PT2931898E - Manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições para manipulação de sequências com domínios funcionais - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"MANIPULAÇÃO E OTIMIZAÇÃO DE SISTEMAS, MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA MANIPULAÇÃO DE SEQUÊNCIAS COM DOMÍNIOS FUNCIONAIS"

ÁREA DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se geralmente com a manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições usados para o controlo da expressão de genes envolvendo sequências alvo, tais como perturbação genómica ou edição de genes, que se relaciona com Repetições Curtas Palindrómicas Agrupadas Regularmente Interespaçadas (CRISPR) e seus componentes.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Avanços recentes em técnicas de sequenciação genética e métodos de análise aceleraram significativamente a capacidade de catalogar e mapear fatores genéticos associados a uma gama diversa de funções biológicas e doenças. Tecnologias de direcionamento do genoma precisas são necessárias para permitir engenharia reversa sistemática de variações genéticas causais permitindo a perturbação seletiva de elementos genéticos individuais, bem como para avançar aplicações em biologia sintética, biotecnológicas, e médicas. Embora as técnicas de edição do genoma tais como configuração de dedos de zinco, efetores do tipo ativador da transcrição (TALEs), ou meganucleases migrantes estejam disponíveis para produção de perturbações genómicas direcionadas permanece uma necessidade de novas tecnologias de manipulação do genoma que sejam acessíveis, fáceis de configurar, escalonáveis, e passíveis de direcionamento para várias posições dentro do genoma eucariótico.

RESUMO DA INVENÇÃO O sistema CRISPR/Cas ou CRISPR-Cas (ambos os termos são usados indistintamente ao longo deste pedido) não requer a geração de proteínas customizadas para visar sequências específicas mas ao invés uma única enzima Cas pode ser programada por uma pequena molécula de RNA para reconhecer um DNA alvo específico, por outras palavras, a enzima Cas pode ser recrutada para um alvo de DNA específico usando a referida pequena molécula de RNA. A adição do sistema CRISPR-Cas ao repertório de técnicas de sequenciação do genoma e métodos de análise pode simplificar significativamente a metodologia e acelerar a capacidade de catalogar e mapear fatores genéticos associados a uma ampla gama de funções biológicas e doenças. Para utilizar eficazmente o sistema CRISPR-Cas para edição do genoma sem efeitos adversos é fundamental entender aspetos de manipulação e otimização destas ferramentas de manipulação do genoma, que são aspetos da presente divulgação.

De acordo com a presente invenção é proporcionada uma composição não ocorrendo naturalmente de acordo com a reivindicação 1. Aspetos adicionais da invenção são divulgados nas reivindicações dependentes. A invenção proporciona também métodos e usos da composição, bem como células hospedeiras eucarióticas, de acordo com as restantes reivindicações independentes. Quaisquer aspetos estando fora do âmbito das reivindicações são proporcionados como divulgação.

Existe uma necessidade premente de sistemas e técnicas alternativos e robustos para direcionamento de sequências com uma ampla rede de aplicações. Aspetos desta invenção atendem a esta necessidade e proporcionam vantagens relacionadas. Um complexo CRISPR exemplar pode compreender uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridada com uma sequência alvo dentro do polinucleótido alvo. A sequência guia é ligada a uma sequência companheira tracr, que por ser turno híbrida com uma sequência tracr.

Num aspeto, a invenção relaciona-se com um ou mais elementos de um sistema CRISPR tendo funcionalidade melhorada ou modificada. 0 complexo CRISPR da invenção proporciona um meio eficaz para modificação de um polinucleótido alvo. 0 complexo CRISPR da invenção tem uma ampla gama de utilidades incluindo modificação (p.ex., eliminação, inserção, translocação, inativação, ativação, repressão, alteração da metilação, transferência de frações específicas) de um polinucleótido alvo numa multiplicidade de tipos de células. Como tal, o complexo CRISPR da invenção tem um amplo espetro de aplicações em, p.ex., edição de genes ou genoma, terapia de genes, descoberta de fármacos, rastreio de fármacos, diagnóstico de doenças, e prognóstico. Um complexo CRISPR exemplar pode compreender uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridada com uma sequência alvo dentro do polinucleótido alvo. A sequência guia é ligada a uma sequência companheira tracr, que por ser turno híbrida com uma sequência tracr.

Em algumas formas de realização, um sistema CRISPR/Cas pode compreender: (a) um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência companheira tracr e um ou mais locais de inserção para inserção de uma ou mais sequências guia a montante da sequência companheira tracr, em que, quando expressa, a sequência guia dirige a ligação específica da sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo numa célula eucariótica, em que o complexo CRISPR pode compreender uma enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que está hibridada com a sequência alvo, e (2) a sequência companheira tracr que está hibridada com a sequência tracr; e (b) um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de enzima codificando a referida enzima CRISPR que pode compreender uma sequência de localização nuclear; em que os componentes (a) e (b) estão localizados no mesmo ou diferentes vetores do sistema. Em algumas formas de realização, o componente (a) pode adicionalmente compreender a sequência tracr a jusante da sequência companheira tracr sob o controlo do primeiro elemento regulador. Em algumas formas de realização, o componente (a) pode adicionalmente compreender duas ou mais sequências guias operacionalmente ligadas ao primeiro elemento regulador, em que, quando expressa, cada uma das duas ou mais sequências guia dirigem a ligação especifica da sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo diferente numa célula eucariótica. Em algumas formas de realização, o sistema pode compreender a sequência tracr sob o controlo de um terceiro elemento regulador, tal como um promotor da polimerase III. Em algumas formas de realização, a sequência tracr exibe pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 99% de complementaridade de sequências ao longo do comprimento da sequência companheira tracr quando otimamente alinhadas. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR pode compreender uma ou mais sequências de localização nuclear de força suficiente para dirigir a acumulação da referida enzima CRISPR numa quantidade detetável no núcleo de uma célula eucariótica. Sem desejar estar limitado pela teoria acredita-se que uma sequência de localização nuclear não é necessária para a atividade de CRISPR em eucariotas, mas que a inclusão de tais sequências intensificada a atividade do sistema. Em algumas formas de realização a enzima CRISPR é uma enzima do sistema CRISPR do tipo II. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é uma enzima Cas9. Em algumas formas de realização, a enzima Cas9 é Cas9 de S. pyogenes ou S. thermophilus, e pode incluir Cas9 mutada derivada de qualquer um destes organismos. A enzima pode ser um homólogo ou ortólogo de Cas9. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR tem otimização de codões para expressão numa célula eucariótica. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR dirigem a clivagem de uma ou duas cadeias na localização da sequência alvo. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR não tem atividade de clivagem de cadeias de DNA. Em algumas formas de realização, o primeiro elemento regulador é um promotor da polimerase III. Em algumas formas de realização, o segundo elemento regulador é um promotor da polimerase II. Em algumas formas de realização, a sequência guia tem pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nucleótidos, ou entre 10-30, ou entre 15-25, ou entre 15-20 nucleótidos em comprimento. Em geral, e ao longo desta especificação, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Os vetores incluem, mas não estão limitados a, moléculas de ácido nucleico que têm cadeia simples, cadeia dupla, ou parcialmente de cadeia dupla; moléculas de ácido nucleico que compreendem uma ou mais extremidades livres, nenhumas extremidades livres (p.ex., circular); moléculas de ácido nucleico que compreendem DNA, RNA, ou ambos; e outras variedades de polinucleótidos conhecidas na técnica. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma ansa de DNA de cadeia dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser inseridos, tal como por técnicas de clonagem molecular padrão. Outro tipo de vetor é um vetor virai, em que sequências de DNA ou RNA derivadas de virus estão presentes no vetor para empacotamento num virus (p.ex., retrovirus, retrovirus defeituosos em termos de replicação, adenovirus, adenovirus defeituosos em termos de replicação, e virus adenoassociados). Os vetores virais incluem também polinucleótidos transportados por um virus para transfecção numa célula hospedeira. Certos vetores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira na qual são introduzidos (p.ex., vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores epissomais de mamíferos). Outros vetores (p.ex., vetores não epissomais de mamíferos) são integrados no genoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira, e deste modo são replicados em conjunto com o genoma do hospedeiro. Além do mais, certos vetores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão". Vetores de expressão comuns de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmideos.

Os vetores de expressão recombinantes podem compreender um ácido nucleico da invenção numa forma adequada para expressão do ácido nucleico numa célula hospedeira, o que significa que os vetores de expressão recombinantes incluem um ou mais elementos reguladores, que podem ser selecionados com base nas células hospedeiras a serem usadas para expressão, que estão operacionalmente ligados à sequência de ácido nucleico a ser expressa. Dentro de um vetor de expressão recombinante, "operacionalmente ligado" pretende significar que a sequência de nucleótidos de interesse está ligada ao(s) elemento (s) regulador(es) de um modo que permite a expressão da sequência de nucleótidos (p.ex., num sistema de transcrição/tradução in vitro ou numa célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). 0 termo "elemento regulador" destina-se a incluir promotores, intensificadores, locais internos de entrada de ribossoma (IRES), e outros elementos de controlo de expressão (p.ex., sinais de terminação da transcrição, tais como sinais de poliadenilação e sequências de poli-U). Tais elementos reguladores são descritos, por exemplo, em Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Os elementos reguladores incluem aqueles que dirigem a expressão constitutiva de uma sequência de nucleótidos em muitos tipos de célula hospedeira e aqueles que dirigem a expressão da sequência de nucleótidos somente em certas células hospedeiras (p.ex., sequências reguladoras especificas de tecido). Um promotor especifico de tecido pode dirigir a expressão principalmente num tecido de interesse desejado, tal como músculo, neurónio, osso, pele, sangue, órgãos específicos (p.ex., fígado, pâncreas), ou tipos de células particulares (p.ex., linfócitos). Os elementos reguladores podem também dirigir a expressão de uma forma dependente do tempo, tal como de uma forma dependente do ciclo celular ou dependente da etapa de desenvolvimento, que pode ou não também ser específica de tecido ou tipo de célula. Em algumas formas de realização, um vetor compreende um ou mais promotores pol III (p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, ou mais promotores pol III), um ou mais promotores pol II (p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, ou mais promotores pol II), um ou mais promotores pol I (p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, ou mais promotores pol I), ou suas combinações. Exemplos de promotores pol III incluem, mas não estão limitados a, promotores U6 e Hl. Exemplos de promotores pol II incluem o, mas não estão limitados ao, promotor LTR do vírus retroviral do sarcoma de Rous (RSV) (opcionalmente com o intensificador RSV), o promotor do citomegalovírus (CMV) (opcionalmente com o intensificador de CMV) [ver, p.ex., Boshart et al. Cell, 41: 521-530 (1985)], o promotor de SV40, o promotor da diidrofolato reductase, o promotor da β-actina, o promotor da fosfoglicerol cinase (PGK), e o promotor de EFla. Também englobados pelo termo "elemento regulador" estão elementos intensificadores, tais como WPRE; Intensif icadores de CMV; o segmento R-U5' em LTR de HTLV-I (Mol. Cell. Biol., Vol. 8 (1), p. 466-472, 1988); intensificador de SV40; e a sequência de intrão entre os exões 2 e 3 de β-globina de coelho (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78 (3), p. 1527-31, 1981). Será apreciado por aqueles peritos na técnica que o desenho do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nivel de expressão desejado, etc. Um vetor pode ser introduzido em células hospedeiras para produzir deste modo transcritos, proteínas, ou péptidos, incluindo proteínas ou péptidos de fusão, codificados por ácidos nucleicos como descrito aqui (p.ex., transcritos de repetições curtas palindrómicas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR), proteínas, enzimas, suas formas mutantes, suas proteínas de fusão, etc.).

Aspetos da invenção relacionam-se com métodos de melhoria ou modificação da especificidade do alvo de uma enzima CRISPR (preferencialmente uma enzima Cas9) que pode compreender: a) seleção da enzima CRISPR tendo um tamanho mais pequeno para empacotamento fácil em vetores de administração; ou b) geração de enzimas CRISPR quiméricas; ou c) utilização de enzimas CRISPR (preferencialmente Cas9) mutadas. Aspetos adicionais da invenção relacionam-se também com métodos e composições para melhoria da especificidade do alvo envolvendo duas enzimas CRISPR (nickase dupla), melhorando o molde de sgRNA fazendo melhoria noutros componentes para além do RNA guia. A invenção compreende uma composição não ocorrendo naturalmente ou manipulada compreendendo um sistema vetor que pode compreender um ou mais vetores compreendendo I. um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de polinucleótidos de RNA quimérico (chiRNA) do sistema CRISPR/Cas, em que a sequência de polinucleótidos pode compreender (a) uma sequência quia capaz de hibridar com uma sequência alvo numa célula, (b) uma sequência companheira tracr, e (c) uma sequência tracr, e II. um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de enzima codificando uma enzima CRISPR compreendendo pelo menos uma ou mais sequências de localização nuclear, em que (a) , (b) e (c) estão dispostas numa orientação 5" para 3', em que os componentes I e II estão localizados no mesmo ou diferentes vetores dos sistema, em que, quando transcrita, a sequência companheira tracr híbrida com a sequência tracr e a sequência guia dirige a ligação específica da sequência de um complexo CRISPR à sequência alvo, em que o complexo CRISPR compreende a enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que está hibridada com a sequência alvo, e (2) a sequência companheira tracr que está hibridada com a sequência tracr, em que a enzima CRISPR pode compreender duas ou mais mutações, tal que a enzima tenha atividade de nuclease alterada em comparação com a enzima de tipo selvagem, e em que a sequência de codificação de enzima codifica adicionalmente um ou mais domínios funcionais heterólogos. A invenção compreende adicionalmente uma composição do sistema de enzima CRISPR de dois componentes multiplexado compreendendo um sistema vetor que pode compreender um ou mais vetores compreendendo I. um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de polinucleótidos de RNA quimérico (chiRNA) do sistema CRISPR/Cas, em que a sequência de polinucleótidos pode compreender (a) uma sequência guia capaz de hibridar com uma sequência alvo numa célula, (b) uma sequência companheira tracr, e (c) uma sequência tracr, e II. um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de enzima codificando uma enzima CRISPR pode compreender pelo menos uma ou mais sequências de localização nuclear, em que (a), (b) e (c) estão dispostas numa orientação 5" para 3', em que os componentes I e II estão localizados no mesmo ou diferentes vetores dos sistema, em que, quando transcrita, a sequência companheira tracr híbrida com a sequência tracr e a sequência guia dirige a ligação específica da sequência de um complexo CRISPR à sequência alvo, em que o complexo CRISPR compreende a enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que está hibridada com a sequência alvo, e (2) a sequência companheira tracr que está hibridada com a sequência tracr, em que a enzima CRISPR pode compreender duas ou mais mutações, tal que a enzima tenha atividade de nuclease alterada em comparação com a enzima de tipo selvagem, em que a sequência de codificação de enzima codifica adicionalmente um ou mais domínios funcionais heterólogos, e em que na composição do sistema multiplexado são usadas múltiplas sequências de polinucleótidos de chiRNA. A invenção compreende adicionalmente uma composição não ocorrendo naturalmente ou manipulada compreendendo um sistema vetor que pode compreender um ou mais vetores compreendendo I. um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a (a) uma sequência guia capaz de hibridar com uma sequência alvo numa célula, e (b) pelo menos uma ou mais sequências companheiras tracr, II. um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de enzima codificando uma enzima CRISPR, e III. um terceiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência tracr, em que os componentes I, II e III estão localizados no mesmo ou diferentes vetores dos sistema, em que, quando transcrita, a sequência companheira tracr híbrida com a sequência tracr e a sequência guia dirige a ligação especifica da sequência de um complexo CRISPR à sequência alvo, em que o complexo CRISPR compreende a enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que está hibridada com a sequência alvo, e (2) a sequência companheira tracr que está hibridada com a sequência tracr, em que a enzima CRISPR pode compreender duas ou mais mutações, tal que a enzima tenha atividade de nuclease alterada em comparação com a enzima de tipo selvagem, e em que a sequência de codificação de enzima codifica adicionalmente um ou mais dominios funcionais heterólogos. A invenção também compreende uma composição do sistema de enzima CRISPR de três componentes multiplexado compreendendo um sistema vetor que pode compreender um ou mais vetores compreendendo I. um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a (a) uma sequência guia capaz de hibridar com uma sequência alvo numa célula, e (b) pelo menos uma ou mais sequências companheiras tracr, II. um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de enzima codificando uma enzima CRISPR, e III. um terceiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência tracr, em que os componentes I, II e III estão localizados no mesmo ou diferentes vetores dos sistema, em que, quando transcrita, a sequência companheira tracr híbrida com a sequência tracr e a sequência guia dirige a ligação específica da sequência de um complexo CRISPR à sequência alvo, em que o complexo CRISPR compreende a enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que está hibridada com a sequência alvo, e (2) a sequência companheira tracr que está hibridada com a sequência tracr, em que a enzima CRISPR pode compreender duas ou mais mutações, tal que a enzima tenha atividade de nuclease alterada em comparação com a enzima de tipo selvagem, em que a sequência de codificação de enzima codifica adicionalmente um ou mais domínios funcionais heterólogos, e em que na composição do sistema multiplexado são usadas múltiplas sequências guia capazes de hibridarem com múltiplas sequências alvo.

Em formas de realização da invenção, a enzima CRISPR pode compreender uma ou mais mutações em dois ou mais domínios cataliticamente ativos. Noutra forma de realização, a enzima CRISPR tem atividade de nuclease reduzida ou abolida em comparação com a enzima de tipo selvagem. Noutra forma de realização, as duas mutações são D10A SpCas9 num primeiro domínio cataliticamente ativo e H840A SpCas9 num segundo domínio cataliticamente ativo ou resíduos correspondentes de outras enzimas CRISPR. Noutra forma de realização, a enzima CRISPR pode compreender duas ou mais mutações num resíduo selecionado do grupo consistindo em DIO, H840, N854, H863, ou D986. Noutra forma de realização, a enzima CRISPR pode compreender duas ou mais mutações selecionadas do grupo compreendendo D10A, E762A, H840A, N854A, H863A ou D986A. Numa forma de realização preferencial, a enzima CRISPR é uma proteína de ligação a DNA que não dirige a clivagem de qualquer uma das cadeias na localização da sequência alvo. Numa forma de realização, cada uma das duas ou mais mutações está num domínio cataliticamente ativo da enzima CRISPR selecionado do grupo compreendendo domínio RuvC I, RuvC II, RuvC III ou HNH. Será entendido ao longo deste pedido que muitas referências a resíduos de aminoácidos específicos são àqueles da enzima SpCas9. A pessoa perita entenderá que a invenção é aplicável a outras enzimas Cas, incluindo enzimas Cas9 de outras fontes, e que, onde é feita referência a resíduos específicos da enzima SpCas9, podem ser feitas alterações e mutações correspondentes nessas outras enzimas Cas. Por exemplo, a pessoa perita será capaz de comparar sequências da SpCas9 e outras enzimas, e identificar resíduos e domínios correspondentes, e consequentemente fazer modificações apropriadas a essas enzimas.

Em formas de realização adicionais, as composições da invenção podem compreender pelo menos duas ou mais sequências de localização nuclear. Num aspeto da invenção, o domínio funcional é um domínio de ativação transcricional, p.ex., VP64. Noutro aspeto, o domínio funcional é um domínio repressor transcricional, p.ex., um domínio KRAB, um domínio SID ou um domínio SID4X. Noutra forma de realização, a sequência de codificação de enzima codifica um, dois, três, quatro, cinco ou mais domínios funcionais heterólogos fundidos à enzima CRISPR. A invenção compreende também uma ou mais sequências ligantes entre quaisquer dois domínios. Formas de realização da invenção incluem um ou mais domínios funcionais tendo uma ou mais das seguintes atividades: atividade de metilase, atividade de desmetilase, atividade de ativação da transcrição, atividade de repressão da transcrição, atividade de fator de libertação da transcrição, atividade de modificação de histona, atividade de clivagem de RNA e atividade de ligação a ácidos nucleicos. Noutra forma de realização, o domínio funcional liga-se a DNA e/ou afeta a transcrição do ácido nucleico alvo. Em aspetos da invenção, a célula é uma célula procariótica ou eucariótica. Numa forma de realização preferencial, a célula é uma célula de mamífero ou uma célula humana. Em algumas formas de realização, a célula de mamífero pode ser uma célula de roedor (por exemplo, camundongo ou rato), uma célula de ungulado, ou uma célula de primata. Em algumas formas de realização, a célula eucariótica pode ser uma célula de artrópode (p.ex., inseto) ou nematódeo. Em outras formas de realização, a célula pode ser uma célula vegetal (incluindo algas) ou uma célula fúngica. Em formas de realização adicionais da invenção, a enzima CRISPR tem otimização de codões para expressão numa célula eucariótica; a enzima CRISPR é uma enzima CRISPR do tipo II; a enzima CRISPR é uma enzima Cas9 e a enzima Cas9 é de um organismo selecionado do grupo consistindo no género Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvlbaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium ou Corynebacter. Num aspeto adicional, os vetores do sistema são vetores virais selecionados do grupo compreendendo de um vetor lentiviral, um vetor adenoviral ou um vetor de AAV. A invenção compreende também métodos de modulação, i.e., alteração, ativação, repressão, expressão de genes numa lócus genómico de interesse numa célula por contacto da célula com composições da invenção.

Um aspeto da divulgação relaciona-se com uma composição que pode compreender um sistema vetor que pode compreender um ou mais vetores que podem compreender I. um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de polinucleótidos de RNA quimérico (chiRNA) do sistema CRISPR/Cas, em que a sequência de polinucleótidos pode compreender (a) uma sequência guia capaz de hibridar com uma sequência alvo numa célula eucariótica, (b) uma sequência companheira tracr, e (c) uma sequência tracr, e II. um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de codificação de enzima codificando uma enzima CRISPR compreendendo pelo menos uma ou mais sequências de localização nuclear, em que (a), (b) e (c) estão dispostas numa orientação 5" para 3', em que os componentes I e II estão localizados no mesmo ou diferentes vetores dos sistema, em que, quando transcrita, a sequência companheira tracr híbrida com a sequência tracr e a sequência guia dirige a ligação específica da sequência de um complexo CRISPR à sequência alvo, em que o complexo CRISPR compreende a enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que está hibridada com a sequência alvo, e (2) a sequência companheira tracr que está hibridada com a sequência tracr, em que a enzima CRISPR pode compreender duas ou mais mutações, tal que a enzima tenha atividade de nuclease alterada em comparação com a enzima de tipo selvagem, e em que a sequência de codificação de enzima codifica adicionalmente um ou mais domínios funcionais heterólogos. A sequência de codificação pode codificar um ou mais domínios funcionais heterólogos (p.ex., cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais domínios adicionalmente à enzima CRISPR). Uma proteína de fusão de enzima CRISPR pode compreender qualquer sequência de proteína adicional, e opcionalmente uma sequência ligante entre quaisquer dois domínios. Exemplos de domínios de proteína que podem ser fundidos a uma enzima CRISPR incluem, sem limitação, marcadores de epítopo, sequências de genes repórter, e domínios de proteína tendo uma ou mais das seguintes atividades: atividade de metilase, atividade de desmetilase, atividade de ativação da transcrição, atividade de repressão da transcrição, atividade de fator de libertação da transcrição, atividade de modificação de histona, atividade de clivagem de RNA e atividade de ligação a ácidos nucleicos. Exemplos não limitantes de marcadores de epítopo incluem marcadores de histidina (His), marcadores de V5, marcadores de FLAG, marcadores de hemaglutinina (HA) da gripe, marcadores de Myc, marcadores de VSV-G, e marcadores de tiorredoxina (Trx). Exemplos de genes repórter incluem, mas não estão limitados a, glutationa-S-transferase (GST), peroxidase de rábano-silvestre (HRP), cloranfenicol-acetiltransferase (CAT) beta-galactosidase, beta-glucuronidase, luciferase, proteina verde fluorescente (GFP), HcRed, DsRed, proteina ciano fluorescente (CFP), proteina amarelo fluorescente (YFP), e proteínas autofluorescentes incluindo proteína azul fluorescente (BFP). Uma enzima CRISPR pode ser fundida a uma sequência de genes codificando uma proteína ou um fragmento de uma proteína que se liga a moléculas de DNA ou se liga a outras moléculas celulares, incluindo mas não se limitando a proteína de ligação à maltose (MBP), marcador de S, fusões de domínio de ligação a DNA (DBD) Lex A, fusões de domínio de ligação a DNA GAL4, e fusões de proteína BP16 do vírus do herpes simples (HSV). Domínios adicionais que podem formar parte de uma proteína de fusão compreendendo uma enzima CRISPR são descritos em US20110059502. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR marcada é usada para identificar a localização de uma sequência alvo.

Num aspeto da invenção, o domínio funcional afeta a transcrição do ácido nucleico alvo.

Exemplos não limitantes de enzimas CRISPR incluem Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também conhecida como Csnl e Csxl2), CaslO, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, CsxlO, Csxl6, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4, seus homólogos, ou suas versões modificadas. Estas enzimas são conhecidas; por exemplo, a sequência de aminoácidos da proteína Cas9 de S. pyogenes pode ser encontrada na base de dados SwissProt (disponível no website uniprot.org) sob o número de acesso Q99ZW2. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é uma enzima Cas9. Em algumas formas de realização, a enzima Cas9 é Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes ou S. thermophilus, e pode incluir Cas9 mutada derivada destes organismos. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR tem otimização de codões para expressão numa célula eucariótica. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR dirige a clivagem de uma ou duas cadeias na localização da sequência alvo. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR não tem atividade de clivagem de cadeias de DNA.

Em alguns aspetos da invenção, uma enzima CRISPR pode compreender uma ou mais mutações e pode ser usada como uma proteína de ligação ao DNA genérica com ou sem fusão a um domínio funcional. As mutações podem incluir mas não estão limitadas a mutações catalíticas, por exemplo mutações num dos domínios catalíticos ou mutação de resíduos catalíticos. Exemplos preferenciais de mutações catalíticas adequadas são o(s) resíduo(s) catalítico(s) no domínio RuvC I do terminal N de Cas9 ou o(s) resíduo(s) catalítico (s) no domínio NHN interno. Em algumas formas de realização, a Cas9 é (ou é derivada de) SpCas9. Em tais formas de realização, as mutações preferenciais são em qualquer uma das ou todas as posições 10, 762, 840, 854, 863 e/ou 986 de SpCas9 ou posições correspondentes em outras Cas9s (que podem ser determinadas por exemplo por ferramentas de comparação de sequências padrão). Em particular, qualquer uma das ou todas as seguintes mutações são preferenciais em SpCas 9: D10A, E762A, H840A, N854A, N863A e/ou D986A; bem como substituição conservativa de qualquer um dos aminoácidos de substituição é também pretendida. 0 mesmo (ou substituições conservativas destas mutações) em posições correspondentes em outras Cas9 é também preferencial. São particularmente preferenciais DIO e H840 em SpCas9. No entanto, em outras Cas9s, são também preferenciais resíduos correspondendo a DIO e H840 de SpCas9.

Num aspeto mais vantajoso da invenção, a enzima CRISPR mutada pode estar fundida com um domínio de ativação transcricional. Num aspeto da invenção, o domínio de ativação transcricional pode ser VP64. Outros aspetos da invenção relacionam-se com a enzima CRISPR mutada estando fundida com domínios que incluem mas não estão limitados a um repressor transcricional, uma recombinase, uma transposase, um remodelador de histona, uma DNA metiltransferase, um criptocromo, um domínio induzível/controlável pela luz ou um domínio quimicamente induzível/controlável.

Em alquns aspetos da invenção, a enzima CRISPR é compreendida por menos do que quatro mil, e em alguns aspetos menos do que mil, aminoácidos. Tais enzimas podem ser proporcionadas fundidas a um domínio funcional heterólogo, ou não. Onde a enzima está fundida a um domínio funcional heterólogo, o tamanho da enzima (menos do que quatro mil, menos do que mil, aminoácidos) refere-se à porção de CRISPR da proteína de fusão. Em certas formas de realização descritas aqui, a invenção ou método é praticado num organismo ou sujeito. Em certas formas de realização, o organismo ou sujeito é um eucariota ou um eucariota não humano. Em certas formas de realização, o organismo ou sujeito é uma planta. Em certas formas de realização, o organismo ou sujeito é um mamífero ou um mamífero não humano. Em certas formas de realização, o organismo ou sujeito é algas. Em algumas formas de realização, o organismo ou sujeito pode ser um roedor (por exemplo, camundongo ou rato), um ungulado, ou um primata. Em algumas formas de realização, o organismo ou sujeito pode ser um artrópode (p.ex., inseto) ou nematódeo. Em outras formas de realização, o organismo ou sujeito pode ser uma planta ou um fungo.

Estas e outras formas de realização são divulgadas ou são óbvias a partir da e englobadas pela seguinte Descrição Detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As caracteristicas novas da invenção são apresentadas com particularidade nas reivindicações anexas. Um melhor entendimento das caracteristicas e vantagens da presente invenção será obtida por referência à seguinte descrição detalhada que apresenta formas de realização ilustrativas, nas quais os princípios da invenção são utilizados, e os desenhos acompanhantes dos quais: A Figura 1 mostra um esquema de nuclease Cas9 guiada por RNA. A nuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes (amarelo) visa DNA genómico por um RNA guia sintético (sgRNA) consistindo numa sequência guia 20 nt (azul) e um molde (vermelho). A sequência guia emparelha em termos de bases com o DNA alvo, diretamente a montante de um motivo adjacente protoespaçador (PAM; magenta) 5'-NGG requerido, e a Cas9 medeia uma quebra de cadeia dupla (DSB) ~3 pb a montante do PAM (triângulo vermelho).

As Figuras 2A-F mostram um sistema CRISPR exemplar, um possível mecanismo de ação, uma adaptação exemplar para expressão em células eucarióticas, e resultados de testes avaliando a localização nuclear e atividade CRISPR.

As Figuras 3A-D são uma árvore filogenética de genes Cas.

As Figuras 4A-4F mostram a análise filogenética revelando cinco famílias de Cas9s, incluindo três grupos de Cas9s grandes (-1400 aminoácidos) e dois de Cas9s pequenas (-1100 aminoácidos). A Figura 5 mostra um constructo esquemático no qual o domínio de ativação transcricional (VP64) está fundido a Cas9 com duas mutações nos domínios catalíticos (D10 e H840) . A Figura 6 mostra uma representação gráfica da ativação transcricional após cotransfecção da Cas9-VP64 com RNA CRISPR quimérico (chiRNA) gerado por PCR em células 293. A avaliação foi levada a cabo 72 horas após transfecção usando RT-qPCR. A Figura 7 mostra um número de vetores incorporando genes Cas9 mutantes com marcadores para VP64, NLS, e GFP. A Figura 8 mostra a localização de constructos Cas9-VP64-GFP em células 2 93 como avaliada por um microscópio fluorescente 12 horas pós-transfecção. A Figura 9 mostra a localização de 16 fusões dCas9-GFP com a mesma sequência NLS da alfa-importina no terminal N ou C com zero a três repetições em tandem. Cada constructo foi transfectado em células HER 293FT usando Lipofectame 2000 e visualizado 24 horas pós-transfecção. A Figura 10 mostra seis versões de um marcador 6xHis adicionado a dCas9, transfectado em células 293FT, e corado com um anticorpo anti-6xHis. Três foram construídas para ativação transcricional (fusões com VP64), e as outras três foram para repressão transcricional (nenhum domínio funcional). A Figura 11 mostra uma razão titulada de chiRNA (Sox2.1 e Sox2.5) em relação a Cas9 (NLS-VP64-NLS-hSpCas9-NLS-VP64-NLS) , transfectada em células 293, e quantificada usando RT-qPCR. A Figura 12 mostra o posicionamento de locais alvo no lócus Sox2 humano com cada alvo tendo 2 0 pb de comprimento com um motivo adjacente protoespaçador (PAM) NGG vizinho. A Figura 13 mostra cotransfecção de cada constructo contendo dCas9 com plasmideos pA6 em células HEK 293FT usando Lipofectame 2000. 72 horas pós-transfecção, o RNA total foi extraido das células. 1 ug de RNA foi reversamente transcrito em cDNA (qScript Supermix) numa reação de 40 uL. 2 uL do produto de reação foram adicionados a uma única reação de qPCR de ensaio TaqMan de 20 uL. Cada experiência foi realizada em triplicados biológicos e técnicos. As reações em controlo da RT e sem controlo de molde não mostraram amplificação. A Figura 14 mostra teste de constructos (pXRPOll, pXRP013, pXRP015) usando os mesmos alvos Sox2 que a Figura 13.

As Figuras 15A-15B mostram uma lista de 31 constructos para explorar diferentes ligantes, domínios funcionais, e fusões e elementos críticos do terminal N e C. A Figura 16 mostra cotransfecção de cada plasmídeo repressor de dCas9 com dois RNAs guia dirigidos à cadeia de codificação do gene da beta-catenina. O RNA foi isolado 72 horas pós-transfecção e a expressão de genes foi quantificada por RT-qPCR. 0 gene de controlo endógeno foi GAPDH. Foram usados dois shRNAs validados como controlos positivos. Os controlos negativos foram certos plasmideos transfectados sem gRNA, estes são denotados "controlo pXRP#". A Figura 17 mostra uma representação gráfica da ativação transcricional adicionalmente a razão de chiRNA (Sox2.1 e Sox2.5) em relação a Cas9 (NLS-VP64-NLS-hSpCas9-NLS-VP64-NLS) sendo titulada e transfectada em células 293. Os resultados foram quantificados usando Rt-qPCR. A Figura 18 mostra dados repórter de luciferase para o ativador (painel do topo) e repressor de Cas9 (painel do fundo). Em comparação com controlos "Sem Cas9" foi alcançada ativação de 3 vezes quando se visou o promotor de Sox2. Quando se visou o corpo do gene da beta-catenia (CTNNB1) foi alcançada uma repressão de cerca de 3 vezes. A Figura 19 mostra a expressão de genes da beta-catenina em células HER 293FT 72 horas após transfecção. Os constructos repressores de Cas9 foram visados ao lócus da beta-catenina e comparados com os shRNAs padrão de ouro. Pôde ser vista repressão similar com repressores de Cas9 e shRNA. A Figura 20 mostra uma repressão gráfica da expressão de Neurog2 de vezes das sequências de sgRNA de 20 pb foram dirigidas ao lócus Neurog2 em células Neuro 2A. Os niveis de mRNA de Neurog2 foram medidos usando RT-qPCR. A Figura 21 mostra a modulação da expressão basal de genes de dCas9-VP64 que foi medida para os alvos de genes indicados. O itálico representa os alvos de genes de camundongo testados em células Neuro 2A, as maiúsculas representam alvos de genes humanos testados em células 2 93FT. Em cada caso, a expressão do gene em células transfectadas com GFP foi comparada com a expressão em células transfectadas com dCas9-VP64. A Figura 22 mostra as mudanças no nivel de expressão dos genes indicados quando as amostras transfectadas com o constructo dCas9-VP64 mas sem um sgRNA.

As Figuras 23A-G mostram a, A nuclease Cas9 guiada por RNA do sistema CRISPR/Cas de Streptococcus pyogenes do tipo II CRISPR/Cas pode ser convertida numa proteina de ligação a DNA guiada por RNA nucleoliticamente inativa (Cas9**) por introdução de substituições de alanina (D10A e H840A). Esquema mostrando que um RNA guia sintético (sgRNA) consegue dirigir fusão efetora Cas9** para um lócus específico no genoma humano. 0 sgRNA contém uma sequência guia de 20 pb na extremidade 5" que especifica a sequência alvo. No DNA genómico alvo, o local alvo de 20 pb necessita de ser seguido por um motivo PAM 5'-NGG. b, c, Esquemas mostrando os locais alvo de sgRNA nos lócus KLF4 e SOX2 humanos, respetivamente. Cada local alvo está indicado pela barra azul e a sequência de PAM correspondente está indicada pela barra magenta, d, e, Esquemas dos constructos ativadores da transcrição Cas9**-VP64 e repressores da transcrição SID4X-Cas9**. f, g, Ativação mediada por Cas9**-VP64 e SID4X-Cas9** de KLF4 e repressão de SOX2, respetivamente. Todos os níveis de mRNA foram medidos em relação a células 293FT pseudotransfectadas com GFP (média ± s.e.m.; n = 3 replicados biológicos). A Figura 24 mostra a sequência ativadora de Cas9. A Figura 25 mostra a sequência repressora de Cas9. A Figura 26 mostra a representação gráfica da ativação de vezes de diferentes genes visados pelo ativador de Cas9 (pXRP57) e RNA guia. A Figura 27 mostra a representação gráfica da repressão de vezes do gene hSox2 visado pelo ativador de Cas9 (pXRP57) e RNA guia. A Figura 28 mostra um mapa de plasmídeo pAAV-EFla-dCas9-GS-CIB1(mNLS d318-334)_WPRE_hGHpolyA. A Figura 29 mostra um mapa de plasmídeo pAAV-EFla-dCas9-GS-NLS-cibl-WPRE-hGHpA. A Figura 30 mostra um mapa de plasmídeo pAAV-EFla-dCas9-GS-NLS-NLS-cibl-WPRE-hGHpA. A Figura 31 mostra uma representação gráfica de constructos CasLITE exibindo níveis variáveis de ativação transcricional induzível pela luz. A Figura 32 mostra a validação de células estaminais embriónicas de camundongo com inativação de Cas9 dependente de Rosa26 Cre. A Figura 33 mostra uma imagem de gel indicando os resultados de genotipagem para Cas9 camundongos. A Figura 34 mostra silenciamento mediado por CRISPR/Cmr de RNA. As proteínas Cmr formam um complexo com crRNA maduro para visar de modo específico quanto ao local e clivar RNA. crRNAs maduros de P. furiosus existem em duas formas de diferente comprimentos, longo (45 nt) e curto (39 nt), consistindo numa asa 5' e uma sequência guia. A asa 5" é requerida para o crRNA a ser incluído no complexo de Cmr. A sequência guia programa o local alvo e pode ser longa (37 nt) ou curta (31 nt) . A clivagem de RNA ocorre 14 nucleótidos a partir da extremidade 3' do crRNA. Esta plataforma poderia ser para reaproveitada visar genes de mamífero expressos a partir de um lócus genómico somente por mudança da sequência guia.

As Figuras 35A-B mostram que as proteínas Cmr são expressas dentro de células de mamífero. Seis genes Cmr (Cmrl-6) e um gene Cas (Cas6) de P. furiosus foram clonados em vetores de expressão de mamífero e transfectados em células HER 293FT. 72 horas pós- transfecção, imagens de fluorescência foram tiradas e lisados de proteína foram preparados. A) A expressão de EGFP é fortemente observada sugerindo que as proteínas exógenas são robustamente expressas. B) Imagens de transferência de Western mostram bandas de proteínas localizadas no tamanho esperado. A segunda banda dentro de cada pista é ~30 kDa maior em cada caso e é provavelmente o resultado de sequência P2A não clivada. A Figura 36 mostra vetores de expressão de CRISPR/Cmr.

As Figuras aqui são somente para propósitos ilustrativos e não estão necessariamente desenhadas à escala.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com a manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições usados para o controlo da expressão de genes envolvendo direcionamento de sequências, tais como perturbação do genoma ou edição de genes, que se relacionam com o sistema CRISPR/Cas e seus componentes. Em formas de realização vantajosas, a enzima Cas é Cas9; por exemplo, Cas9 de S. pyogenes ou S. thermophilus.

0 termo "polinucleótido", "nucleótido", "sequência de nucleótidos", "ácido nucleico" e "oligonucleótido" são usados indistintamente. Referem-se a uma forma polimérica de nucleótidos de qualquer comprimento, tanto desoxirribonucleótidos como ribonucleótidos, ou seus análogos. Os polinucleótidos podem ter qualquer estrutura tridimensional, e podem desempenhar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os seguintes são exemplos não limitantes de polinucleótidos: regiões codificantes ou não codificantes de um gene ou fragmento de gene, lócus (lócus) definidos a partir de análise de ligação, exões, intrões, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossomal, pequeno RNA de interferência (siRNA), RNA de grampo curto (shRNA), microRNA (miRNA), ribozimas, cDNA, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plasmideos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico, e iniciadores. 0 termo engloba também estruturas tipo ácido nucleico com estruturas principais sintéticas, ver, p.ex., Eckstein, 1991; Baserga et al., 1992; Milligan, 1993; WO 97/03211; WO 96/39154; Mata,1997; Strauss-Soukup, 1997; e Samstag, 1996. Um polinucleótido pode compreender um ou mais nucleótidos modificados, tais como nucleótidos metilados e análogos de nucleótidos. Se presente, as modificações à estrutura de nucleótidos podem ser transmitidas antes ou após montagem do polímero. A sequência de nucleótidos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleótido pode ser adicionalmente modificado após polimerização, tal como por conjugação com um componente de marcação.

Em aspetos da invenção, os termos "RNA quimérico", "RNA guia quimérico", "RNA guia", "RNA guia único" e "RNA guia sintético" são usados indistintamente e referem-se à sequência de polinucleótidos compreendendo a sequência guia, a sequência tracr e a sequência companheira tracr. 0 termo "sequência guia" refere-se à sequência com cerca de 20 pb dentro do RNA guia que especifica o local alvo e pode ser usado indistintamente com os termos "guia" ou "espaçador". O termo "sequência companheira tracr" pode ser também usado indistintamente com o termo "repetição(ões) direta(s)".

Como usado aqui, o termo "tipo selvagem" é um termo da técnica entendido por pessoas peritas e significa a forma típica de um organismo, estirpe, gene ou característica como ocorre na natureza como distinta de formas mutantes ou variantes. Por exemplo, "StCas9 de tipo selvagem" refere-se a Cas9 de tipo selvagem de S. thermophilus, a sequência de proteína da qual é dada na base de dados SwissProt sob o número de acesso G3ECR1. Similarmente, Cas9 de S. pyogenes está incluída em SwissProt sob o número de acesso Q99ZW2.

Como usado aqui, o termo "variante" deve ser tomado para significar a exibição de qualidades que têm um padrão que se desvia do que ocorre na natureza.

Os termos "não ocorrendo naturalmente" ou "manipulado" são usados indistintamente e indicam o envolvimento da mão do homem. Os termos, quando se referem a moléculas de ácido nucleico ou polipéptidos, significam que a molécula de ácido nucleico ou o polipéptido está pelo menos substancialmente isento de pelo menos um outro componente com o qual estão naturalmente associados na natureza e como encontrados na natureza. "Complementaridade" refere-se à capacidade de um ácido nucleico de formar ligação(ões) de hidrogénio com outra sequência de ácido nucleico por emparelhamento de bases de Watson-Crick tradicional ou outros tipos não tradicionais. A percentagem de complementaridade indica a percentagem de resíduos numa molécula de ácido nucleico que pode formar ligações de hidrogénio (p.ex., emparelhamento de bases de Watson-Crick) com uma segunda sequência de ácido nucleico (p.ex., 5, 6, 7, 8, 9, 10 dos 10 sendo 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, e 100% complementares) . "Perfeitamente complementar" significa que todos os resíduos contíguos de uma sequência de ácido nucleico irão fazer ligação de hidrogénio com o mesmo número de resíduos contíguos numa segunda sequência de ácido nucleico. "Substancialmente complementar" como usado aqui refere-se a um grau de complementaridade que é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% em relação a uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, ou mais nucleótidos, ou refere-se a dois ácidos nucleicos que hibridam sob condições estringentes.

Como usadas aqui, "condições estringentes" para hibridação referem-se a condições sob as quais um ácido nucleico tendo complementaridade com uma sequência alvo híbrida predominantemente com a sequência alvo, e não hibrida substancialmente com sequências não alvo. As condições estringentes são geralmente dependentes da sequência, e variam dependendo de um número de fatores. Em geral, quanto mais longa a sequência, mais elevada a temperatura à qual a sequência hibrida especificamente com a sua sequência alvo. Exemplos não limitantes de condições estringentes são descritos em detalhe em Tijssen (1993), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Parte I, Capitulo "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.I. "Hibridação" refere-se a uma reação na qual urn ou mais polinucleótidos reagem para formar um complexo que é estabilizado através de ligação de hidrogénio entre as bases dos resíduos de nucleótidos. A ligação de hidrogénio pode ocorrer por emparelhamento de bases de Watson-Crick, ligação de Hoogstein, ou de qualquer outro modo específico da sequência. 0 complexo pode compreender duas cadeias formando uma estrutura em dúplex, três ou mais cadeias formando um complexo com múltiplas cadeias, uma cadeia única auto-hibridante, ou qualquer combinação destes. A reação de hibridação pode constituir um passo num processo mais vasto, tal como a iniciação da PCR, ou a clivagem de um polinucleótido por uma enzima. Uma sequência capaz de hibridar com uma dada sequência é referida como o "complemento" da dada sequência.

Como usado aqui, o termo "lócus genómico" ou "lócus" (plural lócus) é a localização específica de uma sequência de gene ou DNA num cromossoma. Um "gene" refere-se a traços de DNA ou RNA que codificam um polipéptido ou uma cadeia de RNA que tem papel funcional para desempenhar num organismo e consequentemente é a unidade molecular de hereditariedade em organismos vivos. Para o propósito desta invenção pode ser considerado que os genes incluem regiões que regulam a produção do produto do gene, quer ou não tais sequências reguladoras sejam adjacentes a sequências codificantes e/ou transcritas. Conformemente, um gene inclui, mas não está necessariamente limitado a, sequências promotoras, terminadores, sequências reguladoras translacionais tais como locais de ligação ao ribossoma e locais internos de entrada de ribossoma, intensificadores, silenciadores, isoladores, elementos de fronteira, origens de replicação, locais de anexação à matriz e regiões de controlo de lócus.

Como usado aqui, "expressão de um lócus genómico" ou "expressão de genes" é o processo pelo qual a informação de um gene é usada na sintese de um produto de gene funcional. Os produtos da expressão de genes são frequentemente proteínas, mas, em genes não codificantes de proteínas tais como genes de rRNA ou genes de tRNA, o produto é RNA funcional. 0 processo da expressão de genes é usado por toda a vida conhecida - eucariotas (incluindo organismos multicelulares), procariontes (bactérias e arqueobactérias) e virus para gerar produtos funcionais para sobreviverem. Como usada aqui, "expressão" de um gene ou ácido nucleico engloba não só a expressão de genes celulares, mas também a transcrição e tradução de ácido(s) nucleico (s) em sistemas de clonagem e em qualquer outro contexto. Como usada aqui, "expressão" refere-se também ao processo pelo qual um polinucleótido é transcrito a partir de um molde de DNA (tal como em e mRNA ou outro transcrito de RNA) e/ou o processo pelo qual um mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em péptidos, polipéptidos, ou proteínas. Os transcritos e polipéptidos codificados podem ser coletivamente referidos como "produto de genes". Se o polinucleótido for derivado de DNA genómico, a expressão pode incluir processamento do mRNA numa célula eucariótica.

Os termos "polipéptido", "péptido" e "proteína" são usados indistintamente aqui para se referirem a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. 0 polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados, e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos englobam também um polímero de aminoácidos que foi modificado; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação, tal como conjugação com um componente de marcação. Como usado aqui, o termo "aminoácido" inclui aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e ambos os isómeros óticos D ou L, e análogos de aminoácidos e peptidomiméticos.

Como usado aqui, o termo "domínio" ou "domínio de proteína" refere-se a uma parte de uma sequência de proteína que pode existir e funcionar independentemente do resto da cadeia de proteína.

Como descrito em aspetos da invenção, a identidade de sequências está relacionada com homologia de sequências. Comparações de homologia podem conduzidas a olho, ou, mais usualmente, com o auxílio de programas de comparação de sequências prontamente disponíveis. Estes programas de computador comercialmente disponíveis podem calcular a percentagem (%) de homologia entre duas ou mais sequências e podem também calcular a identidade de sequências partilhada por duas ou mais sequências de aminoácidos ou ácido nucleico. Homologias de sequências podem ser geradas por qualquer um de um número de programas de computador conhecidos na técnica, por exemplo, BLAST ou FASTA, etc. Um programa de computador adequado para levar a cabo um tal alinhamento é o pacote GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, E.U.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids

Research 12: 387) . Exemplos de outros softwares que podem realizar comparações de sequências incluem o, mas não estão limitados ao, pacote BLAST (ver Ausubel et al., 1999 ibid -Capitulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) e o GENEWORKS suite de ferramentas de comparação. Ambos o BLAST e o FASTA estão disponíveis para pesquisa offline e online (ver Ausubel et al., 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60) . No entanto é preferencial usar o programa GCG Bestfit. A % de homologia pode ser calculada ao longo de sequências contíguas, i.e., uma sequência é alinhada com a outra sequência e cada aminoácido ou nucleótido numa sequência é diretamente comparado com o aminoácido ou nucleótido correspondente na outra sequência, um resíduo de cada vez. Isto é chamado um alinhamento "sem intervalos". Tipicamente, tais alinhamentos sem intervalos são realizados somente sobre um número relativamente curto de resíduos.

Embora este seja um método muito simples e consistente falha em ter em consideração que, por exemplo, num par de sequências de um outro modo idênticas, uma inserção ou eliminação pode fazer com os seguintes resíduos de aminoácidos sejam colocados fora de alinhamento, logo resultando potencialmente numa grande redução na % de homologia quando é realizado um alinhamento global. Consequentemente, a maioria dos métodos de comparação de sequências é desenhada para produzir alinhamentos ótimos que têm em consideração possíveis inserções e eliminações sem penalizar indevidamente a pontuação de homologia ou identidade global. Isto é alcançado por inserção de intervalos no alinhamento de sequências para tentar maximizar a homologia ou identidade local.

No entanto, estes métodos mais complexos atribuem "penalidades de intervalo" a cada intervalo que ocorre no alinhamento tal que, para o mesmo número de aminoácidos idênticos, um alinhamento de sequências com tão poucos intervalos quanto possível - refletindo relação mais elevada entre as duas sequências comparadas - pode alcançar uma pontuação mais elevada do que um com muitos intervalos. Os "custos de intervalos de afinidade" são tipicamente usados que cobrar um custo relativamente elevado para a existência de um intervalo e uma penalidade mais baixa para cada resíduo subsequente no intervalo. Este é o sistema de pontuação de intervalos mais comummente usado. Elevadas penalidades de intervalos podem, obviamente, produzir alinhamentos otimizados com menos intervalos. A maioria dos programas de alinhamento permite que as penalidades de intervalos sejam modificadas. No entanto é preferencial usar os valores pré-definidos quando se usa tal software para comparações de sequências. Por exemplo, quando se usa o pacote GCG Wisconsin Bestfit, a penalidade de intervalo pré-definida para sequências de aminoácidos é -12 para um intervalo e -4 para cada extensão. 0 cálculo da % de homologia máxima requer portanto em primeiro lugar a produção de um alinhamento ótimo, tomando em consideração penalidades de intervalos. Um programa de computador adequado para levar a cabo tal alinhamento é o pacote GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al., 1984 Nuc. Acids Research 12 p387) . Exemplos de outros softwares que podem realizar comparações de sequências incluem o, mas não estão limitados ao, pacote BLAST (ver Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4a Ed. - Capítulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410) e a GENEWORKS suite de ferramentas de comparação. Ambos o BLAST e o FASTA estão disponíveis para pesquisa offline e online (ver Ausubel et al., 1999 Short Protocols in

Molecular Biology, páginas 7-58 a 7-60). No entanto, para algumas aplicações, é preferencial usar o programa GCG Bestfit. Uma nova ferramenta, chamada BLAST 2 Sequences, está também disponível para comparação de sequências de proteínas e nucleótidos (ver FEMS Microbiol Lett. 1999 174 (2): 247-50; FEMS Microbiol Lett. 1999 177 (1): 187-8 e ο website do National Center for Biotechnology information no website dos National Institutes for Health).

Embora a % de homologia final possa ser medida em termos de identidade, o próprio processo de alinhamento não é tipicamente baseado numa comparação de pares tudo-ou-nada. Ao invés é geralmente usada uma matriz de pontuação de similaridade escalonada que atribui pontuações a cada comparação de pares com base na similaridade química ou distância evolutiva. Um exemplo de uma tal matriz comummente usada é a matriz BLOSUM62 - a matriz pré-definida para o BLAST suite de programas. Os programas GCG Wisconsin usam geralmente os valores pré-definidos públicos ou uma tabela de comparação de símbolo customizada, se fornecida (ver manual do utilizador para detalhes adicionais). Para algumas aplicações é preferencial usar os valores pré-definidos públicos para o pacote GCG, ou, no caso de outro software, a matriz pré-definida, tal como BLOSUM62.

Alternativamente, a percentagem de homologia pode ser calculada usando a função de alinhamento múltiplo em DNASIS™ (Hitachi Software), com base num algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988) , Gene 73 (1), 237-244). Logo o software tenha produzido um alinhamento ótimo é possível calcular a % de homologia,

preferencialmente a % de identidade de sequências. O software faz tipicamente isto como parte da comparação de sequências e gera um resultado numérico.

As sequências podem também ter eliminações, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos que produzem uma mudança silenciosa e resultam numa substância funcionalmente equivalente. Substituições deliberadas de aminoácidos podem ser feitas com base na similaridade nas propriedades de aminoácidos (tais como polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e/ou a natureza anfipática dos resíduos) e é portanto útil agrupar os aminoácidos em conjunto em grupos funcionais. Os aminoácidos podem ser agrupados em conjunto com base nas propriedades das suas cadeias laterais sozinhas. No entanto é mais útil incluir dados de mutação também. É provável que os conjuntos de aminoácidos assim derivados sejam conservados por razões estruturais. Estes conjuntos podem ser descritos na forma de um diagrama de Venn (Livingstone C.D. e Barton G.J. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput. Appl. Biosci. 9: 745-756) (Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J. Theor. Biol. 119; 205-218). Podem ser feitas substituições conservativas, por exemplo de acordo com a tabela em baixo que descreve agrupamento por diagrama de Venn geralmente aceite de aminoácidos.

Conjunto Subconjunto

Hidrofóbico FWYHKMILVAGC Aromático F W Y H

Alifático I L V

Polar WYHKREDCSTNQ Carregado Η K R E D

Carregado Η K R positivamente

Carregado E D negativamente

Pequeno VCAGSPTND Minúsculo A G S

Formas de realização da invenção incluem sequências (tanto de polinucleótidos como de polipéptidos) que podem compreender substituição homóloga (substituição e reposição são ambas usadas aqui para significar o intercâmbio de um resíduo de aminoácido ou nucleótido existente por um resíduo ou nucleótido alternativo) que podem ocorrer, i.e., substituição similar-por-similar no caso de aminoácidos tais como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. Pode também ocorrer substituição não homóloga, i.e., de uma classe de resíduo para outra ou alternativamente envolvendo a inclusão de aminoácidos não naturais tais como ornitina (doravante referida como Z), ornitina de ácido diaminobutírico (doravante referida como B) , ornitina norleucina (doravante referida como 0) , piridilalanina, tienilalanina, naftilalanina e fenilglicina.

Sequências de aminoácidos variantes podem incluir grupos espaçadores adequados que podem ser inseridos entre quaisquer dois resíduos de aminoácidos da sequência incluindo grupos alquilo tais como grupos metilo, etilo ou propilo adicionalmente aos espaçadores de aminoácidos tais como resíduos de glicina ou β-alanina. Uma forma de variação adicional, que envolve a presença de um ou mais resíduos de aminoácidos na forma de peptoide, pode ser bem entendida por aqueles peritos na técnica. Para que não restem dúvidas, "a forma de peptoide" é usada para se referir a resíduos de aminoácidos variantes em que o grupo substituinte de α-carbono está no átomo de nitrogénio do resíduo em vez de no α-carbono. Processos para preparação de péptidos na forma de peptoide são conhecidos na técnica, em por exemplo Simon RJ et al., PNAS (1992) 89 (20), 9367-9371 e Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13 (4), 132-134 .

A prática da presente invenção emprega, a não ser que de outro modo indicado, técnicas convencionais de imunologia, bioquimica, quimica, biologia molecular, microbiologia, biologia celular, genómica e DNA recombinante, que estão dentro do âmbito da técnica. Ver Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONLNG: A LABORATORY MANUAL, 2a edição (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. Μ. Ausubel, et al. eds., (1987)); a série METHODS IN

ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL

APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow e Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, AND ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987)).

Num aspeto, a invenção proporciona vetores que são usados na manipulação e otimização de sistemas CRISPR-Cas.

Como usado aqui, um "vetor" é uma ferramenta que permite ou facilita a transferência de uma entidade de um ambiente para outro. É um replicão, tal como um plasmídeo, fago, ou cosmideo, no qual outro segmento de DNA pode ser inserido de modo a provocar a replicação do segmento inserido. Geralmente, um vetor é capaz de replicação quando associado aos elementos de controlo apropriados. Em geral, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Os vetores incluem, mas não estão limitados a, moléculas de ácido nucleico que têm cadeia simples, cadeia dupla, ou parcialmente de cadeia dupla; moléculas de ácido nucleico que compreendem uma ou mais extremidades livres, nenhumas extremidades livres (p.ex., circular); moléculas de ácido nucleico que compreendem DNA, RNA, ou ambos; e outras variedades de polinucleótidos conhecidas na técnica. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma ansa de DNA de cadeia dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser inseridos, tal como por técnicas de clonagem molecular padrão. Outro tipo de vetor é um vetor virai, em que sequências de DNA ou RNA derivadas de virus estão presentes no vetor para empacotamento num virus (p.ex., retrovirus, retrovirus defeituosos em termos de replicação, adenovirus, adenovirus defeituosos em termos de replicação, e virus adenoassociados (AAV)). Os vetores virais incluem também polinucleótidos transportados por um virus para transfecção numa célula hospedeira. Certos vetores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira na qual são introduzidos (p.ex., vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores epissomais de mamíferos). Outros vetores (p.ex., vetores não epissomais de mamiferos) são integrados no genoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira, e deste modo são replicados em conjunto com o genoma do hospedeiro. Além do mais, certos vetores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão". Vetores de expressão comuns de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos.

Os vetores de expressão recombinantes podem compreender um ácido nucleico da invenção numa forma adequada para expressão do ácido nucleico numa célula hospedeira, o que significa que os vetores de expressão recombinantes incluem um ou mais elementos reguladores, que podem ser selecionados com base nas células hospedeiras a serem usadas para expressão, que estão operacionalmente ligados à sequência de ácido nucleico a ser expressa. Dentro de um vetor de expressão recombinante, "operacionalmente ligado" pretende significar que a sequência de nucleótidos de interesse está ligada ao (s) elemento(s) regulador(es) de um modo que permite a expressão da sequência de nucleótidos (p.ex., num sistema de transcrição/tradução in vitro ou numa célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). No que diz respeito a métodos de recombinação e clonaqem é feita menção ao pedido de Patente dos E.U.A. publicação US 2004-0171156 AI.

Aspetos da invenção relacionam-se com vetores bicistrónicos para RNA quimérico e Cas9. São preferenciais vetores de expressão bicistrónicos para RNA quimérico e Cas9. Em qeral e particularmente nesta forma de realização, a Cas9 é preferencialmente dirigida pelo promotor CBh. O RNA quimérico pode ser preferencialmente dirigido por um promotor U6. Idealmente, os dois são combinados. O RNA guia quimérico consiste tipicamente numa sequência guia de 20 pb (Ns) e esta pode estar unida à sequência tracr (indo do primeiro "U" da cadeia inferior à extremidade do transcrito). A sequência tracr pode estar truncada em várias posições como indicado. As sequências guia e tracr estão separadas pela sequência companheira tracr, que pode ser GUUUUAGAGCUA. Esta pode ser seguida por uma sequência em ansa GAAA como mostrado. Ambas estas são exemplos preferenciais. Os Requerentes demonstraram indels mediadas por Cas9 nos lócus EMX1 e PVALB humanos por ensaios SURVEYOR. Os chiRNAs estão indicados pela sua designação "+n", o crRNA refere-se a um RNA hibrido onde as sequências guia e tracr são expressas como transcritos separados. Ao longo deste pedido, o RNA quimérico pode ser também chamado guia único, ou RNA guia sintético (sgRNA). A ansa é preferencialmente GAAA, mas não está limitada a esta sequência ou de facto somente a 4 pb em comprimentos. De facto, sequências formadoras de ansa preferenciais para uso em estruturas em grampo têm quatro nucleótidos de comprimento, e o mais preferencialmente têm a sequência GAAA. No entanto, sequências em ansa mais longas e mais curtas podem ser usadas, como o podem sequências alternativas. As sequências incluem preferencialmente um tripleto de nucleótidos (por exemplo, AAA), e um nucleótido adicional (por exemplo, C ou G) . Exemplos de sequências formadoras de ansa incluem CAAA e AAAG. 0 termo "elemento regulador" destina-se a incluir promotores, intensificadores, locais internos de entrada de ribossoma (IRES), e outros elementos de controlo de expressão (p.ex., sinais de terminação da transcrição, tais como sinais de poliadenilação e sequências de poli-U). Tais elementos reguladores são descritos, por exemplo, em Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Os elementos reguladores incluem aqueles que dirigem a expressão constitutiva de uma sequência de nucleótidos em muitos tipos de célula hospedeira e aqueles que dirigem a expressão da sequência de nucleótidos somente em certas células hospedeiras (p.ex., sequências reguladoras especificas de tecido) . Um promotor especifico de tecido pode dirigir a expressão principalmente num tecido de interesse desejado, tal como músculo, neurónio, osso, pele, sangue, órgãos específicos (p.ex., fígado, pâncreas), ou tipos de células particulares (p.ex., linfócitos). Os elementos reguladores podem também dirigir a expressão de uma forma dependente do tempo, tal como de uma forma dependente do ciclo celular ou dependente da etapa de desenvolvimento, que pode ou não também ser específica de tecido ou tipo de célula. Em algumas formas de realização, um vetor pode compreender um ou mais promotores pol III (p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, ou mais promotores pol III), um ou mais promotores pol II (p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, ou mais promotores pol II), um ou mais promotores pol I (p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, ou mais promotores pol I), ou suas combinações. Exemplos de promotores pol III incluem, mas não estão limitados a, promotores U6 e Hl. Exemplos de promotores pol II incluem o, mas não estão limitados ao, promotor LTR do virus retroviral do sarcoma de Rous (RSV) (opcionalmente com o intensificador RSV), o promotor do citomegalovirus (CMV) (opcionalmente com o intensif icador de CMV) [ver, p.ex., Boshart et al. Cell, 41: 521-530 (1985)], o promotor de SV40, o promotor da diidrofolato reductase, o promotor da β-actina, o promotor da fosfoglicerol cinase (PGK), e o promotor de EFla. Também englobados pelo termo "elemento regulador" estão elementos intensificadores, tais como WPRE; Intensif icadores de CMV; o segmento R-U5' em LTR de HTLV-I (Mol. Cell. Biol., Vol. 8 (1), p. 466-472, 1988); intensificador de SV40; e a sequência de intrão entre os exões 2 e 3 de β-globina de coelho (Proc. Natl. Acad. Sei. USA., Vol. 78 ( 3), p. 1527-31, 1981). Será apreciado por aqueles peritos na técnica que o desenho do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nivel de expressão desejado, etc. Um vetor pode ser introduzido em células hospedeiras para produzir deste modo transcritos, proteínas, ou péptidos, incluindo proteínas ou péptidos de fusão, codificados por ácidos nucleicos como descrito aqui (p.ex., transcritos de repetições curtas palindrómicas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR), proteínas, enzimas, suas formas mutantes, suas proteínas de fusão, etc.). No que diz respeito a sequências reguladoras é feita menção ao pedido de patente dos E.U.A. publicação US 2004-0242517 Al. No que diz respeito aos promotores é feita menção à publicação PCT WO 2011/028929 e pedido de patente dos E.U.A. publicação US 2011-002739A1.

Os vetores podem ser desenhados para expressão de transcritos de CRISPR (p.ex., transcritos de ácidos nucleicos, proteínas, ou enzimas) em células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, os transcritos de CRISPR pode ser expressos em células bacterianas tais como Escherichia coli, células de inseto (usando vetores de expressão de baculovírus), células de levedura, ou células de mamífero. Células hospedeiras adequadas são discutidas adicionalmente em Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo usando sequências reguladoras do promotor T7 e polimerase T7.

Os vetores podem ser introduzidos e propagados num procariota ou célula procariótica. Em algumas formas de realização, um procariota é usado para amplificar cópias de um vetor a ser introduzido numa célula eucariótica ou como um vetor intermédio na produção de um vetor a ser introduzido numa célula eucariótica (p.ex., amplificação de um plasmídeo como parte de um sistema de empacotamento de vetor virai) . Em algumas formas de realização, um procariota é usado para amplificar cópias de um vetor e expressar um ou mais ácidos nucleicos, de modo a proporcionar uma fonte de uma ou mais proteínas para administração a uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro. A expressão de proteínas em procariotas é o mais frequentemente levado a cabo em Escherichia coli com vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis dirigindo a expressão de proteínas de fusão ou não fusão. Os vetores de fusão adicionam um número de aminoácidos a uma proteína codificada por eles, tal como ao terminal amino da proteína recombinante. Tais vetores de fusão podem servir um ou mais propósitos, tais como: (i) para aumentar a expressão de proteína recombinante; (ii) para aumentar a solubilidade da proteína recombinante; e (iii) auxiliar na purificação da proteína recombinante atuando como um ligando em purificação por afinidade. Frequentemente, em vetores de expressão de fusão, um local de clivagem proteolitica é introduzido na junção da fração de fusão e da proteina recombinante para permitir separação da proteina recombinante a partir da fração de fusão

subsequente à purificação da proteina de fusão. Tais enzimas, e as suas sequências de reconhecimento cognatas, incluem Fator Xa, trombina e enterocinase. Vetores de expressão de fusão exemplares incluem pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith e Johnson, 1988. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que funde glutationa S-transferase (GST), proteina de ligação a maltose E, ou proteina A, respetivamente, à proteina recombinante alvo.

Exemplos de vetores de expressão de E. coli não fusão induziveis adequados incluem pTrc (Amrann et al., (1988)

Gene 69:301-315) e pET lid (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89).

Em algumas formas de realização, um vetor é um vetor de expressão de levedura. Exemplos de vetores para expressão na levedura Saccharomyces cerivisae incluem pYepSecl (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kuijan e Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen

Corporation, San Diego, Calif.), e picZ (Invitrogen Corp, San Diego, Calif.).

Em algumas formas de realização, um vetor dirige a expressão de proteínas em células de inseto usando vetores de expressão de baculovírus. Vetores de baculovírus disponíveis para expressão de proteínas em células de inseto cultivadas (p.ex., células SF9) incluem a série pAc (Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) e a série pVL (Lucklow e Summers, 1989. Virology 170: 31-39).

Em algumas formas de realização, um vetor é capaz de dirigir a expressão de uma ou mais sequências em células de mamífero usando um vetor de expressão de mamífero. Exemplos de vetores de expressão de mamífero incluem pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) e pMT2PC (Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195). Quando usados em células de mamífero, as funções de controlo dos vetores de expressão são tipicamente proporcionadas por um ou mais elementos reguladores. Por exemplo, os promotores comummente usados são derivados de polioma, adenovirus 2, citomegalovírus, vírus de símio 40, e outros divulgados aqui e conhecidos na técnica. Para outros sistemas de expressão adequados para células tanto procarióticas como eucarióticas ver, p.ex., Capítulos 16 e 17 de Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. I. , 1989.

Em algumas formas de realização, o vetor de expressão de mamífero recombinante é capaz de dirigir a expressão do ácido nucleico preferencialmente num tipo de célula particular (p.ex., elementos reguladores específicos de tecido são usados para expressar o ácido nucleico). Elementos reguladores específicos de tecido são conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes de promotores específicos de tecido adequados incluem o promotor da albumina (específico de fígado; Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277), promotores específicos de linfoides (Calame e Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275), em particular promotores de recetores de células T (Winoto e

Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733) e imunoglobulinas (Baneiji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen e Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748), promotores específicos de neurónios (p.ex., o promotor de neurofilamentos; Byrne e Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 5473-5477), promotores específicos do pâncreas (Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916), e promotores específicos das glândula mamárias (p.ex., promotor do soro de leite; Pat. dos E.U.A. No. 4,873,316 e Publicação do Pedido Europeu No. 264,166). Promotores regulados pelo desenvolvimento estão também englobados, p.ex., os promotores hox de murino (Kessel e Gruss, 1990. Science 249: 374-379) e o promotor da α-fetoproteína (Campes e Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546). No que diz respeito a estes vetores procarióticos e eucarióticos é feita menção à Patente dos E.U.A. 6,750,059. Outras formas de realização da invenção podem relacionar-se com o uso de vetores virais, no que diz respeito ao qual é feita menção ao pedido de Patente dos E.U.A. publicação US 2012-0003201 Al. Elementos reguladores específicos de tecido são conhecidos na técnica e, a este respeito, é feita menção à Patente dos E.U.A 7,776,321.

Em algumas formas de realização, um elemento regulador está operacionalmente ligado a um ou mais elementos de um sistema CRISPR de modo a dirigir a expressão do um ou mais elementos do sistema CRISPR. Em geral, as CRISPRs (Repetições Curtas Palindrómicas Agrupadas Regularmente Interespaçadas), também conhecidas como SPIDRs (Repetições Diretas Interespaçadas Espaçadoras), constituem uma família de lócus de DNA que são usualmente específicos de uma espécie bacteriana particular. O lócus CRISPR pode compreender uma classe distinta de repetições de sequências curtas interespaçadas (SSRs) que foram reconhecidas em E. coli (Ishino et al., J. Bacteriol., 169: 5429-5433 [1987]; e Nakata et al., J. Bacteriol., 171: 3553-3556 [1989]), e genes associados. SSRs interespaçadas similares foram identificadas em Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena, e Mycobacterium tuberculosis (Ver, Groenen et al., Mol. Microbiol., 10: 1057-1065 [1993]; Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5: 254-263 [1999]; Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307: 26-30 [1996]; e Mojica et al., Mol. Microbiol., 17: 85-93 [1995]). Os lócus CRISPR diferem tipicamente de outras SSRs pela estrutura das repetições, que foram denominadas repetições curtas regularmente espaçadas (SRSRs) (Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6: 23-33 [2002]; e Mojica et al., Mol. Microbiol., 36: 244-246 [2000]). Em geral, as repetições são elementos curtos que ocorrem em agrupamentos que são regularmente espaçados por sequências intervenientes únicas com um comprimento substancialmente constante (Mojica et al., [2000], supra). Embora as sequências de repetições sejam altamente conservadas entre estirpes, o número repetições interespaçadas e as sequências das regiões espaçadoras diferem tipicamente de estirpe para estirpe (van Embden et al., J. Bacteriol., 182: 2393-2401 [2000]). Foram identificados lócus CRISPR em mais do que 40 procariotas (Ver, p.ex., Jansen et al., Mol. Microbiol., 43: 1565-1575 [2002]; e Mojica et al., [2005]) incluindo mas não se limitando a Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella,

Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella,

Xanthomonas, Yersinia, Treponema, e Thermotoga.

Em geral, "sistema CRISPR" refere-se coletivamente a transcritos e outros elementos envolvidos na expressão de ou direcionamento da atividade de genes associados a CRISPR ("Cas"), incluindo sequências codificando um gene Cas, uma sequência tracr (CRISPR de transativação) (p.ex., tracrRNA ou um tracrRNA parcialmente ativo), uma sequência companheira tracr (englobando uma "repetição direta" e uma repetição direta parcial processada por tracrRNA no contexto de um sistema endógeno de CRISPR), uma sequência guia (também referida como um "espaçador" no contexto de um sistema endógeno de CRISPR), ou outras sequências e transcritos de um lócus de CRISPR. Em formas de realização da invenção, os termos sequência guia e RNA guia são usados indistintamente. Em algumas formas de realização, um ou mais elementos de um sistema CRISPR são derivados de um sistema CRISPR do tipo I, tipo II, ou tipo III. Em algumas formas de realização, um ou mais elementos de um sistema CRISPR são derivados de um organismo particular que pode compreender um sistema endógeno de CRISPR, tal como Streptococcus pyogenes. Em geral, um sistema CRISPR é caracterizado por elementos que promovem a formação de um complexo CRISPR no local de uma sequência alvo (também referido como um protoespaçador no contexto de um sistema endógeno CRISPR). No contexto da formação de um complexo CRISPR, "sequência alvo" refere-se a uma sequência à qual uma sequência guia é desenhada para ter complementaridade, onde a hibridação entre uma sequência alvo e uma sequência guia promove a formação de um complexo CRISPR. Uma sequência alvo pode compreender qualquer polinucleótido, tal como polinucleótidos de DNA ou RNA. Em algumas formas de realização, uma sequência alvo está localizada no núcleo ou citoplasma de uma célula.

Em formas de realização preferenciais da invenção, ο sistema CRISPR é um sistema CRISPR do tipo II e a enzima Cas é Cas9, que catalisa a clivagem de DNA. A ação enzimática por Cas9 derivada de Streptococcus pyogenes ou qualquer Cas9 intimamente relacionada gera quebras de cadeia dupla em sequências do local alvo que hibridam com 20 nucleótidos da sequência guia e que têm uma sequência de motivo adjacente protoespaçador (PAM) NGG após os 20 nucleótidos da sequência alvo. A atividade de CRISPR através de Cas 9 para reconhecimento e clivagem de DNA específicos do local é definida pela sequência guia, pela sequência tracr que híbrida em parte com a sequência guia e pela sequência de PAM. Mais aspetos do sistema CRISPR são descritos em Karginov e Hannon, The CRISPR system: small RNA-guided defence in bacteria and archaea, Mole Cell 15 de janeiro, 2010; 37(1): 7. O lócus CRISPR do tipo II de Streptococcus pyogenes SF370 contém um agrupamento de quatro genes Cas9, Casl, Cas2, e Csnl, bem como dois elementos de RNA não codif icantes, tracrRNA e uma matriz característica de sequências repetitivas (repetições diretas) interespaçadas por troços curtos de sequências não repetitivas (espaçadores, cerca de 30 pb cada). Neste sistema é gerada quebra de cadeia dupla (DSB) do DNA alvo em quatro passos sequenciais (Fig. 2A) . Em primeiro lugar, dois RNAs não codificantes, a matriz pré-crRNA e tracrRNA são transcritos a partir do lócus CRISPR. Em segundo lugar, o tracrRNA híbrida com as repetições diretas de pré-crRNA, que é depois processado em crRNAs maduros contendo sequências espaçadoras individuais. Em terceiro lugar, o complexo crRNA:tracrRNA maduro dirige Cas9 para o alvo de DNA consistindo no protoespaçador e no PAM correspondente através da formação de heterodúplex entre a região espaçadora do crRNA e o DNA protoespaçador.

Finalmente, a Cas9 medeia a clivagem do DNA alvo a montante de PAM para criar uma DSB dentro do protoespaçador (Figura 2A) . A Fig. 2B demonstra a localização nuclear da Cas9 com otimização de codões. Para promover a iniciação precisa da transcrição, o promotor U6 baseando em RNA polimerase III foi selecionado para dirigir a expressão de tracrRNA (Figura 2C) . Similarmente, um constructo baseando no promotor U6 foi desenvolvido para expressar uma matriz de pré-crRNA consistindo num único espaçador flanqueado por duas repetições diretas (DRs, também englobadas pelo termo "sequências companheiras tracr"; Figura 2C) . 0 espaçador inicial foi desenhado para visar um local alvo com 33 pares de bases (pb) (protoespaçador de 30 pb mais uma sequência de motivo (PAM) de CRISPR de 3 pb satisfazendo o motivo de reconhecimento NGG de Cas9) no lócus EMXl humano (Figura 2C) , um gene-chave no desenvolvimento do córtex cerebral.

Tipicamente, no contexto de um sistema endógeno de CRISPR, a formação de um complexo CRISPR (que pode compreender uma sequência guia hibridada com uma sequência alvo e complexada com uma ou mais proteínas Cas) resulta na clivagem de uma das ou ambas as cadeias dentro ou na proximidade (p.ex., dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, ou mais pares de bases) da sequência alvo. Sem se pretender ficar limitado pela teoria, a sequência tracr, que pode compreender ou consistir em toda ou uma porção de uma sequência tracr de tipo selvagem (p.ex., cerca de ou mais do que cerca de 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85, ou mais nucleótidos de uma sequência tracr de tipo selvagem), pode também formar parte de um complexo CRISPR, tal como por hibridação ao longo pelo menos de uma porção da sequência tracr com toda ou uma porção de uma sequência companheira tracr que está operacionalmente ligada à sequência guia. Em algumas formas de realização, um ou mais vetores dirigindo a expressão de um ou mais elementos de um sistema CRISPR são introduzidos numa célula hospedeira tal que a expressão dos elementos do sistema CRISPR dirijam a formação de um complexo CRISPR num ou mais locais alvo. Por exemplo, uma enzima Cas, uma sequência guia ligada a uma sequência companheira tracr, e uma sequência tracr poderiam cada uma estar operacionalmente ligadas para separar elementos reguladores em vetores separados. Alternativamente, dois ou mais dos elementos expressos a partir dos mesmos ou diferentes elementos reguladores podem ser combinados num único vetor, com um ou mais vetores adicionais proporcionando quaisquer componentes do sistema CRISPR não incluídos no primeiro vetor. Os elementos do sistema CRISPR que são combinados num único vetor podem estar dispostos em qualquer orientação adequada, tal como um elemento localizado 5' no que diz respeito a ("a montante" de) ou 3' no que diz respeito a ("a jusante" de) um segundo elemento. A sequência codificante de um elemento pode estar localizada na mesma ou cadeia oposta da sequência codificante de um segundo elemento, e orientada na mesma ou direção oposta. Em algumas formas de realização, um único promotor dirige a expressão de um transcrito codificando uma enzima CRISPR e um ou mais da sequência guia, sequência companheira tracr (opcionalmente operacionalmente ligada à sequência guia), e uma sequência tracr embebida dentro de uma ou mais sequências de intrão (p.ex., cada uma num intrão diferente, duas ou mais em pelo menos um intrão, ou todas num único intrão). Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR, a sequência guia, sequência companheira tracr, e sequência tracr estão operacionalmente ligadas ao e expressadas a partir do mesmo promotor.

Em algumas formas de realização, um vetor pode compreender um ou mais locais de inserção, tais como uma sequência de reconhecimento de endonuclease de restrição (também referida como um "local de clonagem"). Em algumas formas de realização, um ou mais locais de inserção (p.ex., cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais locais de inserção) estão localizados a montante e/ou a jusante de um ou mais elementos de sequência de um ou mais vetores. Em algumas formas de realização, um vetor pode compreender um local de inserção a montante de uma sequência companheira tracr, e opcionalmente a jusante de um elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência companheira tracr, tal que, após inserção de uma sequência guia no local de inserção e após expressão, a sequência guia dirija a ligação especifica da sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo numa célula eucariótica. Em algumas formas de realização, um vetor pode compreender dois ou mais locais de inserção, estando cada local de inserção localizado entre duas sequências companheiras tracrs de modo a permitir inserção de uma sequência guia em cada local. Numa tal disposição, as duas ou mais sequências guia podem compreender duas ou mais cópias da única sequência guia, duas ou mais sequências guia diferentes, ou combinações destas. Quando são usadas múltiplas sequências guia diferentes, um único constructo de expressão pode ser usado para dirigir a atividade de CRISPR a múltiplas sequências alvo correspondentes, diferentes dentro de uma célula. Por exemplo, um único vetor pode compreender cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, ou mais sequências guia. Em algumas formas de realização podem ser proporcionados cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais de tais vetores contendo sequências guia, e opcionalmente administrados a uma célula.

Em algumas formas de realização, um vetor pode compreender um elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência codificante de enzima codificando uma enzima CRISPR, tal como um proteína Cas. Exemplos não limitantes de proteínas Cas incluem Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também conhecidas como Csnl e Csxl2), Casl07 Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, CsxlO, Csxl6, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4, seus homólogos, ou suas versões modificadas. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR não modificada tem atividade de clivagem de DNA, tal como Cas9. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR dirige a clivagem de uma das ou ambas as cadeias na localização de uma sequência alvo, bem como dentro da sequência alvo e/ou dentro do complemento da sequência alvo. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR dirige a clivagem de uma das ou ambas as cadeias dentro de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, ou mais pares de bases do primeiro ou último nucleótido de uma sequência alvo. Em algumas formas de realização, um vetor codifica uma enzima CRISPR que está mutada a no que diz respeito a uma enzima de tipo selvagem correspondente tal que a enzima CRISPR mutada não tenha a capacidade de clivar uma das ou ambas as cadeias de um polinucleótido alvo contendo uma sequência alvo. Por exemplo, uma substituição de aspartato por alanina (D10A) no domínio catalítico RuvC I de Cas 9 de S. pyogenes converte a Cas9 de uma nuclease que cliva ambas as cadeias numa nickase (cliva uma única cadeia). Outros exemplos de mutações que tornam a Cas9 numa nickase incluem, sem limitação, H840A, N854A, e N863A. Como um exemplo adicional, dois ou mais domínios catalíticos da Cas9 (RuvC I, RuvC II, e RuvC III ou o domínio HNH) podem ser mutados para produzir uma Cas9 mutada não tendo substancialmente toda a atividade de clivagem de DNA. Em algumas formas de realização, uma mutação D10A é combinada com uma ou mais das mutações H840A, N854A, ou N863A para produzir uma enzima Cas9 não tendo substancialmente qualquer atividade de clivaqem de DNA. Em alqumas formas de realização, uma enzima CRISPR é considerada como não tendo substancialmente toda a atividade de clivagem de DNA quando a atividade de clivagem de DNA da enzima mutada é menos do que cerca de 25%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01%, ou menos no que diz respeito à sua forma não mutada. Onde a enzima não é SpCas9 podem ser feitas mutações em qualquer um dos ou todos os resíduos correspondendo às posições 10, 762, 840, 854, 863 e/ou 986 de SpCas9 (que podem ser determinadas por exemplo por ferramentas de comparação de sequências padrão). Em particular, qualquer uma das ou todas as seguintes mutações são preferenciais em SpCas9: D10A, E762A, H840A, N854A, N863A e/ou D986A; bem como substituição conservativa de qualquer um dos aminoácidos de substituição é também pretendida. O mesmo (ou substituições conservativas destas mutações) em posições correspondentes em outras Cas9 é também preferencial. São particularmente preferenciais D10 e H840 em SpCas9. No entanto, em outras Cas9s, são também preferenciais resíduos correspondendo a D10 e H840 de SpCas9.

Uma substituição de aspartato por alanina (D10A) no domínio catalítico RuvC I de SpCas9 foi manipulada para converter a nuclease numa nickase (SpCas9n) (ver, p.ex., Sapranauskas et ai., 2011, Nucleic Acids Research, 39: 9275; Gasiunas et ai., 2012, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 109: E2579), tal que o DNA genómico cortado seja submetido a reparação dirigida por homologia (HDR) de elevada fidelidade. O ensaio Surveyor confirmou que SpCas9n não gera indels no alvo protoespaçador EMX. A coexpressão de crRNA quimérico visando EMX1 (tendo também o componente tracrRNA) com SpCas9 produziu indels no local alvo, ao passo que a coexpressão com SpCas9n não (n = 3) . Além do mais, a sequenciação de 327 amplicões não deteta quaisquer indels induzidas por SpCas9n. 0 mesmo lócus foi selecionado para testar a HR mediada por CRISPR por cotransfecção de células HEK 293FT com o RNA quimérico visando EMX1, hSpCas9 ou hSpCas9n, bem como um molde de HR para introduzir um par de locais de restrição (HindIII e Nhel) próximo do protoespaçador.

Ortólogos preferenciais são descritos aqui. Uma enzima Cas pode ser identificada Cas9 pois esta refere-se à classe geral de enzimas que partilham homologia com a maior nuclease com múltiplos dominios de nuclease do sistema CRISPR do tipo II. 0 mais preferencialmente, a enzima Cas9 é de, ou é derivada de, SpCas9 ou SaCas9. Por derivada, os Requerentes pretendem que a enzima derivada seja largamente baseada, no sentido de ter um elevado grau de homologia de sequências com, uma enzima de tipo selvagem, mas que foi mutada (modificada) de algum modo como descrito aqui.

Em algumas formas de realização, uma sequência codificante de enzima codificando uma enzima CRISPR tem otimização de codões para expressão em células particulares, tais como células eucarióticas. As células eucarióticas podem ser aquelas de ou derivadas de um organismo particular, tal como um mamífero, incluindo mas não se limitando a humano, camundongo, rato, coelho, cão, ou primata não humano. Em geral, a otimização de codões refere-se a um processo de modificação de uma sequência de ácido nucleico para expressão intensificada nas células hospedeiras de interesse por substituição de pelo menos um codão (p.ex., cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, ou mais codões) da sequência nativa por codões que são mais frequentemente ou o mais frequentemente usados nos genes dessa célula hospedeira enquanto se mantém a sequência de aminoácidos nativa. Várias espécies exibem tendência particular para certos codões de um aminoácido particular. A tendência de codões (diferenças no uso de codões entre organismos) correlaciona-se frequentemente com a eficácia de tradução de RNA mensageiro (mRNA), que se acredita por sua vez que é dependente das, entre outras coisas, propriedades dos codões sendo traduzidos e disponibilidade de molécula de RNA de transferência (tRNA) particulares. A predominância de tRNAs selecionados numa célula é geralmente um reflexo dos codões usados o mais frequentemente na sintese de péptidos. Conformemente, os genes podem ser customizados para expressão ótima de genes num dado organismo com base na otimização de codões. Tabelas de uso de codões estão prontamente disponíveis, por exemplo, no "Codon Usage Database" disponível em www.kazusa.orjp/codon/ (visitado a 9 de jul., 2002), e estas tabelas podem ser adaptadas de um número de maneiras. Ver Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28: 292 (2000). Algoritmos de computador para otimização de codões de uma sequência particular para expressão numa célula hospedeira particular estão também disponíveis, tal como Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA) . Em algumas formas de realização, um ou mais codões (p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, ou mais, ou todos os codões) numa sequência codificando uma enzima CRISPR correspondem ao codão o mais frequentemente usado para um aminoácido particular.

Em algumas formas de realização, um vetor codifica uma enzima CRISPR que pode compreender uma ou mais sequências de localização nuclear (NLSs), tal como cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais NLSs.

Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR pode compreender cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais NLSs no ou próximo do terminal amino, cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais NLSs no ou próximo do terminal carboxi, ou uma combinação destas (p.ex., uma ou mais NLS no terminal amino e uma ou mais NLS no terminal carboxi) . Quando está presente mais do que uma NLS, cada uma pode ser selecionada independentemente das outras, tal que uma única NLS possa estar presente em mais do que uma cópia e/ou em combinação com uma ou mais outras NLSs presentes numa ou mais cópias. Numa forma de realização preferencial da invenção, a enzima CRISPR pode compreender no máximo 6 NLSs. Em algumas formas de realização, uma NLS é considerada próxima do terminal N ou C quando o aminoácido mais próximo da NLS está dentro de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, ou mais aminoácidos ao longo da cadeia de polipéptidos do terminal N ou C. Exemplos não limitantes de NLSs incluem uma sequência NLS derivada de: a NLS do grande antigénio T do virus SV40, tendo a sequência de aminoácidos PKKKRKV; a NLS da nucleoplasmina (p.ex., a NLS bipartida da nucleoplasmina com a sequência KRPAATKKAGQAKKKK) ; a NLS de c-myc tendo a sequência de aminoácidos PAAKRVKLD ou RQRRNELKRSP; a NLS de hRNPAl M9 tendo a sequência NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY; a sequência RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV do domínio IBB da importina-alfa; as sequências VSRKRPRP e PPKKARED da proteína T de mioma; a sequência POPKKKPL de p53 humana; a sequência SALIKKKKKMAP de c-abl IV de camundongo; as sequências DRLRR e PKQKKRK da NSL do vírus da gripe; a sequência RKLKKKIKKL do antigénio delta do vírus da Hepatite; a sequência REKKKFLKRR da proteína Mxl de camundongo; a sequência KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK da poli(ADP-ribose) polimerase humana; e a sequência RKCLQAGMNLEARKTKK do glucocorticoides de recetores da hormona esteroide (humana).

Em geral, a um ou mais NLSs têm força suficiente para dirigir a acumulação da enzima CRISPR numa quantidade detetável no núcleo de uma célula eucariótica. Em geral, a força da atividade de localização nuclear pode derivar do número de NLSs na enzima CRISPR, da(s) NLS (s) particular(es) usada(s), ou uma combinação destes fatores. A deteção da acumulação no núcleo pode ser realizada por qualquer técnica adequada. Por exemplo, um marcador detetável pode ser fundido à enzima CRISPR, tal que a localização dentro de uma célula possa ser visualizada, tal como em combinação com um meio para deteção da localização do núcleo (p.ex., uma mancha especifica para o núcleo tal como DAPI). Os núcleos de células podem também ser isolados de células, o conteúdo dos quais pode ser depois analisado por qualquer processo adequado para deteção de proteína, tal como imunohistoquímica, transferência de Western, ou ensaio de atividade de enzima. A acumulação no núcleo pode ser também determinada indiretamente, tal como por um ensaio para o efeito de formação do complexo CRISPR (p.ex., ensaio para clivagem de DNA ou mutação na sequência alvo, ou ensaio para atividade de expressão de genes alterada afetada pela formação do complexo CRISPR e/ou atividade de enzima CRISPR), em comparação com um controlo não exposto à enzima ou complexo CRISPR, ou exposto a uma enzima CRISPR não tendo a uma ou mais NLSs.

Em geral, uma sequência guia é qualquer sequência de polinucleótidos tendo suficiente complementaridade com uma sequência de polinucleótidos alvo para hibridar com a sequência alvo e dirigir a ligação específica da sequência de um complexo CRISPR à sequência alvo. Em algumas formas de realização, o grau de complementaridade entre uma sequência guia e a sua correspondente sequência alvo, quando otimamente alinhadas usando um algoritmo de alinhamento adequado, é cerca de ou mais do que cerca de 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99%, ou mais. O alinhamento ótimo pode ser determinado com o uso de qualquer algoritmo adequado para alinhamento de sequências, exemplo não limitante do qual inclui o algoritmo de Smith-Waterman, o algoritmo Needleman-Wunsch, algoritmos baseados no Transformador de Burrows-Wheeler (p.ex., o Alinhador de Burrows Wheeler), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; disponível em www.novocraft.com), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (disponível em soap.genomics.org.cn), e Maq (disponível em maq.sourceforge.net). Em algumas formas de realização, uma sequência guia tem cerca de ou mais do que cerca de 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75, ou mais nucleótidos em comprimento. Em algumas formas de realização, uma sequência guia tem menos do que cerca de 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, ou menos nucleótidos em comprimento. A capacidade de uma sequência guia de dirigir a ligação específica da sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo pode ser avaliada por qualquer ensaio adequado. Por exemplo, os componentes de um sistema CRISPR suficientes para formar um complexo CRISPR, incluindo a sequência guia a ser testada, podem ser proporcionados a uma célula hospedeira tendo a sequência alvo correspondente, tal como por transfecção com vetores codificando os componentes da sequência CRISPR, seguido por uma avaliação de clivagem preferencial dentro da sequência alvo, tal como por ensaio Surveyor como descrito aqui. Similarmente, a clivagem de uma sequência de polinucleótidos alvo pode ser avaliada mum tubo de teste proporcionando a sequência alvo, componentes de um complexo CRISPR, incluindo a sequência guia a ser testada e uma sequência guia de controlo diferente da sequência guia de teste, e comparando a ligação ou taxa de clivagem na sequência alvo entre as reações da sequência guia de teste e controlo. Outros ensaios são possíveis, e ocorrerão àqueles peritos na técnica.

Uma sequência guia pode ser selecionada para visar qualquer sequência alvo. Em algumas formas de realização, a sequência alvo é uma sequência dentro de um genoma de uma célula. Sequências alvo exemplares incluem aquelas que são únicas no genoma alvo. Por exemplo, para a Cas9 de S. pyogenes, uma sequência alvo única num genoma pode incluir um local alvo de Cas9 da forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG onde NNNNNNNNNNNNXGG (N é A, G, T, ou C; e X pode ser qualquer coisa) tem uma única ocorrência no genoma. Uma sequência alvo única num genoma pode incluir um local alvo de Cas9 de S. pyogenes da forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG onde NNNNNNNNNNNXGG (N é A, G, T, ou C; e X pode ser qualquer coisa) tem uma única ocorrência no genoma. Para a Cas9 CRISPR1 de S. thermophilus, uma sequência alvo única num genoma pode incluir um local alvo de Cas9 da forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW onde NNNNNNNNNNNNXXAGAAW (N é A, G, T, ou C; X pode ser qualquer coisa; e W é A ou T) tem uma única ocorrência no genoma. Uma sequência alvo única num genoma pode incluir um local alvo de Cas9 CRISPR1 de S. thermophilus da forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW onde NNNNNNNNNNNXXAGAAW (N é A, G, T, ou C; X pode ser qualquer coisa; e W é A ou T) tem uma única ocorrência no genoma. Para a Cas9 de S. pyogenes, uma sequência alvo única num genoma pode incluir um local alvo de Cas9 da forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG onde NNNNNNNNNNNNXGGXG (N é A, G, T, ou C; e X pode ser qualquer coisa) tem uma única ocorrência no genoma. Uma sequência alvo única num genoma pode incluir um local alvo de Cas9 de S. pyogenes da forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG onde NNNNNNNNNNNXGGXG (N é A, G, T, ou C; e X pode ser qualquer coisa) tem uma única ocorrência no genoma. Em cada uma destas sequências, "M" pode ser A, G, T, ou C, e não necessita de ser considerado na identificação de uma sequência como única.

Em algumas formas de realização, uma sequência quia é selecionada para reduzir o grau de estrutura secundária dentro da sequência guia. Em algumas formas de realização, cerca de ou menos do que cerca de 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, ou menos dos nucleótidos da sequência guia participam no emparelhamento de bases autocomplementar quando otimamente dobrados. A dobragem ótima pode ser determinada por qualquer algoritmo de dobragem de polinucleótidos adequado. Alguns programas são baseados no cálculo da energia mínima livre de Gibbs. Um exemplo de um tal algoritmo é mFold, como descrito por Zuker e Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148). Outro algoritmo de dobragem exemplar é o servidor da web RNAfold, desenvolvido no Institute for Theoretical Chemistry na University of Vienna, usando o algoritmo de previsão de estrutura centroide (ver, p.ex., A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106 (1): 23-24; e PA Carr e GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27 (12): 1151-62).

Em geral, uma sequência companheira tracr inclui qualquer sequência que tenha complementaridade suficiente com uma sequência tracr para promover uma ou mais de: (1) excisão de uma sequência guia flanqueada por sequências companheiras tracr numa célula contendo a correspondente sequência tracr; e (2) formação de um complexo CRISPR numa sequência alvo, em que o complexo CRISPR pode compreender a sequência companheira tracr hibridada com a sequência tracr. Em geral, o grau de complementaridade é com referência ao alinhamento ótimo da sequência companheira tracr e sequência tracr, ao longo do comprimento tracr da mais curta das duas sequências. O alinhamento ótimo pode ser determinado por qualquer algoritmo de alinhamento adequado, e pode adicionalmente ter em consideração estruturas secundárias, tais como autocomplementaridade dentro ou da sequência tracr ou da sequência companheira tracr. Em algumas formas de realização, o grau de complementaridade entre a sequência tracr e a sequência companheira tracr ao longo do comprimento da mais curta das duas quando otimamente alinhadas é cerca de ou mais do que cerca de 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99%, ou maior. Em algumas formas de realização, a sequência tracr tem cerca de ou mais do que cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, ou mais nucleótidos em comprimento. Em algumas formas de realização, a sequência tracr e a sequência companheira tracr estão contidas dentro de um único transcrito, tal que a hibridação entre as duas produza um transcrito tendo uma estrutura secundária, tal como um grampo. Numa forma de realização da invenção, o transcrito ou sequência de polinucleótidos transcrita tem pelo menos dois ou mais grampos. Em formas de realização preferenciais, o transcrito tem dois, três, quatro ou cinco grampos. Numa outra forma de realização da invenção, o transcrito tem no máximo cinco grampos. Numa estrutura em grampo, a porção da sequência 5' do "N" final e a montante da ansa corresponde à sequência companheira tracr, e a porção da sequência 3' da ansa corresponde à sequência tracr. Exemplos não limitantes adicionais de polinucleótidos únicos podem compreender uma sequência guia, uma sequência companheira tracr, e uma sequência tracr são como se segue (listados 5' para 3"), onde "N" representa uma base de uma sequência guia, o primeiro bloco de letras minúsculas representa a sequência companheira tracr, e o segundo bloco de letras minúsculas representa a sequência tracr, e a sequência poli-T final representa o terminador da transcrição: (1) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgca gaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagg gtgttttcgttatttaaTTTTTT; (2) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagat aaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatt taaTTTTTT; (3) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagat aaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTTT; (4) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggcta gtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTT; (5) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggcta gtccgttatcaacttgaaaaagtgTTTTTTT; e (6) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggcta gtccgttatcaTTTTTTTT. Em algumas formas de realização, as sequências (1) a (3) são usadas em combinação com Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus. Em algumas formas de realização, as sequências (4) a (6) são usadas em combinação com Cas9 de S. pyogenes. Em algumas formas de realização, a sequência tracr é um transcrito separado de um transcrito que pode compreender a sequência companheira tracr.

Em algumas formas de realização é também proporcionado um molde de recombinação. Um molde de recombinação pode ser um componente de outro vetor como descrito aqui, contido num vetor separado, ou proporcionado como um polinucleótido separado. Em algumas formas de realização, um molde de recombinação é desenhado para servir como um molde na recombinação homóloga, tal como dentro ou próximo de uma sequência alvo cortada ou clivada por uma enzima CRISPR como uma parte de um complexo CRISPR. Um polinucleótido molde pode ter qualquer comprimento adequado, tal como cerca de ou mais do que cerca de 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000, ou mais nucleótidos em comprimento. Em algumas formas de realização, o polinucleótido molde é complementar com uma porção de um polinucleótido que pode compreender a sequência alvo. Quando otimamente alinhado, um polinucleótido molde deveria sobrepor-se com um ou mais nucleótidos de uma sequência alvo (p.ex., cerca de ou mais do que cerca de 1, 5, 10, 15, 20, ou mais nucleótidos). Em algumas formas de realização, quando uma sequência molde e um polinucleótido que pode compreender uma sequência alvo são otimamente alinhado, o nucleótido mais próximo do polinucleótido molde está dentro de cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000, ou mais nucleótidos da sequência alvo.

Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR é parte de uma proteina de fusão que pode compreender um ou mais dominios funcionais heterólogos (p.ex., cerca de ou mais do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais dominios adicionalmente à enzima CRISPR). Uma proteina de fusão de enzima CRISPR pode compreender qualquer sequência de proteina adicional, e opcionalmente uma sequência ligante entre quaisquer dois dominios. Exemplos de dominios de proteina que podem ser fundidos a uma enzima CRISPR incluem, sem limitação, marcadores de epitopo, sequências de genes repórter, e dominios de proteina tendo uma ou mais das seguintes atividades: atividade de metilase, atividade de desmetilase, atividade de ativação da transcrição, atividade de repressão da transcrição, atividade de fator de libertação da transcrição, atividade de modificação de histona, atividade de clivagem de RNA e atividade de ligação a ácidos nucleicos. Exemplos não limitantes de marcadores de epitopo incluem marcadores de histidina (His), marcadores de V5, marcadores de FLAG, marcadores de hemaglutinina (HA) da gripe, marcadores de Myc, marcadores de VSV-G, e marcadores de tiorredoxina (Trx). Exemplos de genes repórter incluem, mas não estão limitados a, glutationa-S-transferase (GST), peroxidase de rábano-silvestre (HRP), cloranfenicol-acetiltransferase (CAT) beta-galactosidase, beta-glucuronidase, luciferase, proteína verde fluorescente (GFP), HcRed, DsRed, proteína ciano fluorescente (CFP), proteína amarelo fluorescente (YFP), e proteínas autofluorescentes incluindo proteína azul fluorescente (BFP). Uma enzima CRISPR pode ser fundida a uma sequência de genes codificando uma proteína ou um fragmento de uma proteína que se liga a moléculas de DNA ou se liga a outras moléculas celulares, incluindo mas não se limitando a proteína de ligação à maltose (MBP), marcador de S, fusões de domínio de ligação a DNA (DBD) Lex A, fusões de domínio de ligação a DNA GAL4, e fusões de proteína BP16 do vírus do herpes simples (HSV). Domínios adicionais que podem formar parte de uma proteína de fusão que pode compreender uma enzima CRISPR são descritos em US20110059502. Em algumas formas de realização, a enzima CRISPR marcada é usada para identificar a localização de uma sequência alvo.

Em alguns aspetos, a invenção proporciona métodos que podem compreender administração de um ou mais polinucleótidos, tais como ou um ou mais vetores como descritos aqui, um ou mais seus transcritos, e/ou uma ou mais proteínas transcritas a partir deles, a uma célula hospedeira. Em alguns aspetos, a invenção proporciona adicionalmente células produzidas por tais métodos, e animais que podem compreender ou produzidos a partir de tais células. Em algumas formas de realização, uma enzima CRISPR em combinação com (e opcionalmente complexada com) uma sequência guia é administrada a uma célula. Métodos de transferência de genes de base virai e não virai convencionais podem ser usados para introduzir ácidos nucleicos em células de mamifero ou tecidos alvo. Tais métodos podem ser usados para administrar ácidos nucleicos codificando componentes de um sistema CRISPR a células em cultura, ou num organismo hospedeiro. Sistemas de administração de vetores não virais incluem plasmídeos de DNA, RNA (p.ex., um transcrito de um vetor descrito aqui), ácido nucleico nu, e ácido nucleico complexado com um veiculo de administração, tal como um lipossoma. Sistemas de administração de vetores virais incluem virus de RNA e DNA, que têm genomas epissomais ou integrados após administração à célula. Para uma revisão de procedimentos de terapia de genes ver Anderson, Science 256: 808-813 (1992); Nabel & Feigner, TIBTECH 11: 211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11: 162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11: 167-175 (1993); Miller, Nature 357: 455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6 (10): 1149-1154 (1988); Vigne,

Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36 (1995);

Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51 (1): 31- 44 (1995); Haddada et al., em Current Topics in

Microbiology and Immunology Doerfler e Bõhm (eds) (1995) ; e Yu et al., Gene Therapy 1: 13-26 (1994). Métodos de administração não viral de ácidos nucleicos incluem lipofecção, microinjeção, biolistica, virossomas, lipossomas, imunolipossomas, policatião ou conjugados lipido:ácido nucleico, DNA nu, viriões artificiais, e captação de DNA intensificada por agentes. A lipofecção é descrita em, p.ex., Pat dos E.U.A.. Nos. 5,049,386, 4,946,787; e 4,897,355 e reagentes de lipofecção são vendidos comercialmente (p.ex., Transfectam™ e Lipofectin™). Lipidos catiónicos e neutros que são adequados para lipofecção eficaz do recetor de reconhecimento de polinucleótidos incluem aqueles de Feigner, WO 91/17424; WO 91/16024. A administração pode ser a células (p.ex., administração in vitro ou ex vivo) ou tecidos alvo (p.ex., administração in vivo). A preparação de complexos lípido:ácido nucleico, incluindo lipossomas direcionados tais como complexos de imunolipidos, é bem conhecida de um com perícia na técnica (ver, p.ex., Crystal, Science 270: 404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5: 382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2: 710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52: 4817-4820 (1992); Pat dos E.U.A. Nos. 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, e 4,946,787). O uso de sistemas à base de RNA ou DNA viral para a administração de ácidos nucleicos tira vantagem de processos altamente evoluídos para direcionamento de um vírus para células específicas no corpo e tráfego da carga virai para o núcleo. Os vetores virais podem ser administrados diretamente aos pacientes (in vivo) ou podem ser usados para tratar células in vitro, e as células modificadas podem ser opcionalmente administradas aos pacientes (ex vivo). Sistemas de base virai convencionais podem incluir vetores retrovirais, de lentivírus, de adenovirus, adenoassociados e de vírus de herpes simples para a transferência de genes. A integração no genoma hospedeiro é possível com os métodos de transferência de genes dos retrovirus, lentivírus, e vírus adenoassociados, resultando frequentemente em expressão a longo prazo do transgene inserido. Adicionalmente, eficácias de elevada transdução foram observadas em muitos tipos de células e tecidos alvo diferentes. 0 tropismo de um retrovirus pode ser alterado por incorporação de proteínas do envelope estranhas, expandindo da população alvo potencial de células alvo. Os vetores lentivirais são vetores retrovirais que são capazes de transduzir ou infetar células não em divisão e produzem tipicamente elevados títulos virais. A seleção de um sistema de transferência de genes retrovirais dependeria portanto do tecido alvo. Os vetores retrovirais são compreendidos por repetições terminais longas de atuação cis com capacidade de empacotamento de até 6-10 kb de sequência estranha. As LTRs de atuação cis mínimas são suficientes para replicação e empacotamento dos vetores, que são depois usados para integrar o gene terapêutico na célula alvo para proporcionar expressão permanente de transgenes. Vetores retrovirais amplamente usados incluem aqueles baseados em vírus da leucemia murina (MuLV), vírus da leucemia do macaco gibão (GaLV), vírus da

Imunodeficiência Símia (SIV), vírus da imunodeficiência humana (VIH), e suas combinações (ver, p.ex., Buchscher et ai., J. Virol, ββ: 2731-2739 (1992); Johann et al., J.

Virol. 66: 1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176: 58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63: 2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65: 2220-2224 (1991); PCT/US94/05700) .

Em aplicações onde seja preferencial expressão transiente podem ser usados sistemas baseados em adenovirus. Os vetores baseados em adenovirus são capazes de eficácia de transdução muito elevada em muitos tipos de células e não requerem divisão celular. Com tais vetores foram obtidos titulos e niveis de expressão elevados. Este vetor pode ser produzido em grandes quantidades num sistema relativamente simples. Os vetores de virus adenoassociados ("AAV") podem também ser usados para transduzir células com ácidos nucleicos alvo, p.ex., na produção in vitro de ácidos nucleicos e péptidos, e para procedimentos de terapia de genes in vivo e ex vivo (ver, p.ex., West et al., Virology 160: 38-47 (1987); Pat. dos E.U.A. No. 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5: 793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94: 1351 (1994). A construção de vetores de AAV recombinantes é descrita num número de publicações. incluindo Pat. dos E.U.A. No. 5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4: 2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81: 6466-6470 (1984); e Samulski et al., J. Virol. 63: 03822-3828 (1989). Células de empacotamento são tipicamente usadas para formar partículas de virus que são capazes de infetar uma célula hospedeira. Tais células incluem células 293, que empacotam adenovirus, e células ψ2 ou células PA317, que empacotam retrovirus. Os vetores virais usados em terapia de genes são usualmente gerados por produção de uma linha de células que empacota um vetor de ácido nucleico numa partícula virai. Os vetores contêm tipicamente as sequências virais mínimas requeridas para empacotamento e integração subsequente num hospedeiro, estando outras sequências virais substituídas por uma cassete de expressão para o(s) polinucleótido(s) a ser(em) expresso(s). As funções virais em falta são tipicamente fornecidas em trans pela linha de células do empacotamento. Por exemplo, os vetores de AAV usados em terapia de genes possuem tipicamente somente sequências de ITR do genoma de AAV que são requeridas para o empacotamento e integração no genoma hospedeiro. 0 DNA virai é empacotado numa linha de células, que contém um plasmideo ajudante codificando os outros genes de AAV, nomeadamente rep e cap, mas não tendo sequências de ITR. A linha de células pode ser também infetada com adenovirus como um ajudante. 0 virus auxiliar promove a replicação do vetor de AAV e a expressão de genes de AAV do plasmideo auxiliar. 0 plasmideo ajudante não é empacotado em quantidades significativas devido a uma falta das sequências de ITR. A contaminação com adenovirus pode ser reduzida por, p.ex., tratamento térmico ao qual o adenovirus é mais sensível do que AAV. Métodos adicionais para a administração de ácidos nucleicos a células são conhecidos daqueles peritos na técnica. Ver, por exemplo, US20030087817 .

Em algumas formas de realização, uma célula hospedeira é transfectada transientemente ou não transientemente com um ou mais vetores descritos aqui. Em algumas formas de realização, uma célula é transfectada como ocorre naturalmente num sujeito. Em algumas formas de realização, uma célula que é transfectada é retirada de um sujeito. Em algumas formas de realização, a célula é derivada de células retiradas de um sujeito, tal como uma linha de células. Uma ampla variedade de linhas de células para cultura de tecidos é conhecida na técnica. Exemplos de linhas de células incluem, mas não são limitadas a, C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huhl, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panel, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat 6, CV1, RPTE, AIO, T24, J82, A375, ARH-77, Calul, SW480, SW620, SK0V3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB5 6, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw2 64.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, C0S-M6A, BS-C-1 de epitélio renal de macaco, fibroblasto de embrião de camundongo BALB/3T3, 3T3 Swiss, 3T3-L1, fibroblastos fetais humanos 132-d5; fibroblastos de camundongo 10.1, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, células BCP-1, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHOIR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML Tl, CMT, CT2 6, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepalclc7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, células JY, células K562, Ku812, KCL22, KG1, KEYOl, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, linhas de células OPCN/OPCT, Peer, PNT-1A/PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, células Saos-2, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, linhas de células THP1, U373, U87, U937, VCaP, células Vero, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR, e suas variedades transgénicas. As linhas de células estão disponíveis de uma variedade de fontes conhecidas daqueles peritos na técnica (ver, p.ex., a American Type Culture Collection (ATCC) (Manassus, Va.)). Em algumas formas de realização, uma célula transfectada com um ou mais vetores descritos aqui é usada para estabelecer uma nova linha de células que pode compreender uma ou mais sequências derivadas de vetores. Em algumas formas de realização, uma célula transientemente transfectada com os componentes de um sistema CRISPR como descrito (tal como por transfecção transiente de um ou mais vetores, ou transfecção com RNA), e modificada através da atividade de um complexo CRISPR, é usada para estabelecer uma nova linha de células que pode compreender células contendo a modificação mas não tendo qualquer outra sequência exógena. Em algumas formas de realização, as células transfectadas transientemente ou não transientemente com um ou mais vetores descritos aqui, ou linhas de células derivadas de tais células, são usadas na avaliação de um ou mais compostos de teste.

Em algumas formas de realização, um ou mais vetores descritos aqui são usados para produzir um animal transgénico não humano ou planta transgénica. Em algumas formas de realização, o animal transgénico é um mamífero, tal como um camundongo, rato, ou coelho. Métodos para produção de plantas e animais transgénicos são conhecidos na técnica, e começam geralmente com um método de transfecção de células, tal como descrito aqui.

Com avanços recentes na genómica de culturas, a capacidade de usar sistemas CRISPR-Cas para realizar edição e manipulação de genes eficaz e rentável permitirá a seleção e comparação rápidas de manipulações genéticas únicas e multiplexadas para transformar tais genomas quanto a produção melhorada e traços intensificados. A este respeito é feita referência às patentes e publicações dos EUA: Patente dos EUA No. 6,603,061 - Método de Transformação de Plantas Mediado por Agrobacterium; Patente dos EUA No. 7,868,149 - Sequências do Genoma de Plantas e Seus Usos e US 2009/0100536 - Plantas Transgénicas com Traços Agronómicos Intensificados. Na prática da invenção, os conteúdos e divulgação de Morrell et al. "Crop genomics: advances and applications" Nat Rev Genet. 29 dez 2011;13 (2): 85-96 são também mencionados. Numa forma de realização vantajosa da invenção, o sistema CRISPR/Cas9 é usado para manipular microalgas. Conformemente, a referência aqui a células animais pode também aplicar-se, mutatis mutandis, a células vegetais a não ser que de outro modo aparente.

Em plantas, os patogénios são frequentemente específicos do hospedeiro. Por exemplo, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici causa murcha do tomateiro mas ataca somente o tomate, e F. oxysporum f. dianthii Puccinia graminis f. sp. tritici ataca somente o trigo. As plantas têm defesas existentes e induzidas para resistirem à maioria dos patogénios. Mutações e eventos de recombinação ao longo de gerações de plantas levam a variabilidade genética que dá origem a suscetibilidade, especialmente pois os patogénios reproduzem-se com mais frequência do que as plantas. Nas plantas pode existir resistência não hospedeiro, p.ex., o hospedeiro e patogénico são incompatíveis. Pode também existir Resistência Horizontal, p.ex., resistência parcial contra todas as raças de um patogénico, tipicamente controlada por muitos genes e Resistência Vertical, p.ex., resistência completa a algumas raças de um patogénico mas não a outras raças, tipicamente controlada por alguns genes. Num nivel Gene-a-Gene, as plantas e patogénios evoluem em conjunto, e as mudanças genéticas num equilibram as mudanças noutro. Conformemente, usando Variabilidade Natural, os produtores combinam os genes mais úteis para Rendimento, Qualidade, Uniformidade, Dureza, Resistência. As fontes de genes de resistência incluem Variedades nativas ou estranhas, Variedades de Herança, Parentes de Planta Selvagem, e Mutações Induzidas, p.ex., tratamento de material vegetal com agentes mutagénicos. Usando a presente invenção é proporcionada aos produtores de plantas uma nova ferramenta para induzir mutações. Conformemente, um perito na técnica consegue analisar o genoma de fontes de genes de resistência, e em Variedades tendo características ou traços desejados empregar a presente invenção para induzir o surgimento de genes de resistência, com mais precisão do que agentes mutagénicos prévios e consequentemente acelerar e melhorar os programas de melhoramento de plantas.

Num aspeto, a invenção proporciona métodos de modificação de um polinucleótido alvo numa célula eucariótica, que pode ser in vivo, ex vivo ou in vitro. Em algumas formas de realização, o método compreende amostragem de uma célula ou população de células a partir de um animal humano ou não humano ou planta (incluindo microalgas), e modificação da célula ou células. A cultura pode ocorrer em qualquer etapa ex vivo. A célula ou células podem ser mesmo reintroduzidas no animal não humano ou planta. Para as células reintroduzidas é particularmente preferencial que as células sejam células estaminais.

Em aspeto, a invenção proporciona métodos de modificação de um polinucleótido alvo numa célula eucariótica. Em algumas formas de realização, o método pode compreender permissão para que um complexo CRISPR se ligue ao polinucleótido alvo para efetuar a clivagem do referido polinucleótido alvo modificando deste modo o polinucleótido alvo, em que o complexo CRISPR pode compreender uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridada com uma sequência alvo dentro do referido polinucleótido alvo, em que a referida sequência guia é ligada a uma sequência companheira tracr que por seu turno híbrida com uma sequência tracr.

Num aspeto, a invenção proporciona um método de modificação da expressão de um polinucleótido numa célula eucariótica. Em algumas formas de realização, o método pode compreender permissão para que um complexo CRISPR se ligue ao polinucleótido tal que a referida ligação resulte em expressão aumentada ou diminuída do referido polinucleótido; em que o complexo CRISPR pode compreender uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridada com uma sequência alvo dentro do referido polinucleótido, em que a referida sequência guia é ligada a uma sequência companheira tracr que por seu turno hibrida com uma sequência tracr.

Num aspeto, a invenção proporciona estojos contendo qualquer um ou mais dos elementos divulgados nos métodos e composições acima. Os elementos podem ser proporcionar individualmente ou em combinações, e podem ser proporcionados em qualquer recipiente adequado, tal como um frasco, uma garrafa, ou um tubo. Em algumas formas de realização, o estojo inclui instruções numa ou mais linguas, por exemplo em mais do que uma lingua.

Em algumas formas de realização, um estojo pode compreender um ou mais reagentes para uso num processo utilizando um ou mais dos elementos descritos aqui. Os reagentes podem ser proporcionados em qualquer recipiente adequado. Por exemplo, um estojo pode proporcionar um ou mais tampões de reação ou armazenamento. Os reagentes podem ser proporcionados numa forma que seja usável num ensaio particular, ou numa forma que requeira adição de um ou mais outros componentes antes do uso (p.ex., em forma liofilizada ou concentrada). Um tampão pode ser qualquer tampão, incluindo mas não se limitando a um tampão de carbonato de sódio, um tampão de bicarbonato de sódio, um tampão de borato, um tampão Tris, um tampão MOPS, um tampão HEPES, e suas combinações. Em algumas formas de realização, o tampão é alcalino. Em algumas formas de realização, o tampão tem um pH de cerca de 7 a cerca de 10. Em algumas formas de realização, o estojo pode compreender um ou mais oligonucleótidos correspondendo a uma sequência guia para inserção num vetor de modo a ligar operacionalmente a sequência guia e um elemento regulador. Em algumas formas de realização, o estojo pode compreender um polinucleótido molde de recombinação homóloga.

Num aspeto, a invenção proporciona métodos para uso um ou mais elementos de um sistema CRISPR. 0 complexo CRISPR da invenção proporciona um meio eficaz para modificação de um polinucleótido alvo. 0 complexo CRISPR da invenção tem uma ampla gama de utilidades incluindo modificação (p.ex., eliminação, inserção, translocação, inativação, ativação) de um polinucleótido alvo numa multiplicidade de tipos de células. Como tal, o complexo CRISPR da invenção tem um amplo espetro de aplicações em, p.ex., terapia de genes, rastreio de fármacos, diagnóstico de doença, e prognóstico. Um complexo CRISPR exemplar pode compreender uma enzima CRISPR complexada com uma sequência guia hibridada com uma sequência alvo dentro do polinucleótido alvo. A sequência guia é ligada a uma sequência companheira tracr, que por seu turno híbrida com uma sequência tracr.

Numa forma de realização, esta invenção proporciona um método de clivagem de um polinucleótido alvo. 0 método pode compreender modificação de um polinucleótido alvo usando um complexo CRISPR que se liga ao polinucleótido alvo e efetua clivagem do referido polinucleótido alvo. Tipicamente, o complexo CRISPR da invenção, quando introduzido numa célula, cria uma quebra (p.ex., uma quebra de cadeia única ou dupla) na sequência do genoma. Por exemplo, o método pode ser usado para clivar um gene de doença numa célula. A quebra criada pelo complexo CRISPR pode ser reparada por um processo de reparação tal como a via da união de extremidades não homólogas (NHEJ) propensa a erros ou a reparação dirigida por homologia (HDR) de elevada fiabilidade (HDR). Durante este processo de reparação, um molde de polinucleótido exógeno pode ser introduzido na sequência do genoma. Em alguns métodos, o processo de HDR é usado modificar a sequência do genoma. Por exemplo, um molde de polinucleótido exógeno que pode compreender uma sequência a ser integrada flanqueada por uma sequência a montante e uma sequência a jusante é introduzido numa célula. As sequências a montante e a jusante partilham similaridade de sequências com qualquer um dos lados do local de integração no cromossoma.

Onde desejado, um polinucleótido dador pode ser DNA, p.ex., um plasmideo de DNA, um cromossoma artificial bacteriana (BAC), um cromossoma artificial de levedura (YAC), um vetor virai, um pedaço linear de DNA, um fragmento de PCR, um ácido nucleico nu, ou um ácido nucleico complexado com um veículo de administração tal como um lipossoma ou poloxâmero. 0 molde de polinucleótido exógeno pode compreender uma sequência a ser integrada (p.ex., um gene mutado). A sequência para integração pode ser uma sequência endógena ou exógena à célula. Exemplos de uma sequência a ser integrada incluem polinucleótidos codificando uma proteína ou um RNA não codificante (p.ex., um microRNA) . Assim sendo, a sequência para integração pode ser operacionalmente ligada a uma sequência ou sequências de controlo adequadas. Alternativamente, a sequência a ser integrada pode proporcionar uma função reguladora.

As sequências a montante e a jusante no molde de polinucleótido exógeno são selecionadas para promoverem a recombinação entre a sequência cromossomal de interesse e o polinucleótido dador. A sequência a montante é uma sequência de ácido nucleico que partilha similaridade de sequências com a sequência do genoma a montante do local visado para integração. Similarmente, a sequência a jusante é uma sequência de ácido nucleico que partilha similaridade de sequências com a sequência cromossomal a jusante do local visado de integração. As sequências a montante e a jusante do molde de polinucleótido exógeno podem ter 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% de identidade de sequências com a sequência do genoma visada. Preferencialmente, as sequências a montante e a jusante no molde de polinucleótido exógeno têm cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequências com a sequência do genoma visada. Em alguns métodos, as sequências a montante e a jusante no molde de polinucleótido exógeno têm cerca de 99% ou 100% de identidade de sequências com a sequência do genoma visada.

Uma sequência a montante ou a jusante pode compreender de cerca de 20 pb e cerca de 2500 pb, por exemplo, cerca de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, ou 2500 pb. Em alguns métodos, a sequência a montante ou a jusante exemplar tem cerca de 200 pb a cerca de 2000 pb, cerca de 600 pb a cerca de 1000 pb, ou mais particularmente cerca de 700 pb a cerca de 1000 pb.

Em alguns métodos, o molde de polinucleótido exógeno pode adicionalmente compreender um marcador. Um tal marcador pode tornar fácil o rastreio quanto a integrações visadas. Exemplos de marcadores adequados incluem locais de restrição, proteínas fluorescentes, ou marcadores selecionáveis. O molde de polinucleótido exógeno da invenção pode ser construído usando técnicas recombinantes (ver, por exemplo, Sambrook et al., 2001 e Ausubel et al., 1996).

Num método exemplar para modificação de um polinucleótido alvo por integração de um molde de polinucleótido exógeno, uma quebra de cadeia dupla é introduzida na sequência do genoma pelo complexo CRISPR, a quebra é reparada através de recombinação homóloga um molde de polinucleótido exógeno tal que o molde seja integrado no genoma. A presença de uma quebra de cadeia dupla facilita a integração do molde.

Em outras formas de realização, esta invenção proporciona um método de modificação da expressão de um polinucleótido numa célula eucariótica. 0 método pode compreender aumento ou diminuição da expressão de um polinucleótido alvo por uso de um complexo CRISPR que se liga ao polinucleótido.

Em alguns métodos, um polinucleótido alvo pode ser inativado para efetuar a modificação da expressão numa célula. Por exemplo, após a ligação de um complexo CRISPR a uma sequência alvo numa célula, o polinucleótido alvo é inativado tal que a sequência não seja transcrita, a proteína codificada não seja produzida, ou a sequência não funcione como a sequência de tipo selvagem. Por exemplo, uma proteína ou sequência codificante de microRNA pode ser inativada tal que a proteína não seja produzida.

Em alguns métodos, a sequência de controlo pode ser inativada tal que não volte a funcionar como uma sequência de controlo. Como usado aqui, "sequência de controlo" refere-se a qualquer sequência de ácido nucleico que efetua a transcrição, tradução, ou acessibilidade de uma sequência de ácido nucleico. Exemplos de uma sequência de controlo incluem um promotor, um terminador de transcrição, e um intensificador são sequências de controlo. A sequência alvo inativada pode incluir uma mutação de eliminação (i.e., eliminação de um ou mais nucleótidos), uma mutação de inserção (i.e., inserção de um ou mais nucleótidos), ou uma mutação não senso (i.e., substituição de um único nucleótido por outro nucleótido tal que seja introduzido um codão de paragem). Em alguns métodos, a inativação de uma sequência alvo resulta em "inativação" da sequência alvo.

Um método da invenção pode ser usado para criar uma planta, um animal ou célula que possa ser usado como uma modelo de doença. Como usado aqui, "doença" refere-se a uma doença, distúrbio, ou indicação num sujeito. Por exemplo, um método da invenção pode ser usado para criar um animal ou célula que possa compreender uma modificação numa ou mais sequências de ácidos nucleicos associadas a uma doença, ou um animal ou célula no qual a expressão de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos associadas a uma doença esteja alterada. Uma tal sequência de ácidos nucleicos pode codificar uma sequência de proteina associada a doença ou pode ser uma sequência de controlo associada a doença.

Em alguns métodos, o modelo de doença pode ser usado para estudar os efeitos de mutações no animal ou célula e desenvolvimento e/ou progressão da doença usando medidas comummente usadas no estudo da doença. Alternativamente, um tal modelo de doença é útil para estudo do efeito de um composto farmaceuticamente ativo na doença.

Em alguns métodos, o modelo de doença pode ser usado para avaliar a eficácia de uma potencial estratégia de terapia de genes. Isto é, um gene ou polinucleótido associado a doença pode ser modificado tal que o desenvolvimento e/ou progressão da doença sejam inibidos ou reduzidos. Em particular, o método pode compreender modificação de um gene ou polinucleótido associado a doença tal que seja produzida uma proteina alterada e, como resultado, o animal ou célula tenha uma resposta alterada. Conformemente, em alguns métodos, um animal geneticamente modificado pode ser comparado com um animal predisposto ao desenvolvimento da doença tal que o efeito do evento de terapia de genes possa ser avaliado.

Noutra forma de realização, esta invenção proporciona um método de desenvolvimento de um agente biologicamente ativo que module um evento de sinalização celular associado a um gene de doença. 0 método pode compreender contacto de um composto de teste com uma célula que pode compreender um ou mais vetores que dirigem a expressão de uma ou mais de uma enzima CRIPSR, uma sequência guia ligada a uma sequência companheira tracr, e uma sequência tracr; e deteção de uma mudança numa leitura que é indicativa de uma redução ou um aumento de um evento de sinalização celular associado a, p.ex., uma mutação num gene de doença contido na célula.

Um modelo celular ou modelo animal pode ser construído em combinação com o método da invenção para rastreio de uma mudança da função celular. Um tal modelo pode ser usado para estudar os efeitos de uma sequência do genoma modificada pelo complexo CRISPR da invenção numa função celular de interesse. Por exemplo, um modelo de função celular pode ser usado para estudar o efeito de uma sequência do genoma modificada na sinalização intracelular ou sinalização extracelular. Alternativamente, um modelo de função celular pode ser usado para estudar os efeitos de uma sequência do genoma modificada na perceção sensorial. Em alguns tais modelos, uma ou mais sequências do genoma associadas a uma via bioquímica de sinalização no modelo são modificadas.

Uma expressão alterada de uma ou mais sequências do genoma associadas a uma via bioquímica de sinalização pode ser determinada por avaliação de uma diferença nos níveis de mRNA dos genes correspondentes entre a célula de modelo de teste e uma célula de controlo, quando são contactadas com um agente candidato. Alternativamente, a expressão diferencial das sequências associadas a uma via bioquimica de sinalização é determinada por deteção de uma diferença no nivel do polipéptido codificado ou produto de gene.

Para avaliar uma alteração induzida por agente no nivel de transcritos de mRNA ou polinucleótidos correspondentes, o ácido nucleico contido numa amostra é em primeiro lugar extraído de acordo com métodos padrão na técnica. Por exemplo, o mRNA pode ser isolado usando várias enzimas líticas ou soluções químicas de acordo com os procedimentos estabelecidos em Sambrook et al. (1989), ou extraído por resinas de ligação de ácidos nucleicos seguindo as instruções acompanhantes proporcionadas pelos fabricantes. 0 mRNA contido na amostra de ácido nucleico extraída é depois detetado por procedimentos de amplificação ou ensaios de hibridação convencionais (p.ex., análise de transferência de Northern) de acordo com métodos amplamente conhecidos na técnica ou baseados nos métodos exemplificados aqui.

Para propósito desta invenção, amplificação significa qualquer método empregando um iniciador e uma polimerase capaz de replicar uma sequência alvo com fiabilidade razoável. A amplificação pode ser levada a cabo por DNA polimerases naturais ou recombinantes, tais como TaqGold™, polimerase T7 DNA, fragmento Klenow de DNA polimerase de E. coli, e transcriptase reversa. Um método de amplificação preferencial é PCR. Em particular, o RNA isolado pode ser sujeito a um ensaio de transcrição reversa que é acoplado a uma reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-PCR) de modo a quantificar o nível de expressão de uma sequência associada a uma via bioquímica de sinalização. A deteção do nível de expressão de genes pode ser conduzida em tempo real num ensaio de amplificação. Num aspeto, os produtos amplificados podem ser visualizados diretamente com agentes de ligação a DNA fluorescente incluindo mas não se limitando a intercaladores de DNA e ligantes do sulco do DNA. Uma vez que a quantidade dos intercaladores incorporados nas moléculas de DNA de cadeia dupla é tipicamente proporcional à quantidade dos produtos de DNA amplificados pode convenientemente determinar-se a quantidade dos produtos amplificados por quantificação da fluorescência do corante intercalado usando sistemas óticos convencionais na técnica. Corantes de ligação a DNA adequados para esta aplicação incluem verde SYBR, azul SYBR, DAPI, iodo de propídio, Hoechst, ouro SYBR, brometo de etídio, acridinas, proflavina, laranja de acridina, acriflavina, fluorcoumanina, elipticina, daunomicina, cloroquina, distamicina D, cromomicina, homídio, mitramicina, polipiridilos de ruténio, antramicina, e similares.

Noutro aspeto, outros marcadores fluorescentes tais como sondas específicas de sequência podem ser empregues na reação de amplificação para facilitar a deteção e quantificação dos produtos amplificados. A amplificação quantitativa baseada em sondas baseia-se na deteção específica da sequência de um produto amplificado desejado. Utiliza sondas específicas do alvo, fluorescente (p.ex., sondas TaqMan®) resultando em especificidade e sensibilidade aumentadas. Métodos para realização de amplificação quantitativa baseada em sondas estão bem estabelecidos na técnica e são ensinados na Patente dos E.U.A. No. 5,210,015.

Ainda noutro aspeto podem ser realizados ensaios de hibridação convencionais usando sondas de hibridação que partilham homologia de sequências com sequências associadas a uma via bioquímica de sinalização. Tipicamente permite-se que as sondas formem complexos estáveis com as sequências associadas a uma via bioquímica de sinalização contidas dentro da amostra biológica derivada do sujeito de teste numa reação de hibridação. Será apreciado por um perito na técnica que, onde é usado antissenso como a sonda ácido nucleico, os polinucleótidos alvo proporcionados na amostra são escolhidos para serem complementares com sequências dos ácidos nucleicos antissenso. Reciprocamente, onde a sonda de nucleótido é um ácido nucleico senso, o polinucleótido alvo é selecionado para ser complementar com sequências do ácido nucleico senso. A hibridação pode ser realizada sob condições de estringência variada. Condições de hibridação adequadas para a prática da presente invenção são tais que a interação de reconhecimento entre a sonda e sequências associadas a uma via bioquímica de sinalização é tanto suficientemente específica como suficientemente estável. Condições que aumentam a estringência de uma reação de hibridação são amplamente conhecidas e publicadas na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook, et al., (1989); Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual, Boehringer Mannheim, segunda edição. 0 ensaio de hibridação pode ser formado usando sondas imobilizadas em qualquer suporte sólido, incluindo mas não está limitado a nitrocelulose, vidro, silício, e uma variedade de matrizes de genes. Um ensaio de hibridação preferencial é conduzido em chips de genes de elevada densidade como descrito na Patente dos E.U.A. No. 5,445,934.

Para uma deteção conveniente dos complexos sonda-alvo formados durante o ensaio de hibridação, as sondas de nucleótidos são conjugadas a um marcador detetável.

Marcadores detetáveis adequados para uso na presente invenção incluem qualquer composição detetável por meios fotoquimicos, bioquímicos, espetroscópicos, imunoquímicos, elétricos, óticos ou químicos. Uma ampla variedade de marcadores detetáveis apropriados é conhecida na técnica, que incluem marcadores fluorescentes ou quimioluminescentes, marcadores de isótopos radioativos, liqandos enzimáticos ou outros. Em formas de realização preferenciais desejar-se-á provavelmente empreqar um marcador fluorescente ou um marcador de enzima, tal como digoxigenina, β-galactosidase, urease, fosfatase alcalina ou peroxidase, complexo avidina/biotina.

Os métodos de deteção usados para detetar ou quantificar a intensidade de hibridação dependerão tipicamente do marcador selecionado acima. Por exemplo, os radiomarcadores podem ser detetados usando filme fotográfico ou fosforoimagiologia. Os marcadores fluorescentes podem ser detetados e quantificados usando um fotodetetor para detetar luz emitida. Os marcadores enzimáticos são tipicamente detetados proporcionando a enzima com um substrato e medindo o produto de reação produzido pela ação da enzima no substrato; e finalmente os marcadores colorimétricos são detetados por visualização simples do marcador colorido.

Uma mudança induzida por agente na expressão de sequências associadas a uma via bioquímica de sinalização pode ser também determinada por exame dos produtos de gene correspondentes. A determinação do nível de proteína envolve tipicamente a) contacto da proteína contida numa amostra biológica com um agente que se liga especificamente a uma proteína associada a uma via bioquímica de sinalização; e (b) identificação de qualquer complexo agente:proteína assim formado. Num aspeto desta forma de realização, o agente que se liga especif icamente a uma proteína associada a uma via bioquímica de sinalização é um anticorpo, preferencialmente um anticorpo monoclonal. A reação é realizada por contacto do agente com uma amostra das proteínas associadas a uma via bioquímica de sinalização derivada das amostras de teste sob condições que permitirão que um complexo se forme entre o agente e as proteínas associadas a uma via de sinalização bioquímica. A formação do complexo pode ser detetada diretamente ou indiretamente de acordo com procedimentos padrão na técnica. No método de deteção direta, os agentes são fornecidos com um marcador detetável e os agentes não reagidos podem ser removidos do complexo; indicando deste modo a quantidade de marcador restante a quantidade de complexo formado. Para tal método é preferencial selecionar marcadores que permanecem anexados aos agentes mesmo durante condições de lavagem estringentes. É preferencial que o marcador não interfira com a reação de ligação. Em alternativa, um procedimento de deteção indireto pode usar um agente que contenha um marcador introduzido quimicamente ou enzimaticamente. Um marcador desejável geralmente não interfere com a ligação ou a estabilidade do complexo agente:polipéptido resultante. No entanto, o marcador é tipicamente desenhado para ser acessível a um anticorpo para uma ligação eficaz e consequentemente geração de um sinal detetável.

Uma ampla variedade de marcadores adequados para deteção de níveis de proteína é conhecida na técnica. Exemplos não limitantes incluem radioisótopos, enzimas, metais coloidais, compostos fluorescentes, compostos bioluminescentes, e compostos quimioluminescentes. A quantidade de complexos agente:polipéptido formados durante a reação de ligação pode ser quantificada por ensaios quantitativos padrão. Como ilustrado acima, a formação de complexo agente:polipéptido pode ser medido diretamente pela quantidade de marcador restante no local da ligação. Em alternativa, a proteína associada a uma via bioquímica de sinalização é testada quanto à sua capacidade de competir com um análogo marcado para locais de ligação no agente específico. Neste ensaio competitivo, a quantidade de marcador capturado é inversamente proporcional à quantidade de sequências de proteínas associadas a uma via de sinalização bioquímica presente numa amostra de teste.

Um número de técnicas para análise de proteínas com base nos princípios gerais delineados acima está disponível na técnica. Incluem mas não estão limitados a radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzima), imunoensaios de "sanduíche", ensaios imunorradiométricos, imunoensaios in situ (usando, p.ex., ouro coloidal, marcadores enzimáticos ou radioisótopos), análise de transferência de Western, ensaios de imunoprecipitação, ensaios imunofluorescentes, e SDS-PAGE.

Anticorpos que reconhecem especificamente ou se ligam a proteínas associadas a uma via bioquímica de sinalização são preferenciais para condução das análises de proteínas acima mencionadas. Onde desejado podem ser usados anticorpos que reconheçam um tipo específico de modificações pós-translacionais (p.ex., modificações induzíveis por via bioquímica de sinalização). As modificações pós-translacionais incluem mas não estão limitadas a glicosilação, lipidação, acetilação, e fosforilação. Estes anticorpos podem ser adquiridos a partir de vendedores comerciais. Por exemplo, anticorpos antifosfotirosina que reconhecem especificamente proteínas fosforiladas por tirosina estão disponíveis a partir de um número de fabricantes, incluindo Invitrogen e PerkinElmer. Os anticorpos antifosfotirosina são particularmente úteis na deteção de proteínas que são diferencialmente fosforiladas nos seus resíduos de tirosina em resposta a um stress do ER. Tais proteínas incluem mas não estão limitadas a fator 2 alfa de iniciação da tradução eucariótica (eIF-2a). Alternativamente, estes anticorpos podem ser gerados usando tecnologias de anticorpos policlonais ou monoclonais convencionais por imunização de um animal hospedeiro ou uma célula produtora de anticorpos com uma proteína alvo que exibe a modificação pós-translacional desejada.

Na prática do método da presente invenção pode ser desejável discernir o padrão da expressão de uma proteína associada a uma via bioquímica de sinalização em diferentes tecidos corporais, em diferentes tipos de células, e/ou em diferentes estruturas subcelulares. Estes estudos podem ser realizados com o uso de anticorpos específicos de tecido, específicos de células ou específicos de estrutura subcelular capazes de se ligarem a marcadores de proteínas que são preferencialmente expressos em certos tecidos, tipos celulares, ou estruturas subcelulares.

Uma expressão alterada de um gene associado a uma via bioquímica de sinalização pode ser também determinada por exame de uma mudança na atividade do produto de gene em relação a uma célula de controlo. 0 ensaio para uma mudança induzida por agente na atividade de uma proteína associada a uma via bioquímica de sinalização dependerá da atividade biológica e/ou da via de transdução de sinal que está sob investigação. Por exemplo, onde a proteína é uma cinase, uma mudança na sua capacidade de fosforilar o(s) substrato(s) a jusante pode ser determinada por uma variedade de ensaios conhecidos na técnica. Ensaios representativos incluem mas não estão limitados a imunotransferência e imunoprecipitação com anticorpos tais como anticorpos antifosfotirosina que reconhecem proteínas fosforiladas. Adicionalmente, a atividade de cinase pode ser detetada por ensaios quimioluminescentes de elevado rendimento tais como AlphaScreen™ (disponível da PerkinElmer) e ensaio eTag™ (Chan-Hui, et al. (2003) Clinical Immunology 111: 162-174).

Onde a proteína associada a uma via bioquímica de sinalização é parte de uma cascata de sinalização levando a uma flutuação da condição de pH intracelular, moléculas sensíveis ao pH tais como corantes de pH fluorescentes podem ser usadas como as moléculas repórter. Noutro exemplo onde a proteína associada a uma via bioquímica de sinalização é um canal de iões, as flutuações no potencial da membrana e/ou concentração de iões intracelulares podem ser monitorizadas. Um número de estojos comerciais e dispositivos de elevado rendimento é particularmente adequado para um rastreio rápido e robusto para moduladores de canais de iões. Instrumentos representativos incluem FLIPR™ (Molecular Devices, Inc.) e VIPR (Aurora Biosciences). Estes instrumentos são capazes de detetar reações em mais do que 1000 poços de amostras numa microplaca simultaneamente, e proporcionar medição em tempo real e dados funcionais dentro de um segundo ou mesmo um milissegundo.

Na prática de qualquer um dos métodos divulgados aqui, um vetor adequado pode ser introduzido numa célula ou um embrião através de um ou mais métodos conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, microinjeção, eletroporação, sonoporação, biolística, transfecção mediada por fosfato de cálcio, transfecção catiónica, transfecção por lipossomas, transfecção por dendrímeros, transfecção por choque térmico, transfecção por nucleofecção, magnetofecção, lipofecção, impalefecção, transfecção ótica, captação de ácidos nucleicos intensificada por agentes patenteados, e administração através de lipossomas, imunolipossomas, virossomas, ou viriões artificiais. Em alguns métodos, o vetor é introduzido num embrião por microinjeção. 0 vetor ou vetores podem ser microinjetados no núcleo ou no citoplasma do embrião. Em alguns métodos, o vetor ou vetores podem ser introduzidos numa célula por nucleofecção. 0 polinucleótido alvo de um complexo CRISPR pode ser qualquer polinucleótido endógeno ou exógeno à célula eucariótica. Por exemplo, o polinucleótido alvo pode ser um polinucleótido residindo no núcleo da célula eucariótica. 0 polinucleótido alvo pode ser uma sequência codificando um produto de gene (p.ex., uma proteína) ou uma sequência não codificante (p.ex., um polinucleótido regulador ou um DNA lixo).

Exemplos de polinucleótidos alvo incluem uma sequência associada a uma via bioquímica de sinalização, p.ex., um gene ou polinucleótido associado a uma via bioquímica de sinalização. Exemplos de polinucleótidos alvo incluem um gene ou polinucleótido associado a doença. Um gene ou polinucleótido "associado a doença" refere-se a qualquer gene ou polinucleótido que está a originar produtos de transcrição ou tradução a um nível anormal ou numa forma anormal em células derivadas de um tecido afetado por doença em comparação com tecidos ou células de um controlo sem doença. Pode ser um gene que se torna expresso a um nível anormalmente elevado; pode ser um gene que se torna expresso a um nível anormalmente baixo, onde a expressão alterada se correlaciona com a ocorrência e/ou progressão da doença. Um gene associado a doença refere-se também a um gene possuindo mutação(ões) ou variação genética que são diretamente responsáveis ou estão em desequilibrio de ligação com um gene(s) que é(são) responsável(eis) pela etiologia de uma doença. Os produtos transcritos ou traduzidos podem ser conhecidos ou desconhecidos, e podem estar a um nivel normal ou anormal. 0 polinucleótido alvo de um complexo CRISPR pode ser qualquer polinucleótido endógeno ou exógeno à célula eucariótica. Por exemplo, o polinucleótido alvo pode ser um polinucleótido residindo no núcleo da célula eucariótica. 0 polinucleótido alvo pode ser uma sequência codificando um produto de gene (p.ex., uma proteína) ou uma sequência não codificante (p.ex., um polinucleótido regulador ou um DNA lixo). Sem desejar estar limitado pela teoria acredita-se que a sequência alvo deve estar associada a um PAM (motivo adjacente protoespaçador) : isto é, uma sequência curta reconhecida pelo complexo CRISPR. Os requisitos precisos de sequência e comprimento para o PAM diferem dependendo da enzima CRISPR usada, mas os PAMs têm tipicamente 2-5 sequências de pares de bases adjacentes ao protoespaçador (isto é, a sequência alvo) . Exemplos de sequências de PAM são dados na secção dos exemplos em baixo, e a pessoa perita será capaz de identificar sequências de PAM adicionais para uso com uma dada enzima CRISPR.

Exemplos de polinucleótidos alvo incluem uma sequência associada a uma via bioquímica de sinalização, p.ex., um gene ou polinucleótido associado à via bioquímica de sinalização. Exemplos de polinucleótidos alvo incluem um gene ou polinucleótido associado a doença. Um gene ou polinucleótido "associado a doença" refere-se a qualquer gene ou polinucleótido que está a original produtos de transcrição ou tradução a um nível anormal ou numa forma anormal em células derivadas de um tecido afetado por doença em comparação com os tecidos ou células de um controlo sem doença. Pode ser um gene que se torna expresso a um nível anormalmente elevado; pode ser um gene que se torna expresso a um nível anormalmente baixo, em que a expressão alterada se correlaciona com a ocorrência e/ou progressão da doença. Um gene associado a doença refere-se também a um gene possuindo mutação(ões) ou variação genética que são diretamente responsáveis ou estão em desequilíbrio de ligação com um gene(s) que é(são) responsável(eis) pela etiologia de uma doença. Os produtos transcritos ou traduzidos podem ser conhecidos ou desconhecidos, e podem estar a um nível normal ou anormal. 0 polinucleótido alvo de um complexo CRISPR pode incluir um número de genes e polinucleótidos associados a doença bem como genes e polinucleótidos associados à via bioquímica de sinalização como listados nos pedidos de patentes provisórias dos EUA 61/736,527 e 61/748,427, ambos intitulados SISTEMAS, MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA MANIPULAÇÃO DE SEQUÊNCIAS depositado a 12 de dezembro, 2012 e 2 de janeiro, 2013, respetivamente.

Exemplos de polinucleótidos alvo incluem uma sequência associada a uma via bioquímica de sinalização, p.ex., um gene ou polinucleótido associado à via bioquímica de sinalização. Exemplos de polinucleótidos alvo incluem um gene ou polinucleótido associado a doença. Um gene ou polinucleótido "associado a doença" refere-se a qualquer gene ou polinucleótido que está a originar produtos de transcrição ou tradução a um nível anormal ou numa forma anormal em células derivadas de um tecido afetado por doença em comparação com tecidos ou células de um controlo não doente. Pode ser um gene que se torna expresso a um nível anormalmente elevado; pode ser um gene que se torna expresso a um nível anormalmente baixo, onde a expressão alterada se correlaciona com a ocorrência e/ou progressão da doença. Um gene associado a doença refere-se também a um gene possuindo mutação(ões) ou variação genética que seja diretamente responsável ou esteja em desequilíbrio de ligação com um gene(s) que seja responsável pela etiologia de uma doença. Os produtos transcritos ou traduzidos podem ser conhecidos ou desconhecidos, e podem estar a um nível normal ou anormal.

Exemplos de genes e polinucleótidos associados a doença estão disponíveis a partir do McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.) e National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.), disponíveis na World Wide Web.

Exemplos de genes e polinucleótidos associados a doença estão listados nas Tabelas A e B. A informação específica da doença está disponível a partir do McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.) e National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.), disponíveis na World Wide Web. Exemplos de genes e polinucleótidos associados à via bioquímica de sinalização estão listados na Tabela C.

As mutações nestes genes e vias podem resultar na produção de proteínas impróprias ou proteínas em quantidades impróprias que afetam a função. Tais genes, proteínas e vias podem ser o polinucleótido alvo de um complexo CRISPR.

Tabela A

Tabela B:

Tabela C:

As formas de realização da invenção também se relacionam com métodos e composições relacionadas com inativação de genes, amplificação de genes e reparação de mutações particulares associadas com a instabilidade de repetição de DNA e distúrbios neurológicos (Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, Segunda Edição, Academic Press, 13 out, 2011 - Medical). Descobriu-se que aspetos específicos de sequências de repetição em tandem são responsáveis por mais do que vinte doenças humanas (New insights into repeat instability: role of RNA^DNA hybrids. Mclvor EI, Polak U, Napierala M. RNA Biol. Set-out 2010; 7 (5): 551-8). 0 sistema CRISPR-Cas pode ser aproveitado para corrigir estes defeitos de instabilidade genómica.

Um aspeto adicional da invenção relaciona-se com utilização do sistema CRISPR-Cas para corrigir defeitos nos genes EMP2A e EMP2B que foram identificados como estando associados à doença de Lafora. A doença de Lafora é uma condição autossomal recessiva que é caracterizada por epilepsia mioclónica progressiva que pode começar como convulsões epiléticas na adolescência. Alguns casos da doença podem ser causados por mutações em genes ainda a ser identificados. A doença provoca convulsões, espasmos musculares, dificuldade para caminhar, demência, e eventualmente a morte. Não existe correntemente nenhuma terapia que se tenha mostrado eficaz contra a progressão da doença. Outras anormalidades genéticas associadas à epilepsia também podem ser visadas pelo sistema CRISPR-Cas e a genética subjacente é adicionalmente descrita em Genetics of Epilepsy and Genetic Epilepsies, editado por Giuliano Avanzini, Jeffrey L. Noebels, Mariani Foundation Paediatric Neurology: 20; 2009.

Ainda em outro aspeto da invenção, o sistema CRISPR-Cas pode ser usado para corrigir defeitos oculares que surgem de várias mutações genéticas adicionalmente descritas em Genetic Diseases of the Eye, Segunda Edição, editado por Elias I. Traboulsi, Oxford University Press, 2012. Vários aspetos adicionais da invenção relacionam-se à correção de defeitos associados a uma ampla gama de doenças genéticas que estão adicionalmente descritas no website dos National Institutes of Health sob a subsecção com o tópico Genetic Disorders (website em health.nih.gov/topic/GeneticDisorders). As doenças cerebrais genéticas podem incluir mas não estão limitadas a Adrenoleucodistrofia, Agenesia do Corpo Caloso, Sindrome de Aicardi, Doença de Alpers, Doença de Alzheimer, Sindrome de Barth, Doença de Batten, CADASIL, Degeneração Cerebelar, Doença de Fabry, Doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, Doença de Huntington e de Outros Distúrbios de Repetições de Tripleto, Doença de Leigh, Síndrome de Lesch-Nyhan, Doença de Menkes, Miopatias Mitocondriais e Colpocefalia NINDS. Estas doenças são adicionalmente descritas no website dos National Institutes of Health sob a subsecção Genetic Brain Disorders.

Em algumas formas de realização, a condição pode ser neoplasia. Em algumas formas de realização, onde a condição é neoplasia, os genes a serem visados são qualquer um daqueles listados na Tabela A (neste caso, PTEN e assim por diante). Em algumas formas de realização, a condição pode ser Degeneração Macular relacionada com a Idade. Em algumas formas de realização, a condição pode ser um Distúrbio Esquizofrénica. Em algumas formas de realização, a condição pode ser um Distúrbio de Repetição de Trinucleótidos. Em algumas formas de realização, a condição pode ser Sindrome do X Frágil. Em algumas formas de realização, a condição pode ser Distúrbio Relacionado com Secretase. Em algumas formas de realização, a condição pode ser um distúrbio relacionado com Priões. Em algumas formas de realização, a condição pode ser ALS. Em algumas formas de realização, a condição pode ser dependência de fármacos. Em algumas formas de realização, a condição pode ser Autismo. Em algumas formas de realização, a condição pode ser Doença de Alzheimer. Em algumas formas de realização, a condição pode ser inflamação. Em algumas formas de realização, a condição pode ser Doença de Parkinson.

Exemplos de proteínas associadas à doença de Parkinson incluem mas não estão limitados a α-sinucleína, DJ-1, LRRK2, PINK1, Parkin, UCHL1, Sinfilina-1, e Nurrl.

Exemplos de proteínas relacionadas com a dependência podem incluir ABAT por exemplo.

Exemplos de proteínas relacionadas com a inflamação podem incluir a proteína quimioatrativa dos monócitos-1 (MCP1) codificada pelo gene Ccr2, o recetor do tipo 5 de quimiocina C-C (CCR5) codificado pelo gene CCR5, o recetor IIB de IgG (FCGR2b, também denominado CD32) codificado pelo gene Fcgr2b, ou proteína Rlg (FCERlg) Fc épsilon codificada pelo gene Fcerlg, por exemplo.

Exemplos de proteínas associadas a doenças cardiovasculares podem incluir IL1B (interleucina-1, beta), XDH (xantina desidrogenase), TP53 (proteína p53 tumor), PTGIS (prostaglandina 12 (prostaciclina) sintase), MB (mioglobina), IL4 (interleucina 4), ANGPT1 (angiopoietina 1), ABCG8 (cassete de ligação de ATP, subfamília G (WHITE), membro 8), ou CTSK (catepsina K), por exemplo.

Exemplos de proteínas associadas à doença de Alzheimer podem incluir a proteína do recetor de lipoproteína de muito baixa densidade (VLDLR) codificada pelo gene VLDLR, a enzima de ativação modificadora tipo ubiquitina 1 (UBA1) codificada pelo gene UBA1, ou proteína da subunidade catalítica EI de enzima ativadora de NEDD8 (UBE1C) codificada pelo gene UBA3, por exemplo.

Exemplos de proteínas associadas Distúrbio do Espectro do Autismo podem incluir a proteína associada ao recetor de benzodiazepina (periférico) (BZRAP1) codificada pelo gene BZRAPl, a proteína do membro 2 da família AF4 2/FMR2 (AFF2) codificada pelo gene AFF2 (também denominado MFR2), a proteína 1 homóloga autossomal de atraso mental do X frágil (FXR1) codificada pelo gene FXR1, ou a proteína 2 homóloga autossomal de atraso mental do X frágil (FXR2) codificada pelo gene FXR2, por exemplo.

Exemplos de proteínas associadas Degeneração Macular podem incluir a cassete de ligação de ATP, a proteína da subfamília A (ABC1) membro 4 (ABCA4) codificada pelo gene ABCR, a proteína apolipoproteína E (APOE), codificada pelo gene da APOE, ou a proteína ligando 2 quimiocina (motivo C-C) (CCL2) codificada pelo gene CCL2, por exemplo.

Exemplos de proteínas associadas Esquizofrenia podem incluir NRG1, ErbB4, CPLX1, TPH1, TPH2, NRXN1, GSK3A, BDNF, Disci, GSK3B, e suas combinações.

Exemplos de proteínas envolvidas na supressão tumoral podem incluir ATM (ataxia telangiectasia mutada), a ATR (ataxia telangiectasia e Rad3 relacionados), EGFR (recetor do fator de crescimento epidérmico), ERBB2 (oncogene homólogo 2 da leucemia eritroblástica viral v-erb-b2), ERBB3 (oncogene homólogo 3 da leucemia eritroblástica virai v-erb-b2), ERBB4 (v-erb-b2 oncogene homólogo 4 da leucemia eritroblástica viral), Notch 1, Notch2, Notch 3, ou Notch 4, por exemplo.

Exemplos de proteínas associadas a um distúrbio de secretase podem incluir PSENEN (homólogo 2 intensificador da presenilina (C. elegans)), CTSB (catepsina B) , PSEN1 (presenilina 1), APP (proteína precursora da beta-amiloide (A4)), APH1B (homólogo B defeituoso da faringe anterior (C. elegans)) , PSEN2 (presenilina 2 (doença de Alzheimer 4) ) , ou BACE1 (enzima 1 de clivagem de APP de local beta) , por exemplo.

Exemplos de proteínas associadas à Esclerose Lateral Amiotrófica podem incluir S0D1 (superóxido dismutase 1) , ALS2 (esclerose lateral amiotrófica 2) , FUS (fundida no sarcoma), TARDBP (proteína de ligação DNA TAR), VAGFA (fator de crescimento endotelial vascular A), VAGFB (fator de crescimento endotelial vascular B) , e VAGFC (fator de crescimento endotelial vascular C) , e qualquer sua combinação.

Exemplos de proteinas associadas a doenças de priões podem incluir S0D1 (superóxido dismutase 1), ALS2 (esclerose lateral amiotrófica 2), FUS (fundida no sarcoma), TARDBP (proteina de ligação DNA TAR), VAGFA (fator de crescimento endotelial vascular A) , VAGFB (fator de crescimento endotelial vascular B), e VAGFC (fator de crescimento endotelial vascular C), e qualquer sua combinação.

Exemplos de proteinas relacionadas com condições neurodegenerativas em distúrbios de priões podem incluir A2M (alfa-2-macroglobulina), AATF (fator de transcrição antagonizante de apoptose), ACPP (ácido fosfatase da próstata), ACTA2 (alfa 2 actina do músculo liso da aorta), ADAM22 (dominio de metalopeptidase ADAM), AD0RA3 (recetor A3 de adenosina), ou ADRA1D (recetor adrenérgico alfa-lD para adrenorrecetor alfa-lD) , por exemplo.

Exemplos de proteínas associadas à Imunodeficiência podem incluir A2M [alfa-2-macroglobulina]; AANAT [arilalquilamina N-acetiltransferase]; ABCA1 [cassete de ligação de ATP, subfamília A (ABC1), membro 1]; ABCA2 [cassete de ligação de ATP, subfamília A (ABC1) , membro 2]; ou ABCA3 [cassete de ligação de ATP, subfamília A (ABC1) , membro 3] ; por exemplo.

Exemplos de proteínas associadas a Distúrbios de Repetição de Trinucleótidos incluem AR (recetor de androgénio), FMR1 (atraso mental 1 do X frágil), HTT (huntingtina), ou DMPK (distrofia miotónica-proteína cinase), FXN (frataxina), ATXN2 (ataxina 2), por exemplo.

Exemplos de proteínas associadas a Distúrbios da Neurotransmissão incluem SST (somatostatina), N0S1 (óxido nítrico sintase 1 (neuronal)), ADRA2A (adrenérgico, alfa-2A-, recetor), ADRA2C (adrenérgico, alfa-2C-, recetor), TACR1 (recetor de taquiquinina 1), ou HTR2c (recetor de 5-hidroxitriptamina (serotonina) 2C), por exemplo.

Exemplos de sequências associadas ao desenvolvimento neuronal incluem A2BP1 [proteína 1 de ligação a ataxina 2], AADAT [aminoadipato aminotransferase], AANAT [arilalquilamina N-acetiltransferase], ABAT [4-aminobutirato aminotransferase] , ABCA1 [cassete de ligação de ATP, subfamília A (ABC1), membro 1], ou ABCA13 [cassete de ligação de ATP, subfamília A (ABC1), membro 13], por exemplo.

Exemplos adicionais de condições preferenciais tratáveis com o presente sistema podem ser selecionados de: Síndrome de Aicardi-Goutières; Doença de Alexander; Síndrome de Allan-Herndon-Dudley; Distúrbios Relacionados com POLG; Alfa-Manosidose (Tipo II e III); Síndrome de Alstrõm; Síndrome de Angelman; Ataxia-Telangiectasia; Lipofuscinoses Ceroides Neuronais; Beta-Talassemia; Atrofia Ótica Bilateral e Atrofia Ótica (Infantil) Tipo 1; Retinoblastoma (bilateral); Doença de Canavan; Síndrome Cérebro-ócular-fácio-esquelético 1 [C0FS1]; Xantomatose Cerebrotendinosa; Síndrome de Cornelia de Lange; Distúrbios Relacionadas com MAPT; Doenças de Priões Genéticas; Síndrome de Dravet; Doença de Alzheimer Familiar de Início Precoce; Ataxia de Friedreich [FRDA]; Síndrome de Fryns; Fucosidose; Distrofia Muscular Congénita de Fukuyama; Galactosialidose; Doença de Gaucher; Acidemias Orgânicas; Linfohistiocitose Hemofagocítica; Síndrome de Progeria de Hutchinson-Gilford; Mucolipidose II; Doença do Armazenamento de Ácido Siálico Livre infantil; Neurodegeneração Associada a PLA2G6; Síndrome de Jervell e Lange-Nielsen; Epidermólise Bolhosa Juncional; Doença de Huntington; Doença de Krabbe (Infantil); Sindrome de Leigh Associado a DNA Mitocondrial e NARP; Sindrome de Lesch-Nyhan; Lisencefalia Associada a LIS1; Sindrome de Lowe; Doença da Urina do Xarope de Bordo; Síndrome de Duplicação de MECP2; Distúrbios do Transporte de Cobre Relacionado com ATP7A; Distrofia Muscular Relacionada com LAMA2; Deficiência em Arilsulfatase A; Mucopolissacaridose Tipos I, II ou III; Condições de Niogénese de Peroxissoma, Espetro de Síndrome de Zellweger; Neurodegeneração com Distúrbios Cerebrais de Acumulação de Ferro; Deficiência em Esfingomielinase Ácida; Doença de Niemann-Pick Tipo C; Encefalopatia de Glicina; Distúrbios Relacionados com ARX; Distúrbios do Ciclo da Ureia; Osteogénese Imperfeita Relacionada com C0L1A1/2; Síndrome de Eliminação de DNA mitocondrial; Distúrbios Relacionados com PLP1; Síndrome de Perry; Síndrome de Phelan-McDermid; Doença de Armazenamento de Glicogénio Tipo II (Doença de Pompe) (Infantil); Distúrbios Relacionados com MAPT; Distúrbios Relacionados com MECP2; Condrodisplasia Punctata Rizomélica Tipo 1; Síndrome de Roberts; Doença de Sandhoff; Doença de Schindler Tipo 1; Deficiência em Adenosinadesaminase; Síndrome de Smith-Lemli-Opitz; Atrofia Muscular Espinhal; Ataxia Espinocerebelar de Início Infantil; Deficiência em Hexosaminidase A; Displasia Tanatofórica Tipo 1; Distúrbios Relacionados com Colagénio Tipo VI; Síndrome de Usher Tipo I; Distrofia Muscular Congénita; Síndrome de Wolf-Hirschhorn; Deficiência em Lipase Ácida Lissosomal; e Xeroderma Pigmentoso.

Como será aparente pretende-se que o presente sistema possa ser usado para visar qualquer sequência de polinucleótidos de interesse. Alguns exemplos de condições ou doenças que poderiam ser utilmente tratadas usando o presente sistema estão incluídos nas Tabelas acima e exemplos de genes correntemente associados a essas condições são também proporcionados ai. No entanto, os genes exemplificados não são exaustivos.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são dados para o propósito de ilustração de várias formas de realização da invenção.

Exemplo 1: Melhoria do sistema Cas9 para aplicação in vivo

Os Requerentes conduziram uma Pesquisa metagenómica por uma Cas9 com baixo peso molecular. A maioria dos homólogos de Cas9 é relativamente grande. Por exemplo, a SpCas9 tem à volta de 1368 aa de comprimento, o que é demasiado grande para ser facilmente empacotada em vetores virais para administração.

Através de análise computacional, os Requerentes descobriram que, na estirpe bacteriana Campylobacter, existem duas proteínas Cas9 com menos do que 1000 aminoácidos. A sequência para uma Cas9 de Campylobacter jejuni é apresentada em baixo. A este comprimento, CjCas9 pode ser facilmente empacotada em AAV, lentivírus,

Adenovirus, e outros vetores virais para administração robusta em células primárias e in vivo em modelos animais. Numa forma de realização preferencial da invenção é usada a proteína Cas9 de S. aureus. >Cas9 de Campylobacter jejuni (CjCas9)

\URii \H>KH^U'À \FSi MnUklKYAHÍRkVl \|%ΓϋΙΜ \l 11HU \R><ARkk, \HK K \Kt \f fí KHI ! ΆΠ Kl SM ΑΚΛΝ ΚΥΑϋϊίΡΥΙ Ϊ RHYU V I 1 kfeVHr \R \U UKkkRÍH Uikk\^uyk!'KX.k\ÍI..K^?kQNÍ 1 kl \NYQtSV(il \! YkkU'Qkkkkk^k Μ’ T NVRNK kkAYHM I AOSFI .KDFi -Kl IFKKQRHKíRSPSKK FHEHN LSVAFYKMALKOIA Hl \ < M's! ϊ-1 PI-kH YiAASH AFM1 V AlTKUNLí \\i KMfcGItY 1R1M >tNALt.N11VIK.. NM M \ KUÍKJkU GkMN>YHkkGERG í YFIKFKRA kl \ lk -¾I-01·UNlSQDi> 1. Nkí A KI >ÍI i IkPf ik* Kk M \f--YHl Xyk^íDSJLSKIXFKDHLMkFk M kl \TPlMtEGKKYGÍ ACNE LNLKYAlNkDkkDÍ' LFa Γ NkTY YkDH νΤΝΡν'νΐ,Ε,ΛίΚ-Ι' Y RR V LNÁf.i. KK YGK V! ikí\ Í1‘ L AREVOKNHSOR AK1ERFQNENYKAiíKD A£L£C£K I OLKJVSkS iLKI Rl .F KFQAFFΓ S N MA MMklH RH>1 k\1i t lUhlYPYSRSFDDSYMNKA í \ Η kONkH Μ \ΐ>ΗΊ £ M tAik 1 R Vvi^kikAi Ak NI. ¥ Γ kkgk RlkOkNY R.DR.H QKNFR D R N L N i> i k Y IA kl. \ I ΑΛΊ kià L DFLÍ>LS0Dl:NTkLNDTQk(jSKVHV'EAKSaV1LTSAl.RHTVVGFSAkikRNNHLHHAÍDAY1

IAYANNSiVkA*snFKKK^fcSAnT..YAKKiSFLDYKNKRKFFEPi^FROKVLDKJnF.lF \NKFFHhkPSGH Hl 1 ií RKFEKFY QNYtHiM UYkKAUrí «KWKV\T»kU Κ\ϋ!WR VDIFKHKKTNK FYAVPIYTMDFA í. KVLFNKA VARSKKOFTKDWfLMDENYEFCFSEYK

Hkksi «jikmigi phKVYYSArr.ssnsi α-λΚηυκκη-η srnqku ernanfkkyíaks K31QNLKYFFKYÍVSAlOEVTlCAF.FRgUF.l>FKk 0 elemento de tracrRNA putativo para esta CjCas9 é: 1\ΑΪΑΑΤ('ΊΧ:\ΥίΑΑ<ΥΑΑΑ1ΤΤΑΑΑΑΑ00«ΑΓ1'ΑΑΑΛΤΑΑΑ0Λ0ΤΤΓ0Γ000 AI IXTOOUHíG! 1 «'A UH\ iVfAAA HfGtH ÍTF A A \ \Π A sequência de Repetição Direta é:

ATTTTACCATAAAGAAATTTAAAAAGGGACTAAAAC

Um exemplo de um RNA guia quimérico para CjCas9 é:

N N.N-M N Μ Μ NMN N NNNNNNKM MG U U Ulk\ GIJCCCX» AA AGGGACIi A A A AU AA A G AGI U ÍAKXiGGAClJrijGCGCiCRilA.iACAAX COl CU ΑΛΑΛΙ'ΧΧΚ.Ί JUUU

Exemplo 2: Otimização de Cas9

Para função intensificada ou para desenvolver novas funções, os Requerentes geram proteínas Cas9 quiméricas por combinação de fragmentos de diferentes homólogos de Cas9. Por exemplo, duas proteínas Cas9 quiméricas exemplares:

Por exemplo, os Requerentes fundiram o terminal N de StlCas9 (o fragmento desta proteína está a negrito) ao terminal C de SpCas9 (o fragmento desta proteína está sublinhado). >Stl (N)Sp(C)Cas9

MSIMAavGLBIGK^VGV<:iO:ArK:VTGIHIHKNSRlIfPAAQAENNLVRRTNMQGR

RLARRKIO;limVRmRLFEESGI.J.TDFTKISIM.A^¥Qi;..RVKGLTBELSNF,E:LF

lALKNMVKifiStGISYL&amp;BASDBGNSSVGBYAQIVKENSKQLiETKTEGQlQLER

YQI¥GQLR€1>riA'EKI>GKK:.IÍRLINVFrrSAYRSEALRÍLQTQQEFNPQITI>E

FINR\X-EILTGKRKYYHGPGNEKSRTBYGR¥RTSGEl:L0MFGILIGK€TIiYT

BEFRAAKASY'rAQJE^LLNDlAmXVFTETKKLSiCEQKNQIlNYVKNEKAM

GPÂRLFKYIAKLLSCDVABIKGYRIDKSGKAEIHTFEAYRKMRTLETllBIEQ

MnRETLPKLAYVLrLNTERFGIQEALEHEFADGSFSQKQVDELVQFRKAlVS

SÍFGEGWHNFSVmMMEIAP10'.AX1'SEE0MllLYRLGKQKTTSSSNKI’ICYIB

EKUXEEIYNPVVARSVROAIKlVNAAIREYGOFPNlYIEjVIARENQTTQKGOK NSKERMKRJEEGÍKELGSOILKEHPVENTOLONEKLYLYYLONGRDMV^PQELDÍ ií^lsdydvdhtvposflkpdsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknyw

RQI.i.,NAKIJTQSKFDNÍXK,AERCiCxt,SE.LDRÃGFMRQI.AlíTRQ.rrKJWAQODSR .MN1X.YPENPKLXREVKYÍTLKSK.LVSPFRXDFQFYKVREINNYHHAHPAYLNAV VGTAILIKK YPKI.ES EFYYGDYKVYP'VRKM'LAKSEOEIGRATAKYFFYSNIMNFF KTElftÃÍjfflRlÍRkRPLIETNGETGEIVWPKGRÍÍ^ÃTVRKYl^M^\^VKK.TEVO TGGFácFSíLpj^sbKLIAI^ICPWPPlEYGGFPSPIYAYSVIYVAKVEkGKSK iKLKSVKELLGrr ÍMERSSFEKNPIPFLRAKGYKEVKKDLIKCLFK Y SLFELENGRKR LPÊHiOíS^KRVlLÃlXÃmlãk^

A.FKYFDTTiDRKRYTSTKISVI,DÁTl..IHOS.lTGLYETRíDLSOIGCSiD >Sp(N)St1(C)Cas9

MDKKYSIGIJ^IGl^SVOWAVrrDEYK.VPSKK.FKVLGNTDRHSlKKNIJGALLFDS

GETA:ÍÃÍÍLlXRT/\H^YTRRKNllICYLOÍlFkNEMÃKVPPSF^OR.IJBÍSPLVEED

KKl:iERH?ÍFGNWDEVAYBEKVPTIYHLR.KKLVDSTD'KAI>LRLIYLALAIjfM'|l£~FR 08ι€ΪΕ0ΡΜ>ΡΝ^^

LENLIAOLPGEKKNGLI?GNLIALSL-GLT1>NFICS^FDLAEDAKLOLSIS:.1>TYDr>Dí;D

NLÍAÒíGDQYÃMPLAAKNLSDA|LI,SDHJÍ.VMTEnKAPLSASM]O.YD^eílOPL

i:LXÍ5LLVROOU"E^ÍSFPOlKNGYAGÍl5<KfASOEEFYKFIO?ILEKMDGTC

EÍxyKL^EPLIJlKOlQyPNCrSIFHOIHlXjEfJMlLRROB^Y^XKI^M^KiHKlL Μΐ^ΚΥΕΡΚΗ^ΕΙΥΕ^ΤΥν^^^ ÈHRKVT YKQLKED ΥΓ KKIECFDS Y E ISO VED RFNAS ΓΧΠ ΥΗΏ11...KÍ BC DK.PFI,D ΝΕΜΡΪΪΕΡΙΥΙΧΕΤΥΕΕΡ&amp;ΕΜΪΕ^^ 8RKLmGIÍlDKOS<jKTlLDFi;£ÍDOFAMRNFMOlJHDDSLTFKEPI<)KAOVBCAKi

PSOiEHIAji^fíSPAKGnjOTVKVVDEÍVKVMGRHKPENIVIEMAREYNEDP

Ei(»CAIQiaQKANia>EKbAAMLKAANQYNQKãLFH$WH€IXKQI^TK!.ia

WMQQGgí^Í.AÍ'GEYlSHÍPIJNNSNQFEV|>ffii;,?LSn¥MSSLANMÍVIiVYATA

NQEM^ETFYQALDSMBDAWSimiLKAFAmSKYLSNEKKEYXXI'EEOISK

Fl>VEKiKMERA¥AO'rHYASÉVYI.!NALQE.!i!FRAHKII>TK\’SVVmGQrrSQI,E

EJIWGIEK1^I>TYMHEÂYI>ALIÍÁASSQLNLWKKQKNYLVSYSE1>QLLÔIET

GlLIiSI>l>í!-YKESVFRAFYQiS.FVBTIJKSE.EFEDSlL,li!SYQVl>SKFNRKÍSOÁTiY ATRQAK.VQKDKADETYVLGKIK!)iyTQ0GfY0AFMK.lYKK0KSKFLMYRHI>

FQTFEKVIEFIL'ENYPNKQINEKGKEVFCNPFLKYKEEiiGYIRKY'SfCEGNGP ΕΙΚ8ΕΚΥΥΒ8Ι^ΟΝΗΙΙ>ΙΤΡΜΒ§ΝΝΚνΥ1108ν8Ρ,^ΕΑΒνΥΙ^ΚΤΤΟΚΥΕΙΕ€ LK¥AI>LQF;EK€FIOTYEISQEK¥N0.I.EKK1<WDSDSEFKFTLYKNOIX:LVK0

TETEEQQI.¥RFI,SRTMPEQKIf\YEl..KPYDKQKFEGGEAI.íMVLGNV'A.NSG qckkgígksnisi:ykvrt»ylc:ínqhii:knegdkfeli>f 0 benefício de se prepararem Cas9 quiméricas inclui: a. reduzir a toxicidade b. melhorar a expressão em células eucarióticas c. intensificar a especificidade d. reduzir o peso molecular da proteína, preparar proteína mais pequena por combinação dos domínios mais pequenos de diferentes homólogos de Cas9.

e. Alteração do requisito de sequências de PAM

Exemplo 3: Utilização de Cas9 como uma proteína de ligação a DNA genérica

Os Requerentes usaram Cas9 como uma proteína de ligação a DNA genérica por mutação dos dois domínios catalíticos (D10 e H840) responsáveis por clivagem de ambas as cadeias do alvo de DNA. De modo a sobrerregular a transcrição de genes num lócus alvo, os Requerentes fundiram o domínio de ativação transcricional (VP64) a Cas9 (Figura 5). Os Requerentes colocaram a hipótese de que seria importante ver forte localização nuclear da proteína de fusão Cas9-VP64 porque a força de ativação do fator de transcrição é uma função do tempo gasto no alvo. Portanto, os Requerentes clonaram um conjunto de constructos Cas9-VP64-GFP, transfectaram-nos em células 293 e avaliaram a sua localização sob um microscópio fluorescente 12 horas pós-transfecção (Figura 8).

Os mesmos constructos foram clonados como uma 2A-GFP em vez de uma fusão direta de modo a testar funcionalmente os constructos sem uma GFP volumosa presente para interferir. Os Requerentes elegeram visar o lócus Sox2 com o transativador de Cas9 porque poderia ser útil para reprogramação celular e o lócus foi já validado como um alvo para a ativação transcricional mediada por TALE-TF. Para o lócus Sox2, os Requerentes escolheram oito alvos próximo do local de início transcricional (TSS). Cada alvo tinha 20 pb de comprimento com um motivo adjacente protoespaçador (PAM) NGG vizinho (Figura 12). Cada constructo Cas9-VP64 foi cotransfectado com cada RNA crispr quimérico (chiRNA) gerado por PCR em células 293. 72 horas pós-transfecção, a ativação transcricional foi avaliada usando RT-qPCR (Figura 6).

Para otimizar adicionalmente o ativador transcricional, os Requerentes titularam a razão de chiRNA (Sox2.1 e Sox2.5) em relação a Cas9 (NLS-VP64-NLS-hSpCas9-NLS-VP64-NLS), transfectada em células 293, e quantificada usando RT-qPCR (Figura 11) . Estes resultados indicam que a Cas9 pode ser usada como um dominio de ligação a DNA genérico para sobrerregular a transcrição de genes em um lócus alvo.

Os Requerentes desenharam uma segunda geração de constructos. (Tabela 1 em baixo).

Os Requerentes usam estes constructos para avaliar a ativação (constructos fundidos com VP64) e repressão transcricional (somente Cas9) por RT-qPCR. Os Requerentes avaliam a localização celular de cada constructo usando anticorpo anti-His, a atividade de nuclease usando um ensaio de nuclease Surveyor, e a afinidade de ligação a DNA usando um ensaio de desvio em gel. Numa forma de realização preferencial da invenção, o ensaio de desvio em gel é um teste de desvio de gel EMSA.

Exemplo 4: Repressor de Cas9

Foi demonstrado previamente que dCas9 pode ser usada como um dominio de ligação a DNA genérico para reprimir a expressão de genes. Os Requerentes relatam um desenho melhorado de dCas9 bem como fusões de dCas9 com os domínios repressores KRAB e SID4x. A partir da biblioteca de plasmídeos criada para modulação da transcrição usando Cas9 na Tabela 2 em baixo, e Figura 15, os seguintes plasmídeos repressores foram funcionalmente caracterizados por qPCR: pXRP27, pXRP2 8, pXRP29, pXRP48, pXRP49, pXRP50, pXRP51, pXRP52, pXRP53, pXRP56, pXRP58, pXRP59, pXRP61, e pXRP62.

Cada plasmideo repressor de dCas9 foi cotransfectado com dois RNAs guias dirigidos para a cadeia de codificação do gene da beta-catenina (os sgRNAs foram gerados pelo meu colaborador no Broad, Joseph Rosenbluth). 0 RNA foi isolado 72 horas pós-transfecção e a expressão de genes foi quantificada por RT-qPCR (Figura 16) . 0 gene de controlo endógeno foi GAPDH. Dois shRNAs validados foram usados como controlos positivos. Os controlos negativos foram certos plasmídeos transfectados sem gRNA, estes são denotados como "controlo pXRP##" na Figura 16. Os plasmídeos pXRP28, pXRP29, pXRP48, e pXRP49 conseguiram reprimir o gene da beta-catenina quando se usou a estratégia de direcionamento especificada. Estes plasmídeos correspondem à dCas9 sem um domínio funcional (pXRP28 e pXRP28) e dCas9 fundida com SID4x (pXRP48 e pXRP49) .

Tabela 1

Exemplo 5: Modulador transcricional de Cas9 e Localização nuclear

Modulador Transcricional de Cas9: Os Requerentes procederam a tornar o sistema CRISPR Cas9/gRNA num sistema de ligação a DNA generalizado no qual os Requerentes conseguem executar funções para além de clivagem de DNA. Por meio do que, fundindo domínios funcionais a uma Cas9 cataliticamente inativa, dCas9, os Requerentes conseguem transmitir funções novas, tais como ativação/repressão transcricional, metilação/desmetilação, ou modificação de cromatina. Para alcançar este objetivo, os Requerentes prepararam um mutante de Cas9 cataliticamente inativo por mudança de dois resíduos essenciais para a atividade de nuclease, DIO e H840, para alanina. Foi mostrado previamente que por mutação destes dois resíduos a atividade de nuclease de Cas9 é abolida enquanto mantém a capacidade de se ligar ao DNA alvo. Os domínios funcionais nos quais os Requerentes se decidiram focar para testar a hipótese dos Requerentes são o ativador transcricional VP64 e os repressores transcricionais SID e KRAB.

Localização Nuclear de Cas9: Os Requerentes colocaram a hipótese de que o modulador transcricional de dCas9 mais eficaz estaria fortemente localizado no núcleo onde teria a sua maior influência na transcrição. Além do mais, qualquer dCas9 residual no citoplasma poderia ter efeitos indesejados. Em trabalho prévio, os Requerentes determinaram que a Cas9 de tipo selvagem não se localiza no núcleo sem incluir vários sinais de localização nuclear (NLSs). Porque foram requeridas múltiplas sequências NLS, os Requerentes chegaram à conclusão de que é dificil de levar a Cas9 para o núcleo e qualquer domínio adicional que seja fundido a Cas9 poderia perturbar a localização nuclear. Portanto, os Requerentes construíram cinco constructos de fusão Cas9-VP64-GFP para otimizar a posição e número de sequências NLS. Uma segunda versão de cada constructo foi preparada para teste funcional, e estes constructos não foram diretamente fundidos a GFP. Um esquema destes desenhos é mostrado na Figura 7. Estes constructos foram clonados numa estrutura principal de plenti2 sob a expressão do promotor EFla humano. 0 elemento WPRE foi também adicionado para expressão de proteínas mais robusta. Cada constructo foi transfectado em células HEK 293FT usando Lipofectame 2000 e visualizado 24 horas pós-transfecção (Figura 8) . A Figura 8 mostra que a melhor localização nuclear é obtida quando as proteínas de fusão têm sequências NLS no terminal E e C da proteína de fusão. A localização nuclear observada mais elevada ocorreu no constructo com quatro elementos de NLS.

Para entender mais robustamente a influência de elementos de NLS em dCas9, os Requerentes prepararam 16 fusões dCas9-GFP por adição da mesma sequência NLS da alfa-importina no terminal N ou C olhando para zero a três repetições em tandem. Foi usada a mesma estratégia de clonagem como explicado previamente. Cada constructo foi transfectado em células HEK 293FT usando Lipofectame 2000 e visualizado 24 horas pós-transfecção (Figura 9). Notavelmente, o número de elementos de NLS não se correlaciona diretamente com a extensão de localização nuclear. A adição de uma NLS ao terminal C tem uma maior influência sobre a localização nuclear do que a adição ao terminal N. Para aplicação futura é mais favorável ter proteínas mais pequenas. Portanto, a arquitetura ótima de NLS para dCas9 foi ter-se uma NLS no terminal N e terminal C (pXRPNLSOOô).

Um potencial fator confuso de se usar uma fusão de GFP para se determinar a localização nuclear é que a própria GFP poderia ter uma grande influência em onde a proteína se localiza na célula. Portanto, os Requerentes determinaram que uma boa abordagem seria incluir um marcador 6xHis em dCaSs9, transfectar em células 293FT, e depois corar com um anticorpo anti-6xHis. Os Requerentes prepararam seis versões utilizando esta ideia (Figura 10). Três foram construídas para ativação transcricional (fusões de VP64), e as outras três foram para repressão transcricional (nenhum domínio funcional). Estes constructos foram também preparados para que os Requerentes pudessem purificar a proteína recombinante usando uma coluna de níquel. Existem muitas aplicações dos constructos 6xHis-dCas9, tais como realizar um ensaio de desvio em gel de eletromobilidade para mostrar que a Cas9 mutada consegue de facto ligar-se ao seu alvo de DNA. Os constructos de repressão (pXRP013, pXRP014, pXRP015) foram transfectados em células HEK 293 FT e foram imunocorados e visualizados após 24 horas (Figura 11). Sob este contexto específico, dCas9 requer dois sinais de NLS no terminal N para ser localizada no núcleo. Interessantemente, uma NLS em cada terminal não fez com que a dCas9 estivesse fortemente localizada no núcleo. Tomados em conjunto, o que estes dados sugerem é que não existe nenhuma regra generalizada que faça afirmar conclusivamente que uma proteína de fusão dCas9 está localizada no núcleo. O constructo de interesse tem de ser validado no sistema em que será usado para se determinar se está de facto localizado no núcleo.

Teste Funcional de Ativador Transcricional de Cas9: Os Requerentes testaram funcionalmente a proteína Cas9-VP64 por direcionamento do lócus Sox2 e quantificação da ativação transcricional por RT-qPCR. Oito locais alvo de DNA foram escolhidos para abranqer o promotor de Sox2 (Figura 12). As cassetes de expressão de gRNA foram clonadas num plasmídeo com estrutura principal pAAV-U6-gRNA/trcrRNA, pA6. 0 plasmídeo utiliza a enzima do tipo II Bbsi para revelar extremidades coesivas para ligação de oligos emparelhados. Assim, para cada alvo, tudo o que é necessário é dois oligos complementares com as extremidades coesivas apropriadas.

Cada constructo contendo dCas9 foi cotransfectado com plasmídeo pA6 em células HER 293FT usando Lipfectame 2000. 72 horas pós-transfecção, o RNA total foi extraído das células. 1 ug de RNA foi reversamente transcrito em cDNA (qScript Supermix) numa reação de 40 uL. 2 uL de produto de reação foram adicionados a uma única reação qPCR de ensaio TaqMan de 20 uL. Cada experiência foi realizada em triplicados biológicos e técnicos. As reações em controlo de RT e sem controlo de molde não mostraram amplificação. Os resultados desta experiência são mostrados na Figura 13. Os constructos que não mostram forte localização nuclear, pXRP02 e pXRP04, resultam em nenhuma ativação. Para o constructo que mostrou de facto forte localização nuclear, pXRP08, foi observada ativação moderada. Foi observada ativação estatisticamente significativa no caso dos gRNAs Sox2.4 e Sox2.5. Dos constructos 6xHis-dCas9 (pXRPOll, pXRP013, pXRP015) foram também testados usando os mesmos alvos Sox2 (Figura 14) . Em comparação com pseudocontrolos sem gRNA, os Requerentes conseguiram reprimir ou ativar Sox2 .

Para otimizar adicionalmente o ativador e repressor transcricionais de dCas9, os Requerentes construíram 31 constructos para explorar diferentes ligantes, domínios funcionais, e fusões no terminal N e C. A lista de constructos e dos elementos críticos é mostrada na Figura 15. Três ligantes foram testados e o primeiro foi um ligante não usual que foi publicado por Shen e colegas (Shen et al. 2013, artigo da Cell Research do laboratório de Xingxu Huang: Cell Research 23, 720-723 (maio 2013)) onde mostraram que melhorava drasticamente a localização nuclear e atividade de nuclease de Cas9. O segundo e terceiro ligantes foram ligantes muito comuns conhecidos como sendo flexíveis (GGGGS3) e rígidos (EAAAK3). Os domínios funcionais testados foram VP64 para a ativação e SID4x e KRAB para a repressão. dCas9 sem um domínio funcional foi também preparada para testar a repressão. Os promotores testados foram EFla humano, pPGK humano, SV40, e a falta de um promotor onde a expressão é dirigida pela LTR virai.

Todos os constructos ativadores transcricionais foram dirigidos para o lócus Sox2 usando uma combinação de dois gRNAs, hSox2.1 e hSox2.4. Os constructos ativadores de dCas9 foram cotransfectados com os gRNAs em células HEK 293FT e analisados por qPCR após 72 horas (Figura 16).

Um ensaio repórter de Sox2 de luciferase foi adotado para simplificar os métodos associados para determinação dos níveis de ativação. O ensaio funciona por cotransfecção em três plasmídeos, 1) dCas9, 2) gRNA, 3) elemento responsivo a Sox2 dirigindo a luciferase. Logo, o nível de luciferase é proporcional à quantidade de Sox2. O plasmídeo responsivo a Sox2 foi comprado da BioCat. O lócus Sox2 foi visado usando diferentes combinações de gRNAs e os constructos pXRP024 e pXRP025. Foi usado um controlo "Sem dCas9" para se determinar o nível basal de ativação. Os resultados mostrados no painel do topo da Figura 11 sugerem que poderia ser alcançada ativação de 3 vezes em comparação com controlos "Sem dCas9" e "Sem gRNA".

Um ensaio de luciferase similar foi adotado para testar a repressão transcricional de dCas9. 0 gene candidato que os Requerentes escolheram reprimir foi beta-catenina e os alvos estavam localizados próximo da extremidade 5' do corpo do gene na cadeia não codificante. A primeira experiência utilizando este ensaio comparou o repressor pXRPNLSOOô com o repressor de "dCas9" publicado por Qi e colegas (Qi et al. 2003, artigo da Cell do laboratório de Wendell Lim: http://www.sciencedirect. com/science/article/pii/S009286741 3002110) . Os resultados do ensaio de luciferase (painel do fundo da Figura 11) mostram que pode ser alcançada repressão de 3 vezes e o plasmídeo pXRPNLS006 relatado aqui funciona significativamente melhor do que o padrão corrente, "dCas9".

Exemplo 6: Ativador transcricional de Cas9 em linhas de células de murino e humanas

Os Requerentes demonstraram previamente a capacidade de CRISPR/Cas9 de atuar como um ativador transcricional. Neste exemplo, os Requerentes testam adicionalmente esta capacidade numa linha de células de murino. Os Requerentes examinaram também a atividade basal não guiada do dCas9-VP64 (Cas9 mutante dupla D10A H840A fundida ao domínio de ativação transcricional VP64). Os Requerentes administraram o sistema ativador de Cas9 a células de camundongo e, separadamente, caracterizaram os efeitos não guiados de dCas9-VP64 para vários genes humanos.

Experiências em Linhas de Células de Camundongo: os Requerentes selecionaram o lócus para o gene de camundongo Neurog2 para teste da ativação transcricional de dCas9-VP64 em células Neuro 2A. Os Requerentes selecionaram também 7 sgRNA visando sequências de uma região 300 pb a montante 100 pb a jusante do local de inicio transcricional de Neurog2 anotado. Estas sequências guia foram clonadas pelo método do portão dourado no plasmideo px362 contendo o promotor U6 a montante de uma estrutura principal de clonagem de sgRNA quimérico. Células Neuro 2A foram cultivadas em meio consistindo numa razão 1:1 de D5 (100:5:1 DMEM rico em glucose c/ Glutamax e piruvato de sódio: soro fetal de bovino: penicilina/estreptomicina). Para transfecção, células 120K em 0,5 mL de meio de cultura foram plaquecas em cada poço de uma placa de 24 poços. Após 22 h em cultura, cada poço de células Neuro 2A foi transfectado com 1 ug de DNA usando 5 uL de Lipofectamina seguindo os passos recomendados do fabricante (Life Technologies). Para todas as amostras de dCas9-VP64 + sgRNA, 0,5 ug de plasmideo dCas9-VP64 e 0,5 ug de plasmideo de expressão de sgRNA foram usados. Para as amostras de controlo, massas de plasmideo substituíram o plasmideo expressando GFP como necessário. 4 h após transfecção, o meio foi substituído por 1 mL de meio de cultura. 48 h após transfecção, o RNA foi purificado usando o estojo Nucleospin 96 RNA da Macherey Nagel. A transcrição reversa foi realizada com qScript cDNA supermix de acordo com o protocolo do fabricante. qPCR foi realizada usando sondas Taqman e Taqman Fast Advanced Master Mix da Life Technologies numa máquina de PCR em tempo real LightCycler 480 II da Roche.

Experiências em Linhas de Células Humanas: os Requerentes selecionaram 8 sequências de sgRNA previamente disponíveis para teste em células 293FT usando o constructo ativador dCas9-VP64 pXRP057 dos Requerentes. As sequências guia foram clonadas pelo método do portão dourado no plasmídeo px362 contendo o promotor U6 a montante de uma estrutura principal de clonagem de sgRNA quimérico.

As células 293FT foram cultivadas em meio D10 (razão 100:10:1 DMEM rico em glucose c/ Glutamax e piruvato de sódio: soro fetal de bovino: lOOx solução HEPES). Para transfecção, células 100K em 0,5 mL de meio de cultura foram plaqueadas em cada poço de uma placa de 24 poços. Após 22 h em cultura, cada poço de células 293FT foi transfectado com 1 ug de DNA usando 5 uL de Lipofectamina seguindo os passos recomendados do fabricante (Life Technologies). Para todas as amostras de dCas9-VP64 + sgRNA, 0,5 ug de plasmídeo dCas9-VP64 e 0,5 ug de plasmídeo de expressão de sgRNA foram usados. Para as amostras de controlo, incluindo aquelas analisadas quanto a efeitos transcricionais não guiados, massas de plasmídeo substituíram o plasmídeo expressando GFP como necessário. 4 h após transfecção, o meio foi substituído por 1 mL de meio de cultura. 48 h após transfecção, o RNA foi purificado usando o estojo Nucleospin 96 RNA da Macherey Nagel. A transcrição reversa foi realizada com qScript cDNA supermix de acordo com o protocolo do fabricante. qPCR foi realizada usando sondas Taqman e Taqman Fast Advanced Master Mix da Life Technologies numa máquina de PCR em tempo real LightCycler 480 II da Roche.

Resultados experimentais para as Experiências de Linhas de Células de Camundongo: Como mostrado na Fig. 20, 6 de 7 sgRNAs dirigidos para o lócus Neurog2 de camundongo foram capazes de induzir a sobrerregulação de mRNA de Neurog2 como medido por qPCR. Com estes resultados, os Requerentes demonstraram a utilidade do sistema ativador de Cas9 para modulação de genes num modelo celular de camundongo. As 7 sequências de sgRNA são listadas em baixo:

Resultados experimentais para as Experiências de Linhas de Células Humanas: Como mostrado na Fig. 21, sgRNAs dirigidos a vários genes humanos (ASCL1, MY0D1, VEGFA, e NTF3) induziram com sucesso a sobrerregulação do mRNA desejado usando o constructo dCas9-VP64 pXRP057 dos Requerentes (Konermann et al., Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 22 ag 2013; 500 (7463): 472-6). Os Requerentes mostraram que amostras transfectadas com o constructo dCas9-VP64, mas sem um sgRNA, tiveram mudanças significativas no nivel de expressão para vários genes e caracterização adicional é para ser levada a cabo (Fig. 22). As contagens de PAM (-100 a +100 pb de TSS) são indicadas em baixo:

Gene Mudança de Vezes Basal Contagens NGG + NAG

Neurog2 0,60 213 VEGFA 1,25 211 NTF3 0,94 203 ASCL1 4,19 235 MY0D1 0,90 204

Exemplo 7: Estudos adicionais nos dados moduladoras-ativadores e repressores de Cas9

Os Requerentes levaram a cabo estudos para desenvolver adicionalmente o ativador (pXRP57) e repressor (pXRP48) de dCas9 (Fig. 23) . Os Requerentes clonaram os plasmídeos pXRP57 e pXRP48 (Konermann et al., Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 22 ag 2013; 500 (7463): 472—6). A sequência ativadora de Cas9 está indicada na Fig. 24 e a sequência repressora de Cas9 está indicada na Fig. 25. Foram recolhidos dados adicionais para o ativador (Fig. 26), e repressor (Fig. 27) . Uma lista de RNAs guia usados na experiência é listada em baixo:

Exemplo 8: Sistema ativador CRISPR/Cas9 com a indutibilidade pela luz do sistema LITE

Os Requerentes combinaram a guia pelo RNA do sistema ativador de CRISPR/Cas9 com a indutibilidade pela luz do sistema LITE. Um sistema de expressão induzivel baseado em CRISPR/Cas9 pode tornar o rastreio induzivel de muitos alvos de genes muito mais rápido e fácil do que previamente possível, enquanto também proporciona a possibilidade de multiplexa facilmente diferentes alvos por combinação de sgRNAs dirigidos a lócus genéticos diferenciados.

Materiais e métodos: 0 sistema CasLITE consiste em 3 componentes: uma proteína de fusão dCas9-CIBl, o constructo CRY2PHR-VP64, e uma sequência guia de sgRNA. Os Requerentes sintetizaram 3 versões diferentes de dCas9-CIBl: (1) dCas9- GS-NLS-CIB1 compreendendo a dCas9 mutante dupla (D10A H840A) do nosso plasmideo pXRP057, um ligante de glicina serina, sinal de localização nuclear de SV40, e CIB1 de LITE1.0. (2) dCas9-GS-NLS-NLS-CIB1 compreendendo a dCas9 mutante dupla, ligante de glicina serina, 2 sequências NLS de SV40, e CIB1 e LITE1.0. (3) dCas9-GS-CIBl(mNLS d318-334) compreendendo a dCas9 mutante dupla, ligante de glicina serina de LITE2.0, e CIB1 de LITE2.0. Os vetores usados na prática da invenção estão ilustrados nas Figs. 28, 29, 30.

Os Requerentes selecionaram sequências sgRNA dirigidas para ASCL1 e MYOD1, previamente validadas com um ativador dCas9-VP64 constitutivo, para teste dos sistemas CasLITE em células humanas. As sequências guia foram clonadas pelo método do portão dourado no plasmídeo px362 contendo o promotor U6 a montante de uma estrutura principal de clonagem de sgRNA quimérico.

As células 293FT foram cultivadas em meio D10 sem HEPES (razão 10:1 de DMEM rico em glucose c/ Glutamax e piruvato de sódio: soro fetal de bovino). Para transfecção, células 100K em 0,5 mL de meio de cultura foram plaqueadas em cada poço de uma placa de 24 poços. Após 22 h em cultura, cada poço de células 293FT foi transfectado com 1,5 ug de DNA usando 7,5 uL de Lipofectamina seguindo os passos recomendados do fabricante (Life Technologies). Para todas as amostras de CasLITE + sgRNA, 0,5 ug de plasmideo dCas9-CIB1, 0,5 ug de plasmideo CRY2PHR-VP64 (LITE1.0 ou LITE2.0 para corresponder a CB1), e 0,5 ug plasmideo de expressão de sgRNA foram usados. As experiências com 4 sgRNAs usaram massas iguais de cada um de 4 sgRNAs totalizando 0,5 ug. Para as amostras de controlo, massas de plasmideo foram substituídas pelo plasmideo expressando GFP como necessário. 4 h após transfecção, o meio foi substituído por 1 mL de meio de cultura. 48 h após transfecção, a excitação foi iniciada em amostras estimuladas pela luz usando 5 mW/cm2 de luz azul a 475 nm. 12 h após estimulação, todas as amostras, incluindo todos os controlos, foram recolhidos para RNA usando o estojo Nucleospin 96 RNA da Macherey Nagel. A transcrição reversa foi realizada com qScript cDNA supermix de acordo com o protocolo do fabricante. qPCR foi realizada usando sondas Taqman e Taqman Fast Advanced Master Mix da Life Technologies numa máquina de PCR em tempo real LightCycler 480 II da Roche.

Resultados: Os constructos CasLITE exibiram niveis variáveis de ativação transcricional induzivel pela luz (Fig. 31). Embora a funcionalidade inicial do sistema pareça ser modesta, pedindo experimentação repetida, estes resultados sugerem a possibilidade de ativação transcricional guiada por RNA induzivel pela luz.

Exemplo 9: Modelo de camundongo de Cas9 e validação de linha de células estaminais embriónicas de camundongo

Os Requerentes validaram uma linha de células estaminais embriónicas de camundongo que foi modificada para incluir a cassete de Cas9 dependente de Cre (pCM2) no lócus Rosa26 (Fig. 32) e obtiveram resultados de genotipagem para fundadores transmitidos pela linha germinal (Fig. 33).

Para validar que a cassete de Cas9 estava funcional, a linha mESC modificada foi eletroporada com os constructos designados na Fig. 32. A linha mESC foi usada para injeção de blastocistos em recipiente C57BL/6J (realizada pela DCM no MIT) . Seis descendências quiméricas foram produzidas e depois retrocruzadas com o fundo de C57BL/6J. A transmissão bem-sucedida da linha germinal foi identificada com base na cor do revestimento de agouti. Dois dos seis quiméricos produziram filhotes transmitidos pela linha germinal. 0 DNA genómico foi extraído de tecido dos camundongos de Cas9 e foi realizada PCR de genotipagem de braço curto de Rosa26 (Fig. 33) . Uma banda de 1,5 kb é o tamanho correto para transgenes corretamente inseridos no lócus Rosa26. Estes resultados demonstram a transmissão bem-sucedida da linha germinal do transgenes Cas9 dependente de Cre no lócus Rosa2 6. 0 benefício da linha de inativação de Cas9 dependente de Cre Rosa2 6 é que pode ser cruzada com qualquer linha dirigida por Cre para permitir expressão de Cas9. Além do mais, a Cas9 pode ser ativação pela administração de Cre por vetor virai ou outros meios de administração. Isto permite especificidade quanto ao tipo de células, tecido, e desenvolvimento da expressão de Cas9. Um benefício adicional é que o camundongo pode ser usado para isolamento de células primárias. Isto seria particularmente útil no caso de um tipo de células primárias que não seja passível à administração de ácidos nucleicos ou não possa ser cultivada por tempo suficiente para a utilização de vetores virais.

Exemplo 10: Plataforma baseada em CRISPR dirigida por RNA para manipulação do epigenoma de mamíferos

Os Requerentes desenvolvem uma plataforma baseada em CRISPR dirigida por RNA para manipulação do epigenoma de mamíferos. Dois sistemas imunes mediados por CRISPR visada por RNA, lócus CRISPR/Cmr, foram recentemente caracterizados de Pyrococcus furiosus e Sulfolobus solfataricus. Com base na homologia de proteínas, estes lócus CRISPR/Cmr são parte de uma família muito maior do que existe dentro de uma diversidade de genomas bacterianos e arqueobacterianos. Similar a RNAi e Cas9, o mecanismo de interferência de um lócus CRISPR/Cmr é baseado na homologia de um curto trecho de nucleótidos e logo é passível de rastreios à escala do genoma. Além do mars, a região de homologia com o local alvo é significativamente aumentado tornando o potencial de especificidade muito maior.

Os Requerentes conduzem uma análise metagenómica da família CRISPR/Cmr, desenvolvimento de um sistema de ensaio in vitro para identificar lócus funcionais, e caracterização da especificidade e capacidade de multiplexação em células de mamífero. Uma plataforma de manipulação do genoma baseada em CRISPR dirigida por RNA sítio-específica (Fig. 34) pode substituir as muitas utilidades de RNAi e proporcionar um sistema para perturbação da biologia de RNA que nunca antes foi possível.

Trabalho preliminar com o lócus CRISPR/Cmr de P. furiosus: Com base no conhecimento extensivo baseado no lócus CRISPR/Cmr de P. furiosus, os Requerentes investigaram a praticabilidade de expressão dos genes Cmr dentro de células de mamífero. DNA genómico de P. furiosus foi obtido da ATCC e usado como um molde de PCR para amplificar os seis genes Cmr (Cmrl-6). Os Requerentes amplificaram também outra proteína dentro do lócus, Cas9. Cas9 está envolvida no processamento de crRNA na sua forma madura. Embora somente cinco genes Cmr (Cmrl, 2, 3, 4, 5, 6) sejam essenciais, os Requerentes consideraram que Cas9 pode auxiliar na resolução de problemas se acontecesse que os cinco genes Cmr fossem suficientes no contexto de mamífero.

Cmrl-6 e Cas6 foram clonados em plasmídeos de expressão de mamífero e transfectados em células HEK 293 FT. Para visualização fácil, o plasmídeo de clonagem continha um marcador de HA e uma sequência de P2A-EGFP. A sequência de P2A causa um salto ribossomal resultando em duas proteínas maduras do mesmo transcrito. 72 horas pós-transfecção foi observada fluorescência de EGFP para cada plasmídeo de expressão de Cmr (Fig. 35A) , sugerindo que Cmrl-6 e Cas9 são a ser expressos com sucesso. Para validar que as proteínas são estáveis dentro do ambiente de células de mamífero e têm também o tamanho correto, os Requerentes realizaram uma transferência de Western (Fig. 35B). Dentro de cada pista existe uma banda do tamanho esperado, sugerindo que cada proteína está a ser expressa e é estável dentro de células de mamífero. A segunda banda maior que aparece dentro de cada pista pode ser o resultado de falha da sequência de P2A em causar um salto ribossomal e logo uma fusão de proteína é criada e não dois produtos de proteína individuais. A banda localizada acima do tamanho previsto é ~30 kDa maior do que o tamanho esperado, o que corresponde a P2A-EGFP. Os Requerentes confirmarão isto por imunocoloração da mesma transferência usando um anticorpo anti-EGFP e deverão ver duas bandas por pista, uma que tem o tamanho de P2A-EGFP e outra banda maior com o tamanho de P2A-EFGP. Os resultados da transferência de Western mostram também expressão variável para as sete proteínas, visto que Cmrl, Cmr3, e Cmr6 têm expressão baixa enquanto Cmr2, Cmr4, e Cmr5 têm expressão elevada. Os Requerentes demonstraram que é de facto possível expressar proteínas Cmr a partir de P. furiosus dentro de células de mamífero.

Neste exemplo, os Requerentes identificam lócus CRISPR/Cmr dirigidos por RNA putativos e validam a expressão de proteínas individuais e crRNAs correspondentes em células de mamífero. Usando uma abordagem à base de homologia, os Requerentes identificam lócus CRISPR/Cmr dirigidos por RNA putativos ao longo de uma diversidade de genomas bacterianos e arqueobacterianos. Proteínas Cmr e crRNAs de cada lócus são identificados e validados através de clonagem, transfecção em células de mamifero, e deteção por transferência de Western e transferência de Northern, respetivamente. A metodologia é como se segue: 1. Identificar lócus CRISPR dirigidos por RNA: A identificação de lócus CRISPR dirigidos por RNA a partir de trabalho publicado é o primeiro passo no entendimento dos componentes essenciais de um sistema CRISPR/Cmr do Tipo III-B funcional. Dois lócus dirigidos por RNA de dois organismos diferentes foram publicados e caracterizados até graus diferentes. 2. Identificar lócus CRISPR dirigidos por RNA putativos ao longo de uma diversidade de espécies bacterianas e arqueobacterianas: Tem sido feito trabalho extensivo na direção da classificação de todos os lócus CRISPR conhecidos em grupos filogenéticos e tem assim resultado em bases de dados com elevada confiança de proteínas ortólogas. Usando as bases de dados mais extensivas e manualmente curadas, os Requerentes identificam lócus CRISPR/Cmr putativos com base na presença de múltiplos ortólogos de proteínas Cmr. Escolherei um subconjunto que abranja a diversidade de lócus CRISPR/Cmr para caracterização molecular adicional numa tentativa ampla de amostrar a diversidade. 3. Identificar proteínas Cmr e crRNAs dentro de lócus CRISPR: Os lócus CRISPR/Cmr estão bem estudados e muitos genomas bacterianos e arqueobacterianos foram extensivamente anotados, logo a identificação de proteínas Cmr deve ser direta nestes casos. No entanto, na ausência de boa anotação, o problema será mais complicado. Por esta razão, os Requerentes selecionam preferencialmente lócus CRISPR/Cmr de organismos onde estão disponíveis boas anotações. Se estas estratégias não proporcionarem abrangência completa de diversidade lócus CRISPR/Cmr, os Requerentes usam uma abordagem à base de homologia combinada com algoritmos de previsão de ORF para identificar as proteínas Cmr. As matrizes de repetição de CRISPR têm estruturas previsíveis e estão localizados próximo das proteínas associadas a Cmr CRISPR. A matriz de CRISPR consiste numa sequência líder que dirige a expressão da matriz inteira de repetições e espaçadores criando um transcrito primário que é extensivamente processado para fabricar RNAs de CRISPR (crRNA)s. Ferramentas computacionais existentes (CRISPRFinder) permitirão a identificação das matrizes de repetição. A previsão do crRNA maduro de cada lócus pode não ser tão direta e pode requerer otimização. Existem características gerais conhecidas sobre crRNAs maduros de lócus CRISPR/Cmr do Tipo III-B que os Requerentes usam para prever novos crRNAs. Todos os crRNAs maduros identificados de lócus CRISPR do Tipo III-B têm uma asa 5" que é parte da sequência de repetição seguida por um espaçador. A asa 5' funciona no reconhecimento do crRNA pelo complexo Cmr e o espaçador guia o complexo Cmr para o RNA alvo através de emparelhamento de bases de Watson-Crick. Os Requerentes desenham um painel de arquiteturas prováveis de crRNA que têm diferente comprimento total e têm asas 5" de diferente comprimento pois é difícil prever quaisquer características únicas específicas de novos crRNAs a priori.

4. Clonar proteínas Cmr e crRNAs em vetores de expressão de mamífero: As proteínas Cmr são individualmente clonadas em dois vetores de expressão de mamífero diferentes (Fig. 36). 0 primeiro vetor (VI.0) expressa proteínas Cmr individuais usando um promotor de CMV, sequência de cauda de poliA da hormona de crescimento bovino, e um elemento WPRE para maximizar a expressão da proteína. O segundo vetor (V11.2) usa os mesmos elementos como em VI.0 mas incluirá um marcador de HA no terminal H e uma sequência de P2A-EGFP no terminal C. 0 marcador de HA permite a deteção e quantificação de proteínas e a P2A-EGFP permite um método visual fácil para deteção da expressão em células de mamifero. Os Requerentes preparam ambas as versões porque o impacto da adição de um marcador de HA e um péptido P2A a proteínas Cmr e como isso influencia a formação correta do complexo Cmr é desconhecido. Os crRNAs são expressos usando o promotor U6 humano, que foi usado com sucesso para expressar RNAs de não codificação utilizados para RNAi e CRISPR/Cas9 dirigido por DNA. 5. Validar proteina Cmr e expressão de crRNA: A expressão das proteínas Cmr é validada por transfecção de plasmideos VI. 2 em células HER 293FT e observação da expressão de EGFP. Para validar adicionalmente que a proteina é expressa e tem o tamanho correto, os Requerentes preparam lisados de proteina a partir de células transfectadas e realizam uma transferência de Western usando um anticorpo antimarcador de HA. Para validar a expressão de crRNA, os Requerentes purificam pequenos RNAs a partir de células transfectadas e sondam por transferência de Northern.

Os Requerentes demonstram clivagem de RNA num ensaio de lisado de células de mamifero in vitro usando crRNAs naturalmente codificados. Os Requerentes desenvolvem um simples ensaio in vitro de lisado de células de mamifero para validar rapidamente lócus CRISPR/Cmr putativos. Lisados de células de células de mamifero transfectadas com proteínas Cmr são preparados e incubados com crRNAs naturalmente codificados e um alvo de RNA correspondente. Lócus CRISPR/Cmr em funcionamento são identificados com base em produtos de clivagem de tamanho correto usando eletroforese em gel. A metodologia é como se segue: 1. Expressão de proteínas Cmr em células de mamífero e preparação de lisados de células: Os Requerentes transfectam plasmídeos de expressão individuais para todas as proteínas Cmr de uma espécie em células HEK 293FT e esperam 72 horas para que ocorra expressão robusta das proteínas. As células são lisadas, homogeneizadas, e aliquotadas para uso futuro. Embora nem todas as células sejam transfectadas com cada plasmídeo de Cmr, logo que os lisados sejam preparados, todas as proteínas Cmr estarão na mesma mistura. Isto é benéfico em relação ao modelo de células vivas onde a cotransfecção de sete componentes pode ser desafiante. Além do mais, isto dará aos Requerentes controlo absoluto sobre a concentração final do crRNA e RNA alvo na reação. 2. Preparação de crRNAs: Para cada lócus CRISPR/Cmr, os Requerentes preparam crRNAs maduros contendo o espaçador endógeno. Especificamente, os Requerentes utilizam a sequência espaçadora do CRNA mais próximo do líder. Como foi discutido previamente, os Requerentes experimentam com diferentes arquiteturas de crRNA com diferentes extremidades 5". Um método direto para criação de crRNA maduro de uma sequência definida é transcrição in vitro usando estojos de transcrição T7 comercialmente disponíveis. 3. Transcrever in vitro RNA transportando sequências alvo de crRNA: Plasmídeos de expressão T7 são clonados para transportarem unicamente sequências visadas pelo espaçador endógeno de cada lócus CRISPR/Cmr. Este alvo será clonado no meio de um pedaço de ~1 kb de RNA tal que os produtos de clivagem resultantes sejam facilmente visualizados num gel de agarose.

4. Realizar e otimizar experiência de clivagem de lisados de células de mamífero in vitro: Logo que todos os componentes sejam preparados, os Requerentes combinam e incubam os lisados de células, crRNAs individuais, e RNA alvo seguido por visualização num gel de agarose. Os sistemas CRISPR funcionais são identificados com base nos produtos de clivagem do tamanho correto. Certos parâmetros são mantidos em mente. Os parâmetros para otimização são identidade e concentração de proteínas Cmr, arquitetura e concentração de crRNA. Parâmetros menos significativos para otimização são conteúdo e concentração de tampões, estabilidade de crRNA e RNA, tempo de reação, e visualização de RNA.

Os Requerentes demonstram e caracterizam silenciamento de genes endógenos de mamífero usando novos crRNAs. Os crRNAs são manipulados para visarem genes endógenos de mamífero e cotransfectados com plasmídeos de expressão de Cmr em células de mamífero. 0 silenciamento de mRNA e proteínas é quantificado por PCR quantitativa e transferência de Western. A capacidade de multiplexação é investigada por direcionamento de múltiplos genes ao mesmo tempo. A especificidade é caracterizada e comparada com RNAi usando RNA-seq. A metodologia é como se segue: 1. Dirigir crRNAs a genes endógenos de mamífero: Com lócus CRISPR/Cmr dirigidos por RNA funcionalmente validados, os Requerentes desenham novos crRNAs visando três genes que são alvos de RNAi terapeuticamente validados, nomeadamente, P53, VEGF, e CTNNB1 (Beta-catenina). Os Requerentes escolhem oito locais alvo dentro de cada gene para ajudar a resolver quaisquer limitações específicas da sequência da tecnologia. Para diferentes lócus CRISPR/Cmr, a vista de local exato pode diferir por algumas bases devido às características requeridas únicas de cada crRNA mas os Requerentes visam uma região consistente para auxiliar nas comparações.

2. Quantificar e caracterizar silenciamento de mRNA: Os Requerentes testam os sistemas CRISPR/Cmr em células HEK 293FT por transfecção de plasmídeos de expressão de mamífero para componentes de proteínas Cmr e crRNAs individuais. Os mRNAs clivados são rapidamente degradados na célula, ao passo que os fragmentos de RNA resultantes não têm tanto um cap 5" como uma cauda de poliA. Os Requerentes quantificam a extensão do silenciamento de mRNA por realização de PCR quantitativa. Quando é observado silenciamento de mRNA, os Requerentes realizam uma transferência de Western para a proteína visada. Adicionalmente a experiências de transfecção de crRNA único, os Requerentes adicionam múltiplos crRNAs dirigidos ao mesmo gene. Foi observado previamente que outros moduladores transcricionais trabalham sinergicamente quando dirigidos a múltiplos locais dentro da mesma região. Isto é também uma estratégia útil para identificar sistemas CRISPR/Cmr subótimos que não funcionam quando se usam crRNAs únicos mas conseguem funcionar globalmente e apenas necessitam de ser otimizados por uma razão ou outra. Os Requerentes adicionam também múltiplos crRNAs visando diferentes genes na mesma condição para considerar adicionalmente multiplexação neste sistema. Isto tem implicações amplas para manipulação da via e rastreios à escala do genoma. 3. Caracterizar a especificidade por RNA-seq: Uma grande motivação deste trabalho é desenvolver uma plataforma de direcionamento de RNA com maior especificidade do que RNAi. Inerentemente existe uma maior oportunidade para o sistema CRISPR/Cmr ter melhor especificidade devido à complementaridade prolongada com o local alvo. No entanto, cada par de bases dentro da guia pode não ser necessário ou pode existir alguma tolerância a não correspondências. Para entender estas características do sistema CRISPR/Cmr, os Requerentes usarão uma linha de células derivada de HER 293T que expressa uma cópia única de EGFP. Os Requerentes visam EGFP para silenciamento usando 24 crRNAs únicos. 0 uso de uma linha de células HEK/GFP torna a análise fora do alvo direta porque EGFP pode ser considerada uma proteina inócua que não tem influência em processos celulares, logo quaisquer transcritos alterados são provavelmente efeitos fora do alvo. Os resultados são comparados com um siRNA visando EGFP com efeitos fora do alvo conhecidos. Devido à capacidade extensiva de emparelhamento de bases do complexo CRISPR/Cmr, os Requerentes esperam que os efeitos fora do alvo sejam reduzidos. A tolerância a não correspondências é também explorada e isto será importante para desenvolvimento futuro da plataforma CRISPR/Cmr.

Dado que um sistema CRISPR/Cmr dirigido por RNA funciona em células de mamifero, os Requerentes perseguem inicialmente duas aplicações: rastreios à escala do genoma e uma plataforma de ligação a RNA cataliticamente inativo. Um rastreio de RNAi à escala do genoma é um método poderoso para sondagem da biologia. No entanto, efeitos fora do alvo elevados limitam grandemente a abordagem. Uma plataforma com especificidade mais elevada poderia ou substituir os rastreios genómicos de RNAi ou proporcionar uma abordagem ortogonal que auxiliaria na identificação de positivos verdadeiros. Uma plataforma de CRISPR/Cmr dirigidos por RNA é passível de rastreios genómicos porque cada alvo é programado somente por alguns nucleótidos, por meio do que uma biblioteca complexa poderia ser facilmente sintetizada e administrada.

Uma plataforma de ligação a RNA cataliticamente inativo é uma tecnologia capacitadora para o desenvolvimento de complexos efetores que auxiliam na sondagem de RNA. Os Requerentes identificam os componentes cataliticamente ativos do complexo Cmr e mutam os resíduos específicos responsáveis. Isto tem sido feito com sucesso num número de casos, p.ex., isto foi feito para CRISPR/Cas9 para criar uma nickase e um modulador transcricional. Utilizando esta plataforma, os Requerentes desenvolvem uma tecnologia para detetar e visualizar transcritos de RNA dentro da célula. Isto tem aplicações para o entendimento da influência da localização de RNA em processos celulares e deteção e quantificação in vivo de RNA. Alternativamente, os Requerentes adicionam moléculas efetoras a uma plataforma de ligação a RNA na direção de sondagem e entendimento de áreas da biologia de RNA que não são bem entendidas, nomeadamente edição de RNA e epigenética.

Embora formas de realização preferenciais da presente invenção tenham sido mostradas e descritas aqui será óbvio àqueles peritos na técnica que tais formas de realização são proporcionadas a titulo de exemplo somente. Numerosas variações, mudanças, e substituições ocorrerão agora àqueles peritos na técnica sem se afastar da invenção. Deve ser entendido que várias alternativas às formas de realização da invenção descritas aqui podem ser empregues na prática da invenção. REFERÊNCIAS:

Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Boyaval, P., Moineau, S., ... Horvath, P. (2007). CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science (Nova Iorque, N.I.), 315 (5819), 1709-12. doi:10.1126/science.1138140

Birmingham, A., Anderson, E. M., Reynolds, A., Ilsley-Tyree, D., Leake, D., Fedorov, Y., ... Khvorova, A. (2006) . 3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nature methods, 3 (3), 199-204. doi:10.1038/nmeth854

Brouns, S. J. J., Jore, Μ. M., Lundgren, M., Westra, E. R., Slijkhuis, R. J. H., Snijders, A. P. L., ... van der

Oost, J. (2008) . Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science (Nova Iorque, N.I.), 321 (5891), 960-4. doi:10.1126/science.1159689 Burnett, J. C., Rossi, J. J., &amp; Tiemann, K. (2011).

Current progress of siRNA/shRNA therapeutics in clinical trials. Biotechnology journal, 6 (9), 1130-46. doi:10.1002/biot.201100054

Cheong, C.-G., &amp; Hall, T. Μ. T. (2006). Engineering RNA sequence specificity of Pumilio repeats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103 (37), 13635-9. doi:10.1073/pnas.0606294103 Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R.,

Habib, N., ... Zhang, F. (2013). Multiplex Genome

Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science (Nova Iorque, N.I.). doi: 10.1126/science.1231143 Elbashir, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., &amp; Tuschl, T. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature, 411 (6836), 494-8. doi:10.1038/35078107 Fire, A., Xu, S., Montgomery, Μ. K., Kostas, S. A.,

Driver, S. E., &amp; Mello, C. C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in

Caenorhabditis elegans. Nature, 391 (6669), 806-11. doi:10.1038/35888

Hale, C., Kleppe, K., Terns, R. M., &amp; Terns, Μ. P. (2008). Prokaryotic silencing (psi)RNAs in Pyrococcus furiosus. RNA (Nova Iorque, N.I.), 14 (12), 2572-9. doi:10.1261/rna.1246808

Hale, C. R., Majumdar, S., Elmore, J., Pfister, N.,

Compton, M., Olson, S.,... Terns, Μ. P. (2012). Essential features and rational design of CRISPR RNAs that function with the Cas RAMP module complex to cleave RNAs. Molecular cell, 45 (3), 292-302. doi: 10.1016/j.moIce1.2011.10.023

Hale, C. R., Zhao, P., Olson, S., Duff, M. 0., Graveley, B. R., Wells, L., ... Terns, Μ. P. (2009). RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex. Cell, 139 (5), 945-956.

Hou, Z., Zhang, Y., Propson, N. E., Howden, S. E., Chu, L.-F., Sontheimer, E. J., &amp; Thomson, J. A. (2013). Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 110 (39), 15644-9. doi:10.1073/pnas.1313587110

Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., &amp; Nakata, A. (1987) . Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of bacteriology, 169 (12), 5429-33. Jackson, A. L., Bartz, S. R., Schelter, J., Kobayashi, S. V, Burchard, J., Mao, M., ... Linsley, P. S. (2003).

Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nature biotechnology, 21( 6), 635-7. doi:10.1038/nbt831

Jackson, A. L., Burchard, J., Leake, D., Reynolds, A., Schelter, J., Guo, J., ... Linsley, P. S. (2006).

Position-specific chemical modification of siRNAs reduces "off-target" transcript silencing. RNA (Nova Iorque, N. I.), 12 (7), 1197-205. doi:10.1261/rna.30706 Jansen, R., Embden, J. D. A. van, Gaastra, W., &amp; Schouls, L. M. (2002) . Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular microbiology, 43 (6), 1565-75.

Konermann, S., Brigham, M. D., Trevino, A. E., Hsu, P. D., Heidenreich, M., Cong, L., ... Zhang, F. (2013).

Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature, 500 (7463), 472-6. doi:10.1038/nature12466

Mackay, J. P., Font, J., &amp; Segal, D. J. (2011). The prospects for designer single-stranded RNA-binding proteins. Nature structural &amp; molecular biology, 18 (3), 256-61. doi:10.1038/nsmb.2005

Makarova, K. S., Haft, D. H., Barrangou, R., Brouns, S. J. J., Charpentier, E., Horvath, P., ... Koonin, E. V. (2011). Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nature reviews. Microbiology, 9 (6), 467-77. do i:10.1038/nrmicro2 57 7

Mali, P., Yang, L., Esvelt, K. M., Aach, J., Guell, M., DiCarlo, J. E., ... Church, G. M. (2013). RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science (Nova Iorque, N.I.), 339 (6121), 823-6. doi:10.1126/science.1232033 Marraffini, L. A., &amp; Sontheimer, E. J. (2010). CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nature reviews. Genetics, 11 (3), 181-90. doi:10.1038/nrg274 9

Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Soria, E., &amp; Juez, G. (2000) . Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria. Molecular microbiology, 36 (1), 244-6. Mojica, F. J. M., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., &amp; Soria, E. (2005). Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. Journal of molecular evolution, 60 (2), 174-82. doi:10.1007/s00239-004-0046-3

Peabody, D. S. (1993) . The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO journal, 12 (2), 595-600.

Qi, L. S., Larson, Μ. H., Gilbert, L. A., Doudna, J. A., Weissman, J. S., Arkin, A. P., &amp; Lim, W. A. (2013). Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell, 152 (5), 1173-83. doi:10.1016/j.cell.2013.02.022 Sapranauskas, R., Gasiunas, G., Fremaux, C., Barrangou, R., Horvath, P., &amp; Siksnys, V. (2011). The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research, 39 (21), 9275- 82. doi:10.1093/nar/gkr606

SenGupta, D. J., Zhang, B., Kraemer, B., Pochart, P., Fields, S., &amp; Wickens, M. (1996). A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences, 93 (16), 8496-8501. doi:10.1073/pnas.93.16.8496

Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., &amp;

Broude, N. E. (2007). RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nature methods, 4 (5), 421-7. doi:10.1038/nmethl023 Wang, X., McLachlan, J., Zamore, P. D., &amp; Hall, T. Μ. T. (2002) . Modular Recognition of RNA by a Human Pumilio-

Homology Domain. Cell, 110 (4), 501-512.

Zhang, J., Rouillon, C., Kerou, M., Reeks, J., Brugger, K., Graham, S., ... White, M. F. (2012). Structure and mechanism of the CMR complex for CRISPR-mediated antiviral immunity. Molecular cell, 45 (3), 303-13. doi:10.1016/j.molcel. 2011.12.013.

Claims (49)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Uma composição não ocorrendo naturalmente ou manipulada compreendendo: um sistema de administração operacionalmente configurado para administrar componentes do complexo CRISPR-Cas ou sequências de polinucleótidos compreendendo ou codificando os referidos componentes numa célula eucariótica, em que o referido complexo CRISPR-Cas é operacional na célula eucariótica; I. uma ou mais sequências de polinucleótidos do complexo CRISPR-Cas compreendendo ou codificando a expressão na célula eucariótica: (a) uma sequência guia capaz de hibridar com uma sequência alvo numa célula eucariótica, (b) uma sequência companheira tracr, e (c) uma sequência tracr, e II. uma enzima CRISPR compreendendo um ou mais domínios funcionais heterólogos ou um polinucleótido codificando uma enzima CRISPR compreendendo um ou mais domínios funcionais heterólogos para expressão na célula eucariótica; em que a sequência companheira tracr híbrida com a sequência tracr, a sequência guia dirige a ligação especifica da sequência de um complexo CRISPR à sequência alvo, o complexo CRISPR compreende a enzima CRISPR complexada com (1) a sequência guia que está hibridada com a sequência alvo, e (2) a sequência companheira tracr que está hibridada com a sequência tracr, a enzima CRISPR compreende uma ou mais mutações, tal que a enzima tenha atividade de nuclease alterada em comparação com a enzima de tipo selvagem, em que o um ou mais dominios heterólogos compreendem pelo menos um ou mais Sinais de Localização Nuclear NLS(s).
2. 2. A composição de acordo com a reivindicação 1, em que o sistema de administração compreende um sistema vetor compreendendo um ou mais vetores, e em que o componente (I) compreende um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de polinucleótidos que compreende uma sequência guia, a sequência companheira tracr e a sequência tracr, e em que o componente (II) compreende um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de polinucleótidos codificando a enzima CRISPR.
3. 3. A composição de acordo com a reivindicação 1, em que o sistema de administração compreende um sistema vetor compreendendo um ou mais vetores, e em que o componente (I) compreende um primeiro elemento regulador operacionalmente ligado à sequência guia e à sequência companheira tracr, e um terceiro elemento regulador operacionalmente ligado à sequência tracr, e em que o componente (II) compreende um segundo elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de polinucleótidos codificando a enzima CRISPR.
4. 4. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3, em que os componentes I e II estão localizados no mesmo ou diferentes vetores do sistema.
5. 5. A composição de acordo a reivindicação 4, em que os componentes I e II estão localizados no mesmo vetor.
6. 6. Uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, que é uma composição multiplexada compreendendo múltiplas sequências guia capazes de hibridarem com múltiplas sequências alvo.
7. 7. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, em que o um ou mais vetores compreendem um ou mais vetores virais.
8. 8. Uma composição de acordo a reivindicação 7, em que o um ou mais vetores virais compreendem um ou mais vetores de retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adenoassociados ou virus do herpes simples.
9. 9. Uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o sistema de administração compreende um sistema de levedura, um sistema de lipofecção, um sistema de microinjeção, um sistema de biolistica, virossomas, lipossomas, imunolipossomas, policatiões, conjugados lípido:ácido nucleico ou viriões artificiais.
10. 10. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a enzima CRISPR compreende uma ou mais mutações em dois ou mais domínios cataliticamente ativos.
11. 11. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a enzima CRISPR tem atividade de nuclease reduzida ou abolida em comparação com a enzima de tipo selvagem.
12. 12. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a uma ou mais mutações compreendem mutação em DIO SpCas9, H840 SpCas9, N854 SpCas9 ou N863 SPCas9, ou resíduos correspondentes de outras enzimas CRISPR.
13. 13. A composição de acordo com a reivindicação 12 em que a uma ou mais mutações compreendem D10A, H840A, N854A ou N863A.
14. 14. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13 em que a uma ou mais mutações compreendem duas mutações.
15. 15. A composição de acordo com a reivindicação 14 em que as mutações compreendem D10A SpCas9 e H840A SpCas9, ou resíduos correspondentes de outras enzimas CRISPR.
16. 16. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a enzima CRISPR é uma proteína de ligação a DNA que não dirige a clivagem de qualquer uma das cadeias na localização da sequência alvo.
17. 17. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a uma ou mais mutações são num domínio cataliticamente ativo da enzima CRISPR compreendendo RuvC I, RuvC II ou RuvC III.
18. 18. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a enzima CRISPR compreende dois ou mais domínios funcionais heterólogos.
19. 19. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes compreendendo pelo menos duas ou mais NLSs.
20. 20. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a referida pelo menos uma ou mais ou pelo menos duas ou mais sequências de localização nuclear estão no ou próximo do terminal amino da enzima e/ou no ou próximo do terminal carboxi da enzima.
21. 21. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que um domínio funcional compreende um domínio de ativação transcricional.
22. 22. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que um domínio funcional compreende VP64.
23. 23. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, em que um dominio funcional é um dominio repressor transcricional.
24. 24. A composição de acordo com a reivindicação 23, em que o dominio funcional compreende um dominio KRAB ou um dominio SID.
25. 25. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a sequência de codificação de enzima codifica dois ou mais dominios funcionais heteróloqos.
26. 26. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a sequência de codificação de enzima codifica dois ou mais dominios funcionais heterólogos fundidos à enzima CRISPR.
27. 27. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a sequência de codificação de enzima compreende adicionalmente uma sequência ligante entre quaisquer dois domínios.
28. 28. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que um ou mais domínios funcionais têm uma ou mais das seguintes atividades: atividade de metilase, atividade de desmetilase, atividade de ativação da transcrição, atividade de repressão da transcrição, atividade de fator de libertação da transcrição, atividade de modificação de histona, atividade de clivagem de RNA e atividade de ligação a ácidos nucleicos.
29. 29. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que um dominio funcional liga-se a DNA.
30. 30. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que um dominio funcional afeta a transcrição do ácido nucleico alvo.
31. 31. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a célula eucariótica compreende uma célula de mamífero.
32. 32. A composição de acordo com a reivindicação 31, em que a célula de mamífero compreende uma célula humana.
33. 33. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a enzima CRISPR tem otimização de codões para expressão numa célula eucariótica.
34. 34. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a enzima CRISPR é uma enzima CRISPR Cas9 do tipo II.
35. 35. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a enzima Cas9 é de um organismo selecionado do grupo compreendendo o género Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvlbaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium ou Corynebacter.
36. 36. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-34 em que a Cas9 é de Staphylococcus aureus.
37. 37. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a enzima CRISPR é uma enzima Cas9 que é uma proteína Cas9 quimérica compreendendo fragmentos de diferentes homólogos de Cas9.
38. 38. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a sequência alvo é adjacente a um Motivo Adjacente Protoespaçador (PAM) reconhecido pela enzima CRISPR.
39. 39. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 38, em que os referidos primeiro e segundo elementos reguladores compreendem cada um um promotor específico de tecido.
40. 40. A composição de acordo com a reivindicação 39, em que o promotor específico do tecido dirige a expressão de transcritos de CRISPR no sangue.
41. 41. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a sequência tracr tem 30 ou mais nucleótidos em comprimento.
42. 42. Um método de modulação da expressão de genes num lócus genómico de interesse numa célula de um organismo eucariótico por contacto da célula com a composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes; contanto que o organismo não seja um humano ou outro animal.
43. 43. Um método ex vivo ou in vitro de modulação da expressão de genes num lócus genómico de interesse numa célula de um organismo eucariótico por contacto da célula com a composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41; contanto que o referido método não compreenda um processo para modificação da identidade genética da linha germinal de um ser humano.
44. 44. Uso de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41 na edição de genes ou genoma ex vivo ou in vitro; contanto que a referida edição não compreenda um processo para modificação da identidade genética da linha germinal de um ser humano.
45. 45. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41 para uso como um terapêutico.
46. 46. A composição para uso de acordo com a reivindicação 45 em que o referido terapêutico é para edição de genes ou genoma, ou terapia de genes.
47. 47. Uma célula hospedeira eucariótica in vitro ou ex vivo compreendendo a composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41; contanto em que a célula eucariótica não seja uma linha de células germinais humanas.
48. 48. Uma célula hospedeira eucariótica in vitro ou ex vivo compreendendo o complexo CRISPR-Cas como definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41; contanto em que a célula eucariótica não seja uma linha de células germinais humanas.
49. 49. Descendência da célula hospedeira da reivindicação 47 ou 48; contanto que a descendência não compreenda um corpo humano.