接种疫苗。但如过错过疫苗的接种时机，患者一旦发病，病死率近100％。目前狂犬病尚未存在有效的治疗方法，主要使用疫苗免疫，一旦发病百分百致死。
大部分可以抵抗噬菌体侵袭的细菌和真菌中都具有CRISPR-Cas9系统，该系统主要由核苷酸内切酶Cas和向导RNA(sg RNA)复合体两部分组成。CRISPR的组成是间隔序列(spacers)和正向重复序列(Repeats)间隔排列，以及一系列Cas基因和前导序列(Leader)组成。该系统的原理是用向导RNA(sgRNA)，Cas9蛋白可以高效率特异性地破坏靶向DNA或RNA。随后，通过修复非同源末端连DNA损伤引起目标区域的插入或缺失，或通过外源基因同源重组插入DNA供体。这两条途径是针对不同的基因编辑目的进行操作的。
RNA病毒中的基因编辑技术尚处于初级阶段。有证据表明CRISPR-Cas9系统可应用于RNA病毒如HIV、HBV中的基因编辑。而针对狂犬病病毒基因的敲除，目前鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种CRISPR-Cas9系统介导的狂犬病病毒基因组敲除的方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于敲除狂犬病病毒基因组的CRISPR-Cas9系统，所述CRISPR-Cas9系统中gRNA作用位点位于狂犬病病毒G蛋白和/或N蛋白的基因上，gRNA作用位点的核酸序列选自SEQ ID NO:1-16中的至少一个。
进一步地，gRNA作用位点的核酸序列选自SEQ ID NO:1-6、9-10、13-16中的至少一个。
优选地，gRNA作用位点的核酸序列选自如下I～IV的组合：
组合I：SEQ ID NO:1-4；
组合II：SEQ ID NO:3-6；
组合III：SEQ ID NO:9-14；
组合IV：SEQ ID NO:13-16。
第二方面，本发明提供狂犬病病毒G蛋白基因打靶载体，所述打靶载体是基于CRISPR-Cas9系统的gRNA表达载体，其中，gRNA作用位点的核酸序列选自SEQ ID NO:1-8中的至少一个。
优选地，gRNA作用位点的核酸序列为SEQ ID NO:3-6。
第三方面，本发明提供狂犬病病毒N蛋白基因打靶载体，所述打靶载体是基于CRISPR-Cas9系统的gRNA表达载体，其中，gRNA作用位点的核酸序列选自SEQ ID NO:9-16中的至少一个。
优选地，gRNA作用位点的核酸序列为SEQ ID NO:13和/或16。
第四方面，本发明提供CRISPR-Cas9系统介导的狂犬病病毒基因组敲除的方法，其是根据狂犬病病毒基因G、N的基因序列，设计基于CRISPR-Cas9系统的gRNA序列，并将设计好的gRNA序列连接到CRISPR-Cas9载体中，然后将上述连接好的载体转入感染狂犬病毒的细胞中，用于阻断病毒的复制。
具体地，将上述构建的CRISPR-Cas9系统或打靶载体导入感染狂犬病毒的细胞中，通过阻断病毒复制以实现细胞内病毒的清除。
本发明中，所述打靶载体的出发载体优选为PX459。
第五方面，本发明提供所述CRISPR-Cas9系统和/或所述打靶载体在制备抗狂犬病毒的药物或组合物中的应用。
第六方面，本发明提供一种抗狂犬病毒的药物或组合物，其有效成分为所述CRISPR-Cas9系统和/或所述打靶载体。
第七方面，本发明提供一组用于敲除狂犬病病毒基因组的gRNA序列，其是根据狂犬病病毒基因G、N的基因序列，设计基于CRISPR-Cas9系统的gRNA打靶序列，并将上述序列连入CRISPR-Cas9载体中，获得靶向敲除狂犬病病毒基因G、N的打靶载体。
其中，所述SEQ ID NO:1-8所示的gRNA用于特异性靶向敲除狂犬病病毒G蛋白的基因，所述SEQ ID NO:9-16所示的gRNA用于特异性靶向敲除狂犬病病毒N蛋白的基因。
第八方面，本发明提供采用CRISPR-Cas9系统构建特异性敲除狂犬病病毒基因组的载体的方法，至少包括如下步骤：
(1)以狂犬病毒G和N基因序列为靶点设计gRNA序列，gRNA的序列如SEQ ID NO:1-16任一所示；
(2)将Cas9蛋白有效成分重组到狂犬病毒感染性克隆中构建Cas9敲除载体。
其中，Cas9蛋白有效成分是指SV40NLS和Cas9蛋白序列。
实验结果表明，组合Ⅰ-Ⅳ的狂犬病毒基因组敲除效率分别为20％、35％、30％、40％。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明通过构建新型的CRISPR-Cas9载体为狂犬病的治疗提供有效的解决方案。通过构建进行基因修饰的CRISPR-Cas9系统，阻断糖蛋白表达，抑制病毒入侵，实现细胞内病毒的清除。实验表明，本发明的CRISPR-Cas9系统对狂犬病毒有明显的抑制效果。
附图说明
图1为本发明实施例1中PX459-gRNA-P1的质粒图谱。
图2-图3为本发明实施例1中流式细胞分选实验验证sgRNA效率图。
图4为本发明实施例1中gRNA介导的CRISPR-Cas9系统编辑狂犬病病毒基因G后，病毒的滴度测定结果。其中，B2C、SAD、DRV、CVS-11代表不同的狂犬病病毒株。
图5为本发明实施例1中CRISPR-Cas9系统对狂犬病毒G蛋白切割后的测序结果序列比对。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 CRISPR-Cas9系统介导的狂犬病病毒基因组敲除的方法
1.材料与方法
1.1试验材料
CRISPR-Cas9质粒PX459(Addgene，货号：62988，http://www.addgene.org/62988/)，lipofectamineTM 3000购自Invitrogen公司，大肠杆菌DH5α、stableIII均购自北京全式金生物技术有限公司，BbsI等限制性内切酶、质粒小提试剂盒、DNA提取试剂盒、DNA纯化试剂盒均购自美国therom公司。Marker，Primer star GXL，pMD19T均购自大连宝生物公司。无内毒素质粒提取试剂盒购自Promega公司，DMEM高糖培养基、Opti-MEMTM无血清培养液、双抗、胎牛血清均购自Gbico公司。其他试剂均为国产分析纯。所用狂犬病病毒株为CVS-B2C、SAD、DRV、CVS-11。
1.2试验方法
1.2.1靶向狂犬病毒G基因的gRNA的选择和设计
在Genbank中分别找到狂犬病毒G(AEK98549.1)、N(AEK98546.1)基因的序列，在狂犬病毒G基因设计潜在靶位点。通过在线设计工具网站http://crispr.mit.edu/及gRNA的设计原则，评估狂犬病毒G基因和N基因序列上得分较高的靶位点设计gRNA。具体的核苷酸序列如所示。
表1
选择以下4个gRNA组合进行后续实验：
组合I：SEQ ID NO:1-4；
组合II：SEQ ID NO:3-6；
组合III：SEQ ID NO:9-14；
组合IV：SEQ ID NO:13-16。
1.2.2筛选高效的gRNA
1)将PX459质粒，用BbSI酶切，酶切体系如下：
将上述试剂全部加入0.2ml EP管，混匀，37℃固浴1h。
2)酶切质粒的回收纯化
a.进行1％琼脂糖凝胶电泳，将琼脂糖置于紫外照射下，切取目的条带，置于1.5mlEP管中；
b.称取所切胶的重量，按1:1(m/v)加入Binding Buffer；
c.50-60℃恒温固浴10min，晾凉；
d.将离心管中液体全部倒入SV离心柱，12000rpm，1min离心，弃去液体，留柱；
e.柱子中加入700μl Wash Buffer，12000rpm，1min离心，弃去液体，留柱；
f.进行空转，12000rpm，2min离心；
g.将柱子放入收集管，加入20μl Elution Buffer，12000rpm，1min离心；
h.将回收产物置于-20℃保存。
3)将编码各gRNA的两条寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末端的短双链DNA，反应体系及反应程序如下：
反应体系：
注：Solution Ι来自Takara公司的试剂盒。
在PCR仪内按以下程序运行，反应程序：
4)将gRNA与PX459连接，连接体系如下：
采用同样的方法，针对各gRNA分别构建不同的载体。构建得到的载体命名为：
SEQ ID NO:1，gRNA-G154-F所构建的载体PX459-gRNA-P1；
SEQ ID NO:2，gRNA-G154-R所构建的载体PX459-gRNA-P2；
SEQ ID NO:3，gRNA-G95-F所构建的载体PX459-gRNA-P3；
SEQ ID NO:4，4gRNA-G95-R所构建的载体PX459-gRNA-P4；
SEQ ID NO:5，gRNA-G223-F所构建的载体PX459-gRNA-P5；
SEQ ID NO:6，gRNA-G223-R所构建的载体PX459-gRNA-P6；
SEQ ID NO:7，gRNA-G372-F所构建的载体PX459-gRNA-P7；
SEQ ID NO:8，gRNA-G372-R所构建的载体PX459-gRNA-P8；
SEQ ID NO:9，gRNA-N55-F所构建的载体PX459-gRNA-P9；
SEQ ID NO:10，gRNA-N55-R所构建的载体PX459-gRNA-P10；
SEQ ID NO:11，gRNA-N199-F所构建的载体PX459-gRNA-P11；
SEQ ID NO:12，gRNA-N199-F所构建的载体PX459-gRNA-P12；
SEQ ID NO:13，gRNA-N277-F所构建的载体PX459-gRNA-P13；
SEQ ID NO:14，gRNA-N277-R所构建的载体PX459-gRNA-P14；
SEQ ID NO:15，gRNA-N394-F所构建的载体PX459-gRNA-P15。
SEQ ID NO:16，gRNA-N394-R所构建的载体PX459-gRNA-P16。
载体PX459-gRNA-P1全长序列如SEQ ID NO:17所示。其它载体的全序列是将编码各gRNA的序列进行相应替换，即得。
1.2.3质粒DNA的制备
取PX459-gRNA-P1质粒1μl于50μl DH5a感受态细胞中，混匀，冰浴30min，42℃固浴中热激90s，加入LB液体培养基500ml，放置180rpm37℃摇菌1h。将菌液5000rpm离心5分钟，弃上清900μl，取100ul沉淀加入带有氨苄抗性的LB固体培养基。用涂布器涂匀，37℃振荡培养过夜。挑取生长良好的单克隆菌落，加入到200mL氨苄青霉素浓度为100ug/mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养12-16h，3220g条件下离心15min，弃上清，收集菌体。然后按照如下操作步骤提取质粒。
a.加入细胞重悬液3ml，反复吹吸，以形成单细胞有利于下一步裂解；
b.加入细胞裂解液3ml，颠倒混匀，静置3min；
c.加入中和液5ml，上下颠倒混匀，静置2-3min，3220g离心20min；
d.将上清液用枪通过清洁柱转移到新的离心管，避免将沉淀倒出，静置2min，2000g离心5min；
e.用结合柱将清洗好的上清液倒入柱子中，静置2min，1500g离心3min；
f.加入5ml去内毒素，1500g离心3min；
g.加入20ml柱清洗液，1500g离心5min；
h.弃废液，空转离心10min去除酒精，取出晾干柱子；
i.将柱子移至新的离心管，加入500μl无酶水，静置2min，1500g离心3min，得无内毒素的PX459-gRNA-P1质粒，并进行测序鉴定，重组载体构建完成，PX459-gRNA-P1的质粒图谱如图1所示。
1.2.4转染vero细胞
复苏vero细胞(来源：昆明细胞库，货号：KCB92017YJ)，将细胞放入含有10％FBS(灭活胎牛血清)和1％PS(青霉素-链霉素)的DMEM培养瓶中，于37℃5％CO2培养箱中培养，转染前一天，传代培养细胞。弃去培养瓶中的培养基，加入室温预热的0.25％胰酶1ml，置于37℃培养箱中消化1min，取出，弃去胰酶，拍打瓶底，使细胞完全脱离瓶底，加入3mL含有10％FBS和1％PS的DMEM，吹打6-8次，吸取500μl细胞于12孔板中，每孔补加含有10％FBS和1％PS的DMEM 500μl。
(1)接种细胞至70-90％汇合度时转染；
(2)A管：100μl MEM+4μl Lip3000+4μl P3000，混匀；
B管：100μl MEM+10μl质粒或质粒混合物(所述质粒混合物为各质粒按等比例混合)，混匀；
将A、B管混匀，室温放置30分钟；
(3)细胞中原培养液弃去，换成200μl MEM，将A、B管混合物全部加入到12孔板中；
(4)待6h后，换成500μl无血清DMEM，加入10μl狂犬病毒(MOI＝0.01、0.1、1)作感2h，2h后补加含2％FBS和2％PS的DMEM 500μl；
(5)48h后，收集细胞用于流式细胞术检测病毒的增殖情况。
1.2.5流式细胞术检测病毒增殖
(1)细胞经胰酶消化后收集于流式上样管中，加入200μl流式上样缓冲液(PBS+％1FBS+2μmol/L EDTA)，带上机检测。
(2)BD AccuriTM C6流式细胞仪检测荧光细胞数量，用Flow Jo(Tree Star,SanCarlos,CA)软件分析单个细胞内荧光病毒的数量，确定gRNA的切割效率。
实验结果如图2和图3所示。由图2和图3可知，与对照组相比，4个gRNA组合(组合I～IV)对狂犬病毒具有明显的抑制效果。
1.3病毒滴度检测(FFU)
(1)将NA细胞接种于96孔板中，过夜培养，待细胞贴壁后进行实验。
(2)将病毒冻融一次，置于冰上融化。
(3)96孔板中加入90μl含10％FBS和10％PS的1640培养液，加入10μl病毒样品，反复吹吸混匀。
(4)取第一孔病毒10μl至第二孔，加90μl 1640培养液，反复吹吸混匀，依次操作，进行倍比稀释。
(5)消化NA细胞，用血球计数板进行计数，计算细胞浓度，上述96孔板中每孔接种浓度为106个/ml细胞悬液50μl。
(6)轻轻混匀，放入37℃5％CO2的培养箱中培养48h。
(7)弃去病毒培养液，每孔用100μl PBS洗一次，依次加入50μl预先在-20℃冷藏的丙酮，常温固定20min，每孔加入100μlPBS清洗细胞。
(8)将FITC荧光标记的抗狂犬病病毒核蛋白的抗体(Fujirebio，Melvin，PA)用PBS进行50倍稀释，每孔加入稀释后的上述抗体100μl，常温孵育1h。
(9)每孔加入100μl PBS清洗细胞，每次停留5min后弃液。
荧光显微镜下观察狂犬病毒核蛋白荧光灶进行计数，从高浓度病毒到低浓度病毒进行计数，直至不出现荧光斑的孔停止计数。
(10)选择空斑个数在10-30个的梯度计数，至少选择两孔求其平均值，用公式(55×105+96×105)/2×0.4＝9.5×106计算毒价。
1.4测序验证Cas9系统对G蛋白基因的敲除效率
经流式细胞术和病毒滴度的验证，证实Cas9系统对G蛋白和N蛋白都有明显抑制效果。为了进一步验证Cas9系统的效果，将敲除后的狂犬病毒cDNA进行测序统计。
1.4.1提取RNA
1.收集转染后的细胞，加入1ml RNAiso Plus(Takara，Code No.:9109)匀浆，室温静置5min，4℃12000rpm离心5min；
2.将上清移至1.5ml离心管，不要吸出白色沉淀；
3.加入200μl氯仿，振荡混匀，室温静置5min，4℃12000rpm离心5min，将上清移至离心管；
4.加入600μl异丙醇，混匀，静置1min，4℃12000rpm离心10min，此时出现沉淀，弃上清；
5.沉淀中加入1ml 75％无水乙醇洗涤，4℃12000rpm离心5min，弃取上清，重复洗涤一次；
6.将沉淀于室温干燥至酒精味道基本消失；
7.溶于20-50μl无酶水，置于-80℃保存。
1.4.2反转录；
在PCR管中配制如下混合液(使用Takara反转录试剂盒)：
在PCR仪中进行退火反应，程序如下：
65℃5min，4℃(冰上急冷)，∞。
离心数秒，混匀。
1.4.3 PCR扩增
在PCR管中配制如下反应体系：
其中，正向引物:5′-AAAGGATCCTCCTTACAGTCTGGTCTCACC-3′，反向引物:5′-AAAGGTACCGCTAGCAAAGATGGTTCCTCA-3′。
在PCR仪中进行反应，程序如下：
1.4.4连接至T载体
1.4.5转化DH5a感受态细胞
1.4.6挑取单克隆，送测序，测序结果如图5所示。
gRNA介导的CRISPR-Cas9系统编辑狂犬病病毒基因G后，病毒的滴度测定结果见图4(对应于组合II)。
测定方法如下：取96孔细胞培养板，以4行12列为一个样品区，每板两个分区，每孔加入90μL的无血清DMEM培养基，将10μL病毒原液(测定的毒株为B2c、SAD、DRV、CVS-11)加入到96孔细胞板的第一列，充分混合后吸取10μL混合液到第二列，充分混匀，再吸出10μL混合液到下一列，依次连续进行10倍的倍比稀释，第12列孔后弃掉10μL的混合液，将每个孔内加入50μL NA细胞(106个细胞)悬液。在37℃、5％CO2感染48h，弃上清，PBS洗一次100μL/孔，每孔用50μL预冷的80％丙酮常温固定20min，PBS洗三次，5min/次。用抗狂犬病病毒N蛋白荧光抗体(FITC-conjμgated anti-RV N antibodies)染色后，1:50比例稀释，每孔100μL，37℃放置1h，然后用PBS洗三次，5min/次，然后通过荧光显微镜观察并记录抗原阳性区域，
以上实验结果表明，所设计的针对狂犬糖蛋白基因的4个靶位点(SEQ ID NO:3-6)都有不同程度的突变。进一步将PCR产物测序鉴定后，结果证实狂犬糖蛋白基因的4个靶位点具有不同程度的基因插入或缺失，甚至移码突变。
分别对应于组合I、组合II、组合IV的CRISPR-Cas9系统，对狂犬病毒也具有明显的抑制效果。以上实施例证明本方法能够成功地阻止RV感染。今后有望应用于狂犬病的临床基因治疗。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 内蒙古大学
<120> CRISPR-Cas9系统介导的狂犬病病毒基因组敲除的方法
<130> KHP181118499.2
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caccggaagg atgcaccaac ctgtcagg 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 28
<212> DNA
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 28
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aaaccctttt cgtgcaatca caattccc 28
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<211> 28
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caccggacgc atgctcaggg acagtggg 28
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<211> 28
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<400> 16
aaaccccact gtccctgagc atgcgtcc 28
<210> 17
<211> 9175
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
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ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
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agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420
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ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660
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ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780
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gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 960
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tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg 1080
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ctgagcaaga ggtaagggtt taagggatgg ttggttggtg gggtattaat gtttaattac 1200
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aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta caaagacgat gacgataaga 1320
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agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga 2940
ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga 3000
aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga 3060
aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag 3120
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agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt 3420
ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta 3480
aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg 3540
ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg 3600
acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca 3660
gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg 3720
aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc 3780
agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg 3840
accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga 3900
gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg 3960
gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc 4020
agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga 4080
gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc 4140
ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg 4200
agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg 4260
atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc 4320
acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg 4380
aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga 4440
gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact 4500
ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga 4560
caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga 4620
aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct 4680
tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg 4740
actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg 4800
tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg 4860
ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca 4920
agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg 4980
agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg 5040
aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc 5100
tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact 5160
acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg 5220
ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc 5280
aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca 5340
agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg 5400
ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc 5460
tgggaggcga caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagg 5520
aattcggcag tggagagggc agaggaagtc tgctaacatg cggtgacgtc gaggagaatc 5580
ctggcccaat gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca 5640
gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg 5700
atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg 5760
ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca 5820
cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt 5880
tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc 5940
ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg tcggagtctc gcccgaccac cagggcaagg 6000
gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg 6060
ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg 6120
tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg 6180
gtgcctgaga attctaacta gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca 6240
gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac 6300
tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat 6360
tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaga atagcaggca 6420
tgctggggag cggccgcagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc 6480
tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc 6540
ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagctg cctgcagggg cgcctgatgc ggtattttct 6600
ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catacgtcaa agcaaccata gtacgcgccc 6660
tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt 6720
gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc 6780
ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta 6840
cggcacctcg accccaaaaa acttgatttg ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc 6900
tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg 6960
ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcgggctatt cttttgattt ataagggatt 7020
ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat 7080
tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttta tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat 7140
gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct 7200
tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt 7260
cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta 7320
tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg 7380
ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 7440
ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt 7500
attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 7560
gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg 7620
ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa 7680
cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt 7740
gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag 7800
tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt 7860
gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga 7920
ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt 7980
tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta 8040
gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 8100
caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 8160
cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg aagccgcggt 8220
atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg 8280
gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 8340
attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 8400
cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 8460
atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 8520
tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 8580
ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 8640
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 8700
cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 8760
gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 8820
gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 8880
acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 8940
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 9000
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 9060
tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 9120
agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgt 9175
Claims (10)
1.用于敲除狂犬病病毒基因组的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，所述CRISPR-Cas9系统中gRNA作用位点位于狂犬病病毒G蛋白和/或N蛋白的基因上，gRNA作用位点的核酸序列选自SEQ ID NO:1-16中的至少一个。
2.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，gRNA作用位点的核酸序列选自SEQ ID NO:1-6、9-10、13-16中的至少一个；
优选地，gRNA作用位点的核酸序列选自如下I～IV的组合：
组合I：SEQ ID NO:1-4；
组合II：SEQ ID NO:3-6；
组合III：SEQ ID NO:9-14；
组合IV：SEQ ID NO:13-16。
3.狂犬病病毒G蛋白基因打靶载体，其特征在于，所述打靶载体是基于CRISPR-Cas9系统的gRNA表达载体，其中，gRNA作用位点的核酸序列选自SEQ ID NO:1-8中的至少一个。
4.根据权利要求3所述的打靶载体，其特征在于，gRNA作用位点的核酸序列为SEQ IDNO:3-6。
5.狂犬病病毒N蛋白基因打靶载体，其特征在于，所述打靶载体是基于CRISPR-Cas9系统的gRNA表达载体，其中，gRNA作用位点的核酸序列选自SEQ ID NO:9-16中的至少一个。
6.根据权利要求5所述的打靶载体，其特征在于，gRNA作用位点的核酸序列为SEQ IDNO:13和/或16。
7.CRISPR-Cas9系统介导的狂犬病病毒基因组敲除的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述CRISPR-Cas9系统，或权利要求3-6任一项所述打靶载体导入感染狂犬病毒的细胞中，实现细胞内病毒的清除。
8.根据权利要7所述的方法，其特征在于，所述打靶载体的出发载体为PX459。
9.权利要求1或2所述CRISPR-Cas9系统和/或权利要求3-6任一项所述打靶载体在制备抗狂犬病毒的药物或组合物中的应用。
10.一种抗狂犬病毒的药物或组合物，其特征在于，有效成分为权利要求1或2所述CRISPR-Cas9系统和/或权利要求3-6任一项所述打靶载体。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN113564165A (zh) * | 2021-07-19 | 2021-10-29 | 武汉市工程科学技术研究院 | 一种胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株及其构建方法和应用 |
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| CN106574256A (zh) * | 2014-05-30 | 2017-04-19 | 斯坦福大学托管董事会 | 用于潜伏病毒感染的递送治疗的组合物和方法 |
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-
2019
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Patent Citations (3)
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