JP2022530544A - 新規ａａｖカプシドおよびそれを含む組成物 - Google Patents

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Abstract

新規のＡＡＶカプシドおよびそれを含むｒＡＡＶが本明細書で提供される。一実施形態では、新規のＡＡＶカプシドを用いるベクターは、従来技術のＡＡＶと比較して、選択された標的組織の形質導入の増加を示す。【選択図】図１

Description

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト遺伝子療法において非常に有望であり、長期的な遺伝子発現を提供する能力および病原性の欠如により、様々な研究において肝臓、筋肉、心臓、脳、眼、腎臓、および他の組織を標的とするために広く使用されている。ＡＡＶは、パルボウイルス科に属し、それぞれ、２つの逆位末端反復に隣接する一本鎖ＤＮＡを含む。数十の天然に存在するＡＡＶカプシドが報告されており、その固有のカプシド構造により、異なる細胞型および臓器を認識し、形質導入することができる。
１９８１年に最初の試験が開始されて以来、ＡＡＶベクターベースの遺伝子療法の臨床試験において、ベクターに関連する毒性は報告されていない。臨床試験におけるＡＡＶベクターのこれまで蓄積されてきた安全記録は、実証された有効性と組み合わせて、ＡＡＶが遺伝子送達のための有望なプラットフォームであることを示す。別の魅力的な特徴は、ＡＡＶが、Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子とともに、小さなゲノム（約４．７ｋｂ）および単純な遺伝的成分－逆位末端反復（ＩＴＲ）を有する一本鎖ＤＮＡウイルスであるため、比較的容易に操作されることである。ＡＡＶベクターには、ＩＴＲおよびＡＡＶカプシドタンパク質のみが必要であり、ＩＴＲは、ベクター産生のための複製およびパッケージングのシグナルとして機能し、カプシドタンパク質は、ベクターゲノムＤＮＡを収容するためのカプシドを形成するだけでなく、ベクターゲノムを標的の細胞および組織に送達するための組織向性（ｔｉｓｓｕｅ ｔｒｏｐｉｓｍ）を決定する。
ＡＡＶは、免疫原性が低く、かつ非病原性の性質であるため、遺伝子療法のための最も効果的なベクター候補のうちの１つである。しかしながら、効率的な遺伝子導入を可能にするにもかかわらず、現在診療所で使用されているＡＡＶベクターは、ウイルスに対する既存の免疫および制限された組織向性によって妨げられ得る。新しいより効果的なＡＡＶベクターが必要とされている。
一実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシド（ＡＡＶｒｈ．９１）を有し、カプシド中に異種核酸配列を含むベクターゲノムがパッケージングされている、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が本明細書に提供される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号１もしくは３のＡＡＶカプシド配列、または配列番号１もしくは３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を共有する配列の発現によって産生されるカプシドタンパク質を含むカプシドを有し、カプシド中に異種核酸配列を含むベクターゲノムがパッケージングされている。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶが本発明で提供され、ＡＡＶカプシドが、（１）配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号１もしくは３から産生されるｖｐ１タンパク質、または配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１もしくは３と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ．９１ｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号１もしくは３の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、または配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１もしくは３の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タン
パク質から選択されるＡＡＶｒｈ．９１ｖｐ２タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ３タンパク質、配列番号１もしくは３の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、または配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１もしくは３の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ．９１ｖｐ３タンパク質の異種集団、ならびに／あるいは（２）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、および配列番号２の少なくともアミノ酸２０３～７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団、を含むＡＡＶカプシドタンパク質を含み、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質が、配列番号２のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団をさらに含み、脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす。
別の実施形態では、組成物が本明細書に提供され、少なくともｒＡＡＶと、生理学的に適合する担体、緩衝液、アジュバント、および／または希釈剤とを含む。特定の実施形態では、組成物は、髄腔内送達用に製剤化され、ベクターゲノムは、中枢神経系への送達用の遺伝子産物をコードする核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、組成物は、静脈内送達、鼻腔内送達、および／または筋肉内送達用に製剤化される。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶを産生するために有用なシステムが提供される。そのシステムは、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列と、（ｂ）ＡＡＶカプシドへのパッケージングに好適な核酸分子であって、核酸分子が、少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、および宿主細胞で産物の発現を指示する配列と作動可能に連結された遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含む、核酸分子と、（ｃ）ｒＡＡＶカプシド中への核酸分子のパッケージングを可能にするのに十分なＡＡＶのｒｅｐ機能およびヘルパー機能と、を含む。
特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶを生成する方法が提供される。本方法は、宿主細胞を培養するステップを含み、宿主細胞が、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸分子と、（ｂ）機能的なｒｅｐ遺伝子と、（ｃ）ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、ＡＡＶ ３’ＩＴＲ、および導入遺伝子を含むミニ遺伝子と、（ｄ）ＡＡＶカプシドへの前記ミニ遺伝子のパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能と、を含む。
さらに別の実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶ、発現カセット、または核酸分子を含む宿主細胞が提供される。
特定の実施形態では、導入遺伝子を細胞に送達する方法が提供される。本方法は、細胞を本明細書に記載されるｒＡＡＶと接触させるステップを含み、ｒＡＡＶが、導入遺伝子を含む。
これらの組成物および方法の他の態様および利点を、以下の詳細な説明においてさらに説明される。
ＡＡＶ－ＳＧＡのワークフローの図を示す。ゲノムＤＮＡを、アカゲザルの組織試料から単離し、ＡＡＶカプシド遺伝子の存在についてスクリーニングした。ＡＡＶ陽性のＤＮＡを、エンドポイント希釈し、さらなるラウンドのＰＣＲに供した。ポアソン分布によれば、ウェルの３０％以下でＰＣＲ産物を得るＤＮＡ希釈は、その時の陽性ＰＣＲ８０％当たり１つの増幅可能なＤＮＡ鋳型を含む。陽性アンプリコンを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ２ｘ１５０または２ｘ２５０ペアエンド配列決定プラットフォームを使用して配列決定し、得られたリードを、ＳＰＡｄｅｓアセンブラを使用してデノボアセンブリを行った。 新規のＡＡＶ天然分離株および代表的なクレード対照のＤＮＡゲノム配列の隣接結合系統樹を示す図である。 ＡＡＶｒｈ．９１（配列番号１）、ＡＡＶｒｈ．９１ｅｎｇ（配列番号３）、ＡＡＶ６．２（配列番号５）、およびＡＡＶ１（配列番号７）のカプシドの核酸配列の整列を示す。 ＡＡＶｒｈ．９１（配列番号２）、ＡＡＶ６．２（配列番号６）、およびＡＡＶ１（配列番号８）のカプシドのアミノ酸配列の整列を示す。 注入１４日後のマウス組織におけるｅＧＦＰ導入遺伝子の生体分布を示す。（図５Ａおよび図５Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、マウス当たり１ｅ１２ＧＣの用量で、ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ＲＢＧ（ｎ＝５）を含むＡＡＶカプシドをＩＶ注入した。（図５Ｃおよび図５Ｄ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、マウス当たり１ｅ１１ＧＣの用量で、ＣＢ７．ＣＩ．ＥＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ＲＢＧ（ｎ＝５）を含む様々なＡＡＶカプシド（クレードＡベクター、６．９ｅ１０ＧＣ／マウスで投与）を脳室内ＩＣＶ注入した。値は、平均値±ＳＤとして表される。＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１。 ＡＡＶベクターのＩＭ送達後の筋肉におけるＬａｃＺ発現の分析を示す。様々なカプシドを有し、ＣＭＶプロモーターの下でＬａｃＺを発現する３ｅ９ＧＣのベクターをマウスに投与した。２０日目に筋肉組織を採取し、Ｘ－ｇａｌ染色（より濃い染色）により導入遺伝子の発現を評価した。 様々なＡＡＶベクターのＩＭ送達後の血清中のｍＡｂのレベルを示す。Ｂ６マウスに、ｔＭＣＫプロモーターの下で３Ｄ６抗体を発現するベクターを１ｅ１１ＧＣ投与した。 ３Ｄ６またはＬａｃＺ導入遺伝子を発現するベクターの（ＡＡＶ８に対する）収率を示す。 ＮＨＰにおけるプールされたバーコード化ベクター研究の実験設計を示す（図１０Ａ～図１０Ｃに示されるデータ）。５つの新規のカプシドおよび５つの対照（ＡＡＶｒｈ．９０、ＡＡＶｒｈ９．１、ＡＡＶｒｈ．９２、ＡＡＶｒｈ．９３、ＡＡＶｒｈ．９１．９３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ７、およびＡＡＶ９）は、固有の６ｂｐバーコードを有する修飾ＡＴＧ枯渇ＧＦＰ導入遺伝子を用いてパッケージングされた。ベクターを、等量でプールし、カニクイザルにＩＶまたはＩＣＭ注入して（総用量：２ｅ１３ＧＣ／ｋｇ ＩＶおよび３ｅ１３ＧＣ ＩＣＭ）。ＩＶ注入された動物は、ベースラインではＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶｒｈ３２．３３に対して血清陰性であり、ＡＡＶ７およびＡＡＶ９に対して、それぞれ１：５および１：１０の中和抗体力価を有した。 は、ＩＶ送達（図１０Ａおよび図１０Ｂ）およびＩＣＭ送達（図１０Ｃ）後のバーコード化カプシドのＲＮＡ発現の分析を示すグラフである。ＩＶ投与－総用量２ｅ１３ＧＣ／ｋｇ、３０日目に剖検（この動物は、ベースラインでは低レベルのＡＡＶ７およびＡＡＶ９ Ｎａｂを有した）。ＩＣＭ投与－３ｅ１３ＧＣ／動物、３０日目に剖検。各組織ＲＮＡ試料中のバーコード頻度は、各バーコードが混合物中に均等な表現（１０％）を有するように、注入入力材料の頻度に正規化された。８．５～１２％の範囲の１０個のベクターの入力量。値は、平均値±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．００１。 ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｒＢＧを有するＡＡＶｒｈ．９１、ＡＡＶ１、およびＡＡＶ９カプシドをＮＨＰに送達した後の生体分布の検出を示す。１．５５７ｅ１３ＧＣの用量を、各動物にＩＣＭ注入した。注入の２８～３１日後に動物を犠牲にし、組織を分析のために採取した（ｑＰＣＲによるｅＧＦＰの検出）。値は、平均値±ＳＤとして表されている。動物：ＡＡＶｒｈ．９１（１４０９２０１および１４０７０８８）、ＡＡＶ１（ＲＡ３６５４およびＲＡ３５８３）、ＡＡＶ９（１４０８２６６および１４０９０２９）。 ＣＮＳ組織における生体分布を示す。示されるデータは、動物によってグループ化された、図１１Ａ～図１１Ｃに示される組織のＧＣ値に対応する。 ＡＡＶｒｈ．９１、ＡＡＶ１、およびＡＡＶ９ベクターをＮＨＰに送達した後のニューロン形質導入の分析を示す（図１１Ａ～図１１Ｃに記載されているとおり）。 様々なＡＡＶベクターの産生のための小規模調製力価を示す。各ドットは、個々の小規模調製を表す。値は、平均値±ＳＤとして表されている。 ＡＡＶｒｈ．９１ベクター調製物の質量分析の結果を示す。
天然の哺乳類宿主におけるＡＡＶの遺伝的バリエーションを、ＡＡＶ単一ゲノム増幅（個々のＡＡＶゲノムをウイルス集団内から正確に単離するために使用される技術）を使用することによって探索した（図１）。本明細書において、様々なクレードに分類することができるアカゲザル組織由来の新規ＡＡＶ配列の単離が記載される。我々は、マウスにおける静脈内（ＩＶ）および脳室内（ＩＣＶ）送達後、ならびにＮＨＰにおけるＩＶおよび大槽内（ＩＣＭ）送達後の、天然単離由来ＡＡＶベクターの生物学的特性を評価した。その結果、新規のＡＡＶバリアントのクレード特異的形質導入パターンおよび可変形質導入パターンの両方が、それらの原型的なクレードメンバー対照と比較して特定された。
組換えＡＡＶｒｈ．９１ベクターが本明細書で提供され、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドと、対象への送達後に導入遺伝子の発現を指示する調節配列の制御下にある導入遺伝子をコードする核酸と、を有する。ｒＡＡＶｒｈ．９１カプシドは、独立して、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。これらのベクターを含む組成物が提供される。本明細書に記載の方法は、様々な状態の治療のために、目的の組織を標的とするｒＡＡＶの使用を対象とする。
特定の実施形態では、中枢神経系への送達に非常に好適なＡＡＶｒｈ．９１カプシドを含むベクターが、本明細書に提供される。特定の実施形態では、髄腔内送達が望まれ、例えば、ＩＣＭ送達を介した脳への送達が含まれる。特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドを含むベクターは、心臓（平滑筋）への送達に非常に好適である。他の実施形態では、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドを含むベクターは、骨格（横紋）筋への送達に非常に好適である。ｒＡＡＶｒｈ．９１ベクターは、全身に送達され得るか、またはこれらの組織を標的化するのに好適な投与経路を介して標的化され得る。
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって、および本出願で使用されている多くの用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する公開された文書を参照することによって、一般的に理解されているものと同じ意味を有する。以下の定義は、明確にするために提供されるに過ぎず、特許請求される本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を指し、例えば、「宿主細胞」は、１つ以上の宿主細胞を表すことを留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別途指定されない限り、与えられた参照から１０％の変動性を意味する。本明細書の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言
葉を用いて示されているが、他の状況では、関連する実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉を用いて解釈および記載されるべきことも意図される。
以下の説明に関して、本明細書に記載の組成物の各々は、別の実施形態では、本発明の方法で有用であることが意図される。さらに、本方法で有用な本明細書に記載の組成物の各々は、別の実施形態では、それ自体が本発明の実施形態であることも意図される。
「組換えＡＡＶ」または「ｒＡＡＶ」は、２つの要素、ＡＡＶカプシド、およびＡＡＶカプシド内にパッケージされた少なくとも非ＡＡＶコード配列を含むベクターゲノムを含むＤＮＡｓｅ耐性ウイルス粒子である。特に明記しない限り、この用語は「ｒＡＡＶベクター」という句と互換的に使用され得る。ｒＡＡＶは、任意の機能的ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子または機能的ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を欠き、子孫を生成することができないため、「複製欠陥ウイルス」または「複製欠陥ウイルスベクター」である。特定の実施形態では、唯一のＡＡＶ配列は、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）であり、ＩＴＲ間に位置する遺伝子および調節配列がＡＡＶカプシド内にパッケージされることを可能にするために、典型的にはベクターゲノムの５’および３’最末端に位置する。
本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルス粒子を形成するｒＡＡＶカプシドの内側にパッケージされる核酸配列を指す。かかる核酸配列は、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。本明細書の実施例では、ベクターゲノムは、少なくとも、５’から３’へ、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、コード配列、およびＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来（カプシドとは異なるＡＡＶ供給源）であるか、またはそれ以外の完全長ＩＴＲが選択され得る。特定の実施形態では、ＩＴＲは、産生中のｒｅｐ機能またはトランス相補ＡＡＶを提供するＡＡＶと同じＡＡＶ供給源由来である。さらに、他のＩＴＲが使用され得る。さらに、ベクターゲノムは、遺伝子産物の発現を指示する制御配列を含む。ベクターゲノムの好適な成分が本明細書でより詳細に考察される。ベクターゲノムは、本明細書では「ミニ遺伝子」と称されることがある。
「発現カセット」という用語は、導入遺伝子配列およびそのための調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ）を含む核酸分子を指し、そのカセットは、ウイルスベクター（例えば、ウイルス粒子）のカプシドにパッケージングされ得る。典型的に、ウイルスベクターを産生するためのそのような発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する導入遺伝子配列、および本明細書に記載のものなどの他の発現制御配列を含む。例えば、ＡＡＶウイルスベクターの場合、パッケージングシグナルは、５’逆位末端配列（ＩＴＲ）および３’ＩＴＲである。特定の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、「発現カセット」と互換的に使用され得る。他の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、選択された遺伝子のコード配列のみを指す。
ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドおよびベクターゲノムからなる。ＡＡＶカプシドは、ｖｐ１の異種集団、ｖｐ２の異種集団、およびｖｐ３タンパク質の異種集団の集合体である。本明細書で使用される、ｖｐカプシドタンパク質を参照するために使用される場合、「異種」という用語またはその任意の文法的変形は、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではない要素からなる集団を指す。
本明細書で使用される場合、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質（代替的にアイソフォームと称される）に関連して使用される「異種集団」という用語は、カプシド内のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質のアミノ酸配列の違いを指す。ＡＡＶカプシド
は、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に亜集団を含み、予測されるアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、少なくとも特定の脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基が含まれる。例えば、特定の亜集団は、アスパラギン－グリシン対中に少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸をさらに含み、脱アミド化は、アミノ酸変化および他の任意選択的な修飾をもたらす。
本明細書で使用される場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、少なくとも１つの定義された共通の特徴を有し、少なくとも１つの群メンバーから参照群のすべてのメンバーよりも少ないメンバーまでからなるｖｐタンパク質の群を指す。例えば、ｖｐ１タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシド中の少なくとも１つの（１）ｖｐ１タンパク質であり、すべてのｖｐ１タンパク質未満であり得る。ｖｐ３タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシド中のすべてのｖｐ３タンパク質よりも少ない１つ（１）ｖｐ３タンパク質であり得る。例えば、ｖｐ１タンパク質は、ｖｐタンパク質の亜集団であり得、ｖｐ２タンパク質は、ｖｐタンパク質の別個の亜集団であり得、ｖｐ３は、組み立てられたＡＡＶカプシド中のｖｐタンパク質のさらなる亜集団であり得る。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質は、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度脱アミド化アスパラギン、例えば、アスパラギン－グリシン対で異なる修飾を有するサブ集団を含み得る。２０１９年２月２７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／０１９８０４、および２０１９年２月２７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／０１９８６１を参照されたい（これらの各々は、参照により本明細書に援用される）。
別途指定されない限り、高度脱アミド化は、参照アミノ酸位置での予測されたアミノ酸配列と比較して、参照アミノ酸位置での少なくとも４５％の脱アミド化、少なくとも５０％の脱アミド化、少なくとも６０％の脱アミド化、少なくとも６５％の脱アミド化、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または最大約１００％の脱アミド化を指す。かかるパーセンテージは、２Ｄゲル、質量分析技術、または他の好適な技術を使用して決定され得る。
理論に束縛されることを意図するものではないが、ＡＡＶカプシド中のｖｐタンパク質中の少なくとも高度に脱アミドされた残基の脱アミド化は、本質的に非酵素的であると考えられ、選択されたアスパラギンを脱アミド化するカプシドタンパク質内の官能基、およびより少ない程度でグルタミン残基によって引き起こされる。大部分の脱アミド化ｖｐ１タンパク質の効率的なカプシド組み立ては、これらの事象がカプシド組み立て後に生じるか、または個々のモノマー（ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３）における脱アミドが構造的に十分許容され、ほとんどが組み立て動態に影響を及ぼさないことを示す。一般に、細胞侵入前に内部に位置すると考えられているＶＰ１固有（ＶＰ１－ｕ）領域（約ａａ１～１３７）における広範な脱アミド化は、カプシドのアセンブリの前にＶＰ脱アミド化が生じ得ることを示唆する。
理論に束縛されることを意図するものではないが、Ｎの脱アミド化は、そのＣ末端残基の骨格窒素原子を介して、Ａｓｎの側鎖アミド基炭素原子に対して求核攻撃を行うことによって生じ得る。中間環閉鎖スクシンイミド残基が形成されると考えられる。次いで、スクシンイミド残基は、高速加水分解を行って、最終産物であるアスパラギン酸（Ａｓｐ）またはイソアスパラギン酸（ＩｓｏＡｓｐ）をもたらす。したがって、特定の実施形態では、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）の脱アミド化は、ＡｓｐまたはＩｓｏＡｓｐをもたらし、例えば、以下に例示するように、スクシンイミド中間体を介して相互変換され得る。
Figure 2022530544000002
本明細書に提供されるように、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３中の各脱アミド化Ｎは、独立して、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、イソアスパラギン酸（ｉｓｏＡｓｐ）、アスパルテート、および／またはＡｓｐおよびｉｓｏＡｓｐの相互変換ブレンド、またはこれらの組み合わせであり得る。α－およびイソアスパラギン酸の任意の好適な比率が存在し得る。例えば、特定の実施形態では、比率は、１０：１～１：１０のアスパラギン酸対イソアスパラギン酸、約５０：５０のアスパラギン酸：イソアスパラギン酸、もしくは約１：３のアスパラギン酸：イソアスパラギン酸、または別の選択された比率であり得る。
特定の実施形態では、１つ以上のグルタミン（Ｑ）は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、すなわちα－グルタミン酸、γ－グルタミン酸（Ｇｌｕ）、またはα－およびγ－グルタミン酸のブレンドに脱アミド化され得、共通のグルタルイミド中間体を介して相互変換され得る。α－およびγ－グルタミン酸の任意の好適な比率が存在し得る。例えば、特定の実施形態では、比率は、１０：１～１：１０のα対γ、約５０：５０のα：γ、もしくは約１：３のα：γ、または別の選択された比率であり得る。
Figure 2022530544000003
したがって、ｒＡＡＶは、少なくとも１つの高度脱アミド化アスパラギンを含む少なくとも１つの亜集団を含む、脱アミド化アミノ酸を有するｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３タンパク質のｒＡＡＶカプシド中に亜集団を含む。さらに、他の修飾は、特に選択されたアスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）残基位置での異性化を含み得る。さらに他の実
施形態では、修飾は、Ａｓｐ位置でのアミド化を含み得る。
特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個から、少なくとも約２５個の脱アミド化アミノ酸残基位置を有するｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３の亜集団を含み、そのうちの少なくとも１～１０％、少なくとも１０～２５％、少なくとも２５～５０％、少なくとも５０～７０％、少なくとも７０～１００％、少なくとも７５～１００％、少なくとも８０～１００％、または少なくとも９０～１００％は、ｖｐタンパク質のコードアミノ酸配列と比較して脱アミド化されている。これらの大部分はＮ残基であり得る。しかしながら、Ｑ残基は脱アミド化され得る。
本明細書で使用される場合、「コードされたアミノ酸配列」は、アミノ酸に翻訳される参照核酸配列の既知のＤＮＡコドンの翻訳に基づいて予測されるアミノ酸を指す。以下の表は、ＤＮＡコドンおよび２０個の共通アミノ酸を例示し、１文字コード（ＳＬＣ）および３文字コード（３ＬＣ）の両方を示す。
Figure 2022530544000004
特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３タンパク質を有するＡ
ＡＶカプシドを有し、本明細書に提供される表（参照により本明細書に援用される）に示される位置に、２、３、４、５個、またはそれ以上の脱アミド化残基の組み合わせを含む亜集団を有する。
ｒＡＡＶの脱アミド化は、２Ｄゲル電気泳動、および／または質量分析、および／またはタンパク質モデリング技術を使用して決定され得る。オンラインクロマトグラフィーは、ＮａｎｏＦｌｅｘソース（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦに結合されたＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐカラムおよびＴｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ ＲＳＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実行され得る。ＭＳデータは、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ
ＨＦのデータ依存性Ｔｏｐ－２０法を使用して取得され、調査スキャン（２００～２０００ｍ／ｚ）から、最も豊富でまだ配列決定されていない前駆体イオンを動的に選択する。シーケンシングは、予測自動増加制御で決定された１ｅ５イオンの標的値で、より高いエネルギー衝突解離断片化を介して行われ、４ｍ／ｚのウィンドウで前駆体の単離を行った。ｍ／ｚ ２００で１２０，０００の解像度で、調査スキャンを取得した。ＨＣＤスペクトルの解像度は、最大イオン注入時間が５０ｍｓ、正規化された衝突エネルギーが３０で、ｍ／ｚ２００で３０，０００に設定され得る。Ｓ－レンズＲＦレベルを５０に設定して、消化物からのペプチドが占めるｍ／ｚ領域の透過率を最適化できる。前駆体イオンは、単一、割り当てられていない、または断片化選択から６つ以上の電荷状態で除外され得る。ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ １．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、取得したデータの分析に使用され得る。ペプチドマッピングのために、固定変更としてカルバミドメチル化が設定された単一エントリのタンパク質ＦＡＳＴＡデータベース、可変修飾として酸化、脱アミド、およびリン酸化の設定、１０ｐｐｍ質量精度、高プロテアーゼ特異性、ならびにＭＳ／ＭＳスペクトルに対する信頼レベル０．８を使用して検索を行う。好適なプロテアーゼの例としては、例えば、トリプシンまたはキモトリプシンが含まれ得る。脱アミド化は、無傷分子の質量＋０．９８４ Ｄａ（－ＯＨおよび－ＮＨ２基の質量差）を付加するので、脱アミド化ペプチドの質量分析的同定は比較的簡単である。特定のペプチドの脱アミド化の割合は、脱アミド化ペプチドの質量面積を、脱アミド化および天然ペプチドの面積の合計で割ることによって決定される。考えられる脱アミド化部位の数を考慮すると、異なる部位で脱アミド化されている等張種は、単一のピークで共移行し得る。したがって、複数の潜在的脱アミド部位を有するペプチドに由来する断片イオンを使用して、複数の脱アミド部位を特定または区別することができる。これらの事例では、観察された同位体パターン内の相対強度を使用して、異なる脱アミド化ペプチド異性体の相対的存在量を特異的に決定することができる。この方法は、すべての異性体種についての断片化効率が同じであり、脱アミド化部位において独立していることを想定する。これらの例示的な方法のいくつかの変形が使用され得ることは、当業者によって理解されるであろう。例えば、好適な質量分析器は、例えば、Ｗａｔｅｒｓ ＸｅｖｏもしくはＡｇｉｌｅｎｔ ６５３０などの四重飛行質量分析器（ＱＴＯＦ）、またはＯｒｂｉｔｒａｐ ＦｕｓｉｏｎまたはＯｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）などのオービトラップ装置を含み得る。好適な液体クロマトグラフィーシステムとしては、例えば、Ｗａｔｅｒｓ製のＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣシステムまたはＡｇｉｌｅｎｔのシステム（１１００または１２００シリーズ）が含まれる。好適なデータ分析ソフトウェアとしては、例えば、ＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ、およびＰｅｐｆｉｎｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｐｅａｋｓ ＤＢ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を挙げることができる。さらに他の技術は、例えば、２０１７年６月１６日にオンラインで公開されたＸ．Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．５，ｐｐ．２５５－２６７に記載され得る。
脱アミド化に加えて、他の修飾も生じ得るが、１つのアミノ酸が異なるアミノ酸残基に変換されることはない。かかる修飾は、アセチル化残基、異性化、リン酸化、または酸化を含み得る。
脱アミド化の調節：特定の実施形態では、ＡＡＶは、アスパラギン－グリシン対のグリシンを変更し、脱アミド化を低減するように修飾される。他の実施形態では、アスパラギンは、異なるアミノ酸、例えば、より遅い速度で脱アミド化するグルタミン、またはアミド基を欠くアミノ酸（例えば、グルタミンおよびアスパラギンが、アミド基を含む）、および／またはアミン基を欠くアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジンが、アミン基を含む）に変更される。本明細書で使用される場合、アミドまたはアミン側基を欠くアミノ酸は、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン、および／またはプロリンを指す。記載されるような修飾は、コードされたＡＡＶアミノ酸配列に見出されるアスパラギン－グリシン対のうちの１つ、２つ、または３つにあり得る。特定の実施形態では、かかる修飾は、アスパラギン－グリシン対の４つすべてでは行われない。したがって、ＡＡＶおよび／または操作されたＡＡＶバリアントの脱アミドを低減するための方法は、より低い脱アミド率を有する。追加的に、または代替的に、１つ以上の他のアミドアミノ酸を非アミドアミノ酸に変化させて、ＡＡＶの脱アミド化を低減させ得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される変異体ＡＡＶカプシドは、グリシンがアラニンまたはセリンに変化するようなアスパラギン－グリシン（ＮＧ）対における変異を含む。変異ＡＡＶカプシドは、参照ＡＡＶが天然に４つのＮＧ対を含む１つ、２つ、または３つの変異を含み得る。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、参照ＡＡＶが天然に５つのＮＧ対を含む１つ、２つ、３つ、または４つのかかる変異を含み得る。特定の実施形態では、変異ＡＡＶカプシドは、ＮＧ対に単一の変異のみを含む。特定の実施形態では、変異ＡＡＶカプシドは、２つの異なるＮＧ対に変異を含む。特定の実施形態では、変異ＡＡＶカプシドは、変異を含む２つの異なるＮＧ対であり、ＡＡＶカプシド中の構造的に別個の位置に位置する。特定の実施形態では、変異は、ＶＰ１固有領域にはない。特定の実施形態では、変異の１つは、ＶＰ１固有領域にある。任意選択的に、変異体ＡＡＶカプシドは、ＮＧ対中に修飾を含まないが、ＮＧ対の外側に位置する１つ以上のアスパラギンまたはグルタミンの脱アミド化を最小化または排除するための変異を含む。
特定の実施形態では、野生型ＡＡＶカプシド中のＮＧの１つ以上を排除するＡＡＶカプシドを操作することを含む、ｒＡＡＶベクターの効力を増加させる方法が提供される。特定の実施形態では、「ＮＧ」の「Ｇ」のコード配列は、別のアミノ酸をコードするように操作される。以下の特定の例では、「Ｓ」または「Ａ」が置換される。しかしながら、他の好適なアミノ酸コード配列が選択され得る。
これらのアミノ酸修飾は、従来の遺伝子工学技術によって行われ得る。例えば、修飾ＡＡＶ ｖｐコドンを含む核酸配列が生成され得、アスパラギン－グリシン対中のグリシンをコードするコドンのうちの１～３個が、グリシン以外のアミノ酸をコードするように修飾される。特定の実施形態では、修飾アスパラギンコドンを含む核酸配列は、アスパラギン－グリシン対のうちの１～３個が操作され得、その結果、修飾コドンはアスパラギン以外のアミノ酸をコードする。各修飾コドンは、異なるアミノ酸をコードし得る。代替的に、改変されたコドンのうちの１個以上は、同じアミノ酸をコードし得る。特定の実施形態では、修飾ＡＡＶｒｈ．９１の核酸配列は、天然ＡＡＶｒｈ．９１カプシドよりも低い脱アミド化を含むカプシドを有する変異体ｒＡＡＶを生成するために使用され得る。かかる変異ｒＡＡＶは、免疫原性が低下しており、および／または貯蔵、特に懸濁形態での貯蔵の際の安定性を増加させ得る。
本明細書には、低減された脱アミド化を有するＡＡＶカプシドをコードする核酸配列も
提供される。ＤＮＡ（ゲノムまたはｃＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、このＡＡＶカプシドをコードする核酸配列を設計することは当該技術の範囲内である。かかる核酸配列は、選択されたシステム（すなわち、細胞型）における発現のためにコドン最適化され得、様々な方法によって設計することができる。この最適化は、オンラインで利用可能な方法（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ）、公開された方法、またはコドン最適化サービスを提供する会社、例えば、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用して実行され得る。１つのコドン最適化方法は、例えば、国際特許公開第２０１５／０１２９２４号に記載され、参照によりその全体が本明細書に援用される。また、例えば、米国特許公開第２０１４／００３２１８６号および米国特許公開第２００６／０１３６１８４号を参照されたい。好適には、製品のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長を修正する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＯＲＦの断片のみが改変され得る。これらの方法のうちの１つを使用することによって、任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用して、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を産生することができる。コドンへの実際の変更を実行するため、または本明細書に記載されるように設計されたコドン最適化コード領域を合成するために、いくつかのオプションが利用可能である。かかる修飾または合成は、当業者に周知の標準的かつ日常的な分子生物学的操作を使用して行うことができる。１つのアプローチでは、長さが各々８０～９０ヌクレオチド、および所望の配列の長さにまたがる一連の相補的オリゴヌクレオチド対は、標準的な方法によって合成される。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニーリングの際に、付着末端を含む８０～９０塩基対の二本鎖断片が形成されるように合成され、例えば、対の各オリゴヌクレオチドは、対の他のオリゴヌクレオチドと相補的である領域を超えて３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の塩基を伸長するように合成される。オリゴヌクレオチドの各対の一本鎖末端は、オリゴヌクレオチドの別の対の一本鎖末端とアニールするように設計される。オリゴヌクレオチド対をアニールさせ、次いで、これらの二本鎖断片のおよそ５～６個を、凝集性一本鎖末端を介して一緒にアニールさせ、次いで、それらを一緒にライゲーションし、標準的な細菌クローニングベクター、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆから入手可能なＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングする。次いで、構築物を標準的な方法で配列決定する。一緒にライゲーションされた８０～９０塩基対の断片の５～６個の断片（すなわち、約５００塩基対の断片）からなるこれらの構築物のいくつかを調製し、所望の配列全体が一連のプラスミド構築物で表されるようにする。次いで、これらのプラスミドの挿入物を適切な制限酵素で切断し、一緒にライゲーションして、最終構築物を形成する。次いで、最終構築物を標準的な細菌クローニングベクターにクローニングし、配列決定する。追加の方法は、当業者にはすぐに明らかであろう。さらに、遺伝子合成は、商業的に容易に利用可能である。
特定の実施形態では、複数の高度に脱アミド化された「ＮＧ」位置を含むＡＡＶカプシドアイソフォーム（すなわち、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の異種集団を有するＡＡＶカプシドが提供される。特定の実施形態では、高度に脱アミド化された位置は、予測される完全長のＶＰ１アミノ酸配列を参照して、以下に示す位置にある。他の実施形態では、カプシド遺伝子は、参照される「ＮＧ」が除去されるように修飾され、変異「ＮＧ」は、別の位置に操作される。
本明細書で使用される場合、「標的細胞」および「標的組織」という用語は、対象となるＡＡＶベクターによって形質導入されることが意図される任意の細胞または組織を指し得る。この用語は、筋肉、肝臓、肺、気道上皮、中枢神経系、ニューロン、眼（視覚細胞）、または心臓のうちのいずれか１つ以上を指し得る。一実施形態では、標的組織は、肝臓である。別の実施形態では、標的組織は、心臓である。別の実施形態では、標的組織は、脳である。別の実施形態では、標的組織は、筋肉である。
本明細書で使用される場合、「哺乳類対象」または「対象」という用語は、本明細書に記載の治療方法または予防を必要とする任意の哺乳類を含み、特にヒトを含む。かかる治療または予防を必要とする他の哺乳動物としては、非ヒト霊長類を含む、イヌ、ネコ、または他の家畜化動物、ウマ、家畜、実験動物などが挙げられる。対象は、雄または雌であってもよい。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、プラスミドからｒＡＡＶが産生されるパッケージング細胞株を指し得る。代替的に、「宿主細胞」という用語は、導入遺伝子の発現が所望される標的細胞を指し得る。
Ａ．ＡＡＶカプシド
配列番号２に示されるｖｐ１配列を有する新規のＡＡＶカプシドタンパク質が、本明細書に提供される。ＡＡＶカプシドは、３つのオーバーラップするコード配列からなり、これらは、代替的な開始コドン使用により長さが変化する。これらの可変タンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３として参照され、ＶＰ１は最長であり、ＶＰ３は最短である。ＡＡＶ粒子は、約１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の比率で、３つすべてのカプシドタンパク質からなる。Ｎ末端のＶＰ１およびＶＰ２に含まれるＶＰ３は、粒子を構築する主要な構造成分である。カプシドタンパク質は、いくつかの異なる番号付けシステムを使用して参照され得る。便宜上、本明細書で使用される場合、ＡＡＶ配列は、ＶＰ１の最初の残基のａａ１で始まるＶＰ１の番号付けを使用して参照される。しかしながら、本明細書に記載のカプシドタンパク質には、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３（本明細書でｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３と互換的に使用される）が含まれる。カプシドの可変タンパク質の番号付けは、以下のとおりである。
ヌクレオチド（ｎｔ）
ＡＡＶｒｈ．９１：ｖｐ１－配列番号１のｎｔ１～２２０８、ｖｐ２－ｎｔ４１２～２２０８、ｖｐ３－ｎｔ６０７～２２０８
ＡＡＶｒｈ．９１ｅｎｇ：ｖｐ１－配列番号３のｎｔ１～２２０８、ｖｐ２－ｎｔ４１２～２２０８、ｖｐ３－ｎｔ６０７～２２０８
図３Ａ～図３Ｄに、本明細書に記載のカプシドの核酸配列の整列を示す。
アミノ酸（ａａ）
ＡＡＶｒｈ．９１およびＡＡＶｒｈ．９１ｅｎｇ：ｖｐ１－配列番号２のａａ１～７３６、ｖｐ２－ａａ１３８～７３６、ｖｐ３－ａａ２０３～７３６。
図４Ａおよび図４Ｂに、本明細書に記載のカプシドのアミノ酸配列の整列を示す。
ＡＡＶｒｈ．９１（配列番号２）のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３のうちの少なくとも１つ含むｒＡＡＶが、本明細書に含まれる。また、ＡＡＶｒｈ．９１（配列番号１）またはＡＡＶｒｈ．９１ｅｎｇ（配列番号３）のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３のうちの少なくとも１つによってコードされるＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶも、本明細書に提供される。
一実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の混合集団を含む組成物であって、該ｒＡＡＶの各々が、（ａ）ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、およびｖｐ３タンパク質から構成される約６０個のカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドであって、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質が、選択されるＡＡＶｖｐ１アミノ酸配列をコードする核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質の異種集団、選択されるＡＡＶｖｐ２アミノ酸配列をコードする核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質の異種集団、選択されるＡＡＶｖｐ３アミノ酸配列をコードする核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質の異種集団であり、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質が、ＡＡＶカプシド中のア
スパラギン－グリシン対中の少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団をさらに含み、脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす、ＡＡＶカプシドと、（ｂ）ＡＡＶカプシド中のベクターゲノムであって、ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復配列を含む核酸分子、および宿主細胞中で産物の発現を指示する配列と作動可能に連結される産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含む、ベクターゲノムと、を含む、組成物が提供される。
特定の実施形態では、脱アミド化アスパラギンは、アスパラギン酸、イソアスパラギン酸、相互変換アスパラギン酸／イソアスパラギン酸対、またはそれらの組み合わせに脱アミド化される。特定の実施形態では、カプシドは、（α）－グルタミン酸、γ－グルタミン酸、相互変換（α）－グルタミン酸／γ－グルタミン酸対、またはそれらの組み合わせに脱アミド化される脱アミド化グルタミンをさらに含む。
特定の実施形態では、新規の単離されたＡＡＶｒｈ．９１カプシドが提供される。ＡＡＶｒｈ．９１カプシドをコードする核酸配列は、配列番号１に提供され、コードされたアミノ酸配列は、配列番号２に提供される。ＡＡＶｒｈ．９１（配列番号２）のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３のうちの少なくとも１つを含むｒＡＡＶが、本明細書に提供される。また、ＡＡＶｒｈ．９１（配列番号１）のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３のうちの少なくとも１つによってコードされるＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶも、本明細書に提供される。ＡＡＶｒｈ．９１のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号３に提供され、コードされるアミノ酸配列は、配列番号２に提供される。また、ＡＡＶｒｈ．９１ｅｎｇ（配列番号３）のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３のうちの少なくとも１つによってコードされるＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶも、本明細書に提供される。特定の実施形態では、ｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３は、ＡＡＶｒｈ．９１（配列番号２）の完全長カプシドタンパク質である。他の実施形態では、ｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３は、Ｎ末端および／またはＣ末端の切断（例えば、約１～約１０個のアミノ酸の切断）を有する。
さらなる態様では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供され、（Ａ）ＡＡＶｒｈ．９１カプシドであって、（１）配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号１から産生されるｖｐ１タンパク質、もしくは配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ．９１ｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、もしくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ．９１ｖｐ２タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ３タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、もしくは配列番号１の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ．９１ｖｐ３タンパク質の異種集団、ならびに／または（２）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、および配列番号２の少
なくともアミノ酸２０３～７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団、を含み、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質が、配列番号２のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団をさらに含み、脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドと、（Ｂ）ＡＡＶｒｈ．９１カプシド中のベクターゲノムであって、ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復配列を含む核酸分子、および宿主細胞における産物の発現を指示する配列と作動可能に連結された産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含む、ベクターゲノムと、を含む。
さらなる態様では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供され、（Ａ）ＡＡＶｒｈ．９１カプシドであって、（１）配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号３から産生されるｖｐ１タンパク質、もしくは配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号３と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ．９１ｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号３の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、もしくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号３の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ．９１ｖｐ２タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ３タンパク質、配列番号３の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、もしくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号３の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ．９１ｖｐ３タンパク質の異種集団、ならびに／または（２）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、および配列番号２の少なくともアミノ酸２０３～７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団、を含み、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質が、配列番号２のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団をさらに含み、脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドと、（Ｂ）ＡＡＶｒｈ．９１カプシド中のベクターゲノムであって、ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復配列を含む核酸分子、および宿主細胞における産物の発現を指示する配列と作動可能に連結された産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含む、ベクターゲノムと、を含む。
特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ．９１のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質は、配列番号２のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団をさらに含み、脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす。配列番号２の数と比較して、Ｎ－Ｇ対のＮ５７、Ｎ３８３、および／またはＮ５１２で、高いレベルの脱アミド化が観察される。以下の表および図１５Ｂに示されるように、脱アミド化は、他の残基において観察されている。特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ．９１は、脱アミド化された他の残基を有し得（例えば、典型的には１０％未満）、かつ／またはリン酸化（例えば、存在する場合、約２～約３０％、もしくは約２～約２０％、もしくは約２～約１
０％の範囲で）（例えば、Ｓ１４９で）、または酸化（例えば、～Ｗ２２、～Ｍ２１１、Ｗ２４７、Ｍ４０３、Ｍ４３５、Ｍ４７１、Ｗ４７８、Ｗ５０３、～Ｍ５３７、～Ｍ５４１、～Ｍ５５９、～Ｍ５９９、Ｍ６３５、および／もしくはＷ６９５のうちの１つ以上で）を含む他の修飾を有し得る。任意で、Ｗは、キヌレニンに酸化し得る。
Figure 2022530544000005
特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドは、上記の表で特定される１つ以上の位置、提供される範囲で修飾されており、トリプシン酵素を用いた質量分析を使用して決定される。特定の実施形態では、１つ以上の位置、またはＮに続くグリシンは、本明細書に記載されるように修飾されている。残基番号は、本明細書に提供されるＡＡＶｒｈ．９１配列に基づく。配列番号２を参照されたい。
特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドは、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６でのアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、および配列番号２の少なくともアミノ酸２０３～７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団を含む。
特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ．９１ ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１に提供される。他の実施形態では、配列番号１と７０％～９９．９％同一の核酸配列を選択して、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドタンパク質を発現し得る。特定の他の実施形態では、核酸配列は、配列番号１と少なくとも約７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％～９９．９％同一である。しかしながら、配列番号２のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、ｒＡＡＶカプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の核酸配列、または配列番号１と少なくとも７０％～９９．９％同一、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２をコードする特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の核酸配列、または配列番号１の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２０８と、少なくとも７０％～９９．９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３６）をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２０８の核酸配列、または配列番号１のｎｔ６０７～約ｎｔ２２０８と少なくとも７０％～９９．９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少な
くとも９５％、少なくとも９７％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０３～７３６）をコードする。
特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ．９１ ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号３に提供される。他の実施形態では、配列番号３と７０％～９９．９％同一の核酸配列を選択して、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドタンパク質を発現し得る。特定の他の実施形態では、核酸配列は、配列番号３と少なくとも約７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％～９９．９％同一である。しかしながら、配列番号２のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、ｒＡＡＶカプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号３の核酸配列、または配列番号３と少なくとも７０％～９９．９％同一、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２をコードする特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号３の核酸配列、または配列番号３の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２０８と、少なくとも７０％～９９．９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３６）をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号３の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２０８の核酸配列、または配列番号３のｎｔ６０７～約ｎｔ２２０８と少なくとも７０％～９９．９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０３～７３６）をコードする。
本発明はまた、ＡＡＶｒｈ．９１カプシド配列（配列番号２）、または変異体ＡＡＶｒｈ．９１をコードする核酸配列を包含し、１つ以上の残基は、本明細書で特定される脱アミド化または他の修飾を低減させるために改変されている。かかる核酸配列は、変異体ＡＡＶｒｈ．９１カプシドの産生において使用することができる。
特定の実施形態では、配列番号１の配列、または本明細書に記載される修飾（例えば、脱アミド化アミノ酸）を有する配列番号２のｖｐ１アミノ酸配列コードする配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有する核酸分子が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号３の配列、または本明細書に記載される修飾（例えば、脱アミド化アミノ酸）を有する配列番号２のｖｐ１アミノ酸配列コードする配列番号３と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有する核酸分子が本明細書に提供される。特定の実施形態では、ｖｐ１アミノ酸配列は、配列番号２に再現される。特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸配列を有するプラスミドが提供される。
「実質的相同性」または「実質的類似性」という用語は、核酸またはその断片に言及する場合、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を伴って別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列した場合、整列した配列の少なくとも約９５～９９％においてヌクレオチド配列の同一性がある。好ましくは、相同性は、全長配列、またはそのオープンリーディングフレーム、または少なくとも１５ヌクレオチド長である別の好適な断片にわたる。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
核酸配列の文脈における「パーセント（％）同一性」、「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、または「パーセント同一な」という用語は、対応するように整列させたと
きに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、または、望ましくは、少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片にわたり得る。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドの、より小さい断片間の同一性も望まれ得る。
パーセント同一性は、タンパク質の全長、ポリペプチド、約３２個のアミノ酸、約３３０個のアミノ酸、もしくはそのペプチド断片にわたるアミノ酸配列、または配列をコードする対応する核酸配列について容易に決定することができる。好適なアミノ酸フラグメントは、長さが少なくとも約８個のアミノ酸であり得、最大で約７００個であり得る。一般に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」を言及する場合、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「整列された」配列を参照して決定される。「整列された」配列または「整列」とは、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損もしくは追加の塩基またはアミノ酸についての補正を含む。
同一性は、配列の整列を作成することによって、および当該技術分野で既知の、または市販されている様々なアルゴリズムおよび／もしくはコンピュータプログラムを使用することによって［例えば、ＢＬＡＳＴ、ＥｘＰＡＳｙ、ＣｌｕｓｔａｌＯ、ＦＡＳＴＡ、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して］、決定することができる。整列は、公的または商業的に利用可能な様々な多重配列整列プログラムのいずれかを使用して行われる。アミノ酸配列の場合、配列整列プログラム、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、および「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムが利用可能である。一般に、これらのプログラムのいずれかがデフォルト設定で使用されるが、必要に応じて、当業者は、これらの設定を変更することができる。あるいは、当業者は、参照のアルゴリズムおよびプログラムによって提供されるものと少なくとも同じレベルの同一性または整列を提供する、別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。
多重配列整列プログラムもまた、核酸配列に対して利用可能である。かかるプログラムの例としては、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」、および「ＭＥＭＥ」が挙げられる。かかるプログラムの他のソースは、当業者に既知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上に記載のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いて比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、照会配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）および検索配列（ｓｅａｒｃｈ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の間の最良の重複領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、ＧＣＧバージョン６．１（参照により本明細書に援用される）に提供されるように、Ｆａｓｔａ（商標）をそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６およびスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ因子）とともに使用して決定することができる。
Ｂ．ｒＡＡＶベクターおよび組成物
別の態様では、異種遺伝子または他の核酸配列の標的細胞への送達に有用なウイルスベクターを産生するために、本明細書に記載のＡＡＶカプシド配列（その断片を含む）を利用する分子が、本明細書に提供される。一実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法に有用なベクターは、少なくとも、本明細書に記載されるＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶｒｈ．９１カプシド）、またはその断片をコードする配列を含む。別の実施形態では、有用なベクターは、少なくとも、ＡＡＶ血清型ｒｅｐタンパク質、またはその断片をコードする配列を含む。任意選択的に、かかるベクターは、ＡＡＶのｃａｐタンパク質およびｒｅｐタンパク質の両方を含み得る。ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐの両方が提供されるベクターでは、ＡＡＶのｒｅｐ配列およびＡＡＶのｃａｐ配列は、いずれも起源が１つの血清型（例えば、すべてＡＡＶｒｈ．９１起源）であり得る。あるいは、ｒｅｐ配列が、ｃａｐ配列を提供する野生型ＡＡＶとは異なるＡＡＶ由来であるベクターを使用してもよい。一実施形態では、ｒｅｐ配列およびｃａｐ配列は、別個の供給源（例えば、別個のベクター、または宿主細胞およびベクター）から発現される。別の実施形態では、これらのｒｅｐ配列を、異なるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列とインフレームで融合して、米国特許第７，２８２，１９９号（参照により本明細書に援用される）に記載されているＡＡＶ２／８などのキメラＡＡＶベクターを形成する。任意選択的に、ベクターは、ＡＡＶ ５’ＩＴＲおよびＡＡＶ ３’ＩＴＲに隣接する選択された導入遺伝子を含むミニ遺伝子をさらに含む。別の実施形態では、ＡＡＶは、自己相補的なＡＡＶ（ｓｃ－ＡＡＶ）である。ＵＳ２０１２／０１４１４２２を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。自己相補的ベクターは、ＤＮＡ合成または複数のベクターゲノム間の塩基対合を必要とせずに、ｄｓＤＮＡに折り畳むことができる逆位反復ゲノムをパッケージングする。ｓｃＡＡＶは、発現前に一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換する必要がないため、それらはより効率的なベクターである。しかしながら、この効率のトレードオフは、ベクターのコード容量が半分失われることから、ｓｃＡＡＶは、小さなタンパク質のコード遺伝子（最大約５５ｋｄ）に対して有用であり、現在ＲＮＡベースの療法に利用可能である。
１つのＡＡＶのカプシドが異種カプシドタンパク質に置き換えられている擬似型ベクターは、本発明に有用である。例示的な目的で、本明細書に記載されるＡＡＶｒｈ．９１カプシドを利用するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２のＩＴＲとともに、以下に記載の実施例で使用される。上で引用されたＭｕｓｓｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．を参照されたい。別途指定されない限り、ＡＡＶ ＩＴＲ、および本明細書に記載の他の選択されたＡＡＶ成分は、任意のＡＡＶ血清型の中から個別に選択され得、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、または他の既知もしくは未知のＡＡＶ血清型を含む。望ましい一実施形態では、ＡＡＶ血清型２のＩＴＲが使用される。しかし、他の好適な血清型由来のＩＴＲが選択されてもよい。これらのＩＴＲまたは他のＡＡＶ成分は、当業者に利用可能な技術を使用して、ＡＡＶ血清型から容易に単離され得る。かかるＡＡＶは、学術的、商業的、または公的資源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離または取得することができる。あるいは、ＡＡＶ配列は、文献またはデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなど）で利用可能であるような公開された配列を参照することによって、合成または他の好適な手段を通して取得され得る。
本明細書に記載のｒＡＡＶはまた、ベクターゲノムを含む。ベクターゲノムは、少なくとも、以下に記載される非ＡＡＶまたは異種の核酸配列（導入遺伝子）、およびその調節配列、ならびに５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）から構成される。カプシドタンパク質にパッケージングされ、選択された標的細胞に送達されるものが、このミニ遺
伝子である。
導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、または他の産物をコードする導入遺伝子に隣接するベクター配列に対して異種の核酸配列である。核酸コード配列は、標的細胞中で導入遺伝子の転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式で、調節成分に作動可能に連結される。異種核酸配列（導入遺伝子）は、任意の生物に由来し得る。ＡＡＶは、１つ以上の導入遺伝子を含み得る。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶｒｈ．９１ベクターが本明細書に提供され、エリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする配列を含む導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、イヌまたはネコのＥＰＯ遺伝子をコードする。かかる組換えベクターは、例えば、循環赤血球の量の減少を特徴とする対象における慢性腎疾患および他の状態を治療するためのレジメンでの使用に好適である。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶｒｈ．９１ベクターが本明細書に提供され、抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体をコードする配列を含む導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、イヌまたはネコの抗ＮＧＦ抗体をコードする。かかる組換えベクターは、例えば、対象における変形性関節症疼痛を治療するためのレジメンで使用するのに好適である。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶｒｈ．９１ベクターが本明細書に提供され、抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体をコードする配列を含む導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、イヌまたはネコの抗ＮＧＦ抗体をコードする。かかる組換えベクターは、例えば、対象における変形性関節症疼痛を治療するためのレジメンで使用するのに好適である。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶｒｈ．９１ベクターが本明細書で提供され、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）をコードする配列を含む導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、イヌまたはネコのＧＬＰ－１をコードする。かかる組換えベクターは、例えば、対象におけるＩＩ型糖尿病を治療するためのレジメンで使用するのに好適である。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶｒｈ．９１ベクターが本明細書で提供され、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）をコードする配列を含む導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、イヌまたはネコのＧＬＰ－１をコードする。かかる組換えベクターは、例えば、対象におけるＩＩ型糖尿病を治療するためのレジメンで使用するのに好適である。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶｒｈ．９１ベクターが本明細書に提供され、インスリンをコードする配列を含む導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、イヌまたはネコのインスリンをコードする。かかる組換えベクターは、例えば、対象におけるＩ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病を治療するためのレジメンで使用するのに好適である。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶｒｈ．９１ベクターが本明細書に提供され、例えば、抗体および受容体－ＩｇＧ融合タンパク質を含む、ＩｇＥ、ＩＬ－３２、またはＩＬ－４／ＩＬ－１３受容体のインターロイキン－４受容体α（ＩＬ－４Ｒα）サブユニットのアンタゴニストをコードする配列を含む導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、イヌまたはネコのＩｇＥ、ＩＬ－３２、またはＩＬ－４Ｒαサブユニットのアンタゴニストをコードする。かかる組換えベクターは、例えば、対象におけるアトピー性皮膚炎を治療するためのレジメンで使用するのに好適である。
導入遺伝子配列の組成は、得られたベクターが用いられる使用に依存する。例えば、あるタイプの導入遺伝子配列は、発現時に検出可能なシグナルを生成するレポーター配列を含む。かかるレポーター配列には、限定されないが、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、膜結合タンパク質（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を含む）、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質、および当該技術分野で周知の他のもの（それらを対象とする高親和性抗体が存在するか、または従来の手段によって産生され得るもの）、ならびに融合タンパク質（中でも、ヘマグルチニンまたはＭｙｃ由来の抗原タグドメインに適切に融合された膜結合タンパク質を含む）をコードするＤＮＡ配列が含まれる。
これらのコード配列は、それらの発現を駆動する調節エレメントに関連する場合、酵素、放射線、比色、蛍光または他の分光学的アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ、ならびに免疫学的アッセイ（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および免疫組織化学を含む）を含む従来の手段によって検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを有するベクターの存在は、β－ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイによって検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼである場合、シグナルを有するベクターは、ルミノメーターで色または光生成によって視覚的に測定することができる。
しかしながら、導入遺伝子は、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素、ドミナントネガティブ変異体、または触媒ＲＮＡなどの、生物学および医学において有用な産物をコードする非マーカー配列であることが望ましい。望ましいＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡを含む。有用なＲＮＡ配列の一例は、処置される動物において標的の核酸配列の発現を阻害または失わせる配列である。典型的には、好適な標的配列には、腫瘍標的およびウイルス性疾患が含まれる。そのような標的の例については、免疫原に関連するセクションで後述する腫瘍標的およびウイルスを参照されたい。
導入遺伝子は、遺伝子欠損を修正または改善するために使用され得る。遺伝子欠損は、正常な遺伝子が正常レベルよりも低く発現する欠損、または機能的な遺伝子産物が発現しない欠損を含み得る。代替的に、導入遺伝子は、細胞型または宿主で天然に発現されない生成物を細胞に提供し得る。好ましいタイプの導入遺伝子配列は、宿主細胞で発現される治療用タンパク質またはポリペプチドをコードする。本発明は、複数の導入遺伝子を使用することをさらに含む。ある状況では、異なる導入遺伝子は、タンパク質の各サブユニットをコードするために、または異なるペプチドもしくはタンパク質をコードするために使用することができる。これは、タンパク質サブユニットをコードするＤＮＡのサイズが大きい場合（例えば、免疫グロブリン、血小板由来成長因子、またはジストロフィンタンパク質）に望ましい。細胞がマルチサブユニットタンパク質を生成するために、異なるサブユニットの各々を含む組換えウイルスを細胞に感染させる。あるいは、タンパク質の異なるサブユニットは、同じ導入遺伝子によってコードされていてもよい。この場合、単一の導入遺伝子は、各サブユニットのＤＮＡが内部リボザイム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離された、各サブユニットをコードするＤＮＡを含む。これは、サブユニットの各々をコードするＤＮＡのサイズが小さい場合（例えば、サブユニットをコードするＤＮＡおよびＩＲＥＳの総サイズが５キロベース未満）に望ましい。ＩＲＥＳの代替として、翻訳後事象において自己切断する２Ａペプチドをコードする配列によってＤＮＡが分離されていてもよい。例えば、Ｍ．Ｌ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．
，７８（Ｐｔ １）：１３－２１（Ｊａｎ １９９７）、Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（１１）：８６４－８７３（Ｊｕｎｅ ２００１）、Ｋｌｕｍｐ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（１０）：８１１－８１７（Ｍａｙ ２００１）を参照されたい。この２Ａペプチドは、ＩＲＥＳよりも著しく小さく、スペースが制限因子である場合の使用に非常に好適である。より多くの場合、導入遺伝子が大きい場合、マルチサブユニットからなる場合、または２つの導入遺伝子が同時送達される場合、所望の導入遺伝子またはサブユニットを有するｒＡＡＶを同時投与することで、インビボでそれらをコンカテマー化して、単一のベクターゲノムを形成することが可能になる。そのような実施形態では、宿主細胞での同時発現のために、第１のＡＡＶは、単一の導入遺伝子を発現する発現カセットを有し得、第２のＡＡＶは、異なる導入遺伝子を発現する発現カセットを有し得る。しかし、選択される導入遺伝子は、任意の生物学的に活性な産物または他の産物（例えば、研究に望ましい産物）をコードすることができる。
好適な導入遺伝子または遺伝子産物の例としては、家族性高コレステロール血症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、および希少疾患またはみなしご病（ｏｒｐｈａｎ ｄｉｓｅａｓｅ）に関連するものが含まれ得る。かかる希少疾患の例としては、中でも、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン病、レット症候群（例えば、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ５１６０８）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症（例えば、フラタキシン）、脊髄小脳失調症関連ＡＴＸＮ２ ２型（ＳＣＡ２）／ＡＬＳ；ＡＬＳ関連ＴＤＰ－４３、プログラニュリン（ＰＲＧＮ）（前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性非流暢性失語症（ＰＮＦＡ）、および意味性認知症を含む非アルツハイマー型脳変性に関連する）が挙げられ得る。例えば、ｗｗｗ．ｏｒｐｈａ．ｎｅｔ／ｃｏｎｓｏｒ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／Ｄｉｓｅａｓｅ＿Ｓｅａｒｃｈ＿Ｌｉｓｔ．ｐｈｐ；ｒａｒｅｄｉｓｅａｓｅｓ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｉｓｅａｓｅｓを参照されたい。
導入遺伝子によってコードされる有用な治療用産物には、ホルモンならびに増殖因子および分化因子が含まれ、限定されないが、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦα）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ－ＩおよびＩＧＦ－ＩＩ）、形質転換増殖因子βスーパーファミリーのうちのいずれか１つ（ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン）、または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１－１５のうちのいずれか、成長因子のヘレグルイン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１つ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン（ＮＴ－３およびＮＴ－４／５）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのうちのいずれか１つ、ネトリン－１およびネトリン－２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ、チロシンヒドロキシラーゼが挙げられる。
他の有用な導入遺伝子産物としては、免疫系を制御するタンパク質が含まれ、限定されないが、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ－１～ＩＬ－２５（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、およびＩＬ－１８）、単球走化性タンパク質、白血病抑制因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、β、およびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆ
ｌｔ３リガンドなどのサイトカインおよびリンホカインが挙げられる。免疫系によって産生される遺伝子産物も本発明において有用である。これらには、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子、ならびに操作された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子が含まれるがこれらに限定されない。有用な遺伝子産物としては、補体調節タンパク質、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２、およびＣＤ５９などの補体調節タンパク質も含まれる。
さらに他の有用な遺伝子産物としては、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、制御性タンパク質、および免疫系タンパク質の受容体のうちのいずれか１つが含まれる。本発明は、コレステロール調節のための受容体を包含し、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体、およびスカベンジャー受容体を含む。本発明はまた、糖質コルチコイド受容体およびエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体および他の核受容体を含むステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーなどの遺伝子産物を包含する。加えて、有用な遺伝子産物としては、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ－１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニンなどの転写因子、タンパク質を含むＥＴＳボックス、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ－４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ－１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ－３、ならびに翼状螺旋タンパク質のフォークヘッドファミリーが含まれる。
他の有用な遺伝子産物としては、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、α－１アンチトリプシン、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンβシンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、β－グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）配列、およびジストロフィン配列、またはそれらの機能的断片が挙げられる。さらに他の有用な遺伝子産物は、酵素補充療法に有用であり得るような酵素を含み、これは酵素の不十分な活性に起因する様々な状態において有用である。例えば、マンノース－６－リン酸を含む酵素は、リソソーム蓄積症の療法に利用され得る（例えば、好適な遺伝子は、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードする遺伝子を含む）。別の例では、遺伝子産物は、ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ）である。さらに有用な遺伝子産物としては、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼファミリー１メンバーＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）が挙げられる。
他の有用な遺伝子産物としては、挿入、欠失、またはアミノ酸置換を含む非天然アミノ酸配列を有するキメラまたはハイブリッドポリペプチドなどの非天然ポリペプチドが含まれる。例えば、一本鎖操作された免疫グロブリンは、特定の免疫不全患者において有用であり得る。他の種類の非天然遺伝子配列としては、アンチセンス分子およびリボザイムなどの触媒核酸が含まれ、標的の過剰発現を低減するために使用され得る。
遺伝子の発現の低減および／または調節は、癌および乾癬と同様に、過増殖細胞を特徴とする過増殖状態の治療に特に望ましい。標的ポリペプチドとしては、正常細胞と比較し
て、過剰増殖細胞において排他的またはより高いレベルで産生されるポリペプチドが含まれる。標的抗原としては、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎなどの癌遺伝子、ならびに転座遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋ、およびＥＧＲＦによってコードされるポリペプチドが含まれる。標的抗原としての癌遺伝子産物に加えて、抗癌治療および保護レジメンのための標的ポリペプチドは、Ｂ細胞リンパ腫によって作製された抗体の可変領域およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域を含み、いくつかの実施形態では、自己免疫疾患の標的抗原としても使用される。他の腫瘍関連ポリペプチドは、モノクローナル抗体１７－１Ａおよび葉酸結合ポリペプチドによって認識されるポリペプチドを含む腫瘍細胞中でより高いレベルで見出されるポリペプチドなどの標的ポリペプチドとして使用することができる。
他の好適な治療用ポリペプチドおよびタンパク質としては、細胞の受容体および「自己」指向性の抗体を産生する細胞を含む自己免疫に関連する標的に対して広範な防御免疫応答を付与することにより、自己免疫性の疾患および障害に罹患している個体を治療するために有用であり得るものが含まれる。Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患としては、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、クローン病、および潰瘍性大腸炎が含まれる。これらの疾患の各々は、内因性抗原と結合し、自己免疫疾患に関連する炎症カスケードを開始するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を特徴とする。
さらに他の有用な遺伝子産物としては、血友病Ｂ（第ＩＸ因子を含む）および血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子およびそのバリアント、例えばヘテロ二量体およびＢ－欠失ドメインの軽鎖ならびに重鎖を含む；米国特許第６，２００，５６０号および米国特許第６，２２１，３４９号）を含む血友病の治療に使用されるものが含まれる。いくつかの実施形態では、ミニ遺伝子は、１０個のアミノ酸シグナル配列をコードする第ＶＩＩＩ因子重鎖の最初の５７塩基対、ならびにヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列を含む。代替的な実施形態では、ミニ遺伝子は、Ａ１およびＡ２ドメイン、ならびにＢドメインのＮ末端からの５個のアミノ酸、かつ／またはＢドメインのＣ末端の８５個のアミノ酸、ならびにＡ３、Ｃ１、およびＣ２ドメインをさらに含む。さらに他の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子重鎖および軽鎖をコードする核酸は、Ｂドメインの１４個のアミノ酸をコードする４２個の核酸によって分離される単一ミニ遺伝子内に提供される［米国特許第６，２００，５６０号］。
ｒＡＡＶを介して送達され得るさらなる例示的な遺伝子にとしては、限定されないが、グリコーゲン蓄積症または１Ａ型欠乏症（ＧＳＤ１）に関連するグルコース－６－ホスファターゼ、ＰＥＰＣＫ欠乏症に関連するホスホエノールピルビン酸－カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、発作および重度神経発達障害に関連するセリン／スレオニンキナーゼ９（ＳＴＫ９）としても知られるサイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）、ガラクトース血症に関連するガラクトース－１リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に関連するフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＧＯ／ＨＡＯ１）およびＡＧＸＴを含む原発性高シュウ酸尿症１型に関連する遺伝子産物、メープルシロップ尿症に関連する分枝鎖α－ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ、ＢＣＫＤＨ－Ｅ２、ＢＡＫＤＨ－Ｅ１ａ、およびＢＡＫＤＨ－Ｅ１ｂを含む）、チロシン血症１型に関連するフマリルアセト酢酸ヒドラーゼ、メチルマロン酸血症に関連するメチルマロニルＣｏＡムターゼ、中鎖アセチルＣｏＡ欠乏症に関連する中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症に関連するオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、シトルリン血症に関連するアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）、レシチン－コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）欠損症、アメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）、ニーマン・ピック病（Ｃ１型）に
関連するＮＰＣ１、プロピオンアカデミア（ＰＡ）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連遺伝性アミロイドーシスに関連するＴＴＲ、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）に関連する低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質、ＷＯ２０１５／１６４７７８に記載のＬＤＬＲバリアント、ＰＣＳＫ９、認知症に関連するＡｐｏＥおよびＡｐｏＣタンパク質、クリグラー・ナジャー病に関連するＵＤＰ－グルコウロシルトランスフェラーゼ、重症複合免疫不全症に関連するアデノシンデアミナーゼ、痛風およびレッシュ・ナイアン症候群に関連するヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ビオチミダーゼ欠損症に関連するビオチミダーゼ、ファブリー病に関連するα－ガラクトシダーゼＡ（ａ－ＧａｌＡ））、ＧＭ１ガングリオシドーシスに関連するβ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、ウィルソン病に関連するＡＴＰ７Ｂ、ゴーシェ病２型および３型に関連するβ－グルコセレブロシダーゼ、ツェルウェーガー症候群に関連するペルオキシソーム膜タンパク質７０ｋＤａ、異染性白質ジストロフィーに関連するアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、クラッベ病に関連するガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）酵素、ポンペ病に関連するα－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、ニーマン・ピック病Ａ型に関連するスフィンゴミエリナーゼ（ＳＭＰＤ１）遺伝子、成人発症ＩＩ型シトルリン血症（ＣＴＬＮ２）に関連するアルギニノコハク酸シンターゼ、尿素サイクル障害に関連するカルバモイルリン酸シンターゼ１（ＣＰＳ１）、脊髄性筋萎縮症に関連する生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質、ファーバー脂肪肉芽腫症に関連するセラミダーゼ、ＧＭ２ガングリオシドーシスおよびテイサックス病およびサンドホフ病に関連するβ－ヘキソサミニダーゼ、アスパルチル－グルコサミン尿症に関連するアスパルチルグルコサミニダーゼ、フコシドーシスに関連するα－フコシダーゼ、α－マンノシドーシスに関連するα－マンノシダーゼ、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）に関連するポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、α－１アンチトリプシン欠損症（気腫）の治療のためのα－１アンチトリプシン、サラセミアまたは腎不全による貧血の治療のためのエリスロポエチン、虚血性疾患の治療のための血管内皮増殖因子、アンジオポエチン－１、および線維芽細胞増殖因子、例えば、アテローム性動脈硬化症、血栓症、または塞栓症に見られる閉塞した血管の治療のためのトロンボモジュリンおよび組織因子の経路の阻害剤、パーキンソン病の治療のための芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、うっ血性心不全の治療のためのβアドレナリン受容体、ホスホランバンに対するアンチセンスまたはその変異体、筋小胞体（小胞体）アデノシントリホスファターゼ－２（ＳＥＲＣＡ２）、および心臓アデニル酸シクラーゼ、様々な癌の治療のためのｐ５３などの腫瘍抑制遺伝子、炎症性障害および免疫障害および癌の治療のための様々なインターロイキンのうちの１つのようなサイトカイン、筋ジストロフィーの治療のためのジストロフィンまたはミニジストロフィンおよびユートロフィンまたはミニユートロフィン、ならびに糖尿病の治療のためのインスリンまたはＧＬＰ－１が挙げられる。
代替的に、または追加的に、本発明のベクターは、本発明のＡＡＶ配列および選択された免疫原に対する免疫応答を誘導するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする導入遺伝子を含み得る。例えば、免疫原が、様々なウイルスファミリーから選択され得る。免疫応答が望まれる望ましいウイルスファミリーの例としては、ピコルナウイルスファミリーが挙げられ、感冒の症例の約５０％を担うライノウイルス属、ポリポリオウイルスオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、およびＡ型肝炎ウイルスなどのヒトエンテロウイルスを含むエンテロウイルス属、ならびに主に非ヒト動物における口蹄疫を担うアプトウイルス属が含まれる。ウイルスのピコルナウイルスファミリー内で、標的抗原は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、およびＶＰＧを含む。別のウイルスファミリーとしては、カルシウイルスファミリーが挙げられ、流行性胃腸炎の重要な原因病原体であるノーウォークウイルス群を包含する。ヒトおよび非ヒト動物における免疫応答を誘導するための標的化抗原で使用するための望ましいさらに別のウイルスファミリーは、トガウイルスファミリーであり、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、およびベネズエラ、東部、および西部ウマ脳炎ウイルス、ならびに風疹ウイルスを含むルビウイルス
を含むアルファウイルス属を含む。フラビウイルス科には、デング熱、黄熱病、日本脳炎、セントルイス脳炎およびダニ媒介性脳炎ウイルスが含まれる。他の標的抗原は、Ｃ型肝炎ウイルスまたはコロナウイルスのファミリーから生成され得、それらは、伝染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ブタ）、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）、およびヒト呼吸器コロナウイルスなどのいくつかの非ヒトウイルスを含み、これらは、感冒および／または非Ａ型、Ｂ型、またはＣ型肝炎を引き起こし得る。コロナウイルスファミリー内の標的抗原としては、Ｅ１（Ｍまたはマトリックスタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ２（Ｓまたはスパイクタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ３（ＨＥまたはヘマグルチン－エルテロースとも呼ばれる）糖タンパク質（すべてのコロナウイルスに存在しない）、またはＮ（ヌクレオカプシド）が挙げられる。さらに他の抗原は、ラブドウイルスファミリーを標的にしてもよく、これには、ベシクロウイルス属（例えば、小胞性口内炎ウイルス）、および一般的なリッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）が含まれる。ラブドウイルスファミリー内で、好適な抗原は、Ｇタンパク質またはＮタンパク質に由来し得る。フィロウイルス科には、マールブルグウイルスおよびエボラウイルスなどの出血熱ウイルスが含まれ、抗原の好適な供給源であり得る。パラミキソウイルスファミリーには、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルブラウイルス（ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫ウイルス、麻疹ウイルス、およびイヌジステンパーを含むモルビリウイルス、ならびに呼吸器合胞体ウイルスを含むニューモウイルスが含まれる。インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルスファミリー内に分類され、抗原（例えば、ＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）の好適な供給源である。ブニヤウイルスファミリーには、ブニヤウイルスブニヤウイルス属（カリフォルニア脳炎、ラクロス）、フレボウイルス属（リフトバレー熱）、ハンタウイルス属（ピュレマラはヘマハギン熱ウイルス）、ナイロウイルス属（ナイロビヒツジ病）、および様々な未分類のブンガウイルスが含まれる。アレナウイルスファミリーは、ＬＣＭおよびラッサ熱ウイルスに対する抗原の供給源を提供する。レオウイルスファミリーには、レオウイルス属、ロタウイルス属（小児に急性胃腸炎を引き起こす）、オルビウイルス、およびカルチウイルス（コロラドダニ熱、レボンボ（ヒト）、ウマ脳症、ブルータング）が含まれる。
レトロウイルスファミリーには、ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩおよびＨＴＬＶＩＩ、レンチウイルス（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、およびスプマウイルスを含む）などのヒト疾患および獣医疾患を包含するオンコリウイルス亜科が含まれる。ＨＩＶとＳＩＶとの間には、多くの好適な抗原が記載されており、容易に選択することができる。好適なＨＩＶおよびＳＩＶの抗原の例としては、限定されないが、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｘ、ＶＰＲ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、およびＲｅｖのタンパク質、ならびにそれらの様々な断片が挙げられる。さらに、これらの抗原に対する様々な修飾が記載されている。この目的のための好適な抗原は、当業者に既知である。例えば、他のタンパク質のうち、ｇａｇ、ｐｏｌ、ＶｉｆおよびＶｐｒ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、ならびにＲｅｖをコードする配列を選択してもよい。例えば、米国特許第５，９７２，５９６号に記載されている修飾ｇａｇタンパク質を参照されたい。また、Ｄ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（５）：２４６２－２４６７（Ｍａｒｃｈ ２００１），ａｎｄ Ｒ．Ｒ．Ａｍａｒａ，ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９－７４（６ Ａｐｒｉｌ ２００１）に記載されているＨＩＶおよびＳＩＶタンパク質も参照されたい。これらのタンパク質またはそのサブユニットは、単独で、または別個のベクターを介してもしくは単一のベクターからの組み合わせで送達され得る。
パポバウイルスファミリーには、ポリオーマウイルス亜科（ＢＫＵおよびＪＣＵウイル
ス）ならびにパピローマウイルス亜科（癌またはパピローマの悪性進行に関連する）が含まれる。アデノウイルスファミリーには、呼吸器疾患および／または腸炎を引き起こすウイルス（例えば、ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）が含まれる。パルボウイルスファミリーには、ネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコパンロイコペニアウイルス、イヌパルボウイルス、およびブタパルボウイルスが含まれる。ヘルペスウイルスファミリーには、シンプレックスウイルス属（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、バリセロウイルス属（仮性狂犬病、水痘帯状疱疹）を含むアルファヘルペスウイルス亜科、およびサイトメガロウイルス属（ＨＣＭＶ、ムロメガロウイルス）を含むベータヘルペスウイルス亜科、ならびにリンホクリプトウイルス属、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、感染性鼻気管炎、マレック病ウイルス、およびラジノウイルスを含むガンマヘルペスウイルス亜科が含まれる。ポックスウイルスファミリーには、オルソポックスウイルス属（痘瘡（天然痘）およびワクシニア（牛痘））、パラポックスウイルス、トリポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルスを包含するコードポックスウイルス亜科、およびエントモポックスウイルス亜科が含まれる。ヘパドナウイルスファミリーには、Ｂ型肝炎ウイルスが含まれる。抗原の好適な供給源であり得る１つの非分類ウイルスは、デルタ型肝炎ウイルスである。さらに他のウイルス源には、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスおよびブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスが含まれる。アルファウイルスファミリーには、ウマ動脈炎ウイルスおよび様々な脳炎ウイルスが含まれる。
本発明はまた、ヒトおよび非ヒト脊椎動物に感染する細菌、真菌、寄生微生物、もしくは多細胞性寄生虫を含む他の病原体に対して、または癌細胞もしくは腫瘍細胞から、ヒトまたは非ヒト動物を免疫化するのに有用な免疫原を包含し得る。細菌病原体の例には、病原性グラム陽性球菌、肺炎球菌、ブドウ球菌、および連鎖球菌が含まれる。病原性グラム陰性球菌には、髄膜炎菌、淋菌が含まれる。病原性腸内グラム陰性桿菌には、腸内細菌科（シュードモナス、アシネトバクテリア、およびエイケネラを含む）、類鼻疽、サルモネラ、シゲラ、ヘモフィルス、モラクセラ、Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ（軟性下疳を引き起こす）、ブルセラ、Ｆｒａｎｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（野兎病を引き起こす）、エルシニア（パスツレラ属）、ストレプトバチルス、モニリフォルミス、およびスピリラムが含まれる。グラム陽性桿菌には、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ（ジフテリア）、コレラ、炭疽菌（炭疽病）、ドノヴァン症（鼠径肉芽腫）、およびバルトネラ症が含まれる。病原性嫌気性細菌によって引き起こされる疾患としては、破傷風、ボツリヌス症、他のクロストリジウム、結核、ハンセン病、および他のマイコバクテリアが挙げられる。病原性スピロヘータ疾患には、梅毒、トレポネーマ症（いちご腫、ピンタ、および地方病性梅毒）、およびレプトスピラ症が含まれる。高病原性細菌および病原性真菌によって引き起こされる他の感染症としては、放線菌症、ノーカルジオーシス、クリプトコッカス症、ブラストミセス症、ヒストプラズマ症、およびコクチジオイデス症、カンジダ症、アスペルギルス症、およびムコール症、スポロトリクム症、パラコクシジオイデス症、ペトリエリジア症、トルロプシス症、マイセトーマ、およびクロモミセス症、ならびに皮膚糸状菌症が挙げられる。リケッチア感染症には、チフス熱、ロッキー山紅斑熱、Ｑ熱、およびリケッチア痘が含まれる。クラミジア属マイコプラズマおよびクラミジア感染症の例としては、マイコプラズマ肺炎、性病性リンパ肉芽腫、オウム病、および周産期クラミジア感染症が挙げられる。病原性真核生物は、病原性原虫および蠕虫、ならびにそれによって生じる感染症を包含し、アメーバ症、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、トキソプラズマ症、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、トリチャン、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、バベシオーシス、バベシア症、ジアルジア症、旋毛虫症、フィラリア症、住血吸虫症、線虫、吸虫またはフルーク、および条虫（サナダムシ）感染症が挙げられる。
これらの生物および／またはそれによって生成された毒素の多くは、疾患管理センター
［（ＣＤＣ）、保健福祉省、米国］によって、生物攻撃で使用される可能性がある病原体として特定されている。例えば、これらの生物学的薬剤病原体の一部には、以下が含まれる：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽病）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍおよびその毒素（ボツリヌス症）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ（ペスト菌）、大痘瘡（天然痘）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（野兎病）、およびウイルス性出血熱は、現在、これらのすべてがカテゴリーＡ病原体に分類されており、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ（Ｑ熱）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ種（ブルセラ症）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ（鼻疽）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓおよびその毒素（リシン毒素）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓおよびその毒素（イプシロン毒素）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ菌種およびその毒素（エンテロトキシンＢ）は、現在、これらのすべてがカテゴリーＢ病原体に分類されており、ならびに二パンウイルスおよびハンタウイルスは、カテゴリーＣ病原体に分類されている。さらに、このように分類されるか、または分類が異なる他の生物は、将来的にかかる目的のために特定および／または使用され得る。本明細書に記載のウイルスベクターおよび他の構築物が、これらの生物、ウイルス、それらの毒素、または他の副産物由来の抗原を送達するのに有用であり、これらの生物学的病原体による感染または他の有害反応を予防および／または治療することが容易に理解されるであろう。
Ｔ細胞の可変領域に対して免疫原を送達するための本発明のベクターの投与は、それらのＴ細胞を排除するためのＣＴＬを含む免疫応答を誘発する。関節リウマチ（ＲＡ）では、疾患に関与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のいくつかの特定の可変領域が特徴付けられている。これらのＴＣＲには、Ｖ－３、Ｖ－１４、Ｖ－１７およびＶα－１７が含まれる。したがって、これらのポリペプチドのうちの少なくとも１つをコードする核酸配列の送達は、ＲＡに関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘発するであろう。多発性硬化症（ＭＳ）では、疾患に関与するＴＣＲのいくつかの特定の可変領域が特徴付けられている。これらのＴＣＲには、Ｖ－７およびＶα－１０が含まれる。したがって、これらのポリペプチドのうちの少なくとも１つをコードする核酸配列の送達は、ＭＳに関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘発するであろう。強皮症では、疾患に関与するＴＣＲのいくつかの特定の可変領域が特徴付けられている。これらのＴＣＲには、Ｖ－６、Ｖ－８、Ｖ－１４、ならびにＶα－１６、Ｖα－３Ｃ、Ｖα－７、Ｖα－１４、Ｖα－１５、Ｖα－１６、Ｖα－２８、およびＶα－１２が含まれる。したがって、これらのポリペプチドのうちの少なくとも１つをコードする核酸分子の送達は、強皮症に関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘発するであろう。
一実施形態では、導入遺伝子は、光遺伝学療法を提供するように選択される。光遺伝学療法では、人工光受容体は、残りの網膜回路における生存細胞型への光活性化チャネルまたはポンプの遺伝子送達によって構築される。これは、かなりの量の光受容体機能を失ってはいるが、神経節細胞および視神経への双極細胞の回路がそのまま残っている患者に特に有用である。一実施形態では、異種核酸配列（導入遺伝子）は、オプシンである。オプシン配列は、ヒト、藻類、および細菌を含む任意の好適な単細胞生物または多細胞生物に由来することができる。一実施形態では、オプシンは、ロドプシン、フォトプシン、Ｌ／Ｍ波長（赤／緑）－オプシン、または短波長（Ｓ）オプシン（青）である。別の実施形態では、オプシンは、チャネルロドプシンまたはハロロドプシンである。
別の実施形態では、導入遺伝子は、遺伝子増強療法で使用するため、すなわち、欠損しているまたは欠陥のある遺伝子の置換コピーを提供するために選択される。この実施形態では、導入遺伝子は、必要な置換遺伝子を提供するために、当業者によって容易に選択され得る。一実施形態では、欠損／欠陥遺伝子は、眼障害に関連する。別の実施形態では、導入遺伝子は、ＮＹＸ、ＧＲＭ６、ＴＲＰＭ１Ｌ、またはＧＰＲ１７９であり、眼障害は、先天性停止性夜盲症である。例えば、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０１３ Ｊａ
ｎ １０；９２（１）：６７－７５を参照されたい。Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｄｅｃ １３を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。別の実施形態では、導入遺伝子は、ＲＰＧＲである。
別の実施形態では、導入遺伝子は、遺伝子抑制療法における使用のために選択され、すなわち、１つ以上の天然遺伝子の発現が、転写または翻訳のレベルで、中断または抑制される。これは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または当該技術分野で周知の他の技術を使用して達成することができる。例えば、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１０ Ｆｅｂ １；１２６（３）：７６４－７４およびＯ’Ｒｅｉｌｌｙ
Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２００７ Ｊｕｌ；８１（１）：１２７－３５を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。この実施形態では、導入遺伝子は、サイレンシングされることが望まれる遺伝子に基づいて、当業者によって容易に選択され得る。
別の実施形態では、導入遺伝子は、２つ以上の導入遺伝子を含む。これは、２つ以上の異種配列を有する単一のベクターを使用して、または各々が１つ以上の異種配列を有する２つ以上のＡＡＶを使用して達成され得る。一実施形態では、ＡＡＶは、遺伝子抑制（またはノックダウン）併用療法および遺伝子増強併用療法に使用される。ノックダウン／増強併用療法では、目的の遺伝子の欠陥コピーがサイレンシングされ、非変異コピーが供給される。一実施形態では、これは、２つ以上の同時投与ベクターを使用して達成される。Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ－Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｐｒｉｌ ２０１１，１９（４）：６４２－６４９を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。導入遺伝子は、所望の結果に基づいて、当業者によって容易に選択され得る。
別の実施形態では、導入遺伝子は、遺伝子修正療法での使用のために選択される。これは、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）誘導ＤＮＡ二本鎖切断を、外因性ＤＮＡドナー基質と併せて使用して達成され得る。例えば、Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（ｅｐｕｂ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１２）２０：３５－４２を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。導入遺伝子は、所望の結果に基づいて、当業者によって容易に選択され得る。
一実施形態では、本明細書に記載のカプシドは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓデュアルベクターシステムにおいて有用であり、米国仮特許出願第６１／１５３，４７０号、第６２／１８３，８２５号、第６２／２５４，２２５号、および第６２／２８７，５１１号に記載されている（その各々は、参照により本明細書に援用される）。カプシドは、ホーミングエンドヌクレアーゼまたは他のメガヌクレアーゼの送達にも有用である。
別の実施形態では、本明細書で有用な導入遺伝子は、発現時に検出可能なシグナルを生成するレポーター配列を含む。かかるレポーター配列には、限定されないが、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、膜結合タンパク質（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を含む、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質、および当該技術分野で周知の他のもの（それらを対象とする高親和性抗体が存在するか、または従来の手段によって産生され得るもの）、ならびに融合タンパク質（中でも、ヘマグルチニンまたはＭｙｃ由来の抗原タグドメインに適切に融合された膜結合タンパク質を含む）をコードするＤＮＡ配列が含まれる。
これらのコード配列は、それらの発現を駆動する調節エレメントに関連する場合、酵素
、放射線、比色、蛍光または他の分光学的アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ、ならびに免疫学的アッセイ（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および免疫組織化学を含む）を含む従来の手段によって検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを有するベクターの存在は、β－ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイによって検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼである場合、シグナルを有するベクターは、ルミノメーターで色または光生成によって視覚的に測定することができる。
導入遺伝子は、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素、または触媒ＲＮＡなどの、生物学および医学において有用な産物をコードすることが望ましい。望ましいＲＮＡ分子は、ｓｈＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡを含む。有用なＲＮＡ配列の一例は、処置される動物において標的の核酸配列の発現を失わせる配列である。
調節配列は、ベクターでトランスフェクトされた、または本明細書に記載されるように産生されたウイルスで感染された細胞でその転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式で、導入遺伝子と作動可能に連結される従来の制御エレメントを含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」配列は、目的の遺伝子と隣接する発現制御配列、および目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたは離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。
タンパク質または核酸を参照して使用される場合、「異種」という用語は、タンパク質または核酸が、天然では互いに同じ関係で見出されない２つ以上の配列またはサブ配列を含むことを示す。例えば、新規の機能的核酸を作製するために配置された関連しない遺伝子からの２つ以上の配列を有する核酸は、典型的に、組換えにより産生される。例えば、一実施形態では、核酸は、１つの遺伝子由来のプロモーターを有し、異なる遺伝子由来のコード配列の発現を指示するように配置される。したがって、コーディング配列に関しては、プロモーターは、異種性である。
発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター、およびエンハンサーの配列、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）のシグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強させる配列、および必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強させる配列を含み得る。プロモーターを含む多数の発現制御配列が当該分野で既知であり、利用することができる。
本明細書に提供される構築物に有用な調節配列はまた、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と遺伝子との間に位置するイントロンを含み得る。１つの所望のイントロン配列は、ＳＶ－４０に由来し、ＳＤ－ＳＡと称される１００ｂｐのミニイントロンスプライスドナー／スプライスアクセプターである。別の好適な配列としては、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後エレメントが挙げられる。（例えば、Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｉ．Ｖｅｒｍａ，１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９６：３９０６－３９１０を参照されたい）。ＰｏｌｙＡシグナルは、限定されないが、ＳＶ－４０、ヒト、およびウシを含む多くの好適な種に由来し得る。
本明細書に記載の方法に有用なｒＡＡＶの別の調節成分は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列、または他の好適なシステムは、単一の遺伝子転写物から２つ以上のポリペプチドを生成するために使用され得る。ＩＲＥＳ（または他の好適な配列）を用いて、２つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生するか、または同じ細胞からまたは同じ細胞内で２つの異なるタンパク質を発現させる。例示的なＩＲＥＳは
、ポリオウイルス内部リボソーム進入配列であり、光受容器、ＲＰＥ、および神経節細胞における導入遺伝子の発現を支持する。好ましくは、ＩＲＥＳは、ｒＡＡＶベクター内の導入遺伝子の３’に位置する。
一実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、プロモーター（またはプロモーターの機能的断片）を含む。ｒＡＡＶに用いられるプロモーターは、所望の標的細胞において選択された導入遺伝子を発現することができる多数の構成的または誘導性プロモーターの中から、選択がなされ得る。一実施形態では、標的細胞は、視覚細胞である。プロモーターは、ヒトを含む任意の種に由来し得る。望ましくは、一実施形態では、プロモーターは、「細胞特異的」である。「細胞特異的」という用語は、組換えベクターについて選択された特定のプロモーターが、特定の細胞組織において選択された導入遺伝子の発現を導くことができることを意味する。一実施形態では、プロモーターは、筋肉細胞における導入遺伝子の発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは、肺における発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは、肝細胞における導入遺伝子の発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは、気道上皮における導入遺伝子の発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは、ニューロンにおける導入遺伝子の発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは、心臓における導入遺伝子の発現に特異的である。
発現カセットは、典型的には、発現制御配列の一部として、例えば、選択される５’ＩＴＲ配列と免疫グロブリン構築物のコード配列との間に位置するプロモーター配列を含む。一実施形態では、肝臓における発現が望ましい。したがって、一実施形態では、肝臓特異的プロモーターが使用される。組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、調節可能なプロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８およびＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい］、または生理学的手がかりに応答するプロモーターが、本明細書に記載のベクターに使用され得る。別の実施形態では、筋肉における発現が望ましい。したがって、一実施形態では、筋肉特異的プロモーターが使用される。一実施形態では、プロモーターは、ｄＭＣＫ（５０９ｂｐ）またはｔＭＣＫ（７２０ｂｐ）のプロモーターなどのＭＣＫベースのプロモーターである。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ Ｎｏｖ；１５（２２）：１４８９－９９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２００８．１０４．Ｅｐｕｂ ２００８ Ｊｕｎ １９を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。別の有用なプロモーターは、ＳＰｃ５－１２プロモーターである。Ｒａｓｏｗｏ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｊｕｎｅ ２０１４ ｅｄｉｔｉｏｎ ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１８を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。一実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、ＴＢＧプロモーターである。別の実施形態では、ＣＢ７プロモーターまたはＣＡＧプロモーターが使用される。ＣＢ７は、サイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを有するニワトリβアクチンプロモーターである。あるいは、他の肝臓特異的プロモーターが使用され得る［例えば、肝臓特異的プロモーターデータベース，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：ｒｕｌａｉ．ｓｃｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤ、α１抗－トリプシン（Ａ１ＡＴ）、ヒトアルブミン：Ｍｉｙａｔａｋｅ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４ ３２（１９９７）、ｈｕｍＡｌｂ、およびＢ型肝炎ウイルスコアプロモーター：Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２ ９（１９９６）を参照されたい］。ＴＴＲ最小エンハンサー／プロモーター、α－アンチトリプシンプロモーター、ＬＳＰ（８４５ｎｔ）２５（イントロンレスｓｃＡＡＶを必要とする）。
プロモーターは、異なる供給源、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリモマウイルスプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）または神経膠原線維酸性タ
ンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）潜伏関連プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックス金属タンパク質プロモーター（ＭＰＰ）、およびニワトリβアクチンプロモーターから選択され得る。
発現カセットは、少なくとも１つのエンハンサー、すなわち、ＣＭＶエンハンサーを含んでもよい。さらに他のエンハンサーエレメントとしては、例えば、アポリポタンパク質エンハンサー、ゼブラフィッシュエンハンサー、ＧＦＡＰエンハンサー要素、およびＷＯ２０１３／１５５５２２２に記載されているような脳特異的エンハンサー、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメントが挙げられ得る。追加的に、または代替的に、他の、例えば、ハイブリッドのヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）－最初期（ＩＥ）－ＰＤＧＲプロモーターまたは他のプロモーター－エンハンサーエレメントが選択されてもよい。本明細書で有用な他のエンハンサー配列としては、ＩＲＢＰエンハンサー（Ｎｉｃｏｕｄ ２００７，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２００７ Ｄｅｃ；９（１２）：１０１５－２３）、最初期サイトメガロウイルスエンハンサー、免疫グロブリン遺伝子またはＳＶ４０エンハンサーに由来するもの、マウス近位プロモーターで同定されたシス作用性エレメントなどが挙げられる。
プロモーターに加えて、発現カセットおよび／またはベクターは、好適な転写開始配列、終結配列、エンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強させる配列、および必要に応じて、コードされた生成物の分泌を増強させる配列を含み得る。様々な好適なポリＡが知られている。一例では、ポリＡは、１２７ｂｐのウサギβグロビンポリアデニル化シグナル（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｖ００８８２．１）などのウサギβグロビンである。他の実施形態では、ＳＶ４０ポリＡシグナルが選択される。さらに他の好適なポリＡ配列が選択されてもよい。特定の実施形態では、イントロンが含まれる。１つの好適なイントロンは、ニワトリβアクチンイントロンである。一実施形態では、イントロンは、８７５ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ、＃Ｘ００１８２．１）である。別の実施形態では、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なキメライントロンが使用される。しかしながら、他の好適なイントロンが選択されてもよい。一実施形態では、スペーサーは、ベクターゲノムが天然のＡＡＶベクターゲノムとほぼ同じサイズ（例えば、４．１～５．２ｋｂ）であるように含まれる。一実施形態では、スペーサーは、ベクターゲノムが約４．７ｋｂであるように含まれる。Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｉｚｅ ｏｎ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｊａｎ；１８（１）：８０－８６を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。
これらおよび他の一般的なベクターおよび調節エレメントの選択は従来行われており、多くのそのような配列が利用可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｃｉｔｅｄ ｔｈｅｒｅｉｎ ａｔ，ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ，ｐａｇｅｓ ３．１８－３．２６ ａｎｄ １６．１７－１６．２７ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい。もちろん、すべのベクターおよび発現制御配列が、本明細書に記載されているように、すべての導入遺伝子を発現するように良好に十分に等しく機能するわけではない。しかしながら、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、これらおよび他の発現制御配列の中から選択することができる。
特定の実施形態では、発現カセットは、ｍｉＲ－１８３の標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、（配列番号１３）を含むｍｉＲ－１８３標的配列を含む
Figure 2022530544000006
（ｍｉＲ－１８３シード配列に相補的な配列には、下線が引かれている）。特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、ｍｉＲ－１８３シード配列に１００％相補的な配列を、２コピー以上（例えば、２または３コピー）含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８３シード配列に少なくとも１００％相補的な少なくとも１つの領域を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号１３に部分的に相補的な配列を含み、したがって、配列番号１３と整列させた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号１３と整列させた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、１００％相補的な領域を含み、また、ｍｉＲ－１８３標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８３シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８３と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３標的配列を含み、切断された配列番号１３（すなわち、配列番号１３の５’末端もしくは３’末端のいずれかまたは両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを欠く配列）を含む。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、導入遺伝子と、１つのｍｉＲ－１８３標的配列とを含む。さらに他の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、少なくとも２つ、３つ、または４つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。
特定の実施形態では、発現カセットは、ｍｉＲ－１８２の標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、ｍｉＲ－１８２標的配列を含み、ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号１４）を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、ｍｉＲ－１８２シード配列に１００％相補的である配列を、２コピー以上（例えば、２または３コピー）含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８２シード配列に少なくとも１００％相補的な少なくとも１つの領域を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、配列番号１４に部分的に相補的な配列を含み、したがって、配列番号１４と整列させた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号１４と整列させた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、１００％相補的な領域を含み、また、ｍｉＲ－１８２標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８２シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８２と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８２標的配列を含み、切断された配列番号１４（すなわち、配列番号１４の５’末端もしくは３’末端のいずれかまたは両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを欠く配列）を含む。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、導入遺伝子と、１つのｍｉＲ－１８２標的配列とを含む。さらに他の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、少なくとも２つ、３
つ、または４つのｍｉＲ－１８２標的配列を含む。
「タンデムリピート」という用語は、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の存在を指すように本明細書で使用される。これらのｍｉＲＮＡ標的配列は、連続的であってもよい。すなわち、ある配列の３’末端が、介在配列なしで、次の配列の５’末端の直ぐ上流にあるように、またはその逆でもよく、次々と直に位置している。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上が、短いスペーサー配列によって分離されている。
本明細書で使用される場合、「スペーサー」としては、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長の任意の選択された核酸配列であり、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の間に位置する。特定の実施形態では、スペーサーは、１～８ヌクレオチド長、２～７ヌクレオチド長、３～６ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、４～９ヌクレオチド、３～７ヌクレオチド、またはより長い値である。好適には、スペーサーは、非コード配列である。特定の実施形態では、スペーサーは、４つの（４）ヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、スペーサーは、ＧＧＡＴである。特定の実施形態では、スペーサーは、６つの（６）ヌクレオチドである。特定の実施形態では、スペーサーは、ＣＡＣＧＴＧまたはＧＣＡＴＧＣである。
特定の実施形態では、タンデムリピートは、２つ、３つ、４つ以上の同じｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、タンデムリピートは、少なくとも２つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、少なくとも３つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、または少なくとも４つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列などを含む。特定の実施形態では、タンデムリピートは、２つまたは３つの同じｍｉＲＮＡ標的配列、および異なる第４のｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。
特定の実施形態では、発現カセットには、少なくとも２つの異なるセットのタンデムリピートが存在し得る。例えば、３’ＵＴＲは、導入遺伝子、ＵＴＲ配列のすぐ下流にタンデムリピート、およびＵＴＲの３’末端の近くに２つ以上のタンデムリピートを含み得る。別の例では、５’ＵＴＲは、１つ、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。別の例では、３’は、タンデムリピートを含んでもよく、５’ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。
特定の実施形態では、発現カセットは、２つ、３つ、４つ以上のタンデムリピートを含み、導入遺伝子の終止コドンの約０～２０ヌクレオチド以内に開始する。他の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の終止コドンから少なくとも１００～約４０００ヌクレオチドのｍｉＲＮＡタンデムリピートを含む。
２０１８年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／７８３，９５６号（参照により本明細書に援用される）に対する優先権を主張する、２０１９年１２月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／６７８７２号を参照されたい。
別の実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルスを生成する方法が提供される。好適な組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、宿主細胞を培養することによって生成され、宿主細胞は、本明細書に記載されるＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列、またはその断片、機能的ｒｅｐ遺伝子、最低限ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）および所望の導入遺伝子をコードする異種核酸配列からなるミニ遺伝子、ならびにミニ遺伝子をＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングするのを可能にする十分なヘルパー機能を含む。ＡＡＶミニ遺伝子をＡＡＶカプシドにパッケージングするために宿主細胞中で培養される必要がある成分は、トランスで宿主細胞に提供され得る。代替的に、必要な成分（例えば、ミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および／またはヘルパー機能）のうちの任意の１つ以
上は、当業者に既知の方法を使用して、必要な成分のうちの１つ以上を含有するように操作された安定な宿主細胞によって提供され得る。カプシド、コーディング配列を生成する方法、したがって、およびｒＡＡＶウイルスベクターを産生する方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）およびＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。
また、本明細書に記載されるｒＡＡＶで形質導入された宿主細胞も、本明細書に提供される。最も好適には、かかる安定な宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下で必要な成分を含むであろう。しかしながら、必要な成分は、構成的プロモーターの制御下にあり得る。好適な誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターの例は、導入遺伝子との使用に好適な調節エレメントの以下の考察において、本明細書に提供される。さらに別の代替として、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下にある選択された成分と、１つ以上の誘導性プロモーターの制御下にある他の選択された成分とを含み得る。例えば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下にあるＥ１ヘルパー機能を含む）に由来するが、誘導性プロモーターの制御下にあるｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含む、安定な宿主細胞が生成され得る。さらに他の安定な宿主細胞は、当業者によって生成され得る。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載される核酸分子を含む。特定の実施形態では、記載される新規のベクターは、既知のカプシドと比較して、改善された産生（すなわち、より高い収率）を有する。例えば、ＡＡＶｒｈ．９１ベクターの産生は、ＡＡＶ１およびＡＡＶ６と比較して、改善された収率を示した。
本明細書に記載のｒＡＡＶの産生に必要なミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、およびヘルパー機能は、それに担持される配列を導入する任意の遺伝要素の形態で、パッケージング宿主細胞に送達され得る。選択される遺伝要素は、任意の好適な方法によって送達され得、本明細書に記載の方法を含む。本発明の任意の実施形態を構築するために使用される方法は、核酸操作における技術者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は周知であり、好適な方法の選択は、本発明を限定するものではない。例えば、特に、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９３ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２および米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。これらの刊行物は、参照により本明細書に援用される。本明細書に記載のベクターの産生に使用するためのプラスミドもまた、本明細書に提供される。
Ｃ．医薬組成物および投与
一実施形態では、上で詳述した標的細胞で使用するための所望の導入遺伝子およびプロモーターを含む組換えＡＡＶは、任意選択的に、従来の方法によって汚染について評価され、次いで、医薬組成物に製剤化され、それを必要とする対象への投与が意図される。かかる製剤は、薬学的および／または生理学的に許容されるビヒクルまたは担体（適切な生理学的レベルでｐＨを維持するための、緩衝生理食塩水または他の緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）など）、および任意選択的に、他の薬剤（ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ａｇｅｎｔｓ）、薬剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔｓ）、安定化剤、緩衝液、担体、アジュバント、希釈剤などを含む。注射の場合、担体は、典型的には液体である。例示的な生理学的に許容される担体としては、発熱物質不含の滅菌水および発熱物質不含の滅菌リン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。かかる様々な既知の担体は、米国特許公開第７，６２９，３２２号に提供されている（参照により本明細書に援用される）。一実施形態では、担体は等張塩化ナトリウム溶液である。別の実施形態では、担体は、平衡塩類溶液である。一実施形態では、担体は、Ｔｗｅｅｎを含む。ウイルスを長期保存する場合は、グリセ
ロールまたはＴｗｅｅｎ２０の存在下で凍結してもよい。別の実施形態では、薬学的に許容される担体は、パーフルオロオクタン（Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｎ液）などの界面活性剤を含む。ベクターは、ヒト対象における注入に好適な緩衝液／担体中に製剤化される。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが注入チューブに付着するのを防ぐが、インビボでｒＡＡＶ結合活性を妨げない成分を含むべきである。
本明細書に記載の方法の特定の実施形態では、上に記載の医薬組成物は、対象に筋肉内（ＩＭ）投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、静脈内（ＩＶ）投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、脳室内（ＩＣＶ）注入によって投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、大槽内（ＩＣＭ）注入によって投与される。本明細書に記載の方法に有用であり得る他の形態の投与には、これらに限定されないが、網膜下または硝子体内送達を含む所望の臓器（例えば、眼）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、気管内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、および他の親の投与経路が含まれる。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。
本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」または「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への、より詳細には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔空間内への注入を介した、投与経路を指す。髄腔内送達は、腰椎穿刺、脳室内（側脳室内（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／槽内、および／またはＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰部穿刺により、クモ膜下腔空間にわたって拡散させるために導入され得る。別の実施例では、注入は、大槽内であり得る。
本明細書で使用される場合、「槽内送達」または「槽内投与」という用語は、大槽小脳延髄（ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｍｅｄｕｌａｒｉｓ）の脳脊髄液内への直接的な投与経路、より詳細には、後頭下穿刺を介した、または大槽内への直接的な注入による、または永久的に配置されたチューブを介した、投与経路を指す。
組成物は、治療される領域のサイズ、使用されるウイルス力価、投与経路、および本方法の所望の効果に応じて、範囲内のすべての数値を含めて、約０．１μＬ～約１０ｍＬの容量で送達され得る。一実施形態では、容量は、約５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約７０μＬである。別の実施形態では、容量は、約１００μＬである。別の実施形態では、容量は、約１２５μＬである。別の実施形態では、容量は、約１５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約１７５μＬである。さらに別の実施形態では、容量は、約２００μＬである。別の実施形態では、容量は、約２５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約３００μＬである。別の実施形態では、容量は、約４５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約５００μＬである。別の実施形態では、容量は、約６００μＬである。別の実施形態では、容量は、約７５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約８５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約１０００μＬである。別の実施形態では、容量は、約１．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約２ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約２．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約３ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約３．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約４ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約５．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約６ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約６．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約７ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約８ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約８．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約９ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約９．５ｍＬである。別の実施形態では、容量は、約１０ｍＬである。
調節配列の制御下にある所望の導入遺伝子をコードする核酸配列を有する組換えアデノ随伴ウイルスの有効濃度は、望ましくは、１ミリリットル当たり約１０７～１０１４個の
ベクターゲノム（ｖｇ／ｍＬ）（ゲノムコピー／ｍＬ（ＧＣ／ｍＬ）とも呼ばれる）の範囲である。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、リアルタイムＰＣＲによって測定される。別の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、デジタルＰＣＲによって測定される。Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ
ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ａｎｄ ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｔｉｔｅｒｓ ｂｙ ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ
Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。別の実施形態では、ｒＡＡＶ感染性単位は、Ｓ．Ｋ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ，１９８８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３に記載されているように測定される（参照により本明細書に援用される）。
好ましくは、濃度は、約１．５×１０９ｖｇ／ｍＬ～約１．５×１０１３ｖｇ／ｍＬであり、より好ましくは、約１．５×１０９ｖｇ／ｍＬ～約１．５×１０１１ｖｇ／ｍＬである。一実施形態では、有効濃度は、約１．４×１０８ｖｇ／ｍＬである。一実施形態では、有効濃度は、約３．５×１０１０ｖｇ／ｍＬである。別の実施形態では、有効濃度は、約５．６×１０１１ｖｇ／ｍＬである。別の実施形態では、有効濃度は、約５．３×１０１２ｖｇ／ｍＬである。さらに別の実施形態では、有効濃度は、約１．５×１０１２ｖｇ／ｍＬである。別の実施形態では、有効濃度は、約１．５×１０１３ｖｇ／ｍＬである。本明細書に記載のすべての範囲は、エンドポイントを含む。
一実施形態では、投用量は、約１．５×１０９ｖｇ／ｋｇの体重～約１．５×１０１３ｖｇ／ｋｇであり、より好ましくは、約１．５×１０９ｖｇ／ｋｇ～約１．５×１０１１ｖｇ／ｋｇである。一実施形態では、投与量は、約１．４×１０８ｖｇ／ｋｇである。一実施形態では、投与量は、約３．５×１０１０ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与量は、約５．６×１０１１ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与量は、約５．３×１０１２ｖｇ／ｋｇである。さらに別の実施形態では、投与量は、約１．５×１０１２ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与量は、約１．５×１０１３ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与量は、約３．０×１０１３ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与量は、約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇである。本明細書に記載のすべての範囲は、エンドポイントを含む。
一実施形態では、有効投与量（送達される総ゲノムコピー）は、約１０７～１０１３ベクターゲノムである。一実施形態では、総投与量は、約１０８ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０９ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０１０ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０１１ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０１２ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０１３ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０１４ゲノムコピーである。一実施形態では、総投与量は、約１０１５ゲノムコピーである。
毒性などの望ましくない効果のリスクを低減するために、ウイルスの最低有効濃度を利用することが望ましい。さらに、これらの範囲の他の投与量および投与容量は、治療される対象（好ましくは、ヒト）の身体状態、対象の年齢、特定の障害、および進行性の場合、発症した障害の程度を考慮して、主治医によって選択され得る。例えば、静脈内送達は、１．５×１０１３ｖｇ／ｋｇの程度の用量を必要とし得る。
Ｄ．方法
別の態様では、標的の組織または細胞を形質導入する方法が提供される。一実施形態では、本方法は、本明細書に記載されるＡＡＶｒｈ．９１カプシドを有するｒＡＡＶを投与
することを含む。以下の実施例に示されるように、本発明者らは、ＡＡＶｒｈ．９１と称されるＡＡＶが、心臓（平滑筋）、ＣＮＳ細胞、および骨格（横紋）筋を効果的に形質導入することを示している。特定の実施形態では、本方法は、ＡＡＶｒｈ．９１ベクターの全身投与を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ．９１ベクターは、特定の細胞型または組織型を標的とするのに好適な投与経路を介して送達される。
特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドを有するｒＡＡＶを投与することを含む、ＣＮＳの細胞（例えば、ニューロン、内皮細胞、グリア細胞、および上衣細胞のうちの１つ以上）を形質導入する方法が、本明細書に提供される。一実施形態では、静脈内投与が用いられる。別の実施形態では、ＩＣＶ投与が用いられる。さらに別の実施形態では、ＩＣＭ投与が用いられる。特定の実施形態では、これらに限定されないが、脊髄、海馬、運動皮質、小脳、および運動ニューロンのいずれかを含む、導入遺伝子をＣＮＳの細胞に送達する方法が、本明細書に提供される。本方法は、細胞を、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドを有するｒＡＡＶと接触させることを含み、当該ｒＡＡＶは、導入遺伝子を含む。別の態様では、導入遺伝子を心臓に送達するための、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドを有するｒＡＡＶの使用が提供される。
本明細書で考察されるように、本明細書に記載のＡＡＶカプシドを含むベクターは、心臓組織を高レベルで形質導入することができる。導入遺伝子を心臓細胞に送達する方法が、本明細書に提供される。本方法は、細胞を、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドを有するｒＡＡＶと接触させることを含み、当該ｒＡＡＶは、導入遺伝子を含む。別の態様では、導入遺伝子を心臓に送達するための、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドを有するｒＡＡＶの使用が提供される。特定の実施形態では、導入遺伝子を心臓の細胞に送達する方法は、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドを有するｒＡＶＶの全身送達（例えば、ＩＶ投与）を含む。
特定の実施形態では、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドを有するｒＡＡＶを投与することを含む、骨格筋を形質導入する方法が、本明細書に提供される。特定の実施形態では、本方法は、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドを骨格（横紋）筋に送達することを含む。特定の実施形態では、導入遺伝子を骨格筋に送達する方法が提供される。本方法は、細胞を、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドを有するｒＡＡＶと接触させることを含み、当該ｒＡＡＶは、導入遺伝子を含む。特定の実施形態では、導入遺伝子骨格筋の送達方法は、ＡＡＶｒｈ．９１カプシドを有するｒＡＶＶの全身送達（例えば、ＩＶ投与）を含む。
単一ゲノム増幅
ＡＡＶゲノムは、従来、ＰＣＲベースの方法を使用して哺乳類ゲノムＤＮＡ全体の中から単離されてきた。プライマーは、多様なＶＰ１（カプシド）遺伝子の大部分に隣接する保存領域を検出するために使用される。次いで、ＰＣＲ産物をプラスミド骨格にクローニングし、個々のクローンを、Ｓａｎｇｅｒ法を使用して配列決定する。従来のＰＣＲおよび分子クローニングに基づくウイルス単離方法は、新規のＡＡＶゲノムを回収するのに有効ではあるが、回収されるゲノムが、ＰＣＲ媒介性の組換えおよびポリメラーゼエラーの影響を受ける可能性がある。さらに、現在利用可能な次世代配列決定技術により、以前に使用されたサンガー技術と比較して、他に類を見ない正確さでウイルスゲノムを配列決定することが可能になった。個々のＡＡＶゲノムをウイルス集団内から正確に単離する新規でより高スループットのＰＣＲおよび次世代配列決定に基づく方法が、本明細書に提供される。本方法、ＡＡＶ－単一ゲノム増幅（ＡＡＶ－ＳＧＡ）は、哺乳類宿主内のＡＡＶ多様性に関する我々の知識を向上させるために使用することができる。さらに、それは、遺伝子療法のためのベクターとして使用するための新規のカプシドを同定することを可能にした。
ＡＡＶ－ＳＧＡは、ゲノムの集団を含む試料から個々のＡＡＶ配列を効果的に回収する
ように検証および最適化されている。この技術は、ヒトおよび非ヒト霊長類の宿主内から単一のＨＩＶおよびＨＣＶゲノムを単離するために以前に使用されている。カプシド検出ＰＣＲによってＡＡＶ陽性をスクリーニングするゲノムＤＮＡ試料は、エンドポイント希釈される。ＰＣＲ増幅が、８０％の信頼性を有するポアソン分布によれば、３０％未満の陽性反応をもたらす希釈は、単一の増幅可能なＡＡＶゲノムを含む。この手順は、ポリメラーゼの鋳型を切り替えることによって引き起こされるＰＣＲ媒介性組換えの可能性が低減されたウイルスゲノムのＰＣＲ増幅を可能にする。ＡＡＶ－ＳＧＡのＰＣＲアンプリコンは、２×１５０または２×２５０ペアエンド配列決定を使用して、ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑプラットフォームを使用して配列決定される。この方法は、高い相同性の領域を有する複数のウイルスを含む単一の試料由来の配列決定リードの収束を憂慮することなく、完全長ＡＡＶ ＶＰ１配列の正確なデノボアセンブリを可能にする。
ＡＡＶ－ＳＧＡ技術により、アカゲザル組織から複数の新規ＡＡＶカプシド配列を単離することに成功している。単一の試料から、ＡＡＶの異なるクレード由来の複数のウイルスが同定されており、これは、ＡＡＶの集団が宿主組織に存在し得ることを示す。例えば、クレードＤ、Ｅ、および離れた「フリンジ」ウイルスと配列類似性を有するカプシドは、単一の肝臓組織試料から単離された。
ＡＡＶを発見するためのＳＧＡの応用は、以前に記載されていない。このアプローチは、無効なＡＡＶゲノム配列をもたらす可能性のある鋳型の切り替えおよびポリメラーゼエラーの問題に対処する。さらに、単一の分離株と同じ宿主試料から同じ配列を繰り返し回収すると、単離されたゲノムの質は自明である。
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示するために提供される。本実施例は、本発明をいかなる方法でも限定することを意図するものではない。
Ｅ．実施例
実施例１：材料および方法：
ＡＡＶ配列の検出および単離
非ヒト霊長類組織源
ペンシルベニア大学のコロニーのアカゲザルは飼育下で繁殖され、中国またはインド起源であった。アカゲザルの肝臓組織試料は、遺伝子療法プログラムおよびペンシルベニア大学のＴｉｍｏｔｈｙ Ｈ．Ｌｕｃａｓの研究室から好意的に提供された。
新規ＡＡＶの単離
ゲノムＤＮＡを抽出し（ＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキット、ＱＩＡＧＥＮ）、ＰＣＲ戦略を使用して、ＮＨＰ肝臓組織試料から３．１ｋｂの全長Ｃａｐ断片を増幅することによって、ＡＡＶ ＤＮＡの存在について分析した。ＡＡＶＲｅｐ遺伝子の保存領域内の５’プライマー（ＡＶ１ＮＳ、５’－ＧＣＴＧＣＧＴＣＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＧＡＡＣ－３’）（配列番号９）を、ＡＡＶＣａｐ遺伝子の下流の保存領域内に位置する３’プライマー（ＡＶ２ＣＡＳ、５’－ＣＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＡＣＧＡ－３’）（配列番号１０）と組み合わせて、全長ＡＡＶＣａｐアンプリコンの増幅に使用した。Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、以下のサイクル条件を使用してＡＡＶ ＤＮＡを増幅した：９８℃で３０秒間；９８℃で１０秒間、５９℃で１０秒間、７２℃で９３秒間を５０サイクル；および７２℃で１２０秒間の伸長。
陽性のＰＣＲ反応をもたらした鋳型ゲノムＤＮＡ試料を、ＡＡＶ－単一ゲノム増幅（ＡＡＶ－ＳＧＡ）に供した。ゲノムＤＮＡを９６ウェルプレート中でエンドポイント希釈し、上に記載の同じプライマーを使用して、９６回のうち２９回未満のＰＣＲ反応が増幅産
物を生じるようにした。ポアソン分布によれば、ウェルの３０％以下でＰＣＲ産物が得られるＤＮＡ希釈は、その時の８０％超の陽性ＰＣＲ当たり１つの増幅可能なＡＡＶ ＤＮＡ鋳型を含む。陽性のＰＣＲ反応からのＡＡＶ ＤＮＡアンプリコンを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ２×１５０または２×２５０ペアエンド配列決定プラットフォームを使用して配列決定し、得られたリードを、ＳＰＡｄｅｓアセンブラ（ｃａｂ．ｓｐｂｕ．ｒｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｓｐａｄｅｓ）を使用してデノボアセンブリを行った。ＮＣＢＩ
ＢＬＡＳＴｎ（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）およびＶｅｃｔｏｒ
ＮＴＩ ＡｌｉｇｎＸソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して配列解析を行った。
新規ＡＡＶカプシドを使用したベクター産生
目的のＰＣＲ産物からのＡＡＶカプシド遺伝子のＤＮＡ配列を、ＴＯＰＯクローニングし、増幅した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。増幅されたカプシド遺伝子を、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ遺伝子および他の関連するプラスミドエレメントを含むＡＡＶトランスプラスミド骨格にさらにクローニングした。
ＡＡＶベクターを生成し、以前に記載されているように、Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって滴定した（例えば、Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２１：１２５９－７１を参照されたい）。ＨＥＫ２９３細胞を三重でトランスフェクトし、細胞培養上清を回収し、濃縮し、イオジキサノール勾配で精製した。精製したベクターを、以前に記載されているように、ウサギβグロビンポリＡ配列を標的とするプライマーを使用して、デジタルドロップレットＰＣＲで滴定した（例えば、Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：１１５－１２５を参照されたい）。
げっ歯類における新規のＡＡＶカプシドのインビボ特徴付け
動物
すべての動物プロトコルは、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａにより認可された。Ｃ５６ＢＬ／６Ｊマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＧＦＰレポーター遺伝子実験の場合、成体（６～８週齢）のオスに注射した。動物を、１ケージ当たり２～５匹で、標準的なケージに収容した。バリア施設のケージ、給水瓶、および床敷は、オートクレーブ処理し、ケージは、週に１回交換した。自動制御で、１２時間の明暗サイクルを維持した。各暗期は午後７時（±３０分）に開始した。放射線照射された実験用げっ歯類の餌は、自由摂食で提供された。
被験試料および研究設計
マウスは、マウス１匹当たり１×１０１２ＧＣの各ベクターを０．１ｍＬ、外側尾静脈を介して静脈内（ＩＶ）投与されたか、またはマウス１匹当たり１×１０１１ＧＣの用量で５ｕＬ、側脳室に脳室内（ＩＣＶ）注入された。各群について、３匹または５匹のマウスが投薬された。
注入１４日後、ＣＯ２の吸入により、マウスを安楽死させた。組織を採取し、生体分布分析のためにドライアイス上でスナップ凍結したか、または１０％中性ホルマリン中で浸漬固定し、スクロース中で凍結保存し、ＯＣＴ中で凍結し、ＧＦＰ直接観察のためにクライオスタットで切片化した。剖検後、内皮細胞の形質導入の分析に使用される組織をパラフィン包埋した。
ベクター生体分布
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）で組織ゲノムＤＮＡを抽出し、ＡＡＶベクターゲノムを、Ｔａｑｍａｎ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともにベクターのＥＧＦＰ配列を標的とするプライマー／プローブを使用して、リアルタイムＰＣＲによって定量化した。
レポーター遺伝子の可視化
直接ＧＦＰ蛍光を観察するために、組織試料を、ホルマリン中で約２４時間固定し、ＰＢＳ中で短時間洗浄し、ＰＢＳ中の１５％および３０％のスクロースで最大密度に達するまで順次平衡化し、次いで、凍結切片の調製のために、ＯＣＴ包埋媒体中で凍結した。核の対比染色としてのＤＡＰＩを含むＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）中で、切片を載せた。
パラフィン包埋組織試料に対して、ＧＦＰ免疫組織化学を実施した。切片を、エタノールおよびキシレンで脱パラフィン化し、抗原賦活化のために１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で６分間煮沸し、順次、２％のＨ２Ｏ２で１５分間、アビジン／ビオチンブロッキング試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で各々１５分間、およびブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の１％のロバ血清＋０．２％のＴｒｉｔｏｎ）で１０分間処理した。続いて、一次抗体と１時間、ブロッキング緩衝液中のビオチン化二次抗体と４５分間インキュベーションした（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）。一次抗体のニワトリ抗ＧＦＰ（Ａｂｃａｍ ａｂ１３９７０）および内皮細胞マーカーのウサギ抗ＣＤ３１（Ａｂｃａｍ ａｂ２８３６４）を使用した。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、製造元の指示に従って、ＤＡＢを基質として用いて、結合した抗体を褐色沈殿物として可視化した。
免疫蛍光の場合、パラフィン切片を脱パラフィン化し、抗原賦活化後、ＰＢＳ中の１％のロバ血清＋０．２％のＴｒｉｔｏｎで１５分間ブロッキングし、続いて、ブロッキング緩衝液中で希釈された一次抗体（１時間）および蛍光標識二次抗体（４５分間、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、順次インキュベーションした。使用した抗体は、ニワトリ抗ＧＦＰ（Ａｂｃａｍ ａｂ１３９７０）、ウサギ抗ＣＤ３１（Ａｂｃａｍ ａｂ２８３６４）、およびマウス抗ＮＦ－２００（クローンＲＴ９７，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＣＢＬ２１２）であった。一次抗体を一緒に混合し、ＧＦＰ抗体およびＮＦ－２００抗体を、それぞれＦＩＴＣ標識およびＴＲＩＴＣ標識の二次抗体により検出した。ＣＤ３１に対するウサギ抗体のシグナルを、ＶｅｃｔａＦｌｕｏｒ（商標）Ｅｘｃｅｌ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８抗－ウサギＩｇＧキットを使用して、製造元のプロトコルに従って（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）増強した。蛍光および明視野の顕微鏡画像は、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴｉＥ顕微鏡を用いて撮影した。
バーコード化ベクター導入遺伝子の非ヒト霊長類導入の評価
被験試料および研究設計
５つの新規カプシドおよび５つの対照カプシド（ＡＡＶｒｈ９０、ＡＡＶｒｈ９１、ＡＡＶｒｈ９２、ＡＡＶｒｈ９３、ＡＡＶｒｈ９１．９３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ７、およびＡＡＶ９）を使用して、修飾ＡＴＧ枯渇自己相補ｅＧＦＰ（ｄＧＦＰ）導入遺伝子をパッケージングした。各固有のカプシド調製物は、ベクターゲノムのポリアデニル化配列の前に、対応する固有の６ｂｐバーコードを有するｄＧＦＰ導入遺伝子を含んだ。導入遺伝子は、ＣＢ８プロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化配列（ＡＡＶｓｃ．ＣＢ８．ｄＧＦＰ．Ｂａｒｃｏｄｅ．ＳＶ４０）を含んだ。ＡＡＶベクターを生成し、以前に記載されているように、Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ
によって滴定した（例えば、Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２１：１２５９－７１を参照されたい）。ＨＥＫ２９３細胞を三重でトランスフェクトし、細胞培養上清を回収し、濃縮し、イオジキサノール勾配で精製した。精製したベクターを、以前に記載されているように、ＳＶ４０ポリＡ配列を標的とするプライマーを使用して、デジタルドロップレットＰＣＲで滴定した（例えば、Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：１１５－２５）を参照されたい）。
１０種類の精製ベクターを、２つの別個の動物への注入用に均等なゲノムコピー量でプールした：送達された総用量は、ＩＶ送達を介して２ｅ１３ＧＣ／ｋｇおよび３ｅ１３ＧＣ／動物であり、髄腔内空間への大槽内（ＩＣＭ）送達を介してと送達された。動物は、注射の３０日後に犠牲にされ、すべての組織は、下流導入遺伝子のＲＮＡ発現分析のためにＲＮＡｌａｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）で回収された。
動物
動物手順はすべて、ペンシルベニア大学の施設内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。カニクイザルマカク（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）は、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（ＵＳＡ）から寄贈された。動物は、国際実験動物管理評価認証協会認定のフィラデルフィア小児病院（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）の非ヒト霊長類研究プログラム施設で、ステンレス鋼製スクイーズバックケージ内に収容された。動物は、給餌、視覚および聴覚刺激、操作、および社会的相互作用などの様々な豊かさ（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｓ）を享受した。
ＩＣＭ試験には、１０歳齢、雄、８ｋｇの動物を使用した。ＩＶ試験には、６歳齢、雄、６．９８ｋｇの動物を使用した。この動物を、ＡＡＶ中和抗体の存在についてスクリーニングし、ベースラインでは、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶｒｈ３２．３３に対して血清陰性であった。この動物は、ベースラインでは、ＡＡＶ７およびＡＡＶ９に対して、それぞれ１：５および１：１０の中和抗体力価を有した。
ＩＣＭ注入手順
麻酔されたマカクは、Ｘ線撮影台上に側臥位で、頭部を前方に屈曲させて、配置された。無菌技術を使用して、２１Ｇ～２７Ｇ、１～１．５インチのＱｕｉｎｃｋｅ脊椎針（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を、ＣＳＦ流れが観察されるまで、後頭下空間へと前進させた。１ｍＬのＣＳＦを、ベースライン分析用に採取した。針の正確な配置は、脳幹の損傷の可能性を避けるために、蛍光透視（ＯＥＣ９８００Ｃ－ａｒｍ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）により確認した。ＣＳＦ採取の後、ルアーアクセスエクステンションまたは小口径Ｔポートエクステンションセットカテーテルを脊椎針に連結して、１８０ｍｇ／ｍＬのイオヘキソール造影剤の投与を容易にした（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）。針の配置を確認した後、被験試料を含むシリンジ（１ｍＬに加えてシリンジ容量およびリンカーのデッドスペースに等しい容量）を可撓性のリンカーに連結して、３０±５秒間かけて注入した。針を取り外し、穿刺部位に直接圧力を加えた。
ＩＶ注入手順
マカクに、１０ｍＬのベクター被験試料を、注入ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を介して１ｍＬ／分の速度で末梢静脈に投与した。
導入遺伝子の発現分析
全組織ＲＮＡを、製造元の仕様（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って、ＴＲＩｚｏｌを使用して、すべてのＲＮＡＬａｔｅｒ処理組織から抽出した。抽出したＲＮＡを、製造元のプロトコルに従ってＤＮａｓｅＩで処理した（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製した。ｃＤＮＡの逆転写合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの高容量ｃＤＮＡ逆転写酵素キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。１１７ｂｐのアンプリコンをＰＣＲ増幅するために、６ｂｐの固有のバーコードに隣接する領域を標的とするプライマー（フォワードプライマー：ＧＧＣＧＡＡＣＡＧＣＧＧＡＣＡＣＣＧＡＴＡＴＧＡＡ（配列番号１１）、リバースプライマー：ＧＧＣＴＣＴＣＧＴＣＧＣＧＴＧＡＧＡＡＴＧＡＧＡＡ（配列番号１２））およびＱ５高忠実度ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、以下のサイクリング条件：９８℃で３０秒間；９８℃で１０秒間、７２℃で１７秒間を２５サイクル；および７２℃で１２０秒間の伸長で、反応を行った。アンプリコンを、ＭｉＳｅｑ Ｓｔａｎｄａｒｄ ２ｘ１５０ｂｐ配列決定プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して配列決定した。
バーコードリードを、発現分析パッケージ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓ／ｅａ－ｕｔｉｌｓ）、ｃｕｔａｄａｐｔ（ｃｕｔａｄａｐｔ．ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ．ｉｏ／ｅｎ／ｓｔａｂｌｅ／）、ｆａｓｔｘツールキットパッケージ（ｈａｎｎｏｎｌａｂ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／ｆａｓｔｘ＿ｔｏｏｌｋｉｔ／）、およびＲバージョン３．３．１．（ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｂｉｎ／ｗｉｎｄｏｗｓ／ｂａｓｅ／ｏｌｄ／３．３．１／）からのｆａｓｔｑ－ｊｏｉｎプログラムを使用して分析した。組織試料からのバーコード発現カウントデータを、各動物について配列決定された注入用ベクター材料からのバーコードカウントに正規化し、各組織試料からのバーコードの割合を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０４を使用してプロットした。
ＮＨＰにおけるＡＡＶｒｈ．９１のＩＣＭ形質導入特性の試験
動物および研究設計
動物手順はすべて、ペンシルベニア大学の施設内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。６匹の成体アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）は、ＰｒｅＬａｂｓを介してＯｒｉｅｎｔ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ａｌｉｃｅ，ＴＸ）から調達した。動物は、国際実験動物管理評価認証協会認定のフィラデルフィア小児病院（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）の非ヒト霊長類研究プログラム施設で、ステンレス鋼製スクイーズバックケージ内に収容された。動物は、給餌、視覚および聴覚刺激、操作、および社会的相互作用などの様々な豊かさ（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｓ）を享受した。
ＡＡＶｒｈ．９１、ＡＡＶ１、およびＡＡＶ９カプシドは、以前に記載されている方法を使用してＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ導入遺伝子を用いてパッケージングした（例えば、Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｈｕｍ．２１：１２５９－７１ａｎｄＬｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔａｌ．（２０１４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：１１５－２５を参照されたい）。１．５５７ｅ１３ＧＣの用量を、各動物にＩＣＭに注入した。ＩＣＭ注入方法は上に記載されている。注入の２８～３１日後に動物を犠牲にし、ＤＮＡベクター生体分布試験のために組織をドライアイス上で採取した。非臨床一般毒性試験の際の神経系のサンプリングおよび処理のための推奨手順（脳、脊髄、神経、および眼）に従って、脳モールド（ｂｒａｉｎ ｍｏｌｄ）を使用して、脳全体を採取し、トリミングし、切片化した。Ｐａｒｄｏ，ｅｔ．ａｌ．（２０１２）．ＳＴＰ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｐａｐｅｒ。また、組織を採取し、ホルマリン固定し
、パラフィン包埋して、組織病理学的分析を行った。
ベクター形質導入の組織学的分析
ＧＦＰ免疫組織化学（ＩＨＣ）の場合、切片を、エタノールおよびキシレンで脱パラフィン化し、抗原賦活化のために１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で６分間煮沸し、順次、２％のＨ２Ｏ２で１５分間、アビジン／ビオチンブロッキング試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で各々１５分間、およびブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の１％ロバ血清＋０．２％のＴｒｉｔｏｎ）で１０分間処理した。続いて、ブロッキング緩衝液中のＧＦＰに対するヤギ抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＮＢ１００－１７７０，１：５００）とともに４℃で一晩インキュベーションし、ＰＢＳ中で洗浄した後、ブロッキング緩衝液中のビオチン化抗ヤギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，１：５００）とともに４５分間インキュベーションした。ＰＢＳ中で洗浄した後、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を適用して、製造元の指示に従って、ＤＡＢを基質として用いて、結合した抗体を褐色沈殿物として可視化した。
免疫蛍光（ＩＦ）の場合、パラフィン切片を同様に前処理したが、Ｈ２Ｏ２およびアビジン／ビオチンのブロッキングは行わなかった。以下の一次抗体を組み合わせ、切片を３７℃で１時間インキュベートした：ヤギ抗ＧＦＰ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＮＢ１００－１７７０；１：３００～５００）、モルモット抗ＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＡＢＮ９０；１：５００）、ニワトリ抗ＧＦＡＰ（Ａｂｃａｍ，ａｂ４６７４；１：１０００）。これに続いて、ＰＢＳ中で洗浄後、蛍光色素標識二次抗体（ＦＩＴＣ抗ヤギ、Ｃｙ５抗モルモット、ＴＲＩＴＣ抗ＧＦＡＰ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、室温で１時間、１：２００）とインキュベーションした。ＰＢＳ中で洗浄後、ＤＡＰＩを含むＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で切片をマウントし、核の対比染色を行った。
ベクターの生体分布の分析
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）で組織ゲノムＤＮＡを抽出し、ＡＡＶベクターゲノムを、Ｔａｑｍａｎ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともにベクターのＥＧＦＰ配列を標的とするプライマー／プローブを使用して、リアルタイムＰＣＲによって定量化した。
中枢神経系（ＣＮＳ）の組織における細胞形質導入の定量分析
上に記載のようにスライドを調製し、Ａｐｅｒｉｏ ＶＥＲＳＡ走査システムを使用してスキャンした。まず、スライド全体を低倍率で（１．２５倍）でスキャンして、関心領域を定義した。最初の１．２５倍のスキャン後、スライドを、４つの異なるチャネルＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣおよびＣｙ５を用いて、２０倍の倍率でスキャンした。Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ画像解析ソフトウェアｖ．２０１９．０７で開発された共染色検出アルゴリズムを使用して、最終的な２０倍のスキャンから、形質導入されたニューロンおよび星状細胞を定量した。
ＡＡＶカプシドのアミノ酸の修飾についての質量分析（ＭＳ）
試薬
重炭酸アンモニウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。アセトニトリル、ギ酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、８Ｍの塩酸グアニジン（ＧｎｄＨＣｌ）、およびトリプシンは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入した。
トリプシン消化
１ＭのＤＴＴおよび１．０Ｍのヨードアセトアミドのストック溶液を調製した。カプシドタンパク質を、１０ｍＭのＤＴＴおよび２ＭのＧｎｄＨＣｌの存在下で、９０℃で１０分間変性させ還元した。試料を室温に冷却し、次いで、暗所で、３０ｍＭのＩＡＭを用いて室温で３０分間アルキル化した。ＤＴＴを１ｍＬ添加して、アルキル化反応をクエンチした。最終ＧｎｄＨＣｌ濃度を２００ｍＭに希釈する量で、変性タンパク質溶液にｐＨ７．５～８の２０ｍＭ重炭酸アンモニウムを添加する。トリプシン対タンパク質の比率が１：２０になるようにトリプシン溶液を加え、３７℃で４時間インキュベートする。消化後、ＴＦＡを最終濃度が０．５％になるように添加し、消化反応をクエンチした。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
Ａｃｃｌａｉｍ Ｐｅｐ Ｍａｐカラム（長さ１５ｃｍ、内径３００μｍ）およびＮａｎｏＦｌｅｘ源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦと結合したＴｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてオンラインクロマトグラフィーを実行した。オンライン分析中、カラム温度を３５℃の温度で維持した。移動相Ａ（０．１％ギ酸を含むＭｉｌｌｉＱ水）および移動相Ｂ（０．１％ギ酸を含むアセトニトリル）の勾配でペプチドを分離した。１５分間にわたって４％Ｂから６％Ｂへ、次いで、２５分間（合計４０分間）で１０％Ｂへ、その後４６分間（合計８６分間）で３０％Ｂへと勾配を実行した。試料を直接カラムに負荷する。カラムサイズは、７５ｃｍ×１５μｍの内径であり、２ミクロンのＣ１８媒体（Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ）が充填される。負荷、導入、および洗浄ステップにより、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実行の合計時間は約２時間であった。
ＭＳデータは、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦのデータ依存性Ｔｏｐ－２０法を使用して取得され、調査スキャン（２００～２０００ｍ／ｚ）から、最も豊富でまだ配列決定されていない前駆体イオンが動的に選択された。配列決定は、予測自動ゲイン制御で決定された１ｅ５イオンの標的値で、より高いエネルギー衝突解離断片化を介して行われ、４ｍ／ｚのウィンドウで前駆体の単離を行った。ｍ／ｚ ２００で１２０，０００の解像度で、調査スキャンを取得した。ＨＣＤスペクトルの解像度は、最大イオン注入時間が５０ｍｓ、正規化された衝突エネルギーが３０のｍ／ｚ２００で３０，０００に設定された。ＳレンズのＲＦレベルを５０に設定し、これにより、消化由来のペプチドが占めるｍ／ｚ領域が最適に透過される。単一、未割り当て、または６以上の電荷状態を有する前駆体イオンを断片化選択から除外した。
データ処理
ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ１．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が、取得したデータの分析に使用された。ペプチドマッピングのために、固定修飾として設定されたカルバミドメチル化、可変修飾として設定された酸化、脱アミド、およびリン酸化、質量精度１０ｐｐｍ、高プロテアーゼ特異性、ならびにＭＳ／ＭＳスペクトルに対する信頼水準０．８を用いて、単一エントリのタンパク質ＦＡＳＴＡデータベースを使用して検索を行う。ペプチドのパーセント修飾は、修飾ペプチドの質量面積を、修飾ペプチドおよび天然ペプチドの面積の合計で割ることによって決定した。考えられる修飾部位の数を考慮すると、異なる部位で修飾されている同重体は、単一のピークで共移動し得る。したがって、複数の潜在的な修飾部位を有するペプチドに由来する断片イオンを使用して、複数の修飾部位を特定または区別することができる。これらの事例では、観察された同位体パターン内の相対強度を使用して、異なる修飾ペプチド異性体の相対存在量を特異的に決定することができる。この方法は、すべての異性体種についての断片化効率が同じであり、修飾部位において独立していることを想定している。このアプローチにより、特定の修飾部位および関連する潜在的な組み合わせの定義が可能と
なる。
実施例２：ＡＡＶ－ＳＧＡ
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、一本鎖ＤＮＡパルボウイルスであり、非病原性および弱免疫原性であるため、遺伝子療法のためのベクターとして有効な候補になる。第１世代のＡＡＶ（ＡＡＶ１～６）の発見以来、本発明者らの研究室は、様々な高等霊長類種から多数のウイルスを単離する努力を重ねてきた。本明細書で同定されたこの第２世代のＡＡＶは、霊長類由来のＡＡＶゲノムに特異的である保存領域に対するプライマーを使用して、バルクＰＣＲベースの技術を使用して単離された。ＡＡＶ－ＳＧＡを使用して、本発明者らは、天然の哺乳類宿主におけるＡＡＶの遺伝的バリエーションを探索した（図１）。
ＡＡＶ－ＳＧＡは、単一のウイルスゲノムを混合集団内から高精度に単離するために使用することができる強力な技術である。この研究では、本発明者らは、アカゲザル組織標本から新規のＡＡＶゲノムを同定するためにＡＡＶ－ＳＧＡを使用した。新規のウイルス分離株は、遺伝的に多様であり、クレードＤ、Ｅ、およびフリンジクレードに分類することができる（図２）。
強化ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）遺伝子を含むベクターは、新規カプシドおよび以前に同定された対照カプシドを使用して産生された。様々なカプシドを有するベクターを、静脈内（ＩＶ）（図５Ａ）および脳室内（ＩＣＶ）（図５Ｃ）送達経路を介してマウスで試験した。ベクターゲノムの生体分布を、心臓、骨格筋、肝臓、および脳組織においてアッセイした（図５Ｂおよび図５Ｄ）。マウス研究は、新規のカプシドが典型的に、クレード特異的な形質導入パターンを実証することを示した（クレードＤカプシドを除く）。ＡＡＶ６．２およびＡＡＶｒｈ．９１に関して、小脳および脳室／脈絡叢の分析により、ｅＧＦＰ検出のパターンは異なるが、ＩＣＶ送達後の形質導入が明らかになった。クレードＡメンバーのＩＶ送達は、心臓、脳、および筋肉組織において高レベルの形質導入をもたらした。
ＩＭ送達後の筋肉組織の形質導入を評価するために、追加の試験を実施した。様々なカプシドを有し、ＬａｃＺ（図６Ａ）またはｍＡｂを発現するベクターをＩＭ送達し、導入遺伝子の発現を、筋繊維の染色（ＬａｃＺの場合）または血清における検出（ｍＡｂの場合）を介して分析した。図６Ｂは、ＬａｃＺの検出による筋肉形質導入の比較を示す。クレードＡのベクターであるＡＡＶｒｈ．９１は、高効率で筋繊維を形質導入した（より濃い染色）。ＡＡＶｒｈ．９１によるＩＭ送達はまた、血清中で、高レベルの検出可能なｍＡｂをもたらした（図７）。図８は、ｍＡｂおよびＬａｃＺベクターの様々な調製物の収率を示す。両方の導入遺伝子について、ＡＡＶｒｈ．９１は、ＡＡＶ１およびＡＡＶ６と比較して、高い収率を有した。
実施例３：バーコード化導入遺伝子システムを使用した非ヒト霊長類における新規のＡＡＶ天然分離株の形質導入の評価
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、臨床応用において安全かつ効果的な遺伝子導入ビヒクルであることが示されたが、ウイルスに対する既存の免疫によって阻害され得、組織トロピシズムが制限され得る。本発明者らは、バーコード化導入遺伝子法が、複数のＡＡＶ血清型による単一の動物における様々な組織の形質導入を同時に比較するのに有効であることを実証した。この技術は、使用した動物の数を削減し、外来導入遺伝子関連の免疫応答を防止する。したがって、新規のカプシドおよびそれらのそれぞれの原型的なクレードメンバー対照（ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ３２．３３、およびＡＡＶ９）を、転写物のポリＡシグナルの前に、改変ｅＧＦＰ導入遺伝子および固有の６塩基対バーコードを含むベクターへと作製した（図９）。導入遺伝子を、ＡＴＧ配列モチーフの欠失によって修飾して、ポリペプチドの翻訳および結果としての外来タンパク
質に対する免疫応答を防止した。ベクターを、等量でプールし、カニクイザルにＩＶまたはＩＣＭ注入して（総用量：２ｅ１３ＧＣ／ｋｇ（ＩＶ）および３ｅ１３ＧＣ（ＩＣＭ））、新規のカプシドの全身および中枢神経系の形質導入パターンを評価した。ＩＶ注入された動物は、ベースラインではＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶｒｈ３２．３３に対して血清陰性であり、ＡＡＶ７およびＡＡＶ９に対して、それぞれ１：５および１：１０の中和抗体力価を有した。
図１０Ａに示されるように、試験した他のカプシドと比較して、クレードＡベクターであるＡＡＶｒｈ．９１のＩＶ送達により、肺、筋肉、および心臓を含む形質導入された末梢器官が、高い効率で導入された。ＡＡＶｒｈ．９１はまた、ＩＣＭ送達後のＮＨＰのＣＮＳ組織において、高い形質導入レベルを示した（図１０Ｃ）。
ＩＣＭ送達を評価するためのその後の研究から、ＡＡＶ１（ＲＡ３６５４、ＲＡ３５８３）およびＡＡＶ９（１４０８２６６、１４０９０２９）と比較して、ＡＡＶｒｈ．９１（１４０９２０１、１４０７０８８）によるＮＨＰの脳および脊髄における形質導入の改善も明らかになった（図１１Ａ～図１１Ｃ、図１２）。ＡＡＶｒｈ．９１は、ＩＣＭ送達後に、前頭皮質、側頭皮質、および後頭皮質を効果的に形質導入した。ＡＡＶｒｈ．９１はまた、ＡＡＶ９と比較して、ニューロンと星状細胞の両方を高レベルで形質導入した（図１３Ａ～図１３Ｃ）。ＡＡＶｒｈ．９１は、脊髄において運動ニューロンの頑強な形質導入を示した。興味深いことに、ＩＨＣ染色は、ＡＡＶｒｈ．９１およびＡＡＶ１の両方が、脳の脳室を覆う上衣細胞の効率的な形質導入を示したことを明らかにした。ＡＡＶｒｈ．９１による肝臓の形質導入のレベルは、ＩＣＭ送達後の各動物における神経皮質の形質導入レベルと相関した。試験されたすべてのベクターによるＩＣＭ送達後、心臓におけるベクターの形質導入のレベルは様々であった。特に、心臓におけるＧＦＰの発現は、ＩＣＭ送達後のより高いレベルの脳（皮質）発現と相関しなかったが、高レベルの肝臓が観察された。まとめると、これらの結果は、ＡＡＶｒｈ．９１が、強力な遺伝子療法ベクターであり、産生するのが効率的であり、霊長類におけるＩＣＭ送達後、脳および脊髄の様々細胞型を効果的に形質導入することを実証する。
ＨＥＫ２９３細胞における三重トランスフェクション法によって製造される場合、ＡＡＶｒｈ．９１は、そのクレードの対応物であるＡＡＶ１よりも２～３倍多量のベクターを得る（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。ＡＡＶｒｈ．９１カプシドを、以前に記載されているように、脱アミド化および他の修飾について分析した（ＰＣＴ／ＵＳ１９／０１９８０４およびＰＣＴ／ＵＳ１９／２０１９／０１９８６１を参照されたい）。図１５Ａおよび図１５Ｂに示されるように、結果は、ＡＡＶｒｈ．９１が、アスパラギン－グリシン対中のアスパラギンに対応する、高度に脱アミド化されている３つのアミノ酸（Ｎ５７、Ｎ３８３、Ｎ５１２）を有することを示した（配列番号２のようなＡＡＶｒｈ．９１の番号付け）。残基Ｎ３０３、Ｎ４９７、およびＮ６９１でのより低い脱アミド化率、ならびにＳ１４９でのリン酸化が一貫して観察された。
（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、数値識別子＜２２３＞の下のフリーテキストを含む配列に関して提供される。
Figure 2022530544000007
本明細書に引用されるすべての文書は、参照により本明細書に援用される。２０１９年１０月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／９２４，０９５号、２０１９年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／９１３，３１４号、および２０１９年４月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／８４０，１８４号は、それらの配列表とともに、それらの全体が参照により援用される。同様に、「１９－８９０１ＰＣＴ２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前で本明細書とともに提出された配列表、ならびにその中の配列およびテキストは、参照により援用される。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内に収まることが意図される。

Claims (28)

  1. 配列番号２のアミノ酸配列（ＡＡＶｒｈ．９１）を含むカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドを有し、前記カプシド中に、異種核酸配列を含むベクターゲノムがパッケージングされている、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
  2. 配列番号１もしくは３の前記ＡＡＶカプシド配列、または配列番号１もしくは３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を共有する配列の発現によって産生されるカプシドタンパク質を含むカプシドを有し、前記カプシド中に、異種核酸配列を含むベクターゲノムがパッケージングされている、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
  3. 前記カプシドタンパク質が、配列番号１もしくは３によってコードされる、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ。
  4. ５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）および３’ＡＡＶ ＩＴＲ、ならびに調節配列と作動可能に連結される異種核酸配列をさらに含み、前記調節配列が、標的細胞において前記異種核酸配列によってコードされる産物の発現を指示する、請求項１～３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  5. 前記ＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶｒｈ．９１以外のＡＡＶに由来する、請求項４に記載のｒＡＡＶ。
  6. 前記ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２由来である、請求項５に記載のｒＡＡＶ。
  7. 前記ＡＡＶカプシドが、
    （１）配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号１もしくは３から産生されるｖｐ１タンパク質、または配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１もしくは３と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ．９１ｖｐ１タンパク質の異種集団、
    配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号１もしくは３の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、または配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１もしくは３の少なくともヌクレオチド４１２～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ．９１ｖｐ２タンパク質の異種集団、
    配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ３タンパク質、配列番号１もしくは３の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、または配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１もしくは３の少なくともヌクレオチド６０７～２２０８と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質から選択されるＡＡＶｒｈ．９１ｖｐ３タンパク質の異種集団、ならびに／あるいは
    （２）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、および配列番号２の少なくともアミノ酸２０３～７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団を含む、ＡＡＶカプシドタンパク質を含み、前記ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク
    質が、配列番号２のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも２つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団をさらに含み、前記脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす、請求項２～６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  8. 前記タンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号１もしくは３、または配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号１もしくは３と少なくとも８０％～少なくとも９９％同一の配列である、請求項７に記載のｒＡＡＶ。
  9. 前記核酸配列が、配列番号１もしくは３と少なくとも８０％～９７％同一である、請求項７または８に記載のｒＡＡＶ。
  10. 前記ＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶｒｈ．９１以外のＡＡＶ由来の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲである、請求項７～９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  11. 前記ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２由来である、請求項１０に記載のｒＡＡＶ。
  12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶと、生理学的に適合する担体、緩衝液、アジュバント、および／または希釈剤と、を少なくとも含む、組成物。
  13. 前記組成物が、髄腔内送達用に製剤化され、前記ベクターゲノムが、中枢神経系への送達用の遺伝子産物をコードする核酸配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記組成物が、静脈内送達用に製剤化される、請求項１２に記載の組成物。
  15. 前記組成物が、鼻腔内送達用または筋肉内送達用に製剤化される、請求項１２に記載の組成物。
  16. 所望の遺伝子産物を、それを必要とする対象に送達するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  17. 所望の遺伝子産物を、それを必要とする対象に送達するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、または請求項１２～１５のいずれか一項に記載の組成物、の使用。
  18. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを産生するために有用なｒＡＡＶ産生システムであって、前記産生システムが、
    （ａ）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列と、
    （ｂ）ＡＡＶカプシドへのパッケージングに好適な核酸分子であって、前記核酸分子が、少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、および宿主細胞における産物の発現を指示する配列と作動可能に連結される遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含む、核酸分子と、
    （ｃ）前記ｒＡＡＶカプシド中に前記核酸分子をパッケージングすることを可能にするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能およびヘルパー機能と、を含む、ｒＡＡＶ産生システム。
  19. 前記（ａ）の核酸配列が、少なくとも配列番号１もしくは３、または配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号１もしくは３と少なくとも７０％～少なくとも９９％同一の配列を含む、請求項１８に記載のシステム。
  20. 細胞培養物が、ヒト胎児由来腎臓２９３細胞を含む、請求項１８～１９のいずれか一項
    に記載のシステム。
  21. 前記ＡＡＶ ｒｅｐが、ＡＡＶｒｈ．９１以外のＡＡＶ由来である、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のシステム。
  22. 前記ＡＡＶ ｒｅｐが、ＡＡＶ２由来である、請求項２１に記載のシステム。
  23. ｒＡＡＶを生成する方法であって、宿主細胞を培養するステップを含み、前記宿主細胞が、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸分子と、（ｂ）機能的なｒｅｐ遺伝子と、（ｃ）ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、ＡＡＶ ３’ＩＴＲ、および導入遺伝子を含むミニ遺伝子と、（ｄ）ＡＡＶカプシドへの前記ミニ遺伝子のパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能と、を含む、方法。
  24. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶで形質導入された宿主細胞。
  25. 細胞に導入遺伝子を送達する方法であって、前記細胞を請求項１～１１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶと接触させるステップを含み、前記ｒＡＡＶが、前記導入遺伝子を含む、方法。
  26. ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子であって、前記核酸配列が、少なくとも配列番号１もしくは３、または配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号１もしくは３と少なくとも７０％～少なくとも９９％同一の配列を含む、核酸分子。
  27. 前記分子が、プラスミドである、請求項２６に記載の核酸分子。
  28. 請求項２６または２７に記載の核酸分子を用いてトランスフェクトされた、宿主細胞。
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