JP2024515827A - 多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介標的遺伝子活性化システム - Google Patents

多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介標的遺伝子活性化システム Download PDF

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チャオ ワン，
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Abstract

多重ｃｒＲＮＡおよび多重ｓｇＲＮＡ、ならびにそれらのＲＮＡ分子が本明細書で提供される。多重標的化遺伝子活性化（ｍＴＧＡ）システムで使用することができる、多重ｃｒＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含む組成物およびキットも提供される。治療有効量のｍＴＧＡシステムを対象に投与することを含む方法も提供される。いくつかの例では、本方法は、Ｉ型糖尿病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、肝疾患、または急性腎疾患などの遺伝子の発現の減少または非発現に関連する疾患を処置する。

Description

関連出願への相互参照
これは、参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年４月２８日に出願された米国仮出願第６３／１８１，０５９号の利益を主張する。
分野
本出願は、多重ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および多重単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ならびに多重ｃｒＲＮＡおよび多重ｓｇＲＮＡを含む組成物およびキットを提供し、これらは、例えば、遺伝子の発現を増加させるため、細胞を再プログラムするため、またはインビボで疾患を処置するために、多重標的化遺伝子活性化（ｍＴＧＡ）システムで使用することができる。
背景
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、致死的な筋萎縮性疾患であり、世界中で最も頻度の高い遺伝性障害の１つであり、３，５００～５，０００人の男性の出生に１人が罹患する。ＤＭＤは、進行性の筋力低下をもたらし、最終的には１０代で呼吸不全および心不全をもたらす（Ｂｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ８２：２９１－３２９）。ＤＭＤはジストロフィン遺伝子におけるフレームシフト変異によって引き起こされ、コード領域全体にわたって少なくとも７２６の異なる変異が同定されている（Ｂｌａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ ３６：３９５－４０２）。この遺伝子内には、エクソン４５～５３を含むいくつかの変異「ホットスポット」があり、そのうちエクソン５１が最も頻繁に変異しており、ＤＭＤ症例の約１３％を占める。現在、ＤＭＤに対する有効な治療はなく、疾患進行を停止させるために損傷臓器に筋幹細胞を移植することは困難であることが判明している。ジストロフィン遺伝子のサイズが大きいため（ｃＤＮＡは約１４ｋｂである）、従来のウイルス媒介遺伝子治療を介して機能性ジストロフィン導入遺伝子を罹患組織に送達することも困難であることも証明されている（Ｊａｎｇｈｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＰｌｏＳ ｏｎｅ １１，ｅ０１５０８１８；Ｓｉｃｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１５７８－１５８０）。
最近、いくつかのグループが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して変異エクソンを除去することによってジストロフィン遺伝子機能を回復させ、それによってジストロフィン遺伝子の短縮型であるが機能的なバージョンを作り出した（Ａｍｏａｓｉｉ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２：８６－９１；Ａｍｏａｓｉｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２９：９（４１８）；Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １４：８，１４４５４；Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１：４００－４０３；Ｍｏｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｎａｔ Ｍｅｄ ２６：２０７－２１４；Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１：４０３－４０７；Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔ Ｍｅｄ ２５：４２７－４３２；Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１：４０７－４１１；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉ Ａｄｖ ３，ｅ１６０２８１４）。この方法は有望性を示しているが、ジストロフィン遺伝子内のいくつかのエクソンはタンパク質機能に重要であり、疾患を治癒するために除去することはできない。ＤＭＤ患者の５５％のみが、これらのエクソンスキッピング／切除治療から潜在的に利益を受け得る（Ｂｌａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ ３６：３９５－４０２）。したがって、ＤＭＤにおいて筋機能を回復させるための代替アプローチ、特に、患者がどのジストロフィン変異を保有しているかにかかわらず有効なアプローチが必要とされている。
ユートロフィンはジストロフィンの機能的アナログであり、したがって、ＤＭＤ患者におけるジストロフィンの喪失を補償することができる可能性が高い（Ｒａｆａｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ Ｇｅｎ １９，７９－８２；Ｔｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８４：３４９－３５３）。したがって、潜在的な処置戦略は、ＤＭＤ患者のユートロフィンを上方調節することである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、標的ＤＮＡにおいて二本鎖切断を誘導する代わりに、転写活性化ドメインを標的プロモーター領域に動員することによって標的とした遺伝子発現を誘導するように改変することができる（Ｑｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５２：１１７３－１１８３；Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｅｌｌ １７１：１４９５－１５０７ ｅ１４１５）。しかしながら、ＤＭＤの処置のためにこのシステムを実施する際の主な障害は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子活性化システムによるユートロフィン誘導が制限されており、より堅牢なシステムが必要であることである。
Ｂｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ８２：２９１－３２９ Ｂｌａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ ３６：３９５－４０２ Ｊａｎｇｈｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＰｌｏＳ ｏｎｅ １１，ｅ０１５０８１８ Ｓｉｃｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１５７８－１５８０ Ａｍｏａｓｉｉ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２：８６－９１ Ａｍｏａｓｉｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２９：９（４１８） Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １４：８，１４４５４ Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１：４００－４０３ Ｍｏｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｎａｔ Ｍｅｄ ２６：２０７－２１４ Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１：４０３－４０７ Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔ Ｍｅｄ ２５：４２７－４３２ Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１：４０７－４１１ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉ Ａｄｖ ３，ｅ１６０２８１４ Ｒａｆａｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ Ｇｅｎ １９，７９－８２ Ｔｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８４：３４９－３５３ Ｑｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５２：１１７３－１１８３ Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｅｌｌ １７１：１４９５－１５０７ ｅ１４１５
概要
多重ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および多重単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする核酸分子（ＤＮＡ分子など）が本明細書で提供される。コードされた多重ｃｒＲＮＡは、改変トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする核酸分子に作動可能に連結された第１のプロモーター、第１の切断部位、第１のｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸分子、第２の切断部位、および第２のｃｒＲＮＡをコードする第２の核酸分子を含む。改変ｔｒａｃｒＲＮＡは、少なくとも２つの改変ＭＳ２結合ループをコードする。いくつかの実施形態では、コードされた多重ｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡまたはデッドガイドＲＮＡ（ｄｅａｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）（ｄｇＲＮＡ）をコードする第３の核酸分子に作動可能に連結された第２のプロモーターをさらに含む。いくつかの例では、第２のプロモーターおよび第３のｃｒＲＮＡ（またはｄｇＲＮＡ）は、第１のプロモーターに対して逆配向である。いくつかの例では、第２のプロモーターおよび第３のｃｒＲＮＡ（またはｄｇＲＮＡ）は、第１のプロモーターの５’に位置する。いくつかの例では、第１の切断部位はプレトランスファーＲＮＡ（プレｔＲＮＡ）であり、第２の切断部位はハンマーヘッドリボザイムなどの自己切断リボザイムである。さらなる例では、本明細書に開示されるｃｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡは、ＥＥＦ１α２（真核生物翻訳伸長因子１α２）、Ｆｓｔ（フォリスタチン）、Ｐｄｘ１（膵臓および十二指腸ホメオボックス１）、クロトー、ユートロフィン、インターロイキン１０、またはＳｉｘ２（ＳＩＸホメオボックス２）のプロモーター領域内の配列に相補的な標的化配列を含む。
また、多重単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする核酸（ＤＮＡ分子など）も本明細書で提供される。多重ｓｇＲＮＡは、第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の改変ｓｇＲＮＡを逆配向にコードする第１の核酸分子と、第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の改変ｓｇＲＮＡを順配向にコードする第２の核酸分子と、を含む。第１および第２の改変ｓｇＲＮＡは、少なくとも２つの改変ＭＳ２結合ループをコードする。いくつかの実施形態では、多重ｓｇＲＮＡは、第２の核酸分子の３’に位置する第３の核酸分子をさらに含み、第３の核酸は、第１の切断部位および第３の改変ｓｇＲＮＡを順配向にコードする。いくつかの実施形態では、多重ｓｇＲＮＡは、第１の核酸分子の５’に位置する第４の核酸分子をさらに含み、第４の核酸分子は、第２の切断部位および第４の改変ｓｇＲＮＡを逆配向にコードする。第３および第４の改変ｓｇＲＮＡは、少なくとも２つの改変ＭＳ２結合ループをコードする。いくつかの例では、第１および／または第２の切断部位はプレｔＲＮＡをコードする。いくつかの例では、本明細書中に開示されるｓｇＲＮＡは、ＥＥＦ１α２、Ｆｓｔ、Ｐｄｘ１、クロトー、ユートロフィン、インターロイキン１０またはＳｉｘ２のプロモーター領域内の配列に相補的な標的化配列を含む。いくつかの例では、ｓｇＲＮＡはｄｇＲＮＡである。
開示される核酸によってコードされるＲＮＡ分子、および開示される核酸を含むベクター（多重ｃｒＲＮＡまたは多重ｓｇＲＮＡをコードする核酸など）、例えばウイルスベクター、例えばＡＡＶ９ベクターなどのＡＡＶベクターも提供される。開示される核酸、またはそのＲＮＡ分子、または開示されるベクター、および薬学的に許容され得る担体を含む組成物も提供される。
開示される核酸、ＲＮＡ、組成物またはウイルスベクター、ならびにＣａｓ９タンパク質またはデッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質をコードする核酸、および／またはＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸を含むキットも提供される。
多重標的化遺伝子活性化（ｍＴＧＡ）システムも提供される。システムは、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９をコードする核酸を含む第１のベクター（例えばウイルスベクター、例えばＡＡＶ９）と、本明細書に開示される核酸（例えば、多重ｃｒＲＮＡまたは多重ｓｇＲＮＡをコードする核酸）およびＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質（例えば、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１）をコードする核酸を含む第２のベクター（例えばウイルスベクター、例えばＡＡＶ９）とを含み得る。
開示される核酸、ＲＮＡ、組成物、ウイルスベクター、キットおよびｍＴＧＡシステムを使用する方法も提供される。本方法は、治療有効量の開示されたｍＴＧＡシステムを対象に投与することを含む。いくつかの例では、本方法は、対象における少なくとも１つの標的遺伝子の発現を増加させ、それにより、少なくとも１つの遺伝子産物の発現を増加させる。いくつかの例では、本方法は、遺伝子の発現の減少または非発現によって引き起こされるか、またはそれに関連する対象の疾患を処置する。いくつかの例では、標的遺伝子は、発現の減少が疾患を引き起こす遺伝子（原因遺伝子）である。さらなる例では、標的遺伝子は原因遺伝子の機能的アナログであり、機能的アナログの発現は原因遺伝子の機能の損失を補償する。いくつかの例では、疾患は筋ジストロフィーであり、原因遺伝子はジストロフィンであり、標的遺伝子はユートロフィンである。いくつかの例では、疾患は肝線維症または肝硬変であり、標的遺伝子はＦｏｘａ３、Ｇａｔａ４、ＨＮＦ１ａおよび／またはＨＮＦ４ａである。
本開示の上記および他の目的および特徴は、添付の図面を参照して進行する以下の詳細な説明からより明らかになる。
図１は、２つのｃｒＲＮＡ１０１、１０２を含有する例示的なコード多重ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）構築物１００を示す。 図２Ａ～２Ｂは、２つのｃｒＲＮＡと、第２のプロモーター１１１に作動可能に連結された第３のｃｒＲＮＡまたはｄｇＲＮＡをコードする第３の核酸分子１０３と、を含む、例示的なコード多重ｃｒＲＮＡ構築物１００を示す。第３の核酸分子１０３は、第２のｃｒＲＮＡの３’（図２Ａ）または第１のプロモーターの５’（図２Ｂ）に位置し得る。いくつかの実施形態では、第３の核酸分子は、第１のプロモーターの５’に位置し、第１のプロモーターに対して逆配向である（図２Ｂ）。 図３Ａ～３Ｅは、例示的なコード多重単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）構築物２００を示す。図３Ａ、図３Ｃおよび図３Ｄは、２つのｓｇＲＮＡを含有する例示的なＤＮＡ構築物を示す。図３Ｂおよび３Ｅは、３つのｓｇＲＮＡを含有する例示的なＤＮＡ構築物を示す。 図４は、４つのｓｇＲＮＡを含有する例示的なコード多重単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）構築物２００を示す。 図５は、ユートロフィン遺伝子座の異なる領域を標的とするｄｇＲＮＡのユートロフィン活性化を示す（示される配列は、配列番号５６である）。 図６Ａは、トランスフェクションの２日後にｑＲＴ－ＰＣＲによって分析したユートロフィン（Ｕｔｒｎ）の活性化を示す。Ｃａｓ９発現Ｎ２ａ（Ｎ２ａＣａｓ９）細胞を、ｄｇＲＮＡを標的とするユートロフィンとＭＰＨを含有するプラスミドとの示された組み合わせでトランスフェクトした。図６Ｂは、Ｅｅｆ１ａ２発現のｄｇＲＮＡ活性化を示す。 図７は、Ｎ２ａＣａｓ９細胞におけるＵｔｒｎのウエスタンブロット（上）および相対タンパク質レベル（下）を示す。ｄｇＥｅｆ１ａ２とｄｇＵｔｒｎＮＴ２との組み合わせは、ユートロフィンの上方調節を有意に増強する。 図８は、１つのｓｇＲＮＡ（上）または多重ｓｇＲＮＡ（中央および下）を含有するＡＡＶベクターの概略図を示す。 図９は、マウスＮ２細胞における異なるプロモーターの効率を示す。Ｃａｓ９発現Ｎ２ａ（Ｎ２ａＣａｓ９）細胞を、示されたプラスミドおよびＭＰＨを含有するプラスミドでトランスフェクトした。Ｆｓｔの活性化をトランスフェクションの２日後にｑＲＴ－ＰＣＲによって分析した。 図１０は、ｈＵ６、ｍＵ６、Ｈ１または７ＳＫプロモーターを用いたＵｔｎＮＴ２、Ｅｅｆ１α２およびＭｙｏＤの活性化効率を示す。 図１１は、第２のｓｇＲＮＡ（ｄｇＦｓｔ）が第１のｓｇＲＮＡ（ｄｇＵｔｒｎ）に対して順配向（丸）または逆配向（四角）である場合の、２多重ｓｇＲＮＡシステムを用いた標的とした遺伝子発現の誘導を示す。 図１２は、両方のｓｇＲＮＡが順配向にあるときに起こる組換えの概略図（上）およびゲル電気泳動画像（下）を示す。ゲル中の「低バンド」の存在は、両方のｓｇＲＮＡが順配向にある場合、望ましくない組換え産物の存在を確認する。組換えをサンガーシーケンシングによって検証した（図１３参照）。青色矢印は、ＰＣＲ増幅のためのプライマー位置を示す。 図１３は、組換え産物の存在を確認するサンガーシーケンシングを示す。上の配列は配列番号５７であり、下の配列は配列番号５８である。 図１４は、ダイレクトリピート（ＤＲ）または逆方向反復（ｉｎｖｅｒｓｅ ｒｅｐｅａｔ）（ＩＲ）配向を使用したｄｕｏ－ｄｇＲＮＡの概略図を示す。ＤＲ（丸）またはＩＲ（四角）配向におけるｄｕｏ－ｄｇＲＮＡによる標的遺伝子の活性化倍率を下に示す。 図１５は、ｄｕｏ－ｄｇＲＮＡがダイレクトリピート配向にある場合にトランケート型産物が産生されることを示し、このことは、望ましくない組換えを示している。 図１６は、逆方向反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ）として配向されたｄｕｏ－ｄｇＲＮＡを有する骨格筋特異的ｍＴＧＡ構築物の概略図を示す。下は、インビボ実験のための例示的な設計である。 図１７は、ＥＢＤ取り込みによって示されるＴＡ筋の筋線維損傷を示す。損傷した筋線維はＥＢＤを蓄積するため、より強い蛍光を示す。ＴＡ筋肉量も示されている（右上）。 図１８Ａおよび１８Ｂは、標的とした遺伝子の発現を示す。図１８Ａは、ＡＡＶ９－ｄｇＵｔｒｎＴ２－ｄｇＦｓｔ－ＭＰＨ処理が、ユートロフィンおよびＦｓｔの発現をそれぞれ１．８倍および１０倍増加させたことを示す。図１８Ｂは、ＡＡＶ９－ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－ｄｇＥｅｆ１ａ２－ＭＰＨ処理が、ユートロフィンおよびＥｅｆ１ａ２の発現をそれぞれ２．６倍および２．２倍増加させたことを示す。 図１９は、インビボ処置後のウエスタンブロット（左）および相対タンパク質レベル（右）を示す。結果は、ＡＡＶ９－ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－ｄｇＥｅｆ１ａ２－ＭＰＨ（Ｕ－Ｅ）処置がユートロフィンの発現を３．７倍上方調節し、一方で、ＡＡＶ９－ｄｇＵｔｒｎＴ２－ｄｇＦｓｔ－ＭＰＨ（Ｕ－Ｔ）処置がユートロフィンを１．５倍上方調節したことを示す。 図２０は、ユートロフィンの免疫染色を示す。 図２１は、３つの個々のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターによって駆動される３つの多重ｓｇＲＮＡの概略図を示す。ゲル電気泳動は、３つのプロモーターを有する構築物において望ましくない組換えが起こったことを示す（下側のバンド）。青色矢印は、増幅のためのプライマー位置を示す。組換えをサンガーシーケンシングによって検証した（図２２参照）。 図２２は、３つのプロモーターを有する構築物中の望ましくない組換え産物を確認するサンガーシーケンシングを示す。示される配列は、配列番号５９である。 図２３は、２つのｇＲＮＡの発現を駆動する２つの個々のプロモーターを有するシステム（下の模式図）、またはｔＲＮＡによって分離された２つのｇＲＮＡの発現を駆動する１つのプロモーターを有するシステム（上の模式図）を用いた活性化倍率の比較を示す。 図２４は、Ｎ２ａＣａｓ９細胞を使用した示された構築物による遺伝子活性化を比較する。 図２５は、２つのプロモーター（上の模式図）または１つのプロモーターおよびｔＲＮＡ切断部位（下の模式図）のいずれかを有する２つのｓｇＲＮＡシステムの組換えの比較を示す。ゲル電気泳動およびリアルタイムｑＰＣＲの結果は、ｔＲＮＡを有する１つのプロモーターを含有する構築物において生じた組換えが少ないことを示している。青色矢印は、増幅のためのプライマー位置を示す。 図２６は、ｈＵ６－ｔＲＮＡ構築物およびｈＵ６－Ｈ１構築物の活性化効率を示す。 図２７は、ｈＵ６－ｔＲＮＡ構築物ではｈＵ６－Ｈ１構築物よりも組換え事象が少ないことを示すゲル電気泳動画像を示す。 図２８は、Ｃ２Ｃ１２Ｃａｓ９細胞から回収されたプラスミドおよびＡＡＶにおけるｔＲＮＡまたはＨ１対ｈＵ６の比のｑＰＣＲ結果を示す。 図２９は、示されたｍＴＧＡ構築物（ｄｇＭｙｏＤ、ｄｇＭｅｆ２ｂおよびｄｇＰａｘ７を含有）で処理した３Ｔ３Ｌ１Ｃａｓ９細胞におけるＭｙｏＤ、Ｍｅｆ２ｂおよびＰａｘ７の効率的な活性化を示す。 図３０は、ＵｔｒｎＴ２ ＴＧＡシステム（１つのｓｇＲＮＡ）とＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ多重ＴＧＡ（ｍＴＧＡ）システム（３つのｓｇＲＮＡ）との比較を示す。Ｎ２ａＣａｓ９細胞を、単一ＴＧＡ（ＵｔｒｎＴ２）およびｍＴＧＡ（ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ）システムを含むＡＡＶベクターでトランスフェクトした。ユートロフィンの活性化をトランスフェクションの２日後にｑＲＴ－ＰＣＲによって分析した。Ｃ２Ｃ１２ Ｃａｓ９細胞に、単一およびｍＴＧＡシステムを含有するＡＡＶを形質導入した。ユートロフィンの活性化を形質導入の１０日後にｑＲＴ－ＰＣＲによって分析した。 図３１は、多重ＴＧＡシステムがＣａｓ９＋Ｍｄｘマウスの前脛骨筋（ＴＡ）において複数の遺伝子の発現を同時に活性化することを示す。 図３２は、４つのｇＲＮＡを含有するｍＴＧＡ構築物を使用した遺伝子活性化を示す。 図３３Ａ～３３Ｂは、ｍＴＧＡシステムがインビボでユートロフィンの発現を増強することを示す。図３３Ａ：Ｃａｓ９発現ＷＴマウスに、単一ｇＲＮＡ ＴＧＡ（ＵｔｒｎＴ２）またはｍＴＧＡ（ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ）システムを含有するＡＡＶを注射した。注入の２ヶ月後に、ユートロフィンの活性化をｑＲＴ－ＰＣＲによって分析した（ｎ＝５）。図３３Ｂ：単一ＴＧＡ（ｇＵｔｒｎＴ２－ＭＰＨ）、ｍＴＧＡ（ｇＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ－ＭＰＨ）、またはＭＰＨのみを含有するＡＡＶを注射した前脛骨筋（ＴＡ）におけるユートロフィンのウエスタンブロット分析を示す。Ｈｓｐ９０はローディング対照である。 図３４Ａ～３４Ｂは、ｇＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ－ＭＰＨまたはＭＰＨのみを含有するＡＡＶを注射した前脛骨筋（ＴＡ）のＲＮＡ－ｓｅｑ分析を示す（図３４Ａ）。図３４Ｂは、示されるＡＡＶを注射したＴＡ筋におけるユートロフィンの免疫染色を示す。スケールバー＝５０μｍ。 図３５は、握力アッセイ（上）および示されたＡＡＶ処置を受けた示されたマウスの握力（下）の実験設計を示す。各マウスについて６０回の連続握力試験を行った。リードを１０回の試験ごとに平均した。 図３６は、示された処置を受けたマウスにおけるＥＢＤの腹腔内注射による筋鞘の完全性の評価を示す。ＥＢＤは損傷細胞に蓄積する。ＥＢＤ注射の２時間後、マウスを６ｍ／分の速度で２分間トレッドミルランニングに供し、続いて２分間休ませた。トレッドミルランニングを３回繰り返した。高レベルのＥＢＤ取り込みは筋肉損傷を示す。ｍＴＧＡシステム（ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ）による処置は、収縮中の筋線維の切断を著しく改善した。 図３７は、ｍＴＧＡシステムがＭｄｘマウスにおいてユートロフィンの発現を増強することを示す。Ｃａｓ９発現Ｍｄｘマウスに、単一ｓｇＲＮＡ ＴＧＡシステム（ＵｔｒｎＴ２）またはｍＴＧＡシステム（ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ）を含有するＡＡＶを注射した。注入の２ヶ月後に、ユートロフィンの活性化をｑＲＴ－ＰＣＲによって分析した（ｎ＝４）。 図３８は、単一ｓｇＲＮＡ ＴＧＡシステム（ＵｔｒｎＴ２）またはｍＴＧＡシステム（ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ）を含有するＡＡＶを注射したＣａｓ９発現Ｍｄｘマウスを示す。示されるＡＡＶを注射したＴＡ筋におけるユートロフィンの免疫染色。 図３９は、ｍＴＧＡ処置の２ヶ月後のｍｄｘマウスのＴＡ筋へのＥＢＤ取り込みを示す。広範なＥＢＤ取り込みが、対照処置を受けたｍｄｘマウスにおいて見出されたが、ＥＢＤ取り込みは、ｍＴＧＡ処置マウスにおいて有意に緩和される。さらに、Ｕｔｒｎ免疫染色により、ユートロフィンの活性化が確認される。 図４０Ａおよび４０Ｂは、対照（ＭＰＨ）およびｍＴＧＡシステム（ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ）で処置されたＴＡ筋のｑＰＣＲ（図４０Ａ）およびウエスタンブロット（図４０Ｂ）によるユートロフィンの発現の定量を示す。 図４１Ａは、実験設計を示す。Ｃａｓ９／ｍｄｘマウスのＴＡ筋に、１×１０１１個のＧＣ ＡＡＶ９－ＭＰＨ、ＡＡＶ９－ｈＵ６－ｄｇＵｔｒｎＴ２－ＭＰＨ、ＡＡＶ９－ＵｔｒｎＤｕａｌ、またはＡＡＶ９－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅを注射する。図４１Ｂは、ＡＡＶ注射の２ヶ月後のユートロフィンのｍＲＮＡレベルを示す。 図４２は、ＴＡ筋試料のクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）ｑＲＴ－ＰＣＲを示す。 図４３は、ＴＡ筋試料のクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）ｑＲＴ－ＰＣＲを示す。 図４４Ａは、実験設計を示す。ｉｄＣａｓ９マウスのＴＡ筋に、ルシフェラーゼがｄｇＲＮＡ（ｄｇＬｕｃ）結合部位の下流に配置されたルシフェラーゼレポーターを含有するＡＡＶおよびｄｇＬｕｃ－ＣＡＧ－ＭＰＨ配列を含有するＡＡＶを共注射した。その後、Ｄｏｘ水（１ｍｇ／ｍｌ）を１週間または２週間間隔で添加および除去した。図４４Ｂは、ルシフェラーゼシグナルが、Ｄｏｘ投与の１週間後に誘導され、投与の２週間後に基礎レベルに戻ったことを示す。 図４５は、１×１０１１個のＧＣ ＡＡＶ９－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅまたはＡＡＶ９－ＭＰＨを注射したｉｄＣａｓ９マウスにおけるユートロフィンの内因性活性化を示す。マウスには、３０日間連続したＤｏｘ（３０オン）、６０日間連続したＤｏｘ（６０オン）、または３０日間のＤｏｘなし（３０オフ）の後の３０日間連続したＤｏｘを投与した。 図４６Ａは、ＡＡＶ９－ｄＣａｓ９およびＡＡＶ９－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅまたはＡＡＶ９－ＭＰＨの共注射のための実験設計を示す。処置の１３ヶ月後に筋肉試料を収集した。図４６Ｂは、ｍＴＧＡシステムで処置した試料でユートロフィンの３倍の増加が見られたことを示す。図４６Ｃは、Ｕｔｒｎ活性化を検証する、ユートロフィンの免疫染色を示す。 図４７Ａおよび４７Ｂは、筋肉試料の組織病理学的表現型を評価するためのＨ＆Ｅ染色（図４７Ａ）およびマロリー・トリクローム染色（図４７Ｂ）を示す。 図４８は、ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－Ｅｅｆ１ａ２、ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－ｄｇＵｔｒｎＴ２－ｄｇＵｔｒｎＴ１６（ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ）、およびＵｔｒｎＤｕａｌ－Ｅｅｆ１ａ２ ｍＴＧＡ構築物を示す。 図４９Ａは、ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－Ｅｅｆ１ａ２、ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ、ＵｔｒｎＤｕａｌ－Ｅｅｆ１ａ２、またはＭＰＨによる処置の２ヶ月後のｍｄｘマウスのＴＡ筋におけるＥｅｆ１ａ２およびユートロフィンの発現を示す。図４９Ｂは、Ｕｔｒｎタンパク質レベルを示す。 図５０Ａは、２ヶ月齢のｍｄｘマウスの複数の筋肉へのＭＰＨまたはデュアルＡＡＶシステムの筋肉内注射を示す概略図である。図５０Ｂは、ＡＡＶ処置の２ヶ月後の血清クレアチンキナーゼ活性を示す。 図５１Ａおよび５１Ｂは、ｍＴＧＡ処置が、対照マウス（ＭＰＨ）と比較してｍｄｘマウスの活動および持久力を増加させることを示す。図５１Ａは、オープンフィールド試験の結果を示す。図５１Ｂは、トレッドミル試験の結果を示す。 図５２は、単一プロモーターｔＲＮＡ構築物における組換えが１番目と４番目のＭＳ２ループの間で起こることを示すシーケンシングマップを示す。標識されていないバーはＭＳ２ループを示す。上の配列は配列番号６０であり、下の配列は配列番号６１である。 図５３Ａおよび５３Ｂは、クリスパーＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および２つのＭＳ２ループを含有する改変トランス活性化クリスパーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｍ２）を使用した標的遺伝子の活性化を示す。ｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｍ２構築物は標的遺伝子を活性化することができたが、その活性化効率はｄｇＲＮＡより２．８倍低かった（図５３Ａ）。２つのｃｒＲＮＡが２つの異なるＵ６プロモーターによって駆動された場合、ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｍ２と同じプロモーターを共有するｃｒＲＮＡのみが強い活性化効率を有した（図５３Ｂ）。 図５４は、ｔｒａｃｒＲＮＡエレメントとｃｒＲＮＡエレメントとの間にｔＲＮＡおよび／またはハンマーヘッドＲＮＡを利用する代替的なｍＴＧＡシステムの設計および試験を示す。遺伝子１はＦｓｔであり、遺伝子２はユートロフィンである。 図５５は、ｔｒａｃｒＲＮＡＭ２と２つのｃｒＲＮＡ１（ｃｒＦｓｔ）およびｃｒＲＮＡ２（ｃｒＵｔｒｎ）とを含む構築物において組換えが起こらないことを示すゲル電気泳動を示す。 図５６Ａは、Ｃ２Ｃ１２Ｃａｓ９細胞において、ＡＡＶＤＪ－ｈＵ６－ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｍ２－ｔＲＮＡ－ｃｒＦｓｔ－ＨＤＶ－ＨＨ－ｃｒＵｔｒｎ－ＭＰＨの活性化効率がＡＡＶＤＪ－ｈＵ６－ｄｇＵｔｒｎＴ２－ｔＲＮＡ－ｄｇＦｓｔ－ＭＰＨより高くないことを示す。図５６Ｂは、Ｃａｓ９／ｍｄｘマウスのＴＡ筋への異なる濃度のＡＡＶ９－ＭＰＨ、ＡＡＶ９－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ、またはＡＡＶ９－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ－ｃｒＲＮＡの筋肉内注射の２ヶ月後のユートロフィンのインビボ活性化を示す。 図５７は、示された力価での尾静脈注射後のＡＡＶの分布を追跡するためのルシフェラーゼ発現を示す。
配列表
本明細書または添付の配列表に列挙されている任意の核酸およびアミノ酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で定義されているように、ヌクレオチド塩基およびアミノ酸の標準的な文字略語を使用して示されている。少なくともいくつかの場合において、各核酸配列の１つの鎖のみが示されているが、相補鎖は、表示された鎖に対する任意の参照によって含まれると理解される。配列表は、参照により本明細書に組み込まれる、２０２２年４月２７日に作成された８１，９２０バイトのＡＳＣＩＩテキストファイル「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔ」として提出される。添付の配列表において：
配列番号１は、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ＵＴ２－ＨＨ－ＵＴ１６多重ｃｒＲＮＡをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000002
配列番号２は、ｄｇＵｔｎＮＴ２－ｍＵ６－ｈＵ６－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｃｒＵＴ２－ＨＨ－ｃｒＵＴ１６多重ｃｒＲＮＡをｄｇＲＮＡとともにコードする例示的なＤＮＡ配列である（「ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ－ｃｒＲＮＡ」）。
Figure 2024515827000003
Figure 2024515827000004
配列番号３は、ｄｇＦｓｔ／ｄｇＵｔｒｎ多重ｓｇＲＮＡをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000005
配列番号４は、ｄｇＵｔｎＮＴ２／ｄｇＵｔｒｎＴ２／ｄｇＵｔｒｎＴ１６多重ｓｇＲＮＡ（「ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ」）をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000006
Figure 2024515827000007
配列番号５は、ｄｇＵｔｎＮＴ２－ｍＵ６－ｈＵ６－ｄｇＦｓｔ－ｔＲＮＡ－ｄｇＥｅｆ１ａ２多重ｓｇＲＮＡをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000008
配列番号６は、ｄｇＦｓｔ／ｄｇＥｅｆ１ａ２／ｄｇＵｔｎＮＴ２／ｄｇＵｔｒｎＴ２多重ｓｇＲＮＡをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000009
Figure 2024515827000010
配列番号７は、改変ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000011
配列番号８は、ｃｒＵＴ２をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000012
配列番号９は、ｃｒＵＴ１６をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000013
配列番号１０は、ｄｇＦＳＴをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000014
配列番号１１は、ｄｇＥｅｆ１α２をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000015
配列番号１２は、ｄｇＵｔｒｎＮＴ２をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000016
配列番号１３は、ｄｇＵｔｒｎをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000017
配列番号１４は、ｄｇＵｔｒｎＴ２をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000018
配列番号１５は、ｄｇＵｔｒｎＴ１６をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000019
配列番号１６は、天然ＭＳ２結合ループをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000020
配列番号１７は、改変ＭＳ２結合ループをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000021
配列番号１８は、改変ＭＳ２結合ループをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000022
配列番号１９は、改変ＭＳ２結合ループをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000023
配列番号２０は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのプレｔＲＮＡをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000024
配列番号２１は、Ｚｅａ ｍａｙｓのプレｔＲＮＡをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000025
配列番号２２は、ハンマーヘッドＲＮＡをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000026
配列番号２３は、ヒトＥＥＦ１α２の近位プロモーターをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000027
Figure 2024515827000028
配列番号２４は、ヒトＦｓｔの近位プロモーターをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000029
配列番号２５は、ヒトＰｄｘ１の近位プロモーターをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000030
配列番号２６は、ヒトクロトーの近位プロモーターをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000031
配列番号２７は、ヒトユートロフィンの近位プロモーターをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000032
配列番号２８は、ヒトインターロイキン１０の近位プロモーターをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000033
配列番号２９は、ヒトｓｉｘ２の近位プロモーターをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000034
配列番号３０は、Ｃａｓ９をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000035
Figure 2024515827000036
配列番号３１は、例示的なＣａｓ９アミノ酸配列である。
Figure 2024515827000037
Figure 2024515827000038
配列番号３２は、ｄＣａｓ９をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000039
Figure 2024515827000040
配列番号３３は、例示的なｄＣａｓ９アミノ酸配列である。
Figure 2024515827000041
配列番号３４は、ＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000042
Figure 2024515827000043
配列番号３５は、例示的なＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１アミノ酸配列である。
Figure 2024515827000044
配列番号３６は、７ＳＫプロモーターをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000045
配列番号３７は、Ｓｐｃ５．１２プロモーターをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000046
配列番号３８は、Ｃｏｌ１ａ２プロモーターをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000047
配列番号３９は、ｍＵ６プロモーターをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000048
配列番号４０は、ｈＵ６プロモーターをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000049
配列番号４１は、Ｈ１プロモーターをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000050
配列番号４２は、ｄｇＭｙｏＤをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000051
配列番号４３は、ｄｇＭｅｆ２ｂをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000052
配列番号４４は、ｄｇＰａｘ７をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000053
配列番号４５は、ｄｇＯＣＴ４をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000054
配列番号４６は、ｄｇＳＯＸ２をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000055
配列番号４７は、ｄｇＫＬＦをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000056
配列番号４８は、ｄｇＭＹＣをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000057
配列番号４９は、ｃｒＵＣＰ１をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000058
配列番号５０は、ｃｒＰｇｃ１ａをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000059
配列番号５１は、ｃｒＦＳＴをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000060
配列番号５２は、ｃｒＵｔｒｎをコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000061
配列番号５３は、ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－ｍＵ６－ｈＵ６－ｄｇＵｔｒｎＴ２（「ＵｔｒｎＤｕａｌ」）をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000062
配列番号５４は、ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－ｍＵ６－ｈＵ６－ｄｇＥｅｆ１ａ２（「ＵｔｒｎＮＴ２－Ｅｅｆ１ａ２」）をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000063
Figure 2024515827000064
配列番号５５は、ｄｇＵｔｒｎＴ２－ｔＲＮＡ－ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－ｍＵ６－ｈＵ６－ｄｇＥｅｆ１ａ２（「ＵｔｒｎＤｕａｌ－Ｅｅｆ１ａ２」）をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
Figure 2024515827000065
配列番号５６は、図５に示す配列である。
Figure 2024515827000066
配列番号５７は、図１３に示す上側のバンド配列である。
Figure 2024515827000067
配列番号５８は、図１３に示す下側のバンド配列である。
Figure 2024515827000068
配列番号５９は、図２２に示すシーケンシング産物である。
Figure 2024515827000069
配列番号６０は、図５２（上）に示す配列産物である。
Figure 2024515827000070
配列番号６１は、図５２（下）に示す配列産物である。
Figure 2024515827000071
詳細な説明
以下の用語および方法の説明は、本開示をよりよく説明し、本開示の実施において当業者を導くために提供される。「または」という用語は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、記載された代替要素の単一の要素または２またはそれを超える要素の組み合わせを指す。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含む」とは、追加の要素を除外することなく「Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを含む」ことを意味する。
別段の説明がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学における多くの一般的な用語の定義は、Ｋｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｌｅｗｉｎ’ｓ ｇｅｎｅｓ ＸＩＩ、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，２０１７に見いだされ得る。特許出願および特許を含むすべての参考文献、ならびに提供されたＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号（２０２１年４月２８日現在）に関連する配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。全てのパーセンテージおよび比は、特に指示しない限り、重量によって計算される。「約」という用語は、参照値の±５％を指す。例えば、「約」１００は、９５～１０５を指す。
矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
本開示の様々な実施形態の精査を容易にするために、特定の用語の以下の説明が提供される。
Ｉ．用語
投与：対象に、任意の有効な経路によって、薬剤、例えば開示された多重標的遺伝子活性化（ｍＴＧＡ）システムまたはその一部（例えば、ウイルスベクターの一部であり得る多重ｃｒＲＮＡもしくは多重ｓｇＲＮＡ、またはそのＲＮＡをコードする核酸など）を提供または与えること。投与は局所的または全身的であり得る。例示的な投与経路には、経口、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、肝臓内、経皮（肝臓内）、および静脈内）、舌下、直腸、経皮（例えば、局部）、鼻腔内、膣および吸入経路が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、投与は注射によるものである。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）：ヒトおよびいくつかの他の霊長類に感染し得る小さな非エンベロープウイルス。これは、非分裂細胞および分裂細胞の両方に感染し得る。ＡＡＶベクターは、例えば、開示されたｍＴＧＡシステムおよび関連する方法を使用して核酸分子を標的遺伝子に送達するための遺伝子治療ベクターとして使用することができる。本明細書で提供される方法および組成物で使用することができる例示的なＡＡＶベクターには、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓが含まれる。いくつかの例では、例えば、多重ｃｒＲＮＡ、多重ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９コード配列、ｄＣａｓ９コード配列、またはＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質コード配列を含有するＡＡＶベクターは、例えば以下に示すような特定の組織または細胞型に対するトロピズムを有する。
Figure 2024515827000072
Ｃａｓ９：原核生物ウイルスに対するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ免疫防御に関与するＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素。Ｃａｓ９は、二重らせんの各鎖に１つずつ、２つの活性切断部位（ＨＮＨおよびＲｕｖＣ）を有する。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の例示的な天然Ｃａｓ９配列を配列番号３１に示す。
エンドヌクレアーゼ活性を低減または消失させたが依然としてｄｓＤＮＡに結合する触媒的に不活性な（不活性化またはデッド）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）も本開示に含まれる。いくつかの例では、ｄＣａｓ９は、ＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインにおける１またはそれを超える変異、例えば以下の点変異：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、およびＤ９８６Ａ（例えば、配列番号３１のナンバリングに基づく）の１またはそれを超えるものを含む。Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ置換を有する例示的なｄＣａｓ９配列を配列番号３３に示す。一例では、ｄＣａｓ９タンパク質は、変異Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｄ８３９Ａ、およびＮ８６３Ａを有する（例えば、Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．１０：１１１６－２１，２０１３を参照）。
いくつかの例では、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９は、転写活性化ドメイン、例えば、ＶＰ６４、Ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９またはそれらの任意の組み合わせを含む。他の例では、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９は、転写活性化ドメイン、例えば、ＶＰ６４、Ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９またはそれらの任意の組み合わせを含まない。
Ｃａｓ９配列は公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＣＰ０１２０４５．１のヌクレオチド７９６６９３．．８００７９９およびＣＰ０１４１３９．１のヌクレオチド１１０００４６．．１１０４１５２はＣａｓ９核酸を開示しており、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＰ＿２６９２１５．１、ＡＭＡ７０６８５．１、およびＡＫＰ８１６０６．１はＣａｓ９タンパク質を開示している。いくつかの例では、Ｃａｓ９は、ヌクレアーゼ欠損であるもの（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＫＡ６０２４２．１およびＫＲ０１１７４８．１に示されるもの）などのＣａｓ９の不活性化形態（ｄＣａｓ９）である。活性化可能なＣａｓ９タンパク質は、米国特許出願公開第２０１８－００７３００２－Ａ１号に提供されている。
特定の例では、開示された方法またはキットで使用されるＣａｓ９またはｄＣａｓ９は、そのような配列（例えば、配列番号３１および３３）に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し、開示された方法で使用される能力を保持する（例えば、標的遺伝子の発現を増加させるためにｍＴＧＡシステムにおいて使用することができる）。
相補性：核酸が、従来のワトソン－クリック塩基対合または他の非従来型のいずれかによって別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する能力。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン－クリック塩基対合）を形成することができる核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０個中、５個、６個、７個、８個、９個および１０個は、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％の相補性である）。
対照：参照標準。いくつかの実施形態では、対照は、健康な対象から得られた陰性対照試料である。他の実施形態では、対照は、疾患、例えば、筋ジストロフィーなどの標的遺伝子の低発現に関連する疾患と診断された対象から得られた陽性対照試料である。さらに他の実施形態では、対照は、過去の対照または標準参照値または値の範囲（例えば、既知の診断および／または転帰を有する対象からの試料の群、またはベースライン値もしくは正常値を表す試料の群）である。
試験試料と対照との間の差は、増加または逆に減少であり得る。いくつかの例では、標的遺伝子の発現は対照と比較して増加する。差は、定性的差または定量的差、例えば統計的有意差であり得る。いくつかの例では、差は、対照と比較して、例えば少なくとも約５％、例えば少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、または５００％を超える増加である。いくつかの例では、差は、対照と比較して、例えば少なくとも約５％、例えば少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の減少である。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、プラスミドおよびファージなどの外来遺伝要素に対する耐性を付与し、獲得免疫の形態を提供する原核生物免疫システムである。ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、真核生物におけるＲＮＡｉと類似の様式で外因性遺伝要素を認識および切断する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、開示されたｍＴＧＡシステムを使用して遺伝子発現を調節することができ、具体的には、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を切断することなく、ｄＣａｓ９タンパク質、ｄｇＲＮＡまたはその両方を送達することによって発現を活性化することができる。標的遺伝子（または他の核酸分子）の発現の活性化は、ｄｓＤＮＡを切断することなく達成することができる。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの一部。ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズして、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに結合してそれを標的配列に誘導する固有のデュアルＲＮＡハイブリッド構造を形成するＲＮＡ分子である。ｃｒｉｓｐｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズする反復配列に加えて、標的遺伝子と相補性を有する標的化配列も含む。ｄｇＲＮＡ（後述）と同様に、ｃｒＲＮＡは約１４～１５塩基対の短縮型標的化配列を含むことができ、これによりｃｒＲＮＡは野生型Ｃａｓ９を標的配列に導くことができるが、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導しない。いくつかの例では、ｃｒＲＮＡはＲＮＡ分子である（例えば、細胞において発現される場合）。いくつかの例では、ｃｒＲＮＡはＤＮＡ分子によってコードされる（例えば、ウイルスベクターなどのベクター中にある場合）。
デッドガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）：Ｃａｓ９を標的配列に誘導することができるが、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導しない、短縮型一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。短縮型ｓｇＲＮＡは、約１４～１５ヌクレオチドの短縮型標的化配列を含有し、一方、非デッドｓｇＲＮＡは、約２０ヌクレオチドの標的化配列を含有する。ｄｇＲＮＡは、例えばＤａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：１１５９－１１６１；Ｋｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２：１０５１－１０５４；およびＨｓｉｎ－Ｋａｉ Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｅｌｌ，１７１：１４９５－１５０７に更に記載されている。いくつかの例では、ｄｇＲＮＡはＲＮＡ分子である（例えば、細胞において発現される場合）。いくつかの例では、ｄｇＲＮＡはＤＮＡ分子によってコードされる（例えば、ウイルスベクターなどのベクター中にある場合）。
有効量：有益または所望の結果をもたらすのに十分な薬剤（例えば、本明細書中に提供される多重化ｓｇＲＮＡ、多重化ｃｒＲＮＡまたはｍＴＧＡシステム）の量。治療有効量は、処置される対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与様式などの１またはそれを超えるものに応じて変動し得、これらは当業者によって容易に決定され得る。有益な治療的効果には、診断判定の実施可能性；疾患、症状、障害、または病的状態の改善；疾患、症状、障害または病的状態の発症の減少または予防；および概して、疾患、症状、障害または病的状態に対抗することが含まれ得る。有効量は、投与量を変化させ、得られた応答、例えば標的遺伝子の発現を測定することなどによって決定することができる。有効量はまた、様々なインビトロ、インビボまたはインサイチュのアッセイによって決定することもできる。
一実施形態では、「有効量」は、疾患の症状を、（治療剤の非投与などの適切な対照と比較して）例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％減少させるのに十分な量である。この用語はまた、標的遺伝子の標的化（例えば、発現の改変）を可能にするために、Ｃａｓ９（またはｄＣａｓ９）、多重ｃｒＲＮＡ、および／または多重ｓｇＲＮＡの十分な発現を可能にする用量にも適用される。
有効量は、有効な応答を達成するための前または後の投与と組み合わせて寄与する部分用量を包含する。例えば、有効量の薬剤を、数日または数週間続く処置の過程の間に、単回用量で、または数回用量で、例えば、１時間毎、毎日、投与することができる。しかしながら、有効量は、処置される対象、処置される状態の重症度およびタイプ、ならびに投与様式に依存し得る。薬剤の単位剤形は、ある量で、または有効量の倍数で、例えばバイアル（例えば、穿刺可能な蓋を有する）、錠剤、または他の形態で包装することができる。
融合タンパク質：完全長の第１のタンパク質（例えば、ＭＳ２）の配列の少なくとも一部および完全長の第２のタンパク質（例えば、転写活性化因子）の配列の少なくとも一部を含むタンパク質であって、第１および第２のタンパク質が異なるタンパク質。２つの異なるペプチドは、例えば、リンカー（例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒのリンカー、またはそれらの組み合わせ、例えば、ＧＧＧＧＳ）を用いて直接的または間接的に連結され得る。例示的な融合タンパク質としては、１またはそれを超える転写活性化ドメイン、例えばＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、またはＳＥＴ７／９の１またはそれを超えるものに直接的または間接的に融合されたＭＳ２ドメイン（例えば、配列番号３５のアミノ酸１～１３０）、例えばＭＳ２－Ｐ６５－ＨＳＦ１融合タンパク質（例えば、配列番号３５およびＫｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５ Ｊａｎ ２９；５１７（７５３６）：５８３－８）が挙げられる。
増加または減少：参照値からの量のそれぞれ正または負の変化。増加は、対照値と比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％の増加などの正の変化である。例えば、増加は、約２５～５００％、約２５～４００％、約２５～３００％、約２５～２００％、約２５～１００％、約２５～７５％、約２５～５０％、約５０～５００％、約７５～５００％、約１００～５００％、約２００～５００％、約３００～５００％、約４００～５００％、約５０～１００％、約５０～２００％、約５０～３００％、約５０～４００％、約５０～５００％、約１００～２００％、約１００～３００％、約１００～４００％、約１００～５００％、または約２５０～５００％であり得る。減少は、対照値と比較して、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の減少などの負の変化である。例えば、減少は、約２５～１００％、約２５～９８％、約２５～９５％、約２５～９０％、約２５～８０％、約２５～７５％、約２５～５０％、約５０～１００％、約７５～１００％、約９０～１００％、約９５～１００％、約９８～１００％、約９９～１００％、約５０～７５％、約５０～８０％、約５０～９０％、約５０～９５％、約５０～９８％、約７５～８０％、約７５～９０％、約７５～９５％、または約７５～９８％であり得る。
疾患を阻害することまたは処置すること：「処置」は、疾患が発症し始めたときに、感染後の疾患または病的状態の徴候または症状を改善する治療的介入を指す。疾患または病的状態に関して「改善する」という用語は、処置の観察可能な有益な効果を指す。疾患を阻害することは、疾患の症状を軽減することを含み得る。有益な効果は、例えば、対象における疾患の臨床症状の発症の遅延、疾患の一部または全部の臨床症状の重症度の低下、疾患のより遅い進行、標的遺伝子の発現の増加、対象の全体的な健康もしくは幸福の改善、または特定の疾患に特異的な他のパラメータによって証明することができる。
「予防的」処置は、病態を発症するリスクを低下させる目的で、疾患の徴候を示さないかまたは初期の徴候のみを示す対象に投与される処置である。いくつかの実施形態では、開示される方法は治療的であり、予防的ではない。
単離された：「単離された」生物学的成分（例えば、タンパク質、核酸または細胞）は、その成分が存在する生物の細胞または組織中の他の生物学的成分、例えば他の細胞、染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質から実質的に分離されているか、それらとは別に産生されているか、それらから精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学合成された核酸およびタンパク質も包含する。例えば、開示された多重ｃｒＲＮＡ、多重ｓｇＲＮＡ、またはタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９、Ｃａｓ９またはＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質）をコードする核酸を含む単離されたベクター、またはそのようなベクターを含む細胞は、いくつかの例では、少なくとも５０％純粋、例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋である。
標識：別の分子（核酸分子など）に直接または間接的にコンジュゲートして、その分子の検出を容易にする化合物または組成物。標識の特定の非限定的な例としては、蛍光性および蛍光発生部分、発色性部分、ハプテン、アフィニティタグおよび放射性同位体が挙げられる。標識は、直接的に検出可能（例えば、光学的に検出可能）または間接的に検出可能（例えば、次に検出可能な１またはそれを超える追加の分子との相互作用を介する）であり得る。
肝疾患：肝臓の急性または慢性障害。いくつかの例では、肝疾患は、肝移植で処置されるものである。開示される方法および組成物で処置することができる肝疾患の例には、肝炎（Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎など）、肝臓の線維症、肝臓の肝硬変、アルコール性肝疾患、肝細胞癌、アラジール症候群、アルファ－１アンチトリプシン欠損症（アルファ－１）、胆道閉鎖症、ガラクトース血症、ジルベール症候群、ヘモクロマトーシス、リソソーム酸リパーゼ欠損症（ＬＡＬ－Ｄ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、Ｉ型糖原病（ＧＳＤ Ｉ）、血液凝固因子欠損症（例えば、第Ｉ因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｖ＋ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子または第ＸＩＩＩ因子が欠損しているか、または適切に機能していない）およびウィルソン病が含まれるが、これらに限定されない。
雄特異的バクテリオファージ２（ＭＳ２）：コートタンパク質（すなわち、ＭＳ２ドメインまたはＭＳ２タンパク質；例えば、配列番号３５のアミノ酸１～１３０）に結合するＲＮＡオペレーターヘアピンを含むＲＮＡウイルス。ＭＳ２結合ループ（すなわち、ＭＳ２ヘアピンまたはＭＳ２ステムループ；例えば、配列番号１６）およびＭＳ２タンパク質は、第２世代のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおいて相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）複合体に組み込まれている。そのようなＭＳ２ヘアピン配列の改変は、ｓｇＲＮＡ、例えばｄｇＲＮＡに組み込まれ得るか、またはｔｒａｃｒＲＮＡを改変するために本明細書に提供される（例えば、配列番号１７～１９）。ＭＳ２タンパク質（例えば、配列番号３５のアミノ酸１～１３０）を融合タンパク質に組み込んで、転写因子を動員することができる。
作動可能に連結された：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係にある場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列（ｃｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｄＣａｓ９、Ｃａｓ９、またはＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質のコード配列など）に作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、同じ読み枠内にある。
薬学的に許容され得る担体：本発明で有用な薬学的に許容され得る担体は従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７５）には、本明細書で提供される開示された組成物（例えば、多重ｃｒＲＮＡ、多重ｓｇＲＮＡ、ＲＮＡ、ベクター、ＲＮＰ複合体、ｍＴＧＡシステム）の医薬送達に適した組成物および製剤が記載されている。
一般に、担体の性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容され得る流体をビヒクルとして含む注射用流体を含む。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、保存剤およびｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有することができる。
プロモーター：核酸の転写を指示する一群の核酸制御配列。プロモーターは、転写の開始部位の近くに必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、必要に応じて、遠位のエンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを含む。「構成的プロモーター」は、連続的に活性であり、外部シグナルまたは分子による調節を受けないプロモーターである。対照的に、「誘導性プロモーター」の活性は、外部シグナルまたは分子（例えば、転写因子）によって調節される。いくつかの例では、本明細書に提供されるベクターは、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６およびＨ１プロモーター）、ｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、レトロウイルス性ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（必要に応じてＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（必要に応じてＣＭＶエンハンサーを有する）、ＳＶ４０プロモーター、Ｓｐｃ５．１２プロモーター、ＣＷ３ＳＬプロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１αプロモーター）、またはそれらの組み合わせを含む。
組換え細胞または宿主細胞：組換えプラスミドまたはベクターなどの外因性ポリヌクレオチドの導入によって、遺伝子改変されているか、または遺伝子改変することができる細胞。典型的には、宿主細胞は、ベクターを増殖させ、その核酸を発現させることができる細胞である。そのような細胞は、真核生物または原核生物であり得る。この用語はまた、対象宿主細胞の任意の子孫を含む。複製中に生じる変異が存在し得るため、すべての子孫が親細胞と同一ではない可能性があることが理解される。しかしながら、そのような子孫は、「宿主細胞」という用語が使用される場合に含まれる。
調節エレメント：プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列などの転写終結シグナル）を含む語句。このような調節エレメントは、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節エレメントには、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、および特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、主に筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の器官（例えば、肝臓、膵臓）、または特定の細胞型（例えば、筋肉または肝臓細胞）などの目的の所望の組織での発現を指示し得る。調節エレメントはまた、時間依存的様式で、例えば、細胞周期依存的様式または発達段階依存的様式で発現を指示してもよく、これはまた、組織または細胞型特異的であってもよく、またはそうでなくてもよい。
「調節エレメント」という用語には、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ－ＩのＬＴＲにおけるＲ－Ｕ５’セグメント；ＳＶ４０エンハンサー；およびウサギβ－グロビンのエクソン２とエクソン３との間のイントロン配列などのエンハンサーエレメントも包含される。
レポータータンパク質：発現が目的の遺伝子の発現に関連する任意のタンパク質。例示的なレポータータンパク質としては、蛍光タンパク質および化学発光分子、例えば、赤外蛍光タンパク質（ＩＦＰ）、ｍＲＦＰ１、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＫＯ、ｔａｇＲＦＰ、ＥＧＦＰ、ｍＥＧＦＰ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍａｐｌｅ、ｔａｇＲＦＰ－Ｔ、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼおよびコメツキムシルシフェラーゼが挙げられる（例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１２２３５５号）。いくつかの例では、レポータータンパク質は、レポータータンパク質が目的の遺伝子と共発現されるように、目的の遺伝子の下流に、かつ目的の遺伝子とインフレームで配置される。
単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）：Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質を標的核酸配列に導くために使用されるポリヌクレオチド配列。内因性Ｃａｓ９システムにおいて、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）として知られる別のＲＮＡ分子の反復配列とハイブリダイズして、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに結合してそれを標的配列に誘導する固有のデュアルＲＮＡハイブリッド構造を形成するＲＮＡ分子である。ｃｒＲＮＡは、標的遺伝子に相補的な標的化配列を含み、したがって標的配列へのＣａｓ９複合体の結合を促進する。
ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを単一のＲＮＡ転写物に組み合わせる合成キメラである。ｓｇＲＮＡの使用は、完全に機能的なＣａｓ９媒介配列特異的標的化を保持しながら、システムを単純化する。ｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分内の標的化配列を変更することにより、目的の任意のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の標的化が可能になる。（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｆｕｇｕｏ Ｊｉａｎｇ ａｎｄ Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ａ．Ｄｏｕｄｎａ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，４６：１，５０５－５２９（２０１７）を参照）。
いくつかの例では、ｓｇＲＮＡはＲＮＡ分子である（例えば、細胞において発現される場合）。いくつかの例では、ｓｇＲＮＡはＤＮＡ分子によってコードされる（例えば、ウイルスベクターなどのベクター中にある場合）。ｓｇＲＮＡ核酸は、改変塩基または化学的改変を含むことができる（例えば、Ｌａｔｏｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ ５５：３５４８－５０，２０１６を参照）。いくつかの例では、ｓｇＲＮＡは、ＧＣ含有量を増加させるおよび／または反復的なコンテンツを短縮するために天然ＭＳ２結合ループ配列から改変することができる２またはそれを超えるＭＳ２結合ループ配列を含む。いくつかの例では、ｓｇＲＮＡは、ＧＣ含有量を増加させるおよび／または反復的なコンテンツを短縮するように改変される。いくつかの例では、ｓｇＲＮＡはデッドガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である。ＧＣ含有量の増加および／またはｓｇＲＮＡの反復的なコンテンツの短縮は、ｓｇＲＮＡを、ｄｇＲＮＡ、すなわちＣａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質を標的配列に導くことができるがＤＮＡ二本鎖切断を誘導しないガイド核酸分子へと変換するために使用することができる。
配列同一性／類似性：アミノ酸（またはヌクレオチド）配列間の類似性は、配列間の類似性の観点から表され、別段、配列同一性とも呼ばれる。配列同一性は、同一性（または類似性もしくは相同性）パーセンテージに関して頻繁に測定される。パーセンテージが高いほど、２つの配列はより類似している。
比較のための配列のアラインメント方法が記載されている。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３：２３７，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１０８８１，１９８８；およびＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４，１９８８に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．６：１１９，１９９４には、配列アラインメント方法および相同性計算の詳細な考察が示されている。
ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘに関連して使用するために、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）およびインターネット上を含むいくつかの情報源から入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで入手可能である。
既知のタンパク質および核酸配列ならびに本明細書に開示されるもののバリアントは、典型的には、デフォルトパラメータに設定されたＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔを使用したアミノ酸配列との全長アラインメントにわたってカウントされた少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有することを特徴とする。配列全体よりも少ない配列が配列同一性について比較される場合、ホモログおよびバリアントは、典型的には、１０～２０アミノ酸の短いウィンドウにわたって少なくとも８０％の配列同一性を有し、参照配列に対するそれらの類似性に応じて、少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有し得る。このような短いウィンドウにわたって配列同一性を決定するための方法は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで利用可能である。
一例では、多重ｃｒＲＮＡまたは多重ｓｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１、２、３、４、５、６、５３、５４、または５５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
対象：脊椎動物、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物。哺乳動物には、マウス、サル、ヒト、農場動物、スポーツ動物およびペットが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、対象は、サルまたは他の非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシなどの非ヒト哺乳動物対象である。いくつかの例では、対象はヒトである。いくつかの例では、対象は、本明細書中に提供される方法を用いて処置され得る障害または遺伝性疾患、例えば、遺伝子発現の低下に起因する障害を有する。いくつかの例では、対象は、ゼブラフィッシュ、Ｘｅｎｏｐｕｓ、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、マウス、ウサギ、ラット、または霊長類などの実験動物／生物である。
標的遺伝子（または「標的」）：遺伝子産物（例えば、タンパク質）の発現の増加または減少が望まれる遺伝子（または遺伝子群）、例えば、活性化された発現が望まれる遺伝子。遺伝子は、標的遺伝子の発現に影響を及ぼす限り、直接的または間接的に標的化され得る。いくつかの例では、標的化配列（ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ標的化配列など）は、標的遺伝子に対して相補性を有する。いくつかの例では、標的化配列は、標的遺伝子のプロモーターおよび／または調節エレメントに対する相補性を有する。
標的化配列：標的核酸配列と相補性を有するｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの部分。いくつかの例では、標的化配列は、活性化された発現が望まれる標的遺伝子のプロモーターまたは調節エレメントに対する相補性を有する。いくつかの例では、標的化配列は約１４～３０ｎｔであり、標的配列とハイブリダイズし、標的核酸配列へのＣａｓ９またはｄＣａｓ９の配列特異的結合を指示するのに十分な標的核酸配列との相補性を有する。いくつかの実施形態では、標的化配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントされた場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％または１００％またはそれを超える。いくつかの実施形態では、相補性の程度は１００％である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定され得、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。
治療剤：対象への投与の際に何らかの有益な効果を与える１またはそれを超える分子または化合物のことを指す。有益な治療的効果には、診断判定の実施可能性；疾患、症状、障害、または病的状態の改善；疾患、症状、障害または病的状態の発症の減少または予防；および概して、疾患、症状、障害または病的状態に対抗することが含まれ得る。
転写活性化因子：遺伝子などの核酸分子の転写を増加させるタンパク質またはタンパク質ドメイン。そのようなタンパク質は、例えば、標的遺伝子の転写のための補因子およびＲＮＡポリメラーゼの動員を補助するために、本明細書中に提供される方法およびｍＴＧＡシステムにおいて使用され得る。そのようなタンパク質およびタンパク質ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化のためのドメインを有することができる。これらの活性化因子は、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、ｓｇＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡへの結合によってシステムに導入することができる。そのような活性化因子の例としては、ＶＰ６４、ｐ６５、筋原性分化１（ＭｙｏＤ１）、熱ショック転写因子（ＨＳＦ）１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９またはそれらの任意の組み合わせ（ｐ６５およびＨＳＦ１など）が挙げられる。
トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）：ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）として知られる別のＲＮＡ分子の反復配列とハイブリダイズして、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに結合してそれを標的配列に誘導する固有のデュアルＲＮＡハイブリッド構造を形成するＲＮＡ分子。ＧＣ含有量を増加させるおよび／または反復的なコンテンツを短縮するために天然ＭＳ２結合ループ配列から改変された２またはそれを超えるＭＳ２結合ループ配列を含む改変ｔｒａｃｒＲＮＡが本明細書に開示される。いくつかの例では、ＭＳ２結合ループ配列は、ＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質による結合を促進する。いくつかの例では、ｔｒａｃｒＲＮＡはＲＮＡ分子である（例えば、細胞において発現される場合）。他の例では、ｔｒａｃｒＲＮＡはＤＮＡ分子によってコードされる（例えば、ウイルスベクターなどのベクター中にある場合）。
形質導入、形質転換およびトランスフェクト：ウイルスまたはベクターは、核酸分子を細胞に移入する場合、細胞を「形質導入」する。核酸が細胞ゲノムへの核酸の組み込みまたはエピソーム複製のいずれかによって細胞によって安定に複製される場合、細胞は、細胞に形質導入された核酸によって「形質転換」または「トランスフェクト」される。
これらの用語は、ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミドベクターによる形質転換、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクション、粒子銃加速、および当技術分野における他の方法による裸のＤＮＡの導入を含む、核酸分子をそのような細胞に導入することができるすべての技術を包含する。いくつかの例では、本方法は、化学的方法（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション）、物理的方法（例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、または粒子衝撃）、融合（例えば、リポソーム）、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、ＤＮＡ－タンパク質複合体またはウイルスエンベロープ／カプシド－ＤＮＡ複合体）、および組換えウイルスなどのウイルスによる生物学的感染である（Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｄ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＵＳＡ，１９９４）。細胞に核酸分子を導入する方法は公知である（例えば、米国特許第６，１１０，７４３号明細書を参照）。これらの方法は、発現を活性化するために開示された剤で細胞を形質導入するために使用することができる。
導入遺伝子：外因性遺伝子。
ベクター：宿主細胞において複製するおよび／または組み込むベクターの能力を破壊することなく外来核酸分子を導入することができる核酸分子。ベクターには、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖の核酸分子；１またはそれを超える遊離末端を含むかまたは遊離末端を含まない核酸分子（例えば、環状）；ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子；および他の様々なポリヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
ベクターは、複製起点などの宿主細胞内での複製を可能にする核酸配列を含むことができる。ベクターはまた、１またはそれを超える選択マーカー遺伝子および他の遺伝要素を含み得る。組み込みベクターは、それ自体を宿主核酸に組み込むことができる。発現ベクターは、挿入された１つまたは複数の遺伝子の転写および翻訳を可能にするために必要な調節配列を含むベクターである。
ベクターの１つのタイプは、標準的な分子クローニング技術などによって追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列がウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）にパッケージングするためにベクター中に存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって担持されるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ベクターはレンチウイルス（組込み欠損レンチウイルスベクターなど）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。
特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態で本明細書に提供される核酸（例えば、多重ｃｒＲＮＡ、多重ｓｇＲＮＡ、またはＣａｓ９、ｄＣａｓ９もしくはＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質などのタンパク質をコードする核酸など）を含むことができ、これは組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され得る、発現される核酸配列に作動可能に連結された１またはそれを超える調節エレメントを含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結される」は、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳システムにおいて、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節エレメント（複数可）に連結されていることを意味することが意図される。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの要因に依存し得ることが当業者には理解されよう。ベクターを宿主細胞に導入して、それにより、本明細書に記載の核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチドを含む転写物、タンパク質またはペプチドを産生することができる。
ＩＩ．いくつかの実施形態の概要
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、細胞質タンパク質ジストロフィンの早期変異によって引き起こされ、進行性の筋変性および脱力をもたらす。潜在的な処置戦略は、ジストロフィンのホモログであるユートロフィン（Ｕｔｒｎ）遺伝子（１０ｋｂｐ超）の活性化である。しかしながら、伝統的な導入遺伝子法は、遺伝子サイズが大きくＡＡＶ容量が限られているため、ユートロフィンを成熟筋肉に効率的に導入することができない。同様の制限は、他の遺伝性疾患を処置する能力に影響を及ぼす（例えば、以下の表１および表２を参照）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的遺伝子活性化（ＴＧＡ）システムは、改変されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９機構および共転写複合体を利用して、１）遺伝子発現のレベルをレスキューし（例えば、急性腎障害後またはｍｄｘモデルにおいてクロトーレベルを回復させる）、２）遺伝的欠陥を補償し（例えば、ジストロフィンの喪失を補償するためにユートロフィンを過剰発現させる）、３）分化転換因子を誘導することによって細胞運命を変える（例えば、Ｐｄｘ１を異所性に発現させることによってインスリン産生細胞を生成する）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１７／１０４，３７２号を参照されたい）。従来の導入遺伝子法はベクター容量によって制限されるため、ＴＧＡシステムは８ｋｂｐを超える遺伝子を活性化する能力において匹敵するものがない。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくＴＧＡシステムは、ゲノムを切断することなく遺伝子活性化のために遺伝子プロモーター内のｇＲＮＡ結合部位にＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１（ＭＰＨ）融合タンパク質を動員するために、Ｃａｓ９およびＭＳ２結合アプタマーループを含む改変ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、またはｄｇＲＮＡを使用する。以前の研究は、ＴＧＡシステムがユートロフィンの内因性発現を誘導することができることを示しているが、活性化レベルは軽度である（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｅｌｌ，１７１（７）：１４９５－１５０７）。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および／または改変シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を多重化して遺伝子発現を相乗的に活性化する多重標的遺伝子活性化（ｍＴＧＡ）システムが本明細書に開示される。実施例において、複数のｃｒＲＮＡおよび／またはｓｇＲＮＡを同時に送達すると、総ＲＮＡ濃度を増加させる必要なく、ユートロフィンの活性化が増強されることが示されている。いくつかの実施例がユートロフィン活性化およびＤＭＤの処置に関連して提供されるが、このシステムは、任意の他の標的遺伝子を活性化するために使用することができ、または標的遺伝子の活性化が望まれる他の疾患を処置するために使用することができる。
ＩＩＩ．多重ｃｒＲＮＡおよび多重ｓｇＲＮＡ
図１～図４を参照すると、多重ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）１００および多重単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）２００をコードする核酸分子が本明細書で提供される。ｃｒＲＮＡおよびｓｇＲＮＡは、ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）中に存在する場合、ＤＮＡによってコードされ、「Ｔ」は、細胞中で発現されてＲＮＡとして転写される場合、「Ｕ」で置換されることを当業者は認識するであろう。したがって、本明細書の特定の配列番号はｃｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、またはそれらの一部について「Ｔ」を示すが、ＲＮＡとして発現される場合、「Ｔ」は「Ｕ」になる。さらに、図１～図４は、プロモーター（例えば、１１０、１１１、１１２、１１３）が示されている場合のコード配列（例えば、ＤＮＡ）を示すが、対応するコードされたＲＮＡはプロモーター配列を含まないであろう。したがって、いくつかの例では、１００および２００は、プロモーター１１０、１１１、１１２、１１３を含まないＲＮＡ分子である。
図１に示されるように、いくつかの実施形態では、多重ｃｒＲＮＡ１００をコードする核酸分子は、複数のｃｒＲＮＡ、例えば２つのｃｒＲＮＡ（例えば、図１）、３つのｃｒＲＮＡ（例えば、図２Ａ～図２Ｂ）またはそれを超えるものをコードする。いくつかの例では、多重ｃｒＲＮＡ１００をコードする核酸分子は、５’から３’に、第１のプロモーター１１０、改変トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）１３０をコードする核酸分子、第１の切断部位１２０、第１のｃｒＲＮＡ１０１をコードする第１の核酸分子、第２の切断部位１２１、および第２のｃｒＲＮＡ１０２をコードする第２の核酸分子を含む。
図２Ａ～図２Ｂに示されるように、いくつかの実施形態では、多重ｃｒＲＮＡ１００をコードする核酸分子は、第２のプロモーター１１１に作動可能に連結された第３のｃｒＲＮＡまたは改変単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする第３の核酸分子１０３をさらに含む。いくつかの例では、第２のプロモーター１１１および第３の核酸分子１０３は順配向であり、ｉ）第２のｃｒＲＮＡ１０２をコードする第２の核酸分子の３’（例えば、図２Ａ）またはｉｉ）第１のプロモーターの５’（図示せず）のいずれかに位置する。他の例では、第２のプロモーター１１１および第３の核酸分子１０３は逆配向であり、第１のプロモーター１１０の５’に位置する（例えば、図２Ｂ）。第２のプロモーター１１１および第３の核酸分子１０３が「逆配向」であるかどうかは、第１のプロモーター１１０の配向に対して決定される。したがって、第２のプロモーター１１１および第３の核酸１０３が「逆配向」である場合、それは、第２のプロモーターおよび第３の核酸の配列が第１のプロモーター１１１の方向とは反対の方向に読み取られることを意味する（例えば、図２Ｂ）。
遺伝子標的は独立して選択されるので、いくつかの例では、第１のｃｒＲＮＡ１０１をコードする第１の核酸分子および第２のｃｒＲＮＡ１０２をコードする第２の核酸分子は異なる遺伝子を標的とし、例えば、第１のｃｒＲＮＡはユートロフィンを標的とすることができ、第２のｃｒＲＮＡはＥＥＦ１α２、Ｆｓｔ、Ｐｄｘ１、クロトー、インターロイキン１０、またはＳｉｘ２を標的とすることができる。他の例では、第２のｃｒＲＮＡはユートロフィンを標的とし、第１のｃｒＲＮＡはＥＥＦ１α２、Ｆｓｔ、Ｐｄｘ１、クロトー、インターロイキン１０またはＳｉｘ２を標的とする。特定の非限定的な例では、第１のｃｒＲＮＡ１０１はユートロフィンを標的とし、第２のｃｒＲＮＡ１０２はＥＥＦ１ａ２を標的とする。
いくつかの実施形態では、第１および第２のｃｒＲＮＡ１０１、１０２は、両方ともユートロフィンを標的とするなど、同じ遺伝子を標的とする。第１および第２のｃｒＲＮＡ１０１、１０２は、同じ標的化配列を使用して同じ遺伝子を標的とすることができる。例えば、第１のｃｒＲＮＡ１０１および第２のｃｒＲＮＡ１０２は両方とも、配列番号８または配列番号９からなることができる。第１のｃｒＲＮＡ１０１および第２のｃｒＲＮＡ１０２はまた、異なる標的化配列を使用して同じ遺伝子を標的とすることができ、例えば、第１のｃｒＲＮＡ１０１は配列番号８からなることができ、第２のｃｒＲＮＡ１０２は配列番号９からなることができる。
いくつかの例では、第１のｃｒＲＮＡ１０１をコードする第１の核酸分子、または第２のｃｒＲＮＡ１０２をコードする第２の核酸分子は、配列番号８、９、４９、５０、５１、もしくは５２と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するか、または配列番号８もしくは配列番号９、４９、５０、５１、もしくは５２からなるか、またはそれを含む。いくつかの例では、第１のｃｒＲＮＡ１０１をコードする第１の核酸分子は、配列番号８もしくは配列番号５１と少なくとも９５％の配列同一性を有するか、または配列番号８もしくは配列番号５１からなるか、またはそれを含む。さらなる例では、第２のｃｒＲＮＡ１０２をコードする第２の核酸分子は、配列番号９もしくは配列番号５２と少なくとも９５％の配列同一性を有するか、または配列番号９もしくは配列番号５２からなるか、またはそれを含む。
いくつかの例では、第３の核酸分子１０３は、改変単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする。改変ｓｇＲＮＡは、少なくとも１つの改変ＭＳ２結合ループ配列をコードする。いくつかの例では、ｓｇＲＮＡは、２またはそれを超える改変ＭＳ２結合ループ配列をコードする。いくつかの例では、改変ｓｇＲＮＡはｄｇＲＮＡである。
いくつかの例では、改変ｓｇＲＮＡは、第１のｃｒＲＮＡ１０１、第２のｃｒＲＮＡ１０２、またはその両方と同じ遺伝子または配列を標的とする標的化配列を含む。いくつかの例では、改変ｓｇＲＮＡは、第１のｃｒＲＮＡ１０１、第２のｃｒＲＮＡ１０２、またはその両方と異なる遺伝子または配列を標的とする標的化配列を含む。特定の非限定的な例では、第１のｃｒＲＮＡ１０１、第２のｃｒＲＮＡ１０２、および改変ｓｇＲＮＡ１０３はすべて、ユートロフィンなどの同じ遺伝子を標的とする。いくつかの例では、改変ｓｇＲＮＡは、第１のｃｒＲＮＡ１０１、第２のｃｒＲＮＡ１０２、またはその両方と同じ遺伝子を標的とするが、第１のｃｒＲＮＡ１０１、第２のｃｒＲＮＡ１０２、またはその両方とは異なる標的化配列を含む（例えば、配列番号２）。さらなる例では、第１のｃｒＲＮＡ１０１、第２のｃｒＲＮＡ１０２、および改変ｓｇＲＮＡはすべて異なる遺伝子または配列を標的とし、例えば、第１のｃｒＲＮＡ１０１、第２のｃｒＲＮＡ１０２、および改変ｓｇＲＮＡの標的は、それぞれユートロフィン、ＥＥＦ１α２、およびＦｓｔであり得る。別の非限定的な例では、第１のｃｒＲＮＡ１０１、第２のｃｒＲＮＡ１０２、および改変ｓｇＲＮＡの標的は、それぞれユートロフィン、ＥＥＦ１ａ２、およびクロトーであり得る。
いくつかの例では、改変ｓｇＲＮＡをコードする第３の核酸分子１０３は、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの例では、改変ｓｇＲＮＡをコードする第３の核酸分子１０３は、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８と少なくとも９５％の配列同一性を有する。特定の非限定的な例では、改変ｓｇＲＮＡをコードする第３の核酸分子１０３は、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、４２、４３、４４、４５、４６、４７、もしくは４８を含むか、またはそれからなる。別の特定の非限定的な例では、改変ｓｇＲＮＡ１０３をコードする第３の核酸分子は、配列番号１２と少なくとも９５％の配列同一性を有するか、または配列番号１２を含むか、またはそれからなる。
特定の非限定的な例では、第１のｃｒＲＮＡ１０１をコードする第１の核酸分子は配列番号８に対して９０％の配列同一性を有し、第２のｃｒＲＮＡ１０２をコードする第２の核酸分子は配列番号９に対して９０％の配列同一性を有し、改変ｓｇＲＮＡをコードする第３の核酸分子１０３は配列番号１２に対して９０％の配列同一性を有する。別の非限定的な例では、第１のｃｒＲＮＡ１０１をコードする第１の核酸分子は配列番号８を含むかまたはそれからなり、第２のｃｒＲＮＡ１０２をコードする第２の核酸分子は配列番号９を含むかまたはそれからなり、改変ｓｇＲＮＡをコードする第３の核酸分子１０３は配列番号１２を含むかまたはそれからなる。さらなる非限定的な例では、第１のｃｒＲＮＡ１０１をコードする第１の核酸分子は配列番号５１に対して９０％の配列同一性を有し、第２のｃｒＲＮＡ１０２をコードする第２の核酸分子は配列番号５２に対して９０％の配列同一性を有する。他の例では、第１のｃｒＲＮＡ１０１をコードする第１の核酸分子は配列番号５１を含むかまたはそれからなり、第２のｃｒＲＮＡ１０２をコードする第２の核酸分子は配列番号５２を含むかまたはそれからなる。
いくつかの例では、第３の核酸分子１０３は第３のｃｒＲＮＡをコードする。いくつかの例では、第３のｃｒＲＮＡは、第１のｃｒＲＮＡ、第２のｃｒＲＮＡ、またはその両方と同じ遺伝子または配列を標的とする標的化配列を含む。いくつかの例では、第３のｃｒＲＮＡは、第１のｃｒＲＮＡ、第２のｃｒＲＮＡ、またはその両方と異なる遺伝子または配列を標的とする標的化配列を含む。特定の非限定的な例では、第１、第２および第３のｃｒＲＮＡはすべて、同じ遺伝子または配列を標的とし、例えばすべてユートロフィンを標的とする。いくつかの例では、第３のｃｒＲＮＡは、第１のｃｒＲＮＡ、第２のｃｒＲＮＡ、またはその両方と同じ遺伝子を標的とするが、第１のｃｒＲＮＡ、第２のｃｒＲＮＡ、またはその両方とは異なる標的化配列を含む。特定の非限定的な例では、第１および第２のｃｒＲＮＡは、ユートロフィンなどの同じ遺伝子または配列を標的とし、第３のｃｒＲＮＡは、Ｆｓｔ１またはＥＥＦ１α２を標的化するなど、第１および第２のｃｒＲＮＡとは異なる遺伝子または配列を標的とする。
いくつかの例では、第３のｃｒＲＮＡ１０３をコードする第３の核酸分子は、配列番号８、９、５１または５２と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む。特定の非限定的な例では、第３のｃｒＲＮＡ１０３をコードする第３の核酸分子は、配列番号８、９、５１または５２と少なくとも９５％の配列同一性を有する。別の非限定的な例では、第３のｃｒＲＮＡをコードする第３の核酸分子１０３は、配列番号８、９、５１もしくは５２からなるか、またはそれを含む。
改変ｔｒａｃｒＲＮＡ１３０をコードする核酸分子は、少なくとも１つの改変ＭＳ２結合ループをさらにコードする。いくつかの例では、改変ｔｒａｃｒＲＮＡは、少なくとも２つの改変ＭＳ２結合ループをコードする。いくつかの例では、改変ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号１７、１８、または１９のうちの１またはそれを超えるものを含む。特定の非限定的な例では、改変ｔｒａｃｒＲＮＡ１３０をコードする核酸分子は、配列番号７と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む。特定の非限定的な例では、改変ｔｒａｃｒＲＮＡ１０３をコードする核酸分子は、配列番号７と少なくとも９５％の配列同一性を含む。他の非限定的な例では、改変ｔｒａｃｒＲＮＡ１３０をコードする核酸分子は、配列番号７を含むか、またはそれからなる。
いくつかの例では、多重ｃｒＲＮＡ１００をコードする核酸分子は、配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む。特定の例では、多重ｃｒＲＮＡ１００をコードする核酸分子は、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有する。さらなる例では、多重ｃｒＲＮＡ１００をコードする核酸分子は、配列番号１を含むか、またはそれからなる。いくつかの例では、多重ｃｒＲＮＡ１００をコードする核酸分子は、配列番号２と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。特定の例では、多重ｃｒＲＮＡ１００をコードする核酸分子は、配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有する。さらなる例では、多重ｃｒＲＮＡ１００をコードする核酸分子は、配列番号２を含むか、またはそれからなる。
図３～図４に示されるように、本明細書には、２またはそれを超える改変ｓｇＲＮＡを含有する多重ｓｇＲＮＡ２００をコードする核酸分子も記載される。改変ｓｇＲＮＡは、少なくとも１つの改変ＭＳ２結合ループ配列をコードする。いくつかの例では、改変ｓｇＲＮＡは、２またはそれを超える改変ＭＳ２結合ループ配列をコードする。いくつかの例では、改変ｓｇＲＮＡは、配列番号１７、１８、または１９のうちの１またはそれを超えるものを含む。いくつかの例では、改変ｓｇＲＮＡはｄｇＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、多重ｓｇＲＮＡ２００をコードする核酸は、２つの改変ｓｇＲＮＡをコードする（例えば、図３Ａ、図３Ｃ、および図３Ｄ）。いくつかの例では、多重ｓｇＲＮＡ２００をコードする核酸は、５’から３’に、第１のプロモーター１１２に作動可能に連結された第１の改変ｓｇＲＮＡ２０１を逆配向にコードする第１の核酸分子と、第２のプロモーター１１３に作動可能に連結された第２の改変ｓｇＲＮＡ２０２を順配向にコードする第２の核酸分子と、を含む（例えば図３Ａを参照）。第１のプロモーター１１２および第１の改変ｓｇＲＮＡ２０１が「逆配向」であるかどうかは、第２のプロモーター１１３の配向に対して判断される。したがって、第１のプロモーター１１２および第１の改変ｓｇＲＮＡ２０１が「逆配向」である場合、それは、配列が第２のプロモーター１１３の方向とは反対の方向に読み取られることを意味する（例えば、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｅ、および図４）。いくつかの例では、多重ｓｇＲＮＡ２００をコードする核酸は、５’から３’に、第１の改変ｓｇＲＮＡ２０１をコードする第１の核酸分子、切断部位１２２、および第２の核酸分子２０２に作動可能に連結された第１のプロモーター１１２を含む（例えば、図３Ｃを参照）。いくつかの例では、多重ｓｇＲＮＡ２００をコードする核酸は、５’から３’に、第１の改変ｓｇＲＮＡ２０１をコードする第１の核酸分子に作動可能に連結された第１のプロモーター１１２と、第２の核酸分子２０２に作動可能に連結された第２のプロモーター１１３と、を含む（例えば図３Ｄを参照）。
いくつかの実施形態では、多重ｓｇＲＮＡ２００をコードする核酸は、３つの改変ｓｇＲＮＡをコードする（例えば、図３Ｂおよび図３Ｅ）。第３の改変ｓｇＲＮＡ２０３は、第１の切断部位１２２によって、第１の改変ｓｇＲＮＡ２０１または第２の改変ｓｇＲＮＡ２０２のいずれかから分離されている。第３の改変ｓｇＲＮＡ２０３が第２の改変ｓｇＲＮＡ２０２の３’に位置する場合、第１の切断部位１２２および第３の改変ｓｇＲＮＡ２０３は順配向（すなわち、第２のプロモーター１１３と同じ配向）にあり、第２のプロモーター１１３に作動可能に連結される（例えば図３Ｂを参照）。あるいは、第３の核酸分子は、第１の改変ｓｇＲＮＡ２０１の５’に位置し得る（例えば図３Ｅを参照）。第３の核酸が第１の改変ｓｇＲＮＡ２０１の５’である場合、第１の切断部位１２２および第３の改変ｓｇＲＮＡ２０３は逆配向（すなわち、第１のプロモーター１１２と同じ配向）にコードされ、第１のプロモーター１１２に作動可能に連結される。
さらなる例では、多重ｓｇＲＮＡ２００をコードする核酸は、４つの改変ｓｇＲＮＡを含む（例えば図４）。多重ｓｇＲＮＡ２００が４つの改変ｓｇＲＮＡコード配列を含む場合、第３の核酸分子は、第２の改変ｓｇＲＮＡ２０２の３’に位置し、第１の切断部位１２２および第３の改変ｓｇＲＮＡ２０３を順配向（すなわち、第２のプロモーター１１３と同じ配向）にコードし、第２のプロモーター１１３に作動可能に連結される。第４の核酸は、第１の改変ｓｇＲＮＡ２０１の５’に位置し、逆配向（すなわち、第１のプロモーター１１２と同じ配向）で第２の切断部位１２３および第４の改変ｓｇＲＮＡ２０４をコードし、第１のプロモーター１１２に作動可能に連結されている。
いくつかの例では、開示の改変ｓｇＲＮＡ２０１、２０２、２０３、２０４、１０３のいずれかの核酸配列は、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、４２、４３、４４、４５、４６、４７、もしくは４８と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を含むか；または、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、４２、４３、４４、４５、４６、４７、もしくは４８からなるか、またはそれを含む。
いくつかの例では、第１の改変ｓｇＲＮＡ２０１をコードする核酸配列は、配列番号１０、１２、もしくは１３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むか；または配列番号１０、１１、もしくは１３を含むか、またはそれからなる。いくつかの例では、第２の改変ｓｇＲＮＡ２０２をコードする核酸配列は、配列番号１０、１１、１３、もしくは１４と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むか；または配列番号１０、１１、１３、もしくは１４を含むか、またはそれからなる。いくつかの例では、第３の改変ｓｇＲＮＡ２０３をコードする核酸配列は、配列番号１０、１１、１４もしくは１５と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むか；または配列番号１０、１１、１４もしくは１５を含むか、またはそれからなる。いくつかの例では、第４の改変ｓｇＲＮＡ２０４をコードする核酸配列は、配列番号１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むか；または配列番号１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５を含むか、またはそれからなる。
非限定的な例では、多重ｓｇＲＮＡ２００をコードする核酸分子は、配列番号３、４、５、６、５３、５４、または５５と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む。いくつかの例では、多重ｓｇＲＮＡ２００をコードする核酸分子は、配列番号３、４、５、６、５３、５４、または５５と少なくとも９５％の配列同一性を含む。さらなる例では、多重ｓｇＲＮＡ２００をコードする核酸分子は、配列番号３、４、５、６、５３、５４、または５５を含むか、またはそれからなる。
例示的な標的化配列
開示されたｃｒＲＮＡ１０１、１０２、１０３および改変ｓｇＲＮＡ２０１、２０２、２０３、２０４、１０３は、目的の配列へのＣａｓ９の標的化を容易にする標的化配列を含む。標的化配列は、各ｃｒＲＮＡ１０１、１０２、１０３または改変ｓｇＲＮＡ２０１、２０２、２０３、２０４、１０３に対して独立して選択される。したがって、多重ｃｒＲＮＡ１００または多重ｓｇＲＮＡ２００に含まれるｃｒＲＮＡ１０１、１０２、１０３または改変ｓｇＲＮＡ２０１、２０２、２０３、２０４、１０３は、同じ標的化配列、異なる配列、またはそれらの組み合わせを含み得る。したがって、個々のｃｒＲＮＡ１０１、１０２、１０３または改変ｓｇＲＮＡ２０１、２０２、２０３、２０４、１０３は、同じ遺伝子、異なる遺伝子、またはそれらの組み合わせを標的とし得る。
標的化配列は、標的配列（例えば、目的の遺伝子内、または目的の遺伝子のプロモーターもしくは調節エレメント内に見出される配列）にハイブリダイズするのに十分な相補性を有する。いくつかの例では、標的配列は、標的遺伝子の発現をモジュレートするために標的とされる。例えば、標的遺伝子の発現を活性化する。いくつかの例では、標的化配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのＣａｓ９またはｄＣａｓ９の配列特異的結合を指示するのに十分な標的配列との相補性を有する。
いくつかの例では、標的化配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、最適にアラインメントされたとき、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９８％、約９９％または１００％である。特定の例では、標的化配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約９０％またはそれを超える。特定の例では、標的化配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約９５％またはそれを超える。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定され得る。非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、標的化配列は約１４～３０ヌクレオチド長である。例えば、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９または約３０ヌクレオチド長である。さらなる例では、標的化配列は、約１４～２８、約１４～２６、約１４～２４、約１４～２２、約１４～２０、約１４～１８、約１４～１７、約１４～１６、約１４～１５、約１６～３０、約１８～３０、約２０～３０、約２２～３０、約２４～３０、約２６～３０、約２８～３０ヌクレオチドである。特定の非限定的な例では、標的化配列は約１４～１６ヌクレオチドである。
いくつかの例では、標的化配列は、例えば、標的遺伝子のプロモーター領域において、標的遺伝子の転写開始部位の近くの配列に相補的である。いくつかの例では、標的化配列は、転写開始部位の約１０、約２５、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１７５、約２００、約３００、約４００、または約５００ヌクレオチド以内にある配列に相補的である。さらなる例において、標的化配列は、転写開始部位の約１～５０、約１～１００、約１～１５０、約１～２００、約１～３００、約１～４００、約１～５００、約１０～５００、約５０～５００、約１００～５００、約１５０～５００、約２００～５００、約２５０～５００、約３００～５００、約３５０～５００、約４００～５００、約１０～５０、約１０～１００、約１０～１５０、約１０～２００、約１０～２５０、約１０～３００、約１０～３５０、約１０～４００、約１０～４５０、約２５～５０、約２５～１００、約２５～１５０、約２５～２００、約２５～２５０、約２５～３００、約２５～３５０、約２５～４００、約２５～４５０、約５０～１００、約５０～１５０、約５０～２００、約５０～２５０、約５０～３００、約５０～３５０、約５０～４００、約５０～４５０、約１００～２００、約１００～２５０、約１００～３００、または約１００～４００ヌクレオチド以内にある配列に相補的である。特定の非限定的な例では、標的化配列は、転写開始部位の約２００ヌクレオチド以内にある配列に相補的である。
標的化配列は、複数の遺伝子が標的とされるように設計することができる。例えば、標的化配列は、遺伝子標的の群の間で保存されている配列を標的とするように設計することができる。例えば、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個またはそれを超える標的遺伝子の間で保存されている標的配列。したがって、遺伝子に関連して使用される「標的」という用語は、単一の遺伝子標的、または単一の標的化配列によって標的とされ得る複数の遺伝子標的を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子標的は、発現の減少が対象において疾患または障害をもたらす、または発現の増加が疾患または障害の症状を軽減することができる遺伝子である。したがって、活性化された遺伝子発現が望まれる。疾患の非限定的な例および活性化のための例示的な遺伝子標的を以下の表１および表２に示す。
Figure 2024515827000073
Figure 2024515827000074
遺伝子標的および疾患の追加の非限定的な例を表２に示す。
Figure 2024515827000075
Figure 2024515827000076
Figure 2024515827000077
追加の例は、米国特許第１０，５５０，３７２号に見出すことができる。
いくつかの例では、ｃｒＲＮＡ（例えば、１０１、１０２、１０３）または改変ｓｇＲＮＡ（例えば、２０１、２０２、２０３、２０４、１０３）は、活性化された発現が望まれる遺伝子を標的とする。例えば、表１または表２に列挙された１またはそれを超える遺伝子を標的とする。いくつかの例では、遺伝子標的は、標的遺伝子、例えば表１または表２に列挙された１またはそれを超える遺伝子のプロモーターまたは調節領域に相補的な標的化配列を使用することによって活性化される。特定の非限定的な例では、ｃｒＲＮＡ（例えば、１０１、１０２、１０３）または改変ｓｇＲＮＡ（例えば、２０１、２０２、２０３、２０４、１０３）は、ＥＥＦ１α２、Ｆｓｔ、Ｐｄｘ１、クロトー、ユートロフィン、インターロイキン１０、Ｓｉｘ２、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、ＭｙｏＤ、Ｍｅｆ２ｂまたはＰａｘ７のプロモーター領域内の配列に相補的な標的化配列を含む。別の非限定的な例では、ｃｒＲＮＡ（例えば、１０１、１０２、１０３）または改変ｓｇＲＮＡ（例えば、２０１、２０２、２０３、２０４、１０３）は、ユートロフィン、ＥＥＦ１ａ２、またはＦｓｔのプロモーター領域内の配列に相補的な標的化配列を含む。さらなる例では、ｃｒＲＮＡ（例えば、１０１、１０２、１０３）または改変ｓｇＲＮＡ（例えば、２０１、２０２、２０３、２０４、１０３）は、ユートロフィン、ＥＥＦ１ａ２、またはクロトーのプロモーター領域内の配列に相補的な標的化配列を含む。いくつかの例では、ｃｒＲＮＡ（例えば、１０１、１０２、１０３）または改変ｓｇＲＮＡ（例えば、２０１、２０２、２０３、２０４、１０３）は、ユートロフィンのプロモーター領域内の配列に相補的な標的化配列を含む。別の特定の非限定的な例では、ｃｒＲＮＡ（例えば、１０１、１０２、１０３）または改変ｓｇＲＮＡ（例えば、２０１、２０２、２０３、２０４）、１０３は、Ｆｏｘａ３、Ｇａｔａ４、ＨＮＦ１ａ、ＨＮＦ４ａのプロモーター領域内の配列に相補的な標的化配列を含む。
例示的な改変ＭＳ２結合ループ
いくつかの実施形態では、改変ｓｇＲＮＡ（例えば、２０１、２０２、２０３、２０４、１０３）または改変ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、１３０）は、２またはそれを超える改変ＭＳ２結合ループを含む。改変ＭＳ２結合ループの配列は、ｇｇｃｃａａｃａｔｇａｇｇａｔｃａｃｃｃａｔｇｔｃｔｇｃａｇｇｇｃｃ（配列番号１６）の天然ＭＳ２結合ループ配列からの少なくとも２つのヌクレオチド変化を含有し、それにより、天然ＭＳ２結合ループ配列と比較して改変ＭＳ２結合ループ配列のＧＣ含有量を増加させ、および／または反復的なコンテンツを短縮する。例えば、改変ＭＳ２結合ループ配列は、天然の配列のＧＣ含有量を増加させる、例えば、ＧＣ含有量を約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％またはそれを超える割合で増加させる、天然ＭＳ２結合ループ配列ｇｇｃｃａａｃａｔｇａｇｇａｔｃａｃｃｃａｔｇｔｃｔｇｃａｇｇｇｃｃ（配列番号１６）に対して約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９または約１０個のヌクレオチド変化を含み得る。さらなる例では、少なくとも４つのヌクレオチド変化がある。適切な増加パーセントには、例えば、約１～５％、約１～８％、約１～１０％、約１～１２％、約１～１５％、約１～２０％、約１～３０％、約１～４０％、約１～５０％、約１～６０％、約５～１０％、約５～２０％、約５～３０％、約５～４０％、約５～５０％、約５～６０％、約１０～２０％、約１０～３０％、約１０～４０％、約１０～５０％、約１０～６０％、約２０～３０％、約２０～４０％、約２０～５０％、約２０～６０％、約３０～４０％、約３０～５０％、約３０～６０％、約４０～５０％、約４０～６０％、または約５０～６０％が含まれる。いくつかの例では、核酸分子のＧＣ含有量は、１またはそれを超える天然「Ａ」を「Ｇ」に置換するか、または１またはそれを超える天然「Ｔ」を「Ｃ」に置換するか、またはそれらの組み合わせによって、「Ｇ」および／または「Ｃ」ヌクレオチドを分子に付加することによって増加する。いくつかの例では、改変ＭＳ２結合ループ配列は約２個のヌクレオチド変化を含み、それによりＭＳ２結合ループ配列のＧＣ含有量が増加する。いくつかの例では、改変ＭＳ２結合ループ配列は約６個のヌクレオチド変化を含み、それによりＭＳ２結合ループ配列のＧＣ含有量が増加する。
いくつかの例では、天然ＭＳ２結合ループ配列に対するヌクレオチド変化は、反復的なコンテンツを約５％、約８％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、または約５０％、またはそれを超える割合で減少させるなど、反復的なコンテンツを短縮する。いくつかの例では、低下は、約１～５％、約１～８％、約１～１０％、約１～１５％、約５～１０％、約５～２０％、約５～３０％、約５～４０％、約５～５０％、約５～６０％、約５～７５％、約１０～２０％、約１０～３０％、約１０～４０％、約１０～５０％、約１０～６０％、約１０～７５％、約２０～３０％、約２０～４０％、約２０～５０％、約２０～６０％、約２０～７５％、約３０～４０％、約３０～５０％、約３０～６０％、約３０～７５％、約４０～５０％、約４０～６０％、約４０～７５％、約５０～６０％、または約５０～７５％である。いくつかの例では、改変ＭＳ２結合ループ配列は約２個のヌクレオチド変化を含み、それによりＭＳ２結合ループ配列の反復的なコンテンツが減少する。いくつかの例では、改変ＭＳ２結合ループ配列は約６個のヌクレオチド変化を含み、それによりＭＳ２結合ループ配列の反復的なコンテンツが減少する。さらなる例では、１またはそれを超える反復ヌクレオチドを欠失させることによって、反復的なコンテンツが短縮または減少する。
特定の例では、改変ＭＳ２結合ループ配列は、配列番号１７、１８または１９のうちの１またはそれを超えるものに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を含む。非限定的な例では、改変ＭＳ２結合ループ配列は、配列番号１７、１８、または１９のうちの１またはそれを超えるものに対して少なくとも９５％の配列同一性を含む。さらなる例では、改変ＭＳ２結合ループ配列は、配列ｔｇｃｔｇａａｃａｔｇａｇｇａｔｃａｃｃｃａｔｇｔｃｔｇｃａｇｃａｇｃａ（配列番号１７）、ｇｇｇｃｃａａｃａｔｇａｇｇａｔｃａｃｃｃａｔｇｔｃｔｇｃａｇｇｇｃｃｃ（配列番号１８）、またはｇｇｃｃａｇｃａｔｇａｇｇａｔｃａｃｃｃａｔｇｃｃｔｇｃａｇｇｇｃｃ（配列番号１９）を含むか、またはそれからなる。
例示的なプロモーター
プロモーター（例えば、多重ｃｒＲＮＡまたは多重ｓｇＲＮＡの第１または第２のプロモーター、例えば１１０、１１１、１１２、１１３）は、任意の適切なプロモーターであり得る。例えば、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６またはＨ１プロモーター）；ｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、必要に応じてＲＳＶエンハンサーを有するレトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター）；必要に応じてＣＭＶエンハンサーを有するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター；ＳＶ４０プロモーター；ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター；β－アクチンプロモーター；ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター；Ｓｐｃ５．１２（筋肉特異的）；ＣＷ３ＳＬ；および／またはＥＦ１αプロモーター。いくつかの例では、プロモーターは、特定の細胞型または器官に特異的である（例えばＳｐｃ５．１２）。他の例では、プロモーターは遍在性である（例えば、ＥＦ１α）。いくつかの例では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトｂ－アクチン（ｈＡＣＴＢ）、ヒト伸長因子－１ａ（ｈＥＦ－１ａ）および／またはサイトメガロウイルス初期エンハンサー／ニワトリｂ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター（例えば、Ｐａｐａｄａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４：８９－１１３，２００４；Ｄａｍｄｉｎｄｏｒｊ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（８）：ｅ１０６４７２，２０１４に記載されるプロモーター）などの最小プロモーターである。一例では、プロモーター１１０、１１１、１１２、１１３のうちの１またはそれを超えるものは、アルブミンプロモーター、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質プロモーター、ヘモペキシンプロモーター、またはヒトアルファ１－アンチトリプシンプロモーターなどの肝臓特異的プロモーターである。
いくつかの例では、第１のプロモーター１１０、１１２および第２のプロモーター１１１、１１３は、異なる配列からなるか、または異なる配列を含む。他の例では、第１のプロモーター１１０、１１２および第２のプロモーター１１１、１１３は、同じ配列からなるか、またはそれを含む。いくつかの例では、第１のプロモーター１１０、１１２および／または第２のプロモーター１１１、１１３は、ｍＵ６、ｈＵ６、Ｈ１または７ＳＫプロモーターである。特定の非限定的な例では、第１のプロモーター１１０、１１２はｈＵ６またはｍＵ６であり、第２のプロモーター１１１、１１３はｈＵ６またはｍＵ６である。いくつかの例では、プロモーター１１０～１１３は、特定の組織または細胞型、例えばＳｐｃ ５．１２（筋肉特異的）またはＣｏｌ１ａ２（線維芽細胞特異的）に対してトロピズムを付与するか、または刺激に応答して誘導可能である。プロモーター選択は、組織または細胞標的の選択、形質転換される宿主細胞、所望の発現レベルなどの因子に依存し得ることが当業者によって理解される。
例示的な切断部位
切断部位、例えば、多重ｃｒＲＮＡの第１の切断部位１２０もしくは第２の切断部位１２１、または多重ｓｇＲＮＡの第１の切断部位１２２もしくは第２の切断部位１２３は、ＲＮＡに転写されると切断され得る配列である。適切な切断機構には、自己切断、例えば自己切断リボザイム、または宿主細胞の内因性機構による切断、例えばプレｔ－ＲＮＡ切断が含まれる。
いくつかの例では、切断部位（例えば、１２０、１２１、１２２、１２３）は自己切断ＲＮＡである。いくつかの例では、切断部位（例えば、１２０、１２１、１２２、１２３）は、プレｔＲＮＡ配列を含むか、またはそれからなる。他の例では、切断部位（例えば、１２０、１２１、１２２、１２３）は、肝炎デルタウイルスハンマーヘッドリボザイム（ＨＤＶ－ＨＨ）などの自己切断リボザイムを含むかまたはこれからなる。第１の切断部位１２０、１２２および第２の切断部位１２１、１２３は、異なる配列からなるかもしくはそれを含むことができ、または同じ配列からなるかもしくはそれを含んでもよい。特定の非限定的な例において、第１の切断部位１２０、１２２はプレｔＲＮＡ配列であり、第２の切断部位１２１、１２３はハンマーヘッドなどの自己切断リボザイムである。他の非限定的な例では、第１の切断部位１２０、１２２はプレｔＲＮＡ配列であり、第２の切断部位１２１、１２３もプレｔＲＮＡ配列である。いくつかの例では、第１の切断部位１２０、１２２はプレｔＲＮＡ配列であり、第２の切断部位１２１、１２３は異なる生物由来のプレｔＲＮＡ配列である。非限定的な例では、一方の切断部位は酵母由来のプレｔＲＮＡであることができ、他方はＺｅａ ｍａｙｓなどの植物由来のプレｔＲＮＡであることができる。特定の非限定的な例では、多重ｃｒＲＮＡ１００の第１の切断部位１２０は、配列番号２０または配列番号２１を含むかまたはそれからなり、第２の切断部位１２１は、配列番号２２を含むかまたはそれからなる。他の特定の非限定的な例では、多重ｓｇＲＮＡ２００の第１の切断部位１２２は、配列番号２０または配列番号２１を含むかまたはそれからなり、多重ｓｇＲＮＡ２００の第２の切断部位１２３は、配列番号２０または配列番号２１を含むかまたはそれからなる。
Ａ．多重ｃｒＲＮＡおよび多重ｓｇＲＮＡを含むベクター
多重ｃｒＲＮＡ、多重ｓｇＲＮＡ、またはその両方をコードする１またはそれを超える核酸分子を含むウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、または単純ヘルペスウイルス）またはプラスミドなどのベクターも提供される。いくつかの例では、ベクターは、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ１０ベクター、ＡＡＶ１１ベクター、ＡＡＶ１２ベクター ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂベクター、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢベクター、またはＡＡＶ－ＰＨＰ．ＳベクターなどのＡＡＶベクターである。特定の非限定的な例では、ベクターはＡＡＶ９ベクターである。いくつかの例では、ベクターは、Ａｄ５などのアデノウイルスベクターである。ベクターは、他のエレメント、例えば選択マーカー、例えば抗生物質、例えばピューロマイシン、ハイグロマイシン、または検出可能なマーカー、例えばフルオロフォア（例えば、ＧＦＰまたはＲＦＰ）もしくはルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。ベクターは、天然に存在するまたは天然に存在しないヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含むことができる。開示されるベクターは、本明細書中に提供される方法、組成物およびキットにおいて使用され得る。
Ｂ．多重ｃｒＲＮＡおよび多重ｓｇＲＮＡを含む組成物およびキット
本明細書で提供される多重ｃｒＲＮＡもしくは多重ｓｇＲＮＡ、または本明細書で提供される１またはそれを超える多重ｃｒＲＮＡもしくは多重ｓｇＲＮＡをコードする１またはそれを超える核酸を含む組成物およびキットも提供される。例えば、組成物は、開示された多重ｃｒＲＮＡもしくは多重ｓｇＲＮＡ、多重ｃｒＲＮＡもしくは多重ｓｇＲＮＡによってコードされる開示されたＲＮＡ分子、多重ｃｒＲＮＡもしくは多重ｓｇＲＮＡをコードする開示されたベクター、または多重ｃｒＲＮＡもしくは多重ｓｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体をコードする１またはそれを超える核酸、および薬学的に許容され得る担体（例えば、食塩水、水、またはＰＢＳ）を含み得る。いくつかの例では、多重ｃｒＲＮＡもしくは多重ｓｇＲＮＡ、またはそれらのＲＮＡをコードする１またはそれを超える核酸は、組成物の一部である細胞中に存在する。いくつかの例では、組成物は、液体、凍結乾燥粉末、または凍結保存されている。
組成物は、インビトロまたはインビボでの製剤化および投与に適している。適切な担体およびそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｏｙｄ Ｖ．Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）．に記載されている。薬学的に許容され得る担体には、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではない材料が含まれ、すなわち、その材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含有される医薬組成物の他の成分と有害な様式で相互作用することなく対象に投与される。対象に投与される場合、担体は、必要に応じて、有効成分（例えば、多重ｃｒＲＮＡおよび／または多重ｓｇＲＮＡを含むベクター）の分解を最小限に抑え、対象における有害な副作用を最小限に抑えるように選択される。
いくつかの実施形態では、投与のための開示された組成物は、水性担体などの薬学的に許容され得る担体に溶解される。種々の水性担体、例えば緩衝食塩水などを使用することができる。これらの溶液は無菌であり得、一般に望ましくない物質を含まない。これらの組成物は滅菌されてもよい。組成物は、生理学的条件に近似するために必要とされる薬学的に許容され得る補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有し得る。これらの製剤中の活性薬剤の濃度は様々であり得、選択された特定の投与様式および対象の必要性に従って、主に体液量、粘度、体重などに基づいて選択することができる。
医薬製剤は、所望の純度を有する開示された核酸分子、ＲＮＡ分子、ベクター、またはＲＮＰ複合体を、任意の薬学的に許容され得る担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって調製することができる。そのような製剤は、凍結乾燥製剤または水性液剤であり得る。
許容され得る担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性である。許容され得る担体、賦形剤、または安定剤は、アセテート、ホスフェート、シトレート、および他の有機酸；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）防腐剤、および低分子量ポリペプチド；血清アルブミンもしくはゼラチンなどのタンパク質、またはポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；およびアミノ酸、単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤；イオン性および非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート）；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤であり得る。
経口投与に適した製剤は、（ａ）水、食塩水、またはＰＥＧ ４００などの希釈剤に懸濁された、有効量の開示された核酸分子、ＲＮＡ、またはベクター、ＲＮＰ複合体、またはそれらの組み合わせなどの液剤；（ｂ）所定量の有効成分を液体、固体、顆粒またはゼラチンとしてそれぞれ含有するカプセル剤、サシェ剤または錠剤；（ｃ）適切な液体中の懸濁剤；および（ｄ）適切な乳剤を含むことができる。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝化剤、湿潤剤、保存剤、香味剤、染料、崩壊剤、および薬学的に適合性の担体のうちの１またはそれを超えるもの含むことができる。ロゼンジ形態は、香味剤、例えばスクロース中に有効成分を含むことができ、ならびに、有効成分に加えて担体を含有する、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアのエマルジョン、ゲルなどの不活性基剤中に有効成分を含むパステル剤も含むことができる。
開示される核酸分子（例えば、ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ）、ＲＮＡ分子、ベクター、またはＲＮＰ複合体は、単独で、または他の適切な成分と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることができる（すなわち、それらは「噴霧」することができる）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容され得る噴射剤に入れることができる。
例えば、関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内、および皮下経路などによる非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる水性および非水性の等張性滅菌注射液剤、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含むことができる水性および非水性の滅菌懸濁剤が含まれる。提供される方法において、組成物は、例えば、静脈内注入によって、経口的に、局部に、腹腔内に、膀胱内に、腫瘍内に、または髄腔内に投与され得る。非経口投与、腫瘍内投与および静脈内投与が好ましい投与方法である。化合物の製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数用量の密封容器で提供することができる。
注射液剤および懸濁剤は、前記の種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。エクスビボ治療のために開示される核酸で形質導入または感染された細胞は、上記のように静脈内または非経口投与することもできる。
医薬製剤は、単位剤形であり得る。このような形態では、製剤は、適切な量の活性成分を含有する単位用量に細分される。したがって、医薬組成物は、投与方法に応じて様々な単位剤形で投与することができる。例えば、経口投与に適した単位剤形としては、粉剤・散剤（powder）、錠剤、丸剤、カプセル剤およびロゼンジ剤が挙げられるが、これらに限定されない。
開示された多重ｃｒＲＮＡもしくは多重ｓｇＲＮＡ（ＡＡＶベクターなどのベクターの一部であり得る、および／または哺乳動物細胞などの細胞中に存在し得る）または本明細書で提供される１またはそれを超える多重ｃｒＲＮＡもしくは多重ｓｇＲＮＡをコードする１またはそれを超える核酸を含むキットも提供される。キットは、Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質をコードする核酸をさらに含み得る（ＡＡＶベクターなどのベクターの一部であり得る、および／または哺乳動物細胞などの細胞中に存在し得る）。いくつかの例では、キットはＣａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質をさらに含む。キットは、ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）の一部であり得る、および／または哺乳動物細胞などの細胞中に存在し得る、ＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質（例えば、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１）をコードする核酸をさらに含み得る。いくつかの例では、Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質をコードする核酸およびＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸は、単一のウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）の一部である。いくつかの例では、ＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸は、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１、例えば配列番号３５と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質配列をコードする配列をコードする。
一例では、組成物またはキットは、１またはそれを超えるＣａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質と、１またはそれを超える開示されたｃｒＲＮＡおよび改変ｔｒａｃｒＲＮＡ、または改変ｓｇＲＮＡとで構成されるリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体（例えば、ｍＴＧＡ複合体）、および、１またはそれを超える転写活性化因子（例えば、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１）を含む。いくつかの例では、ＲＮＰ複合体は、開示されたｃｒＲＮＡおよび改変ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。さらなる例では、ＲＮＰ複合体は、開示された改変ｓｇＲＮＡ（開示されたｄｇＲＮＡを含む）を含む。
さらなる例では、組成物またはキットは、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質をコードするベクターと、１またはそれを超える開示されたｃｒＲＮＡまたは改変ｓｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡを含む）をコードし、ＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質をコードするベクターと、を含む。一例では、組成物またはキットは、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質コード配列、ｃｒＲＮＡまたは改変ｓｇＲＮＡ分子、ＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸、ＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質（例えば、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１）、またはそれらの組み合わせを含む細胞、例えば細菌細胞または真核細胞を含む。一例では、組成物またはキットは、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質コード配列、開示されるＲＮＡ分子（例えば、ｃｒＲＮＡ、改変ｔｒａｃｒＲＮＡ、改変ｓｇＲＮＡ、多重ｃｒＲＮＡ、多重ｓｇＲＮＡ）、多重ｃｒＲＮＡまたは多重ｓｇＲＮＡをコードする核酸、ＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質（例えば、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ １）、ＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸、またはそれらの組み合わせを含む無細胞系を含む。
いくつかの例では、キットは、送達システム（例えば、リポソーム、粒子、エキソソーム、マイクロベシクル、ウイルスベクターまたはプラスミド）および／または標識（例えば、細胞型特異的取り込みを指示する／エンドソーム脱出を増強する／血液脳関門横断を可能にするなどのために、ＲＮＰまたはＲＮＰを含有する粒子のいずれかに直接コンジュゲートすることができるペプチドまたは抗体）を含む。いくつかの例では、キットは、細菌、植物、昆虫、または哺乳動物細胞を成長させるのに適した培地などの細胞培養または成長培地をさらに含む。いくつかの例では、キットの成分は別個の容器（ガラスまたはプラスチックバイアルなど）内にある。
Ｃ．多重ｃｒＲＮＡおよび多重ｓｇＲＮＡを含む細胞
本明細書で提供される多重ｃｒＲＮＡもしくは多重ｓｇＲＮＡ、または本明細書で提供される１またはそれを超える多重ｃｒＲＮＡもしくは多重ｓｇＲＮＡをコードする１またはそれを超える核酸を含む細胞が提供される。いくつかの例では、そのような細胞は、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質も含む。いくつかの例では、そのような細胞はまた、ＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質を含む。多重ｃｒＲＮＡおよび多重ｓｇＲＮＡ（それらのＲＮＡ分子を含む）をコードする核酸分子、ならびにＣａｓ９、ｄＣａｓ９、および／またはＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸分子を細胞に導入して、形質転換（例えば、組換え）細胞を生成することができる。そのような組換え細胞は、本明細書中に提供される方法、組成物およびキットにおいて使用され得る。いくつかの例では、そのような細胞は、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９および／またはＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質ならびに１またはそれを超える多重ｃｒＲＮＡ分子および多重ｓｇＲＮＡ分子を、例えばリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として細胞に導入することによって生成される。
そのような組換え細胞は、真核生物または原核生物であり得る。そのような細胞の例としては、細菌、古細菌、植物、真菌、酵母、昆虫、および哺乳動物細胞、例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＰｉｃｈｉａ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞、Ｘｅｎｏｐｕｓ細胞、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、および不死化哺乳動物細胞株（例えば、Ｈｅｌａ細胞、骨髄系細胞株、肝細胞株およびリンパ系細胞株）が挙げられるが、これらに限定されない。一例では、細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞などの原核細胞である。
一例では、細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞などの真核細胞である。一例では、細胞は、初代真核細胞、幹細胞、腫瘍／癌細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、血球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、Ｔｒｅｇなど）、造血幹細胞、特殊化免疫細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球または腫瘍抑制リンパ球）、腫瘍微小環境中の間質細胞（例えば、癌関連線維芽細胞など）、膵臓細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、または筋肉細胞である。一例では、細胞は、中枢または末梢神経系の脳細胞（例えば、ニューロン、星状膠細胞、ミクログリア、網膜神経節細胞、桿体／錐体など）である。
一例では、細胞は、対象から得られたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、タンパク質、またはそれらの組み合わせを含有する生物学的検体などの生物学的試料の一部である（またはそれから得られる）。例としては、末梢血、血清、血漿、尿、唾液、痰、組織生検、細針吸引物、外科検体、および剖検材料が挙げられるが、これらに限定されない。
一例では、細胞は、腫瘍、例えば、血液腫瘍（例えば、急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病および骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病および慢性リンパ球性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低グレード、中グレード、高グレードを含む）、多発性骨髄腫、ワルデンストロームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、マントル細胞リンパ腫および骨髄異形成）または固形腫瘍（例えば、肉腫および癌：線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性腫瘍、膵臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、膀胱癌、ならびにＣＮＳ腫瘍（神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫など））に由来する。
ＩＶ．多重標的化遺伝子活性化（ｍＴＧＡ）システム
多重標的化遺伝子活性化（ｍＴＧＡ）システムも提供される。このシステムは、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９をコードする核酸（その発現はプロモーターによって駆動され得る）を含む第１のベクター（例えばウイルスベクター、例えばＡＡＶ、またはレンチウイルスベクター）と、本明細書に開示される多重ｃｒＲＮＡまたは多重ｓｇＲＮＡの１またはそれを超えるものをコードする１またはそれを超える核酸およびＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質（例えば、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１などであり、その発現はプロモーターによって駆動され得る）をコードする核酸を含む第２のベクター（例えばウイルスベクター、例えばＡＡＶ、またはレンチウイルスベクター）とを含み得る。いくつかの例では、ＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸は、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１、例えば配列番号３５と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質配列をコードする配列をコードする。
いくつかの例では、第１および第２のベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ１０ベクター、ＡＡＶ１１ベクター、ＡＡＶ１２ベクター ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂベクター、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢベクター、またはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓベクター）またはアデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ５）などのウイルスベクターである。一例では、第１および第２のベクターはＡＡＶ９またはＡｄ５ベクターである。いくつかの例では、第１および第１および第２のベクター（the first and first and second vector）はＡＡＶ８ベクターである。いくつかの例では、使用されるＡＡＶベクターは、腎臓細胞、筋細胞、または膵臓細胞などの特定の組織または細胞型に対するトロピズムを有する。
いくつかの例では、第１のベクターは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの例では、第１のベクターは、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸、例えば配列番号３１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含み、Ｃａｓ９タンパク質はエンドヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの例では、第１のベクターは、エンドヌクレアーゼ活性が低下しているかまたは全くないｄＣａｓ９タンパク質などのｄＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの例では、第１のベクターは、ｄＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、例えば配列番号３３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含み、ｄＣａｓ９タンパク質は低下したエンドヌクレアーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの例では、核酸分子によってコードされるｄＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｄ９８６Ａ、またはそれらの組み合わせの変異を有する。
いくつかの例では、第１のベクターは、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含み、ＶＰ６４、Ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９またはそれらの任意の組み合わせなどの転写活性化因子をコードしない。したがって、いくつかの例では、第１のベクターによってコードされるＣａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９転写活性化因子融合タンパク質またはｄＣａｓ９転写活性化因子融合タンパク質ではない。
第２のベクターは、本明細書に開示される多重ｃｒＲＮＡまたは多重ｓｇＲＮＡをコードする１またはそれを超える核酸、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、５３、５４または５５と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するものを含む。一例では、コードされた多重化ｃｒＲＮＡまたは改変ｓｇＲＮＡは、配列番号１、２、３、４、５、６、５３、５４、または５５と少なくとも９５％の配列同一性を有する。
第２のベクターはまた、ＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸を含む。ＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質は、転写活性化ドメインと直接的または間接的に（例えば、リンカーを介して）融合したＭＳ２ドメインを含む。例示的な転写活性化ドメインとしては、ＶＰ６４、Ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの例では、ＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸は、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１、例えば配列番号３５と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質配列をコードする配列をコードする。
いくつかの例では、ｍＴＧＡシステムは、複数の遺伝子を標的とすることを可能にする。いくつかの例では、ｍＴＧＡシステムは、１またはそれを超える追加の多重ｃｒＲＮＡ、多重ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、改変ｓｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡを含む）をさらに含む。追加の多重ｃｒＲＮＡ、多重ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、または改変ｓｇＲＮＡを使用して、例えば、目的の異なる遺伝子を標的とすることができる。そのような追加の多重ｃｒＲＮＡ、多重ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、または改変ｓｇＲＮＡは、追加のベクター上に存在し得るか、または第２のベクター上に存在し得る。
Ｖ．標的とする遺伝子活性化の方法
インビトロで、または対象において、少なくとも１つの遺伝子産物の発現を増加させる（例えば、発現を活性化させる）方法が本明細書で提供される。発現が増加する遺伝子産物は、遺伝子自体（例えば、ＤＮＡ）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および非コードＲＮＡなど）、または遺伝子産物（例えば、タンパク質）であり得る。インビトロで使用される場合、発現は、真核細胞または原核細胞などの細胞、例えば哺乳動物細胞において増加させることができる。インビボで使用される場合、発現は、哺乳動物（例えば、マウス、非ヒト霊長類、または他の獣医学的対象）またはヒトなどの対象において増加し得る。
開示された多重ｃｒＲＮＡ、多重ｓｇＲＮＡ、およびｍＴＧＡシステムを使用する方法も本明細書で提供される。そのような方法を使用して、対象における少なくとも１つの標的遺伝子産物、例えば対象において発現が低下している遺伝子の発現を増加させることができる。いくつかの例では、開示される方法は、遺伝子（原因遺伝子）の発現低下によって引き起こされる対象の疾患を処置する。いくつかの例では、標的遺伝子は原因遺伝子である。他の例では、標的遺伝子は原因遺伝子ではなく、代わりに、標的遺伝子の発現の増加は、例えば、標的遺伝子が原因遺伝子の機能的アナログである場合、原因遺伝子の機能の損失を補償する。いくつかの例では、本方法は、標的遺伝子または遺伝子産物の発現を、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、または約５００％増加させる。さらなる例では、本方法は、標的遺伝子または遺伝子産物の発現を、約１０～５００％、約１０～４００％、約１０～３００％、約１０～２００％、約１０～１００％、約１０～９０％、約１０～８０％、約１０～７０％、約１０～６０％、約１０～５０％、約１０～４０％、約１０～３０％、約１０～２０％、約２０～５００％、約３０～５００％、約４０～５００％、約５０～５００％、約６０～５００％、約７０～５００％、約８０～５００％、約９０～５００％、約１００～５００％、約２００～５００％、約３００～５００％、約４００～５００％、約２５～１００％、約２５～２００％、約５０～１００％、約５０～２００％、約５０～３００％、約５０～４００％、約５０～５００％、約１００～２００％、約１００～３００％、約１００～４００％、約１００～５００％、約２００～３００％、約２００～４００％、または約２００～５００％増加させる。
いくつかの例では、本方法は、対象において少なくとも１つの遺伝子産物の発現を増加させる（例えば、発現を活性化させる）インビボ方法である。いくつかの例では、遺伝子産物は標的遺伝子の産物である。本方法は、治療有効量の多重標的化遺伝子活性化（ｍＴＧＡ）システムを対象に投与することを含む。ｍＴＧＡシステムの成分は、細胞（例えば、対象内の細胞、例えば筋肉、肝臓、心臓、肺、腎臓、脊髄、または胃の細胞、例えば肝臓または筋肉細胞）に感染し、それにより、対象における少なくとも１つの遺伝子産物の発現を増加させる。
いくつかの例では、本方法は、細胞または無細胞系において少なくとも１つの遺伝子産物の発現を増加させる（例えば、発現を活性化させる）インビトロ方法である。いくつかの例では、遺伝子産物は標的遺伝子の産物である。本方法は、有効量の多重標的化遺伝子活性化（ｍＴＧＡ）システムを細胞または無細胞系と接触させることを含む。ｍＴＧＡシステムの成分は、インビトロ細胞（例えば、哺乳動物細胞）に感染するか、または無細胞系で発現し、それによって感染細胞または無細胞系における少なくとも１つの遺伝子産物の発現を増加させる。
ｍＴＧＡシステムは、全身投与または局所投与などの公知の方法に従って投与される。特定の例では、静脈内投与、例えばボーラスとして、または一定期間にわたる連続注入によって、または筋肉内、腹腔内、脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局部、腫瘍内、または吸入経路が使用される。一例では、投与は、肝臓または肝静脈または肝動脈への直接投与である。したがって、開示されたｍＴＧＡシステムは、局部に、経口、非経口、静脈内、関節内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮、肝内、頭蓋内、腫瘍内、骨内、噴霧／吸入、肝臓またはその脈管構造へ、または気管支鏡法による設置（installation）による、を含むいくつかの投与経路のいずれかを介して投与することができる。したがって、組成物は、局所処置が望ましいか全身処置が望ましいか、および処置される領域に応じて、いくつかの方法で投与される。
本明細書に開示されるｍＴＧＡシステムの有効量は、少なくとも部分的に、使用される特定のベクター；個人のサイズ、年齢、性別；および増殖細胞のサイズおよび他の特徴に基づき得る。例えば、ヒトの処置のためには、体重ｋｇあたり少なくとも１０３個のウイルスゲノム（ｖｇ）のウイルスベクターが使用され、例えば少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、少なくとも１０１２、少なくとも１０１３、少なくとも１０１４、少なくとも１０１５、少なくとも１０１６、少なくとも１０１７、少なくとも１０１８、少なくとも１０１９、または少なくとも１０２０ｖｇ／ｋｇ体重、例えば約１０３～１０２０、１０９～１０１６、１０１２～１０１５、または１０１３～１０１４ｖｇ／ｋｇ体重のウイルスゲノムが使用される。
開示される組成物、例えばウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）は、単回用量または複数回用量（例えば、２、３、４、６、またはそれを超える用量）で投与することができる。複数回の用量は、併せてまたは連続的に（例えば、数日または数週間にわたって）投与することができる。
本方法で使用されるｍＴＧＡシステムは、（１）Ｃａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む第１のベクター、および（２）本明細書に開示される多重化ｃｒＲＮＡまたは多重化ｓｇＲＮＡおよびＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸を含む第２のベクターを含み得る。いくつかの例では、第１および第２のベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、例えば、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ１０ベクター、ＡＡＶ１１ベクター、ＡＡＶ１２ベクター、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂベクター、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢベクター、またはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓベクターである。一例では、第１および第２のベクターはＡＡＶ９ベクターである。いくつかの例では、使用されるＡＡＶベクターは、腎臓細胞、骨格筋細胞、肝臓細胞、または膵臓細胞などの特定の組織または細胞型に対するトロピズムを有する（例は本明細書の他の箇所に提供される）。
ＤＮＡ二本鎖切断を導入することなく遺伝子活性化を可能にする開示されたｍＴＧＡシステムのためのエレメントを選択する場合、使用されるＣａｓ９タンパク質または改変ｓｇＲＮＡのいずれかがデッド形態であるか、またはその両方である必要がある。したがって、いくつかの例では、ｄＣａｓ９タンパク質（例えば、配列番号３３）を多重ｃｒＲＮＡまたは多重ｓｇＲＮＡと共に使用する。いくつかの例では、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、配列番号３１）は多重ｃｒＲＮＡまたは多重ｓｇＲＮＡとともに使用され、改変ｓｇＲＮＡはｄｇＲＮＡである。
いくつかの例では、第１のベクターは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの例では、第１のベクターは、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸、例えば配列番号３１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含み、Ｃａｓ９タンパク質はエンドヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの例では、第１のベクターは、エンドヌクレアーゼ活性が低下しているかまたは全くないｄＣａｓ９タンパク質などのｄＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの例では、第１のベクターは、ｄＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、例えば配列番号３３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含み、ｄＣａｓ９タンパク質は低下したエンドヌクレアーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの例では、核酸分子によってコードされるｄＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｄ９８６Ａ、またはそれらの組み合わせの変異を有する。
いくつかの例では、第１のベクターは、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含み、ＶＰ６４、Ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９またはそれらの任意の組み合わせなどの転写活性化因子をコードしない。したがって、いくつかの例では、第１のベクターによってコードされるＣａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９転写活性化因子融合タンパク質またはｄＣａｓ９転写活性化因子融合タンパク質ではない。
いくつかの実施形態では、第２のベクターは、本明細書に開示される多重ｃｒＲＮＡまたは多重ｓｇＲＮＡ、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、５３、５４または５５と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するものをコードする。非限定的な例では、コードされた多重化ｃｒＲＮＡは、配列番号１または２と少なくとも９５％の配列同一性を有する。別の非限定的な例では、コードされた多重化ｓｇＲＮＡは、配列番号３、４、５、６、５３、５４または５５と少なくとも９５％の配列同一性を有する。
第２のベクターはまた、ＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸を含む。ＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質は、転写活性化ドメインと直接的または間接的に（例えば、リンカーを介して）融合したＭＳ２ドメインを含む。例示的な転写活性化ドメインとしては、ＶＰ６４、Ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの例では、ＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸は、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１、例えば配列番号３５と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質配列をコードする配列をコードする。
いくつかの例では、ｍＴＧＡシステムは、１またはそれを超える追加の多重ｃｒＲＮＡ、多重ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、もしくは改変ｓｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡを含む）、またはこれらをコードする核酸分子をさらに含む。追加の多重ｃｒＲＮＡ、多重ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡ、またはこれらをコードする核酸分子を、例えば、目的の異なる遺伝子を標的とするために使用することができる。そのような追加の多重ｃｒＲＮＡ、多重ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、または改変ｓｇＲＮＡは、追加のベクター上に存在し得るか、または第２のベクター上に存在し得る。
一例では、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９および／またはＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質は、大腸菌などの組換え細胞で発現され、精製される。次いで、得られた精製Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９および／またはＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質を、開示されたコードされた多重ｃｒＲＮＡ、多重ｓｇＲＮＡまたはそれらのＲＮＡ産物のうちの１またはそれを超えるものと共に、１またはそれを超える遺伝子が上方調節され得る細胞または生物に導入する。いくつかの例では、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、および／またはＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質およびコードされた多重ｃｒＲＮＡ、多重ｓｇＲＮＡ、またはそれらのＲＮＡ産物は、別個の成分として細胞／生物に導入される。他の例では、精製Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９および／またはＭＳ２転写活性化因子融合物を開示されるＲＮＡ分子（例えば、開示される多重ｃｒＲＮＡまたは多重ｓｇＲＮＡのＲＮＡ分子）と複合体化し、このリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を、（例えば、トランスフェクションまたは注射を使用して）標的細胞に導入する。いくつかの例では、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９および／またはＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質およびＲＮＡ分子（またはこれらをコードする核酸分子）を、胚（例えば、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、またはＸｅｎｏｐｕｓの胚）に注入する。Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質、ＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質、およびＲＮＡ分子（またはこれらをコードする核酸分子）が細胞内にあると、１またはそれを超える標的核酸分子の発現を活性化することができる。
細胞または生物において、１またはそれを超える核酸分子または遺伝子、例えば、約１、約２、約３、約４、または約５、約６、約７、約８、約９、または約１０個の異なる核酸分子または遺伝子が、開示される方法によって標的とされ得る。いくつかの例において、約１～１０個、約１～９個、約１～８個、約１～７個、約１～６個、約１～５個、約１～４個、約１～３個、約１～２個、約２～１０個、約３～１０個、約４～１０個、約５～１０個、約６～１０個、約７～１０個、約８～１０個、約９～１０個、約２～４個、約２～６個、約２～８個、約２～１０個、約４～６個、約４～８個、約４～１０個、約６～８個、約６～１０個、または約８～１０個の異なる核酸分子または遺伝子が、開示される方法によって標的とされる。いくつかの例では、開示される方法は、１またはそれを超える遺伝子の非発現または発現の減少（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の減少）に関連する疾患を処置または予防するために使用される。一例では、標的は、Ｉ型糖尿病、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは急性腎疾患などの疾患に関連する。いくつかの例では、疾患は、肝臓、筋肉、膵臓または腎臓の疾患である。いくつかの例では、疾患は、アラジール症候群などの肝臓の疾患；アルファ－１アンチトリプシン欠損症（アルファ－１）；胆道閉鎖；肝硬変；ガラクトース血症；ギルバート症候群；ヘモクロマトーシス；リソソーム酸リパーゼ欠損症（ＬＡＬ－Ｄ）；非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）；原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）；原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）；Ｉ型糖原病（ＧＳＤ Ｉ）；およびウィルソン病である。いくつかの例では、標的とされる（例えば活性化される）遺伝子または遺伝子産物は、Ｆｓｔ、Ｐｄｘ１、クロトー、ユートロフィン、インターロイキン１０、インスリン１、インスリン２、Ｐｃｓｋ１、Ｓｉｘ２、Ｆｏｘａ３、Ｇａｔａ４、ＨＮＦ１ａおよびＨＮＦ４ａのうちの１またはそれを超えるものである。特定の非限定的な例では、疾患は筋ジストロフィーであり、原因遺伝子はジストロフィンであり、標的遺伝子はユートロフィンである。別の非限定的な例では、疾患は肝線維症および／または肝硬変などの肝疾患であり、標的遺伝子はＦｏｘａ３、Ｇａｔａ４、ＨＮＦ１ａおよび／またはＨＮＦ４ａである。
開示される方法で標的とすること（例えば、活性化）ができる遺伝子と共に処置することができる疾患の具体例を表１および表２に提供する。特定の実施形態では、標的化配列は、標的遺伝子の転写開始部位の少なくとも約１０ｎｔ、約２５ｎｔ、約５０ｎｔ、約６０ｎｔ、約７０ｎｔ、約８０ｎｔ、約９０ｎｔ、約１００ｎｔ、約１１０ｎｔ、約１２０ｎｔ、約１３０ｎｔ、約１４０ｎｔ、約１５０ｎｔ、約１７５ｎｔ、約２００ｎｔ、約３００ｎｔ、約４００ｎｔ、または約５００ｎｔ以内にある配列に相補的である。
ＶＩ．レポーター
Ｃａｓ９（例えば、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９）が発現されるか、またはＣａｓ９発現ステップを有する場合など、遺伝子活性化を測定するためのシステム、キット、および方法が本明細書に開示される。本明細書における遺伝子活性化を測定するためのシステム、キットおよび方法は、例えば、遺伝子活性化（例えば、本明細書中に開示されるｍＴＧＡシステムによる遺伝子活性化の効率）および／または細胞の単離もしくは選別（例えば、遺伝子活性化を伴う細胞の単離もしくは選別、または遺伝子活性化を伴わない細胞の単離もしくは選別）の効率をアッセイするために使用することができる。
Ｃａｓ９が発現されたときの遺伝子活性化を測定するためのシステムおよびキットが、本明細書中に提供される。いくつかの例では、システムおよびキットは、少なくとも１つの遺伝子活性化ベクターおよび少なくとも１つのレポーターベクターを含む。Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９を含むＣａｓ９は、Ｃａｓ９（例えばＣａｓ９またはｄＣａｓ９）をコードするベクター（例えば、ウイルスベクター、例えばＡＡＶベクター）を使用するなどして、本明細書に開示される方法、キット、システム、および組成物を含む任意の適切な方法、キット、システム、または組成物を使用して、構成的または誘導的に、ならびに内因的または外因的に発現され得る。いくつかの例では、少なくとも１つの遺伝子活性化ベクターは、多重ｃｒＲＮＡまたは多重ｓｇＲＮＡおよび少なくとも１つの転写活性化因子タンパク質を含む。いくつかの例では、少なくとも１つのレポーターベクターは、多重ｃｒＲＮＡまたは多重ｓｇＲＮＡの標的配列と、レポータータンパク質が標的配列の下流に位置する少なくとも１つのレポータータンパク質とを含む。
いくつかの例では、本方法は、少なくとも１つの遺伝子活性化ベクターおよび少なくとも１つのレポーターベクターを対象に注射することを含む。任意の量の少なくとも１つの遺伝子活性化ベクターおよび少なくとも１つのレポーターベクター（例えば、有効量の本明細書中に記載されるようなベクター）の皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、心臓内、関節内、肝臓またはその脈管構造への注射、および／または空洞内注射を含む、任意の適切な注射方法を使用することができる。
少なくとも１つの遺伝子活性化ベクターまたは少なくとも１つのレポーターベクターのベクターは、任意の適切なベクター、例えば本明細書に記載の任意のベクターであり得る。いくつかの例では、ベクターはウイルスベクターまたはプラスミド（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、または単純ヘルペスウイルス）である。特定の例では、ベクターはＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ９ベクター）である。いくつかの例では、ＡＡＶベクターは、特定の組織または細胞型に対するトロピズムを有する。いくつかの例では、ガイド核酸分子は、プロモーターまたは発現制御エレメント（その例は本出願の他の箇所に提供される）に作動可能に連結される。特定の例では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトｂ－アクチン（ｈＡＣＴＢ）、ヒト伸長因子－１ａ（ｈＥＦ１ａ）およびサイトメガロウイルス初期エンハンサー／ニワトリｂ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター（例えば、Ｐａｐａｄａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４：８９－１１３，２００４；Ｄａｍｄｉｎｄｏｒｊ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（８）：ｅ１０６４７２，２０１４（これらは両方とも、その全体が参照により組み込まれる）に記載されるプロモーター）などの最小プロモーターである。ベクターは、他のエレメント、例えば選択マーカー、例えば抗生物質、例えばピューロマイシンもしくはハイグロマイシン、または検出可能なマーカー、例えばＧＦＰ、別のフルオロフォア、もしくはルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。そのようなベクターは、天然に存在するまたは天然に存在しないヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含むことができる。そのようなベクターは、本明細書中に提供される方法、組成物およびキットにおいて使用され得る。
少なくとも１つのレポーターベクターは、標的配列の下流に位置する少なくとも１つのレポータータンパク質を含み得る。蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせなどの任意の適切なレポータータンパク質を使用することができる。例示的なレポータータンパク質としては、赤外蛍光タンパク質（ＩＦＰ）、ｍＲＦＰ１、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄ、ｄＴｏｍａｔｏ（またはｔｄＴｏｍａｔｏ）、ｍＫＯ、ｔａｇＲＦＰ、ＥＧＦＰ、ｍＥＧＦＰ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍａｐｌｅ、ｔａｇＲＦＰ－Ｔ、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼおよびコメツキムシルシフェラーゼが挙げられる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１２２３５５号）。いくつかの例では、少なくとも１つのレポータータンパク質は、約１、約２、約３、約４または約５個のレポータータンパク質を含むことができる。さらなる例では、少なくとも１つのレポータータンパク質は、約１～５、約１～４、約１～３、約１～２、約２～５、約３～５、約４～５、または約２～４個のレポータータンパク質を含み得る。特定の例では、少なくとも１つのレポータータンパク質には、ルシフェラーゼ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｄＴｏｍａｔｏまたはそれらの任意の組み合わせ（例えば、ルシフェラーゼとｍＣｈｅｒｒｙの組合せまたはルシフェラーゼとｄＴｏｍａｔｏの組合せ）が含まれる。標的配列は、遺伝子活性化ベクターのｃｒＲＮＡまたは改変ｓｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡを含む）に相補的な目的の任意の標的配列であり得る。
少なくとも１つの遺伝子活性化ベクターは、少なくとも１つの多重ｃｒＲＮＡまたは多重ｓｇＲＮＡおよび少なくとも１つの転写活性化因子タンパク質を含む。多重ｃｒＲＮＡおよび多重ｓｇＲＮＡは、本明細書に開示される。転写活性化タンパク質、例えばＶＰ６４、Ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９、またはそれらの任意の組み合わせも本明細書に記載される。特定の非限定的な例では、少なくとも１つの転写タンパク質は、Ｐ６５およびＨＳＦ１（例えば、配列番号３５）を含む。
実施例１
材料および方法
マウス
Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１．１（ＣＡＧ－ｃａｓ９＊，－ＥＧＦＰ）Ｆｅｚｈ／Ｊ（本明細書においてＲｏｓａ２６－Ｃａｓ９ノックインまたはＲｏｓａ２６－Ｃａｓ９後；ストック番号０２４８５８）およびＣ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ－Ｄｍｄｍｄｘ／Ｊ（本明細書においてＭｄｘ後；ストック番号００１８０１）マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。Ｒｏｓａ２６－Ｃａｓ９マウスをＭｄｘマウスと交配させて、Ｃａｓ９＋／－Ｍｄｘ＋／－マウスを作製した。Ｃａｓ９＋／－Ｍｄｘ＋／－マウスを交配してＣａｓ９Ｍｄｘマウスを作製した。６週齢～４ヶ月齢の雄および雌の両方のマウスをこの試験のために使用した。
プラスミドの設計および構築
ＭＳ２－Ｐ６５－ＨＳＦ１（ＭＰＨ）の配列をプラスミドｌｅｎｔｉ＿ＭＳ２－Ｐ６５－ＨＳＦ１＿Ｈｙｇｒｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ ６１４２６）からクローニングした。Ｓｐｃ５．１２プロモーターおよびＣＷ３ＳＬの配列は、Ｇｅｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（登録商標）によって直接合成された。ＥＦ１－ＭＰＨ－ＣＷ３ＳＬおよびＳｐｃ－ＭＰＨ－ＣＷ３ＳＬベクターは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニング（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を使用して、ＡＡＶ骨格にＥＦ１またはＳｐｃ５．１２プロモーター、ＭＰＨおよびＣＷ３ＳＬをサブクローニングすることによって構築した。ｍＴＧＡ構築物をＧｅｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（登録商標）によって合成した。ｍＴＧＡ構築物を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニング法によってＥＦ１－ＭＰＨ－ＣＷ３ＳＬおよびＳｐｃ－ＭＰＨ－ＣＷ３ＳＬベクターに挿入して、ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ ＡＡＶまたはＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ－ｃｒＲＮＡ ＡＡＶベクターを作製した。ＡＡＶ－ｎＥＦ－Ｃａｓ９（Ｌｉａｏ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｅｌｌ １７１：１４９５－１５０７ ｅ１４１５）のｎＥＦプロモーターをＳｐｃ５．１２プロモーターで置き換えることによって、ＡＡＶ ｄＣａｓ９ベクター（ＡＡＶ－Ｓｐｃ－ｄＣａｓ９）を構築した。
ＡＡＶ産生
Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＳｔｕｄｉｅｓのＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｃｏｒｅの手順に従って、ＡＡＶ－ＤＪまたはＡＡＶ－Ｃａｓ９（ＡＡＶ－ＤＪまたはＡＡＶ９カプシドでシュードタイプ化されたＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）ベクター）ウイルス粒子を作製した。簡単に記載すると、ＡＡＶｐｒｏ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２０ｍｌの完全ＤＭＥＭ（＋１０％ ＦＢＳ、ＧｌｕｔａＭＡＸ（１００倍）、ＮＥＡＡ（１００倍））を含む１５ｃｍペトリ皿に維持し、３０枚のプレートを高力価調製用にした。細胞はトランスフェクションのために約７０％コンフルエントであった。ポリエチレンイミントランスフェクション法を使用して、ＨＥＫ２９３細胞を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に細胞を回収し、３サイクルの凍結融解後にウイルスを上清に放出した。ＣｓＣｌ勾配遠心分離を使用してウイルスを精製し、続いて２サイクルのＰＢＳおよび１サイクルの５％ソルビトール－ＰＢＳで透析した。次いで、ウイルスをＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－４ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（Ｕｌｔｒａｃｅｌ（登録商標）－１００Ｋ）によって濃縮した。
ＡＡＶの筋肉内注射および前脛骨筋の収集および切除
ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を用いてマウスを麻酔した。前脛骨筋（ＴＡ）を収集し、ＷａｎｇおよびＫｕａｎｇのプロトコル（Ｂｉｏ－Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ７：ｅ２２７９，２０１７）に従って凍結切除のためにＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物で包埋した。１０μｍ厚の切片を室温の正電荷顕微鏡スライド上に集めた。これらのスライドを免疫染色のためにさらに処理した。
筋肉切片の免疫染色
筋肉切片を４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳおよびグリシンで洗浄した後、切片をブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中５％ヤギ血清、２％ ＢＳＡ、０．２％ ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００および０．１％アジ化ナトリウム）で少なくとも３０分間ブロッキングした。抗ユートロフィン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）からのｓｃ－１５３７７）をブロッキング緩衝液で２００倍希釈し、切片を一次抗体と４°Ｃで一晩インキュベートした。翌日、ＰＢＳで洗浄した後、試料をロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａ－２１２０６）およびＤＡＰＩと共に室温で４５分間インキュベートした。Ｚｅｉｓｓ（登録商標）ＬＳＭ ７１０レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて免疫染色画像を捕捉した。
ＲＮＡ抽出およびリアルタイムｑＰＣＲ
Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標））を使用して、筋肉および筋芽細胞の総ＲＮＡを抽出した。ＥｐｉＳｈｅａｒ（商標）Ｐｒｏｂｅ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒを用いて筋肉および筋線維をホモジナイズした。ＲＮＡをＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅ Ｉで処理してゲノムＤＮＡを除去した。総ＲＮＡの純度および濃度をＳｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標））によって測定した。Ｍａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた逆転写によりｃＤＮＡを作製した。ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、ＣＦＸ ３８４リアルタイムシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でｑＰＣＲ分析を実行した。それぞれの遺伝子の発現レベルをハウスキーピング遺伝子ＧＡＤＰＨに対して正規化した。プライマー配列は、Ｌｉａｏ，ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ １７１：１４９５－１５０７ ｅ１４１５，２０１７）と同じであった。
ＲＮＡ－ｓｅｑ解析
単離された細胞の総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）法を使用して回収した。Ａｇｉｌｅｎｔ ２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（商標）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｑｕｂｉｔ（登録商標）を使用して、ＲＮＡの品質および量を評価した。ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーを、Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＸＴ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐキットを使用してＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｓｍａｒｔ－Ｓｅｑ２（登録商標）を使用して構築し、２×１５０ｂｐのペアエンドシーケンシングをＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑ Ｘ（商標）Ｔｅｎシステムで行う。デフォルトパラメータを使用してＳＴＡＲ［ｖ２．５．３ａ］を使用して、生リードをｍｍ１０ゲノムにアライメントした。次いで、リードの数をＲｅｆＳｅｑ（国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から入手可能）に一意的にアラインメントし、エクソンをＨＯＭＥＲ［ｖ４．９．１］によって定量した。
タンパク質抽出およびウエスタンブロット分析
筋肉試料をＰＢＳで洗浄し、放射免疫沈殿アッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ－４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、および０．１％ ＳＤＳ）でホモジナイズした。タンパク質（１００ｕｇ）を３～８％ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）Ｔｒｉｓ－Ａｃｅｔａｔｅタンパク質ゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気転写し、特異的一次抗体とインキュベートした。抗ユートロフィン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）からのｓｃ－１５３７７）および抗Ｇａｐｄｈ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇからの２１８８Ｓ）を１：１０００の比で５％ ｗ／ｖの脱脂粉乳に希釈した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて免疫検出を行った。
統計分析
提示されたデータは、平均および標準偏差（ＳＤ）を有する別個の試料から得た。Ｐ値は、両側の対応のないスチューデントｔ検定を用いて計算した。全ての分析はＰｒｉｓｍ ７ソフトウェアを用いて行った。０．０５未満のＰ値を統計学的に有意であるとみなした。
実施例２
２つのｄｇＲＮＡを有する多重ＴＧＡ（ｍＴＧＡ）システムの開発
ユートロフィン遺伝子座の異なる領域を標的とするｄｇＲＮＡを、ユートロフィン活性化についてスクリーニングした。１つのｇＲＮＡ（ｄｇＵｔｒｎＮＴ２、配列番号１２）がｄｇＵｔｒｎＴ２およびｄｇＵｔｒｎＴ１６（これらは元のスクリーニングでは最高の効率のｇＲＮＡであった）よりも性能が優れていることが観察された（図５）。ｇＲＮＡおよびＭＰＨの組み合わせをＮ２ａＣａｓ９細胞にトランスフェクトすることによって相乗効果が達成され得るかどうかを決定するために、ｄｇＵｔｒｎＮＴ２、ｄｇＵｔｒｎＴ２およびｄｇＵｔｒｎＴ１６をさらなる試験のために選択した。多重化ｄｇＲＮＡを利用した場合、総ｄｇＲＮＡ濃度を増加させることなく、ユートロフィンの活性化が増強された。３つのｄｇＲＮＡ（配列番号１２、１４および１５）の混合物は、最も強い相乗効果を示し、１８倍の上方調節（単一のｄｇＲＮＡを使用するよりも７倍高い）を伴った（図６Ａ）。
真核生物翻訳伸長因子１アルファ２（Ｅｅｆ１ａ２）は、ユートロフィンの翻訳を担う。Ｅｅｆ１ａ２の発現を誘導するための効率的なｄｇＲＮＡを同定し（図６Ｂ）、Ｅｅｆ１ａ２およびユートロフィンｄｇＲＮＡのデュプレックスが、転写および翻訳を同時に増強することによってユートロフィンのタンパク質レベルを増強することができるかどうかを調べた。ｄｇＥｅｆ１ａ２（ｄｇＲＮＡＴ２）は、Ｎ２ａＣａｓ９細胞においてユートロフィンレベルを２．３倍増加させ、ｄｇＥｅｆ１ａ２とｄｇＵｔｒｎＮＴ２のデュプレックスは、ユートロフィンの上方調節を３．７倍有意に増強した（図７）。これらの結果は、多重化ｇＲＮＡがＴＧＡシステムの効率を高めることができることを示している。
これらの知見に基づいて、複数のユートロフィンおよび／またはＥｅｆ１ａ２ ｄｇＲＮＡならびにＭＰＨ活性化複合体を含むｍＴＧＡシステムを、インビボ適用のために単一のＡＡＶベクターにおいて開発した。ｍＴＧＡシステムを開発するために複数の改変を行った。例えば、同じＡＡＶベクター内に追加のｄｇＲＮＡを挿入するための空間を作り出すために、ＭＰＨ転写活性化複合体の発現は、より短いプロモーターによって駆動される。元のＣＡＧプロモーターを偏在性プロモーター（ＥＦ１ａ）または筋肉特異的プロモーター（Ｓｐｃ５．１２）のいずれかで置き換えた（図８）。ＷＰＲＥ－ｐＡカセットを、より短いが同等に効率的なエレメントＣＷ３ＳＬ（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒａｉｎ，７：１７，２０１４）に置き換えた。さらに、切り詰め（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）および再編成などの有害な組換え事象が、複数の反復フラグメントを含むＡＡＶベクターにおいてしばしば観察される。組換えは、ＡＡＶの効率を劇的に低下させ、望ましくない再編成を伴う副産物を引き起こす可能性がある。反復配列の２つの主要な供給源は、それぞれのプロモーターであるｄｇＲＮＡに由来する。望ましくない組換えに対処するために、異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（ｈＵ６、ｍＵ６およびＨ１）を最初に使用して、異なるｓｇＲＮＡの発現を駆動した。ｈＵ６およびｍＵ６は、Ｈ１よりも約２倍高い活性化効率を有し（図９；図１０も参照）、したがって、ｈＵ６およびｍＵ６を、２つのｓｇＲＮＡを含有するｍＴＧＡシステムのために選択した。
（異なる配向の）２つのｓｇＲＮＡを含む２つのｍＴＧＡシステムの活性を比較した。逆方向反復（順配向に１つのｓｇＲＮＡ、逆配向に１つのｓｇＲＮＡ）を有するｍＴＧＡシステムによる標的とする遺伝子誘導の活性は、ダイレクトリピート（両方とも順配向のｓｇＲＮＡ）を有するｍＴＧＡシステムよりも高いことが見出された（図１１、図１４も参照）。順配向の２つのｓｇＲＮＡを有するｍＴＧＡシステムは、望ましくない組換えを生じさせる傾向があるが、そのような組換えは逆方向反復を有するｍＴＧＡシステムでは生じなかったことも観察された（図１２および図１３、図１５も参照）。結果は、ｄｕｏ－ｄｇＲＮＡの望ましくない組換えが逆方向反復配向によって低減され得ることを実証している。
実施例３
インビボでのＤｕｏ ｍＴＧＡシステム
筋特異的プロモーターＳｐｃ５．１２によって駆動されるＭＰＨ複合体を有する逆方向反復下でｄｕｏ－ｄｇＲＮＡが配向する骨格筋特異的デュプレックスＴＧＡシステムを設計した（図１６）。デュプレックスＴＧＡシステムを、Ｃａｓ９／ｍｄｘマウスの前脛骨筋（ＴＡ）に１×１０１１個のＧＣ ＡＡＶ９－ｄｇＵｔｒｎＴ２－ｄｇＦｓｔ－ＭＰＨ、ＡＡＶ９－ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－ｄｇＥｅｆ１ａ２－ＭＰＨまたはＡＡＶ９－ＭＰＨを筋肉内注射することによってインビボで適用した。ｄｇＵｔｒｎＴ２およびフォリスタチン（Ｆｓｔ）ｄｇＲＮＡを個別に適用して、それぞれユートロフィン発現を増加させ、筋肥大を誘導した（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７１：１４９５－１５０７，ｅ１４１５，２０１７）。収縮誘発性損傷に感受性であるｍｄｘ筋の脆弱性に対するｄｇＵｔｒｎＴ２／ｄｇＦｓｔおよびｄｇＵｔｒｎＮＴ２／ｄｇＥｅｆ１ａ２のデュプレックス効果を調査した。ＡＡＶ注射（１×１０１１ＧＣ）の８週間後にエバンスブルー色素（ＥＢＤ）アッセイで筋鞘の完全性を監視した。損傷した筋線維はＥＢＤを蓄積し、赤色蛍光を生成した。
ＡＡＶ９－ＭＰＨおよびＡＡＶ９－ｄｇＵｔｒｎＴ２－ｄｇＦｓｔ－ＭＰＨ注射を行ったＴＡ筋では、広範囲のＥＢＤ取り込みが観察された（図１７）。対照的に、ＡＡＶ９－ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－ｄｇＥｅｆ１ａ２－ＭＰＨで処置した筋肉では、ＥＢＤ取り込みが大幅に減少した。ＡＡＶ９－ｄｇＵｔｒｎＴ２－ｄｇＦｓｔ－ＭＰＨ処置は筋肥大を誘導したが、筋肉量の増加は筋脆弱性を防止しなかった（図１７）。次に、標的とする遺伝子の発現を調べた。ＡＡＶ９－ｄｇＵｔｒｎＴ２－ｄｇＦｓｔ－ＭＰＨ処置は、ユートロフィンおよびＦｓｔの発現をそれぞれ１．８倍および１０倍増加させた（図１８Ａ）。ＡＡＶ９－ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－ｄｇＥｅｆ１ａ２－ＭＰＨ処置が、ユートロフィンおよびＥｅｆ１ａ２の発現をそれぞれ２．６倍および２．２倍増加させた（図１８Ｂ）。ユートロフィンのタンパク質レベルも測定した。ＡＡＶ９－ｄｇＵｔｒｎＴ２－ｄｇＦｓｔ－ＭＰＨ処置後、ユートロフィン発現は１．５倍上方調節された。対照的に、ＡＡＶ９－ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－ｄｇＥｅｆ１ａ２－ＭＰＨ処置は、ユートロフィンの発現を３．７倍増強させた（図１９）。免疫染色により、ＡＡＶ９－ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－ｄｇＥｅｆ１ａ２－ＭＰＨで処置した筋線維の肉腫において、ＡＡＶ９－ｄｇＵｔｒｎＴ２－ｄｇＦｓｔ－ＭＰＨまたはＡＡＶ９－ＭＰＨよりも強いユートロフィンシグナルが明らかになった（図２０）。結果は、デュプレックスｍＴＧＡシステムが表現型変化を誘導するためにインビボで効率的に働くことを示している。さらに、このシステムは、筋線維の脆弱性の防止を助けるために、ユートロフィンの発現を増強するように設計され得ることが示される。
実施例４
３つのｄｇＲＮＡを有するｍＴＧＡシステムの開発
逆配向下で２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを使用することは、同じＡＡＶベクター内で２つのｄｇＲＮＡを使用する場合に組換えを減少させるのに役立ったが、第３のｓｇＲＮＡを追加する際にさらなる課題に直面した。図２１および図２２に示されるように、第３のｓｇＲＮＡの付加は、以前に逆位ｓｇＲＮＡの一方に対してダイレクトリピートを伴い、有意な切り詰めを引き起こし、ｄｇＲＮＡの望ましくない喪失を誘導する。
この問題に対処するために、内因性ｔＲＮＡプロセシングシステムを利用する技術を用いて、追加のｓｇＲＮＡを組み込んだ。ｔＲＮＡに続くｓｇＲＮＡ（ｄｇＦｓｔ）の活性は、ｈＵ６によって直接駆動されるｄｇＦｓｔを含む逆向き構築物の約半分であることが分かった（図２３）。
ｈＵ６－ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－ｔＲＮＡ－ｄｇＦｓｔ構築物も、第３のｇＲＮＡがＨ１プロモーターによって駆動されるｈＵ６－ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－Ｈ１－ｄｇＦｓｔ構築物と比較した（図２４）。ｔＲＮＡ－ｇＲＮＡ転写物からのｇＲＮＡの不完全なプロセシングおよび成熟のために（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｄｖａｎｃｅｓ ３：ｅ１６０２８１４，２０１７）、ｔＲＮＡの上流のｇＲＮＡ（ｄｇＵｔｒｎＮＴ２）およびｔＲＮＡの下流のｇＲＮＡ（ｄｇＦｓｔ）の活性化効率は、ｈＵ６によって直接駆動されるものよりもそれぞれ１０％および４４％低かった。非ウイルスプラスミドトランスフェクションによるｈＵ６－ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－ｔＲＮＡ－ｄｇＦｓｔ構築物中のｇＲＮＡとｈＵ６－ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－Ｈ１－ｄｇＦｓｔ構築物中のｇＲＮＡとの間に有意差はなかった。
第３のｓｇＲＮＡは（組換えを回避するために）Ｈ１プロモーターによって駆動される必要があり、これもｍＵ６およびｈＵ６プロモーターと比較して半分の活性化効率を示すことを考慮すると、ｔＲＮＡ後のｓｇＲＮＡ活性の低下は許容可能であった。ｔＲＮＡによって分離された２つのｓｇＲＮＡの発現を駆動する単一プロモーターを有する構築物は、２つのｓｇＲＮＡが両方とも順配向にある場合、有害な組換え事象を減少させた（図２５）。このようにして、３つのｓｇＲＮＡを含むｍＴＧＡシステムを構築した。
ｈＵ６－ｔＲＮＡまたはｈＵ６－Ｈ１構築物を含むＡＡＶを、１ｘ１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）のＡＡＶＤＪ－ｈＵ６－ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－ｔＲＮＡ－ｄｇＦｓｔ－ＭＰＨ、ＡＡＶＤＪ－ｈＵ６－ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－Ｈ１－ｄｇＦｓｔ－ＭＰＨまたはＡＡＶＤＪ－ＭＰＨを有するＣ２Ｃ１２Ｃａｓ９細胞において試験した。ｄｇＵｔｒｎＮＴ２の活性化効率は、ｈＵ６－ｔＲＮＡ構築物とｈＵ６－Ｈ１構築物との間で同等であったが、ｄｇＦｓｔは、ｈＵ６－Ｈ１構築物と比較して、ｈＵ６－ｔＲＮＡ構築物において２．２倍高い活性化効率を有していた（図２６）。有害な組換え事象は、ｈＵ６－ｔＲＮＡ構築物ではｈＵ６－Ｈ１構築物よりも少なかった（図２７）。次いで、Ｃ２Ｃ１２Ｃａｓ９細胞から回収されたプラスミドおよびＡＡＶにおけるｔＲＮＡまたはＨ１対ｈＵ６の比を、ｑＰＣＲを用いて定量した。ｔＲＮＡまたはＨ１が組換え後に除去されたので、比率は、ＡＡＶ産生および感染の間に生じた組換え事象を反映する。ＡＡＶ中のｔＲＮＡ対ｈＵ６の比はプラスミド中の比の５１％であったが、ＡＡＶ中のＨ１対ｈＵ６の比はプラスミド中の比の２２％であり、ｈＵ６－ｔＲＮＡ構築物と比較してｈＵ６－Ｈ１構築物では５９％（７８％対４９％）高い組換え事象が起こったことを示している（図２８）。これらの観察に基づいて、ＭｙｏＤ、Ｍｅｆ２ｂおよびＰａｘ７を標的化する３つのｇＲＮＡを含むｍＴＧＡシステムを構築した。３Ｔ３Ｌ１Ｃａｓ９細胞におけるＭｙｏＤ、Ｍｅｆ２ｂおよびＰａｘ７の効率的な活性化が、ＭＰＨのみを含有する１×１０１０ＡＡＶＤＪまたはｍＴＧＡシステムの処理後に報告された（図２９）。
３つのタンデムのユートロフィン標的化ｓｇＲＮＡ（ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ）の組み合わせを含むｍＴＧＡシステムを開発し、Ｎ２Ｃａｓ９細胞における非ウイルストランスフェクションを使用して、またはＣ２Ｃ１２Ｃａｓ９筋芽細胞へのＡＡＶ（血清型ＤＪ）トランスフェクションを使用してインビトロで試験した。対照には、単一のユートロフィンｄｇＲＮＡおよびＭＰＨ（ＵｔｒｎＴ２）、またはＭＰＨのみを有するＡＡＶベクターが含まれた。ユートロフィンの活性化は、いずれかの対照（ＭＰＨのみまたは単一ｄｇＲＮＡ ＴＧＡシステム）と比較して、ｍＴＧＡを使用するとより高かった（図３０）。
３つのｄｇＲＮＡを含有するｍＴＧＡシステムが、Ｃａｓ９＋Ｍｄｘマウスの前脛骨筋（ＴＡ）において複数の標的遺伝子の発現を活性化することも確認された（図３１）。
実施例５
４つのｄｇＲＮＡを有するｍＴＧＡシステムの開発
ｍＴＧＡシステムを、４つのｇＲＮＡを含有するように拡大した。３番目および４番目のｇＲＮＡは、ｔＲＮＡプロセシング後にｍＵ６およびｈＵ６によって駆動された（図３２）。反復配列を最小限に抑えるために、２つの異なるｔＲＮＡ（酵母およびトウモロコシ由来）を選択した（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１１２：３５７０－３５７５，２０１５；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１０：１０５３，２０１９）。ｍＴＧＡシステムを使用して、ＭＰＨのみまたはｍＴＧＡシステムを含有する１×１０１０ ＡＡＶＤＪの処理によって、ＢＪＣａｓ９細胞におけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ－ＭＹＣの発現を活性化した（図３２）。結果は、ＡＡＶ媒介ｍＴＧＡシステムが少なくとも４つの遺伝子を活性化するために効率的に働くことを示している。
実施例６
インビボでのＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ ｍＴＧＡシステム
ｍＴＧＡシステムを、ＭＰＨのみ（ＡＡＶ－ＭＰＨ）、ＴＧＡシステム（１つのユートロフィンｓｇＲＮＡ、ＡＡＶ－ＵｔｒｎＴ２、米国特許出願公開第ＵＳ－２０２１－０１０２２０６－Ａ１号参照）またはｍＴＧＡシステム（トリプルユートロフィンｓｇＲＮＡ、ＡＡＶ－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ）を含有する２×１０１１ｖｇ ＡＡＶ（血清型９）のＣａｓ９発現マウスのＴＡ筋への筋肉内注射によってインビボで試験した。ＡＡＶ注射の２ヶ月後、ｍＴＧＡシステムを注射した筋肉では、ユートロフィンの発現が最大２４倍（平均１６倍）増加した（図３３Ａ）。対照的に、増加の平均レベルは、元のＴＧＡシステム（ＵｔｒｎＴ２）については２．５倍に過ぎなかった。ユートロフィン発現の不偏分析のためにＲＮＡ－ｓｅｑ分析も行った。ｍＴＧＡシステムで処置した筋肉では、ＭＰＨのみと比較して、ユートロフィンの標準読み取り（ｎｏｒｍ ｒｅａｄ）が約１６倍高かった（図３３Ｂ）。ｍＴＧＡシステムを使用すると、ユートロフィンタンパク質のレベルがより高いことも確認された（図３４Ａ）。ユートロフィンに対する抗体を使用した免疫染色は、ＵｔｒｎＴ２処置したＴＡ筋と比較して、ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ処置した筋肉における筋鞘局在化の増加を示した（図３４Ｂ）。
新しいｍＴＧＡシステムを、Ｃａｓ９／ＭｄｘマウスのＴＡおよび腓腹筋（ＧＡ）への２×１０１１ ｖｇのＡＡＶ－ＭＰＨ、ＡＡＶ－ＵｔｒｎＴ２またはＡＡＶ－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅの筋肉内注射によってインビボでさらに試験した。握力およびエバンスブルー色素（ＥＢＤ）の取り込みをＡＡＶ注射の２ヶ月後に評価した。握力試験を各マウスについて連続して６０回繰り返した。１０回の試験ごとの読み取り値を平均した。Ｃａｓ９マウスの握力は、連続試験で一定であることが分かった。対照的に、Ｍｄｘ／Ｃａｓ９マウスおよびＭｄｘマウスの握力は、約－１０の傾きで線形回帰パターンで減少した（図３５）。ＴＧＡ処置は－５の傾きで減少傾向を遅らせたが、ｍＴＧＡ処置は握力の低下をレスキューした（図３５）。また、損傷細胞に蓄積するＥＢＤの取り込みによって、筋鞘の完全性を監視した。データは、ＡＡＶ－ＭＰＨおよびＡＡＶ－ＵｔｒｎＴ２注射を用いたＭｄｘマウスにおける広範なＥＢＤ取り込みを示す（図３６）。対照的に、ＥＢＤ取り込みは、ＡＡＶ－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ処置マウスでは大きく減少する（図３６）。１つのユートロフィンｇＲＮＡまたは多重ユートロフィンｇＲＮＡを有するＴＡ筋におけるユートロフィンの発現も測定した。他の試料と比較して、ｍＴＧＡ処置マウスではユートロフィンの有意な活性化があった（図３７および図３８）。
ｍＴＧＡシステムを、１×１０１１のＧＣ ＡＡＶ９－ｄＣａｓ９およびＡＡＶ９－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅをマウスの片側のＴＡ筋に注射することによって、デュアルＡＡＶシステムを使用して野生型（ＷＴ）ｍｄｘマウスで試験した（図３９）。反対側のＴＡ筋対照には、ＡＡＶ９－ｄＣａｓ９およびＡＡＶ９－ＭＰＨを注射した。処置の２ヶ月後のＥＢＤの取り込みによって、筋鞘の完全性を評価した（図３９）。広範なＥＢＤ取り込みが対照処置で見られた。対照的に、ＥＢＤ取り込みは、ｍＴＧＡ処置によって有意に緩和される。また、免疫染色により、ユートロフィンの効率的な活性化が確認された（図３９）。ユートロフィンの発現をｑＰＣＲおよびウエスタンブロットによって定量した。対照脚と比較して、ｍＴＧＡシステムで処置したＴＡ筋では、ユートロフィンのｍＲＮＡレベルが４．６倍増加した（図４０Ａ）。ウェスタンブロットは、Ｕｔｒｎのタンパク質レベルが有意に４倍上昇したことを示した（図４０Ｂ）。したがって、開示されたｍＴＧＡシステムは、ＤＭＤの処置として利用することができる。
実施例７
多重化ｇＲＮＡはエピジェネティック改変を相乗的に増強する
ＴＧＡシステムは、標的とするゲノム遺伝子座付近のヒストン修飾を改変することができる（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７１：１４９５－１５０７，ｅ１４１５，２０１７）。ｍＴＧＡ処置後のヒストン修飾を同定するために、Ｃａｓ９／ｍｄｘマウスのＴＡ筋に、１×１０１１個のＧＣ ＡＡＶ９－ＭＰＨ、ＡＡＶ９－ｈＵ６－ｄｇＵｔｒｎＴ２－ＭＰＨ、ＡＡＶ９－ＵｔｒｎＤｕａｌ、またはＡＡＶ９－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅを注射した（図４１Ａ）。ユートロフィンのｍＲＮＡレベルは、ＡＡＶ注射の２ヶ月後にｄｇＵｔｒｎＴ２のみわずかに増加した（図４１Ｂ）。対照的に、そのレベルは、ＡＡＶ９－ＵｔｒｎＤｕａｌによって４倍、ＡＡＶ９－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅによって５．５倍増加した。
ＴＡ筋試料のクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。典型的には転写活性遺伝子に関連するＨ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ａｃエピジェネティックマークは、ＡＡＶ９－ＭＰＨ対照と比較して、ＡＡＶ９－ｈＵ６－ｄｇＵｔｒｎＴ２－ＭＰＨ注射マウスの標的遺伝子座で富化されていた（図４２および図４３）。興味深いことに、ＡＡＶ９－ＵｔｒｎＤｕａｌおよびＡＡＶ９－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ａｃマークの富化を増強しただけでなく、ＡＡＶ９－ｈＵ６－ｄｇＵｔｒｎＴ２－ＭＰＨと比較してエピジェネティック変化を延長した。ＡＡＶ９－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅは、ＡＡＶ９－ＵｔｒｎＤｕａｌと比較して、ＵｔｒｎＴ１６付近のエピジェネティックマークをさらに変化させた。データは、ｍＴＧＡシステムが標的部位周辺のエピジェネティック変化を相乗的に増強することを示す。
実施例８
ｍＴＧＡシステムによって惹起されたユートロフィン活性化の持続性
ｍＴＧＡシステムは強いエピジェネティック変化を誘導したが、長期間の遺伝子活性化がシステムの短期間の発現で達成できるかどうかは不明であった。調査するために、ｔｅｔＯ駆動ｄＣａｓ９＋逆テトラサイクリントランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）を有するマウス系統（ｉｄＣａｓ９）を作製し、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）投与によるｄＣａｓ９の発現の調節を可能にした（図４４Ａ）。ｉｄＣａｓ９マウスのＴＡ筋に、ルシフェラーゼがｄｇＲＮＡ（ｄｇＬｕｃ）結合部位の下流に配置されたルシフェラーゼレポーターを含有するＡＡＶおよびｄｇＬｕｃ－ＣＡＧ－ＭＰＨ配列を含有するＡＡＶを共注射した。その後、Ｄｏｘ水（１ｍｇ／ｍｌ）を加えて１週間または２週間間隔で除去した。ルシフェラーゼシグナルが、Ｄｏｘ投与の１週間後に顕著に誘導され、Ｄｏｘ除去の２週間後に基礎レベルに戻った（図４４Ｂ）。ｄＣａｓ９がルシフェラーゼの活性化のために必要であったので、データは、ｄＣａｓ９の発現がｉｄＣａｓ９マウスにおけるＤｏｘ投与によって調節されたことを実証する。次に、１×１０１１個のＧＣ ＡＡＶ９－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅまたはＡＡＶ９－ＭＰＨを注射したｉｄＣａｓ９マウスにおけるユートロフィンの内因性活性化を調べた。ユートロフィンの発現は、連続３０日間または６０日間のＤｏｘ投与後に約８倍増加した（図４５）。対照的に、３０日間のＤｏｘ中止後、ユートロフィンの過剰発現は見られなかった。これらのデータは、ｍＴＧＡシステムが遺伝子活性化に必要であることを実証している。
持続的な導入遺伝子発現は、導入遺伝子を有するＡＡＶの注射後１０年でヒト骨格筋において報告されている（Ｂｕｃｈｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１９：３０３８－３０４１，２０１２）。ＡＡＶ媒介ｍＴＧＡシステムの持続性を追跡するために、６ヶ月齢のｍｄｘマウスのＴＡ筋に１×１０１１個のＧＣ ＡＡＶ９－ｄＣａｓ９およびＡＡＶ９－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅまたはＡＡＶ９－ＭＰＨを共注射した（図４６Ａ）。筋肉試料を１３ヶ月後に収集し、ｍＴＧＡシステムで処置した試料でユートロフィンの３倍の増加が見られた（図４６Ｂ）。免疫染色により、ユートロフィンの効率的な活性化が確認された（図４６Ｃ）。Ｈ＆Ｅ染色およびマロリー・トリクローム染色を利用して、ｍｄｘ筋肉の組織病理学的表現型を評価した。Ｈ＆Ｅ染色は、ｍＴＧＡ処置と比較して、対照処置では筋肉間質腔がより大きく、筋線維サイズがより小さいことを示した（図４７Ａ）。さらに、マロリー・トリクローム染色は、ｍＴＧＡ処置筋肉が対照筋肉と比較して線維症が少ないことを示した（図４７Ｂ）。したがって、ＡＡＶ媒介ｍＴＧＡシステムは、遺伝子活性化および病理学的表現型改善において長期持続効果を有する。
実施例９
ｇＲＮＡの組み合わせを最適化することによるｍＴＧＡ効率の増強
ユートロフィンの発現を増強するためのｇＲＮＡの組み合わせを最適化した。ｄｇＵｔｒｎＮＴ２－ｄｇＵｔｒｎＴ２（ＵｔｒｎＤｕａｌ）およびｄｇＵｔｒｎＮＴ２－ｄｇＵｔｒｎＴ２－ｄｇＵｔｒｎＴ１６（ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ）がユートロフィンプロモーターのヒストン修飾を同様に変化させたので、ＡＡＶ９－ＵｔｒｎＤｕａｌ－Ｅｅｆ１ａ２を生成して、ユートロフィンの転写および翻訳を同時に増強し、それをＡＡＶ９－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅおよびＡＡＶ９－ＵｔｒｎＮＴ２－Ｅｅｆ１ａ２と比較した（図４８）。ｍｄｘマウスのＴＡ筋へのデュアルＡＡＶ注射（１×１０１１ＧＣ）の２ヶ月後、ＡＡＶ９－ＵｔｒｎＤｕａｌ－Ｅｅｆ１ａ２／ＡＡＶ９－ｄＣａｓ９処置は、Ｅｅｆ１ａ２の発現を２．２倍増加させ、ユートロフィンの発現を３．５倍増加させた（図４９Ａ）。対照的に、ＡＡＶ９－ＵｔｒｎＮＴ２－Ｅｅｆ１ａ２／ＡＡＶ９－ｄＣａｓ９は、Ｅｅｆ１ａ２およびユートロフィンの発現をそれぞれ１．９倍および２倍増加させ、ＡＡＶ９－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ／ＡＡＶ９－ｄＣａｓ９は、Ｅｅｆ１ａ２の発現を変化させることなくユートロフィンの発現を４．９倍上方調節した（図４９Ａ）。興味深いことに、ＡＡＶ９－ＵｔｒｎＤｕａｌ－Ｅｅｆ１ａ２／ＡＡＶ９－ｄＣａｓ９処置は、ユートロフィンタンパク質を５．３倍増強し、ＡＡＶ９－ＵｔｒｎＮＴ２－Ｅｅｆ１ａ２／ＡＡＶ９－ｄＣａｓ９およびＡＡＶ９－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ／ＡＡＶ９－ｄＣａｓ９処置と比較して、ユートロフィンタンパク質の上方調節を２７％改善した（図４９Ｂ）。
ＡＡＶ９－ＵｔｒｎＤｕａｌ－Ｅｅｆ１ａ２およびＡＡＶ９－ｄＣａｓ９を含有する最適化されたｍＴＧＡシステムもまた、成体ｍｄｘマウスを処置するために使用した。尾静脈注射による全身の処置を検討したが、尾静脈注射後のＡＡＶの分布を追跡するためにルシフェラーゼレポーター（ＡＡＶ９－Ｓｐｃ５．１２－Ｌｕｃ）を使用すると、ＡＡＶ力価が高くてもＡＡＶが筋細胞に効率的に入らないことが明らかになった（１×１０１２ＧＣ；図５７）。したがって、尾静脈注射を使用する代わりに、ＴＡ筋（１×１０１１ＧＣ）、ＧＡ筋（２×１０１１ＧＣ）、大腿四頭筋（２×１０１１ＧＣ）、三角筋（５×１０１０ＧＣ）、上腕三頭筋（５×１０１０ＧＣ）、僧帽筋（１×１０１１ＧＣ）（図５０Ａ）を含む（筋肉サイズに従った力価での）２ヶ月齢のｍｄｘマウスの複数の筋肉へのデュアルＡＡＶシステムの筋肉内注射。ＡＡＶ処置の２ヶ月後、血清クレアチンキナーゼの活性は、ＡＡＶ９－ＭＰＨ／ＡＡＶ９－ｄＣａｓ９で処置したマウスと比較して、ｍＴＧＡシステムで処置したマウスでは３倍減少した（図５０Ｂ）。オープンフィールド試験では、対照ｍｄｘマウスは、ＷＴマウスと比較してジャンプ数が少なく、休止時間が長かった。ｍＴＧＡ処置はｍｄｘマウスの活動低下をレスキューした（図５１Ａ）。トレッドミル試験はまた、ｍＴＧＡ処置が、対照ｍｄｘマウスと比較して、処置ｍｄｘマウスの速度および持久力を改善することを明らかにした（図５１Ｂ）。
実施例１０
多重ｃｒＲＮＡ ｍＴＧＡ構築物の開発
開示されたｍＴＧＡシステムを、プロモーター－ｔＲＮＡ構築物の組換えを減少させるためにさらに最適化した。組換え事象を、異なる骨格を有するｇＲＮＡを含有するｈＵ６－ｔＲＮＡ構築物を作製することによって監視した（図５２）。ｈＵ６－ｔＲＮＡ構築物のトランケート型バンドをシーケンシングした後、組換えが１番目と４番目のＭＳ２ループの間で起こり（各ｇＲＮＡは２つのＭＳ２ループを含む）、４つのＭＳ２ループを２つに減少させることが見出された。反復ｄｇＲＮＡ足場が減少した場合、組換えを最小限に抑えることができると仮定した。ｇＲＮＡはクリスパーＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化クリスパーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）エレメントに分割することができるので、単一ｔｒａｃｒＲＮＡを多重化目的で複数のｃｒＲＮＡと共に使用することができる。
これを試験するために、ｄｇＲＮＡをクリスパーＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、２つのＭＳ２ループを含む改変トランス活性化クリスパーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｍ２）とに分割し、ポリシストロニック系をｔＲＮＡで連結した（図５３Ａ）。ｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｍ２構築物は標的遺伝子を活性化したが、その活性化効率はｄｇＲＮＡより２．８倍低かった。その活性化効率もまた、異なる種由来のｔＲＮＡを使用して比較した。酵母およびトウモロコシ由来のｔＲＮＡは、ハエ由来のｔＲＮＡと比較して５倍効率的であった（図５３Ａ）。次に、単一ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｍ２を２つのｃｒＲＮＡと共に使用して、対応する標的を活性化できるかどうかを調べた。興味深いことに、２つのｃｒＲＮＡが２つの異なるＵ６プロモーターによって駆動された場合、ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｍ２と同じプロモーターを共有するｃｒＲＮＡのみが強い活性化効率を有した（図５３Ｂ）。したがって、ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｍ２および２つのｃｒＲＮＡ（自己切断ＲＮＡの異なる組み合わせによって分離されている）を駆動する単一のプロモーターが開発された（図５４参照）。異なる構築物の活性化効率を、Ｎ２Ｃａｓ９細胞における非ウイルストランスフェクションを使用してインビトロで試験し、最良の構築物は、ｔＲＮＡおよびＨＤＶ－ＨＨによって連結された２つのｃｒＲＮＡの前にｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｍ２を有する構築物であると決定された（図５４）。第２のｔＲＮＡに続くｓｇＲＮＡは、２つのｔＲＮＡを有する構築物において低い活性化効率を有することが見出された（図５４）。興味深いことに、ｔＲＮＡによって分離された１つのプロモーターおよび２つのｓｇＲＮＡを有する構築物において生じることが見出された組換えは、ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｍ２および２つのｃｒＲＮＡの発現を駆動する１つのプロモーターを含む構築物から排除された（図５５）。しかしながら、ＡＡＶＤＪ－ｈＵ６－ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｍ２－ｔＲＮＡ－ｃｒＦｓｔ－ＨＤＶ－ＨＨ－ｃｒＵｔｒｎ－ＭＰＨの活性化効率がＡＡＶＤＪ－ｈＵ６－ｄｇＵｔｒｎＴ２－ｔＲＮＡ－ｄｇＦｓｔ－ＭＰＨより高くなかった（図５６Ａ）。
実施例１１
インビボでの多重ｃｒＲＮＡ ｍＴＧＡシステム
２つのｇＲＮＡがｈＵ６－ｔＲＮＡ構築物によって駆動されるＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅと、２つのｇＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ構築物によって駆動されるＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ－ｃｒＲＮＡとの間で、ユートロフィンのインビボ活性化を比較した（図５６Ｂ）。異なる濃度のＡＡＶ９－ＭＰＨ、ＡＡＶ９－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅまたはＡＡＶ９－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ－ｃｒＲＮＡをＣａｓ９／ｍｄｘマウスのＴＡ筋に筋肉内注射した２ヶ月後、ＡＡＶ９－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅは５×１０１０ＧＣでＡＡＶ９－ＵｔｒｎＴｒｉｐｌｅ－ｃｒＲＮＡよりも有意に高い活性化効率を有するが、ＡＡＶ濃度が１×１０１１ＧＣを超えると差は有意ではないことが見出された（図５６Ｂ）。データは、ｍＴＧＡシステムの効率がＡＡＶ濃度依存性であることを示している（図５６Ｂ）。
実施例１２
肝疾患の処置
この実施例は、インビボで肝線維症および／または肝硬変を処置するために使用することができる方法を記載する。特定の方法が提供されるが、当業者であれば、１またはそれを超えるステップの追加または省略を含む、これらの特定の方法から逸脱する方法も使用できることを認識する。
この実施例では、ＨＮＦ１ａ、ＨＮＦ４ａ、ＦｏｘＡ３およびＧａｔａ４のうちの１またはそれを超えるものを標的とするｃｒＲＮＡおよび／またはｓｇＲＮＡを、本明細書に記載のｍＴＧＡシステムで使用するために設計する。ＣＭＶおよび／またはＣｏｌ１ａ２プロモーターは、多重ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの発現を駆動するために使用される。ｍＴＧＡ構築物をＡＡＶベクター、例えばＡＡＶ９にクローニングする（本明細書では以下、ＡＡＶ－ｍＴＧＡと呼ぶ）。
マウスにＡＡＶ－ＭＰＨ（対照）またはＡＡＶ－ｍＴＧＡを注射した。標的遺伝子のｑＰＣＲおよびウエスタンブロット分析を使用して活性化効率を評価する。マウス肝臓を採取して、処置後に線維症および／または肝硬変が減少するかどうかを決定することもできる。
本開示の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮すると、図示された実施形態は本発明の例にすぎず、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことが認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲および精神の範囲内に入るすべてを本発明者らの発明として主張する。

Claims (42)

  1. 多重単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする核酸であって、５’から３’に、
    第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の改変ｓｇＲＮＡを逆配向にコードする第１の核酸分子、
    第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の改変ｓｇＲＮＡを順配向にコードする第２の核酸分子、を含み、
    前記コードされた第１および第２の改変ｓｇＲＮＡが、配列番号１６の天然ＭＳ２結合ループ配列に対して少なくとも２つのヌクレオチド変化を含む少なくとも２つの改変ＭＳ２結合ループを含み、前記少なくとも２つのヌクレオチド変化が、前記天然ＭＳ２結合ループ配列と比較して前記改変ＭＳ２結合ループ配列のＧＣ含有量を増加させ、および／または反復的なコンテンツを短縮する、核酸。
  2. 前記第２の核酸分子の３’に位置する第３の核酸分子をさらに含み、前記第３の核酸が、順配向で第１の切断部位および第３の改変ｓｇＲＮＡをコードし、
    前記第３の改変ｓｇＲＮＡが、前記第２のプロモーターに作動可能に連結され、配列番号１６の前記天然ＭＳ２結合ループ配列に対して少なくとも２つのヌクレオチド変化を含む少なくとも２つの改変ＭＳ２結合ループを含み、前記少なくとも２つのヌクレオチド変化が、前記天然ＭＳ２結合ループ配列と比較して前記改変ＭＳ２結合ループ配列のＧＣ含有量を増加させ、および／または反復的なコンテンツを短縮する、請求項１に記載の核酸。
  3. 前記第１の核酸分子の５’に位置する第３の核酸分子をさらに含み、前記第３の核酸が、逆配向で第１の切断部位および第３の改変ｓｇＲＮＡをコードし、
    前記第３の改変ｓｇＲＮＡが、前記第１のプロモーターに作動可能に連結され、配列番号１６の前記天然ＭＳ２結合ループ配列に対して少なくとも２つのヌクレオチド変化を含む少なくとも２つの改変ＭＳ２結合ループを含み、前記少なくとも２つのヌクレオチド変化が、前記天然ＭＳ２結合ループ配列と比較して前記改変ＭＳ２結合ループ配列のＧＣ含有量を増加させ、および／または反復的なコンテンツを短縮する、請求項１に記載の核酸。
  4. 前記第１の核酸分子の５’に位置する第４の核酸分子をさらに含み、前記第４の核酸分子が、逆配向で第２の切断部位および第４の改変ｓｇＲＮＡをコードし、
    前記第４の改変ｓｇＲＮＡが、前記第１のプロモーターに作動可能に連結され、配列番号１６の前記天然ＭＳ２結合ループ配列に対して少なくとも２つのヌクレオチド変化を含む少なくとも２つの改変ＭＳ２結合ループを含み、前記少なくとも２つのヌクレオチド変化が、前記天然ＭＳ２結合ループ配列と比較して前記改変ＭＳ２結合ループ配列のＧＣ含有量を増加させ、および／または反復的なコンテンツを短縮する、請求項２に記載の核酸。
  5. 前記第１、第２、第３、または第４の改変ｓｇＲＮＡの１またはそれを超えるものが、配列番号１７、１８、または１９を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸。
  6. 前記第１の切断部位、前記第２の切断部位、またはその両方が、自己切断ＲＮＡをコードする、請求項２～４のいずれか一項に記載の核酸。
  7. 前記自己切断ＲＮＡが、プレトランスファーＲＮＡ（プレｔＲＮＡ）または自己切断リボザイムである、請求項６に記載の核酸。
  8. 前記第１の切断部位がプレｔＲＮＡをコードし、前記第２の切断部位が異なる生物由来のプレｔＲＮＡをコードする、請求項７に記載の核酸。
  9. 前記第１、第２、第３または第４の改変ｓｇＲＮＡの１またはそれを超えるものが、ＥＥＦ１α２、Ｆｓｔ、Ｐｄｘ１、クロトー、ユートロフィン、インターロイキン１０、Ｓｉｘ２、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、ＭｙｏＤ、Ｍｅｆ２ｂまたはＰａｘ７のプロモーター領域内の配列に相補的な標的化配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸。
  10. 前記第１、第２、第３、または第４の改変ｓｇＲＮＡの１またはそれを超えるものが、配列番号１０～１５もしくは４２～４８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、配列番号１０～１５もしくは４２～４８のいずれか１つを含むか、または配列番号１０～１５もしくは４２～４８のいずれか１つからなる、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸。
  11. 前記第１の改変ｓｇＲＮＡ配列が、
    配列番号１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか；
    配列番号１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５を含むか；または
    配列番号１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５からなる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸。
  12. 前記第２の改変ｓｇＲＮＡ配列が、
    配列番号１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか；
    配列番号１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５を含むか；または
    配列番号１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５からなる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の核酸。
  13. 前記第３の改変ｓｇＲＮＡ配列が、
    配列番号１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか；
    配列番号１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５を含むか；または
    配列番号１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５からなる、請求項２～１２のいずれか一項に記載の核酸。
  14. 前記第４の改変ｓｇＲＮＡ配列が、
    配列番号１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか；
    配列番号１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５を含むか；または
    配列番号１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５からなる、請求項３～１３のいずれか一項に記載の核酸。
  15. 前記核酸分子が、
    配列番号３、５３もしくは５４と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか；
    配列番号３、５３もしくは５４を含むか；または
    配列番号３、５３もしくは５４からなる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸。
  16. 前記核酸分子が、
    配列番号４もしくは５と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか；
    配列番号４もしくは５を含むか；または
    配列番号４もしくは５からなる、請求項２～１４のいずれか一項に記載の核酸。
  17. 前記核酸分子が、
    配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか；
    配列番号５５を含むか；または
    配列番号５５からなる、請求項３～１４のいずれか一項に記載の核酸。
  18. 前記核酸分子が、
    配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか；
    配列番号６を含むか；または
    配列番号６からなる、請求項４～１４のいずれか一項に記載の核酸。
  19. 前記第１、第２、第３、または第４のｓｇＲＮＡの１またはそれを超えるものがｄｇＲＮＡである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の核酸。
  20. 多重クリスパーＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードする核酸であって、５’から３’に、
    改変トランス活性化クリスパーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする核酸分子に作動可能に連結された第１のプロモーター、第１の切断部位、第１のｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸分子、第２の切断部位、および第２のｃｒＲＮＡをコードする第２の核酸分子を含み、
    前記コードされた改変ｔｒａｃｒＲＮＡが、配列番号１６の天然ＭＳ２結合ループ配列に対して少なくとも２つのヌクレオチド変化を含む少なくとも２つの改変ＭＳ２結合ループを含み、前記少なくとも２つのヌクレオチド変化が、前記天然ＭＳ２結合ループ配列と比較して前記改変ＭＳ２結合ループ配列のＧＣ含有量を増加させ、および／または反復的なコンテンツを短縮する、核酸。
  21. 第３のｃｒＲＮＡまたは単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする第３の核酸分子に作動可能に連結された第２のプロモーターをさらに含む、請求項２０に記載の核酸。
  22. ｉ．前記第２のプロモーターおよび前記第３の核酸分子が、第２のｃｒＲＮＡをコードする前記第２の核酸分子の３’であるか、または
    ｉｉ．前記第２のプロモーターおよび前記第３の核酸分子が、逆配向であり、前記第１のプロモーターの５’に位置する、
    請求項２１に記載の核酸。
  23. 前記第１または第２の切断部位が、プレトランスファーＲＮＡ（プレｔＲＮＡ）または自己切断リボザイムをコードする、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の核酸。
  24. 前記第１の切断部位がプレｔＲＮＡをコードし、前記第２の切断部位が自己切断リボザイムをコードする、請求項２３に記載の核酸。
  25. 前記改変ｔｒａｃｒＲＮＡが、
    配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか；
    配列番号７を含むか；または
    配列番号７からなる、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の核酸。
  26. 前記第１のｃｒＲＮＡ、前記第２のｃｒＲＮＡ、前記第３のｃｒＲＮＡ、または前記ｓｇＲＮＡの１またはそれを超えるものが、ＥＥＦ１α２、Ｆｓｔ、Ｐｄｘ１、クロトー、ユートロフィン、インターロイキン１０、Ｓｉｘ２、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、ＭｙｏＤ、Ｍｅｆ２ｂまたはＰａｘ７のプロモーター領域内の配列に相補的な標的化配列を含む、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の核酸。
  27. 前記第１、第２、または第３のｃｒＲＮＡが、
    配列番号８、９、４９、５０、５１、もしくは５２と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか；
    配列番号８、９、４９、５０、５１、もしくは５２を含むか；または
    配列番号８、９、４９、５０、５１、もしくは５２からなる、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の核酸。
  28. 前記ｓｇＲＮＡが、
    配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、４２、４３、４４、４５、４６、４７もしくは４８と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか；
    配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、４２、４３、４４、４５、４６、４７もしくは４８を含むか；または
    配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、４２、４３、４４、４５、４６、４７もしくは４８からなる、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の核酸。
  29. 前記核酸分子が、
    配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか；
    配列番号１を含むか；または
    配列番号１からなる、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の核酸。
  30. 前記核酸分子が、
    配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか；
    配列番号２を含むか；または
    配列番号２からなる、請求項２０～２９のいずれか一項に記載の核酸。
  31. 前記ｓｇＲＮＡがデッドガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である、請求項２０～３０のいずれか一項に記載の核酸。
  32. 請求項１～３１のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるＲＮＡ分子。
  33. 請求項１～３１のいずれか一項に記載の核酸を含むウイルスベクター。
  34. 請求項１～３２のいずれか一項に記載の核酸もしくはＲＮＡ分子、または請求項３３に記載のウイルスベクターと、
    薬学的に許容され得る担体と、
    を含む、組成物。
  35. 請求項１～３２のいずれか一項に記載の核酸もしくはＲＮＡ、請求項３３に記載のウイルスベクター、または請求項３４に記載の組成物と、
    Ｃａｓ９タンパク質またはデッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質をコードする核酸、および／または
    ＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸と、
    を含む、キット。
  36. ａ）Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９をコードする核酸を含む第１のベクターと、
    ｂ）請求項１～３１のいずれか一項に記載の核酸、およびＭＳ２転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸を含む第２のベクターと、
    を含む、多重標的化遺伝子活性化（ｍＴＧＡ）システム。
  37. 対象における少なくとも１つの遺伝子産物の発現を増加させる方法であって、
    治療有効量の請求項３６に記載の多重標的化遺伝子活性化（ｍＴＧＡ）システムを前記対象に投与することを含み、
    前記ｍＴＧＡシステムが前記対象の細胞に感染し、それによって前記感染細胞における前記少なくとも１つの遺伝子産物の発現を増加させる、方法。
  38. 遺伝子の発現の減少または非発現に関連する疾患を処置することを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記疾患が、Ｉ型糖尿病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、肝疾患または急性腎疾患である、請求項３８に記載の方法。
  40. 対象のＩ型糖尿病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、肝疾患または急性腎疾患を処置する方法であって、請求項３４に記載の組成物または請求項３６に記載のｍＴＧＡシステムを前記対象に投与することを含む、方法。
  41. 前記組成物または前記ｍＴＧＡシステムを投与することが、少なくとも１つの遺伝子標的の発現を増加させる、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記対象がヒトである、請求項３７～４１のいずれか一項に記載の方法。
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