CN112153990A - 用于常染色体显性疾病的基因编辑 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于治疗受试者的常染色体显性疾病的方法。在一些方面，所述方法包括使用具有一对独特的引导RNA序列的基因编辑酶，所述引导RNA序列在细胞中靶向常染色体显性疾病相关基因的突变型和野生型形式以进行破坏，然后向细胞提供野生型常染色体显性疾病相关基因cDNA，所述基因经密码子修饰以逃避引导RNA的识别。这些方法广泛地适用于任何常染色体显性疾病。

Description

用于常染色体显性疾病的基因编辑
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年3月23日提交的美国临时申请第62/647,415号的优先权，其通过引用整体并入本文。
政府许可权
本发明是在由美国国家卫生研究院(NIH)颁发的RO1EY024698拨款下借助政府资助进行的。政府对本发明具有一定权利。
序列表
本申请包含以ASCII格式以电子方式提交并据此通过引用整体并入的序列列表。所述ASCII副本创建于2019年3月21日，命名为01001_006660-WO0_ST25.txt，并且大小为37KB。
发明领域
本公开涉及使用基于CRISPR的方法在患者中进行基因编辑，以治疗常染色体显性疾病。
发明背景
对于许多对生活质量有深重的负面影响的常染色体显性或隐性疾病，目前尚无治愈方法。显性形式的视网膜色素变性(RP)、视锥杆营养不良和青少年黄斑变性是影响眼睛的显性常染色体疾病的主要实例。视网膜变性疾病影响至少900万美国人(Friedman DS等人Arch Ophthalmol.2004年4月；122(4):564-72；Schmier JK等人Pharmacoeconomics.2006；24(4):319-34)。最具破坏性的视网膜变性疾病是视网膜色素变性(RP)，这是一种常见的遗传性神经变性疾病，影响到全世界150万人，并且对于该疾病，治疗不够充足。RP是一种变性眼部疾病，可导致视网膜变性和视力下降。视紫红质基因(RHO)的遗传突变是常染色体显性RP的最常见的原因，占病例的20-30％。目前，尚无治愈RP的方法。
这些常染色体显性疾病的特征在于存在表达缺陷蛋白的突变基因。因此，这些疾病不容易接受简单地添加正常健康基因(所谓的“基因补充(gene supplementation)”或“基因添加(gene addition)”)的疗法，因为致病基因和蛋白质仍然存在。RP的基因疗法在概念验证动物模型中进行了测试，并且后来被用作临床治疗，在临床治疗中其改善了多达一半患者的视力。在这些试验中，患者的遗传异常通过基因补充方法得到纠正(即，通过野生型(wt)基因的过表达拯救)。最初，基因补充似乎起作用，因为患者经历了功能性补求，但随访检查显示光感受器持续退化，并且视力下降在3年中进行(Cideciyan等人Proc NatlAcad Sci USA.2013年2月5日；110(6):E517-25；Bainbridge等人N Engl J Med.2015年5月14日；372(20):1887-97；Jacobson等人N Engl J Med.2015年5月14日；372(20):1920-6)。目前针对其它RP基因的基因疗法试验也采用了基因补充的方法，并且除非失败的原因得到解决，否则可能会面临类似的障碍。由于补充wt基因会使患者的突变型基因保持完整，因此尽管存在wt基因，但突变型基因的存在会持续引发持续的损害。
Best卵黄状黄斑营养不良(VMD)是致盲性黄斑病症，其由编码钙依赖性氯离子(Cl-)通道的Bestrophin-1(BEST1)中的250多种常染色体显性点突变引起。BEST1突变降低或消除通道流出Cl-离子的能力，导致液体在视网膜下空间积聚。设计该疾患的治疗有两个主要障碍：1)大多数VMD病是常染色体显性的；和2)BEST1突变具有极大的异质性。因此，靶向特定突变的常规患者特异性疗法不是实用的治疗选项。
显性病症比隐性病症难治疗得多。事实上，目前还没有针对显性遗传病症的有效治疗方法。本方法解决了未满足的需求，并且可以普遍应用于所有具有疾病相关基因突变的患者。所述方法克服了常规患者特异性基因疗法仅治疗常染色体隐性疾病的局限性，并且可广泛适用于任何显性疾病。
发明内容
在一个实施方案中，本公开涉及用于修饰细胞中常染色体显性疾病相关基因的方法，所述方法包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或进一步由以下步骤组成：将细胞与至少一种类型的编码针对常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统的载体接触，其中所述常染色体显性疾病相关基因涉及或纠正眼部疾病。在一个方面，CRISPR-Cas系统包含在至少一种类型的载体中，所述载体包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和(iii)编码Cas核酸酶的第三序列，其中Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。细胞的非限制性实例包括动物细胞、哺乳动物细胞、犬科动物细胞、猫科动物细胞、马科动物细胞和人细胞。
在一个实施方案中，第一引导RNA包含选自SEQ ID NO:40、SEQ.ID NO.41、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48或SEQ ID NO:49的核苷酸序列或其各自的等同物。
在另一方面，本公开提供了用于修饰细胞中的常染色体显性疾病相关基因的方法，所述方法包括以下步骤，或者基本上由以下步骤组成，或者进一步由由以下步骤组成：将细胞与至少一种类型的编码针对常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统的载体接触，其中所述常染色体显性疾病相关基因涉及或纠正眼部疾病。一方面，CRISPR-Cas系统包含在至少一种类型的载体中，所述载体包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交，和(ii)编码催化缺陷型Cas核酸酶(dCas)的第二序列。细胞的非限制性实例包括动物细胞、哺乳动物细胞、犬科动物细胞、猫科动物细胞、马科动物细胞和人细胞。
在一个实施方案中，第二引导RNA包含选自SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39的核苷酸序列或其各自的等同物。
一方面，本公开提供了用于治疗受试者的常染色体显性眼病的方法，所述方法包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或进一步由以下步骤组成：向受试者施用治疗有效量的至少一种类型的载体，所述载体编码针对或纠正受试者中常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统。一方面，CRISPR-Cas系统包含在至少一种类型的载体中，所述载体包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和(iii)编码Cas核酸酶的第三序列，其中Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。受试者的非限制性实例包括动物、哺乳动物、犬科动物、猫科动物、马科动物和人患者。
本公开还涉及用于治疗受试者的常染色体显性眼病的方法，所述方法包括以下步骤、或基本上由以下步骤组成或进一步由以下步骤组成：向受试者施用治疗有效量的至少一种类型的载体，所述载体编码针对受试者中常染色体显性眼病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统。一方面，CRISPR-Cas系统包括至少一种类型的载体，所述载体包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；和(ii)编码催化缺陷型Cas核酸酶(dCas)的第二序列，其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。受试者的非限制性实例包括动物、哺乳动物、犬科动物、猫科动物、马科动物和人患者。
在一个实施方案中，常染色体显性疾病相关基因包含选自SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的序列或其各自的等同物。在另一个实施方案中，与常染色体显性疾病相关基因杂交的第一引导RNA包含SEQ ID NO:31的序列或其等同物。在一个实施方案中，Cas核酸酶不切割或靶向编码常染色体显性疾病相关基因的野生型等位基因。
在另一个实施方案中，第一引导RNA与常染色体显性疾病相关基因杂交，所述常染色体显性疾病相关基因包含SEQ ID NO:31的序列。
在一实施方案中，常染色体显性疾病相关基因是RHO。在一个实施方案中，SNP的变体为rs7984:G SNP、rs7984:A SNP、rs2855558:G SNP或rs2855558:A SNP。
附图说明
图1A是切碎粘贴(ChopStick)AAV载体的示意图。左侧显示了AAV/Cas9载体的示意图。来自化脓性链球菌(S.pyogenes)的Cas9由173-bp的短CMV启动子(sCMV,SEQ ID NO:14)驱动，并由50-bp的合成聚-A信号(SPA)(SEQ ID NO:19)终止。右侧显示了RHO sgRNA的和经密码子修饰的cDNA(cmRHO,(SEQ ID NO:9))的表达载体的示意图。sgRNA1和sgRNA2由U6启动子(SEQ ID NO:12)驱动。具有C末端加标签的c-Myc的cmRHO cDNA由CBh启动子(SEQ IDNO:10)驱动，并由bGH聚-A信号(SEQ ID NO:11)终止。箭头指示转录方向。5'-ITR和3'-ITR为AAV的反向末端重复序列。
图1B是ChopStick AAV基因疗法策略的示意图。左侧示意图(I)显示在AAV/Cas9和AAV/sgRNA1&2_cmRHO共染料后，Cas9蛋白与两个hRHO外显子1特异性sgRNA(sgRNA1和sgRNA2)的共表达将导致宿主RHO外显子1缺失121bp。图(II)的右侧显示了原始视紫红质序列和经密码子修饰的视紫红质序列。
图2A-2B显示双重sgRNA比单sgRNA提供更高效的RHO的“切碎(Chop)”。图2A是RHO上sgRNA1和sgRNA2的靶位点的示意图。这两个sgRNA均靶向RHO外显子1，所述外显子是翻译的起始。一旦进行了基因编辑，无论是靶向一个sgRNA位点还是两个sgRNA位点，大多数编码区都会受到影响。这种设计确保了最大程度地破坏基因表达，并可应用于许多不同类型的RHO突变。图2B显示与仅使用一种sgRNA相比，通过“切碎”策略在人肾细胞系中截短基因的效率提高。用不携带sgRNA、携带单个sgRNA1、携带单个sgRNA2或携带两者的Cas9载体(pX459)转染HEK293FT细胞。96小时后，提取DNA，扩增RHO基因座，并通过错配检测SURVEYOR测定进行分析。将两种sgRNA一起应用导致约30-40％的基因缺失，这表明“切碎”(基因缺失/破坏)策略在哺乳动物细胞中高效地起作用(泳道4)。相反，一次使用一种sgRNA(泳道2和3)不会导致RHO基因大小改变。约30％的基因组DNA通过一种sgRNA进行了非同源末端连接(NHEJ)。相反，当使用两种sgRNA时，最多可编辑80％(缺失和NHEJ)。作为对照，等量的质粒DNA(1μg/1x 105个293FT细胞)用于每个组。
图3A-3C显示当与单种sgRNA相比时，通过双重sgRNA(“切碎”或基因缺失/破坏)灭活基因的功效提高。图3A是RHO表达载体上的sgRNA1和sgRNA2的靶位点的示意图。如图所示，两种sgRNA靶向RHO cDNA的5’末端。Wt RHO cDNA由CMV启动子驱动。由CMV启动子驱动的EGFP在免疫印迹测定中用作内部对照，其可使转染效率和蛋白质载量的差异标准化。图3B显示当用RHO表达载体和另一种携带sgRNA1、sgRNA2或两者的表达Cas9机器的载体(pX459)共转染HEK293FT细胞时，通过免疫印迹测量的蛋白质水平。sg3组是非特异性对照sgRNA。图3C表明，在用EGFP标准化后，两种sgRNA一起命名RHO的表达减少了70％,而使用单种sgRNA仅使表达减少0-30％(与对照组(sg3)相比)。该结果表明“切碎”策略可用于显著减少蛋白质表达或使蛋白质表达失活。
图4A-4C显示“切碎”(基因缺失或破坏策略)具有产生双链断裂以促进通过如同源重组的机制的精确修复的潜力。图4A是RhoD190N小鼠RP模型中的AAV介导的CRISPR编辑的示意图。AAV/Cas9载体和含有wt供体模板和靶向D190N突变的sgRNA的双顺反子AAV载体的双重病毒治疗将导致突变特异性修复。供体模板构建体包含具有两个修饰的野生型Rho序列：1)在CRISPR诱导的同源重组后，在D190密码子上游产生额外的AflII位点，用于鉴定DNA替换；以及2)引入5个摆动碱基对(bps)，以使供体模板无法被sgRNA识别，因此具有Cas9抗性。图4B显示了在用前述AAV病毒处理的小鼠视网膜DNA中使用分解追踪插入缺失(插入和缺失)(tracking of indels(insertions and deletions)by decomposition)(TIDE)分析(公开可得，网址为http://tide-calculator.nki.nl:检索日期为2016年4月30日)评估的编码效率，显示了约50％的光感受器经历了NHEJ。图4C是Rho D190N/+小鼠的视网膜DNA的代表性AflII消化，显示了大部分光感受器通过同源重组修复(泳道2)。用具有(泳道2)或不具有(泳道1)野生型供体模板的Cas9载体处理RhoD190N/+小鼠，提取视网膜DNA并用指定的筛选引物扩增。
图5A-5B显示了通过CRISPR/供体模板介导的修复进行的组织学和功能拯救。在出生后第3天，通过视网膜下注射，用图4A-C中描述的双重病毒处理来处理RhoD190N/+杂合子小鼠。图5B显示了治疗后通过ERG评估的小鼠的视觉功能。图5A显示了视网膜组织切片的组织学评估。视网膜切片的H&E染色显示，与未治疗的眼睛相比，光感受器(外核层，ONL)存活率提高了137％(图5A)。矩形条显示了CRISPR/Cas9眼(注射的)和对照眼(未处理的)中光感受器的ONL的放大横截面积。视网膜电图(ERG)显示3月龄RhoD190N/+杂合子的基因特异性CRISPR介导的疗法的a波和b波均有显著改善(图5B)。
图6A-6C描述了通过在小鼠RHO基因座处进行CRISPR介导的外显子1置换产生Rho人源化动物模型。该系统使得研究人员能够在体内测试CRISPR组分。图6A是用野生型(wt)或突变型人(h)RHO外显子1替换小鼠(m)Rho外显子1的策略的说明。通过编码Cas9和Rho外显子1特异性sgRNA的质粒pX459的共电穿孔，可以在小鼠外显子1中产生双链断裂，促进ES细胞中的同源重组。图6B显示了表征额外的AvaII位点的ES细胞DNA的限制性片段长度多态性(RFLP)测定结果，其表明小鼠Rho外显子1被人RHO外显子1替换(泳道1和2)。图6C：PCR扩增子的序列电泳图谱显示来自一个靶向ES克隆的人和小鼠序列的融合。
图7A-7C显示了在小鼠胚胎干细胞中通过CRISPR对编码Pde6a的基因中的D670G等位基因的成功基因替换。图7A是供体构建体的示意图，所述供体构建体包含具有两个变化的Pde6a：(1)引入了Pde6a密码子修饰，其在D670G密码子上游产生了额外的SphI位点；以及(2)引入了八个摆动碱基对，使得供体模板对sgRNA靶向具有抗性。图7B显示了从经历同源重组的ES细胞产生的PCR扩增子。图7C显示了靶ES克隆DNA的测序电泳图谱数据，其特征为D670G等位基因预期被供体模板替换。
图8A-8C显示“切碎粘贴”(基因缺失或基因破坏)可用于高效地缺失和纠正来青少年黄斑变性患者(OMIM#126600)的诱导的多潜能干(iPS)细胞中的目标基因区域，诸如含有突变的区域。图8A是将CRISPR组分引入人iPSC(iPS细胞)的示意图。将Cas9蛋白/sgRNA复合物(RNP)与单链供体模板(ssODN)共核转染入人iPS细胞。通过限制性片段长度多态性(RFLP)测定进一步选择和筛选克隆。图8B是这种情况下sgRNA靶向位点的示意图。用点标记的核苷酸对应突变位点。图8C是集落PCR的测序结果，表明供体模板的替换。
图9是自切除AAV/Cas9载体的示意图。来自化脓性链球菌的Cas9由173-bp的短CMV启动子(sCMV)驱动，并由50-bp的合成聚-A信号(SPA)终止，侧翼为sgRNA-Y1(SEQ ID NO:7)靶序列(源于果蝇的GGTTTTGGACAATGGAACCGTGG)。一旦细胞同时表达Cas9蛋白和sgRNA-Y1，这种AAV/Cas9载体就会被Cas9本身破坏。
图10A-10D：患者来源的iPS细胞中的几个基因的CRISPRr纠正。(A)Cas9表达载体示意图和用于靶向RHOR135L的CRISPR/Cas9修复策略示意图。在B–D中使用了相同的设计。(B)在Pvul限制性位点处进行的限制性片段长度多态性(RFLP)测定显示，Cas9切割并整合了供体模板。(C)体外Surveyor错配切割测定显示g59 gRNA切割了RPGR(左图右侧的箭头)。DNA测序色谱图显示了纠正后的点突变(右图底部色谱图中的箭头)和未纠正的未处理的对照(右图顶部色谱图中的箭头)。(D)HTRA1 DNA测序色谱图显示了纠正后的点突变(右图底部谱图中的箭头)和未纠正的、未处理的对照(右图顶部色谱图中的箭头)。
图11.CRISPRr、CRISPRd和CRISPRi的比较。HDR：同源性定向修复；SNP：单核苷酸多态性；TSS：转录起始位点。CRISPRr：优点：无可挑剔的基因纠正；缺点：HDR频率低；需要突变特异性设计(在BEST1中发现的>250个突变)。CRISPRd：一种设计处理所有突变；高效的基因消融。CRISPRi：一种设计处理所有突变；可逆的。
图12.两种具有高杂合性的靶向SNP的gRNA。变体的水平由区域指示。ALL，全球流行；AFR，非洲；AMR，美洲；EAS，东亚；EUR，欧洲；SAS，南亚。
图13A-13C.CRISPRd介导BEST1外显子1的选择性缺失。(A)CRISPRd切割位点的示意图。gRNA1靶向SNP rs972355，gRNA3靶向内含子1的中心。水平箭头指示筛选引物组。(B)将具有gRNA1和gRNA3的质粒px459转染到HEK293细胞中，所述细胞对于SNP rs972355是杂合的。孵育48小时后，筛选基因组DNA的CRISPRd介导的缺失。检测到306-bp的截短片段(与2256-bp的亲代序列相比)。(C)通过Sanger测序分析总DNA，确认靶序列被缺失。
图14A-14B.体外SNP特异性BEST1靶向验证了等位基因特异性SNP策略。(A)CRISPR切割模板A和B通过PCR扩增来自在rs972353和rs972355具有杂合SNP变体的患者的BEST1TSS区域而产生。就这两种SNP而言，只有变异形式G才具有CRISPR能力。(B)将模板A或B(650bp)暴露于Cas9和gRNA1或gRNA2(CTRL＝无gRNA)。gRNA1而非gRNA2高效地指导了对患者模板A的切割，产生了590-bp+70-bp的条带。(请注意，70-bp的条带太弱以至于在此处看不到，并且Cas9/gRNA2与模板A的结合(但由于没有足够的PAM位点而没有切割)导致DNA分子量的改变。当使用模板B进行相同的实验时，只有gRNA2(而不是gRNA1)可以介导切割。
图15A-15C.CRISPRi选择性沉默突变的BEST1等位基因。(A)CRISPRi不会产生双链DNA断裂，而是通过转录因子阻断TSS结合来沉默基因。与CRISPRr不同，CRISPRi使用不会裂解DNA而是通过gRNA靶向其的催化缺陷型Cas9(dCas9)。当CRISPRi机器与TSS结合时，与dCas9融合的Kruppel相关盒(KRAB)基因阻遏物使下游基因沉默(第一代)。第二代CRISPRi通过PUF-KRAB阻遏物更强烈地抑制。PUF衔接子蛋白结合经PUF结合序列修饰的gRNA。(B，C)TSS中的两个连续SNP(rs972353或rs972355)使得能够等位基因特异性靶向。例如，gRNA2靶向TSS附近的rs972353:G SNP以敲低MT BEST1表达。
图16A-16C.iRPE细胞中BEST1 mRNA表达的CRISPRi敲低。来自在SNP rs972355处具有GGG变体的VMD患者的iPS来源的RPE细胞。(A)gRNA1靶向位点的设计。(B)用质粒Puro-CRISPRi-sgRNA1转染细胞，在两周的时间内利用嘌呤霉素选择所述细胞。(C)通过qPCR评估BEST1 mRNA水平。
图17A-17B.表达Cl-生物传感器并用5μM A23187刺激的野生型(A)和pArg218H(B)患者来源的RPE细胞的代表性静态图像(左图)。在刺激后的指定时间(min)采集图像。图表显示了针对t＝0时间点归一化的平均全细胞生物传感器发射强度的定量(Moshfegh,Velez等人2016)。
图18A-18D.利用Cirrus HDOCT(Zeiss；Oberkochen,Germany)采集的患有VMD的45岁男性(A)和31岁女性(C)的正面OCT，以及在近似的IS/OS波段水平上的横截面(B,D)中相应的37μm切片。利用这种技术可以高分辨率地观察中央卵黄状病变，并在评估卵黄状病变的结构成分时补充常规FAF和SD-OCT成像。在每个患者中使假性前房积脓(pseudohypopyon)可视化(白色星号)，但在31岁的女性中进展更快(C)。
图19A-19F.由于p.R218H:c.653G>A而患有VMD的31岁女性中的SW-AF。(A)和(D)，分别为在30岁时于2015年11月4日拍摄的OD和OS。(Bb)和(E)，分别为12个月后在31岁时于2016年10月26日拍摄的OD和OS。(C)和(F)，分别为13个月后在31岁时于2016年12月14日拍摄的OD和OS。
图20.光学相干断层扫描(OCT)可以是可靠的终点。OCT图像监控1年内的进展。在因p.Ala10Thr而患有常染色体显性VMD的11岁女孩中观察到的进展。虚线表示病变的初始水平直径。双面箭头表示病变的初始高度。
图21.在因p.Gln293Lys而患有VMD的44岁的VMD男性中观察到的OD与OS之间的对称性。FA图像检测到双类视黄醇脂褐素积累和色素上皮萎缩。
图22A和图22B.CRISPR3.0：对携带不同显性突变的Best VMD患者的治疗。(A)将一对紧密连锁的SNP(r972355和rs972353)在CRISPR3.0(图22C)中用于标记一对同源物中每个同源物的身份。显示了染色体上两个SNP的核苷酸变体的所有四种可能组合。为了实现CRISPR3.0，设计了三种gRNA：gRNA-a靶向rs972355核苷酸变体G(而不是A)；gRNA-b靶向rs972353核苷酸变体G(而不是C)；gRNA-c靶向下游内含子区域。当同源物1(基因型1)中存在突变时，将gRNA-a+gRNA-c用于特异性破坏来自同源物1的突变型BEST1基因的表达。如果突变相反存在于同源物2(基因型2)上，则将使用gRNA-b+gRNA-c。因为这两个SNP不能区分基因型3和4中的两个同源物，所以这些基因型需要使用其它SNP和gRNA。(B)基于rs972355和rs972353设计的gRNA组可治疗约50％的Best VMD患者群体(基因型1+2，基于TOPMED数据库)。在治疗前，可以分析每个患者的DNA以确定基因型(参见图25，工作流程)。
图23A和图23B.CRISPR3.0：对携带不同显性突变的Best VMD患者的潜在治疗。(A)在CRISPR3.0中，将一对紧密连锁的SNP(r972355和rs972353)用于标记一对同源物中每个同源物的身份。显示了染色体上两个SNP的核苷酸变体的所有四种可能组合。为了实现CRISPR3.0，设计了三种gRNA：gRNA-a靶向rs972355核苷酸变体G(而不是A)；gRNA-b靶向rs972353核苷酸变体G(而不是C)；gRNA-c靶向下游内含子区域。当同源物1(基因型1)中存在突变时，将gRNA-a+gRNA-c用于特异性破坏来自同源物1的BEST1基因的表达。如果突变相反存在于同源物2(基因型2)上，则使用gRNA-b+gRNA-c。因为这两个SNP不能区分基因型3和4中的两个同源物，所以这些基因型需要使用其它SNP和gRNA。(B)基于rs972355和rs972353设计gRNA组，其可治疗约50％的总的Best VMD患者群体(基因型1+2，基于TOPMED数据库)。在治疗前分析来自每个患者的基因以确定基因型(见图22D，工作流程)。
图24是CRISPR 1.0、CRISPR 2.0和CRISPR 3.0的概述
图25概述了CRISPR 3.0治疗的工作流程。
图26A-26C.CSGT(CRISPR 3.0)-用于大约一半的Best VMD患者的治疗。使用来自35名Best VMD患者的血液样品对BEST1基因进行测序，以揭示两个上游SNP(rs972355和rs972353)的所有四种可能的核苷酸变体组合(注意这两个SNP是遗传连锁的)。利用同源染色体之间TSS SNP的差异的CRISPR3.0在靶向TSS SNP为杂合时，介导选择性基因截短。因此，占患者群体49.9％的基因型1和基因型2(与突变顺式的SNP杂合子)可由CRISPR3.0治疗，基因型3和基因型4(SNP纯合子)可由CRISPR2.0治疗。
图27A-27B.双重gRNA对基因组BEST1的等位基因特异性切除和在体外对RPE细胞中SNP编辑后BEST1表达的测量。(A)通过不同的双重gRNA系统(CRISPR 3.0)在体外于293FT细胞中截短基因组BEST1。在四个组当中，在三个组(I、II和IV)中检测到不同大小的截短的BEST1等位基因(箭头)。(B)BEST1表达在CRISPR2.0-和3.0-编辑的VMD iRPE中是强劲的。用慢病毒双重gRNA载体转导源自VMD患者成纤维细胞的iRPE，以用于BEST1等位基因的CRISPR2.0或3.0编辑；载体携带WT BEST1 cDNA(+WT)或不携带WT BEST1cDNA(+WT)；WTiRPE未被转导。两周后，收集RNA，产生cDNA，通过qPCR测定BEST1转录物的表达。BEST1的PCR产物约为260bp。WT，对于SNP rs972355是纯合的WT RPE；对照，仅携带WT BEST1 cDNA(无gRNA)的双重载体；GAPDH，内部对照。对照组未使用慢病毒载体。GAPDH用作内部对照。
具体实施方式
在下文中将更全面地描述根据本公开的实施方案。然而，本公开的方面可以以许多不同形式来体现且不应该被解释为局限于文中所阐述的实施方案。而是，提供这些实施方案以使得本公开将是透彻和完整的，并将向本领域技术人员充分传达本发明的范围。在本文的描述中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意于进行限制。
除非另有限定，否则本文中所使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属的领域内的普通技术人员通常理解的含意相同的含意。还将理解的是，术语，诸如在常用词典中定义的那些术语，应当被解释为具有与它们在本申请和相关技术的上下文中的含义一致的含义，并且不应当以理想化或过度正式的意义来解释，除非在此明确定义。尽管在下面未明确定义，但应根据其常用含义来解释此害术语。
本文描述中所使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的且并非旨在限制本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。
除非另有指示，否则本技术的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，所述技术在本领域技术范围内。
除非上下文另外指出，否则特别地期望可以以任何组合使用本文描述的本发明的各种特征。此外，本公开还设想在一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。举例来说，如果说明书指出复合物包含组分A、B和C，则特别地期望可以省略A、B或C中的任一种或其组合，并且可以单独地或以任何组合放弃。
除非另外明确指出，否则所有指定的实施方案、特征和术语意欲包括所列举的实施方案、特征或术语及其生物学等同物。
所有数字标记(numerical designation)(例如，pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围)均为近似值，其可通过(+)或(-)1.0或0.1的增量(视情况而定)而变化，或者可选地以+/-15％、或可选地10％、或可选地5％或可选地2％的变化而变化，并且包括了这些范围。应当理解，尽管并不总是明确指出，但所有数字标记之前均带有术语“约”。尽管并不总是明确指出，但应当理解本文描述的试剂仅是示例性的，并且所述试剂的等同物是本领域已知的。
在整个本公开中，各种出版物、专利和公开的专利说明书通过标识性引用或阿拉伯数字来引用。对由阿拉伯数字标识的出版物的完整引用可以在权利要求书的前面立即找到。所有这些出版物、专利和公布的专利说明书的公开内容据此通过引过引用整体并入本公开，以便更全面地描述本发明所属领域的技术现状。
定义
除非另有说明，否则本技术的实践将采用有机化学、药理学、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，所述技术在本领域技术范围内。参见，例如，Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版(1989)；Current Protocols In Molecular Biology(F.M.Ausubel,等人编辑，(1987))；theseries Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995)),Harlow和Lane，编辑(1988)Antibodies,a Laboratory Manual,and Animal Cell Culture(R.I.Freshney，编辑(1987))。
如本发明的描述和所附权利要求书中所使用，除非上下文另有清楚指示，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述(the)”也意欲包括复数形式。
如本文中所用，术语“包含”意欲表示组合物和方法包括所述要素，但不排除其它要素。如本文中所用，基本上由(和语法变型).......组成的过渡性短语应被解释为涵盖所列举的材料或步骤以及不实质地影响所列举的实施方案的基本和新颖特征的那些材料或步骤。因此，如本文中所用，术语“基本上由……组成”不应解释为等同于“包含”。由......组成”应意指排除超过其它成分的痕量元素和用于施用本文公开的组合物的基本方法步骤。由这些过渡性术语的每一个定义的方面在本公开的范围内。
如本文中所用，术语“约”在涉及诸如量或浓度等可测量值时，意欲涵盖指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的变化。
术语“可接受的”、“有效的”或“足够的”，当用于描述本文公开的任何组分、范围、剂量形式等的选择时，意味着所述组分、范围、剂量形式等适用于所公开的目的。
同样如本文中所用，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关联的所列项的任何和所有可能的组合，以及当以二中择一(“或”)解释时不存在组合。
如本文中所用，术语“细胞”可以指原核细胞或真核细胞，任选地从受试者或商购可得来源获得。
“真核细胞”包括除原核生物界(monera)外的所有生命王国。它们可以很容易地通过膜结合的细胞核来区分。动物、植物、真菌和原生生物是其细胞通过内膜和细胞骨架组织成复杂结构的真核生物或生物体。最具特征的膜结合结构是细胞核。除非特别叙述，否则术语“宿主”包括真核宿主，包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。真核细胞或宿主的非限制性实例包括猿猴、牛、猪、鼠、大鼠、鸟类、爬行动物和人，例如HEK293细胞和293T细胞。
“原核细胞”通常缺乏细胞核或任何其它膜结合的细胞器，分为细菌和古细菌两个域。除了染色体DNA之外，这些细胞还可在称为附加体的圆环中包含遗传信息。细菌细胞非常小，大致相当于动物线粒体的尺寸(直径约1-2μm，长度为10μm)。原核细胞有三种主要形状：杆状、球形和螺旋形。细菌细胞不是像真核生物一样经历复杂的复制过程，而是通过二分分裂进行分裂。实例包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)细菌、大肠杆菌(E.Coli)细菌和沙门氏菌属(Salmonella)细菌。
术语“编码”，当其用于核酸序列时，是指如果在其天然状态下或当通过本领域技术人员熟知的方法操作时，可被转录和/或翻译以产生多肽和/或其片段的mRNA，则被称为“编码”多肽的多核苷酸。反义链是这种核酸的互补序列，可以从其推导出编码序列。
当提及特定分子、生物或细胞材料时，术语“等同物”或“生物等同物”可互换使用，意指具有最小同源性同时仍保持所需结构或功能性的那些。等同多肽的非限制性实例包括与多肽或对多肽序列具有至少60％，或可选地至少65％，或可选地至少70％，或可选地至少75％，或可选地至少80％，或可选地至少85％，或可选地至少90％，或可选地至少95％同一性的多肽，或由在高严格性条件下与编码此类多肽序列的多核苷酸杂交的多核苷酸或其互补序列编码的多肽。本文描述了高严格性条件，并通过引用将其并入本文。或者，其等同物是由与参考多核苷酸例如野生型多核苷酸具有至少70％，或可选地至少75％，或可选地至少80％，或可选地至少85％，或可选地至少90％，或可选地至少95％，或至少97％序列同一性的多核苷酸或针对其的互补序列编码的多肽。
等同多肽的非限制性实例包括与参考多核苷酸具有至少60％，或可选地至少65％，或可选地至少70％，或可选地至少75％，或可选地至少80％，或可选地至少85％，或可选地至少90％，或可选地至少95％，或可选地至少97％同一性的多核苷酸。等同物也意欲指在高严格性条件下与参考多核苷酸杂交的多核苷酸或其互补序列。
与另一序列具有一定百分比(例如，80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”或同源性(等价性或等同性)的多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)意指当比对时，在比较两个序列中，该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。比对和同源性百分比或序列同一性可使用本领域已知的软件程序，例如在Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人，编辑1987)补编30，第7.7.18节，表7.7.1中的那些来确定。在某些实施例中，将默认参数用于比对。非限制性示例性对准程序是BLAST，使用默认参数。具体地，示例性程序包括BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；预期值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的细节可见于以下网址：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。序列同一性和百分比同一性可通过将它们整合到clustalW(可从网址获得：genome.jp/tools/clustalw/，最近一次访问是在2017年1月13日)中来确定。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可通过比较可以为了比较目的而进行比对的每个序列中的位置来确定。当比较的序列中的位置被相同碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置是同源的。序列之间的同源性程度是序列共有的匹配或同源位置数量的函数。“不相关的”或“非同源的”序列与本公开的序列之一共有少于40％的同一性，或可选地少于25％的同一性。
“同源性”或“同一性”或“相似性”还可指在严格条件下杂交的两个核酸分子。
“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应形成通过核苷酸残基碱基之间的氢键合稳定的复合物的反应。氢键合可通过沃尔森-克里克碱基配对、Hoogstein结合或以任何其它序列特异性方式发生。复合物可包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单个自杂交链或这些的任意组合。杂交反应可构成更广泛过程诸如PCR反应的启动或核酶对多核苷酸的酶促切割中的步骤。
严格杂交条件的实例包括：约25℃至约37℃的孵育温度；约6×SSC至10×SSC的杂交缓冲液浓度；约0％至约25％的甲酰胺浓度；以及从约4×SSC至约8×SSC的洗涤溶液。中等杂交条件的实例包括：约40℃至约50℃的孵育温度；约9×SSC至约2×SSC的缓冲液浓度；约30％至约50％的甲酰胺浓度；以及约5×SSC至约2×SSC的洗涤溶液。高严格条件的实例包括：约55℃至约68℃的孵育温度；约1×SSC至约0.1×SSC的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及大约1×SSC、0.1×SSC或去离子水的洗涤溶液。通常，杂交孵育时间为5分钟至24小时，具有1、2或更多个洗涤步骤，并且洗涤孵育时间约为1、2或15分钟。SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液。应当理解，可采用使用其它缓冲系统的SSC的等同物。
如本文中所用，“表达”是指籍以将多核苷酸转录成mRNA的过程和/或籍以将转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸来源于基因组DNA，表达可包括真核细胞中mRNA的剪接。
如本文中所用，术语“分离的”是指基本上不含其它物质的分子或生物制品或细胞材料。
如本文中所用，术语“功能性”可用于修饰任何分子、生物或细胞材料，以期望其实现特定的、指定的效果。
如本文中所用，术语“核酸序列”和“多核苷酸”可互换使用，指具有任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物形式。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体、或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其它天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用，在最广泛的意义上是指具有氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的两个或更多个亚单位的化合物。亚单位可通过肽键连接。在另一方面，亚单位可通过其它键例如酯、醚等连接。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可组成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。如本文中所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。
如本文中所用，术语“重组表达系统”是指用于表达通过重组形成的某些遗传物质的一种或多种遗传构建体。
“基因递送媒介物”被定义为能够将插入的多核苷酸运载到宿主细胞中的任何分子。基因递送媒介物的实例是脂质体、胶束生物相容性聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人造病毒包膜；金属颗粒；以及细菌或病毒，诸如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒、噬菌体、粘粒、质粒、真菌载体和本领域中通常使用的其它重组媒介物，所述重组媒介物已被描述为在多种真核和原核宿主中表达，并可用于基因疗法以及简单的蛋白质表达。
可使用基因递送媒介物将本文公开的多核苷酸递送至细胞或组织。如本文中所用，“基因递送”、“基因转移”，“转导”等是指将外源多核苷酸(有时称为“转基因”)引入宿主细胞中而与用于引入的方法无关的术语。此类方法包括多种公知的技术，诸如载体介导的基因转移(通过，例如，通过病毒感染/转染,或各种其它基于蛋白质或基于脂质的基因递送复合物)，以及有助于“裸”多核苷酸递送的技术(诸如电穿孔、“基因枪”递送和用于引入多核苷酸的各种其它技术)。所引入的多核苷酸可以在宿主细胞中稳定保持或瞬时保持。稳定的维持通常要求引入的多核苷酸包含与宿主细胞相容的复制起始点，或者整合到宿主细胞的复制子诸例如染色体外复制子(例如，质粒)或者细胞核或线粒体染色体中。如本领域已知的和本文所述的，已知许多载体能够介导基因向哺乳动物细胞的转移。
“质粒”是与染色体DNA分离的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA复制。在许多情况下，其为圆形的和双链的。质粒提供了在微生物群体内水平基因转移的机制，并且通常在给定的环境状态下提供选择优势。质粒可携带在竞争性环境小生境(competitiveenvironmental niche)中对天然存在的抗生素具有抗性的基因，或者可选地所产生的蛋白质可在类似情况下充当毒素。
基因工程中使用的“质粒”被称为“质粒载体”。许多质粒可用于此类用途。将要复制的基因插入质粒的拷贝中，所述质粒的拷贝含有使细胞对特定抗生素具有抗性的基因和多克隆位点(MCS或多接头)，所述多克隆位点是包含几个常用的限制性位点，允许在该位置处容易地插入DNA片段的短区域。质粒的另一主要用途是制备大量蛋白质。在这种情况下，研究人员可以使包含具有目标基因的质粒的细菌生长。正如细菌产生赋予其抗生素抗性的蛋白质一样，其也可被诱导以从插入的基因中产生大量蛋白质。
如本文中所用，“靶标(target)”、“靶标(targets)”或“靶向(targeting)”是指多核苷酸的共价主链的部分或无断裂。在一个实施方案中，失活的Cas蛋白(或dCas)在与引导RNA形成DNA结合的复合物后靶向核苷酸序列。因为dCas的核酸酶活性完全或部分失活，所以dCas与序列结合而不切割或完全切割所述序列。在一些实施方案中，用dCas靶向基因序列或其启动子可以抑制或阻止多核苷酸或基因的转录和/或表达。
“酵母人工染色体”或“YAC”是指用于克隆大DNA片段(大于100kb和最大3000kb)的载体。其为人工构建的染色体，并且包含在酵母细胞中复制和保存所需的端粒、着丝粒和复制起始点序列。使用最初的环状质粒构建，通过使用限制酶将它们线性化，然后DNA连接酶可以通过使用粘性末端在线性分子内加入目标序列或基因。酵母表达载体，诸如YAC、YIp(酵母整合质粒)和YEp(酵母附加型质粒)，非常有用，因为人们可以获得具有翻译后修饰的真核生物蛋白质产物(因为酵母本身就是真核细胞)，然而，已经发现YAC比BAC更不稳定，产生嵌合效应。
“病毒载体”被定义为重组产生的病毒或病毒颗粒，其包含待体内、离体或体外递送至宿主细胞的多核苷酸。
病毒载体的实例包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、甲病毒载体等。基于感染性烟草花叶病毒(TMV)的载体可用于制造蛋白质，并且据报道在烟草叶中表达格里菲星(Griffithsin)(O'Keefe等人(2009)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 106(15):6099-6104)。甲病毒载体，诸如基于Semliki森林病毒的载体和基于辛德比斯病毒的载体，也已被开发用于基因疗法和免疫疗法。参见，Schlesinger&Dubensky(1999)Curr.Opin.Biotechnol.5:434-439 and Ying等人(1999)Nat.Med.5(7):823-827。在其中通过逆转录病毒载体介导基因转移的方面，载体构建体是指包含逆转录病毒基因组或其部分和治疗性基因的多核苷酸。关于用于基因转移的载体的现代方法的更多细节可见于例如Kotterman等人(2015)Viral Vectors for Gene Therapy:Translational and ClinicalOutlook Annual Review of Biomedical Engineering 17中。
如本文中所用，“逆转录病毒介导的基因转移”或“逆转录病毒转导”具有相同的含义，并且是指借助于病毒进入细胞并将其基因组整合到宿主基因组中而将基因或核酸序列稳定地转移到宿主细胞中的过程。病毒可通过其正常的感染机制进入宿主细胞，或者可被修饰，使其与不同宿主细胞表面受体或配体结合以进入细胞。如本文中所用，逆转录病毒载体是指能够通过病毒或病毒样进入机制将外源核酸引入细胞的病毒颗粒。
逆转录病毒以RNA形式携带其遗传信息；然而，一旦病毒感染细胞，RNA就被逆转录成DNA形式，所述DNA形式整合到被感染的细胞的基因组DNA中。整合的DNA形式被称为前病毒。
在其中基因转移由DNA病毒载体诸如腺病毒(Ad)或腺相关病毒(AAV)介导的方面，载体构建体是指包含病毒基因组或其一部分和转基因的多核苷酸。腺病毒(Ad)是一组相对较好地表征的同质病毒，包括超过50种血清型。Ad不需要整合到宿主细胞基因组中。还已构建了重组Ad衍生的载体，特别是减少野生型病毒的重组和产生的可能性的那些载体。此类载体可从诸如Takara Bio USA(Mountain View,CA)、Vector Biolabs(Philadelphia,PA)和Creative Biogene(Shirley,NY)等来源商购获得。野生型AAV具有高感染性和特异性，可以整合到宿主细胞的基因组中。参见，Wold和Toth(2013)Curr.Gene.Ther.13(6):421-433,Hermonat&Muzyczka(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470，以及Lebkowski等人(1988)Mol.Cell.Biol.8:3988-3996。
既包含启动子又包含可将多核苷酸可操作地连接到其中的克隆位点的载体是本领域公知的。此类载体能够在体外或体内转录RNA，并且可从诸如Agilent Technologies(Santa Clara,Calif.)和Promega Biotech(Madison,Wis.)等来源商购获得。为了优化表达和/或体外转录，可能需要去除、添加或改变克隆的5'和/或3'非翻译部分，以消除额外的、潜在的不适当的替代翻译起始密码子或可在转录或翻译水平上干扰或降低表达的其它序列。或者，可在紧接起始密码子的5'处插入共有核糖体结合位点以增强表达。
基因递送媒介物还包括DNA/脂质体复合物、胶束和靶向病毒蛋白质-DNA复合物。还包含靶向抗体或其片段的脂质体可用于本文公开的方法中。除了将多核苷酸递送至细胞或细胞群以外，将本文所述的蛋白质直接引入细胞或细胞群中可通过蛋白质转染的非限制性技术来完成，或者可增强本文公开的蛋白质的表达和/或促进所述蛋白质的活性的培养条件是其它非限制性技术。
如本文中所用，术语“病毒衣壳”或“衣壳”是指病毒颗粒的蛋白质性质的壳或外壳。衣壳的功能是将病毒基因组衣壳化、保护、运输并释放到宿主细胞中。衣壳通常由蛋白质的寡聚结构亚单位(“衣壳蛋白”)组成。如本文中所用，术语“衣壳化的”意指封闭在病毒衣壳内。
如本文中所用，关于病毒或质粒的术语“辅助物”是指用于提供病毒颗粒或重组病毒颗粒(诸如本文公开的经修饰的AAV)的复制和包装所必需的附加组分的病毒或质粒。辅助病毒编码的组分可包括病毒体组装、衣壳化、基因组复制和/或包装所需的任何基因。例如，辅助病毒可编码用于复制病毒基因组的必需酶。适用于AAV构建体的辅助病毒和质粒的非限制性实例包括pHELP(质粒)、腺病毒(病毒)或疱疹病毒(病毒)。
如本文中所用，术语“AAV”是腺相关病毒的标准缩写。腺相关病毒是单链DNA细小病毒，其仅在通过共感染辅助病毒提供某些功能的细胞中生长。AAV的一般信息和综述可见于例如Carter,1989,Handbook of Parvoviruses，第1卷，第169-228页以及Berns,1990,Virology，第1743-1764页，Raven Press,(New York)中。完全可以预期，这些综述中描述的相同原理将适用于在所述综述发表之日后表征的其它AAV血清型，因为众所周知，各种血清型在结构及功能上，甚至在基因水平上都非常紧密相关的。(参见，例如，Blacklowe,1988，Parvoviruses and Human Disease的第165-174页，J.R.Pattison，编辑；以及Rose,Comprehensive Virology 3:1-61(1974))。例如，所有AAV血清型都明显地表现出由同源rep基因介导的非常相似的复制特性；并且全都具有三种相关的衣壳蛋白诸如在AAV2中表达的那些。通过异源双链体分析进一步表明了相关性的程度，所述异源双链体分析揭示了沿基因组长度的血清型之间的广泛交叉杂交；以及在末端存在与“反向末端重复序列”(ITR)相对应的类似自退火片段。相似的感染性模式也表明，每种血清型中的复制功能都处于相似的调节控制之下。
如本文中所用，“AAV载体”是指包含侧接AAV末端重复序列(ITR)的一个或多个目标多核苷酸(或转基因)的载体。当存在于已用编码且表达rep和cap基因产物的载体转染的宿主细胞中时，此类AAV载体可被复制并包装到感染性病毒颗粒中。
“AAV病毒体”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化的多核苷酸AAV载体组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组外的多核苷酸，诸如待传递至哺乳动物细胞的转基因)，则其通常被称为“AAV载体颗粒”或简称为“AAV载体”。因此，AAV载体颗粒的产生必然包括AAV载体的产生，因此载体包含在AAV载体颗粒内。
腺相关病毒(AAV)是复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组的长度约为4.7kb，包括两个145个核苷酸的反向末端重复序列(ITR)。AAV有多种血清型。AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。例如，AAV-1的完整基因组提供于GenBank登录号NC_002077中；AAV-2的完整基因组提供于GenBank登录号NC_001401和Srivastava等人，J.Virol.,45:555-564{1983)中；AAV-3的完整基因组提供于GenBank登录号NC_1829中；AAV-4的完整基因组提供于GenBank登录号NC_001829中；AAV-5基因组提供于GenBank登录号AF085716中；AAV-6的完整基因组提供于GenBank登录号NC_00 1862中；AAV-7和AAV-8基因组的至少一部分分别提供于GenBank登录号AX753246和AX753249中；AAV-9基因组提供于Gao等人，J.Virol.,78:6381-6388(2004)中；AAV-10基因组提供于Mol.Ther.,13(1):67-76(2006)中；以及AAV-11基因组提供于Virology,330(2):375-383(2004)中。AAV rh.74基因组的序列提供于美国专利9,434,928(通过引用并入本文)中。指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在AAV ITR中。三种AAV启动子(因其相对图谱位置(relativemap locations)而命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框架的表达。两种rep启动子(p5和pi 9)，结合单个AAV内含子的差异剪接(在核苷酸2107和核苷酸2227处)，导致从rep基因产生四种rep蛋白(rep 78、rep 68、rep 52和rep 40))。Rep蛋白具有多种最终负责复制病毒基因组的酶促性质。cap基因是从p40启动子表达的，其编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。选择性剪接和非共有的翻译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。单个共有多聚腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95。AAV的生命周期和遗传学综述于Muzyczka,Current Topics in Microbiology and Immunology,158:97-129(1992)中。
AAV具有独特的特征，使其例如在基因疗法中作为将外源基因递送到细胞的载体而具有吸引力。培养物中细胞的AAV感染是非致细胞病变的，人和其它动物的自然感染是沉默无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，从而有可能在体内靶向许多不同的组织。此外，AAV转导缓慢分裂和非分裂的细胞，并且可基本上作为转录活性核附加体(染色体外元件)在这些细胞的生命周期中持续存在。将AAV前病毒基因组作为克隆的DNA插入质粒中，这使得重组基因组的构建可行。此外，由于指导AAV复制和基因组衣壳化的信号包含在AAV基因组的ITR中，因此，基因组内部约4.3kb的部分或全部(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可被外源DNA替换。为了产生AAV载体，可以反式提供rep和cap蛋白。AAV的另一个显着特征是其为极其稳定且强壮的病毒。其可以轻松承受用于灭活腺病毒的条件(56°至65℃持续数小时)，从而使AAV的冷藏变得不那么关键。AAV甚至可被冻干。最后，AAV感染的细胞对重叠感染没有抵抗力。
多项研究表明在肌肉中存在长期的(>1.5年)重组AAV介导的蛋白质表达。参见Clark等人，Hum Gene Ther,8:659-669(1997)；Kessler等人，Proc Nat.Acad Sc.USA,93:14082-14087(1996)；以及Xiao等人，J Virol,70:8098-8108(1996)。另请参见，Chao等人，Mol Ther,2:619-623(2000)和Chao等人，Mol Ther,4:217-222(2001)。此外，由于肌肉高度血管化，重组AAV转导已导致在肌内注射后转基因产物在全身循环中出现，如Herzog等人，Proc Natl Acad Sci USA,94:5804-5809(1997)和Murphy等人，Proc Natl Acad Sci USA,94:13921-13926(1997)中所描述的。此外，Lewis等人，J Virol,76:8769-8775(2002)证明了骨骼肌纤维具有正确的抗体糖基化、折叠和分泌所必需的细胞因子，表明肌肉能够稳定表达分泌的蛋白质治疗剂。rAAV基因组中的AAV DNA可来自重组病毒可源自的任何AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13和AAV rh74。假型rAAV的产生公开于例如WO 01/83692中。也可以考虑其它类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见，例如，Marsic等人，Molecular Therapy,22(11):1900-1909(2014)。各种AAV血清型的基因组的核苷酸序列是本领域已知的。
术语“Cas9”是指该名称所指的CRISPR相关内切核酸酶。本文提供了非限制性示例性Cas9，例如UniProtKB G3ECR1中提供的Cas9(CAS9_STRTR)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9，以及核酸酶失活的Cas9(nuclease dead Cas9)、其直向同源物和生物等同物。直向同源物包括但不限于化脓性链球菌Cas9(“spCas9”)；来自嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、乳酰胺奈瑟菌(Neisseria lactamica)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)的Cas 9；和来自包括氨基酸球菌属某些种(Acidaminococcus spp)和新凶手弗朗西斯菌U112在内的各种细菌物种的Cpf1(其执行与Cas9类似的切割功能)。
如本文中所用，术语“CRISPR”是指依赖于成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)途径的序列特异性基因操作技术。CRISPR可用于执行基因编辑和/或基因调控，以及简单地将蛋白质靶向特定的基因组位置。基因编辑是指一种类型的基因工程，其中通过将缺失、插入或碱基取代引入多核苷酸序列来改变靶多核苷酸的核苷酸序列。在某些方面，CRISPR介导的基因编辑利用非同源末端连接(NHEJ)或同源重组的途径进行编辑。基因调控是指增加或减少特定基因产物(诸如蛋白质或RNA)的产生。
如本文中所用，术语“gRNA”或“引导RNA”是指用于靶向特定基因以利用CRISPR技术进行纠正的引导RNA序列。设计gRNA和供体治疗性多核苷酸的靶特异性的技术是本领域公知的。例如，Doench,J.等人Nature biotechnology 2014；32(12):1262-7,Mohr,S.等人(2016)FEBS Journal 283:3232-38以及Graham,D.等人Genome Biol.2015；16:260。gRNA包含以下多核苷酸或可选地基本上由所述多核苷酸组成，或者还进一步所述多核苷酸组成：包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRIPSPR RNA(tracrRNA)的融合多核苷酸；或包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRIPSPR RNA(tracrRNA)的多核苷酸。在一些方面，gRNA是合成的(Kelley,M.等人(2016)J of Biotechnology 233(2016)74-83)。如本文中所用，gRNA的生物等同物包括但不限于能够将Cas9或其等同物引导至特定核苷酸序列诸如细胞基因组的特定区域的多核苷酸或靶向分子。
“组合物”旨在表示活性多肽、多核苷酸或抗体与另一种惰性(例如，可检测的标记物)或活性(例如，基因递送媒介物)的化合物或组合物的组合。
“药物组合物”旨在包括活性多肽、多核苷酸或抗体与惰性或活性载体诸如固体支持物的组合，使得所述组合物适合于体外、体内或离体的诊断或治疗用途。
如本文中所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药物载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液，诸如油/水或水/油乳液，以及各种类型的润湿剂。所述组合物还可包含稳定剂和防腐剂。关于载体、稳定剂和佐剂的实例，参见Martin(1975)Remington’sPharm.Sci.，第15版(Mack Publ.Co.,Easton)。
诊断或治疗的“受试者”是细胞或动物诸如哺乳动物或人。受试者不限于特定物种，包括接受诊断或治疗的非人动物，并且是那些受到感染的受试者或动物模型，例如，猿猴、鼠，诸如大鼠、小鼠、灰鼠、犬科动物，诸如狗、兔科动物，诸如兔子、家畜、运动动物和宠物。人患者也包括在该术语内。
术语“组织”在本文中用于指活的或死亡的生物体的组织，或者源自活的或死亡的生物体或设计成模拟活的或死亡的生物体的任何组织。所述组织可以是健康的、患病的和/或具有基因突变。生物组织可包括任何单个组织(例如，可相互连接的细胞的集合)或组成生物体的器官或身体的一部分或区域的一组组织。所述组织可包括均质的细胞材料，或者其可以是复合结构，诸如包括胸腔在内的在身体区域中发现的复合结构，所述胸腔例如可包括肺组织、骨骼组织和/或肌肉组织。示例性组织包括但不限于源自肝、肺、甲状腺、皮肤、胰腺、血管、膀胱、肾、脑、胆道、十二指肠、腹主动脉、髂静脉、心脏和肠的那些组织，包括其任意组合。
如本文中所用，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”受试者的疾病是指(1)防止症状或疾病在易患疾病或尚未表现出疾病的症状的受试者发生；(2)抑制疾病或阻止其发展；或者(3)改善疾病或疾病的症状或者导致疾病或疾病的症状消退。如本领域所理解的，“治疗”是用于获得有益或期望的结果，包括临床结果的方法。对本技术而言，有益的或期望的结果可包括但不限于以下的一种或多种：一个或多个症状的减轻或改善、疾患(包括疾病)范围的减小、稳定的(即，不恶化)疾患(包括疾病)状态、疾患(包括疾病)进展的延迟或减慢、疾患(包括疾病)状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。一方面，术语“治疗”不包括预防。
为了治疗显性遗传疾病，常规的基于CRISPR的基因疗法侧重于突变特异性基因修复方法。相比之下，本发明的方法采用了更普遍的策略，所述策略使得能够实现等位基因特异性靶向。例如，本方法可利用单核苷酸多态性(SNP)杂合性来创建适用于多重突变的系统。在一个实施方案中，BEST1转录起始位点(TSS)中的SNP可用于使CRISPR gRNA能够区分突变型等位基因与野生型等位基因。本公开涉及将这些突变(例如，SNP)映射到病理突变，并设计gRNA来指导Cas核酸酶仅切割突变型等位基因。所述方法以等位基因特异性的方式去除突变型基因，使得野生型等位基因保持完整以支持正常功能。在一个实施方案中，Cas核酸酶不切割或靶向编码常染色体显性疾病相关基因的野生型等位基因。这种方法将允许靶向并编辑常染色体显性眼病相关基因(例如，BEST1)的所有突变，而不仅仅是一个突变。本方法可用于治疗其它黄斑变性和显性遗传性疾患。
本公开提供了用于修饰细胞中常染色体显性疾病相关基因(例如，常染色体显性眼病相关基因)的方法。所述方法可包括使细胞与至少一种类型的载体接触，所述载体编码针对常染色体显性疾病相关基因(例如，常染色体显性眼病相关基因)的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统。所述至少一种类型的载体可包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和(iii)编码Cas核酸酶的第三序列。
本公开提供了用于修饰细胞中常染色体显性疾病相关基因(例如，常染色体显性眼病相关基因)的方法。所述方法可包括使细胞与至少一种类型的载体接触，所述载体编码针对常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统。所述至少一种类型的载体可包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；和(ii)编码催化缺陷型Cas核酸酶(dCas)的第二序列。
所述细胞可来自患有显性疾病诸如常染色体显性眼部疾病的受试者。所述细胞可源自具有显性疾病状况诸如常染色体显性眼部疾病的受试者的细胞。
所述细胞可以是诱导的多潜能干细胞(iPSC)，例如，源自受试者的成纤维细胞。在另一个实施方案中，细胞可以是成纤维细胞。
所述方法还可包括培养iPSC以分化成视网膜色素上皮(RPE)细胞。所述方法还可包括向受试者施用RPE细胞。在一个实施方案中，所述RPE细胞通过视网膜下移植施用。
RPE细胞对于受试者可以是自体的或同种异体的。
对于SNP，细胞可以是杂合的或纯合的。
所述细胞对于具有突变型等位基因和野生型等位基因的常染色体显性疾病相关基因可以是杂合的。所述细胞对于具有两个突变型等位基因的常染色体显性疾病相关基因可以是纯合的。
本公开提供了用于修饰细胞中常染色体显性疾病相关基因的方法，所述方法包括：使细胞与至少一种类型的载体接触，所述载体编码针对常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统，其中所述常染色体显性疾病相关基因与眼部疾病关，其中所述至少一种类型的载体包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因杂交；(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和(iii)编码Cas核酸酶的第三序列，其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。在一些实施方案中，第一引导RNA包含选自SEQID NO:40、SEQ.ID NO.41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的核苷酸序列或其各自的等同物。一方面，常染色体显性疾病相关基因包含选自SEQ ID NOS：28-33的序列，或其各自的等同物。一方面，第一引导RNA与常染色体显性疾病相关基因杂交，所述基因包含SEQ ID NO:31的序列，或其各自的等同物。
在另一个实施方案中，本公开提供了用于修饰细胞中常染色体显性疾病相关基因的方法，所述方法包括：将细胞与至少一种类型的载体接触，所述载体编码针对常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统，其中所述常染色体显性疾病相关基因与眼部疾病相关，其中所述至少一种类型的载体包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因杂交；和(ii)编码催化缺陷型Cas核酸酶(dCas)的第二序列；其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。在一些实施方案中，第二引导RNA包含选自SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQID NO:38或SEQ ID NO:39的核苷酸序列或其各自的等同物。一方面，常染色体显性疾病相关基因包含选自SEQ ID NOS:28-33的序列或其各自的等同物。一方面，第一引导RNA与包含SEQ ID NO:31的序列或其等同物的常染色体显性疾病相关基因杂交。
本公开提供了包含至少一种类型的载体的系统：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和(iii)编码Cas核酸酶的第三序列，其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。第一引导RNA可包含选自SEQ ID NO:40、SEQ.ID NO.41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的核苷酸序列或其各自的等同物。在一些实施方案中，所述Cas核酸酶是Cas切口酶。在另一个实施方案中，所述Cas核酸酶是Cas9。一方面，Cas系统用于修饰或编辑常染色体显性疾病相关基因，所述基因包含选自SEQ ID NOS:28-33的序列或其各自的等同物。一方面，第一引导RNA与常染色体显性疾病相关基因杂交，所述基因包含SEQ ID NO:31的序列或其等同物。
本公开还提供了包含至少一种类型的载体的系统：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因杂交；和(ii)编码催化缺陷型Cas核酸酶(dCas)的第二序列；其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。第二引导RNA可包含选自SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39的核苷酸序列或其各自的等同物。在一些实施方案中，dCas与阻遏物结构域融合。在另一个实施方案中，阻遏物结构域是Krüppel相关盒(KRAB)结构域。在一个实施方案中，第一引导RNA包含至少一个PUF(Pumilio mRNA结合因子)结合序列，并且在另外的实施方案中，至少一个PUF结合序列与PUF-KRAB结合。
本公开提供了用于治疗受试者的常染色体显性疾病(例如，常染色体显性眼部疾病)的方法。所述方法可包括向受试者施用治疗有效量的至少一种类型的载体，所述载体编码针对受试者中常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统。至少一种类型的载体可包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与常染色体显性疾病相关基因中单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和(iii)编码Cas核酸酶的第三序列。
本公开还涵盖用于治疗受试者的常染色体显性疾病(例如，常染色体显性眼部疾病)的方法。所述方法可包括向受试者施用治疗有效量的至少一种类型的载体，所述载体编码针对受试者中常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统。所述至少一种类型的载体可包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；和(ii)编码催化缺陷型Cas核酸酶(dCas)的第二序列。
受试者对于SNP可以是杂合的或纯合的。
受试者对于具有突变型等位基因和野生型等位基因的常染色体显性疾病相关基因可以是杂合的。受试者对于具有两个突变型等位基因的常染色体显性疾病相关基因可以是纯合的。
所述至少一种类型的载体可通过注射到受试者的眼中来施用。
SNP的变体和常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因可以在同一条染色体上。SNP的变体和常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因可以在不同的染色体上。
SNP可以在常染色体显性疾病相关基因的非编码区中、编码区中或基因间区域中。在一个实施方案中，SNP位于常染色体显性疾病相关基因的转录起始位点(TSS)区域中。
Cas蛋白或酶/核酸酶可以是野生型(wt)Cas(例如，野生型(wt)Cas9)、Cas切口酶(例如，Cas9切口酶)或dCas(例如，dCas9)。
在一个实施方案中，dCas与阻遏物结构域(诸如Krüppel相关盒(KRAB)结构域或本文所述的任何其它阻遏物结构域，包括其组合)融合。
在另一个实施方案中，第一引导RNA包含至少一个PUF(Pumilio mRNA结合因子)结合序列，所述结合序列可与例如PUF或PUF-KRAB融合蛋白结合。
常染色体显性疾病相关基因可以是BEST1、RHO、PRDM13、RGR、TEAD1、AIPL1、CRX、GUCA1A、GUCY2D、PITPNM3、PROM1、PRPH2、RIMS1、SEMA4A、UNC119、GNAT1、PDE6B、WSF1、IMPDH1、OTX2、C1QTNF5、CTNNA1、EFEMP1、ELOVL4、FSCN2、GUCA1B、HMCN1、IMPG1、RP1L1、TIMP3、VCAN、MFN2、NR2F1、OPA1、ARL3、CA4、HK1、KLHL7、NR2E3、NRL、PRPF3、PRPF4、PRPF6、PRPF8、PRPF31、RDH12、ROM1、RP1、RP9、RPE65、SNRNP200、SPP2、TOPORS、ABCC6、ATXN7、COL11A1、COL2A1、JAG1、KCNJ13、KIF11、OPA3、PAX2、TREX1、CAPN5、CRB1、FZD4、ITM2B、LRP5、MAPKAPK3、MIR204、OPN1SW、RB1、TSPAN12或ZNF408。
在某些实施方案中，常染色体显性疾病相关基因为BEST1。在某些实施方案中，SNP的变体是rs972353:G SNP、rs972355:G SNP或rs2668899SNP。
在某些实施方案中，第二引导RNA与BEST1的内含子1杂交。
疾病相关基因的突变可以是单碱基突变、错义突变(包括单错义突变)、缺失等。
疾病相关基因的突变可在一个或多个编码区中、一个或多个非编码区中、一个或多个基因间区域(基因之间的区域)中或一个或多个编码区和/或一个或多个非编码区和/或基因间区域的组合中。突变可在一个或多个内含子中、一个或多个外显子中或者在一个或多个内含子与一个或多个外显子的组合中。
一方面，载体是腺相关病毒载体。腺相关病毒(AAV)载体是被设计为将基因货物高效地递送至细胞的复制缺陷型病毒。它们是在其载体形式中只拥有原始病毒的反向末端重复序列(ITR)的无包膜病毒。结构和酶促AAV蛋白由额外的质粒“反式”提供，并被一起转染到细胞中以产生用于基因递送的工程化颗粒。由于其安全性和高效性，AAV已被广泛用于基因疗法，更具体地说，与CRISPR/Cas9系统一起用于基因疗法。AAV高效地感染各种细胞，在感染过程中，衣壳结合并进入细胞核，载体基因组被递送到所述细胞核中。
AAV结构颗粒由60个由VP1、VP2和VP3组成的蛋白质分子组成。每个颗粒包含有序地排列成二十面体结构的约5个VP1蛋白、5个VP2蛋白和50个VP3蛋白。已经表明，AAV2颗粒可支持肽和蛋白质在衣壳结构内的不同位点插入。将独特的肽引入衣壳的能力已导致具有改变的向性的AAV颗粒的开发，这使得病毒能够结合并感染通常可能难以感染的细胞和组织。另外，在AAV2载体的衣壳中已经引入了大肽甚至功能性蛋白，并取得了不同程度的成功。
AAV载体用于基因递送的限制之一是可被高效地包装成颗粒的基因插入物的尺寸限制。例如，野生型AAV2基因组的大小为单链DNA的4679个碱基。包装甚至Cas9的新的更小的变体之一(金黄色葡萄球菌Cas9，SaCas9，130kD MW)仅编码区就需要大约3255bp。向构建体中添加普遍存在的或组织特异性的启动子可再增加500-800bp。包括聚A添加序列和ITR序列的另外500bp，载体接近AAV颗粒的包装能力。为了实现功能性CRISPR/Cas9基因纠正，还必须包括具有靶序列的引导RNA(gRNA)。要表达这种RNA，还需要最小的polIII启动子和终止序列。这些元件加在一起太大，以至无法组合到被高效包装的AAV载体中。人们可选择将Cas9构建体和引导RNA表达盒包装到分开的载体中，但为了使它们发挥作用，两种病毒必须感染同一靶细胞。
本公开的其它方面涉及用于产生这种经修饰的AAV的重组表达系统。在一些实施方案中，重组表达系统包含多个质粒；所述多个质粒编码所有AAV病毒蛋白-VP1、VP2和VP3。在一些实施方案中，在不同的质粒中编码每种病毒蛋白。在一些实施方案中，在同一质粒中编码一种或多种病毒蛋白。在一些实施方案中，至少一种病毒蛋白被编码为与Cas9的融合蛋白。在一个实施方案中，AAV载体是AAV8载体。在另一个实施方案中，AAV载体是AAV2载体。
至少一种类型的载体可以是至少一种类型的重组腺相关病毒(AAV)载体。例如，至少一种类型的重组AAV载体是至少一种类型的AAV2载体，或至少一种类型的AAV8载体。重组AAV载体可使用病毒包装系统诸如逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒或杆状病毒包装系统进行包装，并且本公开提供了用于产生本公开方法中使用的载体的系统和元件。在一些实施方案中，通过使用辅助病毒或辅助质粒和细胞系来实现包装。辅助病毒或辅助质粒包含促进遗传物质进入细胞的元件和序列。另一方面，将辅助质粒或包含辅助质粒的多核苷酸稳定地整合到包装细胞系的基因组中，使得包装细胞系不需要利用辅助质粒的额外转染。
辅助质粒可包含例如至少一个源自无复制能力的病毒基因组的病毒辅助DNA序列，其反式编码包装无复制能力的AAV所需的所有病毒体蛋白质，并且用于以高滴度产生能够包装无复制能力的AAV的病毒体蛋白质，而不产生有复制能力的AAV。病毒DNA序列缺少编码病毒的病毒5’LTR的天然增强子和/或启动子的区域，并且缺少负责包装辅助基因组的psi功能序列以及3’LTR，但编码外源多聚腺苷酸化位点，例如SV40多聚腺苷酸化位点，以及在需要产生病毒的细胞类型中指导高效转录的外源增强子和/或启动子。所述病毒是白血病病毒，诸如莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)或长臂猿白血病病毒(GALV)。外源增强子和启动子可以是人巨细胞病毒(HCMV)立即早期(IE)增强子和启动子、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MMSV)的增强子和启动子(U3区)、劳斯肉瘤病毒(RSV)的U3区、脾病灶形成病毒(SFFV)的U3区或与天然莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)启动子连接的HCMV IE增强子。辅助质粒可由由基于质粒的表达载体编码的两个逆转录病毒辅助DNA序列组成，例如其中第一辅助序列包含编码单嗜性(ecotropic)MMLV或GALV的gag和pol蛋白的cDNA，第二辅助序列包含编码env蛋白的cDNA。决定宿主范围的Env基因可来源于编码异嗜性、双嗜性、单嗜性、多嗜性(貂病灶形成)或10A1鼠白血病病毒env蛋白、或长臂猿白血病病毒(GALV)env蛋白、人免疫缺陷病毒env(gp160)蛋白、水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白、人T细胞白血病(HTLV)I型和II型env基因产物的基因，源自上述env基因中的一种或多种的组合的嵌合包膜基因或编码上述env基因产物的细胞质和跨膜部分的嵌合包膜基因。
在包装过程中，辅助质粒和编码AAV病毒蛋白的质粒被瞬时共转染到能够产生病毒的第一哺乳动物细胞(诸如人胚胎肾细胞，例如293细胞(ATCC号CRL1573,ATCC,Rockville,Md.))群中，以产生含高滴度的重组逆转录病毒的上清液。在本发明的另一种方法中，然后将这种瞬时转染的第一细胞群与哺乳动物靶细胞例如人淋巴细胞共培养，以高效地用外源基因转导靶细胞。
在一个实施方案中，向受试者施用两种类型的重组AAV载体，其中第一类型的重组AAV载体包含第一序列和第二序列，并且其中第二类型的重组AAV载体包含编码Cas核酸酶的第三序列。
本系统可包含(或基本上由......组成)至少一种类型的载体，所述载体编码针对常染色体显性疾病相关基因(例如，常染色体显性眼部疾病相关基因)的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统。至少一种类型的载体可包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与常染色体显性疾病相关基因中单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和(iii)编码Cas核酸酶的第三序列。
本系统可包含(或基本上由......组成)至少一种类型的载体，所述载体编码针对常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统。至少一种类型的载体可包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；和(ii)编码催化缺陷型Cas核酸酶(dCas)的第二序列。
在一个实施方案中，本系统包含至少一个包含CRISPR系统多核苷酸序列的核酸序列，其中所述多核苷酸序列包含：(i)一个或多个与常染色体显性疾病相关基因序列杂交的引导RNA序列；(ii)编码经密码子修饰的常染色体显性疾病相关基因或片段的第二序列，其中所述经修饰的常染色体显性疾病相关基因或片段中的至少一个疾病相关突变已被纠正，并且所述经密码子修饰的常染色体显性疾病相关基因或片段不能被一个或多个与未修饰的常染色体显性疾病相关基因序列杂交的sg RNA序列识别；和(iii)编码Cas家族酶的序列。
本发明的方法和系统可治疗或预防受试者中的显性遗传疾患(诸如眼部疾病)，或者修饰患有显性遗传疾患(诸如眼部疾病)的受试者(或源自受试者的细胞)的细胞中的基因。眼部疾病包括但不限于：卵黄状黄斑营养不良(VMD)、Best卵黄状黄斑营养不良、常染色体显性脉络膜视网膜萎缩或变性、常染色体显性视锥或视锥-视杆营养不良、常染色体显性先天性静止性夜盲、常染色体显性利伯先天性黑蒙、常染色体显性黄斑变性、常染色体显性眼-视网膜发育疾病、常染色体显性视神经萎缩、常染色体显性视网膜色素变性、伴有视网膜病变的常染色体显性综合征/系统性疾病、索斯比黄斑营养不良、年龄相关性黄斑变性、多因蜂窝状黄斑病(doyne honeycomb macular disease)和青少年黄斑变性。对于熟练的技术人员来说显而易见的是，待递送用于纠正疾病或疾患的基因将随着待治疗的疾病而变化。
在一个实施方案中，眼部疾病是与年龄相关性黄斑变性。在另一个实施方案中，眼部疾病是青少年黄斑变性。
本系统(例如，核酸酶、编码这些核酸酶的多核苷酸、供体多核苷酸和包含本文所述蛋白质和/或多核苷酸的组合物)可以通过任何合适的方式递送。在某些实施方案中，体内递送所述系统。在其它实施方案中，将所述系统体外递送至分离/培养的细胞(例如，自体iPS细胞)，以提供可用于体内递送至患有常染色体显性疾病(例如，眼部常染色体显性疾病)的患者的经修饰的细胞。
作为注射编码本公开中描述的CRISPR组分(例如，一种或多种sgRNA、片段序列的经密码子修饰的供体模板基因和Cas家族核酸酶)的病毒颗粒的替代方案，细胞替代疗法可用于预防、纠正或治疗疾病，其中本公开的方法应用于分离的患者细胞(离体)，然后将“纠正后的”细胞注射回患者体内。
在一个实施方案中，本公开提供了将一种或多种编码CRISPR-Cas的载体引入真核细胞。所述细胞可以是干细胞。干细胞的实例包括多潜能、多能和单能干细胞多潜能干细胞的实例包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞和诱导的多潜能干细胞(iPSC)。一方面，iPSC源自成纤维细胞。
对于眼部疾病的治疗，可分离患者的iPS细胞，并将其离体分化为视网膜色素上皮(RPE)细胞。可使用本公开的方法，以导致常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的消融(例如，缺失)或沉默(例如，转录阻断)的方式来操作特征在于常染色体显性疾病相关基因中的突变的患者iPS细胞或RPE细胞。
因此，本公开提供了用于纠正受试者的常染色体显性眼病的方法，其中所述方法导致常染色体显性眼病相关基因的突变型等位基因的消融。所述方法可包括向受试者施用治疗有效量的自体或同种异体的具有常染色体显性眼病相关基因的消融突变型等位基因的视网膜色素RPE细胞。施用包含具有常染色体显性眼病相关基因的消融突变型等位基因的RPE细胞的药物制剂可有效降低症状的严重性和/或防止患者疾患的进一步恶化。这种施用可以有效地完全恢复任何视力下降或其它症状。
“诱导的多潜能干细胞”，通常缩写为iPS细胞或iPSC，是指通过引入某些称为重编程因子的因子，从非多潜能细胞(通常为成年体细胞)或终末分化的细胞(诸如成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等)人工制备的一种类型的多潜能干细胞。
本方法还可包括将iPS细胞分化为分化的细胞，例如眼细胞。
例如，可以从皮肤活检组织中收集患者成纤维细胞，并将其转化为iPS细胞。DimosJT等人.(2008)Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALScan be differentiated into motor neurons.Science 321:1218–1221；Nature ReviewsNeurology 4,582-583(2008年11月)。Luo等人，Generation of induced pluripotentstem cells from skin fibroblasts of a patient with olivopontocerebellaratrophy,Tohoku J.Exp.Med.2012,226(2):151-9。CRISPR介导的修饰可以在该阶段完成。可通过RFLP测定筛选和选择纠正后的细胞克隆。然后将纠正后的细胞克隆分化成RPE细胞，并测试其RPE特异性标志物(例如，Bestrophin1、RPE65、细胞视黄醛结合蛋白和MFRP)。可将高分化的RPE细胞自体移植回供体患者体内。
所述细胞对于向其施用该细胞的受试者可以是自体的或同种异体的。
术语“自体的”是指源自同一个体的任何材料，所述材料随后将被重新引入该同一个体。
术语“同种异体的”是指任何材料，所述材料源自与向其引入该材料的个体相同的物种的不同动物。同一物种的两个或更多个个体被认为彼此是同种异体的。
可将本公开中描述的用于向受试者施用的细胞疗法的纠正后的细胞(例如，RPE细胞)与药学上可接受的载体一起配制。例如，可将细胞单独施用或作为药物制剂的组分施用。可将细胞(例如，RPE细胞)与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水溶液或非水溶液(例如，平衡盐溶液(BSS))、分散体、悬浮液或乳液、或可在即将使用时重新复原成无菌注射溶液或分散体的无菌粉剂组合施用，所述无菌粉剂可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、溶质或悬浮剂或增稠剂。
本系统可被递送到受试者的视网膜中。本系统可通过注射诸如视网膜下或玻璃体内注射施用。
可通过眼内注射在药学上可接受的眼用制剂中递送纠正后的细胞(例如，RPE细胞)。注射浓度可以是任何有效且无毒的量。可以以至少104个细胞/mL的剂量配制用于治疗患者的本公开细胞的药物制剂。可以以至少为或约为103、104、105、106、107、108、109或1010个细胞/mL的剂量配制用于治疗患者的细胞制剂。
可根据本公开进行治疗的受试者包括可受益于本发明的所有动物。此类受试者包括哺乳动物，优选人(婴儿、儿童、青少年和/或成人)，但也可以是诸如狗和猫等的动物、诸如牛、猪、绵羊、马、山羊等的农场动物以及实验室动物(诸如，大鼠、小鼠、豚鼠等)。
术语“核酸酶”通常用于指水解核酸序列的任何酶。
术语“眼细胞”是指眼睛中的任何细胞或与眼睛功能相关的任何细胞。所述术语可指感光细胞(包括视杆细胞、视锥细胞和感光神经节细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞、穆勒细胞(Müeller cell)、双极细胞、水平细胞或无长突细胞)中的任一种或多种。在一个实施方案中，眼细胞是双极细胞。在另一个实施方案中，眼细胞是水平细胞。在第三实施方案中，眼细胞包括神经节细胞。
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。这些术语是指具有任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或者类似物)的聚合物形式。多核苷酸的实例包括但不限于基因或基因片段的编码或非编码区、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。可进一步修饰多核苷酸序列中的一个或多个核苷酸。核苷酸序列可被非核苷酸组分打断。还可在聚合后，诸如通过与标记剂缀合修饰多核苷酸。
单核苷酸多态性(SNP)
单核苷酸多态性，通常缩写为SNP，是发生在基因组中特定位置的单个核苷酸的取替，其中每种变异以某种可感知的程度存在于群体内(例如，>1％)。在一个实施方案中，在人基因组的特定碱基位置，A核苷酸可出现在大多数个体中，但在少数个体中，该位置被G占据。这意味着在该特定位置存在SNP，并且两种可能的核苷酸变体-A或G-被称为该位置的等位基因。术语SNP是指在比对和比较两个等位基因时，在同一相对位点处的一个碱基的差异；在本文中，该术语在某些上下文中也用于表示单个碱基变化。
单核苷酸变体(SNV)是无任何频率限制的单个核苷酸的变异，并且可出现在体细胞中。
SNP的变体可以是G变体、C变体、A变体或T变体。
一个或多个SNP可存在于一个或多个编码区、一个或多个非编码区、一个或多个基因间区域(基因之间的区域)，或一个或多个编码区和/或一个或多个非编码区和/或一个或多个基因间区域的组合中。一个或多个SNP可存在于一个或多个内含子、一个或多个外显子、一个或多个内含子和一个或多个外显子的组合中。编码区内的SNP可以改变或可以不改变所产生蛋白质的氨基酸序列。SNP可以是同义SNP或非同义SNP。同义SNP不影响蛋白质序列，而非同义SNP改变蛋白质的氨基酸序列。非同义SNP可以是错义SNP或无义SNP。不在蛋白质编码区中的SNP可影响基因剪接、转录因子结合、信使RNA降解和/或非编码RNA的序列。受这种类型的SNP影响的基因表达可在基因的上游或下游。
多态性变体的基因分型可使用本领域已知的任何合适的方法进行。可用于单核苷酸多态性(SNP)基因分型的技术包括DNA测序；毛细管电泳；连接检测反应(Day等人，Genomics29,152 62(1995))；质谱，诸如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)；单链构象多态性(SSCP)；单碱基延伸；电化学分析；变性HPLC和凝胶电泳；限制性片段长度多态性；杂交分析；单核苷酸引物延伸和DNA芯片或微阵列(参见Schafer等人，Nature Biotechnology，第16卷，第33-39页(1998)的综述)。使用DNA芯片或微阵列可使得能够在单个个体中的许多不同多态性基因座上同时进行基因分型，或者在多个个体中同时对单个多态性基因座进行基因分型。SNP也可以通过DNA测序来评分。
除上述方法以外，可使用基于PCR的技术，诸如使用等位基因特异性引物的PCR-SSP对SNP进行评分(Bunce等人，Tissue Antigens,1995；50:23-31)。该方法通常包括使用基因组DNA(作为模板)和两个不同的引物对进行DNA扩增反应，第一引物对包含在适当的条件下能够选择性地与野生型等位基因杂交的等位基因特异性引物和与所述基因内的其它地方的互补序列结合的非等位基因特异性引物，第二引物对包含在适当的条件下能够选择性地与变异等位基因杂交的等位基因特异性引物和所述相同的非等位基因特异性引物。对SNP进行评分的其它合适技术包括PCR ELISA和变性高效液相色谱(DHPLC)。
如果SNP导致限制性位点的消除或产生，则可通过使用跨越所述多态性位点的非等位基因特异性引物进行PCR并使用合适的限制性酶消化所得PCR产物(也称为PCR-RFLP)来进行基因分型。限制性片段长度多态性，包括由单核苷酸多态性产生的那些，可通过用合适的酶消化基因组DNA，然后使用对应于多态性区域的标记探针进行Southern印迹来评分(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Sambrook,Fritsch和Maniatis,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)。
任何给定的多态性变体的“基因分型”可包括筛选受试者基因组中正常或野生型等位基因和变异或突变型等位基因的存在或不存在，或者可包括筛选任一单个等位基因的存在或不存在，通常可以仅通过筛选特定等位基因中的一个等位基因或其它等位基因来得出关于具有两种备选等位基因形式的多态性基因座处的个体基因型的结论。
对多个基因内的多态性或多态性变体进行基因分型也在本公开的范围内。这样的一小组多个基因的筛选可用于同时分析同一受试者中的多个多态性。在一个实施方案中，单个受试者样品中多个多态性的基因分型可以例如使用微阵列或基因芯片来同时进行。
“多个”应理解为两个或更多、三个或更多、四个或更多、五个或更多、六个或更多等。
基因分型可在体外进行，并且可对含有从获自被测试的受试者的合适样品制备的基因组DNA的分离样品进行基因分型。例如，根据本领域公知的标准程序，从全血或组织的样品，或本文所述的任何合适的样品制备基因组DNA。如果被测试个体在含有SNP的区域中的基因组序列数据是可以例如在基因组序列数据库(作为先前基因组测序练习的结果)中获得的，那么SNP的基因分型可以通过搜索可获得的序列数据来完成。
在对从给定基因转录的mRNA转录物具有可检测效果的遗传变体(例如导致剪接改变或影响转录终止或影响水平或mRNA表达的变体)的情况下，那么作为在基因组DNA水平上检测变体存在的替代方法，可以通过使用任何合适的技术评估mRNA表达模式来推断变体的存在。类似地，在对基因编码的蛋白质产物具有可检测效果的遗传变体(例如导致编码的蛋白质的一级氨基酸序列、结构或性质改变的变体)的情况下，可通过使用任何方便的技术评估蛋白质的序列、结构或性质来推断变体的存在。
在一个实施方案中，常染色体显性疾病相关基因包含选自SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的序列或其各自的等同物。在另一个实施方案中，与常染色体显性疾病相关基因杂交的第一引导RNA包含SEQ ID NO:31的序列或其等同物。
Bestrophin-1(BEST1)
Bestrophin-1(Best1)为在人中由人BEST1基因编码的蛋白质(RPD ID-5T5N/4RDQ)。所述bestrophin蛋白家族包含编码完整膜蛋白的4个进化相关基因(BEST1、BEST2、BEST3和BEST4)。这个基因家族的特征在于具有高度保守的N末端和4至6个跨膜结构域的蛋白质。具体来说，染色体11q12.3上的BEST1基因在人中编码其表达在视网膜中最高的Bestrophin-1蛋白。Bestrophin可形成氯离子通道或可调节电压门控L型钙离子通道。通常认为Bestrophin在上皮细胞中形成钙激活的氯离子通道，但也已显示它们对视网膜组织中的碳酸氢根离子转运是高度可渗透的。除了成人发病性卵黄状黄斑营养不良(AVMD)和其它视网膜病以外，该基因的突变也是幼年发病性卵黄状黄斑营养不良(VMD2)(也称为Best黄斑营养不良)的原因。选择性剪接导致编码不同同种型的多种变体。在人中，BEST1突变与Best卵黄状黄斑营养不良(BVMD)相关。BEST1基因中的突变已被鉴定为至少五种不同视网膜变性疾病的主要原因。
人BEST1 mRNA的NCBI参考序列(RefSeq)登录号可包括NM_001139443、NM_001300786、NM_001300787、NM_004183和NM_001363591。人BEST1蛋白的NCBI参考序列(RefSeq)登录号可包括NP_001132915、NP_001287715、NP_001287716、NP_004174和NP_001350520。鼠BEST1 mRNA的NCBI参考序列(RefSeq)登录号可能包括NM_011913。鼠BEST1蛋白的NCBI参考序列(RefSeq)登录号可包括NP_036043。
BEST1的单核苷酸多态性(SNP)包括但不限于rs972353、rs972355、rs2668899、rs972354、rs1800007、rs1801393、rs1109748、rs199529046、rs1805140、rs17156602、rs2668897、rs2668898、rs2736597、rs195156、rs195157、rs195158、rs195160、rs195162、rs741886、rs760306、rs1801621和rs195165。
BEST1的突变体包括但不限于pR218H、pL234P和pA243T。
CRISPR/Cas和其它核酸酶
Cas蛋白或酶/核酸酶可以是野生型(wt)Cas(例如，野生型(wt)Cas9)、Cas切口酶(例如，Cas9切口酶)或dCas(例如，dCas9)。
在其核酸酶结构域上具有一个或多个突变的核酸酶缺陷型或核酸酶缺乏型Cas蛋白(例如，dCas9)，当与gRNA复合时仍保持DNA结合活性。dCas蛋白可以通过蛋白质融合将效应子结构域或蛋白质标签系连和定位至由gRNA匹配的位点，从而构成RNA引导的DNA结合酶。dCas可以与转录激活结构域(例如，VP64)或阻遏物结构域(例如，KRAB)融合，并在gRNA引导下分别激活或阻遏靶基因。dCas还可与荧光蛋白融合，实现染色体区域的活细胞荧光标记。
本领域技术人员应该理解，可以产生gRNA的靶向特定基因(任选地为与疾病、病症或疾患相关的基因)的靶向特异性。因此，与Cas9组合，引导RNA促进CRISPR/Cas9系统的靶特异性。如上所论述的，诸如启动子选择等其它方面可提供实现靶特异性的额外机制-例如，为编码多核苷酸的引导RNA选择在特定器官或组织中促进表达的启动子。因此，本文设想了针对特定疾病、病症或疾患的合适的gRNA的选择。在一个实施方案中，gRNA与包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因杂交。
可在整个治疗过程中连续或间歇地以一个剂量完成经修饰的AAV或组合物的施用。施用可通过任何合适的施用方式进行，包括但不限于：静脉内、动脉内、肌内、心内、鞘内、脑室下、硬膜外、大脑内、脑室内、视网膜下、玻璃体内、关节内、眼内、腹膜内、宫内、皮内、皮下、经皮肤、经粘膜和吸入。
确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将随着用于疗法的组合物、治疗目的和被治疗的受试者变化而变化。可进行单次或多次施用，剂量水平和模式由治疗医生选择。值得注意的是，剂量可受到施用途径的影响。合适的剂量制剂和施用剂的方法是本领域已知的。此类合适剂量的非限制性实例可以是每次施用低至1E+9个载体基因组至高至1E+17个载体基因组。
在另外的方面，可将本发明的病毒颗粒和组合物与其它治疗方法(例如那些适合特定疾病、病症或疾患的经批准的治疗方法)组合施用。非限制性实例包括用经修饰的病毒颗粒和一种或多种类固醇的组合来治疗肌营养不良。人们可通过监测由治疗医生确定的基因修饰的临床或亚临床证据来确定治疗是否成功。
可进行本发明的经修饰的病毒颗粒或组合物的这种施用以产生用于实验和筛选测定的所需疾病、病症或疾患的动物模型。
在一些实施方案中，修饰编码Cas(例如，Cas9)核酸酶的核苷酸序列以改变蛋白质的活性。在一些实施方案中，Cas(例如，Cas9)核酸酶是无催化活性的Cas(例如，Cas9)(或催化失活/缺陷型Cas9或dCas9)。在一个实施方案中，dCas(例如，dCas9)是由于野生型Cas(例如，Cas9)的一个或两个内切核酸酶催化位点(RuvC和HNH)的点突变而缺乏内切核酸酶活性的Cas蛋白(例如，Cas9)。例如，dCas9包含催化活性残基(D10和H840)的突变，并且不具有核酸酶活性。在一些情况下，dCas切割靶DNA的互补链和非互补链的能力降低。作为非限制性实例，在一些情况下，dCas9包含化脓性链球菌Cas9的氨基酸序列的D10A和H840A突变。在一些实施方案中，当dCas9具有降低的或有缺陷的催化活性时(例如，当Cas9蛋白具有D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986和/或A987突变，例如D10A、G12A、G17A、E762A、H840A、N854A、N863A、H982A、H983A、A984A和/或D986A时)，Cas蛋白仍能够以位点特异性方式与靶DNA结合，因为其仍被主题多核苷酸的DNA靶向序列(例如，gRNA)导向靶多核苷酸序列，只要其保留与主题多核苷酸的Cas结合序列(例如，gRNA)相互作用的能力。
Cas内切核酸酶活性的失活可产生催化失活的Cas(dCas，例如，dCas9)。dCas可以结合但不切割DNA，从而通过对转录因子的作用产生物理屏障来阻止目标基因的转录。CRISPR的这种再现在转录水平上以可逆的方式起作用。这种策略被称为CRISPR干扰或CRISPRi。在CRISPR干扰(CRISPRi)中，dCas融合蛋白(例如，与另一种蛋白或其部分融合的dCas)可用于本发明的基因阻遏方法。在一些实施方案中，dCas与(转录)阻遏物结构域或转录沉默子融合。转录阻遏结构域的非限制性实例包括Krüppel相关盒(KRAB)结构域、ERF阻遏物结构域(ERD)、mSin3A相互作用结构域(SID)结构域、SID的串联体(例如SID4X)或其同源物。转录沉默子的非限制性实例包括异染色质蛋白1(HP1)。可通过将Cas(例如，dCas)与Kruppel相关盒阻遏结构域(KRAB)融合来修饰CRISPRi，这增强了Cas的阻遏作用。Gilbert等人CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription ineukaryotes.Cell.2013；154(2):442–51。
第二代CRISPRi通过PUF-KRAB阻遏物进行强烈阻遏。已知PUF蛋白(以普米利奥果蝇(Drosophila Pumilio)和秀丽隐杆线虫fern-3结合因子命名)参与调节mRNA的稳定性和翻译。这些蛋白质包含称为PUF结构域的独特RNA结合结构域。RNA结合PUF结构域，诸如人Pumilio 1蛋白的RNA结合PUF结构域(此处也称为PUM)，包含8个以反平行方式结合连续碱基的重复序列(每个重复序列称为PUF基序或PUF重复序列)，其中每个重复序列识别单个碱基，即，PUF重复序列R1至R8分别识别核苷酸N8至N1。例如，PUM由八个串联重复序列组成，每个重复序列由折叠成由α螺旋组成的紧密堆积的结构域的34个氨基酸组成。PUF及其衍生物或功能性变体是可编程的RNA结合结构域，其可作为将任何效应子结构域带到主题多核苷酸上的特定PUF结合序列(例如，gRNA)的PUF结构域融合物的一部分用于本方法和系统。
如本文中所用，“PUF结构域”是指野生型或天然存在的PUF结构域，以及基于/源自天然或现有PUF结构域的PUF同源结构域，诸如原型人Pumilio 1PUF结构域。
PUF衔接子蛋白结合经PUF结合序列修饰的gRNA。gRNA可包含一个或多个PUF结合序列。例如，gRNA可通过例如在gRNA茎环的下游或靶标匹配区的上游插入多个拷贝的短PUF结合序列(例如，8聚体)来获得。在某些实施方案中，PUF结合序列的一个或多个拷贝中的每个拷贝都具有约8个核苷酸。gRNA可具有不止一个拷贝的PUF结合序列。在某些实施方案中，gRNA包含约1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、5-15个拷贝、约5-14个拷贝、约5-13个拷贝、约5-12个拷贝、约5-11个拷贝、约5-10个拷贝或约5-9个拷贝的PUF结合序列，诸如5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个拷贝的PUF结合序列。在某些实施方案中，PUF结合序列拷贝数的范围为L至H，其中L为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35或40中的任一个，并且其中H为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90或100中的任一个，只要H大于L即可。每个PUF结合序列可以相同或不同。PUF结合序列可以是美国专利公布号20180094257(其内容通过引用整体并入本文)中公开的那些PUF结合序列。gRNA可包含一个或多个串联序列，所述串联序列中的每个序列可被特定的PUF结构域特异性识别和结合。由于可基于PUF结构域的单个PUF基序与它们识别的单个RNA核苷酸之间的核苷酸特异性相互作用，将PUF结构域工程化以结合几乎任何PUF结合序列，PUF结合序列可以是结合它们的相应PUF结构域的任何设计的序列。在某些实施方案中，本发明的PUF结合序列具有8聚体。在其它实施方案中，PUF结合序列具有5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或更多个RNA核苷酸。PUF结合序列可结合人Pumilio 1PUF结构域(野生型或突变型)。
在某些实施方案中，PUF结构域包含来自不同蛋白质的不同PUF结构域的PUF基序。例如，PUF结构域可用来自人Pumilio 1蛋白的PUF基序和来自一种或多种其它PUF蛋白(诸如PuDp或FBF)的一种或多种其它PUF基序构建。在某些实施方案中，所述PUF结构域是Pumilio同源结构域(PU-HUD)。在特定的实施方案中，所述PU-HUD是人Pumilio 1结构域。在某些实施方案中，PUF结构域是具有Pum-HD结构域的任何PUF蛋白家族成员。PUF家族成员的非限制性实例包括秀丽隐杆线虫中的FBF、果蝇中的Ds pum以及诸如拟南芥和水稻等植物中的PUF蛋白。Tam等人，The Puf family of RNA-binding proteins in plants:phylogeny,structural modeling,activity and subcellular localization,BMC PlantBiol.10:44,2010，其内容通过引用并入本文。
本方法和系统可使用CRISPR缺失(CRISPRd)。CRISPRd利用了DNA修复策略默认为NHEJ的趋势，并且不需要供体模板来修复切割的链。相反，Cas首先在含有突变的基因中产生DSB，然后发生NHEJ，并引入破坏序列的插入和/或缺失(INDEL)，从而阻止基因表达或发生适当的蛋白质折叠。这种策略可以特别适用于显性疾患，在该情况下，敲除突变的显性等位基因并保持野生型等位基因完整可以足以将表型恢复到野生型。
在某些实施方案中，Cas酶可以是催化缺陷型Cas(全如我，Cas9)或dCas，或Cas切口酶或切口酶。
Cas酶(例如，Cas9)可以被修饰成起切口酶的作用，之所以这样命名，是因为其通过诱导单链断裂而非DSB来“切刻”DNA。如本文中所用，术语“Cas切口酶”或“切口酶”是指能够仅切割双链核酸分子(例如，双链DNA分子)的一条链的Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas切口酶可以是美国专利第10,167,457号(其内容通过引用整体并入本文)中公开的任何切口酶。在一个实施方案中，Cas(例如，Cas9)切口酶具有活性HNH核酸酶结构域，并且能够切割非靶DNA链，即由gRNA结合的链。在一个实施方案中，Cas(例如，Cas9)切口酶具有无活性的RuvC核酸酶结构域，并且不能切割DNA的靶链，即需要碱基编辑的链。在一些实施方案中，Cas切口酶切割双链核酸分子的靶链，这意味着Cas切口酶切割与结合到Cas的gRNA(例如，sgRNA)碱基配对(互补)的链。在一些实施方案中，Cas切口酶切割双链核酸分子的非靶、非碱基编辑的链，这意味着Cas切口酶切割不与结合到Cas的gRNA(例如，sgRNA)碱基配对的链。在一个实施方案中，Cas9切口酶是在RuvC内切核酸酶结构域中具有突变的Cas9 D10A切口酶。基于本公开和本领域的知识，其它合适的Cas9切口酶对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且在本公开的范围内。
例如，切口酶可以是在对应于化脓性链球菌Cas9的D10A的位置具有突变的Cas9切口酶；或者该切口酶可以是在对应于化脓性链球菌Cas9的H840A的位置具有突变的Cas9切口酶。在某些情况下，Cas切口酶可以切割靶DNA的互补链，但切割靶DNA的非互补链的能力降低。例如，Cas9切口酶可以具有降低RuvC结构域功能的突变(例如，氨基酸取代)。作为非限制性实例，Cas9切口酶是化脓性链球菌Cas9的氨基酸序列的D10A突变。在一些情况下，Cas9切口酶可切割靶DNA的非互补链，但切割靶DNA互补链的能力降低。例如，Cas9切口酶可具有降低HNH结构域(RuvC/HNH/RuvC结构域基序)的功能的突变(例，如氨基酸取代)。作为非限制性实例，Cas9切口酶是化脓性链球菌Cas9的H840A。美国专利公布号20180094257，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，紧密相连在一起的两个gRNA靶向位点可指导单独的Cas切口酶在每条DNA链上诱导断裂。通过需要两个不同的切割事件来诱导重组，该策略可以降低脱靶效应的可能性。
在CRISPR激活(CRISPRa)中，可将dCas与激活物结构域诸如VP64或VPR融合。此类dCas融合蛋白可与本文所述的构建体一起用于基因激活。在一些实施方案中，dCas与表观遗传调节结构域诸如组蛋白去甲基化酶结构域或组蛋白乙酰转移酶结构域融合。在一些实施方案中，dCas与LSD1或p300或其一部分融合。在一些实施方案中，dCas融合用于基于CRISPR的表观遗传调节。在一些实施方案中，dCas或Cas与Fok1核酸酶结构域融合。在一些实施方案中，与Fok1核酸酶结构域融合的Cas或dCas用于基因组编辑。在一些实施方案中，Cas或dCas与荧光蛋白(例如，GFP、RFP、mCherry等)融合。在一些实施方案中，与荧光蛋白融合的Cas/dCas蛋白用于基因组基因座的标记和/或可视化或者鉴定表达Cas内切核酸酶的细胞。
本公开提供了基因编辑方法，所述方法可消融致病突变型等位基因，所述突变等位基因又可用于患有常染色体显性疾病的患者的体内基因疗法。
本公开利用了CRISPR基因编辑系统在某些实施方案中，所述方法使用具有一个或多个独特引导RNA(gRNA，诸如单引导RNA或sgRNA)序列的基因编辑酶，所述序列特异性靶向携带用于破坏的常染色体显性突变的基因的一个或多个突变型等位基因，或同时靶向携带用于破坏的常染色体显性突变的基因的突变型和野生型等位基因。这种靶向可以随后提供或可以随后不提供野生型基因cDNA，所述野生型基因cDNA可以进行或可以不进行密码子修饰以逃避被一种或多种sgRNA识别。
在某些实施方案中，本公开提供了被称为“切碎粘贴”系统的基因编辑系统。“切碎”步骤包括i)待纠正基因的突变型拷贝和/或ii)患有常染色体显性疾病的患者中所述基因的野生型拷贝的部分或完全破坏。因此，“切碎”步骤导致所述基因的突变体和/或野生型活性的部分或完全丧失。“粘贴(Stick)”步骤包括引入目标基因或其片段的经密码子修饰的cDNA(特征在于常染色体显性突变)，其目的是恢复、纠正、补充或增强细胞中的基因或基因产物的功能。缺失基因的突变型和/或野生型形式，随后提供经密码子修饰并能抵抗引导RNA识别的野生型基因cDNA，导致突变的纠正，并从而恢复在常染色体显性疾病中发现的表型。
在一个实施方案中，“粘贴”步骤导致目标基因或片段的经密码子修饰的供体模板(以常染色体显性突变为特征)整合到内源性常染色体疾病相关基因中。这种靶向整合是通过同源重组完成的。一般来说，Cas家族核酸酶在基因组的确定位点产生DNA双链断裂，然后可通过同源重组或非同源末端连接修复所述DNA双链断裂。
或者，“粘贴”步骤不会导致目标基因或片段的经密码子修饰的供体模板(以常染色体显性突变为特征)整合到内源性常染色体疾病相关基因中。例如，染色体外或附加型(游离地)载体以染色体外状态存在于细胞核中，并提供转基因递送和表达而无需整合到宿主基因组中。在此类载体中有AAV载体，其在非分裂细胞的转导中特别高效，并且其中载体基因组主要以附加体形式存在。
本公开提供了方法，所述方法是对CRISPR/Cas9基因编辑系统的修饰，以治疗由视紫红质突变引起的常染色体显性视网膜色素变性(RP)。所述方法是使用具有一对独特的引导RNA序列的基因编辑酶，所述引导RNA序列靶向视紫红质的突变型和野生型形式以进行破坏，然后提供野生型视紫红质cDNA，所述cDNA经密码子修饰以逃避引导RNA的识别。这种密码子修饰的工程化人视紫红质序列可以由CMV启动子驱动并对基因编辑酶的作用具有抗性，将拯救患者的表型。一般来说，具有无效视紫红质的患者的表型比具有显性视紫红质突变的患者的表型更温和。
经密码子修饰的供体模板可通过附加型载体传递给细胞或患者。因为附加型载体在每个细胞中保持多个拷贝，所以目标基因的最终表达在RNA和蛋白质水平上都可以相对较高。在非分裂细胞中，AAV载体作为附加型复制元件的存在可以足以稳定表达基因、RNA和/或蛋白质。
在本发明方法和系统中可使用任何合适的核酸酶。核酸酶是水解核酸的酶。核酸酶可分类为内切核酸酶或外切核酸酶。内切核酸酶是催化DNA或RNA分子内部中的核酸之间的键水解的一组酶中的任一种。外切核酸酶是催化单个核苷酸从DNA或RNA链末端水解的一组酶中的任一种。核酸酶也可以根据它们是否特异性消化DNA或RNA来分类。特异性催化DNA水解的核酸酶可称为脱氧核糖核酸酶或DNA酶，而特异性催化RNA水解的核酸酶可称为核糖核酸酶或RNA酶。一些核酸酶对单链或双链核酸序列具有特异性。一些酶同时具有外切核酸酶和内切核酸酶的特性。此外，一些酶能够消化DNA和RNA序列。
内切核酸酶的非限制性实例包括锌指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚体、ZFN切口酶、转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)或RNA引导的DNA内切核酸酶(例如，CRISPR/Cas)。大范围核酸酶是特征在于其识别并切割大的DNA序列(12个碱基对或更大)的能力的内切核酸酶。任何合适的大范围核酸酶都可用于本发明的方法中，以在宿主基因组中产生双链断裂，包括LAGLIDADG和PI-Sce家族中的内切核酸酶。
可与本文所述的方法和组合物一起使用的序列特异性核酸酶系统的一个实例包括CRISPR系统(Wiedenheft,B.等人Nature 482,331-338(2012)；Jinek,M.等人Science337,816-821(2012)；Mali,P.等人Science 339,823-826(2013)；Cong,L.等人Science339,819-823(2013))。CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)系统利用了RNA引导的DNA结合和靶DNA的序列特异性切割。引导RNA/Cas组合赋予核酸酶位点特异性。单引导RNA(sgRNA)包含与基因组PAM(前间区序列邻近基序)位点(例如，NGG)上游的靶基因组DNA序列互补的约20个核苷酸和恒定的RNA支架区域。Cas(CRISPR相关的)蛋白与sgRNA和sgRNA所结合的靶DNA结合，并在PAM位点上游的确定位置引入双链断裂。Cas9含有两个与HNH和RuvC内切核酸酶同源的独立核酸酶结构域，通过突变这两个结构域中的任一个，Cas9蛋白可以转化为引入单链断裂的切口酶(Cong,L.等人Science 339,819-823(2013))。特别设想了，可将本公开的方法和组合物与Cas9的单链或双链诱导形式，以及与其它RNA引导的DNA核酸酶，诸如其它细菌Cas9样系统一起使用。本文所述的本发明方法和组合物的序列特异性核酸酶可以是工程化的、嵌合的或从生物体中分离的。可将核酸酶以DNA、mRNA和蛋白质的形式引入细胞。
在一个实施方案中，本公开的方法包括使用一种或多种sgRNA来“切碎”、去除或阻遏常染色体显性疾病相关基因。在另一个实施方案中，将一种或多种sgRNA用于“切碎”、去除或阻遏常染色体显性疾病相关基因。在又一个实施方案中，使用两种或更多种sgRNA来“切碎”、去除或阻遏常染色体显性疾病相关基因。
在一个实施方案中，DNA消化剂可以是位点特异性核酸酶。在另一个实施方案中，位点特异性核酸酶可以是Cas家族核酸酶。在更具体的实施方案中，Cas核酸酶可以是Cas9核酸酶。
在一个实施方案中，Cas蛋白可以是天然存在的Cas蛋白的功能衍生物。
除了良好表征的CRISPR-Cas系统以外，还可在本发明的方法和系统(Zetsche等人Cell.pii:S0092-8674(15)01200-3.doi:10.1016/j.cell.2015.09.038(2015))中使用称为Cpf1(PreFran亚型的Cas蛋白1)的新的CRISPR酶。Cpf1是单个RNA引导的内切核酸酶，其缺乏tracrRNA，并利用富含T的前间区序列邻近基序。作者证明Cpf1介导了其特征不同于Cas9的那些DNA干扰的强DNA干扰。因此，在本发明的一个实施方案中，CRISPR-Cpf1系统可用于切割靶基因内的期望区域。
在另外的实施方案中，核酸酶是转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)。TALEN含有与特定核苷酸序列结合的TAL效应子结构域和在靶位点催化双链断裂的内切核酸酶结构域(PCT专利公布号WO2011072246；；Miller等人，Nat.Biotechnol.29,143-148(2011)；Cermak等人，Nucleic Acid Res.39,e82(2011))。序列特异性内切核酸酶本质上可以是模块化的，并且DNA结合特异性是通过排列一个或多个模块获得的。Bibikova等人，Mol.Cell.Biol.21,289-297(2001)。Boch等人，Science 326,1509-1512(2009)。
ZFN可包含两个或更多个(例如，2-8个、3-6个、6-8个或更多)与效应子内切核酸酶结构域(例如，FokI内切核酸酶)融合的序列特异性DNA结合结构域(例如，锌指结构域)。Porteus等人，Nat.Biotechnol.23,967-973(2005)。Kim等人(2007)Hybrid restrictionenzymes:Zinc finger fusions to Fok I cleavage domain,Proceedings of theNational Academy of Sciences of USA,93:1156–1160.美国专利第6,824,978号。PCT公布号WO1995/09233和WO1994018313。
在一个实施方案中，核酸酶是选自由ω、锌指、TALE和CRISPR/Cas组成的组的位点特异性核酸酶。
此处描述的方法和组合物的序列特异性内切核酸酶可以是工程化的、嵌合的或从生物体中分离的。内切核酸酶可通过例如诱变来改造以识别特定的DNA序列。Seligman等人(2002)Mutations altering the cleavage specificity of a homing endonuclease,Nucleic Acids Research 30:3870–3879。组合组装是其中蛋白质亚单位形成可缔合或融合的不同酶的方法。Arnould等人(2006)Engineering of large numbers of highlyspecific homing endonucleases that induce recombination to novel DNA targets,Journal of Molecular Biology 355:443–458。在某些实施方案中，可将这两种方法(诱变和组合组装)组合以产生具有所需DNA识别序列的工程化内切核酸酶。
可将序列特异性核酸酶以蛋白质的形式或以编码序列特异性核酸酶的核酸的形式(诸如mRNA或cDNA)引入细胞。核酸可以作为更大的构建体(诸如质粒或病毒载体)的一部分递送，或者例如通过电穿孔、脂质囊泡、病毒转运体、显微注射和生物弹射(biolistics)直接递送。类似地，含有一种或多种转基因的构建体可通过任何适于将核酸引入细胞的方法来递送。
本发明方法中使用的一种或多种单引导RNA可被设计成使得它们指导Cas-sgRNA复合物与基因组中预定的切割位点的结合。在一个实施方案中，可以选择切割位点以释放含有常染色体显性疾病相关基因的区域的片段或序列。在另外的实施方案中，可选择切割位点以释放含有常染色体显性疾病相关基因的区域的片段或序列。
为了使Cas家族酶(诸如Cas9)成功地与DNA结合，基因组DNA中的靶序列可以与sgRNA序列互补，并且可在其后紧接正确的前间区序列邻近基序或“PAM”序列。“互补性”是指核酸通过常规沃尔森-克里克或其它非常规类型与另一个核酸序列形成一个或多个氢键的能力。互补性百分比表示核酸分子中可与第二个核酸序列形成氢键(例如，沃尔森-克里克碱基配对)的残基的百分比。不一定需要完全互补，只要有足够的互补来引起杂交和促进CRISPR复合物的形成即可。靶序列可包含任何多核苷酸，诸如DNA或RNA多核苷酸。Cas9蛋白可以容忍远离PAM的错配。PAM序列因Cas9所源自的细菌的种而异。最广泛使用的CRISPR系统来源自化脓性链球菌，PAM序列是紧接sgRNA识别序列的3’末端的NGG。来自示例性细菌的种的CRISPR系统的PAM序列包括：化脓性链球菌(NGG)、脑膜炎奈瑟球菌(NNNNGATT)、嗜热链球菌(NNAGAA)和齿垢密螺旋体(Treponema denticola)(NAAAAC)。
本公开中使用的一种或多种sgRNA的长度可约为5至100个核苷酸，或更长(例如，长度为5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59 60个、61个、62个、63个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91 92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个或100个核苷酸，或更长)。在一个实施方案中，一种或多种sgRNA的长度可在约15个与约30个核苷酸之间(例如，长度约为约15-29个、15-26个、15-25个；16-30个、16-29个、16-26个、16-25个；或约18-30个、18-29个、18-26个或18-25个核苷酸)。
为了促进sgRNA设计，已经开发了许多计算工具(参见Prykhozhij等人(PLoS ONE,10(3):(2015))；Zhu等人(PLoS ONE,9(9)(2014))；Xiao等人(Bioinformatics.2014年1月21日)；Heigwer等人(Nat Methods,11(2):122–123(2014))。由Zhu(Frontiers in Biology,10(4)第289-296页(2015))(其通过引用并入本文)论述了用于引导RNA设计的方法和工具。另外，还有可公开获得的可用于促进一种或多种sgRNA的设计的软件工具(http://www.genscript.com/gRNA-design-tool.html)。
经修饰的常染色体显性疾病相关基因或片段序列是供体序列，其已被密码子修饰为无法被用于靶向或识别突变的常染色体显性疾病相关基因的一种或多种sgRNA识别，并且对sgRNA靶向具有抗性。这种经修饰的常染色体显性疾病相关基因序列是编码常染色体显性疾病受试者中缺乏的或具有缺陷的蛋白质的至少一个功能片段的供体序列。
如前所述，可以以这样的方式修饰经密码子修饰的cDNA(供体模板)，使其不能被用于靶向一种或多种突变型和野生型疾病相关基因的一种或多种sgRNA识别。为了实现这一点，需要在供体模板基因或片段中引入突变，以使供体模板基因或片段不能被一种或多种sgRNA识别，从而抵抗已在细胞中引入的Cas酶(诸如Cas9核酸酶)的降解。可通过将一个或多个摆动碱基引入供体模板来修饰供体模板基因。在DNA中引入一个或多个摆动碱基导致沉默突变，使wt基因的表达产物保持完整，但如果核苷酸序列已发生了足够的变化，其将使供体模板序列无法被用于靶向一种或多种突变型和wt疾病相关基因的一种或多种sgRNA识别，最终对Cas核酸酶切割产生抗性。需要引入供体模板的摆动碱基的数量可以有所不同，但需要足以防止sgRNA杂交和CRISPR复合物的形成。
在一个实施方案中，供体模板序列可使用与用于递送Cas核酸酶的基因转移系统相同的基因转移系统递送(包含在相同载体上)，或者可以使用不同的递送系统递送。在另一个实施方案中，供体模板序列可使用与递送一种或多种sgRNA的转移系统相同的转移系统来递送。在具体实施方案中，使用病毒载体(例如，AAV)递送供体。
在一个实施方案中，本公开包括将经密码子修饰的常染色体显性疾病相关基因序列(供体模板序列)整合到内源性常染色体疾病相关基因中。
在另一个实施方案中，通过同源重组(HR)将供体序列或经修饰的常染色体显性疾病相关基因序列整合到内源基因中。
在另外的实施方案中，供体序列或经修饰的常染色体显性疾病相关基因序列的侧翼为上游和下游同源臂。同源臂位于供体序列或经修饰的常染色体显性疾病相关基因序列的侧翼，对应于常染色体显性疾病相关基因的靶基因座内的区域。例如，靶基因座内的相应区域在本文中被称为“靶位点”。因此，在一个实例中，携带供体或经修饰的常染色体显性疾病相关基因序列的载体可包含侧翼为第一和第二同源臂的供体或经修饰的常染色体显性疾病相关基因序列。
携带供体或经修饰的常染色体显性疾病相关基因序列的载体的同源臂可具有足以促进与相应靶位点的同源重组事件的任何长度，包括例如长度为50-100个碱基对、100-1000个碱基对或至少5-10个、5-15个、5-20个、5-25个、5-30个、5-35个、5-40个、5-45个、5-50个、5-55个、5-60个、5-65个、5-70个、5-75个、5-80个、5-85个、5-90个、5-95个、5-100个、100-200个或200-300个碱基对或更长。
在一个实施方案中，供体模板作为双链DNA递送。在此类情况下，同源臂的每个臂可包含15-4000个碱基对。在其它实施方案中，供体模板以单链DNA形式递送。在此类情况下，同源臂的每个臂可包含8-1000个碱基对。
当同源臂和靶位点这两个区域彼此共有足够水平的序列同一性以作为同源重组反应的底物时，同源臂与靶位点彼此“对应(correspond)”或“相应(corresponding)”。“同源性”意指与相应序列相同或共有相同序列的DNA序列。给定靶位点与在携带供体或经修饰的常染色体显性疾病相关基因序列的载体上发现的相应同源臂之间的序列同一性可以是允许同源重组发生的任何程度的序列同一性。例如，除经密码子修饰的区域外，携带供体或经修饰的常染色体显性疾病相关基因序列(或其片段)的载体的同源臂与靶位点(或其片段)共有的序列同一性的量应该是100％序列同一性，使得所述序列经历同源重组。只要Cas酶(Cas 9)仅切割患者DNA，而不切割供体模板或由供体模板修复/替换的患者DNA，则可以容许小于100％的序列同一性。
或者，不将目标基因或片段的供体模板(无论是否经过密码子修饰)整合到内源疾病相关基因中。可将供体模板包装到染色体外载体或附加型载体(诸如AAV载体)中，其以染色体外状态保持在细胞核中，并提供供体模板递送和表达而不整合到宿主基因组中。Wade-Martins R(Methods Mol Biol.2011；738:1-17)已经详细论述了染色体外基因载体技术的使用。
本公开的方法和系统提供了用于修饰细胞中的常染色体显性疾病相关基因的方法，所述方法包括：将细胞与至少一种类型的编码针对常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统的载体接触，其中所述常染色体显性疾病相关基因与眼病相关，其中所述至少一种类型的载体包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因杂交；(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和，(iii)编码Cas核酸酶的第三序列，其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。所述方法还提供了用于修饰细胞中的常染色体显性疾病相关基因的方法，所述方法包括：将细胞与至少一种类型的编码针对常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统的载体接触，其中所述常染色体显性疾病相关基因与眼病相关，其中所述至少一种类型的载体包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因杂交；和，(ii)编码催化缺陷型Cas核酸酶的第二序列(dCas)；其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。这些方法和系统在本文中称为CRISPR 3.0。
本公开的方法和系统还提供了用于治疗受试者的常染色体显性眼病的方法，所述方法包括：向受试者施用治疗有效量的至少一种类型的编码针对受试者中的常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统的载体，其中所述至少一种类型的载体包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因杂交；(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和，(iii)编码Cas核酸酶的第三序列，其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。本公开的方法和系统还提供了治疗受试者的常染色体显性眼病的方法，所述方法包括：向受试者施用治疗有效量的至少一种类型的编码针对受试者中的常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统的载体，其中所述至少一种类型的载体包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因杂交；和，(ii)编码催化缺陷型Cas核酸酶(dCas)的第二序列，其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。这些方法和系统被称为CRISPR 3.0。
待治疗的疾患和疾病相关基因
本发明的方法和系统可用于预防、纠正或治疗由于常染色体显性突变的存在而引起的眼病。眼病的非限制性实例包括卵黄状黄斑营养不良(VMD)，诸如Best卵黄状黄斑营养不良(BVMD)或青少年发病的卵黄状黄斑营养不良以及成人发病的卵黄状黄斑营养不良(AVMD)；常染色体隐性Best病；常染色体显性遗传玻璃体视网膜脉络膜病变和视网膜色素变性(RP)。眼病的非限制性实例包括视网膜病、视网膜营养不良和视网膜变性疾病。
本系统和方法可用作基因编辑工具，以用于纠正在任何常染色体显性疾病中发现的一个或多个突变。因此，本公开的方法可用于治疗任何常染色体显性疾病，包括但不限于肢胸综合征(Acropectoral syndrome)、急性间歇性卟啉症、皮纹病(Adermatoglyphia)、奥尔布赖特遗传性骨营养不良、荒川综合征II(Arakawa's syndrome II)、芳香酶过量综合征、常染色体显性小脑共济失调(Autosomal dominant cerebellar ataxia)、常染色体显性视网膜色素变性、阿克森费尔德综合征(Axenfeld syndrome)、Bethlem肌病、Birt–Hogg–Dubé综合征、回旋镖发育不良(Boomerang dysplasia)、Branchio-oto肾综合征、Buschke–Ollendorff综合征、卡-恩二氏病(Camurati–Engelmann disease)、中央轴空肌病(Centralcore disease)、胶原性疾病、II型和XI型胶原病、先天性远端脊髓性肌萎缩、先天性间质角膜营养不良、Costello综合征、Currarino综合征、毛囊角化病(Darier's disease)、DeVivo病(De Vivo disease)、齿状核红核苍白球丘脑底核萎缩症(Dentatorubral-pallidoluysian atrophy)、网状色素性皮病(Dermatopathia pigmentosa reticularis)、DiGeorge综合征、多因蜂窝病、异常纤维蛋白原血症(Dysfibrinogenemia)、家族性淀粉样多神经病、家族性心房颤动、家族性高胆固醇血症、家族性男性限性性早熟(Familialmale-limited precocious puberty)、Feingold综合征、费尔蒂综合征、Flynn–Aird综合征、Gardner氏综合征、Gillespie综合征、灰白血小板综合征、Greig头多趾综合征(Greigcephalopolysyndactyly syndrome)、Hajdu–Cheney综合征、霍金斯尿症(Hawkinsinuria)、Hay–Wells综合征、遗传性椭圆形红细胞增多症、遗传性出血性毛细血管扩张症、遗传性粘膜上皮异常增生(Hereditary mucoepithelial dysplasia)、遗传性球形红细胞增多症、(Holt–Oram综合征、亨廷顿病、肥厚型心肌病、α低脂蛋白血症(Hypoalphalipoproteinemia)、软骨发育不良、Jackson–Weiss综合征、冬季角化性红斑(Keratolytic winter erythema)、Kniest发育不良、科斯特曼综合征、Langer–Giedion综合征、Larsen综合征、Liddle综合征、马凡综合征、Marshall综合征、髓质囊性肾病、混合性软骨瘤病、Miller–Dieker综合征、MOMO综合征、念珠形发(Monilethrix)、多发性内分泌腺肿瘤、多发性内分泌腺肿瘤1型、多发性内分泌腺肿瘤2型、多发性内分泌腺肿瘤2b型、骨髓粒细胞缺乏症(Myelokathexis)、肌强直性营养不良、内格里-弗朗切斯切特-贾达索恩综合征、指甲膝盖综合征(Nail–patella syndrome)、努南综合征(Noonan syndrome)、眼咽肌营养不良、先天性厚甲症、帕利斯特霍尔综合征、PAPA综合征、乳头状肾综合征(Papillorenalsyndrome)、类扭伤型侏儒(Parastremmatic dwarfism)、佩-休二氏异常(Pelger–Huetanomaly)、Peutz–Jeghers综合征、多指(趾)畸形(Polydactyly)、翼状胬肉综合征(Popliteal pterygium syndrome)、迟发性皮肤卟啉症、假性软骨发育不全、RAS通路病(RASopathy)、雷-布二氏角膜营养不良(Reis–Bucklers corneal dystrophy)、Romano–Ward综合征、Rosselli–Gulienetti综合征、Roussy–Lévy综合征、鲁宾斯坦-泰比综合征(Rubinstein–Taybi syndrome)、西斯瑞-科增综合征(Saethre–Chotzen syndrome)、Schmitt Gillenwater Kelly综合征、短QT综合征、辛-梅二氏综合征(Singleton Mertensyndrome)、以下肢为主的脊肌萎缩症(Spinal muscular atrophy with lower extremitypredominance)、脊髓小脑性共济失调、脊髓小脑性共济失调6型、先天性脊椎骨骺发育不良、脊柱外周发育不良(Spondyloperipheral dysplasia)、史蒂克勒氏综合征(Sticklersyndrome)、(Tietz syndrome)、(Timothy syndrome)、(Treacher Collins syndrome)、结节性硬化症、乌平顿病(Upington disease)、多样性卟啉病(Variegate porphyria)、卵黄状黄斑营养不良、希林二氏病(Von Hippel–Lindau disease)、血管性血友病因子(VonWillebrand disease)、Wallis–Zieff–Goldblatt综合征、WHIM综合征、白色海绵状痣、沃思综合征、裂口病(Zaspopathy)、齐默尔曼-拉班德综合征和Zori–Stalker–Williams综合征。例如，在本公开提供的实施例中，本发明人提供了对人肾细胞和iPS细胞进行“切碎”的数据。这些发现证实了本公开的方法用于预防、纠正或治疗常染色体显性肾病诸如肾血管平滑肌脂瘤、髓质囊性肾病或常染色体显性多囊肾病的潜力。
此类眼病的实例还包括但不限于常染色体显性脉络膜视网膜萎缩或变性、常染色体显性视锥或视锥杆营养不良、常染色体显性先天性静止性夜盲症、常染色体显性利伯先天性黑蒙症、常染色体显性黄斑变性、常染色体显性眼-视网膜发育疾病、常染色体显性视神经萎缩、常染色体显性视网膜色素变性、伴有视网膜病变的常染色体显性综合征/系统性疾病、索斯比黄斑营养不良、年龄相关性黄斑变性、多因蜂窝状黄斑病和青少年黄斑变性。
一般来说，在视网膜色素变性的情况下，具有无效视紫红质突变的患者与具有严重显性视紫红质突变的患者相比具有更温和的表型。即使正常视紫红质基因与突变基因一起被破坏，野生型外显子或cDNA的提供(即，粘贴)仍有望改善受者的视网膜功能。
本公开的方法可用于阻止受试者中与视网膜色素变性(RP)相关的视力下降的进展或改善视力下降。
视力下降可包括周边视觉、中央(阅读)视觉、夜视、昼视的降低、色觉丧失、对比敏感度丧失或视力降低。本公开的方法也可用于预防或阻止受试者的感光功能丧失，或增加受试者的感光功能。
RP的部分诊断是通过对视网膜的检查。眼科检查通常会发现使视网膜出现条纹的异常的深色色素沉积。诊断RP的其它测试包括视网膜电图(ERG)和视野测试。
用于测量或评估受试者的视觉功能、视网膜功能(诸如对光刺激的反应性)或视网膜结构的方法是本领域技术人员公知的。参见例如Kanski's Clinical Ophthalmology: A Systematic Approach，第8版，Elsevier Health Sciences,2015。用于测量或评估视网膜对光的反应的方法可包括检测视网膜对光刺激的电响应。这种反应可以通过测量视网膜电图(ERG；例如，全视野ERG、多焦点ERG或ERG光压测试)、视觉诱发电位或视动性眼球震颤来检测(参见，例如，Wester等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.48:4542-4548,2007)。此外，可通过直接检测视网膜反应(例如通过在视网膜表面使用微电极)来测量视网膜对光的反应。ERG已由Vincent等人Retina,2013；33(1):5-12广泛描述。因此，本公开的方法可用于改善患有眼病的受试者的视觉功能、视网膜功能(诸如对光刺激的反应性)、视网膜结构或与眼病相关的任何其它临床症状或表型变化。
在一个实施方案中，本公开的方法可用于预防常染色体显性疾病的发展和进展。例如，患者可以是常染色体显性突变的携带者，但疾病的表型表达尚未显现，尽管基因组缺陷已通过筛查确定。本公开的方法可应用于这样的患者，以防止疾病发作。
除了用于预防、纠正或治疗常染色体显性疾病以外，本公开的方法还可用于预防、纠正或治疗任何常染色体隐性疾病。因此，此处描述的适用于常染色体显性疾病和常染色体显性基因或片段的所有方法都可被采用于治疗常染色体隐性疾病。
在另外的实施方案中，本公开的方法可用于预防、纠正或治疗由于常染色体隐性突变的存在而引起的眼病。此类疾病的实例包括但不限于常染色体隐性先天性静止性夜盲症、常染色体隐性单独或综合型耳聋(autosomal recessive deafness alone orsyndromic)、常染色体隐性利伯先天性黑蒙症、常染色体隐性视神经萎缩、常染色体隐性视网膜色素变性、伴有视网膜病变的常染色体隐性综合征/系统性疾病、常染色体隐性usher综合征、其它常染色体隐性视网膜病、常染色体隐性视锥或视锥-视杆营养不良、常染色体隐性黄斑变性和常染色体隐性遗传的bardet-biedl综合征。
各种基因的突变已被鉴定会导致常染色体显性疾病(此类基因也被称为常染色体显性疾病相关基因)。本公开的方法可用于完全或部分纠正此类常染色体显性疾病相关基因中的突变，导致野生型的部分或完全恢复。
在所有使用登录号的情况下，登录号是指可用于本公开的方法的基因的一个实施方案。在一个实施方案中，所述登录号是NCBI(国家生物技术信息中心)参考序列(RefSeq)编号。
例如，视网膜色素变性中的常染色体显性疾病相关基因可包括但不限于ARL3(NC_000010.11(102673727..102714433，互补序列))、BEST1(例如，NG_009033.1)、CA4(NG_012050.1)、CRX(NG_008605.1)、FSCN2(NG_015964.1)、GUCA1B(NG_016216.1)、HK1(NG_012077.1)、IMPDH1(NG_009194.1)、KLHL7(NG_016983.1)、NR2E3(NG_009113.2)、NRL(NG_011697.1)、PRPF3(NG_008245.1)、PRPF4(NG_034225.1)、PRPF6(NG_029719.1)、PRPF8(NG_009118.1)、PRPF31(NG_009759.1)、PRPH2(NG_009176.1)、RDH12(NG_008321.1)、RHO(NG_009115.1)、ROM1(NG_009845.1)、RP1(NG_009840.1)、RP9(NG_012968.1)、RPE65(NG_008472.1)、SEMA4A(NG_027683.1)、SNRNP200(NG_016973.1)、SPP2(NG_008668.1)和TOPORS(NG_017050.1)。导致常染色体显性视网膜色素变性的基因和突变由Daiger等人(Cold Spring Harb Perspect Med.2014年10月10日；5(10))详细论述。
另一种类型的常染色体显性疾病相关基因是常染色体显性脉络膜视网膜萎缩或变性相关基因，可包括：PRDM13(NC_000006.12(99606774..99615578))、RGR(NG_009106.1)和TEAD1(NG_021302.1)。
常染色体显性疾病相关基因的另一个实例是常染色体显性视锥或视锥-视杆营养不良相关基因，其可包括：AIPL1(NG_008474.1)、CRX(NG_008605.1)、GUCA1A(NG_009938.1)、GUCY2D(NG_009092.1)、PITPNM3(NG_016020.1)、PROM1(NG_011696.1)、PRPH2(NG_009176.1)、RIMS1(NG_016209.1)、SEMA4A(NG_027683.1)和UNC119(NG_012302.1)。
在一个实施方案中，常染色体显性疾病相关基因是常染色体显性先天性静止性夜盲症相关基因，包括：GNAT1(NG_009831.1)、PDE6B(NG_009839.1)和RHO(NG_009115.1)。
在另一个实施方案中，常染色体显性疾病相关基因是常染色体显性耳聋(单独或综合征型)相关基因，诸如WSF1(NC_000004.12(6269850..6303265))。
另一种类型的常染色体显性疾病相关基因是常染色体显性利伯先天性黑蒙症相关基因，其可包括：CRX(NG_008605.1)、(NG_009194.1)和OTX2(NG_008204.1)。
常染色体显性疾病相关基因的另一个实例是常染色体显性黄斑变性相关基因，其可包括：BEST1(NG_009033.1)、C1QTNF5(NG_012235.1)、CTNNA1(NC_000005.10(138753396..138935034))、EFEMP1(NG_009098.1)、ELOVL4(NG_009108.1)、FSCN2(NG_015964.1)、GUCA1B(NG_016216.1)、HMCN1(NG_011841.1)、IMPG1(NG_041812.1)、OTX2(NG_008204.1)、PRDM13(NC_000006.12(99606774..99615578))、PROM1(NG_011696.1)、PRPH2(NG_009176.1)、RP1L1(NG_028035.1)和TIMP3(NG_009117.1)。
在一个实施方案中，常染色体显性疾病相关基因是常染色体显性眼视网膜发育疾病相关基因，诸如VCAN(NG_012682.1)。以用于本公开方法的每个基因的具体实例的形式提供了登录号。
在另一个实施方案中，常染色体显性疾病相关基因是常染色体显性视神经萎缩相关基因，包括：MFN2(NG_007945.1)、NR2F1(NG_034119.1)和OPA1(NG_011605.1)。
在一个实施方案中，常染色体显性疾病相关基因是具有视网膜病相关基因的常染色体显性综合征/系统性疾病，包括：ABCC6(NG_007558.2)、ATXN7(NG_008227.1)、COL11A1(NG_008033.1)、COL2A1(NG_008072.1)、JAG1(NG_007496.1)、KCNJ13(NG_016742.1)、KIF11(NG_032580.1)、MFN2(NG_007945.1)、OPA3(NG_013332.1)、PAX2(NG_008680.2)、TREX1(NG_009820.1)和VCAN(NG_012682.1)。
常染色体显性疾病相关基因的另一个实例是常染色体显性视网膜病相关基因，包括：BEST1(NG_009033.1)、CAPN5(NG_033002.1)、CRB1(NG_008483.2)、FZD4(NG_011752.1)、ITM2B(NG_013069.1)、LRP5(NG_015835.1)、MAPKAPK3(NC_000003.12(50611862..50649297))、MIR204(NR_029621.1)、OPN1SW(NG_009094.1)、RB1(NG_009009.1)、TSPAN12(NG_023203.1)和ZNF408(NC_000011.10(46700767..46705916)。
根据此处描述的方法，常染色体隐性疾病相关基因被纠正，并且可以部分或完全恢复野生型基因的功能。
常染色体隐性疾病相关基因的一种类型是先天性静止性夜盲症相关基因，包括：CABP4(NG_021211.1)、GNAT1(NG_009831.1)、GNB3(NG_009100.1)、GPR179(NG_032655.2)、GRK1(NC_000013.11(113667279..113671659))、GRM6(NG_008105.1)、LRIT3(NG_033249.1)、RDH5(NG_008606.1)、SAG(NG_009116.1)、SLC24A1(NG_031968.2)和TRPM1(NG_016453.2)。
另一种常染色体隐性疾病相关基因是bardet-biedl综合征相关基因，包括：ADIPOR1(NC_000001.1(202940825..202958572，互补序列))、ARL6(NG_008119.2)、BBIP1(NG_041778.1)、BBS1(NG_009093.1)、BBS2(NG_009312.1)、BBS4(NG_009416.2)、BBS5(NG_011567.1)、BBS7(NG_009111.1)、BBS9(NG_009306.1)、BBS10(NG_016357.1)、BBS12(NG_021203.1)、C8orf37(NG_032804.1)、CEP290(NG_008417.1)、IFT172(NG_034068.1)、IFT27(NG_034205.1)、INPP5E(NG_016126.1)、KCNJ13(NG_016742.1)、LZTFL1(NG_033917.1)、MKKS(NG_009109.1)、MKS1(NG_013032.1)、NPHP1(NG_008287.1)、SDCCAG8(NG_027811.1)、TRIM32(NG_011619.1)和TTC8(NG_008126.1)。
常染色体隐性疾病相关基因的一个实例是视锥或视锥-视杆营养不良相关基因，包括但不限于ABCA4(NG_009073.1)、ADAM9(NG_016335.1)、ATF6(NG_029773.1)、C21orf2(NG_032952.1)、C8orf37(NG_032804.1)、CACNA2D4(NG_012663.1)、CDHR1(NG_028034.1)、CERKL(NG_021178.1)、CNGA3(NG_009097.1)、CNGB3(NG_016980.1)、CNNM4(NG_016608.1)、GNAT2(NG_009099.1)、KCNV2(NG_012181.1)、PDE6C(NG_016752.1)、PDE6H(NG_016859.1)、POC1B(NG_041783.1)、RAB28(NG_033891.1)、RAX2(NG_011565.1)、RDH5(NG_008606.1)、RPGRIP1(NG_008933.1)和TTLL5(NG_016974.1)。
常染色体隐性疾病相关基因的另一个实例是耳聋(单独或综合征型)相关基因，包括：CDH23(NG_008835.1)、CIB2(NG_033006.1)、DFNB31(NG_016700.1)、MYO7A(NG_009086.1)、PCDH15(NG_009191.2)、PDZD7(NG_028030.1)和USH1C(NG_011883.1)。
在一个实施方案中，常染色体隐性疾病相关基因是利伯先天性黑蒙症相关基因，包括：AIPL1(NG_008474.1)、CABP4(NG_021211.1)、CEP290(NG_008417.1)、CLUAP1(NC_000016.10(3500945..3539048))、CRB1(NG_008483.2)、CRX(NG_008605.1)、DTHD1(NG_032962.1)、GDF6(NG_008981.1)、GUCY2D(NG_009092.1)、IFT140(NG_032783.1)、IQCB1(NG_015887.1)、KCNJ13(NG_016742.1)、LCA5(NG_016011.1)、LRAT(NG_009110.1)、NMNAT1(NG_032954.1)、PRPH2(NG_009176.1)、RD3(NG_013042.1)、RDH12(NG_008321.1)、RPE65(NG_008472.1)、RPGRIP1(NG_008933.1)、SPATA7(NG_021183.1)和TULP1(NG_009077.1)。
在另一个实施方案中，常染色体隐性疾病相关基因是视神经萎缩相关基因，包括：RTN4IP1(NC_000006.12(106571028..106630500，互补序列))、SLC25A46(NC_000005.10(110738136..110765161))和TMEM126A(NG_017157.1)。
常染色体隐性疾病相关基因的一个实例是视网膜色素变性相关基因，包括：ABCA4(NG_009073.1)、AGBL5(NC_000002.12(27051423..27070622))、ARL6(NG_008119.2)、ARL2BP(NG_033905.1)、BBS1(NG_009093.1)、BBS2(NG_009312.1)、BEST1(NG_009033.1)、C2orf71(NG_021427.1)、C8orf37(NG_032804.1)、CERKL(NG_021178.1)、CLRN1(NG_009168.1)、CNGA1(NG_009193.1)、CNGB1(NG_016351.1)、CRB1(NG_008483.2)、CYP4V2(NG_007965.1)、DHDDS(NG_029786.1)、DHX38(NG_034207.1)、EMC1(NG_032948.1)、EYS(NG_023443.2)、FAM161A(NG_028125.1)、GPR125(NC_000004.12(22387374..22516058，互补序列))、HGSNAT(NG_009552.1)、IDH3B(NG_012149.1)、IFT140(NG_032783.1)、IFT172(NG_034068.1)、IMPG2(NG_028284.1)、KIAA1549(NG_032965.1)、KIZ(NG_033122.1)、LRAT(NG_009110.1)、MAK(NG_030040.1)、MERTK(NG_011607.1)、MVK(NG_007702.1)、NEK2(NG_029112.1)、NEUROD1(NG_011820.1)、NR2E3(NG_009113.2)、NRL(NG_011697.1)、PDE6A(NG_009102.1)、PDE6B(NG_009839.1)、PDE6G(NG_009834.1)、POMGNT1(NG_009205.2)、PRCD(NG_016702.1)、PROM1(NG_011696.1)、RBP3(NG_029718.1)、RGR(NG_009106.1)、RHO(NG_009115.1)、RLBP1(NG_008116.1)、RP1(NG_009840.1)、RP1L1(NG_028035.1)、RPE65(NG_008472.1)、SAG(NG_009116.1)、SLC7A14(NG_034121.1)、SPATA7(NG_021183.1)、TTC8(NG_008126.1)、TULP1(NG_009077.1)、USH2A(NG_009497.1)、ZNF408(NC_000011.10(46700767..46705916))和ZNF513(NG_028219.1)。
常染色体隐性疾病相关基因的另一个实例是具有视网膜病相关基因的综合征/系统性疾病，包括：ABCC6(NG_007558.2)、ABHD12(NG_028119.1)、ACBD5(NG_032960.2)、ADAMTS18(NG_031879.1)、ADIPOR1(NC_000001.11(202940825..202958572，互补序列))、AHI1(NG_008643.1)、ALMS1(NG_011690.1)、CC2D2A(NG_013035.1)、CEP164(NG_033032.1)、CEP290(NG_008417.1)、CLN3(NG_008654.2)、COL9A1(NG_011654.1)、CSPP1(NG_034100.1)、ELOVL4(NG_009108.1)、EXOSC2(NC_000009.12(130693760..130704894))、FLVCR1(NG_028131.1)、FLVCR1(NG_028131.1)、GNPTG(NG_016985.1)、HARS(NG_032158.1)、HGSNAT(NG_009552.1)、HMX1(NG_013062.2)、IFT140(NG_032783.1)、INPP5E(NG_016126.1)、INVS(NG_008316.1)、IQCB1(NG_015887.1)、LAMA1(NG_034251.1)、LRP5(NG_015835.1)、MKS1(NG_013032.1)、MTTP(NG_011469.1)、NPHP1(NG_008287.1)、NPHP3(NG_008130.1)、NPHP4(NG_011724.2)、OPA3(NG_013332.1)、PANK2(NG_008131.3)、PCYT1A(NG_042817.1)、PEX1(NG_008341.1)、PEX2(NG_008371.1)、PEX7(NG_008462.1)、PHYH(NG_012862.1)、PLK4(NG_041821.1)、PNPLA6(NG_013374.1)、POC1B(NG_041783.1)、PRPS1(NG_008407.1)、RDH11(NG_042282.1)、RPGRIP1L(NG_008991.2)、SDCCAG8(NG_027811.1)、SLC25A46(NC_000005.10(110738136..110765161))、TMEM237(NG_032049.1)、TRNT1(NG_041800.1)、TTPA(NG_016123.1)、TUB(NG_029912.1)、TUBGCP4(NG_042168.1)、TUBGCP6(NG_032160.1)、WDPCP(NG_028144.1)、WDR19(NG_031813.1)、WFS1(NG_011700.1)和ZNF423(NG_032972.2)
常染色体隐性疾病相关基因的一种类型是usher综合征相关基因，包括：ABHD12(NG_028119.1)、CDH23(NG_008835.1)、CEP250(NC_000020.11(35455139..35517531))、CIB2(NG_033006.1)、CLRN1(NG_009168.1)、DFNB31(NG_016700.1)、GPR98(NG_007083.1)、HARS(NG_032158.1)、MYO7A(NG_009086.1)、PCDH15(NG_009191.2)、USH1C(NG_011883.1)、USH1G(NG_007882.1)和USH2A(NG_009497.1)。
常染色体隐性疾病相关基因的另一种类型是视网膜病相关基因，包括：BEST1(NG_009033.1)、C12orf65(NG_027517.1)、CDH3(NG_009096.1)、CNGA3NG_009097.1)、CNGB3(NG_016980.1)、CNNM4(NG_016608.1)、CYP4V2(NG_007965.1)、LRP5(NG_015835.1)、MFRP(NG_012235.1)、MVK(NG_007702.1)、NBAS(NG_032964.1)、NR2E3(NG_009113.2)、OAT(NG_008861.1)、PLA2G5(NG_032045.1)、PROM1(NG_011696.1)、RBP4(NG_009104.1)、RGS9(NG_013021.1)、RGS9BP(NG_016751.1)和RLBP1(NG_008116.1)。
另一种类型的常染色体隐性疾病相关基因是黄斑变性相关基因，包括：ABCA4(NG_009073.1)、CFH(NG_007259.1)、DRAM2(NC_000001.11(111117332..111140216，互补序列))、IMPG1(NG_041812.1)和MFSD8(NG_008657.1)。
除了用于预防、纠正或治疗常染色体显性和隐性疾病以外，本公开的方法可用于预防、纠正或治疗任何X连锁疾病。因此，此处描述的适用于常染色体显性疾病和常染色体显性基因或片段的所有方法都可被采用于治疗X连锁疾病。
此外，本公开的方法可用于预防、纠正或治疗由于X-连锁突变的存在而引起的眼病。此类疾病的实例包括：X连锁视锥或视锥-视杆营养不良、X连锁先天性静止性夜盲症、X连锁黄斑变性、X连锁视网膜色素变性、伴有视网膜病变的X连锁综合征/系统性疾病、X连锁视神经萎缩和X连锁视网膜病变。根据此处描述的方法，X连锁疾病相关基因被纠正，并且可以部分或完全恢复野生型基因的功能。
X连锁疾病相关基因的一个实例是视锥或视锥-视杆营养不良相关基因，包括：CACNA1F(NG_009095.2)和RPGR(NG_009553.1)。
X连锁疾病相关基因的另一个实例是先天性静止性夜盲症相关基因，包括：CACNA1F(NG_009095.2)和NYX(NG_009112.1)。
在一个实施方案中，X连锁疾病相关基因是黄斑变性相关基因，诸如RPGR(NG_009553.1)。
在另一个实施方案中，X连锁疾病相关基因是视神经萎缩相关基因，诸如TIMM8A(NG_011734.1)。
X连锁疾病相关基因的一种类型是视网膜色素变性相关基因，包括：OFD1(NG_008872.1)、RP2(NG_009107.1)和RPGR(NG_009553.1)。
另一种类型的X连锁疾病相关基因是伴有视网膜病的综合征/系统性疾病相关基因，包括：OFD1(NG_008872.1)和TIMM8A(NG_011734.1)。
X连锁疾病相关基因的另一个实例是视网膜病相关基因，包括CACNA1F(NG_009095.2)、CHM(NG_009874.2)、DMD(NG_012232.1)、NDP(NG_009832.1)、OPN1LW(NG_009105.2)、OPN1MW(NG_011606.1)、PGK1(NG_008862.1)和RS1(NG_008659.3)。
疾病相关基因可以是HTRA1。
在另一个实施方案中，本公开的方法可用于预防、纠正或治疗由于线粒体DNA中突变的存在而引起的疾病。此类疾病可包括由线粒体DNA中的基因突变引起的视网膜病。可以以导致视网膜病发展的线粒体DNA中的突变为特征的基因的实例包括：MT-ATP6(NC_012920.1(8527..9207))、MT-TH(NC_012920.1(12138..12206))、MT-TL1(NC_012920.1(3230..3304))、MT-TP(NC_012920.1(15956..16023，互补序列)和MT-TS2(NC_012920.1(12207..12265))。
表1提供了可使用本公开的方法治疗和/或纠正的疾病和疾病相关基因(伴随相应的登记号)的示例性列表。
表1：疾病相关病症和基因
Figure BDA0002783999670000351
Figure BDA0002783999670000361
Figure BDA0002783999670000371
Figure BDA0002783999670000381
Figure BDA0002783999670000391
Figure BDA0002783999670000401
本公开的方法也可用于预防、纠正或治疗由于肿瘤抑制基因中的突变的存在而引起的癌症。肿瘤抑制基因的实例包括：视网膜母细胞瘤易感基因(RB)基因、p53基因、结肠癌(DCC)基因中缺失的、腺瘤性结肠息肉病(APC)基因、p16、BRCA1、BRCA2、MSH2和神经纤维瘤病1型(NF-1)肿瘤抑制基因(Lee等人Cold Spring Harb Perspect Biol.2010Oct；2(10))。
肿瘤抑制基因是在其野生型等位基因中表达抑制异常细胞增殖的蛋白质的基因。当编码肿瘤抑制蛋白的基因被突变或缺失时，产生的突变蛋白或肿瘤抑制蛋白表达的完全缺乏可能不能正确调节细胞增殖，并且可发生异常细胞增殖，特别是如果已经存在对细胞调节机制的损伤。许多充分研究的人肿瘤和肿瘤细胞系已被证明具有缺失或无功能的肿瘤抑制基因。因此，肿瘤抑制基因的功能丧失或失活可在大量人癌症的发生和/或发展中起重要作用。
本公开的方法可用于治疗处于疾病不同阶段(例如早期、中期或晚期)的患者。本发明的方法可用于对患者进行一次或多次治疗。因此，治疗的长度可以变化，并且可包括多次治疗。
如本公开中所论述的，本公开的方法可用于矫正或治疗受试者的常染色体显性眼病。
例如，“切碎”步骤包括在患有常染色体显性眼病患者中缺失待纠正的常染色体显性眼病相关基因的突变拷贝和同一基因的内源性野生型拷贝两者或之一。因此，“切碎”步骤导致基因的突变型和野生型活性两者或之一全部或部分丧失。然后使用“粘贴”步骤纠正常染色体显性眼病相关基因，所述步骤包括引入编码经修饰的常染色体显性眼病相关基因或片段的序列。可以以这样的方式经修饰的常染色体显性眼病相关基因序列，以使其不被sgRNA识别(不可识别的)，所述sgRNA靶向基因的野生型或突变型形式(基因的非密码子修饰形式)。这种修饰使得药密码子修饰的供体模板对Cas家族核酸酶具有抗性。
载体
可使用一种或多种重组腺相关病毒(AAV)载体(例如，1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或更多种AAV载体)将本系统递送至受试者或细胞。可将一种或多种gRNA(例如，sgRNA)包装到单个(一个)重组AAV载体中。重组AAV载体还可包括经密码子修饰的常染色体显性眼病相关基因序列(供体模板)。可将Cas家族核酸酶包装到同一或者可选地分开的重组AAV载体中。
此处描述的方法还提供了纠正受试者的常染色体显性眼病的方法，包括通过注射向所述受试者施用治疗有效量的编码本系统的重组AAV病毒。
由于AAV的承载能力可能会带来挑战，因此可以同时使用两个或更多个AAV载体。例如，可将Cas家族核酸酶包装到不同的AAV载体中。此外，可将编码一种或多种sgRNA(经密码子修饰的常染色体显性疾病相关基因或片段)的序列和Cas家族核酸酶各自包装到单独的AAV载体中。
在RP治疗的情况下，本公开的方法可以包括：通过注射向受试者施用治疗有效量的(1)编码包含CRISPR系统多核苷酸序列的核酸序列的重组AAV病毒，其中所述多核苷酸序列包含:(i)与突变型和野生型RHO序列杂交的两个引导RNA序列；(ii)编码经密码子修饰的RHO基因或片段的第二序列，其中内源RHO基因的一个或多个突变已被纠正，并且经修饰的RHO基因或片段不能被一种或多种与突变型和野生型RHO基因序列杂交的sgRNA序列识别；和(2)编码Cas家族酶的第二重组AAV病毒。
通常，在眼细胞中共表达Cas家族酶和常染色体显性疾病相关基因特异性gRNA可导致常染色体显性疾病相关基因的截短，从而阻止致病突变型等位基因(和/或野生型(wt)等位基因)的表达。
可以向或可以不向眼细胞中提供常染色体显性疾病相关基因的经密码子修饰的cDNA。可以以或可以不以对CRISPR/Cas系统产生抗性的方式修饰常染色体显性疾病相关基因的编码序列。这种策略导致常染色体显性疾病相关基因的表达，这可在缺失一个或多个内源基因或片段缺失后恢复或纠正常染色体显性疾病相关基因或片段的功能。
可以以这样的方式修饰经密码子修饰的cDNA(供体模板)，使得其不能被用于靶向一种或多种突变型和wt疾病相关等位基因/基因的gRNA识别。因此，需要将突变引入供体-模板基因或片段，以避免该供体-模板基因或片段被一种或多种gRNA识别，从而避免被引入细胞的Cas酶(例如Cas9核酸酶)降解。这可通过将摆动碱基引入供体模板中，从而确保DNA的变化导致沉默突变，使wt基因的表达产物保持完整来实现。如本公开中所用，术语“摆动碱基”是指参考核苷酸序列的一个或多个核苷酸碱基的变化，其中该变化不改变(相对于所述参考序列)由所述核苷酸编码的氨基酸序列。
需要引入供体模板中的摆动碱基的数量可以在约1-30个、约1-20个、约2-19个、约3-18个、约4-17个、约5-16个、约6-15个、约7-14个、约8-13个、约9-12个、约10-11个、约9个、约8个、约7个、约6个或5个的范围内。另外，鉴于大量软件应用可用于gRNA的计算机预测建模，所以可以进行计算机分析，以测试经密码子修饰的供体模板是否能被sgRNA识别。可公开获得的CRISPR sgRNA工具的实例可见于在2016年4月30日检索到的http://www.genscript.com/gRNA-design-tool.html:。
或者，如果该方法仅缺失、破坏或截短基因或片段的突变形式(例如，突变型等位基因)，并保持野生型形式(例如，野生型等位基因)完整，则补充到细胞或患者的供体模板或野生型基因序列可以不进行密码子修饰。在此类情况下，用作CRISPR组分的一部分的一种或多种gRNA将被设计成仅识别和靶向疾病相关基因的突变型形式(而不识别和靶向所述基因的野生型形式)。
本公开的方法已被应用于各种基因，包括PDE6A、EFEMP1、小鼠视紫红质(RHO)和人RHO基因。RP可由PDE6A基因中的常染色体隐性突变或RHO基因中的常染色体显性突变引起。EFEMP1的突变导致常染色体显性的莫拉蒂致拉分提那斯症(Malattia Leventinese)(ML)和多因蜂窝状视网膜营养不良(DHRD)。此外，所述方法已应用于各种细胞类型，包括但不限于小鼠视网膜细胞以及人iPS细胞。另外，也已使用眼病的小鼠模型在体内应用本文所述的方法。因此，本公开的方法可以应用于动物以及人受试者。
此外，本公开的方法已经应用于特定的基因人源化小鼠模型以及患者来源的细胞，从而允许确定设计的sgRNA的效率和功效以及人细胞中的位点特异性重组频率，然后可将其在临床环境中用作指南。
在一个实施方案中，“切碎粘贴”系统包括以下组分：两个重组AAV载体：第一重组AAV载体携带编码Cas9酶的多核苷酸以“切碎”突变型和/或天然视紫红质基因，第二重组AAV载体携带编经码密码子修饰的人视紫红质cDNA的核苷酸以将正常视紫红质“粘贴”回到患者体内。由CBh启动子驱动的经密码子修饰或基因工程改造的人视紫红质序列能抵抗基因编辑酶的破坏，拯救患者的表型。
在一个实施方案中，本方法从CBh启动子驱动的经密码子修饰的RHO cDNA中提供至少50％的视紫红质水平，这足以提高存活率。在另一个实施方案中，使用经密码子修饰的RHO供体序列表达的视紫红质没有过量。
对于使用人类和患者来源的细胞的研究，AAV2载体可用作所有构建体的骨架载体，因为已经表明AAV2可高效地转导人iPS(Mitsui K等人Biochem Biophys Res Commun.2009年10月30日；388(4):711-7；Deyle DR等人Mol Ther.2012年1月；20(1):204-13；和Deyle DR等人Nucleic Acids Res.2014年3月；42(5):3119-24)。然而，多种其它AAV载体也可用于实施本公开的方法。
通过本方法对常染色体显性疾病的改善程度可以不同。例如，本方法可恢复对照受试者中基因产物正常水平的约20％、约30％、约40％、大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％的常染色体显性疾病相关基因表达，所述正常水平可以是年龄和性别匹配的。
在某些实施方案中，在对受试者和/或细胞施用后约2周内可观察到野生型基因(例如，视紫红质)的表达。表达可在非分裂体细胞(例如，光感受器、神经元细胞、肌肉细胞等)中无限期保持。在一个实施方案中，在约3天内、约1周内、约3周内、约1个月内、约2个月内、约1周至约2周或不同时间范围内观察到野生型视紫红质的表达。
根据本公开的各种实施方案，多种已知的病毒构建体可用于将本系统(诸如Cas家族核酸酶、一种或多种sgRNA、经密码子修饰的野生型基因(也称为经密码子修饰的供体模板)、供体模板等)递送至靶细胞和/或受试者。此类重组病毒的非限制性实例包括重组腺相关病毒(AAV)、重组腺病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒、重组痘病毒和本领域的其它已知病毒，以及质粒、粘粒和噬菌体。基因递送病毒构建体的选项是公知的(参见，例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1989；Kay,M.A.等人，2001 Nat.Medic.7(1):33-40；以及Walther W.和Stein U.,2000 Drugs,60(2):249-71)。
另外，递送媒介物诸如基于纳米颗粒和基于脂质的mRNA或蛋白质递送系统可用作AAV载体的替代物。替代递送媒介物的另外的实例包括慢病毒载体、核糖核蛋白(RNP)复合物、基于脂质的递送系统、基因枪、流体动力学、电穿孔或核转染显微注射和生物弹射。各种基因传递方法由Nayerossadat等人(Adv Biomed Res.2012；1:27)和Ibraheem等人(Int J Pharm.2014年1月1日；459(1-2):70-83)进行详细论述。
本方法可利用腺相关病毒(AAV)介导的基因组工程。AAV病媒拥有广泛的宿主范围；在体外和体内转导分裂和非分裂细胞，并保持转导基因的高表达水平。病毒颗粒是热稳定的，耐溶剂、去垢剂、pH、温度的变化，并可在CsCl梯度上浓缩。AAV与任何致病事件无关，并且还没有发现利用AAV载体进行的转导会对细胞生长或分化产生任何持久的负面影响。与其它载体(诸如慢病毒载体)相比，AAV缺乏整合机制，已被批准用于临床使用(Wirth等人，Gene.2013 Aug 10；525(2):162-9)。
单链DNA AAV病毒载体在许多不同类型的细胞和组织中具有高转导率。进入宿主细胞后，AAV基因组被宿主细胞DNA聚合酶复合物转化为双链DNA，并作为附加体存在。在非分裂宿主细胞中，附加型AAV基因组可持续并维持治疗性转基因的长期表达。(JVirol.2008年8月；82(16):7875–7885)。
本公开的AAV载体和病毒颗粒可用于各种方法和用途。在一个实施方案中，方法包括将异源多核苷酸序列递送或转移到患者或患者的细胞中，并包括向患者或患者的细胞施用病毒AAV颗粒、多种AAV病毒颗粒或者AAV病毒颗粒或多种AAV病毒颗粒的药物组合物，从而将异源多核苷酸序列递送或转移到患者或患者的细胞中。
在另一个实施方案中，所述方法用于治疗缺乏或需要蛋白质表达或功能，或需要内源性蛋白质(例如，不希望的、异常的或具有功能障碍的蛋白质)的表达或功能降低的患者，所述方法包括提供重组AAV病毒颗粒、多种重组AAV病毒颗粒或者重组AAV病毒颗粒或多种AAV病毒颗粒的药物组合物；以及向患者施用重组AAV病毒颗粒、多种重组AAV病毒颗粒或者AAV病毒颗粒或多种AV病毒颗粒的药物组合物，其中所述异源多核苷酸序列在所述患者中表达，或者其中所述异源多核苷酸序列编码一种或多种减少和/或缺失患者中的内源DNA区段(例如，不希望的、异常的或具有功能障碍的DNA区段)的sgRNA，并且其中所述异源多核苷酸序列编码经密码子修饰的基因或其片段，所述基因或片段不能被用于减少和/或缺失内源DNA区段的一种或多种sgRNA识别。
新的AAV血清型的表征表明它们在不同组织中具有不同的转导模式。AAV病毒载体可选自任何AAV血清型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或其它已知和未知的AAV血清型。在某些实施方案中，使用AAV2和/或AAV8。
除非另有要求，否则术语“AAV”载体涵盖所有亚型、血清型和假型，以及天然存在的形式和重组形式。假型AAV是指含有一种血清型的衣壳蛋白和第二种血清型的病毒基因组的AAV。
为了使Cas9表达的强度和持续时间以及潜在的脱靶效应降至最低，还产生了自我切除的AAV-Cas9载体，其具有在Cas9产生后不久使Cas9表达自我失活的能力。这种方法包括在Cas9基因侧翼连接两个sgRNA-Y1靶位点(类似于Cre重组酶系统中的loxP位点)，以终止Cas9自身的表达(如图9所示)。预计Cas9酶的存在量(在其自身终止之前)仍然足以切割所需的基因座(例如Rho或PDE6A基因座)。自失活型重组AAV载体(见图9)的设计使得本发明人能够控制Cas9在靶细胞中表达的量和持续时间，并且可以防止由于Cas9蛋白的过度表达而导致的不希望的脱靶效应。
本公开的载体可包含本领域已知的许多启动子中的任一种，其中启动子是组成型的、可调型的或诱导型的、细胞类型特异性的、组织特异性的或物种特异性的。除了足以指导转录的序列以外，本发明的启动子序列还可包括参与调节转录的其它调控元件的序列(例如，增强子、kozak序列和内含子)。许多用于驱动基因组成型表达的启动子/调控序列在本领域中是可用的，包括但不限于，例如，CMV(巨细胞病毒启动子)、EF1a(人延伸因子1α启动子)、SV40(猿猴空泡病毒40启动子)、PGK(哺乳动物磷酸甘油酸激酶启动子)、Ubc(人遍在蛋白C启动子)、人β-肌动蛋白启动子、啮齿动物β-肌动蛋白启动子、CBh(鸡β-肌动蛋白启动子)、CAG(杂合启动子含有CMV增强子、鸡β-肌动蛋白启动子和兔β-珠蛋白剪接受体)、TRE(四环素应答元件启动子)、H1(人聚合酶III RNA启动子)、U6(人U6小核启动子)等。此外，通过将编码这种分子的核酸置于诱导型或组织特异性启动子/调控序列的控制下，可以实现RNA、跨膜蛋白或其它蛋白质的诱导型和组织特异性表达。可用于此目的的组织特异性或诱导型启动子/调控序列的实例包括，但不限于，视紫红质启动子、MMTV LTR诱导型启动子、SV40晚期增强子/启动子、突触蛋白1启动子、ET肝细胞启动子、GS谷氨酰胺合酶启动子和许多其它启动子。可在http://www.invivogen.com/prom-a-list上找到各种商购可得的遍在启动子以及组织特异性的启动子。另外，本领域公知的启动子可响应于诱导剂诸如金属、糖皮质激素、四环素、激素等而被诱导，也预期可用于本发明。因此，应当理解，本公开包括本领域已知的能够驱动与其可操作连接的所需蛋白质表达的任何启动子/调控序列的用途。
可将根据本公开的载体转化、转染或以其它方式引入到多种宿主细胞中。转染是指宿主细胞对载体的摄取，而不管实际上是否表达了任何编码序列。许多转染方法是普通技术人员已知的，例如，lipofectamine、磷酸钙共沉淀、电穿孔、DEAE-葡聚糖处理、显微注射、病毒感染和本领域已知的其它方法。转导是指病毒进入细胞并表达(例如，转录和/或翻译)由病毒载体基因组递送的序列。在重组载体的情况下，“转导”通常是指重组病毒载体进入细胞并表达由载体基因组递送的目标核酸。
治疗患者的常染色体显性眼病的方法可包括向患者施用有效浓度的组合物，所述组合物包含本文所述的任何重组AAV和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，病毒的有效浓度为1X106–11X1013GC/ml(基因组拷贝/ml)。对治疗有效的病毒浓度范围可根据包括但不限于特定突变、患者年龄和其它临床参数的因素而变化。
在对患者施用之前，可在体外产生一种或多种重组AAV载体。重组AAV载体的生产及其在体外和体内施用中的应用已由Gray等人(Curr.Protoc.Neurosci.2011年10月，Chapter:Unit 4.17)详细论述。
可将含有所需重组DNA的重组AAV配制成意欲用于视网膜下或玻璃体内注射的药物组合物。这种制剂包括使用药学上和/或生理学上可接受的媒介物或载体，特别是适用于向眼睛施用(例如通过视网膜下注射)的媒介物或载体，诸如缓冲盐水或其它缓冲剂，例如HEPES，以将pH值保持在适当的生理水平，以及任选的其它药剂、药剂、稳定剂、缓冲剂、载体、佐剂、稀释剂等。对于注射，载体通常是液体。示例性生理上可接受的载体包括无菌、无热原的水和无菌、无热原的磷酸盐缓冲盐水。
在一个实施方案中，载体是等渗氯化钠溶液。在另一个实施方案中，载体是平衡盐溶液。在一个实施方案中，载体包括tween。如果病毒要长期保存，可在甘油或Tween-20存在的情况下冷冻其。
在另一个实施方案中，药学上可接受的载体包括表面活性剂，诸如全氟辛烷(全氟液体)。在某些实施方案中，通过视网膜下注射向受试者施用上述药物组合物。在其它实施方案中，通过玻璃体内注射施用药物组合物。可用于本文所述方法的其它施用形式包括但不限于直接递送至所需器官(例如，眼睛)、口服、吸入、鼻内、气管内、静脉内、肌内、皮下、皮内和其它肠胃外施用途径。另外，如果需要，可以组合施用途径。
在某些实施方案中，施用途径是视网膜下注射或玻璃体内注射。
实施例
Surveyor测定
Surveyor突变检测测定提供了简单而稳健的方法来检测DNA混合物中的突变和多态性。该试剂盒的关键组分是Surveyor核酸酶，其为源自芹菜的错配特异性核酸酶的CEL家族的成员。Surveyor核酸酶识别并切割由于单核苷酸多态性(SNP)或小的插入或缺失而导致的错配。
Surveyor核酸酶在两条DNA链中任何错配位点(包括所有碱基取代和多达至少12个核苷酸的插入/缺失)的3’侧以高特异性进行切割。Surveyor核酸酶技术包括四个步骤：(i)PCR，从经历Cas9核酸酶介导的切割的细胞或组织样品中扩增靶DNA；(ii)杂交，以在受影响的与未受影响的DNA之间形成异源双链体(因为受影响的DNA序列不同于不受影响的DNA序列，因此在变性和复性后可形成由错配引起的凸起结构)；(iii)用Surveyor核酸酶处理退火的DNA以切割异源双链体(即，切割凸起)；以及(iv)使用选择的检测/分离平台，例如琼脂糖凝胶电泳，分析消化的DNA产物。Cas9核酸酶介导的切割效率可通过Surveyor核酸酶消化的DNA与未消化的DNA的比率来估计。所述技术非常灵敏，能够检测以低至32份拷贝中的1份存在的稀有突变体。Surveyor突变测定试剂盒可从Integrated DNA Technologies(IDT),Coraville,IA.商购获得。
RFLP分析
限制性片段长度多态性(RFLP)分析是本领域技术人员公知的技术。RFLP利用了同源DNA序列中的变异。用于检测RFLP的基本技术包括用限制性酶片段化DNA样品，所述酶可在称为限制性酶消化的过程中识别并切割其中存在特定短序列的DNA。然后用琼脂糖凝胶电泳按长度分离所得的DNA片段以进行分析。为了检测供体模板替换(也称为基因纠正)，通过密码子修饰将一种或多种类型的附加限制性酶位点引入供体模板，而不影响总长度。在使用PCR从组织样品中扩增靶DNA序列后，可通过上述一种或多种限制性酶评价PCR扩增子，以用于检测已经进行了基因纠正的样品。
实施本发明的特定方面的以下实施例仅是为了说明的目的而提供的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例1.切碎粘贴AAV基因疗法策略评价
本实施例概述了切碎粘贴AAV基因疗法背后的策略。切碎粘贴策略在本文中也被称为CRISPR 2.0。所述方法是基于使用基因编辑酶，所述酶具有一个或多个独特的单引导RNA(sgRNA)序列，所述序列靶向视紫红质的突变型和野生型形式以进行破坏。这个初始步骤之后是向细胞提供野生型密码子修饰的视紫红质cDNA。该系统的显著有利方面是密码子修饰的视紫红质cDNA不能被一种或多种sgRNA识别，并因此能抵抗核酸酶的切割。
如图1所示，此处描述的“切碎粘贴”系统被包装成两个重组AAV载体(图1A)。第一载体携带编码Cas9酶(SEQ ID NO:17)的多核苷酸序列，所述Cas9酶能够“切割”突变型和天然视紫红质基因，而第二载体包含编码经密码子修饰的人视紫红质的多核苷酸，以将正常视紫红质“粘贴”回患者体内。经密码子修饰的工程化人视紫红质序列，在本实施例中由CBh启动子(SEQ ID NO:10)驱动，抵抗基因编辑酶(在本例中为Cas9)的破坏，并允许拯救患者的表型。除了携带经密码子修饰的工程化人视紫红质序列以外，第二载体还携带两个单引导RNA(sgRNA1和sgRNA2)，这两个引导RNA用作向导来确定引入DNA双链断裂的靶位点，并从而用作指导Cas9核酸酶的归巢装置。每对重组AAV载体可用于靶向视紫红质基因。经密码子修饰的序列如图1B第II节所示。每个sgRNA靶向位点包含四个带下划线的错配。
AAV的包装容量为4.5～4.9Kb。由于spCas9的编码序列约为4.2Kb，并且AAV的两个末端反向重复序列(ITR)约为0.3Kb，因此用于启动子和多腺嘌呤终止信号的空间约为0.4Kb。本公开的发明人使用173bp的短CMV启动子和50bp的合成多腺嘌呤信号来构建CasAAV载体。列出了详细的序列，并且重组AAV载体的所有组分如下所示：下划线和粗体：ITR(SEQ ID NO:13)；加下划线的：CMV短启动子；粗体：Flag标签(SEQ ID NO:15)和SV40NLS(SEQ ID NO:16)；大写字母：spCas9 CDS(SEQ ID NO:17)；
Figure BDA0002783999670000451
合成聚A位点
Figure BDA0002783999670000461
Figure BDA0002783999670000471
Figure BDA0002783999670000481
Figure BDA0002783999670000491
在该实施例中，本发明人接下来在人胚胎肾细胞系(HEK293FT)中测试了上述CRISPR RHO策略。用未携带sgRNA(SEQ ID NO:22)、携带一个sgRNA1(SEQ ID NO:1)、携带一个sgRNA2(SEQ ID NO:2)或携带两者的Cas9载体(pX459)转染HEK293FT细胞。96小时后，提取DNA，并扩增RHO基因座，并通过错配检测SURVEYOR测定进行分析。将两种sgRNA一起应用导致基因缺失(约30-40％)，这表明“切碎”策略在哺乳动物细胞中高效地发挥作用(图2B，左，泳道4)。一次使用一种sgRNA(泳道2和泳道3)不会导致大小的改变。约30％的基因组DNA通过一种sgRNA进行非同源末端连接(NHEJ)，并当使用两个sgRNA时，多达80％被编辑(缺失和NHEJ)。每组中使用等量的质粒DNA(1μg/1x 105个293FT细胞)。这些发现表明，应用两种sgRNA可以更高效地破坏、去除或降解内源性人RHO序列。
本发明人还测试了“切碎”是否能降低wt RHO基因表达。在该实验中，将双顺反子构建体转染到HEK293细胞中以表达wt RHO cDNA(SEQ ID NO:8)和EGFP(图3A)。RHO cDNA和EGFP(SEQ ID NO:21)的表达均由CMV启动子(SEQ ID NO:20)独立地且同时驱动，因此EGFP表达可用作蛋白质印迹中的内部对照，其用于将转染效率和蛋白质负载的差异归一化。图3A还说明了在该RHO表达载体上的sgRNA1(SEQ ID NO:1)和sgRNA2(SEQ ID NO:2)的靶位点。当用RHO表达载体和另一种携带sgRNA1和sgRNA2的表达Cas9组分的载体(pX459)共转染HEK293FT细胞时，RHO蛋白表达水平低得多(图3B)。sg3组是非特异性对照sgRNA。这些结果用内部对照进一步归一化，如图3C所示。这些发现表明，与对照组(sg3)相比，将两种sgRNA一起应用会使RHO表达降低约70％，而使用单一sgRNA仅使表达降低0-30％。综上所述，这些结果表明“切碎”策略可以显著消除或灭活wt RHO蛋白的表达。
实施例2.视网膜色素变性小鼠模型中的CRISPR/Cas9诱导的基因编辑延缓疾病进展
接下来，本发明人验证了CRISPR/Cas9内切核酸酶系统作为基因编辑治疗模式在具有显性D190N视紫红质突变的RP小鼠模型中的可行性和功效。在这些实验中，使用了两种AAV8载体，它们含有Cas9编码序列和标记有AflII限制性位点的sgRNA(SEQ ID NO:4)/供体模板。AflII限制性位点的插入允许鉴定已经历同源重组的细胞(图4A-4C)。简言之，在出生后第5天之前，用上述重组AAV8载体将杂合RhoD190N/+转导至右眼中。通过TIDE插入缺失跟踪工具(Brinkman等人Nucleic Acid Res.2014年12月16日,42(22):e168)和AflII酶消化(图4)验证了供体模板(SEQ ID#23)的sgRNA靶向频率和重组。约50％的细胞经历了NHEJ(大部分为1bp插入)，并且约10％的细胞成功地整合了供体模板。通过H&E染色评估结构保存，并在3月龄时通过视网膜电图(ERG)评估视网膜功能拯救(图5A和图5B)。在RhoD190N/+3月龄小鼠中，经处理的眼睛比未接受AAV注射的眼睛显示出更高的光感受器存活率(图5A)。此外，与3月龄的对照眼相比，如通过ERG测量的视网膜功能在治疗眼也得以增强(图5B)。总的来说，这些结果表明，本公开中描述的CRISPR-Cas9基因编辑可用于体内纠正RP的表型。经密码子修饰的供体序列如下所示：下划线和粗体：同源臂；粗体：AflII位点；加下划线的：5个经密码子修饰的摆动核苷酸；
Figure BDA0002783999670000501
实施例3.小鼠Rho基因座处的CRISPR介导的人源化外显子1
本公开的发明人接下来测试了在小鼠胚胎干(ES)细胞中用野生型(wt)(SEQ IDNO:24)或突变型人(h)(SEQ ID NO:25)RHO外显子1替换小鼠Rho基因座的能力(图6)。简言之，用靶向小鼠Rho外显子1)的携带Rho外显子1特异性sgRNA(sgRNA-Rho外显子1，SEQ IDNO:5)的Cas9表达载体和携带人RHO供体模板的靶向载体共转染(通过电穿孔)ES细胞，所述靶向载体包含在每一侧上侧接有约750bp同源臂的hRHO外显子1的序列(图6A)。人RHO供体模板有望替换小鼠外显子1，并赋予对sgRNA-Rho外显子1的抗性。电穿孔后7天，挑选ES克隆，并提取DNA并用筛选引物进行扩增。通过RFLP分析检测到96个克隆中的两个替换了人外显子1(图6B)。如图6C所示，扩增子的序列电泳图谱显示一个靶向ES克隆的完全融合的人和小鼠序列(泳道2，图6B)。正确的靶向克隆还可用于产生人源化RHO外显子1小鼠模型。这种患者特异性人源化小鼠系统使得本发明人能够测试各种sgRNA，所述sgRNA可用于靶向人基因组序列以用于体内切碎粘贴策略。使用这些小鼠模型的有利方面还使得能够通过功能评价方法验证“切碎粘贴”的功效和安全性，所述功能评价方法为如视觉功能、活体动物中拯救组织的成像以进行长期观察。上面列出了sgRNA序列，并且下面列出了供体模板序列：下划线和粗体：同源臂；大写字母：人RHO外显子1
Figure BDA0002783999670000511
实施例4.干细胞中小鼠Pde6a D670G等位基因的修复
编码视杆-特异性酶环磷酸鸟苷(cGMP)磷酸二酯酶6(PDE6A和PDE6B)的亚单位的基因中的突变每年导致全球约72,000例RP，使治疗建模与开发基于机制的疗法高度相关。在本实施例中，本发明人使用CRISPR/Cas9基因编辑系统来纠正小鼠ES细胞中的光感受器基因突变。
对于这些研究，本发明人使用了从Pde6aD670G/D670G小鼠模型中分离的ES细胞(WertKJ等人Hum Mol Genet.2013年2月1日；22(3):558-67；Wert KJ等人J Vis Exp.2012年11月25日；(69))。如图7A所示，本实施例中使用的供体构建体(SEQ ID NO:26)包含两种修饰：1)Pde6a-密码子修饰，其在D670G密码子上游产生额外的SphI位点，其中SphI酶消化可鉴定经历CRISPR介导的同源重组的ES细胞；和2)引入了八个摆动碱基对，这使得供体模板不能被sgRNA(SEQ ID NO:6)识别，并因此对Cas9具有抗性，并导致突变型氨基酸序列改变为wt氨基酸序列。因此，在Cas9切割和同源重组后，内源突变型等位基因被替换(即，被修复)。在图7A中，三角形表示sgRNA靶位点，而两个箭头表示用于PCR扩增的引物对。如图7B所示，从重组细胞产生的扩增子为303bp和402bp，而未编辑的扩增子为705bp。此外，使用来自靶克隆的基因组DNA的直接测序，本发明人证实了供体模板替换D670G外显子的预测(图7C)。这是其中突变位点上没有sgRNA靶位点的实例，但研究人员仍然可在附近设计sgRNA，并通过同源重组成功替换突变型等位基因。
因此，在该实施例中，本发明人验证了CRISPR/Cas9系统编辑小鼠PDE6a基因座和拯救光感受器的能力。
实施例5.Pde6αD670G/Pde6αD670G小鼠模型中的CRISPR/Cas9诱导的体内基因编辑
本发明人已经验证了CRISPR/Cas9系统用于来编辑小鼠Rho基因座和拯救光感受器的用途(实施例2)。此外，如实施例4所示，本发明人能够修复ES细胞中的小鼠Pde6aD670G等位基因。接下来，可以进行体内实验，其中出生后第(P)5天，Pde6αD670G/Pde6αD670G小鼠在一只眼睛中接受重组AAV8-Cas9和AAV8-sgRNA与经密码子优化的Cas9抗性供体DNA(在实施例4中验证的)的视网膜下转导。在对照动物中，用空AAV8载体或AAV8-Cas9作为阴性对照转导一只眼睛。
本发明人接下来在纯合突变体中对Pde6αD670G等位基因之一的重组和纠正进行定量验证。简言之，在注射后一个月(变性开始前)，本发明人解剖视网膜，分离DNA，进行PCR，并验证SphI限制性位点(使用RFLP)。PCR样品以一式三份运行。在3周龄时，收集3只小鼠的视网膜，并且通过免疫印迹定量Pde6α水平。
为了定量评估光感受器功能和存活率，本发明人使用以前发表的技术(Woodruff等人J Neurosci.2008年2月27日；28(9):2064-74；Janisch等人Biochem Biophys Res Commun 390,1149-1153(2009)；Tsang等人Science.1996年5月17日；272(5264):1026-9；Davis等人Invest Ophthalmol Vis Sci.2008年11月；49(11):5067-76)在8周、16周和24周(总共n＝36只动物)时对SD-OCT、ERG和视杆-视锥密度进行了外节变薄(outer segmentthinning)的定量AF。所有测量都对双眼进行。
为了确定PDE功能的功效，作为拯救的关键生化指标，本发明人测量了来自光适应和暗适应视网膜的总cGMP水平和PDE活性是否得到恢复。测定在P18、P21、P28和P35治疗的另外三只右眼样品和Pde6aD670G/D670G的对照同伴左眼。GUCY2E(鸟苷酸环化酶)在所有实验中应保持稳定，并如前所述进行测定(Tsang等人Science.1996年5月17日；272(5264):1026–1029；Science.1998年10月2日；282(5386):117-21)。
实施例6.患者特定干细胞中编辑PD6A的同源重组对比非同源末端连接(NEHJ)的效率和频率
在本实施例中，本发明人研究了AAV2-Cas9系统是否可以编辑人PDE6A基因座。此处，用AAV2-Cas9和AAV2载体-供体模板混合物(MOI:2000)共转导6孔基质胶包被的板(在NutriStem XF/FF培养基中，Stemgent,Cambridge)中的0.25×106名患者iPS以修复PDE6A。48小时后，用Accutase将iPS传代到常规的10-cm基质胶包被的培养皿上。
接下来，挑选1000个PDE6AR102C/PDE6AS303C患者iPS克隆，并分离DNA以进行PCR；(引物：正向：GCAGACTGCAAAACTGCCAT；反向：TGTCACCAGCCTTGTCTTGG)。用BsiWI切割PCR产物，以鉴定已经历同源重组的克隆。在BsiWI消化后，由经历同源重组的iPS产生的扩增子在271bp和380bp处给出条带，而亲代序列仅在651bp处给出一个条带。
为了确定经历NHEJ的克隆的百分比(与经历同源性定向修复的那些克隆相反)，从无BsiWI位点(即，未转导的、转导的脱靶或NHEJ)的克隆中分析DNA，并确定PDE6A等位基因破坏的频率。通过SURVEYOR错配检测测定来分析DNA，并将阳性DNA样品亚克隆到质粒载体诸如pCRTM4Blunt-
Figure BDA0002783999670000521
载体中，然后送去进行Sanger测序。另外，在施加至人之前，评估iPS和活小鼠中的脱靶是先决条件。使用Illumina下一代测序通过全基因组测序分析脱靶位点。
本发明人预计与患者iPS相比，体内光感受器中由AAV8介导的同源重组率要高得多。这是因为AAV8以比转导到iPS中高得多的频率将sgRNA引入光感受器。与通常将单拷贝DNA引入每个细胞中的脂转染和电穿孔相反，AAV8将约10,000个拷贝的sgRNA和Cas9引入光感受器中。
在人-诱导的多潜能干细胞中，对于90-bp供体模板，经历NHEJ的转导的克隆的百分比可能高于经历同源重组的那些克隆的百分比-分别约为10％对比1％。
实施例7.CRISPR系统用于在从多因蜂窝病患者分离的iPS细胞中替换突变型等位基因R345W的用途
多因蜂窝状视网膜营养不良(DHRD)是一种影响眼睛并导致视力下降的遗传性疾病。其特征是在视网膜色素上皮周围积聚的小而圆的白色斑点(玻璃疣)。随着时间的推移，玻璃疣可能会成长并聚集在一起，产生蜂巢窝状模式。其通常在成年早期开始，但发病年龄不同。视力下降的程度也不相同。DHRD由EFEMP1基因中的R345W突变引起，其以常染色体显性方式遗传。
在本实施例中，本发明人使用CRISPR组分和供体模板(SEQ ID NO:SEQ ID 27)来纠正源自多因蜂窝患者成纤维细胞的iPS细胞中的R345W突变(图8A)。所产生的iPS细胞包含具有密码子修饰的野生型EFEMP1序列，其赋予了对通过Cas9的进一步切割的抗性。这些细胞在分化成RPE细胞后可用于自体移植，用于治愈DHRD。
简言之，本发明人收集了来自DHRD患者的iPS。将Cas9蛋白和sgRNA-EFEMP1(SEQID NO:3)(图8B)混合，并通过核转染将其与呈单链寡脱氧核苷酸(ssODN)(序列：tagttagtaaactctttgaccctacatctctacagatataaatgagtgtgagaccacaaaCgaGtgcCgggaggatgaaatgtgttggaattat catggcggcttccgttgttatccacgaaatcctt)形式的供体模板共转导到iPS细胞中。对供体模板进行密码子修饰，以防止被CRISPR组分重复识别和切割。利用附加的ScrFI限制性位点通过RFLP测定证实了具有纠正的序列的集落。iPS细胞的基因型通过测序来进一步证实(图8C)。
本实验提供了“切碎”策略有可能治疗除常染色体显性视网膜色素变性以外的常染色体显性疾病的证据。
实施例8.用于青少年黄斑变性的SNP编辑
患者特异性细胞是用于介导的基因编辑的最具临床相关性的体外基因组靶标，并且患者来源的成纤维细胞(和iPS细胞)已用作视网膜变性病症的基因疗法的体外接受者(Li,Tsai等人2012,Li,Wu等人2014)。FDA对先前的I/II期临床试验的批准是基于在患者来源的成纤维细胞(和iPS细胞)中显示的功效(Vasireddy,Mills等人2013)。为了评估我们的等位基因特异性CRISPR策略的功效，我们将使用患者的iPS细胞(携带BEST1 pR218H、pL234P或pA243T等位基因(Moshfegh,Velez等人，2016))来测试不同CRISPR方法的效率。
本发明人使用CRISPR(一种基因组编辑技术)通过等位基因特异性基因组编辑解决了这些障碍。我们测试了三种不同的CRISPR系统(图11)：左)CRISPRr(r＝修复)，其依赖于同源重组来将突变纠正为野生型(WT)序列；中)CRISPRd(d＝破坏)，其通过非同源末端连接(NHEJ)截断突变型等位基因；和右)CRISPRi(i＝干扰)，其使用失活的Cas9(dCas9)结合(但不切割)转录起始位点(TSS)，特异性地阻止突变型蛋白质的转录。本发明人：i)比较三种CRISPR系统的效率；和ii)验证CRISPR治疗的患者来源的RPE(“iRPE”)的形态和功能。
本发明人先前报告了本发明人通过CRISPR/Cas9同源重组产生的四个小鼠品系(Ortega,Ittmann等人1998,Sancho-Pelluz和Paquet-Durand 2012,Davis,Hsu等人2013,Singh,Shen等人2013,Bassuk,Zheng等人2016)。视网膜疾病进展可使用多模成像(multimodular imaging)和细胞计数(Tsang,Gouras等人1996,Tsang,Burns等人1998,Davis,Tosi等人2008,Tsang,Tsui等人2008,Woodruff,Janisch等人2008,Janisch,Kasanuki等人2009,Wang,Tosi等人2010,Tosi,Davis等人2011,Sancho-Pelluz和Paquet-Durand 2012,Wert,Davis等人2012,Yang,Naumann等人2012)来定量。在一个实施方案中，可使用AAV2载体(图10)。病毒介导的基因转移和/或无足迹基因编辑技术(Tsang,Chen等人1996,Tsang,Gouras等人1996,Ortega,Ittmann等人1998,Tsang,Burns等人1998,Davis,Tosi等人2008,Tsang,Tsui等人2008,Woodruff,Janisch等人2008,Janisch,Kasanuki等人2009,Wang,Tosi等人2010,Tosi,Davis等人2011,Sancho-Pelluz,Tosi等人2012,Wert,Davis等人2012,Yang,Naumann等人2012)可用于本方法。
在iPS细胞中比较CRISPRr、CRISPRd和CRISPRi之间的效率。
患者特异性细胞是用于介导的基因编辑的临床上相关的体外基因组靶标，并且患者来源的成纤维细胞(和iPS细胞)已用作视网膜变性病症的基因疗法的体外接受者(Li,Tsai等人2012,Li,Wu等人2014)。FDA对先前I/II期临床试验的批准是基于患者来源的成纤维细胞(和iPS细胞)中显示的功效(Vasireddy,Mills等人2013)。为了评估我们新型等位基因特异性CRISPR策略的功效，本发明人使用患者的iPS细胞(携带BEST1 pR218H、pL234P或pA243T等位基因(Moshfegh,Velez等人2016))来测试不同CRISPR方法的效率。
CRISPRr可通过同源性定向修复(HDR，一种内在的DNA修复机制)来修复单突变。CRISPRd可通过靶向序列(例如，基因的上游(诸如TSS中的等位基因特异性SNP))并破坏突变型等位基因而不破坏健康等位基因来截短突变型等位基因。CRISPRi使用干扰方法来防止突变型等位基因的转录，并且可能产生少数脱靶效应。
体外验证CRISPR编辑的患者来源的RPE的功能性/形态学和突变修复。
本实验旨在纠正BEST1-VMD的显性形式，并证实CRISPR技术的操作不会对iRPE的成熟和功能产生负面影响。
不受理论约束，本发明人假设BEST1单倍足够性(haplosufficiency)允许人的正常视力(Fung,Yzer等人2015,Li,Zhang等人2017)，以及iPS重编程或CRISPR方案的应用可能损害RPE成熟、正确的RPE极化、RPE65表达、正常的反式视黄醛代谢和吞噬活性(Gouras,Kong等人2002,Nguyen,Li等人2015,Li,Chan等人2016,Moshfegh,Velez等人2016)。
经CRISPRr、CRISPRd或CRISPRi编辑后的iRPE细胞表达适当的RPE标志物，并且具有正常的功能，特别是在维持Cl-离子内稳态方面。
对40名不同年龄的现有BEST1患者进行了研究，以表征BEST1标志物，从而检测进展。BEST1是在患者达到30岁前通常不会不可逆地影响视力的疾病。该实验跟踪具有疾病等位基因的患者，以确定临床病程和CRISPR干预的最佳窗口。通过成像和生物标志物分析对40名BEST1患者进行了5年的临床追踪。
该实验可以鉴定生物标志物和临床试验，所述生物标志物和临床试验可鉴定准备进行干预的患者，并鉴定用于患者的BEST1生物标志物。
实验方法
iPS细胞中CRISPRr与CRISPRd之间的效率。
患者iPS细胞的建立：本发明人使用CytoTune-iPS Sendai重编程试剂盒(LifeTechnologies)(Li,Tsai等人2012)来产生iPS细胞，并且没有留下基因组病毒残留物。为了进行质量控制，对iPS细胞进行了核型分析、基因组测序、山中伸弥转基因缺失检测和多潜能性测定(Li,Tsai等人2012)。
AAV承载能力：AAV承载能力可达4.7kb。本发明人使用2种AAV载体。对于CRISPRr，将两种基于pZac 2.1的构建体包装到AAV2中(Khan,Hirata等人2010,Asuri,Bartel等人2012,Deyle,Khan等人2012)。用AAV2-sgRNA和AAV2-Cas9载体(图10A)以及含有WT BEST1的Cas9抗性供体模板在体外和体内转导细胞(每种载体的病毒滴度为1×1013个基因组拷贝/ml)。AAV2血清型在转导RPE和内视网膜细胞(在小鼠模型中)以及iPS细胞方面是高效的(Pang,Lauramore等人2008,Guziewicz,Zangerl等人2013,Rapti,Stillitano等人2015)。为了获得同基因的BEST1，本发明人挑选了1,000个CRISPRr编辑的患者干细胞克隆，筛选限制性片段长度多态性(RFLP)，并通过Sanger测序进行确认。
gRNA：CRISPRd需要两种gRNA；一种在TSS的上游(gRNA1或gRNA2)，和另一种在内含子的下游(gRNA3，图13A)。靶向内含子的gRNA3可同时靶向突变型和WT等位基因。然而，仅仅是内含子中的单个切口可能不会伤害WT等位基因。只有当染色体同时被上游和下游gRNAs(gRNA1+gRNA3或gRNA2+gRNA3)靶向进行Cas9切割时，才能实现BEST1的大规模缺失。这种基因截短可以阻止突变型BEST1等位基因的表达(图13A-13C)，同时保留WT等位基因。
用于CRISPRr的一个BEST1等位基因的重组和纠正的定量验证：在AAV转导后一个月，通过PCR测定CRISPRr处理的细胞中新的限制性片段长度多态性(RFLP)位点的HDR效率，所述位点在来自HDR来源的细胞的DNA中被切割。还将分析缺乏新的RFLP位点的克隆(这将表明它们未被转导，被以脱靶方式转导，或通过NHEJ而被改变)(图10A)。将DNA进行直接Sanger测序。
如上所述，对携带Cl-生物传感器的CRISPR编辑的iRPE品系(来自携带pR218H、pL234P和pA243T等位基因的患者(Moshfegh,Velez等人2016))的功能性进行测试。对于如上由CRISPRr产生的同基因对照，突变型BEST1基因组序列被具有额外RFLP位点(类似于图10A中的实例)的经密码子修饰的供体模板替换，从而允许鉴定已经历同源重组的细胞。
CRISPRd不太可能通过NHEJ破坏WT等位基因，因为使用PCR产生的底物的体外测定显示出优良的特异性(图13B)。另外，为了使脱靶效应(特别是靶向外显子中)降至最低，本发明人缩短了gRNA互补区(Fu,Foden等人2013,Ran,Hsu等人2013,Pyzocha,Ran等人2014,Smith,Gore等人2014,Tsai,Wyvekens等人2014,Smith,Abalde-Atristain等人2015)。在一些情况下，本发明人可使用第二gRNA和AAV::切口酶来代替AAV::Cas9(Mali,Aach等人2013,Ran,Hsu等人2013,Shen,Zhang等人2014,Tsai,Wyvekens等人2014)。在另一个实施方案中，本发明人可为AAV介导的靶向CRISPRr设计针对突变型基因座的单体转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN，2.7kb)(Beurdeley,Bietz等人2013,M Scharenberg,Duchateau等人2013)。双重AAV载体可在活小鼠中转导>55％的光感受器(Millington-Ward,Chadderton等人2011,Trapani,Colella等人2014,Cabral,DiCarlo等人2017)。如果双重AAV::CRISPR载体没有消融BEST1 MT等位基因，则本发明人在单个AAV2载体中测试AAV::SaCas9；U6::gRNA(Kleinstiver,Prew等人2015,Ran,Cong等人2015)。通过AAV::Cas9载体实现了Cas9表达的水平和持续时间的最小化(和从而脱靶可能性的最小化)，所述载体在Cas9产生后不久就自我失活。本申请人可以可选择地应用常规Cre-lox敲入技术(Kleinstiver,Prew等人2015,Ran,Cong等人2015)，尽管使用该系统不能实现无足迹的基因靶向。供体DNA在细胞中的持续存在也可能产生可表现为低频修复的PCR伪迹(PCR artifact)。单链供体(而不是质粒)应该防止这种情况。
使用患者来源的RPE通过CRISPRi进行BEST1靶向。
CRISPRi SNP编辑：CRISPRi(图14A-14B)由于使用了PUF-KRAB而有效地抑制了转录。衔接蛋白PUF与含有一个或多个PUF结合序列的经修饰的gRNA结合。可将第二代CRISPRi的组分包装成两个AAV，从而使CRISPRi机器能够顺利地递送到iRPE细胞中。
AAV2的构建和递送：本发明人手上有AAV2::PUF-KRAB+AAV2::dCas9；U6::gRNA1-PUF-结合位点构建体，并在iRPE中测试了U6::gRNA1(图15B)(Millington-Ward,Chadderton等人2011,Trapani,Colella等人2014)。CRISPR的亲代品系将是pL234P、pR218H和pA243T患者来源的iRPE，经工程化以携带YFP-H148Q/I152L荧光Cl-生物传感器(图17A-17B)。添加了5个PUF结合序列/位点的gRNA(sgRNA-PBS)用作RNA支架，为多沉默子复合物的组装提供种子(图17A-17B)。经过2至3代后，通过qPCR和免疫印迹测试单个“多克隆”群体(携带不同的gRNA)的BEST1敲低。
用于分析AAV转导的BEST1MT/+RPE的基因表达谱的RNA测序(RNA-Seq)。为了证实CRISPRi对BEST1MT的抑制，本发明人进行了利用双重AAV2::PUF-KRAB；AAV2::dCas9对比单独的对照单AAV2::dCas9转导的iRPE的RNA-Seq(3000万个序列读段)。
为了分析可能由CRISPR产生的脱靶效应，本发明人进行了WGS、双基因组-测序(digenome-seq)和GUIDE-seq。
CRISPRi应该具有少量脱靶效应，因为它不会切割DNA。因此，这将减少癌基因的激活。在一个实施方案中，CRISPRi可能具有比CRISPRr更高的效率，因为约三分之一的由CRISPRr介导的NHEJ破坏导致额外的框内突变。使用CRISPRi沉默MT(突变型)BEST1等位基因导致全基因组转录的干扰可以忽略不计。CRISPRi不应改变WT BEST1 mRNA水平。RNA-seq显示CRISPRi如何高效地抑制iRPE中的MT BEST1等位基因。
本发明人还通过靶向SNPs rs972353和rs972355来测试等位基因特异性编辑是否可行。在某些实施方案中，在这些SNP处为纯合的患者不接受CRISPRi或CRISPRd治疗。这些患者可通过靶向BEST1基因内的其它SNP来进行治疗。在AAV2递送后，催化缺陷型Cas9(dCas9)可在非分裂RPE细胞中持续存在，并可延长潜在的dCas9毒性(Platt,Chen等人2014)。如果双重AAV2::dCas9+AAV2::gRNAPBS/PUF-KRAB不能促进足够的抑制作用，则可在单个载体中施用EIAV::dSaCas9-KRAB(Kleinstiver,Prew等人2015,Ran,Cong等人2015)。慢病毒马传染性贫血病病毒(EIAV)是FDA批准的，并因此Lenti::CRISPRi可以容易地适应临床试验。
确定源自CRISPR编辑的细胞的RPE在结构上是否正常以及表达适当的生物标志物。
为了建立用于试验的阳性对照，本发明人包括来自健康供体的WT(野生型)iRPE；CRISPRr、CRISPRd和CRISPRi实验中的每一个还包括各自的乱序gRNA对照作为阴性处理对照。总共分析了七组细胞。
作为当前标准的同基因CRISPRr-修复的iPS细胞用作阳性对照以用于比较CRISPRd和CRISPRi的效力。
与亲代品系一样，CRISPR编辑的克隆可以分化成呈现正常表型的RPE单层(Gouras,Kong等人2002,Wang,Tosi等人2010,Li,Tsai等人2012,Li,Wu等人2014；Bassuk,Zheng等人2016,Wu,Tsai等人2016)。
细胞培养中可能的镶嵌结果可能是由CRISPR技术产生的。如果通过免疫染色和免疫印迹的表征不足够，则本发明人在CRISPR编辑后进行质谱以分析细胞的蛋白质组谱。为了将使用RPE细胞长期表达Cas9的策略转化为人试验，可使用眼内环孢菌素A植入物(Lai,Gouras等人，2000)。无免疫抑制可用于AAV::Cas9试验(Long,McAnally等人2014,Long,Amoasii等人2016,Nelson,Hakim等人2016,Tabebordbar,Zhu等人2016,Bengtsson,Hall等人2017)。
在CRISPR编辑的RPE中定量Cl-流出的恢复。
测量iRPE中Cl-流出的生物传感器：本发明人包括新型Cl-生物传感器，突破了以前在测试功能恢复和评估CRISPR编辑后细胞功能的可能干扰方面的挑战。使用Cl-浓度生物传感器，本发明人可使用CRISPR编辑的iPS细胞直接测试这两种可能性。本发明人公布了我们的Cl-流出测定法，该测定法使用了携带单个拷贝的黄色荧光蛋白(YFP)-H148Q/I152L阴离子生物传感器的iRPE(图17A-17B)。该测定允许定量CRISPR介导的BEST1通道活性的功能拯救。
生物传感器成像：本发明人在CRISPRd-和CRISPR-i编辑的细胞中观察到携带YFPH148Q/I152L的BESTMT(杂合SNP rs972355)iRPE中的Cl-流出(Galietta,Haggie等人，2001，Moshfegh,Velez，2016)。这种生物传感器对Cl-很敏感：当细胞内Cl-增加时，YFP强度下降，反之亦然。利用Ca2+离子载体A23187的处理诱导Ca2+从内质网储存物中释放以激活BEST1(Moshfegh,Velez等人，2016)。先前，在两分钟的刺激内，表达生物传感器的WT RPE细胞表现出降低的细胞内Cl-浓度，随后在15分钟内恢复(Galietta,Haggie等人，2001；Moshfegh,Velez等人，2016)。
对于特定的Ca2+浓度，本发明人估计了平均稳态Cl-流，其95％的置信区间，并在不同电压值下进行了组间比较。在100mV下，还将在不同Ca2+浓度水平下比较各组间的Cl-电流密度。使用荧光生物传感器成像(Moshfegh,Velez等人，2016)，本发明人还检查了Cl-电导随时间推移的轨迹，并在每个时间点比较各组。
可对每组20个不同的单细胞重复实验。比较组内的平均差异(例如，组内不同时间点之间)，20个细胞将具有80％的能力在0.05的显著性水平下检测为0.66的标准化效应值(effect size)(即，以标准偏差为单位的平均差异)。比较各组之间的平均差异(例如，在特定Ca2+浓度下比较各组之间的平均Cl-电流)，每组20个细胞将具有80％的能力在0.05的显著性水平下检测为0.91的标准化效应值(即，以sd为单位的平均差异)。根据以前的实验，我们将能够检测到此类差异。
为了证实生物传感器的发现(Galietta，Haggie等人2001,Moshfegh,Velez等人2016)，使用EPC10膜片钳放大器(HEKA Electronics)(Li,Zhang等人2017)对iRPE进行48至72h的全细胞记录。
本发明人预期CRISPR方法能够恢复依赖于钙的Cl-流出，并且预期在将细胞分化为RPE或对Cl-电导成像方面没有实验困难(Li,Tsai等人2012,Li,Wu等人2014,Yang等人2014,Yang,Li等人2014,Moshfegh,Velez等人2016,Li,Zhang等人2017)。我们的第二代CRISPRi的性能应该很好，因为PUF-KRAB系统已增强了转录抑制的能力。
如果分化的RPE未表现出正常的极性、生物标志物表达或吞噬能力，那么发明人修改RPE分化方案或采用使用核糖核蛋白(RNP)复合物的非病毒CRISPR递送系统。
对VMD病患者进行研究，以表征该疾患的自然史。
诸如短波长自发荧光(SW-AF)、NIR-AF和OCT的成像方式可以确定使用我们的CRISPR干预预防VMD的最佳窗口。
在理解VMD的自然史方面取得进展一直是个挑战，因为小鼠不能近似人VMD表型(即，没有合适的小鼠模型)(Marmorstein,Wu等人2006,Zhang,Stanton等人2010)，并且组织病理学材料有限。也没有回答的是，VMD对黄斑的影响如何不成比例地超过对视网膜其它部分的影响(Boon,Klevering等人2007,Boon,Theelen等人2009)以及增加的RPE脂褐素形成是否促成疾病的发病机制。
眼底异常通常在生命的前二十年内可见，但也有晚发病例(例如，75岁)的报道(Mullins,Oh等人2005)。VMD早期阶段的特征在于中央黄斑区中的圆顶状的充满液体的病变(卵黄状病变)，所述病变轮廓清晰，并且通过SW-AF成像显得明显强烈(Spaide,Noble等人，2006)。眼电图(EOG)光峰暗谷比的降低是肌萎缩蛋白病(bestrophinopathy)的标志，并且是由BEST1的功能失常引起的。已将多种阴离子通道功能(包括向外的Ca2+-依赖性Cl-电导和碳酸氢盐流出)归因于BEST1(Sun,Tsunenari等人2002,Rosenthal,Bakall等人2006,Qu和Hartzell2008,Marmorstein,Cross等人2009)。本发明人还追踪了充满液体的病变对感光细胞健康的影响。
VMD随着年龄的增长逐渐恶化，但下降的速率通常是缓慢的，并且提供了较长的治疗窗，因为尽管视网膜下液和浆液性脱离的持续存在导致了形态学和功能的改变，但中央光感受器仍然是可治疗的(Ponjavic,Eksandh等人1999,North,Gelman等人2014,Yang,Justus等人2015)。VMD病患者的进展速度和预后可通过组合基因型和表型特征的观察来预测。目前，还没有公布预测VMD的指南。因此，基于眼底镜检查的分层和咨询具有挑战性。
该数据表明，OCT分割、qAF、NIR-AF成像和功能测试可用于对患者的未来视觉功能进行分类和预测(Ferrara,Costa等人2010,Duncker,Greenberg等人2014,Fung,Yzer等人2014,North,Gelman等人2014)。非侵入性视网膜成像方法可广泛获得并且对儿童友好，并且它们快速提供对视网膜变性和疾病进展的直接和敏感的测量。对先前应用于VMD的表征的现有方案的扩展(Ferrara,Costa等人2010,Duncker,Marsiglia等人2014,Fung,Yzer等人2014,North,Gelman等人2014)有望为这些疾患的治疗试验中的疗效监测提供有意义的终点。
为了评估VMD患者的进展速率和预后，可应用经验证的方法的组合(Duncker，Marsiglia等人，2014,Fung,Yzer等人2014,North,Gelman等人2014)：基因分型、OCT分割、qAF、NIR-AF和功能测量。精确的OCT-qAF分类系统将揭示治疗的最佳阶段，并鉴定疾病进展的任何里程碑或“不可逆转”点。治疗性编辑可能对已进展超过卵黄破裂(vitelloruptive)期的患者没有益处(Ponjavic,Eksandh等人，1999)。发现结果可以证实OCT增厚是最早的病理标志的发现(Ferrara,Costa等人2010,Querques,Zerbib等人2011)。这一症状前阶段的特征尚未确定，并且可能是VMD的基于CRISPR的干预的最佳窗口。
自然史数据可以为临床试验中使用的结果测量的设计提供信息。已确认的基因型-表型相关性和精确的分类系统将有助于试验选择标准的患者分层。来自所有临床模式的结果、OCT分割、qAF和NIR-AF成像增加的区域结合利用眼底引导的介视觉(mesopic)和暗适应微视野检查术(microperimetry)(Nidek MP-1S和MAIA)进行的视杆和视锥功能的测量，以及足够大的队列中的自动光和暗适应视野检查，有助于理解基因型-表型相关性和临床分类。OCT分割可以比目前可用的其它成像工具更早地检测进展。进展速率将表现出双侧一致性，以允许对侧成为对照眼。本发明人的登记册用作是基础、临床和药物基因组学研究的基准。
比较作为监测VMD患者4年期疾病进展的可靠终点的SW-AF、NIR-AF和SD-OCT成像对比视觉功能测试(眼底视野检查和自动明暗适应视野检查)的灵敏度。
可定量的眼底变化(归因于疾病的进展)可用当前的成像方式(包括SW-AF(488nm)和NIR-AF(787nm)成像以及OCT)精确记录。
可将结构和功能数据的灵敏度和可比性可以作为4年期间的结果测量进行评价。本发明人还评估了OCT、qAF、NIR-AF和眼底视野检查在检测进展和确定预后方面的效用。
实验
基因分型和临床表征。所有患者都接受了BEST1突变筛查。诊断通常基于根据国际视觉临床电生理学会(ISCEV)标准(Marmor,Brigell等人2011)记录的眼底外观、家族史和下降的EOG的Arden比率进行。根据眼底照片和OCT发现对VMD患者进行分期(亚临床、假性前房积脓(pseudohypopyon)、卵黄破裂、萎缩)(Gass,Chuang等人，1988,Ferrara,Costa等人，2010)。
SW-AF.对于定性和定量的qAF，使用通过如所描述的(Delori,Greenberg等人，2011)，插入内部荧光参考(以考虑可变的激光功率和检测器增益)改进的cSLO(SpectralisHRA+OCT；Heidelberg Engineering,Heidelberg,Germany)采集SW-AF图像(30°；488nm的激发)。在获取图像之前，用局部1％托吡卡胺和2.5％去氧肾上腺素将瞳孔放大至至少7mm。在聚焦和对准过程中，使眼底暴露20-30秒以漂白视紫红质(Delori,Greenberg等人，2011)。调整检测器灵敏度，使灰度级(GL)不超过检测器的线性范围(GL<175)(Delori,Greenberg等人，2011)。
NIR-AF.NIR-AF主要来源于RPE黑色素，脉络膜的贡献较小(Keilhauer和Delori2006,Duncker,Tabacaru等人2013,Duncker,Greenberg等人2014,Duncker,Marsiglia等人2014,Sparrow,Marsiglia等人2015,Lee,Xie等人2016,Schuerch,Marsiglia等人2016)。本发明人记录了眼底AF中的NIR-AF面积，并使其与SW-AF、qAF、用OCT评价的视网膜结构、通过眼底视野检查(MAIA-Nidek-MP-1S)定量的视觉灵敏度以及四年期间每年间隔的自动明暗适应视野检查的变化相关联。
SD-OCT.使用高分辨率单中心凹扫描和体积厚度图。OCT扫描中反射率带的分配基于Staurenghi等人(Staurenghi,Sadda等人2014)。使用计算机辅助手动分割技术评价光感受器所属层(photoreceptor-attributable layer)的厚度。将评价光感受器外节等效增厚的进展(Querques,Zerbib等人2011,Duncker,Greenberg等人2014)；测量了SD-OCT图像中椭圆体区(EZ)损失的面积(Duncker,Greenberg等人2014)，并且本发明人验证了外节与RPE顶突(IZ)之间的交指区(zone of interdigitation)(IZ)的增厚是最早的病理标志的发现(Ferrara,Costa等人2010,Querques,Zerbib等人2011)。这一症状前阶段尚未确定，并且可能是BEST1-预防性CRISPR的最佳窗口。在图像采集和分析过程中，扫描倾斜和Henle纤维阻塞(Henle fiber obstruction)都会得到纠正。将结构的变化(例如，EZ损失的宽度)与微视野检查进行比较。
关于OCT厚度测量的流体分辨率(Fluid resolution)(以微米为单位)提供了灵敏的治疗终点，并可以减少基因疗法试验中所需的样本量。
在疾病的每个阶段跟踪卵黄状病变中的qAF水平，以确定在年龄匹配的健康眼中，相同位置的qAF强度是否大于预期。
由于感光细胞被破坏并因此不能消耗能量来对视黄醛解毒，所以在POS中加速形成双类视黄醇。
背景.由SW 488nm光激发并通过共聚焦扫描激光检眼镜成像的自然SW-AF表现出指示来自RPE双类视黄醇脂褐素的主要来源的光谱特征、位置和年龄关系。尽管已经假设(Frangieh,Green等人1982,Weingeist,Kobrin等人1982,O'Gorman,Flaherty等人1988,Delori,Dorey等人1995,Vedantham和Ramasamy 2005,Spaide,Noble等人2006,Bakall,Radu等人2007,Zhang,Bregman等人2011,Singh,Shen等人2013)RPE皮脂褐素在VMD的非病变区域中增加，但本发明人通过非侵入性qAF证明病变外的SW-AF强度在正常年龄限值内(Duncker,Marsiglia等人2014)。实验的目的是了解卵黄状病变的升高的SW-AF。我们以前曾报道过，VMD患者的卵黄状病变和健康眼睛的RPE脂褐素内记录的发射光谱具有相似的形状，因此表明荧光团是相同的(Duncker,Marsiglia等人，2014)。由于众所周知RPE脂褐素来源于POS(Sparrow和Yamamoto 2012)，因此卵黄状病变中的自荧光材料可能来源于病变中积累的外节碎片。事实上，由于感光细胞被破坏并因此不能消耗能量来对视黄醛解毒，所以在POS中加速形成双类视黄醇。因此，强烈AF指示功能失调的感光细胞。这一观点与OCT中显著的ONL变薄相一致(Duncker,Marsiglia等人2014)。这个问题很重要，因为感光细胞中升高的双类视黄醇水平是有毒的，因此会进一步加速光感受器变性。
上述工作的成功完成将用于鉴定可从CRISPR中受益以及可能从未来的小分子治疗剂中受益的患者，所述小分子治疗剂有可能对抗双类视黄醇形成的过度产生(Sparrow,Duncker等人2016)。靶向视觉周期以减少双类视黄醇的形成目前正在进行临床前和临床研究(Sparrow,Duncker等人，2016)。
实验设计
成像技术。在彩色眼底照片、NIR反射、NIR-AF中以SW-AF图像中鉴定卵黄状病变。测量SW-AF图像中的病变面积(图像J)，并将其与通过视野检查确定的病变进行比较。对于处于卵黄状和假性前房积脓期的患者，将在VMD患者双眼中至少3个位置(26X 26像素)的矩形区域(目标区域，ROI)中测量病变内的qAF水平。从2幅图像(每只眼睛)中获取测量值，并取平均值以获得单个值/眼睛。将VMD患者的qAF值与从我们的健康眼数据库中获得的值进行比较。对照值来自具有相同的偏心率(像素)的5只年龄相似的健康眼睛，以及来自我们数据库中相同种族/民族的受试者(277名受试者中的374只眼睛；白人、亚洲人、西班牙人、女性和男性)(Greenberg,Duncker等人2013)。
用于qAF分析的SW-AF图像是根据既定方案(Delori,Greenberg等人，2011)采集的。简言之，使用通过插入内部荧光参考(以考虑激光功率和探测器增益的变化)改进的共焦扫描激光检眼镜(Spectralis HRA+OCT；Heidelberg Engineering,Heidelberg,Germany)采集SW-AF图像(30°；486nm的激发)。调整检测器灵敏度，使灰度级(GL)不超过检测器在30x30°视野(768x768像素)内高速模式(8.9帧/秒)下的线性范围(GL<175)。将帧对齐，并将平均值以“非归一化模式”(无直方图拉伸)保存。在考虑零GL、放大倍数(折射)和眼介质吸收后，将GL针对内部参考的GL进行校准。
对于统计分析，通过对位置、偏心率、年龄、性别和人种-民族进行调整使混合效应模型将适用于数据，由此计算每只眼睛中每个位置的归一化评分，并记录95％置信区间之外的那些z评分。
病变内qAF比视网膜的非病变旁中心凹区中高许多倍。这些极高水平的AF反映了受卵黄状病变环境损害的感光细胞中加速的双类视黄醇。作为ROIqAF方法的替代或补充，本发明人使用我们的标准qAF片段分析(Delori,Greenberg等人，2011)来测量qAF。在该分析中，计算偏心率约为5-9°的8个预设圆形排列的节段中的每一个的平均qAF，并对其进行平均，以产生每个图像的单个qAF值。如果节段与病变不重叠，则可以将节段排除。发明人使用Bland-Altmann方法来评估测量的可重复性和同一患者眼睛之间的一致性。
验证未经治疗的对侧眼睛是否是适当的内部对照。
不受理论的束缚，本发明人的假设是在表型严重程度和VMD进展速度方面存在双侧一致性。
方法.
在患有VMD病的个体中，本发明人使用数据集纵向计算同一患者眼睛中疾病进展方面的双侧一致程度。本发明人评价了OCT、NIR-AF和SW-AF图像中左右卵黄状病变的可变性和对称性，以及基线和4年后的动态视野检查结果。本发明人还比较了卵黄状病变面积和qAF。
通过计算类内相关系数(ICC)和皮尔逊系数来检验眼间一致性/相关性。基于ICC估计值的95％置信区间，小于0.5、0.5至0.75、0.75至0.90和大于0.90的值将分别被解释为差、中、好和优。
表2.当前iPS供体的人口统计和BEST1测试结果的状态
Figure BDA0002783999670000601
所述测试显示，患者眼睛之间的疾病进展速率相似，这可为使用对侧未治疗的眼睛作为治疗结果的对照提供支持。如果患者两只眼睛之间的疾病进展存在显著差异，那么本发明人需要使用我们收集的VMD进展自然史数据来比较基因治疗后光感受器疾病的任何进展。
本发明人从40名VMD患者中的29名中产生了成纤维细胞或iPS细胞系，并招募了总共至少52名患者。
可以招募另外的患者。以下是招募另外患者的一些纳入和排除标准。
纳入标准
1.愿意并能够提供完整/签名的知情同意书或同意书，包括父母同意书。
2.能够在4个月的时间内跟踪所有要求的访问。
3.年龄≥4岁。
4.利用对一种或多种致病性BEST1突变的分子确认或具有与根据OTC的Best疾病一致的特征的特征性视网膜电图(ERG)和眼电图(EOG)进行的Best疾病的临床诊断。
5.基线视力为20/40或更差。
6.适用于多模视网膜成像(multimodal retinal imaging)的眼介质。允许高质量的摄影成像的瞳孔放大和固定。
7.良好的健康状况，无明显体检结果或临床上明显异常的实验室结果。
排除标准
1.先前存在AAV免疫。
2.当前或过去的视网膜疾病，所述视网膜疾病可能会混淆疾病进展的纵向评估。这包括但不限于玻璃体出血、孔源性病史视网膜脱离和青光眼。
3.既往眼内手术史或证据，其包括但不限于：6个月内进行的玻璃体切除术、白内障摘除和LASIK。
4.患者希望在研究期间的任何时间进行白内障摘除。
5.导致显性或X连锁遗传性视网膜营养不良的基因突变，或已知导致隐性遗传性视网膜疾病的双等位基因突变的存在。
6.在接受任何实验疗法之前。
7.过去接受过可能会混淆结果的化学疗法或生物疗法。
由于内源突变型(MT)等位基因保持完整的事实，涉及WT cDNA递送的常规基因补充疗法(Cideciyan,Jacobson等人2013,Bainbridge,Mehat等人2015)不太可能改善常染色体显性或显性阴性疾患。基于CRISPR的基因编辑技术(该涉及由工程化引导RNA(gRNA)指导的Cas9核酸酶，以在基因组中的指定位置特异性编辑序列)已被提议用于破坏突变基因(Fu,Foden等人2013,Ran,Hsu等人2013,Pyzocha,Ran等人2014,Smith,Gore等人2014,Tsai,Wyvekens等人2014,Smith,Abalde-Atristain等人2015,Wu,Tsai等人2016)。所述方法将这种技术带到了一个新的水平，并使等位基因特异性(或亲代染色体特异性)靶向而不是常规的针对这种显性遗传性疾患的突变特异性靶向成为可能。在解决这一障碍时，所述方法以等位基因特异性的方式消融突变基因，使得WT等位基因保持完整以支持正常功能(图11)。本方法可用于治疗其它黄斑变性和显性遗传性疾患。
iPS细胞作为等位基因特异性基因编辑靶标的正当性：在人中，BEST1作为Ca2+-激活的Cl-通道发挥作用，并且VMD患者的RPE细胞表现出异常的Cl-流出(Moshfegh,Velez等人2016,Li,Zhang等人2017)。然而，由于来自杂合子Best1+/W93C小鼠的RPE细胞表现出正常的Cl-电导，因此BEST1在小鼠的Cl-流出中所起作用可能不太重要(Zhang,Stanton等人2010)。同样的突变(+/W93C)会在人中导致VMD。鉴于这种缺乏适当的动物模型，本发明人已通过建立源自患者自已的iPS细胞的CRISPR编辑的RPE(“iRPE”)开发人模型来测试BEST1功能的恢复。本发明人还创建了新型Cl-生物传感器，以容易地评价CRISPR-编辑的BEST1蛋白是否能适当地流出Cl-离子。
虽然许多基于CRISPR的基因治疗方法侧重于突变特异性基因修复策略，但本方法采用了更具普遍性的方法。不然的话，将需要200多种不同的gRNA和各自的临床试验来涵盖在BEST1中发现的所有突变。因此，本发明人设计了新型方法，所述方法利用SNP杂合性来创建适用于多种突变的系统。BEST1转录起始位点(TSS)中的SNP可用于使CRISPR gRNA能够区分MT与WT等位基因。所述方法包括将这些SNP映射到病理突变，并设计gRNA来指导Cas9只切割患病的等位基因。这种创新的方法允许靶向和编辑所有BEST1突变，而不仅仅一种BEST1突变。
CRISPRi的第二代应用由于使用了PUF-KRAB(Pumilio mRNA结合因子-Kruppel-相关盒结构域)阻遏物而具有了很强的基因阻遏活性(图15A-15B)。CRISPRi设计克服了将KRAB系统(图15B)适配到AAV载体中的过大障碍，并为指定基因提供了更稳定的基因抑制(Cheng,Jillette等人2016)。CRISPRi也被认为是一种更安全的技术，因为其不涉及基因组DNA的修饰。
提议的研究使用创新的结果测量。本发明人开发了遗传编码的荧光氯化物传感器，以评估正常对比VMD患者来源的iPS细胞(其已分化为RPE)中细胞内Cl-浓度的变化。因此，我们不仅可以在动物模型中测试恢复的BEST1功能，还可以直接在患者的RPE中测试。本方法可使用干细胞疗法来治愈目前不可治疗的常染色体显性疾病。
实施例9.CRISPR3.0：对携带不同显性突变的Best VMD患者的治疗。
本公开的方法和系统提供了某些类型的SNP基因型的治疗。首先，Sanger测序将用于确定BEST VMD患者的SNP基因型。预计约有50％的患者为其中一个SNP的杂合子，并因此有资格使用CRISPR3.0进行治疗。接下来，通过系谱分析(或简略连锁基因分型)对合格的患者进行进一步的单倍型分析，以确认每个SNP变体与突变之间的等位基因连锁。最后，患者将接受两组治疗材料中的一组，以用于选择性消融突变型等位基因。
在CRISPR3.0中，在CRISPR3.0中使用一对紧密连锁的SNP来标记一对同源物中每个同源物的身份。在一个实施方案中，紧密连接的SNP包括r972355和rs972353；然而，BEST1的任何紧密连锁的SNP组都涵盖在本文阐述的治疗方案组中。CRISPR3.0涉及至少三种gRNA的使用。为了实现CRISPR3.0，设计了三种gRNA：gRNA-a靶向SNP变体1；gRNA-b靶向SNP变体2；以及，gRNA-c靶向下游内含子区域。当同源物1(例如，基因型1)中存在突变时，gRNA-a+gRNA-c将用于特异性破坏同源物1的突变型BEST1基因的表达。如果突变相反地存在于同源物2(例如，基因型2)上，将使用gRNA-b+gRNA-c。
如图22A–(A)所示，将一对紧密连锁的SNP，r972355和rs972353，在“CRISPR3.0”中用于标记一对同源物中每个同源物的身份。显示了染色体上两个SNP的核苷酸变体的所有四种可能组合。为了实现CRISPR3.0，设计了三种gRNA：gRNA-a靶向rs972355核苷酸变体G(而不是A)；gRNA-b靶向rs972353核苷酸变体G(而不是C)；gRNA-c靶向下游内含子区域。当同源物1(基因型1)中存在突变时，将gRNA-a+gRNA-c用于特异性破坏同源物1的突变型BEST1基因的表达。如果突变相反地存在于同源物2(基因型2)，则使用gRNA-b+gRNA-c。因为这两个SNP不能区分基因型3和4中的两个同源物，所以这些基因型需要使用其它SNP和gRNA。
图22B-(B)显示基于rs972355和rs972353设计的gRNA组可治疗约50％的Best VMD患者群体(基因型1+2，基于TOPMED数据库)。在治疗前分析每个病人的DNA以确定基因型(见图..22Dz，工作流程)。
图23A显示在CRISPR3.0中，一对紧密连锁的SNP，r972355和rs972353，被用来标记一对同源物中每个同源物的身份。显示了染色体上两个SNP的核苷酸变体的所有四种可能组合。为了实现CRISPR3.0，设计了三种gRNA：gRNA-a靶向rs972355核苷酸变体G(而不是A)；gRNA-b靶向rs972353核苷酸变体G(而不是C)；gRNA-c靶向下游内含子区域。当同源物1(基因型1)中存在突变时，gRNA-a+gRNA-c用于特异性破坏同源物1的BEST1基因的表达。如果突变相反存在于同源物2(基因型2)上，则使用gRNA-b+gRNA-c。因为这两个SNP不能区分基因型3和4中的两个同源物，所以这些基因型需要使用其它SNP和gRNA。
图23B-(B)基于rs972355和rs972353设计的gRNA组可治疗约50％的总Best VMD患者群体(基因型1+2，基于TOPMED数据库)。在治疗前分析每个患者的DNA以确定基因型(见图22D，工作流程)。
图24是CRISPR 1.0、CRIPSR 2.0和CRIPSR3.0策略的概述。
图25是CRISPR 3.0治疗的工作流程。首先，Sanger测序可用于确定BEST VMD患者的SNP基因型；预计50％的患者为其中一个SNP的杂合子(49.9％，见图25)，并因此有资格接受治疗。接下来，通过系谱分析(或简略连锁基因分型，见图24)对合格的患者进行进一步的单倍型分析，以确认每个SNP变体和突变之间的等位基因连锁。最后，用两组治疗材料中的一组治疗患者(见图.24)以选择性消融突变型等位基因。
实施例10.Best VMD患者的治疗
CSGT(CRISPR3.0)是用于大约一半的Best VMD患者的治疗。使用我的35名BestVMD患者的血样对BEST1基因进行测序，以揭示上游SNP rs972355和rs972353两者的所有四种可能的核苷酸变体组合(注意这两个SNP是遗传连锁的)。利用同源染色体之间TSS SNP的差异的CRISPR3.0在靶向TSS SNP为杂合时，介导选择性基因截短。因此，基因型1和2(以顺式方式具有突变的SNP杂合子)占Best VMD患者群体的49.9％，可用CRISPR3.0治疗，并且基因型3和4(SNP纯合子)可用CRISPR2.0治疗。图26A、图26B和图26C。
在图27B中，通过双重gRNA对基因组BEST1进行等位基因特异性切除，并在体外对RPE细胞中SNP编辑后的BEST1表达进行测量。(A)通过不同的双重gRNA系统(CRISPR3.0)在体外于293FT细胞中截短基因组BEST1。在四个组当中，在三个组(I、II和IV)中检测到不同大小的截短的BEST1等位基因(箭头)。图27A.(B)在CRISPR 2.0-和3.0-编辑的VMD iRPE中，BEST1表达是稳健的。用慢病毒双重gRNA载体转导源自VMD患者成纤维细胞的iRPE，以进行BEST1等位基因的CRISPR 2.0或3.0编辑；载体携带WT BEST1 cDNA(+WT)或不携带其；WTiRPE未被转导。两周后，收集RNA，产生cDNA，并通过qPCR测定BEST1转录物的表达。BEST1的PCR产物约为260bp。WT，对于SNP rs972355是纯合的WT RPE；对照，仅携带WT BEST1 cDNA(无gRNA)的双重载体；GAPDH，内部对照。对照组未使用慢病毒载体。GAPDH用作内部对照。图27B。
等同方案
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
可在本文未明确公开的任一个或多个元件、一个或多个限制不存在的情况下适当地实施本文说明性描述的本技术。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被广泛而无限制地阅读。另外，本文采用的术语和表达已被用作描述而非限制的术语，并且在使用此类术语和表达时无意排除显示和描述的特征或其部分的任何等同物，但应当认识到，在要求保护的本技术的范围内可以进行各种修改。
因此，应该理解的是，此处提供的材料、方法和实例是优选方面的代表，是示例性的，并且不旨在限制本技术的范围。
已在本文中广泛和一般性地描述了本技术。属于本公开的每一个较窄的种类和亚属分类也构成了本技术的一部分。这包括对本技术的一般描述，附带条件或负面限制是从该类中去除任何主题，而无论被切除的材料是否在本文中被明确引述。
另外，在根据Markush组描述本技术的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本技术也因此根据Markush组的任何单个成员或成员的亚组来描述。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用明确地并入，其程度如同每一篇文献均以单独引用的方式并入。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。
在以下权利要求中阐述了其它方面。
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表3提供了本公开实施例中使用的gRNA/sgRNA序列、供体模板修饰的序列和附加序列。
表3
Figure BDA0002783999670000771
Figure BDA0002783999670000781
Figure BDA0002783999670000791
Figure BDA0002783999670000801
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Figure BDA0002783999670000891
Figure BDA0002783999670000901
本发明的范围不受上文具体显示和描述的内容的限制。本领域技术人员将认识到，对于所描述的材料、配置、构造和尺寸的实例，存在合适的替代方案。在本发明的描述中引用和论述了许多参考文献，包括专利和各种出版物。提供这些参考文献的引用和论述仅仅是为了阐明本发明的描述，而不是承认任何参考文献是本文所述发明的现有技术。本说明书中引用和论述的所有参考文献通过引用整体并入本文。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员将会想到本文描述的内容的变化、修改和其它实现。虽然已经显示和描述了本发明的某些实施方案，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行改变和修改。在前面的描述中阐述的内容仅作为说明而非限制提供。
序列表
<110> 纽约市哥伦比亚大学理事会(THE TRUSTEES OF COLUMBIA UNIVERSITY IN THECITY OF NEW YORK)
<120> 用于常染色体显性疾病的基因编辑
<130> 01001/006660-W00
<150> 62/647,415
<151> 2018-03-23
<160> 49
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
ggacggtgac gtagagcgtg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
gacgaagtat ccatgcagag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
tgagaccaca aatgaatgct 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 4
aactactaca cactcaagcc tg 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 5
gtagtactgc ggctgctcga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 6
gctcatgctg ccggcgattc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)
<400> 7
ggttttggac aatggaaccg 20
<210> 8
<211> 1047
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
atgaatggca cagaaggccc taacttctac gtgcccttct ccaatgcgac gggtgtggta 60
cgcagcccct tcgagtaccc acagtactac ctggctgagc catggcagtt ctccatgctg 120
gccgcctaca tgtttctgct gatcgtgctg ggcttcccca tcaacttcct cacgctctac 180
gtcaccgtcc agcacaagaa gctgcgcacg cctctcaact acatcctgct caacctagcc 240
gtggctgacc tcttcatggt cctaggtggc ttcaccagca ccctctacac ctctctgcat 300
ggatacttcg tcttcgggcc cacaggatgc aatttggagg gcttctttgc caccctgggc 360
ggtgaaattg ccctgtggtc cttggtggtc ctggccatcg agcggtacgt ggtggtgtgt 420
aagcccatga gcaacttccg cttcggggag aaccatgcca tcatgggcgt tgccttcacc 480
tgggtcatgg cgctggcctg cgccgcaccc ccactcgccg gctggtccag gtacatcccc 540
gagggcctgc agtgctcgtg tggaatcgac tactacacgc tcaagccgga ggtcaacaac 600
gagtcttttg tcatctacat gttcgtggtc cacttcacca tccccatgat tatcatcttt 660
ttctgctatg ggcagctcgt cttcaccgtc aaggaggccg ctgcccagca gcaggagtca 720
gccaccacac agaaggcaga gaaggaggtc acccgcatgg tcatcatcat ggtcatcgct 780
ttcctgatct gctgggtgcc ctacgccagc gtggcattct acatcttcac ccaccagggc 840
tccaacttcg gtcccatctt catgaccatc ccagcgttct ttgccaagag cgccgccatc 900
tacaaccctg tcatctatat catgatgaac aagcagttcc ggaactgcat gctcaccacc 960
atctgctgcg gcaagaaccc actgggtgac gatgaggcct ctgctaccgt gtccaagacg 1020
gagacgagcc aggtggcccc ggcctaa 1047
<210> 9
<211> 1044
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
atgaatggca cagaaggccc taacttctac gtgcccttct ccaatgcgac gggtgtggta 60
cgcagcccct tcgagtaccc acagtactac ctggctgagc catggcagtt ctccatgctg 120
gccgcctaca tgtttctgct gatcgtgctg ggcttcccca tcaactttct tacactgtac 180
gtcaccgtcc agcacaagaa gctgcgcacg cctctcaact acatcctgct caacctagcc 240
gtggctgacc tcttcatggt cctaggtggc ttcaccagca ccctctacac gtcgcttcac 300
ggatatttcg tcttcgggcc cacaggatgc aatttggagg gcttctttgc caccctgggc 360
ggtgaaattg ccctgtggtc cttggtggtc ctggccatcg agcggtacgt ggtggtgtgt 420
aagcccatga gcaacttccg cttcggggag aaccatgcca tcatgggcgt tgccttcacc 480
tgggtcatgg cgctggcctg cgccgcaccc ccactcgccg gctggtccag gtacatcccc 540
gagggcctgc agtgctcgtg tggaatcgac tactacacgc tcaagccgga ggtcaacaac 600
gagtcttttg tcatctacat gttcgtggtc cacttcacca tccccatgat tatcatcttt 660
ttctgctatg ggcagctcgt cttcaccgtc aaggaggccg ctgcccagca gcaggagtca 720
gccaccacac agaaggcaga gaaggaggtc acccgcatgg tcatcatcat ggtcatcgct 780
ttcctgatct gctgggtgcc ctacgccagc gtggcattct acatcttcac ccaccagggc 840
tccaacttcg gtcccatctt catgaccatc ccagcgttct ttgccaagag cgccgccatc 900
tacaaccctg tcatctatat catgatgaac aagcagttcc ggaactgcat gctcaccacc 960
atctgctgcg gcaagaaccc actgggtgac gatgaggcct ctgctaccgt gtccaagacg 1020
gagacgagcc aggtggcccc ggcc 1044
<210> 10
<211> 797
<212> DNA
<213> 原鸡(Gallus gallus)
<400> 10
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60
gacgtcaata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg 120
gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 180
cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttgtgcccag tacatgacct tatgggactt 240
tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtcg aggtgagccc 300
cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt 360
tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggggggc gcgcgccagg 420
cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa 480
tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta 540
taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgacg ctgccttcgc cccgtgcccc 600
gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg 660
tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta gctgagcaag aggtaagggt 720
ttaagggatg gttggttggt ggggtattaa tgtttaatta cctggagcac ctgcctgaaa 780
tcactttttt tcaggtt 797
<210> 11
<211> 232
<212> DNA
<213> 普通牛(Bos taurus)
<400> 11
taagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc 60
cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa 120
atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg 180
ggcaggacag caagggggag gattgggaag agaatagcag gcatgctggg ga 232
<210> 12
<211> 249
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacacc 249
<210> 13
<211> 130
<212> DNA
<213> 腺相关病毒-2(Adeno-associated virus-2)
<400> 13
cgcgctcgct cgctcactga ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc gacctttggt 60
cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc catcactagg 120
ggttccttgt 130
<210> 14
<211> 173
<212> DNA
<213> 人疱疹病毒5 (Human herpesvirus 5)
<400> 14
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 60
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta ataaccccgc cccgttgacg caaatgggcg 120
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgt 173
<210> 15
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 15
gactataagg accacgacgg agactacaag gatcatgata ttgattacaa agacgatgac 60
gataag 66
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 猿猴病毒40 (Simian virus 40)
<400> 16
ccaaagaaga agcggaaggt c 21
<210> 17
<211> 4101
<212> DNA
<213> 化脓性链球菌 (Streptococcus pyogenes)
<400> 17
gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 60
accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120
agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 180
acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 240
ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 300
gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360
atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 420
ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 480
atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540
gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 600
aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 660
ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg 720
attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 780
gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840
atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 900
ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 960
atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1020
cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1080
tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1140
aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1200
cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1260
attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1320
aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1380
ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1440
gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1500
ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1560
aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1620
ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1680
aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1740
ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1800
aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1860
accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 1920
ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 1980
ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2040
ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2100
ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2160
gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2220
aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2280
gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2340
aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2400
gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2460
atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2520
gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2580
aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2640
tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2700
aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2760
gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2820
aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 2880
ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 2940
caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3000
cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3060
atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3120
atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3180
ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3240
accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3300
acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3360
agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3420
tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3480
gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3540
ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3600
tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3660
aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3720
tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3780
cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3840
ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 3900
atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 3960
gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4020
gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4080
ctgtctcagc tgggaggcga c 4101
<210> 18
<211> 48
<212> DNA
<213> 非洲爪蟾 (Xenopus laevis)
<400> 18
aaaaggccgg cggccacgaa aaaggccggc caggcaaaaa agaaaaag 48
<210> 19
<211> 49
<212> DNA
<213> 欧洲野兔 (Oryctolagus cuniculus)
<400> 19
aataaaagat ctttattttc attagatctg tgtgttggtt ttttgtgtg 49
<210> 20
<211> 508
<212> DNA
<213> 人疱疹病毒5 (Human herpesvirus 5)
<400> 20
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480
acggtgggag gtctatataa gcagagct 508
<210> 21
<211> 720
<212> DNA
<213> 维多利亚水母 (Aequorea victoria)
<400> 21
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 22
<211> 9175
<212> DNA
<213> 化脓性链球菌 (Streptococcus pyogenes)
<400> 22
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360
agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420
aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840
ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 900
gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 960
ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgacgc 1020
tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg 1080
accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag 1140
ctgagcaaga ggtaagggtt taagggatgg ttggttggtg gggtattaat gtttaattac 1200
ctggagcacc tgcctgaaat cacttttttt caggttggac cggtgccacc atggactata 1260
aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta caaagacgat gacgataaga 1320
tggccccaaa gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt 1380
acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt 1440
acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga 1500
agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga 1560
agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga 1620
tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct 1680
tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg 1740
aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca 1800
gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc 1860
ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt 1920
tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg 1980
gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc 2040
tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga 2100
gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc 2160
agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc 2220
agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca 2280
tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat 2340
acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg 2400
agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg 2460
gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg 2520
gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct 2580
tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc 2640
ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga 2700
ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga 2760
tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg 2820
gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg 2880
agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga 2940
ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga 3000
aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga 3060
aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag 3120
atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg 3180
acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac 3240
tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg 3300
acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga 3360
agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt 3420
ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta 3480
aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg 3540
ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg 3600
acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca 3660
gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg 3720
aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc 3780
agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg 3840
accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga 3900
gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg 3960
gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc 4020
agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga 4080
gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc 4140
ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg 4200
agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg 4260
atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc 4320
acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg 4380
aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga 4440
gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact 4500
ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga 4560
caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga 4620
aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct 4680
tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg 4740
actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg 4800
tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg 4860
ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca 4920
agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg 4980
agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg 5040
aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc 5100
tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact 5160
acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg 5220
ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc 5280
aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca 5340
agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg 5400
ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc 5460
tgggaggcga caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagg 5520
aattcggcag tggagagggc agaggaagtc tgctaacatg cggtgacgtc gaggagaatc 5580
ctggcccaat gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca 5640
gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg 5700
atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg 5760
ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca 5820
cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt 5880
tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc 5940
ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg tcggagtctc gcccgaccac cagggcaagg 6000
gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg 6060
ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg 6120
tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg 6180
gtgcctgaga attctaacta gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca 6240
gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac 6300
tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat 6360
tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaga atagcaggca 6420
tgctggggag cggccgcagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc 6480
tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc 6540
ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagctg cctgcagggg cgcctgatgc ggtattttct 6600
ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catacgtcaa agcaaccata gtacgcgccc 6660
tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt 6720
gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc 6780
ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta 6840
cggcacctcg accccaaaaa acttgatttg ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc 6900
tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg 6960
ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcgggctatt cttttgattt ataagggatt 7020
ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat 7080
tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttta tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat 7140
gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct 7200
tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt 7260
cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta 7320
tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg 7380
ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 7440
ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt 7500
attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 7560
gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg 7620
ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa 7680
cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt 7740
gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag 7800
tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt 7860
gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga 7920
ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt 7980
tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta 8040
gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 8100
caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 8160
cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg aagccgcggt 8220
atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg 8280
gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 8340
attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 8400
cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 8460
atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 8520
tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 8580
ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 8640
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 8700
cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 8760
gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 8820
gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 8880
acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 8940
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 9000
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 9060
tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 9120
agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgt 9175
<210> 23
<211> 380
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 23
tcccttaacc accgaaggca gggcagcagg ctagtggagc agagctgcgt ggtcaagtgg 60
cagggagctt aagaatcgtc caagggcgga gaccagtaag tctcattagg tgatggggcc 120
agcaggtaaa agccattcat gcttatgtcc agctgggcgt gtgttctctt cctgttttat 180
catcccttgc gctgaccatc aggtacatcc ctgagggcat gcaatgttca tgcgggattg 240
actattatac ccttaagccg gaggtcaaca acgaatcctt tgtcatctac atgttcgtgg 300
tccacttcac cattcctatg atcgtcatct tcttctgcta tgggcagctg gtcttcacag 360
tcaaggaggt atgagcaggg 380
<210> 24
<211> 1958
<212> DNA
<213> 未知的(Unknown)
<220>
<223> 未知的描述：小鼠或人多核苷酸
<400> 24
atgctcacct gaataacctg gcagcctgct ccctcatgca gggaccacgt cctgctgcac 60
ccagcaggcc atcccgtctc catagcccat ggtcatccct ccctggacag gaatgtgtct 120
cctccccggg ctgagtcttg ctcaagctag aagcactccg aacagggtta tgggcgcctc 180
ctccatctcc caagtggctg gcttatgaat gtttaatgta catgtgagtg aacaaattcc 240
aattgaacgc aacaaatagt tatcgagccg ctgagccggg gggcgggggg tgtgagactg 300
gaggcgatgg acggagctga cggcacacac agctcagatc tgtcaagtga gccattgtca 360
gggcttgggg actggataag tcagggggtc tcctgggaag agatgggata ggtgagttca 420
ggaggagaca ttgtcaactg gagccatgtg gagaagtgaa tttagggccc aaaggttcca 480
gtcgcagcct gaggccacca gactgacatg gggaggaatt cccagaggac tctggggcag 540
acaagatgag acaccctttc ctttctttac ctaagggcct ccacccgatg tcaccttggc 600
ccctctgcaa gccaattagg ccccggtggc agcagtggga ttagcgttag tatgatatct 660
cgcggatgct gaatcagcct ctggcttagg gagagaaggt cactttataa gggtctgggg 720
ggggtcagtg cctggagttg cgctgtggga gcgagtcatc cagctggagc cctgagtggc 780
tgagctcagg ccttcgcagc attcttgggt gggagcagcc acgggtcagc cacaagggcc 840
acagccatga atggcacaga aggccctaac ttctacgtgc ccttctccaa tgcgacgggt 900
gtggtacgca gccccttcga gtacccacag tactacctgg ctgagccatg gcagttctcc 960
atgctggccg cctacatgtt tctgctgatc gtgctgggct tccccatcaa cttcctcacg 1020
ctctacgtca ccgtccagca caagaagctg cgcacgcctc tcaactacat cctgctcaac 1080
ctagccgtgg ctgacctctt catggtccta ggtggcttca ccagcaccct ctacacctct 1140
ctgcatggat acttcgtctt cgggcccaca ggatgcaatt tggagggctt ctttgccacc 1200
ctgggcggta tgagcagaga gactggggcg ggggggtgta gcatgggagc caaggggcca 1260
cgaaagggcc tgggagggtc tgcagcttac ttgagtctct ttaattggtc tcatctaaag 1320
gcccagctta ttcattggca aacactgtga ccctgagcta ggctgctgtt gagagcaggc 1380
acggaacatt catctatctc atcttgagca atgcaagaaa catgggttca gagaggccaa 1440
ggactcaccg aggagtcaca gagtgtgggg gtgtcctctg aggcagctga gctggggcac 1500
acacagactg agcaccagga gtgagctcta gctttttttt ttctatgtgt cttttctaaa 1560
agacacatag gtttaggact gtccctggtc caggtaagaa ctggttcagt aaacttgtac 1620
atctcactgc ctggccagcc ctgtcagctt ccaccagagt gcgtgcacta cacacccggc 1680
atctcaaagg attcattcct atctttccta tctttggagt gaggcacagt ctcacgtagt 1740
ccagtccaga ctggccttaa attctgcagc tgaggatgta cttaaacttg tcatcctcct 1800
gccccagcct ctcaagtgct gtgatcacag gcacggacca ctatgctacg ccaggtgttt 1860
ccaaacattt tctctccctt aactggaagg tcaatgaggc tctttcgaga agcaacagag 1920
cctgtttagc tgagaaaact gaggcaggga gcaggcaa 1958
<210> 25
<211> 1958
<212> DNA
<213> 未知的(Unknown)
<220>
<223> 未知的描述：小鼠或人多核苷酸
<400> 25
atgctcacct gaataacctg gcagcctgct ccctcatgca gggaccacgt cctgctgcac 60
ccagcaggcc atcccgtctc catagcccat ggtcatccct ccctggacag gaatgtgtct 120
cctccccggg ctgagtcttg ctcaagctag aagcactccg aacagggtta tgggcgcctc 180
ctccatctcc caagtggctg gcttatgaat gtttaatgta catgtgagtg aacaaattcc 240
aattgaacgc aacaaatagt tatcgagccg ctgagccggg gggcgggggg tgtgagactg 300
gaggcgatgg acggagctga cggcacacac agctcagatc tgtcaagtga gccattgtca 360
gggcttgggg actggataag tcagggggtc tcctgggaag agatgggata ggtgagttca 420
ggaggagaca ttgtcaactg gagccatgtg gagaagtgaa tttagggccc aaaggttcca 480
gtcgcagcct gaggccacca gactgacatg gggaggaatt cccagaggac tctggggcag 540
acaagatgag acaccctttc ctttctttac ctaagggcct ccacccgatg tcaccttggc 600
ccctctgcaa gccaattagg ccccggtggc agcagtggga ttagcgttag tatgatatct 660
cgcggatgct gaatcagcct ctggcttagg gagagaaggt cactttataa gggtctgggg 720
ggggtcagtg cctggagttg cgctgtggga gcgagtcatc cagctggagc cctgagtggc 780
tgagctcagg ccttcgcagc attcttgggt gggagcagcc acgggtcagc cacaagggcc 840
acagccatga atggcacaga aggccctaac ttctacgtgc ccttctccaa tgcgacgggt 900
gtggtacgca gccccttcga gtacccacag tactacctgg ctgagccatg gcagttctcc 960
atgctggccg cctacatgtt tctgctgatc gtgctgggct tccccatcaa cttcctcacg 1020
ctctacgtca ccgtccagca caagaagctg cgcacgcctc tcaactacat cctgctcaac 1080
ctagccgtgg ctgacctctt catggtccta ggtggcttca ccagcaccct ctacacctct 1140
ctgcatggat acttcgtctt cgggcccaca ggacgcaatt tggagggctt ctttgccacc 1200
ctgggcggta tgagcagaga gactggggcg ggggggtgta gcatgggagc caaggggcca 1260
cgaaagggcc tgggagggtc tgcagcttac ttgagtctct ttaattggtc tcatctaaag 1320
gcccagctta ttcattggca aacactgtga ccctgagcta ggctgctgtt gagagcaggc 1380
acggaacatt catctatctc atcttgagca atgcaagaaa catgggttca gagaggccaa 1440
ggactcaccg aggagtcaca gagtgtgggg gtgtcctctg aggcagctga gctggggcac 1500
acacagactg agcaccagga gtgagctcta gctttttttt ttctatgtgt cttttctaaa 1560
agacacatag gtttaggact gtccctggtc caggtaagaa ctggttcagt aaacttgtac 1620
atctcactgc ctggccagcc ctgtcagctt ccaccagagt gcgtgcacta cacacccggc 1680
atctcaaagg attcattcct atctttccta tctttggagt gaggcacagt ctcacgtagt 1740
ccagtccaga ctggccttaa attctgcagc tgaggatgta cttaaacttg tcatcctcct 1800
gccccagcct ctcaagtgct gtgatcacag gcacggacca ctatgctacg ccaggtgttt 1860
ccaaacattt tctctccctt aactggaagg tcaatgaggc tctttcgaga agcaacagag 1920
cctgtttagc tgagaaaact gaggcaggga gcaggcaa 1958
<210> 26
<211> 469
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 26
tgagagatga ggtagggtgg cgcccatctc gagggcagct tgcgtgagca caggcagcct 60
tcttgccatt ggctgaggct gtcattgccg tcaccacttc gggtgggcac cggaagaaga 120
gtgaccttat tgccagcacc atttctcaaa cgttgtctaa ttcttttctc tagagcctga 180
atatcttcca gaatctcaac cgacgtcaac acgagcatgc gatccacatg atggacatcg 240
cgatcattgc cacagacctt gccttgtatt tcaagtgggt atttctcctc actttaatag 300
tagcagtgtg ggggctggag agatggttca gtggttaaca gcactgactg ctcttccaga 360
ggtcctgagt tcaaatccca gcaaccacat ggtggctcac aactatctgt aatgggatct 420
gataccctct tctggtgtgt gtctgaagac agcgatggag tactcacat 469
<210> 27
<211> 128
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
tagttagtaa actctttgac cctacatctc tacagatata aatgagtgtg agaccacaaa 60
cgagtgccgg gaggatgaaa tgtgttggaa ttatcatggc ggcttccgtt gttatccacg 120
aaatcctt 128
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
ccttcgtcca gccgcagag 19
<210> 29
<211> 13
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
tggaagggta ggt 13
<210> 30
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
gaggagctga aacctactgt agggaaaggt gcggac 36
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
agaggagctg aaacctaccc g 21
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
gagaggagct gaaacctacc cggggtca 28
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 33
ctctcctcga ctttggatgg gccccagt 28
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 34
cacagccagg aatggaccat 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 35
atggtccatt cctggctgtg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 36
taagtgtgca agtcagaaca 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 37
cagcagctga ggtttaaagg 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 38
gtctgaggct gagtatcggg 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 39
ggtctcgcta tgttgctcag 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 40
agaggagctg aaacctaccc 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 41
gaggagctga aacctacccg 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 42
ccacaaagga gtccttgtct 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 43
ttagagtagt tttaggttca 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 44
ttcttgggtg ggagcagcca 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 45
ttcttgggtg ggagcagccg 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 46
tgaaggccaa gttcccaatg 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 47
tgaaggccaa gttcccagtg 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 48
ggacggtgac gtagagcgtg 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 49
gacgaagtat ccatgcagag 20

Claims (56)

1.一种用于修饰细胞中的常染色体显性疾病相关基因的方法，所述方法包括：
将所述细胞与至少一种类型的编码针对所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统的载体接触，其中所述常染色体显性疾病相关基因涉及眼病，其中所述至少一种类型的载体包含：
(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；
(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和，
(iii)编码Cas核酸酶的第三序列，
其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一引导RNA包含选自SEQ ID NO:40、SEQ.IDNO.41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的核苷酸序列或其各自的等同物。
3.一种用于修饰细胞中的常染色体显性疾病相关基因的方法，所述方法包括：将所述细胞与至少一种类型的编码针对所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统的载体接触，其中所述常染色体显性疾病相关基因与眼病相关，其中所述至少一种类型的载体包含：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与所述常染色体显性疾病相关中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；和，(ii)编码催化缺陷型Cas核酸酶(dCas)的第二序列；
其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述第二引导RNA包含选自SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39的核苷酸序列或其各自的等同物。
5.如权利要求1或3所述的方法，其中所述细胞是诱导的多潜能干细胞(iPSC)。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述iPSC源自受试者的成纤维细胞。
7.如权利要求5所述的方法，所述方法还包括培养所述iPSC以分化成视网膜色素上皮(RPE)细胞。
8.如权利要求7所述的方法，所述方法还包括向受试者施用所述RPE细胞。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述RPE细胞对于所述受试者是自体的。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述RPE细胞通过视网膜下移植来施用。
11.如权利要求1或3所述的方法，其中所述细胞对于所述SNP是杂合的。
12.如权利要求1或3所述的方法，其中所述细胞对于具有突变型等位基因和野生型等位基因的所述常染色体显性疾病相关基因是杂合的。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述常染色体显性疾病相关基因包含选自SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的序列或其各自的等同物。
14.如权利要求1或3至13中任一项所述的方法，其中与所述常染色体显性疾病相关基因杂交的所述第一引导RNA包含SEQ ID NO:31的序列。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶不切割或不靶向编码所述常染色体显性疾病相关基因的所述野生型等位基因。
16.一种用于治疗受试者的常染色体显性眼病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的至少一种类型的载体，所述载体编码针对所述受试者中常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统，其中所述至少一种类型的载体包含：
(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因中单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；
(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和，
(iii)编码Cas核酸酶的第三序列，
其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。
17.一种用于治疗受试者的常染色体显性眼病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的至少一种类型的载体，所述载体编码针对所述受试者中常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统，其中所述至少一种类型的载体包含：
(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；和，
(ii)编码催化缺陷型Cas核酸酶(dCas)的第二序列，
其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中所述受试者对于所述SNP是杂合的。
19.如权利要求16或17所述的方法，其中所述受试者对于具有突变型等位基因和野生型等位基因的所述常染色体显性疾病相关基因是杂合的。
20.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述SNP的变体和所述突变型等位基因在同一条染色体上。
21.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述SNP存在于所述常染色体显性疾病相关基因的非编码区中。
22.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述SNP存在于所述常染色体显性疾病相关基因的转录起始位点(TSS)区域中。
23.如权利要求1或16所述的方法，其中所述Cas核酸酶是Cas切口酶。
24.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶是Cas9。
25.如权利要求3或17所述的方法，其中所述dCas与阻遏物结构域融合。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述阻遏物结构域是Krüppel相关盒(KRAB)结构域。
27.如权利要求3或17所述的方法，其中所述第一引导RNA包含至少一个PUF(PumiliomRNA结合因子)结合序列。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述至少一个PUF结合序列与PUF-KRAB结合。
29.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述常染色体显性疾病相关基因是BEST1。
30.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述SNP的变体是rs972353:GSNP、rs972355:G SNP或rs2668899 SNP。
31.如权利要求1或16所述的方法，其中所述第二引导RNA与BEST1的内含子1杂交。
32.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述至少一种类型的载体是至少一种类型的重组腺相关病毒(AAV)载体。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述至少一种类型的重组AAV载体是至少一种类型的AAV2载体。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述至少一种类型的重组AAV载体是至少一种类型的AAV8载体。
35.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述常染色体显性疾病相关基因选自由以下组成的组：PRDM13、RGR、TEAD1、AIPL1、CRX、GUCA1A、GUCY2D、PITPNM3、PROM1、PRPH2、RIMS1、SEMA4A、UNC119、GNAT1、PDE6B、RHO、WSF1、IMPDH1、OTX2、BEST1、C1QTNF5、CTNNA1、EFEMP1、ELOVL4、FSCN2、GUCA1B、HMCN1、IMPG1、RP1L1、TIMP3、VCAN、MFN2、NR2F1、OPA1、ARL3、CA4、HK1、KLHL7、NR2E3、NRL、PRPF3、PRPF4、PRPF6、PRPF8、PRPF31、RDH12、ROM1、RP1、RP9、RPE65、SNRNP200、SPP2、TOPORS、ABCC6、ATXN7、COL11A1、COL2A1、JAG1、KCNJ13、KIF11、OPA3、PAX2、TREX1、CAPN5、CRB1、FZD4、ITM2B、LRP5、MAPKAPK3、MIR204、OPN1SW、RB1、TSPAN12和ZNF408。
36.如权利要求1或16所述的方法，其中向所述受试者施用两种类型的重组AAV载体，其中第一类型的重组AAV载体包含所述第一序列和所述第二序列，并且其中第二类型的重组AAV载体包含所述第三序列。
37.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述眼病选自由以下组成的组：卵黄状黄斑营养不良(VMD)、Best卵黄状黄斑营养不良、常染色体显性脉络膜视网膜萎缩或变性、常染色体显性视锥或视锥-视杆营养不良、常染色体显性先天性静止性夜盲症、常染色体显性利伯先天性黑蒙症、常染色体显性黄斑变性、常染色体显性眼-视网膜发育疾病、常染色体显性视神经萎缩、常染色体显性视网膜色素变性、伴有视网膜病的常染色体显性综合征/系统性疾病、索斯比黄斑营养不良、年龄相关性黄斑变性、多因蜂窝状黄斑病和青少年黄斑变性。
38.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述眼病是年龄相关性黄斑变性。
39.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述眼病是青少年黄斑变性。
40.如权利要求16或17所述的方法，其中所述至少一种类型的载体通过注射到所述受试者的眼中来施用。
41.如权利要求16至40中任一项所述的方法，其中所述常染色体显性疾病相关基因包含选自SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的序列。
42.如权利要求16至41中任一项所述的方法，其中与所述常染色体显性疾病相关基因杂交的所述第一引导RNA包含SEQ ID NO:31的序列。
43.如权利要求16至42中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶不切割或不靶向编码所述常染色体显性疾病相关基因的野生型等位基因。
44.一种包含至少一种类型的载体的系统：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；(ii)编码第二引导RNA的第二序列，所述第二引导RNA与所述常染色体显性疾病相关基因的内含子杂交；和，(iii)编码Cas核酸酶的第三序列，其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。
45.如权利要求44所述的系统，其中所述第一引导RNA包含选自SEQ ID NO:40、SEQ.IDNO.41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的核苷酸序列或其各自的等同物。
46.如权利要求44所述的系统，其中所述Cas核酸酶是Cas切口酶。
47.如权利要求44所述的系统，其中所述Cas核酸酶是Cas9。
48.一种包含至少一种类型的载体的系统：(i)编码第一引导RNA的第一序列，所述第一引导RNA与包含单核苷酸多态性(SNP)的常染色体显性疾病相关基因中的单核苷酸多态性(SNP)的变体杂交；和，(ii)编码催化缺陷型Cas核酸酶(dCas)的第二序列；其中所述Cas核酸酶仅切割或靶向编码包含单核苷酸多态性(SNP)的所述常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因。
49.如权利要求48所述的系统，其中所述第二引导RNA包含选自SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39的核苷酸序列或其各自的等同物。
50.如权利要求48所述的系统，其中所述dCas与阻遏物结构域融合。
51.如权利要求48所述的系统，其中所述阻遏物结构域是Krüppel相关盒(KRAB)结构域。
52.如权利要求48所述的系统，其中所述第一引导RNA包含至少一个PUF(Pumilio mRNA结合因子)结合序列。
53.如权利要求52所述的系统，其中所述至少一个PUF结合序列与PUF-KRAB结合。
54.如权利要求16或17所述的方法，所述方法还包括在向所述受试者施用治疗有效量的至少一种类型的载体之前对所述受试者进行基因分型的步骤，所述载体编码针对所述受试者中的常染色体显性疾病相关基因的突变型等位基因的CRISPR-Cas系统。
55.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述常染色体显性疾病相关基因是RHO。
56.如权利要求1、3、16或17中任一项所述的方法，其中所述SNP的变体是rs7984:GSNP、rs7984:A SNP、rs2855558:G SNP或rs2855558:A SNP。
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