JP2022526398A - 標的化されたＩｎ ｖｉｖｏエピジェネティック抑制を介した持続性鎮痛剤 - Google Patents

標的化されたＩｎ ｖｉｖｏエピジェネティック抑制を介した持続性鎮痛剤 Download PDF

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Abstract

本開示は、抑制因子ドメインと融合した亜鉛フィンガー及び/または抑制因子ドメインと融合したdCas9を含むゲノム編集構築物を用いて、治療が必要な被験者における疼痛を治療及びコントロールする、エピジェネティックに基づいたアプローチ及び方法を提供する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、35 U.S.C.§119条に基づいて、2019年4月9日に出願された仮出願シリアル番号62/831,706及び2019年7月23日に出願された仮出願シリアル番号62/877,810の優先権を主張する。あらゆる目的のため、それらの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
政府援助研究に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所に授与されたCA222826、GM123313、及びHG009285に基づく政府援助により行われたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本開示は、抑制因子ドメインと融合した亜鉛フィンガー及び/または抑制因子ドメインと融合したdCas9を含むゲノム編集構築物を用いて、治療を必要とする被験者における疼痛を治療及びコントロールする、エピジェネティックに基づいたアプローチ及び方法を提供する。
配列リストの参照による組み込み
“Sequence-Listing_ST25.txt”と題する配列リスト（2020年4月9日に作成、121,918バイト、IBM-PC、MS-Windows OS上で機械フォーマットされた）が、本出願に付随されている。あらゆる目的のため、該配列リスト全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
世界人口の19%～50%が慢性疼痛の影響を受け、米国のみで1億人以上がそれに罹患している。また、高齢化や慢性疾患のため、慢性疼痛を訴える人々の数は、2035年までに増加傾向と予想される。慢性疼痛は、癌、糖尿病、及び心臓血管疾患よりも一般的であるが、その治療薬の開発は、他の治療領域で見られる程顕著に進んでいない。さらに、現在の慢性疼痛の標準治療は、しばしば、麻薬様物質に依存する。これらは、副作用及び顕著な中毒の危険性を有する可能性がある。数十年にわたる研究もかかわらず、広範に有効で持続的かつ非依存性の慢性疼痛の治療法はまだ達成されていない。
本開示は、転写抑制因子に融合され、少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)に関連付けられ、核酸分解酵素が不活性化されたCas9(dCas9)タンパク質を含む組換え遺伝子抑制因子複合体を提供し、ここで、該gRNAが、TRPV1/2/3/4、P2XR3、TRPM8、TRPA1、P23X2、P2RY、BDKRB1/2、Hlr3A、ACCNs、TRPV4、TRPC/P、ACCN1/2、SCN1/3/8A/9A、SCN10A、SCN11A、KCNQ、BDNF、OPRD1/K1/M1、CNR1、GABRs、TNF、PLA2、IL1/6/12/18、COX-2、NTRK1、NGF、 GDNF、TNF、LIF、CCL1、CNR2、TLR2/4、P2RX47、CCL2、CX3CR1、BDNF、NR1/2、GR1A1-4、 GRC1-5、NK1R、CACNA1A-S、及びCACNA2D1からなる群から選択された遺伝子産物をコードする標的核酸配列に特異的にハイブリダイズし、該遺伝子産物の発現が阻害される。一実施形態では、前記標的核酸配列は、染色体2の2q24.3の位置にある。別のまたはさらなる実施形態では、前記gRNAは、11～107のいずれかに示される配列によってコードされる配列を含む。別のまたはさらなる実施形態では、前記gRNAは、SCN9A産物(Nav1.7)をコードする核酸配列に特異的にハイブリダイズする。別のまたはさらなる実施形態では、前記転写抑制因子は、mSin3相互作用ドメイン(SID)タンパク質、メチル-CpG結合ドメイン2(MBD2)、MBD3、DNAメチル基転移酵素(DNMT)1(DNMT1)、DNMT2A、DNMT3A、DNMT3B DNMT3L、網膜芽細胞腫タンパク質（Rb）、メチルCpG結合タンパク質2（Mecp2）、GATA 1の友（Fog1）、MAT2の制御因子（ROM2）、シロイヌナズナHD2Aタンパク質（AtHD2A）、リジン特異的脱メチル化酵素1（LSD1）、及びクリュッペル関連ボックス（
Figure 2022526398000002
, KRAB）からなる群から選択される。別の実施形態では、前記転写抑制因子ドメインは、KRABドメインである。
本開示はまた、上記及び本明細書に記載の組換え遺伝子抑制因子複合体の1つまたは複数の成分をコードするポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、ヒト細胞における発現に最適化されたコドンである。
本開示はまた、1つまたは複数の成分をコードし、本開示の組換え遺伝子抑制因子複合体を生成する本開示のポリヌクレオチドを含むベクターまたはベクター系を提供する。一実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結される。別の実施形態では、前記プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、CAGプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV）LTRプロモーター/転写促進因子、SV40プロモーター、EF1-αプロモーター、CMV即時/初期遺伝子転写促進因子/CBAプロモーター、Nav1.7プロモーター、Nav1.8プロモーター、Nav1.9プロモーター、TRPV1プロモーター、シナプシンプロモーター、カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIプロモーター、チューブリンαIプロモーター、神経特異性エノラーゼプロモーター、及びグリア原線維酸性タンパク質(GFAP)プロモーターからなる群から選択される。さらに別の実施形態では、前記ベクターは、少なくとも1つのガイドRNAコード配列の上流にpolIIIプロモーターを含む。さらなる実施形態では、前記polIIIプロモーターは、U6及びH1プロモーターから選択される。別の実施形態では、前記ベクターは、調節制御配列をさらに含む。さらなる実施形態では、前記調節制御配列は、ウッドチャック型肝炎ウイルス後転写調節因子(WPRE)である。別の実施形態では、前記ベクターは、組換えアデノ関連ウイルスベクター(rAAVベクター)である。別の実施形態では、前記rAAVは、AAV1、AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3、AAV3(Y705+731F)、AAV4、AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6(VP3変異体Y705F/Y731F/T492V)、AAV7、 AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3変異体Y731F)、AAV10、AAV10(Y733F)、AAV-ShH10、AAV11、AAV12、及び自己相補的ベクター(scAAV)からなる群から選択される。さらに別のまたはさらなる実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の反転反復(ITR)を含む。さらに別のまたはさらなる実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ポリA配列を含む。別の実施形態では、前記ベクター及びポリヌクレオチドは、細胞内で発現されるように操作される。さらに別の実施形態では、前記ベクターは、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである。さらに別の実施形態では、前記ベクターは、分割dCas9ベクター系を含む。別の実施形態では、前記ベクターは、配列番号:2に示されるような配列またはそれと少なくとも90%同一の配列を有するdCas9をコードする核酸を含み、gRNAと複合することができ、かつ核酸分解酵素の活性を欠いている。さらに別の実施形態では、前記ベクターは、配列番号:7のKRAB配列またはそれと少なくとも90%同一の配列をコードする核酸を含み、かつ転写を抑制することができる。さらに別の実施形態では、前記分割ベクター系は、配列番号:3、4、及び10から選択されるベクター配列、またはそれらと少なくとも90%～99%同一の配列を含む。
本開示は、転写抑制因子に結合された、操作された亜鉛フィンガーDNA結合ドメインを含む亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物を提供し、ここで、該亜鉛フィンガーDNA結合ドメインが、1～6個の亜鉛-フィンガー配列を含み、該亜鉛フィンガー配列が、TRPV1/2/3/4、P2XR3、TRPM8、TRPA1、P23X2、P2RY、BDKRB1/2、Hlr3A、ACCNs、TRPV4、TRPC/P、ACCN1/2、SCN1/3/8A/9A、SCN10A、SCN11A、KCNQ、BDNF、OPRD1/K1/M1、CNR1、GABRs、TNF、PLA2、IL1/6/12/18、COX-2、NTRK1、NGF、GDNF、TNF、LIF、CCL1、CNR2、TLR2/4、P2RX47、CCL2、CX3CR1、BDNF、NR1/2、GR1A1-4、GRC1-5、NK1R、CACNA1A-S、及びCACNA2D1からなる群から選択された遺伝子産物をコードする遺伝子において、標的核酸配列に結合し、該遺伝子産物の発現が阻害される。一実施形態では、前記標的核酸配列は、表2に示されている配列である。さらに別の実施形態では、前記転写抑制因子は、mSin3相互作用ドメイン(SID)タンパク質、メチル-CpG結合ドメイン2(MBD2)、MBD3、DNAメチル基転移酵素(DNMT)1(DNMT1)、DNMT2A、DNMT3A、DNMT3B DNMT3L、網膜芽細胞腫タンパク質（Rb）、メチルCpG結合タンパク質2（Mecp2）、GATA 1の友（Fog1）、MAT2の制御因子（ROM2）、シロイヌナズナHD2Aタンパク質（AtHD2A）、リジン特異的脱メチル化酵素1（LSD1）、及びクリュッペル関連ボックス（
Figure 2022526398000003
, KRAB）からなる群から選択される。
本開示はまた、上記及び本明細書に記載の亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物をコードするポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、ヒト細胞における発現に最適化されたコドンである。
本開示はまた、本開示の亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結される。さらなる実施形態では、前記プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、CAGプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV）LTRプロモーター/転写促進因子、SV40プロモーター、EF1-αプロモーター、CMV即時/初期遺伝子転写促進因子/CBAプロモーター、Nav1.7プロモーター、Nav1.8プロモーター、Nav1.9プロモーター、TRPV1プロモーター、シナプシンプロモーター、カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIプロモーター、チューブリンαIプロモーター、神経特異性エノラーゼプロモーター、及びグリア原線維酸性タンパク質(GFAP)プロモーターからなる群から選択される。別の実施形態では、前記ベクターは、調節制御配列をさらに含む。さらなる実施形態では、前記調節制御配列は、ウッドチャック型肝炎ウイルス後転写調節因子(WPRE)である。別の実施形態では、前記ベクターは、組換えアデノ関連ウイルスベクター(rAAVベクター)である。さらに別の実施形態では、前記rAAVは、AAV1、AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3、AAV3(Y705+731F)、AAV4、AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6(VP3変異体Y705F/Y731F/T492V)、AAV7、AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3変異体Y731F)、AAV10、AAV10(Y733F)、AAV-ShH10、AAV11、AAV12、及び自己相補的ベクター(scAAV)からなる群から選択される。別の実施形態では、前記ベクターまたはポリヌクレオチドは、1つまたは複数の反転反復(ITR)を含む。別の実施形態では、前記ベクターまたはポリヌクレオチドは、ポリA配列を含む。さらに別の実施形態では、前記核酸は、細胞において1つまたは複数の成分を発現するように操作される。別の実施形態では、前記ベクターは、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである。別の実施形態では、前記ベクターは、配列番号:7のKRAB配列またはそれと少なくとも90%～99%同一の配列をコードする核酸を含む。
本開示はまた、被験者における慢性疼痛を治療またはコントロールするための、エピジェネティックに基づいた方法を提供する。該方法は、有効量の、上記及び本明細書に記載の複合体または構築物を投与することを含む。
本開示はまた、治療を必要とする被験者における疼痛を治療またはコントロールするための、エピジェネティックに基づいた方法を提供する。該方法は、有効量の亜鉛フィンガー－抑制因子の構築物及び/またはdCas9－抑制因子ドメインの複合体を該被験者に投与することを含む。ここで、該dCas9が、DNAを切断しないが、ガイド-RNA (gRNA)を介してゲノムに結合する能力を維持する、触媒的に不活性化されたCas9である。一実施形態では、前記疼痛は、神経障害性疼痛、痛覚受容性疼痛、異痛症、炎症性疼痛、炎症性痛覚過敏、神経障害、神経痛、糖尿病性神経障害、ヒト免疫不全ウイルス関連神経障害、神経損傷、関節リウマチ性疼痛、関節炎性疼痛、火傷、背痛、眼痛、内臓痛、癌疼痛、骨癌疼痛、片頭痛、手根管症候群による疼痛、線維筋痛、神経炎性疼痛、シアチカ性疼痛、骨盤過敏症の疼痛、骨盤疼痛、帯状疱疹後神経痛の疼痛、術後の疼痛、脳卒中後の疼痛、及び月経痛から選択される。別の実施形態では、前記疼痛は、神経障害性末梢神経障害、糖尿病性神経障害、食後神経痛、三叉神経痛、背中のケガ、癌神経障害、HIV神経障害、四肢損失、手根管症候群、脳卒中、アルコール依存症、甲状腺機能亢進症、尿毒症、多発性硬化症、脊髄損傷、パーキンソン病、及びてんかんからなる群から選択される疾患または障害に関連する。別の実施形態では、本方法は、慢性疼痛を有する被験者を治療するために使用される。さらに別の実施形態では、前記亜鉛フィンガー－抑制因子の構築物は、mSin3相互作用ドメイン(SID)タンパク質、メチル-CpG結合ドメイン2(MBD2)、MBD3、DNAメチル基転移酵素(DNMT)1(DNMT1)、DNMT2A、DNMT3A、DNMT3B DNMT3L、網膜芽細胞腫タンパク質（Rb）、メチルCpG結合タンパク質2（Mecp2）、GATA 1の友（Fog1）、MAT2の制御因子（ROM2）、シロイヌナズナHD2Aタンパク質（AtHD2A）、リジン特異的脱メチル化酵素1（LSD1）、及びクリュッペル関連ボックス（
Figure 2022526398000004
, KRAB）からなる群から選択される抑制因子ドメインを含む。さらなる実施形態では、前記抑制因子ドメインは、KRABを含む。別の実施形態では、前記亜鉛フィンガー－抑制因子の構築物は、表2の標的に結合する。別の実施形態では、前記dCas9－抑制因子ドメインの複合体は、mSin3相互作用ドメイン(SID)タンパク質、メチル-CpG結合ドメイン2(MBD2)、MBD3、DNAメチル基転移酵素(DNMT)1(DNMT1)、DNMT2A、DNMT3A、DNMT3B DNMT3L、網膜芽細胞腫タンパク質（Rb）、メチルCpG結合タンパク質2（Mecp2）、GATA 1の友（Fog1）、MAT2の制御因子（ROM2）、シロイヌナズナHD2Aタンパク質（AtHD2A）、リジン特異的脱メチル化酵素1（LSD1）、及びクリュッペル関連ボックス（
Figure 2022526398000005
, KRAB）からなる群から選択される抑制因子ドメインを含む。さらなる実施形態では、前記抑制因子ドメインは、KRABを含む。別の実施形態では、前記dCas9－抑制因子ドメインの構築物は、配列番号:11～106及び107から選択される配列を有するガイドRNAスペーサー配列を含む。さらに別の実施形態では、前記亜鉛フィンガー－抑制因子の構築物及び／またはdCas9－抑制因子ドメインの構築物は、電位依存性ナトリウムチャネルの非永続的な遺伝子抑制を提供する。さらなる実施形態では、前記電位依存性ナトリウムチャネルは、NaV1.7、NaV1.8、及びNaV1.9から選択される。さらに別の実施形態では、前記電位依存性ナトリウムチャネルはNaV1.7である。別の実施形態では、前記亜鉛フィンガー－抑制因子の構築物及び／またはdCas9－抑制因子ドメインの構築物は、組換えウイルスによって一括され、送達される。さらなる実施形態では、前記組換えウイルスは、アデノウイルス、ガンマレトロウイルス、アデノ関連ウイルス（AAV）、単純ヘルペスウイルス（HSV）、またはレンチウイルスである。さらなる実施形態では、前記組換えウイルスは、AAV1、AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3、AAV3(Y705+731F)、AAV4、AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6(VP3変異体Y705F/Y731F/T492V)、AAV7、AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3変異体Y731F)、AAV10、AAV10(Y733F)、AAV-ShH10、AAV11、AAV12、及び自己相補的ベクター(scAAV)からなる群から選択される。別の実施形態では、前記亜鉛フィンガー－抑制因子の構築物及び／または前記dCas9－抑制因子ドメインの構築物は、静脈内、腹腔内、髄腔内、神経節内、神経内、頭蓋内、または筋肉内に投与される。
図1A-Dは、in situでのNaV1.7抑制が炎症性疼痛のカラゲナンモデルにおける疼痛改善につながることを示している。（A）ZFP-KRAB及びKRAB-dCas9を用いたin situでのNaV1.7抑制の全体方針の概略図。NaV1.7は、DRG神経細胞の末梢末端での電気衝撃への痛覚刺激の伝達に関与するDRGチャネルである。AAV-ZFP-KRAB及びAAV-KRAB-dCas9を介したでのin situでのNaV1.7抑制は、髄腔内注射によって得られ、脳に到達する前に疼痛信号を破壊する。（B）カラゲナン誘発性の炎症性疼痛モデルの概略図。0日目に、AAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRAB、AAV9-mCherry、AAV9-KRAB-dCas9-二重gRNA、またはAAV9-KRAB-dCas9-gRNA無しのいずれかをマウスに髄腔内注射した。21日後、Hargreaves試験で全てのマウスについて熱痛感受性を測定した。該感受性のベースラインレベルを確立するために、カラゲナン注射の前にフォンフレイフィラメントを用いてマウスの触覚閾値について試験した。次に、マウスの左足（同側）にカラゲナンを注射し、右足（対側）にマウス内対照として生理食塩水を注射した。そして、カラゲナン投与の30分後、1時間後、2時間後、4時間後、及び24時間後に熱による足引っ込め潜時について試験した。（C）in vivo でのNaV1.7抑制効率：カラゲナン投与の24時間後、マウスDRG（L4～L6）を採取し、NaV1.7抑制効果をqPCRによって測定した（n=5;エラーバーはSEMである;スチューデントのt検定; ***p=0.0008、**p=0.0033）。（D）総足引っ込め潜時は、カラゲナンと生理食塩水を注射した両足の曲線下面積（AUC）として計算した。亜鉛-フィンガー-4-KRAB及びKRAB-dCas9-二重gRNAで処置されたマウスでは、カラゲナンを注射した足の足引っ込め潜時が有意に増加した（n=10;エラーバーはSEMである;スチューデントのt検定、****p<0.0001）。
図2A-Cは、確立された低分子薬物ガバペンチンを有する亜鉛-フィンガー-KRABを用いたin situでのNaV1.7抑制の評価基準を示す。(A)実験的アプローチの概略図。(B-C)ガバペンチン（100 mg/kg）、mCherry、及び亜鉛-フィンガー-4-KRABを注射したマウスの後足にカラゲナン（実線）または生理食塩水（点線）を注射した後の熱痛覚過敏の時間経過をプロットした。平均足引っ込め潜時（PWL）が示されている。熱痛覚過敏の時間経過のAUCが右側のパネルにプロットされている。ガバペンチンと亜鉛-フィンガー-4-KRABを注射したマウスのカラゲナンを注射した足にPWLの有意な増加が見られる (mCherry及びガバペンチンの場合ではn=5、亜鉛-フィンガー-KRABの場合ではn=6；エラーバーはSEMであるである；スチューデントのt-検定、*p=0.0208、**p=0.0021)。
図3A-Eは、2つの神経障害性疼痛モデルにおける亜鉛-フィンガー-KRAB及びKRAB-dCas9のin vivoでの有効性を示している。（A）パクリタキセルに誘発された神経障害性疼痛モデルの概略図。AAV9-mCherry、AAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRAB、AAV9-KRAB-dCas9-gRNA無し、AAV9-KRAB-dCas9-二重gRNA、または生理食塩水をマウスにi.t.注射した。14日目にベースラインフォンフレイ閾値試験を行った後、i.t.注射後の14、16、18、及び20日目に8 mg/kgのパクリタキセルをマウスにi.p.注射した。i.t.注射後の21日目に、フォンフレイフィラメントで触覚異痛及びアセトン塗布で冷感異痛についてマウスを試験した。（B）亜鉛-フィンガー-4-KRAB及びKRAB-dCas9-二重gRNAを介したin situでのNaV1.7抑制は、パクリタキセル誘発性の触覚異痛を軽減させる。（n=8;エラーバーはSEMである;スチューデントのt検定; ***p=0.0007、***p=0.0004）（C）亜鉛-フィンガー-4-KRAB及びKRAB-dCas9-二重gRNAを介したin situでのNaV1.7抑制は、パクリタキセル誘発性の冷感異痛を軽減させる。（n=8;エラーバーはSEMである;スチューデントのt検定; ****p<0.0001、**p=0.008）。（D）BzATP 疼痛モデルの概略図。0日目にAAV9-mCherry、AAV9-KRAB-dCas9-gRNA無し、またはAAV9-KRAB-dCas9-二重gRNAをマウスに注射した。21日後、マウスのフォンフレイ触覚閾値のベースラインを設定し、30 nmolのBzATPをi.t.注射した。BzATP 投与の30分後、1時間、2時間、3時間、6時間、及び24時間後に、触覚異痛についてマウスを試験した。（E）神経障害性疼痛のBzATPモデルにおいて、KRAB-dCas9-二重gRNAを介したin situでのNaV1.7抑制は、触覚異痛を軽減させる（KRAB-dCas9-gRNA無しの場合n=5、その他の群の場合n=6、Bonferroni事後検定を使用した2元配置分散分析; ****p<0.0001、*p=0.0469）。
図4A-Eは、2つの独立した疼痛モデルにおける亜鉛-フィンガー-KRAB及びKRAB-dCas9の長期有効性を示している。（A）カラゲナンに誘発された炎症性疼痛モデルの予定表。（B）AAV9-mCherry及びAAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRABをi.t.注射してから42日後のマウスの後足にカラゲナン（実線）または生理食塩水（点線）を注射した後の熱痛覚過敏の時間経過をプロットした。平均足引っ込め潜時が示されている。熱痛覚過敏の時間経過のAUCが右側のパネルにプロットされている。AAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRABを注射したマウスのカラゲナンを注射した足にPWLの有意な増加が見られる（n=8;エラーバーはSEMであるである;スチューデントのt検定; ****p<0.0001）。（C）パクリタキセルに誘発された神経障害性疼痛モデルの概略図。（D）亜鉛フィンガー-4-KRAB及びKRAB-dCas9-二重gRNAを介したin situでのNaV1.7抑制は、パクリタキセルの最終注射の49日後にパクリタキセル誘発性の触覚異痛を軽減させる（亜鉛-フィンガー-4-KRABの場合n=7、その他の群の場合n=8、エラーバーはSEMである、スチューデントのt検定、****p<0.0001）。（E）亜鉛-フィンガー-4-KRAB及びKRAB-dCas9-二重gRNAを介したin situでのNaV1.7抑制は、パクリタキセル誘発性の冷感異痛を軽減させる。（亜鉛-フィンガー-4-KRABの場合n=7、その他の群の場合n=8、エラーバーはSEMである、スチューデントのt検定、****p<0.0001、***p=0.0001）。
図5A-Bは、NaV1.7抑制を可能にするエピジェネティックゲノムエンジニアリングツールのin vitro最適化を示す。（A）4つの亜鉛フィンガータンパク質及び10個のgRNAのパネルは、マウス神経芽細胞腫細胞株（ニューロ2a）のNaV1.7を標的とするように設計し、qPCRによって抑制効果についてスクリーニングした。NaV1.7を標的とするKRAB-dCas9構築物の対照として非標的gRNA（gRNAなし）を使用し、NaV1.7を標的とするZFP-KRAB構築物の対照としてmCherryを使用した（n=3;エラーバーはSEMである;一元配置分散分析;****p<0.0001）。（B）mCherry、亜鉛-フィンガー-2-KRAB、亜鉛-フィンガー-4-KRAB、KRAB-dCas9-gRNA無し、KRAB-dCas9-二重gRNA（1+2）、及びKRAB-dCas9-gRNA-8+10で遺伝子導入されたニューロ2a細胞におけるin vitroでのNaV1.7ウエスタンブロッティング。
図6A-Dは、in situでのNaV1.7抑制が炎症性疼痛のカラゲナンモデルにおける疼痛改善につながることを示している。（A）RNA FISHを介したマウスDRGにおけるAAV9-mCherry形質導入の確認（赤=mCherry、ピンク=NaV1.7、緑=NeuN;スケールバー=50 μm）。（B）AAV9-KRAB-dCas9-gRNA無し及びAAV9-KRAB-dCas9-二重gRNAをi.t.注射してから21日後のマウスの後足にカラゲナン（実線）または生理食塩水（点線）を注射した後の熱痛覚過敏の時間経過をプロットした。平均足引っ込め潜時が示されている（n=10;エラーバーはSEMである）。（C）AAV9-mCherry及びAAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRABをi.t.注射してから21日後のマウスの後足にカラゲナン（実線）または生理食塩水（点線）を注射した後の熱痛覚過敏の時間経過をプロットした。平均足引っ込め潜時が示されている（n=10;エラーバーはSEMである）。（D）ベースライン時及びカラゲナン注射の4時間後の同側の足の厚さをプロットした（n=10）。
図7A-Dは、炎症性疼痛モデルにおける亜鉛-フィンガー-KRABの評価を示している。(A)処置マウスDRGからのin vivo でのNaV1.7抑制効率。カラゲナン投与の24時間後、マウスDRG(L4～L6)を収集し、qPCRによりNaV1.7抑制効果を測定した(mCherry 及びガバペンチン群ではn=5;亜鉛-フィンガー-4-KRAB群ではn=6；エラーバーはSEMである；Dunnet事後検定を使用した1元配置分散分析；***p=0.0007、*p=0.0121)。(B)ベースライン時及びカラゲナン注射の4時間後の同側の足の厚さをプロットした。(C)AAV9-mCherry カラゲナンを注射した足 (陰性対照)と比較した、AAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRAB及びガバペンチン(100 mg/kg)を注射されたマウスにおける足引っ込め潜時の有意性（Bonferroni事後検定を使用した2元配置分散分析）。(D)(a)における実験の単独再現：AAV9-mCherry及びAAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRABを注射してから21日後のマウスの後足にカラゲナン(実線)または生理食塩水(点線)を注射した後の熱痛覚過敏の時間経過。平均足引っ込め潜時が示されている。熱痛覚過敏の時間経過のAUCが右側のパネルにプロットされている。AAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRABを注射したマウスのカラゲナンを注射した足に、PWLの有意な増加が見られる(n=8；エラーバーはSEMである；スチューデントのt-検定；***p<0.0001)。
図8A-Cは、本開示の方法及び組成物に使用されるプラスミド構築物を示している。(A)はAAV、dNCas9のプラスミド構築物(配列番号:3)を示し、(B)はAAV、dNCas9-KRABのプラスミド構築物(配列番号:10)を示し、また(C)はAAV、dCCas9のプラスミド構築物(配列番号:4)を示している。
図9は、本開示の方法及び組成物に使用される亜鉛-フィンガープラスミド構築物(配列番号:5)を示している。
図10A-Bは、in situでのNaV1.7抑制が、化学療法に誘発された神経障害性疼痛を復帰させることを示している。(A)パクリタキセルに誘発された慢性神経障害性疼痛モデルの処置の概略図。感受性のベースラインレベルを確立するために、フォンフレイフィラメントを用いてマウスの触覚閾値について試験した。次いで、1日目、3日目、5日目、及び7日目に、8 mg/kgのパクリタキセルをマウスに注射した。9日目に、フォンフレイフィラメントで触覚異痛を確認した後、AAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRAB(1E+11または1E+12 vg/マウス)またはAAV9-mCherry(1E+11または1E+12 vg/マウス)のいずれかをマウスを髄腔内注射した。14日及び21日後、フォンフレイフィラメントを用いてマウスの触覚異痛について試験した。(B)亜鉛-フィンガー-4-KRABを介したin situでのNaV1.7抑制は、パクリタキセル誘導性の触覚異痛を軽減させる(n=8；エラーバーはSEMである；スチューデントのt-検定；2週目 ****p<0.0001、*p=0.0029；3週目 ****p<0.0001、***p=0.0012)。
図11は、疼痛感知に関与する遺伝子及び潜在的な治療介入モードを示している。
詳細な説明
本明細書及び添付の請求項で使用される場合、単数形“1つ”及び“この”は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、“1つの亜鉛フィンガー”への言及は、複数のこのような亜鉛フィンガーを含み、“1つのアデノ関連ウイルス”への言及は、1つまたは複数のアデノ関連ウイルス及び当業者に公知のその等価物を含む。
また、“または”の使用は、特に明記しない限り、“及び／または”を意味する。同様に、“含む”、“含んでいる”、“包含する”、及び“包含している”は交換可能であり、限定することを意図するものではない。
さらに理解されるべきこととして、様々な実施形態の記述において“含む”という用語が用いられる場合、当業者は、いくつかの特定な場合において、実施形態が“本質的にからなる”または“からなる”という用語で代用して記載されてもよいことを理解できる。
別途で定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。多くの方法及び試薬は、本明細書に記載される方法と類似または同等であるが、本明細書では、例示的な方法及び材料が開示される。
本明細書で言及される全ての刊行物は、本明細書の説明に関連して使用され得る方法論を説明及び開示する目的で、参照により本明細書に完全に組み込まれる。さらに、本明細書において明示的に定義された用語と類似または同一である1つまたは複数の刊行物に提示される任意の用語に関して、本開示で明示的に提供された用語の定義は、全ての点で支配する。
本明細書で使用される“慢性疼痛”は、再発することなく、限られた持続時間のみの急性疼痛を除き、再発の持続時間及び/または頻度によって特徴づけられる疼痛を意味する。いくつかの場合では、“慢性疼痛”は、特定の傷害、状態または疾患に関連し得る自然治癒プロセスの時間経過よりも6ヶ月以上、またはもっと長く持続する。“慢性疼痛”には、限定されるものではないが、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、癌疼痛、熱痛、及び器質的疼痛、または前述の2つ以上の組み合わせが含まれる。
核酸配列に適用される“コードする”という用語は、その天然状態で、または当業者に周知の方法によって操作された場合に、ポリペプチドを“コードする”と言われるポリヌクレオチドを指す。ポリペプチド及び/またはそのフラグメントのmRNAを生成するために転写及び/または翻訳され得る。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補体であり、そこからコード配列を推定することができる。
“等価物”または“生物学的等価物”という用語は、特定の分子、生物学的または細胞性物質を参照するときに交換可能に使用され、そして依然として所望の構造または機能性を維持しながら、最小の相同性を有するものを意図する。
本明細書で使用される場合、“発現”という用語は、ポリヌクレオチドがmRNAに転写されるプロセス及び/または転写されたmRNAが続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムDNAから誘導される場合、発現は真核細胞におけるmRNAのスプライシングを含むことができる。遺伝子の発現レベルは、細胞または組織サンプル中のmRNAまたはタンパク質の量を測定することによって測定できる。さらに、複数の遺伝子の発現レベルを測定して、特定のサンプルについての発現プロファイルを確立することができる。
本明細書で使用される場合、“機能性”という用語を用いて、分子、生物学的または細胞性物質を修飾し、それが特定の効果を達成することを意図できる。
“融合分子”は、2個以上のサブユニット分子が連結し、典型的には共有結合している分子である。該サブユニット分子は、同じ化学的分子種であってもよく、または異なる化学的分子種であってもよい。最初の種類の融合分子の例には、融合ポリペプチド(例えば、ZFP DNA結合ドメインと転写抑制ドメインとの間の融合、または、Cas9またはdCas9と転写抑制ドメインとの間の融合)及び融合核酸(例えば、上述した融合ポリペプチドをコードする核酸)が含まれるが、これらに限定されない。
“遺伝子抑制”及び“遺伝子発現の阻害”は、遺伝子産物の産生の減少をもたらす任意のプロセスを指す。遺伝子産物は、RNA (mRNA、rRNA、tRNA、及び構造性RNAを含むが、これらに限定されない)またはタンパク質のいずれかであってもよい。従って、遺伝子抑制には、遺伝子の転写及び/またはmRNAの翻訳を減少させるプロセスが含まれる。転写を減少させる遺伝子抑制プロセスの例には、転写開始複合体の形成を阻害するもの、転写の開始速度を低下させるもの、転写の伸長速度を低下させるもの、転写の進行度を低下させるもの、及び転写活性化に拮抗するもの(例えば、転写活性化剤の結合を遮断することによる)が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子抑制は、例えば、活性化の防止、並びに既存のレベル以下の発現の阻害を含むことができる。翻訳を減少させる遺伝子抑制プロセスの例には、翻訳の開始を減少させるもの、翻訳の伸長を減少させるもの、及びmRNAの安定性を低下させるものが含まれる。転写抑制は、遺伝子転写の可逆的及び不可逆的不活性の両方を含む。一般に、遺伝子抑制は、遺伝子産物の産生の検出可能な減少を含む。いくつかの場合には、約2倍、他の場合では、約2倍～約5倍またはこの間任意の整数の、さらに他の場合では、約5～約10倍またはこの間任意の整数の、さらに他の場合では、約10～約20倍またはこの間任意の整数の、時には、約20～約50倍またはこの間任意の整数の、他の場合では、約50～約100倍またはこの間任意の整数の、さらに他の例では、100倍以上の遺伝子産物産生の減少が含まれる。さらに他の場合では、遺伝子抑制は、遺伝子発現の完全な阻害をもたらし、遺伝子産物が検出できない。
“雑種形成”は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。該水素結合は、ワトソン-クリック塩基対形成、フーグスティーン結合、またはその他の配列特異的な方法で発生しうる。該複合体は、二本鎖構造を形成する2本鎖、多重鎖複合体を形成する3本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。雑種形成反応は、PC反応の開始またはポリヌクレオチドの酵素的切断等のより広範なプロセスのステップからなりうる。雑種形成の厳密な条件の例は、インキュベーション温度：約25℃～約37℃の；雑種形成緩衝液の濃度：約6x SSC～約10x SSC、ホルムアミドの濃度：約0%～約25%、及び洗浄溶液：約4x SSC～約8x SSCを含む。雑種形成の適度な条件の例は、インキュベーション温度：約40℃～約50℃、緩衝液の濃度：約9x SSC～約2x SSC、ホルムアミドの濃度：約30%～約50%、及び洗浄溶液：約5x SSC～約2x SSCを含む。高度に厳密な条件の例は、インキュベーション温度：約55℃～約68℃、緩衝液の濃度：約lx SSC～約0.1x SSC、ホルムアミドの濃度：約55%～約75%、及び洗浄溶液：約lx SSC、0.1x SSC、または脱イオン水を含む。一般に、雑種形成インキュベーションの時間は5分間～24時間であり、1つ、2つ、またはそれ以上の洗浄工程が含まれ、洗浄インキュベーションの時間は約1、2、または15分間である。SSCは0.15 M NaCl及び15 mMクエン酸緩衝液である。理解されるように、他の緩衝系を用いたSSCの等価物は使用できる。
“相同性”または“同一性”または“類似性”は、2つのペプチド間または2つの核酸分子間の配列類似性を意味する。相同性は、比較のために整列され得る各配列中の位置を比較することによって測定できる。比較された配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占められている場合、その分子は該位置で相同である。配列間の相同性の程度は、該配列によって共有される一致または相同位置の数の関数である。“無関係の”または“非相同的な”配列は、本開示の配列中の1つと40%未満または25%未満の同一性を共有する。2つのポリペプチド間、または2つの核酸分子間の“同一性”または“相同性”を測定するために利用可能な方法及びアルゴリズムは、当該技術分野で周知であり、ワールドーワイドーウェブを介してオンラインで入手可能である。
本明細書で使用される場合、“単離された”という用語は、他の物質を実質的に含まない分子、生物学的物質または細胞材料を指す。
“Nav1.7”（SCN9A、ETHA、FEB3B、GEFSP7、HSAN2D、NE-NA、NENA、PN1、SFNP、及びナトリウム電位依存性チャネルαサブユニット9とも呼ばれる）は、ヒトではSCN9A遺伝子によってコードされるナトリウムイオンチャネルである。それは、通常、2種類の神経細胞（背側根神経節（DRG）における痛覚受容性（疼痛）神経細胞及び三叉神経節/交感神経節神経細胞）において高レベルで発現される。これらは自律（非自発的）神経系の一部である。Nav1.7チャネルは、テトロドトキシンのレベルに敏感な迅速に活性化及び不活性化する電流を生成する。SCN9A遺伝子の配列及び染色体位置は公知である。
本明細書で使用される場合、“核酸配列”及び“ポリヌクレオチド”という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために交換可能に使用される。従って、該用語は、限定するものではないが、単鎖、二本鎖、または多鎖DNAまたはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA-RNAハイブリッド、またはプリン及びピリミジン塩基または他の天然の、化学的または生物学的に修飾された、非天然または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。いくつかの場合では、本開示は、配列リストの形態で核酸配列を提供する。配列リストがDNA配列を提供する場合、本開示はさらにRNAを意図している(即ち、“T”は、本明細書に提供されるいずれかの配列において“U”で置換される)。
本明細書で使用される場合、“プロモーター”という用語は、遺伝子のようなコード配列の発現を調節する任意の配列を指す。プロモーターは、例えば、恒常的、誘導的、抑制可能な、または組織特異的であってもよい。該用語は、50～500ペアの塩基対のミニ-及びコア-プロモーターを含み、polII及びpolIIIプロモーターの両方を含む。“プロモーター”は、転写の開始及び速度が制御されるポリヌクレオチド配列の領域である制御配列である。これは、調節タンパク質と分子が、RNAポリメラーゼ及び他の転写因子のように結合しうる遺伝子因子を含んでいてもよい。プロモーターの例には、CMVプロモーター及びU6プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。適切なpolIIIプロモーターには、U6(マウス及びヒト)及びH1(マウス及びヒト)が含まれるが、これらに限定されない。polIIIプロモーターは、小さなRNA鎖(例えば、shRNA等)を処理するのに適している。本開示は、CRISPRi、CRISPRi-抑制因子等の転写を駆動するための種々のプロモーター(polII)の使用を意図している。例えば、CMV、CAG、SV40、RSV、EF1α等のような非特異的プロモーターを使用できるが、これらに限定されない。あるいは、Nav1.7-、Nav1.8-、及びNav1.9-特異的プロモーター、TPRV1プロモーター等のような細胞特異的プロモーターを使用できるが、これらに限定されない。さらに別の実施形態では、シナプシンIプロモーター、カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIプロモーター、チューブリンαIプロモーター、及び神経特異性エノラーゼプロモーターのような神経特異的プロモーターを使用できるが、これらに限定されない。
用語“タンパク質”、“ペプチド”、及び“ポリペプチド”は、交換可能に使用され、それらの最も広い意味では、アミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣物の2つ以上のサブユニットの化合物を指す。該サブユニットは、ペプチド結合によって連結されていてもよい。別の態様では、該サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテル等によって連結されていてもよい。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を含むことができるアミノ酸の最大数に限定されない。本明細書で使用される場合、“アミノ酸”という用語は、グリシン及びDとL両方の光学異性体、アミノ酸類似体、及びペプチド模倣物を含む、天然及び/または非天然、または合成のアミノ酸のいずれかを意味する。
本明細書で使用される場合、“組換え発現系”という用語は、組換えによって形成されたある種の遺伝物質の発現のための遺伝子構築物を意味する。組換え発現系の例には、本開示の構成要素の発現のための多数の組換えドメイン(例えば、図8A-C及び図9参照)を含む本開示のAAVベクターが含まれる。
本明細書で使用される場合、“被験者”という用語は、任意の動物を意味することが意図されている。いくつかの実施形態では、該被験者は、哺乳動物であってもよく、さらなる実施形態では、該被験者は、ウシ、ウマ、ネコ、マウス、ブタ、イヌ、ヒト、またはラットであってもよい。
本明細書で使用される場合、“ベクター”という用語は、非分裂及び/またはゆっくりと分裂する細胞を感染及び形質導入する能力を保持し、標的細胞のゲノムに組み込まれるか、またはエピジェネティックのままである組換えベクターを意図する。該ベクターは、野生型ウイルス由来であってもよく、または野生型ウイルスに基づくものであってもよい。本開示の態様は、アデノ関連ウイルスベクター(例えば、図8A-C及び図9参照)に関する。
体細胞または神経損傷/病理から生じる疼痛は、典型的には、組織損傷に関連する活性化閾値と、局所的な組織損傷及び炎症によって放出される生成物に対する感受性とを特徴とする一次求心性神経集団の活性化によって生じる。これらの求心性神経は、脊髄の背側角において終結する。ここで、該インプットは、コードされ、長い上昇路によって脳に伝達される。脳では、それは疼痛経験に処理される。一次求心性神経の細胞体は、その背側根神経節(DRG)に存在する。これらの神経細胞体は、作用電位を開始及び伝播するのに役立つ電位依存性ナトリウムチャネルを合成する。局所麻酔薬は、高密度の麻酔をもたらすことができるが、実際では、以前の研究で示されたように、麻酔量以下の濃度で全身投与されるリドカイン等の非特異的ナトリウムチャネル遮断薬は、動物モデル及びヒトの過敏症に対して選択的な効果をもたらすことができた。
現在では知られているように、9つの電位依存性ナトリウムチャネルのサブタイプ及び多くのスプライス変異体が存在する。なお、これらのアイソタイプのうちの3つ、Nav1.7、Nav1.8、及びNav1.9は、主に一次求心性侵害受容器に発現されることが見出されている。これらのアイソタイプとヒトの疼痛との関連性は、以下の観察に示唆されている。即ち、Nav1.7(SCN9A)における機能喪失の突然変異が、稀な遺伝子障害である疼痛(CIP)に対する先天性不感受性をもたらすことが観察された。逆に、機能突然変異の利得は、異常な過剰障害状態を生じる。これらの観察に基づいて、Nav1.7チャネルは、病理学的疼痛状態に対処し、慢性疼痛治療を開発するための魅力的な標的と考えられている。しかし、選択的低分子阻害剤を開発する努力は、Navサブタイプ間の配列類似性のために阻害されてきた。Nav1.7を標的とする多数の低分子薬物は、それに応じて、全身経路による標的特異性またはそれらの生物学的利用能の欠如によって引き起こされる副作用のために失敗した。また、抗体は、チャネルの特異的(開閉)立体配座の結合による選択性と効力との間にトレードオフがあり、結合が常に成功したチャネル阻害に翻訳されないので、同様の状況に直面してきた。さらに、このような抗体は、適切なNav1.7チャネルへのアクセスを得ることができ、それらの機能の信頼できるブロックを生じることは明らかではない。従って、NaV1.7活性の低下が炎症性及び神経障害性疼痛の軽減につながることを示す前臨床試験にもかかわらず、臨床試験の最終段階に到達した遺伝子産物を標的とする分子はまだない。
本開示は、2つのゲノムエンジニアリングツール、即ち、クラスター化された規則的に間隔を置いた短いパリンドロームの反復配列である(CRISPR)-Cas9(CRISPR-Cas9)及び亜鉛フィンガータンパク質(ZFP)を用いて、Nav1.7の発現を遺伝的に調節し、上述の代替的なアプローチを提供し、その結果、高度に特異的、持続的、及び回復可能な疼痛治療を操作することができる。
CRISPR-Cas9システムは、疾患を引き起こすDNA変異を正確に標的化する能力を通して、ゲノム操作のための強力なツールとして現れ、ヒト疾患の複数の動物モデルにおいて治療効果を示した。しかし、永久的なゲノム編集は、疼痛知覚の永久的な変化を導くことが望ましくない場合がある。例えば、疼痛は、不快な感覚と感情的な経験とすることができるが、組織の損傷を警告する重要な役割を果たしている。従って、それが永久に消失することは、有害な結果となることがある。これらの理由から、本明細書では、触媒的に不活性化された“デッド”Cas9(dCas9、CRISPRiとしても知られている)が用いられてきた。これは、DNAを切断せず、ガイド-RNA(gRNA)を介してゲノムに結合する能力を維持し、さらに不活性化Cas9を抑制因子ドメイン(クリュッペル関連ボックス、KRAB)に融合させて、Nav1.7の非永久的遺伝子抑制を可能にする。
本明細書に示すように、KRABエピジェネティックな抑制因子モチーフをdCas9に加えることで、in vitro及びin vivoの両方において高いレベルの特異性で遺伝子抑制を増強することができる。該転写調節系は、CRISPR-Cas9の高い特異性を利用し、同時にゲノムの永久的な改変は行われないので、安全プロファイルを増加させる。
in situでのエピゲノムNav1.7抑制のための第2のアプローチとして、本明細書は、KRAB抑制因子に融合したCys2His2亜鉛フィンガーからなるDNA結合ドメインを含む亜鉛-フィンガー-KRABタンパク質(ZFP-KRAB)を利用してきた。ZFPは、高等生物のゲノムによってコードされる転写調節因子の最大の個別のファミリーを構成し、ヒトタンパク質シャッセ上で操作された一般的な合成バージョンでは、潜在的に低い免疫原性のin vivo標的化アプローチを示す。本開示はさらに、アデノ関連ウイルス（AAV）構築物（例えば、AAV1-9、rh.8、rh.10、rh.39、及びrh.43）の両方のエピジェネティックツール（本明細書に記載）を脊髄髄腔内に送達することによって、遺伝子調節の特定の解剖学的標的化を提供する。なお、多くのAAVが、背根神経節の強固な形質導入を産生することが示されている。該アプローチは、ウイルス負荷を最小限に使用でき、全身的な免疫原性の可能性を減少させるので、いくつかの利点を有する。
“CRISPRシステム”、“Casシステム”、または“CRISPR/Casシステム”という用語は、RNA誘導ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子による標的配列での核酸の修飾を一緒に誘導し、そして効果をもたらす、RNAガイドヌクレアーゼ、または他のエフェクター分子及びgRNA分子を含む分子のセットを指す。一実施形態では、CRISPRシステムは、gRNA及びCasタンパク質(例えば、Cas9タンパク質)を含む。Cas9または改変Cas9分子を含むこのようなシステムは、本明細書では“Cas9システム”または“CRISPR/Cas9システム”と呼ばれる。一例では、該gRNA分子及びCas分子は、組み合わせられてリボ核タンパク質(RNP)複合体を形成してもよい。
“Cas9”または“Cas9分子”という用語は、DNA切断を担う細菌型II CRISPR/Casシステムからの酵素を指す。Cas9はまた、野生型タンパク質、及びその機能的と非機能的変異体も含む。実施形態では、前記Cas9は、S.pyogenesまたはC.jejuniのCas9である。別の実施形態では、前記Cas9は、改変されたまたは“デッド”Cas9(dCas9)である。さらに別の実施形態では、前記Cas9は、そのサイズを制限するためにさらに切断されたデッドCas9である。本開示では、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes、Streptococcus thermophilis、Treponema denticola、Neisseria meningitidis、Campylobacter jejuni等由来のCas9ヌクレアーゼ-ヌルオルソログの使用が熟考される。
いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、修飾(例えば、遺伝子操作)され、ヌクレアーゼ活性を欠く。例えば、デッドCas9(dCas9)タンパク質は、標的遺伝子座に結合するが、該遺伝子座で核酸を切断しない。いくつかの実施形態では、dCas9タンパク質は、配列番号:2の配列(その核酸配列は配列番号:1に提供される)を含む。他の実施形態では、該dCas9は、配列番号:2と少なくとも70%、80%、85%、87%、90%、92%、95%、98%、または99%同一の配列を含み、標的配列に結合することができるが、ヌクレアーゼ活性を欠く。
いくつかの実施形態では、触媒的デッドCas9タンパク質(例えば、デッドCas9、“dCas9”)は、転写調節因子ドメインに融合(例えば、共有結合)され、標的遺伝子(例えば、Nav1.7)の発現を調節(例えば、阻害)する。いくつかの実施形態では、dCas9は、配列番号:2と70%～100%同一の配列を含む。特定の理論に拘束されたくないが、いくつかの実施形態では、dCas9(または他の触媒的デッドCasタンパク質)は、転写機械(例えば、RNAポリメラーゼ複合体)の標的配列への結合を立体的に阻害することで転写抑制を媒介する。
いくつかの実施形態では、本開示は、N-及びC-ドメインが異なるベクターに分離され、インテイン分子上のN-及びC-ドメインで共発現される分割Cas9システムを提供する。例えば、Cas9の2つ以上の部分またはセグメントは、細胞に導入された対応する核酸から発現されること等によって、該細胞に提供される。該2つまたはそれ以上の部分は、細胞内で組み合わされ、標的核酸においてガイドRNAと共局在化する能力を有するCas9を形成する。理解されるべきこととして、Cas9は、当業者に知られている全長Cas9からの1つまたは複数の改変(例えば、dCas9)を有してもよいが、それでもなお、標的核酸におけるガイドRNAとの共局在化能力を保持し、または有する。従って、前記2つ以上の部分またはセグメントは、一緒に結合されると、標的核酸においてガイドRNAと共局在化する能力を有するCas9を産生するか、または結果として得られるのみである。一実施形態では、第1核酸は、第1分割インテインを有するCas9タンパク質の第1部分をコードし、第2核酸は、該第1分割インテインに相補的な第2分割インテインを有するCas9タンパク質の第2部分をコードし、そして、Cas9タンパク質の第1部分とCas9タンパク質の第2部分が結合してCas9タンパク質を形成する。一実施形態では、C-インテイン-dCCas9は、配列番号:8の配列または配列番号:8と70～99%同一の配列を含み、dNCas9-N-インテインは、配列番号:9の配列または配列番号:9と70～99%同一の配列を含む。
いくつかの実施形態では、Casタンパク質(例えば、dCas9)は、転写調節因子ドメインに融合される。本明細書で使用される場合、“転写調節因子ドメイン”は、改変された転写活性(例えば、転写活性化または転写抑制)をもたらす染色質分子における構造的または化学的変化を触媒するタンパク質ドメインである。いくつかの実施形態では、転写調節因子ドメインは、転写抑制因子ドメインである。いくつかの実施形態では、該抑制ドメインは、クリュッペル関連ボックスドメイン(KRABドメイン)を含む。前記KRABドメインの非限定的な例には、KOX1 KRABドメイン、KOX8 KRABドメイン、ZNF43 KRABドメイン、及びZNF184 KRABドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、前記KRABドメインは、KOX1 KRABドメインである。該抑制ドメインのさらなる非限定的な例には、クロモ-シャドウ(CS)ドメイン(例えば、HP1αのCSドメイン)及びWRPWドメイン(例えば、Hes1のWRPWドメイン)が含まれる。特定の実施形態では、前記KRABドメインは、配列番号:6の核酸配列及び配列番号:7のポリペプチド配列、またはこれらと少なくとも70%、80%、85%、87%、90%、92%、95%、98%、または99%同一の配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記dCas9は、1つまたは複数の転写抑制因子を含む。例えば、いくつかの実施形態では、転写抑制因子ドメインを有する例示的なdCas9融合タンパク質の一般的な構造は、[NH2]-[NLS]-[dCas9またはCas9]-[(転写抑制因子)n]-[COOH]、[NH2]-[NLS]-[（転写抑制因子）n]-[dCas9またはCas9]-[COOH ]、[NH2]-[dCas9またはCas9]-[(転写抑制因子)n]-[COOH]、または[NH2]-[(転写抑制因子)n]-[dCas9またはCas9]-[COOH]の構造を含み、ここで、NLSが核局在化シグナルであり、NH2が該融合タンパク質のN末端であり、また、COOHが該融合タンパク質のC末端である。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、前記転写抑制因子の1つまたは複数の反復を含み、例えば、n=1～10(例えば、nが1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10)である。いくつかの実施形態では、n=1～20である。いくつかの実施形態では、リンカーは、前記dCas9と前記転写抑制因子ドメインとの間に挿入される。いくつかの実施形態では、リンカーは、前記核局在化シグナル(NLS)と前記転写抑制因子及び/またはdCas9ドメインとの間に挿入される。いくつかの実施形態では、前記NLSは、前記転写抑制因子及び/または前記dCas9ドメインのC末端に配置される。いくつかの実施形態では、前記NLSは、前記転写抑制因子ドメインと前記dCas9ドメインとの間に配置される。配列タグのような付加的な特徴も存在し得る。いくつかの実施形態では、前記転写抑制因子は、Kox1のKRAB（クリュッペル関連ボックス）ドメイン、SID（mSin3相互作用ドメイン）、HP1αのCS（クロモシャドウ）ドメイン、HeslのWRPWドメイン、MBD2、MBD3、DNMTファミリー（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT2A）、Rb、Mecp2、Fog1、ROM2、AtHD2A、及びLSD1からなる群から選択される。これら及び他の抑制因子ドメインは、当該技術分野で公知であり、いくつかの実施形態では、Urrutia、KRABを含有する亜鉛-フィンガー抑制因子タンパク質、Genome. Biol. 2003; 4(10):231；Gilbertら、真核生物におけるCRISPRを介したモジュラーRNAガイドによる転写調節、Cell. 2013; 154, 442-451；Konermannら、哺乳類の内因性転写及びエピジェネティック状態の光学的制御、2013；500, 472-476；及びU.S.2014/0186958 A1として公表されている公開された米国特許出願第14/105,017号に記載されているもの(その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる)に相当する。いくつかの実施形態では、前記転写抑制因子ドメインは、KRABドメインの1つまたは複数の反復(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、または10個の反復)を含む。いくつかの実施形態では、前記KRABドメインは、配列番号:7からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記転写抑制因子ドメインは、SIDタンパク質の1つまたは複数の反復を含む。いくつかの実施形態では、前記抑制因子ドメインは、SIDタンパク質の2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、または10個の反復を含む。いくつかの実施形態では、前記抑制因子ドメインは、SIDの4つの反復を含む。
いくつかの実施形態では、転写調節剤は、分割Cas9システムの1つまたは両方の構築物中に存在する。例えば、KRABドメインは、配列番号:3及び/または4のいずれかまたは両方に存在することができる。例えば、KRAB配列が配列番号:3に存在する場合、得られる構築物は、図8B及び配列番号:10に提供される。
“ガイドRNA”、“ガイドRNA分子”、“gRNA分子”または“gRNA”という用語は、交換可能に使用され、RNA誘導ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子(典型的には、gRNA分子と複の合体)を特定の配列に促進する核酸分子のセットを指す。標的特異性のためのgRNA及びドナーの治療用ポリヌクレオチドを設計する技術は、当該技術分野で周知である。例えば、Doench, J.ら、Nature biotechnology 2014；32(12)：1262-7、Mohr,S.ら、(2016) FEBS Journal 283：3232-38、及びGraham,D.ら、Genome Biol.2015；16：260。gRNAは、CRISPR RNA（crRNA）とトランス活性化CRIPSPR RNA（tracrRNA）を含む融合ポリヌクレオチド、または、CRISPR RNA（crRNA）とトランス活性化CRIPSPR RNA（tracrRNA）を含むポリヌクレオチドを含むか、本質的に構成されているか、さらにこれらで構成される。いくつかの態様では、gRNAは、合成されたものである(Kelley, M.ら、(2016) J.Biotechnology 233((2016)74-83)。いくつかの実施形態では、標的化は、gRNAの一部をDNAに雑種形成(例えば、gRNA標的化ドメイン)を介して、そして、gRNA分子の一部をRNA誘導ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子に結合させることによって達成される。いくつかの実施形態では、gRNA分子は、本明細書では、“単一ガイドRNA”または“sgRNA”等と呼ばれる単一の連続したポリヌクレオチド分子からなる。他の実施形態では、gRNA分子は、通常、本明細書では“二重ガイドRNA”または“dgRNA”等と呼ばれ、雑種形成を介して関連付けできる複数の、通常は2つのポリヌクレオチド分子からなる。gRNA分子は、一般に、標的化ドメイン及びtracrを含む。実施形態では、該標的化ドメイン及びtracrは、単一のポリヌクレオチド上に配置される。他の実施形態では、該標的化ドメイン及びtracrは、別々のポリヌクレオチド上に配置される。
“標的ドメイン”という用語は、gRNAとの関連で使用される場合、標的配列（例えば、細胞の核酸内（例えば、遺伝子内）の標的配列）を認識する（例えば、それと相補的である）gRNA分子の一部である。
“標的配列”という用語は、gRNA標的化ドメインに相補的な、例えば、完全に相補的な核酸の配列を指す。実施形態では、前記標的配列は、ゲノムDNA上に配置されている。一実施形態では、前記標的配列は、ヌクレアーゼまたは他のエフェクター活性を有するタンパク質、例えば、Cas9によって認識されるPAM配列によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列に隣接(同一の鎖上、またはDNAの相補鎖上のいずれかに)している。実施形態では、前記標的配列は、Nav1.7遺伝子の発現に影響を及ぼす遺伝子または遺伝子座内の標的配列(例えば、電位依存性ナトリウムチャネル1.7の発現に影響を及ぼすもの)である。
本開示は、表1におけるgRNA標的配列を提供する。認識されるように、表1におけるgRNA標的配列は、該標的配列がゲノムにおけるSCN9A遺伝子中の標的配列にハイブリダイズできる限り、約1～5ペアの塩基対(例えば、1、2、3、4、または5ペアの塩基対)の置換によって変化し得る。
表1：
Figure 2022526398000006
Figure 2022526398000007
Figure 2022526398000008
一実施形態では、本開示は、転写抑制因子に融合されたヌクレアーゼ不活性化Cas9タンパク質を含む組換え遺伝子抑制因子複合体を提供し、ここで、該ヌクレアーゼ不活性化Cas9は、ガイドRNAと関連し、ここで、該ガイドRNAは、配列番号:11～107、及び1～5ペア(例えば、1、2、3、4、または5ペア)の塩基対置換を有する配列番号:11～107のいずれかから選択された配列を有し、ここで、該gRNAは、遺伝子の発現を抑制するSCN9A遺伝子における標的配列に結合することができる。1つの実施形態では、前記ヌクレアーゼ不活性化Cas9は、分割Cas9の形態である。該不活性化Cas9は、任意のCas9タンパク質に由来及び/または誘導され得る。別の実施形態では、前記ヌクレアーゼ不活性化Cas9はC.jejuniから操作される。別の実施形態では、前記ヌクレアーゼ不活性化Cas9は、配列番号:2またはそれと少なくとも70%、少なくとも90%～99%同一の配列を含む。別のまたはさらなる実施形態では、前記転写抑制因子は、KRABである。さらなる実施形態では、該KRABは、配列番号:7に示されるような配列、または配列番号:7と70%～99%同一の配列を含み、かつ遺伝子転写を抑制できる。
図8A-Cの構築物を参照すると、表1のgRNA配列の少なくとも1つは、U6プロモーターのすぐ下流のAgeI部位にクローニングされる。
以下にさらに説明するように、前記組換え遺伝子抑制因子複合体は、レンチウイルスベクター及びアデノウイルスベクターを含む種々のウイルスベクターを用いて送達することができる。
本開示はまた、亜鉛フィンガーDNA結合タンパク質を含む組換え遺伝子抑制因子複合体を提供する。
本明細書で使用される場合、“ポリA”は、アデノシンのポリマーを指す。ポリA配列は、例えば、SV40ポリ(A)、ウシ成長ホルモンポリ(A)(bGHpA)、ウサギβ-グロビンポリ(A)等から得ることができる。
“調節因子”は、ウイルスベクターからの発現を改善するための方法及び組成物に使用できる。例えば、ウッドチャック型肝炎ウイルス調節因子(WPRE)を用いて、ウイルスベクターからのdCas9構築物の発現を増強することができる。WPREの配列は、公知である(例えば、ウィキペディアにおける“WHP 転写後応答因子”；[https：//]en.wikipedia.org/wiki/WHP_Posttranscriptional_Response _Elementを参照)。
当業者は図8A-C及び図9に示されている構築物を参照して気づくように、これらの構造は模式的なものであるため、本明細書で提供されるような異なる“ポリA”配列を本開示のベクターにクローニングでき、異なるプロモーターを図8A-C及び図9中の“CMV”の代わりに、該ベクターに置換でき(例えば、該CMVプロモーターをRSVプロモーターのような別のpolIIプロモーターに置換できる)、異なるpolIIIプロモーターを図8A-C中のU6プロモーターに置換できる。
“亜鉛フィンガーDNA結合タンパク質”(または結合ドメイン)は、1つまたは複数の亜鉛フィンガーを介して配列特異的にDNAを結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインであり、その構造が亜鉛イオンの配位によって安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である。亜鉛フィンガーDNA結合タンパク質という用語は、しばしば、亜鉛フィンガータンパク質、ZF、またはZFPと略記される。個々のDNA結合ドメインは、典型的には“フィンガー”と呼ばれる。ZFPは、少なくとも1本のフィンガー、典型的には2本、3本、4本、5本、6本、またはそれ以上のフィンガーを有する。各フィンガーは、2～4ペアの塩基対のDNA、典型的には3または4ペアの塩基対のDNAに結合する。ZFPは、標的部位または標的セグメントと呼ばれる核酸配列に結合する。各フィンガーは、典型的には、約30個のアミノ酸、亜鉛-キレート化、DNA結合のサブドメインを含む。これらのタンパク質の1つのクラス(C2H2クラス)を特徴付ける例示的なモチーフは、-Cys-(X)2-4-Cys-(X)12-His-(X)3-5-Hisである(ここで、Xが任意のアミノ酸である)(配列番号:143)。亜鉛フィンガータンパク質の他のクラスは知られており、本法の実施、本明細書に開示される組成物の製造及び使用に有用である(例えば、Rhodesら、(1993) Scientific American 268：56-65及び米国特許出願公開第2003/0108880を参照)。研究では、該クラスの単一の亜鉛フィンガーが、単一のβターンの2つのシステイン残基と共に亜鉛と配位した2つの不変のヒスチジン残基を含むαヘリックスからなることが実証されている(例えば、Berg & Shi, Science 271：1081-1085(1996)を参照)。ZFPのための単一の標的部位は、典型的には約4～約10ペアの塩基対を有する。典型的には、2フィンガー型ZFPは4～7塩基対の標的部位を認識し、3フィンガー型ZFPは6～10塩基対の標的部位を認識し、4フィンガー型ZFPは12～14塩基対の標的部位を認識し、6フィンガー型ZFPは18～20塩基対の標的部位を認識する。これらは、2つの隣接する9～10塩基対の標的部位または3つの隣接する6～7塩基対の標的部位を含むことができる。
操作された亜鉛フィンガー結合ドメインを含むこれらの実施形態では、亜鉛フィンガードメインは、特定の標的部位に結合するように操作される。該結合ドメインは、複数の亜鉛フィンガー(例えば、2本、3本、4本、5本、6本、またはそれ以上の亜鉛フィンガー)を含有する。一般に、個々の亜鉛フィンガーは、3つから4つまでのヌクレオチドのサブサイトに結合する。該サブサイトは、標的部位に隣接していてもよく（そして、いくつかの場合には重複している)；あるいは、該サブサイトは、1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のヌクレオチドのギャップによって隣接するサブサイトから分離されてもよい。1つまたは複数のヌクレオチドのギャップによって分離されたサブサイトへの結合は、隣接する亜鉛フィンガー間の非標準的なより長いリンカー配列の使用によって促進される。
本開示は、表2に示されるような亜鉛フィンガー標的を提供する。表2は、SCN9A遺伝子配列におけるマウス及びヒト標的部位の両方を示している。
表2：
Figure 2022526398000009
上記の標的配列を用いて、当業者は、これらの配列に結合する亜鉛-フィンガータンパク質を設計することができる。例えば、当技術分野で知られている方法を用いて、配列番号:108、109、110、または111に結合する亜鉛-フィンガー抑制因子構築物は設計された。該亜鉛-フィンガー抑制因子構築物は、以下の表3に示されているような6本の亜鉛フィンガーを含み、ここで、該亜鉛フィンガーの標的アミノ酸は、6～12個のアミノ酸を含む。
表3(太字/下線付きの部分は、KRAB抑制因子配列であり、二重下線付きの領域は、亜鉛フィンガー標的領域である。)
Figure 2022526398000010
ヒトNav1.7発現は、ZFPによって表2に示される核酸配列(例えば、配列番号:108～122またはその部分配列)を有する標的部位への結合を介して調節される。マウスNav1.7発現は、ZFPによって配列番号108、109、110、または111の配列を有する標的部位への結合を介して調節される(例えば、マウスSCN10Aのような)。Nav1.7の種変異体（例えば、マウスSCN10A）は、その種における配列番号:108、109、110、または111に対応する部位(即ち、最大の配列同一性を有する部位)で調節され得る。個々の亜鉛フィンガーが主に接触するサブサイトを含むヌクレオチドは上の方に示され、サブサイト間のヌクレオチドは下の方に示されている。
マウス相同体(SCN10A)中のNav1.7発現を抑制できる例示的なZFP-KRAB配列は、配列番号:123～126に示されている。ここで、各配列は、6個のフィンガードメイン及びアミノ酸220～282からのKRAB配列を含む。
本明細書に記載の亜鉛フィンガーまたはCRISPR/Casタンパク質は、1つまたは複数の亜鉛フィンガーまたはCRISPR/Casタンパク質をコードする配列を含むベクターを用いて送達され得る。これらに限定されないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びアデノ関連ウイルスベクター等を含む任意のベクター系を使用することができる。米国特許第6,534,261号、第6,607,882号、第6,824,978号、第6,933,113号、第6,979,539号、第7,013,219号、及び第7,163,824号（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。さらに、これらのベクターのいずれも、1つまたは複数の亜鉛フィンガータンパク質をコードする配列を含んでいてもよいことは明らかであろう。従って、1つまたは複数のZFPまたはCRISPR/Casタンパク質が細胞に導入される際、ZFPまたはCRISPR/Casタンパク質をコードする配列は、同じベクターまたは異なるベクター上で担持され得る。複数のベクターが使用される場合、各ベクターは、1つまたは複数のZFPまたはCRISPR/Casシステムをコードする配列を含んでもよい。
汎用のウイルス及び非ウイルスに基づく遺伝子導入法を用いて、操作されたZFPまたはCRISPR/Casシステムをコードする核酸を細胞(例えば、哺乳動物の細胞)及び標的組織に導入することができる。このような方法はまた、ZFPまたはCRISPR/Casシステムをコードする核酸をin vitroで細胞に投与するために使用することもできる。特定の実施形態では、ZFPまたはCRISPR/Casシステムをコードする核酸は、in vivoまたはex vivo遺伝子治療法のために投与される。非ウイルス性のベクター送達系には、DNAプラスミド、ネイキッド核酸、及びリポソームまたはポロキサマーのような送達溶媒と複合体化された核酸が含まれる。ウイルス性のベクター送達系には、エピソームまたは細胞への送達後に一体化されたゲノムのいずれかを有するDNA及びRNAウイルスが含まれる。遺伝子治療の手順は公知であり、Anderson (1992) Science 256:808-813; NabelとFelgner (1993) TIBTECH 11:211-217; MitaniとCaskey (1993) TIBTECH 11:162-166; Dillon (1993) TIBTECH 11:167-175; Miller (1992) Nature 357:455-460; Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10):1149-1154; Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36; KremerとPerricaudet (1995) British Medical Bulletin 51(1):31-44; Haddadaら, in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (編集) (1995); 及びYuら, (1994) Gene Therapy 1:13-26を参照されたい。
核酸の非ウイルス性の送達方法には、電気穿孔、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオスティックス、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、エクソソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸結合体、ネイキッドDNA、ネイキッドRNA、人工ウイルス粒子、及びDNAの増強された取り込みが含まれる。例えば、ソニトロン2000システム(Rich-Mar)を用いたソノポレーションも、核酸の送達のために使用することができる。一実施形態では、1つまたは複数の核酸は、mRNAとして送達される。また、いくつかの実施形態では、キャップされたmRNAを使用して、翻訳効率及び/またはmRNA安定性を増加させることができる。
他の例示的な核酸送達系には、Amaxa Biosystems (Cologne、Germany)、Maxcyte,Inc. (Rockville, Md.)、BTX分子送達系(Holliston, Mass.)、及びCopernicus Therapeutics Inc.(例えば、米国特許第6,008,336号を参照されたい)によって提供されるものが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第5,049,386号、第4,946,787号、及び第4,897,355号に記載され、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Transfectam(登録商標)、Lipofectin(登録商標)、及びLipofectamine(登録商標)RNAiMAX)。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適している陽イオン性及び中性脂質には、Felgnerの国際特許公開第WO 91/17424号及び第WO 91/16024号のものが含まれる。細胞(ex vivo投与)または標的組織(in vivo投与）に送達することができる。
脂質：免疫性脂質複合体等の標的リポソームを含む核酸複合体の調製は、当業者に周知である(例えば、Crystal (1995) Science 270:404-410 (1995)、Blaeseら,(1995) Cancer Gene Ther. 2:291-297、Behrら, (1994) Bioconjugate Chem. 5:382-389、Remyら, (1994) Bioconjugate Chem. 5:647-654、Gaoら, (1995) Gene Therapy 2:710-722、Ahmadら, (1992) Cancer Res. 52:4817-4820、米国特許第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、及び第4,946,787号を参照)。
さらなる送達方法には、送達される核酸をEnGenelC送達溶媒(EDV)に一括する方法が含まれる。これらのEDVは、抗体の一方のアームが標的組織に対して特異性を有し、他方のアームがEDVに対して特異性を有する二重特異性抗体を用いて、標的組織に特異的に送達される。該抗体は、EDVを標的細胞の表面にもたらし、次いでEDVがエンドサイトーシスによって細胞に導入される。一旦細胞内に入ると、その内容物が放出される(MacDiarmidら, (2009) Nature Biotechnology 27(7)：643を参照)。
操作されたZFPまたはCRISPR/Casシステムをコードする核酸の送達のためのRNAまたはDNAウイルスに基づくシステムの使用は、ウイルスを身体内の特定の細胞に標的化し、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与され(in vivo) 得るか、またはin vitroで細胞を処理し、改変された細胞を患者に投与(ex vivo)され得る。汎用のZFPまたはCRISPR/Casシステムを送達するためのウイルスに基づくシステムは、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、及び単純ヘルペスウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。
宿主ゲノム中の組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ関連ウイルス遺伝子導入法によって可能であり、しばしば、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。また、多くの異なる細胞型及び標的組織において、高い形質導入効率が観察されてきた。
レトロウイルスの熱帯性は、外来エンベロープタンパク質を導入し、標的細胞の潜在的標的集団を拡張することによって、変えることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させることができ、典型的には高いウイルス力価を産生することができるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、6～10 kbまでの外来配列の一括化能力を有するシス作用性の長い末端反復からなる。最小のシス作用性LTRは、ベクターの複製及び一括化に十分であり、これは、次いで、治療遺伝子を標的細胞に統合して、永久導入遺伝子発現を提供するために使用される。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス(MuLV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、Simian免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、及びそれらの組み合わせに基づくものが含まれる(例えば、Buchscherら, (1992) J. Virol. 66:2731-2739、Johannら, (1992) J. Virol. 66:1635-1640、Sommerfeltら, (1990) Virol. 176:58-59、Wilsonら, (1989) J. Virol. 63:2374-2378、Millerら, (1991) J. Virol. 65:2220-2224 (1991)、及びPCT/US94/05700を参照)。
一過性の発現が望まれる用途では、アデノウイルスに基づくシステムを使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターでは、高力価及び高レベルの発現が得られた。該ベクターは、比較的簡単なシステムで大量に製造することができる。アデノ関連ウイルス(“AAV”)ベクターもまた、例えば、標的核酸で細胞を形質導入するために、例えば、核酸及びペプチドのin vitro産生、及びin vivo及びex vivo遺伝子治療手順に使用される(例えば、Westら, (1987) Virology 160:38-47、米国特許第4,797,368号、国際特許公開第WO 93/24641号、Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801、及びMuzyczka (1994) J. Clin. Invest. 94:1351を参照)。組換えAAVベクターの構築は、米国特許第5,173,414号、Tratschinら, (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260、Tratschinら, (1984) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081、HermonatとMuzyczka (1984) PNAS 81:6466-6470、及びSamulskiら, (1989) J. Virol. 63:3822-3828を含む多数の刊行物に記載されている。
現在、少なくとも6つのウイルスベクターアプローチは、臨床試験における遺伝子導入のために利用可能であり、これらは、形質導入剤を生成するためにヘルパー細胞系に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性を含むアプローチを利用している。
pLASN及びMFG-Sは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Dunbarら,（1995）Blood 85：3048-305、Kohnら,(1995) Nat. Med.1：1017-102、及びMalechら,(1997) PNAS 94（22）：12133-12138）。PA317/pLASNは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療用ベクターであった（Blaeseら,（1995） Science 270：475-480）。MFG-Sパッケージベクターでは、50%以上の形質導入効率が観察されている（Ellemら,（1997）Immunol Immunother 44（1）：10-20、及びDranoffら,(1997) Hum. Gene Ther.1：111-112）。
組換えアデノ関連ウイルスベクター(rAAV)は、欠陥及び非病原性パルボウイルスアデノ関連型2ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するAAV 145 bp反転末端反復(ITR)のみを保持するプラスミドから誘導される。形質導入された細胞のゲノムへの組み込みによる効率的な遺伝子導入及び安定な導入遺伝子送達は、該ベクター系のための重要な特徴である(Wagnerら, (1998) Lancet 351(9117)：1702-1703、Kearnsら, (1996) Gene Ther. 9：748-55)。AAV 1、AAV3、AAV4、AAVS、AAV6、AAV8AAV8.2、AAV9、AAV rh10、及び偽型AAV(AAV2/8、AAV2/5及びAAV2/6等)を含む他のAAV血清型も本発明に従って使用することができる。
複製欠損組換えアデノウイルスベクター(Ad)は、高い力価で製造することができ、多くの異なる細胞型に容易に感染させることができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がAd E1a、E1b、及び／または E3遺伝子に置換するように操作される。次いで、該複製欠損ベクターは、トランスに欠失遺伝子機能を供給するヒト293細胞中で増殖される。Adベクターは、in vivoで、肝臓、腎臓、及び筋肉で見られるような非分裂の、分化細胞を含む複数種類の組織を形質導入することができる。従来のAdベクターは、搬送容量が大きい。臨床試験におけるAdベクターの使用例には、筋肉内注射による抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド療法(Stermanら, (1998) Hum. Gene Ther.7：1083-1089)が含まれる。他の臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用例には、Roseneckerら, (1996) Infection 24(1):5-10、Stermanら, (1998) Hum. Gene Ther. 9(7):1083-1089、Welshら, (1995) Hum. Gene Ther. 2:205-218、Alvarezら, (1997) Hum. Gene Ther. 5:597-613、Topfら, (1998) Gene Ther. 5:507-513、及びStermanら, (1998) Hum. Gene Ther. 7:1083-1089が含まれる。
パッケージング細胞は、宿主細胞に感染できるウイルス粒子を形成するために使用される。このような細胞には、アデノウイルスを一括する293細胞、及びレトロウイルスを一括するΨ2細胞またはPA317細胞が含まれる。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子に一括するプロデューサー細胞株によって生成される。ベクターは通常、一括化及びその後の宿主への組み込み（該当する場合）に必要な最小限のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。欠損したウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療に使用されるAAVベクターは、典型的には、一括化及び宿主ゲノムへの組み込みに必要なAAVゲノムからの反転末端反復(ITR)配列を有するだけである。ウイルスDNAは、他のAAV遺伝子(即ち、rep及びcap)をコードするがITR配列を欠くヘルパープラスミドを含む細胞株中に一括される。該細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染する。該ヘルパーウイルスは、前記ヘルパープラスミドからのAAVベクターの複製及びAAV遺伝子の発現を促進する。前記ヘルパープラスミドは、ITR配列の欠如のために有意な量でパッケージされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがAAVより敏感な熱処理によって、減少させることができる。
多くの遺伝子治療用途において、遺伝子治療ベクターは、特定の組織タイプに対して高度の特異性で送達されることが望ましい。従って、ウイルスベクターは、ウイルスの外側表面上にウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることにより、所定の細胞型に対して特異性を有するように改変することができる。該リガンドは、目的の細胞型上に存在することが知られている受容体に対して親和性を有するように選択される。例えば、Hanら,(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751には、モロニーマウス白血病ウイルスを改変してgp70に融合したヒト遺伝性イヌリンを発現させることができ、該組換えウイルスは、ヒト上皮増殖因子受容体を発現する特定のヒト乳癌細胞に感染すると報告されている。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する他のウイルス標的細胞対にまで拡大することができる。例えば、糸状ファージは、実質的に任意の選択された細胞受容体に対して特異的な結合親和性を有する抗体フラグメント (例えば、FAB または Fv)を表示するように操作することができる。上記の説明は主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターにも適用できる。このようなベクターは、特定の標的細胞による取り込みに有利な特定の取り込み配列を含むように操作することができる。
遺伝子治療ベクターは、典型的には、以下に記載するように、全身投与(例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、髄腔内、または頭蓋内注入)または局所適用によって、個々の患者に投与することによってin vivoで送達され得る。あるいは、ベクターは、ex vivoで、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）やユニバーサルドナー造血幹細胞等の細胞に送達でき、その後、通常は該ベクターを組み込んだ細胞を選択した後、患者に細胞を再移植する。
治療用ZFP核酸またはCRISPRを含むベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等)もまた、in vivoでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することができる。あるいは、ネイキッドDNAを投与することもできる。投与は、通常、注射、注入、局所適用、及び電気穿孔を含むが、これらに限定されない血液または組織細胞と最終的に接触する分子を導入するために通常使用される経路のいずれかによるものである。このような核酸を投与するのに適した方法は、利用可能であり、当業者によく知られているが、特定の組成物を投与するために複数の経路を使用することができるが、特定の経路は、しばしば、別の経路よりも迅速かつより効果的な反応を提供することができる。
薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。従って、以下に説明するように、利用可能な医薬組成物の適切な製剤が多種多様に存在している(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（第17版)を参照）。
本開示のCas9複合体及び亜鉛フィンガー融合構築物を用いて、様々な動物モデルにおける疼痛知覚を抑制した。疼痛知覚は、病因学的に多様で、多面的であるので、いくつかの齧歯類の疼痛モデルが、疼痛シグナル伝達及び疼痛挙動を研究するために利用された。本明細書に記載の研究は、メカニズム上異なる3つのモデルを用いて、Nav1.7のCRISPR媒介ノックダウンの効果を評価した。 (i)対照(正常)及び片側炎症増感された後足での熱感受性、(ii)化学療法により誘導された両側後足の触覚異痛を生じる多重神経障害、及び(iii)プリン受容体の脊髄活性化によって誘導された脊髄的に誘発された両側後足の触覚異痛症。組織損傷及び炎症に起因する疼痛は、痛覚受容の求心性神経細胞の末梢端を増感する因子の放出から生じる。この表現型は、足にカラゲナンを局所的に塗布し、その結果、炎症、膨潤、Nav1.7の発現の増加、及び熱的及び器質的感受性の急増(痛覚過敏)をもたらすことによって研究することができる。癌を治療するための化学療法は、しばしば、軽い接触に対する感受性(例えば、触覚異痛)及び冷感を特徴とする多神経障害をもたらす。パクリタキセルは、一般的に使用される化学療法薬であるが、これは、痛覚受容の求心性神経におけるNav1.7の発現を増加させ、動物モデルにおいて強烈な異痛を誘導する。最後に、求心性神経末端、2次神経細胞、及び非神経細胞上で発現される種々のプリン受容体上の作用によるATP(アデノシン三リン酸)は、炎症性、内臓、及び神経障害性の疼痛に広く関与している。従って、安定なATP類似体(BzATP：2',3'-O-(4-ベンゾイルベンゾイル)-ATP)の髄腔内送達は、マウスにおいて持続的な異痛を生じる。
本明細書では、種々のKRAB-CRISPR-dCas9及びZFP-KRAB構築物が提供され、マウス神経芽腫細胞系におけるNav1.7(ニューロ2a)発現の抑制について研究された。これらの構築物は、送達のためにレトロウイルスシステムに一括することができる。例えば、in vitroでの抑制を有する試験された構築物をAAV9に一括し、そして成体C57BL/6Jマウスに髄腔内に注射した。21日後、カラゲナンの注射を介して足炎症を誘導した。次いで、熱痛覚過敏を評価した。本明細書に示される例示的な研究では、本開示の構築物を使用するNav1.7のin vivo抑制は、熱痛覚過敏の軽減をもたらした。該構築物をさらに2つの神経障害性疼痛（化学療法に誘発された(パクリタキセル) 神経障害性疼痛及び BzATPに誘導された神経障害性疼痛）のモデルで試験した。パクリタキセルに誘発された神経障害性疼痛のモデルの結果に示されたように、本開示の構築物を用いたNav1.7の抑制は、触覚及び冷感異痛を軽減させる。また、KRAB-CRISPR-dCas9を注入されたマウスは、ATP類似体BzATPの投与後に、触覚異痛の軽減が示された。多くの疼痛状態は、慢性的な炎症及び神経損傷の後に発生し、通常は絶え間ない再投薬を必要とする永続的な状態を引き起こすため、本開示の遺伝的アプローチは、この異常な処理及び永続的な疼痛の継続的かつ制御可能な調節を提供する。本明細書に記載されたin situでのエピジェネティックなアプローチは、麻薬様物質を代替し、長期間持続する慢性疼痛のための潜在的な治療的アプローチとして機能する。
本明細書に示される実験では、背根神経節におけるNav1.7の抑制の効力は、本開示の2つの別個のゲノムエンジニアリング構築物（KRAB-dCas9及び亜鉛-フィンガー-KRABタンパク質）を用いて評価された。本開示のゲノム編集構築物は、末梢炎症及び多発性神経障害の動物モデルで生成される急性及び持続性の痛覚受容処理を抑制するのに効果的であったことが見出された。本開示のゲノム編集構築物は、分割-dCas9プラットフォームへの染色質の位置及び配列特徴に基づいて効果的なgRNAを予測するin silicoツールを使用して合理的に設計された複数のガイドRNA（gRNA）クローンを試験することから発見された。同様に、複数のZFP-KRAB Nav1.7 DNA標的化構築物も発見された。本開示のゲノム編集構築物を、Nav1.7(ニューロ2a)を発現するマウス神経芽細胞腫細胞株に遺伝子導入した。Nav1.7の抑制が確認された。その後のin vivo研究のために、最も高い抑制レベルを示す構築物を選択した。
RNAiのような他の技術は、Nav1.7を標的化するために利用されてきたが、CRISPRiと比較して、RNAiの非特異的な効果は、一般的に理解されるよりもはるかに強く、より普及していることが試験で示されている。また、外因性システムとして、CRISPR及びZFP (RNAiとは異なり)は、マイクロRNAまたは RISC複合機能のような内因性機構と競合しない。従って、RNAiは、RNA合成及び分解の通常の恒常性機構に影響を及ぼすことができる。さらに、CRISPR及びZFP法は、RNAの代わりにゲノムDNAを標的とする。即ち、効果を達成するために、RNAi法は、通常、RNA代謝回転が高いため、薬物動態の見通しが悪く、より高い投与量を必要とする。
研究により、Nav1.7の部分的抑制が疼痛を改善するのに十分であることが示されている。このノックダウンは、後足の炎症により誘発される痛覚過敏の有意な回復を生じるのに役立つ。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いると、器質的疼痛を30～80%のNav1.7抑制レベルで改善することができる。マイクロRNA 30bを用いると、Nav1.7の50%の抑制は、神経障害性疼痛を軽減し、一方、最近では、microRNA182は疼痛を改善し、神経損傷を免れたラットにおけるNaV1.7の過剰発現を予防した。同様に、Nav1.7のshRNAを介したノックダウンは、火傷における過剰発現を予防し、疼痛を和らげた。他の研究では、疼痛を軽減させるのに必要なNav1.7抑制レベルは定量されなかった。さらに、shRNAレンチウイルスベクターは、Nav1.7を40～60%抑制することで、骨癌の疼痛を軽減させることができる。
Nav1.7の役割は、齧歯類のカラギーナン及びCFAモデルのように強い炎症に関連するものを含む、様々な前臨床モデルに関係している。このように、パクリタキセルにより誘導された多重神経障害におけるNav1.7のノックダウンの効果は、本開示のゲノム編集構築物を用いて研究された。以前の研究では、該処置がNaV1.7を誘発することが示された。両方のエピジェネティック抑制因子は、内部比較のガバペンチンと同程度に触覚異痛を改善する。最後に、BzATPのi.t.注入によって誘発された痛覚過敏における本開示のゲノム編集構築物を用いたNaV1.7ノックダウンの役割を評価した。脊髄プリン受容体は、炎症性/切開性疼痛及び種々の神経障害を含む種々の刺激条件によって開始される痛覚受容処理において重要な役割を果たすことが示されている。本研究に示されたように、侵害受容器における求心性NaV1.7発現の抑制が、中枢的に誘発される触覚感受性の増強を抑制することにつながっている。これらの結果の根底にあるメカニズムは、求心性神経におけるNaV1.7の減少がミクログリア及び星状細胞の活性化を最小限に抑えるのに役立つ可能性があるという観察を反映している可能性がある。これらの結果は、Nav1.7を介する疼痛シグナル伝達の少なくとも一部がATPシグナル伝達の下流であることを示唆している。ガバペンチンは、齧歯動物のカラゲナンに誘発された熱痛覚過敏を軽減させるという証拠と、NaV1.7を抑制することが知られているため、陽性対照として選択された。本開示のゲノム編集構築物を使用した結果は、NaV1.7発現レベルに対するガバペンチンの阻害効果を示し、最終的には神経細胞の興奮性を低下させることをもたらした以前の研究と一致している。
本明細書に開示された方法は、本明細書に開示のゲノム編集構築物を用いて、3つの痛覚過敏モデルにおいてNav1.7における脊髄減少の有効性を実証する。本明細書に示された研究は、本開示のゲノム編集構築物を使用する場合、NaV1.7の髄腔内ノックダウン後の明らかな有害事象なしに、有意な標的関与及び明確な治療効果を明確に確立する。NaV1.7が果たす役割は、痛覚受容性求心性神経にあり、それらの細胞体は、それぞれの分節のDRG神経細胞に存在する。従って、DRGはこの遺伝子導入モチーフの標的を表している。髄腔内送達経路は、AAVを標的外の生体内分布の可能性を最小限に抑えるDRG神経細胞に効率的に配置し、形質導入を得るために必要なウイルス量を減少させる。特定の実施形態では、本開示のゲノム編集構築物は、髄腔内投与される。重要なことに、脳脊髄液にB細胞とT細胞が比較的存在しないため、潜在的な免疫応答が最小限に抑えられる。この点に関して、ZFPは、ヒトタンパク質シャッセ上で操作されるので、それらは本質的に、より低い潜在的な免疫原性を有する標的化アプローチを構成する。実際、非ヒト霊長類(NHP)での研究は、非自己タンパク質(AAV9-GFP)の髄腔内送達が自己タンパク質の送達で見られなかった免疫応答を産生したことを見出した。
本明細書に記載の結果は、本開示のゲノム編集構築物が、短期及び長期にわたって好ましい標的関与特性及び有効性を有することを示している。このように、持続性疼痛を制御するための、本開示のゲノム編集構築物を使用する方法が明らかに示されている。本開示のゲノム編集構築物(例えば、KRAB-dCas9及びZFP-KRAB)は、慢性炎症性及び神経障害性疼痛を治療するための、潜在的な臨床治療法としての有望性を示す。これらのシステムは、永久的な疼痛非感受性が望まれないので、慢性疼痛のフレームワークに有利な一過性の遺伝子治療を可能にする。この一過的でありながら数週間にわたる治療は、毎日または数時間ごとに服用する必要があり、かつ望ましくない中毒作用を有しうる既存の薬物と比べて、顕著な利点を示す。まとめると、これらの研究の結果は、私たちの社会における重要かつ益々緊急な問題である慢性疼痛を治療するための有望な新しい道を示している。留意すべきこととして、この治療レジメンは、重要な疼痛表現型、即ち、永続的であるが回復可能な疼痛状態に対処する。3ヶ月以上続く疼痛状態として定義される慢性疼痛は、必ずしも回復不可能ではない。医療進歩のおかけで、この数十年で癌生存者の数は着実に増加している。この増加は、その後の癌関連の副作用の数の増加につながり、化学療法に誘発される多発性神経障害は、最も一般的な有害事象の1つである。この場合、数ヶ月続く治療アプローチは、回復不可能なアプローチよりも好ましい。さらに、時間の経過に伴う複数の脊髄幹麻酔の使用は、硬膜外ステロイドの場合と同様に、臨床的介入の一般的なモチーフであり、硬膜外送達が数か月間隔で1年にわたって繰り返される可能性があります。
従って、本開示は、抑制因子ドメインに融合された亜鉛フィンガー(ZF)及び／または抑制因子ドメインに融合されたdCas9を含む構築物を用いて、疼痛を有する被験者を治療するためのエピジェネティックなアプローチを提供する。ここで、dCas 9は、DNAを切断しないが、ガイド-RNA (gRNA)を介してゲノムに結合する能力を維持する触媒的に不活性化されたCas9である。本明細書に記載のエピジェネティックなアプローチは、永久的な疼痛非感受性が望まれないので、慢性疼痛のフレームワークに有利な一過性の遺伝子治療を可能にする。この一過的でありながら数週間にわたる治療は、毎日または数時間ごとに服用する必要があり、かつ望ましくない中毒作用を有しうる既存の薬物と比べて、顕著な利点を示す。まとめると、該ZF-抑制因子ドメイン構築物及び／またはdCas9-抑制因子ドメイン構築物を用いる、本明細書に記載のエピジェネティックなアプローチは、社会における重要かつ益々緊急な問題である慢性疼痛を治療するための有望な新しい道を提供する。
さらなる実施形態では、前記ZF-抑制因子ドメイン構築物及び/またはdCas9-抑制因子ドメイン構築物は、アデノ関連ウイルス(AAV)によって一括され、発現される。このようなAAVシステムの使用は、手術前に該ウイルスを投与される患者、または患者は一度に約1ヶ月間疼痛を軽減しうる慢性疼痛に使用するために理想的である。特定の実施形態では、前記AAVは、AAV9である。本明細書に示される結果として、本開示のZF-抑制因子ドメイン構築物及び/またはdCas9-抑制因子ドメイン構築物を使用するエピジェネティックなアプローチは、炎症性慢性疼痛モデルにおいて有効であり、神経障害性疼痛、術後の疼痛、片頭痛、及び癌誘発性疼痛を含むが、これらに限定されない他の疼痛様式に使用することができる。さらなる実施形態では、本明細書に記載のZF-抑制因子ドメイン構築物及び/またはdCas9-抑制因子ドメイン構築物は、Nav1.3、Nav1.9、TRPV1/2/3/4、Nav1.8、P2X4、P2X7、Atp1b3、Mapk8、Avpr1a、Calca、Htr1b、Oprm1、Mc1r、Kcnk9、KCNQ、及びTLR2/3を含むが、これらに限定されない他の遺伝子を調節するように設計され得る。
本開示はさらに、特定の投与様式のための、本明細書に記載のZF-抑制因子ドメイン構築物及び/またはdCas9-抑制因子ドメイン構築物を含む医薬組成物及び製剤を提供する。一実施形態では、本明細書に記載のZF-抑制因子ドメイン構築物及び/またはdCas9-抑制因子ドメイン構築物は、薬学的に許容される担体を含む組成物中の活性成分である。このような組成物は、本明細書では医薬組成物と呼ばれる。“薬学的に許容される担体”は、標的の送達組成物を混合し、かつ／または被験者に送達するための任意の薬学的に許容される手段を意味する。本明細書で使用される場合、“薬学的に許容される担体”という用語は、対象の薬剤をある器官または体の一部から別の器官または体の一部に運ぶまたは輸送することに関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入物質のような薬学的に許容される材料、組成物または溶媒を意味する。各担体は、該組成物の他の成分との適合性という意味で、“許容可能”でなければならず、例えばヒトの被験者への投与に適合でなければならない。このような組成物は、本明細書に記載の投与経路のような多数の経路のうちの1つまたは複数を介して投与するために特別に製剤化することができる。補助的な活性成分もまた、該組成物中に組み込むことができる。本明細書に記載の薬剤、製剤または医薬組成物が被験者に投与される場合、好ましくは、治療的有効量で投与される。本明細書で使用される場合、“治療的有効量”という用語は、状況の改善または治療をもたらす量を指す。
被験者への医薬組成物の投与は、その中に含まれるZF-抑制因子ドメイン構築物及び/またはdCas9-抑制因子ドメイン構築物が標的細胞に接触する手段で行われる。特定の経路は、標的細胞等の特定の変動要因によって異なり、当業者によって決定され得る。本明細書に記載のZF-抑制因子ドメイン構築物及び/またはdCas9-抑制因子ドメイン構築物を患者に投与するのに適した方法には、本明細書に記載のZF-抑制因子ドメイン構築物及び/またはdCas9-抑制因子ドメイン構築物を患者に送達するのに適した任意のin vivo投与経路が含まれる。好ましい投与経路は、使用されるウイルス遺伝子治療製剤のタイプ、標的細胞集団、及び被験者の疾患または状態によって異なり、当業者には明らかであろう。in vivo投与の典型的な方法には、静脈内投与、腹腔内投与、髄腔内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、頭蓋内投与、動脈内投与(例えば、頸動脈中に)、皮下投与、経皮送達、気管内投与、皮下投与、関節内投与、脳内投与、吸入(例えば、エアロゾル)、脳内、鼻腔、経口、肺投与、カテーテルの含浸、及び組織への直接注射が含まれるが、これらに限定されない。標的細胞が腫瘍内または腫瘍の近辺にある実施形態では、好ましい投与経路は、該腫瘍またはその周囲組織への直接注射によるものである。例えば、腫瘍が乳癌である場合の好ましい投与方法には、カテーテルの含浸及び腫瘍への直接注射が含まれる。
静脈内、腹腔内、髄腔内、胃内、神経内、頭蓋内、及び筋肉内投与は、当該技術分野における標準的な方法を用いて行うことができる。エアロゾル(吸入)送達は、当該技術分野における標準的な方法を用いて行うこともできる(例えば、Striblingら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189：11277-11281, 1992を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。経口的な送達は、本明細書に記載の亜鉛フィンガー-抑制因子ドメイン構築物を動物の腸内の消化酵素による分解に耐えれる担体に複合化することによって行うことができる。そのような担体の例には、当該技術分野で知られているようなプラスチックカプセルまたは錠剤が含まれる。
局所投与の1つの方法は、直接注射である。直接注入の技術は、本明細書に記載のZF-抑制因子ドメイン構築物及び/またはdCas9-抑制因子ドメイン構築物を、手術によってアクセス可能な細胞または組織、特に、身体の表面上または表面の近くに投与するために特に有用である。標的細胞の領域内に局所的に組成物を投与することは、標的細胞または組織から数センチメートル、好ましくは数ミリメートルから組成物を注入することを指す。例えば、本明細書では、髄腔内投与経路により有利な結果が得られた。
本明細書に記載される治療方法のための適切な用量及び治療レジメンは、治療される特定の疾患、送達する本明細書に記載のZF-抑制因子ドメイン構築物及び/またはdCas9-抑制因子ドメイン構築物、及び被験者の具体的な状態によって異なる。熟練した開業医は、投与量及び頻度を症例ごとに決定する。一実施形態では、投与は、所望の効果(例えば、症状が軽減される)が達成されるまでの期間にわたる。ある実施形態では、投与は、週に1回、2回、3回、4回、5回、6回、または7回である。特定の実施形態では、投与は、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、または10週間にわたる。別の実施形態では、投与は、2ヶ月間、3ヶ月間、4ヶ月間、5ヶ月間、6ヶ月間、またはそれ以上長い期間にわたる。さらに別の実施形態では、治療は、寛解期間後に再開される。
本明細書に記載のZF-抑制因子ドメイン構築物及び/またはdCas9-抑制因子ドメイン構築物は、痛覚受容性疼痛シグナル伝達を阻害する1つまたは複数の他の活性剤と組み合わせて投与することができる。例えば、該ZF-抑制因子ドメイン構築物及び/またはdCas9-抑制因子ドメイン構築物は、単一または複数のgRNAを送達することによって、または、単一または複数の遺伝子に結合するZFを設計することによって、単一または複数の遺伝子を標的とする1つまたは複数の他の薬剤と共に投与することができる。他の遺伝子標的には、P2x3、P2x4、P2x7、Nav1.3、カプサイシン受容体(TRPV1/2/3/4)、TRPA1、SHANK3、電位依存性カルシウムチャネル(Cav2.2、Cav3.1、Cav3.2)が含まれるが、これらに限定されない。図11は、本開示のZF-抑制因子ドメイン構築物及び/またはdCas9-抑制因子ドメイン構築物と組み合わせて阻害され得る他の標的を示している。あるいはまたはさらに、様々な鎮痛剤を本開示のZF-抑制因子ドメイン構築物及び/またはdCas9-抑制因子ドメイン構築物と組み合わせて使用することができる。このような鎮痛剤及び他の疼痛緩和薬は、当該技術分野で公知である。
本明細書に記載の治療用途で使用するために、本明細書では、キット及び製造者の添付文書も記載されている。このようなキットは、バイアルやチューブ等のような１つまたは複数の容器を受け入れるように区画化された担体、パッケージ、または容器を含むことができ、各容器は、本明細書に記載の方法で使用される別個の要素の１つを含む。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。前記容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から成ることができる。
例えば、前記容器は、本明細書に記載の1つまたは複数のZF-抑制因子ドメイン構築物及び/またはdCas9-抑制因子ドメイン構築物を、任意に組成物としてまたは本明細書に開示される別の薬剤と組み合わせて含むことができる。前記容器は、任意に無菌のアクセスポート(例えば、該容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパを有する静脈用溶液のバッグまたはバイアルであってもよい)を有していてもよい。このようなキットは、本明細書に開示される化合物を、任意に、本明細書に記載の方法におけるその使用に関連する識別の説明、ラベル、または取扱説明書と共に含む。
キットは、典型的には、1つまたは複数の他の容器を含み、各々は、本明細書に記載の化合物の使用のための商業的及びユーザの観点からの望ましい1つまたは複数の様々な材料(例えば、任意に濃縮された形態での試薬、及び/または装置)を含む。このような材料の例には、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器、担体、パッケージ、容器、内容物及び/または使用説明書を記載したバイアル及び/またはチューブラベル、及び使用説明付きの添付文書が含まれるが、これらに限定されない。通常、説明書のセットも含まれる。
ラベルは、容器上にあってもよく、または容器に関連付けられてもよい。ラベルを形成する文字、数字、またはその他の文字が容器自体に取り付けられたり、成形されたり、エッチングされたりする場合に、ラベルは容器上にあってもよい。ラベルは、例えば添付文書として、容器を保持する入れ物または担体内に存在する場合、容器に関連付けられてもよい。ラベルは、その内容物が特定の治療用途に使用されることを示すために使用できる。ラベルは、本明細書に記載の方法等、内容物の使用方法を示すこともできる。これらの他の治療薬は、例えば、医師用卓上参考文献（PDR）に示されている量で、または当業者によって決定された量で使用できる。
上記及び以下の実施例を考慮して、本開示は、以下に例示されるいくつかの態様を提供する。
態様1 転写抑制因子に融合され、少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)に関連付けられ、核酸分解酵素が不活性化されたCas9(dCas9)タンパク質を含む、組換え遺伝子抑制因子複合体。ここで、該gRNAが、TRPV1/2/3/4、P2XR3、TRPM8、TRPA1、P23X2、P2RY、BDKRB1/2、Hlr3A、ACCNs、TRPV4、TRPC/P、ACCN1/2、SCN1/3/8A/9A、SCN10A、SCN11A、KCNQ、BDNF、OPRD1/K1/M1、CNR1、GABRs、TNF、PLA2、IL1/6/12/18、COX-2、NTRK1、NGF、 GDNF、TNF、LIF、CCL1、CNR2、TLR2/4、P2RX47、CCL2、CX3CR1、BDNF、NR1/2、GR1A1-4、GRC1-5、NK1R、CACNA1A-S、及びCACNA2D1からなる群から選択された遺伝子産物をコードする標的核酸配列に特異的にハイブリダイズし、該遺伝子産物の発現が阻害される。
態様2 前記標的核酸配列が、染色体2の2q24.3の位置にある、態様1に記載の組換え遺伝子抑制因子複合体。
態様3 前記gRNAが、11～107のいずれか1つに示される配列によってコードされる配列を含む、態様1または2に記載の組換え遺伝子抑制因子複合体。
態様4 前記gRNAが、SCN9A産物(Nav1.7)をコードする核酸配列に特異的にハイブリダイズする、態様１～3のいずれか1つに記載の組換え遺伝子抑制因子複合体。
態様5 前記転写抑制因子が、mSin3相互作用ドメイン(SID)タンパク質、メチル-CpG結合ドメイン2(MBD2)、MBD3、DNAメチル基転移酵素(DNMT)1(DNMT1)、DNMT2A、DNMT3A、DNMT3B DNMT3L、網膜芽細胞腫タンパク質（Rb）、メチルCpG結合タンパク質2（Mecp2）、GATA 1の友（Fog1）、MAT2の制御因子（ROM2）、シロイヌナズナHD2Aタンパク質（AtHD2A）、リジン特異的脱メチル化酵素1（LSD1）、及びクリュッペル関連ボックス（
Figure 2022526398000011
, KRAB）からなる群から選択される、態様1～4のいずれか1つに記載の組換え遺伝子抑制因子複合体。
態様6 前記転写抑制因子ドメインが、KRABドメインである、態様5に記載の組換え遺伝子抑制因子複合体。
態様7 態様1～6のいずれか1つに記載の組換え遺伝子抑制因子複合体の1つまたは複数の成分をコードする、ポリヌクレオチド。
態様8 前記ポリヌクレオチドが、ヒト細胞における発現に最適化されたコドンである、態様7に記載のポリヌクレオチド。
態様9 態様7または8に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
態様10 前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結される、態様9に記載のベクター。
態様11 前記プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、CAGプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV）LTRプロモーター/転写促進因子、SV40プロモーター、EF1-αプロモーター、CMV即時/初期遺伝子転写促進因子/CBAプロモーター、Nav1.7プロモーター、Nav1.8プロモーター、Nav1.9プロモーター、TRPV1プロモーター、シナプシンプロモーター、カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIプロモーター、チューブリンαIプロモーター、神経特異性エノラーゼプロモーター、及びグリア原線維酸性タンパク質(GFAP)プロモーターからなる群から選択される、態様10に記載のベクター。
態様12 前記ベクターが、少なくとも1つのガイドRNAコード配列の上流にpolIIIプロモーターを含む、態様9に記載のベクター。
態様13 前記polIIIプロモーターが、U6及びH1プロモーターから選択される、態様12に記載のベクター。
態様14 調節制御配列をさらに含む、態様9～13のいずれか1つに記載のベクター。
態様15 前記調節制御配列が、ウッドチャック型肝炎ウイルス後転写調節因子(WPRE)である、態様14に記載のベクター。
態様16 前記ベクターが、組換えアデノ関連ウイルスベクター(rAAVベクター)である、態様9～15のいずれか1つに記載のベクター。
態様17 前記rAAVが、AAV1、AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3、AAV3(Y705+731F)、AAV4、AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6(VP3変異体Y705F/Y731F/T492V)、AAV7、AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3変異体Y731F)、AAV10、AAV10(Y733F)、AAV-ShH10、AAV11、AAV12、及び自己相補的ベクター(scAAV)からなる群から選択される、態様16に記載のベクター。
態様18 前記ポリヌクレオチドが、1つまたは複数の反転反復(ITR)を含む、態様16に記載のベクター。
態様19 前記ポリヌクレオチドまたはベクターが、ポリA配列を含む、態様9～18のいずれか1つに記載のベクター。
態様20 前記ポリヌクレオチドが、細胞における1つまたは複数の成分を発現するように操作される、態様9に記載のベクター。
態様21 前記ベクターが、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである、態様9に記載のベクター。
態様22 前記ベクターが、分割dCas9ベクター系を含む、態様9に記載のベクター。
態様23 前記ベクターが、配列番号:2に示されるような配列を有するdCas9をコードする核酸を含む、態様9または22に記載のベクター。
態様24 前記ベクターが、配列番号:7のKRAB配列をコードする核酸を含む、態様9または23に記載のベクター。
態様25 前記分割ベクター系が、配列番号:3、4及び10から選択されるベクター配列を含む、態様22～24のいずれか1つに記載のベクター。
態様26 転写抑制因子に結合された操作された亜鉛フィンガーDNA結合ドメインを含む亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物であって、ここで、該亜鉛フィンガーDNA結合ドメインが、1～6個の亜鉛―フィンガー配列を含み、該亜鉛フィンガー配列が、TRPV1/2/3/4、P2XR3、TRPM8、TRPA1、P23X2、P2RY、BDKRB1/2、Hlr3A、ACCNs、TRPV4、TRPC/P、ACCN1/2、SCN1/3/8A/9A、SCN10A、SCN11A、KCNQ、BDNF、OPRD1/K1/M1、CNR1、GABRs、TNF、PLA2、IL1/6/12/18、COX-2、NTRK1、NGF、GDNF、TNF、LIF、CCL1、CNR2、TLR2/4、P2RX47、CCL2、CX3CR1、BDNF、NR1/2、GR1A1-4、GRC1-5、NK1R、CACNA1A-S、及びCACNA2D1からなる群から選択された遺伝子産物をコードする遺伝子において標的核酸配列に結合し、該遺伝子産物の発現が阻害される。
態様27 前記標的核酸配列が、表2に示されている配列である、態様26に記載の亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物。
態様28 前記転写抑制因子が、mSin3相互作用ドメイン(SID)タンパク質、メチル-CpG結合ドメイン2(MBD2)、MBD3、DNAメチル基転移酵素(DNMT)1(DNMT1)、DNMT2A、DNMT3A、DNMT3B DNMT3L、網膜芽細胞腫タンパク質（Rb）、メチルCpG結合タンパク質2（Mecp2）、GATA 1の友（Fog1）、MAT2の制御因子（ROM2）、シロイヌナズナHD2Aタンパク質（AtHD2A）、リジン特異的脱メチル化酵素1（LSD1）、及びクリュッペル関連ボックス（
Figure 2022526398000012
, KRAB）からなる群から選択される、態様26または27に記載の亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物。
態様29 態様26、27または28に記載の亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物をコードする、ポリヌクレオチド。
態様30 前記ポリヌクレオチドが、ヒト細胞における発現に最適化されたコドンである、態様29に記載のポリヌクレオチド。
態様31 態様29または30に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
態様32 前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結される、態様31に記載のベクター。
態様33 前記プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、CAGプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV）LTRプロモーター/転写促進因子、SV40プロモーター、EF1-αプロモーター、CMV即時/初期遺伝子転写促進因子/CBAプロモーター、Nav1.7プロモーター、Nav1.8プロモーター、Nav1.9プロモーター、TRPV1プロモーター、シナプシンプロモーター、カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIプロモーター、チューブリンαIプロモーター、神経特異性エノラーゼプロモーター、及びグリア原線維酸性タンパク質(GFAP)プロモーターからなる群から選択される、態様32に記載のベクター。
態様34 調節制御配列をさらに含む、態様31、32または33に記載のベクター。
態様35 前記調節制御配列が、ウッドチャック型肝炎ウイルス後転写調節因子(WPRE)である、態様34に記載のベクター。
態様36 前記ベクターが、組換えアデノ関連ウイルスベクター(rAAVベクター)である、態様31～35のいずれか1つに記載のベクター。
態様37 前記rAAVが、AAV1、AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3、AAV3(Y705+731F)、AAV4、AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6(VP3変異体Y705F/Y731F/T492V)、AAV7、AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3変異体Y731F)、AAV10、AAV10(Y733F)、AAV-ShH10、AAV11、AAV12、及び自己相補的ベクター(scAAV)からなる群から選択される、態様36に記載のベクター。
態様38 前記ポリヌクレオチドが、1つまたは複数の反転反復(ITR)を含む、態様31～37のいずれか1つに記載のベクター。
態様39 前記ポリヌクレオチドが、ポリA配列を含む、態様31～38のいずれか1つに記載のベクター。
態様40 前記核酸が、細胞において1つまたは複数の成分を発現するように操作される、態様31に記載のベクター。
態様41 前記ベクターが、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである、態様31に記載のベクター。
態様42 前記ベクターが、配列番号:7のKRAB配列をコードする核酸を含む、態様31に記載のベクター。
態様43 被験者における慢性疼痛を治療またはコントロールするための、エピジェネティックに基づいた方法であって、有効量の態様1～6のいずれか1つに記載の複合体、態様9～25のいずれか1つに記載のベクター、態様26～28のいずれか1つに記載の構築物、または態様31～42のいずれか1つに記載のベクターを投与することを含む、方法。
態様44 治療を必要とする被験者における疼痛を治療またはコントロールするための、エピジェネティックに基づいた方法であって、有効量の亜鉛フィンガー－抑制因子の構築物及び/またはdCas9－抑制因子ドメインの複合体を該被験者に投与することを含み、ここで、該dCas9が、DNAを切断しないが、ガイド-RNA (gRNA)を介してゲノムに結合する能力を維持する、触媒的に不活性化されたCas9である、方法。
態様45 前記疼痛が、神経障害性疼痛、痛覚受容性疼痛、異痛症、炎症性疼痛、炎症性痛覚過敏、神経障害、神経痛、糖尿病性神経障害、ヒト免疫不全ウイルス関連神経障害、神経損傷、関節リウマチ性疼痛、関節炎性疼痛、火傷、背痛、眼痛、内臓痛、癌疼痛、骨癌疼痛、片頭痛、手根管症候群による疼痛、線維筋痛、神経炎性疼痛、シアチカ性疼痛、骨盤過敏症の疼痛、骨盤疼痛、帯状疱疹後神経痛の疼痛、術後の疼痛、脳卒中後の疼痛、及び月経痛から選択される、態様44に記載の方法。
態様46 前記疼痛が、神経障害性末梢神経障害、糖尿病性神経障害、食後神経痛、三叉神経痛、背中のケガ、癌神経障害、HIV神経障害、四肢損失、手根管症候群、脳卒中、アルコール依存症、甲状腺機能亢進症、尿毒症、多発性硬化症、脊髄損傷、パーキンソン病、及びてんかんからなる群から選択される疾患または障害に関連する、態様44に記載の方法。
態様47 前記方法が、慢性疼痛を有する被験者を治療するために使用される、態様44に記載のエピジェネティックな方法。
態様48 前記亜鉛フィンガー－抑制因子の構築物が、mSin3相互作用ドメイン(SID)タンパク質、メチル-CpG結合ドメイン2(MBD2)、MBD3、DNAメチル基転移酵素(DNMT)1(DNMT1)、DNMT2A、DNMT3A、DNMT3B DNMT3L、網膜芽細胞腫タンパク質（Rb）、メチルCpG結合タンパク質2（Mecp2）、GATA 1の友（Fog1）、MAT2の制御因子（ROM2）、シロイヌナズナHD2Aタンパク質（AtHD2A）、リジン特異的脱メチル化酵素1（LSD1）、及びクリュッペル関連ボックス（
Figure 2022526398000013
, KRAB）からなる群から選択される抑制因子ドメインを含む、態様44～47のいずれか1つに記載のエピジェネティックな方法。
態様49 前記抑制因子ドメインが、KRABを含む、態様48に記載のエピジェネティックな方法。
態様50 前記亜鉛フィンガー－抑制因子の構築物が、表2の標的に結合する、態様44～49のいずれか1つに記載のエピジェネティックな方法。
態様51 前記dCas9－抑制因子ドメインの複合体が、mSin3相互作用ドメイン(SID)タンパク質、メチル-CpG結合ドメイン2(MBD2)、MBD3、DNAメチル基転移酵素(DNMT)1(DNMT1)、DNMT2A、DNMT3A、DNMT3B DNMT3L、網膜芽細胞腫タンパク質（Rb）、メチルCpG結合タンパク質2（Mecp2）、GATA 1の友（Fog1）、MAT2の制御因子（ROM2）、シロイヌナズナHD2Aタンパク質（AtHD2A）、リジン特異的脱メチル化酵素1（LSD1）、及びクリュッペル関連ボックス（
Figure 2022526398000014
, KRAB）からなる群から選択される抑制因子ドメインを含む、態様44～47のいずれか1つに記載のエピジェネティックな方法。
態様52 前記抑制因子ドメインが、KRABを含む、態様51に記載のエピジェネティックな方法。
態様53 前記dCas9－抑制因子ドメインの構築物が、配列番号:11～106及び107から選択される配列を有するガイドRNAスペーサー配列を含む、態様44～47または51～52のいずれか1つに記載のエピジェネティックな方法。
態様54 前記亜鉛フィンガー－抑制因子の構築物及び／またはdCas9－抑制因子ドメインの構築物が、電位依存性ナトリウムチャネルの非永続的な遺伝子抑制を提供する、態様44～53のいずれか1つに記載のエピジェネティックな方法。
態様55 前記電位依存性ナトリウムチャネルが、NaV1.7、NaV1.8、及びNaV1.9から選択される、態様54に記載のエピジェネティックな方法。
態様56 前記電位依存性ナトリウムチャネルが、NaV1.7である、態様55に記載のエピジェネティックな方法。
態様57 前記亜鉛フィンガー－抑制因子の構築物及び／またはdCas9－抑制因子ドメインの構築物が、組換えウイルスまたはベクターによって一括され、送達される、態様44～56のいずれか1つに記載のエピジェネティックな方法。
態様58 前記組換えウイルスが、アデノウイルス、ガンマレトロウイルス、アデノ関連ウイルス(AAV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、またはレンチウイルスである、態様57に記載のエピジェネティックな方法。
態様59 前記組換えウイルスが、AAV1、AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3、AAV3(Y705+731F)、AAV4、AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6(VP3変異体Y705F/Y731F/T492V)、AAV7、AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3変異体Y731F)、AAV10、AAV10(Y733F)、AAV-ShH10、AAV11、AAV12、及び自己相補的ベクター(scAAV)からなる群から選択される、態様57に記載のエピジェネティックな方法。
態様60 前記亜鉛フィンガー－抑制因子の構築物及び／またはdCas9－抑制因子ドメインの構築物が、静脈内、腹腔内、髄腔内、神経節内、神経内、頭蓋内、または筋肉内に投与される、態様44～59のいずれか1つに記載のエピジェネティックな方法。
以下の実施例は、説明を意図するが、本開示を限定するものではない。これらは、使用しうる典型的なものであるが、当業者に公知される他の方法を使用してもよい。
ベクトルの設計と構築
Cas9及び亜鉛-フィンガーAAVベクターを、対応する遺伝子ブロック（統合されたDNA 技術）を習慣的に合成されたrAAV2ベクター骨格に順次に組み立てることによって構築した。スペーサーをコードするオリゴヌクレオチド（IDT）を、ギブソンアセンブリを介してAgeIクローニング部位にクローニングすることにより、gRNA配列をdNCas9プラスミドに挿入した。in silicoツールを利用してgRNAs73を予測するようにgRNAを設計した。
哺乳動物細胞の培養
ニューロ2a細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)及び1%抗生物質-抗真菌を補充したEMEM(Thermo Fisher Scientific)の中、37℃及び5%CO2雰囲気下で増殖させた。
脂質媒介細胞の遺伝子導入
遺伝子導入の1日前に、ニューロ2a細胞を、1ウェル当たり1または2E+5細胞の細胞密度で24ウェルプレートに播種した。0.5 mLの各プラスミドを25 μLのOpti-MEM培地に添加し、続いて2 μLのリポフェクタミン2000を含有する25 μLのOpti-MEM を添加した。該混合物を室温で15分間インキュベートした。次いで溶液の全量を24ウェルプレート中の細胞に加えて、プレートを穏やかに旋回させ、混合した。24時間後に培地を変え、プレートを5%CO2インキュベーター中、37℃で72時間インキュベートした。細胞を回収し、遠心沈殿し、-80℃で凍結した。
AAVの産生
ソーク生物学研究所（La Jolla, CA）において遺伝子導入、標的化及び治療（GT3）コアによってウイルスを調製し、またはGT3コアプロトコルを自家利用してウイルスを調製した。簡単に述べると、HEK293T細胞を用いて、トリプル遺伝子導入法でAAV2/1、AAV2/5、及びAAV2/9ウイルス粒子を生成し、イオジキサノール勾配で精製した。遺伝子導入時の培養密度は、80%～90%であった。遺伝子導入の2時間前に、培地を予熱した媒体で置き換えた。5枚の15 cmプレートで各ウイルスを産生し、ポリエチレンイミン(PEI；1 mg/mLの線状PEIのDPBS溶液、[pH 4.5]、HCl使用)を用いて、PEI：DNA質量比4：1で、各プレートを10 μgのpXR-キャプシド(pXR-1、pXR-5、及びpXR-9)、10 μgの組換え転写ベクター、及び10 μgのヘルパーベクターで遺伝子導入した。該混合物を室温で10分間インキュベートし、次いで培地に滴下した。72時間後にウイルスを回収し、イオジキサノール密度勾配の超遠心分離法を用いて精製した。次いで、50-kDaフィルター（Millipore）を用いて最終容量を約100 μLにし、50 mM NaCl及び0.0001％のPluronic F68（Thermo Fisher Scientific）を添加した1x PBS(pH 7.2)でウイルスを透析し、ITR領域に特異的なプライマーを使用したqPCRにより、標準（ATCC VR-1616）：AAV-ITR-F:5'-CGGCCTCAGTGAGCGA-3'(配列番号:127)及びAAV-ITR-R:5'-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3'(配列番号128）に対して定量した。
動物実験
全ての動物操作は、カリフォルニア大学サンディエゴ校の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたプロトコルに従って行った。全てのマウスをJackson Laboratoryから入手した。生後2ヶ月の成体雄C57BL/6マウス（25～30 g）を、ケージあたり最大5匹のマウスを用いた12時間の明暗サイクルの下で、餌と水を自由に与えて飼育した。全ての行動試験は、明るいサイクル期間中に行った。
AAVの髄腔内注射
右眼反射の損失が観察されるまで、密閉チャンバ内の等量のO2及び室内空気中で送達された2.5%イソフルランで麻酔を誘導した。マウスの下背部を剃り、70%エタノールを塗布した。次いで、前述(104)のように、ハミルトン注射器及び30G針を用いて、脊椎L4とL5の間に、5 μLのAAVを合計1E+12 vg/マウスで、マウスに髄腔内注射(i.t.)した。尾のちらつきは、針の配置が適切であることの指標とみなされた。注射後、全てのマウスは、i.t.注射前に観察されたように運動を再開した。
疼痛モデル
カラゲナンの足底内注射：カラゲナン誘導炎症は、浮腫形成及び痛覚過敏症(105～107)の古典的なモデルである。AAV前処理の21日後、上記のように麻酔を誘導した。λカラゲナン(Sigma Aldrich；2%(W/V)、0.9%(W/V)NaCl溶液に溶解したもの、20 μL)を30G針で同側足の底部(腹)表面に皮下注射した。同量の等張食塩水を反対側の足に注射した。浮腫/炎症の指標として、カラゲナン/生理食塩水注射の前及び4時間後に、ノギスで足の厚さを計測した。注射前(t=0)及び注射後(t=30、60、120、240分、及び24時間)に、Hargreaves試験を行った。実験者は、処置群の構成について目隠しされた。24時間後、マウスを安楽死させた。
パクリタキセル誘発性神経障害：パクリタキセル(Tocris Biosciences, 1097)を エタノール、Cremophor EL (Millipore, 238470)、及び滅菌0.9%(W/V)NaCl溶液の1：1：18(v/v)混合物に溶解した。パクリタキセル注射剤（8 mg/kg）を1 mL/100 g体重の容量で1日おきに腹腔内（i.p.）投与し、合計4回注射して神経障害（32 mg/kg）を誘発し、前述のようにヒトでの累積投与量28.4～113.5 mg/m2に相当するものをもたらした。最終投与の24時間後に行動試験を行った。
BzATPの髄腔内注射：BzATP(2'(3')-O-(4-ベンゾイルベンゾイル)アデノシン5'-三リン酸トリエチルアンモニウム塩)をMillipore Sigmaから購入し、以前の試験に基づいて、生理食塩水(0.9%NaCl)に溶解し、最終濃度30 nmolにした。該食塩水は、溶媒対照としても使用し、両者を5 μlの体積で注射した。ハミルトン注射器に取り付けられた30ゲージ針を用いて、イソフルラン(2.5%)麻酔下で腰椎穿刺により髄腔内注射した。
行動試験
試験前に、マウスを行動及び実験室に少なくとも30分間慣れさせた。陽性対照として、ガバペンチン(Sigma, G154)を生理食塩水に溶解し、100 mg/kg/マウスでi.p.注入した。
熱による引っ込め潜時(Hargreaves試験)：急性痛覚受容性の熱閾値を測定するために、足底用の試験装置(Ugo Basile, Italy))を用いてHargreaves試験を行った。試験の40分間前に、動物を透明なプラスチック収納容器(直径6 cm×高さ16 cm)の中で、ガラス床の上に自由にさせた。次いで、移動式の放射熱源をガラス床の下に配置し、後足に集束させた。30秒のカットオフ時間で引っ込め潜時を測定した。IR強度40を使用した。10分間隔で各後足に3回の熱刺激を繰り返し、足引っ込め潜時の平均を得た。実験者は、処置群の構成について目隠しされた。
触覚異痛：BzATP疼痛モデルについて、BzATP注射の30分、1時間、2時間、3時間、6時間、及び24時間後に触覚閾値(異痛)を評価した。パクリタキセルモデルについて、パクリタキセルの最終注入の24時間及び29日後に触覚閾値(異痛)を評価した。試験の45分間前、順化のためにマウスを透明なプラスチックワイヤーメッシュ底のケージに入れた。前記のように、2.44～4.31(0.04～2.00 g)のフォンフレイフィラメント(Seemes Weinstein von Frey麻酔器；Stoelting Co., Wood Dale, IL, USA)を用いてアップダウン法で引っ込め閾値の50%確率を評価した。
冷感異痛
後足の足底表面にアセトンの液滴を塗布し、冷感異痛を測定した。マウスを個別のプラスチックケージの上昇プラットフォームの上に入れ、探査行動が終了するまで少なくとも30分間慣れさせた。針先端のないシリンジバレルにアセトンを装填した。次いで、1滴のアセトン(約20 μL)を、メッシュプラットフォームを介して後足の足底表面に塗布した。シリンジバレルと足との接触を介して器質的な刺激を誘発しないように足上の皮膚にアセトンの泡を穏やかに塗布するように注意した。アセトン塗布後60秒間の観察期間における足の引っ込め時間を記録した。足を引っ込める挙動は、足の急速なちらつき、びびり、噛み込み、及び/または足を舐めること等の二次的な動物応答と関連付けした。試験順序は、各足について5回の測定が行われるまで、左右の足で交互した。左右の足の試験の間に5分間の相互刺激の間隔を与えた。
組織の採取
カラゲナン投与の24時間後、水圧抽出（断頭後に脊柱管に配置された短い鈍い20ゲージの針を通して2 mLの氷食塩水を注入）で脊髄を採取した。脊髄組織を採取した後、各側のL4～L6のDRGを合わせて、脊髄を凍結した。試料をDnase/Rnaseを含まない1.5 mL遠心分離管に入れ、ドライアイスで急速に凍結した後、将来の分析のために-80℃で保存した。
遺伝子発現解析及びqPCR
ニューロ2a細胞からのRNAをRneasy Kit (QIAGEN；74104)で抽出し、DRGからのRNAをRneasy Micro Kit (QIAGEN；74004)で抽出した。Protoscript II逆転写酵素キット(NEB；E6560L)を用いてRNAからcDNAを合成した。KAPA SYBR Fast qPCR Kit(Kapa Biosystem, KK4601)を用いて、遺伝子特異的プライマーとのリアルタイムPCR(qPCR)反応を技術的に3通りで及び生物学的(ニューロ2a細胞)に3通り実施した。相対的mRNA発現をGAPDHレベルに規準化し、比較CT(ΔΔCT)法を用いて倍率変化を計算し、GAPDHに規準化した。マイクロソフトエクセルを用いて平均倍率変化及びSDを計算した。
ウエスタンブロット
ニューロ2a細胞を解凍し、プロテアーゼ阻害剤（Sigma P8849）を添加したRIPA緩衝液（25 mM Tris HCl pH 7.6、150 mM NaCl、1%NP-40、1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS; Thermo Fisher 89900）を使用してタンパク質抽出を行った。BCAタンパク質アッセイキット（Thermo Fisher 23225）で総タンパク質を定量し、40 μgのタンパク質を4～15%ポリアクリルアミドゲル（BioRad 4561085）に負荷した。タンパク質をPVDF膜（Thermo Fisher IB401001）に転写し、該膜をTBS-T（Thermo Fisher、28358、0.1%（V/V）Tween-20、BioRad 1610781を添加）に溶解した5%（W/V）ブロッティング級の遮断剤（Biorad 1706404）で遮断した。次に、該膜を一次抗体（1：1000に希釈した抗NaV1.7（Abcam; ab85015）及び1：4000に希釈した抗GAPDH（Cell Signaling, 2118））とともに4℃で一晩インキュベートした。そして、該膜をTBS-Tで3回洗浄し、1：20000に希釈した抗ウサギ西洋ワサビ過酸化酵素抱合体の二次抗体（Cell Signaling, 7074）とともに室温で1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、SuperSignal West Femto化学発光基質（Thermo Fisher）でブロットを可視化し、X線フィルム上に可視化した。
RNAscope ISHアッセイ
Advanced Cell Diagnostics（Hayward, CA）によってmCherry、NaV1.7、及びNeuNプローブを設計した。1480～2138 bp（KF450807.1、C1チャネル）を検出するようにmCherryプローブ（ACDカタログ番号404491）を設計し、ハツカネズミNaV1.7 mRNA配列（NM_018852.2、C3チャネル）の3404～4576 bpを検出するようにNaV1.7（ACDカタログ番号313341）を設計し、また、ハツカネズミNeun遺伝子（NM_001039167.1、C2チャネル）の1827～3068 bpを標的にするようにNeuNプローブ（ACDカタログ番号313311）を設計した。切片する前に、室温でDRGを4%PFAに2時間入れ、続いて30%蔗糖中、4℃で一晩インキュベートした。組織を切片し（厚さ12 μm）、正に帯電した顕微鏡用ガラススライド（Fisher Scientific）に載せた。全ての雑種形成及び増幅のステップは、ACD RNAscope V2固定組織プロトコルに従って行った。染色したスライドを蛍光封入剤（ProLong Gold退色防止剤P36930; Life Technologies）でカバースリップし、Zeiss 880 Airyscan Confocalを用いて倍率20でデジタル画像にスキャンした。ZENソフトウェア（メーカー提供）を用いてデータを処理した。
統計分析
結果は、平均+/-標準誤差(SE)として表示する。統計分析は、GraphPad Prism（Ver.8.0, GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を用いて行った。スチューデントのt検定(2群間の差異の場合)、1元配置分散分析(複数群の場合)、またはBonferroni事後検定(複数群の経時的実験の場合)を用いた2元配置分散分析を用いて結果を分析した。群間差p<0.05の場合は、統計的に有意であると見なされた。
分割ベクターの設計及び構築
分割-Cas9/dCas9 AAVベクターを、対応する遺伝子ブロック(統合されたDNA技術)を習慣的に合成されたrAAV2ベクター骨格に順次に組み立てることによって構築した。スペーサーをコードするオリゴヌクレオチド（IDT）を、ギブソンアセンブリを介してAgeIクローニング部位にクローニングすることにより、gRNA配列をNCas9またはdNCas9プラスミドに挿入した。
AAVの産生
簡単に説明すると、HEK293T細胞を用いて、三重遺伝子導入法でAAV2/9及びウイルス粒子を産生し、イオジキサノール勾配で精製した。遺伝子導入時の培養密度は、80%～90%であった。遺伝子導入の2時間前に、培地を予熱した培地と交換した。各ウイルスを5x15 cmのプレートで産生し、ここで、ポリエチレンイミン(PEI；1 mg/mLの線状PEIの1DPBS溶液、[pH 4.5]、HCl使用)を用いて、PEI：DNA質量比4：1で、各プレートを7.5 mgのpXR-キャプシド（pXR-9）、7.5 mgの組換え転写ベクター、及び22.5 mgのpAd5ヘルパーベクターで遺伝子導入した。該混合物を室温で10分間インキュベートし、次に培地に滴下した。72時間後に該ウイルスを回収し、イオジキサノール密度勾配の超遠心分離法を使用して精製した。次に、100-kDaフィルター（Millipore）を用いて最終容量を1 mLにし、50 mM NaCl及び0.0001%のPluronic F68（Thermo Fisher Scientific）を添加した1 PBS（pH7.2）で該ウイルスを透析した。
AAVの注射
AAV注射は、成体C57BL/6Jマウス（10週齢）において、分割Cas9の1E+12 vg/マウス（総ウイルス2E+12 vg/マウス）またはZFの1E+12 vg/マウスのいずれかを用いて、髄腔内注射により行った。
強力なNav1.7抑制を確立するために、KRAB-dCas9及びZFP-KRAB構築物を用いて、in vitroでのNav1.7抑制効果を比較した。これに向けて、染色質の位置と配列の特徴に基づいて非常に効果的なgRNAを予測するin silicoツールによって設計された10個のガイドRNA（gRNA;表3）を分割dCas9プラットフォームにクローン化した。また、複数のgRNAを使用することでより高い効率を達成できるため、最も効率が高いと予測された2つのgRNA（SCN9A-1及びSCN9A-2）も単一の構築物にクローン化した。次に、Nav1.7 DNA配列を標的とする4つのZFP-KRAB構築物を設計した（表4）。これらの構築物を、Nav1.7（ニューロ2a）を発現するマウス神経芽細胞腫細胞株に遺伝子導入し、Nav1.7をqPCRでGAPDHに対して抑制した。10個のgRNAのうち6個は、非標的gRNA対照と比較してNav1.7転写産物を50%以上抑制した。そのうち、gRNA-2が最も高い抑制(56%)をもつ単一gRNAであり、二重gRNAの抑制レベルは71%（p<0.0001）であった。これらをその後のin vivo研究に利用した（図5A）。ZFP-KRAB設計の中で、亜鉛-フィンガー-4-KRAB構築物は、その後のin vivo研究で選択された陰性対照（mCherry）と比較して、最も高い抑制（88%; p<0.0001）を示した（図5A）。ウエスタンブロッティングにより、亜鉛-フィンガー-4-KRAB群及びKRAB-dCas9-二重gRNA群の両方で対応するタンパク質レベルの低下が確認された（図5B）。
表3：CRISPR-Cas9ガイドRNAスペーサー配列
Figure 2022526398000015
表4：亜鉛フィンガータンパク質ゲノム標的配列
Figure 2022526398000016
in vitroでのNav1.7抑制を確立した後、カラゲナン誘発性の炎症性疼痛モデルにおけるin vitroスクリーニング（亜鉛フィンガー-4-KRAB及びKRAB-dCas9-二重gRNA）からの最良のZFP-KRAB及びKRAB-dCas9構築物の有効性を試験した。1E+12 vg/マウスのAAV9-mCherry（陰性対照; n=10）、AAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRAB（n=10）、AAV9-KRAB-dCas9-gRNA無し（陰性対照; n=10）、及びAAV9-KRAB-dCas9-二重gRNA（n=10）をマウスに髄腔内（i.t.）注射した。有意な神経細胞指向性を有するAAV9の髄腔内送達は、DRGを効率的に標的化するのに役立つ（図6A）。21日後、熱痛感受性を測定して、ベースライン応答閾値を確立した。マウスの4つの群全てについて、片方の後足にカラゲナン（同側）を注射して炎症を誘発し、もう一方の後足（対側）に生理食塩水を注射してマウス内対照とした。次に、カラゲナン注射の30分、1時間、2時間、4時間、及び24時間後に、マウスの熱痛感受性を試験した（図1B）。カラゲナン投与の24時間後、マウスを安楽死させ、DRG（L4～L6）を抽出した。qPCRでNav1.7の発現レベルを測定し、AAV9-mCherryを注射したマウスと比較して、AAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRAB（67%; p=0.0008）を注射したマウス、また、AAV9-KRAB-dCas9-gRNA無しを注射したマウスと比較して、AAV9-KRAB-dCas9-二重gRNA（50%; p=0.0033）を注射したマウスではではNav1.7の有意な抑制が観察された（図1C）。カラゲナンと生理食塩水を注射した両方の足について平均足引っ込め潜時（PWL）を計算し（図6B-C）、総平均PWLの曲線下面積（AUC）を計算した。予想したように、生理食塩水を注射した足と比較して、カラゲナンを注射した足は熱痛覚過敏を発症し、熱刺激の適用後のPWLの減少によって測定された（図1D）。また、AAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRABまたはAAV9-KRAB-dCas9-二重gRNAのいずれかを注射したマウスでPWLの有意な増加が観察された。これは、マウスDRGにおけるNav1.7の抑制が、炎症性疼痛状態における熱痛覚過敏の低下につながることを示している。対照（炎症を起こしていない足）の熱潜時は、AAV処置群の中で有意差はなかった。これは、Nav1.7のノックダウンが通常の熱感受性に最小限の影響しか及ぼさなかったことを示している。浮腫/炎症の指標として、カラゲナン注射の前及び最も高い熱痛覚過敏の時点である注射の4時間後に、同側及び対側の足をノギスで計測した。有意な浮腫形成が実験群と対照群の両方で観察された。これは、Nav1.7抑制が炎症に影響を及ぼさないことを示している（図6D）。
炎症性疼痛のカラゲナンモデルにおけるZFP-KRABの熱痛覚過敏改善の有効性を検証するために、別の実験を行い、陽性対照として低分子薬ガバペンチンを試験した。マウスに、AAV9-mCherry (n=5)、AAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRAB (n=6)、または生理食塩水(n=5)を1E+12vg/マウスの投与量で注射した。21日後、前述したように全てのマウスについて熱痛覚を測定した。カラゲナン投与の1時間前、髄腔内生理食塩水を投与されたマウスに、ガバペンチン(100 mg/kg)を腹腔内(i.p.)注射し、陽性対照とした。該薬剤は、電位依存性カルシウムチャネルの脊髄α2δサブユニットに結合することにより、齧歯類中のカラゲナン誘導性の熱痛覚過敏を減少させることが知られている。カラゲナン投与の24時間後、マウスを安楽死させ、DRG(L4～L6)を抽出した。qPCRでNav1.7の発現レベルを測定し、AAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRAB群(***p=0.0007)及びガバペンチン群(*p=0.0121)において、Nav1.7の有意な抑制が観察された(図7A)。カラゲナン注射前及び4時間後に、対側及び同側の足をノギスで計測し、全ての群の非注射足と比較して、全ての群で注射を受けた足において有意な浮腫形成が確認された(図7B)。カラゲナン及び生理食塩水の両方の注射を受けた足について平均PWLを計算した(図2B-C)。
次いで、AAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRAB群及びガバペンチン群について、カラゲナン注射された足の足引っ込め潜時を、2元配置分散分析の計算を使用してAAV9-mCherry カラゲナンを注射された対照と各時点で比較し、熱痛覚過敏の有意な減少があったかどうかを測定した(図7C)。カラゲナンを注射された後足を比較すると、AAV9-mCherry対照群と比較した場合、カラゲナン注射後の全ての時点で、AAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRAB群のみが有意に高いPWLを示したことが観察された。また、30分、1時間、及び4時間の時点で、ガバペンチン陽性対照群でPWLに有意性が観察されたが、24時間の時点では観察されなかった。該結果は、ガバペンチンの半減期(3～5時間)を反映する。次いで、熱痛覚過敏について曲線下面積(AUC)を計算した。カラゲナン注射AAV9-mCherry対照群と比較して、カラゲナン注射ガバペンチン群(p=0.0208)(図2B)及び亜鉛-フィンガー-4-KRAB群(115%の改善、p=0.0021)(図2C)のPWLにおいて、有意な増加が観察された。さらに、AAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRAB群は、ガバペンチン陽性対照群より31%高いPWLを有した。なお、反対側の非炎症性足の熱脱出潜時については、群間に有意差は示されなかった。
炎症性疼痛モデルにおけるin vivoでの有効性を確立した後、化学療法薬のパクリタキセルによる多発性神経障害モデルを用いて実験を行い、神経障害性疼痛のエピゲノム抑制戦略を検証した。このモデルを確立するために、マウスに最初に1E+12 vg/マウスの用量で、AAV9-mCherry（n=8）、AAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRAB（n=8）、AAV9-KRAB-dCas9-二重gRNA（n=8）、AAV9-KRAB-dCas9-gRNA無し（n=8）、または生理食塩水（n=16）を注射した。パクリタキセル投与の前及び14日後に、触覚閾値（フォンフレイフィラメント）のベースラインを確立した。次に、14、16、18、及び20日目に、マウスにパクリタキセルを8 mg/kgの投与量（合計累積投与量32 mg/kg）で投与した。該化学療法薬によって引き起こされる触覚異痛症を確立するために、パクリタキセルを投与されていない生理食塩水を注射されたマウスの群（n=8）を用いた。初回注射の21日後、試験の1時間前に、生理食塩水を注射したマウスの群（n=8）にガバペンチン（100 mg/kg）をi.p.注射した。次に、マウスをフォンフレイフィラメントで触覚異痛症及びアセトンで冷感異痛症について試験した（図3A）。50%の触覚閾値を計算した。触覚閾値の低下は、AAV9-mCherry及びAAV9-KRAB-dCas9-gRNA無しを投与されたマウスで観察され、一方、ガバペンチン、AAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRAB、及びAAV9-KRAB-dCas9-二重gRNAを投与されたマウスでは、引っ込め閾値が上昇した。これは、in situでのNav1.7抑制が化学療法誘発性の触覚異痛の改善につながることを示している（図3B）。同様に、引っ込め反応の数の増加は、陰性対照群（AAV9-mCherry及びAAV9-KRAB-dCas9-gRNA無し）の冷感異痛症について試験されたマウスで見られ、一方、AAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRAB群とAAV9-KRAB-dCas9-二重gRNA群の両方で引っ込め反応が減少した。これは、in situでのNav1.7抑制が化学療法誘発性の冷感異痛の減少にもつながることを示している（図3C）。
次に、KRAB-dCas9を介したin situでのNav1.7抑制がBzATPによって誘発される神経障害性疼痛を改善できるかどうかを検証するために実験を行った。該分子は、中枢末端にあるP2X受容体を活性化し、中枢を介した痛覚過敏状態を引き起こす。マウスに、最初に1E+12 vg/マウスの投与量でAAV9-mCherry（n=6）、AAV9-KRAB-dCas9-gRNA無し（n=5）、及びAAV9-KRAB-dCas9-二重gRNA（n=6）を注射した。21日後、フォンフレイフィラメントを用いて触覚閾値を測定し、マウスにBzATP（30 nmol）をi.t.注射した。次に、BzATP投与の30分、1時間、2時間、3時間、6時間、及び24時間後に触覚異痛を測定した（図3D）。AAV9-KRAB-dCas9-二重gRNAを注射したマウスでは、30分、1時間及び2時間の時点で触覚異痛の有意な軽減が観察され、全ての時点で触覚閾値の全体的な増加が観察された（図3E）。
in situでのNav1.7抑制が長期的に有効であるかどうかを検証するために、カラゲナン炎症性疼痛モデルを、AAVのi.t.注射の21日後及び42日後に熱痛覚過敏で繰り返した（n=8/群）（図4A）。21日目（図7D）と42日目（図4B）の両方で、亜鉛フィンガー-4-KRAB群のカラゲナン注射足でPWLの有意な改善が観察された。これは、該アプローチの耐久性を示している。in situでのNav1.7抑制が多発性神経障害性疼痛モデルにおいても長期的に有効であったかどうかを検証するために、AAVの初回注射の49日後及びパクリタキセルの最終注射の29日後に触覚及び冷感異痛を測定した（合計累積投与量32 mg/kg;図4C）。以前の時点（図3B-C）と比較して、AAV9-mCherry群（n=8）とAAV9-KRAB-dCas9-二重gRNA群（n=8）の両方のマウスは、21日目と比較して、49日目に触覚異痛が増加し、調べた最低のフォンフレイフィラメント（0.04 g）に反応した。比較すると、AAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRAB及びAAV9-KRAB-dCas9-二重gRNAを投与されたマウスは、引っ込め閾値が増加した。これは、in situでのNav1.7抑制が、化学療法誘発性の触覚異痛の長期改善につながることを示している（図4C）。以前のように、引っ込め反応の数の増加は、陰性対照群（AAV9-mCherry及びAAV9-KRAB-dCas9-gRNA無し）の冷感異痛について試験されたマウスで見られ、一方、AAV9-亜鉛-フィンガー-4-KRAB群とAAV9-KRAB-dCas9-二重gRNA群の両方で引っ込め反応が減少した。これは、in situでのNav1.7抑制も化学療法誘発性の冷感異痛の長期改善につながることを示している（図4E）。
本開示はまた、前記方法及び組成物が慢性疼痛の状態を回復させることを実証している。これらの実験では、慢性疼痛を誘発するために、最初にマウスをパクリタキセルで処置した。フォンフレイフィラメントで器質的異痛を確認した後、マウスに遺伝子抑制剤を注射し、2週間及び3週間後に、ZF遺伝子抑制剤を受けたマウスの群で器質的異痛が回復した（図10A-B）。
本開示の主旨及び範囲から逸脱することなく、様々な改変がなされ得ることが理解されるであろう。従って、他の実施形態は、以下の請求項の範囲内にある。

Claims (60)

  1. 転写抑制因子に融合され、少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)に関連付けられ、核酸分解酵素が不活性化されたCas9(dCas9)タンパク質を含む、組換え遺伝子抑制因子複合体。ここで、該gRNAが、TRPV1/2/3/4、P2XR3、TRPM8、TRPA1、P23X2、P2RY、BDKRB1/2、Hlr3A、ACCNs、TRPV4、TRPC/P、ACCN1/2、SCN1/3/8A/9A、SCN10A、SCN11A、KCNQ、BDNF、OPRD1/K1/M1、CNR1、GABRs、TNF、PLA2、IL1/6/12/18、COX-2、NTRK1、NGF、 GDNF、TNF、LIF、CCL1、CNR2、TLR2/4、P2RX47、CCL2、CX3CR1、BDNF、NR1/2、GR1A1-4、 GRC1-5、NK1R、CACNA1A-S、及びCACNA2D1からなる群から選択された遺伝子産物をコードする標的核酸配列に特異的にハイブリダイズし、該遺伝子産物の発現が阻害される、組換え遺伝子抑制因子複合体。
  2. 前記標的核酸配列が、染色体2の2q24.3の位置にある、請求項１に記載の組換え遺伝子抑制因子複合体。
  3. 前記gRNAが、11～107のいずれか1つに示される配列によってコードされる配列を含む、請求項１または２に記載の組換え遺伝子抑制因子複合体。
  4. 前記gRNAが、SCN9A産物(Nav1.7)をコードする核酸配列に特異的にハイブリダイズする、請求項１または２のいずれか1項に記載の組換え遺伝子抑制因子複合体。
  5. 前記転写抑制因子が、mSin3相互作用ドメイン(SID)タンパク質、メチル-CpG結合ドメイン2(MBD2)、MBD3、DNAメチル基転移酵素(DNMT)1(DNMT1)、DNMT2A、DNMT3A、DNMT3B DNMT3L、網膜芽細胞腫タンパク質（Rb）、メチルCpG結合タンパク質2（Mecp2）、GATA 1の友（Fog1）、MAT2の制御因子（ROM2）、シロイヌナズナHD2Aタンパク質（AtHD2A）、リジン特異的脱メチル化酵素1（LSD1）、及びクリュッペル関連ボックス（
    Figure 2022526398000017
    , KRAB）からなる群から選択される、請求項１または２のいずれか１項に記載の組換え遺伝子抑制因子複合体。
  6. 前記転写抑制因子ドメインが、KRABドメインである、請求項５に記載の組換え遺伝子抑制因子複合体。
  7. 請求項１に記載の組換え遺伝子抑制因子複合体の1つまたは複数の成分をコードする、ポリヌクレオチド。
  8. 前記ポリヌクレオチドが、ヒト細胞における発現に最適化されたコドンである、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
  9. 請求項７または８に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  10. 前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結される、請求項９に記載のベクター。
  11. 前記プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、CAGプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV）LTRプロモーター/転写促進因子、SV40プロモーター、EF1-αプロモーター、CMV即時/初期遺伝子転写促進因子/CBAプロモーター、Nav1.7プロモーター、Nav1.8プロモーター、Nav1.9プロモーター、TRPV1プロモーター、シナプシンプロモーター、カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIプロモーター、チューブリンαIプロモーター、神経特異性エノラーゼプロモーター、及びグリア原線維酸性タンパク質(GFAP)プロモーターからなる群から選択される、請求項１０に記載のベクター。
  12. 前記ベクターが、少なくとも1つのガイドRNAコード配列の上流にpolIIIプロモーターを含む、請求項９に記載のベクター。
  13. 前記polIIIプロモーターが、U6及びH1プロモーターから選択される、請求項１２に記載のベクター。
  14. 調節制御配列をさらに含む、請求項９に記載のベクター。
  15. 前記調節制御配列が、ウッドチャック型肝炎ウイルス後転写調節因子(WPRE)である、請求項１４に記載のベクター。
  16. 前記ベクターが、組換えアデノ関連ウイルスベクター(rAAVベクター)である、請求項９に記載のベクター。
  17. 前記rAAVが、AAV1、AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3、AAV3(Y705+731F)、AAV4、AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6 (VP3変異体Y705F/Y731F/T492V)、AAV7、 AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3変異体Y731F)、AAV10、AAV10(Y733F)、AAV-ShH10、AAV11、AAV12、及び自己相補的ベクター(scAAV)からなる群から選択される、請求項１６に記載のベクター。
  18. 前記ポリヌクレオチドが、1つまたは複数の反転反復(ITR)を含む、請求項１６または１７に記載のベクター。
  19. 前記ポリヌクレオチドが、ポリA配列を含む、請求項１６に記載のベクター。
  20. 前記ポリヌクレオチドが、細胞内で発現されるように操作される、請求項９に記載のベクター。
  21. 前記ベクターが、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである、請求項９に記載のベクター。
  22. 前記ベクターが、分割dCas9ベクター系を含む、請求項９に記載のベクター。
  23. 前記ベクターが、配列番号:2に示されるような配列を有するdCas9をコードする核酸を含む、請求項９に記載のベクター。
  24. 前記ベクターが、配列番号:7のKRAB配列をコードする核酸を含む、請求項９に記載のベクター。
  25. 前記分割ベクター系が、配列番号:3、4及び10から選択されるベクター配列を含む、請求項２２に記載のベクター。
  26. 転写抑制因子に結合された操作された亜鉛フィンガーDNA結合ドメインを含む亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物であって、ここで、該亜鉛フィンガーDNA結合ドメインが、1～6個の亜鉛―フィンガー配列を含み、該亜鉛フィンガー配列が、TRPV1/2/3/4、P2XR3、TRPM8、TRPA1、P23X2、P2RY、BDKRB1/2、Hlr3A、ACCNs、TRPV4、TRPC/P、ACCN1/2、SCN1/3/8A/9A、SCN10A、SCN11A、KCNQ、BDNF、OPRD1/K1/M1、CNR1、GABRs、TNF、PLA2、IL1/6/12/18、COX-2、NTRK1、NGF、GDNF、TNF、LIF、CCL1、CNR2、TLR2/4、P2RX47、CCL2、CX3CR1、BDNF、NR1/2、GR1A1-4、GRC1-5、NK1R、CACNA1A-S、及びCACNA2D1からなる群から選択された遺伝子産物をコードする遺伝子において標的核酸配列に結合し、該遺伝子産物の発現が阻害される、亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物。
  27. 前記標的核酸配列が、表2に示されている配列である、請求項２６に記載の亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物。
  28. 前記転写抑制因子が、mSin3相互作用ドメイン(SID)タンパク質、メチル-CpG結合ドメイン2(MBD2)、MBD3、DNAメチル基転移酵素(DNMT)1(DNMT1)、DNMT2A、DNMT3A、DNMT3B DNMT3L、網膜芽細胞腫タンパク質（Rb）、メチルCpG結合タンパク質2（Mecp2）、GATA 1の友（Fog1）、MAT2の制御因子（ROM2）、シロイヌナズナHD2Aタンパク質（AtHD2A）、リジン特異的脱メチル化酵素1（LSD1）、及びクリュッペル関連ボックス（
    Figure 2022526398000018
    , KRAB）からなる群から選択される、請求項２６に記載の亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物。
  29. 請求項２６、２７または２８に記載の亜鉛－フィンガー抑制因子の構築物をコードする、ポリヌクレオチド。
  30. 前記ポリヌクレオチドが、ヒト細胞における発現に最適化されたコドンである、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
  31. 請求項２９に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  32. 前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結される、請求項３１に記載のベクター。
  33. 前記プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、CAGプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV）LTRプロモーター/転写促進因子、SV40プロモーター、EF1-αプロモーター、CMV即時/初期遺伝子転写促進因子/CBAプロモーター、Nav1.7プロモーター、Nav1.8プロモーター、Nav1.9プロモーター、TRPV1プロモーター、シナプシンプロモーター、カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIプロモーター、チューブリンαIプロモーター、神経特異性エノラーゼプロモーター、及びグリア原線維酸性タンパク質(GFAP)プロモーターからなる群から選択される、請求項３２に記載のベクター。
  34. 調節制御配列をさらに含む、請求項３１に記載のベクター。
  35. 前記調節制御配列が、ウッドチャック型肝炎ウイルス後転写調節因子(WPRE)である、請求項３４に記載のベクター。
  36. 前記ベクターが、組換えアデノ関連ウイルスベクター(rAAVベクター)である、請求項３１に記載のベクター。
  37. 前記rAAVが、AAV1、AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3、AAV3(Y705+731F)、AAV4、AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6 (VP3変異体Y705F/Y731F/T492V)、AAV7、AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3変異体Y731F)、AAV10、AAV10(Y733F)、AAV-ShH10、AAV11、AAV12、及び自己相補的ベクター(scAAV)からなる群から選択される、請求項３６に記載のベクター。
  38. 前記ポリヌクレオチドが、1つまたは複数の反転反復(ITR)を含む、請求項３１に記載のベクター。
  39. 前記ポリヌクレオチドが、ポリA配列を含む、請求項３１に記載のベクター。
  40. 前記核酸が、細胞において1つまたは複数の成分を発現するように操作される、請求項３１に記載のベクター。
  41. 前記ベクターが、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである、請求項３１に記載のベクター。
  42. 前記ベクターが、配列番号:7のKRAB配列をコードする核酸を含む、請求項３１に記載のベクター。
  43. 被験者における慢性疼痛を治療またはコントロールするための、エピジェネティックに基づいた方法であって、有効量の請求項１に記載の複合体または請求項２６に記載の構築物を投与することを含む、方法。
  44. 治療を必要とする被験者における疼痛を治療またはコントロールするための、エピジェネティックに基づいた方法であって、有効量の亜鉛フィンガー－抑制因子の構築物及び/またはdCas9－抑制因子ドメインの複合体を該被験者に投与することを含み、ここで、該dCas9が、DNAを切断しないが、ガイド-RNA (gRNA)を介してゲノムに結合する能力を維持する、触媒的に不活性化されたCas9である、方法。
  45. 前記疼痛が、神経障害性疼痛、痛覚受容性疼痛、異痛症、炎症性疼痛、炎症性痛覚過敏、神経障害、神経痛、糖尿病性神経障害、ヒト免疫不全ウイルス関連神経障害、神経損傷、関節リウマチ性疼痛、関節炎性疼痛、火傷、背痛、眼痛、内臓痛、癌疼痛、骨癌疼痛、片頭痛、手根管症候群による疼痛、線維筋痛、神経炎性疼痛、シアチカ性疼痛、骨盤過敏症の疼痛、骨盤疼痛、帯状疱疹後神経痛の疼痛、術後の疼痛、脳卒中後の疼痛、及び月経痛から選択される、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記疼痛が、神経障害性末梢神経障害、糖尿病性神経障害、食後神経痛、三叉神経痛、背中のケガ、癌神経障害、HIV神経障害、四肢損失、手根管症候群、脳卒中、アルコール依存症、甲状腺機能亢進症、尿毒症、多発性硬化症、脊髄損傷、パーキンソン病、及びてんかんからなる群から選択される疾患または障害に関連する、請求項４４に記載の方法。
  47. 前記方法が、慢性疼痛を有する被験者を治療するために使用される、請求項４４に記載のエピジェネティックな方法。
  48. 前記亜鉛フィンガー－抑制因子の構築物が、mSin3相互作用ドメイン(SID)タンパク質、メチル-CpG結合ドメイン2(MBD2)、MBD3、DNAメチル基転移酵素(DNMT)1(DNMT1)、DNMT2A、DNMT3A、DNMT3B DNMT3L、網膜芽細胞腫タンパク質（Rb）、メチルCpG結合タンパク質2（Mecp2）、GATA 1の友（Fog1）、MAT2の制御因子（ROM2）、シロイヌナズナHD2Aタンパク質（AtHD2A）、リジン特異的脱メチル化酵素1（LSD1）、及びクリュッペル関連ボックス（
    Figure 2022526398000019
    , KRAB）からなる群から選択される抑制因子ドメインを含む、請求項４４に記載のエピジェネティックな方法。
  49. 前記抑制因子ドメインが、KRABを含む、請求項４８に記載のエピジェネティックな方法。
  50. 前記亜鉛フィンガー－抑制因子の構築物が、表2の標的に結合する、請求項４４に記載のエピジェネティックな方法。
  51. 前記dCas9－抑制因子ドメインの複合体が、mSin3相互作用ドメイン(SID)タンパク質、メチル-CpG結合ドメイン2(MBD2)、MBD3、DNAメチル基転移酵素(DNMT)1(DNMT1)、DNMT2A、DNMT3A、DNMT3B DNMT3L、網膜芽細胞腫タンパク質（Rb）、メチルCpG結合タンパク質2（Mecp2）、GATA 1の友（Fog1）、MAT2の制御因子（ROM2）、シロイヌナズナHD2Aタンパク質（AtHD2A）、リジン特異的脱メチル化酵素1（LSD1）、及びクリュッペル関連ボックス（
    Figure 2022526398000020
    , KRAB）からなる群から選択される抑制因子ドメインを含む、請求項４４に記載のエピジェネティックな方法。
  52. 前記抑制因子ドメインが、KRABを含む、請求項５１に記載のエピジェネティックな方法。
  53. 前記dCas9－抑制因子ドメインの構築物が、配列番号:11～106及び107から選択される配列を有するガイドRNAスペーサー配列を含む、請求項４４に記載のエピジェネティックな方法。
  54. 前記亜鉛フィンガー－抑制因子の構築物及び／またはdCas9－抑制因子ドメインの構築物が、電位依存性ナトリウムチャネルの非永続的な遺伝子抑制を提供する、請求項４４に記載のエピジェネティックな方法。
  55. 前記電位依存性ナトリウムチャネルが、NaV1.7、NaV1.8、及びNaV1.9から選択される、請求項５４に記載のエピジェネティックな方法。
  56. 前記電位依存性ナトリウムチャネルが、NaV1.7である、請求項５５に記載のエピジェネティックな方法。
  57. 前記亜鉛フィンガー－抑制因子の構築物及び／またはdCas9－抑制因子ドメインの構築物が、組換えウイルスによって一括され、送達される、請求項４４に記載のエピジェネティックな方法。
  58. 前記組換えウイルスが、アデノウイルス、ガンマレトロウイルス、アデノ関連ウイルス(AAV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、またはレンチウイルスである、請求項５７に記載のエピジェネティックな方法。
  59. 前記組換えウイルスが、AAV1、AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3、AAV3(Y705+731F)、AAV4、AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6(VP3変異体Y705F/Y731F/T492V)、AAV7、AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3変異体Y731F)、AAV10、AAV10(Y733F)、AAV-ShH10、AAV11、AAV12、及び自己相補的ベクター(scAAV)からなる群から選択される、請求項５７に記載のエピジェネティックな方法。
  60. 前記亜鉛フィンガー－抑制因子の構築物及び／またはdCas9－抑制因子ドメインの構築物が、静脈内、腹腔内、髄腔内、神経節内、神経内、頭蓋内、または筋肉内に投与される、請求項４４に記載のエピジェネティックな方法。

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