KR20220004681A - 신규 aav 캡시드 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

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칼리아니 남비아르
제임스 엠. 윌슨
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아
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Abstract

신규 AAV 캡시드 및 이를 포함하는 rAAV가 본 명세서에서 제공된다. 일 실시형태에서, 신규 AAV 캡시드를 이용하는 벡터는 종래 기술의 AAV와 비교하여 선택된 표적 조직의 형질도입 증가를 나타낸다.

Description

신규 AAV 캡시드 및 이를 포함하는 조성물
아데노-연관 바이러스(AAV)는 인간 유전자 요법에서 큰 가능성을 가지고 있으며, 장기간 유전자 발현을 제공하는 능력 및 병원성의 결여로 인해 다양한 연구에서 간, 근육, 심장, 뇌, 눈, 신장, 및 기타 조직을 표적화하는 데 널리 사용되어 왔다. AAV는 파보바이러스 과에 속하며, 각각은 2개의 반전 말단 반복부(inverted terminal repeat)가 측접된 단일 가닥 DNA를 포함한다. 수십 개의 자연적으로 발생한 AAV 캡시드(capsid)가 보고되었으며; 이들의 독특한 캡시드 구조는 상이한 세포 유형과 기관을 인식하고 형질도입할 수 있게 한다.
1981년에 첫 번째 시험이 시작된 이후, AAV 벡터-기반 유전자 요법의 임상 시험에서 어떠한 벡터-관련 독성도 보고되지 않았다. 입증된 효능과 결합된, 임상 시험에서 AAV 벡터의 끊임없이 축적되는 안전성 기록은 AAV가 유전자 전달을 위한 유망한 플랫폼임을 나타낸다. 또 다른 매력적인 특성은 AAV가 작은 게놈(대략 4.7 kb) 및 단순한 유전자 성분(Rep 및 Cap 유전자와 함께 반전 말단 반복부(ITR))을 가지는 단일-가닥 DNA 바이러스이기 때문에 비교적 용이하게 조작된다는 점이다. AAV 벡터에는 ITR 및 AAV 캡시드 단백질만 필요하며, 이때 ITR은 벡터 생성을 위한 복제 및 패키징 신호의 역할을 하고 캡시드 단백질은 캡시드를 형성하여 벡터 게놈 DNA를 수용할 뿐만 아니라, 조직 친화성(tissue tropism)을 결정하여 벡터 게놈을 표적 세포 및 조직에 전달한다.
AAV는 이의 낮은 면역원성과 비병원성 특성으로 인해 유전자 요법을 위한 가장 효과적인 벡터 후보 중 하나이다. 그러나, 효율적인 유전자 전달을 가능하게 함에도 불구하고, 현재 임상에서 사용되는 AAV 벡터는 바이러스에 대한 기존 면역성과 제한된 조직 친화성으로 인해 방해를 받을 수 있다. 새롭고 보다 효과적인 AAV 벡터가 필요하다.
일 실시형태에서, 서열번호 2(AAVrh.90)의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드를 갖고, 캡시드에 이종 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈을 패키징한 재조합 아데노-연관 바이러스(recombinant adeno-associated virus: rAAV)가 본 명세서에서 제공된다. 소정의 실시형태에서, rAAV는 서열번호 1의 AAV 캡시드 서열, 또는 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 공유하는 서열의 발현에 의해 생성되는 캡시드 단백질을 포함하고, 캡시드에 이종 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈을 패키징한 캡시드를 가진다.
소정의 실시형태에서, rAAV가 본 명세서에서 제공되되, 여기서 AAV는, (1) 서열번호 2의 1 내지 738번의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로부터의 발현에 의해 생성되는 vp1 단백질, 서열번호 1로부터 생성되는 vp1 단백질, 또는 서열번호 2의 1 내지 738번의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1과 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성되는 vp1 단백질로부터 선택되는 AAVrh.90 vp1 단백질의 이종 집단; 서열번호 2의 적어도 약 138 내지 738번 아미노산의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로부터의 발현에 의해 생성되는 vp2 단백질, 서열번호 1의 적어도 412 내지 2214번 뉴클레오타이드를 포함하는 서열로부터 생성되는 vp2 단백질, 또는 서열번호 2의 적어도 약 138 내지 738번 아미노산의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1의 적어도 412 내지 2214번 뉴클레오타이드와 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성되는 vp2 단백질로부터 선택되는 AAVrh.90 vp2 단백질의 이종 집단; 서열번호 2의 적어도 약 204 내지 738번 아미노산의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로부터의 발현에 의해 생성되는 vp3 단백질, 서열번호 1의 적어도 610 내지 2214번 뉴클레오타이드를 포함하는 서열로부터 생성되는 vp3 단백질, 또는 서열번호 2의 적어도 약 204 내지 738번 아미노산의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1의 적어도 610 내지 2214번 뉴클레오타이드와 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성되는 vp3 단백질로부터 선택되는 AAVrh.90 vp3의 이종집단; 및/또는 (2) 서열번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열의 산물인 vp1 단백질의 이종 집단, 서열번호 2의 적어도 약 138 내지 738번 아미노산의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열의 산물인 vp2 단백질의 이종 집단, 및 서열번호 2의 적어도 204 내지 738번 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열의 산물인 vp3 단백질의 이종 집단을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 포함하며, 여기서 vp1, vp2 및 vp3 단백질은 서열번호 2의 아스파라긴-글리신 쌍에서 적어도 2개의 고도로 탈아마이드화된 아스파라긴(N)을 포함하고 선택적으로 다른 탈아마이드화된 아미노산을 포함하는 하위집단을 더 포함하는 아미노산 변형을 가지는 하위집단을 포함하고, 탈아마이드화는 아미노산 변화를 초래한다.
또 다른 실시형태에서, 적어도 rAAV 및 생리학적으로 양립 가능한 담체, 완충제, 아쥬반트 및/또는 희석제를 포함하는 조성물이 본 명세서에서 제공된다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 척추강내 전달용으로 제형화되고 벡터 게놈은 중추신경계로의 전달을 위한 유전자 산물을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 정맥내 전달, 비강내, 및/또는 근육내 전달용으로 제형화된다.
소정의 실시형태에서, rAAV를 생성하는 데 유용한 시스템이 제공된다. 시스템은, (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열; (b) AAV 캡시드로 패키징하기에 적합한 핵산 분자로서, 여기서 핵산 분자는 적어도 하나의 AAV 반전 말단 반복부(ITR) 및 숙주 세포에서 유전자 산물의 발현을 지시하는 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 산물을 인코딩하는 비-AAV 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자; 및 (c) rAAV 캡시드 내로 핵산 분자의 패키징을 허용하기에 충분한 AAV rep 기능 및 헬퍼 기능을 포함한다.
소정의 실시형태에서, AAV 캡시드를 포함하는 rAAV를 생성하는 방법이 제공된다. 방법은, (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산 분자; (b) 기능성 rep 유전자; (c) AAV 5' ITR, AAV 3' ITR, 및 이식유전자(transgene)를 포함하는 미니유전자; 및 (d) AAV 캡시드 내로 미니유전자의 패키징을 허용하기에 충분한 헬퍼 기능을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 rAAV, 발현 카세트, 또는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
소정의 실시형태에서, 이식유전자를 세포에 전달하는 방법이 제공된다. 방법은 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같은 rAAV와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 rAAV는 이식유전자를 포함한다.
이들 조성물 및 방법의 다른 양상 및 이점은 하기 상세한 설명에서 추가로 설명된다.
도 1은 AAV-SGA 작업 흐름에 대한 다이어그램을 도시한다. 게놈 DNA를 히말라야 원숭이(rhesus macaque) 조직 샘플로부터 단리하고 AAV 캡시드 유전자의 존재에 대해 스크리닝하였다. AAV-양성 DNA를 종점 희석시키고 추가 라운드의 PCR에 적용하였다. 푸아송 분포(Poisson distribution)에 따르면, 웰의 30% 이하에서 PCR 산물을 산출하는 DNA 희석은 시간의 80%에서 양성 PCR당 하나의 증폭 가능한 DNA 주형을 포함한다. Illumina MiSeq 2×150 또는 2×250쌍 말단 서열결정 플랫폼(paired end sequencing platform)을 사용하여 양성 앰플리콘의 서열을 결정하였고, 결과 판독물을 SPAdes 어셈블러를 사용하여 새로 조립하였다.
도 2는 신규 AAV 천연 분리주 및 대표적인 클레드(clade) 대조군의 DNA 게놈 서열의 이웃-결합 계통발생을 나타내는 다이어그램이다.
도 3A 내지 도 3C는 AAVrh.90(서열번호 1) 및 AAV8(서열번호 3) 캡시드에 대한 핵산 서열에 대한 정렬을 도시한다.
도 4는 AAVrh.90(서열번호 2) 및 AAV8(서열번호 4) 캡시드에 대한 아미노산 서열의 정렬을 도시한다.
도 5A 내지 도 5D는 주사 14일 후 마우스 조직에서 eGFP 이식유전자 생체분포를 도시한다. (도 5A 및 도 5B) C57BL/6 마우스에 CB7.CI.eGFP.WPRE.RBG를 포함하는 AAV 캡시드를 마우스당 1e12 GC의 용량으로 IV 주사하였다(n=5). (도 5C 및 도 5D) C57BL/6 마우스에 CB7.CI.eGFP.WPRE.RBG를 포함하는 다양한 AAV 캡시드(6.9e10 GC/마우스로 투약된 클레드 A 벡터)를 마우스당 1e11 GC의 용량으로 뇌실내(intracerebroventricularly: ICV) 주사하였다(n=5). 값은 평균±SD로 표현되어 있으며; * p < 0.01, ** p < 0.001이다.
도 6A 및 도 6B는 AAV 벡터의 IM 전달 후 근육에서 LacZ 발현의 분석을 도시한다. 다양한 캡시드를 갖고 CMV 프로모터 하에서 LacZ를 발현하는 3e9 GC의 벡터를 마우스에 투여하였다. 제20일에, 근육 조직을 수확하고, X-gal 염색(어두운 염색)에 의해 이식유전자 발현을 평가하였다.
도 7은 다양한 AAV 벡터의 IM 전달 후 혈청에서 mAb의 수준을 도시한다. tMCK 프로모터 하에서 3D6 항체를 발현하는 1e11 GC의 벡터를 B6 마우스에 투여하였다.
도 8은 3D6 또는 LacZ 이식유전자를 발현하는 벡터에 대한 (AAV8에 대한) 수율을 도시한다.
도 9는 NHP에서 풀링된 바코딩된 벡터 연구에 대한 실험 설계를 도시한다(데이터는 도 10A 내지 도 10C에 나타냄). 5개의 신규 캡시드 및 5개의 대조군(AAVrh.90, AAVrh.91, AAVrh.92, AAVrh.93, AAVrh.91.93, AAV8, AAV6.2, AAVrh32.33, AAV7 및 AAV9)을 고유한 6 bp 바코드가 있는 변형된 ATG-고갈 GFP 이식유전자로 패키징하였다. 동일한 양으로 벡터를 풀링하고 필리핀 원숭이(cynomologus macaque)에 IV 또는 ICM 주사하였다(총 용량: 2e13 GC/㎏ IV 및 3e13 GC ICM). IV 주사한 동물은 기준선에서 AAV6, AAV8, 및 AAVrh32.33에 대해 혈청음성이었고 중화 항체 역가가 AAV7 및 AAV9에 대하여 각각 1:5 및 1:10이었다.
도 10A 내지 10C는 IV 전달(도 10A 및 도 10B) 및 ICM 전달(도 10C) 후 바코딩된 캡시드의 RNA 발현 분석을 나타내는 그래프이다. IV 투여 - 2e13 GC/㎏ 총 용량, 제30일에 부검(이 동물은 기준선에서 낮은 수준의 AAV7 및 AAV9 Nab를 가짐). ICM 투여 - 3e13 GC/동물, 제30일에 부검. 각각의 조직 RNA 샘플에서 바코드 빈도를 각각의 바코드가 혼합물에서 동등한 표현(10%)을 가지도록 주사 주입 물질의 빈도로 정규화하였다. 10개 벡터의 입력량은 8.5 내지 12%의 범위였다. 값은 평균±SEM으로 표현되어 있으며, ** p < 0.001이다.
도 11은 NHP 바코드 연구에 사용된 다양한 AAV 캡시드의 소규모 제조 역가(small scale prep titer)를 나타내는 막대 그래프이다. 각각의 점은 개별적인 소규모 제조를 나타낸다.
도 12A 및 도 12B는 AAVrh.90 벡터 제조물의 질량 분석 분석법의 결과를 도시한다.
천연 포유동물 숙주에서 AAV의 유전적 변이는 바이러스 집단 내에서 개별 AAV 게놈을 정확하게 단리하는 데 사용되는 기법인 AAV 단일 게놈 증폭을 사용함으로써 조사되었다(도 1). 다양한 클레드에서 분류될 수 있는 히말라야 원숭이 조직으로부터 신규 AAV 서열의 단리가 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명자들은 정맥내(IV) 및 뇌실내(ICV) 전달 후 마우스에서, 그리고 IV 및 대조내(intra-cisterna magna: ICM) 전달 후 NHP에서 천연 분리주-유래 AAV 벡터의 생물학적 특성을 평가하였다. 결과는 프로토타입 클레드 구성원 대조군과 비교할 때 새로운 AAV 변이체의 클레드-특이적 및 가변적 형질도입 패턴을 둘 다 확인해 주었다.
대상체에게 전달된 후 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 AAVrh.90 캡시드 및 이식유전자를 인코딩하는 핵산을 가지는 재조합 AAVrh.90 벡터가 본 명세서에서 제공된다. rAAVrh.90 캡시드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 독립적으로 가지는 단백질을 포함한다. 이들 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다. 본 명세서에 기재된 방법은 다양한 병태의 치료를 위해 관심이 있는 조직을 표적화하기 위한 rAAV의 용도에 관한 것이다.
소정의 실시형태에서, 중추신경계의 세포로의 이식유전자의 전달에 매우 적합한 AAVrh.90 캡시드를 포함하는 벡터가 본 명세서에서 제공된다. 소정의 실시형태에서, 예컨대, ICM 전달을 통한 뇌 또는 척수로의 전달을 비롯한 척추강내 전달이 요망된다. 소정의 실시형태에서, AAVrh.90 캡시드를 포함하는 벡터는 간, 심장, 골격(가로무늬) 근육, 신장, 및 췌장을 포함하는 말초 기관의 세포로의 이식유전자의 전달에 매우 적합하다. AAVrh.90 벡터는 이들 조직을 표적화하는 데 적합한 투여 경로를 통해 전신으로 전달되거나 표적화될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 그리고 당업자에게 본 출원에서 사용되는 다수의 용어에 대한 일반적인 지침을 제공하는 공개된 텍스트를 참조하여 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 하기 정의는 단지 명확성을 위해 제공되며 청구된 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 용어는 하나 이상을 지칭하며, 예를 들어 "숙주 세포"는 하나 이상의 숙주 세포를 표현하는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "하나", "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 달리 명시되지 않는 한, 주어진 참조값으로부터 10%의 변동성을 의미한다. 본 명세서의 다양한 실시형태는 "포함하는" 용어를 사용하여 제시되어 있지만, 다른 상황 하에서, 관련 실시형태는 또한 "로 이루어진" 또는 "로 본질적으로 이루어진" 용어를 사용하여 해석되고 기재되는 것으로 의도된다.
하기 설명과 관련하여, 본 명세서에 기재된 각각의 조성물은 또 다른 실시형태에서 본 발명의 방법에 유용한 것으로 의도된다. 추가적으로, 또한 방법에 유용한 것으로 본 명세서에 기재된 각각의 조성물은 또 다른 실시형태에서 그 자체가 본 발명의 실시형태인 것으로 의도된다.
"재조합 AAV" 또는 "rAAV"는 2개의 요소, 즉, AAV 캡시드 및 AAV 캡시드 내에 패키징된 적어도 비-AAV 코딩 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 DNAse-저항성 바이러스 입자이다. 달리 명시되지 않는 한, 이 용어는 어구 "rAAV 벡터"와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. rAAV는 기능성 AAV rep 유전자 또는 기능성 AAV cap 유전자가 결여되어 있고 자손을 생성할 수 없기 때문에, "복제-결함 바이러스" 또는 "바이러스 벡터"이다. 소정의 실시형태에서, 유일한 AAV 서열은, 반전 말단 반복부 서열(ITR) 사이에 위치하는 유전자 및 조절 서열이 AAV 캡시드 내에 패키징될 수 있도록 하기 위해 전형적으로 벡터 게놈의 5' 및 3' 제일 말단에 위치하는 AAV 반전 말단 반복부 서열(ITR)이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "벡터 게놈"은 바이러스 입자를 형성하는 rAAV 캡시드 내부에 패키징된 핵산 서열을 지칭한다. 이와 같은 핵산 서열은 AAV 반전 말단 반복 서열(ITR)을 포함한다. 본 명세서의 예에서, 벡터 게놈은 최소한 5'에서 3'으로, AAV 5' ITR, 코딩 서열(들), 및 AAV 3' ITR을 포함한다. 소정의 실시형태에서, ITR은 AAV2 유래이고, 캡시드와 상이한 공급원의 AAV, 또는 또 다른 전장 ITR이 선택될 수 있다. 소정의 실시형태에서, ITR은 생성 동안 rep 기능을 제공하는 AAV 또는 트랜스상보성(transcomplementing) AAV와 동일한 AAV 공급원 유래이다. 또한, 다른 ITR이 사용될 수 있다. 또한, 벡터 게놈은 유전자 산물의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함한다. 벡터 게놈의 적합한 성분은 본 명세서에서 보다 상세하게 논의된다. 벡터 게놈은 때때로 "미니유전자"로 본 명세서에서 지칭된다.
용어 "발현 카세트"는 이식유전자 서열 및 이에 따른 조절 서열(예컨대, 프로모터, 인핸서, 폴리A)를 포함하는 핵산 분자를 지칭하며, 상기 카세트는 바이러스 벡터(예컨대, 바이러스 입자)의 캡시드 내로 패키징될 수 있다. 전형적으로, 바이러스 벡터를 생성하기 위한 이와 같은 발현 카세트는 바이러스 게놈의 패키징 신호가 측접된 이식유전자 서열 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 발현 제어 서열을 포함한다. 예를 들어, AAV 바이러스 벡터의 경우, 패키징 신호는 5' 반전 말단 반복부(ITR) 및 3' ITR에 있다. 소정의 실시형태에서, 용어 "이식유전자"는 "발현 카세트"와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 용어 "이식유전자"는 선택된 유전자에 대한 코딩 서열만을 지칭한다.
rAAV는 AAV 캡시드 및 벡터 게놈으로 구성된다. AAV 캡시드는 vp1의 이종 집단, vp2의 이종 집단, 및 vp3 단백질의 이종 집단의 조립체이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 vp 캡시드 단백질을 지칭하는 데 사용되는 경우, 용어 "이종" 또는 이의 임의의 문법적 변형은, 예를 들어, 상이한 변형된 아미노산 서열이 있는 vp1, vp2 또는 vp3 단량체(단백질)를 가지는, 동일하지 않은 요소로 이루어진 집단을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, vp1, vp2 및 vp3 단백질(대안적으로 아이소형(isoform)으로 불림)과 관련하여 사용될 때 용어 "이종 집단"은 캡시드 내 vp1, vp2 및 vp3 단백질의 아미노산 서열의 차이를 지칭한다. AAV 캡시드는 vp1 단백질 내, vp2 단백질 내 및 vp3 단백질 내에 예상되는 아미노산 잔기로부터 변형이 있는 하위집단을 포함한다. 이러한 하위집단은, 최소한 특정 탈아마이드화된 아스파라긴(N 또는 Asn) 잔기를 포함한다. 예를 들어, 특정 하위집단은 아스파라긴-글리신 쌍에서 적어도 1, 2, 3 또는 4개의 고도로 탈아마이드화된 아스파라긴(N) 위치를 포함하고 선택적으로 다른 탈아마이드화된 아미노산을 더 포함하며, 여기서 탈아마이드화는 아미노산 변화 및 다른 선택적인 변형을 초래한다. 2019년 2월 27일자로 출원된 PCT/US19/019804호, 및 2019년 2월 27일자로 출원된 PCT/US19/019861호를 참조하며, 이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, vp 단백질의 "하위집단"은 달리 명시되지 않는 한, 공통적으로 적어도 하나의 정의된 특징을 가지고, 적어도 하나의 그룹 구성원 내지 참조 그룹의 모든 구성원보다 더 적은 수의 그룹 구성원으로 이루어진 vp 단백질의 그룹을 지칭한다. 예를 들어, vp1 단백질의 "하위집단"은 달리 명시되지 않는 한, 조립된 AAV 캡시드 내에 적어도 하나(1)의 vp1 단백질이 있고 모든 vp1 단백질보다 더 적은 수의 vp1 단백질이 있을 수 있다. vp3 단백질의 "하위집단"은 달리 명시되지 않는 한, 조립된 AAV 캡시드 내에 하나(1)의 vp3 단백질 내지 모든 vp3 단백질보다 더 적은 수의 vp3 단백질이 있을 수 있다. 예를 들어, vp1 단백질은 vp 단백질의 하위집단일 수 있고; vp2 단백질은 vp 단백질의 별개의 하위집단일 수 있으며, vp3은 또한 조립된 AAV 캡시드 내의 vp 단백질의 추가의 하위집단이다. 또 다른 예에서, vp1, vp2 및 vp3 단백질은, 예를 들어, 아스파라긴-글리신 쌍에서 상이한 변형, 예를 들어 적어도 1, 2, 3 또는 4개의 고도로 탈아마이드화된 아스파라긴을 가지는 하위집단을 포함할 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 고도로 탈아마이드화된 것은 참조 아미노산 위치에서 예상되는 아미노산 서열과 비교하여, 참조된 아미노산 위치에서 적어도 45% 탈아마이드화된, 적어도 50% 탈아마이드화된, 적어도 60% 탈아마이드화된, 적어도 65% 탈아마이드화된, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 최대 약 100%의 탈아마이드화된 것을 지칭한다. 이와 같은 백분율은 2D-겔, 질량분석법 기법, 또는 다른 적합한 기법을 사용하여 결정될 수 있다.
이론에 구속되고자 하지 않지만, AAV 캡시드 내의 vp 단백질에서 적어도 고도로 탈아마이드화된 잔기의 탈아마이드화는 사실상 주로 비효소적인 것으로 여겨지는데, 이는 선택된 아스파라긴, 그리고 더 적은 정도로는 글루타민 잔기를 탈아마이드화시키는 캡시드 단백질 내의 작용기에 의해 유발된다. 대부분의 탈아마이드화 vp1 단백질의 효율적인 캡시드 조립은, 이러한 사건이 캡시드 조립 이후에 일어나거나 개별적인 단량체(vp1, vp2 또는 vp3)의 탈아마이드화가 구조적으로 잘 용인되고, 조립 동역학에 크게 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 일반적으로 세포 유입 이전에 내부에 위치될 것으로 간주되는 VP1-고유(VP1-u) 영역(대략 aa 1 내지 137)에서의 광범위한 탈아마이드화는, VP 탈아마이드화가 캡시드 조립 이전에 일어날 수 있음을 시사한다.
이론에 구속되고자 하지 않지만, N의 탈아마이드화는 이의 C-말단 잔기의 백본 질소 원자가 Asn 측쇄 아마이드 기 탄소 원자에 대한 친핵성 공격을 수행함으로써 일어날 수 있다. 중간체 폐환(ring-closed) 석신이미드 잔기가 형성되는 것으로 여겨진다. 이어서 석신이미드 잔기에 신속한 가수분해가 수행되어 최종 산물인 아스파트산(Asp) 또는 아이소 아스파트산(IsoAsp)이 생성된다. 따라서, 소정의 실시형태에서, 아스파라긴(N 또는 Asn)의 탈아마이드화는 Asp 또는 IsoAsp를 생성하고, 이는 하기에 설명되는 바와 같이, 예를 들어 석신이미드 중간체를 통해서 상호 전환될 수 있다.
Figure pct00001
본 명세서에서 제공되는 바와 같이, VP1, VP2 또는 VP3의 각각의 탈아마이드화된 N은 독립적으로 아스파트산(Asp), 아이소아스파트산(isoAsp), 아스파테이트, 및/또는 Asp 및 isoAsp의 상호전환 블렌드, 또는 이들의 조합물일 수 있다. α-와 아이소아스파트산의 임의의 적합한 비율이 존재할 수 있다. 예를 들어, 소정의 실시형태에서, 비율은 10:1 내지 1:10의 아스파트산 대 아이소아스파트산, 약 50:50의 아스파트산:아이소아스파트산, 또는 약 1:3의 아스파트산:아이소아스파트산, 또는 또 다른 선택된 비율일 수 있다.
소정의 실시형태에서, 하나 이상의 글루타민(Q)은 글루탐산(Glu), 즉, α-글루탐산, γ-글루탐산(Glu), 또는 α-글루탐산과 γ-글루탐산의 블렌드로 탈아마이드화될 수 있으며, 이는 일반적인 글루타린이미드 중간체를 통해서 상호전환될 수 있다. α-글루탐산과 γ-글루탐산의 임의의 적합한 비율이 존재할 수 있다. 예를 들어, 소정의 실시형태에서, 비율은 10:1 내지 1:10의 α 대 γ, 약 50:50의 α:γ, 또는 약 1:3의 α:γ, 또는 또 다른 선택된 비율일 수 있다.
Figure pct00002
따라서, rAAV는, 최소한 적어도 하나의 고도로 탈아마이드화된 아스파라긴을 포함하는 적어도 하나의 하위집단을 포함하는, 탈아마이드화된 아미노산이 있는 vp1, vp2 및/또는 vp3 단백질의 rAAV 캡시드 내의 하위집단을 포함한다. 추가적으로, 다른 변형은 특히 선택된 아스파트산(D 또는 Asp) 잔기 위치에서 이성질체화를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 변형은 Asp 위치에서의 아마이드화를 포함할 수 있다.
소정의 실시형태에서, AAV 캡시드는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5 내지 적어도 약 25개의 탈아마이드화된 아미노산 잔기 위치를 가지는 vp1, vp2 및 vp3의 하위집단을 포함하며, 이의 적어도 1 내지 10%, 적어도 10 내지 25%, 적어도 25 내지 50%, 적어도 50 내지 70%, 적어도 70 내지 100%, 적어도 75 내지 100%, 적어도 80 내지 100% 또는 적어도 90 내지 100%는 vp 단백질의 인코딩된 아미노산 서열과 비교하여 탈아마이드화된다. 이들 대부분은 N 잔기일 수 있다. 그러나, Q 잔기가 또한 탈아마이드화될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "인코딩된 아미노산 서열"은 아미노산으로 번역될 참조된 핵산 서열의 공지된 DNA 코돈의 번역을 기준으로 예상되는 아미노산을 지칭한다. 하기 표는 단일 문자 암호(SLC) 및 3 문자 암호(3LC) 둘 다를 나타내는, DNA 코돈 및 20개의 일반적인 아미노산을 설명한다.
Figure pct00003
소정의 실시형태에서, rAAV는 본 명세서에서 제공되고 본 명세서에서 참조에 의해 원용되는 표에 제시된 위치에서 2, 3, 4, 5개, 또는 그 초과의 탈아마이드화된 잔기를 포함하는 하위집단을 가지는 vp1, vp2 및 vp3 단백질을 가지는 AAV 캡시드를 가진다.
rAAV에서의 탈아마이드화는 2D 겔 전기영동법, 및/또는 질량 분석법, 및/또는 단백질 모델링 기법을 사용하여 결정될 수 있다. 온라인 크로마토그래피는 Acclaim PepMap 칼럼 및 NanoFlex 소스가 있는 Q Exactive HF(Thermo Fisher Scientific)에 커플링된 Thermo UltiMate 3000 RSLC 시스템(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 수행될 수 있다. MS 데이터는 조사 스캔(200 내지 2000 m/z)으로부터의 가장 풍부한 서열결정전(not-yet-sequenced) 전구체 이온을 동력학적으로 선택하는 Q Exactive HF에 대한 데이터 의존적인 상위 20 방법을 사용하여 획득된다. 서열결정은 예측된 자동 이득 제어로 결정된 1e5 이온의 목표 값을 이용한 고 에너지 충돌 분열 단편화를 통해서 수행되고, 전구체의 단리는 4 m/z의 창으로 수행되었다. 조사 스캔은 m/z 200에서 120,000의 분해능으로 획득되었다. HCD 스펙트럼에 대한 분해능은 50㎳의 최대 이온 주입 시간 및 30의 정규화된 충돌 에너지를 이용하여 m/z 200에서 30,000으로 설정될 수 있다. S-렌즈 RF 수준은 50에서 설정되어, 소화로부터 펩타이드에 의해서 점유된 m/z 영역의 최적의 전달을 제공할 수 있다. 전구체 이온은 단편화 선택으로부터 단일, 미배정, 또는 6 및 더 높은 전하 상태로 제외될 수 있다. BioPharma Finder 1.0 소프트웨어(Thermo Fischer Scientific)가 획득된 데이터의 분석에 사용될 수 있다. 펩타이드 맵핑을 위해서, 고정된 변형으로서 설정된 카바마이도메틸화; 및 가변 변형으로서 설정된 산화, 탈아마이드화, 및 인산화, 10-ppm 질량 정확도, 높은 프로테아제 특이성, 및 MS/MS 스펙트럼에 대한 0.8의 신뢰 수준을 가지는 단기식 단백질 FASTA 데이터베이스를 사용하여 검색을 수행한다. 적합한 프로테아제의 예는, 예를 들어 트립신 또는 키모트립신을 포함할 수 있다. 탈아마이드화된 펩타이드의 질량 분석법적 식별은 비교적 간단한데, 그 이유는 탈아마이드화가 무손상 분자 +0.984 Da의 질량(-OH와 -NH2 기 간의 질량 차이)에 추가되기 때문이다. 특정 펩타이드의 탈아마이드화 백분율은 탈아마이드화된 펩타이드의 질량 면적을, 탈아마이드화된 펩타이드와 천연 펩타이드의 면적의 합으로 나눔으로써 결정된다. 가능한 탈아마이드화 부위의 수를 고려하여, 상이한 부위에서 탈아마이드화된 동중 원소종(isobaric species)이 단일 피크에서 동시에 이동할 수 있다. 결론적으로, 다수의 잠재적인 탈아마이드화 부위가 있는 펩타이드로부터 기원한 단편 이온을 사용하여 탈아마이드화의 다수의 부위를 위치시키거나 구별할 수 있다. 이러한 경우에, 관찰된 동위원소 패턴 내의 상대 강도를 사용하여 상이한 탈아마이드화된 펩타이드 이성질체의 상대 풍부도를 구체적으로 결정할 수 있다. 이러한 방법은, 모든 이성질체 종에 대한 단편화 효율성이 동일하고, 탈아마이드화 부위에 독립적이라고 가정한다. 이러한 예시적인 방법에 대한 다수의 변경이 사용될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들어, 적합한 질량 분석기는, 예를 들어 사중극자 비행 시간 질량 분석기(quadrupole time of flight mass spectrometer: QTOF), 예컨대, Waters Xevo 또는 Agilent 6530 또는 오비트랩 기기(orbitrap instrument), 예컨대, Orbitrap Fusion 또는 Orbitrap Velos(Thermo Fisher)를 포함할 수 있다. 적합하게 액체 크로마토그래피 시스템은, 예를 들어, Waters 또는 Agilent 시스템으로부터의 Acquity UPLC 시스템(1100 또는 1200 시리즈)을 포함한다. 적합한 데이터 분석 소프트웨어는, 예를 들어 MassLynx(Waters), Pinpoint 및 Pepfinder(Thermo Fischer Scientific), Mascot(Matrix Science), Peaks DB(Bioinformatics Solutions)를 포함할 수 있다. 또 다른 기법은, 예를 들어, 문헌[X. Jin et al, Hu Gene Therapy Methods, Vol. 28, No. 5, pp. 255-267](2017년 6월 16일자로 온라인 공개됨)에 기재된 것일 수 있다.
탈아마이드화에 추가적으로, 다른 변형이 일어날 수 있는데, 이는 하나의 아미노산의 상이한 아미노산 잔기로의 전환을 초래하지 않는다. 이와 같은 변형은 아세틸화된 잔기, 이성질체화, 인산화, 또는 산화를 포함할 수 있다.
탈아마이드화의 조절: 소정의 실시형태에서, AAV는 아스파라긴-글리신 쌍에서 글리신을 변화시키도록 변형되어, 탈아마이드화를 감소시킨다. 다른 실시형태에서, 아스파라긴은 상이한 아미노산, 예를 들어 더 느린 속도로 탈아마이드화시키는 글루타민으로; 또는 아마이드 기가 결여된 아미노산(예컨대, 글루타민 및 아스파라긴은 아마이드 기를 포함함)으로; 그리고/또는 아민기가 결여된 아미노산(예컨대, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘은 아민 기를 포함함)으로 변경된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 아마이드 또는 아민 측쇄가 결여된 아미노산은, 예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 세린, 트레오닌, 시스틴, 페닐알라닌, 타이로신, 또는 트립토판, 및/또는 프롤린을 지칭한다. 예컨대, 기재된 변형은 인코딩된 AAV 아미노산 서열에서 발견되는 아스파라긴-글리신 쌍 중 1, 2 또는 3개에 존재할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 이와 같은 변형은 아스파라긴-글리신 쌍 중 4개 모두에서 일어나지는 않는다. 따라서, AAV 및/또는 조작된 AAV 변이체의 탈아마이드화를 감소시키는 방법은 더 낮은 탈아마이드화 속도를 가진다. 추가적으로, 또는 대안적으로 하나 이상의 다른 아마이드 아미노산은 비-아마이드 아미노산으로 변화되어 AAV의 탈아마이드화를 감소시킬 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 돌연변이체 AAV 캡시드는 아르기닌-글리신 쌍에서 돌연변이를 포함하여, 글리신은 알라닌 또는 세린으로 변화된다. 돌연변이체 AAV 캡시드는 1, 2 또는 3개의 돌연변이체를 포함할 수 있고, 여기서 참조 AAV는 본래 4개의 NG 쌍을 포함한다. 소정의 실시형태에서, AAV 캡시드는 1, 2, 3 또는 4개의 이와 같은 돌연변이체를 포함할 수 있고, 여기서 참조 AAV는 본래 5개의 NG 쌍을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 돌연변이체 AAV 캡시드는 NG 쌍 내에 단일 돌연변이만을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 돌연변이체 AAV 캡시드는 2개의 상이한 NG 쌍 내에 돌연변이를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 돌연변이체 AAV 캡시드는 AAV 캡시드에서 구조적으로 분리된 위치에 위치된 2개의 상이한 NG 쌍이다. 소정의 실시형태에서, 돌연변이는 VP1-고유 영역에 존재하지 않는다. 소정의 실시형태에서, 돌연변이 중 하나는 VP1-고유 영역에 존재한다. 선택적으로, 돌연변이체 AAV 캡시드는 NG 쌍 내에 어떠한 변형도 포함하지 않지만, NG 쌍의 위부에 위치된 하나 이상의 아스파라긴 또는 글루타민에서 탈아마이드화를 최소화 또는 제거하기 위해서 돌연변이를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 야생형 AAV 캡시드에서 하나 이상의 NG를 제거하는 AAV 캡시드를 조작하는 단계를 포함하는 rAAV 벡터의 효능을 증가시키는 방법이 제공된다. 소정의 실시형태에서, "NG"의 "G"에 대한 코딩 서열은 또 다른 아미노산을 인코딩하도록 조작된다. 하기 소정의 예에서, "S" 또는 "A"가 치환된다. 그러나, 다른 적합한 아미노산 코딩 서열이 선택될 수 있다.
이러한 아미노산 변형은 통상적인 유전 공학 기법에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 아스파라긴-글리신 쌍에서 글리신을 인코딩하는 코돈 중 1 내지 3개가 글리신 이외의 아미노산을 인코딩하도록 변형되는, 변형된 AAV vp 코돈을 포함하는 핵산 서열이 생성될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 변형된 아스파라긴 코돈을 포함하는 핵산 서열은 변형된 코돈이 아스파라긴 이외의 아미노산을 인코딩하도록, 아스파라긴-글리신 쌍 중 1 내지 3개에서 조작될 수 있다. 각각의 변형된 코돈은 상이한 아미노산을 인코딩할 수 있다. 대안적으로, 변경된 코돈 중 하나 이상은 동일한 아미노산을 인코딩할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 이러한 변형된 AAVrh.90 핵산 서열은 천연 AAVrh.90 캡시드보다 탈아마이드화가 더 낮은 캡시드를 갖는 돌연변이체 rAAV를 생성하는 데 사용될 수 있다. 이와 같은 돌연변이체 rAAV는 감소된 면역성을 갖고/갖거나 저장, 특히 현탁액 형태로의 저장 시 안정성을 증가시킬 수 있다.
또한, 탈아마이드화가 감소된 AAV 캡시드를 인코딩하는 핵산 서열이 본 명세서에서 제공된다. DNA(게놈 또는 cDNA), 또는 RNA(예컨대, mRNA)를 포함하여, 이러한 AAV 캡시드를 인코딩하는 핵산 서열을 설계하는 것은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 이와 같은 핵산 서열은 선택된 시스템(즉, 세포 유형)에서의 발현에 대하여 코돈-최적화될 수 있고 다양한 방법에 의해 설계될 수 있다. 이러한 최적화는 입수 가능한 온라인(예컨대, GeneArt), 공개된 방법, 또는 코돈 최적화 서비스를 제공하는 회사, 예를 들어, DNA2.0(미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재)을 사용하여 수행될 수 있다. 한 코돈 최적화 방법은, 예를 들어, 국제 특허 공개 WO 제2015/012924호에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다. 또한, 예를 들어 미국 특허 공개 제2014/0032186호 및 미국 특허 공개 제2006/0136184호를 참조한다. 적합하게는, 산물에 대한 오픈 리딩 프레임(ORF)의 전체 길이는 변형된다. 그러나, 몇몇 실시형태에서, 단지 ORF의 단편만이 변경될 수 있다. 이러한 방법 중 하나를 사용함으로써, 임의의 주어진 폴리펩타이드 서열에 빈도를 적용할 수 있고, 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈-최적화된 코딩 영역의 핵산 단편을 생성할 수 있다. 코돈에 대한 실제 변화를 수행하기 위해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 설계된 코돈-최적화된 코딩 영역을 합성하기 위해 다수의 옵션이 이용 가능하다. 이와 같은 변형 또는 합성은 당업자에게 널리 공지된 표준 및 일상적인 분자 생물학 조작을 사용하여 수행될 수 있다. 한 접근법에서, 각각 80 내지 90개 뉴클레오타이드 길이의 일련의 상보성 올리고뉴클레오타이드 쌍 및 원하는 서열의 길이의 스패닝은 표준 방법에 의해서 합성된다. 이러한 올리고뉴클레오타이드 쌍은, 어닐링 시, 이것이 응집성(cohesive) 말단을 포함하는, 80 내지 90개 염기쌍의 이중 가닥 단편을 형성하도록 합성되고, 예를 들어 쌍 내의 각각의 올리고뉴클레오타이드는 쌍 내의 다른 올리고뉴클레오타이드와 상보성인 영역을 넘어서 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 염기를 연장하도록 합성된다. 올리고뉴클레오타이드의 각각의 쌍의 단일-가닥 말단은 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 쌍의 단일-가닥 말단과 어닐링하도록 설계된다. 올리고뉴클레오타이드 쌍은 어닐링되는 것이 허용되며, 그 다음 이러한 이중-가닥 단편의 대략 5 내지 6개는 응집성 단일 가닥 말단을 통해 함께 어닐링되는 것이 허용되고, 그 다음 이는 함께 결찰되고, 표준 박테리아 클로닝 벡터, 예를 들어, Invitrogen Corporation(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)으로부터 입수 가능한 TOPO® 벡터 내로 클로닝된다. 그 다음, 작제물은 표준 방법에 의해서 서열결정된다. 함께 결찰된 80 내지 90개 염기 쌍 단편의 5 내지 6개의 단편, 즉, 약 500개 염기 쌍의 단편으로 이루어진 이러한 작제물 중 몇몇이 제조되어, 전체 원하는 서열이 일련의 플라스미드 작제물에서 표현된다. 그 다음, 이러한 플라스미드의 삽입물은 적절한 제한 효소로 절단되고, 함께 결찰되어 최종 작제물을 형성한다. 그 다음, 최종 작제물은 표준 박테리아 클로닝 벡터 내로 클로닝되고, 서열결정된다. 추가 방법은 당업자에게 즉시 명백할 것이다. 추가적으로, 유전자 합성은 상업적으로 용이하게 입수 가능하다.
소정의 실시형태에서, 다수의 고도로 탈아마이드화된 "NG" 위치를 포함하는 AAV 캡시드 아이소폼(즉, VP1, VP2, VP3)의 이종 집단을 가지는 AAV 캡시드가 제공된다. 소정의 실시형태에서, 고도로 탈아마이드화된 위치는 예상되는 전장 VP1 아미노산 서열을 참조하여 하기 확인된 위치에 있다. 다른 실시형태에서, 캡시드 유전자는 참조된 "NG"가 제거되고 돌연변이체 "NG"가 또 다른 위치로 조작되도록 변형된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표적 세포" 및 "표적 조직"은 대상 AAV 벡터에 의해 형질도입되도록 의도된 임의의 세포 또는 조직을 지칭할 수 있다. 용어는 근육, 간, 폐, 기도 상피, 중추신경계, 뉴런, 눈(안구 세포), 또는 심장 중 임의의 하나 이상을 지칭할 수 있다. 일 실시형태에서, 표적 조직은 간이다. 또 다른 실시형태에서, 표적 조직은 심장이다. 또 다른 실시형태에서, 표적 조직은 뇌이다. 또 다른 실시형태에서, 표적 조직은 근육이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포유동물 대상체" 또는 "대상체"는 특히 인간을 포함하여 본 명세서에 기재된 치료 또는 예방 방법을 필요로 하는 임의의 포유동물을 포함한다. 이와 같은 치료 또는 예방을 필요로 하는 다른 포유동물은 비-인간 영장류 등을 포함하여, 개, 고양이, 또는 기타 가축동물, 말, 가축, 실험 동물을 포함한다. 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 rAAV가 플라스미드로부터 생성되는 패키징 세포주를 지칭할 수 있다. 대안적으로, 용어 "숙주 세포"는 이식유전자의 발현이 요망되는 표적 세포를 지칭할 수 있다.
A. AAV 캡시드
서열번호 2에 제시된 vp1 서열을 갖는 신규한 AAV 캡시드 단백질이 본 명세서에서 제공된다. AAV 캡시드는 3개의 중첩 코딩 서열로 이루어지며, 이는 대안적인 시작 코돈 출현빈도로 인해 길이가 다양하다. 이러한 가변 단백질은 VP1, VP2 및 VP3으로 지칭되며, 이때 VP1이 가장 길고 VP3이 가장 짧다. AAV 입자는 대략 1:1:10(VP1:VP2:VP3)의 비율로 3가지 캡시드 단백질 전부로 이루어진다. N-말단에서 VP1 및 VP2에 포함되는 VP3은 입자를 구축하는 주요 구조 성분이다. 캡시드 단백질은 여러 가지 상이한 넘버링 시스템을 사용하여 지칭될 수 있다. 편의상, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, AAV 서열은, VP1의 첫 번째 잔기에 대해 aa 1로 시작하는 VP1 넘버링을 사용하여 지칭된다. 그러나, 본 명세서에 기재된 캡시드 단백질은 VP1, VP2 및 VP3(본 명세서에서 vp1, vp2 및 vp3으로 상호 교환 가능하게 사용됨)을 포함한다. 캡시드의 가변 단백질의 넘버링은 다음과 같다:
뉴클레오타이드 (nt)
AAVrh.90: 서열번호 1의 vp1 - nt 1 내지 2214번; vp2 - nt 412 내지 2214번; vp3 - nt 610 내지 2214번
AAV8 캡시드 서열이 있는 AAVrh.90 캡시드에 대한 핵산 서열의 정렬이 도 3A 내지 도 3C에 도시되어 있다.
아미노산(aa)
AAVrh.90: 서열번호 2의 aa vp1 - 1 내지 738번; vp2 - aa 138 내지 738번; vp3 - aa 204 내지 738번
AAV8 캡시드 서열이 있는 AAVrh.90 캡시드에 대한 아미노산 서열 캡시드의 정렬이 도 4에 도시되어 있다.
AAVrh.90(서열번호 2)의 vp1, vp2 및 vp3 중 적어도 하나를 포함하는 rAAV가 본 명세서에 포함된다. 또한, AAVrh.90(서열번호 1) 또는 이의 vp1, vp2 및 vp3 중 적어도 하나에 의해 인코딩되는 AAV 캡시드를 포함하는 rAAV가 본 명세서에서 제공된다.
일 실시형태에서, 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)의 혼합 집단을 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 rAAV 각각은, (a) vp1 단백질, vp2 단백질 및 vp3 단백질로 구성되는 약 60개의 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 단백질로서, vp1, vp2 및 vp3 단백질은 선택된 AAV vp1 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로부터 생성되는 vp1 단백질의 이종 집단, 선택된 AAV vp2 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로부터 생성되는 vp2 단백질의 이종 집단, 선택된 AAV vp3 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로부터 생성되는 vp3 단백질의 이종 집단이고, vp1, vp2 및 vp3 단백질은 AAV 캡시드의 아스파라긴-글리신 쌍에서 적어도 2개의 고도로 탈아마이드화된 아스파라긴(N)을 포함하고 선택적으로 다른 탈아마이드화된 아미노산을 포함하는 하위집단을 더 포함하는 아미노산 변형이 있는 하위집단을 포함하며, 탈아마이드화는 아미노산 변화를 초래하는, AAV 캡시드; 및 (b) AAV 캡시드 내의 벡터 게놈으로서, AAV 반전 말단 반복부 서열을 포함하는 핵산 분자 및 숙주 세포에서 산물의 발현을 지시하는 서열에 작동 가능하게 연결된 산물을 인코딩하는 비-AAV 핵산 서열을 포함하는, 벡터 게놈을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 탈아마이드화된 아스파라긴은 아스파트산, 아이소아스파트산, 상호전환 아스파트산/아이소아스파트산 쌍, 또는 이들의 조합물로 탈아마이드화된다. 소정의 실시형태에서, 캡시드는 (α)-글루탐산, γ-글루탐산, 상호전환 (α)-글루탐산/γ-글루탐산 쌍, 또는 이들의 조합물로 탈아마이드화된 탈아마이드화된 글루타민(들)을 더 포함한다.
소정의 실시형태에서, 신규한 단리된 AAVrh.90 캡시드가 제공된다. AAVrh.90 캡시드를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1에서 제공되고 인코딩된 아미노산 서열은 서열번호 2에서 제공된다. AAVrh.90(서열번호 2)의 vp1, vp2 및 vp3 중 적어도 하나를 포함하는 rAAV가 본 명세서에서 제공된다. 또한 AAVrh.90(서열번호 1)의 vp1, vp2 및 vp3 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 AAV 캡시드를 포함하는 rAAV가 본 명세서에서 제공된다. 소정의 실시형태에서, vp1, vp2 및/또는 vp3은 AAVrh.90(서열번호 2)의 전장 캡시드 단백질이다. 다른 실시형태에서, vp1, vp2 및/또는 vp3은 N-말단 및/또는 C-말단 절단부(예컨대, 약 1 내지 약 10개 아미노산의 절단부(들))를 가진다.
추가의 양상에서, (A) (1) 서열번호 2의 1 내지 738번의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로부터의 발현에 의해 생성되는 AAVrh.90 vp1 단백질, 서열번호 2로부터 생성되는 vp1 단백질, 또는 서열번호 2의 1 내지 738번의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1과 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성되는 vp1 단백질로부터 선택되는 AAVrh.90 vp1 단백질의 이종 집단, 서열번호 2의 적어도 약 138 내지 738번 아미노산의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로부터의 발현에 의해 생성되는 vp2 단백질, 서열번호 2의 적어도 412 내지 2214번 뉴클레오타이드를 포함하는 서열로부터 생성되는 vp2 단백질, 또는 서열번호 2의 적어도 약 138 내지 738번 아미노산의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1의 적어도 412 내지 2214번 뉴클레오타이드와 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성되는 vp2 단백질로부터 선택되는 AAVrh.90 vp2 단백질의 이종 집단, 서열번호 2의 적어도 약 204 내지 738번 아미노산의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로부터의 발현에 의해 생성되는 vp3 단백질, 서열번호 2의 적어도 610 내지 2214번 뉴클레오타이드를 포함하는 서열로부터 생성되는 vp3 단백질, 또는 서열번호 2의 적어도 약 204 내지 738번 아미노산의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1의 적어도 610 내지 2214번 뉴클레오타이드와 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성되는 vp3 단백질로부터 선택되는 AAVrh.90 vp3의 이종 집단을 포함하는 AAVrh.90 캡시드 단백질; 및/또는 (2) 서열번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열의 산물인 vp1 단백질의 이종 집단, 서열번호 2의 적어도 약 138 내지 738번 아미노산의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열의 산물인 vp2 단백질의 이종 집단, 및 서열번호 2의 적어도 204 내지 738번 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열의 산물인 vp3 단백질의 이종 집단(여기서 vp1, vp2 및 vp3 단백질은 서열번호 2의 아스파라긴-글리신 쌍에서 적어도 2개의 고도로 탈아마이드화된 아스파라긴(N)을 포함하고 선택적으로 다른 탈아마이드화된 아미노산을 포함하는 하위집단을 더 포함하는 아미노산 변형이 있는 하위집단을 포함하고, 탈아마이드화는 아미노산 변화를 초래함) 중 하나 이상을 포함하는 AAVrh.90 캡시드; 및 (B) AAVrh.90 캡시드 내 벡터 게놈으로서, AAV 반전 말단 반복부 서열을 포함하는 핵산 분자 및 숙주 세포에서 산물의 발현을 지시하는 서열에 작동 가능하게 연결된 산물을 인코딩하는 비-AAV 핵산 서열을 포함하는 상기 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)가 제공된다.
소정의 실시형태에서, AAVrh.90 vp1, vp2 및 vp3 단백질은 서열번호 2의 아스파라긴-글리신 쌍에서 적어도 2개의 고도로 탈아마이드화된 아스파라긴(N)을 포함하고 선택적으로 다른 탈아마이드화된 아미노산을 포함하는 하위집단을 더 포함하는 아미노산 변형이 있는 하위집단을 포함하고, 여기서 탈아마이드화는 아미노산 변화를 초래한다. 서열번호 2의 수에 비해, N-G 쌍 N57, ~N263, ~N385 및/또는 ~N514에서 높은 수준의 탈아마이드화가 관찰된다. 다른 잔기에서는 하기 표 및 도 12B에 나타낸 바와 같이 탈아마이드화가 관찰되었다. 소정의 실시형태에서, AAVrh.90은 탈아마이드화된 다른 잔기(예컨대, ~N305, ~N499 및/또는 ~N599, 전형적으로 20% 미만)를 가질 수 있고/있거나 인산화(예컨대, 존재하는 경우, 약 2 내지 약 30%, 또는 약 2 내지 약 20%, 또는 약 2 내지 약 10%의 범위)(예컨대, S149에서), 또는 산화(예컨대, ~W23, ~M204, ~M212, W248, W282, M405, M473, W480, W505, M526, ~N544, M561 및/또는 ~M607 중 하나 이상에서)를 포함하여 다른 변형을 가질 수 있다. 선택적으로 W는 카이뉴레닌으로 산화될 수 있다.
Figure pct00004
소정의 실시형태에서, AAVrh.90 캡시드는 트립신 효소를 이용한 질량 분석법을 사용하여 결정된 바와 같이, 상기 표에서 확인된 위치 중 하나 이상에서 제공된 범위로 변형된다. 소정의 실시형태에서, 위치 중 하나 이상, 또는 N 다음의 글리신은 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된다. 잔기 번호는 본 명세서에서 제공된 AAVrh.90 서열을 기반으로 한다. 서열번호 2를 참조한다.
소정의 실시형태에서, AAVrh.90 캡시드는, 서열번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열의 산물인 vp1 단백질의 이종 집단, 서열번호 2의 적어도 약 138 내지 738번 아미노산의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열의 산물인 vp2 단백질의 이종 집단, 및 서열번호 2의 적어도 204 내지 738번 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열의 산물인 vp3 단백질의 이종 집단을 포함한다.
소정의 실시형태에서, AAVrh.90 vp1 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1에서 제공된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1과 70% 내지 99.9% 동일성의 핵산 서열이 AAVrh.90 캡시드 단백질을 발현하도록 선택될 수 있다. 다른 소정의 실시형태에서, 핵산 서열은 서열번호 1과 적어도 약 75% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 내지 99.9% 동일하다. 그러나, 서열번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 다른 핵산 서열은 rAAV 캡시드를 생성하는 데 사용하기 위해 선택될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열, 또는 서열번호 2를 인코딩하는 서열번호 1과 적어도 70% 내지 99.9% 동일, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 소정의 실시형태에서, 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열, 또는 서열번호 2의 vp2 캡시드 단백질(약 aa 138 내지 738번)을 인코딩하는 서열번호 1의 약 nt 412 내지 약 nt 2214번과 적어도 70% 내지 99.9%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 소정의 실시형태에서, 핵산 서열은 서열번호 1의 약 nt 610 내지 약 nt 2214번 또는 서열번호 2의 vp3 캡시드 단백질(약 aa 204 내지 738번)을 인코딩하는 서열번호 1의 약 nt 610 내지 약 nt 2214번과 적어도 70% 내지 99.9%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 AAVrh.90 캡시드 서열(서열번호 2) 또는 돌연변이체 AAVrh.90을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 잔기는 탈아마이드화, 또는 본 명세서에서 확인된 다른 변형을 감소시키기 위해 변경되었다. 이와 같은 핵산 서열은 돌연변이체 AAVrh.90 캡시드의 생산에 사용될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 서열번호 1의 서열, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형(예컨대, 탈아마이드화된 아미노산)을 가진 서열번호 2의 vp1 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 갖는 핵산 분자가 본 명세서에서 제공된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 핵산 서열을 갖는 플라스미드가 제공된다.
용어 "실질적인 상동성" 또는 "실질적인 유사성"은 핵산 또는 이의 단편을 지칭하는 경우, 또 다른 핵산(또는 이의 상보적 가닥)과 적절한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실이 있도록 최적 상태로 정렬될 때, 정렬된 서열의 적어도 약 95 내지 99%에 뉴클레오타이드 서열 동일성이 존재한다는 것을 나타낸다. 바람직하게는, 상동성은 전장 서열, 또는 이의 오픈 리딩 프레임, 또는 길이가 적어도 15개의 뉴클레오타이드인 또 다른 적합한 단편에 걸친 것이다. 적합한 단편의 예가 본 명세서에 기재되어 있다.
핵산 서열과 관련하여 용어 "동일성 백분율(%)", "서열 동일성", "서열 동일성 백분율", 또는 "동일한 백분율"은 관련성을 위해서 정렬되는 경우 동일한 2개의 서열에서의 잔기를 지칭한다. 서열 동일성 비교의 길이는 게놈의 전장, 유전자 코딩 서열의 전장, 또는 적어도 약 500 내지 5000개 뉴클레오타이드의 단편에 걸친 것일 수 있으며, 이것이 바람직하다. 그러나, 예를 들어, 적어도 약 9개의 뉴클레오타이드, 보통 적어도 약 20 내지 24개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 28 내지 32개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 36개 이상의 뉴클레오타이드의 더 작은 단편 간의 동일성이 또한 바람직할 수 있다.
동일성 백분율은 단백질의 전장, 폴리펩타이드, 약 32개의 아미노산, 약 330개의 아미노산, 또는 이들의 펩타이드 단편 또는 상응하는 핵산 서열 코딩 서열에 걸친 아미노산 서열에 대하여 용이하게 결정될 수 있다. 적합한 아미노산 단편은 적어도 약 8개의 아미노산 길이일 수 있고, 최대 약 700개의 아미노산일 수 있다. 일반적으로, 2개의 상이한 서열 사이의 "동일성", "상동성", 또는 "유사성"을 지칭하는 경우, "동일성", "상동성" 또는 "유사성"은 "정렬된" 서열을 참조로 결정된다. "정렬된" 서열 또는 "정렬"은, 종종 참조 서열과 비교하여 누락되거나 추가적인 염기 또는 아미노산에 대한 수정을 포함하는, 다수의 핵산 서열 또는 단백질(아미노산) 서열을 지칭한다.
동일성은 서열의 정렬을 준비함으로써 그리고 당업계에 공지되어 있거나 상업적으로 입수 가능한 다양한 알고리즘 및/또는 컴퓨터 프로그램의 사용을 통해 결정될 수 있다[예를 들어, BLAST, ExPASy; ClustalO; FASTA; 예를 들어, Needleman-Wunsch 알고리즘, Smith-Waterman 알고리즘을 사용함]. 정렬은 다양한 공공 또는 상업적으로 입수 가능한 다중 서열 정렬 프로그램 중 임의의 것을 사용하여 수행된다. 서열 정렬 프로그램, 예를 들어 "Clustal Omega", "Clustal X", "MAP", "PIMA", "MSA", "BLOCKMAKER", "MEME", 및 "Match-Box" 프로그램이 아미노산 서열에 이용 가능하다. 일반적으로, 이들 프로그램 중 임의의 것은 디폴트 설정으로 사용되지만, 당업자는 필요에 따라 이러한 설정을 변경할 수 있다. 대안적으로, 당업자는 적어도 참조된 알고리즘 및 프로그램에 의해 제공되는 것과 같은 동일성 또는 정렬의 수준을 제공하는 또 다른 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27(13):2682-2690 (1999)]을 참조한다.
다중 서열 정렬 프로그램은 또한 핵산 서열에 대해 이용 가능하다. 이와 같은 프로그램의 예는 "Clustal Omega", "Clustal W", "CAP Sequence Assembly", "BLAST", "MAP" 및 "MEME"를 포함하며, 이들은 인터넷 웹 서버를 통해 접근 가능하다. 이와 같은 프로그램에 대한 다른 공급원은 당업자에게 공지되어 있다. 대안적으로, Vector NTI 유틸리티가 또한 사용된다. 또한 상기 기재된 프로그램에 포함된 것을 포함하여, 뉴클레오타이드 서열 동일성을 측정하는 데 사용될 수 있는 당업계에 공지된 다수의 알고리즘이 있다. 또 다른 예로서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 GCG 버전 6.1의 프로그램인 Fasta™을 사용하여 비교될 수 있다. Fasta™은 질의 서열과 검색 서열 사이의 최상의 중복 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다. 예를 들어, 핵산 서열 사이의 서열 동일성 백분율은 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 GCG 버전 6.1에서 제공되는 바와 같이 디폴트 파라미터(단어 크기 6, 득점 매트릭스에 대한 NOPAM 인자)와 함께 Fasta™를 사용하여 결정될 수 있다.
B. rAAV 벡터 및 조성물
또 다른 양상에서, 이종 유전자 또는 다른 핵산 서열을 표적 세포에 전달하는 데 유용한 바이러스 벡터의 생성을 위해, 단편을 포함하여 본 명세서에 기재된 AAV 캡시드 서열을 이용하는 분자가 본 명세서에서 제공된다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 유용한 벡터는, 최소한, AAVrh.90 캡시드를 인코딩하는 서열, 또는 이의 단편을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 유용한 벡터는, 최소한, AAVrh.90 rep 단백질을 인코딩하는 서열, 또는 이의 단편을 포함한다. 선택적으로, 이와 같은 벡터는 AAV cap 및 rep 단백질을 둘 다 포함할 수 있다. AAV rep 및 cap이 둘 다 제공되는 벡터에서, AAV rep 및 AAV cap 서열은 둘 다 하나의 혈청형 기원, 예를 들어, 모두 AAVrh.90 기원을 가질 수 있다. 대안적으로, rep 서열이 cap 서열을 제공하는 야생형 AAV와 상이한 AAV 유래인 벡터가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, rep 및 cap 서열은 별개의 공급원(예컨대, 별개의 벡터, 또는 숙주 세포 및 벡터)으로부터 발현된다. 또 다른 실형태에서, 이러한 rep 서열은 상이한 AAV 혈청형의 cap 서열에 프레임 내에서 융합되어 키메라 AAV 벡터, 예컨대, 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 특허 제7,282,199호에 기재된 AAV2/8을 형성한다. 선택적으로, 벡터는 AAV 5' ITR 및 AAV 3' ITR이 측접한 선택된 이식유전자를 포함하는 미니유전자를 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, AAV는 자가-상보성 AAV(sc-AAV)이다(본 명세서에 참조에 의해 원용되는 US 제2012/0141422호 참조). 자가-상보성 벡터는 DNA 합성 또는 다중 벡터 게놈 간의 염기쌍 형성에 대한 필요 없이 dsDNA로 접힐 수 있는 반전 반복 게놈을 패키징한다. scAAV는 발현 이전에 단일-가닥 DNA(ssDNA)를 이중-가닥 DNA(dsDNA)로 전환할 필요가 없기 때문에, 보다 효율적인 벡터이다. 그러나, 이러한 효율성에 대한 절충점은 벡터의 코딩 능력의 절반이 손실된다는 것이다. scAAV는 작은 단백질-코딩 유전자(최대 대략 55 kd) 및 현재 이용 가능한 임의의 RNA-기반 요법에 유용하다.
하나의 AAV의 캡시드가 이종 캡시드 단백질로 대체된 위형 벡터가 본 명세서에서 유용하다. 예시적인 목적으로, AAV2 ITR과 함께 본 명세서에 기재된 바와 같은 AAVrh.90 캡시드를 이용하는 AAV 벡터가 하기 기재된 실시예에서 사용된다. 위에서 인용한 문헌[Mussolino et al]을 참조한다. 달리 명시되지 않는 한, AAV ITR, 및 본 명세서에 기재된 다른 선택된 AAV 성분은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 다른 공지되고 공지되지 않은 AAV 혈청형을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 AAV 혈청형 중에서 개별적으로 선택될 수 있다. 바람직한 일 실시형태에서, AAV 혈청형 2의 ITR이 사용된다. 그러나, 다른 적합한 혈청형 유래의 ITR이 선택될 수 있다. 이러한 ITR 또는 다른 AAV 성분은 당업자에게 이용 가능한 기법을 사용하여 AAV 혈청형으로부터 용이하게 단리될 수 있다. 이와 같은 AAV는 학문적, 상업적, 또는 공공 출처(예컨대, 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(American Type Culture Collection), 미국 버지니아주 매너서스 소재)로부터 단리되거나 얻을 수 있다. 대안적으로, AAV 서열은, 예를 들어, GenBank, PubMed 등과 같은 문헌 또는 데이터베이스에서 이용 가능한 것과 같은 공개된 서열을 참조하여 합성 또는 다른 적합한 수단을 통해 얻을 수 있다.
본 명세서에 기재된 rAAV는 또한 벡터 게놈을 포함한다. 벡터 게놈은 최소한 하기 기재된 바와 같은 비-AAV 또는 이종 핵산 서열(이식유전자), 및 이의 조절 서열, 및 5' 및 3' AAV 반전 말단 반복부(ITR)로 구성된다. 캡시드 단백질 내로 패키징되어 선택된 표적 세포에 전달되는 것은 이러한 미니유전자이다.
이식유전자는 관심이 있는 폴리펩타이드, 단백질, 또는 다른 산물을 인코딩하는 이식유전자를 측접하는 벡터 서열에 이종성인 핵산 서열이다. 핵산 코딩 서열은 표적 세포에서 이식유전자 전사, 번역, 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 조절 성분에 작동적으로 연결된다. 이종 핵산 서열(이식유전자)은 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. AAV는 하나 이상의 이식유전자를 포함할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 에리스로포이에틴(EPO)을 인코딩하는 서열을 포함하는 이식유전자를 포함하는 rAAVrh.90 벡터가 본 명세서에서 제공된다. 소정의 실시형태에서, 이식유전자는 개 또는 고양이 EPO 유전자를 인코딩한다. 이와 같은 재조합 벡터는, 예를 들어 순환 적혈구의 양의 감소를 특징으로 하는 대상체에서 만성 신장 질환 및 다른 병태를 치료하기 위한 요법에서 사용하기에 적합하다.
소정의 실시형태에서, 항-신경 성장 인자(NGF) 항체를 인코딩하는 서열을 포함하는 이식유전자를 포함하는 rAAVrh.90 벡터가 본 명세서에서 제공된다. 소정의 실시형태에서, 이식유전자는 개 또는 고양이 항-NGF 항체를 인코딩한다. 이와 같은 재조합 벡터는, 예를 들어 대상체에서 골관절염 통증을 치료하기 위한 요법에서 사용하기에 적합하다.
소정의 실시형태에서, 항-신경 성장 인자(NGF) 항체를 인코딩하는 서열을 포함하는 이식유전자를 포함하는 rAAVrh.90 벡터가 본 명세서에서 제공된다. 소정의 실시형태에서, 이식유전자는 개 또는 고양이 항-NGF 항체를 인코딩한다. 이와 같은 재조합 벡터는, 예를 들어 대상체에서 골관절염 통증을 치료하기 위한 요법에서 사용하기에 적합하다.
소정의 실시형태에서, 글루카곤-유사 펩타이드 1(GLP-1)을 인코딩하는 서열을 포함하는 이식유전자를 포함하는 rAAVrh.90 벡터가 본 명세서에서 제공된다. 소정의 실시형태에서, 이식유전자는 개 또는 고양이 GLP-1을 인코딩한다. 이와 같은 재조합 벡터는, 예를 들어 대상체에서 II형 당뇨병을 치료하기 위한 요법에서 사용하기에 적합하다.
소정의 실시형태에서, 글루카곤-유사 펩타이드 1(GLP-1)을 인코딩하는 서열을 포함하는 이식유전자를 포함하는 rAAVrh.90 벡터가 본 명세서에서 제공된다. 소정의 실시형태에서, 이식유전자는 개 또는 고양이 GLP-1을 인코딩한다. 이와 같은 재조합 벡터는, 예를 들어 대상체에서 II형 당뇨병을 치료하기 위한 요법에서 사용하기에 적합하다.
소정의 실시형태에서, 인슐린을 인코딩하는 서열을 포함하는 이식유전자를 포함하는 rAAVrh.90 벡터가 본 명세서에서 제공된다. 소정의 실시형태에서, 이식유전자는 개 또는 고양이 인슐린을 인코딩한다. 이와 같은 재조합 벡터는, 예를 들어 대상체에서 I형 당뇨병 또는 II형 당뇨병을 치료하기 위한 요법에서 사용하기에 적합하다.
소정의 실시형태에서, IgE, IL-32, 또는 예를 들어 항체 및 수용체-IgG 융합 단백질을 비롯한, IL-4/IL-13 수용체의 인터류킨-4 수용체 알파(IL-4Rα) 서브유닛에 대한 길항제를 인코딩하는 서열을 포함하는 이식유전자를 포함하는 rAAVrh.90 벡터가 본 명세서에서 제공된다. 소정의 실시형태에서, 이식유전자는 개 또는 고양이 IgE, IL-32, 또는 IL-4Rα 서브유닛에 대한 길항제를 인코딩한다. 이와 같은 재조합 벡터는, 예를 들어 대상체에서 아토피 피부염을 치료하기 위한 요법에서 사용하기에 적합하다.
이식유전자 서열의 조성은 생성된 벡터가 사용될 용도에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 이식유전자 서열의 한 가지 유형은, 발현 시 검출 가능한 신호를 생성하는 리포터 서열을 포함한다. 이와 같은 리포터 서열은, β-락타마제, β-갈락토시다제(LacZ), 알칼리 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질(GFP), 강화 GFP(EGFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 루시퍼라제, 예를 들어 CD2, CD4, CD8, 인플루엔자 혈구응집소 단백질, 및 당업계에 널리 공지된 다른 것을 포함하는 막 결합 단백질(이에 대한 고친화성 항체가 존재하거나 통상적인 수단에 의해 생성될 수 있음), 및 특히 혈구응집소 또는 Myc 유래의 항원 tag 도메인에 적절하게 융합된 막 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
이들 코딩 서열은 이의 발현을 구동시키는 조절 요소와 연관되어 있을 때 효소, 방사선, 비색, 형광 또는 다른 분광 사진 분석, 형광 활성화 세포 분류 분석 및 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사면역측정법(RIA) 및 면역조직화학을 포함하는 면역학적 분석을 포함하는 통상적인 수단에 의해 검출 가능한 신호를 제공한다. 예를 들어, 마커 서열이 LacZ 유전자인 경우, 신호를 보유하는 벡터의 존재는 베타-갈락토시다제 활성에 대한 분석, 즉, 검정에 의해 검출된다. 이식유전자가 녹색 형광 단백질 또는 루시퍼라제인 경우, 신호를 보유하는 벡터는 광도계에서 색상 또는 광 생성에 의해 시각적으로 측정될 수 있다.
그러나, 바람직하게는, 이식유전자는 단백질, 펩타이드, RNA, 효소, 우성 음성 돌연변이체, 또는 촉매 RNA와 같은 생물학 및 의학에서 유용한 산물을 인코딩하는 비-마커 서열이다. 바람직한 RNA 분자는 tRNA, dsRNA, 리보솜 RNA, 촉매 RNA, siRNA, 작은 헤어핀 RNA, 트랜스-스플라이싱 RNA, 및 안티센스 RNA를 포함한다. 유용한 RNA 서열의 일 예는 처리된 동물에서 표적화된 핵산 서열의 발현을 저해하거나 소멸시키는 서열이다. 전형적으로, 적합한 표적 서열은 종양학적 표적 및 바이러스 질환을 포함한다. 이와 같은 표적의 예를 들어, 면역원과 관련된 섹션에서 하기 식별된 종양학적 표적 및 바이러스를 참조한다.
이식유전자는 정상 유전자가 정상 수준 보다 적게 발현되는 결함 또는 기능성 유전자 산물이 발현되지 않는 결함을 포함할 수 있는 유전자 결함을 교정하거나 개선시키는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 이식유전자는 세포 유형 또는 숙주에서 천연적으로 발현되지 않는 산물을 세포에 제공할 수 있다. 바람직한 이식유전자 서열의 유형은 숙주 세포에서 발현되는 치료용 단백질 또는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 본 발명은 다수의 이식유전자를 사용하는 것을 더 포함한다. 특정 상황에서, 상이한 이식유전자는 단백질의 각각의 서브유닛을 인코딩하거나 상이한 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 데 사용될 수 있다. 이는, 단백질 서브유닛을 인코딩하는 DNA의 크기가 큰 경우, 예를 들어 면역글로불린, 혈소판-유래 성장 인자, 또는 디스트로핀 단백질의 경우에 바람직하다. 세포가 다중-서브유닛 단백질을 생성하기 위해, 세포는 각각의 상이한 서브유닛을 포함하는 재조합 바이러스로 감염된다. 대안적으로, 단백질의 상이한 서브유닛은 동일한 이식유전자에 의해 인코딩될 수 있다. 이 경우에, 단일 이식유전자는 각각의 서브유닛을 인코딩하는 DNA를 포함하고, 이 때 각각의 서브유닛에 대한 DNA는 내부 리보자임 유입 부위(internal ribozyme entry site: IRES)에 의해 분리된다. 이는, 각각의 서브유닛을 인코딩하는 DNA의 크기가 작은 경우, 예를 들어 서브유닛을 인코딩하는 DNA의 총 크기 및 IRES가 5 킬로베이스 미만인 경우에 바람직하다. IRES에 대한 대안으로서, DNA는 번역 후 사건에서 자가 절단하는 2A 펩타이드를 인코딩하는 서열에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 문헌[M.L. Donnelly, et al, J. Gen. Virol., 78(Pt 1):13-21 (Jan 1997); Furler, S., et al, Gene Ther., 8(11):864-873 (June 2001); Klump H., et al., Gene Ther., 8(10):811-817 (May 2001)]을 참조한다. 이러한 2A 펩타이드는 IRES보다 상당히 더 작아서, 공간이 제한 인자인 경우에 사용하기에 매우 적합하게 한다. 보다 종종, 이식유전자가 크거나, 다수의 서브유닛으로 이루어지거나, 2개의 이식유전자가 동시 전달되는 경우, 원하는 이식유전자(들) 또는 서브유닛을 보유하는 rAAV는 동시 투여되어 이를 생체내에서 콘카타머화(concatamerize)되는 것을 가능하게 하여 단일 벡터 게놈을 형성한다. 이와 같은 실시형태에서, 제1 AAV는 단일 이식유전자를 발현하는 발현 카세트를 보유할 수 있고 제2 AAV는 숙주 세포에서 공동 발현을 위해 상이한 이식유전자를 발현하는 발현 카세트를 보유할 수 있다. 그러나, 선택된 이식유전자는 임의의 생물학적 활성 산물 또는 다른 산물, 예를 들어 연구에 바람직한 산물을 인코딩할 수 있다.
적합한 이식유전자 또는 유전자 산물의 예는 가족성 고콜레스테롤혈증, 근이영양증, 낭포성 섬유증, 및 희귀 질환과 연관된 것을 포함한다. 이와 같은 희귀 질환의 예는 특히 척수성 근위축(SMA), 헌팅턴병, 레트 증후군(예컨대, 메틸-CpG-결합 단백질 2(MeCP2); UniProtKB - P51608), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 듀센형 근이영양증, 프리드리히 운동실조증(예컨대, 프라탁신), 척수소뇌 운동실조증 2형(SCA2)/ALS와 연관된 ATXN2; ALS와 연관된 TDP-43, 프로그래뉼린(PRGN)(전두측두엽 치매(FTD), 진행형 비유창성 실어증(PNFA) 및 의미 치매를 포함하는, 비-알츠하이머 뇌 변성과 연관됨)을 포함할 수 있다. 예를 들어, www.orpha.net/consor/cgi-bin/Disease_Search_List.php; rarediseases.info.nih.gov/diseases를 참조한다.
이식유전자에 의해 인코딩되는 유용한 치료 산물은, 인슐린, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩타이드 1(GLP-1), 성장 호르몬(GH), 부갑상선 호르몬(PTH), 성장 호르몬 방출 인자(GRF), 여포 자극 호르몬(FSH), 황체 형성 호르몬(LH), 인간 융모성 생식선 자극 호르몬(hCG), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 안지오포이에틴, 안지오스타틴, 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF), 에리스로포이에틴(EPO), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 염기성 섬유아세포 성자 인자(bFGF), 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF), 표피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자 α(TGFα), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 형질전환 성장 인자 β 슈퍼패밀리 중 어느 하나(인슐린 성장 인자 I 및 II(IGF-I 및 IGF-II), TGF β, 액티빈, 인히빈, 또는 골형성 단백질(BMP) BMP 1 내지 15 중 임의의 것을 포함함), 헤레귤린/뉴레귤린/ARIA/성장 인자의 neu 분화 인자(NDF) 패밀리 중 임의의 하나, 신경 성장 인자(NGF), 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀 NT-3 및 NT-4/5, 섬모 신경영양 인자(CNTF), 신경 아교 세포계 유래 신경영양 인자(GDNF), 뉴투린, 아그린, 세마포린/콜랩신의 패밀리 중 임의의 하나, 네트린-1 및 네트린-2, 간세포 성장 인자(HGF), 에프린, 노긴, 음향 고슴도치 및 타이로신 하이드록실라제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 호르몬 및 성장 및 분화 인자를 포함한다.
다른 유용한 이식유전자 산물은, 트롬보포이에틴(TPO), 인터류킨(IL) IL-1 내지 IL-25(IL-2, IL-4, IL-12, 및 IL-18을 포함함), 단핵구 화학주성 단백질, 백혈병 저해 인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, Fas 리간드, 종양 괴사 인자 α 및 β, 인터페론 α, β 및 γ, 줄기 세포 인자, flk-2/flt3 리간드와 같은 사이토카인 및 림포카인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 면역계를 조절하는 단백질을 포함한다. 면역계에 의해 생성되는 유전자 산물도 또한 본 발명에 유용하다. 이는 면역글로불린 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 키메라 면역글로불린, 인간화 항체, 단일 사슬 항체, T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 단일 사슬 T 세포 수용체, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자뿐만 아니라, 조작된 면역글로불린 및 MHC 분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 유용한 유전자 산물은 또한 보체 조절 단백질, 예컨대, 보체 조절 단백질, 막 보조인자 단백질(MCP), 붕괴 촉진 인자(DAF), CR1, CF2 및 CD59를 포함한다.
또 다른 유용한 유전자 산물은 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 림포카인, 조절 단백질 및 면역계 단백질에 대한 수용체 중 임의의 하나를 포함한다. 본 발명은 저밀도 리포단백질(LDL) 수용체, 고밀도 리포단백질(HDL) 수용체, 초저밀도 리포단백질(VLDL) 수용체, 및 스캐빈저 수용체를 포함하여, 콜레스테롤 조절을 위한 수용체를 포함한다. 본 발명은 또한 글루코코르티코이드 수용체 및 에스트로겐 수용체, 비타민 D 수용체 및 다른 핵 수용체를 포함하는 스테로이드 호르몬 수용체 슈퍼패밀리의 구성원과 같은 유전자 산물을 포함한다. 추가적으로, 유용한 유전자 산물은 jun, fos, max, mad, 혈청 반응 인자(SRF), AP-1, AP2, myb, MyoD 및 미오게닌, ETS-박스 포함 단백질, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, CCAAT-박스 결합 단백질, 인터페론 조절 인자(IRF-1), 윌름스 종양 단백질, ETS-결합 단백질, STAT, GATA-박스 결합 단백질, 예를 들어, GATA-3, 및 날개 나선 단백질(winged helix protein)의 포크헤드 패밀리와 같은 전사 인자를 포함한다.
다른 유용한 유전자 산물은 카바모일 합성효소 I, 오르니틴 트랜스카바밀라제, 아르기노석시네이느 합성효소, 아르기노석시네이트 리아제, 아르기나제, 푸마릴아세트아세테이트 가수분해효소, 페닐알라닌 하이드록실라제, 알파-1 항트립신, 글루코스-6-포스파타제, 포르포빌리노겐 데아미나제, 인자 VIII, 인자 IX, 시스타티온 베타-신타제, 분지쇄 케토산 데카복실라제, 알부민, 아이소발레릴-coA 데하이드로게나제, 프로피오닐 CoA 카복실라제, 메틸 말로닐 CoA 뮤타제, 글루타릴 CoA 데하이드로게나제, 인슐린, 베타-글루코시다제, 피루베이트 카복실레이트, 간 포스포릴라제, 포스포릴라제 키나제, 글리신 데카복실라제, H-단백질, T-단백질, 낭포성 섬유증 막관통 조절인자(CFTR) 서열, 및 디스트로핀 서열 또는 이들의 기능성 단편을 포함한다. 또 다른 유용한 유전자 산물은 효소 대체 요법에 유용할 수 있는 효소를 포함하며, 이는 효소의 활성 결핍으로 인한 다양한 병태에 유용하다. 예를 들어, 만노스-6-포스페이트를 포함하는 효소는 리소좀 축적 질환에 이용될 수 있다(예컨대, 적합한 유전자는 β-글루쿠로니다제(GUSB)를 인코딩하는 것을 포함함). 또 다른 예에서, 유전자 산물은 유비퀴틴 단백질 리가제 E3A(UBE3A)이다. 또한 유용한 유전자 산물은 UDP 글루쿠로노실트랜스퍼라제 패밀리 1 구성원 A1(UGT1A1)을 포함한다.
다른 유용한 유전자 산물은 삽입, 결실 또는 아미노산 치환을 포함하는 비-자연 발생 아미노산 서열을 갖는 키메라 또는 하이브리드 폴리펩타이드와 같은 비-자연 발생 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 단일-사슬 조작된 면역글로불린은 특정 면역손상 환자에서 유용할 수 있다. 비-자연 발생 유전자 서열의 다른 유형은 표적의 과발현을 감소시키는 데 사용될 수 있는 리보자임과 같은 안티센스 분자 및 촉매 핵산을 포함한다.
유전자 발현의 감소 및/또는 조절은 특히 암 및 건선과 같은 과증식 세포를 특징으로 하는 과증식성 병태의 치료에 바람직하다. 표적 폴리펩타이드는 정상 세포와 비교하여 과증식성 세포에서 독점적으로 또는 더 높은 수준으로 생성되는 폴리펩타이드를 포함한다. 표적 항원은 myb, myc, fyn과 같은 종양 유전자, 및 전좌 유전자 bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk 및 EGRF에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 포함한다. 표적 항원으로서 종양 유전자 산물에 추가적으로, 항암 치료 및 보호 요법을 위한 표적 폴리펩타이드는 B 세포 림프종에 의해 만들어진 항체의 가변 영역 및 T 세포 림프종의 T 세포 수용체의 가변 영역을 포함하며, 이들은 몇몇 실시형태에서 또한 자가면역 질환에 대한 표적 항원으로서 사용된다. 다른 종양-연관 폴리펩타이드는 모노클로널 항체 17-1A에 의해 인식되는 폴리펩타이드 및 폴레이트 결합 폴리펩타이드를 포함하여 종양 세포에서 더 높은 수준으로 발견되는 폴리펩타이드와 같은 표적 폴리펩타이드로서 사용될 수 있다.
다른 적합한 치료용 폴리펩타이드 및 단백질은 자가-지시 항체를 생성하는 세포 및 세포 수용체를 포함하는 자가면역과 연관된 표적에 대한 광범위한 기반 보호 면역 반응을 부여함으로써 자가면역 질환 및 장애를 앓고 있는 개체를 치료하는 데 유용할 수 있는 것을 포함한다. T 세포 매개 자가면역 질환은 류카티스 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 쇼그렌 증후군, 사르코이드증, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 자가면역성 갑상선염, 반응성 관절염, 강직성 척추염, 피부경화증, 다발성근염, 피부근염, 건선, 혈관염, 베게너 육아종증, 크론병 및 궤양성 대장염을 포함한다. 이들 질환 각각은 내인성 항원에 결합하고 자가면역 질환과 연관된 염증 캐스케이드를 개시하는 T 세포 수용체(TCR)를 특징으로 한다.
또 다른 유용한 유전자 산물은 혈우병 B(인자 IX를 포함함) 및 혈우병 A(인자 VIII 및 이의 변이체, 예컨대, B-결실 도메인 및 이종이량체의 경쇄 및 중쇄를 포함함; 미국 특허 제6,200,560호 및 미국 특허 제6,221,349호)를 포함하여, 혈우병의 치료에 사용되는 것을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 미니유전자는 10개 아미노산 신호 서열뿐만 아니라 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리아데닐화 서열을 인코딩하는 인자 VIII 중쇄의 처음 57개 염기쌍을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 미니유전자는 A1 및 A2 도메인뿐만 아니라, B 도메인 N-말단으로부터 5개 아미노산, 및/또는 B 도메인 C-말단의 85개 아미노산뿐만 아니라, A3, C1 및 C2 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 인자 VIII 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산은 B 도메인의 14개 아미노산을 코딩하는 42개 핵산에 의해 분리된 단일 미니유전자로 제공된다[미국 특허 제6,200,560호].
rAAV를 통해 전달될 수 있는 추가의 예시적인 유전자는, 글리코겐 축적 질환 또는 결핍 유형 1A(GSD1)와 연관된 글루코스-6-포스포타제, PEPCK 결핍과 연관된 포스포에놀피루베이트-카복시키나제(PEPCK); 발작 및 심각한 신경발달 장애와 연관된 세린/트레오닌 키나제 9(STK9)로도 공지된 사이클린-의존성 키나제-유사 5(CDKL5); 갈락토스혈증과 연관된 갈락토스-1-포스페이트 우리딜 트랜스퍼라제; 페닐케톤뇨증(PKU)과 연관된 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH); 단풍당뇨증과 연관된 BCKDH, BCKDH-E2, BAKDH-E1a, 및 BAKDH-E1b를 포함하여, 하이드록시산 옥시다제 1(GO/HAO1) 및 AGXT, 분지쇄 알파-케토산 데하이드로게나제를 포함하는 원발성 옥살산뇨증 1형과 연관된 유전자 산물; 타이로신혈증 1형과 연관된 푸마릴아세토아세테이트 가수분해효소; 메틸말론산혈증과 연관된 메틸말로닐-CoA 뮤타제; 중쇄 아세틸 CoA 결핍과 연관된 중쇄 아실 CoA 데하이드로게나제; 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍과 연관된 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC); 시트룰린혈증과 연관된 아르기니노숙신산 합성효소(ASS1); 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LCAT) 결핍; 아메틸말론산혈증(MMA); 니만피크병 유형 C1과 연관된 NPC1; 프로피온산혈증(PA); 트랜스타이레틴(TTR)-관련 유전성 아밀로이드증과 연관된 TTR; 가족성 고콜레스테롤혈증(FH)과 연관된 저밀도 리포단백질 수용체(LDLR) 단백질, LDLR 변이체, 예컨대 WO 제2015/164778호에 기재된 것; PCSK9; 치매와 연관된 ApoE 및 ApoC 단백질; 크리글러-나자르병과 연관된 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제; 중증 복합 면역결핍병과 연관된 아데노신 데아미나제; 통풍 레슈니안 증후군과 연관된 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제; 바이오티미다제 결핍과 연관된 바이오티미다제; 파브리병과 연관된 알파-갈락토시다제 A(a-Gal A); GM1 강글리오사이드 축적증과 연관된 베타-갈락토시다제(GLB1); 윌슨병과 연관된 ATP7B; 고셔병 2형 및 3형과 연관된 베타-글루코세레브로시다제; 젤웨거 증후군과 연관된 퍼옥시좀 막 단백질 70 kDa; 이염성 백질디스트로피와 연관된 아릴설파타제 A(ARSA), 크라베병과 연관된 갈락토세레브로시다제(GALC) 효소, 폼페병과 연관된 알파-글루코시다제(GAA); 니만피크병 A형과 연관된 스핑고미엘리나제(SMPD1) 유전자; 성인 발병 II형 시트룰린혈증(CTLN2)과 연관된 아르기니노숙시네이트 신타제; 요소 회로 장애와 연관된 카바모일-포스페이트 신타제 1(CPS1); 척수성 근위축과 연관된 생존 운동 뉴런(SMN) 단백질; 파아버 지방육아종증과 연관된 세라미다제; GM2 강글리오사이드 축적증 및 테이-삭스병 및 샌드호프병과 연관된 b-헥소사미니다제; 아스파틸-글루코사민뇨증과 연관된 아스파틸글루코사미니다제; 푸코사이드 축적증과 연관된 α-푸코시다제; 알파-만노사이드 축적증과 연관된 α-만노시다제; 급성 간헐성 포르피린증(AIP)과 연관된 포르포빌리노겐 데아미나제; 알파-1 항트립신 결핍(폐기종)의 치료를 위한 알파-1 항트립신; 지중해빈혈 또는 신부전으로 인한 빈혈의 치료를 위한 에리스로포이에틴; 허혈성 질환의 치료를 위한 혈관 내피 성장 인자, 안지오포이에틴-1, 및 섬유아세포 성장 인자; 예를 들어 죽상동맥경화증, 혈전증, 또는 색전증에서 보이는 바와 같은 폐색된 혈관의 치료를 위한 트롬보모듈린 및 조직 인자 경로 저해제; 파킨스병의 치료를 위한 방향족 아미노산 데카복실라제(AADC), 및 타이로신 하이드록실라제(TH); 울혈성 심부전의 치료를 위한 포스포람반, 근소포체(소포체) 아데노신 트라이포스파타제-2(SERCA2), 및 심장 아데닐릴 사이클라제의 베타 아드레날린 수용체, 이에 대한 안티센스, 또는 이의 돌연변이체 형태; 다양한 암의 치료를 위한 p53과 같은 종양 억제 유전자; 염증 및 면역 장애 및 암의 치료를 위한 다양한 인터류킨 중 하나와 같은 사이토카인; 근이영양증의 치료를 위한 디스트로핀 또는 미니디스트로핀 및 유트로핀 또는 미니유트로핀; 및 당뇨병의 치료를 위한 인슐린 또는 GLP-1을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
대안적으로, 또는 추가적으로, 본 발명의 벡터는 본 발명의 AAV 서열 및 선택된 면역원에 대한 면역 반응을 유도하는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역원은 다양한 바이러스 패밀리로부터 선택될 수 있다. 면역 반응이 바람직한 바람직한 바이러스 패밀리의 예는, 일반 감기 사례의 약 50%를 차지하는 리노바이러스(rhinovirus) 속을 포함하는 피코나바이러스(picornavirus) 과; 폴리오바이러스(poliovirus), 콕사키바이러스(coxsackievirus), 에코바이러스(echovirus), 및 인간 엔테로바이러스(human enterovirus), 예컨대, A형 간염 바이러스를 포함하는 엔테로바이러스(enterovirus) 속; 및 주로 비-인간 동물에서 구제역의 원인이 되는 압소바이러스(apthovirus) 속을 포함한다. 바이러스 중 피코나바이러스 과 내에서, 표적 항원은 VP1, VP2, VP3, VP4, 및 VPG를 포함한다. 또 다른 바이러스 과는, 유행성 위장염의 중요한 원인 물질인 노워크(Norwalk) 그룹의 바이러스를 포함하는 칼시바이러스(calcivirus) 과를 포함한다. 인간 및 비-인간 동물에서 면역 반응을 유도하기 위해 항원을 표적화하는 데 사용하기에 바람직한 또 다른 바이러스 과는 신드비스 바이러스(Sindbis virus), 로스리버 바이러스(RossRiver virus), 및 베네수엘라, 동부 및 서부 말 뇌염(Venezuelan, Eastern & Western Equine encephalitis)을 포함하는 알파바이러스(alphavirus) 속, 및 루벨라 바이러스(Rubella virus)를 포함하는 루비바이러스(rubivirus) 속을 포함하는 토가바이러스(togavirus) 과이다. 플라비비리대(flaviviridae) 과는 뎅기, 황열, 일본 뇌염, 세인트루이스 뇌염 및 진드기 매개 뇌염 바이러스를 포함한다. 다른 표적 항원은 다수의 비-인간 바이러스, 예컨대, 전염성 기관지염 바이러스(가금류), 돼지 전염성 위장 바이러스(돼지), 돼지 혈구응집성 뇌척수염 바이러스(돼지), 고양이 전염성 복막염 바이러스(고양이), 고양이 장 코로나바이러스(고양이), 개 코로나바이러스(개), 및 인간 호흡기 코로나바이러스(일반 감기 및/또는 비-A, B 또는 C형 간염을 유발할 수 있음)를 포함하는 C형 간염 또는 코로나바이러스(coronavirus) 과로부터 생성될 수 있다. 코로나바이러스 과 내에서, 표적 항원은 E1(또한 M 또는 기질 단백질이라고 함), E2(또한 S 또는 스파이크 단백질이라고 함), E3(또한 HE 또는 혈구응집소-엘테로스라고 함) 당단백질(모든 코로나바이러스에 존재하지는 않음), 또는 N(뉴클레오캡시드)를 포함한다. 또 다른 항원은 베시큘로바이러스(vesiculovirus) 속(예컨대, 수포성 구내염 바이러스), 및 리사바이러스(lyssavirus) 속(예컨대, 광견병)을 포함하는 랍도바이러스(rhabdovirus) 과에 대하여 표적화될 수 있다. 랍도바이러스 과 내에서, 적합한 항원은 G 단백질 또는 N 단백질로부터 유래될 수 있다. 출혈열 바이러스, 예컨대, 마르부르그(Marburg) 및 에볼라 바이러스(Ebola virus)를 포함하는 필로비리대(filoviridae) 과는 항원의 적합한 공급원일 수 있다. 파라믹소바이러스(paramyxovirus) 과는 파라인플루엔자(parainfluenza) 바이러스 1형, 파라인플루엔자 바이러스 3형, 소 파라인플루엔자 바이러스 3형, 이하선염 바이러스(멈프스 바이러스), 파라인플루엔자 바이러스 2형, 파라인플루엔자 바이러스 4형, 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus)(닭), 우역, 모르빌리바이러스(morbillivirus)(홍역 및 개홍역을 포함함), 및 폐렴바이러스(pneumovirus)(호흡기 세포융합 바이러스를 포함함)를 포함한다. 인플루엔자 바이러스는 오쏘믹소바이러스(orthomyxovirus) 과 내에서 분류되며, 항원(예컨대, HA 단백질, N1 단백질)의 적합한 공급원이다. 분야바이러스(bunyavirus) 과는 분야바이러스(캘리포니아 뇌염, 라크로스), 플레보바이러스(phlebovirus)(리프트 계곡열), 한타바이러스(hantavirus)(푸레말라(puremala)는 헤마하긴(hemahagin) 열 바이러스임), 나이로바이러스(nairovirus)(나이로비 양 병) 속 및 다양한 비지정 분가바이러스(bungavirus)를 포함한다. 아레나바이러스(arenavirus) 과는 LCM 및 랏사열 바이러스(Lassa fever virus)에 대한 항원의 공급원을 제공한다. 레오바이러스(reovirus) 과는 레오바이러스, 로타바이러스(rotavirus)(소아에서 급성 위장염을 유발함), 오르비바이러스(orbivirus), 및 컬티바이러스(cultivirus)(콜로라도 진드기 열, 레봄보(인간), 말 뇌염, 청설병) 속을 포함한다.
레트로바이러스(retrovirus) 과는 고양이 백혈병 바이러스, HTLVI 및 HTLVII, 렌티바이러스(인간 면역결핍 바이러스(HIV), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 말 전염성 빈혈 바이러스, 및 스푸마바이러스(spumavirinal)를 포함함)와 같은 인간 및 수의학적 질환을 포함하는 온코리바이러스(oncorivirinal) 아과를 포함한다. HIV와 SIV 사이에, 많은 적합한 항원이 기재되어 있으며 용이하게 선택될 수 있다. 적합한 HIV 및 SIV 항원의 예는 gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat 및 Rev 단백질뿐만 아니라 이들의 다양한 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가적으로, 이들 항원에 대한 다양한 변형이 기재된 바 있다. 이러한 목적에 적합한 항원이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 단백질 중에서, gag, pol, Vif, 및 Vpr, Env, Tat 및 Rev를 인코딩하는 서열을 선택할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,972,596호에 기재된 변형된 gag 단백질을 참조한다. 또한, 문헌[D.H. Barouch et al, J. Virol., 75(5):2462-2467 (March 2001), 및 R.R. Amara, et al, Science, 292:69-74 (6 April 2001)]에 기재된 HIV 및 SIV 단백질을 참조한다. 이들 단백질 또는 이들의 서브유닛은 단독으로, 또는 별개의 벡터를 통해 또는 단일 벡터로부터 조합되어 전달될 수 있다.
파포바바이러스(papovavirus) 과는 폴리오마바이러스(polyomavirus) 아과(BKU 및 JCU 바이러스) 및 파필로마바이러스(papillomavirus) 아과(유두종의 악성 진행 또는 암과 연관됨)를 포함한다. 아데노바이러스(adenovirus) 과는 호흡기 질환 및/또는 장염을 유발하는 바이러스(EX, AD7, ARD, O.B.)를 포함한다. 파보바이러스(parvovirus) 과는 고양이 파보바이러스(고양이 장염), 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 개 파보바이러스, 및 돼지 파보바이러스. 헤르페스바이러스(herpesvirus) 과는, 단순바이러스(simplexvirus)(HSVI, HSVII), 바리셀로바이러스(varicellovirus)(위광견병, 수두 대상포진) 속을 포함하는 알파헤르페스비리내(alphaherpesvirinae) 아과, 및 거대세포바이러스(cytomegalovirus) 속(HCMV, 뮤로메갈로바이러스(muromegalovirus))을 포함하는 베타헤르페스비리내(betaherpesvirinae) 아과, 및 림포크립토바이러스(lymphocryptovirus), EBV(버킷 림프종), 전염성 비강기관염, 마레크병 바이러스(Marek's disease virus), 및 라디노바이러스(rhadinovirus) 속을 포함하는 감마헤르페스비리내(gammaherpesvirinae) 아과를 포함한다. 폭스바이러스(poxvirus) 과는 오쏘폭스바이러스(orthopoxvirus)(두창(천연두) 및 백시니아(우두)), 파라폭스바이러스(parapoxvirus), 아비폭스바이러스(avipoxvirus), 카프리폭스바이러스(capripoxvirus), 레포리폭스바이러스(leporipoxvirus), 수이폭스바이러스(suipoxvirus) 속을 포함하는 코르도폭스비리내(chordopoxvirinae) 아과, 및 엔테모폭스비리내(entomopoxvirinae) 아과를 포함한다. 헤파드나바이러스(hepadnavirus) 과는 B형 간염 바이러스를 포함한다. 항원의 적합한 공급원일 수 있는 한 가지 미분류 바이러스는 델타 간염 바이러스이다. 또 다른 바이러스 공급원은 조류 전염성 파브리우스 낭병 바이러스 및 돼지 호흡기 및 생식 증후군 바이러스를 포함할 수 있다. 알파바이러스(alphavirus) 과는 말 동맥염 바이러스 및 다양한 뇌염 바이러스를 포함한다.
본 발명은 또한 인간 및 비-인간 척추동물을 감염시키는 박테리아, 진균, 기생 미생물 또는 다세포 기생충을 포함하는 다른 병원체에 대하여, 또는 암 세포 또는 종양 세포로부터 인간 또는 비-인간 동물을 면역화시키는 데 유용한 면역원을 포함할 수 있다. 박테리아 병원체의 예는 병원성 그람-양성 구균(cocci)을 포함하며, 그람-양성 구균은 폐렴구균(pneumococci); 포도상구균(staphylococci); 및 연쇄구균(streptococci)을 포함한다. 병원성 그람-음성 구균은 수막염균(meningococcus); 임균(gonococcus)을 포함한다. 병원성 장내 그람-음성 간균(bacillus)은 장내세균과(enterobacteriaceae); 슈도모나스(pseudomonas); 아시네토박테리아(acinetobacteria) 및 아이케넬라(eikenella); 멜리오이도시스(melioidosis); 살모넬라(salmonella); 시겔라(shigella); 헤모필루스(haemophilus); 모락셀라(moraxella); 에이치. 듀크레이(H. ducreyi)(연성하감을 유발함); 브루셀라(brucella); 프라니셀라 투라렌시스(Franisella tularensis)(야토병을 유발함); 예르시니아(yersinia)(파스퇴렐라(pasteurella)); 스트렙토바실러스 모닐리포르미스(streptobacillus moniliformis) 및 스피릴룸(spirillum)을 포함하고; 그람-양성 간균은 리스테리아 모노사이토게네스(listeria monocytogenes); 에리시펠로트릭스 루시오패티에(erysipelothrix rhusiopathiae); 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)(디프테리아); 콜레라; 비. 안트라시스(B. anthracis)(탄저병); 도너반증(서혜부 육아종); 및 바르토넬라증을 포함한다. 병원성 혐기성 박테리아에 의해 유발되는 질환은 파상풍; 보툴리눔독소증; 다른 클로스트리디아; 결핵; 한센병; 및 다른 마이코박테리아를 포함한다. 병원성 스피로헤타병은 매독, 트레포네마증; 요오스(yaws), 열대백반피부염 및 지방유행성 매독; 및 렙토스피라증을 포함한다. 더 고등의 병원체 박테리아 및 병원성 진균에 의해 유발되는 다른 감염증은 방선균증; 노카르디아증; 크립토코커스증, 분아균증, 히스토플라스마증 및 콕시디오이데스 진균증; 칸디다증, 아스페르길루스증, 및 모균증; 스포로트릭스증; 파라콕시디오이드 진균증, 페트리엘리디오시스(petriellidiosis), 토룰롭시스증, 진균종 및 색소진균증; 및 피부사상균증을 포함한다. 리케차 감염은 발진티푸스, 록키산 홍반열, Q열, 및 리케치아두를 포함한다. 마이코플라스마 및 클라미디아 감염의 예는 폐렴 마이코플라스마; 성병성 림프 육아종; 앵무새병; 및 주산기 클라미디아 감염을 포함한다. 병원성 진핵생물은 병원성 원생동물 및 연충을 포함하고 이에 의해 생성되는 감염은 아메바증; 말라리아; 리슈만편모충증; 트리파노소마증; 톡소플라스마증; 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii); 트라이칸스(Trichans); 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii); 바베시아증; 지아디아증; 트리키넬라증; 필라리아증; 주혈흡충증; 선충; 흡충(trematodes 또는 fluke); 및 조충(촌충) 감염을 포함한다.
다수의 이들 유기체 및/또는 이에 의해 생성되는 독소는 질병통제센터[Centers for Disease Control(CDC), 보건사회복지부, 미국]에 의해 생물학적 공격에 사용될 가능성이 있는 작용제로 확인되었다. 예를 들어, 이들 생물학적 작용제의 일부는 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)(탄저병), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum) 및 이의 독소(보툴리눔독소증), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)(페스트), 바리올라 메이저(variola major)(천연두), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis)(야토병), 및 바이러스성 출혈열(이들 모두는 현재 카테고리 A 작용제로 분류됨); 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetti)(Q열); 브루셀라 종(브루셀라병), 부르크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei)(마비저), 리시누스 코뮤니스(Ricinus communis) 및 이의 독소(리신 독소), 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 및 이의 독소(엡실론 독소), 스타필로코커스(Staphylococcus) 종 및 이의 독소(엔테로톡신 B)(이들 모두 현재 카테고리 B 작용제로 분류됨); 니판 바이러스(Nipan virus) 및 한타바이러스(이들은 현재 카테고리 C작용제로 분류됨)를 포함한다. 추가적으로, 그렇게 분류되거나 상이하게 분류되는 다른 유기체가 장래에 이와 같은 목적으로 식별되고/거나 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터 및 다른 작제물은 이들 유기체, 바이러스, 이의 독소 또는 다른 부산물로부터 항원을 전달하는 데 유용하며, 이는 이들 생물학적 작용제로 감염 또는 다른 부작용을 예방 및/또는 치료할 것임을 용이하게 이해할 것이다.
T 세포의 가변 영역에 대한 면역원을 전달하기 위한 본 발명의 벡터의 투여는 이러한 T 세포를 제거하기 위한 CTL을 포함하는 면역 반응을 유발한다. 류마티스 관절염(RA)에서, 질환과 관련된 T 세포 수용체(TCR)의 몇 가지 특정 가변 영역이 특성화되었다. 이러한 TCR은 V-3, V-14, V-17 및 Vα-17을 포함한다. 따라서, 이들 폴리펩타이드 중 적어도 하나를 인코딩하는 핵산 서열의 전달은 RA에 관련된 T 세포를 표적화할 면역 반응을 유발할 것이다. 다발성 경화증(MS)에서, 질환과 관련된 TCR의 몇 가지 특정 가변 영역이 특성화되었다. 이러한 TCR은 V-7 및 Vα-10을 포함한다. 따라서, 이들 폴리펩타이드 중 적어도 하나를 인코딩하는 핵산 서열의 전달은 MS에 관련된 T 세포를 표적화할 면역 반응을 유발할 것이다. 피부경화증에서, 질환과 관련된 TCR의 몇 가지 특정 가변 영역이 특성화되었다. 이러한 TCR은 V-6, V-8, V-14 및 Vα-16, Vα-3C, Vα-7, Vα-14, Vα-15, Vαα-16, Vα-28 및 Vα-12를 포함한다. 따라서, 이들 폴리펩타이드 중 적어도 하나를 인코딩하는 핵산 분자의 전달은 피부경화증에 관련된 T 세포를 표적화할 면역 반응을 유발할 것이다.
일 실시형태에서, 이식유전자는 광유전자 요법을 제공하도록 선택된다. 광유전자 요법에서, 인공 광수용체는 나머지 망막 회로에 있는 생존 세포 유형으로 광-활성화 채널 또는 펌프의 유전자 전달에 의해 작제된다. 이는 상당한 양의 광수용체 기능을 상실했지만 신경절 세포 및 시신경에 대한 양극 세포 회로가 손상되지 않은 상태인 환자에게 특히 유용하다. 일 실시형태에서, 이종 핵산 서열(이식유전자)은 옵신이다. 옵신 서열은 인간, 조류 및 박테리아를 포함하는 임의의 적합한 단일- 또는 다세포-유기체로부터 유래될 수 있다. 일 실시형태에서, 옵신은 로돕신, 포톱신, L/M 파장(적색/녹색)-옵신, 또는 단파장(S) 옵신(청색)이다. 또 다른 실시형태에서, 옵신은 채널로돕신 또는 할로로돕신이다.
또 다른 실시형태에서, 이식유전자는 유전자 증대 요법에 사용하기 위해, 즉, 결손되거나 결함이 있는 유전자의 대체 복제물을 제공하기 위해 선택된다. 이러한 실시형태에서, 이식유전자는 필요한 대체 유전자를 제공하기 위해 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, 결손/결함 유전자는 안구 장애와 관련이 있다. 또 다른 실시형태에서, 이식유전자는 NYX, GRM6, TRPM1L 또는 GPR179이고, 안구 장애는 선천성 고정형 야맹증이다. 예를 들어, 문헌[Zeitz et al, Am J Hum Genet. 2013 Jan 10;92(1):67-75. Epub 2012 Dec 13]을 참조하며, 이는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 또 다른 실시형태에서, 이식유전자는 RPGR이다.
또 다른 실시형태에서, 이식유전자는 유전자 억제 요법에 사용하기 위해 선택되며, 즉, 하나 이상의 천연 유전자의 발현은 전사 또는 번역 수준에서 중단되거나 억제된다. 이는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 당업계에 널리 공지된 다른 기법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sun et al, Int J Cancer. 2010 Feb 1;126(3):764-74 및 O'Reilly M, et al. Am J Hum Genet. 2007 Jul;81(1):127-35]을 참조하며, 이들은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 이 실시형태에서, 이식유전자는 침묵시키고자 하는 유전자를 기반으로 하여 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 이식유전자는 하나 초과의 이식유전자를 포함한다. 이는 2개 이상의 이종 서열을 보유하는 단일 벡터를 사용하여, 또는 각각 하나 이상의 이종 서열을 보유하는 2개 이상의 AAV를 사용하여 달성될 수 있다. 일 실시형태에서, AAV는 유전자 억제(또는 녹다운) 및 유전자 증대 공동 요법에 사용된다. 녹다운/증대 공동 요법에서, 관심이 있는 유전자의 결함 복제물은 침묵되고 돌연변이되지 않은 복제물이 공급된다. 일 실시형태에서, 이는 2개 이상의 동시 투여된 벡터를 사용하여 달성된다. 문헌[Millington-Ward et al, Molecular Therapy, April 2011, 19(4):642-649]을 참조하며, 이는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 이식유전자는 원하는 결과를 기반으로 하여 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 이식유전자는 유전자 교정 요법에 사용하기 위해 선택된다. 이는, 예를 들어 외인성 DNA 공여체 기질과 함께 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)-유도 DNA 이중-가닥 절단을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ellis et al, Gene Therapy (epub January 2012) 20:35-42]을 참조하며, 이는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 이식유전자는 원하는 결과를 기반으로 하여 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 캡시드는 미국 특허 가출원 제61/153,470호, 제62/183,825호, 제62/254,225호 및 제62/287,511호에 기재된 CRISPR-Cas 이중 벡터 시스템에 유용하며, 상기 출원 각각은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 캡시드는 또한 호밍 엔도뉴클레아제 또는 다른 메가뉴클레아제의 전달에 유용하다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에서 유용한 이식유전자는 발현시 검출 가능한 신호를 생성하는 리포터 서열을 포함한다. 이와 같은 리포터 서열은, β-락타마제, β-갈락토시다제(LAcZ), 알칼리 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 루시퍼라제, 예를 들어 CD2, CD4, CD8, 인플루엔자 혈구응집소 단백질, 및 당업계에 널리 공지된 다른 것을 포함하는 막 결합 단백질(이에 대한 고친화성 항체가 존재하거나 통상적인 수단에 의해 생성될 수 있음), 및 특히 혈구응집소 또는 Myc 유래의 항원 tag 도메인에 적절하게 융합된 막 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
이들 코딩 서열은 이의 발현을 구동시키는 조절 요소와 연관되어 있을 때 효소, 방사선, 비색, 형광 또는 다른 분광 사진 분석, 형광 활성화 세포 분류 분석 및 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사면역측정법(RIA) 및 면역조직화학을 포함하는 면역학적 분석을 포함하는 통상적인 수단에 의해 검출 가능한 신호를 제공한다. 예를 들어, 마커 서열이 LacZ 유전자인 경우, 신호를 보유하는 벡터의 존재는 베타-갈락토시다제 활성에 대한 분석에 의해 검출된다. 이식유전자가 녹색 형광 단백질 또는 루시퍼라제인 경우, 신호를 보유하는 벡터는 광도계에서 색상 또는 광 생성에 의해 시각적으로 측정될 수 있다.
바람직하게는, 이식유전자는 단백질, 펩타이드, RNA, 효소, 또는 촉매 RNA와 같은 생물학 및 의학에서 유용한 산물을 인코딩한다. 바람직한 RNA 분자는 shRNA, tRNA, dsRNA, 리보솜 RNA, 촉매 RNA, 및 안티센스 RNA를 포함한다. 유용한 RNA 서열의 일 예는 처리된 동물에서 표적화된 핵산 서열의 발현을 소멸시키는 서열이다.
조절 서열은 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 벡터로 형질감염되거나 바이러스로 감염된 세포에서 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 통상적인 제어 요소를 포함한다. "작동 가능하게 연결된" 서열은 관심이 있는 유전자와 인접한 발현 제어 서열 및 관심이 있는 유전자를 제어하기 위해 트랜스로 또는 떨어져서 작용하는 발현 제어 서열을 둘 다 포함한다.
발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 처리 신호, 예컨대, 스플라이싱 및 폴리아데닐화(폴리A) 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, 코작(Kozak) 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 인코딩된 산물의 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 프로모터를 포함하여 다수의 발현 제어 서열이 당업계에 공지되어 있고 이용될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 작제물에 유용한 조절 서열은 또한, 바람직하게는 프로모터/인핸서 서열과 유전자 사이에 위치한 인트론을 포함할 수 있다. 바람직한 한 가지 인트론 서열은 SV-40에서 유래한 것이며, SD-SA로 지칭되는 100 bp 미니-인트론 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체이다. 또 다른 적합한 서열은 우드척 간염 바이러스(woodchuck hepatitis virus) 전사후 요소를 포함한다(예컨대, 문헌[L. Wang and I. Verma, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96:3906-3910] 참조). 폴리A 신호는 SV-40, 인간 및 소를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 많은 적합한 종에서 유래할 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 유용한 rAAV의 또 다른 조절 성분은 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site: IRES)이다. IRES 서열, 또는 다른 적합한 시스템은 단일 유전자 전사체로부터 하나 초과의 폴리펩타이드를 생성하는 데 사용될 수 있다. IRES(또는 다른 적합한 서열)는 하나 초과의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 단백질을 생성하는 데 또는 동일한 세포로부터 또는 동일한 세포 내에서 2가지 상이한 단백질을 발현시키는 데 사용된다. 예시적인 IRES는, 광수용체, RPE 및 신경절 세포에서 이식유전자 발현을 지원하는 폴리오바이러스 내부 리보솜 유입 서열이다. 바람직하게는 IRES는 rAAV 벡터에서 이식유전자에 대해 3'에 위치한다.
일 실시형태에서, AAV는 프로모터(또는 프로모터의 기능성 단편)를 포함한다. rAAV에서 이용될 프로모터의 선택은 원하는 표적 세포에서 선택된 이식유전자를 발현할 수 있는 광범위한 구성적 또는 유도성 프로모터 중에서 이루어질 수 있다. 일 실시형태에서, 표적 세포는 안구 세포이다. 프로모터는 인간을 포함하는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 일 실시형태에서, 프로모터는 "세포 특이적"이다. 용어 "세포-특이적"은 재조합 벡터에 대해 선택된 특정 프로모터가 특정 세포 조직에서 선택된 이식유전자의 발현을 지시할 수 있음을 의미한다. 일 실시형태에서, 프로모터는 근육 세포에서 이식유전자의 발현에 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 프로모터는 폐에서의 발현에 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 프로모터는 간 세포에서 이식유전자의 발현에 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 프로모터는 기도 상피에서 이식유전자의 발현에 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 프로모터는 뉴런에서 이식유전자의 발현에 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 프로모터는 심장에서 이식유전자의 발현에 특이적이다.
발현 카세트는 전형적으로, 예를 들어 선택된 5' ITR 서열 및 면역글로불린 작제물 코딩 서열 사이에 위치한 발현 제어 서열의 일부로서 프로모터 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 간에서의 발현이 바람직하다. 따라서, 일 실시형태에서, 간-특이적 프로모터가 사용된다. 조직 특이적 프로모터, 구성 프로모터, 조절 가능 프로모터[예를 들어, WO 제2011/126808호 및 WO 제2013/04943호 참조], 또는 생리학적 신호에 반응성인 프로모터가 본 명세서에 기재된 벡터에 사용되고 이용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 근육에서의 발현이 바람직하다. 따라서, 일 실시형태에서, 근육-특이적 프로모터가 사용된다. 일 실시형태에서, 프로모터는 MCK 기반 프로모터, 예컨대, dMCK(509 bp) 또는 tMCK(720 bp) 프로모터이다(예컨대, 문헌[Wang et al, Gene Ther. 2008 Nov;15(22):1489-99. doi: 10.1038/gt.2008.104. Epub 2008 Jun 19] 참조, 이는 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 또 다른 유용한 프로모터는 SPc5-12 프로모터이다(문헌[Rasowo et al, European Scientific Journal June 2014 edition vol.10, No.18] 참조, 이는 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 일 실시형태에서, 프로모터는 CMV 프로모터이다. 또 다른 실시형태에서, 프로모터는 TBG 프로모터이다. 또 다른 실시형태에서, CB7 프로모터 또는 CAG 프로모터가 사용된다. CB7은 거대세포바이러스 인핸서 요소가 있는 닭 β-액틴 프로모터이다. 대안적으로, 다른 간-특이적 프로모터가 사용될 수 있다[예를 들어, 문헌[The Liver Specific Gene Promoter Database, Cold Spring Harbor, rulai.schl.edu/LSPD, alpha 1 anti-trypsin (A1AT); human albumin Miyatake et al., J. Virol., 71:5124 32 (1997), humAlb; 및 hepatitis B virus core promoter, Sandig et al., Gene Ther., 3:1002 9 (1996)] 참조]. TTR 최소 인핸서/프로모터, 알파-항트립신 프로모터, LSP(845 nt)25는 인트론이 없는 scAAV를 필요로 한다.
프로모터(들)는 상이한 공급원, 예를 들어 인간 거대세포바이러스(CMV), 급초기 인핸서/프로모터, SV40 초기 인핸서/프로모터, JC 폴리모바이러스 프로모터, 수초 염기성 단백질(MBP) 또는 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP) 프로모터, 단순 헤르페스 바이러스(HSV-1) 잠복기 연관 프로모터(LAP), 라우스 육종 바이러스(RSV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 뉴런-특이적 프로모터(NSE), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 프로모터, hSYN, 멜라닌-농축 호르몬(MCH) 프로모터, CBA, 기질 금속단백질 프로모터(MPP), 및 닭 베타-액틴 프로모터로부터 선택될 수 있다.
발현 카세트는 적어도 하나의 인핸서, 즉, CMV 인핸서를 포함할 수 있다. 또 다른 인핸서 요소는, 예를 들어 아포리포단백질 인핸서, 제브라피시 인핸서, GFAP 인핸서 요소, 및 뇌 특이적 인핸서, 예컨대, WO 제2013/1555222호에 기재된 것, 우드척 후 간염 전사후 조절 요소를 포함할 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 다른 것, 예를 들어 하이브리드 인간 거대세포바이러스(HCMV)-급초기(IE)-PDGR 프로모터 또는 다른 프로모터-인핸서 요소가 선택될 수 있다. 본 명세서에서 유용한 다른 인핸서 서열은 IRBP 인핸서(Nicoud 2007, J Gene Med. 2007 Dec;9(12):1015-23), 급초기 거대세포바이러스 인핸서, 면역글로불린 유전자 또는 SV40 인핸서로부터 유래된 것, 마우스 근위 프로모터에서 확인된 시스-작용 요소 등을 포함한다.
프로모터에 추가적으로, 발현 카세트 및/또는 벡터는 다른 적절한 전사 개시, 종결, 인핸서 서열, 효율적인 RNA 처리 신호, 예컨대, 스플라이싱 및 폴리아데닐화(폴리A) 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, 코작 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 인코딩된 산물의 분비를 향상시키는 서열을 포함할 수 있다. 다양한 적합한 폴리A가 공지되어 있다. 일 예에서, 폴리A는 토기 베타 글로빈, 예컨대, 127 bp 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호(GenBank # V00882.1)이다. 다른 실시형태에서, SV40 폴리A 신호가 선택된다. 또 다른 적합한 폴리A 서열이 선택될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 인트론이 포함된다. 한 가지 적합한 인트론은 닭 베타-액틴 인트론이다. 일 실시형태에서, 인트론은 875 bp(GenBank # X00182.1)이다. 또 다른 실시형태에서, Promega로부터 입수 가능한 키메라 인트론이 사용된다. 그러나, 다른 적합한 인트론이 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, 벡터 게놈이 천연 AAV 벡터 게놈(예컨대, 4.1 내지 5.2 kb)과 대략 동일한 크기를 가지도록 스페이서가 포함된다. 일 실시형태에서, 벡터 게놈이 대략 4.7 kb가 되도록 스페이서가 포함된다. 문헌[Wu et al, Effect of Genome Size on AAV Vector Packaging, Mol Ther. 2010 Jan; 18(1): 80-86]을 참조하며, 이는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
이들 및 다른 공통 벡터 및 조절 서열의 선택은 통상적이며, 다수의 이와 같은 서열이 이용 가능하다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al] 및 예를 들어 페이지 3.18 내지 3.26 및 16.17 내지 16.27에 인용된 참조문헌 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989]을 참조한다. 물론, 모든 벡터 및 발현 제어 서열이 본 명세서에 기재된 바와 같은 모든 이식유전자를 발현하도록 동등하게 잘 기능하지는 않을 것이다. 그러나, 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 이들 및 다른 발현 제어 서열 중에서 선택할 수 있을 것이다.
소정의 실시형태에서, 발현 카세트는 miR-183 표적 서열인 적어도 하나의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 벡터 게놈 또는 발현 카세트는 AGTGAATTCTACCAGTGCCATA(서열번호 9)를 포함하는 miR-183 표적 서열을 포함하며, 여기서 miR-183 시드 서열에 상보적인 서열은 밑줄이 그어져 있다. 소정의 실시형태에서, 벡터 게놈 또는 발현 카세트는 miR-183 시드 서열에 100% 상보적인 서열의 하나 초과의 복제물(예컨대, 2 또는 3개 복제물)을 포함한다. 소정의 실시형태에서, miR-183 표적 서열은 길이가 약 7개 뉴클레오타이드 내지 약 28개 뉴클레오타이드이고 miR-183 시드 서열에 적어도 100% 상보적인 적어도 하나의 영역을 포함한다. 소정의 실시형태에서, miR-183 표적 서열은 서열번호 9에 부분 상보성을 가지는 서열을 포함하고, 따라서 서열번호 9에 대해 정렬될 때 하나 이상의 미스매치가 존재한다. 소정의 실시형태에서, miR-183 표적 서열은 서열번호 9에 대해 정렬될 때 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 미스매치를 가지는 서열을 포함하며, 여기서 미스매치는 비-연속적일 수 있다. 소정의 실시형태에서, miR-183 표적 서열은 miR-183 표적 서열 길이의 적어도 30%를 또한 포함하는 100% 상보성의 영역을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 100% 상보성의 영역은 miR-183 시드 서열에 100% 상보성을 가지는 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, miR-183 표적 서열의 나머지는 miR-183에 적어도 약 80% 내지 약 99% 상보성을 가진다. 소정의 실시형태에서, 발현 카세트 또는 벡터 게놈은 절단된 서열번호 9, 즉, 서열번호 9의 5' 또는 3' 말단 중 어느 하나 또는 둘 다에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오타이드가 결여된 서열을 포함하는 miR-183 표적 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 발현 카세트 또는 벡터 게놈은 이식유전자 및 1개의 miR-183 표적 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 발현 카세트 또는 벡터 게놈은 적어도 2, 3 또는 4개의 miR-183 표적 서열을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 발현 카세트는 miR-182 표적 서열인 적어도 하나의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 벡터 게놈 또는 발현 카세트는 AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA(서열번호 10)를 포함하는 miR-182 표적 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 벡터 게놈 또는 발현 카세트는 miR-182 시드 서열에 100% 상보적인 서열의 하나 초과의 복제물(예컨대, 2 또는 3개 복제물)을 포함한다. 소정의 실시형태에서, miR-182 표적 서열은 길이가 약 7개 뉴클레오타이드 내지 약 28개 뉴클레오타이드이고 miR-182 시드 서열에 적어도 100% 상보적인 적어도 하나의 영역을 포함한다. 소정의 실시형태에서, miR-182 표적 서열은 서열번호 10에 부분 상보성을 가지는 서열을 포함하고, 따라서 서열번호 10에 대해 정렬될 때 하나 이상의 미스매치가 존재한다. 소정의 실시형태에서, miR-183 표적 서열은 서열번호 10에 대해 정렬될 때 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 미스매치를 가지는 서열을 포함하며, 여기서 미스매치는 비-연속적일 수 있다. 소정의 실시형태에서, miR-182 표적 서열은 miR-182 표적 서열 길이의 적어도 30%를 또한 포함하는 100% 상보성의 영역을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 100% 상보성의 영역은 miR-182 시드 서열에 100% 상보성을 가지는 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, miR-182 표적 서열의 나머지는 miR-182에 적어도 약 80% 내지 약 99% 상보성을 가진다. 소정의 실시형태에서, 발현 카세트 또는 벡터 게놈은 절단된 서열번호 10, 즉, 서열번호 10의 5' 또는 3' 말단 중 어느 하나 또는 둘 다에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오타이드가 결여된 서열을 포함하는 miR-182 표적 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 발현 카세트 또는 벡터 게놈은 이식유전자 및 1개의 miR-182 표적 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 발현 카세트 또는 벡터 게놈은 적어도 2, 3 또는 4개의 miR-182 표적 서열을 포함한다.
용어 "탠덤 반복부"는 본 명세서에서 2개 이상의 연속적인 miRNA 표적 서열의 존재를 지칭하는 데 사용된다. 이러한 miRNA 표적 서열은 연속적일 수 있으며, 즉, 하나의 3' 말단이 개재 서열 없이 다음의 5' 말단의 바로 상류에 있거나 그 반대이도록 서로 바로 뒤에 위치할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 2개 이상의 miRNA 표적 서열은 짧은 스페이서 서열에 의해 분리된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "스페이서"는 2개 이상의 연속적인 miRNA 표적 서열 사이에 위치한, 예를 들어 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오타이드인 임의의 선택된 핵산 서열이다. 소정의 실시형태에서, 스페이서는 길이가 1 내지 8개 뉴클레오타이드, 길이가 2 내지 7개 뉴클레오타이드, 길이가 3 내지 6개 뉴클레오타이드, 길이가 4개 뉴클레오타이드, 4 내지 9개 뉴클레오타이드, 3 내지 7개 뉴클레오타이드, 또는 더 긴 값이다. 적합하게는, 스페이서는 비-코딩 서열이다. 소정의 실시형태에서, 스페이서는 네(4) 개의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 소정의 실시형태에서, 스페이서는 GGAT이다. 소정의 실시형태에서, 스페이서는 여섯(6) 개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 스페이서는 CACGTG 또는 GCATGC이다.
소정의 실시형태에서, 탠덤 반복부는 2, 3, 4개 또는 그 초과의 동일한 miRNA 표적 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 탠덤 반복부는 적어도 2개의 상이한 miRNA 표적 서열, 적어도 3개의 상이한 miRNA 표적 서열, 또는 적어도 4개의 상이한 miRNA 표적 서열 등을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 탠덤 반복부는 2개 또는 3개의 동일한 miRNA 표적 서열 및 상이한 제4 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 발현 카세트에 탠덤 반복부의 적어도 2개의 상이한 세트가 있을 수 있다. 예를 들어, 3' UTR은 이식유전자의 바로 하류에 탠덤 반복부, UTR 서열, 및 UTR의 3' 말단에 더 가까운 2개 이상의 탠덤 반복부를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 5' UTR은 1, 2개 또는 그 초과의 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 3'은 탠덤 반복부를 포함할 수 있고 5' UTR은 적어도 1개의 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 발현 카세트는 이식유전자에 대한 정지 코돈의 약 0 내지 20개 뉴클레오타이드 내에서 시작하는 2, 3, 4개 또는 그 초과의 탠덤 반복부를 포함한다. 다른 실시형태에서, 발현 카세트는 이식유전자에 대한 정지 코돈으로부터 적어도 100 내지 약 4000개 뉴클레오타이드의 miRNA 탠덤 반복부를 포함한다.
미국 특허 가출원 제62/783,956호(출원일: 2018년 12월 21일, 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)에 대해 우선권을 주장하고, 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 PCT/US19/67872호(출원일: 2019년 12월 20일, 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)를 참조한다.
또 다른 실시형태에서, 재조합 아데노-연관 바이러스를 생성하는 방법이 제공된다. 적합한 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV)는 본 명세서에 기재된 바와 같은 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이의 단편; 기능성 rep 유전자; 최소한 AAV 반전 말단 반복부(ITR) 및 바람직한 이식유전자를 인코딩하는 이종 핵산 서열로 구성된 미니유전자; 및 AAV 캡시드 단백질 내로 미니유전자의 패키징을 허용하기에 충분한 헬퍼 기능을 포함하는 숙주 세포를 배양함으로써 생성된다. AAV 캡시드에 AAV 미니유전자를 패키징하기 위해 숙주 세포에서 배양되는 데 필요한 구성요소는 숙주 세포에 트랜스로 제공될 수 있다. 대안적으로, 필요한 구성요소(예컨대, 미니유전자, rep 서열, cap 서열 및/또는 헬퍼 기능) 중 임의의 하나 이상은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 필요한 구성요소 중 하나 이상을 포함하도록 조작된 안정적인 숙주 세포에 의해 제공될 수 있다.
또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 AAV로 형질감염된 숙주 세포가 본 명세서에서 제공된다. 가장 적합하게는, 이와 같은 안정적인 숙주 세포는 유도성 프로모터의 제어 하에서 필요한 구성요소(들)를 포함할 것이다. 그러나, 필요한 구성요소(들)는 구성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 적합한 유도성 및 구성 프로모터의 예는 본 명세서의 이식유전자와 함께 사용하기에 적합한 조절 요소의 하기 논의에서 제공된다. 또 다른 대안에서, 선택되는 안정적인 숙주 세포는 구성 프로모터의 제어 하에 선택된 구성요소(들) 및 하나 이상의 유도성 프로모터의 제어 하에 다른 선택된 구성요소(들)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 293 세포(구성 프로모터의 제어 하에 E1 헬퍼 기능을 포함함)로부터 유래되지만, 유도성 프로모터의 제어 하에 rep 및/또는 cap 단백질을 포함하는 안정적인 숙주 세포가 생성될 수 있다. 또 다른 안정적인 숙주 세포는 당업자에 의해 생성될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 분자를 포함한다.
본 명세서에 기재된 rAAV를 생성하는 데 필요한 미니유전자, rep 서열, cap 서열, 및 헬퍼 기능은 운반되는 서열을 전달하는 임의의 유전 요소의 형태로 패키징 숙주 세포에 전달될 수 있다. 선택된 유전 요소는 본 명세서에 기재된 것을 포함하여 임의의 적합한 방법에 의해 전달될 수 있다. 본 발명의 임의의 실시형태를 작제하는 데 사용되는 방법은 핵산 조작의 숙련자에게 공지되어 있고 유전 공학, 재조합 공학, 및 합성 기법을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY]을 참조한다. 유사하게, rAAV 비리온을 생성하는 방법이 널리 공지되어 있고 적합한 방법의 선택은 본 발명에 대하여 제한되지 않는다. 예를 들어, 특히 문헌[K. Fisher et al, 1993 J. Virol ., 70:520-532] 및 미국 특허 제5,478,745호를 참조한다. 이들 간행물은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
또한, 본 명세서에 기재된 벡터를 생성하는 데 사용하기 위한 플라스미드가 본 명세서에서 제공된다. 이와 같은 플라스미드는 실시예 섹션에 기재되어 있다.
C. 약제학적 조성물 및 투여
일 실시형태에서, 위에서 상세히 기술된 바와 같은 표적 세포에서 사용하기 위한 원하는 이식유전자 및 프로모터를 포함하는 재조합 AAV는 선택적으로 통상적인 방법에 의해 오염에 대해 평가된 다음, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 약제학적 조성물로 제형화된다. 이와 같은 제형은 적절한 생리학적 수준에서 pH를 유지하기 위한 약제학적으로 및/또는 생리학적으로 허용 가능한 비히클 또는 담체, 예컨대, 완충 식염수 또는 다른 완충제, 예를 들어 HEPES의 사용, 및 선택적으로 다른 약물, 약제, 안정화제, 완충제, 담체, 아쥬반트, 희석제 등을 포함한다. 주사의 경우, 담체는 전형적으로 액체일 것이다. 예시적인 생리학적으로 허용 가능한 담체는 멸균된 무-발열원 물 및 멸균된 무-발열원 인산염 완충 식염수를 포함한다. 이와 같은 공지된 다양한 담체는 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 특허 공개 제7,629,322호에 제공되어 있다. 일 실시형태에서, 담체는 등장성 염화나트륨 용액이다. 또 다른 실시형태에서, 담체는 평형 염액이다. 일 실시형태에서, 담체는 트윈(tween)을 포함한다. 바이러스가 장기간 보관되어야 하는 경우, 글리세롤 또는 Tween20의 존재 하에 동결될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 계면활성제, 예컨대, 퍼플루오로옥탄(퍼플루오론 액체)을 포함한다. 벡터는 인간 대상체에서의 주입에 적합한 완충제/담체 중에서 제형화된다. 완충제/담체는 rAAV가 주입 튜브에 달라붙는 것을 방지하지만 생체 내에서 rAAV 결합 활성을 방해하지 않는 구성요소를 포함해야 한다.
본 명세서에 기재된 방법의 소정의 실시형태에서, 상기 기재된 약제학적 조성물은 대상체에게 근육내로 투여된다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 정맥내로 투여된다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 뇌실내 주사에 의해 투여된다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 대조내(ICM) 주사에 의해 투여된다. 본 명세서에 기재된 방법에 유용할 수 있는 다른 투여 형태는, 망막하 또는 유리체내 전달을 포함하여 원하는 기관(예컨대, 눈)으로의 직접 전달, 경구, 흡입, 비강내, 기관내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 및 다른 비경구 투여 경로를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 원하는 경우 투여 경로는 조합될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "척추강내 전달" 또는 "척추강내 투여"는 뇌척수액(CSF)에 도달하도록 주사를 통해 척추관으로, 보다 구체적으로는 지주막하 공간으로의 투여 경로를 지칭한다. 척추강내 전달은 요추 천자, 뇌실내(intraventricular)(뇌실내(ICV)를 포함함), 후두하/수조내, 및/또는 C1-2 천자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 물질은 요추 천자에 의해 지주막하 공간 전체에 확산을 위해 도입될 수 있다. 또 다른 예에서, 주사는 대조 내로 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "수조내 전달" 또는 "수조내 투여"는 소뇌연수 대조의 뇌척수액으로, 보다 구체적으로는 후두하 천자를 통해 또는 대조 내로의 직접 주사에 의해 또는 영구적으로 위치한 튜브를 통해 직접 투여하는 경로를 지칭한다.
조성물은 치료할 영역의 크기, 사용되는 바이러스 역가, 투여 경로, 및 방법의 원하는 효과에 따라, 범위 내의 모든 숫자를 포함하여 약 0.1㎕ 내지 약 10㎖의 부피로 전달될 수 있다. 일 실시형태에서, 부피는 약 50㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 70㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 100㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 125㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 150㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 175㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 200㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 250㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 300㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 450㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 500㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 600㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 750㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 850㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 1000㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 1.5㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 2㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 2.5㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 3㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 3.5㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 4㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 5㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 5.5㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 6㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 6.5㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 7㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 8㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 8.5㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 9㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 9.5㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 10㎖이다.
조절 서열의 제어 하에 원하는 이식유전자를 인코딩하는 핵산 서열을 보유하는 재조합 아데노-연관 바이러스의 유효 농도는 바람직하게는 밀리리터당 약 107 내지 1014개 벡터 게놈(vg/㎖)(또한, 게놈 복제물/㎖(GC/㎖)로도 불림)의 범위이다. 일 실시형태에서, rAAV 벡터 게놈은 실시간 PCR에 의해 측정된다. 또 다른 실시형태에서, rAAV 벡터 게놈은 디지털 PCR에 의해 측정된다. 문헌[Lock et al, Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14]을 참조하며, 이는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 또 다른 실시형태에서, rAAV 감염 단위는 문헌[S.K. McLaughlin et al, 1988 J. Virol., 62:1963]에 기재된 바와 같이 측정되며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
바람직하게는, 농도는 약 1.5×109 vg/㎖ 내지 약 1.5×1013 vg/㎖, 더 바람직하게는 약 1.5×109 vg/㎖ 내지 약 1.5×1011 vg/㎖이다. 일 실시형태에서, 유효 농도는 약 1.4×108 vg/㎖이다. 일 실시형태에서, 유효 농도는 약 3.5×1010 vg/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 유효 농도는 약 5.6×1011 vg/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 유효 농도는 약 5.3×1012 vg/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 유효 농도는 약 1.5×1012 vg/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 유효 농도는 약 1.5×1013 vg/㎖이다. 본 명세서에 기재된 모든 범위는 종점을 포함한다.
일 실시형태에서, 투약량은 약 1.5×109 vg/체중 ㎏ 내지 약 1.5×1013 vg/㎏, 더 바람직하게는 약 1.5×109 vg/㎏ 내지 약 1.5×1011 vg/㎏이다. 일 실시형태에서, 투약량은 약 1.4×108 vg/㎏이다. 일 실시형태에서, 투약량은 약 3.5×1010 vg/㎏이다. 또 다른 실시형태에서, 투약량은 약 5.6×1011 vg/㎏이다. 또 다른 실시형태에서, 투약량은 약 5.3×1012 vg/㎏이다. 또 다른 실시형태에서, 투약량은 약 1.5×1012 vg/㎏이다. 또 다른 실시형태에서, 투약량은 약 1.5×1013 vg/㎏이다. 또 다른 실시형태에서, 투약량은 약 3.0×1013 vg/㎏이다. 또 다른 실시형태에서, 투약량은 약 1.0×1014 vg/㎏이다. 본 명세서에 기재된 모든 범위는 종점을 포함한다.
일 실시형태에서, 유효 투약량(전달되는 총 게놈 복제물)은 약 107 내지 1013개의 벡터 게놈이다. 일 실시형태에서, 총 투약량은 약 108개의 게놈 복제물이다. 일 실시형태에서, 총 투약량은 약 109개의 게놈 복제물이다. 일 실시형태에서, 총 투약량은 약 1010개의 게놈 복제물이다. 일 실시형태에서, 총 투약량은 약 1011개의 게놈 복제물이다. 일 실시형태에서, 총 투약량은 약 1012개의 게놈 복제물이다. 일 실시형태에서, 총 투약량은 약 1013개의 게놈 복제물이다. 일 실시형태에서, 총 투약량은 약 1014개의 게놈 복제물이다. 일 실시형태에서, 총 투약량은 약 1015개의 게놈 복제물이다.
독성과 같은 바람직하지 않은 영향의 위험을 감소시키기 위해 가장 낮은 유효 농도의 바이러스를 이용하는 것이 바람직하다. 이들 범위의 또 다른 투약량 및 투여 부피는 치료될 대상체, 바람직하게는 인간의 신체 상태, 대상체의 연령, 특정 장애 및 진행성인 경우 장애의 발달 정도를 고려하여 주치의에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어 정맥내 전달은 약 1.5×1013개 vg/㎏의 용량이 필요할 수 있다.
D. 방법
또 다른 양상에서, 표적 조직에 형질도입하는 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 AAVrh.90 캡시드를 갖는 AAV를 투여하는 단계를 포함한다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 AAVrh.90으로 명명된 AAV가 CNS(뇌), 간, 심장, 및 근육 조직에 효과적으로 형질도입한다는 것을 제시하였다. 따라서, AAVrh.90 캡시드를 갖는 rAAV를 투여하는 단계를 포함하는, 근육에 형질도입하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 실시형태에서, AAVrh.90 캡시드를 갖는 rAAV를 투여하는 단계를 포함하는, 뇌에 형질도입하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 실시형태에서, AAVrh.90 캡시드를 갖는 rAAV를 투여하는 단계를 포함하는, 간에 형질도입하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 실시형태에서, AAVrh.90 캡시드를 갖는 rAAV를 투여하는 단계를 포함하는, 심장에 형질도입하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 일 실시형태에서, 정맥내 투여가 이용된다. 또 다른 실시형태에서, ICV 투여가 이용된다. 또 다른 실시형태에서, ICM 투여가 이용된다.
본 명세서에서 논의되는 바와 같이, 본 명세서에 기재된 AAV 캡시드를 포함하는 벡터는 높은 수준으로 표적 조직에 형질도입될 수 있다. 따라서, 이식유전자를 간 세포에 전달하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 방법은 세포를 AAVrh.90 캡시드를 갖는 rAAV와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 rAAV는 이식유전자를 포함한다. 또 다른 양상에서, AAVrh.90 캡시드를 갖는 rAAV의 용도는 이식유전자를 간에 전달하기 위해 제공된다. 소정의 실시형태에서, 방법은 AAVrh.90 캡시드를 갖는 rAAV를 투여하여 이식유전자를 간의 세포에 전달하는 단계를 포함하며, 여기서 이식유전자는 전구단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 유형 9(PCSK9)(콜레스테롤 관련 장애), 트랜스타이레틴(TTR)(트랜스타이레틴 아밀로이드증), HAO, 아포리포단백질 C-III(APOC3), 인자 VIII, 인자 IX, 저밀도 리포단백질 수용체(LDLr), 리포단백질 리파제(LPL)(리포단백질 리파제 결핍증), 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LCAT), 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC), 카르노시나제(CN1), 스핑고미엘린 포스포다이에스터라제(SMPD1)(니만피크병), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HGPRT), 분지쇄 알파-케토산 데하이드로게나제 복합체(BCKDC)(단풍당뇨증), 및 에리스로포이에틴(EPO)으로부터 선택된다.
또한 이식유전자를 근육 세포에 전달하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 방법은 세포를 AAVrh.90 캡시드를 갖는 rAAV와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 rAAV는 이식유전자를 포함한다. 또 다른 양상에서, AAVrh.90 캡시드를 갖는 rAAV의 용도는 이식유전자를 근육에 전달하기 위해 제공된다.
또한 이식유전자를 심장 세포에 전달하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 방법은 세포를 AAVrh.90 캡시드를 갖는 rAAV와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 rAAV는 이식유전자를 포함한다. 또 다른 양상에서, AAVrh.90 캡시드를 갖는 rAAV의 용도는 이식유전자를 심장에 전달하기 위해 제공된다.
또한 이식유전자를 신장 세포에 전달하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 방법은 세포를 AAVrh.90 캡시드를 갖는 rAAV와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 rAAV는 이식유전자를 포함한다. 또 다른 양상에서, AAVrh.90 캡시드를 갖는 rAAV의 용도는 이식유전자를 심장에 전달하기 위해 제공된다.
또한 이식유전자를 췌장 세포에 전달하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 방법은 세포를 AAVrh.90 캡시드를 갖는 rAAV와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 rAAV는 이식유전자를 포함한다. 또 다른 양상에서, AAVrh.90 캡시드를 갖는 rAAV의 용도는 이식유전자를 췌장에 전달하기 위해 제공된다.
또한 이식유전자를 뇌 세포에 전달하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 방법은 세포를 AAVrh.90 캡시드를 갖는 rAAV와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 rAAV는 이식유전자를 포함한다. 또 다른 양상에서, AAVrh.90 캡시드를 갖는 rAAV의 용도는 이식유전자를 뇌에 전달하기 위해 제공된다. 소정의 실시형태에서, rAAV는 ICM 전달을 사용하여 전달된다.
단일 게놈 증폭
AAV 게놈은 전통적으로 PCR 기반 방법을 사용하여 전체 포유동물 게놈 DNA 내로부터 단리되었고: 프라이머가 다양한 VP1(캡시드) 유전자의 대부분에 측접하는 보존된 영역을 검출하는 데 사용된다. 그 다음 PCR 산물은 플라스미드 백본으로 클로닝되고 개별 클론은 Sanger 방법을 사용하여 서열결정된다. 전통적인 PCR 및 분자 클로닝 기반 바이러스 단리 방법은 신규 AAV 게놈을 회수하는 데 효과적이지만 회수된 게놈은 PCR-매개 재조합 및 중합효소 오류에 의해 영향을 받을 수 있다. 추가적으로, 현재 이용 가능한 차세대 서열결정 기술은 이전에 사용된 Sanger 기술과 비교하여 견줄 데 없는 정확도로 바이러스 게놈의 서열결정을 가능하게 하였다. 바이러스 집단 내로부터 개별 AAV 게놈을 정확하게 단리하는 신규하고 더 높은 처리량의 PCR 및 차세대 서열결정 기반 방법이 본 명세서에서 제공된다. 이 방법, 즉, AAV-단일 게놈 증폭(AAV-SGA)은 포유동물 숙주 내에서 AAV 다양성에 대한 지식을 개선시키는 데 사용될 수 있다. 더욱이, 유전자 요법용 벡터로서 사용하기 위한 신규 캡시드를 식별하는 것을 가능하게 하였다.
AAV-SGA는 검증되고 최적화되어 게놈 집단을 포함하는 샘플로부터 개별 AAV 서열을 효과적으로 회수하였다. 이 기법은 이전에 인간 및 비인간 영장류 숙주 내로부터 단일 HIV 및 HCV 게놈을 단리하는 데 사용되었다. 캡시드 검출 PCR에 의해 AAV에 대해 양성인 것을 스크리닝하는 게놈 DNA 샘플은 종점-희석된다. 푸아송 분포에 따르면, 80% 신뢰도로 PCR 증폭이 30% 미만의 양성 반응을 산출하는 희석은 단일 증폭 가능한 AAV 게놈을 포함한다. 이러한 절차는 중합효소의 주형 전환에 의해 유발된 PCR-매개 재조합의 가능성이 감소된 바이러스 게놈의 PCR 증폭을 가능하게 한다. AAV-SGA PCR 앰플리콘은 2×150 또는 2×250 쌍-말단 서열결정을 사용하는 Illumina MiSeq 플랫폼을 사용하여 서열결정된다. 이 방법은 높은 상동성 영역을 가지는 여러 바이러스를 포함하는 단일 샘플로부터 서열결정 판독물의 수렴에 대한 염려 없이 전장 AAV VP1 서열의 정확한 새로운 조립을 가능하게 한다.
AAV-SGA 기법은 히말라야 원숭이 조직으로부터 다수의 신규 AAV 캡시드 서열을 단리하는 데 성공하였다. AAV의 상이한 클레드 유래의 다수 바이러스가 단일 샘플로부터 식별되었으며; 이는 AAV의 집단이 숙주 조직에 존재할 수 있음을 입증한다. 예를 들어, 클레드 D, E, 및 외부 "프린지" 바이러스와 서열 유사성을 가지는 캡시드가 단일 간 조직 샘플에서 단리되었다.
AAV 발견에 대한 SGA의 적용은 이전에 설명된 바 없다. 이러한 접근법은 유효하지 않은 AAV 게놈 서열을 생성할 수 있는 주형 전환 및 중합효소 오류 문제를 해결한다. 추가적으로, 단리된 게놈의 품질은 단일 단리물과 동일한 숙주 샘플로부터 동일한 서열이 반복적으로 회수될 때 자명하다.
하기 실시예는 본 발명의 다양한 실시형태를 예시하기 위해 제공된다. 실시예는 어떤 식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
E. 실시예
실시예 1: 물질 및 방법
AAV 서열의 검출 및 단리
비인간 영장류 조직 공급원
펜실베이니아 대학교 콜로니 유래의 히말라야 원숭이를 인공적으로 번식시켰으며, 이들은 중국 또는 인도 기원을 가졌다. 히말라야 원숭이의 간 조직 샘플은 펜실베이니아 대학교의 Timothy H. Lucas의 실험실 및 Gene Therapy Program에서 친절하게 제공하였다.
신규 AAV 단리
게놈 DNA를 추출하고(QIAmp DNA Mini Kit, QIAGEN), NHP 간 조직 표본으로부터 3.1 kb 전장 Cap 단편을 증폭시키는 PCR 전력을 사용함으로써 AAV DNA의 존재에 대해 분석하였다. AAV Rep 유전자의 보존 영역 내 5' 프라이머(AV1NS, 5'-GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC-3')(서열번호 5)를 전장 AAV Cap 앰플리콘의 증폭을 위해 AAV Cap 유전자의 하류에 있는 보존된 영역에 위치한 3' 프라이머(AV2CAS, 5'- CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA-3')(서열번호 6)와 조합하여 사용하였다. Q5 High-Fidelity Hot Start DNA Polymerase(New England Biolabs)를 사용하여 다음 사이클링 조건을 사용하여 AAV DNA를 증폭시켰다: 98℃에서 30초; 98℃에서 10초, 59℃에서 10초, 72℃에서 93초, 50 사이클; 및 72℃에서 120초 동안 연장.
양성 PCR 반응을 초래한 주형 게놈 DNA 샘플에 AAV-단일 게놈 증폭(AAV-SGA)을 적용하였다. 상기에서 언급한 동일한 프라이머를 사용하여, 96개 중 29개 미만의 PCR 반응이 증폭 산물을 산출하도록 96-웰 플레이트에서 게놈 DNA를 종점 희석시켰다. 푸아송 분포에 따르면, 웰의 30% 이하에서 PCR 산물을 산출하는 DNA 희석은 시간의 80% 초과에서 양성 PCR당 하나의 증폭 가능한 DNA 주형을 포함한다. Illumina MiSeq 2×150 또는 2×250쌍 말단 서열결정 플랫폼을 사용하여 양성 PCR 반응으로부터 AAV DNA 앰플리콘의 서열을 결정하였고, 결과 판독물을 SPAdes 어셉블러(cab.spbu.ru/software/spades)를 사용하여 새로 조립하였다. NCBI BLASTn(blast.ncbi.nlm.nih.gov) 및 Vector NTI AlignX 소프트웨어(Thermo Fisher)를 사용하여 서열 분석을 수행하였다.
신규 AAV 캡시드를 사용한 벡터 생성
관심이 있는 PCR 산물로부터의 AAV 캡시드 유전자 DNA 서열을 TOPO-클로닝하고 증폭시켰다(Invitrogen). 증폭된 캡시드 유전자를 AAV2 Rep 유전자 및 기타 연관된 플라스미드 요소를 포함하는 AAV 트랜스플라스미드 백본 내로 추가로 클로닝하였다.
앞서 기재된 바와 같이 Penn Vector Core에 의해 AAV 벡터를 생성하고 적정하였다(예컨대, 문헌[Lock, M., et al. (2010) Hum. Gene Ther. 21:1259-71] 참조). HEK293 세포를 삼중 형질감염시킨 다음, 세포 배양액 상청액을 수확하고, 농축시킨 다음, 이오딕사놀 구배를 이용하여 정제하였다. 정제된 벡터를 앞서 기재된 바와 같이 토끼 베타-글로빈 폴리A 서열을 표적화하는 프라이머를 사용하여 액적 디지털 PCR로 적정하였다(예컨대, 문헌[Lock, M., et al. (2014) Hum. Gene Ther. Methods 25:115-125] 참조).
설치류에서 신규 AAV 캡시드의 생체내 특성화
동물
모든 동물 프로토콜은 펜실베이니아 대학교의 동물실험 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다. C56BL/6J 마우스는 Jackson Laboratory에서 구입하였다. GFP 리포터 유전자 실험을 위해, 성체(6 내지 8주령) 수컷에게 주사하였다. 동물을 케이지당 2 내지 5마리 동물의 표준 케이지에 수용하였다. 케이지, 물병, 및 침구 기재는 차단 시설에서 고압멸균처리하고, 케이지는 1주일에 1회 교체하였다. 자동으로 제어되는 12시간 명 또는 암 사이클을 유지하였다. 각각의 암기는 오후 7:00(±30분)에 시작되었다. 방사선조사된 실험실 설치류 먹이는 임의로 제공되었다.
시험 물품 및 연구 설계
마우스에게 측면 꼬리 정맥을 통해 0.1㎖로 각각의 벡터의 마우스당 1×1012개 GC를 정맥내로(IV) 투여하거나 마우스당 5㎕로 1× 1011개 GC의 용량으로 뇌의 측면 뇌실 내에 뇌실내(ICV) 주사하였다. 각각의 그룹에 대해 3 또는 5마리의 마우스에 투약하였다.
주사 14일 후에 CO2의 흡입에 의해 마우스를 안락사시켰다. 조직을 수집하고, 생체분포 분석을 위해 드라이 아이스에서 급속 동결하거나 10% 중성 포말린에 침지-고정시키고, 수크로스에 동결 보존하고, OCT에서 동결한 다음, GFP 직접 관찰을 위해 크라이오스탯을 이용하여 절편화하였다. 내피 세포 형질도입 분석에 사용된 조직을 부검 후 파라핀으로 포매하였다.
벡터 생체분포
조직 게놈 DNA를 QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN)를 이용하여 추출하였고, AAV 벡터 게놈을 벡터의 EGFP 서열을 표적화하는 프라이머/프로브와 함께 Taqman 시약(Applied Biosystems, Life Technologies)을 사용하여 실시간 PCR에 의해 정량화하였다.
리포터 유전자 시각화
직접적인 GFP 형광을 관찰하기 위해, 조직 샘플을 약 24시간 동안 포말린에 고정시키고, PBS에서 잠시 세척한 다음, 최대 밀도에 도달할 때까지 PBS 중 15% 및 30% 수크로스에서 순차적으로 평형화한 다음, 동결절편의 준비를 위해 OCT 포매 배지에서 동결시켰다. 절편을 핵 대조염색으로서 DAPI를 포함하는 Fluoromount G(Electron Microscopy Sciences, 미국 펜실베이니아주 하트필드 소재)에 장착하였다.
GFP 면역조직화학을 파라핀-포매 조직 샘플에서 수행하였다. 에탄올 및 자일렌을 이용하여 절편을 탈파라핀화하고, 항원 복원을 위해 10mM 시트레이트 완충제(pH 6.0)에서 6분 동안 끓인 다음, 2% H2O2로 15분 동안, 아비딘/비오틴 차단 시약(Vector Laboratories)으로 각각 15분 동안, 그리고 차단 완충제(PBS 중 1% 당나귀 혈청+0.2% 트리톤)로 10분 동안 순차적으로 처리하였다. 그 다음 1차 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고 차단 완충제에서 45분 동안 비오틴화된 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다(Jackson Immunoresearch). 1차 항체, 닭 항-GFP(Abcam ab13970) 및 토끼 항-CD31(Abcam ab28364) 내피 세포 마커를 사용하였다. DAB를 기질로서 이용하여 제조업체의 지침에 따라 Vectastain Elite ABC 키트(Vector Laboratories)를 사용하여 결합된 항체를 갈색 침전물로 시각화하였다.
면역형광의 경우, 파라핀 절편을 탈파라핀화하고 15분 동안 PBS+0.2% Triton에서 1% 당나귀 혈청으로 항원 복원 후 차단시킨 다음, 차단 완충제에서 희석된 1차(1시간) 및 형광-표지 2차 항체(45분, Jackson Immunoresearch)와 함께 순차적으로 인큐베이션하였다. 사용된 항체는 닭 항-GFP(Abcam ab13970), 토끼 항-CD31(Abcam ab28364), 및 마우스 항-NF-200(클론 RT97, Millipore CBL212)이었다. 1차 항체를 함께 혼합하고 GFP 및 NF-200 항체를 각각 FITC- 및 TRITC-표지된 2차 항체를 통해 검출하였다. 제조업체의 프로토콜(Vector Labs)에 따라서 VectaFluor™ Excel Amplified DyLight® 488 Anti-Rabbit IgG 키트를 사용하여 CD31에 대한 토끼 항체에 대한 신호를 향상시켰다. 형광 및 명시야 현미경 이미지를 Nikon Eclipse TiE 현미경으로 촬영하였다.
바코딩된 벡터 이식유전자의 비인간 영장류 형질도입 평가
시험 물품 및 연구 설계
5개의 신규 캡시드 및 5개의 대조군 캡시드(AAVrh90, AAVrh91, AAVrh92, AAVrh93, AAVrh91.93, AAV8, AAV6.2, AAVrh32.33, AAV7 및 AAV9)를 사용하여 변형된 ATG-고갈 자가-상보성 eGFP(dGFP) 이식유전자를 패키징하였다. 각각의 독특한 캡시드 제제는 벡터 게놈의 폴리아데닐화 서열 이전에 상응하는 독특한 6 bp 바코드가 있는 dGFP 이식유전자를 포함하였다. 이식유전자는 CB8 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 서열(AAVsc.CB8.dGFP.바코드.SV40)을 포함하였다. 앞서 기재된 바와 같이 Penn Vector Core에 의해 AAV 벡터를 생성하고 적정하였다(예컨대, 문헌[Lock, M., et al. (2010) Hum. Gene Ther. 21:1259-71] 참조). HEK293 세포를 삼중 형질감염시킨 다음, 세포 배양액 상청액을 수확하고, 농축시킨 다음, 이오딕사놀 구배를 이용하여 정제하였다. 정제된 벡터를 앞서 기재된 바와 같이 SV40 폴리A 서열을 표적화하는 프라이머를 사용하여 액적 디지털 PCR로 적정하였다(예컨대, 문헌[Lock, M., et al. (2014) Hum. Gene Ther. Methods 25:115-25] 참조).
10개의 정제된 벡터를 2마리의 개별 동물에 주사하기 위해 동일한 게놈 복제물 양으로 풀링하였고: 전달된 총 용량은 IV 전달을 통한 2e13 GC/㎏ 및 척추강내 공간으로 대조내(ICM) 전달을 통한 3e13 GC/동물이었다. 주사 30일 후에 동물을 희생시켰고 하류 이식유전자 RNA 발현 분석을 위해 RNAlater(QIAGEN)에서 모든 조직을 수확하였다.
동물
모든 동물 절차는 펜실베이니아 대학교의 동물실험 위원회의 승인을 받았다. 필리핀 원숭이(마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))를 Bristol Meyers Squibb(미국)에서 기증받았다. 동물을 스테인리스-강 압착 백 케이지가 있는, 필라델피아 아동 병원(미국 펜실베이니아주 필라델피아 소재)의 실험실 동물 관리 국제 인증 비인간 영장류 연구 프로그램 시설의 평가 및 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International-accredited Nonhuman Primate Research Program facility)에 수용하였다. 동물은 음식 대접, 시각 및 청각 자극, 조종, 및 사회적 상호작용과 같은 다양한 강화를 받았다.
10세 수컷 8㎏ 동물을 ICM 연구에 사용하였다. 6세 수컷 6.98㎏ 동물을 IV 연구에 사용하였다. 이 동물을 AAV-중화 항체의 존재에 대해 스크리닝하였고, 기준선에서 AAV6, AAV8, 및 AAVrh32.33에 대해 혈청음성이었다. 기준선에서, 이 동물은 중화 항체 역가가 AAV7 및 AAV9에 대해 각각 1:5 및 1:10이었다.
ICM 주사 절차
마취된 원숭이를 머리를 앞으로 구부린 상태에서 측와위 자세로 X-선 테이블 위에 놓았다. 무균 기법을 사용하여 CSF 흐름이 관찰될 때까지 21 G 내지 27 G, 1 인치 내지 1.5 인치 Quincke 척추 바늘(Becton Dickinson, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크 소재)을 후두하 공간으로 진행시켰다. 기준선 분석을 위해 1㎖의 CSF를 수집하였다. 뇌간의 잠재적인 손상을 회피하기 위해 형광투시법(OEC 9800 C-arm; GE Healthcare, 영국 리틀 챌폰트 소재)에 의해 바늘의 올바른 위치를 확인하였다. CSF 수집 후, 루어(Luer) 접근 연장 또는 소구경 T 포트 연장 세트 카테터를 척추 바늘에 연결하여 180 mg/㎖ 이오헥솔 조영제(GE Healthcare, 영국 챌폰트 소재)의 투약을 용이하게 하였다. 바늘 위치를 확인한 후, 시험 물품을 포함하는 주사기(1㎖에 해당하는 부피+주사기 부피 및 링커 사강(dead space))를 가요성 링커에 연결하고 30±5초에 걸쳐 주사하였다. 바늘을 제거하고, 천자 부위에 직접 압력을 가하였다.
IV 주사 절차
주입 펌프(Harvard Apparatus, 미국 매사추세츠주 홀리스턴 소재)를 통해 1 ㎖/분의 속도로 말초 정맥 내로 10㎖의 벡터 시험 물품을 원숭이에게 투여하였다.
이식유전자 발현 분석
제조업체의 사양(Life Technologies)에 따라 TRIzol을 사용하여 모든 RNALater-처리 조직으로부터 전체 조직 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 제조업체의 프로토콜(Roche, 스위스 바젤 소재)에 따라 DNase I로 처리하였다. RNeasy Mini Kit(QIAGEN)를 사용하여 RNA를 정제하였다. Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit(Life Technologies)를 사용하여 cDNA의 역전사 합성을 수행하였다. 6 bp 고유 바코드를 측접하는 프라이머 표적화 영역을 사용하여 117 bp 앰플리콘(정방향 프라이머: GGCGAACAGCGGACACCGATATGAA(서열번호 7), 역방향 프라이머: GGCTCTCGTCGCGTGAGAATGAGAA(서열번호 8))을 PCR 증폭시켰고, Q5 High-Fidelity Hot Start DNA Polymerase(New England Biolabs)를 사용하여 다음 사이클링 조건을 사용하여 반응을 수행하였다: 98℃에서 30초; 98℃에서 10초, 72℃에서 17초, 25 사이클; 및 72℃에서 120초 동안 연장. MiSeq Standard 2×150 bp 서열결정 플랫폼(Illumina)을 사용하여 앰플리콘의 서열을 결정하였다.
Expression Analysis 패키지(github.com/ExpressionAnalysis/ea-utils), cutadapt(cutadapt.readthedocs.io/en/stable/), fastx toolkit 패키지(hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/) 및 R 버전 3.3.1.(cran.r-project.org/bin/windows/base/old/3.3.1/)의 fastq-join 프로그램을 사용하여 바코드 판독물을 분석하였다. 조직 샘플 유래의 바코드 발현 카운드 데이터를 각각의 동물에 대한 서열결정된 주사 벡터 물질 유래의 바코드 카운트에 대하여 정규화하고 GraphPad Prism 버전 7.04를 사용하여 각각의 조직 샘플 유래의 바코드 비율을 플롯팅하였다.
NHP에서 ICM AAVrh90 형질도입 특성화 연구
동물 및 연구 설계
모든 동물 절차는 펜실베이니아 대학교의 동물실험 위원회의 승인을 받았다. 6마리의 성체 히말라야 원숭이(마카카 물라타(Macaca mulatta))를 PreLabs를 통해 Orient Bioresources(미국 텍사스주 앨리스 소재)에서 공급받았다. 동물을 스테인리스-강 압착 백 케이지가 있는, 필라델피아 아동 병원(미국 펜실베이니아주 필라델피아 소재)의 실험실 동물 관리 국제 인증 비인간 영장류 연구 프로그램 시설의 평가 및 인증 협회에 수용하였다. 동물은 음식 대접, 시각 및 청각 자극, 조종, 및 사회적 상호작용과 같은 다양한 강화를 받았다.
앞서 기재된 방법을 사용하여 AAVrh90, AAV8, 및 AAV9 캡시드를 AAV.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG 이식유전자와 함께 패키징하였다(예컨대, 문헌[Lock, M., et al. (2010) Hum. Gene Ther. 21:1259-71 및 Lock, M., et al. (2014) Hum. Gene Ther. Methods 25:115-25] 참조). 3e13 GC의 용량을 각각의 동물에 ICM으로 주사하였다. ICM 주사 방법은 상기 기재되어 있다. 주사 14일 후에 동물을 희생시키고 DNA 벡터 생체분포 연구를 위해 조직을 드라이아이스 상에서 수확하였다. 문헌[Recommended Practices for Sampling and Processing the Nervous System (Brain, Spinal Cord, Nerve, and Eye) during Nonclinical General Toxicity Studies. Pardo, et. al. (2012). STP Position Paper]에 따라 뇌를 전체 수집하고, 다듬고, 뇌 몰드를 사용하여 절편화하였다. 조직을 또한 수집하고, 포말린으로 고정한 다음, 조직병리학적 분석을 위해 파라핀으로 포매하였다.
벡터 형질도입의 조직학적 분석
GFP 면역조직화학(IHC)의 경우, 에탄올 및 자일렌을 이용하여 절편을 탈파라핀화하고, 항원 복원을 위해 10mM 시트레이트 완충제(pH 6.0)에서 6분 동안 끓인 다음, 2% H2O2로 15분 동안, 아비딘/비오틴 차단 시약(Vector Laboratories)으로 각각 15분 동안, 그리고 차단 완충제(PBS 중 1% 당나귀 혈청+0.2% 트리톤)로 10분 동안 순차적으로 처리하였다. 그 다음 차단 완충액에서 GFP에 대한 염소 항체(Novus Biologicals, NB100-1770, 1:500)와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하고, PBS에서 세척한 후, 차단 완충액에서 비오틴화된 2차 항-염소 항체(Jackson ImmunoResearch, 1:500)와 함께 45분 동안 인큐베이션하였다. PBS에서 세척한 후, DAB를 기질로서 이용하여 제조업체의 지침에 따라 Vectastain Elite ABC 키트(Vector Laboratories)를 적용하여 결합된 항체를 갈색 침전물로 시각화하였다.
AAV 캡시드의 아미노산 변형에 대한 질량 분석(MS) 분석
시약
중탄산암모늄, 다이티오트레이톨(DTT), 요오도아세트아마이드(IAM)를 Sigma(미국 미주리주 세인트루이스 소재)에서 구입하였다. 아세토나이트릴, 폼산, 및 트라이플루오로아세트산(TFA), 8M 구아니딘 하이드로클로라이드(GndHCl), 및 트립신을 Thermo Fisher Scientific(미국 일리노이주 록퍼드 소재)에서 구입하였다.
트립신 소화
1M DTT 및 1.0M 요오도아세트아마이드의 스톡 용액을 준비하였다. 10mM DTT 및 2M GndHCl의 존재 하에 90℃에서 10분 동안 캡시드 단백질을 변성시키고 환원시켰다. 샘플을 실온까지 냉각시킨 다음, 암실에서 실온에서 30분 동안 30mM IAM으로 알킬화시켰다. 1㎖ DTT를 첨가하여 알킬화 반응을 켄칭하였다. 변성된 단백질 용액에 최종 GndHCl 농도를 200mM로 희석시키는 부피로 20mM 중탄산암모늄(pH 7.5 내지 8)을 첨가한다. 트립신 대 단백질 비율이 1:20이 되도록 트립신 용액을 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시킨다. 소화 후, 최종 0.5%로 TFA를 첨가하여 소화 반응을 켄칭시킨다.
LC-MS/MS
NanoFlex 공급원이 있는 Q Exactive HF(Thermo Fisher Scientific)에 커플링된 Thermo UltiMate 3000 RSLC 시스템(Thermo Fisher Scientific)과 Acclaim PepMap 칼럼(길이 15㎝, 내경 300㎛)을 이용하여 온라인 크로마토그래피를 수행하였다. 온라인 분석 동안, 칼럼 온도를 35℃의 온도로 조절하였다. 이동상 A(0.1% 폼산을 포함하는 MilliQ 물) 및 이동상 B(0.1% 폼산을 포함하는 아세토나이트릴)의 구배를 이용하여 펩타이드를 분리하였다. 구배를 15분에 걸쳐 4% B에서 6% B로, 그 다음 25분 동안 10% B로(총 40분), 그 다음 46분 동안 30% B로(총 86분) 실행하였다. 샘플을 칼럼에 직접 로딩한다. 칼럼 크기는 75㎝×내경 15㎛이고 2 미크론 C18 매질(Acclaim PepMap)로 패킹한다. 로딩, 도입, 및 세척 단계로 인해, LC-MS/MS 실행에 대한 총 시간은 약 2시간이었다.
조사 스캔(200 내지 2000 m/z)으로부터의 가장 풍부한 서열결정전 전구체 이온을 동력학적으로 선택하는 Q Exactive HF에 대한 데이터 의존적인 상위 20 방법을 사용하여 MS 데이터를 획득하였다. 예측된 자동 이득 제어로 결정된 1e5 이온의 목표 값을 이용한 고 에너지 충돌 분열 단편화를 통해서 서열결정을 수행하였고, 4 m/z의 창으로 전구체의 단리를 수행하였다. m/z 200에서 120,000의 분해능으로 조사 스캔을 획득하였다. 50㎳의 최대 이온 주입 시간 및 30의 정규화된 충돌 에너지를 이용하여 m/z 200에서 30,000으로 HCD 스펙트럼에 대한 분해능을 설정하였다. S-렌즈 RF 수준을 50에서 설정하여, 소화로부터 펩타이드에 의해서 점유된 m/z 영역의 최적의 전달을 제공하였다. 단편화 선택으로부터 단일, 미배정, 또는 6 및 더 높은 전하 상태를 가지는 전구체 이온을 제외하였다.
데이터 처리
BioPharma Finder 1.0 소프트웨어(Thermo Fischer Scientific)를 획득된 모든 데이터의 분석에 사용하였다. 펩타이드 맵핑을 위해서, 고정된 변형으로서 설정된 카바마이도메틸화; 및 가변 변형으로서 설정된 산화, 탈아마이드화, 및 인산화, 10 ppm 질량 정확도, 높은 프로테아제 특이성 및 MS/MS 스펙트럼에 대한 0.8의 신뢰 수준을 가지는 단기식 단백질 FASTA 데이터베이스를 사용하여 검색을 수행하였다. 변형된 펩타이드의 질량 면적을, 변형된 펩타이드와 천연 펩타이드의 면적의 합으로 나눔으로써 펩타이드의 변형 백분율을 결정하였다. 가능한 변형 부위의 수를 고려하여, 상이한 부위에서 변형된 동중 원소종이 단일 피크에서 동시에 이동할 수 있다. 결론적으로, 다수의 잠재적인 변형 부위가 있는 펩타이드로부터 기원한 단편 이온을 사용하여 다수의 변형 부위를 위치시키거나 구별할 수 있다. 이러한 경우에, 관찰된 동위원소 패턴 내의 상대 강도를 사용하여 상이한 변형된 펩타이드 이성질체의 상대 풍부도를 구체적으로 결정할 수 있다. 이러한 방법은, 모든 이성질체 종에 대한 단편화 효율성이 동일하고, 변형 부위에 독립적이라고 가정한다. 이러한 접근법은 변형된 구체적인 부위 및 또한 관련된 잠재적인 조합의 정의를 가능하게 한다.
실시예 2: AAV-SGA
아데노-연관 바이러스(AAV)는 이를 유전자 요법을 위한 벡터로서 효과적인 후보로 만드는 비-병원성이고 면역원성이 약한 단일-가닥 DNA 파보바이러스이다. 1세대 AAV(AAV1 내지 6)의 발견 이래로, 본 발명자들의 실험실은 다양한 고등 영장류 종으로부터 다수의 바이러스를 단리하는 노력을 주도하여 왔다. 여기에서 확인된 이러한 2세대 AAV는 영장류-유래 AAV 게놈에 특이적인 보존 영역에 대한 프라이머를 사용하는 벌크 PCR-기반 기법을 사용하여 단리되었다. AAV-SGA를 사용하여, 본 발명자들은 자연 포유동물 숙주에서 AAV의 유전적 변이를 탐구하였다(도 1).
AAV-SGA는 혼합 집단 내로부터 단일 바이러스 게놈을 높은 정확도로 단리하는 데 사용될 수 있는 강력한 기법이다. 이 연구에서, 본 발명자들은 AAV-SGA를 사용하여 히말라야 원숭이 조직 표본으로부터 신규 AAV 게놈을 동정하였다. 신규 바이러스 분리주는 유전적으로 다양하고 클레드 D, E, 및 프린지 클레드로 분류될 수 있다(도 2).
향상된 GFP(eGFP) 유전자를 포함하는 벡터는 신규 캡시드 및 이전에 확인된 대조군 캡시드를 사용하여 생성되었다. 다양한 캡시드를 갖는 벡터를 정맥내(IV)(도 5A) 및 뇌실내(ICV)(도 5C) 전달 경로를 통해 마우스에서 시험하였다. 심장, 골격근, 간, 및 뇌 조직에서 벡터 게놈의 생체분포를 분석하였다(도 5B 및 도 5D). 본 발명자들의 마우스 연구는 신규 캡시드가 전형적으로 클레드-특이적 형질도입 패턴을 나타냄을 보였다(클레드 D 캡시드 제외). 특히, 신규 클레드 E 벡터인 AAVrh.90은 IV 및 ICV 전달 후 말초 기관의 강력한 형질도입을 나타내었다. 이는 AAV8에서도 명백한 바와 같이, 높은 수준의 GFP 검출을 나타내는 간 절편의 조직학에 의해 확인되었다. 근육의 조직학적 분석은 AAVrh.90 벡터의 IV 주사 후 혈관계에서 내피 세포 형질도입을 나타내었다(항-GFP, 항-CD31(내피 세포), 및 신경미세섬유(뉴런)로 염색된 마우스 뇌 절편의 면역형광 이미징에 의해 결정됨).
IM 전달 후 근육 조직의 형질도입을 평가하기 위해 추가적인 연구를 수행하였다. 다양한 캡시드를 갖고 LacZ(도 6A) 또는 mAb를 발현하는 벡터를 IM으로 전달하고 근육 섬유의 염색(LacZ의 경우) 또는 혈청에서의 검출(mAb의 경우)을 통해 이식유전자의 발현을 분석하였다. 도 6B는 LacZ의 검출에 의한 근육 형질도입의 비교를 나타낸다. 클레드 A 벡터(AAV1, AAV6 및 AAVrh.91)가 높은 효율성으로 근육 섬유에 형질도입하는 반면(더 어두운 염색), AAVrh.90에 대해서는 염색이 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다. AAVrh.90을 통한 IM 전달은 AAV8과 비슷한 혈청에서 검출 가능한 mAb의 수준을 초래하였다(도 7). 도 8은 mAb 및 LacZ 벡터의 다양한 제조에 대한 수율을 나타낸다. 이식유전자 둘 다에 대해, AAVrh.90는 AAV8과 비교하여 더 높은 수율을 가졌다.
실시예 3: 바코딩된 이식유전자 시스템을 사용한 비인간 영장류에서 신규 AAV 자연 분리주의 형질도입 평가
아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 임상 적용에서 안전하고 효과적인 유전자 전달 비히클인 것으로 나타났지만, 바이러스에 대한 기존 면역력에 의해 방해받을 수 있고 제한된 조직 친화성을 가질 수 있다. 본 발명자들은 바코딩된 이식유전자 방법이 다수의 AAV 혈청형에 의해 단일 동물에서 다양한 조직의 형질도입을 동시에 비교하는 데 효과적임을 입증하였다. 이러한 기법은 사용되는 동물의 수를 감소시키고 외래 이식유전자-관련 면역 반응을 방지한다. 따라서, 신규 캡시드 및 이의 각각의 원형 클레드 구성원 대조군(AAV6.2, AAV7, AAV8, AAVrh32.33, 및 AAV9)을 전사체의 폴리A 신호 이전에 변형된 eGFP 이식유전자 및 고유한 6개 염기쌍 바코드를 포함하는 벡터로 만들었다(도 9). ATG 서열 모티프의 결실에 의해 이식유전자를 변형시켜 폴리펩타이드 번역과 그 결과에 따른 외래 단백질에 대한 면역 반응을 방지하였다. 동일한 양으로 벡터를 풀링하고 필리핀 원숭이에 IV 또는 ICM 주사하여(총 용량: 2e13 GC/㎏ IV 및 3e13 GC ICM) 신규 캡시드의 전신 및 중추신경계 형질도입 패턴을 평가하였다. IV 주사한 동물은 기준선에서 AAV6, AAV8, 및 AAVrh32.33에 대해 혈청음성이었고 중화 항체 역가가 AAV7 및 AAV9에 대하여 각각 1:5 및 1:10이었다.
AAVrh.90 및 AAVrh.91 둘 다 IV 전달 후 높은 효율로 말초 기관에 형질도입되었다(도 10A). IV 전달 후 조직의 분석은 AAVrh.90 캡시드가 NHP 간, 심장, 골격근, 신장, 및 췌장에서 시험한 다른 모든 캡시드(신규 및 대조군)보다 더 높은 수준의 발현을 가짐을 밝혔다(도 10A). AAVrh.90은 또한 IV 전달 후 시험한 다른 캡시드보다 더 높은 효율로 CNS 조직에 형질도입되었다(도 10B).
AAVrh.90은 ICM 주사 후 (AAV8을 포함하여 시험한 다른 벡터에 비해) NHP의 뇌에서 형질도입 수준의 증가를 나타내지 않았다. 조직학적 연구는 또한 AAVrh.90이 AAV9보다 더 낮은 수준으로 뉴런 및 성상교세포에 둘 다 형질도입하고 3e13 GC/동물의 용량에서 뇌의 뇌실 안에 막을 형성하는 뇌실막 세포에 형질도입하지 않았다는 것을 나타내었다. 이는 AAV9와 비교하여 높은 수준으로 뉴런 및 성상교세포를 둘 다 형질도입하고 척수에서 강력한 운동 뉴런 형질도입을 나타내는 신규 클레드 A 변이체인 AAVrh.91과 대조적이었다. IHC 염색은 또한 AAVrh.91 및 AAV1 둘 다 뇌의 뇌실 안에 막을 형성하는 뇌실막 세포의 효율적인 형질도입을 나타내었음을 밝혔다.
신규 및 대조군 캡시드의 소규모 제조로부터의 수율 평가는 AAVrh.90이 AAV8과 비슷한 수율을 나타냄을 나타내었다(도 11). AAVrh.90 캡시드를 앞서 기재된 바와 같이 탈아마이드화 및 다른 변형에 대해 분석하였다(PCT/US19/019804호 및 PCT/US19/2019/019861호 참조). 도 12A 및 도 12B에 나타낸 바와 같이, 결과는 AAVrh.90이 고도로 탈아마이드화된 4개의 아미노산(N57, N263, N385, N514)을 가지고, 이는 아스파라긴-글리신 쌍에서 아스파라긴에 해당한다(서열번호 2에서와 같은 AAVrh.90의 넘버링). 더 낮은 탈아마이드화 백분율은 잔기 N94, N305, N499, 및 N599에서 일관되게 관찰되었을 뿐만 아니라, S149에서 인산화가 관찰되었다.
(서열목록 자유 텍스트)
숫자 식별자 <223> 하에 자유 텍스트를 포함하는 서열에 대해 하기 정보가 제공된다.
Figure pct00005
본 명세서에 인용된 모든 문헌은 참조에 의해 원용된다. 2019년 10월 21일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/924,095호, 2019년 10월 10일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/913,314호, 및 2019년 4월 29일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/840,184호는 서열목록과 함께 전문이 참조에 의해 포함된다. 명칭이 "19-8901PCT1_ST25.txt"인 본 명세서와 함께 제출된 서열목록 및 그 안의 서열 및 텍스트는 참조에 의해 원용된다. 본 발명이 소정의 실시형태를 참조하여 기재되었지만, 본 발명의 사상을 벗어나지 않으면서 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 이와 같은 변형은 첨부된 청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> The Trustees of the University of Pennsylvania <120> NOVEL AAV CAPSIDS AND COMPOSITIONS CONTAINING SAME <130> 19-8901PCT1 <140> PCT/US2020/030273 <141> 2020-04-28 <150> US 62/924,095 <151> 2019-10-21 <150> US 62/913,314 <151> 2019-10-10 <150> US 62/840,184 <151> 2019-04-29 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2217 <212> DNA <213> adeno-associated virus rh.90 <220> <221> CDS <222> (1)..(2217) <400> 1 atg gct gcc gat ggt tat ctt cca gat tgg ctc gag gac aac ctc tct 48 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 gag ggc att cgc gag tgg tgg gac ctg aaa cct gga gcc cca aaa ccc 96 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 aaa gcc aac cag caa aag cag gac gac ggc cgg ggt ctg gtg ctt cct 144 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 ggc tac aag tac ctc gga ccc ttc aac gga ctc gac aag ggg gag ccc 192 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 gtc aac gcg gcg gac gca gcg gcc ctc gag cac gac aag gcc tac gac 240 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 cag cag ctg cag gcg ggt gat aat ccg tac ctg cgg tat aac cac gcc 288 Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 gac gcc gag ttt cag gag cgt ctg caa gaa gat acg tca ttt ggg ggc 336 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 aac ctc ggg cga gca gtc ttc cag gcc aag aag cgg gtt ctc gaa cct 384 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 ctc ggt ctg gtt gag gaa ggc gct aag acg gct cct gga aag aag aga 432 Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 ccg gta gag cca tca cca cag cgt tcc ccc gac tcc tcc acg ggc atc 480 Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160 ggc aag aaa ggc cag cag ccc gcc aga aag aga ctc aat ttc ggt cag 528 Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 165 170 175 act ggc gac tca gag tca gtc ccc gac cct caa cct ctc gga gaa cct 576 Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro 180 185 190 cca gca gcg ccc tct agt gtg gga tct ggt aca atg gct gca ggc ggt 624 Pro Ala Ala Pro Ser Ser Val Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly 195 200 205 ggc gca cca atg gca gac aat aac gaa ggt gcc gac gga gtg ggt agt 672 Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser 210 215 220 tcc tcg gga aat tgg cat tgc gat tcc aca tgg ctg ggc gac aga gtc 720 Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 225 230 235 240 atc acc acc agc acc cga acc tgg gcc ctg ccc acc tac aac aac cac 768 Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 245 250 255 ctc tac aag caa atc tcc aac ggg acc tcg gga ggc agc acc aac gac 816 Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp 260 265 270 aac acc tac ttc ggc tac agc acc ccc tgg ggg tat ttt gac ttt aac 864 Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 275 280 285 aga ttc cac tgc cac ttc tca cca cgt gac tgg cag cga ctt atc aac 912 Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 290 295 300 aac aac tgg gga ttc cgg ccc aag aga ctc agc ttc aag ctc ttc aac 960 Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn 305 310 315 320 atc cag gtc aag gag gtc acg caa aat gaa ggc acc aag acc atc gcc 1008 Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 325 330 335 aat aac ctc acc agc acc atc cag gtg ttt acg gac tcg gaa tac cag 1056 Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln 340 345 350 ctg cca tac gtc ctc ggc tct gcc cac cag ggc tgc ctg cct ccg ttc 1104 Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe 355 360 365 ccg gcg gac gtc ttc atg att cct cag tat ggc tac ctg acg ctg aac 1152 Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 370 375 380 aac gga agt cag gcc gtg ggc cgt tcc tcc ttc tac tgc ctg gag tac 1200 Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 385 390 395 400 ttt ccc tct cag atg cta aga acg ggc aac aac ttc tcc ttc agc tat 1248 Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Ser Phe Ser Tyr 405 410 415 acc ttc gag gac gtg cct ttc cac agc agc tac gcg cac agc cag agc 1296 Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser 420 425 430 ctg gac cgg ctg atg aat ccc ctc att gac cag tac ctg tac tac ctg 1344 Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu 435 440 445 tcg cgg aca caa tcc aca gga ggc aca gcg gga act cag cag ttg ctg 1392 Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu 450 455 460 ttt tct cag gcc ggg cct aac aac atg tct gct cag gcc aaa aac tgg 1440 Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp 465 470 475 480 cta ccc gga cct tgt tat cgg cag caa cgt gtt tcc acg aca ctg tcg 1488 Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser 485 490 495 caa aac aac aac agc aac ttt gcc tgg acc ggt gcc acc aaa tac cac 1536 Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His 500 505 510 ctg aac gga aga gac tct ctg gta aat ccg ggt gtc gcc atg gca acc 1584 Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr 515 520 525 aac aag gac gac gag gac cgc ttc ttc cca tcc agc ggc atc ctc atg 1632 Asn Lys Asp Asp Glu Asp Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Ile Leu Met 530 535 540 ttt ggc aag cag ggg gct gga aaa gac aac gtg gac tat agc aac gtg 1680 Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Asn Val 545 550 555 560 atg cta acc agc gag gaa gaa atc aag acc act aac cct gtg gcc aca 1728 Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr 565 570 575 gaa cag tat ggt gtg gtg gcg gat aac ctg cag cag caa aac aca gct 1776 Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala 580 585 590 cct att gtg ggg gcc gtc aac agc caa gga gcc tta cct ggc atg gtt 1824 Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val 595 600 605 tgg cag aac cgg gac gtg tac ctg cag ggt ccc atc tgg gcc aag att 1872 Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile 610 615 620 cct cac acg gat ggt aac ttt cac ccg tct cct ctc atg ggc ggc ttt 1920 Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe 625 630 635 640 gga ctt aaa cat ccg cct cct cag atc ctg atc aag aac act ccc gtt 1968 Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val 645 650 655 cct gcg gat cct cca acg gcg ttc aac cag gcc aag ctg aac tct ttc 2016 Pro Ala Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Gln Ala Lys Leu Asn Ser Phe 660 665 670 atc acg cag tac agc acc gga caa gtc agc gtg gag atc gag tgg gag 2064 Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu 675 680 685 ctg cag aag gag aac agc aag cgc tgg aac cca gag att cag tat acc 2112 Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr 690 695 700 tcc aac tac tac aaa tct aca aat gtg gac ttt gct gtt aat act gag 2160 Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu 705 710 715 720 ggt gtt tac tct gag cct cgc ccc att ggc acc cgt tac ctc acc cgt 2208 Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 725 730 735 aat ctg taa 2217 Asn Leu <210> 2 <211> 738 <212> PRT <213> adeno-associated virus rh.90 <400> 2 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160 Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 165 170 175 Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro 180 185 190 Pro Ala Ala Pro Ser Ser Val Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly 195 200 205 Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser 210 215 220 Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 225 230 235 240 Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 245 250 255 Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp 260 265 270 Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 275 280 285 Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 290 295 300 Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn 305 310 315 320 Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 325 330 335 Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln 340 345 350 Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe 355 360 365 Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 370 375 380 Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 385 390 395 400 Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Ser Phe Ser Tyr 405 410 415 Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser 420 425 430 Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu 435 440 445 Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu 450 455 460 Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp 465 470 475 480 Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser 485 490 495 Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His 500 505 510 Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr 515 520 525 Asn Lys Asp Asp Glu Asp Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Ile Leu Met 530 535 540 Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Asn Val 545 550 555 560 Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr 565 570 575 Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala 580 585 590 Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val 595 600 605 Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile 610 615 620 Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe 625 630 635 640 Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val 645 650 655 Pro Ala Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Gln Ala Lys Leu Asn Ser Phe 660 665 670 Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu 675 680 685 Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr 690 695 700 Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu 705 710 715 720 Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 725 730 735 Asn Leu <210> 3 <211> 2217 <212> DNA <213> adeno-associated virus 8 <220> <221> CDS <222> (1)..(2217) <400> 3 atg gct gcc gat ggt tat ctt cca gat tgg ctc gag gac aac ctc tct 48 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 gag ggc att cgc gag tgg tgg gcg ctg aaa cct gga gcc ccg aag ccc 96 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 aaa gcc aac cag caa aag cag gac gac ggc cgg ggt ctg gtg ctt cct 144 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 ggc tac aag tac ctc gga ccc ttc aac gga ctc gac aag ggg gag ccc 192 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 gtc aac gcg gcg gac gca gcg gcc ctc gag cac gac aag gcc tac gac 240 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 cag cag ctg cag gcg ggt gac aat ccg tac ctg cgg tat aac cac gcc 288 Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 gac gcc gag ttt cag gag cgt ctg caa gaa gat acg tct ttt ggg ggc 336 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 aac ctc ggg cga gca gtc ttc cag gcc aag aag cgg gtt ctc gaa cct 384 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 ctc ggt ctg gtt gag gaa ggc gct aag acg gct cct gga aag aag aga 432 Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 ccg gta gag cca tca ccc cag cgt tct cca gac tcc tct acg ggc atc 480 Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160 ggc aag aaa ggc caa cag ccc gcc aga aaa aga ctc aat ttt ggt cag 528 Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 165 170 175 act ggc gac tca gag tca gtt cca gac cct caa cct ctc gga gaa cct 576 Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro 180 185 190 cca gca gcg ccc tct ggt gtg gga cct aat aca atg gct gca ggc ggt 624 Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly 195 200 205 ggc gca cca atg gca gac aat aac gaa ggc gcc gac gga gtg ggt agt 672 Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser 210 215 220 tcc tcg gga aat tgg cat tgc gat tcc aca tgg ctg ggc gac aga gtc 720 Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 225 230 235 240 atc acc acc agc acc cga acc tgg gcc ctg ccc acc tac aac aac cac 768 Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 245 250 255 ctc tac aag caa atc tcc aac ggg aca tcg gga gga gcc acc aac gac 816 Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp 260 265 270 aac acc tac ttc ggc tac agc acc ccc tgg ggg tat ttt gac ttt aac 864 Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 275 280 285 aga ttc cac tgc cac ttt tca cca cgt gac tgg cag cga ctc atc aac 912 Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 290 295 300 aac aac tgg gga ttc cgg ccc aag aga ctc agc ttc aag ctc ttc aac 960 Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn 305 310 315 320 atc cag gtc aag gag gtc acg cag aat gaa ggc acc aag acc atc gcc 1008 Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 325 330 335 aat aac ctc acc agc acc atc cag gtg ttt acg gac tcg gag tac cag 1056 Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln 340 345 350 ctg ccg tac gtt ctc ggc tct gcc cac cag ggc tgc ctg cct ccg ttc 1104 Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe 355 360 365 ccg gcg gac gtg ttc atg att ccc cag tac ggc tac cta aca ctc aac 1152 Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 370 375 380 aac ggt agt cag gcc gtg gga cgc tcc tcc ttc tac tgc ctg gaa tac 1200 Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 385 390 395 400 ttt cct tcg cag atg ctg aga acc ggc aac aac ttc cag ttt act tac 1248 Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr 405 410 415 acc ttc gag gac gtg cct ttc cac agc agc tac gcc cac agc cag agc 1296 Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser 420 425 430 ttg gac cgg ctg atg aat cct ctg att gac cag tac ctg tac tac ttg 1344 Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu 435 440 445 tct cgg act caa aca aca gga ggc acg gca aat acg cag act ctg ggc 1392 Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn Thr Gln Thr 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Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu 675 680 685 ctg cag aag gaa aac agc aag cgc tgg aac ccc gag atc cag tac acc 2112 Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr 690 695 700 tcc aac tac tac aaa tct aca agt gtg gac ttt gct gtt aat aca gaa 2160 Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu 705 710 715 720 ggc gtg tac tct gaa ccc cgc ccc att ggc acc cgt tac ctc acc cgt 2208 Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 725 730 735 aat ctg taa 2217 Asn Leu <210> 4 <211> 738 <212> PRT <213> adeno-associated virus 8 <400> 4 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro 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Gly Thr Lys Tyr His 500 505 510 Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr 515 520 525 His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile 530 535 540 Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val 545 550 555 560 Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr 565 570 575 Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala 580 585 590 Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val 595 600 605 Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile 610 615 620 Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe 625 630 635 640 Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val 645 650 655 Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe 660 665 670 Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu 675 680 685 Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr 690 695 700 Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu 705 710 715 720 Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 725 730 735 Asn Leu <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 5 gctgcgtcaa ctggaccaat gagaac 26 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 6 cgcagagacc aaagttcaac tgaaacga 28 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 7 ggcgaacagc ggacaccgat atgaa 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 8 ggctctcgtc gcgtgagaat gagaa 25 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA target sequence <400> 9 agtgaattct accagtgcca ta 22 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA target sequence <400> 10 agtgtgagtt ctaccattgc caaa 24

Claims (28)

  1. 재조합 아데노-연관 바이러스(recombinant adeno-associated virus: rAAV)로서, 서열번호 2(AAVrh.90)의 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질(capsid protein)을 포함하는 AAV 캡시드를 갖고, 상기 캡시드에 이종 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈을 패키징한, rAAV.
  2. 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)로서, 서열번호 1의 AAV 캡시드 서열, 또는 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 공유하는 서열의 발현에 의해 생성되는 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 갖고, 상기 캡시드에 이종 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈을 패키징한, rAAV.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 캡시드 단백질은 서열번호 1에 의해 인코딩되는, rAAV.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 5' AAV 반전 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR) 및 3' AAV ITR, 및 표적 세포에서 이종 핵산 서열에 의해 인코딩되는 산물의 발현을 지시하는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 이종 핵산 서열을 더 포함하는, rAAV.
  5. 제4항에 있어서, 상기 AAV ITR 서열은 AAVrh.90 이외의 AAV 유래인, rAAV.
  6. 제5항에 있어서, 상기 ITR 서열은 AAV2 유래인, rAAV.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 캡시드는,
    (1) 서열번호 2의 1 내지 738번의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로부터의 발현에 의해 생성되는 vp1 단백질, 서열번호 1로부터 생성되는 vp1 단백질, 또는 서열번호 2의 1 내지 738번의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1과 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성되는 vp1 단백질로부터 선택되는 AAVrh.90 vp1 단백질의 이종 집단,
    서열번호 2의 적어도 약 138 내지 738번 아미노산의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로부터의 발현에 의해 생성되는 vp2 단백질, 서열번호 1의 적어도 412 내지 2214번 뉴클레오타이드를 포함하는 서열로부터 생성되는 vp2 단백질, 또는 서열번호 2의 적어도 약 138 내지 738번 아미노산의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1의 적어도 412 내지 2214번 뉴클레오타이드와 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성되는 vp2 단백질로부터 선택되는 AAVrh.90 vp2 단백질의 이종 집단,
    서열번호 2의 적어도 약 204 내지 738번 아미노산의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로부터의 발현에 의해 생성되는 vp3 단백질, 서열번호 1의 적어도 610 내지 2214번 뉴클레오타이드를 포함하는 서열로부터 생성되는 vp3 단백질, 또는 서열번호 2의 적어도 약 204 내지 738번 아미노산의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1의 적어도 610 내지 2214번 뉴클레오타이드와 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성되는 vp3 단백질로부터 선택되는 AAVrh.90 vp3의 이종 집단; 및/또는
    (2) 서열번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열의 산물인 vp1 단백질의 이종 집단, 서열번호 2의 적어도 약 138 내지 738번 아미노산의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열의 산물인 vp2 단백질의 이종 집단, 및 서열번호 2의 적어도 204 내지 738번 아미노산을 인코딩하는 핵산 서열의 산물인 vp3 단백질의 이종 집단으로서, 상기 vp1, vp2 및 vp3 단백질은 서열번호 2의 아스파라긴-글리신 쌍에서 적어도 2개의 고도로 탈아마이드화된 아스파라긴(N)을 포함하고 선택적으로 다른 탈아마이드화된 아미노산을 포함하는 하위집단을 더 포함하는 아미노산 변형을 가지는 하위집단을 포함하고, 탈아마이드화는 아미노산 변화를 초래하는, 상기 vp1 단백질의 이종 집단, 상기 vp2 단백질의 이종 집단 및 상기 vp3 단백질의 이종 집단
    을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는, rAAV.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1과 적어도 80% 내지 적어도 99% 동일한 서열인, rAAV.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 1과 적어도 80% 내지 97% 동일한, rAAV.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV ITR 서열은 AAVrh.90 이외의 AAV 유래의 5' ITR 및 3' ITR인, rAAV.
  11. 제10항에 있어서, 상기 ITR 서열은 AAV2 유래인, rAAV.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 rAAV 및 생리학적으로 양립 가능한 담체, 완충제, 아쥬반트 및/또는 희석제를 포함하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 척추강내 전달용으로 제형화되고 벡터 게놈은 중추신경계로의 전달을 위한 유전자 산물을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 정맥내 전달용으로 제형화된, 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 비강내 또는 근육내 전달용으로 제형화된, 조성물.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 필요로 하는 대상체에게 원하는 유전자 산물을 전달하기 위한, rAAV.
  17. 필요로 하는 대상체에게 원하는 유전자 산물을 전달하기 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 또는 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  18. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 rAAV를 생성하는 데 유용한 rAAV 생성 시스템으로서,
    (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열;
    (b) AAV 캡시드 내로의 패키징에 적합한 핵산 분자로서, 적어도 하나의 AAV 반전 말단 반복부(ITR) 및 숙주 세포에서 산물의 발현을 지시하는 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 산물을 인코딩하는 비-AAV 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자; 및
    (c) rAAV 캡시드 내로 핵산 분자의 패키징을 허용하기에 충분한 AAV rep 기능 및 헬퍼 기능
    을 포함하는, rAAV 생성 시스템.
  19. 제18항에 있어서, 상기 (a)의 핵산 서열은 적어도 서열번호 1, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1과 적어도 70% 내지 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, rAAV 생성 시스템.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 세포 배양물은 인간 배아 신장 293 세포를 포함하는, rAAV 생성 시스템.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV rep는 AAVrh.90 이외의 AAV 유래인, rAAV 생성 시스템.
  22. 제21항에 있어서, 상기 AAV rep는 AAV2 유래인, rAAV 생성 시스템.
  23. rAAV를 생성하는 방법으로서, (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산 분자; (b) 기능성 rep 유전자; (c) AAV 5' ITR, AAV 3' ITR, 및 이식유전자를 포함하는 미니유전자; 및 (d) AAV 캡시드 내로 미니유전자의 패키징을 허용하기에 충분한 헬퍼 기능을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, rAAV를 생성하는 방법.
  24. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 rAAV로 형질도입된 숙주 세포.
  25. 이식유전자를 세포에 전달하는 방법으로서, 상기 세포를 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 rAAV와 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 rAAV는 이식유전자를 포함하는, 방법.
  26. AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 상기 핵산 서열은 적어도 서열번호 1, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1과 적어도 70% 내지 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  27. 제26항에 있어서, 상기 분자는 플라스미드인, 핵산 분자.
  28. 제26항 또는 제27항에 따른 핵산 분자로 형질감염된 숙주 세포.
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