CN112236516A

CN112236516A - 针对氧化应激的基因疗法

Info

Publication number: CN112236516A
Application number: CN201980037750.7A
Authority: CN
Inventors: R·G·克雷斯托; S·M·凯明斯基; C·萨拉米
Original assignee: Cornell University
Current assignee: Cornell University
Priority date: 2018-04-03
Filing date: 2019-04-03
Publication date: 2021-01-15
Also published as: KR20210005612A; CA3095911A1; JP2021520204A; AU2019249162A1; WO2019195387A9; IL277696A; WO2019195387A1; EP3775177A1; BR112020019848A2; US20210381002A1

Abstract

本发明提供了用于抗氧化疗法的组合物和方法。

Description

针对氧化应激的基因疗法

对相关申请的交叉引用

本申请要求2018年4月3日提交的美国申请62/652,098的优先权。其全部内容在此参考并入。

发明领域

氧化应激是引起组织损伤并伴随疾病的发生或进展的常见原因，氧化应激是动脉粥样硬化、慢性肺部疾病如慢性阻塞性肺疾病和纤维化性肺部疾病、癌症、糖尿病、类风湿性关节炎、缺血后灌注损伤、心肌梗塞、心血管疾病、慢性炎症、中风和败血性休克、衰老及其他退行性和神经性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病的已知危险因素，并导致衰老过程(Durackova,2010；Mitscher et al.,1996)。

氧化剂来源于环境，包括工业污染、宇宙辐射和香烟烟雾，或者来源于正常的细胞功能，例如来自中性粒细胞和单核细胞的呼吸爆发以及解毒酶。氧化应激由包括羟基和超氧化物的自由基介导，这些自由基又导致活性种例如过氧化氢，它们一起被称为活性氧簇(ROS)。这些氧化剂会破坏脂质、蛋白质和DNA，介导上述许多致病结果，并且大量研究表明，抗氧化化合物可以发挥针对动脉粥样硬化、癌症、诱变和炎症的保护作用(Mitscher etal.,1996；Uttara et al.,2009；Owen et al.,2000；Sala et al.,2002)。

针对氧化应激的天然保护，抗氧化剂蛋白过氧化氢酶和超氧化物歧化酶分别催化过氧化氢和超氧化物的中和作用(Mates et al.,1999；Birben et al.,2012)。这些酶代表了健康个体中由正常的细胞过程引发的对氧化应激的防御线，但由于大小或生理位置的原因，这些酶没有能力解决源自环境或超疾病状态的过量的氧化剂负担。例如，过氧化氢酶是一种四聚体细胞内蛋白，因此在血清或粘膜表面均未发现过氧化氢酶，而在这些地方它本可以成为针对外源性ROS的第一道防线(Goyal等人，2010)。SOD具有三种形式，即SOD1、SOD2和SOD3，分别由它们的细胞位置来确定，即分别为细胞质、线粒体和与肝素结合的细胞外空间(Perry et al.,2010)。与过氧化氢酶相似，SOD酶不存在于血清或粘膜表面上。SOD3是分泌型的，但它具有附着至细胞表面的肝素结合结构域，因此SOD3不能达到足够的不与细胞表面结合的水平来穿透器官的上皮表面并到达粘膜表面(Perry等人，2010)。

发明概述

本发明提供了一种基因治疗方法，其介导分泌型抗氧化酶的表达，从而提供针对病原性细胞外氧化应激的保护(包括在粘膜表面)。通过用编码单体分泌型功能性过氧化氢酶和修饰的细胞外超氧化物歧化酶的cDNA构建的腺相关病毒、逆转录病毒或慢病毒载体的长期表达，可针对外源的或不当水平的活性氧簇提供前线防御。为了解决这个问题，对过氧化氢酶和SOD3的序列进行修饰以促进分泌和扩散，特别是使SOD保持不附着在细胞表面。在一个实施方案中，将这些分泌形式的过氧化氢酶和SOD的遗传密码掺入腺相关病毒载体中，从而在治疗区域、在血清中以及跨上皮和黏膜表面提供持久和一致水平的这些抗氧化酶，以作为针对氧簇过氧化氢和超氧化物的环境和病原体侵袭的屏障。构建分泌型单体过氧化氢酶的策略是去除介导四聚体形成所需的分子间粘附的相对非结构化区域并加入分泌信号转导序列。对SOD3进行了修饰，以取代与单体接合从而和SOD3序列中的片段形成一个更大的四聚体的环，并且肝素结合结构域消除了粘附至细胞外基质的能力。已显示，修饰的过氧化氢酶和SOD3均被释放到血清中并维持功能。在一个实施方案中，所述两种抗氧化剂酶可以在分开的载体中递送。在一个实施方案中，所述载体可以是AAV载体的任何血清型。在一个实施方案中，所述载体可以是质粒载体或其他病毒载体，例如逆转录病毒、腺病毒或慢病毒载体。可以使用任何表达盒，并且可以对过氧化氢酶和SOD3的蛋白质序列进行不同的改变。

载体的施用可导致免于环境引起的氧化应激损害的侵害，例如，由于辐射或化学暴露(例如核袭击或瓦斯(恐怖)袭击)、香烟或其他烟草制品(包括电子烟或雾化、雪茄烟暴露或来自炎症反应的不当的内源性ROS。在一个实施方案中，所述载体可以用于预防、抑制或治疗一种或多种疾病的方法中，所述疾病包括但不限于动脉粥样硬化、癌症、糖尿病、类风湿性关节炎、缺血后灌注损伤、心肌梗塞、心血管疾病、慢性炎症、中风和败血性休克、衰老以及其他退行性和神经性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病，并助长了衰老过程。

在一个实施方案中，提供了一种基因治疗载体，所述基因治疗载体包含表达盒，所述表达盒包含编码修饰的过氧化氢酶的核酸序列，所述修饰的过氧化氢酶具有过氧化氢酶活性但不形成四聚体。在一个实施方案中，所述过氧化氢酶与SEQ ID No.1、5-7或12中的一个具有至少80％、82％、84％、85％、87％、90％、92％、94％、95％、96％、98％、99％或更多的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述基因治疗载体还包含编码修饰的超氧化物歧化酶的核酸序列，所述修饰的超氧化物歧化酶是分泌型的但不结合细胞表面，并且任选地不形成四聚体。在一个实施方案中，所述超氧化物歧化酶与SEQ ID No.2-4、8或10中的一个具有至少80％、82％、84％、85％、87％、90％、92％、94％、95％、96％、98％、99％或更多的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，提供了一种基因治疗载体，所述基因治疗载体包含表达盒，所述表达盒包含编码修饰的超氧化物歧化酶的核酸序列，所述修饰的超氧化物歧化酶是分泌型的但不结合细胞表面。在一个实施方案中，所述修饰的超氧化物歧化酶为修饰的超氧化物歧化酶-3。在一个实施方案中，所述修饰的超氧化物歧化酶不与肝素结合。在一个实施方案中，所述修饰的超氧化物歧化酶不形成四聚体。在一个实施方案中，所述修饰的过氧化氢酶在穿线臂结构域的N末端具有缺失，所述缺失可以是1至80或更多个残基或1至80之间的任意整数，例如缺失5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75个残基。在一个实施方案中，所述修饰的过氧化氢酶在N末端具有缺失，例如，缺失5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个残基。在一个实施方案中，所述修饰的过氧化氢酶在N末端具有缺失，例如，缺失15或20或20至25个残基。在一个实施方案中，所述修饰的过氧化氢酶在包裹环结构域中具有缺失，所述缺失可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个残基。在一个实施方案中，所述修饰的过氧化氢酶在包裹环结构域中具有缺失，所述缺失可以是15至20或20至25个残基。在一个实施方案中，所述修饰的过氧化氢酶在所述包裹环结构域中具有缺失，所述缺失可以是从位置379、380、381、382、383、384或385到约位置398、399、400、401、402或403，例如，过氧化氢酶中的位置381至400(请参见图2)。在一个实施方案中，所述修饰的过氧化氢酶在穿线臂结构域和包裹环结构域中具有缺失。在一个实施方案中，所述修饰的过氧化氢酶具有分泌序列，例如异源分泌序列。在一个实施方案中，所述修饰的超氧化物歧化酶在肝素结合结构域中具有缺失，在所述环残基中的缺失可以是1至15或20或25或更多个残基或1至15之间的任意整数，例如，缺失2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、23或25个残基。在一个实施方案中，所述修饰的超氧化物歧化酶具有转角结构域或环结构域的一个或多个残基的取代，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、23、25或更多个残基被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、23、25或更多个残基取代。在一个实施方案中，所述修饰的超氧化物歧化酶具有转角结构域或环结构域的一个或多个残基的取代，例如，6、7、8、9、10、11或12个残基被4、5、6、7、8、9或10个残基取代。在一个实施方案中，所述修饰的超氧化物歧化酶具有转角结构域或环结构域的残基的取代，例如，超氧化物歧化酶的位置46、47、48、49、50、51、52或53至位置56、57、58、59、60、61或62被位置66、67、68、69、70或71至位置72、73、74、75、76、77、78或79，或者位置70、71、72、73、74或75至位置77、78、79、80、81、82或83的取代(请参见图3)。在一个实施方案中，所述修饰的超氧化物歧化酶具有转角结构域或环结构域的一个或多个残基的缺失和插入，例如，缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、23、25或更多个残基。在一个实施方案中，所述修饰的超氧化物歧化酶具有肝素结合结构域的一个或多个残基的缺失，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、23、25或更多个残基的取代。在一个实施方案中，所述修饰的超氧化物歧化酶具有肝素结合结构域的一个或多个残基的缺失，例如，缺失10至30，例如18、19、20、21或22个残基，或缺失25、26、27、28、29或30个残基。在一个实施方案中，所述修饰的超氧化物歧化酶具有肝素结合结构域的缺失，例如，超氧化物歧化酶中的位置209、210、211、212、213、214或215到位置235、236、237、238、239或240，或从位置217、218、219、220、221、222或223到位置235、236、237、238、239或240。

在一个实施方案中，基因治疗载体是病毒载体，例如腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒或慢病毒载体。在一个实施方案中，AAV载体是AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh.10。在一个实施方案中，一个载体包含表达盒，所述表达盒包含编码修饰的过氧化氢酶和修饰的超氧化物歧化酶的核酸序列，所述过氧化氢酶序列和超氧化物歧化酶序列被蛋白酶底物序列分开。在一个实施方案中，修饰的过氧化氢酶在修饰的超氧化物歧化酶的N-末端。在一个实施方案中，修饰的过氧化氢酶在修饰的超氧化物歧化酶的C末端。在一个实施方案中，一个载体包含表达盒，所述表达盒包含编码修饰的过氧化氢酶的核酸序列，且另一个载体包含表达盒，所述表达盒包含编码修饰的过氧化物歧化酶的核酸序列。

还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含一定量的载体。在一个实施方案中，所述载体在质粒上。在一个实施方案中，所述载体是病毒载体，例如腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒或慢病毒载体。在一个实施方案中，所述AAV载体是假型的。在一个实施方案中，所述AAV载体用AAVrh.10、AAV8、AAV9、AAV5、AAVhu.37、AAVhu.20、AAVhu.43、AAVhu.8、AAVhu.2或AAV7衣壳进行假型化。在一个实施方案中，所述载体的AAV基因组是AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh.10。在一个实施方案中，所述载体的量为约1×10¹¹至约1×10¹⁶个基因组拷贝。在一个实施方案中，所述载体的量为约1×10¹²至约1×10¹⁵个基因组拷贝，约1×10¹¹至约1×10¹³个基因组拷贝，或约1×10¹³至约1×10¹⁵个基因组拷贝。在一个实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的运载体。在一个实施方案中，所述药物组合物包含编码修饰的过氧化氢酶的病毒载体和编码修饰的超氧化物歧化酶的另一个病毒载体。

还提供了预防、抑制或治疗哺乳动物中的氧化损伤的方法，所述方法包括：向所述哺乳动物施用有效量的所述载体或所述药物组合物。在一个实施方案中，所述哺乳动物患有或具有患以下疾病的风险：动脉粥样硬化、癌症、糖尿病、类风湿性关节炎、缺血后灌注损伤、心肌梗塞、心血管疾病、慢性炎症、中风、败血性休克或其他退行性和神经疾病如阿尔茨海默病或帕金森病。在一个实施方案中，所述哺乳动物是人。在一个实施方案中，施用一定量的编码所述修饰的过氧化氢酶的病毒载体和一定量的编码所述修饰的超氧化物歧化酶的病毒载体。在一个实施方案中，所述病毒载体被依次施用。在一个实施方案中，所述病毒载体同时施用。在一个实施方案中，施用编码所述修饰的过氧化氢酶和所述修饰的超氧化物歧化酶的病毒载体。在一个实施方案中，所述AAV载体是AAVrh.10、AAV8、AAV9、AAV5、AAVhu.37、AAVhu.20、AAVhu.43、AAVhu.8、AAVhu.2或AAV7衣壳。在一个实施方案中，所述AAV载体是AAVrh.10、AAV8或AAV5。在一个实施方案中，所述AAV载体是AAV2，AAV5，AAV7，AAV8，AAV9或AAVrh.10。所述病毒载体的剂量可以是约1×10¹¹至约1×10¹⁶个基因组拷贝，约1×10¹²至约1×10¹⁵个基因组拷贝，约1×10¹¹至约1×10¹³个基因组拷贝，或约1×10¹³至约1×10¹⁵个基因组拷贝。在一个实施方案中，所述AAV载体用AAVrh.10、AAV8、AAV9、AAV5、AAVhu.37、AAVhu.20、AAVhu.43、AAVhu.8、AAVhu.2或AAV7衣壳进行假型化。在一个实施方案中，所述AAV载体用AAVrh.10、AAV8或AAV5进行假型化。在一个实施方案中，所述AAV载体为AAV2，AAV5，AAV7，AAV8，AAV9或AAVrh.10。

还提供了预防、抑制或治疗哺乳动物中的COPD、呼吸窘迫综合征或纤维化间质性肺病的方法，所述方法包括：向有此需要的哺乳动物施用有效量的所述载体或所述药物组合物。在一个实施方案中，所述哺乳动物是人。在一个实施方案中，施用一定量的编码所述修饰的过氧化氢酶的病毒载体和一定量的编码所述修饰的超氧化物歧化酶的病毒载体。在一个实施方案中，所述病毒载体被依次施用。在一个实施方案中，所述病毒载体被同时施用。在一个实施方案中，施用编码所述修饰的过氧化氢酶和所述修饰的超氧化物歧化酶的病毒载体。在一个实施方案中，所述AAV载体为AAVrh.10、AAV8、AAV9、AAV5、AAVhu.37、AAVhu.20、AAVhu.43、AAVhu.8、AAVhu.2或AAV7衣壳。在一个实施方案中，所述AAV载体是AAVrh.10、AAV8或AAV5。在一个实施方案中，所述AAV载体是AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh.10。所述病毒载体的剂量可以是约1×10¹¹至约1×10¹⁶个基因组拷贝，约1×10¹²至约1×10¹⁵个基因组拷贝，约1×10¹¹至约1×10¹³个基因组拷贝，或约1×10¹³至约1×10¹⁵个基因组拷贝。在一个实施方案中，所述AAV载体用AAVrh.10、AAV8、AAV9、AAV5、AAVhu.37、AAVhu.20、AAVhu.43、AAVhu.8、AAVhu.2或AAV7衣壳进行假型化。在一个实施方案中，所述AAV载体用AAVrh.10、AAV8或AAV5进行假型化。在一个实施方案中，所述AAV载体为AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh.10。

附图简述

图1A-B：肺的氧化负担和抗氧化防御能力。A)通过吸入的氧化剂以及在COPD情况下用来自激活的炎症细胞的内源性细胞外氧化剂对肺进行应激。B)肺细胞具有3种主要的酶抗氧化剂防御能力：SOD(催化

转化为H₂O₂)；过氧化氢酶(H₂O₂转化为H₂O)和谷胱甘肽(GSH；H₂O₂转化为H₂O；氧化的GSH形成GSSG，其被多种细胞内酶还原)。这些酶系统都不能提供足够的细胞外抗氧化防御能力。

图2A-B：过氧化氢酶的修饰，从而产生功能性的细胞外单体。A)人过氧化氢酶单体结构。B)人过氧化氢酶单体的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。显示的是对N端和包裹环结构域进行修改的区域。使用了三种策略：hCatNT-(从N端缺失20个氨基酸)，hCatWL-(从包裹环结构域缺失20个氨基酸)和hCat-NT-WL-(两个缺失的组合)。为了引导分泌，添加了一个5’信号肽；为了检测蛋白质，添加了3’血凝素(HA)标签。

图3A-B：进行修饰以产生功能性的细胞外SOD3单体。A)SOD3单体结构。B)人SOD3氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。显示的是进行了修饰的区域，并带有详细的修饰信息。

图4：LEX 5，一种基于基因疗法的细胞外可扩散酶促抗氧化载体，为4种候选基因转移载体(LEX 5a、b、c和d)中的一种。所有候选物都具有相同的表达盒，只是抗氧化酶编码序列不同。所有这些都包装在AAVrh.10衣壳中以产生4个候选载体。

图5A-C：对修饰的过氧化氢酶构建体的评估。A)修饰的过氧化氢酶构建体的分泌。经3种修饰的过氧化氢酶构建体转染的293T细胞上清液的Western(SDS还原凝胶；抗-HA标签)。泳道1-模拟；泳道2-hCatNT-构建体；泳道3-hCATWL-；泳道4-hCATNT-WL-；和泳道5-过氧化氢酶对照。B)分析由3种构建体产生的上清液的过氧化氢酶活性。所有3个都是分泌型的，但是只有hCatWL-是有活性的。C)在Bis Tris凝胶中分析来自hCatWD-构建体的上清液，以证明hCatND-构建体是单体的。

图6A-B：修饰的SOD3构建体。A)修饰的SOD3构建体的分泌。293T细胞的上清液的Western(抗-HA标签)，所述293T细胞进行以下转染：泳道1-模拟；泳道2-未修饰的HA标记的SOD3；泳道3-SOD3hd-。上清液中只有SOD3hd-。B)将来自SOD3hd-上清液的级分在聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱上进行抗HA Western，以证明SOD3hd-构建体是单体的。近似分子量由色谱柱规格计算得出。

图7A-F：体内LEX 5a和LEX 5b功能的评估。将AAVrh.10hCatWD-(LEX 5a)或AAVrh.10hSOD3hd-(LEX 5b)静脉内施用给雄性Balb/c小鼠(总剂量为10¹¹个基因组)。两周后，取肝和肺中的载体DNA，并评估血清中的过氧化氢酶和SOD活性。A-C)LEX 5a。A)肝载体DNA；B)肺载体DNA；和C)血清过氧化氢酶活性。D-F)LEX 5b。D)肝载体DNA；E)肺载体DNA；和F)血清SOD活性。

图8：过氧化氢酶结构。每个单体具有四个结构域。在第一个结构域中，氨基末端残基包括那些用于将单体单元结合在一起的互锁臂交换的残基。第二个结构域是血红素结构域。第三个结构域是包裹环结构域，其中四个单体彼此包裹形成四聚体；在带有正电荷和带负电荷的氨基酸侧链之间的盐桥和离子相互作用将这四种单体结合在一起。第四结构域包括羧基末端残基，其在使进入的H₂O₂底物定向进行催化降解的过程中起作用。

图9：抑制过氧化氢酶四聚体形成的遗传修饰。为防止单体形成，在保留阅读框的同时删除了N末端穿线臂和/或包裹环结构域中的氨基酸残基，并确保不修改NADPH结合功能和酶功能。

图10：修饰的过氧化氢酶序列。

图11：四聚体过氧化氢酶的体外表征。虽然有分泌信号，但是野生型过氧化氢酶留在细胞中(Western分析将四聚体分解为单体单元进行分析)。

图12：对修饰的过氧化氢酶构建体的体外表征。

图13A-B：对修饰的过氧化氢酶构建体的体外表征。A)蛋白质印迹。B)上清液中的过氧化氢酶活性。

图14：过氧化氢酶构建体上清液的评估(单体和多聚体过氧化氢酶的分离)。样品在Bis-Tris凝胶上评估、印迹并用抗-过氧化氢酶抗体(ABCAM：ab88067)进行探测；预测的条带大小，单体为60kDa，四聚体为240kDa。所有3个构建体仅分泌单体构建体。

图15：体外评估上清液的由单体和多聚体过氧化氢酶的构建体导致的的过氧化氢酶活性。单体构建体表达具有过氧化氢酶活性的蛋白质。

图16A-B：在体内评估由编码人过氧化氢酶的AAVrh.10导致的人过氧化氢酶的表达，所述人过氧化氢酶具有修饰的包裹结构域(hCatWL-)。A)实验设计。B)肝脏中的载体拷贝数。

图17A-B：由腺相关病毒血清型rh.10介导的体内过氧化氢酶活性的长期过程，所述血清型rh.10编码具有修饰的包裹环结构域(hCatWL-)的人过氧化氢酶。A)载体设计。B)实验设计。

图18：由腺相关病毒血清型rh.10介导的体内过氧化氢酶活性的长期过程，所述血清型rh.10编码修饰的人过氧化氢酶包裹环结构域(hCatWL-)。在第2周至第12周，来自以下治疗组的雄性C57bl/6J小鼠血清中的过氧化氢酶活性。PBS(n＝4)。AAVrh.10hCATWL-(n＝5直到第4周，在第4周处死一只小鼠，随后在第8周处死另一只小鼠)。hCatWL-(从包裹环结构域和HA标签中删除了20个AA)。

图19A-B：超氧化物歧化酶3。A)蛋白质结构。B)晶体结构。

图20：修饰的SOD3，用以增强细胞外可及性。为了增强细胞外扩散，修饰了肝素结合域中的“转角”残基。

图21：hSOD3hd-的体外评估。

图22：由SOD3hd^-表达的上清液中SOD3的单体和多聚体形式的分析。将来自尺寸排阻柱的级分在Bis-Tris凝胶上运行。用抗-HA抗体进行Western分析；对于泳道2-5的级分，预计单体分子量为30kDa。

图23A-B：IV注射后肝脏和肺中的SOD3hd-gDNA定量。A)肝脏中的DNA定量。B)肺中的DNA定量。

图24：血清中修饰的SOD3的活性(第2周)。

图25：暴露于氧化剂的大气道上皮细胞的由修饰的SOD3和过氧化氢酶介导的体外抗氧化剂保护作用。数据显示了修饰的SOD3和过氧化氢酶的抗氧化特性，可保护人的大气道上皮细胞免于来源于黄嘌呤氧化酶和香烟烟雾提取物(CSE)的氧化剂的伤害。

图26A-B：暴露于氧化剂的大气道上皮细胞的由修饰的SOD3和过氧化氢酶介导的体外抗氧化剂保护作用。LDH测定可测量细胞死亡，较低的LDH表明可保护免于氧化剂引起的细胞死亡。修饰的SOD3增强了针对香烟烟雾提取物和黄嘌呤氧化酶衍生的氧化剂的保护作用(降低了由于暴露于CSE或黄嘌呤氧化酶而引起的LDH活性)。与未修饰的SOD3和过氧化氢酶相比，修饰的SOD3和修饰的过氧化氢酶均能提供更好的针对黄嘌呤氧化酶暴露的保护作用。

图27：两个构建体的示意图。

发明详述

在下面的描述中，参考了附图，所述附图形成本描述的一部分，并且在附图中通过图示的方式示出了可以实践的特定实施方案。详细描述这些实施方案以使本领域技术人员能够实施本发明，并且应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以利用其他实施方案并且可以进行逻辑改变。因此，以下示例性实施方案的描述不应被认为是限制性的，并且本发明的范围由权利要求书限定。

提供了摘要以符合37C.F.R.§1.72(b)，从而允许读者快速确定本技术公开的性质和要旨。应理解，提交的摘要不应被用来解释或限制权利要求的范围或含义。

定义

“载体”是指大分子或大分子缔合，其包含多核苷酸或与多核苷酸缔合，并且其可用于介导多核苷酸在体外或体内向细胞的递送。示例性的载体包括例如质粒、病毒载体、脂质体和其他基因递送载体。待递送的多核苷酸有时被称为“靶多核苷酸”或“转基因”，其可以包含基因疗法中的目标编码序列(例如编码目标治疗蛋白质的基因)，疫苗开发中的目标编码序列(例如，表达适于在哺乳动物中引发免疫应答的蛋白质、多肽或肽的多核苷酸)和/或可选择的或可检测的标志物。

如本文所用，术语“转导”、“转染”、“转化”或“进行转导”是指将外源多核苷酸引入宿主细胞以使得该多核苷酸(例如细胞中的转基因)表达的过程，并且包括使用重组病毒将外源多核苷酸引入宿主细胞中。细胞中多核苷酸的转导、转染或转化可以通过本领域众所周知的方法来确定，包括但不限于，蛋白质表达(包括稳态水平)如通过ELISA、流式细胞术和蛋白质印迹，通过异源化测定法(例如，Northern印迹，Southern印迹和凝胶移位迁移率测定)进行DNA和RNA的检测。用于引入外源多核苷酸的方法包括众所周知的技术，例如病毒感染或转染、脂质转染、转化和电穿孔、以及其他非病毒基因递送技术。所引入的多核苷酸可以在宿主细胞中稳定或瞬时维持。

“基因递送”是指将外源多核苷酸引入细胞以进行基因转移，并且可以包括靶向、结合、摄取、转运、定位、复制子整合和表达。

“基因转移”是指将外源多核苷酸引入细胞，其可以包括靶向，结合，摄取，转运，定位和复制子整合，但是不同于且不表示所述基因的后续表达。

“基因表达”或“表达”是指基因转录、翻译和翻译后修饰的过程。

“感染性”病毒或病毒颗粒是包含多核苷酸组分的病毒或病毒颗粒，所述多核苷酸组分能够递送至对之来说病毒物种为营养型的细胞中。该术语不一定表示所述病毒具有任何复制能力。

术语“多核苷酸”是指任意长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的或加帽的核苷酸和核苷酸类似物，并且可以被非核苷酸成分中断。如果存在修饰，可以是在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。本文所用的术语多核苷酸可互换地是指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则本文描述的任何实施方案中多核苷酸既包括双链形式，也包括已知或预测组成双链形式的两个互补单链形式中的每一个。

“分离的”多核苷酸，例如质粒、病毒、多肽或其他物质是指物质的制剂，所述制剂不含在所述物质或类似物质天然存在或最初制备时可能存在的至少一些其他成分。因此，例如，可以通过使用纯化技术来制备分离的物质，以从源混合物中使其富集。分离的核酸、肽或多肽以不同于在自然界发现时所处的形式或背景而存在。例如，在宿主细胞染色体上邻近基因的附近发现了给定的DNA序列(例如基因)；在细胞中发现了与许多其他编码多种蛋白质的mRNA形成混合物的RNA序列(例如编码特定蛋白质的特定mRNA序列)。分离的核酸分子可以以单链或双链形式存在。当使用分离的核酸分子表达蛋白质时，所述分子将至少包含有义或编码链(即，所述分子可以是单链的)，但可以同时包含有义和反义链(即，所述分子可以是双链的)。可以绝对地测量富集度，例如重量/溶液体积，或者也可以相对于来源混合物中存在的第二种可能的干扰物质测量富集度。可以预见到本发明所述实施方案的富集度增加。如此，例如，2倍富集、10倍富集、100倍富集或1000倍富集。

“转录调控序列”是指这样的基因组区域：其控制与之可操作地连接的基因或编码序列的转录。用于本发明的转录调节序列通常包括至少一个转录启动子，并且还可以包括一个或多个转录增强子和/或终止子。

“可操作地连接”是指两个或更多个组分的排列，其中所述组分处于允许它们以协调方式起作用的关系。举例来说，如果TRS(转录调控序列)或启动子促进编码序列的转录，则将转录调控序列或启动子可操作地连接至编码序列。可操作地连接的TRS通常与编码序列顺式连接，但不一定直接与其相邻。

“异源的”是指，相比于参比实体，来源于基因型上不同的实体。例如，通过基因工程技术被引入不同细胞类型的多核苷酸是异源多核苷酸(并且当表达时，可以编码异源多肽)。类似地，将转录调控元件(例如启动子)从其天然编码序列中去除，并可操作地连接至不同的编码序列的，是异源转录调控元件。

“终止子”是指倾向于减少或阻止通读转录的多核苷酸序列(即，其减少或阻止源自终止子一侧的转录继续延伸至终止子的另一侧)。转录被破坏的程度通常是碱基序列和/或终止子序列长度的函数。特别地，如在许多分子生物学系统中众所周知的，特定的DNA序列(通常称为“转录终止序列”)是这样的特异性的序列：其倾向于通过RNA聚合酶来破坏通读转录，可能是通过使RNA聚合酶分子停止和/或使RNA聚合酶分子与转录的DNA脱离开来。这种序列特异性终止子的典型例子包括聚腺苷酸化(“polyA”)序列，例如SV40 polyA。除了这种序列特异性终止子，或用来取代这种序列特异性终止子，通过在启动子和编码区之间插入的相对长的DNA序列也往往会破坏编码区的转录，这通常与插入序列的长度成比例。这种效应产生的原因可能是由于RNA聚合酶分子总是有某种趋势从所转录的DNA上脱离出来，而在完成或甚至可能启动编码区的转录之前，在到达编码区之前增加待经过的序列的长度通常会增加在转录之前发生脱离的可能性。因此，终止子可以防止仅从一个方向(“单向”终止子)或从两个方向(“双向”终止子)进行的转录，并且可以由序列特异性终止序列或序列非特异性终止子或两者组成。各种这样的终止子序列是本领域已知的；下面提供了这些序列在本发明上下文中的说明性用途。

“宿主细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”，“包装细胞系”和其他这样的术语表示在本发明中用于，例如，产生重组病毒或重组融合多肽的更高真核水平的细胞，例如包括人细胞在内的哺乳动物细胞。这些细胞包括被转导的原始细胞的后代。应当理解，单个细胞的后代不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态或在基因组互补性方面)。

应用于多核苷酸的“重组”是指多核苷酸是以下技术的各种组合的产物：克隆、限制和/或连接步骤、以及导致形成不同于自然界中的多核苷酸的构建体的其他方法。重组病毒是包含重组多核苷酸的病毒颗粒。所述术语分别包括原始多核苷酸构建体的复制物和原始病毒构建体的后代。

“控制元件”或“控制序列”是参与分子相互作用的核苷酸序列，其有助于多核苷酸的功能调节，包括多核苷酸的复制、重复、转录、剪接、翻译或降解。调节可能会影响过程的频率、速度或特异性，并且本质上可能是增强的或抑制性的。本领域已知的控制元件包括，例如，转录调控序列如启动子和增强子。启动子是在一定条件下能够结合RNA聚合酶并启动通常位于启动子下游(沿3'方向)的编码区的转录的DNA区域。启动子包括AAV启动子，例如P5、P19、P40和AAV ITR启动子，以及异源启动子。

“表达载体”是包含编码目标基因产物的区域的载体，并用于实现基因产物在预期靶细胞中的表达。表达载体还包含与编码区可操作地连接的控制元件，以促进蛋白质在靶标中的表达。有时将控制元件和与其可操作地连接以进行表达的一个或多个基因的组合称为“表达盒”，其有许多是本领域已知的并且可以方便地从本领域的现有组分构建得到。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。该术语还涵盖已被修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键的形成、糖基化、乙酰化、膦酰化、脂质化或与标记组分的缀合。

当用于涉及细胞或生物体中的蛋白质、基因，核酸或多核苷酸时，术语“外源的”是指已经通过人工或自然的手段被引入了细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸。外源核酸可以来自不同的生物体或细胞，或者它可以是在生物体或细胞中天然存在的核酸的一个或多个额外拷贝。作为一个非限制性实例，相比于天然细胞中的染色体位置，外源核酸处于不同的染色体位置，或者外源核酸的侧翼具有与自然界不同的核酸序列，例如，将来自一个基因的启动子连接至来自另一个基因的基因产物的开放阅读框的表达盒。

本文使用的“转化的”或“转基因的”包括任何宿主细胞或细胞系，其因为存在至少一种重组DNA序列而已经被改变或增强。本发明所述的宿主细胞通常通过用质粒表达载体中的DNA序列转染(其为分离的线性DNA序列)，或通过用重组病毒载体感染而产生。

术语“序列同源性”是指两个核酸序列之间的碱基匹配比例或两个氨基酸序列之间的氨基酸匹配比例。当将序列同源性表示为百分比如50％时，该百分比表示，在与某些其他序列比较时，所选序列的长度上的匹配比例。允许有间隙(在两个序列中的任何一个中)以最大化匹配；通常使用的间隙长度为15个碱基或更小，6个碱基或更小，例如2个碱基或更小。当使用寡核苷酸作为探针或进行处理时，靶核酸和寡核苷酸序列之间的序列同源性通常不小于20个可能的寡核苷酸碱基对匹配中的17个靶碱基匹配(85％)；不少于10个可能的碱基对匹配中的9个匹配(90％)，或不少于20个可能的碱基对匹配中的19个匹配(95％)。

如果两个氨基酸序列之间存在部分或完全同一性，则它们的序列是同源的。例如，85％的同源性是指当两个序列进行比对以获得最大匹配时，85％的氨基酸是相同的。在最大限度地提高匹配性时，允许有间隙(在两个匹配序列中的任何一个中)；间隙长度等于或小于5或等于或小于2。或者，如本文所使用的术语“同源的”，如果两个蛋白质序列(或从其衍生的长度至少为30个氨基酸的多肽序列)在使用ALIGN程序(突变数据矩阵和间隙罚分为6或更大)时的比对得分大于5(以标准差为单位)时，则它们是同源的。如果使用ALIGN程序进行最佳比对时，两个序列或其部分的氨基酸具有大于或等于50％相同，则它们的同源性更高。

本文使用的术语“对应于”是指多核苷酸序列在结构上与参照多核苷酸序列的全部或部分相关，或者多肽序列在结构上与参照多肽序列的全部或部分相关，例如，它们具有至少80％、85％、90％、95％或更多(例如99％或100％)的序列同一性。相比之下，本文所用的术语“与……互补”是指互补序列与参照多核苷酸序列的全部或一部分同源。例如，核苷酸序列“TATAC”对应于参照序列“TATAC”，并且与参照序列“GTATA”互补。

术语“序列同一性”是指两个多核苷酸序列在比较窗口中是相同的(即，基于核苷酸与核苷酸的比较)。术语“序列同一性百分比”是指两个多核苷酸序列在比较窗口中是相同的(即，基于核苷酸与核苷酸的比较)。术语“序列同一性百分比”是这样计算的：比对比较窗口中的两个最佳比对的序列，确定两个序列中均出现相同的核酸碱基(例如，A，T，C，G，U或I)的位置数，以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，然后将结果乘以100，以得出序列同一性百分比。如本文所用，术语“基本同一性”表示多核苷酸序列的特征，其中所述多核苷酸通过在包含了至少20个核苷酸位置的比较窗口(通常是至少20-50个核苷酸的窗口)中与参照序列相比，具有至少85％的序列同一性，例如至少90％至95％的序列同一性，或至少99％的序列同一性的序列，其中序列同一性百分比是通过比对参照序列与多核苷酸序列算得的，所述多核苷酸序列可能包含在比较窗口中占参照序列总数的20％或更少的缺失或添加。

“保守的”氨基酸取代是，例如，作为极性酸性氨基酸的天冬氨酸-谷氨酸；作为极性碱性氨基酸的赖氨酸/精氨酸/组氨酸；作为非极性或疏水性氨基酸的亮氨酸/异亮氨酸/蛋氨酸/缬氨酸/丙氨酸/甘氨酸/脯氨酸；作为极性或不带电荷的亲水性氨基酸的丝氨酸/苏氨酸。保守的氨基酸取代还包括基于侧链的分组。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族羟基侧链的氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；具有酰胺基侧链的氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的氨基酸基团为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸为半胱氨酸和蛋氨酸。例如，可以合理地预期，用异亮氨酸或缬氨酸替代亮氨酸、用谷氨酸替代天冬氨酸、用丝氨酸替代苏氨酸、或类似地用结构相关的氨基酸替代氨基酸不会对所得的多肽的性质产生重大效应。氨基酸改变是否会导致产生功能性多肽可以通过测定所述多肽的特异性活性容易地确定。天然存在的残基根据共同的侧链特性分为几组：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：asn、gln、his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；以及(6)芳香族的：trp、tyr、phe。

本发明还设想了具有非保守取代的多肽。非保守取代需要将上述类别之一的成员交换为另一类别。

成分和方法

作为一种解决氧化应激的机制，并无本文所述的针对在基因转移方法中单独或组合使用的两种抗氧化剂酶的修饰的先例。在一个实施方案中，设计了蛋白质修饰并为过氧化氢酶和超氧化物歧化酶3酶的分泌型的单体形式制备了遗传构建体。将各自的遗传密码单独地、或者组合成单个翻译序列(具有插入切割位点)地插入到表达盒中(例如病毒载体，如腺相关病毒载体)。载体介导的表达将过氧化氢酶或SOD或两者提供至细胞外环境，并转移至血清和粘膜表面，以作为氧化应激的前线屏障。这些基因转移方法的使用可保护免于氧化介导的病理和疾病。

基因疗法的使用基于持久的表达载体，例如腺相关病毒(AAV)载体(但也可以是另一种病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒载体)。研究了人过氧化氢酶和人SOD3酶的3维蛋白质结构，它们是针对ROS进行保护的有效的抗氧化武器。本文提出了一种修饰每种酶的策略，目的是以载体介导的方式内源性地产生分泌型的、单体的、功能性的构建体，该构建体能够提供前线防御，从而能穿透器官的上皮表面并到达粘膜表面。

过氧化氢酶。在一个实施方案中，在分泌信号肽蛋白质(例如，来自人免疫球蛋白；参见SEQ ID NO.13)的N末端添加遗传密码，以向细胞的蛋白质生产机器提供指示，从而指导翻译的序列从细胞中分泌出来。在一个实施方案中，所述遗传密码被修饰以去除编码蛋白质序列中的环的序列，所述环形成四聚体中的单体之间的结合界面。在一个实施方案中，以这样一种方式删除了编码第381至400氨基酸的DNA，使得3维蛋白质结构中的末端保持彼此靠近，因此，修剪后的蛋白质链不受中间环的去除的限制，从而使得对整体蛋白质结构的影响最小化。

SOD3。在一个实施方案中，去除了编码氨基酸残基50至59的遗传密码，并用编码氨基酸74至80的遗传密码代替，其是SOD3结构中的另一个柔性环，选择它是为了最小化通过将非SOD3序列引入结构而可能产生的免疫性。在一个实施方案中，使编码细胞外基质/肝素结合域(氨基酸220至240)的区域的遗传密码缺失，以使分泌的蛋白质能够从细胞表面自由扩散。由于野生型SOD3编码分泌信号序列，因此未对其编码氨基末端的cDNA进行任何更改。

在一个实施方案中，将两种转基因都置于组成型的表达巨细胞病毒(CMV)/鸡β-肌动蛋白杂合启动子后面的表达盒中，并加入AAVrh.10血清型载体中。插入的弗林蛋白酶-2a切割序列为单个翻译序列提供了产生两个独立的多肽产物(分泌型的单体过氧化氢酶和分泌型的单体SOD3)的能力(Fang et al.,2005)。

SEQ ID NO.1和SEQ ID No.5-7或12提供了过氧化氢酶的示例性氨基酸序列，SEQID No.2-4、8和10提供了示例性的SOD序列：

SEQ ID NO:2

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SEQ ID NO:3

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SEQ ID NO:4

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SEQ ID NO:6

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SEQ ID NO:7

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APRAATMPRVRSCLLHSPRTHALADSRDPASDQMQHWKEQRAAQKADVLTTGAGNPVGDKLNVITVGPRGPLLVQDVVFTDEMAHFDRERIPERVVHAKGAGAFGYFEVTHDITKYSKAKVFEHIGKKTPIAVRFSTVAGESGSADTVRDPRGFAVKFYTEDGNWDLVGNNTPIFFIRDPILFPSFIHSQKRNPQTHLKDPDMVWDFWSLRPESLHQVSFLFSDRGIPDGHRHMNGYGSHTFKLVNANGEAVYCKFHYKTDQGIKNLSVEDAARLSQEDPDYGIRDLFNAIATGKYPSWTFYIQVMTFNQAETFPFNPFDLTKVWPHKDYPLIPVGKLVLNRNPVNYFAEVEQIAFDPSNMPPGIEASPDKMLQGRLFAYPDTHRHRLGPNYLHIPVNCPYRAPNYYPNSFGAPEQQPSALEHSIQYSGEVRRFNTANDDNVTQVRAFYVNVLNEEQRKRLCENIAGHLKDAQIFIQKKAVKNFTEVHPDYGSHIQALLDKYNAEKPKNAIHTFVQSGSHLAAREKANLYPYDVPDYA(SEQ ID NO:12)；或者具有Ig信号序列的序列

atgccacgcgtccgctcctgtcttctccacagtcccagaacacacgcactc

GCTGACAGCCGGGATCCCGCCAGCGACCAGATGCAGCACTGGAAGGAGCAGCGGGCCGCGCAGAAAGCTGATGTCCTGACCACTGGAGCTGGTAACCCAGTAGGAGACAAACTTAATGTTATTACAGTAGGGCCCCGTGGGCCCCTTCTTGTTCAGGATGTGGTTTTCACTGATGAAATGGCTCATTTTGACCGAGAGAGAATTCCTGAGAGAGTTGTGCATGCTAAAGGAGCAGGGGCCTTTGGCTACTTTGAGGTCACACATGACATTACCAAATACTCCAAGGCAAAGGTATTTGAGCATATTGGAAAGAAGACTCCCATCGCAGTTCGGTTCTCCACTGTTGCTGGAGAATCGGGTTCAGCTGACACAGTTCGGGACCCTCGTGGGTTTGCAGTGAAATTTTACACAGAAGATGGTAACTGGGATCTCGTTGGAAATAACACCCCCATTTTCTTCATCAGGGATCCCATATTGTTTCCATCTTTTATCCACAGCCAAAAGAGAAATCCTCAGACACATCTGAAGGATCCGGACATGGTCTGGGACTTCTGGAGCCTACGTCCTGAGTCTCTGCATCAGGTTTCTTTCTTGTTCAGTGATCGGGGGATTCCAGATGGACATCGCCACATGAATGGATATGGATCACATACTTTCAAGCTGGTTAATGCAAATGGGGAGGCAGTTTATTGCAAATTCCATTATAAGACTGACCAGGGCATCAAAAACCTTTCTGTTGAAGATGCGGCGAGACTTTCCCAGGAAGATCCTGACTATGGCATCCGGGATCTTTTTAACGCCATTGCCACAGGAAAGTACCCCTCCTGGACTTTTTACATCCAGGTCATGACATTTAATCAGGCAGAAACTTTTCCATTTAATCCATTCGATCTCACCAAGGTTTGGCCTCACAAGGACTACCCTCTCATCCCAGTTGGTAAACTGGTCTTAAACCGGAATCCAGTTAATTACTTTGCTGAGGTTGAACAGATAGCCTTCGACCCAAGCAACATGCCACCTGGCATTGAGGCCAGTCCTGACAAAATGCTTCAGGGCCGCCTTTTTGCCTATCCTGACACTCACCGCCATCGCCTGGGACCCAATTATCTTCATATACCTGTGAACTGTCCCTACCGTGCTCCAAATTACTACCCCAACAGCTTTGGTGCTCCGGAACAACAGCCTTCTGCCCTGGAGCACAGCATCCAATATTCTGGAGAAGTGCGGAGATTCAACACTGCCAATGATGATAACGTTACTCAGGTGCGGGCATTCTATGTGAACGTGCTGAATGAGGAACAGAGGAAACGTCTGTGTGAGAACATTGCCGGCCACCTGAAGGATGCACAAATTTTCATCCAGAAGAAAGCGGTCAAGAACTTCACTGAGGTCCACCCTGACTACGGGAGCCACATCCAGGCTCTTCTGGACAAGTACAATGCTGAGAAGCCTAAGAATGCGATTCACACCTTTGTGCAGTCCGGATCTCACTTGGCGGCAAGGGAGAAGGCAAATCTG(SEQ ID NO:13)。

ATGCTGGCGCTACTGTGTTCCTGCCTGCTCCTGGCAGCCGGTGCCTCGGACGCCTGGACGGGCGAGGACTCGGCGGAGCCCAACTCTGACTCGGCGGAGTGGATCCGAGACATGTACGCCAAGGTCACGGAGATCTGGCAGGAGGTCGCCACGCTGGACGCCGCGCAGCACGCCGCCTGCCAGGTGCAGCCGTCGGCCACGCTGGACGCCGCGCAGCCCCGGGTGACCGGCGTCGTCCTCTTCCGGCAGCTTGCGCCCCGCGCCAAGCTCGACGCCTTCTTCGCCCTGGAGGGCTTCCCGACCGAGCCGAACAGCTCCAGCCGCGCCATCCACGTGCACCAGTTCGGGGACCTGAGCCAGGGCTGCGAGTCCACCGGGCCCCACTACAACCCGCTGGCCGTGCCGCACCCGCAGCACCCGGGCGACTTCGGCAACTTCGCGGTCCGCGACGGCAGCCTCTGGAGGTACCGCGCCGGCCTGGCCGCCTCGCTCGCGGGCCCGCACTCCATCGTGGGCCGGGCCGTGGTCGTCCACGCTGGCGAGGACGACCTGGGCCGCGGCGGCAACCAGGCCAGCGTGGAGAACGGGAACGCGGGCCGGCGGCTGGCCTGCTGCGTGGTGGG C(SEQ ID NO:11；DNA序列hSOD3hd^-)编码

MLALLCSCLLLAAGASDAWTGEDSAEPNSDSAEWIRDMYAKVTEIWQEVATLDAAQHAACQVQPSATLDAAQPRVTGVVLFRQLAPRAKLDAFFALEGFPTEPNSSSRAIHVHQFGDLSQGCESTGPHYNPLAVPHPQHPGDFGNFAVRDGSLWRYRAGLAASLAGPHSIVGRAVVVHAGEDDLGRGGNQASVENGNAGRRLACCVVG(SEQ ID NO:10)

在本发明范围内的序列包括与SEQ ID No.1-8、10或12中的一个具有至少80％、85％、88％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的氨基酸序列同一性的序列。在本发明范围内的过氧化氢酶序列具有比全长过氧化氢酶序列少约2％、5％、10％、12％、15％或高达20％的残基。在本发明范围内的超氧化物歧化酶序列具有比全长超氧化物歧化酶序列少约2％、5％、10％、12％、15％或高达20％的残基。

基因递送载体

基因递送载体包括，例如，病毒载体、脂质体和其他含脂质的复合物，例如脂质复合物(DNA和阳离子脂质)、多聚体(例如与阳离子聚合物例如聚乙二醇复合的DNA)、纳米颗粒(例如结合或官能化以结合DNA的磁性无机纳米颗粒，如Fe₃O₄或MnO₂纳米颗粒)、微粒(例如由聚丙交酯-聚半乳糖试剂形成的微粒)、纳米管(例如二氧化硅纳米管)以及其他能够介导将基因递送给宿主细胞的大分子复合物。载体还可以包含能进一步调节基因递送和/或基因表达、或者以其他方式为靶细胞提供有益特性的其他组分或官能。此类其他组分包括，例如，影响结合或靶向细胞的组分(包括介导细胞类型或组织特异性结合的组分)；影响细胞对载体吸收的组分；影响被转移基因在被摄取后在细胞内定位的组分(例如介导核定位的试剂)；和影响基因表达的组分。此类组分还可包括标志物，例如可检测和/或选择性标志物，其可用于检测或选择已摄取并正在表达由载体递送的核酸的细胞。大量这样的载体在本领域中是已知的并且通常是可用的。

在本发明范围内的基因递送载体包括但不限于分离的核酸(例如，可以在染色体外维持的基于质粒的载体)和病毒载体(例如，重组的腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、痘病毒、乳头瘤病毒、或腺相关病毒，包括存在于脂质体中的病毒和非病毒载体，例如中性或阳离子脂质体如DOSPA/DOPE、DOGS/DOPE或DMRIE/DOPE脂质体)，和/或与其他分子相关例如DNA-抗-DNA抗体-阳离子脂质(DOTMA/DOPE)复合物。示例性的病毒性基因递送载体描述如下。基因递送载体可以通过任何途径施用，包括但不限于颅内、鞘内、肌肉内、经颊、直肠内、静脉内或冠状动脉内施用，并且可以通过使用电穿孔和/或离子电渗疗法，和/或支架如细胞外基质或水凝胶，例如水凝胶贴剂来增强向细胞的转移。在一个实施方案中，不使用渗透增强剂来增强向CNS的间接递送。

逆转录病毒载体

逆转录病毒载体表现出几个独特的特征，包括它们能够稳定而精确地整合到宿主基因组中，从而提供长期的转基因表达。可以离体操作这些载体，以消除感染性的基因颗粒，从而最大程度地降低全身感染和患者向患者传播的风险。假型逆转录病毒载体可以改变宿主细胞的嗜性。

慢病毒

慢病毒衍生自逆转录病毒家族，包括人类免疫缺陷病毒和猫免疫缺陷病毒。但是，与仅感染分裂细胞的逆转录病毒不同，慢病毒可以感染分裂细胞和非分裂细胞。例如，基于人免疫缺陷病毒基因组的慢病毒载体能够在体内有效地转导心肌细胞。尽管慢病毒具有特定的嗜性，但用水泡性口炎病毒对病毒包膜进行假型化可产生范围更广的病毒(Schneppet al.,Meth.Mol.Med.,69:427(2002))。

腺病毒载体

通过从基因组中删除负责病毒基因表达的早期(E1A和E1B)基因，可以使腺病毒载体无法复制，并以染色体外的形式稳定地维持在宿主细胞中。这些载体具有转染复制性细胞和非复制性细胞的能力，并且特别地，这些载体已显示出例如在直接注射或灌注后在体内有效地感染心肌细胞。已经显示，腺病毒载体可导致体内治疗基因的瞬时表达，在7天达到峰值并持续约4周。在利用神经特异性启动子的系统中，可以提高转基因表达的持续时间。另外，可以以非常高的滴度产生腺病毒载体，从而可以用小体积的病毒进行有效的基因转移。

腺相关病毒载体

重组的腺相关病毒(rAAV)源自非致病性细小病毒，基本上不会引起细胞免疫应答，并且在大多数系统中能持续数月表达转基因。此外，像腺病毒一样，腺相关病毒载体也具有感染复制性和非复制性细胞的能力，并且被认为对人类没有致病性。此外，它们似乎有望用于持续的心脏基因转移(Hoshijima等人，Nat.Med.,8:864(2002)；Lynch等人，Circ.Res.,80:197(1997))。

AAV载体包括但不限于AAV1、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh.10。

质粒DNA载体

质粒DNA通常被称为“裸露的DNA”，用以表明缺少更复杂的包装系统。体内将质粒DNA直接注射到心肌细胞中已经是很熟练的了。基于质粒的载体是相对非免疫原性和非致病性的，具有稳定整合到细胞基因组中的潜力，从而导致体内有丝分裂后细胞中的长期基因表达。例如，在往肌肉注射质粒DNA后，虽然局部(focal)转基因表达水平相对较低，但是分泌型的血管生成因子的表达已经在动物模型中显示出了显著的生物学作用，并且在临床上似乎很有希望(Isner,Nature,415:234(2002))。此外，质粒DNA在血流中迅速降解；因此，在远处器官系统中的转基因表达的机会可以忽略不计。质粒DNA可以作为大分子复合物例如脂质体或DNA-蛋白质复合物的一部分递送至细胞，并且可以使用包括电穿孔在内的技术来增强递送。

药物组合物

本发明提供了一种组合物，所述组合物包含上述基因转移载体和药学上可接受的(例如生理学上可接受的)运载体，所述组合物基本上由上述基因转移载体和药学上可接受的(例如生理学上可接受的)运载体组成，或所述组合物由上述基因转移载体和药学上可接受的(例如生理学上可接受的)运载体组成。当所述组合物基本上由本发明所述基因转移载体和药学上可接受的运载体组成时，可以包含不会实质性影响所述组合物的其他组分(例如佐剂、缓冲剂、稳定剂、抗炎剂、增溶剂、防腐剂等)。当所述组合物由本发明所述基因转移载体和所述药学上可接受的运载体组成时，所述组合物不包含任何其他组分。在本发明的范围内可以使用任何合适的运载体，并且这种运载体在本领域中是众所周知的。运载体的选择将部分地由所述组合物所要施用的特定部位和用于施用所述组合物的特定方法来确定。除了本文所述的基因转移载体以外，所述组合物可以任选地是无菌的。可以将组合物冷冻或冻干以用于储存，并在使用前在合适的无菌载体中重构。所述组合物可以根据例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,PA(2001)中所述的常规技术来产生。

适用于所述组合物的制剂包括水性和非水性溶液、等渗无菌溶液(可以包含抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂)以及水性和非水性无菌悬浮液(可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。制剂可以装在单位剂量或多剂量密封的容器中，例如安瓿和小瓶，并可以在冷冻干燥(冻干)条件下保存，在使用之前仅需添加无菌液体运载体，例如水。临时性的溶液和悬浮液可以由上述无菌粉剂、颗粒剂和片剂制得。在一个实施方案中，所述运载体为缓冲盐溶液。在一个实施方案中，本发明所述的基因转移载体在组合物中被施用，所述组合物被配制成在施用前保护基因转移载体不受损害。例如，所述组合物可以被配制成减少基因转移载体在用于制备、储存或施用所述基因转移载体的装置(例如玻璃器皿、注射器或针头)上的损失。所述组合物可以被配制成降低基因转移载体的光敏感性和/或温度敏感性。为此，组合物可包含药学上可接受的液体运载体(例如上述那些运载体)，以及稳定剂，所述稳定剂选自聚山梨酯80、L-精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及其组合。这种组合物的使用将延长基因转移载体的保存期限，以便于施用，并提高本发明所述方法的效率。含基因转移载体的组合物的制剂进一步描述于例如Wright等人，Curr.Opin.Drug Discov.Devel.,6(2):174-178(2003)和Wright等人，Molecular Therapy,12:171-178(2005))中。

还可以将组合物配制成增强转导效率。另外，本领域普通技术人员应当理解，本发明所述基因转移载体可以与其他治疗性或生物活性试剂一起存在于组合物中。例如，控制炎症的因子如布洛芬或类固醇类可以是组合物的一部分，以减少与基因转移载体的体内施用有关的肿胀和炎症。免疫系统刺激剂或佐剂，例如白介素、脂多糖和双链RNA。可以存在抗生素，即杀微生物剂和杀真菌剂，以治疗现有感染和/或降低将来感染的风险，例如与基因转移步骤有关的感染。

通过在可生物降解的聚合物例如聚丙交酯-聚乙交酯中形成主题化合物的微胶囊基质来制得可注射的贮库形式。根据药物与聚合物的比例以及所用特定聚合物的性质，可以控制药物的释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还可以通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备可注射储库的制剂。

在某些实施方案中，本发明所述的制剂包含选自下组的生物相容性聚合物：聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物、聚乙烯基聚合物、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酐、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-己内酯)、多糖、蛋白质、聚透明质酸、聚氰基丙烯酸酯、及其搅拌物、混合物或共聚物。

组合物可以在允许受控或持续释放的装置中或在装置上施用，所述装置诸如海绵、生物相容性网状物、机械贮存器或机械植入物。植入物(参见例如美国专利号5,443,505)、装置(参见例如美国专利号4,863,457)，例如可植入装置如机械储存器或包含聚合物组合物的植入物或装置，对于本发明所述基因转移载体的施用特别有用。组合物也可以以持续释放制剂的形式进行施用(参见，例如，美国专利号5,378,475)，所述持续释放制剂包含，例如，凝胶泡沫、透明质酸、明胶、硫酸软骨素、聚磷酸酯例如对苯二甲酸二-2-羟乙基酯(BHET)，和/或聚乙醇酸。

施用给哺乳动物的组合物中基因转移载体的剂量将取决于许多因素，包括哺乳动物的大小(质量)、任何副作用的程度、特定的给药途径等。在一个实施方案中，本发明所述的方法包括施用“治疗有效量”的包含本文所述的本发明的基因转移载体的组合物。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效达到期望的治疗结果的量。治疗有效量可以根据各种因素而变化，例如，疾病或病症的程度，个体的年龄、性别和体重，以及基因转移载体在个体中引起期望的应答的能力等。达到特定治疗效果所需的组合物中基因转移载体的剂量通常以以下单位施用：每个细胞的载体基因组拷贝数(gc/细胞)或载体基因组拷贝数/每千克体重(gc/kg)。基于本领域众所周知的这些因素和其他因素，本领域普通技术人员可以容易地确定用于治疗患有特定疾病或病症的患者的适当的基因转移载体剂量范围。治疗有效量可以在1×10¹⁰个基因组拷贝至1×10¹³个基因组拷贝之间。

在一个实施方案中，向所述哺乳动物施用一次所述组合物。据信所述组合物的单次施用可以导致在哺乳动物中的持续表达，而副作用最小。然而，在某些情况下，在治疗期间多次施用所述组合物以确保细胞充分暴露于所述组合物可能是合适的。例如，在治疗期间，可向所述哺乳动物施用两次或多次(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次)所述组合物。

本公开提供了药学上可接受的组合物，所述组合物包含治疗有效量的基因转移载体，所述基因转移载体包含如上所述的核酸序列。

施用途径、剂量和剂型

根据本发明所述的基因递送载体的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况和熟练的从业者已知的其他因素。基因递送载体的施用可以在预定的时间段内基本上是连续的，或者可以是一系列间隔的剂量。可以考虑局部给药，例如颅内、鼻内或鞘内给药，以及全身性给药，例如使用能穿透血脑屏障的病毒。可以采用任何给药途径，例如，静脉内、鼻内或支气管内的方式直接向肺和胸膜内给药。在一个实施方案中，可将组合物递送至胸膜。

可以通过多种途径施用包含基因递送载体的一种或多种合适的单位剂型，所述单位剂型任选地被配制为用于持续释放，所述途径包括颅内、鞘内或鼻内，或用于递送至CNS的其他方式，或口服或胃肠外给药，包括通过直肠、颊、阴道和舌下、经皮、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、胸腔内或肺内途径。在适当的时候，制剂可以方便地以离散的单位剂型存在，并且可以通过药学上熟知的任何方法来制备。这样的方法可以包括以下步骤：将载体与液体运载体、固体基质、半固体载体、细分的固体运载体或其组合缔合，随后，如果需要，将产物引入或成形为所需的递送系统。

为获得特定结果而施用的基因递送载体的量将根据各种因素而变化，这些因素包括但不限于，所选的基因和启动子，病症，患者特异性参数如身高、体重和年龄，以及是预防还是治疗。

可以方便地以适合于施用例如至脑内的制剂形式提供本发明所述的载体。合适的施用方式最好由医生根据标准程序分别为每个患者确定。合适的药学上可接受的运载体及其制剂描述于标准制剂专著，例如Remington's Pharmaceuticals Sciences中。“药学上可接受的”是指与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害的运载体、稀释剂、赋形剂和/或盐。

本发明所述的载体可以在中性pH(例如约pH 6.5至约pH 8.5，或约pH 7至8)溶液中与赋形剂一起配制，以使溶液达到等渗，例如4.5％甘露醇或0.9％的氯化钠，并用公认的缓冲溶液(例如磷酸钠)缓冲pH，该缓冲液通常被认为是安全的，并与公认的防腐剂一起使用，例如0.1％至0.75％，或0.15％至0.4％的间甲酚。可以使用氯化钠或其他药学上可接受的试剂，例如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇、多元醇(例如甘露醇和山梨糖醇)、或其他无机或有机溶质来获得所需的等渗性。氯化钠可用于含有钠离子的缓冲液。如果需要，也可以制备上述组合物的溶液以延长保存期限和稳定性。本发明所述的治疗上有用的组合物可以通过按照通常认可的程序混合成分来制得。例如，可以将所选择的组分混合以产生浓缩的混合物，然后可以通过添加水和/或缓冲剂来控制pH或添加另外的溶质来控制张力，从而调节至最终浓度和粘度。

载体可以以剂型提供，所述剂型包含一定量的在一个或多个剂量中有效的载体。对于病毒载体，有效剂量可以是在至少约10⁷个病毒颗粒的范围内，例如约10⁹个病毒颗粒或约10¹¹个病毒颗粒。添加的病毒颗粒的数量可以高达10¹⁴。例如，当使用病毒表达载体时，可以以核酸或包装的病毒体的形式施用约10⁸至约10⁶⁰gc的病毒载体。在一些实施方案中，可以以核酸或包装的病毒体的形式施用，例如，每0.5至10mL中约10⁹至约10¹⁵个拷贝的病毒载体。或者，可以以至少约0.0001mg/kg至约1mg/kg、至少约0.001mg/kg至约0.5mg/kg、至少约0.01mg/kg至约0.25mg/kg或至少约0.01mg/kg至约0.25mg/kg体重的剂量施用核酸或载体，但是其它剂量也可以提供有益的结果。施用的量将根据各种因素而变化，包括但不限于，所选的用于施用的核酸或载体、疾病、体重、身体状况、健康情况和/或哺乳动物的年龄。临床医生可以采用动物模型或本领域可用的其他测试系统来容易地确定这些因素。如上所述，虽然待施用的确切剂量由主治医生确定，但是可以置于1mL磷酸盐缓冲盐水中。对于递送单独的质粒DNA或与其他大分子复合的质粒DNA，待施用的DNA的量应是对受体产生有益作用的量。例如，可以以单独或分开的剂量形式，例如0.001至0.5mg，或0.01至0.1mg施用0.0001至1mg或更多(例如高达1g)的DNA。

例如，当使用病毒表达载体时，可以以核酸或包装的病毒体的形式施用约10⁸至约10⁶⁰gc的病毒载体。在一些实施方案中，可以以核酸或包装的病毒体的形式施用例如，每0.5至10mL的约10⁹至约10¹⁵个病毒载体拷贝。或者，可以以至少约0.0001mg/kg至约1mg/kg，至少约0.001mg/kg至约0.5mg/kg，至少约0.01mg/kg至约0.25mg/kg或至少约0.01mg/kg至约0.25mg/kg体重的剂量施用核酸或载体，但是其它剂量也可以提供有益的结果。

在一个实施方案中，施用可以通过颅内、肝内、气管内或支气管内注射或使用合适的导管或针头的输注来进行。如本领域中已知的，可以使用多种导管来实现递送。例如，可从商业供应商处获得适用于本发明的各种通用导管以及改进的导管。另外，如本领域所知，在通过直接注射到脑或肺的特定区域而实现递送的情况下，可以使用多种方法将导管引入该区域。

举例来说，脂质体和其他含脂质的基因递送复合物可用于递送一种或多种转基因。此类用于基因递送的复合物的制备和用途的原理已经在本领域中进行了描述(参见，例如，Ledley,(1995)；Miller等人，(1995)；Chonn等人，(1995)；Schofield等人，(1995)；Brigham等人，(1993))。

包含基因递送载体的药物制剂可以通过本领域已知的方法使用熟知的和容易获得的成分来制得。例如，试剂可以与常见的赋形剂、稀释剂或运载体一起配制，并制成片剂、胶囊剂、混悬剂、粉剂等。本发明所述的载体还可以被配制成适于肠胃外(例如通过肌内、皮下或静脉内途径)给药的酏剂或溶液。

载体的药物制剂也可以采用水溶液或无水溶液的形式，例如冻干制剂、或分散液、或者乳液或悬浮液的形式。

在一个实施方案中，可以将载体配制成用于施用的形式，例如通过注射进行，例如推注或通过导管连续输注，并且可以以单位剂型形式存在于安瓿、预填充注射器、小容量输注容器或在添加了防腐剂的多剂量容器中。活性成分可以采取诸如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以包含配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，通过无菌分离无菌固体或通过从溶液中冻干获得，用于在使用前用合适的媒介物例如无菌、无热原的水进行配制。

这些制剂可以包含现有技术中众所周知的药学上可接受的媒介物和佐剂。例如，可以使用从生理学角度可接受的一种或多种有机溶剂来制备溶液。

为了通过吸入的方式施用于上(鼻)或下呼吸道，载体可方便地从吹入器、喷雾器或加压包装或其他递送气雾剂的便利方式递送。加压包装可包含合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送一定计量的量来确定。

或者，对于通过吸入或吹入的施用，组合物可以采用干燥粉末的形式，例如治疗剂和适当的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以以单位剂型的形式存在于例如胶囊或药筒中，或者在例如明胶或泡状包装中，可以借助吸入器、吹入器或定量吸入器从其中施用粉末。

对于鼻内给药，可以通过滴鼻剂、液体喷雾剂例如通过塑料瓶雾化器或定量吸入器来施用载体。雾化器的典型代表是Mistometer(Wintrop)和Medihaler(Riker)。

载体的局部递送也可以通过多种技术进行，所述技术例如使用导管或针头在疾病部位或附近施用载体。位点特异性的或靶向的局部递送技术的实例并非旨在进行限制，而是用以说明可用的技术。实例包括局部递送导管，例如输注或留置导管如针头输注导管、分流器和支架、或其他可植入装置、位点特异性的运载体、直接注射或直接应用。

本文所述的制剂和组合物还可包含其他成分，例如抗微生物剂或防腐剂。

受试者

受试者可以是任何动物，包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖动物和爬行动物，但是优选哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛和马。受试者还可以是牲畜，例如牛、猪、绵羊、家禽和马，或宠物，例如狗和猫。

受试者包括患有或具有氧化损伤风险的人受试者。受试者通常由熟练的技术人员例如执业医生诊断为患有本发明所述的病症。

本文描述的方法可以用于任何物种、性别、年龄、种族人群或基因型的受试者。因此，术语受试者包括男性和女性，并且其包括老年人、从老年人到成人的过渡年龄受试者、成人、从成人到预成人的过渡年龄受试者以及预成人(包括青少年、儿童和婴儿)。

人类种族人群的例子包括高加索人、亚洲人、西班牙裔、非洲人、非裔美国人、美洲原住民、闪米特人和太平洋岛民。本方法可能更适合某些种族人群，例如高加索人，尤其是北欧人口，以及亚洲人口。

如上所述，术语受试者还包括任何具有基因型或表型的受试者，只要他们需要本发明即可。另外，受试者可以具有任何发色、眼睛颜色、肤色或其任何组合的基因型或表型。

术语受试者包括具有任何身高、体重或任何器官或身体部位尺寸或形状的受试者。

通过以下非限制性实施例描述本发明。

实施例

通过以下实施例进一步举例说明本发明，其不应以任何方式解释为限制性的。所有引用的参考文献(包括本申请全文中引用的参考文献、授权专利、公开的专利申请)的内容在此明确地通过引用并入。

动物实验的设计旨在确保实验设计无偏见。实验动物将被随机分组，研究人员在评估动物行为时将不知情。男性和女性将被用来解决在转导、疾病表现或治疗反应方面可能存在的性别差异。对每个队列中的动物数量进行选择以产生具有统计学意义的数据。

概述

本公开的重点是开发具有防御细胞外抗氧化剂作用以保护肺而治疗疾病的疗法，疾病包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)，其是一种慢性疾病，在这种疾病中，从烟草烟雾、污染吸入的氧化剂以及在肺内由活化的炎性细胞产生的氧化剂在维持对该病发病机理来说至关重要的肺上皮和内皮损伤中起主要作用。该策略是使用体内基因治疗技术向肺部提供持久的细胞外抗氧化酶屏障，从而使超氧化物

和H₂O₂(肺部的主要细胞外氧化应激)失活。该策略包括使用过氧化氢酶和超氧化物歧化酶3(SOD3)的基因，这些基因已经经过了遗传修饰以分泌可在细胞外环境中扩散的功能性单体抗氧化酶，从而为肺部提供有效的细胞外抗氧化屏障。过氧化氢酶是一种四聚体的胞内酶，如果被设计为分泌型，则太大(232kDa)以至于不能扩散。为了将过氧化氢酶用作有效的细胞外抗氧化剂，对过氧化氢酶基因进行了修饰，以防止包裹环结构域介导四聚体的形成。在加入了分泌信号后，能分泌人过氧化氢酶单体(hCatWL-)，其能发挥作用将细胞外H₂O₂催化为H₂O。超氧化物歧化酶3(SOD3)被分泌出来，但是它是一个大的四聚体(130kDa)，并且具有一个肝素结合结构域，将其附着在细胞表面。为了将SOD3修饰成更有效的肺部细胞外抗氧化剂，针对对四聚体形成至关重要的环进行了修饰，并去除了肝素结合结构域(hSOD3hd-)，从而产生了一种不会与细胞表面结合的有效单体抗氧化剂酶(30kDa)。腺相关(AAV)基因转移载体被用作示例性基因转移载体，以遗传修饰肝脏从而表达和分泌修饰的过氧化氢酶和/或SOD3单体。将评估四个AAVrh.10候选物：AAVrh.10hCatWL-(表达过氧化氢酶单体)；AAVrh.10hSOD3hd-(SOD3单体)；AAVrh.10hCatWL-/hSOD3hd-(两种单体)；和AAVrh.10hSODhd-/hCatWL-(相同，但SOD3hd-处于5’位置)。在一个实施方案中，AAVrh.10载体在施用后产生了肺内皮和上皮表面的持久性细胞外抗氧化剂屏障。

目标1：比较在体外由4种AAVrh.10抗氧化剂载体(hCatWL-、hSOD3hd-、hCatWL-/hSOD3hd-和hSOD3hd-/hCatWL-)的表达盒介导的分泌型的、功能性的修饰的过氧化氢酶和/或SOD3的表达水平。

目标2：在体内定量4种AAVrh.10抗氧化剂载体表达能够保护肺内皮和上皮免于

和/或H₂O₂应激的分泌型的、功能性的修饰的过氧化氢酶和/或SOD3的能力。

实施例1

在一个实施方案中，本文公开的基因疗法的重点是用细胞外抗氧化剂防御来保护肺，以治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)，其是一种慢性疾病，在这种疾病中，从烟草烟雾、污染吸入的氧化剂以及在肺内由活化的炎性细胞产生的氧化剂在促发和维持对该病发病机理来说至关重要的肺上皮和内皮损伤中起主要作用(Lin&Thomas,2010；McGuinness等人，2017；Hubbard&Crystal,1986；MacNee,2000；Shapiro&Ingenito,2005；Yoshida等人，2007；Elmasry等人，2015)。肺部的大部分氧化应激是细胞外的，压制了上皮和内皮细胞的细胞内抗氧化防御，导致细胞损伤、功能障碍和最终死亡(Shaykhiev等人，2014；Gao等人，2015；Polverino等人，2018)。当前的策略是使用体内基因治疗技术向肺部提供持久的细胞外抗氧化酶屏障，从而使超氧化物

和H₂O₂(肺部细胞外氧化应激的两个主要成分)失活。

过氧化氢酶和超氧化物歧化酶3(SOD3)的编码序列已经经过了基因修饰，可以以功能性单体的形式分泌，并可以在细胞外环境中扩散，从而为肺部提供了有效的细胞外抗氧化剂屏障。过氧化氢酶是一种大(232kDa)的四聚体酶，其与血红素基团结合，而NADPH是一种高效的细胞内酶，但是太大了而无法有效扩散到细胞外环境中，即使被设计成可以分泌出来的也是如此(Reynolds等人，1977；Rennard等人，1986；Goyal&Basak,2010；Sepasi等人，2018；Bell等人，1981)。为了将过氧化氢酶用作有效的细胞外抗氧化剂，修饰了过氧化氢酶基因以防止包裹环结构域介导四聚体的形成(Goyal&Basak,2010；Ko等人，2000；Safo等人，2001)。通过添加分泌信号，人过氧化氢酶单体(hCatWL^-)被分泌出来，能够将细胞外H₂O₂催化成H₂O。

存在3种超氧化物歧化酶基因，SOD1、2和3(Fukai&Ushio-Fukai,2011；Perry等人，2010)。SOD1在细胞质中起作用，SOD2在线粒体中起作用。SOD3是分泌型的，但是是一个大的四聚体(130kDa)，并具有能将其附着到细胞表面的肝素结合结构域(Fukai&Ushio-Fukai,2011；Antonyuk等人，2009；Griess等人，2017)。为了将SOD3修饰成更有效的肺部细胞外抗氧化剂，针对对四聚体形成至关重要的环进行了修饰，并除去了肝素结合结构域(hSOD3hd-)，以产生了一种功能性的、分泌型的单体抗氧化剂，它不会与细胞表面结合。在一个实施方案中，将腺相关(AAV)基因转移载体用于遗传修饰肝脏，以表达和分泌修饰的过氧化氢酶和/或SOD3单体，每个单体具有能够在肺中扩散的分子量(Reynolds等人，1977；Bell等人，1981)，其结果是对整个肺部进行了细胞外抗氧化保护。在一个实施方案中，基因治疗策略使用sAAVrh.10，其是一种非人灵长类动物腺相关病毒(AAV)基因转移载体，当静脉内施用时，其有效地转导肝细胞以表达抗氧化剂基因。评估了四个AAVrh.10候选物：AAVrh.10hCatWL-(仅表达过氧化氢酶单体)；AAVrh.10hSOD3hd-(SOD3单体)；AAVrh.10hCatWL-/hSOD3hd-(均为抗氧化剂单体)；和AAVrh.10hSODhd-/hCatWL-(相同，但SOD3hd-处于5’位置)。

氧化剂是易于接受来自其他分子的电子的分子，从而导致功能障碍和最终的细胞/器官损伤(Davies等人，2001；Devasagayam等人，2002；O'Reilly等人，2001；Janssen等人，1993)。在正常情况下，抗氧化剂可以抵抗氧化应激(Pham-Huy等人，2008；Irshad等人，2002)。当氧化负担超过抗氧化剂的防御能力时，所产生的氧化应激在器官功能障碍的发病机理中起关键作用(Casas等人，2015；Pham-Huy等人，2008；Irshad等人，2002)。肺对吸入的细胞外氧化剂(烟草烟雾、污染物、外源性化学物、高浓度氧)和内源性氧化剂(活化的炎性细胞)高度脆弱，但是肺部的抗氧化防御则主要在细胞内(Rhaman等人，2006；Sies等人，2017)。

在COPD中，肺上皮和内皮受到来自活化的炎性细胞(肺泡巨噬细胞和嗜中性粒细胞)的额外氧化应激，所述活化的炎性细胞产生的细胞外氧化剂压制细胞内的氧化剂防御能力(图1A)。肺部主要的抗氧化防御酶为超氧化物歧化酶(SOD；将

催化为H₂O₂；有3种形式：胞质的SOD1，线粒体的SOD2，细胞外的SOD3)、过氧化氢酶(在胞质中，将H₂O₂催化为H₂O)、以及谷胱甘肽系统将H₂O₂转化为水(GSH既是胞质的，又是胞外的；需要多种胞质酶来保持GSH处于还原状态；图1B)(Rahman et al.,2006；Sies et al.,2017)。虽然肺细胞具有氧化剂传感器，例如NRF2和NF-kB/IkB，但人肺细胞不能上调主要的抗氧化酶即过氧化氢酶和SOD。Crystal实验室进行的一项研究充分证明了这一点，在该研究中，对正常的人志愿者进行了支气管镜检查以采样气道上皮来定量基线的过氧化氢酶和SOD mRNA水平，然后将其暴露于100％O₂中12-18小时(足以引起气管支气管炎)，对上皮进行重新采样(Erzurum等人，1985)。令人惊讶的是，过氧化氢酶和SOD mRNA的水平都没有被上调，即，虽然有强烈的细胞外氧化应激，但人气道上皮上调抗氧化剂屏障的机制是有限的。一种解决方案是提供有效的细胞外“抗氧化剂铁氟龙涂层”，以保护肺免于细胞外氧化剂的应激。腺相关病毒(AAV)基因转移载体用于表达分泌形式的单独的过氧化氢酶、单独的SOD3或过氧化氢酶+SOD3，以产生有效的抗氧化剂屏障。问题在于过氧化氢酶是一种大的细胞内四聚体，而SOD3是一种结合到细胞表面的大四聚体；在其天然形式下，两者都不能提供有效的扩散性细胞外抗氧化剂防御。解决方案是修饰过氧化氢酶和SOD3的编码序列，以生成功能性单体，这些单体可以有效地用作基于基因治疗的抗氧化剂，能够通过肺扩散，从而保护易被氧化剂破坏的内皮和上皮(Reynolds等人，1977；Bell等人，1981)。在一个实施方案中，通过静脉内施用编码修饰的过氧化氢酶和/或SOD3单体的AAV载体，肝脏的肝细胞将分泌功能性抗氧化剂单体到血液中，从而能够对肺内皮(从血液侧)进行抗氧化保护，并能让低分子量(50-60kDa)扩散到内皮和上皮紧密连接处，为间质组织和上皮提供有效的抗氧化屏障(对于分子量为50-60kDa的蛋白质，人肺上皮内衬液(human lung epithelial lining fluid)水平是血液中的水平的10％。)

一个过氧化氢酶分子每秒可以将数百万个H₂O₂分子转化为H₂O(Goyal&Basak,2010；Chance,1947)。过氧化氢酶是一种细胞内酶，由4个单体(每个501个氨基酸)+4个含铁的4血红素基团+4个NAPDH分子组成。过氧化氢酶在所有器官中都有表达。增强肺部细胞外抗氧化剂保护能力的基因治疗策略面临的挑战是过氧化氢酶太大(232kDa)，以至于无法分泌和扩散，而无法提供有效的细胞外抗氧化剂屏障。LEX解决方案是对过氧化氢酶基因序列进行遗传修饰，使其不能形成四聚体，并且可以以发挥有效的细胞外抗氧化剂作用的单体形式被分泌出来。每个过氧化氢酶单体都具有对于将单体单元结合在一起的互锁臂交换非常重要的氨基末端残基，以及一个包裹环结构域——4种单体彼此包裹形成四聚体，其中盐桥和离子相互作用将这4种单体结合在一起。候选基因的修饰包括：(1)所有构建体均具有N端分泌序列(来自人IgG1)；(2)修饰过氧化氢酶序列的N-末端区域，以删除稳定四聚体结构的结构域；(3)删除了形成单体之间结合界面的包裹环结构域(图2)。

SOD将

转化为H₂O₂。SOD3(活性位点铜+锌)是一种分泌型的同型四聚体(约130kDa)，具有氨基端信号肽和由一群带正电荷的残基组成的肝素结合结构域的C端。尽管是分泌型的，但肝素结合结构域将SOD3锚定在细胞表面以及基质硫酸肝素蛋白聚糖和胶原蛋白上(Sandstom,1993；Olsen等人，2004)(N端附近有小片段裂解，产生循环的四聚体)。为了最大程度地提高SOD3作为肺中基因治疗剂的有效性，进行了修饰以取代使单体结合形成四聚体的环，并删除了肝素结合结构域的一段，以允许SOD3单体在组织中自由扩散。由于SOD3具有信号肽，因此保持其完整(图3)。

COPD是美国第三大最常见的死亡原因。除氧气外，没有其他药物可以降低COPD相关的死亡率(Benton等人，2018；Woodruff等人，2015)。COPD中使用的药物(支气管扩张药，皮质类固醇)有助于缓解症状，长期使用抗生素可降低病情加重的频率(Benton等人，2018；Woodruff等人，2015)。有大量数据支持这一概念，即细胞外氧化剂的应激在COPD的发病机理中起着重要作用(Shaykiev等人，2014；Gao等人，2015；Polverino等人，2010；Rahman,2015)。已经有数项临床研究评估了用于COPD治疗的抗氧化剂(在Rahman,2008；Rahman,2012中综述)。这些试验都没有成功。LEX策略是一种新方法，它使用基因治疗技术来提高细胞外环境中有效的抗氧化酶的水平，从而保护上皮细胞和内皮细胞免于氧化应激。基于氧化剂在COPD发病机理中的重要性，如果前述方法成功，则基于基因疗法的细胞外抗氧化剂筛选的建立应具有重要意义(作为一种治疗这种常见的致命性疾病的方法)(Foronjy等人，2008；Rahman等人，2006)。

图4显示了示例性的用于治疗COPD的基于基因疗法的细胞外可扩散酶促抗氧化剂。根据迄今为止的研究，LEX 5包含AAV血清型rh.10衣壳，具有4个候选表达盒中的1个(图4)。除了编码抗氧化酶的cDNA不一样外，这4个候选基因转移载体是相同的。每个都包含具有以下组分(5’至3’)的表达盒：(1)AAV血清型2的AAV反向末端重复序列(ITR)；(2)CAG-巨细胞病毒增强子/启动子、剪接供体、鸡β-肌动蛋白的内含子序列、兔β-珠蛋白的右手内含子和剪接受体；CAG是一种高度活跃的组成型启动子，广泛用于基因治疗应用中(Miyazaki等人，1989；Niwa等人，1991)；(3)过氧化氢酶单体(LEX 5a,hCatWD-)、SOD3单体(LEX 5b,hSOD3hd-)的编码序列、hCatWD-+hSOD3hd-的组合编码序列(5’至3’)(由弗林蛋白酶2A(furin2A)分开，LEX 5c)、和hSOD3hd-+hCatWD-的组合编码序列(5’至3’)(由弗林蛋白酶2A分开，LEX 5d，与LEX 5c相同，但过氧化氢酶和SOD3序列的顺序相反)；(4)血凝素标签(便于检测蛋白质)；(5)polyA/停止信号；和(6)3'AAV2ITR。表达盒将全部包装在AAVrh.10血清型衣壳中，这是一种非人灵长类动物AAV衣壳，非常适合转导肝脏以表达分泌型蛋白质。在体外评估4个候选表达盒的功能，并使用每种载体的等效静脉内剂量对4个候选AAV载体在小鼠中进行头对头比较，评估肝脏和肺中载体DNA和人过氧化氢酶和/或SOD3 mRNA的含量，以及过氧化氢酶单体蛋白的量以及血浆(用于肺内皮保护)和肺上皮内衬液(lining fluid)(用于肺上皮保护)中的活性。使用3c中详述的定量标准，可以从4个候选载体中选择一个载体。

在全球范围内，COPD影响了3.29亿人(占世界人口的4.8％(Vos等人，2012))，每年在世界范围内造成超过300万人死亡。在美国，COPD是第三大死亡原因，估计每年导致15万人死亡。所述载体可能仅需单次静脉输注就可以终身治疗这种慢性的致命性疾病。本发明所述的策略不是使用基因疗法来表达编码主要增强细胞内抗氧化剂(过氧化氢酶)或保持附着在细胞膜上(SOD3)的抗氧化剂酶的天然基因，而是使用基因疗法来产生有效的细胞外酶性抗氧化剂“屏障”，为所有肺细胞，包括高度脆弱的内皮和上皮细胞提供细胞外抗氧化剂保护。

产生有效的肺部细胞外防御的解决方案是修饰天然的人过氧化氢酶和SOD3的编码序列，以便它们可以生成具有50-60kDa分子量的功能性单体，当通过AAV介导的向肝脏进行基因转移以被表达时，该单体能增强血液的抗氧化防御能力(保护肺内皮)并扩散到整个肺部，并增强肺上皮内衬液的抗氧化防御能力(保护上皮)。总而言之，这些创新包括：(1)人过氧化氢酶和SOD3基因的分子改造，以引导这些高效的抗氧化剂为肺内皮和上皮形成细胞外抗氧化剂屏障，从而防止细胞外氧化应激损害肺细胞；(2)在一个实施方案中，在一个基因转移构建体中使用遗传修饰的过氧化氢酶和SOD3基因的组合，利用了这些抗氧化剂有效去除

和H₂O₂的能力，从而提供了有效的细胞外抗氧化剂屏障来抵御吸入性氧化剂以及由活化的炎性细胞产生的细胞外氧化剂。分开的过氧化氢酶和SOD载体可以一起施用。

根据数据，已经鉴定出了4个候选载体，它们全部基于AAV非人血清型rh.10(图4)：(1)LEX 5a–AAVrh.10hCatWD-(分泌型过氧化氢酶单体)；(2)LEX 5b–AAVrh.10hSOD3hd-(分泌型SOD3单体，具有缺失的肝素结合域)；(3)LEX 5c–AAVrh.10hCatWD-/SOD3hd-(表达分泌型过氧化氢酶单体和分泌型SOD3单体的单一载体)；(4)LEX 5d–AAVrh.10hSOD3hd-/hCatWD-(与LEX 5c相同，但SOD3构建体位于过氧化氢酶构建物前面)。鉴定LEX 5的实验方法是使用体外和体内测定法。

对人过氧化氢酶编码序列的修饰产生了LEX 5a的表达盒，从而产生了AAVrh.10hCatWD-(LEX 5a)，并且证明了将LEX 5a静脉内施用于小鼠时，其结果是血清中有功能性的人过氧化氢酶活性。同样，对人SOD3编码序列的修饰产生了LEX 5b小鼠表达盒，其结果是血清中有功能性SOD活性。已经产生了AAVrh.10hCatWD-/hSOD3hd-和AAVrh.10hSOD3hd-/hCatWD-载体，并且它们正在进行体外和体内测试。

评估了人过氧化氢酶序列的三种修饰：hCatNT-，hCatWL-和hCatNT-WL-。将这些质粒转染到无血清培养基中的293T细胞中后，对培养上清液的评估表明，所有3种都是分泌型的(图5A)。然而，在3种构建体中，仅包裹环结构域缺失(hCatWD-)的保留了过氧化氢酶活性(图5B)。Bis-Tris凝胶分析表明hCAThd-以单体形式进行分泌(图5C)。基于此数据，创建了AAVrh.10hCatWD-(LEX 5a)。对小鼠的静脉内给药导致在肝和肺中检测到了hCatWD-DNA(特别是对于AAVrh.10载体)(Chiuchiolo等人，2013)，重要的是，血清中易于检测到人过氧化氢酶活性，例如LEX 5a产生了分泌型的功能性过氧化氢酶单体(图7A-C)。

在单个SOD3变体(hSOD3hd-)中进行了两个修饰，包括删除残基50-59，替换为74-80残基区段的框内拷贝，以及删除残基212-240，其是肝素结合域。将该质粒转染到293T细胞中后，对培养物上清液的定量表明，hSOD3hd-变体在上清液中很容易被检测到(图6A)，并且是单体(图6B)。根据此数据，生成了AAVrh.10hSOD3hd-(LEX 5b)(图4)。向Balb/c小鼠的静脉内给药导致肝和肺中有载体DNA(肝脏高50倍)以及血清中有SOD活性(图7D-F)。LEX5c，LEX 5d。基于LEX 5a和LEX5b的体内和体外功能数据，生成了LEX 5c和LEX 5d，以表达过氧化氢酶和SOD3修饰的单体。在1个AAV构建体中表达2个基因的基础上(De等人，2008；Wang等人，2010；Watanabe等人，2010；Mao等人，2011；Rosenberg等人，2012；Hicks等人，2012；Xie等人，2014；Hicks等人，2015；Pagovich等人，2016；Liu等人，2016)，LEX 5a和LEX 5b都使用单个启动子，2个修饰的cDNA用弗林蛋白酶2A切割位点分开，所述弗林蛋白酶2A切割位点指导切割所得的前体蛋白以产生2种功能蛋白。测试了两种构建体：LEX 5c(其中hCatWD-序列在hSOD3hd-序列之前)，以及LEX 5d(其中两个cDNA编码序列被翻转)。两者都将进行体外和体内功能测试。

实验设计。研究重点是在体外和体内比较LEX 5a、LEX 5b、LEX 5c和LEX 5d。以下标准用于对相同载体剂量的候选药物进行排名：(1)体外–分泌的抗

H₂O₂氧化应激的功能性抗氧化剂的水平；(2)体内–血清和肺上皮内衬液中功能性抗氧化剂的持续含量。

表I.4个候选表达质粒的体外比较

¹用PEI将质粒(4μg)转染到无血清培养基中的293T细胞中。72小时后，收集培养基并进行评估。“对照”——没有转基因的质粒。所有研究均一式四份进行，每个质粒一式四份进行评估。²通过ELISA检测人过氧化氢酶和SOD3的水平；通过比色测定法(Thermo Fisher)测过氧化氢酶活性，通过比色测定法(Abcam)测SOD3活性；H₂O₂和

攻击人肺微血管内皮和人气道上皮。³每个测定的排名从1(最差，无效应)到5(最佳，对4个试验取平均值)。排名的总得分从6(最差)到30(最佳)不等。

在体外比较由4种AAVrh.10抗氧化剂载体(hCatWL-、hSOD3hd-、hCatWL-/hSOD3hd-和hSOD3hd-/hCatWL-)的表达盒介导的分泌型的、功能性修饰的过氧化氢酶和/或SOD3的表达水平。数据表明，hCatWD-(LEX 5a的表达盒)和hSOD3hd-(LEX 5b的表达盒)均能产生单体，并且在体外和体内均起作用以分别产生过氧化氢酶和SOD。目标1的目的是通过将质粒(hCatWD-、hSOD2hd-、hCatWD-/hSOD3hd-和hSOD3hd-/hCatWD-)转染到无血清培养基中的293T细胞中，以剂量的函数形式来对4个表达盒进行比较测试。72小时后，测试所得上清液的：(1)过氧化氢酶和SOD水平；(2)过氧化氢酶和SOD活性；(3)上清液保护人微血管内皮和人气道上皮免于氧化应激(

和H₂O₂)的能力。4种质粒的体外评估将按表II中详细描述进行排名。

表II.4个候选表达载体的体内比较

¹ ¹对照——与其他载体相同，但无转基因；n＝5男性和n＝5女性/组/时间点。²静脉内施用。³类似于表I，脚注²，以血清或肺上皮内衬液(ELF)的量的函数代替了上清液。⁴在第0、2、4和12周评估肝、肺、血清和ELF。⁴如统计学中所述，总排名是体外评估和体内评估的组合，体内排名的相当于体外排名的2倍。

在体内量化4种AAVrh.10抗氧化剂载体表达能够保护肺内皮和上皮免受

和H₂O₂应激的分泌型的、功能性的修饰的过氧化氢酶和/或SOD3的能力。目的是在体内比较LEX5a、b、c和d载体。根据之前的AAVrh.10载体中双表达盒的经验(De等人，2008；Wang等人，2010；Watanabe等人，2010；Mao等人，2011；Rosenberg等人，2012；Hicks等人，2012；Xie等人，2014；Hicks等人，2015；Pagovich等人，2016；Liu等人，2016)，由于LEX 5a和LEX 5b是具有功能性的，所以LEX 5c与LEX 5d的设计没理由没有功能性，尽管过氧化氢酶与SOD3在LEX5c与LEX 5d的表达盒中的相对表达可能存在差异。为了比较这4种载体，在Balb/c雄性和雌性小鼠中比较了相同剂量(10⁹、10¹⁰和10¹¹基因组拷贝)的静脉内施用。在第0周、第2周，1个月和3个月时，将评估以下参数：(1)肝和肺的载体DNA；(2)肝和肺的表达盒mRNA；(3)血清和肺上皮内衬液(ELF)中的过氧化氢酶和SOD水平及活性；(4)测试处理过的小鼠的血清在体外保护人微血管内皮免于

和H₂O₂的应激的作用，并测试ELF保护人气道上皮免于相同的氧化应激的作用。3个月这个时间点会是最后的时间点，这是基于根据广泛的数据，即如果AAVrh.10介导的分泌蛋白的表达在3个月时保持稳定，则它们将在动物的整个生命中保持稳定(Chiuchiolo等人，2013；De等人，2008；De等人，2006)。选择Balb/c小鼠是基于该品系在体内可耐受人蛋白质的表达，而不会产生针对人蛋白质的免疫力(Rosenberg等人，2012)。如果存在任何免疫问题(通过表达缺失而注意到)，那我们会将小鼠品系切换为C57Bl/6，它也可以耐受通过AAV载体表达的人细胞基因(De等人，2006)。体内评估按表II中详细描述进行排名。将体外和体内排名组合起来以获得总体排名。

通过6种功效测定法对质粒表达盒进行排名；目标2中使用了相同的测定方法来评估血清和肺ELF。

过氧化氢酶水平。ELISA(Abcam)。

SOD3水平。ELISA(Biocompare)。

过氧化氢酶活性。比色测定法(Thermo Fischer)。

SOD3活性。比色测定法(Abcam)。

用

和H2O2攻击内皮。人微血管内皮细胞(Lonza)会受到超氧化物(化学上使用Fenton反应)或H₂O₂的攻击。在24和48小时时，细胞死亡(上清液中乳酸脱氢酶水平)，氧化应答(对氧化应激基因的mRNA水平进行定量PCR)。为了进行保护，会用质粒上清液、血清或ELF预处理细胞。

用

和H2O2攻击上皮。该测定与内皮的测定相同，但是用人气道上皮代替了内皮。人上皮将在28天后通过气-液界面培养物从IV型胶原上的人正常基底细胞中衍生出来。

AAVrh.10载体的产生。载体通过将表达质粒与携带AAV2 Rep基因、蛋白质VP1、2和3的AAVrh.10Cap基因(其定义了rh.10AAV载体的血清型)以及E2、E4和VA RNA的腺病毒辅助功能(Collaco等人1999；Hicks等人，2016)的质粒共转染到人胚胎肾293T细胞(HEK 293T；ATCC)中而产生。通过碘克沙醇梯度和QHP阴离子交换色谱法纯化载体。载体基因组滴度将通过TaqMan实时定量PCR分析确定(Mayginnes等人，2006)。

动物模型。将载体以3剂(10⁹、10¹⁰、10¹¹)的剂量分别静脉注射到Balb/c小鼠的尾静脉。在每个数据点以n＝5只雄性和5只雌性小鼠进行了所有研究。通过纤维支气管镜检查和灌洗获得的肺ELF是用于回收ELF的盐水和实际ELF的混合物。使用尿素法(Rennard等人，1985)定量回收得到的ELF的体积，并且过氧化氢酶或SOD3的水平以μM/ELF体积表示。在0(治疗前)、2、4、12周时评估通过尾静脉出血得到的血清和肺ELF。处死时，从小鼠中收集肝和肺，用于分析载体基因组和基因表达，并转移肝和肺至标记的干净的15ml锥形管中，每100mg组织用1ml RNAlater(Qiagen)进行DNA/mRNA分离，并保存在4℃下过夜。将样品在4℃下匀浆10-20分钟，随后使用针对转基因的引物探针组通过实时PCR将1个样品用于每个DNA和mRNA分析。

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所有出版物，专利和专利申请均通过引用并入本文。尽管在前述说明书中，已经就本发明的某些优选实施例描述了本发明，并且出于说明的目的已经阐述了许多细节，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明容许有其他实施例，并且在不脱离本发明的基本原理的情况下，本文所述的某些细节可以有相当大的变化。

Claims

1.一种基因治疗载体，所述基因治疗载体包含表达盒，所述表达盒包含编码修饰的过氧化氢酶的核酸序列，所述修饰的过氧化氢酶具有过氧化氢酶活性但不形成四聚体。

2.根据权利要求1所述的基因治疗载体，所述基因治疗载体还包含编码修饰的超氧化物歧化酶的核酸序列，所述修饰的超氧化物歧化酶是分泌型的但不结合细胞表面。

3.一种基因治疗载体，所述基因治疗载体包含表达盒，所述表达盒包含编码修饰的超氧化物歧化酶的核酸序列，所述修饰的超氧化物歧化酶是分泌型的但不结合细胞表面或不形成四聚体。

4.根据权利要求2或3所述的基因治疗载体，其中所述修饰的超氧化物歧化酶为修饰的超氧化物歧化酶-3。

5.根据权利要求2、3或4所述的基因治疗载体，其中所述修饰的超氧化物歧化酶不与肝素结合。

6.根据权利要求3或4所述的基因治疗载体，其还包含编码修饰的过氧化氢酶的核酸序列，所述修饰的过氧化氢酶具有过氧化氢酶活性但不形成四聚体。

7.权利要求1-2或5中任一项所述的基因治疗载体，其中所述修饰的过氧化氢酶在穿线臂结构域的N末端具有缺失，所述缺失可以是1至80或1和80之间的任意整数。

8.根据权利要求1-2、5或7中任一项所述的基因治疗载体，其中所述修饰的过氧化氢酶在包裹环结构域中具有缺失，所述缺失可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个残基。

9.根据权利要求1-2、5、7或8中任一项所述的基因治疗载体，其中所述修饰的过氧化氢酶在所述穿线臂结构域和所述包裹环结构域中具有缺失。

10.根据权利要求1-2、5或7-9中任一项所述的基因治疗载体，其中所述修饰的过氧化氢酶具有分泌型的序列。

11.根据权利要求2-10中任一项所述的基因治疗载体，其中所述修饰的超氧化物歧化酶在肝素结合结构域中具有缺失，所述缺失可以是1至15或20或25或更多个残基。

12.根据权利要求2至11中任一项所述的基因治疗载体，其中所述修饰的超氧化物歧化酶具有转角结构域或环结构域的一个或多个残基的取代。

13.根据权利要求2至12中任一项所述的基因治疗载体，其中所述修饰的超氧化物歧化酶具有转角结构域或环结构域的一个或多个残基的缺失和插入。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的基因治疗载体，所述基因治疗载体为病毒载体。

15.根据权利要求14所述的基因治疗载体，所述基因治疗载体为腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒或慢病毒载体。

16.根据权利要求15所述的基因治疗载体，其中所述AAV载体是假型的。

17.根据权利要求16所述的基因治疗载体，其中所述AAV载体用AAVrh.10、AAV8、AAV9、AAV5、AAVhu.37、AAVhu.20、AAVhu.43、AAVhu.8、AAVhu.2或AAV7衣壳进行假型化。

18.根据权利要求16所述的基因治疗载体，其中所述AAV载体用AAVrh.10、AAV8或AAV5进行假型化。

19.根据权利要求15所述的基因治疗载体，其中所述AAV载体为AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh.10。

20.根据权利要求2-19中任一项所述的基因治疗载体，其中一个载体包含表达盒，所述表达盒包含编码所述修饰的过氧化氢酶和所述修饰的超氧化物歧化酶的核酸序列，所述过氧化氢酶序列和超氧化物歧化酶序列被蛋白酶底物序列分开。

21.根据权利要求20所述的基因治疗载体，其中所述修饰的过氧化氢酶在所述修饰的超氧化物歧化酶的N-末端。

22.根据权利要求20所述的基因治疗载体，其中所述修饰的过氧化氢酶在所述修饰的超氧化物歧化酶的C-末端。

23.根据权利要求2-19中任一项所述的基因治疗载体，其中一个载体包含具有编码所述修饰的过氧化氢酶的核酸序列的表达盒，且另一个载体包含具有编码所述修饰的超氧化物歧化酶的核酸序列的表达盒。

24.一种药物组合物，所述药物组合物包含一定量的根据权利要求1-23中任一项所述的载体。

25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述载体是质粒。

26.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述载体是病毒载体。

27.根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述载体为腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒或慢病毒载体。

28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述载体是AAV载体。

29.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述AAV载体是假型的。

30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述AAV载体用AAVrh.10、AAV8、AAV9、AAV5、AAVhu.37、AAVhu.20、AAVhu.43、AAVhu.8、AAVhu.2或AAV7衣壳进行假型化。

31.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述AAV载体为AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh.10。

32.根据权利要求26-31中任一项所述的药物组合物，其中所述载体的量为约1x 10¹¹至约1x 10¹⁶个基因组拷贝。

33.根据权利要求26-32中任一项所述的药物组合物，其中所述载体的量为约1x 10¹²至约1x 10¹⁵个基因组拷贝、约1x 10¹¹至约1x 10¹³个基因组拷贝或约1x 10¹³至约1x 10¹⁵个基因组拷贝。

34.根据权利要求24-33中任一项所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的运载体。

35.根据权利要求26至33中任一项所述的药物组合物，其包含编码所述修饰的过氧化氢酶的病毒载体和编码所述修饰的超氧化物歧化酶的另一个病毒载体。

36.一种预防、抑制或治疗哺乳动物中的氧化损伤的方法，所述方法包括：向所述哺乳动物施用有效量的根据权利要求1-23中任一项所述的载体或根据权利要求24-35中任一项所述的药物组合物。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述哺乳动物患有或具有患有以下疾病的风险：动脉粥样硬化、癌症、糖尿病、类风湿性关节炎、局部缺血后灌注损伤、心肌梗塞、心血管疾病、慢性炎症、中风、败血性休克或其他退化性和神经性疾病如阿尔茨海默病或帕金森病。

38.一种预防、抑制或治疗哺乳动物中的COPD、呼吸窘迫综合征或纤维化间质性肺病的方法，所述方法包括：向有此需要的哺乳动物施用有效量的根据权利要求1-23中任一项所述的载体或根据权利要求24-35中任一项所述的药物组合物。

39.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

40.根据权利要求36-39中任一项所述的方法，其中施用一定量的编码所述修饰的过氧化氢酶的病毒载体和一定量的编码所述修饰的超氧化物歧化酶的病毒载体。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述病毒载体被依次施用。

42.根据权利要求40所述的方法，其中所述病毒载体被同时施用。

43.根据权利要求36-39中任一项所述的方法，其中施用编码所述修饰的过氧化氢酶和所述修饰的超氧化物歧化酶的病毒载体。