JP2022545921A - 反復ｄｎａに関連する障害の治療のための組成物及び方法 - Google Patents

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Abstract

トリヌクレオチドリピートを切除する治療のための、ならびにトリヌクレオチドリピートに関連する疾患及び障害を治療するための組成物及び方法が含まれる。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１９年８月２７日出願の米国仮出願第６２／８９２，４４５号、２０２０年３月２３日出願の米国仮出願第６２／９９３，６１６号、及び２０２０年８月１９日出願の米国仮出願第６３／０６７，４８９号に対する優先権の利益を主張し、これらはすべて、参照によりその全体が組み込まれている。
ＥＦＳ－ＷＥＢ経由で提出された配列表の参照
本出願には、電子的に提出された．ｔｘｔ形式の配列表が含まれている。．ｔｘｔファイルには、２０２０年８月２５日に作成された「２０２０－０８－２５ ０１２４５－０００２－００ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という表題の配列表が含まれており、サイズは１１．７ＭＢである。この．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
序説及び概要
トリヌクレオチドリピート及び自己相補性を有する他の配列を含む反復ＤＮＡ配列は、顕著な遺伝的不安定性を示す傾向があり、神経学的及び神経筋疾患の主な原因として認識されている。特に、種々の遺伝子内またはその近くのトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）は、筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、ハンチントン病、及び種々のタイプの脊髄小脳失調症などの変性状態を含む、多くの神経学的及び神経筋的状態に関連している。
ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集は、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを使用してゲノムＤＮＡの配列特異的切断を提供することができる。哺乳動物細胞では、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼによる切断は、ＤＮＡ依存性セリン／スレオニンプロテインキナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）依存性である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介して最も一般的に修復される。トリヌクレオチドリピートまたは自己相補的領域の近くの個々の二本鎖切断のＮＨＥＪ修復によって、通常、次のトリヌクレオチドリピートまたは自己相補的領域の切除が生じず、このことは、ゲノム編集を適用して問題のあるトリヌクレオチドリピートまたは自己相補的遺伝子型を改善することは簡単ではないことを意味する。トリヌクレオチドリピートまたは自己相補的領域のいずれかの側で切断する１対のガイドＲＮＡを提供すると、ＮＨＥＪを介してある程度切除されるが、切断は単純に再封止され、かなりの数の細胞において介在リピートまたは自己相補的配列は失われない。したがって、反復ＤＮＡ配列を切除するための改善された組成物及び方法が必要である。
本明細書に開示されるのは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼと、エンドヌクレアーゼを、トリヌクレオチドリピートまたは自己相補的領域内またはその近くの標的に標的化させて、ＤＮＡからリピートまたは自己相補的配列を切除する少なくとも１つのガイドＲＮＡと、任意選択でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を使用する組成物及び方法である。このような方法により、とりわけ、トリヌクレオチドリピートに関連する遺伝子型を改善することができる。反復配列中またはその近くのＤＮＡの切断と組み合わせたＤＮＡ－ＰＫの阻害によって、増加した頻度での反復配列の切除が提供されることが見出された。ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を用いる場合または用いない場合において、トリヌクレオチドリピートを切除する方法における使用に特に好適なガイドＲＮＡ及びガイドＲＮＡの組み合わせも開示されている。
したがって、以下の実施形態が提供される。
実施形態１
組成物であって、
ｉ）スペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸であって、
ａ．配列番号４０１８、４０１０、４００２、４０４２、４０３４、４０２６、３９５４、３９４６、３９９４、３９１４、３９７８、３９０６、３８９８、３９３８、３９２２、３８５８、３８５０、３８８２、３８２６、３８１８、３８４２、３７９４、３７８６、３７６２、３８１０、３７４６、３７７８、３７３８、３７７０、３７２２、３７５４、３６９０、３６６６、３６５８、３６３４、３５８６、３５４６、３５３０、３６４２、３５１４、３５０６、３４９０、３６１８、３６１０、３６０２、３５７８、３４４２、３５２２、３４１０、３３７８、３４３４、３３７０、３４２６、３４１８、３３９４、３３８６、３３３０、３３５４、３３４６、３３１４、３９３０、３８９０、３８３４、３８０２、３７０６、３６９８、３６８２、３６７４、３５７０、３５５４、３５３８、３４９８、３４８２、３４５８、３４７４、３４５０、２６６７、２６６６、２６５０、２６４２、２６２６、２６１８、２７０６、２６９０、２６８２、２６１０、２６７４、２６５８、２６０２、２５９４、２６３４、２５５４、２５４６、２５８６、２５３８、２５７８、２５７０、２５２２、２４９８、２４９０、２４６６、２４５８、２４５０、２５１４、２５０６、２４１８、２４８２、２４７４、２３９４、２４４２、２４３４、２３７０、２３７８、２３５４、２３４６、２３３８、２３１４、２２９８、２２８２、２２７４、２２６６、２３３０、２２５８、２３２２、２２４２、２２３４、２２９０、２２５０、２２１８、２２２６、２２１０、２１９４、２１４６、２１３８、２１２２、２１０６、２０９８、２０９０、２１３０、２１１４、２０３４、２０２６、２０５８、２０５０、２０４２、１９１４、１７８６、１７７８、１７７０、１８４２、１７３８、１７０６、１６９０、１７４６、１７１４、１６５０、１６４２、１６１０、１５８６、１５６２、１５４６、１５７８、１５３８、１３７８、１３７０、１９２２、１８９８、１９０６、１７９４、１７６２、１６９８、１６７４、１７２２、１３６２、１４５０、２２０２、２１７８、２１７０、２１６２、２０１８、２０１０、１８９０、１９６２、１９４６、１８５０、１８１８、１６５８、１６３４、１６０２、１５５４、１４３４、１４２６、１３３８、１３４６、１９７８、１９９４、１９８６、１９７０、１９３８、１９３０、１８１０、１８３４、１８２６、１８０２、１６２６、１５９４、１５１４、１４９８、１４９０、１４８２、１４７４、１４５８、１４４２、１４１８、１４１０、１４０２、１３９４、及び１３８６から選択されるスペーサー配列；または
ｂ．配列番号３３３０、３９１４、３４１８、３７４６、３７７８、３３９４、４０２６、３６９０、３７９４、３３８６、３９３８、３６８２、３８１８、３６５８、３７２２、３８０２、３８５８、３５１４、３７７０、３３７０、３３５４、４０１０、２２０２、１７０６、２２１０、２１７０、１７７８、２２５８、２１１４、２１７８、１６４２、１７３８、１７４６、２３２２、１７７０、１５３８、２５１４、２４５８、２１９４、２５９４、２１６２、及び２６１８から選択されるスペーサー配列；または
ｃ．配列番号３７４６、３７７８、３３９４、３３８６、３９３８、３８１８、３７２２、３８５８、３３７０、１７０６、２２１０、２１１４、１５３８、及び２５９４から選択されるスペーサー配列；または
ｄ．配列番号３３３０、３７４６、３７７８、３３９４、４０２６、３３８６、３９３８、３８１８、３７２２、３８０２、３８５８、３５１４、３７７０、３３７０、２２０２、１７０６、２２１０、１７７８、２１１４、１７３８、１７４６、２３２２、１５３８、２５１４、２４５８、２１９４、及び２５９４から選択されるスペーサー配列；または
ｅ．配列番号３３３０、３９１４、３４１８、３７４６、３７７８、３３９４、４０２６、３６９０、３７９４、３３８６、３９３８、３６８２、３８１８、３６５８、及び３７２２から選択されるスペーサー配列；または
ｆ．配列番号２２０２、１７０６、２２１０、２１７０、１７７８、２２５８、２１１４、２１７８、１６４２、１７３８、１７４６、及び２３２２から選択されるスペーサー配列；または
ｇ．配列番号３７７８、４０２６、３７９４、４０１０、３９０６、３７４６、１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、１９１４、及び２２１０から選択されるスペーサー配列；または
ｈ．配列番号３３７８、３３５４、３３４６、３３３０、３３１４、２６５８、２６９０、２５４６、２５５４、２４９８、及び２５０６から選択されるスペーサー配列；または
ｉ．配列番号３３３０、３３１４、２６５８、２６９０、２５５４、及び２４９８から選択されるスペーサー配列；または
ｊ．配列番号３３１４、２６９０、２５５４、及び２４９８から選択されるスペーサー配列；または
ｋ．配列番号３９１４、３５１４、１７７８、２４５８、３８５８、３４１８、１７０６、及び２２５８から選択されるスペーサー配列；または
ｌ．配列番号３９１４及び３４１８から選択されるスペーサー配列；または
ｍ．配列番号３９３８；または
ｎ．配列番号３９１６、３４２０、及び３９４０から選択されるスペーサー配列；または
ｏ．ａ）からｎ）までの前記スペーサー配列のいずれか１つの少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続したヌクレオチドを含むスペーサー配列；または
ｐ．ａ）からｏ）の前記スペーサー配列のいずれか１つと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるスペーサー配列、を含む、前記スペーサー配列を含む前記ガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする前記核酸；
あるいは
ｉｉ）第１及び第２のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸であって、
ａ．配列番号２２０２及び３４１８；２２０２及び３３７０；２２０２及び３５１４；２２０２及び３６５８；２１７８及び３４１８；２１７８及び３３７０；２１７８及び３５１４；２１７８及び３６５８；２１７０及び３４１８；２１７０及び３３７０；２１７０及び３５１４；２１７０及び３６５８；２１６２及び３４１８；２１６２及び３３７０；２１６２及び３５１４；２１６２及び３６５８；２２０２及び４０１０；２２０２及び４０２６；２２０２及び３９１４；２２０２及び３９３８；２２０２及び３８５８；２２０２及び３８１８；２２０２及び３７９４；２２０２及び３８０２；２２０２及び３７４６；２２０２及び３７７８；２２０２及び３７７０；２２０２及び３７２２；２２０２及び３６９０；２２０２及び３６８２；２２０２及び３３３０；２２０２及び３３５４；２２０２及び３３９４；２２０２及び３３８６；２１７８及び４０１０；２１７８及び４０２６；２１７８及び３９１４；２１７８及び３９３８；２１７８及び３８５８；２１７８及び３８１８；２１７８及び３７９４；２１７８及び３８０２；２１７８及び３７４６；２１７８及び３７７８；２１７８及び３７７０；２１７８及び３７２２；２１７８及び３６９０；２１７８及び３６８２；２１７８及び３３３０；２１７８及び３３５４；２１７８及び３３９４；２１７８及び３３８６；２１７０及び４０１０；２１７０及び４０２６；２１７０及び３９１４；２１７０及び３９３８；２１７０及び３８５８；２１７０及び３８１８；２１７０及び３７９４；２１７０及び３８０２；２１７０及び３７４６；２１７０及び３７７８；２１７０及び３７７０；２１７０及び３７２２；２１７０及び３６９０；２１７０及び３６８２；２１７０及び３３３０；２１７０及び３３５４；２１７０及び３３９４；２１７０及び３３８６；２１６２及び４０１０；２１６２及び４０２６；２１６２及び３９１４；２１６２及び３９３８；２１６２及び３８５８；２１６２及び３８１８；２１６２及び３７９４；２１６２及び３８０２；２１６２及び３７４６；２１６２及び３７７８；２１６２及び３７７０；２１６２及び３７２２；２１６２及び３６９０；２１６２及び３６８２；２１６２及び３３３０；２１６２及び３３５４；２１６２及び３３９４；２１６２及び３３８６；１７０６及び３４１８；１７０６及び３３７０；１７０６及び３５１４；１７０６及び３６５８；１７０６及び４０１０；１７０６及び４０２６；１７０６及び３９１４；１７０６及び３９３８；１７０６及び３８５８；１７０６及び３８１８；１７０６及び３７９４；１７０６及び３８０２；１７０６及び３７４６；１７０６及び３７７８；１７０６及び３７７０；１７０６及び３７２２；１７０６及び３６９０；１７０６及び３６８２；１７０６及び３３３０；１７０６及び３３５４；１７０６及び３３９４；１７０６及び３３８６；２２１０及び３４１８；２２１０及び３３７０；２２１０及び３５１４；２２１０及び３６５８；２２１０及び４０１０；２２１０及び４０２６；２２１０及び３９１４；２２１０及び３９３８；２２１０及び３８５８；２２１０及び３８１８；２２１０及び３７９４；２２１０及び３８０２；２２１０及び３７４６；２２１０及び３７７８；２２１０及び３７７０；２２１０及び３７２２；２２１０及び３６９０；２２１０及び３６８２；２２１０及び３３３０；２２１０及び３３５４；２２１０及び３３９４；２２１０及び３３８６；１７７８及び３４１８；１７７８及び３３７０；１７７８及び３５１４；１７７８及び３６５８；１７７８及び４０１０；１７７８及び４０２６；１７７８及び３９１４；１７７８及び３９３８；１７７８及び３８５８；１７７８及び３８１８；１７７８及び３７９４；１７７８及び３８０２；１７７８及び３７４６；１７７８及び３７７８；１７７８及び３７７０；１７７８及び３７２２；１７７８及び３６９０；１７７８及び３６８２；１７７８及び３３３０；１７７８及び３３５４；１７７８及び３３９４；１７７８及び３３８６；２２５８及び３４１８；２２５８及び３３７０；２２５８及び３５１４；２２５８及び３６５８；２２５８及び４０１０；２２５８及び４０２６；２２５８及び３９１４；２２５８及び３９３８；２２５８及び３８５８；２２５８及び３８１８；２２５８及び３７９４；２２５８及び３８０２；２２５８及び３７４６；２２５８及び３７７８；２２５８及び３７７０；２２５８及び３７２２；２２５８及び３６９０；２２５８及び３６８２；２２５８及び３３３０；２２５８及び３３５４；２２５８及び３３９４；２２５８及び３３８６；２１１４及び３４１８；２１１４及び３３７０；２１１４及び３５１４；２１１４及び３６５８；２１１４及び４０１０；２１１４及び４０２６；２１１４及び３９１４；２１１４及び３９３８；２１１４及び３８５８；２１１４及び３８１８；２１１４及び３７９４；２１１４及び３８０２；２１１４及び３７４６；２１１４及び３７７８；２１１４及び３７７０；２１１４及び３７２２；２１１４及び３６９０；２１１４及び３６８２；２１１４及び３３３０；２１１４及び３３５４；２１１４及び３３９４；２１１４及び３３８６；１６４２及び３４１８；１６４２及び３３７０；１６４２及び３５１４；１６４２及び３６５８；１６４２及び４０１０；１６４２及び４０２６；１６４２及び３９１４；１６４２及び３９３８；１６４２及び３８５８；１６４２及び３８１８；１６４２及び３７９４；１６４２及び３８０２；１６４２及び３７４６；１６４２及び３７７８；１６４２及び３７７０；１６４２及び３７２２；１６４２及び３６９０；１６４２及び３６８２；１６４２及び３３３０；１６４２及び３３５４；１６４２及び３３９４；１６４２及び３３８６；１７３８及び３４１８；１７３８及び３３７０；１７３８及び３５１４；１７３８及び３６５８；１７３８及び４０１０；１７３８及び４０２６；１７３８及び３９１４；１７３８及び３９３８；１７３８及び３８５８；１７３８及び３８１８；１７３８及び３７９４；１７３８及び３８０２；１７３８及び３７４６；１７３８及び３７７８；１７３８及び３７７０；１７３８及び３７２２；１７３８及び３６９０；１７３８及び３６８２；１７３８及び３３３０；１７３８及び３３５４；１７３８及び３３９４；１７３８及び３３８６；２２５８及び３４１８；２２５８及び３３７０；２２５８及び３５１４；２２５８及び３６５８；２２５８及び４０１０；２２５８及び４０２６；２２５８及び３９１４；２２５８及び３９３８；２２５８及び３８５８；２２５８及び３８１８；２２５８及び３７９４；２２５８及び３８０２；２２５８及び３７４６；２２５８及び３７７８；２２５８及び３７７０；２２５８及び３７２２；２２５８及び３６９０；２２５８及び３６８２；２２５８及び３３３０；２２５８及び３３５４；２２５８及び３３９４；２２５８及び３３８６；２１１４及び３４１８；２１１４及び３３７０；２１１４及び３５１４；２１１４及び３６５８；２１１４及び４０１０；２１１４及び４０２６；２１１４及び３９１４；２１１４及び３９３８；２１１４及び３８５８；２１１４及び３８１８；２１１４及び３７９４；２１１４及び３８０２；２１１４及び３７４６；２１１４及び３７７８；２１１４及び３７７０；２１１４及び３７２２；２１１４及び３６９０；２１１４及び３６８２；２１１４及び３３３０；２１１４及び３３５４；２１１４及び３３９４；１７０６及び３３８６；１６４２及び３４１８；１６４２及び３３７０；１６４２及び３５１４；１６４２及び３６５８；１６４２及び４０１０；１６４２及び４０２６；１６４２及び３９１４；１６４２及び３９３８；１６４２及び３８５８；１６４２及び３８１８；１６４２及び３７９４；１６４２及び３８０２；１６４２及び３７４６；１６４２及び３７７８；１６４２及び３７７０；１６４２及び３７２２；１６４２及び３６９０；１６４２及び３６８２；１６４２及び３３３０；１６４２及び３３５４；１６４２及び３３９４；１６４２及び３３８６；１７３８及び３４１８；１７３８及び３３７０；１７３８及び３５１４；１７３８及び３６５８；１７３８及び４０１０；１７３８及び４０２６；１７３８及び３９１４；１７３８及び３９３８；１７３８及び３８５８；１７３８及び３８１８；１７３８及び３７９４；１７３８及び３８０２；１７３８及び３７４６；１７３８及び３７７８；１７３８及び３７７０；１７３８及び３７２２；１７３８及び３６９０；１７３８及び３６８２；１７３８及び３３３０；１７３８及び３３５４；１７３８及び３３９４；１７３８及び３３８６；１７４６及び３４１８；１７４６及び３３７０；１７４６及び３５１４；１７４６及び３６５８；１７４６及び４０１０；１７４６及び４０２６；１７４６及び３９１４；１７４６及び３９３８；１７４６及び３８５８；１７４６及び３８１８；１７４６及び３７９４；１７４６及び３８０２；１７４６及び３７４６；１７４６及び３７７８；１７４６及び３７７０；１７４６及び３７２２；１７４６及び３６９０；１７４６及び３６８２；１７４６及び３３３０；１７４６及び３３５４；１７４６及び３３９４；１７４６及び３３８６；２３２２及び３４１８；２３２２及び３３７０；２３２２及び３５１４；２３２２及び３６５８；２３２２及び４０１０；２３２２及び４０２６；２３２２及び３９１４；２３２２及び３９３８；２３２２及び３８５８；２３２２及び３８１８；２３２２及び３７９４；２３２２及び３８０２；２３２２及び３７４６；２３２２及び３７７８；２３２２及び３７７０；２３２２及び３７２２；２３２２及び３６９０；２３２２及び３６８２；２３２２及び３３３０；２３２２及び３３５４；２３２２及び３３９４；２３２２及び３３８６；１７７０及び３４１８；１７７０及び３３７０；１７７０及び３５１４；１７７０及び３６５８；１７７０及び４０１０；１７７０及び４０２６；１７７０及び３９１４；１７７０及び３９３８；１７７０及び３８５８；１７７０及び３８１８；１７７０及び３７９４；１７７０及び３８０２；１７７０及び３７４６；１７７０及び３７７８；１７７０及び３７７０；１７７０及び３７２２；１７７０及び３６９０；１７７０及び３６８２；１７７０及び３３３０；１７７０及び３３５４；１７７０及び３３９４；１７７０及び３３８６；１５３８及び３４１８；１５３８及び３３７０；１５３８及び３５１４；１５３８及び３６５８；１５３８及び４０１０；１５３８及び４０２６；１５３８及び３９１４；１５３８及び３９３８；１５３８及び３８５８；１５３８及び３８１８；１５３８及び３７９４；１５３８及び３８０２；１５３８及び３７４６；１５３８及び３７７８；１５３８及び３７７０；１５３８及び３７２２；１５３８及び３６９０；１５３８及び３６８２；１５３８及び３３３０；１５３８及び３３５４；１５３８及び３３９４；１５３８及び３３８６；２５１４及び３４１８；２５１４及び３３７０；２５１４及び３５１４；２５１４及び３６５８；２５１４及び４０１０；２５１４及び４０２６；２５１４及び３９１４；２５１４及び３９３８；２５１４及び３８５８；２５１４及び３８１８；２５１４及び３７９４；２５１４及び３８０２；２５１４及び３７４６；２５１４及び３７７８；２５１４及び３７７０；２５１４及び３７２２；２５１４及び３６９０；２５１４及び３６８２；２５１４及び３３３０；２５１４及び３３５４；２５１４及び３３９４；２５１４及び３３８６；２４５８及び３４１８；２４５８及び３３７０；２４５８及び３５１４；２４５８及び３６５８；２４５８及び４０１０；２４５８及び４０２６；２４５８及び３９１４；２４５８及び３９３８；２４５８及び３８５８；２４５８及び３８１８；２４５８及び３７９４；２４５８及び３８０２；２４５８及び３７４６；２４５８及び３７７８；２４５８及び３７７０；２４５８及び３７２２；２４５８及び３６９０；２４５８及び３６８２；２４５８及び３３３０；２４５８及び３３５４；２４５８及び３３９４；２４５８及び３３８６；２１９４及び３４１８；２１９４及び３３７０；２１９４及び３５１４；


２１９４及び３６５８；２１９４及び４０１０；２１９４及び４０２６；２１９４及び３９１４；２１９４及び３９３８；２１９４及び３８５８；２１９４及び３８１８；２１９４及び３７９４；２１９４及び３８０２；２１９４及び３７４６；２１９４及び３７７８；２１９４及び３７７０；２１９４及び３７２２；２１９４及び３６９０；２１９４及び３６８２；２１９４及び３３３０；２１９４及び３３５４；２１９４及び３３９４；２１９４及び３３８６；２５９４及び３４１８；２５９４及び３３７０；２５９４及び３５１４；２５９４及び３６５８；２５９４及び４０１０；２５９４及び４０２６；２５９４及び３９１４；２５９４及び３９３８；２５９４及び３８５８；２５９４及び３８１８；２５９４及び３７９４；２５９４及び３８０２；２５９４及び３７４６；２５９４及び３７７８；２５９４及び３７７０；２５９４及び３７２２；２５９４及び３６９０；２５９４及び３６８２；２５９４及び３３３０；２５９４及び３３５４；２５９４及び３３９４；２５９４及び３３８６；２６１８及び３４１８；２６１８及び３３７０；２６１８及び３５１４；２６１８及び３６５８；２６１８及び４０１０；２６１８及び４０２６；２６１８及び３９１４；２６１８及び３９３８；２６１８及び３８５８；２６１８及び３８１８；２６１８及び３７９４；２６１８及び３８０２；２６１８及び３７４６；２６１８及び３７７８；２６１８及び３７７０；２６１８及び３７２２；２６１８及び３６９０；２６１８及び３６８２；２６１８及び３３３０；２６１８及び３３５４；２６１８及び３３９４；ならびに２６１８及び３３８６から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
ｂ．配列番号２２０２及び３４１８；２２０２及び３３７０；２２０２及び３５１４；２２０２及び３６５８；２１７８及び３４１８；２１７８及び３３７０；２１７８及び３５１４；２１７８及び３６５８；２１７０及び３４１８；２１７０及び３３７０；２１７０及び３５１４；２１７０及び３６５８；２１６２及び３４１８；２１６２及び３３７０；２１６２及び３５１４；２１６２及び３６５８；２２０２及び４０１０；２２０２及び４０２６；２２０２及び３９１４；２２０２及び３９３８；２２０２及び３８５８；２２０２及び３８１８；２２０２及び３７９４；２２０２及び３８０２；２２０２及び３７４６；２２０２及び３７７８；２２０２及び３７７０；２２０２及び３７２２；２２０２及び３６９０；２２０２及び３６８２；２２０２及び３３３０；２２０２及び３３５４；２２０２及び３３９４；２２０２及び３３８６；２１７８及び４０１０；２１７８及び４０２６；２１７８及び３９１４；２１７８及び３９３８；２１７８及び３８５８；２１７８及び３８１８；２１７８及び３７９４；２１７８及び３８０２；２１７８及び３７４６；２１７８及び３７７８；２１７８及び３７７０；２１７８及び３７２２；２１７８及び３６９０；２１７８及び３６８２；２１７８及び３３３０；２１７８及び３３５４；２１７８及び３３９４；２１７８及び３３８６；２１７０及び４０１０；２１７０及び４０２６；２１７０及び３９１４；２１７０及び３９３８；２１７０及び３８５８；２１７０及び３８１８；２１７０及び３７９４；２１７０及び３８０２；２１７０及び３７４６；２１７０及び３７７８；２１７０及び３７７０；２１７０及び３７２２；２１７０及び３６９０；２１７０及び３６８２；２１７０及び３３３０；２１７０及び３３５４；２１７０及び３３９４；２１７０及び３３８６；２１６２及び４０１０；２１６２及び４０２６；２１６２及び３９１４；２１６２及び３９３８；２１６２及び３８５８；２１６２及び３８１８；２１６２及び３７９４；２１６２及び３８０２；２１６２及び３７４６；２１６２及び３７７８；２１６２及び３７７０；２１６２及び３７２２；２１６２及び３６９０；２１６２及び３６８２；２１６２及び３３３０；２１６２及び３３５４；２１６２及び３３９４；及び２１６２；ならびに３３８６から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
ｃ．配列番号２２０２及び３４１８；２２０２及び３３７０；２２０２及び３５１４；２２０２及び３６５８；２１７８及び３４１８；２１７８及び３３７０；２１７８及び３５１４；２１７８及び３６５８；２１７０及び３４１８；２１７０及び３３７０；２１７０及び３５１４；２１７０及び３６５８；２１６２及び３４１８；２１６２及び３３７０；２１６２及び３５１４；ならびに２１６２及び３６５８から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
ｄ．配列番号３７７８及び２５１４；３７７８及び２２５８；３７７８及び２２１０；３３８６及び２５１４；３３８６及び２２５８；３３８６及び２２１０；３３５４及び２５１４；３３５４及び２２５８；ならびに３３５４及び２２１０から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
ｅ．配列番号３７７８及び２２５８；３７７８及び２２１０；３３８６及び２２５８；３３８６及び２２１０；ならびに３３５４及び２５１４から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
ｆ．配列番号３３４６及び２５５４；３３４６及び２４９８；３３３０及び２５５４；３３３０及び２４９８；３３３０及び２５０６；ならびに３３３０及び２５４６から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
ｇ．配列番号１１５３及び１１２９；または
ｈ．配列番号３３４６及び２５５４；３３４６及び２４９８；３３３０及び２５５４；３３３０及び２４９８；３３５４及び２５４６；３３５４及び２５０６；３３７８及び２５４６；ならびに３３７８及び２５０６から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
ｉ．配列番号３３４６及び２５５４；３３４６及び２４９８；３３３０及び２５５４；ならびに３３３０及び２４９８から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
ｊ．ａ）からｉ）までの前記第１及び第２のスペーサー配列のいずれかの少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続したヌクレオチドを含む第１及び第２のスペーサー配列；または
ｋ．ａ）からｊ）までの前記第１及び第２のスペーサー配列のいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である第１及び第２のスペーサー配列、を含む、前記第１及び第２のスペーサー配列を含む前記１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする前記１つ以上の核酸、
を含む、前記組成物。
実施形態２
組成物であって、
１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含み、前記１対のスペーサー配列が、
ａ．配列番号２８５６、２８６４、２８８０、２８９６、２９０４、２９１２、２９３６、２９４４、２９６０、２９９２、３０１６、３０２４、３０６４、３０９６、３１１２、３１２８、３１３６、３１４４、３１６０、３１６８、３１９２、３２００、３２０８、３２１６、３２２４、３２３２、３２４０、３２４８、３２５６、３２６４、３３１４、３３３０、３３４６、３３５４、３３７０、３３７８、３３８６、３３９４、３４１０、３４１８、３４２６、３４３４、３４４２、３４５０、３４５８、３４７４、３４８２、３４９０、３４９８、３５０６、３５１４、３５２２、３５３０、３５３８、３５４６、３５５４、３５７０、３５７８、３５８６、３６０２、３６１０、３６１８、３６３４、３６４２、３６５８、３６７４、３６８２、３６９０、３６９８、３７０６、３７２２、３７４６、３７６２、３７７０、３７７８、３７９４、３８０２、３８１８、３８２６、３８３４、３８５０、３８５８、３８９０、３８９８、３９０６、３９１４、３９２２、３９３０、３９３８、３９４６、３９９４、４０１０、４０１８、４０２６、４０３４、４０４２、４２０８、及び４５０６から選択される第１のスペーサー配列、ならびに配列番号５６０、５８４、６０８、６１６、６５６、６７２、６８８、６９６、７１２、７４４、７５２、７６０、８４０、８６４、９６０、９７６、９８４、１００８、１０５６、１１２８、１１３６、１１５２、１２２４、１２４０、１２７２、１３３８、１３４６、１３７０、１３７８、１３８６、１３９４、１４０２、１４１０、１４１８、１４２６、１４３４、１４４２、１４５８、１４７４、１４８２、１４９０、１４９８、１５１４、１５３８、１５４６、１５５４、１５６２、１５７８、１５８６、１５９４、１６０２、１６１０、１６２６、１６３４、１６４２、１６５０、１６５８、１６９０、１７０６、１７１４、１７３８、１７４６、１７７０、１７７８、１７８６、１８０２、１８１０、１８１８、１８２６、１８３４、１８４２、１８５０、１８９０、１９１４、１９３０、１９３８、１９４６、１９６２、１９７０、１９７８、１９８６、１９９４、２０１０、２０１８、２０２６、２０４２、２０５０、２０５８、２０９０、２１１４、２１３０、２１６２、２１７０、２１７８、２２０２、２２１０、２２２６、２２４２、２２５８、２２６６、２２７４、２２８２、２２９８、２３１４、２３２２、２３３０、２３３８、２３４６、２３５４、２３７０、２３７８、２３９４、２４１８、２４３４、２４４２、２４５８、２４６６、２４７４、２４９８、２５０６、２５１４、２５２２、２５４６、２５５４、２５７０、２５８６、２６５８、４９８９、４９９０、４９９１、及び４９９２から選択される第２のスペーサー配列または；
ｂ．配列番号３７７８、４０２６、３７９４、４０１０、３９０６及び３７４６から選択される第１のスペーサー配列、ならびに配列番号１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、１９１４、及び２２１０から選択される第２のスペーサー配列；または
ｃ．配列番号３７７８及び１７７８；３７７８及び１７４６；３７７８及び１７７０；３７７８及び１５８６；３７７８及び１９１４；３７７８及び２２１０；４０２６及び１７７８；４０２６及び１７４６；４０２６及び１７７０；４０２６及び１５８６；４０２６及び１９１４；４０２６及び２２１０；３７９４及び１７７８；３７９４及び１７４６；３７９４及び１７７０；３７９４及び１５８６；３７９４及び１５８６；３７９４及び１９１４；３７９４及び２２１０；４０１０及び１７７８；４０１０及び１７７０；４０１０及び１７４６；４０１０及び１５８６；４０１０及び１９１４；４０１０及び２２１０；３９０６及び１７７８；３９０６及び１７７８；３９０６及び１７４６；３９０６及び１７７０；３９０６及び１５８６；３９０６及び１９１４；３９０６及び２２１０；３７４６及び１７７８；３７４６及び１７４６；３７４６及び１７７０；３７４６及び１５８６；３７４６及び１９１４；ならびに３７４６及び２２１０から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
ｄ．配列番号３２５６、２８９６、３１３６、及び３２２４から選択される第１のスペーサー配列、ならびに４９８９、５６０、６７２、９７６、７６０、９８４、及び６１６から選択される第２のスペーサー配列；または
ｅ．配列番号３２５６及び４９８９；３２５６及び９８４；３２５６及び６１６；２８９６及び４９８９；２８９６及び６７２；２８９６及び７６０；３１３６及び４９８９；３１３６及び５６０；３２２４及び４９８９；３２２４及び９７６；ならびに３２２４及び７６０から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
ｆ．ａ）からｅ）までの前記第１及び第２のスペーサー配列のいずれかの少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続したヌクレオチドを含む第１及び第２のスペーサー配列；または
ｇ．ａ）からｆ）までの前記第１及び第２のスペーサー配列のいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である第１及び第２のスペーサー配列、を含む、前記組成物。
実施形態２ｂは、１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物であって、ここで、前記１対のスペーサー配列は、配列番号２７０９～４０７６から選択される第１のスペーサー配列、及び配列番号１０１～２７０８から選択される第２のスペーサー配列を含む。実施形態２．２７０９～実施形態２．４０７６は、追加の特徴を含む実施形態１２ｂによる実施形態である。実施形態２．２７０９～実施形態２．４０７６、実施形態２．０５０７０～実施形態２．０５３３４、及び実施形態２．４６７６８～実施形態２．５２８９８では、略語は次のように使用される：「ｅｍｂ．」は、実施形態を意味する；「ｓ．ｓ．」は、スペーサー配列を意味する；「ＳＩＤ」は、配列番号を意味する。ｅｍｂ．２．２７０９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７０９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７１０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７１０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７１１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７１１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７１２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７１２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７１３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７１３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７１４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７１４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７１５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７１５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７１６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７１６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７１７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７１７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７１８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７１８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７１９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７１９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７２０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７２０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７２１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７２１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７２２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７２２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７２３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７２３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７２４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７２４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７２５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７２５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７２６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７２６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７２７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７２７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７２８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７２８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７２９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７２９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７３０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７３０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７３１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７３１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７３２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７３２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７３３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７３３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７３４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７３４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７３５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７３５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７３６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７３６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７３７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７３７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７３８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７３８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７３９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７３９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７４０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７４０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７４１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７４１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７４２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７４２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７４３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７４３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７４４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７４４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７４５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７４５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７４６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７４６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７４７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７４７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７４８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７４８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７４９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７４９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７５０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７５０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７５１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７５１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７５２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７５２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７５３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７５３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７５４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７５４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７５５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７５５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７５６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７５６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７５７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７５７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７５８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７５８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７５９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７５９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７６０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７６０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７６１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７６１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７６２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７６２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７６３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７６３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７６４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７６４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７６５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７６５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７６６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７６６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７６７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７６７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７６８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７６８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７６９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７６９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７７０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７７０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７７１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７７１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７７２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７７２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７７３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７７３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７７４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７７４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７７５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７７５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７７６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７７６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７７７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７７７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７７８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７７８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７７９において


、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７７９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７８０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７８０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７８１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７８１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７８２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７８２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７８３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７８３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７８４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７８４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７８５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７８５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７８６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７８６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７８７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７８７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７８８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７８８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７８９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７８９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７９０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７９０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７９１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７９１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７９２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７９２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７９３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７９３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７９４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７９４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７９５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７９５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７９６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７９６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７９７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７９７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７９８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２７９９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２７９９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８００において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８００及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８０１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８０１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８０２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８０２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８０３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８０３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８０４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８０４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８０５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８０５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８０６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８０６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８０７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８０７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８０８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８０８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８０９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８０９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８１０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８１０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８１１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８１１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８１２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８１２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８１３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８１３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８１４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８１４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８１５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８１５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８１６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８１６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８１７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８１７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８１８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８１８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８１９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８１９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８２０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８２０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８２１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８２１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８２２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８２２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８２３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８２３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８２４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８２４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８２５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８２５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８２６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８２６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８２７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８２７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８２８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８２８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８２９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８２９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８３０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８３０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８３１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８３１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８３２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８３２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８３３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８３３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８３４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８３４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８３５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８３５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８３６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８３６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８３７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８３７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８３８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８３８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８３９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８３９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８４０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８４０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８４１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８４１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８４２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８４２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８４３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８４３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８４４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８４４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８４５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８４５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８４６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８４６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８４７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８４７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８４８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８４８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８４９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８４９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８５０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８５０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８５１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８５１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８５２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８５２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８５３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８５３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８５４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳ


ＩＤ２８５４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８５５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８５５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８５６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８５６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８５７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８５７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８５８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８５８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８５９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８５９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８６０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８６０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。６ ｅｍｂ．２．２８６１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８６１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８６２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８６２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８６３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８６３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８６４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８６４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８６５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８６５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８６６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８６６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８６７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８６７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８６８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８６８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８６９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８６９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８７０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８７０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８７１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８７１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８７２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８７２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８７３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８７３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８７４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８７４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８７５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８７５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８７６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８７６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８７７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８７７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８７８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８７８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８７９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８７９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８８０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８８０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８８１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８８１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８８２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８８２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８８３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８８３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８８４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８８４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８８５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８８５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８８６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８８６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８８７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８８７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８８８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８８８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８８９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８８９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８９０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８９０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８９１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８９１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８９２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８９２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８９３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８９３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８９４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８９４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８９５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８９５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８９６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８９６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８９７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８９７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８９８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２８９９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２８９９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９００において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９００及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９０１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９０１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９０２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９０２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９０３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９０３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９０４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９０４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９０５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９０５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９０６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９０６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９０７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９０７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９０８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９０８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９０９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９０９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９１０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９１０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９１１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９１１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９１２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９１２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９１３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９１３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９１４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９１４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９１５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９１５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９１６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９１６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９１７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９１７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９１８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９１８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９１９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９１９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９２０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９２０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９２１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９２１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９２２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９２２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９２３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９２３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９２４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９２４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９２５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９２５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９２６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９２６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９２７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９２７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９２８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９２８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９２９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９２９及びＳＩＤ１０１～２７０８


のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９３０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９３０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９３１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９３１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９３２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９３２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９３３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９３３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９３４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９３４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９３５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９３５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９３６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９３６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９３７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９３７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９３８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９３８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９３９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９３９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９４０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９４０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９４１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９４１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９４２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９４２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９４３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９４３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９４４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９４４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９４５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９４５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９４６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９４６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９４７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９４７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９４８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９４８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９４９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９４９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９５０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９５０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９５１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９５１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９５２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９５２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９５３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９５３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９５４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９５４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９５５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９５５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９５６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９５６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９５７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９５７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９５８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９５８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９５９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９５９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９６０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９６０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９６１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９６１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９６２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９６２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９６３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９６３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９６４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９６４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９６５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９６５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９６６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９６６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９６７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９６７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９６８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９６８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９６９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９６９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９７０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９７０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９７１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９７１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９７２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９７２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９７３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９７３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９７４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９７４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９７５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９７５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９７６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９７６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９７７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９７７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９７８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９７８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９７９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９７９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９８０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９８０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９８１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９８１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９８２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９８２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９８３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９８３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９８４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９８４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９８５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９８５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９８６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９８６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９８７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９８７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９８８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９８８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９８９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９８９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９９０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９９０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９９１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９９１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９９２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９９２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９９３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９９３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９９４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９９４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９９５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９９５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９９６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９９６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９９７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９９７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９９８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．２９９９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ２９９９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０００において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０００及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３００１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３００１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３００２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３００２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３００３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３００３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３００４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３００４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３


００５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３００５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３００６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３００６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３００７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３００７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３００８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３００８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３００９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３００９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０１０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０１０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０１１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０１１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０１２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０１２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０１３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０１３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０１４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０１４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０１５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０１５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０１６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０１６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０１７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０１７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０１８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０１８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０１９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０１９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０２０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０２０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０２１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０２１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０２２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０２２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０２３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０２３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０２４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０２４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０２５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０２５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０２６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０２６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０２７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０２７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０２８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０２８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０２９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０２９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０３０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０３０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０３１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０３１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０３２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０３２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０３３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０３３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０３４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０３４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０３５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０３５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０３６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０３６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０３７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０３７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０３８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０３８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０３９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０３９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０４０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０４０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０４１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０４１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０４２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０４２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０４３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０４３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０４４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０４４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０４５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０４５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０４６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０４６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０４７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０４７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０４８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０４８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０４９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０４９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０５０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０５０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０５１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０５１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０５２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０５２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０５３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０５３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０５４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０５４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０５５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０５５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０５６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０５６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０５７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０５７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０５８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０５８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０５９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０５９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０６０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０６０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０６１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０６１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０６２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０６２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０６３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０６３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０６４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０６４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０６５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０６５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０６６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０６６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０６７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０６７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０６８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０６８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０６９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０６９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０７０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０７０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０７１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０７１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０７２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０７２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０７３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０７３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０７４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０７４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０７５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０７５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０７６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０７６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０７７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０７７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０７８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０７８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０７９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０７９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０８０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．


は、それぞれＳＩＤ３０８０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０８１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０８１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０８２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０８２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０８３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０８３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０８４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０８４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０８５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０８５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０８６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０８６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０８７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０８７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０８８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０８８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０８９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０８９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０９０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０９０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０９１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０９１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０９２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０９２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０９３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０９３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０９４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０９４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０９５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０９５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０９６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０９６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０９７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０９７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０９８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３０９９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３０９９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１００において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１００及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１０１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１０１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１０２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１０２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１０３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１０３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１０４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１０４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１０５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１０５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１０６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１０６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１０７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１０７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１０８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１０８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１０９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１０９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１１０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１１０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１１１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１１１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１１２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１１２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１１３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１１３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。３１１ ｅｍｂ．２．３１１４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１１４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１１５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１１５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１１６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１１６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１１７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１１７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１１８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１１８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１１９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１１９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１２０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１２０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１２１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１２１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１２２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１２２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。３１２ ｅｍｂ．２．３１２３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１２３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１２４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１２４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１２５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１２５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１２６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１２６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１２７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１２７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１２８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１２８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１２９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１２９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１３０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１３０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１３１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１３１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１３２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１３２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１３３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１３３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１３４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１３４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１３５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１３５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１３６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１３６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１３７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１３７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１３８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１３８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１３９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１３９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１４０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１４０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１４１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１４１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１４２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１４２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１４３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１４３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１４４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１４４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１４５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１４５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１４６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１４６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１４７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１４７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１４８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１４８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１４９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１４９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１５０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１５０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１５１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１５１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１５２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１５２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１５３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１５３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１５４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１５４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１５５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１５５


及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１５６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１５６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１５７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１５７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１５８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１５８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１５９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１５９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１６０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１６０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１６１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１６１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１６２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１６２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１６３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１６３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１６４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１６４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１６５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１６５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１６６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１６６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１６７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１６７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１６８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１６８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１６９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１６９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１７０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１７０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１７１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１７１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１７２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１７２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１７３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１７３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１７４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１７４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１７５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１７５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１７６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１７６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１７７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１７７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１７８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１７８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１７９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１７９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１８０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１８０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１８１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１８１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１８２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１８２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１８３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１８３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１８４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１８４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１８５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１８５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１８６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１８６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１８７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１８７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１８８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１８８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１８９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１８９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１９０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１９０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１９１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１９１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１９２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１９２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１９３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１９３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１９４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１９４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１９５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１９５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１９６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１９６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１９７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１９７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１９８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３１９９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３１９９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２００において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２００及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２０１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２０１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２０２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２０２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２０３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２０３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２０４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２０４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２０５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２０５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２０６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２０６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２０７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２０７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２０８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２０８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２０９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２０９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２１０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２１０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２１１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２１１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２１２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２１２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２１３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２１３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２１４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２１４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２１５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２１５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２１６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２１６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２１７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２１７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２１８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２１８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２１９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２１９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２２０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２２０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２２１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２２１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２２２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２２２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２２３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２２３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２２４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２２４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２２５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２２５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２２６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２２６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２２７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２２７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２２８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２２８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２２９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２２９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２３０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２３０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか


１つである。ｅｍｂ．２．３２３１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２３１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２３２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２３２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２３３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２３３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２３４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２３４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２３５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２３５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２３６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２３６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２３７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２３７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２３８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２３８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２３９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２３９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２４０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２４０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２４１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２４１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２４２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２４２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２４３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２４３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２４４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２４４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２４５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２４５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２４６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２４６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２４７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２４７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２４８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２４８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２４９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２４９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２５０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２５０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２５１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２５１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２５２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２５２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２５３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２５３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２５４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２５４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２５５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２５５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２５６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２５６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２５７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２５７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２５８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２５８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２５９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２５９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。３２５ ｅｍｂ．２．３２６０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２６０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２６１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２６１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２６２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２６２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２６３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２６３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２６４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２６４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２６５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２６５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２６６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２６６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２６７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２６７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２６８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２６８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２６９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２６９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２７０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２７０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２７１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２７１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２７２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２７２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２７３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２７３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２７４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２７４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。３２７ ｅｍｂ．２．３２７５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２７５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２７６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２７６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２７７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２７７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２７８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２７８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２７９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２７９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２８０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２８０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。８ ｅｍｂ．２．３２８１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２８１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２８２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２８２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２８３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２８３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２８４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２８４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２８５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２８５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２８６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２８６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２８７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２８７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２８８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２８８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２８９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２８９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２９０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２９０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２９１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２９１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２９２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２９２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２９３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２９３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２９４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２９４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２９５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２９５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２９６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２９６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２９７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２９７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２９８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３２９９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３２９９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３００において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３００及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３０１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３０１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３０２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３０２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３０３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３０３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３０４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３０４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３０５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３０５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２


．３３０６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３０６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３０７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３０７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３０８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３０８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３０９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３０９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３１０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３１０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３１１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３１１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３１２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３１２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３１３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３１３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３１４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３１４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３１５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３１５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３１６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３１６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３１７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３１７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３１８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３１８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３１９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３１９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３２０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３２０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３２１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３２１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３２２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３２２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３２３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３２３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３２４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３２４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３２５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３２５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３２６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３２６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３２７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３２７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３２８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３２８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３２９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３２９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３３０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３３０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３３１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３３１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３３２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３３２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３３３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３３３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３３４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３３４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３３５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３３５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３３６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３３６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３３７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３３７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３３８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３３８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３３９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３３９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３４０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３４０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３４１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３４１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３４２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３４２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３４３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３４３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３４４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３４４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３４５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３４５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３４６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３４６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３４７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３４７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３４８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３４８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３４９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３４９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３５０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３５０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３５１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３５１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３５２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３５２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３５３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３５３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３５４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３５４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３５５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３５５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３５６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３５６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３５７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３５７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３５８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３５８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３５９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３５９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３６０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３６０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３６１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３６１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３６２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３６２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３６３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３６３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３６４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３６４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３６５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３６５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３６６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３６６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３６７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３６７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３６８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３６８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３６９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３６９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３７０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３７０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３７１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３７１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３７２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３７２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３７３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３７３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３７４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３７４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３７５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３７５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３７６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３７６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３７７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３７７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３７８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３７８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３７９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３７９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３８０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３８０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３８１において、前記第１及び第２のｓ．


ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３８１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３８２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３８２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３８３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３８３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３８４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３８４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３８５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３８５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３８６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３８６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３８７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３８７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３８８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３８８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３８９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３８９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３９０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３９０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３９１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３９１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３９２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３９２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３９３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３９３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３９４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３９４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３９５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３９５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３９６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３９６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３９７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３９７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３９８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３３９９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３３９９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４００において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４００及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４０１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４０１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４０２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４０２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４０３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４０３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４０４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４０４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４０５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４０５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４０６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４０６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４０７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４０７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４０８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４０８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４０９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４０９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４１０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４１０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４１１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４１１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４１２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４１２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４１３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４１３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４１４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４１４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４１５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４１５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４１６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４１６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４１７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４１７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４１８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４１８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４１９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４１９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４２０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４２０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４２１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４２１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４２２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４２２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４２３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４２３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４２４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４２４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４２５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４２５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４２６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４２６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４２７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４２７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４２８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４２８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４２９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４２９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４３０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４３０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４３１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４３１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４３２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４３２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４３３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４３３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４３４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４３４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４３５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４３５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４３６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４３６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４３７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４３７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４３８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４３８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４３９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４３９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４４０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４４０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４４１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４４１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４４２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４４２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４４３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４４３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４４４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４４４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４４５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４４５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４４６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４４６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４４７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４４７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４４８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４４８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４４９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４４９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４５０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４５０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４５１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４５１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４５２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４５２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４５３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４５３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４５４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４５４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４５５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４５５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４５６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４５６及びＳＩＤ１


０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４５７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４５７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４５８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４５８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４５９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４５９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４６０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４６０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４６１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４６１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４６２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４６２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４６３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４６３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４６４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４６４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４６５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４６５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４６６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４６６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４６７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４６７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４６８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４６８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４６９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４６９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４７０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４７０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４７１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４７１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４７２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４７２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４７３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４７３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４７４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４７４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４７５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４７５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４７６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４７６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４７７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４７７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４７８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４７８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４７９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４７９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４８０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４８０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４８１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４８１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４８２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４８２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４８３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４８３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４８４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４８４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４８５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４８５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４８６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４８６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４８７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４８７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４８８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４８８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４８９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４８９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４９０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４９０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４９１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４９１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４９２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４９２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４９３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４９３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４９４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４９４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４９５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４９５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４９６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４９６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４９７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４９７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４９８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３４９９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３４９９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５００において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５００及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５０１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５０１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５０２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５０２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５０３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５０３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５０４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５０４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５０５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５０５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５０６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５０６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５０７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５０７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５０８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５０８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５０９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５０９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５１０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５１０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５１１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５１１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５１２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５１２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５１３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５１３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５１４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５１４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５１５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５１５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５１６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５１６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５１７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５１７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５１８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５１８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５１９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５１９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５２０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５２０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５２１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５２１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５２２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５２２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５２３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５２３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５２４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５２４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５２５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５２５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５２６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５２６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５２７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５２７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５２８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５２８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５２９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５２９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５３０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５３０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５３１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５３１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。


ｅｍｂ．２．３５３２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５３２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５３３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５３３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５３４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５３４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５３５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５３５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５３６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５３６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５３７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５３７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５３８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５３８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５３９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５３９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５４０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５４０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５４１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５４１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５４２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５４２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５４３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５４３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５４４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５４４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５４５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５４５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５４６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５４６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５４７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５４７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５４８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５４８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５４９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５４９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５５０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５５０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５５１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５５１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５５２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５５２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５５３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５５３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５５４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５５４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５５５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５５５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５５６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５５６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５５７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５５７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５５８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５５８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５５９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５５９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５６０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５６０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５６１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５６１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５６２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５６２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５６３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５６３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５６４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５６４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５６５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５６５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５６６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５６６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５６７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５６７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５６８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５６８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５６９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５６９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５７０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５７０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５７１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５７１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５７２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５７２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５７３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５７３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５７４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５７４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５７５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５７５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５７６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５７６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５７７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５７７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５７８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５７８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５７９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５７９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５８０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５８０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５８１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５８１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５８２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５８２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５８３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５８３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５８４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５８４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５８５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５８５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５８６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５８６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５８７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５８７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５８８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５８８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５８９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５８９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５９０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５９０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５９１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５９１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５９２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５９２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５９３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５９３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５９４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５９４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５９５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５９５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５９６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５９６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５９７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５９７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５９８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３５９９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３５９９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６００において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６００及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６０１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６０１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６０２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６０２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６０３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６０３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６０４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６０４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６０５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６０５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６０６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６０６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６０７において、前記第１及び


第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６０７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６０８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６０８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６０９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６０９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６１０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６１０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６１１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６１１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６１２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６１２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６１３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６１３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６１４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６１４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６１５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６１５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６１６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６１６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６１７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６１７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６１８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６１８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６１９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６１９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６２０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６２０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６２１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６２１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６２２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６２２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６２３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６２３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６２４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６２４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６２５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６２５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６２６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６２６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６２７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６２７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６２８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６２８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６２９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６２９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６３０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６３０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６３１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６３１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６３２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６３２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６３３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６３３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６３４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６３４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６３５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６３５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６３６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６３６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６３７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６３７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６３８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６３８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６３９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６３９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６４０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６４０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６４１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６４１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６４２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６４２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６４３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６４３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６４４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６４４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６４５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６４５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６４６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６４６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６４７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６４７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６４８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６４８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６４９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６４９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６５０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６５０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６５１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６５１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６５２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６５２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６５３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６５３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６５４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６５４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６５５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６５５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６５６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６５６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６５７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６５７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６５８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６５８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６５９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６５９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６６０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６６０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６６１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６６１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６６２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６６２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６６３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６６３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６６４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６６４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６６５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６６５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６６６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６６６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６６７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６６７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６６８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６６８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６６９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６６９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６７０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６７０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６７１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６７１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６７２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６７２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６７３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６７３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６７４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６７４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６７５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６７５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６７６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６７６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６７７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６７７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６７８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６７８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６７９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６７９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６８０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６８０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６８１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６８１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６８２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６８２及


びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６８３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６８３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６８４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６８４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６８５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６８５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６８６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６８６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６８７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６８７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６８８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６８８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６８９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６８９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６９０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６９０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６９１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６９１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６９２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６９２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６９３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６９３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６９４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６９４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６９５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６９５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６９６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６９６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６９７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６９７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６９８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３６９９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３６９９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７００において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７００及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７０１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７０１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７０２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７０２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７０３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７０３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７０４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７０４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７０５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７０５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７０６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７０６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７０７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７０７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７０８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７０８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７０９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７０９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７１０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７１０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７１１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７１１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７１２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７１２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７１３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７１３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７１４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７１４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７１５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７１５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７１６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７１６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７１７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７１７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７１８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７１８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７１９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７１９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７２０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７２０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７２１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７２１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７２２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７２２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７２３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７２３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７２４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７２４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７２５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７２５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７２６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７２６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７２７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７２７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７２８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７２８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７２９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７２９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７３０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７３０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７３１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７３１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７３２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７３２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７３３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７３３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７３４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７３４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７３５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７３５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７３６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７３６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７３７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７３７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７３８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７３８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７３９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７３９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７４０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７４０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７４１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７４１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７４２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７４２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７４３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７４３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７４４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７４４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７４５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７４５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７４６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７４６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７４７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７４７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７４８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７４８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７４９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７４９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７５０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７５０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７５１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７５１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７５２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７５２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７５３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７５３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７５４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７５４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７５５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７５５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７５６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７５６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７５７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７５７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１


つである。ｅｍｂ．２．３７５８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７５８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７５９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７５９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７６０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７６０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７６１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７６１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７６２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７６２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７６３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７６３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７６４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７６４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７６５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７６５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７６６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７６６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７６７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７６７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７６８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７６８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７６９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７６９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７７０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７７０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７７１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７７１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７７２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７７２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７７３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７７３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７７４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７７４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７７５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７７５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７７６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７７６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７７７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７７７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７７８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７７８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７７９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７７９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７８０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７８０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７８１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７８１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７８２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７８２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７８３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７８３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７８４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７８４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７８５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７８５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７８６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７８６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７８７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７８７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７８８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７８８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７８９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７８９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７９０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７９０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７９１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７９１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７９２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７９２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７９３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７９３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７９４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７９４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７９５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７９５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７９６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７９６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７９７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７９７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７９８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３７９９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３７９９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８００において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８００及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８０１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８０１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８０２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８０２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８０３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８０３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８０４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８０４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８０５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８０５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８０６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８０６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８０７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８０７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８０８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８０８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８０９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８０９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８１０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８１０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８１１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８１１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８１２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８１２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８１３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８１３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８１４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８１４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８１５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８１５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８１６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８１６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８１７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８１７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８１８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８１８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８１９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８１９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８２０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８２０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８２１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８２１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８２２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８２２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８２３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８２３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８２４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８２４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８２５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８２５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８２６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８２６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８２７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８２７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８２８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８２８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８２９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８２９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８３０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８３０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８３１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８３１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８３２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８３２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８３３において、前


記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８３３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８３４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８３４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８３５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８３５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８３６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８３６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８３７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８３７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８３８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８３８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８３９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８３９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８４０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８４０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８４１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８４１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８４２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８４２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８４３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８４３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８４４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８４４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８４５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８４５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８４６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８４６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８４７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８４７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８４８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８４８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８４９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８４９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８５０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８５０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８５１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８５１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８５２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８５２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８５３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８５３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８５４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８５４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８５５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８５５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８５６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８５６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８５７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８５７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８５８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８５８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８５９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８５９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８６０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８６０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８６１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８６１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８６２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８６２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８６３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８６３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８６４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８６４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８６５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８６５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８６６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８６６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８６７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８６７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８６８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８６８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８６９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８６９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８７０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８７０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８７１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８７１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８７２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８７２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８７３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８７３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８７４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８７４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８７５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８７５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８７６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８７６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８７７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８７７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８７８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８７８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８７９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８７９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８８０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８８０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８８１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８８１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８８２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８８２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８８３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８８３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８８４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８８４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８８５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８８５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８８６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８８６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８８７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８８７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８８８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８８８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８８９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８８９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８９０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８９０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８９１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８９１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８９２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８９２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８９３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８９３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８９４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８９４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８９５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８９５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８９６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８９６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８９７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８９７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８９８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３８９９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３８９９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９００において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９００及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９０１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９０１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９０２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９０２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９０３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９０３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９０４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９０４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９０５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９０５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９０６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９０６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９０７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９０７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９０８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ


３９０８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９０９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９０９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９１０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９１０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９１１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９１１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９１２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９１２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９１３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９１３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９１４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９１４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９１５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９１５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９１６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９１６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９１７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９１７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９１８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９１８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９１９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９１９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９２０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９２０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９２１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９２１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９２２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９２２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９２３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９２３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９２４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９２４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９２５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９２５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９２６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９２６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９２７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９２７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９２８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９２８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９２９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９２９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９３０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９３０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９３１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９３１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９３２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９３２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９３３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９３３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９３４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９３４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９３５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９３５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９３６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９３６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９３７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９３７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９３８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９３８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９３９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９３９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９４０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９４０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９４１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９４１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９４２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９４２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９４３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９４３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９４４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９４４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９４５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９４５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９４６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９４６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９４７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９４７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９４８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９４８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９４９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９４９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９５０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９５０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９５１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９５１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９５２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９５２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９５３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９５３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９５４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９５４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９５５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９５５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９５６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９５６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９５７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９５７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９５８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９５８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９５９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９５９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９６０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９６０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９６１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９６１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９６２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９６２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９６３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９６３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９６４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９６４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９６５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９６５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９６６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９６６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９６７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９６７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９６８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９６８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９６９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９６９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９７０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９７０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９７１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９７１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９７２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９７２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９７３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９７３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９７４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９７４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９７５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９７５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９７６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９７６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９７７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９７７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９７８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９７８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９７９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９７９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９８０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９８０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９８１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９８１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９８２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９８２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９８３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９８３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちの


いずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９８４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９８４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９８５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９８５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９８６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９８６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９８７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９８７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９８８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９８８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９８９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９８９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９９０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９９０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９９１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９９１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９９２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９９２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９９３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９９３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９９４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９９４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９９５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９９５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９９６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９９６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９９７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９９７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９９８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．３９９９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ３９９９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０００において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０００及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４００１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４００１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４００２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４００２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４００３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４００３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４００４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４００４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４００５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４００５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４００６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４００６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４００７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４００７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４００８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４００８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４００９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４００９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０１０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０１０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０１１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０１１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０１２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０１２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０１３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０１３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０１４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０１４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０１５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０１５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０１６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０１６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０１７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０１７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０１８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０１８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０１９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０１９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０２０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０２０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０２１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０２１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０２２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０２２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０２３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０２３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０２４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０２４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０２５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０２５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０２６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０２６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０２７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０２７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０２８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０２８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０２９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０２９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０３０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０３０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０３１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０３１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０３２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０３２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０３３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０３３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０３４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０３４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０３５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０３５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０３６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０３６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０３７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０３７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０３８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０３８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０３９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０３９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０４０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０４０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０４１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０４１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０４２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０４２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０４３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０４３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０４４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０４４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０４５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０４５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０４６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０４６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０４７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０４７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０４８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０４８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０４９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０４９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０５０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０５０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０５１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０５１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０５２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０５２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０５３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０５３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０５４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０５４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０５５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０５５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０５６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０５６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０５７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０５７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０５８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０５８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０５９に


おいて、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０５９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０６０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０６０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０６１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０６１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０６２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０６２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０６３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０６３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０６４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０６４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０６５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０６５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０６６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０６６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０６７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０６７及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０６８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０６８及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０６９において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０６９及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０７０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０７０及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０７１において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０７１及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０７２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０７２及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０７３において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０７３及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０７４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０７４及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０７５において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０７５及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４０７６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４０７６及びＳＩＤ１０１～２７０８のうちのいずれか１つである。
実施形態２ｃは、１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物であって、ここで、前記１対のスペーサー配列は、配列番号５００１～５４９６から選択される第１のスペーサー配列、及び配列番号５４９７～６０８０から選択される第２のスペーサー配列を含む。実施形態２．０５０７０～実施形態２．０５３３４は、追加の特徴を含む実施形態１２ｃによる実施形態である。略語の意味については、上記を参照のこと。ｅｍｂ．２．０５０７０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５０７０及びＳＩＤ５４９７～６０８０のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．０５２６２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２６２及びＳＩＤ５４９７～６０８０のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．０５３１０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５３１０及びＳＩＤ５４９７～６０８０のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．０５３３４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５３３４及びＳＩＤ５４９７～６０８０のうちのいずれか１つである。
実施形態２ｄは、１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物であって、ここで、前記１対のスペーサー配列は、配列番号４６５９７～５３０２８から選択される第１のスペーサー配列、及び配列番号７３０１～４６５９６から選択される第２のスペーサー配列を含む。実施形態２．４６７６８～実施形態２．５２８９８は、追加の特徴を含む実施形態１２ｄによる実施形態である。略語の意味については、上記を参照のこと。ｅｍｂ．２．４６７６８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４６７６８及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４６９６７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４６９６７及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４７０３２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４７０３２及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．４７０４７において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ４７０４７及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５０５３８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５０５３８及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５０６７４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５０６７４及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５０６８２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５０６８２及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５０７０６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５０７０６及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５０７１４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５０７１４及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５０８９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５０８９８及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５０９７８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５０９７８及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１０５８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１０５８及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１１６２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１１６２及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１３６２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１３６２及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１３９４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１３９４及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１４６６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１４６６及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１４７４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１４７４及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１４９０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１４９０及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１４９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１４９８及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１５０６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１５０６及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１６５０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１６５０及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１６５８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１６５８及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１６８２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１６８２及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１７０６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１７０６及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１７４６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１７４６及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１７５４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１７５４及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１７６２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１７６２及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１８１０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１８１０及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１８９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１８９８及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１９１４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１９１４及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１９３０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１９３０及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５１９５４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５１９５４及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２０６６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２０６６及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２０８２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２０８２及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２０９０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２０９０及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２０９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２０９８及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２１０６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２１０６及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２２５０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２２５０及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２２５８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２２５８及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２２６６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２２６６及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２２９０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２２９０及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２２９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２２９８及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２３０６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２３０６及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２３５４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２３５４及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２３８６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２３８６及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２４１８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２４１８及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２４３４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２４３４及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２４５８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２４５８及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２４７４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２４７４及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２４９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２４９８及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２５０６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２５０６及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２５２２において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２５２２及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２５３０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２５３０及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２５４６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２５４６及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２５５４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２５５４及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２５９４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２５９４及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２６１０において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２６１０及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２６１８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２６１８及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２６３４において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２６３４及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２６６６において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２６６６及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。ｅｍｂ．２．５２８９８において、前記第１及び第２のｓ．ｓ．は、それぞれＳＩＤ５２８９８及びＳＩＤ７３０１～４６５９６のうちのいずれか１つである。
実施形態３
組成物であって、
ｉ）スペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸であって、
ａ．配列番号５２６２、５７８２、５８３０、５９２６、５９５０、５９９８、６０２２、５３１０、及び５３３４から選択されるスペーサー配列；または
ｂ．配列番号５８３０、６０２２、５２６２、及び５３１０から選択されるスペーサー配列；または
ｃ．配列番号５２６２、５３３４、及び５８３０から選択されるスペーサー配列；または
ｄ．配列番号５２６２；または
ｅ．配列番号５２６４、５３３６、５８３２、６０２４、及び５３１２から選択されるスペーサー配列；または
ｆ．ａ）からｅ）までの前記スペーサー配列のいずれか１つの少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続したヌクレオチドを含むスペーサー配列；または
ｇ．ａ）からｆ）までの前記スペーサー配列のいずれか１つと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるスペーサー配列を含む、前記スペーサー配列を含む前記ガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする前記核酸；あるいは
ｉｉ）第１及び第２のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸であって、
ａ．配列番号５７８２及び５２６２；５８３０及び５２６２；５９２６及び５２６２；５９５０及び５２６２；ならびに５９９８及び５２６２から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
ｂ．配列番号５８３０及び５２６２；ならびに６０２２及び５３１０から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
ｃ．配列番号：５３３４及び５８３０；または
ｄ．ａ）からｃ）までの前記第１及び第２のスペーサー配列のいずれかの少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続したヌクレオチドを含む第１及び第２のスペーサー配列；または
ｅ．ａ）からｄ）までの前記第１及び第２のスペーサー配列のいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である第１及び第２のスペーサー配列、を含む、第１及び第２のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む、組成物。
実施形態４
組成物であって、
ｉ）スペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸であって、
ａ．配列番号２８１３０、３４４４２、４５９０６、２６５６２、５２６６６、５１３２２、４６５９９、５２８９８、２６５４６、７４４７、４７０４７、４９９８６、５１７６２、５１７５４、５２２９０、５２２９８、５１４７４、５２３０６、５０６８２、５１７０６、５２０９８、５０７１４、５１４９８、５２４９８、５０９７８、５１７４６、５２１０６、５１５０６、５０６７４、５２０８２、５２５０６、５０５３８、５２０６６、５２３８６、５２０９０、５２２６６、５２４７４、５２２５８、５２４３４、５０７０６、５１４９０、５２４５８、５１４６６、５２３５４、５１９１４、５１３６２、５１０５８、５０１７０、５１９５４、５２２５０、５１９３０、５１６８２、５２５９４、５２６１０、５１１６２、４９１６２、５０８９８、４９２２６、５１６５８、５２５５４、５２６３４、５１３９４、４９０３４、５２５４６、５２５２２、５２６１８、５２５３０、２８３２２、２６５３０、２６５７８、２６６０２、２６６３４、２６６２６、２６６９８、２６７４６、２６７５４、２６７８６、２６８８２、２７７２２、２７７３０、２７７３８、２７７７０、２７７５４、２７７６２、２７８０２、２７８５０、２７８４２、２７９２２、２７９４６、２７９８６、２８１１４、２８１２２、２８１４６、２８１８６、２８１９４、２８３３８、２８３４６、２８３２２、２８３７８、２８３７０、２８４５８、２８５０６、２８６３４、２８６４２、２８６５０、３４４４２、及び４５９０６から選択されるスペーサー配列；または
ｂ．配列番号５１７０６、５１０５８、５１７５４、５２０９０、５２５９４、５２０９８、５２２９８、５２１０６、５１６８２、５２０６６、５２３５４、５２４５８、５２２９０、５２４９８、５１６５８、５１９３０、５１１６２、５２５０６、５１７６２、５１７４６、５２３８６、５２２５８、５２５３０、５２６３４、２７８５０、２８６３４、２６８８２、２８６５０、２８３７０、２８１９４、２６６２６、２６６３４、２６７８６、２６７５４、２７７７０、２６５７８、２８１３０、２７７３８、２８３３８、２８６４２、２６６０２、２７７５４、２７７３０、及び２８１２２から選択されるスペーサー配列；または
ｃ．配列番号４７０４７、７４４７、７４６３、４６９６７、４６７６８、７６８０、及び４７０３２から選択されるスペーサー配列；または
ｄ．配列番号４７０４５、７４４５、７４６１、４６７６６、７６７８、及び４７０３０から選択されるスペーサー配列；または
ｅ．ａ）からｄ）までの前記スペーサー配列のいずれか１つの少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続したヌクレオチドを含むスペーサー配列；または
ｆ．ａ）からｅ）までの前記スペーサー配列のいずれか１つと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるスペーサー配列、を含む、前記スペーサー配列を含む前記ガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする前記核酸；あるいは
ｉｉ）第１及び第２のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸であって、
ａ．配列番号４７０４７及び７４４７；７４６３及び４６９６７；４６７６８及び７６８０；ならびに４７０３２及び７４４７から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
ｂ．配列番号：４７０４７及び７４４７；または
ｃ．配列番号５２８９８及び２６５４６；または
ｄ．ａ）からｃ）までの前記第１及び第２のスペーサー配列のいずれかの少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続したヌクレオチドを含む第１及び第２のスペーサー配列；または
ｅ．ａ）からｄ）までの前記第１及び第２のスペーサー配列のいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である第１及び第２のスペーサー配列、を含む、前記第１及び第２のスペーサー配列を含む前記１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする前記１つ以上の核酸を含む、前記組成物。
実施形態５
ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ、または前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸をさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態６
前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼがＣａｓヌクレアーゼである、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態７
前記ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ９である、実施形態６に記載の組成物。
実施形態８
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼがＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する、実施形態７に記載の組成物。
実施形態９
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに由来する、実施形態７に記載の組成物。
実施形態１０
前記ＣａｓヌクレアーゼがＣｐｆ１ヌクレアーゼである、実施形態６に記載の組成物。
実施形態１１
ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤をさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１２
前記ガイドＲＮＡがｓｇＲＮＡである、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
実施形態１３
前記ｓｇＲＮＡが修飾されている、実施形態１２に記載の組成物。
実施形態１４
前記修飾により、１つ以上の２’位置及び／またはホスホジエステル結合が改変される、実施形態１３に記載の組成物。
実施形態１５
前記修飾により、前記ｓｇＲＮＡの最初の３つのヌクレオチドのうちの１つ以上、またはすべてが改変される、実施形態１３～１４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１６
前記修飾により、前記ｓｇＲＮＡの最後の３つのヌクレオチドのうちの１つ以上、またはすべてが改変される、実施形態１３～１５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１７
前記修飾が、ホスホロチオエート修飾、２’－ＯＭｅ修飾、２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾、２’－Ｆ修飾、２’－Ｏ－メチン－４’ブリッジ修飾、３’－チオホスホノアセテート修飾、または２’－デオキシ修飾のうちの１つ以上を含む、実施形態１３～１６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１８
先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物であって、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、前記組成物。
実施形態１９
前記ガイドＲＮＡが脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）またはウイルスベクターと会合している、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２０
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アルファウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである、実施形態１９に記載の組成物。
実施形態２１
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、実施形態１９に記載の組成物。
実施形態２２
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、またはＡＡＶ９ベクターであり、ＡＡＶに続く番号がＡＡＶ血清型を示す、実施形態２１に記載の組成物。
実施形態２３
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ血清型９ベクターである、実施形態２２に記載の組成物。
実施形態２４
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶｒｈ１０ベクターである、実施形態２２に記載の組成物。
実施形態２５
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶｒｈ７４ベクターである、実施形態２２に記載の組成物。
実施形態２６
前記ウイルスベクターが組織特異的プロモーターを含む、実施形態１９～２５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２７
ウイルスベクターを含み、前記ウイルスベクターが筋肉特異的プロモーターを含み、任意選択で、前記筋肉特異的プロモーターが筋肉クレアチンキナーゼプロモーター、デスミンプロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター、ＳＰｃ５－１２プロモーター、またはＣＫ８ｅプロモーターである、実施形態１９～２６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２８
前記ウイルスベクターがニューロン特異的プロモーターを含み、任意選択で前記ニューロン特異的プロモーターがエノラーゼプロモーターである、実施形態１９～２５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２９
ＤＮＡ中のトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを前記ＴＮＲにまたはその近くに誘導する、スペーサー配列もしくは１対のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡもしくは１対のガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡもしくは前記１対のガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含む、前記方法。
実施形態３０
ＤＮＡ中の自己相補的領域を切除する方法であって、前記自己相補的領域を含む細胞に、ｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを前記自己相補的領域にまたはその近くに誘導する、スペーサー配列もしくは１対のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡもしくは１対のガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡもしくは１対のガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含み、前記自己相補的領域が切除される、前記方法。
実施形態３１
ＤＮＡ中のトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、前記ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを前記ＴＮＲにまたはその近くに誘導する、スペーサー配列もしくは１対のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡもしくは１対のガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡもしくは前記１対のガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含み、少なくとも１つのＴＮＲが切除される、前記方法。
実施形態３２
前記自己相補的領域が、パリンドローム配列、同一方向リピート、逆方向リピート、ＧＣリッチ配列、またはＡＴリッチ配列を含み、任意選択で、ＧＣリッチネスまたはＡＴリッチネスは、ループ形成配列によって任意選択で中断される少なくとも１０ヌクレオチドの長さ全体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％である、実施形態３０に記載の方法。
実施形態３３
前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＴＮＲまたは自己相補的領域にまたはその近くに送達する、１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡを含む、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸が前記細胞に送達される、実施形態２９～３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３４
前記標的が（ｉ）前記ＴＮＲもしくは前記自己相補的領域内にあるか、または（ｉｉ）前記ＴＮＲもしくは前記自己相補的領域の１０、１５、２０、２５、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド内にある、実施形態２９～３３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３５
ＤＭ１、ＨＤ、ＦＡ、ＦＸＳ、ＦＸＴＡＳ、ＦＸＰＯＩ、ＦＸＥＳ、ＸＳＢＭＡ、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１２、ＳＣＡ１７、またはＤＲＰＬＡを有するヒト対象を治療するための医薬を調製するための実施形態２９～３４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３６
前記ＴＮＲが、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）におけるＣＴＧである、実施形態２９または３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３７
ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲの少なくとも一部を切除することを含み、前記切除が筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）の治療をもたらす、実施形態３６に記載の方法。
実施形態３８
前記ＴＮＲがＦＭＲ１遺伝子内にある、実施形態２９または３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３９
前記切除が脆弱Ｘ症候群の治療をもたらす、実施形態３８に記載の方法。
実施形態４０
前記ＴＮＲがＦＸＮ遺伝子内にある、実施形態２９または３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４１
前記切除がフリードライヒ運動失調症（ＦＡ）の治療をもたらす、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４２
前記ＴＮＲが、ハンチンチン、フラタキシン（ＦＸＮ）、脆弱Ｘ精神遅滞１（ＦＭＲ１）、脆弱Ｘ精神遅滞２（ＦＭＲ２）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、アリスタレス関連ホメオボックス（ＡＲＸ）、アタキシン１（ＡＴＸＮ１）、アタキシン２（ＡＴＸＮ２）、アタキシン３（ＡＴＸＮ３）、カルシウム電位依存性チャネルサブユニットアルファ１Ａ（ＣＡＣＮＡ１Ａ）、アタキシン７（ＡＴＸＮ７）、ＡＴＸＮ８反対鎖ｌｎｃＲＮＡ（ＡＴＸＮ８ＯＳ）、セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼ２Ａ ５５ｋＤａ調節サブユニットＢベータアイソフォーム（ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ）、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）、もしくはアトロフィン－１（ＡＴＮ１）遺伝子内にあるか、または前記ＴＮＲが、ＦＭＲ２の５’ＵＴＲに隣接している、実施形態２９または３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４３
ハンチンチン（ＨＴＴ）における切除により、ハンチントン病（ＨＤ）の治療がもたらされる；ＦＸＮにおける切除により、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）の治療がもたらされる；ＦＭＲ１における切除により、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能不全（ＦＸＰＯＩ）、または脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）の治療がもたらされる；ＦＭＲ２におけるまたはＦＭＲ２の５’ＵＴＲに隣接する切除により、脆弱ＸＥ症候群（ＦＸＥＳ）の治療がもたらされる；ＡＲにおける切除により、Ｘ連鎖性球脊髄性筋萎縮症（ＸＳＢＭＡ）の治療がもたらされる；ＡＴＸＮ１における切除により、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）の治療がもたらされる；ＡＴＸＮ２における切除により、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）の治療がもたらされる；ＡＴＸＮ３における切除により、脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）の治療がもたらされる；ＣＡＣＮＡ１Ａにおける切除により、脊髄小脳失調症６型（ＳＣＡ６）の治療がもたらされる；ＡＴＸＮ７における切除により、脊髄小脳失調症７型（ＳＣＡ７）の治療がもたらされる；ＡＴＸＮ８ＯＳにおける切除により、脊髄小脳失調症８型（ＳＣＡ８）の治療がもたらされる；ＰＰＰ２Ｒ２Ｂにおける切除により、脊髄小脳失調症１２型（ＳＣＡ１２）の治療がもたらされる；ＴＢＰにおける切除により、脊髄小脳失調症１７型（ＳＣＡ１７）の治療がもたらされる；またはＡＴＮ１における切除により、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）の治療がもたらされる、実施形態４２に記載の方法。
実施形態４４
少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１０，０００ＴＮＲが切除される、実施形態２９または３１～４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４５
１～５、５～１０、１０～２０、２０～３０、４０～６０、６０～８０、８０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～３００、３００～５００、５００～７００、７００～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、７０００～８０００、８０００～９０００、または９０００～１０，０００ＴＮＲが切除される、実施形態２９または３１～４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４６
前記ＴＮＲがＤＭＰＫ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＤＭＰＫ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ活性の増加；ホスホレンマン、ジヒドロピリジン受容体、ミオジェニン、Ｌ型カルシウムチャネルベータサブユニット、及び／またはミオシンホスファターゼ標的化サブユニットのリン酸化の増加；ミオシンホスファターゼの阻害の増加；及び／または筋肉喪失、筋衰弱、過眠症、１つ以上の実行機能障害、インスリン抵抗性、白内障形成、禿毛、または男性不妊症もしくは受精能低下の改善、のうちの１つ以上を任意選択で含む、実施形態２９または３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４７
前記ＴＮＲがＨＴＴ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＨＴＴ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、線条体ニューロン喪失、不随意運動、易刺激性、うつ病、小不随意運動、協調性の欠如、新しい情報の学習や意思決定の困難、歩行、発話、及び／または嚥下の困難、及び／または思考及び／または推論能力の低下、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、実施形態２９または３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４８
前記ＴＮＲが、ＦＭＲ１遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＦＭＲ１遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なＦＭＲ１転写物または脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質レベル、通常ＦＭＲＰに関連するｍＲＮＡの翻訳調節不全、ホスホコフィリン（ＣＦＬ１）のレベルの低下、ホスホコフィリンホスファターゼＰＰＰ２ＣＡのレベルの上昇、神経シナプスへのｍＲＮＡ輸送の低下、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０、及び／またはＣＲＹＡＢの発現の増加、ラミンＡ／Ｃアイソフォームの異常な細胞分布、４０歳未満の閉経などの早期発症閉経、卵巣の発達または機能の欠陥、血清ゴナドトロピン（例えばＦＳＨ）のレベルの上昇、進行性意図振戦、パーキンソニズム、認知機能低下、全身性脳萎縮、インポテンス、及び／または発達遅延、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、実施形態２９または３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４９
前記ＴＮＲがＦＭＲ２遺伝子内にあるか、またはＦＭＲ２の５’ＵＴＲに隣接しており、前記ＴＮＲの切除により、ＦＭＲ２遺伝子内にあるかまたはＦＭＲ２遺伝子に隣接する伸長リピートに関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なＦＭＲ２発現、発達遅延、アイコンタクト不良、言語の反復使用、及びハンドフラッピング、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、実施形態２９または３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５０
前記ＴＮＲが、ＡＲ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＲ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なＡＲ発現、アンドロゲン受容体タンパク質のＣ末端短縮化断片の生成；カスパーゼ－３及び／またはユビキチン－プロテアソーム経路を介したアンドロゲン受容体タンパク質のタンパク質分解；ＣＲＥＢ結合タンパク質を含む核内封入体の形成；ｐ４４／４２、ｐ３８、及び／またはＳＡＰＫ／ＪＮＫの異常なリン酸化；筋衰弱；筋消耗；歩行、嚥下、及び／または発話の困難；女性化乳房；及び／または男性不妊症、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、実施形態２９または３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５１
前記ＴＮＲが、ＡＴＸＮ１遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ１遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、ＡＴＸＮ１を含む凝集体の形成；プルキンエ細胞死；運動失調；筋肉のこわばり；急速な、不随意の眼球運動；手足のしびれ、うずき、または疼痛；及び／または筋肉の痙攣、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、実施形態２９または３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５２
前記ＴＮＲが、ＡＴＸＮ２遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ２遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なＡＴＸＮ２産生；プルキンエ細胞死；運動失調；発話または嚥下の困難；手足の感覚喪失及び脱力；認知症；筋消耗；制御不良の筋緊張；及び／または不随意の筋反射運動、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、実施形態２９または３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５３
前記ＴＮＲが、ＡＴＸＮ３遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ３遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なＡＴＸＮ３レベル；異常なベクリン－１レベル；オートファジーの阻害；スーパーオキシドジスムターゼ２の調節障害；運動失調；嚥下困難；手足の感覚喪失及び脱力；認知症；筋肉のこわばり；制御不良の筋緊張；振戦；レストレスレッグス症候群；及び／または筋肉の痙攣、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、実施形態２９または３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５４
前記ＴＮＲが、ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、ＣＡＣＮＡ１Ａ発現細胞における異常なＣａＶ２．１電位依存性カルシウムチャネル；運動失調；発話困難；不随意の眼球運動；複視；腕協調運動の喪失；振戦；及び／または制御不良の筋緊張、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、実施形態２９または３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５５
前記ＴＮＲが、ＡＴＸＮ７遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ７遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なヒストンアセチル化；異常なヒストン脱ユビキチン化；ＣＲＸによるトランス活性化の障害；ＡＴＸＮ７を含む核内封入体の形成；運動失調；歩行の協調運動障害；手、発話及び／または眼球運動の不十分な協調；網膜変性；及び／または色素性黄斑ジストロフィー、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、実施形態２９または３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５６
前記ＴＮＲが、ＡＴＸＮ８ＯＳ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ８ＯＳ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、ＡＴＸＮ８ＯＳ ｍＲＮＡを含むリボ核封入体の形成；異常なＫＬＨＬ１タンパク質発現；運動失調；発話及び／または歩行困難；及び／または不随意の眼球運動、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、実施形態２９または３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５７
前記ＴＮＲが、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＰＰＰ２Ｒ２Ｂ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なＰＰＰ２Ｒ２Ｂ発現；異常なホスファターゼ２活性；運動失調；小脳変性；歩行困難；及び／または手、発話及び／または眼球運動の不十分な協調、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、実施形態２９または３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５８
前記ＴＮＲが、ＴＢＰ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＴＢＰ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常な転写開始；異常なＴＢＰタンパク質の蓄積（例えば、小脳ニューロンにおける）；異常な小脳ニューロン細胞死；運動失調；歩行困難；筋力低下；及び／または認知能力の喪失、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、実施形態２９または３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５９
前記ＴＮＲが、ＡＴＮ１遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＮ１遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常な転写調節；異常なＡＴＮ１タンパク質の蓄積（例えば、ニューロンにおける）；異常なニューロン細胞死；不随意運動；及び／または認知能力の喪失、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、実施形態２９または３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６０
実施形態１～２８のいずれか１つの組成物を含む医薬組成物。
実施形態６１
ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、実施形態１～２、２ｂ、２．２７０９～２．４０７６、または５～２８のいずれか１つに記載の組成物、または実施形態６０に記載の医薬製剤を投与することを含む、前記方法。
実施形態６２
ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、実施形態１～２、２ｂ、２．２７０９～２．４０７６、または５～２８のいずれか１つに記載の組成物、または実施形態６０に記載の医薬製剤を投与することを含む、前記方法。
実施形態６３
１つのｇＲＮＡのみが投与され、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるＣＴＧリピートが切除される、実施形態６１または６２に記載の方法。
実施形態６４
前記ｇＲＮＡが、
ａ．配列番号３７４６、３７７８、３３９４、３３８６、３９３８、３８１８、３７２２、３８５８、３３７０、１７０６、２２１０、２１１４、１５３８、及び２５９４から選択されるスペーサー配列；または
ｂ．配列番号３３３０、３７４６、３７７８、３３９４、４０２６、３３８６、３９３８、３８１８、３７２２、３８０２、３８５８、３５１４、３７７０、３３７０、２２０２、１７０６、２２１０、１７７８、２１１４、１７３８、１７４６、２３２２、１５３８、２５１４、２４５８、２１９４、及び２５９４から選択されるスペーサー配列；または
ｃ．配列番号３３３０、３３１４、２６５８、２６９０、２５５４、及び２４９８から選択されるスペーサー配列；または
ｄ．配列番号３３１４、２６９０、２５５４、及び２４９８から選択されるスペーサー配列；または
ｅ．配列番号３９１４、３５１４、１７７８、２４５８、３８５８、３４１８、１７０６、及び２２５８から選択されるスペーサー配列；または
ｆ．配列番号３９１４；または
ｇ．配列番号３４１８；または
ｈ．配列番号３９３８；または
ｉ．配列番号３９１６、３４２０、及び３９４０から選択されるスペーサー配列、を含むスペーサー配列を含む、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６５
ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、実施形態２ｃ、２．０５０７０～２．０５３３４、３、もしくは５～２８のいずれか１つに記載の組成物、または実施形態６０に記載の医薬製剤を投与することを含む、前記方法。
実施形態６６
ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、実施形態２ｃ、２．０５０７０～２．０５３３４、３、もしくは５～２８のいずれか１つに記載の組成物、または実施形態６０に記載の医薬製剤を投与することを含む、前記方法。
実施形態６７
１つのｇＲＮＡのみが投与され、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるＴＮＲが切除される、実施形態６５または実施形態６６に記載の方法。
実施形態６８
前記ｇＲＮＡが、
ａ．配列番号５８３０、６０２２、５２６２、及び５３１０から選択されるスペーサー配列；または
ｂ．配列番号５２６２、５３３４、及び５８３０から選択されるスペーサー配列；または
ｃ．配列番号５２６２、
ｄ．配列番号５２６４、５３３６、５８３２、６０２４、及び５３１２から選択されるスペーサー配列、を含むスペーサー配列を含む、実施形態６７に記載の方法。
実施形態６９
ＦＸＮ遺伝子のイントロンにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、実施形態２ｄ、２．４６７６８～２．５２８９８、４～２８のいずれか１つに記載の組成物、または実施形態６０に記載の医薬製剤を投与することを含む、前記方法。
実施形態７０
ＦＸＮ遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、実施形態２ｄ、２．４６７６８～２．５２８９８、４～２８のいずれか１つに記載の組成物、または実施形態６０に記載の医薬製剤を投与することを含む、前記方法。
実施形態７１
１つのｇＲＮＡのみが投与され、ＦＸＮ遺伝子の５’ＵＴＲにおけるＴＮＲが切除される、実施形態６９または実施形態７０に記載の方法。
実施形態７２
前記ｇＲＮＡが、
ａ．配列番号４７０４７、７４４７、７４６３、４６９６７、４６７６８、７６８０、及び４７０３２から選択されるスペーサー配列；または
ｂ．配列番号４７０４５、７４４５、７４６１、４６７６６、７６７８、及び４７０３０から選択されるスペーサー配列、を含むスペーサー配列を含む、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７３
ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含む、実施形態２９～５９または６１～７２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７４
前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が化合物６である、実施形態７３に記載の方法。
実施形態７５
前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が化合物３である、実施形態７３に記載の方法。
実施形態７６
ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡを投与することを含み、第１のスペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを、配列の第１のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導し、ここで、前記第１のストレッチは、
ａ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｕ２９切断部位の１ヌクレオチドから開始し、前記リピートまで続くか；または
ｂ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｕ３０切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｕ５６切断部位の１ヌクレオチド前まで続くか；または
ｃ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｕ３０切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｕ５２切断部位の１ヌクレオチド前まで続くか；または
ｄ．配列番号５３４１３であるか；または
ｅ．配列番号５３４１４であるか；または
ｆ．配列番号５３４１５である、前記方法。
実施形態７７
ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡを投与することを含み、第２のスペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを、配列の第２のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導し、ここで、前記第２のストレッチは、
ａ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｄ１５切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｄ５１切断部位の１ヌクレオチド前まで続くか；または
ｂ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｄ３５切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｄ５１切断部位の１ヌクレオチド前まで続くか；または
ｃ．配列番号５３４１６であるか；または
ｄ．配列番号５３４１７である、前記方法。
実施形態７８
ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡを投与することを含み、
ｉ．第１のスペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを、配列の第１のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導し、ここで、前記第１のストレッチは、
ａ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｕ２９切断部位の１ヌクレオチドから開始し、前記リピートまで続くか；または
ｂ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｕ３０切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｕ５６切断部位の１ヌクレオチド前まで続くか；または
ｃ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｕ３０切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｕ５２切断部位の１ヌクレオチド前まで続くか；または
ｄ．配列番号５３４１３であるか；または
ｅ．配列番号５３４１４であるか；または
ｆ．配列番号５３４１５であり；及び
ｉｉ．第２のスペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを、配列の第２のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導し、ここで、前記第２のストレッチは、
ａ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｄ１５切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｄ５１切断部位の１ヌクレオチド前まで続くか；または
ｂ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｄ３５切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｄ５１切断部位の１ヌクレオチド前まで続くか；または
ｃ．配列番号５３４１６であるか；または
ｄ．配列番号５３４１７である、前記方法。
実施形態７９
ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含む、実施形態７６～７８に記載の方法。
実施形態８０
前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が化合物６である、実施形態７９に記載の方法。
実施形態８１
前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が化合物３である、実施形態７９に記載の方法。
実施形態８２
ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ、または前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸を投与することをさらに含む、実施形態７６～８１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８３
前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼがＣａｓヌクレアーゼである、実施形態８２に記載の方法。
実施形態８４
前記ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ９である、実施形態８３に記載の方法。
実施形態８５
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼがＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する、実施形態８４に記載の方法。
実施形態８６
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに由来する、実施形態８４に記載の方法。
実施形態８７
前記ＣａｓヌクレアーゼがＣｐｆ１ヌクレアーゼである、実施形態８３に記載の方法。
実施形態８８
実施形態７６～８７のいずれか１つに記載の方法であって、
（ｉ）前記Ｕ２９切断部位は、ｃｈｒ１９上のヌクレオチド４５，７７０，３８３と４５，７７０，３８４との間にあり、これは、以下の配列：ｔｔｃａｃａａｃｃｇｃｔｃｃｇａｇ＊ｃｇｔｇｇｇ中の＊に対応しており；
（ｉｉ）前記Ｕ３０切断部位は、ｃｈｒ１９：４５，７７０，３８５と４５，７７０，３８６との間にあり、これは、以下の配列：ｇｃｔｇｇｇｃｇｇａｇａｃｃｃａｃ＊ｇｃｔｃｇｇ中の＊に対応しており；
（ｉｉｉ）前記Ｄ１５切断部位は、ｃｈｒ１９：４５，７７０，１５４と４５，７７０，１５５との間にあり、これは、以下の配列：ｇｇｃｔｇａｇｇｃｃｃｔｇａｃｇｔ＊ｇｇａｔｇｇ中の＊に対応しており；
（ｉｖ）前記Ｄ３５切断部位は、ｃｈｒ１９：４５，７７０，０７８と４５，７７０，０７９との間にあり、これは、以下の配列：ｃａｃｇｃａｃｃｃｃｃａｃｃｔａｔ＊ｃｇｔｔｇｇ中の＊に対応している、前記方法。
実施形態８９
ＤＮＡのＴＮＲまたは自己相補的領域を切除することができるガイドＲＮＡをスクリーニングする方法であって、
ａ）ｉ．細胞を、ガイドＲＮＡ、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ、及びＤＮＡ－ＰＫ阻害剤と接触させることと；
ｉｉ．ｉ）で使用されたものと同じタイプの細胞を、前記ガイドＲＮＡ、前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼと接触させるがＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は用いないことと；
ｂ）ステップａ）ｉ）で接触させた前記細胞からの前記ＴＮＲまたは自己相補的領域の前記切除をステップａ）ｉｉ）で接触させた前記細胞と比較することと；
ｃ）前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を用いない場合と比較して、前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤の存在下で前記切除が改善されるガイドＲＮＡを選択することと、を含む、前記方法。
実施形態９０
ＴＮＲまたは自己相補的領域を切除することができる１対のガイドＲＮＡをスクリーニングする方法であって、
ａ．ｉ．細胞を、１対のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ、及びＤＮＡ－ＰＫ阻害剤と接触させることと；
ｉｉ．ｉ）で使用されたものと同じタイプの細胞を、前記ガイドＲＮＡ、前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼと接触させるがＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を用いないことと；
ｂ．ステップａ）ｉ）で接触させた前記細胞からの前記ＴＮＲまたは自己相補的領域の前記切除をステップａ）ｉｉ）で接触させた前記細胞と比較することと；
ｃ．前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を用いない場合と比較して、前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤の存在下で前記切除が改善される１対のガイドＲＮＡを選択することと、を含む、前記方法。
実施形態９１
前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が化合物６である、実施形態８９または実施形態９０に記載の方法。
実施形態９２
前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が化合物３である、実施形態８９または実施形態９０に記載の方法。
実施形態９３
前記ガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡが、前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲに誘導する、実施形態８９～９２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９４
前記ガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡが、前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲに誘導する、実施形態８９～９２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９５
前記ガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡが、前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＦＸＮ遺伝子の５’ＵＴＲに誘導する、実施形態８９～９２のいずれか１つに記載の方法。
５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、イントロン、エクソン、または３’ＵＴＲのいずれかに位置する伸長トリヌクレオチド配列（三角形）を含む遺伝子の例示的な構造の概略図を示す。トリヌクレオチドリピート伸長の例には、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおける（ＣＧＧ）ｎ、ＨＴＴ遺伝子のエクソン１における（ＣＡＧ）ｎ、ＦＸＮ遺伝子の最初のイントロンにおける（ＧＡＡ）ｎ、及びＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおける（ＣＴＧ）ｎが含まれる。 Ａ～Ｂは、２つのｇＲＮＡを使用したトリヌクレオチドリピート切除の概要を示す。Ａは、エラーが発生しやすいＮＨＥＪによって媒介される種々のＤＮＡ修復結果を伴う２つのｇＲＮＡ戦略を示す。Ｂにおいて、ＤＮＡ－ＰＫｉでＮＨＥＪ修復を阻害することにより、トリヌクレオチドリピート切除を改善した。ＮＨＥＪ：非相同末端結合；ＭＭＥＪ：マイクロホモロジー媒介末端結合。 単一ｇＲＮＡを使用したトリヌクレオチドリピート切除の概要を示す。ＤＮＡ－ＰＫｉでＮＨＥＪ修復機構を阻害することにより、ＭＭＥＪ修復を強化し、トリヌクレオチドリピート切除を改善した。 ウイルスのパッケージング及び送達に関して、１つのｇＲＮＡを使用するトリヌクレオチドリピート切除のためのＡＡＶベクターの概要を示す。 ＤＮＡ対の二本鎖切断が誘導された後の、カノニカルな非相同末端結合（Ｃ－ＮＨＥＪ）及びマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）ＤＮＡ修復経路の概略概要を示す。編集条件、遺伝子座配列構成、及び細胞型に応じて、ＭＭＥＪ以外の経路（ＨＤＲを含むがこれに限定されない）がＭＲＥ１１－ＲＡＤ５０－ＮＢＳ１複合体（ＭＲＮ）の下流で活性化される場合がある。 ＤＭ１におけるＣＴＧトリヌクレオチド伸長の単一ｇＲＮＡ切除のモデルを示す。ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）により、Ｃ－ＮＨＥＪ及びＭＭＥＪ（または他の代替）経路が活性化される。ＭＭＥＪは、ＤＳＢ周辺の既存のマイクロホモロジー（ボックス）に依存している。ＭＲＮ（ＭＲＥ１１－ＲＡＤ５０－ＮＢＳ１複合体）／ＣｔＩＰ刺激による５’切除及びＣＴＧ二次構造の切断は、ＤＮＡ－ＰＫが阻害される場合の主要な修復経路である。編集条件、遺伝子座配列構成、及び細胞型に応じて、ＭＭＥＪ以外の経路（ＨＤＲを含むがこれに限定されない）がＭＲＮ／ＣｔＩＰの下流で活性化される場合がある。 ＳｐＣａｓ９ ＲＮＰエレクトロポレーション後の野生型心筋細胞における野生型及び切除されたＤＮＡのＤＮＡゲル電気泳動による分離を示す。ｇＲＮＡ対Ａ～Ｈのうちの１つによる標的化後のＰＣＲ増幅されたＤＭＰＫ１ ＣＴＧリピート遺伝子座が示されている（表６を参照）。 １対のｇＲＮＡアプローチを使用するＤＭ１の疾患モデルにおけるＣＴＧリピート切除を示す。ＤＭ１心筋細胞におけるＳｐＣａｓ９ ＲＮＰエレクトロポレーションは、ＣＴＧリピートの切除を示す。左端のパネルは、図７のバンドＢ及びＣの複製である。ＤＮＡゲル電気泳動により、ＰＣＲ増幅されたＤＭＰＫ１遺伝子座の野生型と切除されたＤＮＡが分離される。２つのｇＲＮＡ対（ＤＭ１対１及び２）の例を示す。 １対のｇＲＮＡアプローチを使用するＤＭ１の疾患モデルにおけるＣＴＧリピート切除を示す。初代線維芽細胞におけるＳｐＣａｓ９ ＲＮＰエレクトロポレーションは、ＣＴＧリピートの切除を示す。ＤＮＡゲル電気泳動により、ＰＣＲ増幅されたＤＭＰＫ１遺伝子座の野生型と切除されたＤＮＡが分離される。２つのｇＲＮＡ対（ＤＭ１対１及び２）の例を示す。 １対のｇＲＮＡアプローチを使用するＤＭ１の疾患モデルにおけるＣＴＧリピート切除を示す。サンガーシーケンシングによる、ＣＴＧリピートを含むウィンドウの切除の確認を示す。 Ａ～Ｂは、２つのｇＲＮＡ及びＳｐＣａｓ９による初代ＤＭ１線維芽細胞におけるＣＴＧリピート切除後の表現型の救済を示す。Ａは、ＦＩＳＨによって示される対照（－）と比較して減少したＣＵＧ ＲＮＡ増殖巣を示す。Ｂは、免疫蛍光によって示される対照（－）と比較して減少したＭＢＮＬ１タンパク質増殖巣を示す。 原発性ＤＭ１線維芽細胞におけるデュアルｇＲＮＡ ＣＴＧリピート切除後の疾患表現型の救済を示す。ＭＢＮＬ１ ｍＲＮＡにおけるＲＮＡスプライシングの部分的回復を示すｑＰＣＲ結果を示す。縦軸は、野生型比に正規化された、全転写物に対するミススプライシングされた転写物の比として表されている（すなわち、野生型細胞は、正規化比１を与える）。 原発性ＤＭ１線維芽細胞におけるデュアルｇＲＮＡ ＣＴＧリピート切除後の疾患表現型の救済を示す。ＮＣＯＲ２ ｍＲＮＡにおけるＲＮＡスプライシングの部分的回復を示すｑＰＣＲ結果を示す。縦軸は、野生型比に正規化された、全転写物に対するミススプライシングされた転写物の比として表されている（すなわち、野生型細胞は、正規化比１を与える）。 原発性ＤＭ１線維芽細胞におけるデュアルｇＲＮＡ ＣＴＧリピート切除後の疾患表現型の救済を示す。ＦＮ１ ｍＲＮＡにおけるＲＮＡスプライシングの部分的回復を示すｑＰＣＲ結果を示す。縦軸は、野生型比に正規化された、全転写物に対するミススプライシングされた転写物の比として表されている（すなわち、野生型細胞は、正規化比１を与える）。 原発性ＤＭ１線維芽細胞におけるデュアルｇＲＮＡ ＣＴＧリピート切除後の疾患表現型の救済を示す。ＫＩＦ１３Ａ ｍＲＮＡにおけるＲＮＡスプライシングの部分的回復を示すｑＰＣＲ結果を示す。縦軸は、野生型比に正規化された、全転写物に対するミススプライシングされた転写物の比として表されている（すなわち、野生型細胞は、正規化比１を与える）。 原発性ＤＭ１線維芽細胞におけるデュアルｇＲＮＡ ＣＴＧリピート切除後の疾患表現型の救済を示す。線維芽細胞におけるミススプライシング補正の定量分析を示しており、救済のパーセンテージとして表される（つまり、１００％の救済は編集された患者と非治療の健康な者が等しいことを意味し、５０％の救済は編集された患者には非治療の健康な者の２倍のミススプライシングがあることを意味するような、健康な未治療の者と編集された患者の値との間の比）。 原発性ＤＭ１線維芽細胞におけるＣＵＧ増殖巣の数に対する示されたガイド対の効果を示す。ＦＩＳＨで示されているように、非編集対照細胞（白いバー）と比較して、細胞核のＣＵＧ増殖巣が０である細胞数の増加が示されている。４つのＤＭ１ ｓｇＲＮＡ対（５つ入っている各セットの２番目から５番目のバーとして対Ａ～Ｄ）の例がＳｐＣａｓ９について示されている。 ｈＴｅｒｔ形質転換ＤＭ１線維芽細胞における対のｇＲＮＡ ＣＴＧリピート切除が、ＤＮＡ－ＰＫｉ化合物６（１０ｕＭ）により改善されることを示す。ＤＭＰＫ１遺伝子座はＰＣＲによって増幅され、野生型ＤＮＡはＤＮＡゲル電気泳動によって分離された。条件ごとに３つの生物学的複製が示されている（１～３）。 ｈＴｅｒｔ形質転換ＤＭ１線維芽細胞において単一ｇＲＮＡを使用したＣＴＧリピート切除（左、阻害剤なし）及びＤＮＡ－ＰＫ阻害後の強化されたリピート切除（右、１０ｕＭ化合物６）を示す。ＤＮＡゲル電気泳動により、野生型を切除されたＤＮＡから分離する。６つの個々のｇＲＮＡ（４、５、６、７、９、及び１０）のリピート切除実験が示されている。 Ａ～Ｅは、形質転換ＤＭ１線維芽細胞におけるＣＵＧ増殖巣の数に対する、示されたガイド対プラスまたはマイナスＤＮＡ－ＰＫ阻害剤の効果を示す。ＳｐＣａｓ９を使用するガイド対Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤを、それぞれ、図１４Ｂ、１４Ｃ、１４Ｄ、及び１４Ｅに示す。ＦＩＳＨによって示されるように、非編集対照細胞（図１４Ａ）と比較して、細胞核のＣＵＧ増殖巣が０である細胞数の増加が示されている。ｘ軸は、核ごとのＣＵＧ増殖巣の数を示す。この効果は、ＤＮＡ－ＰＫｉ（１０ｕＭ化合物６）の存在下でさらに強化される。 形質転換されたＤＭ１線維芽細胞においてｇＲＮＡ対を使用したＣＴＧリピート切除後の疾患表現型の救済を示す。ＲＮＡスプライシングの部分的な回復は、ＭＢＮＬ１でのｑＰＣＲによって確認され、観察された効果はＤＮＡ－ＰＫｉ（１０ｕＭ、化合物６）の存在下でさらに増強される。モック処理（Ｍ）及びＡＡＶＳ１（ＮＴ）を標的とする対照ガイドで処理された細胞も分析した。 形質転換されたＤＭ１線維芽細胞においてｇＲＮＡ対を使用したＣＴＧリピート切除後の疾患表現型の救済を示す。ＲＮＡスプライシングの部分的な回復は、ＮＣＯＲ２でのｑＰＣＲによって確認され、観察された効果はＤＮＡ－ＰＫｉ（１０ｕＭ、化合物６）の存在下でさらに増強される。モック処理（Ｍ）及びＡＡＶＳ１（ＮＴ）を標的とする対照ガイドで処理された細胞も分析した。 形質転換されたＤＭ１線維芽細胞においてｇＲＮＡ対を使用したＣＴＧリピート切除後の疾患表現型の救済を示す。ＲＮＡスプライシングの部分的な回復は、ＦＭ１でのｑＰＣＲによって確認され、観察された効果はＤＮＡ－ＰＫｉ（１０ｕＭ、化合物６）の存在下でさらに増強される。モック処理（Ｍ）及びＡＡＶＳ１（ＮＴ）を標的とする対照ガイドで処理された細胞も分析した。 形質転換されたＤＭ１線維芽細胞においてｇＲＮＡ対を使用したＣＴＧリピート切除後の疾患表現型の救済を示す。さらに、編集によって、標的化ＤＭＰＫ遺伝子の発現は有意に変化しない（図１５Ｄ）。モック処理（Ｍ）及びＡＡＶＳ１（ＮＴ）を標的とする対照ガイドで処理された細胞も分析した。 ヒトＤＭＰＫ遺伝子座における単一ｇＲＮＡ ＣＴＧリピート切除に使用されるｇＲＮＡの概要を示す。ｇＲＮＡは、ＣＴＧリピートの５’または３’の部位を標的とするように設計された。例示的なガイドのみが示されている。 ＦＭＲ１の５’ＵＴＲ領域及びＣＧＧｎリピートに対する例示的な試験されたｇＲＮＡの概略図を示す。 Ｍ２８ ＣＨＯＣ２及びモザイクＣＨＯＣ１ニューロン前駆細胞（ＮＰＣ）におけるＣＧＧリピート切除を示す。５つの可能な５’ｇＲＮＡがリピートの左側に示され、１つの可能な３’ｇＲＮＡがリピートの右側に示されている。ＳｐＣａｓ９ ＲＮＰエレクトロポレーション後、細胞を３’ｇＲＮＡと組み合わせたｇＲＮＡ ａ～ｅ（５’ｇＲＮＡ）のうちの１つで処理した。ΔＣＧＧ：ＣＧＧ切除ｉＰＳＣに由来する対照。Ｃ１及びＣ２：ＣＨＯＣ１の非編集対照。注：Ｃ１対照レーンについてのＰＣＲは失敗した。 ある特定のガイド配列の標的配列と重複するＣＨＯＣ１ ＮＰＣの小さな既存の欠失（ＣＨＯＣ１Δ）の位置を示す５’ＵＴＲ遺伝子型決定の結果を示す。図１９はまた、例示的なガイド位置に対するＣＨＯＣ１Δの概略図を含む。 単一ｇＲＮＡ（配列番号５２６２）を使用した切除後の単一ＣＨＯＣ１クローンからのシーケンシングリードの表示を示す。 ＳｐＣａｓ９ ＲＮＰエレクトロポレーション後の単一または対のｇＲＮＡを使用したＣＧＧリピート切除の証拠を示す。分化した有糸分裂後のＣＨＯＣ２ニューロンにおけるＤＮＡ－ＰＫ阻害剤による治療を伴わないＣＧＧリピート切除を示す。矢印は、サンガーシーケンシングによって確認された切除されたＤＮＡバンドを示す。 ＳｐＣａｓ９ ＲＮＰエレクトロポレーション後の単一または対のｇＲＮＡを使用したＣＧＧリピート切除の証拠を示す。ＣＨＯＣ２ニューロン前駆細胞（ＮＰＣ）におけるＳｐＣａｓ９を用いた単一ガイド切除実験を示す。ＰＣＲ増幅ＦＭＲ１ ＤＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔの２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを使用した電気泳動によって分離させた。ｇＲＮＡ ＧＤＧ＿Ｃａｓ９＿Ｆｍｒ１＿１（配列番号５２６２）（レーンＢ１＝ＤＭＳＯ；レーンＡ２＝化合物６）は、ＣＧＧリピートの切除を示す。 Ｃｐｆ１またはＳｐＣａｓ９を伴う１対のｇＲＮＡアプローチにおけるＤＮＡ－ＰＫ阻害剤（「＋阻害剤」；１ｕＭ化合物３）により処置されたｉＰＳ細胞（４６７０及び６８ＦＡ）におけるフラタキシン遺伝子座でのＧＡＡリピート切除に対する効果を示す。 フラタキシン遺伝子座でのＤＮＡ－ＰＫ阻害剤（１ｕＭ化合物３）及び１対のガイドＧＡＡリピート切除によりｉＰＳ細胞を処理したときに観察された全ＮＨＥＪ修復から５０％ＭＭＥＪ修復へのシフトを示す。点線は予想される切断部位を示す。太字及び下線付きの文字は、挿入されたヌクレオチドを示す（ＮＨＥＪ修復で一般的）。太字は、修復の両端のマイクロホモロジーを強調している（明確にするために両端に示されているが、実際の配列にはマイクロ相同配列のコピーが１つだけ保存されている）。 Ａ～Ｃは、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を伴う（「＋Ｉｎｈ．」）かまたは伴わない（「－Ｉｎｈ．」）ＳｐＣａｓ９による ＦＡ ｉＰＳＣにおけるＧＡＡ切除後のＦＸＮレベルの上昇を示す。Ａは、ｉＰＳＣにおけるＣａｓ９媒介遺伝子編集のワークフローを示す。Ｂは、対照と比較した対のｇＲＮＡ切除後の０．４、１．５、５及び１１ｋｂフラグメントの代表的なウエスタンブロット（ＡＡＶＳ１ ｇＲＮＡ、スペーサー配列 配列番号３１）である。Ｃは、未編集対照と比較した、ＦＡＣＳによってソートされた個々のクローンの分析を示す。 脆弱Ｘ遺伝子座でのＭＭＥＪベースのＣＧＧリピート切除のモデルを示す。単一ｇＲＮＡを使用した切断及び５’ＤＮＡ切除により、ＣＧＧリピート部位の上流部位へマイクロホモロジーを含む末端（ボックス）がもたらされ、ＭＭＥＪ修復が容易になる。 リポフェクタミン３０００トランスフェクションによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞における上流ｓｇＲＮＡを含む、ＤＭＰＫの３’ＵＴＲを標的とするｓｇＲＮＡの編集効率（インデル％）を示す。トランスフェクションの７２時間後にゲノムＤＮＡを単離し、編集効率をサンガーシーケンシング及びＴＩＤＥ分析によって評価した（エラーバー＝３回の繰り返しからのＳＥＭ）。 リポフェクタミン３０００トランスフェクションによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞における下流ｓｇＲＮＡを含む、ＤＭＰＫの３’ＵＴＲを標的とするｓｇＲＮＡの編集効率（インデル％）を示す。トランスフェクションの７２時間後にゲノムＤＮＡを単離し、編集効率をサンガーシーケンシング及びＴＩＤＥ分析によって評価した（エラーバー＝３回の繰り返しからのＳＥＭ）。 リポフェクタミン３０００トランスフェクションによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞における下流ｓｇＲＮＡを含む、ＤＭＰＫの３’ＵＴＲを標的とするｓｇＲＮＡの編集効率（インデル％）を示す。トランスフェクションの７２時間後にゲノムＤＮＡを単離し、編集効率をサンガーシーケンシング及びＴＩＤＥ分析によって評価した（エラーバー＝３回の繰り返しからのＳＥＭ）。 リポフェクタミン３０００トランスフェクションによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣＴＧリピート伸長内に位置するかまたはそれに隣接するｓｇＲＮＡを含む、ＤＭＰＫの３’ＵＴＲを標的とするｓｇＲＮＡの編集効率（インデル％）を示す。トランスフェクションの７２時間後にゲノムＤＮＡを単離し、編集効率をサンガーシーケンシング及びＴＩＤＥ分析によって評価した（エラーバー＝３回の繰り返しからのＳＥＭ）。 リポフェクタミン２０００トランスフェクションによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、上流ｓｇＲＮＡを含む、ＤＭＰＫの３’ＵＴＲを標的とするｓｇＲＮＡの編集効率（インデル％）を示す。トランスフェクションの４８時間後にゲノムＤＮＡを単離し、編集効率をサンガーシーケンシングとＴＩＤＥ分析によって評価した（エラーバー＝４回の繰り返しからのＳＥＭ）。 リポフェクタミン２０００トランスフェクションによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、上流ｓｇＲＮＡを含む、ＤＭＰＫの３’ＵＴＲを標的とするｓｇＲＮＡの編集効率（インデル％）を示す。トランスフェクションの４８時間後にゲノムＤＮＡを単離し、編集効率をサンガーシーケンシングとＴＩＤＥ分析によって評価した（エラーバー＝４回の繰り返しからのＳＥＭ）。 リポフェクタミン２０００トランスフェクションによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、下流ｓｇＲＮＡを含む、ＤＭＰＫの３’ＵＴＲを標的とするｓｇＲＮＡの編集効率（インデル％）を示す。トランスフェクションの４８時間後にゲノムＤＮＡを単離し、編集効率をサンガーシーケンシングとＴＩＤＥ分析によって評価した（エラーバー＝４回の繰り返しからのＳＥＭ）。 リポフェクタミン２０００トランスフェクションによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、下流ｓｇＲＮＡを含む、ＤＭＰＫの３’ＵＴＲを標的とするｓｇＲＮＡの編集効率（インデル％）を示す。トランスフェクションの４８時間後にゲノムＤＮＡを単離し、編集効率をサンガーシーケンシングとＴＩＤＥ分析によって評価した（エラーバー＝４回の繰り返しからのＳＥＭ）。 リポフェクタミン２０００トランスフェクションによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、ＣＴＧリピート伸長内に位置するかまたはそれに隣接するｓｇＲＮＡを含む、ＤＭＰＫの３’ＵＴＲを標的とするｓｇＲＮＡの編集効率（インデル％）を示す。トランスフェクションの４８時間後にゲノムＤＮＡを単離し、編集効率をサンガーシーケンシングとＴＩＤＥ分析によって評価した（エラーバー＝４回の繰り返しからのＳＥＭ）。 ＴＩＤＥ分析による、１：６のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡの比率でＣａｓ９の３つの濃度（１０ｐｍｏｌｅ（三角形）、２０ｐｍｏｌｅ（正方形）、及び３０ｐｍｏｌ（円））でのＤＭ１筋芽細胞におけるＤＭＰＫの３’ＵＴＲを標的とする個々のｓｇＲＮＡの編集効率を示す。編集効率のパーセントは、Ｙ軸として表示される。 ＴＩＤＥ分析による、１：６のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡの比率でＣａｓ９の３つの濃度（１０ｐｍｏｌｅ（三角形）、２０ｐｍｏｌｅ（正方形）、及び３０ｐｍｏｌ（円））でのＤＭ１筋芽細胞におけるＤＭＰＫの３’ＵＴＲを標的とする個々のｓｇＲＮＡの編集効率を示す。編集効率のパーセントは、ヒートマップとして表示される。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＤＭ１筋芽細胞における４２個の個々のｓｇＲＮＡの編集効率の結果のスピアマン相関を示す。スピアマン相関値、ｒｈｏ＝０．５２８。ｐ値＝０．０００２。 ＤＭ１筋芽細胞にＲＮＰ（２０ｐｍｏｌ）で送達された個々のｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９を使用して誘導された低頻度の大きなインデルを示す。ＤＭＰＫ ３’ＵＴＲ領域は、ＧｏＴａｑ ＰＣＲによって増幅され、ＤＮＡゲル電気泳動によって視覚化された；ＰＣＲ産物を切除し、サンガーシーケンシングにかけた。 ＲＮＰでＤＭ１筋芽細胞に送達された個々のｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９を使用して誘導された低頻度の大きなインデルをしたものを示す。ｓｇＲＮＡ配列番号３９３８（ＤＭＰＫ－Ｕ１４）及びＤＭ３８３対照のサンガーシーケンシングトレースを示す。 ＲＮＰでＤＭ１筋芽細胞に送達された個々のｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９を使用して誘導された低頻度の大きなインデルをしたものを示す。ＤＭ１筋芽細胞をＣａｓ９の２つの濃度（２０ｐｍｏｌ及び３０ｐｍｏｌ）でｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９により処理した後のＤＮＡゲル電気泳動によるＰＣＲ産物を示す。 ＤＭ１筋芽細胞にＲＮＰで送達された、ＤＭＰＫの３’ＵＴＲを標的とする個々のｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９によって誘導される例示的な大きなインデル、及び大きなインデルを誘導することによってＣＴＧリピートをさらに切除する例示的なｓｇＲＮＡを示す。矢印は、各ｓｇＲＮＡのゲノム標的部位を示す。 ＤＭ１筋芽細胞における対のｓｇＲＮＡを使用するＣＴＧリピート切除を示す。ＷＴ及びＤＭＰＫの疾患対立遺伝子における選択されたｓｇＲＮＡの標的部位の概略図を示す。Ｕ１は配列番号３７７８（ＤＭＰＫ－Ｕ２７）であり；Ｕ２は配列番号３３８６（ＤＭＰＫ－Ｕ５６）であり；Ｕ３は配列番号３３５４（ＤＭＰＫ－Ｕ５８）であり；Ｄ１は配列番号２５１４（ＤＭＰＫ－Ｄ１５）であり；Ｄ２は配列番号２２５８（ＤＭＰＫ－Ｄ３４）であり；Ｄ３は配列番号２２１０（ＤＭＰＫ－Ｄ４２）である。対１は、ｓｇＲＮＡ配列番号３７７８（ＤＭＰＫ－Ｕ２７）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２５８（ＤＭＰＫ－Ｄ３４）に対応し；対２は、ｓｇＲＮＡ配列番号３７７８（ＤＭＰＫ－Ｕ２７）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２１０（ＤＭＰＫ－Ｄ４２）に対応し；対３は、ｓｇＲＮＡ配列番号３３８６（ＤＭＰＫ－Ｕ５６）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２５８（ＤＭＰＫ－Ｄ３４）に対応し；対４は、ｓｇＲＮＡ配列番号３３８６（ＤＭＰＫ－Ｕ５６）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２１０（ＤＭＰＫ－Ｄ４２）に対応し；対５は、ｓｇＲＮＡ配列番号３３５４（ＤＭＰＫ－Ｕ５８）及びｓｇＲＮＡ配列番号２５１４（ＤＭＰＫ－Ｄ１５）に対応する。 ＤＭ１筋芽細胞における対のｓｇＲＮＡを使用するＣＴＧリピート切除を示す。野生型ＤＮＡ及び切除されたＤＮＡ（「ＤｏｕｂｌｅＣｕｔ編集対立遺伝子」と呼ばれる）のＤＮＡゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の分離を示す。Ｕ１は配列番号３７７８（ＤＭＰＫ－Ｕ２７）であり；Ｕ２は配列番号３３８６（ＤＭＰＫ－Ｕ５６）であり；Ｕ３は配列番号３３５４（ＤＭＰＫ－Ｕ５８）であり；Ｄ１は配列番号２５１４（ＤＭＰＫ－Ｄ１５）であり；Ｄ２は配列番号２２５８（ＤＭＰＫ－Ｄ３４）であり；Ｄ３は配列番号２２１０（ＤＭＰＫ－Ｄ４２）である。対１は、ｓｇＲＮＡ配列番号３７７８（ＤＭＰＫ－Ｕ２７）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２５８（ＤＭＰＫ－Ｄ３４）に対応し；対２は、ｓｇＲＮＡ配列番号３７７８（ＤＭＰＫ－Ｕ２７）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２１０（ＤＭＰＫ－Ｄ４２）に対応し；対３は、ｓｇＲＮＡ配列番号３３８６（ＤＭＰＫ－Ｕ５６）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２５８（ＤＭＰＫ－Ｄ３４）に対応し；対４は、ｓｇＲＮＡ配列番号３３８６（ＤＭＰＫ－Ｕ５６）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２１０（ＤＭＰＫ－Ｄ４２）に対応し；対５は、ｓｇＲＮＡ配列番号３３５４（ＤＭＰＫ－Ｕ５８）及びｓｇＲＮＡ配列番号２５１４（ＤＭＰＫ－Ｄ１５）に対応する。 ＤＭ１筋芽細胞における対のｓｇＲＮＡを使用するＣＴＧリピート切除を示す。シグナル喪失ｄｄＰＣＲアッセイによって測定された個々のｓｇＲＮＡ及び対のｇＲＮＡについてのＣＴＧリピート切除効率を示す。Ｕ１は配列番号３７７８（ＤＭＰＫ－Ｕ２７）であり；Ｕ２は配列番号３３８６（ＤＭＰＫ－Ｕ５６）であり；Ｕ３は配列番号３３５４（ＤＭＰＫ－Ｕ５８）であり；Ｄ１は配列番号２５１４（ＤＭＰＫ－Ｄ１５）であり；Ｄ２は配列番号２２５８（ＤＭＰＫ－Ｄ３４）であり；Ｄ３は配列番号２２１０（ＤＭＰＫ－Ｄ４２）である。対１は、ｓｇＲＮＡ配列番号３７７８（ＤＭＰＫ－Ｕ２７）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２５８（ＤＭＰＫ－Ｄ３４）に対応し；対２は、ｓｇＲＮＡ配列番号３７７８（ＤＭＰＫ－Ｕ２７）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２１０（ＤＭＰＫ－Ｄ４２）に対応し；対３は、ｓｇＲＮＡ配列番号３３８６（ＤＭＰＫ－Ｕ５６）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２５８（ＤＭＰＫ－Ｄ３４）に対応し；対４は、ｓｇＲＮＡ配列番号３３８６（ＤＭＰＫ－Ｕ５６）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２１０（ＤＭＰＫ－Ｄ４２）に対応し；対５は、ｓｇＲＮＡ配列番号３３５４（ＤＭＰＫ－Ｕ５８）及びｓｇＲＮＡ配列番号２５１４（ＤＭＰＫ－Ｄ１５）に対応する。 Ａ～Ｂは、ＤＭ１及び健康な対照試料と比較した、ＦＩＳＨによる個々のｓｇＲＮＡまたは対のｓｇＲＮＡを使用したＤＭ１筋芽細胞における（ＣＵＧ）ｎリピートＲＮＡ増殖巣の減少を示す。Ａでは、免疫蛍光は、シングルカットｓｇＲＮＡ１及び対４で示されている。Ｂでは、結果は、ｓｇＲＮＡ１～６及び対１～５の核ごとに観察された（ＣＵＧ）ｎリピートＲＮＡ増殖巣の数の％相対頻度として示されている。ｓｇＲＮＡ１は配列番号３７７８（ＤＭＰＫ－Ｕ２７）であり；ｓｇＲＮＡ２は配列番号３３８６（ＤＭＰＫ－Ｕ５６）であり；ｓｇＲＮＡ３は配列番号３３５４（ＤＭＰＫ－Ｕ５８）であり；ｓｇＲＮＡ４は配列番号２５１４（ＤＭＰＫ－Ｄ１５）であり；ｓｇＲＮＡ５は配列番号２２５８（ＤＭＰＫ－Ｄ３４）であり；ｓｇＲＮＡ６は配列番号２２１０（ＤＭＰＫ－Ｄ４２）である。対１は、ｓｇＲＮＡ配列番号３７７８（ＤＭＰＫ－Ｕ２７）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２５８（ＤＭＰＫ－Ｄ３４）に対応し；対２は、ｓｇＲＮＡ配列番号３７７８（ＤＭＰＫ－Ｕ２７）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２１０（ＤＭＰＫ－Ｄ４２）に対応し；対３は、ｓｇＲＮＡ配列番号３３８６（ＤＭＰＫ－Ｕ５６）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２５８（ＤＭＰＫ－Ｄ３４）に対応し；対４は、ｓｇＲＮＡ配列番号３３８６（ＤＭＰＫ－Ｕ５６）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２１０（ＤＭＰＫ－Ｄ４２）に対応し；対５は、ｓｇＲＮＡ配列番号３３５４（ＤＭＰＫ－Ｕ５８）及びｓｇＲＮＡ配列番号２５１４（ＤＭＰＫ－Ｄ１５）に対応する。 Ａ～Ｂは、ＤＭ１及び健康な対照と比較した、ＦＩＳＨによる個々のｓｇＲＮＡまたは対のｓｇＲＮＡを使用したＤＭ１筋管における（ＣＵＧ）ｎリピートＲＮＡ増殖巣の減少を示す。Ａでは、ｓｇＲＮＡ１（配列番号３７７８、ＤＭＰＫ－Ｕ２７）及び対４（ｓｇＲＮＡ配列番号３３８６（ＤＭＰＫ－Ｕ５６）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２１０（ＤＭＰＫ－Ｄ４２））の場合の、ＤＡＰＩ、ミオジェニン、ＭＢＬＮ１、及び（ＣＵＧ）ｎ ＲＮＡ増殖巣に対する蛍光抗体法を示す。Ｂでは、結果は、ｓｇＲＮＡ１～６及び対１～５の核ごとに観察された（ＣＵＧ）ｎリピートＲＮＡ増殖巣の数の％相対頻度として示されている。ｓｇＲＮＡ１は配列番号３７７８（ＤＭＰＫ－Ｕ２７）であり；ｓｇＲＮＡ２は配列番号３３８６（ＤＭＰＫ－Ｕ５６）であり；ｓｇＲＮＡ３は配列番号３３５４（ＤＭＰＫ－Ｕ５８）であり；ｓｇＲＮＡ４は配列番号２５１４（ＤＭＰＫ－Ｄ１５）であり；ｓｇＲＮＡ５は配列番号２２５８（ＤＭＰＫ－Ｄ３４）であり；ｓｇＲＮＡ６は配列番号２２１０（ＤＭＰＫ－Ｄ４２）である。対１は、ｓｇＲＮＡ配列番号３７７８（ＤＭＰＫ－Ｕ２７）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２５８（ＤＭＰＫ－Ｄ３４）に対応し；対２は、ｓｇＲＮＡ配列番号３７７８（ＤＭＰＫ－Ｕ２７）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２１０（ＤＭＰＫ－Ｄ４２）に対応し；対３は、ｓｇＲＮＡ配列番号３３８６（ＤＭＰＫ－Ｕ５６）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２５８（ＤＭＰＫ－Ｄ３４）に対応し；対４は、ｓｇＲＮＡ配列番号３３８６（ＤＭＰＫ－Ｕ５６）及びｓｇＲＮＡ配列番号２２１０（ＤＭＰＫ－Ｄ４２）に対応し；対５は、ｓｇＲＮＡ配列番号３３５４（ＤＭＰＫ－Ｕ５８）及びｓｇＲＮＡ配列番号２５１４（ＤＭＰＫ－Ｄ１５）に対応する。 Ａ～Ｄは、ＤＭ１筋管における対のｓｇＲＮＡを使用するＣＴＧリピート切除によるミススプライシングの補正を示す。結果は、Ａでは、ＢＩＮ１、Ｂでは、ＤＭＤ、Ｃでは、ＫＩＦ１３Ａ、及びＤでは、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１のｍＲＮＡにおけるＲＮＡスプライシングの部分的な回復を示すｑＰＣＲデータを示す。 ＤＭ１筋芽細胞におけるＳｐＣａｓ９を用いる単一ガイド切除実験を示す。図３７は、切除されたＣＴＧリピート＋／－３ｕＭ化合物６及び８個の個々のガイド（ＤＭＰＫ－Ｕ１０（配列番号３９１４）、ＤＭＰＫ－Ｕ４０（配列番号：３５１４）、ＤＭＰＫ－Ｄ５９（配列番号１７７８）、ＤＭＰＫ－Ｄ１３（配列番号２４５８）、ＤＭＰＫ－Ｕ１６（配列番号３８５８）、ＤＭＰＫ－Ｕ５４（配列番号３４１８）、ＤＭＰＫ－Ｄ６３（配列番号１７０６）、またはＤＭＰＫ－Ｄ３４（配列番号２２５８））の例示的トレースに関するＡｇｉｌｅｎｔの２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを使用した電気泳動によって分離されたＰＣＲ増幅ＤＭＰＫ ＤＮＡを示す。化合物６で処理した試料のより顕著なバンドは、ＤＭＳＯ対照と比較して、切除率が高いことを示す（丸で囲んだ部分）。 Ａ～Ｃにおいて、Ａは、ガイド対（配列番号３３３０及び２５５４）を用いてＳｐＣａｓ９ ＲＮＰを、＋／－３ｕＭ化合物６（白丸（＋Ｉｎｈ）、黒丸（－Ｉｎｈ））で送達した後の、デュアルｇＲＮＡ ＣＴＧリピート切除後のＤＭ１筋芽細胞におけるミススプライシング補正を示す。ＢではＡＡＶＳ１ ｇＲＮＡ及びＣではモックエレクトロポレーション細胞を対照として使用した。ミススプライシング補正を、遺伝子ＧＦＴＰ１、ＢＩＮ１、ＭＢＮＬ２、ＤＭＤ、ＮＦＩＸ、ＧＯＬＧＡ４、及びＫＩＦ１３Ａについて評価した。所与のスプライシングイベントの頻度をＮＧＳによって測定した；データは、モック処理に正規化されている。 Ａ～Ｂは、ＡでｓｐＣａｓ９及びガイド対（配列番号３３３０（ＧＤＧ＿ＤＭＰＫ３）及び配列番号２５０６（ＣＲＩＳＰＲ－３）；またはＢで配列番号３３３０（ＧＤＧ＿ＤＭＰＫ３）及び配列番号２５４６（ＣＲＩＳＰＲ－４））を含有するＲＮＰで処理されたＤＭ１患者線維芽細胞におけるＣＴＧリピート切除に対するＤＮＡ－ＰＫ阻害剤の用量応答を示す。線維芽細胞は、化合物６（３０ｎＭ、３００ｎＭ、３μＭ及び１０μＭ）またはＤＭＳＯの用量を増加して処理した。切除された産物は、ＤＮＡゲル電気泳動によるバンドとして観察される。 ＤＭ１患者線維芽細胞における２つのｇＲＮＡ（配列番号１１５３（ｇＲＮＡ１）、配列番号１１２９（ｇＲＮＡ２））についての、化合物６を用いる場合及び用いない場合のＳａＣａｓ９による単一ｇＲＮＡ切除の例示的なＤＮＡ電気泳動を示す。 ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲを標的とする４２の個々のＳｐＣａｓ９ ｓｇＲＮＡで編集されたＤＭ１患者筋芽細胞からのＤＭＰＫのＰＣＲ増幅３’ＵＴＲ領域のエレクトロフェログラムのコンポジットを示す。エレクトロポレーション後、細胞をＤＭＳＯ（上段）または３ｕＭ化合物６（下段）と２４時間インキュベートした。矢印は、未編集の健康な対立遺伝子の予想サイズを示す。未編集疾患（伸長ＣＴＧ対立遺伝子は増幅しない）。矢印下のバンドは、推定上の編集対立遺伝子である。モック＝ＲＮＰなしでエレクトロポレーションされている。ゲノムの他の場所を標的とするＲＮＰを用いてエレクトロポレーションしたＮＴＣ（非標的対照）。Ａは複製１を示す。 ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲを標的とする４２の個々のＳｐＣａｓ９ ｓｇＲＮＡで編集されたＤＭ１患者筋芽細胞からのＤＭＰＫのＰＣＲ増幅３’ＵＴＲ領域のエレクトロフェログラムのコンポジットを示す。エレクトロポレーション後、細胞をＤＭＳＯ（上段）または３ｕＭ化合物６（下段）と２４時間インキュベートした。矢印は、未編集の健康な対立遺伝子の予想サイズを示す。未編集疾患（伸長ＣＴＧ対立遺伝子は増幅しない）。矢印下のバンドは、推定上の編集対立遺伝子である。モック＝ＲＮＰなしでエレクトロポレーションされている。ゲノムの他の場所を標的とするＲＮＰを用いてエレクトロポレーションしたＮＴＣ（非標的対照）。Ｂは複製２を示す。 ＤＮＡ－ＰＫ阻害を伴う場合及び伴わない場合のシングルカット切除実験の例示的なＰａｃＢｉｏシーケンシング結果を示す。モックガイドを用いた結果を示す。結果は、健康な対立遺伝子の読み取り計数を示す。１１９５ｂｐアンプリコン（プラス鎖に表示された）にまたがる、各条件のリードパイルアップ図。黒い実線の領域は３’ＵＴＲを表し、パターン化された領域はリピートを表す。破線はｓｇＲＮＡの切断部位を表す。目的領域でのリピートがゼロの各条件での読み取りのおよその割合（つまり、リピート切除を伴うリードの割合）。これは、（品質管理を実行した後）反復領域に対応するＣＩＧＡＲ文字列の部分を抽出することによって計算された。ガイドは、アンプリコンに沿った切断部位の位置順に並べられている。品質管理後の各条件のリード長分布。 ＤＮＡ－ＰＫ阻害を伴う場合及び伴わない場合のシングルカット切除実験の例示的なＰａｃＢｉｏシーケンシング結果を示す。ガイドＤＭＰＫ－Ｄ４３を用いた結果を示す。結果は、健康な対立遺伝子の読み取り計数を示す。１１９５ｂｐアンプリコン（プラス鎖に表示された）にまたがる、各条件のリードパイルアップ図。黒い実線の領域は３’ＵＴＲを表し、パターン化された領域はリピートを表す。破線はｓｇＲＮＡの切断部位を表す。目的領域でのリピートがゼロの各条件での読み取りのおよその割合（つまり、リピート切除を伴うリードの割合）。これは、（品質管理を実行した後）反復領域に対応するＣＩＧＡＲ文字列の部分を抽出することによって計算された。ガイドは、アンプリコンに沿った切断部位の位置順に並べられている。品質管理後の各条件のリード長分布。 ＤＮＡ－ＰＫ阻害を伴う場合及び伴わない場合のシングルカット切除実験の例示的なＰａｃＢｉｏシーケンシング結果を示す。ＤＭＰＫ－Ｄ５１を用いた結果を示す。結果は、健康な対立遺伝子の読み取り計数を示す。１１９５ｂｐアンプリコン（プラス鎖に表示された）にまたがる、各条件のリードパイルアップ図。黒い実線の領域は３’ＵＴＲを表し、パターン化された領域はリピートを表す。破線はｓｇＲＮＡの切断部位を表す。目的領域でのリピートがゼロの各条件での読み取りのおよその割合（つまり、リピート切除を伴うリードの割合）。これは、（品質管理を実行した後）反復領域に対応するＣＩＧＡＲ文字列の部分を抽出することによって計算された。ガイドは、アンプリコンに沿った切断部位の位置順に並べられている。品質管理後の各条件のリード長分布。 ＤＮＡ－ＰＫ阻害を伴う場合及び伴わない場合のシングルカット切除実験の例示的なＰａｃＢｉｏシーケンシング結果を示す。ガイドＤＭＰＫ－Ｕ１０を用いた結果を示す。結果は、健康な対立遺伝子の読み取り計数を示す。１１９５ｂｐアンプリコン（プラス鎖に表示された）にまたがる、各条件のリードパイルアップ図。黒い実線の領域は３’ＵＴＲを表し、パターン化された領域はリピートを表す。破線はｓｇＲＮＡの切断部位を表す。目的領域でのリピートがゼロの各条件での読み取りのおよその割合（つまり、リピート切除を伴うリードの割合）。これは、（品質管理を実行した後）反復領域に対応するＣＩＧＡＲ文字列の部分を抽出することによって計算された。ガイドは、アンプリコンに沿った切断部位の位置順に並べられている。品質管理後の各条件のリード長分布。 ＤＮＡ－ＰＫ阻害を伴う場合及び伴わない場合のシングルカット切除実験の例示的なＰａｃＢｉｏシーケンシング結果を示す。ガイドＤＭＰＫ－Ｕ５２を用いた結果を示す。結果は、健康な対立遺伝子の読み取り計数を示す。１１９５ｂｐアンプリコン（プラス鎖に表示された）にまたがる、各条件のリードパイルアップ図。黒い実線の領域は３’ＵＴＲを表し、パターン化された領域はリピートを表す。破線はｓｇＲＮＡの切断部位を表す。目的領域でのリピートがゼロの各条件での読み取りのおよその割合（つまり、リピート切除を伴うリードの割合）。これは、（品質管理を実行した後）反復領域に対応するＣＩＧＡＲ文字列の部分を抽出することによって計算された。ガイドは、アンプリコンに沿った切断部位の位置順に並べられている。品質管理後の各条件のリード長分布。 ＤＮＡ－ＰＫ阻害を伴う場合及び伴わない場合のシングルカット切除実験の例示的なＰａｃＢｉｏシーケンシング結果を示す。結果ガイドＤＭＰＫ－Ｕ５８を示す。結果は、健康な対立遺伝子の読み取り計数を示す。１１９５ｂｐアンプリコン（プラス鎖に表示された）にまたがる、各条件のリードパイルアップ図。黒い実線の領域は３’ＵＴＲを表し、パターン化された領域はリピートを表す。破線はｓｇＲＮＡの切断部位を表す。目的領域でのリピートがゼロの各条件での読み取りのおよその割合（つまり、リピート切除を伴うリードの割合）。これは、（品質管理を実行した後）反復領域に対応するＣＩＧＡＲ文字列の部分を抽出することによって計算された。ガイドは、アンプリコンに沿った切断部位の位置順に並べられている。品質管理後の各条件のリード長分布。 ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲを標的とする４２個のＳｐＣａｓ９ ｓｇＲＮＡのすべてのペアワイズ組み合わせで編集されたＤＭ１患者線維芽細胞からのＤＭＰＫのＰＣＲ増幅３’ＵＴＲ領域のエレクトロフェログラムのコンポジットを示す（ＣＴＧリピートの上流に２２ｓｇＲＮＡ、下流に２０）。各ガイド対を事前ロードしたＲＮＰでエレクトロポレーションした後、細胞を、ＤＭＳＯ（各対の上段）または３ｕＭ化合物６（各対の下段）と２４時間インキュベートした。矢印は、未編集の健康な対立遺伝子の予想サイズを示す。未編集の患者の対立遺伝子は増幅していない。矢印下のバンドは、推定上の編集対立遺伝子である；健康なラインより上のバンドは、推定上の複製または他の複雑な再編成である。スクリーニングのプレート１を示す。 ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲを標的とする４２個のＳｐＣａｓ９ ｓｇＲＮＡのすべてのペアワイズ組み合わせで編集されたＤＭ１患者線維芽細胞からのＤＭＰＫのＰＣＲ増幅３’ＵＴＲ領域のエレクトロフェログラムのコンポジットを示す（ＣＴＧリピートの上流に２２ｓｇＲＮＡ、下流に２０）。各ガイド対を事前ロードしたＲＮＰでエレクトロポレーションした後、細胞を、ＤＭＳＯ（各対の上段）または３ｕＭ化合物６（各対の下段）と２４時間インキュベートした。矢印は、未編集の健康な対立遺伝子の予想サイズを示す。未編集の患者の対立遺伝子は増幅していない。矢印下のバンドは、推定上の編集対立遺伝子である；健康なラインより上のバンドは、推定上の複製または他の複雑な再編成である。スクリーニングのプレート２を示す。 ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲを標的とする４２個のＳｐＣａｓ９ ｓｇＲＮＡのすべてのペアワイズ組み合わせで編集されたＤＭ１患者線維芽細胞からのＤＭＰＫのＰＣＲ増幅３’ＵＴＲ領域のエレクトロフェログラムのコンポジットを示す（ＣＴＧリピートの上流に２２ｓｇＲＮＡ、下流に２０）。各ガイド対を事前ロードしたＲＮＰでエレクトロポレーションした後、細胞を、ＤＭＳＯ（各対の上段）または３ｕＭ化合物６（各対の下段）と２４時間インキュベートした。矢印は、未編集の健康な対立遺伝子の予想サイズを示す。未編集の患者の対立遺伝子は増幅していない。矢印下のバンドは、推定上の編集対立遺伝子である；健康なラインより上のバンドは、推定上の複製または他の複雑な再編成である。スクリーニングのプレート３を示す ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲを標的とする４２個のＳｐＣａｓ９ ｓｇＲＮＡのすべてのペアワイズ組み合わせで編集されたＤＭ１患者線維芽細胞からのＤＭＰＫのＰＣＲ増幅３’ＵＴＲ領域のエレクトロフェログラムのコンポジットを示す（ＣＴＧリピートの上流に２２ｓｇＲＮＡ、下流に２０）。各ガイド対を事前ロードしたＲＮＰでエレクトロポレーションした後、細胞を、ＤＭＳＯ（各対の上段）または３ｕＭ化合物６（各対の下段）と２４時間インキュベートした。矢印は、未編集の健康な対立遺伝子の予想サイズを示す。未編集の患者の対立遺伝子は増幅していない。矢印下のバンドは、推定上の編集対立遺伝子である；健康なラインより上のバンドは、推定上の複製または他の複雑な再編成である。スクリーニングのプレート４を示す。 ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲを標的とする４２個のＳｐＣａｓ９ ｓｇＲＮＡのすべてのペアワイズ組み合わせで編集されたＤＭ１患者線維芽細胞からのＤＭＰＫのＰＣＲ増幅３’ＵＴＲ領域のエレクトロフェログラムのコンポジットを示す（ＣＴＧリピートの上流に２２ｓｇＲＮＡ、下流に２０）。各ガイド対を事前ロードしたＲＮＰでエレクトロポレーションした後、細胞を、ＤＭＳＯ（各対の上段）または３ｕＭ化合物６（各対の下段）と２４時間インキュベートした。矢印は、未編集の健康な対立遺伝子の予想サイズを示す。未編集の患者の対立遺伝子は増幅していない。矢印下のバンドは、推定上の編集対立遺伝子である；健康なラインより上のバンドは、推定上の複製または他の複雑な再編成である。スクリーニングのプレート５を示す。 ＦＡリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）におけるＣａｓ９及びｓｇＲＮＡ濃度を変化させた条件のスクリーニングにおけるＦＸＮ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのインデル効率％のヒートマップを示す。 ２つの患者細胞株（ＧＭ１４５１８及びＧＭ０３６６５）におけるＦＸＮ遺伝子のＧＡＡリピートの上流を標的とする５６個の個々のｓｇＲＮＡのインデル効率（％）を表すヒートマップを示す。送達されるＲＮＰの濃度は、「高」（１５ｐｍｏｌ Ｃａｓ９＋４５ｐｍｏｌ ｓｇＲＮＡ）または「低」（７．５ｐｍｏｌ Ｃａｓ９＋２２．５ｐｍｏｌ ｓｇＲＮＡ）として示されている。 ２つの患者細胞株（ＧＭ１４５１８及びＧＭ０３６６５）におけるＦＸＮ遺伝子のＧＡＡリピートの下流を標的とする４０個の個々のｓｇＲＮＡのインデル効率（％）を表すヒートマップを示す。送達されるＲＮＰの濃度は、「高」（１５ｐｍｏｌ Ｃａｓ９＋４５ｐｍｏｌ ｓｇＲＮＡ）または「低」（７．５ｐｍｏｌ Ｃａｓ９＋２２．５ｐｍｏｌ ｓｇＲＮＡ）として示されている。ｓｇＲＮＡ配列番号２６５６２（ＦＸＮ－Ｄ２５）のインデル効率は、標的化ガイドＲＮＡ配列内にあるＧＭ１４５１８患者株に存在するＳＮＰ（一塩基多型）のために計算することができなかった。ＣＤＣ４２ＢＰＢ及びＲＥＬＡは、それぞれ既知の高効率及び中程度の効率のため、実験アッセイ対照として使用した。 Ａ～Ｃは、ＧＡＡリピート（配列番号５２６６６及び２６５６２）に隣接するガイド対を用いたＲＮＰエレクトロポレーションを使用した、ＦＡ心筋細胞におけるＳｐＣａｓ９を用いたデュアルガイド切除実験を示す。Ａでは、ＧＡＡ切除は、３ｕＭ化合物６により有意に改善され、これによりＢでより高いＦＸＮ ｍＲＮＡレベル（ＧＡＡ＋Ｉｎｈ）及びＣでより高いＦＸＮタンパク質レベル（ＧＡＡ＋Ｉｎｈ）がもたらされた。「ＮＴＣ」は、非ターゲティング制御を指す。「ＧＡＡ」は、ＧＡＡリピートに隣接する対のガイドを指す。 ＲＮＰエレクトロポレーションを使用した、野生型（ＷＴ）及びＦＡ ｉＰＳＣにおけるＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）及びＳｐＣａｓ９を用いたデュアルガイド切除実験を示す。図４８は、Ｃｐｆ１（ボックス、ＧＤ１＆２（配列番号４７０４７及び７４４７））及びＳｐＣａｓ９（Ｃａｓ９ ＬＧ５＆１１（配列番号５２６６６及び２６５６２））によるＧＡＡリピート切除後の切除されたＤＮＡバンドを示すＤＮＡゲル電気泳動を示す。 野生型ｉＰＳＣ由来の皮質ニューロンにおけるＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を用いたデュアルガイド切除実験を示す。ＤＮＡゲル電気泳動は、以下のガイド対：ガイド１＆２（配列番号４７０４７及び７４４７）。ガイド３＆４（配列番号７４６３及び４６９６７）；ガイド５＆６（配列番号４６７６８及び７６８０）；ガイド７＆２（配列番号４７０３２及び７４４７）、を用いたＲＮＰエレクトロポレーションを使用したＣｐｆ１によるＧＡＡリピート切除後の切除されたＤＮＡバンドを示す。 成体ＹＧ８＋／－マウスのニューロンを標的とするための例示的なＡＡＶベクター設計を示す。ｈＳｙｎａｐｓｉｎ１プロモーターは、ニューロンにおけるＡｓＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ、ベクター１）及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＫＡＳＨ（ベクター２）の発現を促進する。２つのＣｐｆ１ ｇＲＮＡ（配列番号４７０４７及び７４４７）は、ＧＡＡリピートを切除するために１つのＵ６プロモーターの制御下でタンデムでクローン化された。 成体ＹＧ８＋／－マウスの線条体へのデュアルＡＡＶ送達（１：１比）を伴う、フリードライヒ運動失調症のインビボマウスモデルにおけるＡｓＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を用いたデュアルガイド切除実験を示す。ｍＣｈｅｒｒｙ陽性線条体を示す定位注射の２週間後の脳組織学を示す。 成体ＹＧ８＋／－マウスの線条体へのデュアルＡＡＶ送達（１：１比）を伴う、フリードライヒ運動失調症のインビボマウスモデルにおけるＡｓＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を用いたデュアルガイド切除実験を示す。ＦＡＣＳによる標的ニューロンの核ソーティングを示す。 成体ＹＧ８＋／－マウスの線条体へのデュアルＡＡＶ送達（１：１比）を伴う、フリードライヒ運動失調症のインビボマウスモデルにおけるＡｓＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を用いたデュアルガイド切除実験を示す。標的化ニューロン（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）対非標的化細胞（ｍＣｈｅｒｒｙ－）におけるＣｐｆ１によるＧＡＡリピート切除後の切除されたＤＮＡバンドを示すＤＮＡゲル電気泳動を示す。 ＣＴＧリピート領域を確認するためにゲノムＤＮＡをＢｇｌ Ｉで消化した後のサザンブロット分析による、野生型ｉＰＳＣ細胞株と比較したＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株ＳＢ１の特性決定を示す。ＳＢ１細胞には、約３００ ＣＴＧリピートのＣＴＧリピート領域が含まれている（ＣＴＧリピート対立遺伝子は約４．４ｋＢで示されている）。 ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるＣＴＧリピート領域の欠失を検出するために使用される２つのシグナル喪失（ＬＯＳ）デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイ（５’ＬＯＳ ｄｄＰＣＲアッセイ及び３’ＬＯＳ ｄｄＰＣＲアッセイ）の概略図を示す。 ＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株ＳＢ１におけるＳｐＣａｓ９による編集効率の評価のために選択された６つの上流ｇＲＮＡ（ＣＴＧリピート領域の５’側）（配列番号３７７８、４０２６、３７９４、４０１０、３９０６、及び３７４６）及び６つの下流ｇＲＮＡ（ＣＴＧリピート領域の３’側）（配列番号１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、１９１４、及び２２１０）の概略図を示す。 ＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株ＳＢ１におけるＳｐＣａｓ９による６つの上流ｇＲＮＡ（配列番号３７７８、４０２６、３７９４、４０１０、３９０６、及び３７４６）及び６つの下流ｇＲＮＡ（配列番号１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、１９１４、及び２２１０）の編集効率パーセントの結果を示す。 ２つのＬＯＳｄｄＰＣＲアッセイ（５’及び３’）によるＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株ＳＢ１におけるＳｐＣａｓ９による、個々のｇＲＮＡとして試験されたｇＲＮＡ、及び６つの上流ｇＲＮＡ（配列番号３７７８、４０２６、３７９４、４０１０、３９０６、及び３７４６）のそれぞれと６つの下流ｇＲＮＡ（配列番号１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、１９１４、及び２２１０）のそれぞれとの３６対の組み合わせについてのＣＴＧリピート領域の欠失パーセントを示す。示されている欠失％は、両方のＬＯＳ ｄｄＰＣＲアッセイからの平均リピート欠失の組み合わせである。 ＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株ＳＢ１におけるＳｐＣａｓ９ ｇＲＮＡ対及び個々のｇＲＮＡにわたる５’及び３’ＬＯＳ ｄｄＰＣＲの結果の比較を示す。結果は欠失パーセントとして示される。 ＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株ＳＢ１におけるＳｐＣａｓ９ ｇＲＮＡ対及び個々のｇＲＮＡにわたる５’及び３’ＬＯＳ ｄｄＰＣＲの結果の比較を示す。結果は欠失パーセントとして示される。 ＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株４０３３－４におけるＳｐＣａｓ９による編集効率の評価のために選択された５つの上流ｇＲＮＡ（配列番号３７７８、４０２６、３７９４、３９０６、及び３７４６）及び５つの下流ｇＲＮＡ（配列番号１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、及び２２１０）の概略図を示す。 ２つのＬＯＳｄｄＰＣＲアッセイ（５’及び３’）によるＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株４０３３－４におけるＳｐＣａｓ９による、個々のｇＲＮＡとして試験されたｇＲＮＡ、及び５つの上流ｇＲＮＡ（配列番号３７７８、４０２６、３７９４、３９０６、及び３７４６）と５つの下流ｇＲＮＡ（配列番号：１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、及び２２１０）との２５対の組み合わせについてのＣＴＧリピート領域の欠失パーセントを示す。結果は、５’及び３’ＬＯＳ ｄｄＰＣＲアッセイの両方の欠失パーセントとして示されている。 ２つのＬＯＳｄｄＰＣＲアッセイ（５’及び３’）によるＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株４０３３－４におけるＳｐＣａｓ９による、個々のｇＲＮＡとして試験されたｇＲＮＡ、及び５つの上流ｇＲＮＡ（配列番号３７７８、４０２６、３７９４、３９０６、及び３７４６）と５つの下流ｇＲＮＡ（配列番号：１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、及び２２１０）との２５対の組み合わせについてのＣＴＧリピート領域の欠失パーセントを示す。結果は、５’及び３’ＬＯＳ ｄｄＰＣＲアッセイの両方の欠失パーセントとして示されている。 ＳＢ１細胞（約１ｋｂ ＣＴＧリピート対立遺伝子）（ｎ＝１）における、ＳｐＣａｓ９を用いたｇＲＮＡ対及び個々のｇＲＮＡ全体の平均リピート欠失を示す。５’及び３’ＬＯＳ ｄｄＰＣＲアッセイの両方を各実験に使用した。 ４０３３－４細胞（約７．５ｋｂ ＣＴＧリピート対立遺伝子）（ｎ＝２）における、ＳｐＣａｓ９を用いたｇＲＮＡ対及び個々のｇＲＮＡ全体の平均リピート欠失を示す。５’及び３’ＬＯＳ ｄｄＰＣＲアッセイの両方を各実験に使用した。 ＤＭ１心筋細胞におけるＳｐＣａｓ９を用いた編集効率の評価のために選択された５つの上流ｇＲＮＡ（配列番号３７７８、４０２６、３７９４、３９０６、及び３７４６）及び５つの下流ｇＲＮＡ（配列番号１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、及び２２１０）の概略図を示す。 ＤＭ１ ｉＰＳＣ ＳＢ１細胞の編集効率と比較した、ＤＭ１心筋細胞におけるＳｐＣａｓ９を用いた５つの上流ｇＲＮＡ（配列番号３７７８、４０２６、３７９４、３９０６、及び３７４６）及び５つの下流ｇＲＮＡ（配列番号１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、及び２２１０）の編集効率を示す。編集効率は、パーセントインデル（ｎ＝１）として示される。 ＤＭ１心筋細胞（「ＣＭ」）及びＤＭ１ ｉＰＳＣ ＳＢ１細胞（「ｉＰＳＣ」）におけるＳｐＣａｓ９を用いた３つのｇＲＮＡ対（配列番号３７４６／２２１０、４０２６／１５８６、及び３７７８／１７７８）についてのＣＴＧリピート領域の欠失パーセントを示す（ｎ＝１）。 ２つのＬＯＳｄｄＰＣＲアッセイ（５’及び３’）によるＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株ＳＢ１におけるＳｐＣａｓ９を用いた、個々のｇＲＮＡとして試験されたｇＲＮＡ、及び６つの上流ｇＲＮＡ（配列番号３７７８、４０２６、３７９４、４０１０、３９０６、及び３７４６）と６つの下流ｇＲＮＡ（配列番号１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、１９１４、及び２２１０）の３６対の組み合わせについてのＣＴＧリピート領域の欠失パーセントを示す。矢印は、ハイブリッド捕捉オフターゲット分析に基づいて、「クリーン」（白）、「オフターゲット＜１％」（灰色）、または「オフターゲット＞１％」（黒）として同定されたｇＲＮＡ対を示す。 ＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株ＳＢ１におけるＳａＣａｓ９を用いた編集効率の評価のために選択された３０の上流ｇＲＮＡ及び３０の下流ｇＲＮＡの概略図を示す。 野生型ｉＰＳＣ細胞におけるＳａＣａｓ９を用いた３０の上流ｇＲＮＡ及び３０の下流ｇＲＮＡの編集効率パーセントの結果を示す。 ＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株ＳＢ１におけるＳａＣａｓ９を用いたＣＴＧリピート欠失の評価のために選択された４つの上流ｇＲＮＡ（配列番号３２５６、２８９６、３１３６、及び３２２４）及び６つの下流ｇＲＮＡ（配列番号４９８９、５６０、６７２、９７６、７６０、９８４、及び６１６）の概略図を示す。 Ａ～Ｂにおいて、Ａは、ｓａＣａｓ９ ｇＲＮＡのＣＴＧリピート欠失パーセント及びＢは編集効率を示す。３’ＬＯＳ ｄｄＰＣＲアッセイからの対及び個々のｓａＣａｓ９ ｇＲＮＡのリピート欠失パーセントデータを示す。ｓｐＣａｓ９ ｇＲＮＡ対（配列番号３７４６及び２２１０）を対照として使用した。Ｂにおいて、＃２はｇＲＮＡ Ｓａ２を指し、＃３はｇＲＮＡ Ｓａ３を指し、＃４はｇＲＮＡ Ｓａ４を指し、＃２１はｇＲＮＡ Ｓａ２１を指し、＃１はｇＲＮＡ Ｓａ１を指し、＃１０はｇＲＮＡ Ｓａ１０を指し、＃１７はｇＲＮＡ Ｓａ１７を指し、＃１９はｇＲＮＡ Ｓａ１９を指し、＃２５はｇＲＮＡ Ｓａ２５を指し、＃２９はｇＲＮＡ Ｓａ２９を指す（表２１も参照のこと）。
ここで、本発明のある特定の実施形態を詳細に参照し、その実施例を添付の図面に示す。本発明は、例示された実施形態と併せて説明されるが、それらは、本発明をそれらの実施形態に限定することを意図するものではないことを理解されたい。逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲及び含まれる実施形態によって定義されるように本発明に含まれ得るすべてのすべての代替形態、修正形態、及び均等物を網羅することが意図されている。
本教示を詳細に説明する前に、本開示は特定の組成物またはプロセスステップに限定されず、それ自体が変化する可能性があることを理解されたい。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に明確に記載のない限り、複数形の参照を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ａ ｇｕｉｄｅ（ガイド）」への言及は、複数のガイドを含み、「ａ ｃｅｌｌ（細胞）」への言及は、複数の細胞を含み、その他も同様である。
数値範囲は、その範囲を定義する数を含むものとする。測定された値及び測定可能な値は、有効数字及び測定に関連する誤差を考慮して、概算値であると理解されている。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定することを意図するものではない。前述の一般的な説明及び詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的なものに過ぎず、教示を限定するものではないことを理解されたい。
本明細書に特に記載されていない限り、種々の成分を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と記載する明細書の実施形態は、記載された成分「からなる」または「から本質的になる」と企図され；種々の成分「からなる」と記載する明細書の実施形態はまた、記載された成分「を含む」または「から本質的になる」と企図され；種々の成分を「から本質的になる」と記載する明細書の実施形態は、また記載された成分「からなる」または「を含む」と企図される（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。「または」という用語は、特に明確に記載のない限り、包括的意味で使用され、すなわち、「及び／または」と同等である。
本明細書中で使用する節の見出しは編成を目的としたものに過ぎず、所望の主題をいかようにも限定するものとして解釈すべきではない。参照により組み込まれた資料が、本明細書または本明細書の他の明示的な内容で定義された用語と矛盾する場合、この本明細書が優先される。本教示を様々な実施形態と併せて説明しているが、これは本教示がそのような実施形態に限定されることを意図するものではない。それどころか、本教示は、当業者には理解されるように、様々な代替形態、修正形態、及び均等物を包含する。
Ｉ．定義
別途示されない限り、本明細書に使用される以下の用語及び語句は、以下の意味を有することが意図される。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書において、従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ－ＤＮＡ、及びそのアナログであるポリマーを含む、骨格に沿って互いに連結された窒素性複素環式塩基または塩基アナログを有するヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを含む多量体化合物を指すために使用される。核酸「骨格」は、１つ以上の糖－ホスホジエステル連結、ペプチド－核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ；ＰＣＴ番号ＷＯ９５／３２３０５）、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結、またはそれらの組み合わせを含む様々な連結から構成することができる。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または置換、例えば、２’メトキシまたは２’ハロゲン化物置換を有する類似の化合物であり得る。窒素塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、そのアナログ（例えば、５－メトキシウリジン、シュードウリジン、またはＮ１－メチルシュードウリジンなどの修飾ウリジンなど）；イノシン；プリンまたはピリミジンの誘導体（例えば、Ｎ４－メチルデオキシグアノシン、デアザ－またはアザ－プリン、デアザ－またはアザ－ピリミジン、５または６位に置換基を有するピリミジン塩基（例えば、５－メチルシトシン）、２、６、または８位に置換基を持つプリン塩基、２－アミノ－６－メチルアミノプリン、Ｏ６－メチルグアニン、４－チオ－ピリミジン、４－アミノ－ピリミジン、４－ジメチルヒドラジン－ピリミジン、及びＯ４－アルキル－ピリミジン；米国特許第５，３７８，８２５号及びＰＣＴ番号ＷＯ９３／１３１２１）であり得る。一般的な考察については、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５－３６， Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄ．， １１ｔｈ ｅｄ．， １９９２を参照のこと。核酸は、骨格がポリマーの位置（複数可）のための窒素塩基を含まない１つ以上の「非塩基性」残基を含むことができる（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、従来のＲＮＡまたはＤＮＡ糖、塩基及び連結のみを含むことができ、または従来の成分及び置換の両方を含むことができる（例えば、２’メトキシ連結を有する従来の塩基、または従来の塩基と１つ以上の塩基アナログの両方を含むポリマー）。核酸には、「ロックド核酸」（ＬＮＡ）が含まれ、これは、糖の立体構造を模倣したＲＮＡにロックされた二環式フラノース単位を有する１つ以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含有するアナログであり、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション親和性を高める（Ｖｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ， ２００４， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３（４２）：１３２３３－４１）。ＲＮＡ及びＤＮＡは異なる糖部分を有し、ＲＮＡ中のウラシルまたはそのアナログとＤＮＡ中のチミンまたはそのアナログの存在によって異なる場合がある。
「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、及び単に「ガイド」は、本明細書では交換可能に使用され、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとしても知られる）、またはｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡとしても知られる）との組み合わせのいずれかを指す。ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一ＲＮＡ分子（単一ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）として会合してもよく、または２つの別々のＲＮＡ分子（デュアルガイドＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ）であってもよい。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、各タイプを指す。ｔｒＲＮＡは、天然に存在する配列、または天然に存在する配列と比較して修飾またはバリエーションを有するｔｒＲＮＡ配列であり得る。
本明細書で使用される場合、「スペーサー配列」は、本明細書及び文献において「ガイド配列」または「標的指向性配列」とも呼ばれることがあり、標的配列に相補的であり、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼによる切断のためにガイドＲＮＡを標的配列に誘導するように機能するガイドＲＮＡ内の配列である。ガイド配列は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９）及び関連するＣａｓ９ホモログ／オルソログの場合、長さが２０塩基対であり得る。より短いまたはより長い配列もガイドとして使用することができ、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さである。例えば、いくつかの実施形態において、ガイド配列は、配列番号１０１～４９８８、５００１～７２６４、または７３０１～５３３７２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ガイド配列は、配列番号１０１～４９８８、５００１～７２６４、または７３０１～５３３７２から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、標的配列は、例えば、遺伝子内または染色体上にあり、ガイド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性または同一性の程度は、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、ガイド配列は、配列番号１０１～４９８８、５００１～７２６４、または７３０１～５３３７２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続したヌクレオチドと、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイド配列は、配列番号１０１～４９８８、５００１～７２６４、または７３０１～５３３７２から選択される配列と、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイド配列及び標的領域は、１００％相補的または同一であり得る。他の実施形態において、ガイド配列及び標的領域は、少なくとも１つのミスマッチを含有し得る。例えば、ガイド配列及び標的配列は、１、２、３、または４つのミスマッチを含有する場合があり、ここで、標的配列の全長は、少なくとも１７、１８、１９、２０またはそれ以上の塩基対である。いくつかの実施形態において、ガイド配列及び標的領域は、１～４のミスマッチを含む場合があり、ここで、ガイド配列は、少なくとも１７、１８、１９、２０またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ガイド配列及び標的領域は、１、２、３、または４つのミスマッチを含み得、ここで、ガイド配列は、２０ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ガイド配列は、配列番号１０１～４９８８、５００１～７２６４、または７３０１～５３３７２から選択される配列を含み、ここで、５’末端ヌクレオチドがグアニンでない場合、１つ以上のグアニン（ｇ）がその５’末端で配列に付加される。５’ｇまたはｇｇは、転写、例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性Ｕ６プロモーターまたはＴ７プロモーターによる発現に必要な場合がある。いくつかの実施形態において、５’グアニンは、本明細書に開示されるガイド配列またはガイド配列対のいずれか１つに付加される。
ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼの核酸基質は二本鎖核酸であるため、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼの標的配列には、ゲノムＤＮＡのプラス鎖とマイナス鎖の両方（すなわち、与えられた配列とその配列の逆相補体）が含まれる。したがって、ガイド配列が「標的配列に対して相補的である」と言われる場合、ガイド配列は、ガイドＲＮＡを標的配列の逆相補体に結合するように誘導することができることが理解され得る。したがって、ガイド配列が標的配列の逆相補体に結合するいくつかの実施形態において、ガイド配列は、ガイド配列においてＴの代わりにＵを用いることを除いて、標的配列のある特定のヌクレオチド（例えば、ＰＡＭを含まない標的配列）と同一である。
本明細書で使用される場合、「１対のガイドＲＮＡ」または「ガイド対」または「ｇＲＮＡ対」または「対のガイドＲＮＡ」は、同一のスペーサー配列を有さない２つのガイドＲＮＡを指す。第１のスペーサー配列は、対のｇＲＮＡの一方のスペーサー配列を指し、第２のスペーサー配列は、対の他方のｇＲＮＡのスペーサー配列を指す。いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡの使用は、「ダブルカット」または「ＤｏｕｂｌｅＣｕｔ」戦略とも呼ばれ、この戦略では、２つの切断が行われる。対照的に、いくつかの実施形態において、１つのガイドＲＮＡのみの使用は、「シングルカット」または「ＳｉｎｇｌｅＣｕｔ」戦略と呼ばれ、そこでは、１つの切断が行われる。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ」は、ＲＮＡ及びＤＮＡ結合活性及びＤＮＡ切断活性を有するポリペプチドまたはポリペプチドの複合体、またはそのような複合体のＤＮＡ結合サブユニットを意味し、ここで、ＤＮＡ結合活性は配列特異的であり、ＲＮＡの配列に依存する。例示的なＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼとしては、Ｃａｓクリーバーゼ／ニッカーゼが挙げられる。本明細書で使用される「Ｃａｓタンパク質」とも呼ばれる「Ｃａｓヌクレアーゼ」は、Ｃａｓクリーバーゼ及びＣａｓニッカーゼを包含する。Ｃａｓクリーバーゼ／ニッカーゼには、タイプＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのＣｓｍまたはＣｍｒ複合体、そのＣａｓ１０、Ｃｓｍ１、またはＣｍｒ２サブユニット、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのカスケード複合体、そのＣａｓ３サブユニット、及びクラス２ Ｃａｓヌクレアーゼが含まれる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、クラス１ Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼである。本明細書で使用される場合、「クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ」は、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ活性を有する一本鎖ポリペプチドである。クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼにはクラス２ Ｃａｓクリーバーゼ／ニッカーゼ（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８６３Ａバリアント）が含まれ、これらはさらにＲＮＡガイド型ＤＮＡクリーバーゼまたはニッカーゼ活性を有する。クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ Ｃａｓ９（例えば、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａバリアント）、ＨｙｐａＣａｓ９（例えば、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａバリアント）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）（例えば、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）、及びｅＳＰＣａｓ９（１．１）（例えば、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）タンパク質及びその修飾が挙げられる。Ｃｐｆ１タンパク質、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １６３： １－１３ （２０１５）、は、Ｃａｓ９と相同であり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有している。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、参照によりその全体が組み込まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの表Ｓ１及びＳ３を参照のこと。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １３（１１）： ７２２－３６ （２０１５）；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ， ６０：３８５－３９７ （２０１５）を参照のこと。クラス１は、タイプＩ、ＩＩＩ、及びＩＶのＣａｓヌクレアーゼに分類される。クラス２は、タイプＩＩ、Ｖ、及びＶＩのＣａｓヌクレアーゼに分類される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、またはＶＩ Ｃａｓヌクレアーゼである。
本明細書で使用される場合、「リボ核タンパク質」（ＲＮＰ）または「ＲＮＰ複合体」は、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、ＣａｓクリーバーゼまたはＣａｓニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９）などのＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼと共にガイドＲＮＡを指す。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９などのＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを標的配列にガイドし、ガイドＲＮＡは、標的配列とハイブリダイズし、薬剤が標的配列に結合し、その後、標的配列を切断またはニッキングすることができる。
本明細書で使用される場合、「自己相補的領域」は、例えば、領域に少なくとも１つの自由二本鎖端がある場合、それ自体へのハイブリダイゼーションを介して二次構造（例えば、ヘアピン、十字型など）を形成することができる核酸の任意の部分を指す。種々の形態のリピート及びＧＣリッチまたはＡＴリッチ核酸は、自己相補的であると見なされ、二次構造を形成する可能性がある。いくつかのミスマッチ塩基及び／または非カノニカル塩基対が存在するにもかかわらず二次構造が形成される可能性があるため、自己相補性は完全な自己相補性を必要としない。いくつかの実施形態において、自己相補的領域は、４０ヌクレオチドを含む。自己相補的領域は、必ずしも自己相補的ではなく、ヘアピンまたは他の二次構造でステムを形成する自己相補的領域のセグメント間に一本鎖状態で存在し得るループ形成配列によって中断され得る。
本明細書で使用される場合、第１の配列の第２の配列へのアラインメントが、第２の配列の位置の全体のＸ％以上が第１の配列と一致することを示す場合、第１の配列は、第２の配列「と少なくともＸ％同一である配列を含む」と考えられる。例えば、配列ＡＡＧＡは、配列ＡＡＧに対して１００％の同一性を有する配列を含む、なぜなら、アラインメントは、第２の配列の３つの位置すべてに一致するという点で１００％の同一性を与えるからである。ＲＮＡとＤＮＡの違い（一般に、ウリジンのチミジンへの交換、またはその逆）、及び修飾ウリジンなどのヌクレオシドアナログの存在は、関連するヌクレオチド（チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンなど）が同じ補体を有する限り（例えば、すべてのチミジン、ウリジン、または修飾ウリジンのアデノシン；別の例は、シトシンと５－メチルシトシンであり、どちらもグアノシンまたは修飾グアノシンを補体として有する）、ポリヌクレオチド間の同一性または相補性の違いに寄与しない。したがって、例えば、Ｘがシュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、または５－メトキシウリジンなどの任意の修飾ウリジンである配列５’－ＡＸＧは、両方が同じ配列（５’－ＣＡＵ）に完全に相補的であるという点で、ＡＵＧと１００％同一であると考えられる。例示的なアラインメントアルゴリズムは、当技術分野でよく知られているスミス－ウォーターマン及びニードルマン－ブンシュアルゴリズムである。当業者は、アラインメントされる配列の所与の対に対して、アルゴリズム及びパラメータ設定のどの選択が適切であるかを理解するであろう；一般的に、類似した長さであり、アミノ酸の場合は＞５０％、ヌクレオチドの場合は＞７５％の同一性が予想される配列の場合、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋウェブサーバーでＥＢＩによって提供されるニードルマン－ブンシュアルゴリズムインターフェイスのデフォルト設定を使用したニードルマン－ブンシュアルゴリズムが一般的に適切である。
「ｍＲＮＡ」は、ＤＮＡではなく、ポリペプチドに翻訳することができる（すなわち、リボソーム及びアミノアシル化ｔＲＮＡによる翻訳のための基質として機能することができる）オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指すために本明細書で使用される。ｍＲＮＡは、リボース残基またはその類似体、例えば、２’－メトキシリボース残基を含むリン酸－糖骨格を含み得る。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡリン酸－糖骨格の糖は、リボース残基、２’－メトキシリボース残基、またはそれらの組み合わせから本質的になる。
本明細書に記載のガイドＲＮＡ組成物及び方法に有用なガイド配列は、表２及び配列表に、ならびに本出願全体にわたって示されている。
本明細書で使用される場合、「標的配列」は、ｇＲＮＡのガイド配列に対して相補性を有する標的遺伝子中の核酸の配列を指す。標的配列とガイド配列との相互作用により、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼが、標的配列内で結合し、潜在的にニックまたは切断（薬剤の活性に応じて）するように誘導される。
本明細書で使用される場合、「治療」は、対象における疾患または障害の治療薬の任意の投与または適用を指し、疾患または疾患の発症（例えば、疾患は対象が疾患の発症の可能性がある、または発症する可能性が高い遺伝子型を有する場合、疾患が正式に診断される前または後に起こり得る）を阻害すること、その発症を阻止すること、疾患の１つ以上の症状を緩和すること、疾患を治癒すること、または疾患の１つ以上の症状の再発を予防することを含む。例えば、ＤＭ１の治療は、ＤＭ１の症状を緩和することを含み得る。
本明細書で使用される場合、「改善する」とは、表現型または症状に対する任意の有益な効果、例としてその重症度の低下、その発症の緩徐または遅延、その発症の阻止、またはその部分的もしくは完全な逆転もしくは排除、を指す。発現レベルなどの定量的表現型の場合、改善することは、健康な細胞もしくは個体または影響を受けていない細胞もしくは個体で見られる発現レベルに近づくように発現レベルを変更することを包含する。
本明細書で使用される場合、標的の切断とそれに続くＭＭＥＪまたは他の非ＮＨＥＪ修復が検出可能な程度までトリヌクレオチドリピートまたは自己相補的配列の切除をもたらす場合、標的配列はトリヌクレオチドリピートまたは自己相補的配列に「近い」ものである。いくつかの実施形態において、標的配列は、トリヌクレオチドリピートまたは自己相補的配列の１０、２０、３０、４０、５０または１００ヌクレオチド以内にあり、標的からトリヌクレオチドリピートまたは自己相補的配列までの距離は、トリヌクレオチドリピートまたは自己相補的配列の最も近いヌクレオチドと、切断を受ける標的内の部位との間のヌクレオチドの数として測定される。
本明細書で使用される場合、配列の「切除」は、配列が元々生じた核酸（例えば、ｇＤＮＡなどのＤＮＡ）からの配列の除去を生じるプロセスを意味し、これには、限定されないが、１つまたは２つの二本鎖切断イベント、または２つ以上のニッキングイベントを含むプロセスが挙げられ、それにいずれかの修復プロセス（その配列は修復産物には含まれない）が続き、これには、遠位末端のライゲーション（例えば、図５）、切除（例えば、図５及び６）、または切除された領域の少なくとも一部による二次構造の形成（例えば、図６）を含み得る。
本明細書で使用される場合、「伸長アミノ酸リピート」は、ポリペプチドの野生型バージョンで通常見られるよりも多くのアミノ酸が存在しているポリペプチド中の所与のアミノ酸（例えば、グルタミン、アラニンなどの１つ）のセグメントを指す。エクソンで発生するものとして列挙されている表１のトリヌクレオチドリピートの場合、正常範囲は、対応するポリペプチドの野生型バージョンで通常見られるよりも（多くの）アミノ酸の存在範囲を示す。
本明細書で使用される場合、「ＤＭ１筋芽細胞」は、ＤＭ１に関連する遺伝子型を有する筋細胞の前駆体を指し、例えば、ＤＭ１を有する対象に由来するかまたはそれから単離された細胞を含む。ＤＭ１筋芽細胞には、初代細胞、培養細胞、または細胞株が含まれる。
「薬学的に許容される担体」とは、有効成分ではない、医薬製剤に含まれる薬剤を指す。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、薬物送達を支援するか、または安定性もしくは生物学的利用能を支持または増強し得る。
「約」または「およそ」という用語は、その値がどのように測定または決定されるかに一部依存する、当業者によって決定される特定の値の許容誤差を意味する。
ＩＩ．反復ＤＮＡ切除の概要
本明細書に開示されるのは、ＲＮＡ指向性エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼをＴＮＲに隣接する部位に標的化する単一または対のガイドＲＮＡと組み合わさって、トリヌクレオチドリピートまたは自己相補的領域を切除できるという我々の発見、ならびにＤＮＡ－ＰＫ阻害剤がそのような配列の切除改善を提供するという我々の発見に基づく組成物及び方法である。図２Ａ～Ｂに示されるように、ＤＮＡ－ＰＫを阻害すると、おそらくマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）を含む１つ以上の代替経路が支持され、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介した修復が低減または排除されると考えられる。
さらに、図３に示すように、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤により、１つのｇＲＮＡと組み合わさったＣａｓ９またはＣｐｆ１などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによるトリヌクレオチドリピートの切除を促進することができることも見出された。この場合も、ＤＮＡ－ＰＫを阻害すると、１つ以上の代替経路が支持され、１つのｇＲＮＡのみが使用される場合、一般にトリヌクレオチドリピート切除をもたらさない、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介した修復が低減または排除されると考えられる。代替の修復経路には、切断部位でのＤＮＡ末端のエキソヌクレアーゼによる切除が含まれ、これによりトリヌクレオチドリピートの切除が行われる。図４に示されるように、単一ｇＲＮＡを提供することにより、ＡＡＶベクターなどのより小さなベクターの使用が容易になる。
図５は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによる２つの部位での切断後の修復経路をより詳細に示している。カノニカルなＮＨＥＪ（Ｃ－ＮＨＥＪ）は通常、より高速な経路であり、ＤＮＡ－ＰＫに依存する。切断部位がＴＮＲに隣接している場合、Ｃ－ＮＨＥＪは、両方の二本鎖切断（ＤＳＢ）の再封止、ＴＮＲの保持、またはＴＮＲを含まないＤＮＡの末端の単一結合をもたらし、こうして切除することができる。ＤＮＡ－ＰＫの阻害により、末端切除を含むＭＲＥ１１－ＲＡＤ５０－ＮＢＳ１複合体（ＭＲＮ）による作用の機会が増加する。マイクロホモロジー検索はＭＭＥＪ経路の一部として行われ、これによりＴＮＲが切除された修復産物を得ることができる。
図６は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによる１つの部位での切断後の修復経路をより詳細に示している。Ｃ－ＮＨＥＪにより、二本鎖切断の再封止及び、場合によっては小さな挿入または欠失（インデル）の導入がもたらされ、ＴＮＲが完全にまたは実質的に維持される場合がある。ＤＮＡ－ＰＫの阻害により、ＭＲＥ１１－ＲＡＤ５０－ＮＢＳ１複合体（ＭＲＮ）による作用の機会が増加し、これには、末端切除及び潜在的なＣｔＩＰ刺激による５’切除及びＣＴＧ二次構造の切断が含まれる。マイクロホモロジー検索はＭＭＥＪ経路の一部として行われ、これによりＴＮＲが切除された修復産物を得ることができる。
本明細書で提供される方法及び組成物を使用して、トリヌクレオチドリピートまたは自己相補的配列を切除して、種々の障害に関連する遺伝子型を改善することができる。表１は、例示的な遺伝子、障害、及びトリヌクレオチドリピートに関する情報を提供する。
Figure 2022545921000001
Figure 2022545921000002
Figure 2022545921000003
Figure 2022545921000004
ＩＩＩ．トリヌクレオチドリピート及び自己相補的領域を切除する方法；治療方法
本開示は、トリヌクレオチドリピートまたは自己相補的領域を切除すること、及び／またはＤＮＡ中のトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療することに使用するための組成物、及び方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ（例えば、１対のｇＲＮＡ）またはｇＲＮＡをコードするベクターは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸と組み合わさって細胞に送達される。例示的なｇＲＮＡ、ベクター、及びＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、本明細書、例えば、要約及び組成物のセクションに記載されている。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を細胞に送達することをさらに含む。
ＤＮＡ中のトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＴＮＲにまたはその近くに誘導する、スペーサー配列もしくは１対のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡもしくは１対のガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡもしくは１対のガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び任意選択でｉｉｉ）ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３または化合物６である。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ中のトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＴＮＲにまたはその近くに誘導する、スペーサーもしくは１対のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡもしくは１対のガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡもしくは１対のガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）化合物３または化合物６であるＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含む、方法を提供する。
自己相補的領域を切除する方法であって、自己相補的領域を含む細胞に、ｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを自己相補的領域にまたはその近くに誘導する、スペーサーもしくは１対のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡもしくは１対のガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡもしくは１対のガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び任意選択でｉｉｉ）ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含み、自己相補的領域が切除される、方法もまた提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３または化合物６である。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ中のトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＴＮＲにまたはその近くに誘導する、スペーサーを含むガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び任意選択でｉｉｉ）ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含み、少なくとも１つのＴＮＲが切除される、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３または化合物６である。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ中の自己相補的領域を切除する方法及び／またはＴＮＲを切除する方法は、表１に提供される疾患または障害の治療のためのものである。
また、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるＴＮＲを含む細胞に、ｉ）配列番号１０１～４９８８のいずれか１つの配列を含むスペーサーを含むガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）任意選択でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含む、方法も提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３または化合物６である。
また、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるＴＮＲを含む細胞に、ｉ）配列番号４０１８、４０１０、４００２、４０４２、４０３４、４０２６、３９５４、３９４６、３９９４、３９１４、３９７８、３９０６、３８９８、３９３８、３９２２、３８５８、３８５０、３８８２、３８２６、３８１８、３８４２、３７９４、３７８６、３７６２、３８１０、３７４６、３７７８、３７３８、３７７０、３７２２、３７５４、３６９０、３６６６、３６５８、３６３４、３５８６、３５４６、３５３０、３６４２、３５１４、３５０６、３４９０、３６１８、３６１０、３６０２、３５７８、３４４２、３５２２、３４１０、３３７８、３４３４、３３７０、３４２６、３４１８、３３９４、３３８６、３３３０、３３５４、３３４６、３３１４、３９３０、３８９０、３８３４、３８０２、３７０６、３６９８、３６８２、３６７４、３５７０、３５５４、３５３８、３４９８、３４８２、３４５８、３４７４、３４５０、２６６７、２６６６、２６５０、２６４２、２６２６、２６１８、２７０６、２６９０、２６８２、２６１０、２６７４、２６５８、２６０２、２５９４、２６３４、２５５４、２５４６、２５８６、２５３８、２５７８、２５７０、２５２２、２４９８、２４９０、２４６６、２４５８、２４５０、２５１４、２５０６、２４１８、２４８２、２４７４、２３９４、２４４２、２４３４、２３７０、２３７８、２３５４、２３４６、２３３８、２３１４、２２９８、２２８２、２２７４、２２６６、２３３０、２２５８、２３２２、２２４２、２２３４、２２９０、２２５０、２２１８、２２２６、２２１０、２１９４、２１４６、２１３８、２１２２、２１０６、２０９８、２０９０、２１３０、２１１４、２０３４、２０２６、２０５８、２０５０、２０４２、１９１４、１７８６、１７７８、１７７０、１８４２、１７３８、１７０６、１６９０、１７４６、１７１４、１６５０、１６４２、１６１０、１５８６、１５６２、１５４６、１５７８、１５３８、１３７８、１３７０、１９２２、１８９８、１９０６、１７９４、１７６２、１６９８、１６７４、１７２２、１３６２、１４５０、２２０２、２１７８、２１７０、２１６２、２０１８、２０１０、１８９０、１９６２、１９４６、１８５０、１８１８、１６５８、１６３４、１６０２、１５５４、１４３４、１４２６、１３３８、１３４６、１９７８、１９９４、１９８６、１９７０、１９３８、１９３０、１８１０、１８３４、１８２６、１８０２、１６２６、１５９４、１５１４、１４９８、１４９０、１４８２、１４７４、１４５８、１４４２、１４１８、１４１０、１４０２、１３９４、もしくは１３８６、のいずれか１つの配列を含むスペーサーを含むガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）任意選択でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含む、方法も提供する。また、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）配列番号４０１８、４０１０、４００２、４０４２、４０３４、４０２６、３９５４、３９４６、３９９４、３９１４、３９７８、３９０６、３８９８、３９３８、３９２２、３８５８、３８５０、３８８２、３８２６、３８１８、３８４２、３７９４、３７８６、３７６２、３８１０、３７４６、３７７８、３７３８、３７７０、３７２２、３７５４、３６９０、３６６６、３６５８、３６３４、３５８６、３５４６、３５３０、３６４２、３５１４、３５０６、３４９０、３６１８、３６１０、３６０２、３５７８、３４４２、３５２２、３４１０、３３７８、３４３４、３３７０、３４２６、３４１８、３３９４、３３８６、３３３０、３３５４、３３４６、３３１４、３９３０、３８９０、３８３４、３８０２、３７０６、３６９８、３６８２、３６７４、３５７０、３５５４、３５３８、３４９８、３４８２、３４５８、３４７４、３４５０、２６６７、２６６６、２６５０、２６４２、２６２６、２６１８、２７０６、２６９０、２６８２、２６１０、２６７４、２６５８、２６０２、２５９４、２６３４、２５５４、２５４６、２５８６、２５３８、２５７８、２５７０、２５２２、２４９８、２４９０、２４６６、２４５８、２４５０、２５１４、２５０６、２４１８、２４８２、２４７４、２３９４、２４４２、２４３４、２３７０、２３７８、２３５４、２３４６、２３３８、２３１４、２２９８、２２８２、２２７４、２２６６、２３３０、２２５８、２３２２、２２４２、２２３４、２２９０、２２５０、２２１８、２２２６、２２１０、２１９４、２１４６、２１３８、２１２２、２１０６、２０９８、２０９０、２１３０、２１１４、２０３４、２０２６、２０５８、２０５０、２０４２、１９１４、１７８６、１７７８、１７７０、１８４２、１７３８、１７０６、１６９０、１７４６、１７１４、１６５０、１６４２、１６１０、１５８６、１５６２、１５４６、１５７８、１５３８、１３７８、１３７０、１９２２、１８９８、１９０６、１７９４、１７６２、１６９８、１６７４、１７２２、１３６２、１４５０、２２０２、２１７８、２１７０、２１６２、２０１８、２０１０、１８９０、１９６２、１９４６、１８５０、１８１８、１６５８、１６３４、１６０２、１５５４、１４３４、１４２６、１３３８、１３４６、１９７８、１９９４、１９８６、１９７０、１９３８、１９３０、１８１０、１８３４、１８２６、１８０２、１６２６、１５９４、１５１４、１４９８、１４９０、１４８２、１４７４、１４５８、１４４２、１４１８、１４１０、１４０２、１３９４、もしくは１３８６、のいずれか１つの配列を含むスペーサーを含むガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）任意選択でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含み、少なくとも１つのＴＮＲが切除される、方法も提供する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３３３０、３９１４、３４１８、３７４６、３７７８、３３９４、４０２６、３６９０、３７９４、３３８６、３９３８、３６８２、３８１８、３６５８、３７２２、３８０２、３８５８、３５１４、３７７０、３３７０、３３５４、４０１０、２２０２、１７０６、２２１０、２１７０、１７７８、２２５８、２１１４、２１７８、１６４２、１７３８、１７４６、２３２２、１７７０、１５３８、２５１４、２４５８、２１９４、２５９４、２１６２、または２６１８のいずれか１つの配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３７４６、３７７８、３３９４、３３８６、３９３８、３８１８、３７２２、３８５８、３３７０、１７０６、２２１０、２１１４、１５３８、または２５９４のいずれか１つの配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３３３０、３７４６、３７７８、３３９４、４０２６、３３８６、３９３８、３８１８、３７２２、３８０２、３８５８、３５１４、３７７０、３３７０、２２０２、１７０６、２２１０、１７７８、２１１４、１７３８、１７４６、２３２２、１５３８、２５１４、２４５８、２１９４、または２５９４のいずれか１つの配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３３３０、３９１４、３４１８、３７４６、３７７８、３３９４、４０２６、３６９０、３７９４、３３８６、３９３８、３６８２、３８１８、３６５８、または３７２２のいずれか１つの配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２０２、１７０６、２２１０、２１７０、１７７８、２２５８、２１１４、２１７８、１６４２、１７３８、１７４６、または２３２２のいずれか１つの配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３７７８、４０２６、３７９４、４０１０、３９０６、３７４６、１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、１９１４、または２２１０のいずれか１つの配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３３７８、３３５４、３３４６、３３３０、３３１４、２６５８、２６９０、２５４６、２５５４、２４９８、または２５０６のいずれか１つの配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３３３０、３３１４、２６５８、２６９０、２５５４、または２４９８のいずれか１つの配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３３１４、２６９０、２５５４、または２４９８のいずれか１つの配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３９１４、３５１４、１７７８、２４５８、３８５８、３４１８、１７０６、または２２５８のいずれか１つの配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３９１６、３４２０、または３９４０のいずれか１つの配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３９１４を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３４１８を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３９３８を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物６である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３である。
また、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるＴＮＲを含む細胞に、ｉ）配列番号５００１～７２６４のいずれか１つの配列を含むスペーサーを含むガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）任意選択でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含む、方法も提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３または化合物６である。
また、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）配列番号５２６２、５７８２、５８３０、５９２６、５９５０、５９９８、６０２２、５３１０、及び５３３４のいずれか１つの配列を含むスペーサーを含むガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）任意選択でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含む、方法も提供する。また、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）配列番号５２６２、５７８２、５８３０、５９２６、５９５０、５９９８、６０２２、５３１０、及び５３３４のいずれか１つの配列を含むスペーサーを含むガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）任意選択でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含み、少なくとも１つのＴＮＲが切除される、方法も提供する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号５８３０、６０２２、５２６２、または５３１０のいずれか１つの配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号５２６２、５３３４、及び５８３０のいずれか１つの配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号５２６４、５３３６、５８３２、６０２４、または５３１２のいずれか１つの配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号５２６２を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号５２６４を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物６である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３である。
また、ＦＸＮ遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、ＦＸＮ遺伝子の５’ＵＴＲにおけるＴＮＲを含む細胞に、ｉ）配列番号７３０１～５３３７２のいずれか１つの配列を含むスペーサーを含むガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）任意選択でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含む、方法も提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３または化合物６である。
また、ＦＸＮ遺伝子のイントロンにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）配列番号２８１３０、３４４４２、４５９０６、２６５６２、５２６６６、５１３２２、４６５９９、５２８９８、２６５４６、７４４７、４７０４７、４９９８６、５１７６２、５１７５４、５２２９０、５２２９８、５１４７４、５２３０６、５０６８２、５１７０６、５２０９８、５０７１４、５１４９８、５２４９８、５０９７８、５１７４６、５２１０６、５１５０６、５０６７４、５２０８２、５２５０６、５０５３８、５２０６６、５２３８６、５２０９０、５２２６６、５２４７４、５２２５８、５２４３４、５０７０６、５１４９０、５２４５８、５１４６６、５２３５４、５１９１４、５１３６２、５１０５８、５０１７０、５１９５４、５２２５０、５１９３０、５１６８２、５２５９４、５２６１０、５１１６２、４９１６２、５０８９８、４９２２６、５１６５８、５２５５４、５２６３４、５１３９４、４９０３４、５２５４６、５２５２２、５２６１８、５２５３０、２８３２２、２６５３０、２６５７８、２６６０２、２６６３４、２６６２６、２６６９８、２６７４６、２６７５４、２６７８６、２６８８２、２７７２２、２７７３０、２７７３８、２７７７０、２７７５４、２７７６２、２７８０２、２７８５０、２７８４２、２７９２２、２７９４６、２７９８６、２８１１４、２８１２２、２８１４６、２８１８６、２８１９４、２８３３８、２８３４６、２８３２２、２８３７８、２８３７０、２８４５８、２８５０６、２８６３４、２８６４２、２８６５０、３４４４２、または４５９０６のいずれか１つの配列を含むスペーサーを含むガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）任意選択でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含む、方法も提供する。また、ＦＸＮ遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）配列番号２８１３０、３４４４２、４５９０６、２６５６２、５２６６６、５１３２２、４６５９９、５２８９８、２６５４６、７４４７、４７０４７、４９９８６、５１７６２、５１７５４、５２２９０、５２２９８、５１４７４、５２３０６、５０６８２、５１７０６、５２０９８、５０７１４、５１４９８、５２４９８、５０９７８、５１７４６、５２１０６、５１５０６、５０６７４、５２０８２、５２５０６、５０５３８、５２０６６、５２３８６、５２０９０、５２２６６、５２４７４、５２２５８、５２４３４、５０７０６、５１４９０、５２４５８、５１４６６、５２３５４、５１９１４、５１３６２、５１０５８、５０１７０、５１９５４、５２２５０、５１９３０、５１６８２、５２５９４、５２６１０、５１１６２、４９１６２、５０８９８、４９２２６、５１６５８、５２５５４、５２６３４、５１３９４、４９０３４、５２５４６、５２５２２、５２６１８、５２５３０、２８３２２、２６５３０、２６５７８、２６６０２、２６６３４、２６６２６、２６６９８、２６７４６、２６７５４、２６７８６、２６８８２、２７７２２、２７７３０、２７７３８、２７７７０、２７７５４、２７７６２、２７８０２、２７８５０、２７８４２、２７９２２、２７９４６、２７９８６、２８１１４、２８１２２、２８１４６、２８１８６、２８１９４、２８３３８、２８３４６、２８３２２、２８３７８、２８３７０、２８４５８、２８５０６、２８６３４、２８６４２、２８６５０、３４４４２、または４５９０６のいずれか１つの配列を含むスペーサーを含むガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）任意選択でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含み、少なくとも１つのＴＮＲが切除される、方法も提供する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号５１７０６、５１０５８、５１７５４、５２０９０、５２５９４、５２０９８、５２２９８、５２１０６、５１６８２、５２０６６、５２３５４、５２４５８、５２２９０、５２４９８、５１６５８、５１９３０、５１１６２、５２５０６、５１７６２、５１７４６、５２３８６、５２２５８、５２５３０、５２６３４、２７８５０、２８６３４、２６８８２、２８６５０、２８３７０、２８１９４、２６６２６、２６６３４、２６７８６、２６７５４、２７７７０、２６５７８、２８１３０、２７７３８、２８３３８、２８６４２、２６６０２、２７７５４、２７７３０、及び２８１２２のいずれか１つの配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号４７０４７、７４４７、７４６３、４６９６７、４６７６８、７６８０、及び４７０３２のいずれか１つの配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号４７０４５、７４４５、７４６１、４６７６６、７６７８、及び４７０３０のいずれか１つの配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物６である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３である。
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、１つのｇＲＮＡのみまたは１つのｇＲＮＡのみをコードするベクターが提供または送達される、すなわち、この方法は、ＴＮＲまたは自己相補的領域の近くで切断を促進する２つ以上のガイドを提供することを伴わない。
いくつかの実施形態において、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患を治療するための方法であって、１つのガイドＲＮＡのみ、またはガイドＲＮＡをコードするベクターを投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、１つのガイドＲＮＡのみ、またはガイドＲＮＡをコードするベクターを投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、１つのｇＲＮＡのみを投与するための方法であって、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲのＣＴＧリピートが切除される、方法が提供される。１つのｇＲＮＡのみであり、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲのＣＴＧリピートが切除されるいくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３７４６、３７７８、３３９４、３３８６、３９３８、３８１８、３７２２、３８５８、３３７０、１７０６、２２１０、２１１４、１５３８、及び２５９４から選択される配列を含むスペーサー配列を含む。１つのｇＲＮＡのみであり、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲのＣＴＧリピートが切除されるいくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３３３０、３７４６、３７７８、３３９４、４０２６、３３８６、３９３８、３８１８、３７２２、３８０２、３８５８、３５１４、３７７０、３３７０、２２０２、１７０６、２２１０、１７７８、２１１４、１７３８、１７４６、２３２２、１５３８、２５１４、２４５８、２１９４、及び２５９４から選択される配列を含むスペーサー配列を含む。１つのｇＲＮＡのみであり、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲのＣＴＧリピートが切除されるいくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３３３０、３３１４、２６５８、２６９０、２５５４、及び２４９８から選択される配列を含むスペーサー配列を含む。１つのｇＲＮＡのみであり、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲのＣＴＧリピートが切除されるいくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３３１４、２６９０、２５５４、及び２４９８から選択される配列を含むスペーサー配列を含む。１つのｇＲＮＡのみであり、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲのＣＴＧリピートが切除されるいくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３９１４、３５１４、１７７８、２４５８、３８５８、３４１８、１７０６、及び２２５８から選択される配列を含むスペーサー配列を含む。１つのｇＲＮＡのみであり、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲのＣＴＧリピートが切除されるいくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３９１４、３４１８、または３９３８から選択される配列を含むスペーサー配列を含む。１つのｇＲＮＡのみであり、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲのＣＴＧリピートが切除されるいくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３９１６、３４２０、または３９４０から選択される配列を含むスペーサー配列を含む。１つのｇＲＮＡのみであり、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲのＣＴＧリピートが切除されるいくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３９１４の配列を含む。１つのｇＲＮＡのみであり、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲのＣＴＧリピートが切除されるいくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３４１８の配列を含む。１つのｇＲＮＡのみであり、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲのＣＴＧリピートが切除されるいくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３９３８の配列を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物６である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３である。
いくつかの実施形態において、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患を治療するための方法であって、１つのガイドＲＮＡのみ、またはガイドＲＮＡをコードするベクターを投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、１つのガイドＲＮＡのみ、またはガイドＲＮＡをコードするベクターを投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、１つのｇＲＮＡのみを投与するための方法であって、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるＴＮＲが切除される、方法が提供される。１つのｇＲＮＡのみであり、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるＴＮＲが切除されるいくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号５８３０、６０２２、５２６２、及び５３１０から選択される配列を含むスペーサー配列を含む。１つのｇＲＮＡのみであり、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるＴＮＲが切除されるいくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号５２６２、５３３４、及び５８３０から選択される配列を含むスペーサー配列を含む。１つのｇＲＮＡのみであり、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるＴＮＲが切除されるいくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号５２６４、５３３６、５８３２、６０２４、または５３１２から選択される配列を含むスペーサー配列を含む。１つのｇＲＮＡのみであり、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるＴＮＲが切除されるいくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号５２６２の配列を含む。１つのｇＲＮＡのみであり、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるＴＮＲが切除されるいくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号５２６４の配列を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物６である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３である。
いくつかの実施形態において、ＦＸＮ遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患を治療するための方法であって、１つのガイドＲＮＡのみ、またはガイドＲＮＡをコードするベクターを投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＦＸＮ遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、１つのガイドＲＮＡのみ、またはガイドＲＮＡをコードするベクターを投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、１つのｇＲＮＡのみを投与するための方法であって、ＦＸＮ遺伝子の５’ＵＴＲにおけるＴＮＲが切除される、方法が提供される。１つのｇＲＮＡのみであり、ＦＸＮ遺伝子の５’ＵＴＲにおけるＴＮＲが切除されるいくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号４７０４７、７４４７、７４６３、４６９６７、４６７６８、７６８０、及び４７０３２から選択される配列を含むスペーサー配列を含む。１つのｇＲＮＡのみであり、ＦＸＮ遺伝子の５’ＵＴＲにおけるＴＮＲが切除されるいくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号４７０４５、７４４５、７４６１、４６７６６、７６７８、及び４７０３０から選択される配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物６である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３である。
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＴＮＲにまたはＴＮＲの近くに送達する、第１及び第２のスペーサーを含む１対のガイドＲＮＡ、または１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸が細胞に提供または送達される。例えば、ＴＮＲがＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにある場合、第１及び第２のスペーサーは、以下の対の配列番号２２０２及び３４１８；２２０２及び３３７０；２２０２及び３５１４；２２０２及び３６５８；２１７８及び３４１８；２１７８及び３３７０；２１７８及び３５１４；２１７８及び３６５８；２１７０及び３４１８；２１７０及び３３７０；２１７０及び３５１４；２１７０及び３６５８；２１６２及び３４１８；２１６２及び３３７０；２１６２及び３５１４；２１６２及び３６５８；２２０２及び４０１０；２２０２及び４０２６；２２０２及び３９１４；２２０２及び３９３８；２２０２及び３８５８；２２０２及び３８１８；２２０２及び３７９４；２２０２及び３８０２；２２０２及び３７４６；２２０２及び３７７８；２２０２及び３７７０；２２０２及び３７２２；２２０２及び３６９０；２２０２及び３６８２；２２０２及び３３３０；２２０２及び３３５４；２２０２及び３３９４；２２０２及び３３８６；２１７８及び４０１０；２１７８及び４０２６；２１７８及び３９１４；２１７８及び３９３８；２１７８及び３８５８；２１７８及び３８１８；２１７８及び３７９４；２１７８及び３８０２；２１７８及び３７４６；２１７８及び３７７８；２１７８及び３７７０；２１７８及び３７２２；２１７８及び３６９０；２１７８及び３６８２；２１７８及び３３３０；２１７８及び３３５４；２１７８及び３３９４；２１７８及び３３８６；２１７０及び４０１０；２１７０及び４０２６；２１７０及び３９１４；２１７０及び３９３８；２１７０及び３８５８；２１７０及び３８１８；２１７０及び３７９４；２１７０及び３８０２；２１７０及び３７４６；２１７０及び３７７８；２１７０及び３７７０；２１７０及び３７２２；２１７０及び３６９０；２１７０及び３６８２；２１７０及び３３３０；２１７０及び３３５４；２１７０及び３３９４；２１７０及び３３８６；２１６２及び４０１０；２１６２及び４０２６；２１６２及び３９１４；２１６２及び３９３８；２１６２及び３８５８；２１６２及び３８１８；２１６２及び３７９４；２１６２及び３８０２；２１６２及び３７４６；２１６２及び３７７８；２１６２及び３７７０；２１６２及び３７２２；２１６２及び３６９０；２１６２及び３６８２；２１６２及び３３３０；２１６２及び３３５４；２１６２及び３３９４；２１６２及び３３８６；１７０６及び３４１８；１７０６及び３３７０；１７０６及び３５１４；１７０６及び３６５８；１７０６及び４０１０；１７０６及び４０２６；１７０６及び３９１４；１７０６及び３９３８；１７０６及び３８５８；１７０６及び３８１８；１７０６及び３７９４；１７０６及び３８０２；１７０６及び３７４６；１７０６及び３７７８；１７０６及び３７７０；１７０６及び３７２２；１７０６及び３６９０；１７０６及び３６８２；１７０６及び３３３０；１７０６及び３３５４；１７０６及び３３９４；１７０６及び３３８６；２２１０及び３４１８；２２１０及び３３７０；２２１０及び３５１４；２２１０及び３６５８；２２１０及び４０１０；２２１０及び４０２６；２２１０及び３９１４；２２１０及び３９３８；２２１０及び３８５８；２２１０及び３８１８；２２１０及び３７９４；２２１０及び３８０２；２２１０及び３７４６；２２１０及び３７７８；２２１０及び３７７０；２２１０及び３７２２；２２１０及び３６９０；２２１０及び３６８２；２２１０及び３３３０；２２１０及び３３５４；２２１０及び３３９４；２２１０及び３３８６；１７７８及び３４１８；１７７８及び３３７０；１７７８及び３５１４；１７７８及び３６５８；１７７８及び４０１０；１７７８及び４０２６；１７７８及び３９１４；１７７８及び３９３８；１７７８及び３８５８；１７７８及び３８１８；１７７８及び３７９４；１７７８及び３８０２；１７７８及び３７４６；１７７８及び３７７８；１７７８及び３７７０；１７７８及び３７２２；１７７８及び３６９０；１７７８及び３６８２；１７７８及び３３３０；１７７８及び３３５４；１７７８及び３３９４；１７７８及び３３８６；２２５８及び３４１８；２２５８及び３３７０；２２５８及び３５１４；２２５８及び３６５８；２２５８及び４０１０；２２５８及び４０２６；２２５８及び３９１４；２２５８及び３９３８；２２５８及び３８５８；２２５８及び３８１８；２２５８及び３７９４；２２５８及び３８０２；２２５８及び３７４６；２２５８及び３７７８；２２５８及び３７７０；２２５８及び３７２２；２２５８及び３６９０；２２５８及び３６８２；２２５８及び３３３０；２２５８及び３３５４；２２５８及び３３９４；２２５８及び３３８６；２１１４及び３４１８；２１１４及び３３７０；２１１４及び３５１４；２１１４及び３６５８；２１１４及び４０１０；２１１４及び４０２６；２１１４及び３９１４；２１１４及び３９３８；２１１４及び３８５８；２１１４及び３８１８；２１１４及び３７９４；２１１４及び３８０２；２１１４及び３７４６；２１１４及び３７７８；２１１４及び３７７０；２１１４及び３７２２；２１１４及び３６９０；２１１４及び３６８２；２１１４及び３３３０；２１１４及び３３５４；２１１４及び３３９４；２１１４及び３３８６；１６４２及び３４１８；１６４２及び３３７０；１６４２及び３５１４；１６４２及び３６５８；１６４２及び４０１０；１６４２及び４０２６；１６４２及び３９１４；１６４２及び３９３８；１６４２及び３８５８；１６４２及び３８１８；１６４２及び３７９４；１６４２及び３８０２；１６４２及び３７４６；１６４２及び３７７８；１６４２及び３７７０；１６４２及び３７２２；１６４２及び３６９０；１６４２及び３６８２；１６４２及び３３３０；１６４２及び３３５４；１６４２及び３３９４；１６４２及び３３８６；１７３８及び３４１８；１７３８及び３３７０；１７３８及び３５１４；１７３８及び３６５８；１７３８及び４０１０；１７３８及び４０２６；１７３８及び３９１４；１７３８及び３９３８；１７３８及び３８５８；１７３８及び３８１８；１７３８及び３７９４；１７３８及び３８０２；１７３８及び３７４６；１７３８及び３７７８；１７３８及び３７７０；１７３８及び３７２２；１７３８及び３６９０；１７３８及び３６８２；１７３８及び３３３０；１７３８及び３３５４；１７３８及び３３９４；１７３８及び３３８６；２２５８及び３４１８；２２５８及び３３７０；２２５８及び３５１４；２２５８及び３６５８；２２５８及び４０１０；２２５８及び４０２６；２２５８及び３９１４；２２５８及び３９３８；２２５８及び３８５８；２２５８及び３８１８；２２５８及び３７９４；２２５８及び３８０２；２２５８及び３７４６；２２５８及び３７７８；２２５８及び３７７０；２２５８及び３７２２；２２５８及び３６９０；２２５８及び３６８２；２２５８及び３３３０；２２５８及び３３５４；２２５８及び３３９４；２２５８及び３３８６；２１１４及び３４１８；２１１４及び３３７０；２１１４及び３５１４；２１１４及び３６５８；２１１４及び４０１０；２１１４及び４０２６；２１１４及び３９１４；２１１４及び３９３８；２１１４及び３８５８；２１１４及び３８１８；２１１４及び３７９４；２１１４及び３８０２；２１１４及び３７４６；２１１４及び３７７８；２１１４及び３７７０；２１１４及び３７２２；２１１４及び３６９０；２１１４及び３６８２；２１１４及び３３３０；２１１４及び３３５４；２１１４及び３３９４；１７０６及び３３８６；１６４２及び３４１８；１６４２及び３３７０；１６４２及び３５１４；１６４２及び３６５８；１６４２及び４０１０；１６４２及び４０２６；１６４２及び３９１４；１６４２及び３９３８；１６４２及び３８５８；１６４２及び３８１８；１６４２及び３７９４；１６４２及び３８０２；１６４２及び３７４６；１６４２及び３７７８；１６４２及び３７７０；１６４２及び３７２２；１６４２及び３６９０；１６４２及び３６８２；１６４２及び３３３０；１６４２及び３３５４；１６４２及び３３９４；１６４２及び３３８６；１７３８及び３４１８；１７３８及び３３７０；１７３８及び３５１４；１７３８及び３６５８；１７３８及び４０１０；１７３８及び４０２６；１７３８及び３９１４；１７３８及び３９３８；１７３８及び３８５８；１７３８及び３８１８；１７３８及び３７９４；１７３８及び３８０２；１７３８及び３７４６；１７３８及び３７７８；１７３８及び３７７０；１７３８及び３７２２；１７３８及び３６９０；１７３８及び３６８２；１７３８及び３３３０；１７３８及び３３５４；１７３８及び３３９４；１７３８及び３３８６；１７４６及び３４１８；１７４６及び３３７０；１７４６及び３５１４；１７４６及び３６５８；１７４６及び４０１０；１７４６及び４０２６；１７４６及び３９１４；１７４６及び３９３８；１７４６及び３８５８；１７４６及び３８１８；１７４６及び３７９４；１７４６及び３８０２；１７４６及び３７４６；１７４６及び３７７８；１７４６及び３７７０；１７４６及び３７２２；１７４６及び３６９０；１７４６及び３６８２；１７４６及び３３３０；１７４６及び３３５４；１７４６及び３３９４；１７４６及び３３８６；２３２２及び３４１８；２３２２及び３３７０；２３２２及び３５１４；２３２２及び３６５８；２３２２及び４０１０；２３２２及び４０２６；２３２２及び３９１４；２３２２及び３９３８；２３２２及び３８５８；２３２２及び３８１８；２３２２及び３７９４；２３２２及び３８０２；２３２２及び３７４６；２３２２及び３７７８；２３２２及び３７７０；２３２２及び３７２２；２３２２及び３６９０；２３２２及び３６８２；２３２２及び３３３０；２３２２及び３３５４；２３２２及び３３９４；２３２２及び３３８６；１７７０及び３４１８；１７７０及び３３７０；１７７０及び３５１４；１７７０及び３６５８；１７７０及び４０１０；１７７０及び４０２６；１７７０及び３９１４；１７７０及び３９３８；１７７０及び３８５８；１７７０及び３８１８；１７７０及び３７９４；１７７０及び３８０２；１７７０及び３７４６；１７７０及び３７７８；１７７０及び３７７０；１７７０及び３７２２；１７７０及び３６９０；１７７０及び３６８２；１７７０及び３３３０；１７７０及び３３５４；１７７０及び３３９４；１７７０及び３３８６；１５３８及び３４１８；１５３８及び３３７０；１５３８及び３５１４；１５３８及び３６５８；１５３８及び４０１０；１５３８及び４０２６；１５３８及び３９１４；１５３８及び３９３８；１５３８及び３８５８；１５３８及び３８１８；１５３８及び３７９４；１５３８及び３８０２；１５３８及び３７４６；１５３８及び３７７８；１５３８及び３７７０；１５３８及び３７２２；１５３８及び３６９０；１５３８及び３６８２；１５３８及び３３３０；１５３８及び３３５４；１５３８及び３３９４；１５３８及び３３８６；２５１４及び３４１８；２５１４及び３３７０；２５１４及び３５１４；２５１４及び３６５８；２５１４及び４０１０；２５１４及び４０２６；２５１４及び３９１４；２５１４及び３９３８；２５１４及び３８５８；２５１４及び３８１８；２５１４及び３７９４；２５１４及び３８０２；２５１４及び３７４６；２５１４及び３７７８；２５１４及び３７７０；２５１４及び３７２２；２５１４及び３６９０；２５１４及び３６８２；２５１４及び３３３０；２５１４及び３３５４；２５１４及び３３９４；２５１４及び３３８６；２４５８及び３４１８；２４５８及び３３７０；２４５８及び３５１４；２４５８及び３６５８；２４５８及び４０１０；２４５８及び４０２６；２４５８及び３９１４；２４５８及び３９３８；２４５８及び３８５８；２４５８及び


３８１８；２４５８及び３７９４；２４５８及び３８０２；２４５８及び３７４６；２４５８及び３７７８；２４５８及び３７７０；２４５８及び３７２２；２４５８及び３６９０；２４５８及び３６８２；２４５８及び３３３０；２４５８及び３３５４；２４５８及び３３９４；２４５８及び３３８６；２１９４及び３４１８；２１９４及び３３７０；２１９４及び３５１４；２１９４及び３６５８；２１９４及び４０１０；２１９４及び４０２６；２１９４及び３９１４；２１９４及び３９３８；２１９４及び３８５８；２１９４及び３８１８；２１９４及び３７９４；２１９４及び３８０２；２１９４及び３７４６；２１９４及び３７７８；２１９４及び３７７０；２１９４及び３７２２；２１９４及び３６９０；２１９４及び３６８２；２１９４及び３３３０；２１９４及び３３５４；２１９４及び３３９４；２１９４及び３３８６；２５９４及び３４１８；２５９４及び３３７０；２５９４及び３５１４；２５９４及び３６５８；２５９４及び４０１０；２５９４及び４０２６；２５９４及び３９１４；２５９４及び３９３８；２５９４及び３８５８；２５９４及び３８１８；２５９４及び３７９４；２５９４及び３８０２；２５９４及び３７４６；２５９４及び３７７８；２５９４及び３７７０；２５９４及び３７２２；２５９４及び３６９０；２５９４及び３６８２；２５９４及び３３３０；２５９４及び３３５４；２５９４及び３３９４；２５９４及び３３８６；２６１８及び３４１８；２６１８及び３３７０；２６１８及び３５１４；２６１８及び３６５８；２６１８及び４０１０；２６１８及び４０２６；２６１８及び３９１４；２６１８及び３９３８；２６１８及び３８５８；２６１８及び３８１８；２６１８及び３７９４；２６１８及び３８０２；２６１８及び３７４６；２６１８及び３７７８；２６１８及び３７７０；２６１８及び３７２２；２６１８及び３６９０；２６１８及び３６８２；２６１８及び３３３０；２６１８及び３３５４；２６１８及び３３９４；ならびに２６１８及び３３８６のいずれか１つの配列を有し得る。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物６である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３である。
さらなる例では、ＴＮＲがＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにある場合、第１及び第２のスペーサーは、以下の対の配列番号５７８２及び５２６２；５８３０及び５２６２；５９２６及び５２６２；５９５０及び５２６２；ならびに５９９８及び５２６２のいずれか１つの配列を有し得る。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物６である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３である。
ＴＮＲがＦＸＮ遺伝子のイントロンにあるさらなる例では、第１及び第２のスペーサーは、以下の対の配列番号４７０４７及び７４４７；７４６３及び４６９６７；４６７６８及び７６８０；４７０３２及び７４４７のいずれか１つの配列を有し得る。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物６である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３である。
いくつかの実施形態において、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患を治療する方法であって、第１及び第２のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、第１及び第２のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの対は、配列番号２２０２及び３４１８；２２０２及び３３７０；２２０２及び３５１４；２２０２及び３６５８；２１７８及び３４１８；２１７８及び３３７０；２１７８及び３５１４；２１７８及び３６５８；２１７０及び３４１８；２１７０及び３３７０；２１７０及び３５１４；２１７０及び３６５８；２１６２及び３４１８；２１６２及び３３７０；２１６２及び３５１４；２１６２及び３６５８；２２０２及び４０１０；２２０２及び４０２６；２２０２及び３９１４；２２０２及び３９３８；２２０２及び３８５８；２２０２及び３８１８；２２０２及び３７９４；２２０２及び３８０２；２２０２及び３７４６；２２０２及び３７７８；２２０２及び３７７０；２２０２及び３７２２；２２０２及び３６９０；２２０２及び３６８２；２２０２及び３３３０；２２０２及び３３５４；２２０２及び３３９４；２２０２及び３３８６；２１７８及び４０１０；２１７８及び４０２６；２１７８及び３９１４；２１７８及び３９３８；２１７８及び３８５８；２１７８及び３８１８；２１７８及び３７９４；２１７８及び３８０２；２１７８及び３７４６；２１７８及び３７７８；２１７８及び３７７０；２１７８及び３７２２；２１７８及び３６９０；２１７８及び３６８２；２１７８及び３３３０；２１７８及び３３５４；２１７８及び３３９４；２１７８及び３３８６；２１７０及び４０１０；２１７０及び４０２６；２１７０及び３９１４；２１７０及び３９３８；２１７０及び３８５８；２１７０及び３８１８；２１７０及び３７９４；２１７０及び３８０２；２１７０及び３７４６；２１７０及び３７７８；２１７０及び３７７０；２１７０及び３７２２；２１７０及び３６９０；２１７０及び３６８２；２１７０及び３３３０；２１７０及び３３５４；２１７０及び３３９４；２１７０及び３３８６；２１６２及び４０１０；２１６２及び４０２６；２１６２及び３９１４；２１６２及び３９３８；２１６２及び３８５８；２１６２及び３８１８；２１６２及び３７９４；２１６２及び３８０２；２１６２及び３７４６；２１６２及び３７７８；２１６２及び３７７０；２１６２及び３７２２；２１６２及び３６９０；２１６２及び３６８２；２１６２及び３３３０；２１６２及び３３５４；２１６２及び３３９４；２１６２及び３３８６；１７０６及び３４１８；１７０６及び３３７０；１７０６及び３５１４；１７０６及び３６５８；１７０６及び４０１０；１７０６及び４０２６；１７０６及び３９１４；１７０６及び３９３８；１７０６及び３８５８；１７０６及び３８１８；１７０６及び３７９４；１７０６及び３８０２；１７０６及び３７４６；１７０６及び３７７８；１７０６及び３７７０；１７０６及び３７２２；１７０６及び３６９０；１７０６及び３６８２；１７０６及び３３３０；１７０６及び３３５４；１７０６及び３３９４；１７０６及び３３８６；２２１０及び３４１８；２２１０及び３３７０；２２１０及び３５１４；２２１０及び３６５８；２２１０及び４０１０；２２１０及び４０２６；２２１０及び３９１４；２２１０及び３９３８；２２１０及び３８５８；２２１０及び３８１８；２２１０及び３７９４；２２１０及び３８０２；２２１０及び３７４６；２２１０及び３７７８；２２１０及び３７７０；２２１０及び３７２２；２２１０及び３６９０；２２１０及び３６８２；２２１０及び３３３０；２２１０及び３３５４；２２１０及び３３９４；２２１０及び３３８６；１７７８及び３４１８；１７７８及び３３７０；１７７８及び３５１４；１７７８及び３６５８；１７７８及び４０１０；１７７８及び４０２６；１７７８及び３９１４；１７７８及び３９３８；１７７８及び３８５８；１７７８及び３８１８；１７７８及び３７９４；１７７８及び３８０２；１７７８及び３７４６；１７７８及び３７７８；１７７８及び３７７０；１７７８及び３７２２；１７７８及び３６９０；１７７８及び３６８２；１７７８及び３３３０；１７７８及び３３５４；１７７８及び３３９４；１７７８及び３３８６；２２５８及び３４１８；２２５８及び３３７０；２２５８及び３５１４；２２５８及び３６５８；２２５８及び４０１０；２２５８及び４０２６；２２５８及び３９１４；２２５８及び３９３８；２２５８及び３８５８；２２５８及び３８１８；２２５８及び３７９４；２２５８及び３８０２；２２５８及び３７４６；２２５８及び３７７８；２２５８及び３７７０；２２５８及び３７２２；２２５８及び３６９０；２２５８及び３６８２；２２５８及び３３３０；２２５８及び３３５４；２２５８及び３３９４；２２５８及び３３８６；２１１４及び３４１８；２１１４及び３３７０；２１１４及び３５１４；２１１４及び３６５８；２１１４及び４０１０；２１１４及び４０２６；２１１４及び３９１４；２１１４及び３９３８；２１１４及び３８５８；２１１４及び３８１８；２１１４及び３７９４；２１１４及び３８０２；２１１４及び３７４６；２１１４及び３７７８；２１１４及び３７７０；２１１４及び３７２２；２１１４及び３６９０；２１１４及び３６８２；２１１４及び３３３０；２１１４及び３３５４；２１１４及び３３９４；２１１４及び３３８６；１６４２及び３４１８；１６４２及び３３７０；１６４２及び３５１４；１６４２及び３６５８；１６４２及び４０１０；１６４２及び４０２６；１６４２及び３９１４；１６４２及び３９３８；１６４２及び３８５８；１６４２及び３８１８；１６４２及び３７９４；１６４２及び３８０２；１６４２及び３７４６；１６４２及び３７７８；１６４２及び３７７０；１６４２及び３７２２；１６４２及び３６９０；１６４２及び３６８２；１６４２及び３３３０；１６４２及び３３５４；１６４２及び３３９４；１６４２及び３３８６；１７３８及び３４１８；１７３８及び３３７０；１７３８及び３５１４；１７３８及び３６５８；１７３８及び４０１０；１７３８及び４０２６；１７３８及び３９１４；１７３８及び３９３８；１７３８及び３８５８；１７３８及び３８１８；１７３８及び３７９４；１７３８及び３８０２；１７３８及び３７４６；１７３８及び３７７８；１７３８及び３７７０；１７３８及び３７２２；１７３８及び３６９０；１７３８及び３６８２；１７３８及び３３３０；１７３８及び３３５４；１７３８及び３３９４；１７３８及び３３８６；２２５８及び３４１８；２２５８及び３３７０；２２５８及び３５１４；２２５８及び３６５８；２２５８及び４０１０；２２５８及び４０２６；２２５８及び３９１４；２２５８及び３９３８；２２５８及び３８５８；２２５８及び３８１８；２２５８及び３７９４；２２５８及び３８０２；２２５８及び３７４６；２２５８及び３７７８；２２５８及び３７７０；２２５８及び３７２２；２２５８及び３６９０；２２５８及び３６８２；２２５８及び３３３０；２２５８及び３３５４；２２５８及び３３９４；２２５８及び３３８６；２１１４及び３４１８；２１１４及び３３７０；２１１４及び３５１４；２１１４及び３６５８；２１１４及び４０１０；２１１４及び４０２６；２１１４及び３９１４；２１１４及び３９３８；２１１４及び３８５８；２１１４及び３８１８；２１１４及び３７９４；２１１４及び３８０２；２１１４及び３７４６；２１１４及び３７７８；２１１４及び３７７０；２１１４及び３７２２；２１１４及び３６９０；２１１４及び３６８２；２１１４及び３３３０；２１１４及び３３５４；２１１４及び３３９４；１７０６及び３３８６；１６４２及び３４１８；１６４２及び３３７０；１６４２及び３５１４；１６４２及び３６５８；１６４２及び４０１０；１６４２及び４０２６；１６４２及び３９１４；１６４２及び３９３８；１６４２及び３８５８；１６４２及び３８１８；１６４２及び３７９４；１６４２及び３８０２；１６４２及び３７４６；１６４２及び３７７８；１６４２及び３７７０；１６４２及び３７２２；１６４２及び３６９０；１６４２及び３６８２；１６４２及び３３３０；１６４２及び３３５４；１６４２及び３３９４；１６４２及び３３８６；１７３８及び３４１８；１７３８及び３３７０；１７３８及び３５１４；１７３８及び３６５８；１７３８及び４０１０；１７３８及び４０２６；１７３８及び３９１４；１７３８及び３９３８；１７３８及び３８５８；１７３８及び３８１８；１７３８及び３７９４；１７３８及び３８０２；１７３８及び３７４６；１７３８及び３７７８；１７３８及び３７７０；１７３８及び３７２２；１７３８及び３６９０；１７３８及び３６８２；１７３８及び３３３０；１７３８及び３３５４；１７３８及び３３９４；１７３８及び３３８６；１７４６及び３４１８；１７４６及び３３７０；１７４６及び３５１４；１７４６及び３６５８；１７４６及び４０１０；１７４６及び４０２６；１７４６及び３９１４；１７４６及び３９３８；１７４６及び３８５８；１７４６及び３８１８；１７４６及び３７９４；１７４６及び３８０２；１７４６及び３７４６；１７４６及び３７７８；１７４６及び３７７０；１７４６及び３７２２；１７４６及び３６９０；１７４６及び３６８２；１７４６及び３３３０；１７４６及び３３５４；１７４６及び３３９４；１７４６及び３３８６；２３２２及び３４１８；２３２２及び３３７０；２３２２及び３５１４；２３２２及び３６５８；２３２２及び４０１０；２３２２及び４０２６；２３２２及び３９１４；２３２２及び３９３８；２３２２及び３８５８；２３２２及び３８１８；２３２２及び３７９４；２３２２及び３８０２；２３２２及び３７４６；２３２２及び３７７８；２３２２及び３７７０；２３２２及び３７２２；２３２２及び３６９０；２３２２及び３６８２；２３２２及び３３３０；２３２２及び３３５４；２３２２及び３３９４；２３２２及び３３８６；１７７０及び３４１８；１７７０及び３３７０；１７７０及び３５１４；１７７０及び３６５８；１７７０及び４０１０；１７７０及び４０２６；１７７０及び３９１４；１７７０及び３９３８；１７７０及び３８５８；１７７０及び３８１８；１７７０及び３７９４；１７７０及び３８０２；１７７０及び３７４６；１７７０及び３７７８；１７７０及び３７７０；１７７０及び３７２２；１７７０及び３６９０；１７７０及び３６８２；１７７０及び３３３０；１７７０及び３３５４；１７７０及び３３９４；１７７０及び３３８６；１５３８及び３４１８；１５３８及び３３７０；１５３８及び３５１４；１５３８及び３６５８；１５３８及び４０１０；１５３８及び４０２６；１５３８及び３９１４；１５３８及び３９３８；１５３８及び３８５８；１５３８及び３８１８；１５３８及び３７９４；１５３８及び３８０２；１５３８及び３７４６；１５３８及び３７７８；１５３８及び３７７０；１５３８及び３７２２；１５３８及び３６９０；１５３８及び３６８２；１５３８及び３３３０；１５３８及び３３５４；１５３８及び３３９４；１５３８及び３３８６；２５１４及び３４１８；２５１４及び３３７０；２５１４及び３５１４；２５１４及び３６５８；２５１４及び４０１０；２５１４及び４０２６；２５１４及び３９１４；２５１４及び３９３８；２５１４及び３８５８；２５１４及び３８１８；２５１４及び３７９４；２５１４及び３８０２；２５１４及び３７４６；２５１４及び３７７８；２５１４及び３７７０；２５１４及び３７２２；２５１４及び３６９０；２５１４及び３６８２；２５１４及び３３３０；２５１


４及び３３５４；２５１４及び３３９４；２５１４及び３３８６；２４５８及び３４１８；２４５８及び３３７０；２４５８及び３５１４；２４５８及び３６５８；２４５８及び４０１０；２４５８及び４０２６；２４５８及び３９１４；２４５８及び３９３８；２４５８及び３８５８；２４５８及び３８１８；２４５８及び３７９４；２４５８及び３８０２；２４５８及び３７４６；２４５８及び３７７８；２４５８及び３７７０；２４５８及び３７２２；２４５８及び３６９０；２４５８及び３６８２；２４５８及び３３３０；２４５８及び３３５４；２４５８及び３３９４；２４５８及び３３８６；２１９４及び３４１８；２１９４及び３３７０；２１９４及び３５１４；２１９４及び３６５８；２１９４及び４０１０；２１９４及び４０２６；２１９４及び３９１４；２１９４及び３９３８；２１９４及び３８５８；２１９４及び３８１８；２１９４及び３７９４；２１９４及び３８０２；２１９４及び３７４６；２１９４及び３７７８；２１９４及び３７７０；２１９４及び３７２２；２１９４及び３６９０；２１９４及び３６８２；２１９４及び３３３０；２１９４及び３３５４；２１９４及び３３９４；２１９４及び３３８６；２５９４及び３４１８；２５９４及び３３７０；２５９４及び３５１４；２５９４及び３６５８；２５９４及び４０１０；２５９４及び４０２６；２５９４及び３９１４；２５９４及び３９３８；２５９４及び３８５８；２５９４及び３８１８；２５９４及び３７９４；２５９４及び３８０２；２５９４及び３７４６；２５９４及び３７７８；２５９４及び３７７０；２５９４及び３７２２；２５９４及び３６９０；２５９４及び３６８２；２５９４及び３３３０；２５９４及び３３５４；２５９４及び３３９４；２５９４及び３３８６；２６１８及び３４１８；２６１８及び３３７０；２６１８及び３５１４；２６１８及び３６５８；２６１８及び４０１０；２６１８及び４０２６；２６１８及び３９１４；２６１８及び３９３８；２６１８及び３８５８；２６１８及び３８１８；２６１８及び３７９４；２６１８及び３８０２；２６１８及び３７４６；２６１８及び３７７８；２６１８及び３７７０；２６１８及び３７２２；２６１８及び３６９０；２６１８及び３６８２；２６１８及び３３３０；２６１８及び３３５４；２６１８及び３３９４；ならびに２６１８及び３３８６から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの対は、配列番号２２０２及び３４１８；２２０２及び３３７０；２２０２及び３５１４；２２０２及び３６５８；２１７８及び３４１８；２１７８及び３３７０；２１７８及び３５１４；２１７８及び３６５８；２１７０及び３４１８；２１７０及び３３７０；２１７０及び３５１４；２１７０及び３６５８；２１６２及び３４１８；２１６２及び３３７０；２１６２及び３５１４；２１６２及び３６５８；２２０２及び４０１０；２２０２及び４０２６；２２０２及び３９１４；２２０２及び３９３８；２２０２及び３８５８；２２０２及び３８１８；２２０２及び３７９４；２２０２及び３８０２；２２０２及び３７４６；２２０２及び３７７８；２２０２及び３７７０；２２０２及び３７２２；２２０２及び３６９０；２２０２及び３６８２；２２０２及び３３３０；２２０２及び３３５４；２２０２及び３３９４；２２０２及び３３８６；２１７８及び４０１０；２１７８及び４０２６；２１７８及び３９１４；２１７８及び３９３８；２１７８及び３８５８；２１７８及び３８１８；２１７８及び３７９４；２１７８及び３８０２；２１７８及び３７４６；２１７８及び３７７８；２１７８及び３７７０；２１７８及び３７２２；２１７８及び３６９０；２１７８及び３６８２；２１７８及び３３３０；２１７８及び３３５４；２１７８及び３３９４；２１７８及び３３８６；２１７０及び４０１０；２１７０及び４０２６；２１７０及び３９１４；２１７０及び３９３８；２１７０及び３８５８；２１７０及び３８１８；２１７０及び３７９４；２１７０及び３８０２；２１７０及び３７４６；２１７０及び３７７８；２１７０及び３７７０；２１７０及び３７２２；２１７０及び３６９０；２１７０及び３６８２；２１７０及び３３３０；２１７０及び３３５４；２１７０及び３３９４；２１７０及び３３８６；２１６２及び４０１０；２１６２及び４０２６；２１６２及び３９１４；２１６２及び３９３８；２１６２及び３８５８；２１６２及び３８１８；２１６２及び３７９４；２１６２及び３８０２；２１６２及び３７４６；２１６２及び３７７８；２１６２及び３７７０；２１６２及び３７２２；２１６２及び３６９０；２１６２及び３６８２；２１６２及び３３３０；２１６２及び３３５４；２１６２及び３３９４；２１６２及び３３８６から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの対は、配列番号２２０２及び３４１８；２２０２及び３３７０；２２０２及び３５１４；２２０２及び３６５８；２１７８及び３４１８；２１７８及び３３７０；２１７８及び３５１４；２１７８及び３６５８；２１７０及び３４１８；２１７０及び３３７０；２１７０及び３５１４；２１７０及び３６５８；２１６２及び３４１８；２１６２及び３３７０；２１６２及び３５１４；ならびに２１６２及び３６５８から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの対は、配列番号３７７８及び２５１４；３７７８及び２２５８；３７７８及び２２１０；３３８６及び２５１４；３３８６及び２２５８；３３８６及び２２１０；３３５４及び２５１４；３３５４及び２２５８；ならびに３３５４及び２２１０から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの対は、配列番号３７７８及び２２５８；３７７８及び２２１０；３３８６及び２２５８；３３８６及び２２１０；ならびに３３５４及び２５１４から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの対は、配列番号３３４６及び２５５４；３３４６及び２４９８；３３３０及び２５５４；３３３０及び２４９８；３３３０及び２５０６；ならびに３３３０及び２５４６から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの対は、配列番号３３４６及び２５５４；３３４６及び２４９８；３３３０及び２５５４；３３３０及び２４９８；３３５４及び２５４６；３３５４及び２５０６；３３７８及び２５４６；３３７８及び２５０６から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号３３４６及び２５５４；３３４６及び２４９８；３３３０及び２５５４；ならびに３３３０及び２４９８から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの対は、配列番号１１５３及び１１２９を含む第１及び第２のスペーサーを含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの対は、第１及び第２のスペーサー配列を含み、この１対のスペーサー配列は、配列番号２８５６、２８６４、２８８０、２８９６、２９０４、２９１２、２９３６、２９４４、２９６０、２９９２、３０１６、３０２４、３０６４、３０９６、３１１２、３１２８、３１３６、３１４４、３１６０、３１６８、３１９２、３２００、３２０８、３２１６、３２２４、３２３２、３２４０、３２４８、３２５６、３２６４、３３１４、３３３０、３３４６、３３５４、３３７０、３３７８、３３８６、３３９４、３４１０、３４１８、３４２６、３４３４、３４４２、３４５０、３４５８、３４７４、３４８２、３４９０、３４９８、３５０６、３５１４、３５２２、３５３０、３５３８、３５４６、３５５４、３５７０、３５７８、３５８６、３６０２、３６１０、３６１８、３６３４、３６４２、３６５８、３６７４、３６８２、３６９０、３６９８、３７０６、３７２２、３７４６、３７６２、３７７０、３７７８、３７９４、３８０２、３８１８、３８２６、３８３４、３８５０、３８５８、３８９０、３８９８、３９０６、３９１４、３９２２、３９３０、３９３８、３９４６、３９９４、４０１０、４０１８、４０２６、４０３４、４０４２、４２０８、または４５０６から選択される第１のスペーサー配列、及び配列番号５６０、５８４、６０８、６１６、６５６、６７２、６８８、６９６、７１２、７４４、７５２、７６０、８４０、８６４、９６０、９７６、９８４、１００８、１０５６、１１２８、１１３６、１１５２、１２２４、１２４０、１２７２、１３３８、１３４６、１３７０、１３７８、１３８６、１３９４、１４０２、１４１０、１４１８、１４２６、１４３４、１４４２、１４５８、１４７４、１４８２、１４９０、１４９８、１５１４、１５３８、１５４６、１５５４、１５６２、１５７８、１５８６、１５９４、１６０２、１６１０、１６２６、１６３４、１６４２、１６５０、１６５８、１６９０、１７０６、１７１４、１７３８、１７４６、１７７０、１７７８、１７８６、１８０２、１８１０、１８１８、１８２６、１８３４、１８４２、１８５０、１８９０、１９１４、１９３０、１９３８、１９４６、１９６２、１９７０、１９７８、１９８６、１９９４、２０１０、２０１８、２０２６、２０４２、２０５０、２０５８、２０９０、２１１４、２１３０、２１６２、２１７０、２１７８、２２０２、２２１０、２２２６、２２４２、２２５８、２２６６、２２７４、２２８２、２２９８、２３１４、２３２２、２３３０、２３３８、２３４６、２３５４、２３７０、２３７８、２３９４、２４１８、２４３４、２４４２、２４５８、２４６６、２４７４、２４９８、２５０６、２５１４、２５２２、２５４６、２５５４、２５７０、２５８６、２６５８、４９８９、４９９０、４９９１、または４９９２から選択される第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの対は、第１及び第２のスペーサー配列を含み、この１対のスペーサー配列は、配列番号３７７８、４０２６、３７９４、４０１０、３９０６及び３７４６から選択される第１のスペーサー配列、ならびに配列番号１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、１９１４、及び２２１０から選択される第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの対は、第１及び第２のスペーサー配列を含み、この１対のスペーサー配列は、配列番号３７７８及び１７７８；３７７８及び１７４６；３７７８及び１７７０；３７７８及び１５８６；３７７８及び１９１４；３７７８及び２２１０；４０２６及び１７７８；４０２６及び１７４６；４０２６及び１７７０；４０２６及び１５８６；４０２６及び１９１４；４０２６及び２２１０；３７９４及び１７７８；３７９４及び１７４６；３７９４及び１７７０；３７９４及び１５８６；３７９４及び１５８６；３７９４及び１９１４；３７９４及び２２１０；４０１０及び１７７８；４０１０及び１７７０；４０１０及び１７４６；４０１０及び１５８６；４０１０及び１９１４；４０１０及び２２１０；３９０６及び１７７８；３９０６及び１７７８；３９０６及び１７４６；３９０６及び１７７０；３９０６及び１５８６；３９０６及び１９１４；３９０６及び２２１０；３７４６及び１７７８；３７４６及び１７４６；３７４６及び１７７０；３７４６及び１５８６；３７４６及び１９１４；ならびに３７４６及び２２１０から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの対は、第１及び第２のスペーサー配列を含み、この１対のスペーサー配列は、配列番号３２５６、２８９６、３１３６、及び３２２４から選択される第１のスペーサー配列、ならびに配列番号４９８９、５６０、６７２、９７６、７６０、９８４、及び６１６から選択される第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの対は、第１及び第２のスペーサー配列を含み、この１対のスペーサー配列は、配列番号３２５６及び４９８９；３２５６及び９８４；３２５６及び６１６；２８９６及び４９


８９；２８９６及び６７２；２８９６及び７６０；３１３６及び４９８９；３１３６及び５６０；３２２４及び４９８９；３２２４及び９７６；ならびに３２２４及び７６０から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物６である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３である。
いくつかの実施形態において、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患を治療する方法であって、第１及び第２のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、第１及び第２のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの対は、配列番号５７８２及び５２６２；５８３０及び５２６２；５９２６及び５２６２；５９５０及び５２６２；ならびに５９９８及び５２６２から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの対は、配列番号５８３０及び５２６２；ならびに６０２２及び５３１０から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの対は、配列番号５３３４及び５８３０を含む第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物６である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３である。
いくつかの実施形態において、ＦＸＮ遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患を治療する方法であって、第１及び第２のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＦＸＮ遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、第１及び第２のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの対は、配列番号４７０４７及び７４４７；７４６３及び４６９６７；４６７６８及び７６８０；４７０３２及び７４４７から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの対は、配列番号４７０４７及び７４４７を含む第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの対は、配列番号５２８９８及び３６５４６を含む第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物６である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３である。
いくつかの実施形態において、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡを投与することを含み、第１のスペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを、配列の第１のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導し、ここで、第１のストレッチは、ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｕ２９切断部位の１ヌクレオチドから開始し、リピートまで続く。いくつかの実施形態において、第１のストレッチは、ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｕ３０切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｕ５６切断部位の１ヌクレオチド前まで続く。いくつかの実施形態において、第１のストレッチは、ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｕ３０切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｕ５２切断部位の１ヌクレオチド前まで続く。いくつかの実施形態において、第１のストレッチは、配列番号５３４１３である。いくつかの実施形態において、第１のストレッチは、配列番号５３４１４である。いくつかの実施形態において、第１のストレッチは、配列番号５３４１５である。
いくつかの実施形態において、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡを投与することを含み、第２のスペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを、配列の第２のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導し、ここで、第２のストレッチは、ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｄ１５切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｄ５１切断部位の１ヌクレオチド前まで続く。いくつかの実施形態において、第２のストレッチは、ｓｐＣａｓ９でＤＭＰＫ－Ｄ３５切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｄ５１切断部位の１ヌクレオチド前まで続く。いくつかの実施形態において、第２のストレッチは、配列番号５３４１６である。いくつかの実施形態において、第２のストレッチは、配列番号５３４１７である。
いくつかの実施形態において、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡを投与することを含み、第１のスペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを、配列の第１のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導し、第２のスペーサー配列は、配列の第２のストレッチ内の任意のヌクレオチドにＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを誘導する。いくつかの実施形態において、第１のストレッチは、ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｕ２９切断部位の１ヌクレオチドから開始し、リピートまで続く。いくつかの実施形態において、第１のストレッチは、ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｕ３０切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｕ５６切断部位の１ヌクレオチド前まで続く。いくつかの実施形態において、第１のストレッチは、ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｕ３０切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｕ５２切断部位の１ヌクレオチド前まで続く。いくつかの実施形態において、第１のストレッチは、配列番号５３４１３である。いくつかの実施形態において、第１のストレッチは、配列番号５３４１４である。いくつかの実施形態において、第１のストレッチは、配列番号５３４１５である。いくつかの実施形態において、第２のストレッチは、ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｄ１５切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｄ５１切断部位の１ヌクレオチド前まで続く。いくつかの実施形態において、第２のストレッチは、ｓｐＣａｓ９でＤＭＰＫ－Ｄ３５切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｄ５１切断部位の１ヌクレオチド前まで続く。いくつかの実施形態において、第２のストレッチは、配列番号５３４１６である。いくつかの実施形態において、第２のストレッチは、配列番号５３４１７である。いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物６である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３である。
いくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ、またはＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する（ｓｐＣａｓ９）。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに由来する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１である。
前述の方法のいずれか及び本明細書に記載のその他の方法は、上記のセクション、以下の考察、及び実施例を含む、本明細書に記載の追加の特徴のいずれかと実行可能な程度で組み合わせることができる。
いくつかの実施形態において、１つ以上のｇＲＮＡは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを、ＴＮＲまたは自己相補的領域内またはその近くの部位に誘導する。例えば、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを、ＴＮＲまたは自己相補的領域の１０、２０、３０、４０、または５０ヌクレオチド内で切断するように誘導することができる。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを、ＴＮＲまたは自己相補的領域に隣接する（すなわち、その反対側にある）１対の部位に誘導する、少なくとも１対のｇＲＮＡが提供される。例えば、ＴＮＲまたは自己相補的領域に隣接する対の部位は、それぞれ、ＴＮＲまたは自己相補的領域の１０、２０、３０、４０、または５０ヌクレオチド内であるが、それらの反対側にあり得る。
本明細書に開示される方法でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が使用される場合、それは、当技術分野で知られている任意のＤＮＡ－ＰＫ阻害剤であり得る。ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、例えば、ＷＯ２０１４／１５９６９０；ＷＯ２０１３／１６３１９０；ＷＯ２０１８／０１３８４０；ＷＯ２０１９／１４３６７５；ＷＯ２０１９／１４３６７７；ＷＯ２０１９／１４３６７８；及びＲｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （２０１５） ７：９３、で詳細に議論されており、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、ＮＵ７４４１、ＫＵ－００６０６４８、または化合物１、２、３、４、５、もしくは６（以下に示す構造）のいずれか１つであり、これらのそれぞれは、前述の引用の少なくとも１つに記載されている。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物６である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物３である。例示的なＤＮＡ－ＰＫ阻害剤の構造は、表１Ａにおいて以下のとおりである。特に明記しない限り、名称または構造によるＤＮＡ－ＰＫ阻害剤への言及は、その薬学的に許容される塩を包含する。
Figure 2022545921000005
Figure 2022545921000006
ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が使用される前述の実施形態のいずれかにおいて、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、切除を促進するために、１つのｇＲＮＡのみと、または１つのｇＲＮＡのみをコードするベクターと組み合わせて使用することができる、すなわち、この方法は、ＴＮＲまたは自己相補的領域の近くで切断を促進する２つ以上のガイドを提供することを必ずしも伴わない。
いくつかの実施形態において、トリヌクレオチドリピートまたは自己相補的領域は、トリヌクレオチドリピート伸長障害であり得るリピート伸長障害などの障害に関連する遺伝子座または遺伝子から切除される。リピート伸長障害とは、罹患していない個体が正常範囲内のリピート数を含む対立遺伝子を有し、障害を有するか障害のリスクがある個体は、正常範囲に比べてより増加した範囲のリピート数を含む１つまたは２つの対立遺伝子を有する障害である。例示的なリピート伸長障害は、表１に列挙され、記載されている。いくつかの実施形態において、リピート伸長障害は、表１に列挙された障害のいずれか１つである。いくつかの実施形態において、リピート伸長障害は、ＤＭ１である。いくつかの実施形態において、リピート伸長障害は、ＨＤである。いくつかの実施形態において、リピート伸長障害は、ＦＸＳである。いくつかの実施形態において、リピート伸長障害は、脊髄小脳失調症である。いくつかの実施形態において、トリヌクレオチドリピートが切除される遺伝子座または遺伝子は、表１に列挙された遺伝子である。いくつかの実施形態において、トリヌクレオチドリピートが切除される遺伝子座または遺伝子は、ＤＭＰＫである。いくつかの実施形態において、トリヌクレオチドリピートが切除される遺伝子座または遺伝子は、ＨＴＴである。いくつかの実施形態において、トリヌクレオチドリピートが切除される遺伝子座または遺伝子は、フラタキシンである。いくつかの実施形態において、トリヌクレオチドリピートが切除される遺伝子座または遺伝子は、ＦＭＲ１である。いくつかの実施形態において、トリヌクレオチドリピートが切除される遺伝子座または遺伝子は、アタキシンである。いくつかの実施形態において、トリヌクレオチドリピートが切除される遺伝子座または遺伝子は、あるタイプの脊髄小脳失調症に関連する遺伝子である。
切除されるリピートの数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、もしくは１０，０００、または前述の数値のいずれか２つで囲まれた範囲（両端を含む）、または上記の概要に列挙されている範囲のいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、切除されるリピートの数は、例えば、病理学的、前変異、リスクのある、または中間の範囲として、表１に列挙された範囲内にある。
いくつかの実施形態において、リピートもしくは自己相補的領域の切除により、リピートもしくは自己相補的領域に関連するか、またはリピートもしくは自己相補的領域に関連する障害に関連する少なくとも１つの表現型もしくは症状を改善する。これには、リピートもしくは自己相補的領域を包含するかまたはその近くの遺伝子の異常な発現の改善、またはリピートもしくは自己相補的領域を包含する遺伝子によってコードされる遺伝子産物（非コードＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはポリペプチド）の異常な活性の改善が含まれ得る。
例えば、ＴＮＲがＤＭＰＫ遺伝子内にある場合、ＴＮＲの切除により、伸長リピートＤＭＰＫ遺伝子に関連する１つ以上の表現型、例えば、筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ活性の増加；ホスホレンマン、ジヒドロピリジン受容体、ミオジェニン、Ｌ型カルシウムチャネルベータサブユニット、及び／またはミオシンホスファターゼ標的化サブユニットのリン酸化の増加；ミオシンホスファターゼの阻害の増加；及び／または筋肉喪失、筋衰弱、過眠症、１つ以上の実行機能障害、インスリン抵抗性、白内障形成、禿毛、または男性不妊症または受精能低下の改善、のうちの１つ以上など、が改善される。
ＴＮＲがＨＴＴ遺伝子内にある場合、ＴＮＲの切除により、伸長リピートＨＴＴ遺伝子に関連する１つ以上の表現型、例えば、線条体ニューロン喪失、不随意運動、易刺激性、うつ病、小不随意運動、協調性の欠如、新しい情報の学習や意思決定の困難、歩行、発話、及び／または嚥下の困難、及び／または思考及び／または推論能力の低下、のうちの１つ以上など、が改善される。
ＴＮＲがＦＭＲ１遺伝子内にある場合、ＴＮＲの切除により、伸長リピートＦＭＲ１遺伝子に関連する１つ以上の表現型、例えば、異常なＦＭＲ１転写物または脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質レベル、通常ＦＭＲＰに関連するｍＲＮＡの翻訳調節不全、ホスホコフィリン（ＣＦＬ１）のレベルの低下、ホスホコフィリンホスファターゼＰＰＰ２ＣＡのレベルの上昇、神経シナプスへのｍＲＮＡ輸送の低下、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０、及び／またはＣＲＹＡＢの発現の増加、ラミンＡ／Ｃアイソフォームの異常な細胞分布、４０歳未満の閉経などの早期発症閉経、卵巣の発達または機能の欠陥、血清ゴナドトロピン（例えばＦＳＨ）のレベルの上昇、進行性意図振戦、パーキンソニズム、認知機能低下、全身性脳萎縮、インポテンス、及び／または発達遅延、のうちの１つ以上など、が改善される。
ＴＮＲがＦＭＲ２遺伝子内またはＦＭＲ２の５’ＵＴＲに隣接している場合、ＴＮＲの切除により、ＦＭＲ２遺伝子内またはＦＭＲ２遺伝子に隣接している伸長リピートに関連する１つ以上の表現型、例えば、異常なＦＭＲ２発現、発達遅延、アイコンタクト不良、言語の反復使用、及びハンドフラッピング、のうちの１つ以上など、が改善される。
ＴＮＲがＡＲ遺伝子内にある場合、ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＲ遺伝子に関連する１つ以上の表現型、例えば、異常なＡＲ発現、アンドロゲン受容体タンパク質のＣ末端短縮化断片の生成；カスパーゼ－３及び／またはユビキチン－プロテアソーム経路を介したアンドロゲン受容体タンパク質のタンパク質分解；ＣＲＥＢ結合タンパク質を含む核内封入体の形成；ｐ４４／４２、ｐ３８、及び／またはＳＡＰＫ／ＪＮＫの異常なリン酸化；筋衰弱；筋消耗；歩行、嚥下、及び／または発話の困難；女性化乳房；及び／または男性不妊症、のうちの１つ以上など、が改善される。
ＴＮＲがＡＴＸＮ１遺伝子内にある場合、ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ１遺伝子に関連する１つ以上の表現型、例えば、ＡＴＸＮ１を含む凝集体の形成；プルキンエ細胞死；運動失調；筋肉のこわばり；急速な、不随意の眼球運動；手足のしびれ、うずき、または疼痛；及び／または筋肉の痙攣、のうちの１つ以上など、が改善される。
ＴＮＲがＡＴＸＮ２遺伝子内にある場合、ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ２遺伝子に関連する１つ以上の表現型、例えば、異常なＡＴＸＮ２産生；プルキンエ細胞死；運動失調；発話もしくは嚥下の困難；手足の感覚喪失及び脱力；認知症；筋消耗；制御不良の筋緊張；及び／または不随意の筋反射運動、のうちの１つ以上など、が改善される。
ＴＮＲがＡＴＸＮ３遺伝子内にある場合、ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ３遺伝子に関連する１つ以上の表現型、例えば、異常なＡＴＸＮ３レベル；異常なベクリン－１レベル；オートファジーの阻害；スーパーオキシドジスムターゼ２の調節障害；運動失調；嚥下困難；手足の感覚喪失及び脱力；認知症；筋肉のこわばり；制御不良の筋緊張；振戦；レストレスレッグス症候群；及び／または筋肉の痙攣、のうちの１つ以上など、が改善される。
ＴＮＲがＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子内にある場合、ＴＮＲの切除により、伸長リピートＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子に関連する１つ以上の表現型、例えば、ＣＡＣＮＡ１Ａ発現細胞における異常なＣａＶ２．１電位依存性カルシウムチャネル；運動失調；発話困難；不随意の眼球運動；複視；腕協調運動の喪失；振戦；及び／または制御不良の筋緊張、のうちの１つ以上など、が改善される。
ＴＮＲがＡＴＸＮ７遺伝子内にある場合、ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ７遺伝子に関連する１つ以上の表現型、例えば、異常なヒストンアセチル化；異常なヒストン脱ユビキチン化；ＣＲＸによるトランス活性化の障害；ＡＴＸＮ７を含む核内封入体の形成；運動失調；歩行の協調運動障害；手、発話及び／または眼球運動の不十分な協調；網膜変性；及び／または色素性黄斑ジストロフィー、のうちの１つ以上など、が改善される。
ＴＮＲがＡＴＸＮ８ＯＳ遺伝子内にある場合、ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ８ＯＳ遺伝子に関連する１つ以上の表現型、例えば、ＡＴＸＮ８ＯＳ ｍＲＮＡを含むリボ核封入体の形成；異常なＫＬＨＬ１タンパク質発現；運動失調；発話及び／または歩行困難；及び／または不随意の眼球運動、のうちの１つ以上など、が改善される。
ＴＮＲがＰＰＰ２Ｒ２Ｂ遺伝子内にある場合、ＴＮＲの切除により、伸長リピートＰＰＰ２Ｒ２Ｂ遺伝子に関連する１つ以上の表現型、例えば、異常なＰＰＰ２Ｒ２Ｂ発現；異常なホスファターゼ２活性；運動失調；小脳変性；歩行困難；及び／または手、発話及び／または眼球運動の不十分な協調、のうちの１つ以上など、が改善される。
ＴＮＲがＴＢＰ遺伝子内にある場合、ＴＮＲの切除により、伸長リピートＴＢＰ遺伝子に関連する１つ以上の表現型、例えば、異常な転写開始；異常なＴＢＰタンパク質の蓄積（例えば、小脳ニューロンにおける）；異常な小脳ニューロン細胞死；運動失調；歩行困難；筋力低下；及び／または認知能力の喪失、のうちの１つ以上など、が改善される。
ＴＮＲがＡＴＮ１遺伝子内にある場合、ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＮ１遺伝子に関連する１つ以上の表現型、例えば、異常な転写調節；異常なＡＴＮ１タンパク質の蓄積（例えば、ニューロンにおける）；異常なニューロン細胞死；不随意運動；及び／または認知能力の喪失、のうちの１つ以上など、が改善される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｇＲＮＡ、ベクター、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、組成物、または医薬製剤のいずれか１つ以上は、本明細書に開示される方法において、あるいは対象における疾患もしくは障害を治療または予防するための医薬を調製する際に、使用するためのものである。いくつかの実施形態において、治療及び／または予防は、医薬／組成物の単回投与、例えば、１回の治療で達成される。
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載のｇＲＮＡ、ベクター、組成物、または医薬製剤のいずれか１つ以上を投与することを含む、対象における疾患または障害を治療または予防する方法を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｇＲＮＡ、ベクター、組成物、または医薬製剤は、単回用量として、例えば、一度に投与される。いくつかの実施形態において、単回投与により、持続的治療及び／または予防が達成される。いくつかの実施形態において、本方法により、持続的治療及び／または予防が達成される。本明細書で使用される持続的治療及び／または予防には、少なくともｉ）３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５週間；ｉｉ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４、３０、もしくは３６か月；またはｉｉｉ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０年延長する治療及び／または予防が含まれる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｇＲＮＡ、ベクター、組成物、または医薬製剤の単回投与は、対象の生涯にわたって本明細書に記載の適応症のいずれかを治療及び／または予防するのに十分である。
いくつかの実施形態において、ＴＮＲを切除する方法であって、配列番号１０１～４９８８、５００１～７２６４、または７３０１～５３３７２のうちの任意の１つ以上のガイド配列を含む、ガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡをコードするベクターを含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、配列番号１０１～４９８８、５００１～７２６４、または７３１０－５３３７２のガイド配列のうちの任意の１つ以上を含むｇＲＮＡを投与して、ＴＮＲを切除する。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）などのＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼ、またはＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）などのＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡまたはベクターと一緒に投与することができる。これらの方法のいずれも、例えば、本明細書に記載の方法のいずれかのように、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含み得る。
いくつかの実施形態において、ＴＮＲ関連疾患または障害を治療する方法であって、配列番号１０１～４９８８、５００１～７２６４、または７３０１～５３３７２のガイド配列のうちの任意の１つ以上を含むガイドＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）などのＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼ、またはＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）などのＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡまたはベクターと一緒に投与することができる。これらの方法のいずれも、例えば、本明細書に記載の方法のいずれかのように、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含み得る。
いくつかの実施形態において、伸長トリヌクレオチドリピートを含むｍＲＮＡの産生を低減または排除する方法であって、１０１～４９８８、５００１～７２６４、または７３０１～５３３７２のガイド配列のうちの任意の１つ以上を含むガイドＲＮＡを投与することを含む、方法が提供される。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）などのＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼ、またはＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）などのＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡまたはベクターと一緒に投与することができる。これらの方法のいずれも、例えば、本明細書に記載の方法のいずれかのように、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含み得る。
いくつかの実施形態において、伸長アミノ酸リピートを含むタンパク質の産生を低減または排除する方法であって、１０１～４９８８、５００１～７２６４、または７３０１～５３３７２のガイド配列のうちの任意の１つ以上を含むガイドＲＮＡを投与することを含む、方法が提供される。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）などのＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼ、またはＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）などのＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡまたはベクターと一緒に投与することができる。これらの方法のいずれも、例えば、本明細書に記載の方法のいずれかのように、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含み得る。
いくつかの実施形態において、配列番号１０１～４９８８、５００１～７２６４、または７３０１～５３３７２のガイド配列のうちの任意の１つ以上を含むｇＲＮＡを投与して、伸長アミノ酸リピートを含むポリペプチドの発現を低減する。ｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）などのＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼ、またはＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）などのＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡまたはベクターと一緒に投与することができる。これらの方法のいずれも、例えば、本明細書に記載の方法のいずれかのように、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含み得る。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼ及びなどのＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼ及びＤＮＡ－ＰＫ阻害剤と共に表２または配列表のガイド配列を含むｇＲＮＡは、ＤＳＢを誘導し、修復中にマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）により、標的遺伝子の変異がもたらされる。いくつかの実施形態において、ＭＭＥＪにより、トリヌクレオチドリピートまたは自己相補的配列の切除がもたらされる。
いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、ウシ、ブタ、サル、ヒツジ、イヌ、ネコ、魚、または家禽である。
いくつかの実施形態において、表２及び／または配列表におけるガイド配列の任意の１つ以上を含むガイドＲＮＡの使用（例えば、本明細書で提供される組成物における）が、ＤＭ１などの表１に列挙されている障害を有するヒト対象を治療するための医薬の調製のために提供される。そのような使用は、本明細書に記載されているもののいずれかなど、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤の投与と組み合わせてもよい。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ、組成物、及び製剤は、静脈内投与される。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ、組成物、及び製剤は、筋肉内投与される。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ、組成物、及び製剤は、頭蓋内投与される。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ、組成物、及び製剤は、エクスビボで細胞に投与される。ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が投与される場合、それは、ガイドＲＮＡを含む組成物と同じかまたは異なる組成物で投与してもよく、ガイドＲＮＡと同じかまたは異なる経路によって投与してもよい。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、静脈内投与され得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、経口投与され得る。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ、組成物、及び製剤は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤と同時に投与される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、それ自体の投薬スケジュールに従って投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるガイドＲＮＡを含む組成物の単回投与は、ＴＮＲまたは自己相補的領域を切除するのに十分である。他の実施形態において、本明細書で提供されるガイドＲＮＡを含む組成物の２回以上の投与は、治療効果を最大化するために有益であり得る。
併用療法
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載の方法のいずれか（例えば、表２及び／または配列表に開示されるガイド配列のいずれか１つ以上を含む１つ以上のｇＲＮＡ）（例えば、本明細書で提供される組成物における）と、上記のような、標的化遺伝子及び／またはその１つ以上の症状に関連する障害を改善するのに好適な追加の療法とを一緒に含む、併用療法を含む。表１に列挙されている障害などの種々の障害、及び／またはその１つ以上の症状の改善に使用するのに好適な追加の療法が、当技術分野で知られている。
ｇＲＮＡ組成物の送達
本明細書に開示される方法及び使用は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ及び組成物を送達するための任意の適切なアプローチを使用することができる。例示的な送達アプローチとしては、ウイルスベクターなどのベクター；脂質ナノ粒子；トランスフェクション；及びエレクトロポレーションが挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるｇＲＮＡに関連するベクターまたはＬＮＰは、疾患または障害を治療するための医薬を調製する際に使用するためのものである。
ベクターが使用される場合、それは、非組み込み型ウイルスベクターなどのウイルスベクターであり得る。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アルファウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ１０である（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ９，７９０，４７２の配列番号８１を参照のこと）、ＡＡＶｒｈ７４（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１５／０１１１９５５の配列番号１を参照のこと）、またはＡＡＶ９ベクターであり、ここで、ＡＡＶに続く番号は、ＡＡＶ血清型を示す。自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターなどのＡＡＶベクターまたはその血清型の任意のバリアントは、一般用語ＡＡＶベクター、ＡＡＶ１ベクターなどに含まれる。例えば、ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００１；８：１２４８－４， Ｎａｓｏ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２０１７；３１：３１７－３３４、及び種々のＡＡＶベクターの詳細な考察のためにそこに引用されている参考文献を参照のこと。
いくつかの実施形態において、ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクター）は、例えば、ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されている組織特異的（例えば、筋肉特異的）プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、筋肉特異的プロモーターは、筋肉クレアチンキナーゼプロモーター、デスミンプロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター、またはＳＰｃ５－１２プロモーターである。いくつかの実施形態において、筋肉特異的プロモーターは、ＣＫ８プロモーターである。いくつかの実施形態において、筋肉特異的プロモーターは、ＣＫ８ｅプロモーターである。筋肉特異的プロモーターは、例えば、ＵＳ２００４／０１７５７２７Ａ１；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． （２０１４） １１， ３４５－３６４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ （２００８） １５， １４８９－１４９９に詳細に記載されている。いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーターは、エノラーゼプロモーターなどのニューロン特異的プロモーターである。例えば、Ｎａｓｏ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２０１７；３１：３１７－３３４；Ｄａｓｈｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ． ２０１６；３：１６０８１、及びニューロン特異的プロモーターを含む組織特異的プロモーターの詳細な考察のためにそこに引用されている参考文献を参照のこと。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ配列に加えて、ベクターは、ガイドＲＮＡをコードしない核酸をさらに含む。ガイドＲＮＡをコードしない核酸としては、プロモーター、エンハンサー、調節配列、及びＣａｓ９などのヌクレアーゼであり得るＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼをコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ｓｇＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）、及びＣａｓ９またはＣｐｆ１などのＣａｓヌクレアーゼであり得るＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列、及びＣａｓ９またはＣａｓ９などのＣａｓタンパク質であり得るＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む。一実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９またはＳｐＣａｓ９）に由来する。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡであり得る）をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからのリピート配列のすべてまたは一部が隣接するガイド配列を含むかまたはそれからなる。ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡを含むかまたはそれらからなる核酸は、ベクター配列をさらに含み得、ここで、ベクター配列は、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡと一緒に天然に見出されない核酸を含むかまたはそれらからなる。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ヌクレオチド及びタンパク質カーゴを送達するための既知の手段であり、本明細書に開示されるガイドＲＮＡ、組成物、または医薬製剤の送達に使用することができる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、核酸、タンパク質、または核酸をタンパク質と一緒に送達する。
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に開示されるｇＲＮＡのいずれか１つを対象に送達するための方法であって、ｇＲＮＡが、ＬＮＰと会合している、方法を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ／ＬＮＰはまた、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡと会合している。
いくつかの実施形態において、本発明は、開示されたｇＲＮＡのいずれか１つ及びＬＮＰを含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡをさらに含む。
エレクトロポレーションは、カーゴを送達するための周知の手段であり、本明細書に開示されるｇＲＮＡのいずれか１つを送達するために、任意のエレクトロポレーション方法論を使用することができる。いくつかの実施形態において、エレクトロポレーションを使用して、本明細書に開示されるｇＲＮＡのいずれか１つ及びＣａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを送達することができる。
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に開示されるｇＲＮＡのいずれか１つをエクスビボ細胞に送達するための方法であって、ｇＲＮＡが、ベクターによってコードされる、ＬＮＰと会合している、または水溶液中にある、方法を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ／ＬＮＰまたはｇＲＮＡはまた、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードする配列に会合している（例えば、同じベクター、ＬＮＰ、または溶液中）。
ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を含むｇＲＮＡ組成物のスクリーニング
いくつかの実施形態において、ＴＮＲまたは自己相補的領域を切除することができるガイドＲＮＡをスクリーニングするための方法であって、ａ）細胞を、ガイドＲＮＡ、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ、及びＤＮＡ－ＰＫ阻害剤と接触させることと；ｂ）ステップａ）をＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を用いないで繰り返すことと；ｃ）ステップａ）で接触させた細胞からのＴＮＲまたは自己相補的領域の切除をステップｂ）で接触させた細胞と比較することと；ｄ）ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を用いない場合と比較して、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤の存在下で切除が改善されるガイドＲＮＡを選択することと、を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ中のＴＮＲまたは自己相補的領域を切除することができるガイドＲＮＡをスクリーニングするための方法であって、ａ）ｉ）細胞（筋芽細胞など）を、ガイドＲＮＡ、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ、及びＤＮＡ－ＰＫ阻害剤と接触させることと；ａ）ｉ）で使用されたものと同じタイプの細胞を、ガイドＲＮＡ、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼと、ただしＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を用いないで接触させることと；ｂ）ステップａ）ｉ）で接触させた細胞からのＤＮＡ中のＴＮＲまたは自己相補的領域の切除をステップａ）ｉｉ）で接触させた細胞と比較することと；ｃ）ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を用いない場合と比較して、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤の存在下で切除が改善されるガイドＲＮＡを選択することと、を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ中のＴＮＲまたは自己相補的領域を切除することができる１対のガイドＲＮＡをスクリーニングするための方法であって、ａ）細胞を、１対のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ、及びＤＮＡ－ＰＫ阻害剤と接触させることと；ｂ）ステップａ）をＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を用いないで繰り返すことと；ｃ）ステップａ）で接触させた細胞からのＤＮＡ中のＴＮＲまたは自己相補的領域の切除をステップｂ）で接触させた細胞と比較することと；ｄ）ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を用いない場合と比較して、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤の存在下で切除が改善される１対のガイドＲＮＡを選択することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ中のＴＮＲまたは自己相補的領域を切除することができる１対のガイドＲＮＡをスクリーニングするための方法であって、ａ）ｉ）細胞（筋芽細胞など）を、１対のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ、及びＤＮＡ－ＰＫ阻害剤と接触させることと；ａ）ｉ）で使用されたものと同じタイプの細胞を、１対のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼと、ただしＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を用いないで接触させることと；ｂ）ステップａ）ｉ）で接触させた細胞からのＤＮＡ中のＴＮＲまたは自己相補的領域の切除をステップａ）ｉｉ）で接触させた細胞と比較することと；ｃ）ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を用いない場合と比較して、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤の存在下で切除が改善される１対のガイドＲＮＡを選択することと、を含む、方法を提供する。
本明細書で使用される場合、「切除が改善される」または「切除の改善」は、ＤＮＡ中のＴＮＲまたは自己相補的領域のより大量の切除、及び／またはより所望の切除産物（例えば、欠失のサイズまたは位置に基づく）を指すことができる。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡによって、細胞のＤＮＡからのＤＮＡにおけるＴＮＲまたは自己相補的領域の切除が改善されたかどうかの判定は、ＤＮＡ中のＴＮＲまたは自己相補的領域を取り囲むＤＮＡの領域を増幅するように設計されたプライマーを使用する細胞のゲノムＤＮＡのＰＣＲによって行うことができる。ＰＣＲ産物を、ＤＮＡゲル電気泳動によって評価し、ＤＮＡ中のＴＮＲまたは自己相補的領域の切除について分析する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ中のＴＮＲまたは自己相補的領域の切除を、シーケンシング法（例えば、サンガーシーケンシング、ＰａｃＢｉｏシーケンシング）によって評価することができる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡにおけるＴＮＲまたは自己相補的領域の欠失パーセントを、ｄｄＰＣＲアッセイを使用して決定することができる（例えば、図５３を参照のこと）。いくつかの実施形態において、「切除が改善される」または「切除の改善」は、ＤＭＰＫの場合、ＣＵＧ増殖巣減少、ＭＢＮＬ１増殖巣減少などの細胞特徴、またはＭＢＮＬ１、ＮＣＯＲ２、ＦＮ１及び／またはＫＩＦ１３ＡのｍＲＮＡのスプライシング効率の改善を評価することによって判定される。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲに誘導する。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲに誘導する。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＦＸＮ遺伝子の５’ＵＴＲに誘導する。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、化合物６または化合物３である。いくつかの実施形態において、細胞は、野生型細胞、例えば、野生型ｉＰＳＣ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、疾患細胞、例えば、患者に由来する細胞、例えば、ＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞、ＤＭ１筋芽細胞、ＤＭ１線維芽細胞である。スクリーニングには、単一ガイド切除でのＤＮＡ－ＰＫ阻害の増強を評価するために、用量を増加させてＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を加えることを含めてもよい。スクリーニングには、対のガイド切除でのＤＮＡ－ＰＫ阻害の増強を評価するために、用量を増加させてＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を加えることを含めてもよい。
ＩＶ．組成物
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物
本明細書で提供されるのは、例えば、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）と共に、１つ以上のガイドＲＮＡまたは１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸を使用する、ＤＮＡのトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）または自己相補的領域に関連する疾患及び障害（例えば、表１の疾患及び障害）を治療するために、ならびにＤＮＡからトリヌクレオチドリピートまたは自己相補的領域を切除するために有用な組成物である。組成物は、ガイドＲＮＡ（複数可）またはガイドＲＮＡ（複数可）をコードするベクター（複数可）を含むことができ、トリヌクレオチドリピートまたは自己相補的領域に関連する疾患を有するかまたは有すると疑われる対象に投与することができ、さらに本明細書に記載されているもののいずれかなどのＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を含むか、またはそれと組み合わせて投与することができる。例示的なガイド配列は、表２及び配列番号１０１～４９８８、５００１～７２６４、または７３０１～５３３７２の配列表に示されている。
いくつかの実施形態において、１つ以上のｇＲＮＡは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを、ＴＮＲまたは自己相補的領域内またはその近くの部位に誘導する。例えば、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを、ＴＮＲまたは自己相補的領域の１０、２０、３０、４０、または５０ヌクレオチド内で切断するように誘導することができる。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを、ＴＮＲまたは自己相補的領域に隣接する（すなわち、その反対側にある）１対の部位に誘導する、少なくとも１対のｇＲＮＡが提供される。例えば、ＴＮＲまたは自己相補的領域に隣接する対の部位は、それぞれ、ＴＮＲまたは自己相補的領域の１０、２０、３０、４０、または５０ヌクレオチド内であるが、それらの反対側にあり得る。いくつかの実施形態において、表２及び／または配列表からのガイド配列を含み、前述の実施形態のいずれかに従って、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを１対の部位に誘導する１対のｇＲＮＡが提供される。
配列番号１０１～４９８８、５００１～７２６４、または７３０１～５３３７２で表２及び配列表に示されるガイド配列のそれぞれは、例えば、使用されているＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼに適した任意の既知の配列を使用する、ｃｒＲＮＡを形成またはコードするための追加のヌクレオチドをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡは、（５’から３’）少なくともスペーサー配列及び第１の相補性ドメインを含む。第１の相補的ドメインは、第２の相補性ドメインに十分に相補的であり、これは、ｓｇＲＮＡの場合は同じ分子の一部であり、デュアルまたはモジュラーｇＲＮＡの場合はｔｒａｃｒＲＮＡにあり、二重鎖を形成する。第１及び第２の相補性ドメインを含むｃｒＲＮＡ及びｇＲＮＡドメインの詳細な考察については、例えば、ＵＳ２０１７／０００７６７９を参照のこと。例えば、その３’末端でガイド配列に続くためにＳｐＣａｓ９と共に使用するのに好適な例示的な配列は、５’から３’方向のＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号９９）である。いくつかの実施形態において、ガイド配列の３’末端に続くためにＳｐＣａｓ９と共に使用するための例示的な配列は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列番号９９と同一である配列であるか、または１、２、３、４または５以下のヌクレオチドが配列番号９９と異なる配列である。ｔｒａｃｒＲＮＡが使用される場合、いくつかの実施形態において、それは、（５’から３’）第２の相補的ドメイン及び近位ドメインを含む。ｓｇＲＮＡの場合、上記のガイド配列は、例えば、使用されているＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼに適した任意の既知の配列を使用する、ｓｇＲＮＡを形成またはコード化するための追加のヌクレオチドをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、（５’から３’）少なくともスペーサー配列、第１の相補的ドメイン、連結ドメイン、第２の相補的ドメイン、及び近位ドメインを含む。ｓｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡは、テールドメインをさらに含み得る。連結ドメインは、ヘアピン形成であり得る。第２の相補性ドメイン、連結ドメイン、近位ドメイン、及びテールドメインなど、ｃｒＲＮＡ及びｇＲＮＡドメインの詳細な考察及び例については、例えばＵＳ２０１７／０００７６７９を参照のこと。例えば、ガイド配列の３’末端に続くためにＳｐＣａｓ９と共に使用するのに好適な例示的な配列は、５’から３’方向のＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号１００）である。いくつかの実施形態において、ガイド配列の３’末端に続くためにＳｐＣａｓ９と共に使用するための例示的な配列は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列番号１００と同一である配列であるか、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以下のヌクレオチドだけ配列番号１００と異なる配列である。
一般に、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡベクターの場合、本明細書に記載の任意のＲＮＡ配列中のＵ残基は、Ｔ残基で置き換えることができる。
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ＳＩＤは配列番号を意味する。表２では、記載は以下の意味を有する。標的遺伝子座が最初に示され、その後にガイドが（フォワード鎖の方向で）リピート領域の５’または３’での切断を誘導するかどうかを示す５もしくは３、またはガイドがリピート内にあるかもしくはリピートが発生する領域もしくはセグメントの外側（ＵＴＲまたはイントロンなど）にあることを示すＯが続き、その後に配列が対応する鎖を示す「フォワード」または「リバース」が続き、その後に配列のゲノム座標（バージョンＧＲＣｈ３８のヒトゲノム）が続く。したがって、例えば、配列番号１０１の場合、「ＤＭＰＫ ３フォワード１９：４５７６９７１６－４５７６９７３８」という呼称は、ガイドがＤＭＰＫのリピート領域の３’切断を指示し、１９番染色体の位置４５７６９７１６～４５７６９７３８のフォワード鎖の配列に対応することを意味する。Ａｓ／ＬｂＣｐｆ１は、本明細書ではＣｐｆ１と呼ばれることもある。ガイドの組み合わせを使用してリピート領域の５’及び３’での切断を誘導する場合、当業者は、ＤＭＰＫ、ＦＭＲ１、ＦＸＮなどの所与の標的に対して、本明細書に開示される５’ガイド及び本明細書に開示される３’ガイドの組み合わせを選択することができる。
本明細書で提供されるのは、１つ以上のガイドＲＮＡまたは１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物である。そのような組成物は、本明細書に開示されるスペーサー配列のうちの任意の１つ以上を含み得る（例えば、表２及び配列表を参照されたい）。
以下は、ＤＭＰＫに誘導されたガイド配列である：配列番号１０１～４９８８。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ガイドＲＮＡは、配列番号１０１～４９８８のいずれか１つを含むスペーサー配列を含む。ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ガイドＲＮＡは、配列番号１０１～４９８８のいずれか１つのスペーサー配列を含む。以下は、ＦＭＲ１に誘導されたガイド配列である：配列番号５００１～７２６４。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ガイドＲＮＡは、配列番号５００１～７２６４のいずれか１つを含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ガイドＲＮＡは、配列番号５００１～７２６４のいずれか１つのスペーサー配列を含む。以下は、ＦＸＮに誘導されたガイド配列である：配列番号７３０１～５３３７２。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ガイドＲＮＡは、配列番号７３０１～５３３７２のいずれか１つを含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ガイドＲＮＡは、配列番号７３０１～５３３７２のいずれか１つのスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、または１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物が提供され、ここで、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）を、筋緊張性ジストロフィー１型に関連する筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ遺伝子（ＤＭＰＫ）におけるＣＴＧリピート領域内またはその近くの標的ＤＮＡ配列に誘導するガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号１０１～４９８８で表２または配列表に示されるＤＭＰＫガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号１０１～４９８８で表２または配列表に示されるＤＭＰＫガイド配列の１７、１８、１９、または２０個の連続するヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号４０１８、４０１０、４００２、４０４２、４０３４、４０２６、３９５４、３９４６、３９９４、３９１４、３９７８、３９０６、３８９８、３９３８、３９２２、３８５８、３８５０、３８８２、３８２６、３８１８、３８４２、３７９４、３７８６、３７６２、３８１０、３７４６、３７７８、３７３８、３７７０、３７２２、３７５４、３６９０、３６６６、３６５８、３６３４、３５８６、３５４６、３５３０、３６４２、３５１４、３５０６、３４９０、３６１８、３６１０、３６０２、３５７８、３４４２、３５２２、３４１０、３３７８、３４３４、３３７０、３４２６、３４１８、３３９４、３３８６、３３３０、３３５４、３３４６、３３１４、３９３０、３８９０、３８３４、３８０２、３７０６、３６９８、３６８２、３６７４、３５７０、３５５４、３５３８、３４９８、３４８２、３４５８、３４７４、３４５０、２６６７、２６６６、２６５０、２６４２、２６２６、２６１８、２７０６、２６９０、２６８２、２６１０、２６７４、２６５８、２６０２、２５９４、２６３４、２５５４、２５４６、２５８６、２５３８、２５７８、２５７０、２５２２、２４９８、２４９０、２４６６、２４５８、２４５０、２５１４、２５０６、２４１８、２４８２、２４７４、２３９４、２４４２、２４３４、２３７０、２３７８、２３５４、２３４６、２３３８、２３１４、２２９８、２２８２、２２７４、２２６６、２３３０、２２５８、２３２２、２２４２、２２３４、２２９０、２２５０、２２１８、２２２６、２２１０、２１９４、２１４６、２１３８、２１２２、２１０６、２０９８、２０９０、２１３０、２１１４、２０３４、２０２６、２０５８、２０５０、２０４２、１９１４、１７８６、１７７８、１７７０、１８４２、１７３８、１７０６、１６９０、１７４６、１７１４、１６５０、１６４２、１６１０、１５８６、１５６２、１５４６、１５７８、１５３８、１３７８、１３７０、１９２２、１８９８、１９０６、１７９４、１７６２、１６９８、１６７４、１７２２、１３６２、１４５０、２２０２、２１７８、２１７０、２１６２、２０１８、２０１０、１８９０、１９６２、１９４６、１８５０、１８１８、１６５８、１６３４、１６０２、１５５４、１４３４、１４２６、１３３８、１３４６、１９７８、１９９４、１９８６、１９７０、１９３８、１９３０、１８１０、１８３４、１８２６、１８０２、１６２６、１５９４、１５１４、１４９８、１４９０、１４８２、１４７４、１４５８、１４４２、１４１８、１４１０、１４０２、１３９４、または１３８６のいずれか１つの１７、１８、１９、または２０個の連続するヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、表２または配列表に示されているＤＭＰＫガイド配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続したヌクレオチドに対して約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、表２に示されているガイド配列に対してｇＲＮＡは、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡはｔｒＲＮＡをさらに含む。本明細書に記載の各組成物及び方法の実施形態において、ｃｒＲＮＡ（スペーサー配列を含む）及びｔｒＲＮＡは、単一ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として会合することができるか、または別個のＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）上にあり得る。ｓｇＲＮＡとの関係において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡ成分は、例えば、ホスホジエステル結合または他の共有結合を介して共有結合され得る。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号４０１８、４０１０、４００２、４０４２、４０３４、４０２６、３９５４、３９４６、３９９４、３９１４、３９７８、３９０６、３８９８、３９３８、３９２２、３８５８、３８５０、３８８２、３８２６、３８１８、３８４２、３７９４、３７８６、３７６２、３８１０、３７４６、３７７８、３７３８、３７７０、３７２２、３７５４、３６９０、３６６６、３６５８、３６３４、３５８６、３５４６、３５３０、３６４２、３５１４、３５０６、３４９０、３６１８、３６１０、３６０２、３５７８、３４４２、３５２２、３４１０、３３７８、３４３４、３３７０、３４２６、３４１８、３３９４、３３８６、３３３０、３３５４、３３４６、３３１４、３９３０、３８９０、３８３４、３８０２、３７０６、３６９８、３６８２、３６７４、３５７０、３５５４、３５３８、３４９８、３４８２、３４５８、３４７４、３４５０、２６６７、２６６６、２６５０、２６４２、２６２６、２６１８、２７０６、２６９０、２６８２、２６１０、２６７４、２６５８、２６０２、２５９４、２６３４、２５５４、２５４６、２５８６、２５３８、２５７８、２５７０、２５２２、２４９８、２４９０、２４６６、２４５８、２４５０、２５１４、２５０６、２４１８、２４８２、２４７４、２３９４、２４４２、２４３４、２３７０、２３７８、２３５４、２３４６、２３３８、２３１４、２２９８、２２８２、２２７４、２２６６、２３３０、２２５８、２３２２、２２４２、２２３４、２２９０、２２５０、２２１８、２２２６、２２１０、２１９４、２１４６、２１３８、２１２２、２１０６、２０９８、２０９０、２１３０、２１１４、２０３４、２０２６、２０５８、２０５０、２０４２、１９１４、１７８６、１７７８、１７７０、１８４２、１７３８、１７０６、１６９０、１７４６、１７１４、１６５０、１６４２、１６１０、１５８６、１５６２、１５４６、１５７８、１５３８、１３７８、１３７０、１９２２、１８９８、１９０６、１７９４、１７６２、１６９８、１６７４、１７２２、１３６２、１４５０、２２０２、２１７８、２１７０、２１６２、２０１８、２０１０、１８９０、１９６２、１９４６、１８５０、１８１８、１６５８、１６３４、１６０２、１５５４、１４３４、１４２６、１３３８、１３４６、１９７８、１９９４、１９８６、１９７０、１９３８、１９３０、１８１０、１８３４、１８２６、１８０２、１６２６、１５９４、１５１４、１４９８、１４９０、１４８２、１４７４、１４５８、１４４２、１４１８、１４１０、１４０２、１３９４、または１３８６から選択されるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号３３３０、３９１４、３４１８、３７４６、３７７８、３３９４、４０２６、３６９０、３７９４、３３８６、３９３８、３６８２、３８１８、３６５８、３７２２、３８０２、３８５８、３５１４、３７７０、３３７０、３３５４、４０１０、２２０２、１７０６、２２１０、２１７０、１７７８、２２５８、２１１４、２１７８、１６４２、１７３８、１７４６、２３２２、１７７０、１５３８、２５１４、２４５８、２１９４、２５９４、２１６２、及び２６１８から選択されるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号３７４６、３７７８、３３９４、３３８６、３９３８、３８１８、３７２２、３８５８、３３７０、１７０６、２２１０、２１１４、１５３８、及び２５９４から選択されるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号３３３０、３７４６、３７７８、３３９４、４０２６、３３８６、３９３８、３８１８、３７２２、３８０２、３８５８、３５１４、３７７０、３３７０、２２０２、１７０６、２２１０、１７７８、２１１４、１７３８、１７４６、２３２２、１５３８、２５１４、２４５８、２１９４、及び２５９４から選択されるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号３３３０、３９１４、３４１８、３７４６、３７７８、３３９４、４０２６、３６９０、３７９４、３３８６、３９３８、３６８２、３８１８、３６５８、及び３７２２から選択されるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号２２０２、１７０６、２２１０、２１７０、１７７８、２２５８、２１１４、２１７８、１６４２、１７３８、１７４６、及び２３２２から選択されるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号３７７８、４０２６、３７９４、４０１０、３９０６、３７４６、１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、１９１４、及び２２１０から選択されるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号３３７８、３３５４、３３４６、３３３０、３３１４、２６５８、２６９０、２５４６、２５５４、２４９８、及び２５０６から選択されるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号３３３０、３３１４、２６５８、２６９０、２５５４、及び２４９８から選択されるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号３３１４、２６９０、２５５４、及び２４９８から選択されるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号３９１４、３５１４、１７７８、２４５８、３８５８、３４１８、１７０６、及び２２５８から選択されるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号３９１４、２１１４、２６１８、及び３４１８から選択されるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号３９１６，３４２０、及び３９４０から選択されるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号３９１４及び３４１８から選択されるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号３９３８を含む。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号４０１８、４０１０、４００２、４０４２、４０３４、４０２６、３９５４、３９４６、３９９４、３９１４、３９７８、３９０６、３８９８、３９３８、３９２２、３８５８、３８５０、３８８２、３８２６、３８１８、３８４２、３７９４、３７８６、３７６２、３８１０、３７４６、３７７８、３７３８、３７７０、３７２２、３７５４、３６９０、３６６６、３６５８、３６３４、３５８６、３５４６、３５３０、３６４２、３５１４、３５０６、３４９０、３６１８、３６１０、３６０２、３５７８、３４４２、３５２２、３４１０、３３７８、３４３４、３３７０、３４２６、３４１８、３３９４、３３８６、３３３０、３３５４、３３４６、３３１４、３９３０、３８９０、３８３４、３８０２、３７０６、３６９８、３６８２、３６７４、３５７０、３５５４、３５３８、３４９８、３４８２、３４５８、３４７４、３４５０、２６６７、２６６６、２６５０、２６４２、２６２６、２６１８、２７０６、２６９０、２６８２、２６１０、２６７４、２６５８、２６０２、２５９４、２６３４、２５５４、２５４６、２５８６、２５３８、２５７８、２５７０、２５２２、２４９８、２４９０、２４６６、２４５８、２４５０、２５１４、２５０６、２４１８、２４８２、２４７４、２３９４、２４４２、２４３４、２３７０、２３７８、２３５４、２３４６、２３３８、２３１４、２２９８、２２８２、２２７４、２２６６、２３３０、２２５８、２３２２、２２４２、２２３４、２２９０、２２５０、２２１８、２２２６、２２１０、２１９４、２１４６、２１３８、２１２２、２１０６、２０９８、２０９０、２１３０、２１１４、２０３４、２０２６、２０５８、２０５０、２０４２、１９１４、１７８６、１７７８、１７７０、１８４２、１７３８、１７０６、１６９０、１７４６、１７１４、１６５０、１６４２、１６１０、１５８６、１５６２、１５４６、１５７８、１５３８、１３７８、１３７０、１９２２、１８９８、１９０６、１７９４、１７６２、１６９８、１６７４、１７２２、１３６２、１４５０、２２０２、２１７８、２１７０、２１６２、２０１８、２０１０、１８９０、１９６２、１９４６、１８５０、１８１８、１６５８、１６３４、１６０２、１５５４、１４３４、１４２６、１３３８、１３４６、１９７８、１９９４、１９８６、１９７０、１９３８、１９３０、１８１０、１８３４、１８２６、１８０２、１６２６、１５９４、１５１４、１４９８、１４９０、１４８２、１４７４、１４５８、１４４２、１４１８、１４１０、１４０２、１３９４、または１３８６から選択されるＦＸＮガイド配列の１７、１８、１９、または２０個の連続するヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ＤＮＡ－ＰＫ阻害によるＤＭＰＫ遺伝子からのＴＮＲのシングルカット切除に有用である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、シングルカット切除を増強する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号３９１４の配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号３４１８の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号３９３８の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号３９１６の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号３４２０の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号３９４０の配列を含む。
１対のガイドＲＮＡまたはガイド１対のＲＮＡの対をコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号２２０２及び３４１８；２２０２及び３３７０；２２０２及び３５１４；２２０２及び３６５８；２１７８及び３４１８；２１７８及び３３７０；２１７８及び３５１４；２１７８及び３６５８；２１７０及び３４１８；２１７０及び３３７０；２１７０及び３５１４；２１７０及び３６５８；２１６２及び３４１８；２１６２及び３３７０；２１６２及び３５１４；２１６２及び３６５８；２２０２及び４０１０；２２０２及び４０２６；２２０２及び３９１４；２２０２及び３９３８；２２０２及び３８５８；２２０２及び３８１８；２２０２及び３７９４；２２０２及び３８０２；２２０２及び３７４６；２２０２及び３７７８；２２０２及び３７７０；２２０２及び３７２２；２２０２及び３６９０；２２０２及び３６８２；２２０２及び３３３０；２２０２及び３３５４；２２０２及び３３９４；２２０２及び３３８６；２１７８及び４０１０；２１７８及び４０２６；２１７８及び３９１４；２１７８及び３９３８；２１７８及び３８５８；２１７８及び３８１８；２１７８及び３７９４；２１７８及び３８０２；２１７８及び３７４６；２１７８及び３７７８；２１７８及び３７７０；２１７８及び３７２２；２１７８及び３６９０；２１７８及び３６８２；２１７８及び３３３０；２１７８及び３３５４；２１７８及び３３９４；２１７８及び３３８６；２１７０及び４０１０；２１７０及び４０２６；２１７０及び３９１４；２１７０及び３９３８；２１７０及び３８５８；２１７０及び３８１８；２１７０及び３７９４；２１７０及び３８０２；２１７０及び３７４６；２１７０及び３７７８；２１７０及び３７７０；２１７０及び３７２２；２１７０及び３６９０；２１７０及び３６８２；２１７０及び３３３０；２１７０及び３３５４；２１７０及び３３９４；２１７０及び３３８６；２１６２及び４０１０；２１６２及び４０２６；２１６２及び３９１４；２１６２及び３９３８；２１６２及び３８５８；２１６２及び３８１８；２１６２及び３７９４；２１６２及び３８０２；２１６２及び３７４６；２１６２及び３７７８；２１６２及び３７７０；２１６２及び３７２２；２１６２及び３６９０；２１６２及び３６８２；２１６２及び３３３０；２１６２及び３３５４；２１６２及び３３９４；２１６２及び３３８６；１７０６及び３４１８；１７０６及び３３７０；１７０６及び３５１４；１７０６及び３６５８；１７０６及び４０１０；１７０６及び４０２６；１７０６及び３９１４；１７０６及び３９３８；１７０６及び３８５８；１７０６及び３８１８；１７０６及び３７９４；１７０６及び３８０２；１７０６及び３７４６；１７０６及び３７７８；１７０６及び３７７０；１７０６及び３７２２；１７０６及び３６９０；１７０６及び３６８２；１７０６及び３３３０；１７０６及び３３５４；１７０６及び３３９４；１７０６及び３３８６；２２１０及び３４１８；２２１０及び３３７０；２２１０及び３５１４；２２１０及び３６５８；２２１０及び４０１０；２２１０及び４０２６；２２１０及び３９１４；２２１０及び３９３８；２２１０及び３８５８；２２１０及び３８１８；２２１０及び３７９４；２２１０及び３８０２；２２１０及び３７４６；２２１０及び３７７８；２２１０及び３７７０；２２１０及び３７２２；２２１０及び３６９０；２２１０及び３６８２；２２１０及び３３３０；２２１０及び３３５４；２２１０及び３３９４；２２１０及び３３８６；１７７８及び３４１８；１７７８及び３３７０；１７７８及び３５１４；１７７８及び３６５８；１７７８及び４０１０；１７７８及び４０２６；１７７８及び３９１４；１７７８及び３９３８；１７７８及び３８５８；１７７８及び３８１８；１７７８及び３７９４；１７７８及び３８０２；１７７８及び３７４６；１７７８及び３７７８；１７７８及び３７７０；１７７８及び３７２２；１７７８及び３６９０；１７７８及び３６８２；１７７８及び３３３０；１７７８及び３３５４；１７７８及び３３９４；１７７８及び３３８６；２２５８及び３４１８；２２５８及び３３７０；２２５８及び３５１４；２２５８及び３６５８；２２５８及び４０１０；２２５８及び４０２６；２２５８及び３９１４；２２５８及び３９３８；２２５８及び３８５８；２２５８及び３８１８；２２５８及び３７９４；２２５８及び３８０２；２２５８及び３７４６；２２５８及び３７７８；２２５８及び３７７０；２２５８及び３７２２；２２５８及び３６９０；２２５８及び３６８２；２２５８及び３３３０；２２５８及び３３５４；２２５８及び３３９４；２２５８及び３３８６；２１１４及び３４１８；２１１４及び３３７０；２１１４及び３５１４；２１１４及び３６５８；２１１４及び４０１０；２１１４及び４０２６；２１１４及び３９１４；２１１４及び３９３８；２１１４及び３８５８；２１１４及び３８１８；２１１４及び３７９４；２１１４及び３８０２；２１１４及び３７４６；２１１４及び３７７８；２１１４及び３７７０；２１１４及び３７２２；２１１４及び３６９０；２１１４及び３６８２；２１１４及び３３３０；２１１４及び３３５４；２１１４及び３３９４；２１１４及び３３８６；１６４２及び３４１８；１６４２及び３３７０；１６４２及び３５１４；１６４２及び３６５８；１６４２及び４０１０；１６４２及び４０２６；１６４２及び３９１４；１６４２及び３９３８；１６４２及び３８５８；１６４２及び３８１８；１６４２及び３７９４；１６４２及び３８０２；１６４２及び３７４６；１６４２及び３７７８；１６４２及び３７７０；１６４２及び３７２２；１６４２及び３６９０；１６４２及び３６８２；１６４２及び３３３０；１６４２及び３３５４；１６４２及び３３９４；１６４２及び３３８６；１７３８及び３４１８；１７３８及び３３７０；１７３８及び３５１４；１７３８及び３６５８；１７３８及び４０１０；１７３８及び４０２６；１７３８及び３９１４；１７３８及び３９３８；１７３８及び３８５８；１７３８及び３８１８；１７３８及び３７９４；１７３８及び３８０２；１７３８及び３７４６；１７３８及び３７７８；１７３８及び３７７０；１７３８及び３７２２；１７３８及び３６９０；１７３８及び３６８２；１７３８及び３３３０；１７３８及び３３５４；１７３８及び３３９４；１７３８及び３３８６；２２５８及び３４１８；２２５８及び３３７０；２２５８及び３５１４；２２５８及び３６５８；２２５８及び４０１０；２２５８及び４０２６；２２５８及び３９１４；２２５８及び３９３８；２２５８及び３８５８；２２５８及び３８１８；２２５８及び３７９４；２２５８及び３８０２；２２５８及び３７４６；２２５８及び３７７８；２２５８及び３７７０；２２５８及び３７２２；２２５８及び３６９０；２２５８及び３６８２；２２５８及び３３３０；２２５８及び３３５４；２２５８及び３３９４；２２５８及び３３８６；２１１４及び３４１８；２１１４及び３３７０；２１１４及び３５１４；２１１４及び３６５８；２１１４及び４０１０；２１１４及び４０２６；２１１４及び３９１４；２１１４及び３９３８；２１１４及び３８５８；２１１４及び３８１８；２１１４及び３７９４；２１１４及び３８０２；２１１４及び３７４６；２１１４及び３７７８；２１１４及び３７７０；２１１４及び３７２２；２１１４及び３６９０；２１１４及び３６８２；２１１４及び３３３０；２１１４及び３３５４；２１１４及び３３９４；１７０６及び３３８６；１６４２及び３４１８；１６４２及び３３７０；１６４２及び３５１４；１６４２及び３６５８；１６４２及び４０１０；１６４２及び４０２６；１６４２及び３９１４；１６４２及び３９３８；１６４２及び３８５８；１６４２及び３８１８；１６４２及び３７９４；１６４２及び３８０２；１６４２及び３７４６；１６４２及び３７７８；１６４２及び３７７０；１６４２及び３７２２；１６４２及び３６９０；１６４２及び３６８２；１６４２及び３３３０；１６４２及び３３５４；１６４２及び３３９４；１６４２及び３３８６；１７３８及び３４１８；１７３８及び３３７０；１７３８及び３５１４；１７３８及び３６５８；１７３８及び４０１０；１７３８及び４０２６；１７３８及び３９１４；１７３８及び３９３８；１７３８及び３８５８；１７３８及び３８１８；１７３８及び３７９４；１７３８及び３８０２；１７３８及び３７４６；１７３８及び３７７８；１７３８及び３７７０；１７３８及び３７２２；１７３８及び３６９０；１７３８及び３６８２；１７３８及び３３３０；１７３８及び３３５４；１７３８及び３３９４；１７３８及び３３８６；１７４６及び３４１８；１７４６及び３３７０；１７４６及び３５１４；１７４６及び３６５８；１７４６及び４０１０；１７４６及び４０２６；１７４６及び３９１４；１７４６及び３９３８；１７４６及び３８５８；１７４６及び３８１８；１７４６及び３７９４；１７４６及び３８０２；１７４６及び３７４６；１７４６及び３７７８；１７４６及び３７７０；１７４６及び３７２２；１７４６及び３６９０；１７４６及び３６８２；１７４６及び３３３０；１７４６及び３３５４；１７４６及び３３９４；１７４６及び３３８６；２３２２及び３４１８；２３２２及び３３７０；２３２２及び３５１４；２３２２及び３６５８；２３２２及び４０１０；２３２２及び４０２６；２３２２及び３９１４；２３２２及び３９３８；２３２２及び３８５８；２３２２及び３８１８；２３２２及び３７９４；２３２２及び３８０２；２３２２及び３７４６；２３２２及び３７７８；２３２２及び３７７０；２３２２及び３７２２；２３２２及び３６９０；２３２２及び３６８２；２３２２及び３３３０；２３２２及び３３５４；２３２２及び３３９４；２３２２及び３３８６；１７７０及び３４１８；１７７０及び３３７０；１７７０及び３５１４；１７７０及び３６５８；１７７０及び４０１０；１７７０及び４０２６；１７７０及び３９１４；１７７０及び３９３８；１７７０及び３８５８；１７７０及び３８１８；１７７０及び３７９４；１７７０及び３８０２；１７７０及び３７４６；１７７０及び３７７８；１７７０及び３７７０；１７７０及び３７２２；１７７０及び３６９０；１７７０及び３６８２；１７７０及び３３３０；１７７０及び３３５４；１７７０及び３３９４；１７７０及び３３８６；１５３８及び３４１８；１５３８及び３３７０；１５３８及び３５１４；１５３８及び３６５８；１５３８及び４０１０；１５３８及び４０２６；１５３８及び３９１４；１５３８及び３９３８；１５３８及び３８５８；１５３８及び３８１８；１５３８及び３７９４；１５３８及び３８０２；１５３８及び３７４６；１５３８及び３７７８；１５３８及び３７７０；１５３８及び３７２２；１５３８及び３６９０；１５３８及び３６８２；１５３８及び３３３０；１５３８及び３３５４；１５３８及び３３９４；１５３８及び３３８６；２５１４及び３４１８；２５１４及び３３７０；２５１４及び３５１４；２５１４及び３６５８；２５１４及び４０１０；２５１４及び４０２６；２５１４及び３９１４；２５１４及び３９３８；２５１４及び３８５８；２５１４及び３８１８；２５１４及び３７９４；２５１４及び３８０２；２５１４及び３７４６；２５１４及び３７７８；２５１４及び３７７０；２５１４及び３７２２；２５１４及び３６９０；２５１４及び３６８２；２５１４及び３３３０；２５１４及び３３５４；２５１４及び３３９４；２５１４及び３３８６；２４５８及び３４１８；２４５８及び３３７０；２４５８及び３５１４；２４５８及び３６５８；２４５８及び４０１０；２４５８及び４０２６；２４５８及び３９１４；２４５８及び３９３８；２４５８及び３８５８；２４５８及び３８１８；２４５８及び３７９４；２４５８及び３８０２；２４５８及び３７４６；２４５８及び３７７８；２４５８及び３７７０；２４５８及び３７２２；２４５８及び３６９０；２４５８及び３６８２；２４５８及び３３３０；２４５


８及び３３５４；２４５８及び３３９４；２４５８及び３３８６；２１９４及び３４１８；２１９４及び３３７０；２１９４及び３５１４；２１９４及び３６５８；２１９４及び４０１０；２１９４及び４０２６；２１９４及び３９１４；２１９４及び３９３８；２１９４及び３８５８；２１９４及び３８１８；２１９４及び３７９４；２１９４及び３８０２；２１９４及び３７４６；２１９４及び３７７８；２１９４及び３７７０；２１９４及び３７２２；２１９４及び３６９０；２１９４及び３６８２；２１９４及び３３３０；２１９４及び３３５４；２１９４及び３３９４；２１９４及び３３８６；２５９４及び３４１８；２５９４及び３３７０；２５９４及び３５１４；２５９４及び３６５８；２５９４及び４０１０；２５９４及び４０２６；２５９４及び３９１４；２５９４及び３９３８；２５９４及び３８５８；２５９４及び３８１８；２５９４及び３７９４；２５９４及び３８０２；２５９４及び３７４６；２５９４及び３７７８；２５９４及び３７７０；２５９４及び３７２２；２５９４及び３６９０；２５９４及び３６８２；２５９４及び３３３０；２５９４及び３３５４；２５９４及び３３９４；２５９４及び３３８６；２６１８及び３４１８；２６１８及び３３７０；２６１８及び３５１４；２６１８及び３６５８；２６１８及び４０１０；２６１８及び４０２６；２６１８及び３９１４；２６１８及び３９３８；２６１８及び３８５８；２６１８及び３８１８；２６１８及び３７９４；２６１８及び３８０２；２６１８及び３７４６；２６１８及び３７７８；２６１８及び３７７０；２６１８及び３７２２；２６１８及び３６９０；２６１８及び３６８２；２６１８及び３３３０；２６１８及び３３５４；２６１８及び３３９４；ならびに２６１８及び３３８６から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号２２０２及び３４１８；２２０２及び３３７０；２２０２及び３５１４；２２０２及び３６５８；２１７８及び３４１８；２１７８及び３３７０；２１７８及び３５１４；２１７８及び３６５８；２１７０及び３４１８；２１７０及び３３７０；２１７０及び３５１４；２１７０及び３６５８；２１６２及び３４１８；２１６２及び３３７０；２１６２及び３５１４；２１６２及び３６５８；２２０２及び４０１０；２２０２及び４０２６；２２０２及び３９１４；２２０２及び３９３８；２２０２及び３８５８；２２０２及び３８１８；２２０２及び３７９４；２２０２及び３８０２；２２０２及び３７４６；２２０２及び３７７８；２２０２及び３７７０；２２０２及び３７２２；２２０２及び３６９０；２２０２及び３６８２；２２０２及び３３３０；２２０２及び３３５４；２２０２及び３３９４；２２０２及び３３８６；２１７８及び４０１０；２１７８及び４０２６；２１７８及び３９１４；２１７８及び３９３８；２１７８及び３８５８；２１７８及び３８１８；２１７８及び３７９４；２１７８及び３８０２；２１７８及び３７４６；２１７８及び３７７８；２１７８及び３７７０；２１７８及び３７２２；２１７８及び３６９０；２１７８及び３６８２；２１７８及び３３３０；２１７８及び３３５４；２１７８及び３３９４；２１７８及び３３８６；２１７０及び４０１０；２１７０及び４０２６；２１７０及び３９１４；２１７０及び３９３８；２１７０及び３８５８；２１７０及び３８１８；２１７０及び３７９４；２１７０及び３８０２；２１７０及び３７４６；２１７０及び３７７８；２１７０及び３７７０；２１７０及び３７２２；２１７０及び３６９０；２１７０及び３６８２；２１７０及び３３３０；２１７０及び３３５４；２１７０及び３３９４；２１７０及び３３８６；２１６２及び４０１０；２１６２及び４０２６；２１６２及び３９１４；２１６２及び３９３８；２１６２及び３８５８；２１６２及び３８１８；２１６２及び３７９４；２１６２及び３８０２；２１６２及び３７４６；２１６２及び３７７８；２１６２及び３７７０；２１６２及び３７２２；２１６２及び３６９０；２１６２及び３６８２；２１６２及び３３３０；２１６２及び３３５４；２１６２及び３３９４；２１６２及び３３８６から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号２２０２及び３４１８；２２０２及び３３７０；２２０２及び３５１４；２２０２及び３６５８；２１７８及び３４１８；２１７８及び３３７０；２１７８及び３５１４；２１７８及び３６５８；２１７０及び３４１８；２１７０及び３３７０；２１７０及び３５１４；２１７０及び３６５８；２１６２及び３４１８；２１６２及び３３７０；２１６２及び３５１４；ならびに２１６２及び３６５８から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号３７７８及び２５１４；３７７８及び２２５８；３７７８及び２２１０；３３８６及び２５１４；３３８６及び２２５８；３３８６及び２２１０；３３５４及び２５１４；３３５４及び２２５８；ならびに３３５４及び２２１０から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号３７７８及び２２５８；３７７８及び２２１０；３３８６及び２２５８；３３８６及び２２１０；ならびに３３５４及び２５１４から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号３３４６及び２５５４；３３４６及び２４９８；３３３０及び２５５４；３３３０及び２４９８；３３３０及び２５０６；及び３３３０及び２５４６から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号３３４６及び２５５４；３３４６及び２４９８；３３３０及び２５５４；３３３０及び２４９８；３３５４及び２５４６；３３５４及び２５０６；３３７８及び２５４６；３３７８及び２５０６から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号３３４６及び２５５４；３３４６及び２４９８；３３３０及び２５５４；ならびに３３３０及び２４９８から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号１１５３及び１１２９を含む第１及び第２のスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号２８５６、２８６４、２８８０、２８９６、２９０４、２９１２、２９３６、２９４４、２９６０、２９９２、３０１６、３０２４、３０６４、３０９６、３１１２、３１２８、３１３６、３１４４、３１６０、３１６８、３１９２、３２００、３２０８、３２１６、３２２４、３２３２、３２４０、３２４８、３２５６、３２６４、３３１４、３３３０、３３４６、３３５４、３３７０、３３７８、３３８６、３３９４、３４１０、３４１８、３４２６、３４３４、３４４２、３４５０、３４５８、３４７４、３４８２、３４９０、３４９８、３５０６、３５１４、３５２２、３５３０、３５３８、３５４６、３５５４、３５７０、３５７８、３５８６、３６０２、３６１０、３６１８、３６３４、３６４２、３６５８、３６７４、３６８２、３６９０、３６９８、３７０６、３７２２、３７４６、３７６２、３７７０、３７７８、３７９４、３８０２、３８１８、３８２６、３８３４、３８５０、３８５８、３８９０、３８９８、３９０６、３９１４、３９２２、３９３０、３９３８、３９４６、３９９４、４０１０、４０１８、４０２６、４０３４、４０４２、４２０８、及び４５０６から選択される第１のスペーサー配列、ならびに配列番号５６０、５８４、６０８、６１６、６５６、６７２、６８８、６９６、７１２、７４４、７５２、７６０、８４０、８６４、９６０、９７６、９８４、１００８、１０５６、１１２８、１１３６、１１５２、１２２４、１２４０、１２７２、１３３８、１３４６、１３７０、１３７８、１３８６、１３９４、１４０２、１４１０、１４１８、１４２６、１４３４、１４４２、１４５８、１４７４、１４８２、１４９０、１４９８、１５１４、１５３８、１５４６、１５５４、１５６２、１５７８、１５８６、１５９４、１６０２、１６１０、１６２６、１６３４、１６４２、１６５０、１６５８、１６９０、１７０６、１７１４、１７３８、１７４６、１７７０、１７７８、１７８６、１８０２、１８１０、１８１８、１８２６、１８３４、１８４２、１８５０、１８９０、１９１４、１９３０、１９３８、１９４６、１９６２、１９７０、１９７８、１９８６、１９９４、２０１０、２０１８、２０２６、２０４２、２０５０、２０５８、２０９０、２１１４、２１３０、２１６２、２１７０、２１７８、２２０２、２２１０、２２２６、２２４２、２２５８、２２６６、２２７４、２２８２、２２９８、２３１４、２３２２、２３３０、２３３８、２３４６、２３５４、２３７０、２３７８、２３９４、２４１８、２４３４、２４４２、２４５８、２４６６、２４７４、２４９８、２５０６、２５１４、２５２２、２５４６、２５５４、２５７０、２５８６、２６５８、４９８９、４９９０、４９９１、及びに４９９２から選択される第２のスペーサー配列を含む、第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号３７７８、４０２６、３７９４、４０１０、３９０６及び３７４６から選択される第１のスペーサー配列、ならびに配列番号１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、１９１４、及び２２１０から選択される第２のスペーサー配列を含む、第１及び第２のスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号３７７８及び１７７８；３７７８及び１７４６；３７７８及び１７７０；３７７８及び１５８６；３７７８及び１９１４；３７７８及び２２１０；４０２６及び１７７８；４０２６及び１７４６；４０２６及び１７７０；４０２６及び１５８６；４０２６及び１９１４；４０２６及び２２１０；３７９４及び１７７８；３７９４及び１７４６；３７９４及び１７７０；３７９４及び１５８６；３７９４及び１５８６；３７９４及び１９１４；３７９４及び２２１０；４０１０及び１７７８；４０１０及び１７７０；４０１０及び１７４６；４０１０及び１５８６；４０１０及び１９１４；４０１０及び２２１０；３９０６及び１７７８；３９０６及び１７７８；３９０６及び１７４６；３９０６及び１７７０；３９０６及び１５８６；３９０６及び１９１４；３９０６及び２２１０；３７４６及び１７７８；３７４６及び１７４６；３７４６及び１７７０；３７４６及び１５８６；３７４６及び１９１４；ならびに３７４６及び２２１０から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号３２５６、２８９６、３１３６、及び３２２４から選択される第１のスペーサー配列、ならびに配列番号４９８９、５６０、６７２、９７６、７６０、９８４、及び６１６から選択される第２のスペーサー配列を含む第１及び第２のスペーサー配列を含む第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号３２５６及び４９８９；３２５６及び９８４；３２５６及び６１６；２８９６及び４９８９；２８９６及び６７２；２８９６及び７６０；３１３６及び４９８９；３１３６及び５６０；３２２４及び４９８９；３２２４及び９７６；ならびに３２２４及び７６０から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む第１及び第２のスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ガイドＲＮＡはスペーサー配列を含み、スペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを配列のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導し、ストレッチはＤＭＰＫ－Ｕ２９切断部位の１ヌクレオチドから始まり、リピートまで続く。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ガイドＲＮＡはスペーサー配列を含み、スペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを配列のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導しここで、ストレッチは配列番号５３４１３：ｇｔｇｇｇｔｃｔｃｃｇｃｃｃａｇｃｔｃｃａｇｔｃｃｔｇｔｇａｔｃｃｇｇｇｃｃｃｇｃｃｃｃｃｔａｇｃｇｇｃｃｇｇｇｇａｇｇｇａｇｇｇｇｃｃｇｇｇｔｃｃｇｃｇｇｃｃｇｇｃｇａａｃｇｇｇｇｃｔｃｇａａｇｇｇｔｃｃｔｔｇｔａｇｃｃｇｇｇａａｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇである。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ガイドＲＮＡはスペーサー配列を含み、スペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを配列のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導し、ストレッチはＤＭＰＫ－Ｕ３０切断部位の１ヌクレオチドから始まり、ＤＭＰＫ－Ｕ５６切断部位の１ヌクレオチド前まで続く。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ガイドＲＮＡはスペーサー配列を含み、スペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを配列のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導し、ストレッチは配列番号５３４１４：ｔｇｇｇｔｃｔｃｃｇｃｃｃａｇｃｔｃｃａｇｔｃｃｔｇｔｇａｔｃｃｇｇｇｃｃｃｇｃｃｃｃｃｔａｇｃｇｇｃｃｇｇｇｇａｇｇｇａｇｇｇｇｃｃｇｇｇｔｃｃｇｃｇｇｃｃｇｇｃｇａａｃｇｇｇｇである。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ガイドＲＮＡはスペーサー配列を含み、スペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを配列のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導し、ストレッチはＤＭＰＫ－Ｕ３０切断部位の１ヌクレオチドから始まり、ＤＭＰＫ－Ｕ５２切断部位の１ヌクレオチド前まで続く。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ガイドＲＮＡはスペーサー配列を含み、スペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを配列のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導し、ストレッチは配列番号５３４１５：ｔｇｇｇｔｃｔｃｃｇｃｃｃａｇｃｔｃｃａｇｔｃｃｔｇｔｇａｔｃｃｇｇｇｃｃｃｇｃｃｃｃｃｔａｇｃｇｇｃｃｇｇｇｇａｇｇｇａｇｇｇｇｃｃｇｇｇｔｃｃｇｃｇｇｃｃｇｇｃである。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ガイドＲＮＡはスペーサー配列を含み、スペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを配列のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導し、ストレッチはＤＭＰＫ－Ｄ１５切断部位の１ヌクレオチドから始まり、ＤＭＰＫ－Ｄ５１切断部位の１ヌクレオチド前まで続く。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ガイドＲＮＡはスペーサー配列を含み、スペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを配列のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導し、ストレッチは配列番号５３４１６：ｇａｔｇｇｇｃａａａｃｔｇｃａｇｇｃｃｔｇｇｇａａｇｇｃａｇｃａａｇｃｃｇｇｇｃｃｇｔｃｃｇｔｇｔｔｃｃａｔｃｃｔｃｃａｃｇｃａｃｃｃｃｃａｃｃｔａｔｃｇｔｔｇｇｔｔｃｇｃａａａｇｔｇｃａａａｇｃｔｔｔｃｔｔｇｔｇｃａｔｇａｃｇｃｃｃｔｇｃｔｃｔｇｇｇｇａｇｃｇｔｃｔｇｇｃｇｃｇａｔｃｔｃｔｇｃｃｔｇｃｔｔである。
いくつかの実施形態において、ストレッチは、ＤＭＰＫ－Ｄ３５切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｄ５１切断部位の１ヌクレオチド前まで続く。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ガイドＲＮＡはスペーサー配列を含み、スペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを配列のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導し、ストレッチは配列番号５３４１７：ｇｔｔｇｇｔｔｃｇｃａａａｇｔｇｃａａａｇｃｔｔｔｃｔｔｇｔｇｃａｔｇａｃｇｃｃｃｔｇｃｔｃｔｇｇｇｇａｇｃｇｔｃｔｇｇｃｇｃｇａｔｃｔｃｔｇｃｃｔｇｃｔｔである。
Ｕ２９切断部位は、ｃｈｒ１９：ヌクレオチド４５，７７０，３８３と４５，７７０，３８４（Ｈｇ３８座標を使用）との間にあり、これは、以下の配列：ｔｔｃａｃａａｃｃｇｃｔｃｃｇａｇ＊ｃｇｔｇｇｇ中の＊に対応している。
Ｕ３０切断部位は、ｃｈｒ１９：ヌクレオチド４５，７７０，３８５と４５，７７０，３８６（Ｈｇ３８座標を使用）との間にあり、これは、以下の配列：ｇｃｔｇｇｇｃｇｇａｇａｃｃｃａｃ＊ｇｃｔｃｇｇ中の＊に対応している。
Ｄ１５切断部位は、ｃｈｒ１９：ヌクレオチド４５，７７０，１５４と４５，７７０，１５５（Ｈｇ３８座標を使用）との間にあり、これは、以下の配列：ｇｇｃｔｇａｇｇｃｃｃｔｇａｃｇｔ＊ｇｇａｔｇｇ中の＊に対応している。
Ｄ３５切断部位は、ｃｈｒ１９：ヌクレオチド４５，７７０，０７８と４５，７７０，０７９（Ｈｇ３８座標を使用）との間にあり、これは、以下の配列：ｃａｃｇｃａｃｃｃｃｃａｃｃｔａｔ＊ｃｇｔｔｇｇ中の＊に対応している。
いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、または１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物が提供され、ここで、１つ以上のガイドＲＮＡは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）を、筋緊張性ジストロフィー１型に関連する筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ遺伝子（ＦＸＮ）におけるＣＴＧリピート領域内またはその近くの標的ＤＮＡ配列に誘導するガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、表２または配列表に示されるＦＸＮガイド配列を含むｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ｇＲＮＡは、表２または配列表に示されるＦＸＮガイド配列の１７、１８、１９、または２０個の連続するヌクレオチドを含むｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、表２または配列表に示されているＦＸＮガイド配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続したヌクレオチドに対して約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含むｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、表２または配列表に示されているガイド配列に対して約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含むｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、ｔｒＲＮＡをさらに含む。本明細書に記載の各組成物及び方法の実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として会合することができるか、または別個のＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）上にあり得る。ｓｇＲＮＡとの関係において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡ成分は、例えば、ホスホジエステル結合または他の共有結合を介して共有結合され得る。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号２８１３０、３４４４２、４５９０６、２６５６２、５２６６６、５１３２２、４６５９９、５２８９８、２６５４６、７４４７、４７０４７、４９９８６、５１７６２、５１７５４、５２２９０、５２２９８、５１４７４、５２３０６、５０６８２、５１７０６、５２０９８、５０７１４、５１４９８、５２４９８、５０９７８、５１７４６、５２１０６、５１５０６、５０６７４、５２０８２、５２５０６、５０５３８、５２０６６、５２３８６、５２０９０、５２２６６、５２４７４、５２２５８、５２４３４、５０７０６、５１４９０、５２４５８、５１４６６、５２３５４、５１９１４、５１３６２、５１０５８、５０１７０、５１９５４、５２２５０、５１９３０、５１６８２、５２５９４、５２６１０、５１１６２、４９１６２、５０８９８、４９２２６、５１６５８、５２５５４、５２６３４、５１３９４、４９０３４、５２５４６、５２５２２、５２６１８、５２５３０、２８３２２、２６５３０、２６５７８、２６６０２、２６６３４、２６６２６、２６６９８、２６７４６、２６７５４、２６７８６、２６８８２、２７７２２、２７７３０、２７７３８、２７７７０、２７７５４、２７７６２、２７８０２、２７８５０、２７８４２、２７９２２、２７９４６、２７９８６、２８１１４、２８１２２、２８１４６、２８１８６、２８１９４、２８３３８、２８３４６、２８３２２、２８３７８、２８３７０、２８４５８、２８５０６、２８６３４、２８６４２、２８６５０、３４４４２、または４５９０６から選択されるスペーサー配列を含むスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号２８１３０、３４４４２、４５９０６、２６５６２、５２６６６、５１３２２、４６５９９、５２８９８、２６５４６、７４４７、４７０４７、４９９８６、５１７６２、５１７５４、５２２９０、５２２９８、５１４７４、５２３０６、５０６８２、５１７０６、５２０９８、５０７１４、５１４９８、５２４９８、５０９７８、５１７４６、５２１０６、５１５０６、５０６７４、５２０８２、５２５０６、５０５３８、５２０６６、５２３８６、５２０９０、５２２６６、５２４７４、５２２５８、５２４３４、５０７０６、５１４９０、５２４５８、５１４６６、５２３５４、５１９１４、５１３６２、５１０５８、５０１７０、５１９５４、５２２５０、５１９３０、５１６８２、５２５９４、５２６１０、５１１６２、４９１６２、５０８９８、４９２２６、５１６５８、５２５５４、５２６３４、５１３９４、４９０３４、５２５４６、５２５２２、５２６１８、５２５３０、２８３２２、２６５３０、２６５７８、２６６０２、２６６３４、２６６２６、２６６９８、２６７４６、２６７５４、２６７８６、２６８８２、２７７２２、２７７３０、２７７３８、２７７７０、２７７５４、２７７６２、２７８０２、２７８５０、２７８４２、２７９２２、２７９４６、２７９８６、２８１１４、２８１２２、２８１４６、２８１８６、２８１９４、２８３３８、２８３４６、２８３２２、２８３７８、２８３７０、２８４５８、２８５０６、２８６３４、２８６４２、２８６５０、３４４４２、または４５９０６から選択されるＦＸＮガイド配列の１７、１８、１９、または２０個の連続するヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号５１７０６、５１０５８、５１７５４、５２０９０、５２５９４、５２０９８、５２２９８、５２１０６、５１６８２、５２０６６、５２３５４、５２４５８、５２２９０、５２４９８、５１６５８、５１９３０、５１１６２、５２５０６、５１７６２、５１７４６、５２３８６、５２２５８、５２５３０、５２６３４、２７８５０、２８６３４、２６８８２、２８６５０、２８３７０、２８１９４、２６６２６、２６６３４、２６７８６、２６７５４、２７７７０、２６５７８、２８１３０、２７７３８、２８３３８、２８６４２、２６６０２、２７７５４、２７７３０、及び２８１２２から選択されるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号４７０４７、７４４７、７４６３、４６９６７、４６７６８、７６８０、及び４７０３２から選択されるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号４７０４５、７４４５、７４６１、４６７６６、７６７８、及び４７０３０から選択されるスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号４７０４７及び７４４７；７４６３及び４６９６７；４６７６８及び７６８０；４７０３２及び７４４７から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号４７０４７及び７４４７を含む。いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号５２８９８及び２６５４６を含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、または１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物が提供され、ここで、１つ以上のガイドＲＮＡは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）を、筋緊張性ジストロフィー１型に関連する筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ遺伝子（ＦＭＲ１）におけるＣＴＧリピート領域内またはその近くの標的ＤＮＡ配列に誘導するガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、表２または配列表に示されるＦＭＲ１ガイド配列を含むｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ｇＲＮＡは、表２または配列表に示されるＦＭＲ１ガイド配列の１７、１８、１９、または２０個の連続するヌクレオチドを含むｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、表２または配列表に示されているＦＭＲ１ガイド配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続したヌクレオチドに対して約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含むｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、表２または配列表に示されているガイド配列に対して約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、ｔｒＲＮＡをさらに含む。本明細書に記載の各組成物及び方法の実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として会合することができるか、または別個のＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）上にあり得る。ｓｇＲＮＡとの関係において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡ成分は、例えば、ホスホジエステル結合または他の共有結合を介して共有結合され得る。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号５２６２、５７８２、５８３０、５９２６、５９５０、５９９８、６０２２、５３１０、及び５３３４から選択されるスペーサー配列を含むスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号５８３０、６０２２、５２６２、及び５３１０から選択されるスペーサー配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号５２６２、５３３４、及び５８３０から選択されるスペーサー配列を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号５２６４、５３３６、５８３２、６０２４、及び５３１２から選択されるスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号５２６２を含むスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号５２６４から選択されるスペーサー配列を含むスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号５２６２、５７８２、５８３０、５９２６、５９５０、５９９８、６０２２、５３１０、または５３３４から選択されるＦＭＲ１ガイド配列の１７、１８、１９、もしくは２０個の連続したヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号５７８２及び５２６２；５８３０及び５２６２；５９２６及び５２６２；５９５０及び５２６２；及び５９９８及び５２６２から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号５８３０及び５２６２；ならびに６０２２及び５３１０から選択される第１及び第２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、１対のガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上の組成物として提供され、ガイドＲＮＡの対は、配列番号５３３４及び５８３０を含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物が提供され、ここで、１つ以上のガイドＲＮＡは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）を、ハンチントン病に関連するハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子におけるリピート領域内またはその近くの標的ＤＮＡ配列に誘導するガイド配列を含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物が提供され、ここで、１つ以上のガイドＲＮＡは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）を、脆弱ＸＥ症候群に関連する脆弱Ｘ精神遅滞２（ＦＭＲ２）遺伝子におけるリピート領域内またはその近くの標的ＤＮＡ配列に誘導するガイド配列を含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物が提供され、ここで、１つ以上のガイドＲＮＡは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）を、Ｘ連鎖性球脊髄性筋萎縮症（ケネディ病）に関連するアンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子におけるリピート領域内またはその近くの標的ＤＮＡ配列に誘導するガイド配列を含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物が提供され、ここで、１つ以上のガイドＲＮＡは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）を、ＡＲＸ関連乳児てんかん性脳症、早期乳児てんかん性脳症１、大田原症候群、パーティントン症候群、またはウェスト症候群に関連するアリスタレス関連ホメオボックス（ＡＲＸ）遺伝子におけるリピート領域内またはその近くの標的ＤＮＡ配列に誘導するガイド配列を含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物が提供され、ここで、１つ以上のガイドＲＮＡは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）を、脊髄小脳失調症の一形態に関連するアタキシン１（ＡＴＸＮ１）、アタキシン２（ＡＴＸＮ２）、アタキシン３（ＡＴＸＮ３）、カルシウム電圧ゲートチャネルサブユニットアルファ１ Ａ（ＣＡＣＮＡ１Ａ）、アタキシン７（ＡＴＸＮ７）、ＡＴＸＮ８反対鎖ｌｎｃＲＮＡ（ＡＴＸＮ８ＯＳ／ＳＣＡ８）、セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼ２Ａ ５５ｋＤａ調節サブユニットＢベータアイソフォーム（ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ）、またはＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）遺伝子におけるリピート領域内またはその近くの標的ＤＮＡ配列に誘導するガイド配列を含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物が提供され、ここで、１つ以上のガイドＲＮＡは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）を、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）に関連するアトロフィン－１（ＡＴＮ１）遺伝子におけるリピート領域内またはその近くの標的ＤＮＡ配列に誘導するガイド配列を含む。
本明細書に記載の組成物、使用、及び方法の実施形態のそれぞれにおいて、ガイドＲＮＡは、「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」として２つのＲＮＡ分子を含み得る。ｄｇＲＮＡは、例えば、表２及び配列表に示されるガイド配列を含むｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子と、ｔｒＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子とを含む。第１及び第２のＲＮＡ分子は共有結合していない場合があるが、ｃｒＲＮＡの一部とｔｒＲＮＡとの間の塩基対を介してＲＮＡ二重鎖を形成していてもよい。
本明細書に記載の組成物、使用、及び方法の実施形態のそれぞれにおいて、ガイドＲＮＡは、「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」として単一ＲＮＡ分子を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｔｒＲＮＡに共有結合された表２に示されるガイド配列を含むｃｒＲＮＡ（またはその一部）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、表２及び配列表に示されているガイド配列の１７、１８、１９、もしくは２０個の連続したヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、リンカーを介して共有結合している。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの部分とｔｒＲＮＡとの間の塩基対形成を介してステムループ構造を形成する。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、ホスホジエステル結合ではない１つ以上の結合を介して共有結合している。
いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来するｔｒＲＮＡ配列のすべてまたは一部を含み得る。いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、短縮されたまたは修飾された野生型ｔｒＲＮＡを含む。ｔｒＲＮＡの長さは、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって異なる。いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００を超えるヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、例えば、１つ以上のヘアピンもしくはステムループ構造、または１つ以上のバルジ構造などのある特定の二次構造を含み得る。
いくつかの実施形態において、１以上のガイドＲＮＡ（または１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸）を含む組成物が提供され、１つ以上のｇＲＮＡは、配列番号１０１～４９８８、５００１～７２６４、または７３０１～５３３７２のいずれか１つのガイド配列を含む。
一態様では、配列番号１０１～４９８８、５００１～７２６４、または７３０１～５３３７２の核酸のいずれかと、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含むｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードするベクターを含む組成物が提供される。
他の実施形態において、組成物は、少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つのｇＲＮＡ、または少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つのｇＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含み、ｇＲＮＡは、配列番号１０１～４９８８、５００１～７２６４、または７３０１～５３３７２のガイド配列のうちの任意の２つ以上から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、それぞれが、配列番号１０１～４９８８、５００１～７２６４、または７３０１～５３３７２の核酸のいずれかと、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含む少なくとも２つのｇＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡをコードする核酸を含む組成物が提供され、ガイドＲＮＡをコードする核酸はベクターである。いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物が提供され、１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸は、１つ以上のベクターである。
本明細書に記載されているもののいずれかなど、任意のタイプのベクターを使用することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書に記載の１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、非組み込み型ウイルスベクターである（すなわち、ベクターから宿主染色体に配列を挿入しない）。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アルファウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、筋肉特異的プロモーターを含む。例示的な筋肉特異的プロモーターには、筋肉クレアチンキナーゼプロモーター、デスミンプロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター、またはＳＰｃ５－１２プロモーターが含まれる。ＵＳ２００４／０１７５７２７Ａ１；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． （２０１４） １１， ３４５－３６４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ （２００８） １５， １４８９－１４９９を参照のこと。いくつかの実施形態において、筋肉特異的プロモーターは、ＣＫ８プロモーターである。いくつかの実施形態において、筋肉特異的プロモーターは、ＣＫ８ｅプロモーターである。前述の実施形態のいずれかにおいて、ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターであり得る。
本明細書に開示されるガイドＲＮＡ組成物は、ＤＭＰＫ遺伝子におけるトリヌクレオチドリピートまたは自己相補的領域などのトリヌクレオチドリピートまたは自己相補的領域内またはその近くの標的配列を認識する（例えば、ハイブリダイズする）ように設計されている。例えば、標的配列を、ガイドＲＮＡを含む提供されたＣａｓクリーバーゼによって認識させ、切断することができる。いくつかの実施形態において、ＣａｓクリーバーゼなどのＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡによって標的配列に誘導されてもよく、ここで、ガイドＲＮＡのガイド配列は標的配列とハイブリダイズし、ＣａｓクリーバーゼなどのＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼが標的配列を切断する。
いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡの選択は、トリヌクレオチドリピート伸長疾患に関連する任意の遺伝子などの目的の遺伝子内の標的配列に基づいて決定される。例示的な目的の遺伝子を、表１に列挙する。
特定の理論に拘束されることなく、変異（例えば、ヌクレアーゼ媒介ＤＳＢの修復から生じる切除）は、遺伝子のある特定の領域で切断が起こる場合、より効率的に提供され、及び／またはより良好に許容され得るので、ＤＳＢの位置は、生じる可能性のある切除後対立遺伝子の重要な要因である。
いくつかの実施形態において、ガイド配列は、目的のヒト遺伝子に存在する標的配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である。いくつかの実施形態において、標的配列は、ガイドＲＮＡのガイド配列に相補的であり得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡのガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性または同一性の程度は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡの標的配列及びガイド配列は、１００％相補的または同一であり得る。他の実施形態において、ｇＲＮＡの標的配列及びガイド配列は、少なくとも１つのミスマッチを含有し得る。例えば、ｇＲＮＡの標的配列及びガイド配列は、１、２、３、または４つのミスマッチを含有する場合があり、ガイド配列の全長は２０である。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡの標的配列及びガイド配列は、１～４のミスマッチを含有する場合があり、ガイド配列は、２０ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物または製剤は、本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼなどのＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼなどのＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡは、提供、使用、または投与される。
修飾ｇＲＮＡ
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは化学的に修飾されている。１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｇＲＮＡは、「修飾」ｇＲＮＡまたは「化学修飾」ｇＲＮＡと呼ばれ、カノニカルなＡ、Ｇ、Ｃ、及びＵ残基の代わりにまたはそれらに加えて使用される１つ以上の非天然及び／または天然に存在する成分または配置の存在を説明する。いくつかの実施形態において、修飾ｇＲＮＡは、非カノニカルなヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いて合成され、ここでは「修飾された」と呼ばれる。修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドとしては、（ｉ）ホスホジエステル骨格結合における非結合ホスフェート酸素の一方または両方の、及び／または結合ホスフェート酸素の１つ以上の改変、例えば、置換（例示的な骨格修飾）；（ｉｉ）リボース糖の成分、例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシルの改変、例えば、置換（例示的な糖修飾）；（ｉｉｉ）ホスフェート部分の「デホスホ」リンカーによる大規模な置換（例示的な骨格修飾）；（ｉｖ）非カノニカル核酸塩基を含む天然に存在する核酸塩基の修飾または置換（例示的な塩基修飾）；（ｖ）リボース－ホスフェート骨格の置換または修飾（例示的な骨格修飾）；（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾もしくは置換、または部分、キャップもしくはリンカーのコンジュゲーション（そのような３’もしくは５’キャップ修飾には、糖及び／または骨格修飾が含まれる）；ならびに（ｖｉｉ）糖の修飾または置換（例示的な糖修飾）のうちの１つ以上を挙げることができる。
上記のような化学修飾を組み合わせて、２、３、４、またはそれ以上の修飾を有することができるヌクレオシド及びヌクレオチド（総称して「残基」）を含む修飾ｇＲＮＡを提供することができる。例えば、修飾残基は、修飾糖及び修飾核酸塩基、または修飾糖及び修飾ホスホジエステルを有することができる。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡのすべての塩基は修飾されており、例えば、すべての塩基は、ホスホロチオエート基などの修飾リン酸基を有する。ある特定の実施形態において、ｇＲＮＡ分子のリン酸基のすべて、または実質的にすべてが、ホスホロチオエート基で置き換えられている。いくつかの実施形態において、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの５’末端またはその近くに少なくとも１つの修飾残基を含む。いくつかの実施形態において、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの３’末端またはその近くに少なくとも１つの修飾残基を含む。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の修飾残基を含む。いくつかの実施形態において、修飾ｇＲＮＡにおける位置の少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％）は、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドである。
非修飾核酸は、例えば、細胞内ヌクレアーゼまたは血清中に見られるものによって分解されやすい可能性がある。例えば、ヌクレアーゼは核酸のホスホジエステル結合を加水分解することができる。したがって、一態様では、本明細書に記載のｇＲＮＡは、例えば、細胞内または血清ベースのヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の修飾ｇＲＮＡ分子は、インビボ及びエクスビボの両方で、細胞の集団に導入された場合、自然免疫応答の低下を示す可能性がある。「自然免疫応答」という用語は、サイトカイン、特にインターフェロンの発現及び放出、ならびに細胞死の誘発を含む、一本鎖核酸を含む外因性核酸に対する細胞応答を含む。
骨格修飾のいくつかの実施形態において、修飾残基のリン酸基は、１つ以上の酸素を異なる置換基で置き換えることによって修飾することができる。さらに、修飾残基、例えば、修飾核酸中に存在する修飾残基は、本明細書に記載されるように、非修飾リン酸部分の修飾リン酸基による大規模な置換を含み得る。いくつかの実施形態において、リン酸骨格の骨格修飾は、非荷電リンカーまたは非対称電荷分布を有する荷電リンカーのいずれかをもたらす改変を含み得る。
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート及びホスホトリエステルが挙げられる。非修飾リン酸基のリン原子はアキラルである。しかし、非架橋酸素の１つを上記の原子または原子の群のうちの１つに置き換えると、リン原子がキラルになる可能性がある。不斉リン原子は、「Ｒ」配置（ここではＲｐ）または「Ｓ」配置（ここではＳｐ）のいずれかを有することができる。骨格は、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）を窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレンホスホネート）で置き換えることによっても修飾することができる。置換は、連結酸素の一方でまたは連結酸素の両方で起こり得る。
リン酸基は、ある特定の骨格修飾において、リン非含有接続部で置き換えることができる。いくつかの実施形態において、荷電リン酸基は、中性部分によって置き換えることができる。リン酸基を置換することができる部分の例としては、例えば、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ及びメチレンオキシメチルイミノ、を挙げることができるが、これらに限定されない。
核酸を模倣することができる足場はまた、ホスフェートリンカー及びリボース糖がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲートによって置き換えられるように構築することができる。そのような修飾は、骨格修飾及び糖修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、サロゲート骨格によって繋ぐことができる。例として、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシドサロゲートが挙げられるが、これらに限定されない。
修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、糖基への１つ以上の修飾、すなわち糖修飾を含むことができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）を修飾することができ、例えば、複数の異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で置き換えることができる。いくつかの実施形態において、２’－ヒドロキシル基への修飾は、ヒドロキシルがもはや脱プロトン化されて２’－アルコキシドイオンを形成することができないので、核酸の安定性を高めることができる。
２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、ここで、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（式中、Ｒは、例えば、Ｈもしくは任意選択で置換されたアルキルであり得、ｎは、０～２０（例えば、０～４、０～８、０～１０、０～１６、１～４、１～８、１～１０、１～１６、１～２０、２～４、２～８、２～１０、２～１６、２～２０、４～８、４～１０、４～１６、及び４～２０）の整数であり得る）、を挙げることができる。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅであり得る。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基修飾は、２’－ヒドロキシル基をフッ化物で置き換える２’－フルオロ修飾であり得る。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基修飾は、２’ヒドロキシルが、例えば、Ｃ１－６アルキレンまたはＣ１－６ヘテロアルキレンブリッジによって同じリボース糖の４’炭素に接続され得る「ロックされた」核酸（ＬＮＡ）を含むことができ、ここで、例示的なブリッジとして、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノブリッジ；Ｏ－アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）及びアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ－アミノ、（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）を挙げることができる。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基修飾は、リボース環がＣ２’－Ｃ３’結合を欠く「アンロックされた」核酸（ＵＮＡ）を含むことができる。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基修飾は、メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えば、ＰＥＧ誘導体）を含み得る。
「デオキシ」２’修飾としては、水素（すなわち、例えば、部分的にｄｓＲＮＡのオーバーハング部分におけるデオキシリボース糖）；ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード）；アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２－アミノ（ここで、アミノは、例えば、本明細書に記載のようなものであり得る）、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（ここで、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、シアノ；メルカプト；アルキル－チオ－アルキル；チオアルコキシ；ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルであって、例えば、本明細書に記載のアミノで任意選択で置換することができるもの、を挙げることができる。
糖修飾は、リボース中の対応する炭素とは反対の立体化学的配置を有する１つ以上の炭素を含有することもできる糖基を含むことができる。したがって、修飾核酸は、糖として、例えば、アラビノースを含有するヌクレオチドを含むことができる。修飾核酸はまた、脱塩基糖を含み得る。これらの脱塩基糖はまた、糖の構成原子の１つ以上でさらに修飾することができる。修飾された核酸はまた、例えば、Ｌ－ヌクレオシドなど、Ｌ型である１つ以上の糖を含むことができる。
修飾核酸に組み込むことができる、本明細書に記載の修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、修飾塩基を含むことができ、核酸塩基とも呼ばれる。核酸塩基の例としては、これらに限定されないが、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が挙げられる。これらの核酸塩基は、修飾されるか、または完全に置換されて、修飾核酸に組み込むことができる修飾残基を提供することができる。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリンアナログ、またはピリミジンアナログから独立して選択することができる。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、例えば、塩基の天然に存在する合成誘導体を含むことができる。
デュアルガイドＲＮＡを使用する実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡのそれぞれは、修飾を含有することができる。そのような修飾は、ｃｒＲＮＡ及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡの一端または両端にあり得る。ｓｇＲＮＡを含む実施形態において、ｓｇＲＮＡの一端または両端の１つ以上の残基を化学的に修飾することができ、及び／または内部ヌクレオシドを修飾することができ、及び／またはｓｇＲＮＡ全体を化学的に修飾することができる。ある特定の実施形態は、５’末端修飾を含む。ある特定の実施形態は、３’末端修飾を含む。
２’－Ｏ－メチルの修飾が含まれる。
ヌクレオチド糖環に影響を与えることが示されている別の化学修飾は、ハロゲン置換である。例えば、ヌクレオチド糖環の２’－フルオロ（２’－Ｆ）置換は、オリゴヌクレオチド結合親和性及びヌクレアーゼ安定性を高めることができる。２’－フルオロ（２’－Ｆ）の修飾が含まれる。
ホスホロチオエート（ＰＳ）連結または結合とは、ホスホジエステル結合、例えばヌクレオチド塩基間の結合において、硫黄が１つの非架橋リン酸酸素の代わりに使用される結合を指す。ホスホロチオエートを使用してオリゴヌクレオチドを生成する場合、修飾オリゴヌクレオチドはＳ－オリゴと呼ばれることもある。
脱塩基ヌクレオチドは、窒素塩基を欠くヌクレオチドを指す。
逆塩基は、通常の５’から３’への連結と逆になっている連結（すなわち、５’から５’への連結または３’から３’への連結のいずれか）を有するものを指す。
脱塩基ヌクレオチドは、逆連結で結合することができる。例えば、脱塩基ヌクレオチドは、５’から５’への連結を介して末端５’ヌクレオチドに結合することができるか、または脱塩基ヌクレオチドは、３’から３’への結合を介して末端３’ヌクレオチドに結合することができる。末端５’ヌクレオチドまたは末端３’ヌクレオチドのいずれかにある逆脱塩基ヌクレオチドは、逆脱塩基エンドキャップと呼ばれることもある。
いくつかの実施形態において、５’末端の最初の３、４、または５ヌクレオチドのうちの１つ以上、及び３’末端の最後の３、４、または５ヌクレオチドのうちの１つ以上が修飾される。いくつかの実施形態において、修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ、逆脱塩基ヌクレオチド、ＰＳ結合、または安定性及び／または性能を高めるための当技術分野で周知の他のヌクレオチド修飾である。
いくつかの実施形態において、５’末端の最初の４つのヌクレオチド、及び３’末端の最後の４つのヌクレオチドは、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合で連結されている。
いくつかの実施形態において、５’末端の最初の３つのヌクレオチド、及び３’末端の最後の３つのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、５’末端の最初の３つのヌクレオチド、及び３’末端の最後の３つのヌクレオチドは、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。
リボ核タンパク質複合体
いくつかの実施形態において、組成物は、表２または配列表からの１つ以上のガイド配列を含む１つ以上のｇＲＮＡ、及びＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼなどのヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、二本鎖エンドヌクレアーゼ活性とも呼ぶことができるクリーバーゼ活性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの例としては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、及び他の原核生物のタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、次の段落のリストを参照のこと）、ならびにそれらの修飾（例えば、操作または変異）バージョンのものが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１６／０３１２１９８Ａ１；ＵＳ２０１６／０３１２１９９Ａ１を参照のこと。Ｃａｓヌクレアーゼの他の例としては、タイプＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのＣｓｍもしくはＣｍｒ複合体、またはそのＣａｓ１０、Ｃｓｍ１、またはＣｍｒ２サブユニット、及びタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのカスケード複合体またはそのＣａｓ３サブユニットが挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、タイプＩＩＡ、タイプＩＩＢ、またはタイプＩＩＣシステムに由来し得る。種々のＣＲＩＳＰＲシステム及びＣａｓヌクレアーゼの考察については、例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ９：４６７－４７７ （２０１１）；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １３： ７２２－３６ （２０１５）；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ， ６０：３８５－３９７ （２０１５）を参照のこと。
Ｃａｓヌクレアーゼが由来し得る非限定的な例示的な種としては 、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、及びＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａが挙げられる。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。さらなる実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。ある特定の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ またはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼと共にｇＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）と呼ばれる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼと共にｇＲＮＡは、Ｃａｓ ＲＮＰと呼ばれる。いくつかの実施形態において、ＲＮＰは、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、またはタイプＶの成分を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２またはＣａｓ１２ａ（以前はＣｐｆ１として知られていた）などのタイプＶシステムに由来し得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムからのＣａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９と共にｇＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＲＮＰと呼ばれる。
野生型Ｃａｓ９には、ＲｕｖＣとＨＮＨの２つのヌクレアーゼドメインがある。ＲｕｖＣドメインは非標的ＤＮＡ鎖を切断し、ＨＮＨドメインはＤＮＡの標的鎖を切断する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、２つ以上のＲｕｖＣドメイン及び／または２つ以上のＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９である。組成物、使用、及び方法の実施形態のそれぞれにおいて、Ｃａｓは標的ＤＮＡにおける二本鎖切断を誘導する。
いくつかの実施形態において、タンパク質の１つのドメインまたは領域が異なるタンパク質の一部によって置き換えられているキメラＣａｓヌクレアーゼが使用される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１などの異なるヌクレアーゼからのドメインで置き換えることができる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、修飾ヌクレアーゼであり得る。
他の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来し得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのカスケード複合体の成分であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ３タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、タイプＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来し得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲＮＡ切断活性を有し得る。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、一本鎖ニッカーゼ活性を有する、すなわち、１つのＤＮＡ鎖を切断して、「ニック」としても知られる一本鎖切断を生成することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓニッカーゼを含む。ニッカーゼは、ｄｓＤＮＡにニックを作成する酵素である、すなわち、一方の鎖を切断するが、ＤＮＡ二重らせんのもう一方は切断しない。いくつかの実施形態において、Ｃａｓニッカーゼは、例えば、触媒ドメインにおける１つ以上の改変（例えば、点変異）によって、エンドヌクレアーゼ活性部位が不活性化される、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、上記のＣａｓヌクレアーゼ）のバージョンである。例えば、Ｃａｓニッカーゼ及び例示的な触媒ドメインの変化の考察については、米国特許第８，８８９，３５６号を参照のこと。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼなどのＣａｓニッカーゼは、不活化ＲｕｖＣまたはＨＮＨドメインを有する。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、１つの機能的ヌクレアーゼドメインのみを含有するように修飾される。例えば、薬剤タンパク質を、ヌクレアーゼドメインの１つが変異するか、または完全にまたは部分的に削除されて、その核酸切断活性を低下させるように修飾することができる。いくつかの実施形態において、活性が低下したＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態において、不活性ＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態において、活性が低下したＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態において、不活性ＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質ヌクレアーゼドメイン内の保存アミノ酸は、ヌクレアーゼ活性を低減または改変するために置換される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにおけるアミノ酸置換を含み得る。ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換には、Ｄ１０Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が含まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｃｅｌｌ Ｏｃｔ ２２：１６３（３）： ７５９－７７１を参照のこと。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおけるアミノ酸置換を含み得る。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換には、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ、及びＤ９８６Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が含まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ． （２０１５）を参照のこと。さらなる例示的なアミノ酸置換には、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、及びＤ１２５５Ａ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ｑ７Ｑ２（ＣＰＦ１＿ＦＲＡＴＮ）に基づく）が含まれる。
いくつかの実施形態において、ニッカーゼをコードするｍＲＮＡは、それぞれ、標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖に相補的である１対のガイドＲＮＡと組み合わせて提供される。この実施形態において、ガイドＲＮＡは、ニッカーゼを標的配列に誘導し、標的配列の反対の鎖にニックを生成することによってＤＳＢを導入する（すなわち、二重ニッキング）。いくつかの実施形態において、二重ニッキングの使用により、特異性を改善し、オフターゲット効果を低減することができる。いくつかの実施形態において、ニッカーゼは、ＤＮＡの反対の鎖を標的とする２つの別個のガイドＲＮＡと共に使用されて、標的ＤＮＡに二重ニックを生成する。いくつかの実施形態において、ニッカーゼを、近接するように選択される２つの別個のガイドＲＮＡと共に使用して、標的ＤＮＡにおいて二重ニックを生成する。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、クリーバーゼ及びニッカーゼ活性を欠いている。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、ｄＣａｓ ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む。ｄＣａｓポリペプチドは、本質的に触媒（クリーバーゼ／ニッカーゼ）活性を欠いているが、ＤＮＡ結合活性を有する。いくつかの実施形態において、ｄＣａｓポリペプチドは、ｄＣａｓ９ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、クリーバーゼ及びニッカーゼ活性を欠くＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたはｄＣａｓ ＤＮＡ結合ポリペプチドは、例えば、触媒ドメインにおける１つ以上の改変（例えば、点変異）によって、エンドヌクレアーゼ活性部位が不活性化される、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、上記のＣａｓヌクレアーゼ）のバージョンである。例えば、ＵＳ２０１４／０１８６９５８Ａ１；ＵＳ２０１５／０１６６９８０Ａ１を参照のこと。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、１つ以上の異種機能的ドメインを含む（例えば、融合ポリペプチドであるか、またはそれを含む）。
いくつかの実施形態において、異種機能ドメインにより、細胞の核へのＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼの輸送を促進することができる。例えば、異種機能ドメインは核局在化シグナル（ＮＬＳ）であり得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、１～１０のＮＬＳ（複数可）と融合することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、１～５のＮＬＳ（複数可）と融合することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、１つのＮＬＳと融合することができる。１つのＮＬＳが使用される場合、ＮＬＳを、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ配列のＮ末端またはＣ末端で連結することができる。ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ配列内に挿入することもできる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、１つを超えるＮＬＳと融合することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、２、３、４、または５つのＮＬＳと融合することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、２つのＮＬＳと融合することができる。ある特定の状況では、２つのＮＬＳは、同じ（例えば、２つのＳＶ４０ ＮＬＳ）であってもまたは異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、カルボキシ末端で連結された２つのＳＶ４０ ＮＬＳ配列に融合される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、２つのＮＬＳと融合され得、１つはＮ末端で連結され、そして１つはＣ末端で連結され得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、３つのＮＬＳと融合することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、ＮＬＳと融合しなくてもよい。
いくつかの実施形態において、異種機能ドメインにより、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼの細胞内半減期を改変することができる場合がある。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼの半減期を、増加させることができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼの半減期を短縮することができる。いくつかの実施形態において、異種機能ドメインは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼの安定性を増加させることができる場合がある。いくつかの実施形態において、異種機能ドメインにより、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼの安定性を抑制することができる場合がある。いくつかの実施形態において、異種機能ドメインは、タンパク質分解のためのシグナルペプチドとして作用し得る。いくつかの実施形態において、タンパク質分解は、例えば、プロテアソーム、リソソームプロテアーゼ、またはカルパインプロテアーゼなどのタンパク質分解酵素によって媒介され得る。いくつかの実施形態において、異種機能ドメインは、ＰＥＳＴ配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼは、ユビキチンまたはポリユビキチン鎖の付加によって修飾され得る。いくつかの実施形態において、ユビキチンは、ユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）であり得る。ユビキチン様タンパク質の非限定的な例としては、小ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ユビキチン交差反応性タンパク質（ＵＣＲＰ、インターフェロン刺激遺伝子－１５（ＩＳＧ１５）としても知られる）、ユビキチン関連修飾因子－１（ＵＲＭ１）、ニューロン前駆細胞発現発生下方制御タンパク質－８（ｎｅｕｒｏｎａｌ－ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ－ｃｅｌｌ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－８ ）（ＮＥＤＤ８、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅではＲｕｂ１とも呼ばれる）、ヒト白血球抗原Ｆ関連（ＦＡＴ１０）、オートファジー－８（ＡＴＧ８）及び－１２（ＡＴＧ１２）、Ｆａｕユビキチン様タンパク質（ＦＵＢ１）、膜アンカー型ＵＢＬ（ＭＵＢ）、ユビキチン折り畳み修飾因子－１（ＵＦＭ１）、及びユビキチン様タンパク質－５（ＵＢＬ５）、が挙げられる。
いくつかの実施形態において、異種機能ドメインは、マーカードメインであり得る。マーカードメインの非限定的な例には、蛍光タンパク質、精製タグ、エピトープタグ、及びレポーター遺伝子配列が含まれる。いくつかの実施形態において、マーカードメインは、蛍光タンパク質であり得る。適切な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ，）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、及びオレンジ色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）またはその他の適切な蛍光タンパク質、が挙げられる。他の実施形態において、マーカードメインは、精製タグ及び／またはエピトープタグであり得る。非限定的な例示的なタグとしては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、６ｘＨｉｓ、８ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、ポリ－Ｈｉｓ、及びカルモジュリンが挙げられる。非限定的な例示的なレポーター遺伝子としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質が挙げられる。
追加の実施形態において、異種機能ドメインは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを特定の細胞小器官、細胞型、組織、または器官に標的化することができる。いくつかの実施形態において、異種機能ドメインは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを筋肉に標的化することができる。
さらなる実施形態において、異種機能ドメインは、エフェクタードメインであり得る。ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼがその標的配列に誘導される場合、例えば、ＣａｓヌクレアーゼがｇＲＮＡによって標的配列に誘導される場合、エフェクタードメインは標的配列を修飾するかまたは標的配列に影響を及ぼすことができる。いくつかの実施形態において、エフェクタードメインは、核酸結合ドメインまたはヌクレアーゼドメイン（例えば、非Ｃａｓヌクレアーゼドメイン）から選択され得る。いくつかの実施形態において、異種機能ドメインは、ＦｏｋＩヌクレアーゼなどのヌクレアーゼである。例えば、米国特許第９，０２３，６４９号を参照のこと。
ｇＲＮＡの有効性の決定
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡの有効性は、ＲＮＰを形成する他の成分と一緒に送達されるかまたは発現するときに決定される。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９などのＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼと共に発現する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼまたはニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼなどのＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼをすでに安定して発現している細胞株に送達されるか、または細胞株において発現する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ＲＮＰの一部として細胞に送達される。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼまたはニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼなどのＲＮＡ誘導ＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと共に細胞に送達される。
本明細書に記載されるように、本明細書に開示されるＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼ及び１つ以上のガイドＲＮＡの使用により、例えば、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤の存在下で、細胞機構による修復時に、トリヌクレオチドリピートまたは自己相補的領域の切除を生じ得るＤＮＡの二本鎖切断をもたらすことができる。
いくつかの実施形態において、特定のｇＲＮＡの有効性は、インビトロモデルに基づいて決定される。いくつかの実施形態において、インビトロモデルは、標的トリヌクレオチドリピートまたは自己相補的領域を含む細胞株であり、例えば、以下の実施例のセクションに記載される任意のそのような細胞株である。
いくつかの実施形態において、特定のｇＲＮＡの有効性は、ｇＲＮＡ選択プロセスのための複数のインビトロ細胞モデルにわたって決定される。いくつかの実施形態において、選択されたｇＲＮＡに関するデータの細胞株比較を実施する。いくつかの実施形態において、複数の細胞モデルにおけるクロススクリーニングを実施する。
いくつかの実施形態において、特定のｇＲＮＡの有効性は、インビトロモデルに基づいて決定される。いくつかの実施形態において、インビボモデルは齧歯動物モデルである。いくつかの実施形態において、齧歯動物モデルは、伸長トリヌクレオチドリピートまたは自己相補的領域を含む遺伝子を発現するマウスである。遺伝子は、表１に列挙された遺伝子のいずれかのヒトバージョンまたは齧歯類（例えば、マウス）ホモログであり得る。いくつかの実施形態において、遺伝子は、ヒトＤＭＰＫである。いくつかの実施形態において、遺伝子は、ＤＭＰＫの齧歯類（例えば、マウス）ホモログである。いくつかの実施形態において、インビボモデルは、非ヒト霊長類、例えば、カニクイザルである。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの有効性は、目的のトリヌクレオチドリピートの切除量によって測定される。切除の量は、任意の適切な方法、例えば、定量的シーケンシング；定量的ＰＣＲ；サザンブロットの定量分析；などによって決定することができる。
追加の実施形態が提供される：
実施形態１Ａは、ＤＮＡ中のトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを前記ＴＮＲにまたはその近くに誘導する、スペーサーを含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）任意選択でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含む、前記方法である。
実施形態２Ａは、ＤＮＡにおける自己相補的領域を切除する方法であって、前記自己相補的領域を含む細胞に、ｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを前記自己相補的領域にまたはその近くに誘導する、スペーサーを含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）任意選択でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含み、前記自己相補的領域が切除される、前記方法である。
実施形態３Ａは、ＤＮＡ中のトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、前記ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを前記ＴＮＲにまたはその近くに誘導する、スペーサーを含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び任ｉｉｉ）任意選択でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含み、少なくとも１つのＴＮＲが切除される、前記方法である。
実施形態４Ａ
前記自己相補的領域が、パリンドローム配列、同一方向リピート、逆方向リピート、ＧＣリッチ配列、またはＡＴリッチ配列を含み、任意選択で、ＧＣリッチネスまたはＡＴリッチネスは、ループ形成配列によって任意選択で中断される少なくとも１０ヌクレオチドの長さ全体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％である、実施形態２Ａに記載の方法。
実施形態５Ａ
前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＴＮＲまたは自己相補的領域にまたはその近くに送達する、第１及び第２のスペーサーを含む１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸が前記細胞に送達される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６Ａ
前記標的が（ｉ）前記ＴＮＲもしくは前記自己相補的領域内にあるか、または（ｉｉ）前記ＴＮＲもしくは前記自己相補的領域の１０、１５、２０、２５、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド内にある、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７Ａ
前記ＴＮＲが、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）におけるＣＴＧである、実施形態１Ａ、３Ａ、５Ａ、及び６Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態８Ａ
前記切除が筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）の治療をもたらす、実施形態７Ａに記載の方法。
実施形態９Ａ
前記ＴＮＲが、ハンチンチン、フラタキシン（ＦＸＮ）、脆弱Ｘ精神遅滞１（ＦＭＲ１）、脆弱Ｘ精神遅滞２（ＦＭＲ２）、及びアンドロゲン受容体（ＡＲ）、アリスタレス関連ホメオボックス（ＡＲＸ）、アタキシン１（ＡＴＸＮ１）、アタキシン２（ＡＴＸＮ２）、アタキシン３（ＡＴＸＮ３）、カルシウム電位依存性チャネルサブユニットアルファ１Ａ（ＣＡＣＮＡ１Ａ）、アタキシン７（ＡＴＸＮ７）、ＡＴＸＮ８反対鎖ｌｎｃＲＮＡ（ＡＴＸＮ８ＯＳ）、セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼ２Ａ ５５ｋＤａ調節サブユニットＢベータアイソフォーム（ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ）、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）、もしくはアトロフィン－１（ＡＴＮ１）遺伝子内にあるか、または前記ＴＮＲが、ＦＭＲ２の５’ＵＴＲに隣接している、実施形態１Ａ、３Ａ、５Ａ、及び６Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０Ａ
ハンチンチン（ＨＴＴ）における切除により、ハンチントン病（ＨＤ）の治療がもたらされる；ＦＸＮにおける切除により、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）の治療がもたらされる；ＦＭＲ１における切除により、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能不全（ＦＸＰＯＩ）、または脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）の治療がもたらされる；ＦＭＲ２におけるまたはＦＭＲ２の５’ＵＴＲに隣接する切除により、脆弱ＸＥ症候群（ＦＸＥＳ）の治療がもたらされる；ＡＲにおける切除により、Ｘ連鎖性球脊髄性筋萎縮症（ＸＳＢＭＡ）の治療がもたらされる；ＡＴＸＮ１における切除により、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）の治療がもたらされる；ＡＴＸＮ２における切除により、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）の治療がもたらされる；ＡＴＸＮ３における切除により、脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）の治療がもたらされる；ＣＡＣＮＡ１Ａにおける切除により、脊髄小脳失調症６型（ＳＣＡ６）の治療がもたらされる；ＡＴＸＮ７における切除により、脊髄小脳失調症７型（ＳＣＡ７）の治療がもたらされる；ＡＴＸＮ８ＯＳにおける切除により、脊髄小脳失調症８型（ＳＣＡ８）の治療がもたらされる；ＰＰＰ２Ｒ２Ｂにおける切除により、脊髄小脳失調症１２型（ＳＣＡ１２）の治療がもたらされる；ＴＢＰにおける切除により、脊髄小脳失調症１７型（ＳＣＡ１７）の治療がもたらされる；またはＡＴＮ１における切除により、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）の治療がもたらされる、実施形態９Ａに記載の方法。
実施形態１１Ａ
ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２Ａ
組成物であって、
スペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸であって、前記スペーサー配列が以下：
配列番号１０１～４９８８、５００１～７２６４、もしくは７３０１～５３３７２から選択されるスペーサー配列；または、
配列番号１０１～４９８８、５００１～７２６４、もしくは７３０１～５３３７２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続するヌクレオチドを有するスペーサー配列；または
配列番号１０１～４９８８、５００１～７２６４、もしくは７３０１～５３３７２から選択された配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるスペーサー配列、を含む、前記スペーサー配列を含む前記ガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする前記核酸；あるいは
１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸であって、前記１対のスペーサー配列が、以下：
配列番号２７０９～４０７６から選択される第１のスペーサー配列、及び配列番号１０１～２７０８から選択される第２のスペーサー配列；または
配列番号２７０９～４０７６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続するヌクレオチドを有する第１のスペーサー配列、及び配列番号１０１～２７０８から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続するヌクレオチドを有する第２のスペーサー配列；または
配列番号２７０９～４０７６から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である第１のスペーサー配列、及び配列番号１０１～２７０８から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である第２のスペーサー配列、を含む、前記１対のスペーサー配列を含む前記１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする前記１つ以上の核酸；あるいは
１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸であって、前記１対のスペーサー配列が、以下：
配列番号５００１～５４９６から選択される第１のスペーサー配列、及び配列番号５４９７～６０８０から選択される第２のスペーサー配列；または
配列番号５００１～５４９６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続するヌクレオチドを有する第１のスペーサー配列、及び配列番号５４９７～６０８０から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続するヌクレオチドを有する第２のスペーサー配列；または
配列番号５００１～５４９６から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である第１のスペーサー配列、及び配列番号５４９７～６０８０から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である第２のスペーサー配列、を含む、前記１対のスペーサー配列を含む前記１対のガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする前記１つ以上の核酸；あるいは
１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸であって、前記１対のスペーサー配列が、以下：
配列番号４６５９７～５３０２８から選択される第１のスペーサー配列、及び配列番号７３０１～４６５９６から選択される第２のスペーサー配列；または
配列番号４６５９７～５３０２８から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続するヌクレオチドを有する第１のスペーサー配列、及び配列番号７３０１～４６５９６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続するヌクレオチドを有する第２のスペーサー配列；または
配列番号４６５９７～５３０２８から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である第１のスペーサー配列、及び配列番号７３０１～４６５９６から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である第２のスペーサー配列、を含む、前記１対のスペーサー配列を含む前記１対のガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする前記１つ以上の核酸、を含む、前記組成物。
実施形態１３Ａは、スペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含み、ここで、前記スペーサー配列は、配列番号３３７８、３３５４、３３４６、３３３０、３３１４、２６５８、２６９０、２５４６、２５５４、２４９８、２５０６、４０１０、４０２６、３９１４、３９３８、３８５８、３８１８、３７９４、３７４６、３７７８、３７７０、３７２２、３６９０、３６５８、３５１４、３３７０、３４１８、３３９４、３３８６、３８０２、３６８２、２６１８、２５９４、２４５８、２５１４、２２５８、２３２２、２２１０、２１９４、２１１４、１９１４、１７７８、１７７０、１７３８、１７０６、１７４６、１６４２、１５３８、２２０２、２１７８、２１７０、または２１６２のうちのいずれか１つである、実施形態１２Ａに記載の組成物である。
実施形態１４Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３３７８の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態１５Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３３５４の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態１６Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３３４６の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態１７Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３３３０の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態１８Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３３１４の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態１９Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２６５８の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態２０Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２６９０の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態２１Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２５４６の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態２２Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２５５４の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態２３Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２４９８の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態２４Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２５０６の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態２５Ａ
前記スペーサー配列が配列番号４０１０の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態２６Ａ
前記スペーサー配列が配列番号４０２６の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態２７Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３９１４の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態２８Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３９３８の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態２９Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３８５８の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態３０Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３８１８の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態３１Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３７９４の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態３２Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３７４６の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態３３Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３７７８の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態３４Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３７７０の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態３５Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３２７２の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態３６Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３６９０の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態３７Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３６５８の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態３８Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３５１４の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態３９Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３３７０の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態４０Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３４１８の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態４１Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３３９４の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態４２Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３３８６の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態４３Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３８０２の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態４４Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３６８２の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態４５Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２６１８の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態４６Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２９５４の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態４７Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２４５８の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態４８Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２５１４の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態４９Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２２５８の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態５０Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２３２２の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態５１Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２２１０の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態５２Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２１９４の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態５３Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２１１４の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態５４Ａ
前記スペーサー配列が配列番号１９１４の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態５５Ａ
前記スペーサー配列が配列番号１７７８の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態５６Ａ
前記スペーサー配列が配列番号１７７０の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態５７Ａ
前記スペーサー配列が配列番号１７３８の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態５８Ａ
前記スペーサー配列が配列番号１７０６の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態５９Ａ
前記スペーサー配列が配列番号１７４６の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態６０Ａ
前記スペーサー配列が配列番号１６４２の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態６１Ａ
前記スペーサー配列が配列番号１５３８の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態６２Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２２０２の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態６３Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２１７８の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態６４Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２１７０の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態６５Ａ
スペーサー配列が配列番号２１６２の配列を有する、実施形態１３Ａに記載の組成物。
実施形態６６Ａ
１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡを含む、実施形態１２Ａの組成物であって、
第１のスペーサー配列は配列番号３３４６であり、第２のスペーサー配列は配列番号２５５４であるか、または
第１のスペーサー配列は配列番号３３４６であり、第２のスペーサー配列は配列番号１４９８であるか、または
第１のスペーサー配列は配列番号３３３０であり、第２のスペーサー配列は配列番号２５５４であるか、または
第１のスペーサー配列は配列番号３３３０であり、第２のスペーサー配列は配列番号２４９８であるか、または
第１のスペーサー配列は配列番号３３７８であり、第２のスペーサー配列は配列番号２５４６であるか、または
第１のスペーサー配列は配列番号３３５４であり、第２のスペーサー配列は配列番号２５４６であるか、または
第１のスペーサー配列は配列番号３３５４であり、第２のスペーサー配列は配列番号２５０６である、前記組成物。
実施形態６７Ａ
ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ、または前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸をさらに含む、実施形態１２Ａに記載の組成物。
実施形態６８Ａ
ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤をさらに含む、実施形態１２Ａまたは６７Ａに記載の組成物。
実施形態６９Ａ
前記ガイドＲＮＡがｓｇＲＮＡである、先行実施形態のいずれかに記載の方法または組成物。
実施形態７０Ａ
前記ｓｇＲＮＡが修飾されている、実施形態６９Ａに記載の方法または組成物。
実施形態７１Ａ
前記修飾により、１つ以上の２’位置及び／またはホスホジエステル結合が改変される、実施形態７０Ａの方法または組成物。
実施形態７２Ａ
前記修飾により、前記ｓｇＲＮＡの最初の３つのヌクレオチドのうちの１つ以上、またはすべてが改変される、実施形態７０Ａ～７１Ａのいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態７３Ａ
前記修飾により、前記ｓｇＲＮＡの最後の３つのヌクレオチドのうちの１つ以上、またはすべてが改変される、実施形態７０Ａ～７２Ａのいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態７４Ａ
前記修飾が、ホスホロチオエート修飾、２’－ＯＭｅ修飾、２’－Ｏ－ｍｏｅ修飾、２’－Ｆ修飾、２’－Ｏ－メチン－４’ブリッジ修飾、３’－チオホスホノアセテート修飾、及び２’－デオキシ修飾のうちの１つ以上を含む、実施形態７０Ａ～７３Ａのいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態７５Ａ
前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤がＮＵ７４４１、ＫＵ－００６０６４８、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、または化合物６である、先行実施形態のいずれかに記載の方法または組成物。
実施形態７６Ａ
前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が化合物３または化合物６である、実施形態７５Ａに記載の方法または組成物。
実施形態７７Ａ
少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１０，０００ＴＮＲが切除される、先行実施形態のいずれかに記載の方法または組成物。
実施形態７８Ａ
１～５、５～１０、１０～２０、２０～３０、４０～６０、６０～８０、８０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～３００、３００～５００、５００～７００、７００～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、７０００～８０００、８０００～９０００、または９０００～１０，０００ＴＮＲが切除される、先行実施形態のいずれかに記載の方法または組成物。
実施形態７９Ａ
前記ＴＮＲがＤＭＰＫ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＤＭＰＫ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ活性の増加；ホスホレンマン、ジヒドロピリジン受容体、ミオジェニン、Ｌ型カルシウムチャネルベータサブユニット、及び／またはミオシンホスファターゼ標的化サブユニットのリン酸化の増加；ミオシンホスファターゼの阻害の増加；及び／または筋肉喪失、筋衰弱、過眠症、１つ以上の実行機能障害、インスリン抵抗性、白内障形成、禿毛、または男性不妊症もしくは受精能低下の改善、のうちの１つ以上を任意選択で含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態８０Ａ
前記ＴＮＲがＨＴＴ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＨＴＴ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、線条体ニューロン喪失、不随意運動、易刺激性、うつ病、小不随意運動、協調性の欠如、新しい情報の学習や意思決定の困難、歩行、発話、及び／または嚥下の困難、及び／または思考及び／または推論能力の低下、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態８１Ａ
前記ＴＮＲが、ＦＭＲ１遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＦＭＲ１遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なＦＭＲ１転写物または脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質レベル、通常ＦＭＲＰに関連するｍＲＮＡの翻訳調節不全、ホスホコフィリン（ＣＦＬ１）のレベルの低下、ホスホコフィリンホスファターゼＰＰＰ２ＣＡのレベルの上昇、神経シナプスへのｍＲＮＡ輸送の低下、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０、及び／またはＣＲＹＡＢの発現の増加、ラミンＡ／Ｃアイソフォームの異常な細胞分布、４０歳未満の閉経などの早期発症閉経、卵巣の発達または機能の欠陥、血清ゴナドトロピン（例えばＦＳＨ）のレベルの上昇、進行性意図振戦、パーキンソニズム、認知機能低下、全身性脳萎縮、インポテンス、及び／または発達遅延、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態８２Ａ
前記ＴＮＲがＦＭＲ２遺伝子内にあるか、またはＦＭＲ２の５’ＵＴＲに隣接しており、前記ＴＮＲの切除により、ＦＭＲ２遺伝子内またはＦＭＲ２遺伝子に隣接する伸長リピートに関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なＦＭＲ２発現、発達遅延、アイコンタクト不良、言語の反復使用、及びハンドフラッピング、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態８３Ａ
前記ＴＮＲが、ＡＲ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＲ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なＡＲ発現、アンドロゲン受容体タンパク質のＣ末端短縮化断片の生成；カスパーゼ－３及び／またはユビキチン－プロテアソーム経路を介したアンドロゲン受容体タンパク質のタンパク質分解；ＣＲＥＢ結合タンパク質を含む核内封入体の形成；ｐ４４／４２、ｐ３８、及び／またはＳＡＰＫ／ＪＮＫの異常なリン酸化；筋衰弱；筋消耗；歩行、嚥下、及び／または発話の困難；女性化乳房；及び／または男性不妊症、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態８４Ａ
前記ＴＮＲが、ＡＴＸＮ１遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ１遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、ＡＴＸＮ１を含む凝集体の形成；プルキンエ細胞死；運動失調；筋肉のこわばり；急速な、不随意の眼球運動；手足のしびれ、うずき、または疼痛；及び／または筋肉の痙攣、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態８５Ａ
前記ＴＮＲが、ＡＴＸＮ２遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ２遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なＡＴＸＮ２産生；プルキンエ細胞死；運動失調；発話または嚥下の困難；手足の感覚喪失及び脱力；認知症；筋消耗；制御不良の筋緊張；及び／または不随意の筋反射運動、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態８６Ａ
前記ＴＮＲが、ＡＴＸＮ３遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ３遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なＡＴＸＮ３レベル；異常なベクリン－１レベル；オートファジーの阻害；スーパーオキシドジスムターゼ２の調節障害；運動失調；嚥下困難；手足の感覚喪失及び脱力；認知症；筋肉のこわばり；制御不良の筋緊張；振戦；レストレスレッグス症候群；及び／または筋肉の痙攣、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態８７Ａ
前記ＴＮＲが、ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、ＣＡＣＮＡ１Ａ発現細胞における異常なＣａＶ２．１電位依存性カルシウムチャネル；運動失調；発話困難；不随意の眼球運動；複視；腕協調運動の喪失；振戦；及び／または制御不良の筋緊張、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態８８Ａ
前記ＴＮＲが、ＡＴＸＮ７遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ７遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なヒストンアセチル化；異常なヒストン脱ユビキチン化；ＣＲＸによるトランス活性化の障害；ＡＴＸＮ７を含む核内封入体の形成；運動失調；歩行の協調運動障害；手、発話及び／または眼球運動の不十分な協調；網膜変性；及び／または色素性黄斑ジストロフィー、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態８９Ａ
前記ＴＮＲが、ＡＴＸＮ８ＯＳ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ８ＯＳ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、ＡＴＸＮ８ＯＳ ｍＲＮＡを含むリボ核封入体の形成；異常なＫＬＨＬ１タンパク質発現；運動失調；発話及び／または歩行困難；及び／または不随意の眼球運動、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態９０Ａ
前記ＴＮＲが、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＰＰＰ２Ｒ２Ｂ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なＰＰＰ２Ｒ２Ｂ発現；異常なホスファターゼ２活性；運動失調；小脳変性；歩行困難；及び／または手、発話及び／または眼球運動の不十分な協調、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態９１Ａ
前記ＴＮＲが、ＴＢＰ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＴＢＰ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常な転写開始；異常なＴＢＰタンパク質の蓄積（例えば、小脳ニューロンにおける）；異常な小脳ニューロン細胞死；運動失調；歩行困難；筋力低下；及び／または認知能力の喪失、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態９２Ａ
前記ＴＮＲが、ＡＴＮ１遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＮ１遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常な転写調節；異常なＡＴＮ１タンパク質の蓄積（例えば、ニューロンにおける）；異常なニューロン細胞死；不随意運動；及び／または認知能力の喪失、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態９３Ａ
前記組成物が薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態９４Ａ
前記ガイドＲＮＡが脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合している、またはウイルスベクターによってコードされている、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態９５Ａ
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アルファウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである、実施形態９４Ａに記載の方法または組成物。
実施形態９６Ａ
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、実施形態９５Ａに記載の方法または組成物。
実施形態９７Ａ
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９ベクターであり、ＡＡＶに続く番号がＡＡＶ血清型を示す、実施形態９６Ａに記載の方法または組成物。
実施形態９８Ａ
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ血清型９ベクターである、実施形態９６Ａに記載の方法または組成物。
実施形態９９Ａ
前記ウイルスベクターが組織特異的プロモーターを含む、実施形態９４Ａ～９８Ａのいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１００Ａ
前記ウイルスベクターが筋肉特異的プロモーターを含み、任意選択で、前記筋肉特異的プロモーターが筋肉クレアチンキナーゼプロモーター、デスミンプロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター、またはＳＰｃ５－１２プロモーターである、実施形態９４Ａ～９９Ａのいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１０１Ａ
前記ウイルスベクターがニューロン特異的プロモーターを含み、任意選択で前記ニューロン特異的プロモーターがエノラーゼプロモーターである、実施形態９４Ａ～１００Ａのいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１０２Ａ
ＤＭ１、ＨＤ、ＦＡ、ＦＸＳ、ＦＸＴＡＳ、ＦＸＰＯＩ、ＦＸＥＳ、ＸＳＢＭＡ、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１２、ＳＣＡ１７、またはＤＲＰＬＡを有するヒト対象を治療するための医薬を調製するための、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物の使用。
実施形態１０３Ａ
ＤＮＡ中のトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを前記ＴＮＲにまたはその近くに誘導する、スペーサーを含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）化合物３または化合物６であるＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含む、前記方法。
実施形態１０４Ａ
ＤＮＡにおける自己相補的領域を切除する方法であって、前記自己相補的領域を含む細胞に、ｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを前記自己相補的領域にまたはその近くに誘導する、スペーサーを含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）化合物３または化合物６であるＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含み、前記自己相補的領域が切除される、前記方法。
実施形態１０５Ａ
ＤＮＡ中のトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、前記ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを前記ＴＮＲにまたはその近くに誘導する、スペーサーを含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び任ｉｉｉ）化合物３または化合物６であるＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含み、少なくとも１つのＴＮＲが切除される、前記方法。
実施形態１０６Ａ
前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が化合物３である、実施形態１０３Ａまたは１０５Ａに記載の方法。
実施形態１０７Ａ
前記ＴＮＲがフラタキシン遺伝子内にある、実施形態１０６Ａに記載の方法。
実施形態１０８Ａ
前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が化合物６である、実施形態１０３Ａまたは１０５Ａに記載の方法。
実施形態１０９Ａ
前記ＴＮＲがＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるＣＴＧである、実施形態１０８Ａの方法。
実施形態１１０Ａ
前記ＴＮＲがフラタキシン遺伝子内にある、実施形態１０８Ａの方法。
実施形態１１１Ａ
前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＴＮＲまたは自己相補的領域にまたはその近くに送達する、第１及び第２のスペーサーを含む１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸が前記細胞に送達される、実施形態１０３Ａ～１１０Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１２Ａ
ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）配列番号３３７８、３３５４、３３４６、３３３０、３３１４、２６５８、２６９０、２５４６、２５５４、２４９８、２５０６、４０１０、４０２６、３９１４、３９３８、３８５８、３８１８、３７９４、３７４６、３７７８、３７７０、３７２２、３６９０、３６５８、３５１４、３３７０、３４１８、３３９４、３３８６、３８０２、３６８２、２６１８、２５９４、２４５８、２５１４、２２５８、２３２２、２２１０、２１９４、２１１４、１９１４、１７７８、１７７０、１７３８、１７０６、１７４６、１６４２、１５３８、２２０２、２１７８、２１７０、または２１６２のいずれか１つの配列を含むスペーサーを含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）任意選択でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含む、前記方法。
実施形態１１３Ａ
ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）配列番号３３７８、３３５４、３３４６、３３３０、３３１４、２６５８、２６９０、２５４６、２５５４、２４９８、２５０６、４０１０、４０２６、３９１４、３９３８、３８５８、３８１８、３７９４、３７４６、３７７８、３７７０、３７２２、３６９０、３６５８、３５１４、３３７０、３４１８、３３９４、３３８６、３８０２、３６８２、２６１８、２５９４、２４５８、２５１４、２２５８、２３２２、２２１０、２１９４、２１１４、１９１４、１７７８、１７７０、１７３８、１７０６、１７４６、１６４２、１５３８、２２０２、２１７８、２１７０、または２１６２のいずれか１つの配列を含むスペーサーを含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）任意選択でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含み、少なくとも１つのＴＮＲが切除される、前記方法。
実施形態１１４Ａ
前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が送達される、実施形態１１２Ａまたは１１３Ａに記載の方法。
実施形態１１５Ａ
前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が化合物６である、実施形態１１４Ａに記載の方法。
実施形態１１６Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３３７８の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１７Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３３５４の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１８Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３３４６の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１９Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３３３０の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２０Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３３１４の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２１Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２６５８の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２２Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２６９０の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２３Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２５４６の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２４Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２５５４の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２５Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２４９８の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２６Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２５０６の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２７Ａ
前記スペーサー配列が配列番号４０１０の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２８Ａ
前記スペーサー配列が配列番号４０２６の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２９Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３９１４の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３０Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３９３８の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３１Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３８５８の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３２Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３８１８の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３３Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３７９４の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３４Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３７４６の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３５Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３７７８の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３６Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３７７０の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３７Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３７２２の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３８Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３６９０の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３９Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３６５８の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４０Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３５１４の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４１Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３３７０の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４２Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３４１８の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４３Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３３９４の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４４Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３３８６の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４５Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３８０２の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４６Ａ
前記スペーサー配列が配列番号３６８２の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４７Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２６１８の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４８Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２５９４の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４９Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２４５８の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５０Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２５１４の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５１Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２２５８の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５２Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２３２２の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５３Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２２１０の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５４Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２１９４の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５５Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２１１４の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５６Ａ
前記スペーサー配列が配列番号１９１４の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５７Ａ
前記スペーサー配列が配列番号１７７８の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５８Ａ
前記スペーサー配列が配列番号１７７０の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５９Ａ
前記スペーサー配列が配列番号１７３８の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６０Ａ
前記スペーサー配列が配列番号１７０６の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６１Ａ
前記スペーサー配列が配列番号１７４６の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６２Ａ
前記スペーサー配列が配列番号１６４２の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６３Ａ
前記スペーサー配列が配列番号１５３８の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６４Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２２０２の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６５Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２１７８の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６６Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２１７０の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６７Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２１６２の配列を有する、実施形態１１２Ａ～１１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６８Ａ
前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＴＮＲまたは自己相補的領域にまたはその近くに送達する、第１及び第２のスペーサーを含む１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸が前記細胞に送達される、実施形態１１２Ａ～１６７Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６９Ａ
前記第１及び第２のスペーサーが配列番号３３４６及び２５５４の配列を有する、実施形態１６８Ａに記載の方法。
実施形態１７０Ａ
前記第１及び第２のスペーサーが配列番号３３４６及び２４９８の配列を有する、実施形態１６８Ａに記載の方法。
実施形態１７１Ａ
前記第１及び第２のスペーサーが配列番号３３３０及び２５５４の配列を有する、実施形態１６８Ａに記載の方法。
実施形態１７２Ａ
前記第１及び第２のスペーサーが配列番号３３３０及び２４９８の配列を有する、実施形態１６８Ａに記載の方法。
実施形態１７３Ａ
前記第１及び第２のスペーサーが配列番号３３７８及び２５４６の配列を有する、実施形態１６８Ａに記載の方法。
実施形態１７４Ａ
前記第１及び第２のスペーサーが配列番号３３７８及び２５０６の配列を有する、実施形態１６８Ａに記載の方法。
実施形態１７５Ａ
前記第１及び第２のスペーサーが配列番号３３５４及び２５４６の配列を有する、実施形態１６８Ａに記載の方法。
実施形態１７６Ａ
前記第１及び第２のスペーサーが配列番号３３５４及び２５０６の配列を有する、実施形態１６８Ａに記載の方法。
実施形態１７７Ａ
ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）配列番号５８３０、６０２２、５０７０、５３１０、５３３４、５６２２、５９２６、５９５０、または５９９８のいずれか１つの配列を有するスペーサーを含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）任意選択でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含む、前記方法。
実施形態１７８Ａ
ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、前記ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）配列番号５８３０、６０２２、５０７０、５３１０、５３３４、５６２２、５９２６、５９５０、または５９９８のいずれか１つの配列を有するスペーサーを含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）任意選択でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含み、少なくとも１つのＴＮＲが切除される、前記方法。
実施形態１７９Ａ
前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が送達される、実施形態１７７Ａまたは１７８Ａに記載の方法。
実施形態１８０Ａ
前記スペーサー配列が配列番号５８３０の配列を有する、実施形態１７７Ａ～１７９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８１Ａ
前記スペーサー配列が配列番号６０２２の配列を有する、実施形態１７７Ａ～１７９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８２Ａ
前記スペーサー配列が配列番号５０７０の配列を有する、実施形態１７７Ａ～１７９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８３Ａ
前記スペーサー配列が配列番号５３１０の配列を有する、実施形態１７７Ａ～１７９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８４Ａ
前記スペーサー配列が配列番号５３３４の配列を有する、実施形態１７７Ａ～１７９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８５Ａ
前記スペーサー配列が配列番号５６２２の配列を有する、実施形態１７７Ａ～１７９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８６Ａ
前記スペーサー配列が配列番号５９２６の配列を有する、実施形態１７７Ａ～１７９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８７Ａ
前記スペーサー配列が配列番号５９５０の配列を有する、実施形態１７７Ａ～１７９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８８Ａ
前記スペーサー配列が配列番号５９９８の配列を有する、実施形態１７７Ａ～１７９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８９Ａ
前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＴＮＲまたは自己相補的領域にまたはその近くに送達する、第１及び第２のスペーサーを含む１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸が前記細胞に送達される、実施形態１７７Ａ～１８８Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９０Ａ
前記第１及び第２のスペーサーが配列番号５８３０及び５０７０の配列を有する、実施形態１８９Ａに記載の方法。
実施形態１９１Ａ
前記第１及び第２のスペーサーが配列番号６０２２及び５３１０の配列を有する、実施形態１８９Ａに記載の方法。
実施形態１９２Ａ
前記第１及び第２のスペーサーが配列番号５６２２及び５０７０の配列を有する、実施形態１８９Ａに記載の方法。
実施形態１９３Ａ
前記第１及び第２のスペーサーが配列番号５９２６及び５０７０の配列を有する、実施形態１８９Ａに記載の方法。
実施形態１９４Ａ
前記第１及び第２のスペーサーが配列番号５９５０及び５０７０の配列を有する、実施形態１８９Ａに記載の方法。
実施形態１９５Ａ
前記第１及び第２のスペーサーが配列番号５９９８及び５０７０の配列を有する、実施形態１８９Ａに記載の方法。
実施形態１９６Ａ
ＦＸＮ遺伝子のイントロンにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）配列番号１６６９０、３４４４２、４５９０６、１５９９４、５２６６６、５１３２２、４６５９９、５２８９８、２６５４６、７４４７、４７０４７、または４９９８６のいずれか１つの配列を有するスペーサーを含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）任意選択でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含む、前記方法。
実施形態１９７Ａ
ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）配列番号１６６９０、３４４４２、４５９０６、１５９９４、５２６６６、５１３２２、４６５９９、５２８９８、２６５４６、７４４７、４７０４７、または４９９８６のいずれか１つの配列を有するスペーサーを含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）任意選択でＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含み、少なくとも１つのＴＮＲが切除される、前記方法。
実施形態１９８Ａ
前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が送達される、実施形態１９６Ａまたは１９７Ａに記載の方法。
実施形態１９９Ａ
前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が化合物３である、実施形態１９８Ａに記載の方法。
実施形態２００Ａ
前記スペーサー配列が、配列番号１６６９０の配列を有する、実施形態１９６Ａ～１９９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０１Ａ
前記スペーサー配列が、配列番号３４４４２の配列を有する、実施形態１９６Ａ～１９９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０２Ａ
前記スペーサー配列が配列番号４５９０６の配列を有する、実施形態１９６Ａ～１９９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０３Ａ
前記スペーサー配列が配列番号１５９９４の配列を有する、実施形態１９６Ａ～１９９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０４Ａ
前記スペーサー配列が配列番号５２６６６の配列を有する、実施形態１９６Ａ～１９９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０５Ａ
前記スペーサー配列が配列番号５１３２２の配列を有する、実施形態１９６Ａ～１９９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０６Ａ
前記スペーサー配列が配列番号４６５９９の配列を有する、実施形態１９６Ａ～１９９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０７Ａ
前記スペーサー配列が配列番号４９９８６の配列を有する、実施形態１９６Ａ～１９９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０８Ａ
前記スペーサー配列が配列番号５２８９８の配列を有する、実施形態１９６Ａ～１９９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０９Ａ
前記スペーサー配列が配列番号２６５４６の配列を有する、実施形態１９６Ａ～１９９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１０Ａ
前記スペーサー配列が配列番号７４４７の配列を有する、実施形態１９６Ａ～１９９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１１Ａ
前記スペーサー配列が配列番号４７０４７の配列を有する、実施形態１９６Ａ～１９９Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１２Ａ
前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを前記ＴＮＲにまたはその近くに送達する、第１及び第２のスペーサーを含む１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸が前記細胞に送達される、実施形態１９６Ａ～２１１Ａのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１３Ａ
前記第１及び第２のスペーサーが配列番号５２８９８及び２６５４６の配列を有する、実施形態２１２Ａの方法。
実施形態２１４Ａ
前記第１及び第２のスペーサーが配列番号４７０４７及び７４４７の配列を有する、実施形態２１２Ａの方法。
実施形態２１５Ａ
前記第１及び第２のスペーサーが配列番号５２６６６及び１５９９４の配列を有する、実施形態２１２Ａの方法。
実施形態２１６Ａ
１つのｇＲＮＡのみまたは１つのｇＲＮＡのみをコードするベクターが提供または送達される、実施形態１Ａ～４Ａ、６Ａ～１６７Ａ、１７７Ａ～１８８Ａ、または１９６Ａ～２１１Ａのいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１Ｂは、１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物であって、前記１対のスペーサー配列は、
ｉ．配列番号２８５６、２８６４、２８８０、２８９６、２９０４、２９１２、２９３６、２９４４、２９６０、２９９２、３０１６、３０２４、３０６４、３０９６、３１１２、３１２８、３１３６、３１４４、３１６０、３１６８、３１９２、３２００、３２０８、３２１６、３２２４、３２３２、３２４０、３２４８、３２５６、３２６４、３３１４、３３３０、３３４６、３３５４、３３７０、３３７８、３３８６、３３９４、３４１０、３４１８、３４２６、３４３４、３４４２、３４５０、３４５８、３４７４、３４８２、３４９０、３４９８、３５０６、３５１４、３５２２、３５３０、３５３８、３５４６、３５５４、３５７０、３５７８、３５８６、３６０２、３６１０、３６１８、３６３４、３６４２、３６５８、３６７４、３６８２、３６９０、３６９８、３７０６、３７２２、３７４６、３７６２、３７７０、３７７８、３７９４、３８０２、３８１８、３８２６、３８３４、３８５０、３８５８、３８９０、３８９８、３９０６、３９１４、３９２２、３９３０、３９３８、３９４６、３９９４、４０１０、４０１８、４０２６、４０３４、４０４２、４２０８、または４５０６から選択される第１のスペーサー配列、及び配列番号５６０、５８４、６０８、６１６、６５６、６７２、６８８、６９６、７１２、７４４、７５２、７６０、８４０、８６４、９６０、９７６、９８４、１００８、１０５６、１１２８、１１３６、１１５２、１２２４、１２４０、１２７２、１３３８、１３４６、１３７０、１３７８、１３８６、１３９４、１４０２、１４１０、１４１８、１４２６、１４３４、１４４２、１４５８、１４７４、１４８２、１４９０、１４９８、１５１４、１５３８、１５４６、１５５４、１５６２、１５７８、１５８６、１５９４、１６０２、１６１０、１６２６、１６３４、１６４２、１６５０、１６５８、１６９０、１７０６、１７１４、１７３８、１７４６、１７７０、１７７８、１７８６、１８０２、１８１０、１８１８、１８２６、１８３４、１８４２、１８５０、１８９０、１９１４、１９３０、１９３８、１９４６、１９６２、１９７０、１９７８、１９８６、１９９４、２０１０、２０１８、２０２６、２０４２、２０５０、２０５８、２０９０、２１１４、２１３０、２１６２、２１７０、２１７８、２２０２、２２１０、２２２６、２２４２、２２５８、２２６６、２２７４、２２８２、２２９８、２３１４、２３２２、２３３０、２３３８、２３４６、２３５４、２３７０、２３７８、２３９４、２４１８、２４３４、２４４２、２４５８、２４６６、２４７４、２４９８、２５０６、２５１４、２５２２、２５４６、２５５４、２５７０、２５８６、２６５８、４９８９、４９９０、４９９１、または４９９２から選択される第２のスペーサー配列；及び／または
ｉｉ． 配列番号２８５６、２８６４、２８８０、２８９６、２９０４、２９１２、２９３６、２９４４、２９６０、２９９２、３０１６、３０２４、３０６４、３０９６、３１１２、３１２８、３１３６、３１４４、３１６０、３１６８、３１９２、３２００、３２０８、３２１６、３２２４、３２３２、３２４０、３２４８、３２５６、３２６４、３３１４、３３３０、３３４６、３３５４、３３７０、３３７８、３３８６、３３９４、３４１０、３４１８、３４２６、３４３４、３４４２、３４５０、３４５８、３４７４、３４８２、３４９０、３４９８、３５０６、３５１４、３５２２、３５３０、３５３８、３５４６、３５５４、３５７０、３５７８、３５８６、３６０２、３６１０、３６１８、３６３４、３６４２、３６５８、３６７４、３６８２、３６９０、３６９８、３７０６、３７２２、３７４６、３７６２、３７７０、３７７８、３７９４、３８０２、３８１８、３８２６、３８３４、３８５０、３８５８、３８９０、３８９８、３９０６、３９１４、３９２２、３９３０、３９３８、３９４６、３９９４、４０１０、４０１８、４０２６、４０３４、４０４２、４２０８、または４５０６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続するヌクレオチドを有する第１のスペーサー配列、及び配列番号５６０、５８４、６０８、６１６、６５６、６７２、６８８、６９６、７１２、７４４、７５２、７６０、８４０、８６４、９６０、９７６、９８４、１００８、１０５６、１１２８、１１３６、１１５２、１２２４、１２４０、１２７２、１３３８、１３４６、１３７０、１３７８、１３８６、１３９４、１４０２、１４１０、１４１８、１４２６、１４３４、１４４２、１４５８、１４７４、１４８２、１４９０、１４９８、１５１４、１５３８、１５４６、１５５４、１５６２、１５７８、１５８６、１５９４、１６０２、１６１０、１６２６、１６３４、１６４２、１６５０、１６５８、１６９０、１７０６、１７１４、１７３８、１７４６、１７７０、１７７８、１７８６、１８０２、１８１０、１８１８、１８２６、１８３４、１８４２、１８５０、１８９０、１９１４、１９３０、１９３８、１９４６、１９６２、１９７０、１９７８、１９８６、１９９４、２０１０、２０１８、２０２６、２０４２、２０５０、２０５８、２０９０、２１１４、２１３０、２１６２、２１７０、２１７８、２２０２、２２１０、２２２６、２２４２、２２５８、２２６６、２２７４、２２８２、２２９８、２３１４、２３２２、２３３０、２３３８、２３４６、２３５４、２３７０、２３７８、２３９４、２４１８、２４３４、２４４２、２４５８、２４６６、２４７４、２４９８、２５０６、２５１４、２５２２、２５４６、２５５４、２５７０、２５８６、２６５８、４９８９、４９９０、４９９１、または４９９２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続するヌクレオチドを有する第２のスペーサー配列；及び／または
ｉｉｉ．配列番号２８５６、２８６４、２８８０、２８９６、２９０４、２９１２、２９３６、２９４４、２９６０、２９９２、３０１６、３０２４、３０６４、３０９６、３１１２、３１２８、３１３６、３１４４、３１６０、３１６８、３１９２、３２００、３２０８、３２１６、３２２４、３２３２、３２４０、３２４８、３２５６、３２６４、３３１４、３３３０、３３４６、３３５４、３３７０、３３７８、３３８６、３３９４、３４１０、３４１８、３４２６、３４３４、３４４２、３４５０、３４５８、３４７４、３４８２、３４９０、３４９８、３５０６、３５１４、３５２２、３５３０、３５３８、３５４６、３５５４、３５７０、３５７８、３５８６、３６０２、３６１０、３６１８、３６３４、３６４２、３６５８、３６７４、３６８２、３６９０、３６９８、３７０６、３７２２、３７４６、３７６２、３７７０、３７７８、３７９４、３８０２、３８１８、３８２６、３８３４、３８５０、３８５８、３８９０、３８９８、３９０６、３９１４、３９２２、３９３０、３９３８、３９４６、３９９４、４０１０、４０１８、４０２６、４０３４、４０４２、４２０８、または４５０６から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一である第１のスペーサー配列、及び配列番号５６０、５８４、６０８、６１６、６５６、６７２、６８８、６９６、７１２、７４４、７５２、７６０、８４０、８６４、９６０、９７６、９８４、１００８、１０５６、１１２８、１１３６、１１５２、１２２４、１２４０、１２７２、１３３８、１３４６、１３７０、１３７８、１３８６、１３９４、１４０２、１４１０、１４１８、１４２６、１４３４、１４４２、１４５８、１４７４、１４８２、１４９０、１４９８、１５１４、１５３８、１５４６、１５５４、１５６２、１５７８、１５８６、１５９４、１６０２、１６１０、１６２６、１６３４、１６４２、１６５０、１６５８、１６９０、１７０６、１７１４、１７３８、１７４６、１７７０、１７７８、１７８６、１８０２、１８１０、１８１８、１８２６、１８３４、１８４２、１８５０、１８９０、１９１４、１９３０、１９３８、１９４６、１９６２、１９７０、１９７８、１９８６、１９９４、２０１０、２０１８、２０２６、２０４２、２０５０、２０５８、２０９０、２１１４、２１３０、２１６２、２１７０、２１７８、２２０２、２２１０、２２２６、２２４２、２２５８、２２６６、２２７４、２２８２、２２９８、２３１４、２３２２、２３３０、２３３８、２３４６、２３５４、２３７０、２３７８、２３９４、２４１８、２４３４、２４４２、２４５８、２４６６、２４７４、２４９８、２５０６、２５１４、２５２２、２５４６、２５５４、２５７０、２５８６、２６５８、４９８９、４９９０、４９９１、もしくは４９９２から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である第２のスペーサー配列、を含む前記組成物である。
実施形態２Ｂは、
１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含む組成物であって、前記１対のスペーサー配列は、
ｉｖ．配列番号３７７８、４０２６、３７９４、４０１０、３９０６または３７４６から選択される第１のスペーサー配列、及び配列番号１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、１９１４、または２２１０から選択される第２のスペーサー配列；及び／または
ｖ．配列番号３２５６、２８９６、３１３６、または３２２４，から選択される第１のスペーサー配列、及び４９８９、５６０、６７２、９７６、７６０、９８４、または６１６から選択される第２のスペーサー配列；及び／または
ｖｉ．配列番号３７７８及び１７７８；３７７８及び１７４６；３７７８及び１７７０；３７７８及び１５８６；３７７８及び１９１４；３７７８及び２２１０；４０２６及び１７７８；４０２６及び１７４６；４０２６及び１７７０；４０２６及び１５８６；４０２６及び１９１４；４０２６及び２２１０；３７９４及び１７７８；３７９４及び１７４６；３７９４及び１７７０；３７９４及び１５８６；３７９４及び１５８６；３７９４及び１９１４；３７９４及び２２１０；４０１０及び１７７８；４０１０及び１７７０；４０１０及び１７４６；４０１０及び１５８６；４０１０及び１９１４；４０１０及び２２１０；３９０６及び１７７８；３９０６及び１７７８；３９０６及び１７４６；３９０６及び１７７０；３９０６及び１５８６；３９０６及び１９１４；３９０６及び２２１０；３７４６及び１７７８；３７４６及び１７４６；３７４６及び１７７０；３７４６及び１５８６；３７４６及び１９１４；または３７４６及び２２１０から選択される第１のスペーサー配列及び第２のスペーサー配列；及び／または
ｖｉｉ．配列番号３２５６及び４９８９；３２５６及び９８４；３２５６及び６１６；２８９６及び４９８９；２８９６及び６７２；２８９６及び７６０；３１３６及び４９８９；３１３６及び５６０；３２２４及び４９８９；３２２４及び９７６；または３２２４及び７６０から選択される第１のスペーサー配列及び第２のスペーサー配列を含む、前記組成物である。
実施形態３Ｂは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ、または前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸をさらに含む、実施形態１Ｂまたは２Ｂに記載の組成物である。
実施形態４Ｂは、前記ガイドＲＮＡがｓｇＲＮＡである、先行実施形態のいずれかに記載の組成物である。
実施形態５Ｂは、前記ｓｇＲＮＡが修飾されている、実施形態４Ｂに記載の組成物である。
実施形態６Ｂは、前記修飾により、１つ以上の２’位置及び／またはホスホジエステル結合が改変される、実施形態５Ｂに記載の組成物である。
実施形態７Ｂは、前記修飾により、前記ｓｇＲＮＡの最初の３つのヌクレオチドのうちの１つ以上、またはすべてが改変される、実施形態５Ｂ～６Ｂのいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態８Ｂは、前記修飾により、前記ｓｇＲＮＡの最後の３つのヌクレオチドのうちの１つ以上、またはすべてが改変される、実施形態５Ｂ～７Ｂのいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態９Ｂは、前記修飾が、ホスホロチオエート修飾、２’－ＯＭｅ修飾、２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾、２’－Ｆ修飾、２’－Ｏ－メチン－４’ブリッジ修飾、３’－チオホスホノアセテート修飾、及び２’－デオキシ修飾のうちの１つ以上を含む、実施形態５Ｂ～８Ｂのいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１０Ｂは、前記組成物が薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、先行実施形態のいずれかに記載の組成物である。
実施形態１１Ｂは、前記ガイドＲＮＡが脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合している、またはウイルスベクターによってコードされている、先行実施形態のいずれかに記載の組成物である。
実施形態１２Ｂは、前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アルファウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである、実施形態１１Ｂに記載の組成物である。
実施形態１３Ｂは、前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、実施形態１２Ｂに記載の組成物である。
実施形態１４Ｂは、前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、またはＡＡＶ９ベクターであり、ＡＡＶに続く番号がＡＡＶ血清型を示す、実施形態１３Ｂに記載の組成物である。
実施形態１５Ｂは、前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ血清型９ベクターである、実施形態１４Ｂに記載の組成物である。
実施形態１６Ｂは、前記ウイルスベクターが組織特異的プロモーターを含む、実施形態１１Ｂ～１５Ｂのいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１７Ｂは、前記ウイルスベクターが筋肉特異的プロモーターを含み、任意選択で、前記筋肉特異的プロモーターが筋肉クレアチンキナーゼプロモーター、デスミンプロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター、またはＳＰｃ５－１２プロモーターである、実施形態１１Ｂ～１６Ｂのいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１８Ｂは、前記ウイルスベクターがニューロン特異的プロモーターを含み、任意選択で前記ニューロン特異的プロモーターがエノラーゼプロモーターである、実施形態１１Ｂ～１７Ｂのいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１９Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号５６０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２０Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号５８４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２１Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号６０８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２２Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号６１６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２３Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号６５６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２４Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号６７２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２５Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号６８８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２６Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号６９６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２７Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号７１２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２８Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号７４４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２９Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号７５２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態３０Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号７６０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態３１Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号８４０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態３２Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号８６４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態３３Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号９６０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態３４Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号９７６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態３５Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号９８４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態３６Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１００８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態３７Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１０５６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態３８Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１１２８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態３９Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１１３６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態４０Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１１５２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態４１Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１２２４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態４２Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１２４０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態４３Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１２７２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態４４Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１３３８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態４５Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１３４６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態４６Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１３７０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態４７Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１３７８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態４８Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１３８６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態４９Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１３９４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態５０Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１４０２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態５１Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１４１０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態５２Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１４１８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態５３Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１４２６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態５４Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１４３４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態５５Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１４４２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態５６Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１４５８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態５７Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１４７４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態５８Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１４８２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態５９Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１４９０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態６０Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１４９８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態６１Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１５１４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態６２Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１５３８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態６３Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１５４６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態６４Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１５５４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態６５Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１５６２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態６６Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１５７８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態６７Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１５８６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態６８Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１５９４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態６９Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１６０２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態７０Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１６１０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態７１Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１６２６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態７２Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１６３４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態７３Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１６４２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態７４Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１６５０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態７５Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１６５８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態７６Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１６９０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態７７Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１７０６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態７８Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１７１４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態７９Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１７３８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態８０Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１７４６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態８１Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１７７０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態８２Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１７７８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態８３Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１７８６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態８４Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１８０２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態８５Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１８１０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態８６Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１８１８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態８７Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１８２６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態８８Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１８３４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態８９Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１８４２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態９０Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１８５０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態９１Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１８９０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態９２Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１９１４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態９３Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１９３０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態９４Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１９３８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態９５Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１９４６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態９６Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１９６２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態９７Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１９７０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態９８Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１９７８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態９９Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１９８６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１００Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号１９９４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１０１Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２０１０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１０２Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２０１８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１０３Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２０２６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１０４Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２０４２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１０５Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２０５０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１０６Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２０５８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１０７Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２０９０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１０８Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２１１４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１０９Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２１３０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１１０Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２１６２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１１１Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２１７０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１１２Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２１７８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１１３Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２２０２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１１４Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２２１０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１１５Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２２２６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１１６Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２２４２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１１７Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２２５８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１１８Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２２６６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１１９Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２２７４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１２０Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２２８２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１２１Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２２９８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１２２Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２３１４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１２３Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２３２２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１２４Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２３３０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１２５Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２３３８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１２６Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２３４６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１２７Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２３５４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１２８Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２３７０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１２９Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２３７８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１３０Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２３９４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１３１Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２４１８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１３２Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２４３４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１３３Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２４４２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１３４Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２４５８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１３５Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２４６６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１３６Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２４７４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１３７Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２４９８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１３８Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２５０６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１３９Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２５１４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１４０Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２５２２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１４１Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２５４６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１４２Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２５５４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１４３Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２５７０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１４４Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２５８６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１４５Ｂは、前記第２のスペーサー配列が、配列番号２６５８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１４６Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号２８５６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１４７Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号２８６４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１４８Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号２８８０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１４９Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号２８９６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１５０Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号２９０４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１５１Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号２９１２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１５２Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号２９３６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１５３Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号２９４４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１５４Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号２９６０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１５５Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号２９９２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１５６Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３０１６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１５７Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３０２４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１５８Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３０６４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１５９Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３０９６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１６０Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３１１２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１６１Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３１２８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１６２Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３１３６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１６３Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３１４４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１６４Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３１６０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１６５Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３１６８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１６６Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３１９２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１６７Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３２００の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１６８Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３２０８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１６９Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３２１６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１７０Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３２２４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１７１Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３２３２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１７２Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３２４０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１７３Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３２４８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１７４Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３２５６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１７５Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３２６４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１７６Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３３１４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１７７Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３３３０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１７８Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３３４６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１７９Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３３５４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１８０Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３３７０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１８１Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３３７８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１８２Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３３８６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１８３Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３３９４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１８４Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３４１０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１８５Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３４１８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１８６Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３４２６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１８７Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３４３４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１８８Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３４４２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１８９Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３４５０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１９０Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３４５８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１９１Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３４７４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１９２Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３４８２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１９３Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３４９０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１９４Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３４９８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１９５Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３５０６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１９６Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３５１４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１９７Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３５２２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１９８Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３５３０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態１９９Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３５３８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２００Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３５４６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２０１Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３５５４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２０２Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３５７０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２０３Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３５７８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２０４Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３５８６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２０５Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３６０２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２０６Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３６１０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２０７Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３６１８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２０８Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３６３４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２０９Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３６４２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２１０Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３６５８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２１１Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３６７４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２１２Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３６８２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２１３Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３６９０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２１４Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３６９８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２１５Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３７０６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２１６Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３７２２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２１７Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３７４６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２１８Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３７６２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２１９Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３７７０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２２０Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３７７８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２２１Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３７９４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２２２Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３８０２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２２３Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３８１８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２２４Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３８２６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２２５Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３８３４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２２６Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３８５０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２２７Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３８５８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２２８Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３８９０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２２９Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３８９８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２３０Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３９０６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２３１Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３９１４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２３２Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３９２２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２３３Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３９３０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２３４Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３９３８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２３５Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３９４６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２３６Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号３９９４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２３７Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号４０１０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２３８Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号４０１８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２３９Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号４０２６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２４０Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号４０３４の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２４１Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号４０４２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２４２Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号４２０８の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２４３Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号４５０６の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２４４Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号４９８９の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２４５Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号４９９０の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２４６Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号４９９１の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２４７Ｂは、前記第１のスペーサー配列が、配列番号４９９２の配列を有する、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２４８Ｂは、ＤＭ１を有するヒト対象を治療するための医薬を調製するための、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物の使用である。
実施形態２４９Ｂは、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする筋ジストロフィーを治療する方法であって、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにＴＮＲを含む細胞に、１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡの対をコードする１つ以上の核酸であって、前記１対のスペーサー配列は、
ｉ．配列番号２８５６、２８６４、２８８０、２８９６、２９０４、２９１２、２９３６、２９４４、２９６０、２９９２、３０１６、３０２４、３０６４、３０９６、３１１２、３１２８、３１３６、３１４４、３１６０、３１６８、３１９２、３２００、３２０８、３２１６、３２２４、３２３２、３２４０、３２４８、３２５６、３２６４、３３１４、３３３０、３３４６、３３５４、３３７０、３３７８、３３８６、３３９４、３４１０、３４１８、３４２６、３４３４、３４４２、３４５０、３４５８、３４７４、３４８２、３４９０、３４９８、３５０６、３５１４、３５２２、３５３０、３５３８、３５４６、３５５４、３５７０、３５７８、３５８６、３６０２、３６１０、３６１８、３６３４、３６４２、３６５８、３６７４、３６８２、３６９０、３６９８、３７０６、３７２２、３７４６、３７６２、３７７０、３７７８、３７９４、３８０２、３８１８、３８２６、３８３４、３８５０、３８５８、３８９０、３８９８、３９０６、３９１４、３９２２、３９３０、３９３８、３９４６、３９９４、４０１０、４０１８、４０２６、４０３４、４０４２、４２０８、もしくは４５０６から選択される第１のスペーサー配列、及び配列番号５６０、５８４、６０８、６１６、６５６、６７２、６８８、６９６、７１２、７４４、７５２、７６０、８４０、８６４、９６０、９７６、９８４、１００８、１０５６、１１２８、１１３６、１１５２、１２２４、１２４０、１２７２、１３３８、１３４６、１３７０、１３７８、１３８６、１３９４、１４０２、１４１０、１４１８、１４２６、１４３４、１４４２、１４５８、１４７４、１４８２、１４９０、１４９８、１５１４、１５３８、１５４６、１５５４、１５６２、１５７８、１５８６、１５９４、１６０２、１６１０、１６２６、１６３４、１６４２、１６５０、１６５８、１６９０、１７０６、１７１４、１７３８、１７４６、１７７０、１７７８、１７８６、１８０２、１８１０、１８１８、１８２６、１８３４、１８４２、１８５０、１８９０、１９１４、１９３０、１９３８、１９４６、１９６２、１９７０、１９７８、１９８６、１９９４、２０１０、２０１８、２０２６、２０４２、２０５０、２０５８、２０９０、２１１４、２１３０、２１６２、２１７０、２１７８、２２０２、２２１０、２２２６、２２４２、２２５８、２２６６、２２７４、２２８２、２２９８、２３１４、２３２２、２３３０、２３３８、２３４６、２３５４、２３７０、２３７８、２３９４、２４１８、２４３４、２４４２、２４５８、２４６６、２４７４、２４９８、２５０６、２５１４、２５２２、２５４６、２５５４、２５７０、２５８６、２６５８、４９８９、４９９０、４９９１、もしくは４９９２から選択される第２のスペーサー配列を含む、前記１対のスペーサー配列を含む前記１対のガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡの対をコードする前記１つ以上の核酸；及びｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼもしくは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸、を送達することを含む、前記方法である。
実施形態２５０Ｂは、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲに前記ＴＮＲを含む細胞に、１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡの対をコードする１つ以上の核酸であって、前記１対のスペーサー配列は、
ｉｉ． 配列番号２８５６、２８６４、２８８０、２８９６、２９０４、２９１２、２９３６、２９４４、２９６０、２９９２、３０１６、３０２４、３０６４、３０９６、３１１２、３１２８、３１３６、３１４４、３１６０、３１６８、３１９２、３２００、３２０８、３２１６、３２２４、３２３２、３２４０、３２４８、３２５６、３２６４、３３１４、３３３０、３３４６、３３５４、３３７０、３３７８、３３８６、３３９４、３４１０、３４１８、３４２６、３４３４、３４４２、３４５０、３４５８、３４７４、３４８２、３４９０、３４９８、３５０６、３５１４、３５２２、３５３０、３５３８、３５４６、３５５４、３５７０、３５７８、３５８６、３６０２、３６１０、３６１８、３６３４、３６４２、３６５８、３６７４、３６８２、３６９０、３６９８、３７０６、３７２２、３７４６、３７６２、３７７０、３７７８、３７９４、３８０２、３８１８、３８２６、３８３４、３８５０、３８５８、３８９０、３８９８、３９０６、３９１４、３９２２、３９３０、３９３８、３９４６、３９９４、４０１０、４０１８、４０２６、４０３４、４０４２、４２０８、もしくは４５０６から選択される第１のスペーサー配列、及び配列番号５６０、５８４、６０８、６１６、６５６、６７２、６８８、６９６、７１２、７４４、７５２、７６０、８４０、８６４、９６０、９７６、９８４、１００８、１０５６、１１２８、１１３６、１１５２、１２２４、１２４０、１２７２、１３３８、１３４６、１３７０、１３７８、１３８６、１３９４、１４０２、１４１０、１４１８、１４２６、１４３４、１４４２、１４５８、１４７４、１４８２、１４９０、１４９８、１５１４、１５３８、１５４６、１５５４、１５６２、１５７８、１５８６、１５９４、１６０２、１６１０、１６２６、１６３４、１６４２、１６５０、１６５８、１６９０、１７０６、１７１４、１７３８、１７４６、１７７０、１７７８、１７８６、１８０２、１８１０、１８１８、１８２６、１８３４、１８４２、１８５０、１８９０、１９１４、１９３０、１９３８、１９４６、１９６２、１９７０、１９７８、１９８６、１９９４、２０１０、２０１８、２０２６、２０４２、２０５０、２０５８、２０９０、２１１４、２１３０、２１６２、２１７０、２１７８、２２０２、２２１０、２２２６、２２４２、２２５８、２２６６、２２７４、２２８２、２２９８、２３１４、２３２２、２３３０、２３３８、２３４６、２３５４、２３７０、２３７８、２３９４、２４１８、２４３４、２４４２、２４５８、２４６６、２４７４、２４９８、２５０６、２５１４、２５２２、２５４６、２５５４、２５７０、２５８６、２６５８、４９８９、４９９０、４９９１、もしくは４９９２から選択される第２のスペーサー配列を含む、前記１対のスペーサー配列を含む前記１対のガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡの対をコードする前記１つ以上の核酸；及びｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼもしくは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸、を送達することを含む、前記方法である。
実施形態２５１Ｂは、前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＴＮＲまたは自己相補的領域にまたはその近くに送達する、第１及び第２のスペーサーを含む１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸が前記細胞に送達される、実施形態２４９Ｂ～２５０Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２５２Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３７７８及び１７７８の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２５３Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３７７８及び１７４６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２５４Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３７７８及び１７７０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２５５Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３７７８及び１５８６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２５６Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３７７８及び１９１４の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２５７Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３７７８及び２２１０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２５８Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号４０２６及び１７７８の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２５９Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号４０２６及び１７４６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２６０Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号４０２６及び１７７０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２６１Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号４０２６及び１５８６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２６２Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号４０２６及び１９１４の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２６３Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号４０２６及び２２１０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２６４Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３７９４及び１７７８の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２６５Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３７９４及び１７４６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２６６Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３７９４及び１７７０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２６７Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３７９４及び１５８６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２６８Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３７９４及び１９１４の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２６９Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３７９４及び２２１０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２７０Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号４０１０及び１７７８の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２７１Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号４０１０及び１７４６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２７２Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号４０１０及び１７７０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２７３Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号４０１０及び１５８６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２７４Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号４０１０及び１９１４の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２７５Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号４０１０及び２２１０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２７６Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３９０６及び１７７８の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２７７Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３９０６及び１７４６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２７８Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３９０６及び１７７０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２７９Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３９０６及び１５８６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２８０Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３９０６及び１９１４の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２８１Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３９０６及び２２１０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２８２Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３７４６及び１７７８の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２８３Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３７４６及び１７４６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２８４Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３７４６及び１７７０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２８５Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３７４６及び１５８６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２８６Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３７４６及び１９１４の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２８７Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３７４６及び２２１０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２８８Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３２５６及び４９８９の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２８９Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３２５６及び５６０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２９０Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３２５６及び６７２の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２９１Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３２５６及び９７６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２９２Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３２５６及び７６０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２９３Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３２５６及び９８４の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２９４Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３２５６及び６１６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２９５Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号２８９６及び４９８９の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２９６Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号２８９６及び５６０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２９７Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号２８９６及び６７２の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２９８Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号２８９６及び９７６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２９９Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号２８９６及び７６０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３００Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号２８９６及び９８４の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３０１Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号２８９６及び６１６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３０２Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３１３６及び４９８９の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３０３Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３１３６及び５６０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３０４Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３１３６及び６７２の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３０５Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３１３６及び９７６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３０６Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３１３６及び７６０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３０７Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３１３６及び９８４の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３０８Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３１３６及び６１６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３０９Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３２２４及び４９８９の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３１０Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３２２４及び５６０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３１１Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３２２４及び６７２の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３１２Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３２２４及び９７６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３１３Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３２２４及び７６０の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３１４Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３２２４及び９８４の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３１５Ｂは、前記第１及び第２のスペーサー配列が、配列番号３２２４及び６１６の配列を有する、実施形態２４９Ｂ～２５１Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３１６Ｂは、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ、または前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸をさらに含む、実施形態２４９Ｂ～３１５Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３１７Ｂは、前記ガイドＲＮＡがｓｇＲＮＡである、実施形態２４９Ｂ～３１６Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３１８Ｂは、前記ｓｇＲＮＡが修飾されている、実施形態３１７Ｂに記載の方法である。
実施形態３１９Ｂは、前記修飾により、１つ以上の２’位置及び／またはホスホジエステル結合が改変される、実施形態３１８Ｂに記載の方法である。
実施形態３２０Ｂは、前記修飾により、前記ｓｇＲＮＡの最初の３つのヌクレオチドのうちの１つ以上、またはすべてが改変される、実施形態３１８Ｂ～３１９Ｂに記載の方法である。
実施形態３２１Ｂは、前記修飾により、前記ｓｇＲＮＡの最後の３つのヌクレオチドのうちの１つ以上、またはすべてが改変される、実施形態３１８Ｂ～３２０Ｂに記載の方法である。
実施形態３２２Ｂは、前記修飾が、ホスホロチオエート修飾、２’－ＯＭｅ修飾、２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾、２’－Ｆ修飾、２’－Ｏ－メチン－４’ブリッジ修飾、３’－チオホスホノアセテート修飾、及び２’－デオキシ修飾のうちの１つ以上を含む、実施形態３１８Ｂ～３２１Ｂに記載の方法である。
実施形態３２３Ｂは、前記組成物が薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、実施形態２４９Ｂ～３２２Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３２４Ｂは、前記ガイドＲＮＡが脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合しているか、またはウイルスベクターによってコードされている、実施形態２４９Ｂ～３２３Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３２５Ｂは、前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アルファウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである、実施形態３２４Ｂに記載の方法である。
実施形態３２６Ｂは、前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、実施形態３２５Ｂに記載の方法である。
実施形態３２７Ｂは、前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、またはＡＡＶ９ベクターであり、ＡＡＶに続く番号がＡＡＶ血清型を示す、実施形態３２６Ｂに記載の方法である。
実施形態３２８Ｂは、前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ血清型９ベクターである、実施形態３２７Ｂの方法である。
実施形態３２９Ｂは、前記ウイルスベクターが組織特異的プロモーターを含む、実施形態３２４Ｂ～３２８Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３３０Ｂは、前記ウイルスベクターが筋肉特異的プロモーターを含み、任意選択で、前記筋肉特異的プロモーターが筋肉クレアチンキナーゼプロモーター、デスミンプロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター、またはＳＰｃ５－１２プロモーターである、実施形態３２４Ｂ～３２９Ｂのいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３３１Ｂは、前記ウイルスベクターがニューロン特異的プロモーターを含み、任意選択で前記ニューロン特異的プロモーターがエノラーゼプロモーターである、実施形態３２４Ｂ～３３０Ｂのいずれか１つに記載の組成物である。
以下の実施例は、ある特定の開示された実施形態を説明するために提供されており、いかなる方法においても本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
１．材料及び方法
ガイドＲＮＡ及びプライマー配列。プライマー配列は、追加配列の表に示されている。Ｃａｓ９ガイドＲＮＡは、単一ガイド形式（ｓｇＲＮＡ）として特に示されていない限り、デュアルガイド（ｄｇＲＮＡ）形式として使用された。ｃｒＲＮＡは、追加配列の表に列挙されているスペーサー配列を含有し、ＡｌｔＲ－ｃｒＲＮＡとしてＩＤＴから取得された。ＳｐＣａｓ９で使用されたｔｒａｃｒＲＮＡはＡｌｔＲ－ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＩＤＴカタログ番号１０７２５３４）であった。
線維芽細胞の不死化。２ｘ１０５個の線維芽細胞（ＧＭ０４０３３及びＧＭ０７４９２、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を６ウェルプレートに播種した。翌日、線維芽細胞に、１０ｕｇ／ｍＬポリブレンを含むｈＴＥＲＴ－ｎｅｏレンチウイルスをＭＯＩ ５で形質導入した。媒体を、形質導入の２４時間後に交換した。細胞を、ＭＥＭ＋１５％ＦＢＳ＋ＮＥＡＡでの形質導入の４８時間後に、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８により選択した。
不死化線維芽細胞エレクトロポレーション及びＤＮＡ－ＰＫ阻害剤処理（対ガイド）。２００ｕＭ ｃｒＲＮＡ（ＩＤＴＥ、ＩＤＴカタログ番号１１－０１－０２－０５中に再懸濁）と２００ｕＭ ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＩＤＴデュプレックス緩衝液、カタログ番号１１－０１－０３－０１中に再懸濁）を１：１で混合し、事前アニーリングした（９５℃で５分間インキュベートした後、室温まで冷却した）。特に明記されていない限り、ＲＮＰ集合体は、１対のガイドの対を使用した場合、２μＬの１００μＭ事前アニーリング５’ガイド、２μＬの１００μＭ事前アニーリング３’ガイド、及び２μＬのヌクレアーゼ、または１つのガイドのみを使用した場合、４μＬの１００μＭ事前アニーリングガイド及び２μＬのヌクレアーゼを使用して実行した。各ＲＮＰを３回構築した。ＳｐＣａｓ９（ＩＤＴ）ストック溶液の濃度は１０ｕｇ／ｕｌであった。
ガイド（１００ｕＭ事前アニーリング）及びＳｐＣａｓ９タンパク質（１０ｕｇ／ｕｌ ＩＤＴ）を、１．７ｍｌエッペンドルフチューブ内の各ヌクレオフェクションに対して混合し、室温で約１０分間インキュベートして、ＲＮＰを事前構築した。（注：実験は一般に、条件ごとに生物学的に３回実行した。）
２０ｕｌのＰ２ヌクレオフェクション溶液（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号Ｖ４ＸＰ－２０３２；室温に予熱し、付属のサプリメントを加えて調製した）を、各ＲＮＰ混合物に加えた。
細胞調製：０４０３３ ｈＴｅｒｔ形質転換ＤＭ１患者線維芽細胞及び７４９２ ｈＴｅｒｔ形質転換健康対照線維芽細胞を、Ｔ１７５フラスコ内でコンフルエントになるまで増殖させた。細胞をＰＢＳ－で１回洗浄し、５ｍｌの１×ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで７分間処理し、２５ｍｌの血清含有培地（ＧｌｕｔａＭＡＸを含むＭＥＭ、１５％ＦＢＳ、１ｘＮＥＡＡ）で洗い流した。
細胞を５００ｇで５分間スピンダウンし、新鮮な培地に再懸濁した。懸濁液を４４ｕＭフィルターでろ過し、単一細胞懸濁液を確保した。細胞を計数し、１５ｍｌコニカルチューブ内にエレクトロポレーション条件ごとに約３００，０００で分注した。すべてのアリコートを５００ｇで５分間ペレット化し、ヌクレオフェクションの直前に培地を除去した。
ヌクレオフェクション：２０ｕｌのＲＮＰ／Ｐ２混合物を使用して３００，０００細胞ペレットを再懸濁し、得られた懸濁液を１６ウェルエレクトロポレーションキュベットに移した。ヌクレオフェクションを、Ｌｏｎｚａ Ｘユニット（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で、溶液Ｐ２及びパルスコードＥＮ１５０の設定で実行した。
プレーティング：各ヌクレオフェクション処理ウェル（２０ｕｌ中約３００，０００細胞）を、１ｍｌの予熱した（１）プレーン培地または（２）１０ｕＭの化合物６を補充した培地を含有する１２ウェルプレートの２ウェル（ウェルあたり８ｕｌ）に分割した。プレーティングの２４時間後にすべてのウェルで、培地をプレーン培地（化合物６なし）に変更した。ほとんどのウェルがコンフルエンスに近づくまで、細胞を、３日ごとに培地を交換しながら１０日間増殖させた。
採取：ヌクレオフェクション後１０日目に、細胞をＰＢＳ－で１回洗浄し、２００ｕｌの１ｘＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで７分間処理し、２ｍｌの血清含有培地で洗い流した。細胞を５００ｇで５分間ペレット化し、１ｍｌの新鮮な培地に再懸濁した。
ＣＵＧ増殖巣ＦＩＳＨアッセイ：細胞を計数し、３８４ウェルのハイコンテントイメージングプレートに、ウェルあたり５，０００細胞で４連にてプレーティングした。細胞を一晩付着させた後、固定させた。
遺伝子型決定用の試料の調製：１００ｕｌの細胞懸濁液を１．７ｍｌチューブ内で５００ｇにて５分間ペレット化した。細胞ペレットを１００ｕｌのＬｕｃｉｇｅｎ ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ緩衝液に再懸濁し、６５℃で１５分間溶解した後、９８℃で２分間熱失活させた。抽出物を、－８０℃で保存した。
スプライシングアッセイ用の試料の調製：残りのすべての細胞を１．７ｍｌチューブ内で５００ｇにて５分間ペレット化した。培地を除去し、ＲＮＡ処理までペレットを凍結させた。
遺伝子型決定：ＰＣＲマスターミックスを２０ｕｌの反応のために以下のように調製した：１０ｕｌのＰｈｕｓｉｏｎ ２×マスターミックス、１ｕｌの１０ｕＭ ＤＭＰＫ－ｎｅｓｔ－Ｆプライマー、１ｕｌの１０ｕＭ ＤＭＰＫ－ｎｅｓｔ－Ｒプライマー、７ｕｌの水。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出緩衝液中の３ｕｌの試料を、各反応用の１７ｕｌのマスターミックスに加えた。サイクルを、タッチダウンプログラムとして実行した：９８℃で３０秒間、続いて９８℃で１０秒間の融解、７２℃で１０秒間のアニーリング（サイクルごとに０．５Ｃずつ低下）、７２℃で３０秒間の伸長を８サイクル。続いて、９８℃で１０秒間、６８℃で１０秒間、７２℃で３０秒間の２７サイクル。７２℃で１０分間の最終伸長。産物を、２％アガロースゲルでの電気泳動によって分析した。
エレクトロポレーション及びＤＮＡＰＫ－Ｉ処理（個々のガイド）
プロトコルは、本明細書に示されている場合を除いて、対のガイドプロトコルについて上に記載されたとおりであった。エレクトロポレーションを、Ｐ３溶液及びパルスコードＣＡ１３７を使用して実行し、１０ｕＭ化合物６を伴う場合と伴わない場合で２４ウェルプレートにて増殖させた。ＲＮＰ構築を、上記のように４μＬの事前アニーリングした１００μＭのガイド及び２μＬのＣａｓ９を使用して実行した。採取：ヌクレオフェクションの４８時間後に、細胞をＰＢＳ－で１回洗浄し、２００ｕｌの１ｘＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで７分間処理し、２ｍｌの血清含有培地で洗い流した。細胞を５００ｇで５分間ペレット化し、１ｍｌの新鮮な培地に再懸濁した。
遺伝子型決定のために、５０ｕｌの細胞懸濁液を１．７ｍｌチューブ内で５００ｇにて５分間ペレット化した。細胞ペレットを１００ｕｌのＬｕｃｉｇｅｎ ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ緩衝液に再懸濁し、６５℃で１５分間溶解した後、９８℃で２分間熱失活させた。抽出物を、－８０℃で保存した。
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）／ＩＦ共染色
ＭＢＮＬ１／（ＣＵＧ）ｎ増殖巣イメージングを、直交法として使用して、ＤＭ１線維芽細胞におけるＤＭＰＫガイドＲＮＡによるＣＴＧリピート切除を評価した。
細胞を、４％ＰＦＡを用いて室温にて１５分間固定し、室温にて１×ＰＢＳで１０分間５回洗浄した。直ちにプローブしない場合、細胞を４℃で保存した。
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）手順では、細胞を１×ＰＢＳ中の０．５％トリトンＸ－１００で室温にて５分間透過処理した。
細胞を３０％ホルムアミド、２×ＳＳＣで室温にて１０分間前洗浄した。次に、細胞を、３０％ホルムアミド中の１ｎｇ／ｕＬのＡｌｅｘａ５４６－（ＣＡＧ）１０プローブ、２×ＳＳＣ、２ｕｇ／ｍＬ ＢＳＡ、６６ｕｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡ、２ｍＭバナジル錯体を用いて３７℃で２時間プローブした。
次に、細胞を、３０％ホルムアミド、２×ＳＳＣで４２℃にて３０分間洗浄し、次に３０％ホルムアミド、２×ＳＳＣで３７℃にて３０分間、次に１×ＳＳＣで室温にて１０分間洗浄し、最後に１×ＰＢＳで室温にて１０分間洗浄した。次に、細胞を、１×ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中の抗ＭＢＮＬ１抗体（１：１０００希釈、ｓａｎｔａｃｒｕｚ、３Ａ４）により４℃にて一晩プローブした。細胞を、１×ＰＢＳで室温にて１０分間、２回洗浄した。細胞を、１×ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（１：５００希釈）中のヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ ６４７と共に、室温で１時間インキュベートした。細胞を、１×ＰＢＳで室温にて１０分間、２回洗浄した。細胞をＨｏｅｃｈｓｔ溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）で５分間染色した後、１×ＰＢＳで５分間、１回洗浄した。
ＰＢＳを吸引し、ウェルごとに新鮮なＰＢＳ（１００ｕｌ）を加えた。イメージングプレートを粘着性アルミニウムホイルで密封し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してイメージング処理した。
ｉＰＳ細胞のエレクトロポレーション
ｉＰＳ細胞へのエレクトロポレーション用のＳｐＣａｓ９ ＲＮＰを、以下のように調製した。ＳｐＣａｓ９ ｃｒＲＮＡを、ＩＤＴＥに２００μＭで再懸濁し、ｔｒａｃｒＲＮＡを二本鎖緩衝液に２００μＭで再懸濁した。等量の２００ｕＭ ｃｒＲＮＡ及び２００ｕＭ ｔｒａｃｒＲＮＡをＰＣＲチューブ内で混合し、９５℃に加熱し、室温まで冷却して、１００μＭのガイド複合体を得た。
Ｃｐｆ１ガイドをＩＤＴＥに１００ｍＭで再懸濁した。
図２２に対応する実験用のＲＮＰ複合体を、５’ガイド、３’ガイド、及びヌクレアーゼのそれぞれ２μＬを合わせることによって調製した。
図２４に対応する実験用のＲＮＰ複合体を、５’ガイド及び３’ガイドのそれぞれ４μＬ（または１つのガイドのみを使用した場合は８μＬの１つのガイド）、及び３μＬのヌクレアーゼを合わせることによって調製した。
細胞ペレットを１００ｕｌの事前混合Ｐ３ヌクレオフェクション溶液に再懸濁し、事前構築したＲＮＰを含有するチューブに移した。１００ｕｌのＲＮＰ／細胞混合物をヌクレオフェクションキュベットに移した。ヌクレオフェクションは、溶液Ｐ３及びパルスコードＣＡ１３７に設定したＬｏｎｚａ Ｘ－ｕｎｉｔを使用して実行した。細胞をキュベットからラミニンコーティングプレートにおける予熱培地に迅速に移動させ、各ヌクレオフェクションを、プレーン培地または３ｕＭ 化合物６（図２４に対応する実験の場合）もしくは１μＭ 化合物３（図２２及び２３に対応する実験の場合）を補充した培地に分割した。翌日、培地をＳｔｅｍＦｌｅｘ＋１０ｕＭロック阻害剤に変更した。翌日、媒体を、再びロック阻害剤を伴わないＳｔｅｍＦｌｅｘに変更した。培養を合計５日間続けた。
ＲｅＬｅＳＲを３７℃で６分間使用して細胞を剥離させ、２ｍｌのＳｔｅｍＦｌｅｘで洗い流した。さらに培養及びクローン単離を行うために、２００μｌを２ｍｌ ＳｔｅｍＦｌｅｘ＋４ｕｌ Ｌａｍｉｎ ４１１を含む新しい６ウェルディッシュに入れた。残りを、以下のように１．７ｍｌチューブに分割した：タンパク質用には６００ｕｌ；ＤＮＡ抽出用には１００ｕｌ。
ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを製造元のプロトコルに従って使用して抽出した。遺伝子型決定を、ネステッドＰＣＲとして実行した。
Figure 2022545921000133
Figure 2022545921000134
完了後、ＰＣＲを１：１０に希釈し、２ｕｌを次の反応（ＰＣＲ２）の投入物として使用した。
Figure 2022545921000135
Figure 2022545921000136
製品を、２％アガロースゲルで分析した。
心筋細胞分化プロトコル
心筋細胞を、以下のように調製した。ｉＰＳＣの培養物を、吸引によって分化した細胞から精製し、次にアキュターゼで処理した。細胞を、ＲＯＣＫｉを含むＳｔｅｍＦｌｅｘ（最終濃度１０ｕＭ）に０．１３３×１０６細胞／ｃｍ２でプレーティングし、さらに２日間ＳｔｅｍＦｌｅｘを供給した。次に（「０日目」に）培地を、低分子ＣＨＩＲ９９０２１（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈ．カタログ番号７２０５２）を含むＲＰＭＩ／Ｂ２７－インスリンに変更した（濃度は株によって異なる）。１～３日目は、培地をＲＰＭＩ／Ｂ２７－インスリンに変更した。３～５日目は、培地を、小分子ＩＷＰ２（Ｔｏｃｒｉｓカタログ番号３５３３）（５ｕＭ）を含むＲＰＭＩ／Ｂ２７－インスリンに変更した。５～７日目は、培地をＲＰＭＩ／Ｂ２７－インスリンに変更した。７～１１日目は、培地をＲＰＭＩ／Ｂ２７＋インスリンに変更した。１１～１５日目、培地をＣＤＭ３Ｌに変更した。
Figure 2022545921000137
心筋細胞ヌクレオフェクションプロトコル
プレートを、以下のように調製した。１ｍｇ／ｍｌフィブロネクチンをＰＢＳで１：１００に希釈し、２４ウェルプレートのウェルごとに２００ｕｌ加えた。プレートを室温で２時間放置した。フィブロネクチンを除去し、５００ｕｌのｉＣｅｌｌ心筋細胞維持培地を各ウェルに加え、３７℃で予熱した。
ＲＮＰを、本質的に、線維芽細胞実験のために上記に記載された手順に従って調製した。ＲＮＰ複合体の構築に続いて、２０ｕｌのＰ３溶液（サプリメントを添加）を各ＲＮＰに加え、１ｕｌのエレクトロポレーション促進剤（ＩＤＴ）を各ＲＮＰ混合物に加えた。
細胞を調製するために、６ウェルディッシュで増殖させたｉＰＳＣ由来の心筋細胞から培地を吸引し、ウェルあたり２ｍｌのＰＢＳで細胞を１回洗浄した。ウェルごとに１ｍｌのＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ（１０×）を加え、細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。
細胞を穏やかにピペットで取り、６ウェルプレートのウェルあたり１ｍｌ ＦＢＳ＋８ｍｌ ＰＢＳで１５ｍＬチューブに加え、ＴｒｙｐＬＥ酵素を不活性化した。細胞を１０００ＲＰＭで５分間スピンダウンし、ＰＢＳを吸引し、細胞を新鮮なｉＣｅｌｌ心筋細胞維持培地に再懸濁した。細胞を１００ｕｍフィルターに通して５０ｍＬチューブに入れ、再懸濁した細胞をゆっくりとピペットに取って通した。細胞を計数し、１５ｍｌチューブにヌクレオフェクションあたり約１００，０００の心筋細胞を分注した。細胞を１０００ＲＰＭで５分間ペレット化し、ヌクレオフェクションの前に培地を除去した。
２０ｕｌのＲＮＰ／Ｐ３混合物を使用して、約１００，０００の細胞ペレットを再懸濁し、懸濁液を１６ウェルエレクトロポレーションキュベットに移した。ヌクレオフェクションを、溶液をＰ３に設定し、パルスコードをＣＡ１３７に設定して、Ｌｏｎｚａ Ｘ－ｕｎｉｔで実行した。ヌクレオフェクション後、細胞を、調製した２４ウェルプレートにプレーティングし、４８時間回復させた後、採取した。
培地を除去し、１００ｕｌのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出緩衝液を各ウェルに加え、上下にピペットで移してすべての細胞を除去した後、ＰＣＲチューブに移した。溶解を６５℃で１５分間実行し、続いて９８℃で２分間不活性化した。溶解物は－８０℃で保存した。
神経前駆細胞の調製
基本培地を、以下のように調製した：
Figure 2022545921000138
以下の培地も使用した。培地２：基本培地＋１μＭ ＬＤＮ １９３１８９＋１０μＭ ＳＢ４３１５４２。培地３：基本培地＋１μＭ ＬＤＮ １９３１８９＋１０μＭ ＳＢ４３１５４２＋１μＭシクロパミン＋１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２。培地４：基本培地＋１μＭ シクロパミン＋１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２。培地５：基本培地＋１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２。ＮＰＣ成熟播種培地：基本培地＋１：１００ラミニン＋１：１，０００ Ｙ－２７６３２ＲＯＣＫ阻害剤。ＢｒａｉｎＰｈｙｓ成熟培地：
Figure 2022545921000139
神経の再パターン化のためにｉＰＳＣを播種するために、ヒトｉＰＳＣを、播種時にラミニン５－１－１（１：４００）を補充したＳｔｅｍＦｌｅｘ培地を使用して、６ウェルプレートでおよそ８０％のコンフルエンスまで継代培養した。培養アーチファクトの伝播を防ぐために、毎月のマイコプラズマ分析及び定期的な核型分析（５～１０継代）を全般的に実行した。
分化のための播種の日（０日目として定義）に、ｉＰＳ細胞の異常な自発的分化を検査した。一般に、培養物の１０％未満が、分化したかまたは緩い形態を示す必要がある。培地を吸引し、細胞を３ｍＬのダルベッコのＰＢＳ（ＤＰＢＳ、二価カチオン非含有、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ＃１４１９０１４４）で１回すすいだ。ＤＰＢＳを吸引し、１ｍＬの加温した（２５～３５℃）アキュターゼ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ＃Ａ１１１０５０１）を直ちに分注した。プレートを穏やかに回転させて均一に完全に解離させた後、３７℃のインキュベーターで１０分間インキュベートした。ｉＰＳＣコロニーがプレートから解離するように、プレートを３～５分ごとにしっかりと叩いた（ｔａｐｅｄ）。
アキュターゼを、少なくとも２ｍＬの加温した（２５～３５℃）培養培地、通常はＳｔｅｍＦｌｅｘ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈ＃８５８５０）またはＳｔｅｍＦｌｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ＃Ａ３３４９４０１）で中和した。細胞溶液を穏やかに粉砕して、凝集した細胞をさらに解離させた。
細胞溶液をきれいな５０ｍＬコニカルチューブに移し、約１５０ＲＣＦで５分間遠心分離して細胞をペレット化した。
上清を吸引した後、Ｙ－２７６３２ ＲＯＣＫ阻害剤（１：１０００ ｖ／ｖ）を補充した１ｍＬの加温したＳｔｅｍＦｌｅｘを加え、チューブを手の甲に軽く叩くことにより、細胞ペレットを分解させた。さらに９ｍＬの培養培地を加え、穏やかに逆さにして混合した。生細胞数を、ＶｉＣｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒまたは同等のデバイスを使用して取得した。６Ｅ６生細胞を、Ｙ－２７６３２ ＲＯＣＫ阻害剤（１：１０００）を補充した合計１２ｍＬのｉＰＳＣ培養培地で希釈した後、マトリゲルコーティング６ウェルプレートの各ウェルに２ｍＬの細胞溶液を分注し（ウェルあたり１Ｅ６細胞の播種密度）、次にプレートを各方向（左から右、前から後ろ）に垂直に３～４回揺り動かして、各ウェルに細胞を均一に分散させた。培養を、３７℃、５％ＣＯ２、８５％ＲＨインキュベーターで維持した。次に、播種後少なくとも３時間、プレートを静置した。毎日、培地を完全に吸引し、次の培地スケジュールに従って交換した（１２日目については以下を参照）。６ウェルプレートごとに、少なくとも１２～１３ｍＬの培地（ウェルあたり２ｍＬ）を調製して加温する。培養物を、形態学的不均一性（最初の週以降は低いはずである）またはマトリゲル層の破壊について検査した。培地スケジュール：
Figure 2022545921000140
再パターン化されたＮＰＣの継代
１２日目に、培養物の形態的不均一性を検査した後、培地を吸引し、細胞を３ｍＬのダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ、二価カチオン非含有、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ＃１４１９０１４４）で１回すすいだ。次に、ＤＰＢＳを吸引し、その後１ｍＬの加温した（２５～３５℃）アキュターゼ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ＃Ａ１１１０５０１）を直ちに分注した。プレートを穏やかに回転させて均一に完全に解離させた後、３７℃のインキュベーターで１０分間インキュベートした。ｉＰＳＣコロニーがプレートから解離するように、プレートを３～５分ごとにしっかりと叩いた。アキュターゼを、少なくとも２ｍＬの加温した（２５～３５℃）培地４で中和した。細胞溶液を穏やかに粉砕して、凝集した細胞をさらに解離させた。
細胞溶液をきれいな５０ｍＬコニカルチューブに移す。３００ＲＣＦで５分間遠心分離して細胞をペレット化する。上清を吸引して、Ｙ－２７６３２ ＲＯＣＫ阻害剤（１：１０００ ｖ／ｖ）を補充した１ｍＬの加温したＳｔｅｍＦｌｅｘを加え、チューブを手の甲に軽く叩くことにより、細胞ペレットを分解させた。さらに９ｍＬの培養培地を加え、チューブを穏やかに逆さにして細胞溶液を混合した。細胞を計数し、９Ｅ６生細胞を、Ｙ－２７６３２ ＲＯＣＫ阻害剤（１：１０００）を補充した合計１２ｍＬのｉＰＳＣ培地に希釈した。２ｍＬの細胞溶液をマトリゲルコーティング６ウェルプレートの各ウェルに分注した（ウェルあたり１．５Ｅ６細胞の維持密度）。プレートを各方向（左から右、前から後ろ）に垂直に３～４回揺り動かして、各ウェルに細胞を均一に分散させた。培養を、３７℃、５％ＣＯ２、８５％ＲＨインキュベーターで維持した。播種後少なくとも３時間、プレートを静置した。
毎日、培地を完全に吸引し、上記の培地スケジュールに従って交換した（ウェルあたり２ｍＬの培地）。
ＮＰＣを週に１回継代し、最終ＮＰＣのＦＡＣＳソーティング（継代３の間に行われる）の前に２回継代した。
ＮＰＣフローサイトメトリー標識プロトコル
単一細胞懸濁液を生成し、ＮＰＣが高密度であり（９Ｅ６／６ウェルプレートに播種され、５～７日間増殖させた）、形態学的に均質であることが確認された。培地を吸引し、細胞を２価カチオン非含有ダルベッコＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃１４１９０２５０）で１回洗浄した後、吸引し、１ｍＬの加温した（２５～３５℃）アキュターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃Ａ１１１０５０１）を加え、次に３７℃で１０～１５分間インキュベートした。プレートをしっかりと叩いて、付着したＮＰＣを取り除いた。
２ｍＬの加温した（約３５℃）ＤＭＥＭ－Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃１１３２００３３）を加えることにより、アキュターゼを中和した。細胞を、２２℃で５分間、３００×ｇで遠心分離することによりペレット化した。上清を吸引し、ＮＰＣを５ｍＬの加温したＤＭＥＭ－Ｆ１２に再懸濁した。細胞計数は、ＶｉＣｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇシステムを使用して行った。
ＮＰＣを免疫標識するために、以下の手順を使用した：２～５Ｅ７細胞を５０ｍＬコニカルチューブに分注する；３００×ｇで５分間室温で遠心分離して細胞をペレット化する；細胞ペレットを乱さないように注意しながら、上清を吸引する；カチオン非含有ＤＰＢＳで細胞を１回洗浄する；細胞を穏やかに粉砕して凝集塊を分解する；３００×ｇで５分間室温にて遠心分離して細胞をペレット化する；上清を吸引する。固定可能な色素Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４２３１０２）を使用して、各ウェルに１００μＬの希釈（１：２５０）色素を分注することにより、生／死細胞に標識する（自家蛍光対照または蛍光マイナス１対照を除く）。細胞をホイルで包み、４℃で１５～３０分間インキュベートする；３００×ｇで５分間室温にて遠心分離して細胞をペレット化する；上清を吸引する；カチオン非含有ＤＰＢＳで細胞を１回洗浄する。細胞を穏やかに粉砕して凝集塊を分解する；３００×ｇで５分間室温にて遠心分離して細胞をペレット化する；上清を吸引する。低温（４℃）Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４２０２０１）を使用して４℃で３０分間非特異的標識をブロックする（ホイルで包む）。分注後、細胞を穏やかに粉砕して凝集塊を分解する。３００×ｇで５分間、室温で遠心分離して細胞をペレット化する。上清を吸引する。Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで希釈した５Ｅ６全細胞あたり１００μＬの抗体（下表を参照）を各試料に分注する（自家蛍光対照または蛍光マイナス１対照を除く）。分注後、細胞を穏やかに粉砕して凝集塊を分解する。試料をホイルに包み、４℃で３０分間インキュベートする。注：単一染色の補正対照は、水溶解細胞（Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ Ｌ／Ｄ）または抗体捕捉ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃Ａ１０４９７）のいずれかを使用して作製することができる。
Figure 2022545921000141
インキュベーション後、５ｍＬのＣｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで細胞を洗浄する。細胞を穏やかに粉砕して凝集塊を分解し、均一に洗浄する。３００×ｇで５分間、室温にて遠心分離して細胞をペレット化する。上清を吸引する。低温Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで細胞をもう一度洗浄する。細胞を穏やかに粉砕して凝集塊を分解する。３００×ｇで５分間、室温にて遠心分離して細胞をペレット化する。上清を吸引する。
Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（１：５００）を補充したＰｒｅ－Ｓｏｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃５６３５０３）に細胞を再懸濁し、最終濃度を１ｍＬあたり７～１０Ｅ６細胞にする。ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎでソートするまで（１～２時間以内）、ホイルに包み４℃で保存する。１５ｍＬのコニカルチューブに事前コートし、Ｙ－２７６３２ ＲＯＣＫ阻害剤（１：１０００）、Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（１：５００）、及び１５ｍモル濃度ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ＃１５６３００８０、１Ｍストックの１：６７希釈）を補充した７ｍＬの培地５を充填し、冷却してソートする
ＮＰＣフローサイトメトリーのソーティング及び分析
以下の手順を、ＮＰＣのソーティング及び分析に使用した。３００ＲＰＭの試料撹拌及び４℃の試料保存を伴い、１００ミクロンノズル（１００μｍ～２０ｐｓｉ）の標準設定を使用して、機器（ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ）をセットアップする。ビーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃６５５０５１；３５０μＬ ＤＰＢＳに１滴）を使用してＣＳ＆Ｔを実行する。ＣＳ＆Ｔ設定から電圧を変更しないこと。Ａｃｃｕｄｒｏｐ較正を実行する（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃３４５２４９；５００μＬ ＤＰＢＳで１滴）。左偏向板の位置は、較正の場合は３２に、ソーティングの場合は５８～６０に設定する必要がある。液滴が７０％エタノールで７ｍＬに充填された１５ｍＬコニカルチューブの中心に当たることを確認する。試料ごとに、Ｐ１スキャッターゲートを停止ゲートとして、１０，０００の事前ソートイベントを収集する。以下のようにゲートを設定する。収集：ＦＳＣ－Ａ／ＳＳＣ－Ａ Ｐ１－＞ ＳＳＣ－Ｈ／ＳＳＣ－Ｗ Ｐ２－＞ ＦＳＣ－Ｈ／ＦＳＣ－Ｗ Ｐ３－＞ Ｌ／Ｄ Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（－）（生細胞）－＞ ＣＤ１８４（＋）－＞ Ｔｒａ－１－６０（－）／ＳＳＥＡ４（－）（非ｉＰＳＣ）－＞ ＣＤ４４（－）／ＣＤ２７１（－）（非グリア、非神経堤）－＞ ＣＤ２４（＋）／ＣＤ１５（低／中）（ＮＰＣ）。各株から１．５～２Ｅ６細胞をソートする。ソートの前後にすべての試料を冷却しておくこと。Ｙ－２７６３２ ＲＯＣＫ阻害剤（１：１０００）を加えた２ｍＬの培地５に懸濁した１．５Ｅ６の生ＮＰＣを、マトリゲルコーティング６ウェルプレートに播種する。
ＮＰＣスケールアップ
以下の手順を使用してＮＰＣをスケールアップした：週に１回ＮＰＣを継代する。継代４（ＦＡＣＳソーティング後の最初の継代）の場合：ＮＰＣが高密度であり（９Ｅ６／６ウェルプレートに播種され、５～７日間増殖させる）、形態学的に均質であることを確認する。培地を吸引し、２価カチオン非含有ダルベッコＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃１４１９０２５０）で１回洗浄する。ＤＰＢＳを吸引し、１ｍＬの加温した（２５～３５℃）アキュターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃Ａ１１１０５０１）を分注する。３７℃で８～１０分間インキュベートする。しっかりと叩いて、付着したＮＰＣを取り除く。Ｙ－２７６３２ ＲＯＣＫ阻害剤（１：１，０００）を加えた１ｍＬの加温した（約３５℃）培地５を加えて、アキュターゼを中和する。細胞を、２２℃で５分間、３００×ｇで遠心分離することによりペレット化する。上清を吸引し、Ｙ－２７６３２ ＲＯＣＫ阻害剤（１：１，０００）を補充した５ｍＬの加温した培地５にＮＰＣを再懸濁する。ＶｉＣｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇシステムを使用して細胞計数を行った。Ｙ－２７６３２ ＲＯＣＫ阻害剤（１：１，０００）を補充した１２ｍＬの培地５に９Ｅ６の生ＮＰＣを再懸濁する。マトリゲルコーティング６ウェルプレートの各ウェルに２ｍＬを分注する。５継代目については、上記の手順を繰り返すが、Ｙ－２７６３２ ＲＯＣＫｉ（１：１，０００）を加えた１５ｍＬの培地５に１２．５Ｅ６ ＮＰＣを播種するようにスケールアップする。すべての細胞をマトリゲルコーティングＴ７５フラスコに分注する。
ＮＰＣバンキング／凍結保存
ＮＰＣのバンキング／凍結保存には、以下の手順を使用した：ＮＰＣが高密度であり（Ｔ７５形式で１２．５Ｅ６／プレートで播種し、５～７日間増殖させる）、形態学的に均質であることを確認する。培地を吸引し、２価カチオン非含有ダルベッコＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃１４１９０２５０）で１回洗浄する。ＤＰＢＳを吸引し、１ｍＬの加温した（２５～３５℃）アキュターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃Ａ１１１０５０１）を分注する。３７℃で１０～１５分間インキュベートする。しっかりと叩いて、付着したＮＰＣを取り除く。Ｙ－２７６３２ ＲＯＣＫ阻害剤（１：１，０００）を補充した２ｍＬの加温した（約３５℃）基本培地を加えて、アキュターゼを中和する。
細胞を、２２℃で５分間、３００×ｇで遠心分離することによりペレット化する。上清を吸引し、Ｙ－２７６３２ ＲＯＣＫ阻害剤（１：１，０００）を補充した５ｍＬの加温した基本培地にＮＰＣを再懸濁する。ＶｉＣｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇシステムを使用して細胞計数を行った。ＮＰＣは、１ｍＬ ＣｒｙｏＳｔｏｒ１０（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃０７９３０）に１２．５Ｅ６／ｍＬでバンク保存される。バンク保存されたアリコートの所望数を満たすために必要な細胞数を計算し、Ｙ－２７６３２ ＲＯＣＫ阻害剤（１：１，０００）を補充したＮＰＣ含有基本培地の必要量を新しい５０ｍＬコニカルチューブに分注する。細胞を、２２℃で５分間、３００×ｇで遠心分離することによりペレット化する。ＮＰＣを必要な量のＣｒｙｏＳｔｏｒ１０（所望のアリコートあたり１ｍＬ）に再懸濁し、２ｍＬのクライオバイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃４３０６５９）に分注する。充填されたクライオバイアルをＭｒ．Ｆｒｏｓｔｙ凍結容器（Ｔｈｅｒｍｏ、＃５１００－０００１）に迅速に移す。－８０℃で少なくとも２４時間保存してから、液体窒素での長期保存に移す。
ニューロンの成熟
以下の手順を使用して、ポリエチレンイミンコーティングプレートを調製した：４７４ｍＬの滅菌蒸留水に、２５ｍＬのホウ酸緩衝液ｐＨ８．２（２０×；Ｓｉｇｍａ、＃０８０５９）及び１ｍＬのポリエチレンイミン（５０％；Ｓｉｇｍａ、＃０３８８０）を加える。ＳｔｒｉｐｅｔｔｅでＰＥＩをかき混ぜる。滅菌フィルターを使用し、４℃で１か月未満保存する。０．１％ＰＥＩを細胞培養プレートに分注し、室温で１時間インキュベートする。ＰＥＩを吸引する。滅菌蒸留水で４回洗浄する。吸引して乾燥させる。細胞培養フードで一晩風乾させる。４℃で２週間未満保存する。
ニューロンの成熟には、以下の手順を使用した：再播種の日に、ＮＰＣが高密度であり（１２．５Ｅ６／Ｔ７５フラスコで播種し、５～７日間増殖させる）、形態学的に均質であることを確認する。培地を吸引し、２価カチオン非含有ダルベッコＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃１４１９０２５０）で１回洗浄する。ＤＰＢＳを吸引し、１ｍＬの加温した（２５～３５℃）アキュターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃Ａ１１１０５０１）を分注する。３７℃で８～１０分間インキュベートする。しっかりと叩いて、付着したＮＰＣを取り除く。Ｙ－２７６３２ ＲＯＣＫ阻害剤（１：１，０００）を補充した２ｍＬの加温した（約３５℃）基本培地を加えて、アキュターゼを中和する。細胞を、２２℃で５分間、３００×ｇで遠心分離することによりペレット化する。上清を吸引し、Ｙ－２７６３２ ＲＯＣＫ阻害剤（１：１，０００）を補充した５ｍＬの加温した基本培地にＮＰＣを再懸濁する。ＶｉＣｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇシステムを使用して細胞計数を行った（または当量）。
ラミニン（１：１００）及びＹ－２７６３２ ＲＯＣＫ阻害剤（１：１，０００）を補充した基本培地に必要な数の生ＮＰＣを再懸濁する。細胞溶液をポリエチレンイミンコーティング容器に分注する。翌日（ＤＩＶ１）は、ラミニン（１：１，０００）を使用して基本培地の完全な培地交換を実行する。ＤＩＶ ２で、基本培地とラミニン（１：１，０００）との５０：５０混合と、ＰＤ ０３３２９９１（１：５，０００）、ＤＡＰＴ（１：２，５００）、ラミニン（１：１，０００）を補充したＢｒａｉｎＰｈｙｓとの完全な培地交換を実行する。ＤＩＶ ３～５から、ＰＤ ０３３２９９１（１：５，０００）、ＤＡＰＴ（１：２，５００）、ラミニン（１：１，０００）を補充したＢｒａｉｎＰｈｙｓを使用して毎日完全な培地交換を実行する。ＤＩＶ７＋から、ＰＤ ０３３２９９１（１：５，０００）、ＤＡＰＴ（１：２，５００）、ラミニン（１：１，０００）を補充したＢｒａｉｎＰｈｙｓと１／２培地交換を週に２～３回実行する。
ＮＰＣヌクレオフェクション
ＲＮＰ複合体は、線維芽細胞実験のために本質的に上記のように調製された。
以下の手順を使用して細胞を調製した。基本培地調製の場合：５００ｍＬのＮｅｕｒｏｂａｓａｌを５００ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２と合わせてから、２０ｍＬのＳＭ１サプリメント（ＶｉｔＡ非含有）、１０ｍＬのＮ２－Ｂサプリメント、１０ｍＬのＧｌｕｔａＭａｘ、及び２ｍＬのＮｏｒｍｏｃｉｎを加えた。
細胞培養容器をコーティングするために：マトリゲルを氷上で４℃で一晩解凍する。５ｍＬのマトリゲルを４９５ｍＬの低温ＤＭＥＭ（１％ｖｏｌ／ｖｏｌ）に希釈し、４℃で保存する。１２ウェルプレートのウェルあたり０．５ｍＬを分注し、室温で１時間インキュベートする。細胞プレーティングの直前にマトリゲル溶液を吸引する。
細胞を調製するために：培地を吸引し、２価カチオン非含有ダルベッコＰＢＳで１回洗浄する。ＤＰＢＳを吸引し、１ｍＬの加温した（２５～３５℃）アキュターゼを分注する。３７℃で１０～１５分間インキュベートする。フラスコを軽く叩いて付着したＮＰＣを取り除く。２ｍＬの加温した（約３５℃）基本培地を加えてアキュターゼを中和する（上記のとおり）。細胞を、２２℃で５分間、３００×ｇで遠心分離することによりペレット化する。上清を吸引し、ＮＰＣを５ｍＬの加温した基本培地（上記のとおり）に再懸濁し、４０ｕｍセルストレーナーを通過させて計数する。ヌクレオフェクションあたり２．５Ｅ６で１５ｍｌチューブに細胞を分注する。
ヌクレオフェクションするために：細胞ペレットを１００ｕｌの事前混合Ｐ３ヌクレオフェクション溶液に再懸濁し、事前構築したＲＮＰを含有するチューブに移す。１００ｕｌのＲＮＰ／細胞混合物をヌクレオフェクションキュベットに移す。Ｌｏｎｚａ Ｘ－ｕｎｉｔを使用したヌクレオフェクションを行う。溶液をＰ３に設定し、パルスコードＣＡ１３７を使用する。ＤＰＢＳで細胞を１回洗浄する。細胞をキュベットから、Ｒｏｃｋ阻害剤を含む予熱した培地を含む１２ウェルプレコートディッシュに迅速に移動させる。回復のために、翌日、培地を１０ｎｇ／ｍＬＦＧＦ－２を補充した基本培地に交換する。上記のように、１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２を補充した毎日の培地交換で、合計５日間培養を続ける。採取の場合：アキュターゼを３７℃で１０分間使用して細胞を剥離する。ＤＰＢＳでペレット化した細胞を１回洗浄し、ＰＢＳを除去し、ペレットを－８０℃で凍結する。
ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを製造元のプロトコルに従って使用して抽出した。ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、標準的手法を使用してＰＣＲ／アガロース電気泳動でサイズを決定した。ＰＣＲプライマー： ５’－ＡＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＧＴＴＴＣＧＧＴＴＴＣＡＣＴＴＣＣＧＧＴ－３’（配列番号５５）；５’－ＣＡＡＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＧＴＡＧＡＡＡＧＣＧＣＣＡＴＴＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＡ－３’（配列番号５６）。
ニューロンヌクレオフェクション
ニューロン（例えば、上記のようにＮＰＣから分化した）は、以下のようにヌクレオフェクションされた。ＲＮＰ複合体を、線維芽細胞実験のために本質的に上記のように調製した。
同封のサプリメントをＡＤ１ヌクレオフェクション溶液に加え、３５０ｕｌの溶液を各ＲＮＰ複合チューブに加えた。ヌクレオフェクションの直前に、７．５ｕｌの１００ｕＭエレクトロポレーション促進剤を各ＲＮＰチューブに加えた。
培地を一度に１ウェルずつ細胞から除去し、３５０ｕｌのＲＮＰ含有ヌクレオフェクション溶液と交換した。すべてのウェルを交換したら、気泡を避けて電極をウェルに穏やかに挿入した。細胞を、溶液ＡＤ１及びパルスコードＥＨ－１５８に設定されたＬｏｎｚａ Ｙ－ｕｎｉｔ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使用してヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクション後、ＲＮＰ溶液を穏やかに除去し、事前加温した新鮮なＢｒａｉｎｐｈｙｓ培地（成熟プロトコルに記載）と交換した。細胞を３７℃で７２時間回復させた後、採取した。培地を採取するために、細胞を５００ｕｌのＰＢＳに再懸濁し、ペレット化し、ＰＢＳを除去し、ペレットを凍結させた。
ＤＮＡ抽出及び遺伝子型決定を、ＮＰＣヌクレオフェクションについて上記のように実行した。
ウエスタンブロットプロトコル
細胞ペレットを、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を補充した１×ＭＳＤ溶解緩衝液に再懸濁した。５０μｌの溶解緩衝液を２００，０００細胞に使用した。
溶解物をボルテックスし、２０Ａｍｐで短時間（５～１０秒）超音波処理した後（Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ超音波ソニケーターを使用）、２１０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離して清澄化した。得られた上清は、タンパク質推定（ＢＣＡアッセイ）に使用することができる。
清澄化した上清に４×ＬＤＳ緩衝液を加えて、１×ＬＤＳの最終濃度を得た後、１００℃で５分間煮沸した。
５～１５μｇの細胞溶解物を１× ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液を含む４～１２％ＮｕＰａｇｅ Ｂｉｓ－ｔｒｉｓゲルで泳動させた後、Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏシステム（カタログ番号１７０４１５０の取扱説明書）を使用して、０．２μＭニトロセルロースメンブレンに転写した。ブロットは、ＬｉＣｏＲ ＰＢＳブロッキング緩衝液（カタログ番号９２７－４００００）を使用して室温で１時間ブロックした。１時間後、０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含むＬｉＣｏｒ ＰＢＳブロッキング緩衝液中の一次抗体で、４℃でロッキングしながら一晩インキュベートした。濃度は一次抗体の効率によって異なった。
翌日、メンブレンをＰＢＳ－Ｔ（０．１％ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）で３回洗浄した後、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含むＬｉＣｏＲ ＰＢＳブロッキング緩衝液で１：１００００に希釈した二次抗体（ＬｉＣｏｒ ＩＲｄｙｅ ８００または６８０）で１時間インキュベートした。メンブレンをＰＢＳ－Ｔ（０．１％ ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）で３回洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ検出器を使用したＬｉＣｏｒ蛍光のシグナル検出に進んだ。使用した抗体（Ａｂｃａｍ）： ビンキュリン：ａｂ１２９００２（１：５０００）；フラタキシン：ａｂ１１０３２８（１：２５０）。
ＲＮＡ抽出及びｑＲＴ－ＰＣＲ
ミススプライシング補正を、ＤＭ１線維芽細胞のデュアルＤＭＰＫガイドＲＮＡによるＣＴＧリピート切除の機能的読み出しとして使用した。Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ ９６ ｋｉｔを使用して２０ｕｌの体積で総ＲＮＡを抽出した（ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。１０ｕｌのＲＮＡを使用して、ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ＲＴ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ４３６８８１４）の２×ＲＴマスターミックス１０ｕｌと混合して第１鎖ｃＤＮＡを生成した。反応混合物をスピンダウンして気泡を除去し、サーマルサイクラーにロードした。
逆転写は、２５℃で１０分、３７℃で１２０分、８５℃で５分からなる３ステッププログラムを使用して実行し、続いて４℃で保持した。
スプライシングを、Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ １２Ｋ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステムでＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ａ２５７４２）を使用したｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。１０ｕｌの１×反応の組成を以下の表３に示す。プライマー配列は、追加配列の表に列挙されている。
Figure 2022545921000142
材料の供給源
表４に列挙されている材料は、指定された販売者から入手したものである。
Figure 2022545921000143
Figure 2022545921000144
Figure 2022545921000145
２．対のｇＲＮＡを使用した心筋細胞及び線維芽細胞におけるＤＭＰＫのＴＮＲ切除
ＰＣＲ及びゲル電気泳動による切除の分析。心筋細胞は、上記のようにエレクトロポレーションを介して、ｓｐＣａｓ９及びＤＭＰＫ１のＣＴＧリピート遺伝子座に隣接する部位を標的とする１対のｇＲＮＡを含むＲＮＰで処理された。表５及び６に示すように、ｇＲＮＡ対は対Ａ～Ｈの１つであった。
Figure 2022545921000146
Figure 2022545921000147
以下の１８量体スペーサー配列を含むガイドの対を試験した：配列番号：３３４８及び２５５６；配列番号：３３４８及び２５００；配列番号：３３３２及び２５５６；配列番号：３３３２及び２５００；配列番号：３３５６及び２５４８；配列番号：３３５６及び２５０８；配列番号：３３８０及び２５４８；配列番号：３３８０及び２５０８。より具体的には、試験されたガイドは、表６に示されるように、図７で試験された２０量体のガイド対であった。
処理は、図７に示される程度までのＣＴＧリピート遺伝子座の切除をもたらし、これは、ＤＭＰＫ１のＣＴＧリピート遺伝子座に隣接するプライマーを使用するＰＣＲ産物の電気泳動分離を示す。
野生型及びヘテロ接合型ＤＭ１患者の心筋細胞をｉＰＳＣから調製し、上記のようにエレクトロポレーションを介して、ＤＭＰＫ１のＣＴＧリピート遺伝子座に隣接する部位を標的とするｓｐＣａｓ９及び１対のｇＲＮＡを含むＲＮＰで処理した。ｇＲＮＡ対は、表６に示されるように、それぞれ対Ｂ及び対Ｃと同じである対１または対２（図８Ａに示される）の１つであった。処理は、図８Ａに示される程度までのＣＴＧリピート遺伝子座の切除をもたらし、これは、ＤＭＰＫ１のＣＴＧリピート遺伝子座に隣接するプライマーを使用するＰＣＲ産物の電気泳動分離を示す。
野生型及びヘテロ接合型ＤＭ１患者の線維芽細胞は、上記のようにエレクトロポレーションを介して、ＤＭＰＫ１のＣＴＧリピート遺伝子座に隣接する部位を標的とするｓｐＣａｓ９及び１対のｇＲＮＡを含むＲＮＰで処理された。ｇＲＮＡ対は、表６に示されるように、対１または対２（図８Ｂに示される）の１つであった。処理は、図８Ｂに示される程度までのＣＴＧリピート遺伝子座の切除をもたらし、これは、ＤＭＰＫ１のＣＴＧリピート遺伝子座に隣接するプライマーを使用するＰＣＲ産物の電気泳動分離を示す。
ＣＴＧリピート遺伝子座の切除は、代表的な産物についてのサンガーシーケンシングによって確認された（図８Ｃ）。
ＣＵＧ増殖巣に対するＦＩＳＨによる切除及びＭＢＮＬ１増殖巣に対する免疫蛍光の分析。初代ＤＭ１及び野生型線維芽細胞を、上記のエレクトロポレーションを介してＤＭＰＫ１のＣＴＧリピート遺伝子座に隣接する部位を標的とするｓｐＣａｓ９及びｇＲＮＡの対を含むＲＮＰを用いて処理するか、またはｇＲＮＡを含めないで（陰性対照）処理した。ｇＲＮＡ対は、表６に示すように対Ａ～Ｄの１つであった。処理した細胞の試料を、上記のようにＤＭＰＫ１ ｍＲＮＡのＣＵＧリピート領域に対してＡｌｅｘａ５４６－（ＣＡＧ）１０プローブ（ＩＤＴからカスタムオーダー）を使用してＦＩＳＨによりアッセイした。処理された細胞の試料をまた、ＭＢＮＬ１タンパク質増殖巣についての免疫蛍光によってアッセイした。
核あたりのＣＵＧ増殖巣の数が決定され、図９Ａに示され、ガイド対Ａ～Ｄのそれぞれが、陰性対照と比較して核あたりのＣＵＧ増殖巣の減少を提供する。処理された各細胞集団及び未編集細胞における核あたりのＣＵＧ増殖巣の数のヒストグラムを図１１に示す。
核あたりのＭＢＮＬ１増殖巣の数が決定され、図９Ｂに示され、ガイド対Ａ～Ｄのそれぞれが、陰性対照と比較して核あたりのＭＢＮＬ１増殖巣の減少を提供する。
ＲＮＡスプライシングの分析。初代ＤＭ１線維芽細胞は、上記のようにｇＲＮＡ対７（表６の対Ｃと同一）を含有するＲＮＰで処理するか、ｇＲＮＡを含めずモック処理するか、または処理しなかった。スプライシングを、ＭＢＮＬ１（図１０Ａ）、ＮＣＯＲ２（図１０Ｂ）、ＦＮ１（図１０Ｃ）及びＫＩＦ１３Ａ（図１０Ｄ）のｍＲＮＡでアッセイした。結果は、ｇＲＮＡ対７を含有するＲＮＰを用いて処理した後の各アッセイｍＲＮＡのミススプライシングの減少を示した。図１０Ｅは、切除されたＤＭ１線維芽細胞の救出パーセンテージとして表されるミススプライシング補正の定量分析を示す。
３．ＤＮＡ－ＰＫの阻害を伴うＤＭＰＫのＴＮＲ切除
ｈＴｅｒｔ形質転換ＤＭ１線維芽細胞を、１０ｕＭのＤＮＡ－ＰＫ阻害剤化合物６を用いるかまたは用いないで、ＤＭＰＫ ｇＲＮＡ対Ａ～Ｄ（表６を参照）の１つを含有するＲＮＰを用いて上記のように処理した。処理は、図１２に示される程度までのＣＴＧリピート遺伝子座の切除をもたらし、これは、ＤＭＰＫ１のＣＴＧリピート遺伝子座に隣接するプライマーを使用するＰＣＲ産物の電気泳動分離を示す。化合物６で処理された試料では、切除産物を表すバンドは著しく強く、野生型産物を表すバンドは著しく弱かった。
配列番号３３３２、３３１６、２６６０、２６９２、２５５６、及び２５００の１８量体スペーサー配列を含むｇＲＮＡを試験した。より具体的には、試験されたガイドは、表５及び表６に示すように２０量体ガイドであった。
ｈＴｅｒｔ形質転換ＤＭ１線維芽細胞を、１０ｕＭのＤＮＡ－ＰＫ阻害剤化合物６を用いるかまたは用いないで、及び以下のＤＭＰＫ ｇＲＮＡ：ＤＭＰＫ－Ｕ５７（配列番号３３３０）（ｇＲＮＡ＃４）、ＤＭＰＫ－Ｕ６０（配列番号３３１４）（ｇＲＮＡ＃５）、ＤＭＰＫ－Ｒ１２（配列番号２６５８）（ｇＲＮＡ＃６）、ＤＭＰＫ－Ｒ０８（配列番号２６９０）（ｇＲＮＡ＃７）、ＤＭＰＫ－Ｄ０３（配列番号２５５４）（ｇＲＮＡ＃９）、またはＤＭＰＫ－Ｄ１０（配列番号２４９８）（ｇＲＮＡ＃１０）（表５、図１３、図１６を参照）のうちの１つを含有するＲＮＰを用いて上記のように処理した。処理は、図１３に示される程度までのＣＴＧリピート遺伝子座の切除をもたらし、これは、ＤＭＰＫ１のＣＴＧリピート遺伝子座に隣接するプライマーを使用するＰＣＲ産物の電気泳動分離を示す。化合物６で処理された試料では、切除産物を表すバンドは、ガイドＤＭＰＫ－Ｕ６０、ＤＭＰＫ－Ｒ０８、ＤＭＰＫ－Ｄ０３、及びＤＭＰＫ－Ｄ１０で著しく強く、野生型産物を表すバンドは、ガイドＤＭＰＫ－Ｕ６０、ＤＭＰＫ－Ｒ１２、及びＤＭＰＫ－Ｒ０８で著しく弱かった。
ｈＴｅｒｔ形質転換ＤＭ１線維芽細胞を、１０ｕＭのＤＮＡ－ＰＫ阻害剤化合物６を用いるかまたは用いないで、以下のＤＭＰＫ ｇＲＮＡ対：Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤ（表６を参照）の１つを含有するＲＮＰを用いて上記のように処理した。上記のように、ＦＩＳＨによって核あたりのＣＵＧ増殖巣について細胞をアッセイした。図１４は、ｇＲＮＡ対Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤを用いた３回の実験、ならびに未編集の健康な細胞及び患者の細胞の核あたりのＣＵＧ増殖巣のヒストグラムを示す。化合物６の存在下での各ガイド対による処理は、化合物６の非存在下でガイド対により処理された細胞よりも増殖巣が０の細胞の頻度が高く、未編集患者細胞よりも増殖巣が０の細胞の頻度が高かったことを示した。
ｈＴｅｒｔ形質転換ＤＭ１線維芽細胞を、１０ｕＭのＤＮＡ－ＰＫ阻害剤化合物６を用いるかまたは用いないで、以下のＤＭＰＫ ｇＲＮＡ対：Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤ（表６を参照）の１つを含有するＲＮＰを用いて上記のように処理した。対Ａ＝ガイドＤＭＰＫ－Ｕ５９及びＤＭＰＫ－Ｄ０３；対Ｂ＝ガイドＤＭＰＫ－Ｕ５９及びＤＭＰＫ－Ｄ１０；対Ｃ＝ガイドＤＭＰＫ－Ｕ５７及びＤＭＰＫ－Ｄ０３；対Ｄ＝ガイドＤＭＰＫ－Ｕ５７及びＤＭＰＫ－Ｄ１０（（上記の配列、表５、及び配列表）。モック処理（Ｍ）及びＡＡＶＳ１（ＮＴ）を標的とする対照ガイド（スペーサー配列：ａｃｃｃｃａｃａｇｔｇｇｇｇｃｃａｃｔａ、配列番号３１）で処理した細胞も分析した。ミススプライシングされた転写物のパーセンテージを、上記のように、ＭＢＮＬ１（図１５Ａ）、ＮＣＯＲ２（図１５Ｂ）、及びＦＭ１（図１５Ｃ）について決定した。相対ＤＭＰＫ発現も決定した（図１５Ｄ）。ＲＮＡスプライシングの部分的な回復は、ＭＢＮＬ１、ＮＣＯＲ２、及びＦＭ１のそれぞれのｑＰＣＲによって確認され、多くの結果は、化合物６の存在下でさらに増強されることを示している。編集によって、ＤＭＰＫの発現は有意に変化しなかった。
図１６は、ヒトＤＭＰＫ遺伝子座における単一ｇＲＮＡ ＣＴＧリピート切除に使用される例示的なｇＲＮＡの概要を示す。ｇＲＮＡは、ＣＴＧリピートの部位５’または３’を標的とするように設計され、例えば、配列番号３３７８（ｇＲＮＡ＃１）、配列番号３３５４（ｇＲＮＡ＃２）、配列番号３３４６（ｇＲＮＡ＃３）、配列番号３３３０（ｇＲＮＡ＃４）、配列番号３３１４（ｇＲＮＡ＃５）、配列番号２６５８（ｇＲＮＡ＃６）、配列番号２６９０（ｇＲＮＡ＃７）、配列番号２５４６（ｇＲＮＡ＃８）、配列番号２５５４（ｇＲＮＡ＃９）、配列番号２４９８（ｇＲＮＡ＃１０）、及び配列番号２５０６（ｇＲＮＡ＃１１）、を含むガイドを含む。
４．トリヌクレオチドリピートと重複するガイド対を使用したＦＭＲ１のリピートの切除
Ｍ２８ ＣＨＯＣ２及びモザイクＣＨＯＣ１ニューロン前駆細胞（ＮＰＣ）を、エレクトロポレーションを介して５’及び３’ＦＭＲ１ ｇＲＮＡとＳｐＣａｓ９との組み合わせを用いて処理した。種々のガイドが対象とするＦＭＲ１の位置を図１７に示す。以下のようにガイドにより処理した細胞からＤＮＡを単離した。レーンＡ～Ｅのそれぞれの３’ガイドは、配列番号５２６２のスペーサー配列を有していた。５’ガイドは、レーンＡ～Ｅに対して、それぞれ、配列番号５７８２、５８３０、５９２６、５９５０、または５９９８のスペーサー配列を有していた。切除を、ＰＣＲ及びゲル電気泳動によって分析した（図１８）。試験されたガイドの組み合わせそれぞれに対し、切除産物が目視された。
５．ＣＨＯＣ１細胞及びＣＨＯＣ２細胞におけるＦＭＲ１のＣＧＧリピートの切除
ａ．ＣＨＯＣ１細胞におけるＦＭＲ１のＣＧＧリピートの切除
標的遺伝子座のＰＣＲ及び電気泳動を使用してＣＨＯＣ１細胞の遺伝子型決定をし（図１９）、５’ＵＴＲに既存の欠失があることが明らかになった。欠失は、ある特定のｇＲＮＡ結合部位を排除するＣＧＧリピート領域の５’側の７１ｂｐの喪失としてシーケンシングによって特徴付けた（データは示されていない）。
それにもかかわらず、ＦＭＲ１のＣＧＧリピート領域の３’部位を標的とする１つのｇＲＮＡによるＣＨＯＣ１細胞の処理は、欠失領域の配列を標的とする５’ガイドと対になっており、したがって効果がないはずであったが、それでもリピート切除をもたらし、このことは、１つの効果的なガイドを使用してリピートを切除することができることを示している。単一ガイドＲＮＡ（配列番号５２６２）によりそのような切除を受けたクローンからの配列を、図２０に示す。接合配列は、ＭＭＥＪ経路を介した修復と一致していた。
ｂ．ＣＨＯＣ２細胞におけるＦＭＲ１のＣＧＧリピートの切除
ＣＧＧリピート切除を、ＳｐＣａｓ９ ＲＮＰエレクトロポレーション後の分化した有糸分裂後のＣＨＯＣ２ニューロンで単一または対のｇＲＮＡを使用して評価した。ＣＨＯＣ２有糸分裂後ニューロンを、ＤＮＡ－ＰＫ阻害を用いないで、ｓｐＣａｓ９及び以下の表７ａに示されるようなガイドを含むＲＮＰで処理した。スペーサー領域配列には配列番号が記載されている。配列については、表２及び／または配列表を参照のこと。
Figure 2022545921000148
ＣＧＧリピートの切除を、ＰＣＲによって分析した（図２１Ａ）。３’ガイド配列番号５２６２を用いた実験により、サンガーシーケンシング（図示せず）によって確認された、ＣＧＧリピート切除産物（図２１Ａ、レーン３）を表すバンドが目視された。
ＦＭＲ１のＣＧＧリピートの切除は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤の治療についてさらに評価された。ＣＨＯＣ２ニューロン前駆細胞（ＮＰＣ）を、以下の表７ｂに示すように、ｓｐＣａｓ９及びガイドを含むＲＮＰを用いて処理した。スペーサー領域配列には配列番号が記載されている。配列については、表２及び／または配列表を参照のこと。エレクトロポレーション後、以下の表７ｂに示すように、ＣＨＯＣ２ ＮＰＣをＤＭＳＯまたは３μＭ ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤（化合物６）で処理した。
Figure 2022545921000149
ＣＧＧリピートの切除を、ＰＣＲによってＦＭＲ１ ＤＮＡを増幅し、Ａｇｉｌｅｎｔの２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを使用した電気泳動によってＰＣＲ産物を分離することによって分析した（図２１Ｂ）。３’ガイド配列番号５２６２を用いた実験は、ＣＧＧリピートの切除を示した（図２１Ｂ、レーンＢ１及びＡ２）。注目すべきことに、図２１Ｂのより顕著なバンド（小さな矢印）、レーンＡ２は、ＤＭＳＯ対照と比較して、３ｕＭ化合物６によるＣＴＧ切除の増強を示している。
配列番号５２６４、５３３６、５８３２、６０２４、及び５３１２の１８量体スペーサー配列を含むｇＲＮＡを試験した。より具体的には、試験されたガイドは、表７ａ及び表７ｂに示すような２０量体ガイドであった。
６．ＦＸＮのフラタキシン遺伝子座でのＧＡＡリピートの切除
ｉＰＳ細胞（野生型、４６７０、または６８ＦＡ）を、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ（Ｃｐｆ１またはＣａｓ９）及び、フラタキシン遺伝子座におけるＧＡＡリピートに隣接する以下のようなフラタキシンｇＲＮＡを用い、１μＭの化合物３を伴うかまたは伴わないで処理した。Ｃｐｆ１ ＦＸＮ ｇＲＮＡ１及び２：配列番号：それぞれ４７０４７及び７４４７；ＳｐＣａｓ９ ＦＸＮ ｇＲＮＡ１及び２：配列番号５２８９８及び２６５４６。リピート切除を、ＰＣＲ及び電気泳動によって分析した（図２２）。化合物３の存在下でＧＡＡリピート切除が改善された。切除を受けたクローンは、フラタキシン遺伝子座で配列決定された（図２３）。化合物３の非存在下で切除を受けたクローンからの配列は、ＮＨＥＪのみによる修復と一致していた。化合物３の存在下で切除を受けたクローンからの配列の５０％は、ＭＭＥＪによる修復を示し、５０％は、ＮＨＥＪによる修復を示した。したがって、化合物３を用いる処理により、ＭＭＥＪ修復が支持され、ＮＨＥＪ修復の頻度が減少した。
ＦＸＮ遺伝子座のリピートにおける切除により、ＦＸＮレベルの上昇がもたらされた（図２４Ｂ～Ｃ）。具体的には、図２４Ａのワークフローに示されるように、ＦＡ ｉＰＳＣを、０．４、１．５、５または１１ｋｂフラグメントの切除を生じさせるために標的化されたＳｐＣａｓ９及びガイド対を含むＲＮＰを用いてエレクトロポレーションし、これを化合物６（図２４Ａにおける「Ｉｎｈ」）を用いるか用いない場合で増殖させ、バルクで（図２４Ｂ）またはＦＡＣＳによって単離された単一細胞のクローン増殖後（図２４Ｃ）のいずれかでウエスタンブロットによって分析された。試験されたガイド対は以下のとおりであった：対１（配列番号５２６６６及び２６５６２）。対２（ＧＤＧ＿ＳｐＣａｓ９＿ＦＡ＿６８０ｂｐ＿５（配列番号５１３２２）及びＧＤＧ＿ＳｐＣａｓ９＿ＦＡ＿８８０ｂｐ＿３（配列番号２８１３０））；対３（ＧＤＧ＿ＳｐＣａｓ９＿ＦＡ＿１ｋｂ＿５（配列番号５０３９４）及びＧＤＧ＿ＳｐＣａｓ９＿ＦＡ＿４ｋｂ＿３（配列番号３４４４２））；対４（ＧＤＧ＿ＳｐＣａｓ９＿ＦＡ＿１．３ｋｂ＿５（配列番号４９９８６）及びＧＤＧ＿ＳｐＣａｓ９＿ＦＡ＿１０ｋｂ＿３（配列番号４５９０６））。バルクＦＸＮ発現は、すべてのＤＮＡ－ＰＫ阻害剤処理集団において対照と比較して著しく増加した（図２４Ｂ）。ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤で処理されていない集団から、発現が増加した複数のクローンを単離した。
７．ＦＭＲ１の脆弱Ｘ遺伝子座でのＭＭＥＪベースのＣＧＧリピート切除のモデル
図２５は、ＦＭＲ１の脆弱Ｘ遺伝子座でのＭＭＥＪ経路を介したＣＧＧリピート切除のメカニズムを示している。示された位置での切断に続いて、ＤＮＡの５’末端切除が行われ、これにより、最後の２つのヌクレオチドがＧ及びＡ（５’から３’方向）である３’末端が露出する。マイクロホモロジー検索により、相補鎖内のいくつかのＴＣジヌクレオチドの１つを特定することができる（図２５においてボックス及び太い矢印で示されている）。ＭＭＥＪでこれらのＴＣジヌクレオチドのいずれかを使用した結果生じる修復産物は、リピート領域を欠いている。
８．ＤＭＰＫの３’ＵＴＲでのｓｇＲＮＡスクリーニング
ａ．材料及び方法
ｓｇＲＮＡの選択。ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を走査して、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかでＮＧＧまたはＮＡＧ ＳｐＣａｓ９プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を探索し、ＰＡＭに隣接する２０ヌクレオチドのｓｇＲＮＡスペーサー配列を同定した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の編集効率を評価するために、ＮＧＧ ＰＡＭを含む１７２個のｓｇＲＮＡとＮＡＧ ＰＡＭを含む４６個のｓｇＲＮＡを選択した（表８）。
プラスミド。ｓｇＲＮＡ、ＳｐＣａｓ９、及びＥＧＦＰを発現するオールインワン発現ベクターｐＵ６－ｓｇＲＮＡ－Ｃｂｈ－ＳｐＣａｓ９－２Ａ－ＥＧＦＰを使用して、個々のｓｇＲＮＡをサブクローニングした。各ｓｇＲＮＡの上部及び下部鎖オリゴをアニーリングし、前述のようにｐＵ６－ｓｇＲＮＡ－Ｃｂｈ－ＳｐＣａｓ９－２Ａ－ＥＧＦＰベクターのＢｂｓＩ制限部位にサブクローニングした（Ｒａｎ， Ｆ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ． ８：２２８１－２３０８；ＰＭＩＤ： ２４１５７５４８）。
トランスフェクション及びＰＣＲ増幅。個々のｓｇＲＮＡを含有するｐＵ６－ｓｇＲＮＡ－Ｃｂｈ－ＳｐＣａｓ９－２Ａ－ＥＧＦＰベクターを、製造元のプロトコルに従ったトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（及び７２時間のトランスフェクション時間）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（及び４８時間のトランスフェクション時間）のいずれかを使用して、ＣＥＬＬＳＴＡＲブラック９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に播種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後、０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｖｉａｇｅｎ）を補充したＤｉｒｅｃｔＰＣＲ溶解試薬（Ｖｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを単離し、その後のＰＣＲのテンプレートとして使用した。ＤＭＰＫ ３’ＵＴＲ領域は、ＧｏＴａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び３’ＵＴＲ領域に隣接するＰＣＲプライマー（配列番号３２及び３３）を使用して増幅された（追加配列の表）。増幅は、以下のサイクリングパラメータを使用して実施した：９５℃で２分間の１サイクル。９５℃で３０秒間、６３℃で３０秒間、７２℃で９０秒間を４０サイクル。７２℃で５分間の１サイクル。
サンガーシーケンシング及びＴＩＤＥ分析。ＰＣＲ産物を、精製及びサンガーシーケンシングのためにＧｅｎｅＷｉｚに送った。シーケンシングプライマーＵＴＲｓＦ３（配列番号３４）を、ＣＴＧリピートの上流のｓｇＲＮＡに使用し、リバースＰＣＲプライマー（配列番号３３）を、下流のｓｇＲＮＡ及びＣＴＧリピート領域と重複する１３個のｓｇＲＮＡに使用した。リバースＰＣＲプライマー（配列番号３３）の近くに位置するｓｇＲＮＡ（ＤＭＰＫ－Ｄ７５、ＤＭＰＫ－Ｄ７６、ＤＭＰＫ－Ｄ８５、ＤＭＰＫ－Ｄ８６、ＤＭＰＫ－Ｄ１０２、ＤＭＰＫ－Ｄ１０３、ＤＭＰＫ－Ｄ１０４、ＤＭＰＫ－Ｄ１０５、ＤＭＰＫ－Ｄ１１９、ＤＭＰＫ－Ｄ１２０、ＤＭＰＫ－Ｄ１２１、ＤＭＰＫ－Ｄ１２２、ＤＭＰＫ－Ｄ１２３、ＤＭＰＫ－Ｄ１２４、ＤＭＰＫ－Ｄ１２５、ＤＭＰＫ－Ｄ１２６、ＤＭＰＫ－Ｄ１２７、ＤＭＰＫ－Ｄ１２８、ＤＭＰＫＤ１２９）を、シーケンシングプライマーＵＴＲｓＦ２（配列番号３５）を使用して配列決定した。インデル値を、サンガーシーケンシングから得られた電気泳動図を使用したＴＩＤＥ分析アルゴリズム（ＤｅｓｋＧｅｎ／Ｖｅｒｔｅｘ）を使用して推定した。ＴＩＤＥは、シーケンシング電気泳動図からのインデルのスペクトルの回復に基づいて、テンプレート媒介編集イベントの割合を定量化する方法である（Ｂｒｉｎｋｍａｎ， Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４２： ｅ１６８；ＰＭＩＤ： ２５３００４８４）。
ｓｇＲＮＡのオフターゲットスコアリング。オフターゲット部位は、ｈｇ３８ヒト参照スゲノム、具体的には、ＮＧＧまたはＮＡＧのプロトスペーサー配列及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に対して、最大３つのミスマッチ、または最大２つのミスマッチ及び１つのＤＮＡ／ＲＮＡバルジがあると同定された任意の部位との配列類似性に基づいて、各ｓｇＲＮＡについて計算により予測された。次に、これらの計算により予測されたオフターゲット部位に基づいて、各ｓｇＲＮＡのオフターゲットスコアを計算した。
具体的には、各オフターゲット部位には、標的部位とそのＰＡＭシーケンスに対する部位の配列類似度に基づいて、編集される確率を表す重みが与えられた：（ｉ）不一致の数に基づく重み付けは、Ｈａｅｕｓｓｌｅｒ， Ｍ． ｅｔ． Ａｌ． （２０１６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．， １７（１４８）；ＰＭＩＤ： ２７３８０９３９で公開された経験的データのメタアナリシスから計算された（ＤＮＡ／ＲＮＡバルジがオフターゲット部位に存在する場合、ＤＮＡ／ＲＮＡバルジのある部位でのオフターゲット編集がミスマッチよりも少ない頻度で観察されるという経験的データに基づいて、バルジは２つの追加のミスマッチとして計数された）；また（ｉｉ）ＰＡＭシーケンスに基づく重み付けには、Ｄｏｅｎｃｈ， Ｊ． Ｇ． ｅｔ． Ａｌ． （２０１６） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ３４ （２）： １８４－１９１；ＰＭＩＤ： ２６７８０１８０からの切断頻度決定モデルを使用した。各オフターゲット部位の重みは、不一致の数に基づく部位の重みとＰＡＭ配列に基づく部位の重みを掛けることによって計算された。各ｓｇＲＮＡの全体のオフターゲットスコアは、関連するすべての予測されたオフターゲット部位の重みの合計として計算された。全体として、ｓｇＲＮＡのオフターゲットスコアは、そのｓｇＲＮＡのオフターゲット部位数の期待値に対応する。オフターゲットスコアが高いほど、オフターゲット編集を行う可能性が高いｓｇＲＮＡに対応する。
ｂ．結果
ＤＭＰＫ遺伝子のＣＴＧリピート伸長に隣接する２１８個のｓｇＲＮＡ（表８）を、ＣＴＧリピート伸長を編集するために選択した。ＤＭＰＫコード配列及びｍＲＮＡ成熟への干渉を回避するために、選択されたすべてのｓｇＲＮＡは、終止コドンと最後のエクソンの終端の間のＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置された。これらの２１８個のｓｇＲＮＡのうち、７６個（ＤＭＰＫ－Ｕ０１～ＤＭＰＫ－Ｕ７６）はＣＴＧリピート伸長の上流（終止コドンとＣＴＧリピート伸長の間）に位置しており、１２９個のｓｇＲＮＡ（ＤＭＰＫ－Ｄ０１～ＤＭＰＫ－Ｄ１２９）はＣＴＧリピート伸長の下流（ＣＴＧリピート伸長とＤＭＰＫの最後のエクソンの末端の間）に位置しており、及び１３のｓｇＲＮＡ（ＤＭＰＫ－Ｒ０１～ＤＭＰＫ－Ｒ１３）は、ＣＴＧリピート伸長と完全にまたは部分的に重複している。
配列番号４０２０、４０１２、４００４、４０４４、４０３６、４０２８、３９５６、３９４８、３９９６、３９１６、３９８０、３９０８、３９００、３９４０、３８５２、３８８４、２８２８、３８２０、３８４４、３７９６、３７８８、３７６４、３８１２、３７４８、３７８０、３７４０、３７７２、３７２４、３７５６、３６９２、３６６８、３６６０、３６３６、３５８８、３５４８、３５３２、３６４４、３５１６、３５０８、３４９２、３６２０、３６１２、３６０４、３５８０、３４４４、３５２４、３４１２、３３８０、３４３６、３３７２、３４２８、３４２０、３３９６、３３８８、３３３２、３３５６、３３４８、３３１６、３９３２、３８９２、３８３６、３８０４、３７０８、３７００、３６８４、３６７６、３５７２、３５５６、３５４０、３５００、３４８４、３４６０、３４７６、３４５２、２６６９、２６６８、２６５２、２６４４、２６２８、２６２０、２７０８、２６９２、２６８４、２６１２、２６７６、２６６０、２６０４、２５９６、２６３６、２５５６、２５４８、２５８８、２５４０、２５８０、２５７２、２５２４、２５００、２４９２、２４６８、２４６０、２４５２、２５１６、２５０８、２４２０、２４８４、２４７６、２６９６、２４４４、２４３６、２３７２、２３８０、２３５６、２３４８、２３４０、２３１６、２３００、２２８４、２２７６、２２６８、２３３２、２２６０、２３２４、２２４４、２２３６、２２９２、２２５２、２２２０、２２２８、２２１２、２１９６、２１４８、２１４０、２１２４、２１０８、２１００、２０９２、２１３２、２１１６、２０３６、２０２８、２０６０、２０５２、２０４４、１９１６、１７８８、１７８０、１７７２、１８４４、１７４０、１７０８、１６９２、１７４８、１７１６、１６５２、１６４４、１６１２、１５８８、１５６４、１５４８、１５８０、１５４０、１３８０、１３７２、１９２４、１９００、１９０８、１７９６、１７６４、１７００、１６７６、１７２４、１３６４、１４５２、２２０４、２１８０、２１７２、２１６４、２０２０、２０１２、１８９２、１９６４、１９４８、１８５２、１８２０、１６６０、１６３６、１６０４、１５５６、１４３６、１４２８、１３４０、１３４８、１９８０、１９９６、１９８８、１９７２、１９４０、１９３２、１８１２、１８３６、１８２８、１８０４、１６２８、１５９６、１５１６、１５００、１４９２、１４８４、１４７６、１４６０、１４４４、１４２０、１４１２、１４０４、１３９６、及び１３８８の１８量体スペーサー配列を含むガイドが試験された。より具体的には、例示されたガイドは、表８に示されるように、２０量体のガイドであった。
編集効率を評価するために、個々のｓｇＲＮＡをｐＵ６－ｓｇＲＮＡ－Ｃｂｈ－ＳｐＣａｓ９－２Ａ－ＥＧＦＰベクターにサブクローニングし、両方の対立遺伝子のＤＭＰＫ遺伝子に５つのＣＴＧリピートを含有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００の場合）または７２時間後（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００の場合）にゲノムＤＮＡを抽出し、ＣＴＧリピート伸長及びｓｇＲＮＡの標的部位を包摂する１１７４ｂｐの配列をＰＣＲで増幅した。次に、サンガーシーケンシング及びＴＩＤＥ分析を使用して、各ｓｇＲＮＡによって生成されたインデルの頻度を定量化した。上流ガイド（図２６Ａ）、下流ガイド（図２６Ｂ）、及びＣＴＧリピート伸長内にまたはそれに隣接して配置されたガイド（図２６Ｃ）に対するリポフェクタミン３０００のトランスフェクションの結果が示されている。上流ガイド（図２７Ａ）、下流ガイド（図２７Ｂ）、及びＣＴＧリピート伸長内にまたはそれ隣接して配置されたガイド（図２７Ｃ）に対するリポフェクタミン２０００のトランスフェクションの結果もまた示されている。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクションでは、１３個の上流ｓｇＲＮＡが４０％を超えるインデルを誘導し、３６個の上流ｓｇＲＮＡが２０％を超えるインデルを誘導し、ＤＭＰＫ－Ｕ３２が最高の活性（６５％インデル値）を示した（図２７Ａ）。５つの下流ｓｇＲＮＡは４０％を超えるインデルを誘導し、５１の下流ｓｇＲＮＡは２０％を超えるインデルを誘導し、ＤＭＰＫ－Ｄ８７は最高の活性（６０％インデル値）を示した（図２７Ｂ）。ＣＴＧリピート領域と重複する１３個のｓｇＲＮＡのうち８個は、５個を超える連続したＣＴＧまたはＣＡＧリピート配列を含有しているため、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ではインデルを生成しなかった（図２７Ｃ）。残りの５つのＣＴＧリピート領域ｓｇＲＮＡの中で、ＤＭＰＫ－Ｒ０６によって、２０％の最高のインデル値がもたらされた（図２７Ｃ）。表８も参照のこと、これは、図２６及び２７に示されている生データ、ならびにオフターゲットスコアを示している。
Figure 2022545921000150
Figure 2022545921000151
Figure 2022545921000152
Figure 2022545921000153
Figure 2022545921000154
Figure 2022545921000155
９．ＤＮＡ－ＰＫ阻害を伴うかまたは伴わないＤＭＰＫのＣＴＧリピート切除
ａ．材料及び方法
ＤＭ１筋芽細胞及び筋管の調製。健康なヒト筋芽細胞（Ｐ０１４３１－１８Ｆ）及びＤＭ１患者の筋芽細胞（０３００１－３２Ｆ）は、Ｃｏｏｋ ｍｙｏｓｉｔｅから入手した。初代ヒト筋芽細胞は、Ｍｙｏｔｏｎｉｃ（商標）基本培地（Ｃｏｏｋ ｍｙｏｓｉｔｅ、ＭＢ－２２２２）及びＭｙｏＴｏｎｉｃ（商標）Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｃｏｏｋ ｍｙｏｓｉｔｅ、ＭＳ－３３３３）からなる増殖培地で培養された。筋芽細胞の分化は、培養培地をＭＹＯＴＯＮＩＣ分化培地（Ｃｏｏｋ ｍｙｏｉｔｅ、ＭＤ－５５５５）に変更することによって誘導された。分化培地に変更した後に筋管が形成され、分化誘導の７日後に筋管試料を収集した。初代ヒト筋芽細胞を、ヌクレオフェクションの３日前に製造元のプロトコルに従って、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ５６ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈ １７８５５）でさらに精製し、ＲＮＰのヌクレオフェクションまで増殖培地で維持した。
ｓｇＲＮＡの選択。ＤＭ１筋芽細胞においてさらに評価するために、ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞（実施例８）のＤＭＰＫ ３’ＵＴＲスクリーニングから４２個のｓｇＲＮＡを選択した。ｓｇＲＮＡを、ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞の編集効率、インシリコオフターゲットスコア、及びＣＴＧリピート領域に隣接する領域のカバレッジに基づいて選択した。４２個のｓｇＲＮＡのうち、２２個の上流及び２０個の下流のｓｇＲＮＡが選択された（表９）。
ＲＮＰの調製。Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを含有するＲＮＰは、Ｃａｓ：ｓｇＲＮＡを１：６（シングルカットスクリーニング）及び１：３（ダブルカットスクリーニング）の比率で調製した。シングルカットスクリーニングでは、ＲＮＰ複合体を、１０ｕＬのエレクトロポレーション緩衝液中のそれぞれ３０、２０、または１０ｐモルのＣａｓ９と１８０、１２０、または６０ｐモルのｓｇＲＮＡを用いて構築した。室温で２０分間インキュベートした後、１０ｕＬのこの溶液を１０ｕＬヌクレオフェクション緩衝液中の３×１０５個の初代筋芽細胞と混合した。ダブルカットスクリーニングでは、最初にＲＮＰ複合体を、個々のｓｇＲＮＡに対し５ｕＬのエレクトロポレーション緩衝液中の１０ｐモルのＣａｓ９及び３０ｐモルのｓｇＲＮＡ用いて構築した。室温で２０分間インキュベートした後、２つのＲＮＰを１：１の比率で混合し、次に１０ｕＬのエレクトロポレーション緩衝液中で２×１０５個の初代筋芽細胞と混合した。
ＤＭ１筋芽細胞へのＲＮＰの送達。ＤＭ１筋芽細胞（Ｃｏｏｋ ｍｙｏｓｉｔｅ ０３００１－３２Ｆ；シングルカットスクリーニングの場合は反応あたり３×１０５細胞；ダブルカットスクリーンの場合は反応あたり２×１０５細胞）を、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡＲＮＰでヌクレオフェクションした。Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ９６ウェルシャトルシステムを使用して、Ｃａｓ９（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）及び化学的に修飾されたｓｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）を送達した。シングルカットスクリーニングでは、Ｃａｓ９の３つの用量（１０、２０、または３０ｐｍｏｌ）を評価した。ダブルカットスクリーニングでは、２０ｐｍｏｌのＣａｓ９を使用した。エレクトロポレーション後、ヌクレオフェクションシャトルデバイスの各ウェルからの筋芽細胞を、９６ウェル細胞培養プレートの６つの同一ウェルに分割した。エレクトロポレーションの２４時間後、新鮮な培地と交換した。これらの筋芽細胞は、エレクトロポレーション後７２時間まで３７℃／５％ＣＯ２で培養し、次にＤＮＡ抽出及び蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）染色のために採取するか、さらに７日間、培地をＭＹＯＴＯＮＩＣ分化培地（Ｃｏｏｋ ｍｙｏｉｔｅ、ＭＤ－５５５５）に置き換えることで筋管分化を誘導した。次に、ＤＭ１筋管をＦＩＳＨ用に固定するか、ＲＮＡ抽出用に採取した。
ＰＣＲ増幅。ヌクレオフェクション後３日目に、ＤＭ１筋芽細胞のゲノムＤＮＡを単離し、実施例８に記載されているように増幅した。
サンガーシーケンシング及びＴＩＤＥ分析。実施例８に記載されているように、ＰＣＲ産物を分析した。
ＰａｃＢｉｏシーケンシング。ＰａｃＢｉｏロングリードシーケンシングを使用して、ＤＭＰＫ ＣＴＧリピートの近くのＣａｓ９遺伝子編集に対するガイド及びＤＮＡＰＫ阻害剤処理の影響を調査した。Ｉｌｌｕｍｉｎａのショートリードシーケンシング（＜＜３００ＮＴリード）よりもロングリードシーケンシングを選択して、約１．２ｋｂのアンプリコンでの複雑な編集を完全に捕捉した。ＤＭＰＫ遺伝子のＣＴＧリピートを中心とする１２１９ＮＴアンプリコンを増幅する遺伝子特異的プライマーＣＧＣＴＡＧＧＡＡＧＣＡＧＣＣＡＡＴＧＡ（配列番号５３３７４）及びＴＡＧＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＡＣＣＴＴＣＧ（配列番号５３３７５）に、ＰａｃＢｉｏ特異的１６ＮＴインデックスを付加した。フォワード及びリバースプライマーの最終フォーマットは、／５Ｐｈｏｓ／ＧＧＧＴ（１６ＮＴ＿ｉｎｄｅｘ）ＣＧＣＴＡＧＧＡＡＧＣＡＧＣＣＡＡＴＧＡ（配列番号５３３７６）及び／５Ｐｈｏｓ／ＣＡＧＴ（１６ＮＴ＿ｉｎｄｅｘ）ＴＡＧＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＡＣＣＴＴＣＧ（配列番号５３３７７）であった。５’リン酸化は、ＳＭＲＴＢｅｌｌアダプターのライゲーションを促進し、フォワードまたはリバースプライマーに付加されたＧＧＧＴまたはＣＡＧＴ塩基は、ライゲーション効率を正規化し、逆多重化を促進するのに役立つ。
ＰａｃＢｉｏライブラリを生成するために、ＷＴまたはＤＭ１細胞を９６ウェルプレートでガイド及び／または化合物を用いて処理した。ＤＮＡを、ＤｉｒｅｃｔＰＣＲ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｖｉａｇｅｎ Ｂｉｏ、３０１－Ｃ）を製造元の指示に従って使用して回復させ、将来の使用のために凍結した。この溶解物の２μｌを、ＮＥＢの２ＸＱ５ ＰＣＲミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０４９１）を含む２５μｌのＰＣＲ反応液においてにおいて使用した。インデックス付きプライマーはそれぞれ２５０ｎＭで含まれていた。使用したすべてのプライマー及びインデックスを以下に示す。勾配を使用して６９℃の最適なアニーリング温度を特定し、合計３０サイクルを使用して、編集分布を歪める可能性のある不要な増幅を最小限に抑えながら、ＳＭＲＴＢｅｌｌライゲーションに十分なアンプリコンを生成した。使用したサイクリングパラメータは以下のとおりである。
Figure 2022545921000156
ＰＣＲ反応液を、分子生物学グレードの水で１：１０に希釈し、高感度Ｄ５０００テープ（Ａｇｉｌｅｎｔ、５０６７－５５９２）を使用してＡｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｇ２９９１ＡＡ）で実行した。いくつかの試料では、約１２００ヌクレオチド（ＮＴ）の顕著なピーク及び、欠失を示している、いくつかのより小さなバンドが検出された。試料をプールし、２つの連続した０．７×比のＡｍｐｕｒｅＸＰビーズステップ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８０）で精製した。連続溶出を、製造元のプロトコルに従って１００μｌ及び２５μｌのＴＥで実行した。試料をＳＭＲＴＢｅｌｌアダプターにライゲーションし、ＰａｃＢｉｏ Ｓｅｑｕｅｌ ＩＩ（Ｆｏｒｎａｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で８Ｍ ＳＭＲＴＣｅｌｌを使用してシーケンシングを行い、１０時間のデータ収集を行った。配列の逆多重化、アダプターの削除、及びサブリードの循環コンセンサス配列への処理を、Ｆｏｒｎａｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって実行した。ＰａｃＢｉｏバーコードプライマー－インデックス（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を表９に示す。
Figure 2022545921000157
Figure 2022545921000158
ＰａｃＢｉｏデータを、ＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴＴｏｏｌｓコマンドラインプログラムを使用して処理した。循環コンセンサス配列を、それぞれｃｃｓツール及びｌｉｍａツールを使用してコールし、逆多重化させた。次に、ｐｂｍｍ２（ｍｉｍｉｍａｐ２のラッパー）を使用して、リードをアンプリコンにアラインメントさせた。アラインメントには、ｐｂｍｍ２のＲＮＡシーケンシングプリセットを使用し、これらの設定により、大きな欠失をより正確に検出できると想定される（ＲＮＡシーケンシングアラインメントはイントロンを検出するようにすでに設定されているため）。
品質管理のために、マッピングスコア（ＭＡＰＱ）が少なくとも３０の参照アンプリコンにマッピングされなかったすべてのリードを削除した。４００未満または１５００超塩基対の長さのリードも削除した。さらに、複数のアラインメントに分割されたリード、アラインメントの最初または末端に２０を超えるソフトクリップされた塩基を含むリード、及びＣＩＧＡＲストリング全体にまたがる少なくとも１０ｂｐ以内に存在しなかったリードを削除した。
ＣＩＧＡＲ文字列を解析して、各リードで観察されたすべてのバリアントをコールした。ホモポリマー領域の短いインデルは、スプリアスである可能性が高いとフラグが付けられ、これは、ＰａｃＢｉｏシーケンシングがそのような領域で比較的高いエラー率を示すことが知られているためである。パイルアップは、ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｇｅｎｏｍｅｃｏｖツールを使用して生成した。
ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）。ｄｄＰＣＲプライマー及びプローブ配列を、Ｐｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３ｐｌｕｓ／ｐｒｉｍｅｒ３ｐｌｕｓ．ｃｇｉ）を使用して設計した。標的プライマー／プローブセットを使用してＣＴＧリピート切除を検出し、参照プライマー／プローブセットを対照として使用して、ＤＭＰＫ遺伝子のエクソン１にある領域を増幅させた。プライマー及びプローブの配列を以下の表１０に示す。
Figure 2022545921000159
２４ｕＬのｄｄＰＣＲ反応物は、１２μＬのＳｕｐｅｒｍｉｘｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰ非含有）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１μＬの参照プライマーミックス（２１．６μＭ）、１μＬの参照プローブ（６μＭ）、１μＬの標的プライマーミックス（２１．６μＭ）、１μＬの標的プローブ（６μＭ）、及び８μＬの試料ゲノムＤＮＡ、で構成されていた。液滴を、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてプローブオイルを使用して生成した。液滴を９６ウェルＰＣＲプレートに移し、密封し、Ｃ１０００ディープウェルＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、以下のサイクリングプロトコルでサイクリングした：９５℃にて１０分間、続いて９４℃で３０秒間（変性）及び５８℃で１分間（アニーリング）の４０サイクル、続いて９８℃で１０分間のサイクリング後ステップ（酵素の不活性化）及び４℃での無限の保持。次に、サイクルプレートを移し、ディープウェルブロックを備えたＣ１０００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で実行されるＢｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ リーダーを使用して、ＦＡＭ及びＨＥＸチャネルで読み取った。すべてのｄｄＰＣＲ反応を、以下の熱サイクリング条件下で実行した：１）９５℃で１０分間；２）９４℃で３０秒間；３）５８℃で１分間；４）ステップ２と３を３９回繰り返した；５）９８℃で１０分間。ｄｄＰＣＲ分析を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ Ｐｒｏソフトウェアによって実行した。
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
ＭＢＮＬ１／（ＣＵＧ）ｎ増殖巣イメージングを、直交法として使用して、ＤＭ１筋芽細胞におけるＤＭＰＫ ｓｇＲＮＡによるＣＴＧリピート切除を評価した。ミオジェニン抗体を使用して、筋芽細胞から分化した筋管の筋核を同定した。
細胞を、４％ＰＦＡを用いて室温にて１５分間固定し、室温にてそれぞれ１×ＰＢＳで１０分間５回洗浄した。直ちにプローブしない場合、細胞を４℃で保存した。
ＦＩＳＨ手順では、細胞を１×ＰＢＳ中の０．５％トリトンＸ－１００で室温にて５分間透過処理した。
細胞を３０％ホルムアミド、２×ＳＳＣで室温にて１０分間前洗浄した。次に、細胞を、８０℃で１５分間、３０％ホルムアミド中の１ｎｇ／μＬのＣｙ３－ＰＮＡ（ＣＡＧ）５プローブ（ＰＮＡ Ｂｉｏ、Ｆ５００１）、２×ＳＳＣ、２μｇ／ｍＬのＢＳＡ、６６μｇ／ｍＬの酵母ｔＲＮＡ、２ｍＭバナジル複合体でプローブした。
次に、細胞を、３０％ホルムアミド、２×ＳＳＣで４２℃にて３０分間洗浄し、次に３０％ホルムアミド、２×ＳＳＣで３７℃にて３０分間、次に１×ＳＳＣで室温にて１０分間洗浄し、最後に１×ＰＢＳで室温にて１０分間洗浄した。次に、細胞を１×ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中の抗ＭＢＮＬ１抗体（１：１０００希釈、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、３Ａ４）抗ミオジェニン抗体（１：５００希釈、Ａｂｃａｍ－Ｍｙｏｔｕｂｅ試料のみ）で４℃にて一晩プローブした。細胞を、それぞれ１×ＰＢＳで室温にて１０分間、２回洗浄した。細胞を、１×ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（１：５００希釈）中のヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ６４７及びヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ４８８（筋管のみ）と共に室温で１時間インキュベートした。細胞を、それぞれ１×ＰＢＳで室温にて１０分間、２回洗浄した。細胞をＨｏｅｃｈｓｔ溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）で５分間染色した後、１×ＰＢＳで５分間、１回洗浄した。
ＰＢＳを吸引し、ウェルごとに新鮮なＰＢＳ（１００μｌ）を加えた。イメージングプレートを粘着性アルミニウムホイルで密封し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してイメージング処理した。
ＲＮＡ抽出及びｑＲＴ－ＰＣＲ。ミススプライシング補正を、ＤＭ１筋管のｓｇＲＮＡの対によるＣＴＧリピート切除の機能的読み出しとして使用した。ＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴ（商標）Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ、ＡＭ１７２８）を使用して製造元のプロトコルに従って抽出し、実施例１で説明したようにｑＲＴ－ＰＣＲで分析した。
プライマー配列は、追加配列の表に列挙されている。
ｂ．ＤＭ１筋芽細胞におけるＤＭＰＫの編集効率のためのｓｇＲＮＡのスクリーニング
ＤＭＰＫ遺伝子のＣＴＧリピート伸長に隣接する４２個のｓｇＲＮＡを、ＣＴＧリピート伸長を編集するために選択した。これらの４２個のｓｇＲＮＡのうち、２２個はＣＴＧリピート伸長の上流（停止コドンとＣＴＧリピート伸長の間）に配置し、２０個はＣＴＧリピート伸長の下流（ＣＴＧリピート伸長とＤＭＰＫの最後のエクソンの末端の間、または、ＣＴＧリピート伸長と部分的に重複している）に配置した。
配列番号３３３２、３９１６、３４２０、３７４８、３７８０、３３９６、４０２８、３６９２、３７９６、３３８８、３９４０、３６８４、３８２０、３６６０、３７２４、３８０４、３８６０、３５１６、３７７２、３３７２、３３５６、４０１２、２２０４、１７０８、２２１２、２１７２、１７８０、２２６０、２１１６、２１８０、１６４４、１７４０、１７４８、２３２４、１７７２、１５４０、２５１６、２４６０、２１９６、２５９６、２１６４、または２６２０の１８量体スペーサー配列を含むｇＲＮＡが試験された。より具体的には、試験されたガイドは、表１１に示すように例示的な２０量体ガイドであった。
編集効率を評価するために、個々のｓｇＲＮＡをｓｐＣａｓ９と共にＲＮＰとして調製し、ＤＭ１筋芽細胞に送達した。ゲノムＤＮＡを細胞から分離し、ＰＣＲで増幅させた。サンガーシーケンシング及びＴＩＤＥ分析を使用して、各ｓｇＲＮＡによって生成されたインデルの頻度を定量化した。結果は、ＴＩＤＥ分析による編集効率％として、３つのｓｐＣａｓ９濃度（１０、２０、または３０ｐｍｏｌ）で上流及び下流ガイドについて示されている（図２８Ａ、図２８Ｂ）。２０ｐｍｏｌ ｓｐＣａｓ９での編集効率％を表１１に示す。
Figure 2022545921000160
Figure 2022545921000161
ＤＭ１筋芽細胞の編集効率を、スピアマン相関を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞で得られた効率と比較した（分析で使用したＨＥＫ２９３ Ｔ細胞データについては実施例８を参照のこと）。図２９は、両方の細胞型で試験された４２個の上流及び下流ガイドＲＮＡのスピアマン相関プロット（ｘ軸に筋芽細胞及びｙ軸にＨＥＫ２９３ Ｔ細胞）を示す。比較の結果、スピアマンの相関値はｒｈｏ－０．５２８、ｐ値は０．０００２になった。
ＤＭＰＫの３’ＵＴＲを標的とする個々のｓｇＲＮＡの編集効率を視覚化するために、処理したＤＭ１筋芽細胞のゲノムＤＮＡからのＰＣＲ産物を、ＤＮＡゲル電気泳動により分離した（図３０）。一部のｓｇＲＮＡでは、ＤＭ１筋芽細胞において誘導される低頻度の大きなインデル（＞５０ｂｐ）のため、高い編集効率がＴＩＤＥスコアに反映されなかった。例えば、ｓｇＲＮＡ ＤＭＰＫ－Ｕ１４（配列番号３９３８）は、サンガーシーケンシング（図３１Ａ）及びＤＮＡゲル電気泳動（図３１Ｂ）によって証明されるように、低頻度の大きなインデルを誘導することが見出された。他のｓｇＲＮＡも、表１１に示され、図３２に示されているように、ＤＭ１筋芽細胞に大きなインデルを誘導した。重要なことに、いくつかの個々のｓｇＲＮＡは、ＣＴＧリピート領域の切除をもたらす大きなインデルを誘導した（表１１、図３２を参照）。
ＤＭ１筋芽細胞のＴＩＤＥスコアに基づいて（例えば、＞３０％の編集効率、表１１）、１５個の上流ｓｇＲＮＡ（ＤＭＰＫ－Ｕ５７、ＤＭＰＫ－Ｕ１０、ＤＭＰＫ－Ｕ５４、ＤＭＰＫ－Ｕ２６、ＤＭＰＫ－Ｕ２７、ＤＭＰＫ－Ｕ５５、ＤＭＰＫ－Ｕ６、ＤＭＰＫ－Ｕ３２、ＤＭＰＫ－Ｕ２２、ＤＭＰＫ－Ｕ５６、ＤＭＰＫ－Ｕ１４、ＤＭＰＫ－Ｕ６７、ＤＭＰＫ－Ｕ２０、ＤＭＰＫ－Ｕ３４、ＤＭＰＫ－Ｕ３０）及び１１個の下流ｓｇＲＮＡ（ＤＭＰＫ－Ｄ８７、ＤＭＰＫ－Ｄ６３、ＤＭＰＫ－Ｄ４２、ＤＭＰＫ－Ｄ８９、ＤＭＰＫ－Ｄ５９、ＤＭＰＫ－Ｄ３４、ＤＭＰＫ－Ｄ５１、ＤＭＰＫ－Ｄ８８、ＤＭＰＫ－Ｄ６８、ＤＭＰＫ－Ｄ６２、ＤＭＰＫ－Ｄ３５）が、ＤＭ１筋芽細胞において対としてスクリーニングのために同定された。
ｃ．ＤＭ１筋芽細胞における例示的なガイド対を用いたＤＭＰＫのＣＴＧリピート切除
３つの上流ｓｇＲＮＡ（配列番号３７７８、３３８６、３３５４）及び３つの下流ｓｇＲＮＡ（配列番号２５１４、２２５８、２２１０）を含む、ＤＭ１筋芽細胞におけるＣＴＧリピート切除の効率についてｓｇＲＮＡの対を選択して試験した。各ｓｇＲＮＡは個別に試験され、以下のｓｇＲＮＡは対として試験された（配列番号３７７８及び２２５８（対１）；３７７８及び２２１０（対２）；３３８６及び２２５８（対３）；３３８６及び２２１０（対４）；３３５４及び２５１４（対５））。
ＣＴＧリピート切除効率を評価するために、ｓｇＲＮＡの対をｓｐＣａｓ９（２０ｐｍｏｌ）と共にＲＮＰとして調製し、ヌクレオフェクションによってＤＭ１筋芽細胞に送達した。ＣＴＧリピート切除を、個々のｓｇＲＮＡ（配列番号：３７７８、３３８６、３３５４、２５１４、２２５８、２２１０）またはｓｇＲＮＡ対（配列番号：３７７８及び２２５８；３７７８及び２２１０；３３８６及び２２５８；３３８６及び２２１０；３３５４及び２５１４）を用いて処理されたＤＭ１患者筋芽細胞における野生型対立遺伝子（図３３Ａにおける概略）のＰＣＲによって評価し、健康な筋芽細胞と比較した。野生型対立遺伝子とダブルカット編集対立遺伝子を、ＤＮＡゲル電気泳動によって分離させた（図３３Ｂ）。
ＣＴＧリピート切除を、シグナル喪失ｄｄＰＣＲアッセイ（図３３Ａの概略図）を使用してさらに測定した。疾患対立遺伝子の補正％は、個々のｓｇＲＮＡと比較して、試験されたｓｇＲＮＡの対の方が大きかった（図３３Ｃ）。
ＤＭ１筋芽細胞（図３４）及びＤＭ１筋管（図３５）におけるｓｇＲＮＡ対または個々のｓｇＲＮＡを用いた処理後のＦＩＳＨによる（ＣＵＧ）ｎＲＮＡ増殖巣の減少を測定することにより、ＣＴＧリピート切除をさらに評価した。一般に、ＣＴＧリピートの変異転写物を有する細胞は核ＲＮＡ増殖巣に拘束される。したがって、ＣＴＧリピートを切除するｓｇＲＮＡにより処理された筋芽細胞は、（ＣＵＧ）ｎＲＮＡ増殖巣の減少を示す。
ＣＵＧリピートＲＮＡの蓄積は、スプライシングを正常に調節するタンパク質の機能を破壊し、他の遺伝子のミススプライシングｍＲＮＡ産物の発現をもたらす可能性がある。他の遺伝子のスプライシングに対するＤＭＰＫでのＣＴＧリピート切除の効果を、ｓｇＲＮＡ対（配列番号３３８６／２２１０）を使用してＤＭ１筋管で評価した。結果は、ｑＰＣＲによるＢＩＮ１（図３６Ａ）、ＤＭＤ（図３６Ｂ）、ＫＩＦ１３Ａ（図３６Ｃ）、及びＣＡＣＮＡ２Ｄ１（図３６Ｄ）ｍＲＮＡにおけるＲＮＡスプライシングの部分的な回復を示すことを示した。
ｄ．ＤＮＡ－ＰＫ阻害を伴うＤＭ１筋芽細胞におけるＤＭＰＫのＣＴＧリピート切除
ＤＭ１筋芽細胞の編集効率に関するスクリーニングからの個々のガイドＲＮＡを、ＤＮＡ－ＰＫ阻害を伴う場合及び伴わない場合でＣＴＧリピート切除についてさらに分析した。具体的には、ＤＭ１筋芽細胞を、ｓｐＣａｓ９及びガイドＲＮＡ（ＤＭＰＫ－Ｕ１０（配列番号３９１４）、ＤＭＰＫ－Ｕ４０（配列番号３５１４）、ＤＭＰＫ－Ｄ５９（配列番号１７７８）、ＤＭＰＫ－Ｄ１３（配列番号２４５８）、ＤＭＰＫ－Ｕ１６（配列番号３８５８）、ＤＭＰＫ－Ｕ５４（配列番号３４１８）、ＤＭＰＫ－Ｄ６３（配列番号１７０６）、またはＤＭＰＫ－Ｄ３４（配列番号：２２５８））を含有するＲＮＰを用い、３μＭ化合物６またはＤＭＳＯを伴って処理した。試料を、ＰＣＲ及びＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ電気泳動によって処理した。化合物６で処理した試料のより顕著なバンドは、ＤＭＳＯ対照と比較して切除率が高いことを示す（図３７、丸で囲んだ部分）。
ミススプライシング補正を、ＤＮＡ－ＰＫ阻害を伴う場合及び伴わない場合で、デュアルｇＲＮＡ ＣＴＧリピート切除後のＤＭ１筋芽細胞でも評価した。ＤＭ１筋芽細胞を、ｓｐＣａｓ９及びガイドＲＮＡ（ＤＭＰＫ－Ｕ５７及びＧＤＧ＿Ｃａｓ９＿Ｄｍｐｋ３とも呼ばれる配列番号３３３０、ＤＭＰＫ－Ｄ０３及びＧＤＧ＿Ｃａｓ９＿Ｄｍｐｋ＿６とも呼ばれる配列番号２５５４）を含むＲＮＰを用い、３μＭの化合物６を伴うかまたは伴わない場合で、処理した。ｇＲＮＡの対（図３８Ａ）、ＡＡＶＳ１ ｇＲＮＡ（図３８Ｂ）、またはモックエレクトロポレーション（図３８Ｃ）で処理した細胞における遺伝子ＧＦＴＰ１、ＢＩＮ１、ＭＢＮＬ２、ＤＭＤ、ＮＦＩＸ、ＧＯＬＧＡ４、及びＫＩＦ１３Ａのミススプライシング補正を評価した。
ｅ．例示的なガイド対を用いたＤＮＡ－ＰＫ阻害剤の用量反応
ＤＭＰＫのＣＴＧリピート切除に対するＤＮＡ－ＰＫ阻害の用量反応を、ＤＭ１患者の線維芽細胞（上記の実施例１に記載の細胞）において評価した。細胞を、ｓｐＣａｓ９及びガイド対（配列番号３３３０（ＧＤＧ＿ＤＭＰＫ３）及び配列番号２５０６（ＣＲＩＳＰＲ－３）；または配列番号３３３０（ＧＤＧ＿ＤＭＰＫ３）及び配列番号２５４６（ＣＲＩＳＰＲ－４））を含有するＲＮＰ、及び用量を増加させた化合物６（３０ｎＭ、３００ｎＭ、３μＭ、及び１０μＭ）、またはＤＭＳＯを用いて処理した。ＤＮＡ－ＰＫｉの用量を増加させると、切除された産物に対応するより強いバンドが両方の対で観察された（図３９Ａ及び図３９Ｂ）。
ｆ．ＳａＣａｓ９及びＤＮＡ－ＰＫ阻害剤によるＤＭＰＫのＣＴＧリピート切除
単一ガイド切除を、ｓａＣａｓ９を使用して、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤（化合物６）を用いる場合と用いない場合で、ＤＭ１患者の線維芽細胞（上記の実施例１で説明した細胞）において評価した。細胞を、ｓａＣａｓ９及び個々のガイド（図４０Ｂ）を含有するＲＮＰを用いて処理した（配列番号１１５３（ｇＲＮＡ１）；配列番号１１２９（ｇＲＮＡ２））。
ｇ．ＤＮＡ－ＰＫ阻害を伴う個々のｓｇＲＮＡによるＣＴＧリピート切除のスクリーニング
ＤＭＰＫの３’ＵＴＲを標的とする４２個の個々のＳｐＣａｓ９ ｓｇＲＮＡのスクリーニング（表１１）を、ＤＭＳＯまたは３ｕＭの化合物６を用いてＤＭ１筋芽細胞において実施した。エレクトロポレーション後、細胞をＤＭＳＯまたは３ｕＭ化合物６と２４時間インキュベートした。図４１Ａ～Ｂは、２回の反復実験からの編集細胞からのＤＭＰＫのＰＣＲ増幅された３’ＵＴＲ領域のエレクトロフェログラムの複合体を示す。非標的指向性対照ｇＲＮＡには、ＣＤＣ４２ＢＰＢ ｇＲＮＡ（ＧＡＧＣＣＧＣＡＣＣＵＵＧＧＣＣＧＡＣＡ）（配列番号５３４０８）及びＲＥＬＡ ｇＲＮＡ（ＧＡＵＣＵＣＣＡＣＡＵＡＧＧＧＧＣＣＡＧ）（配列番号５３４０９）が含まれていた。シングルカット切除実験の例示的なＰａｃＢｉｏシーケンシングリードパイルアップの結果は、ＤＮＡ－ＰＫ阻害による切除の改善及び増強を示している（図４２Ａ～Ｆ）。
ｈ．ＤＮＡ－ＰＫ阻害を伴うガイド対によるＣＴＧリピート切除のスクリーニング
ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲを標的とする４２個のＳｐＣａｓ９ ｓｇＲＮＡのすべてのペアワイズの組み合わせのスクリーニング（表１１、ＣＴＧリピートの上流に２２個のｓｇＲＮＡ、下流に２０個のｓｇＲＮＡ）をＤＭ１患者の線維芽細胞（上記の実施例１で説明した細胞）において実施した。各ガイド対を事前ロードしたＲＮＰを用いたエレクトロポレーション後、細胞をＤＭＳＯまたは３ｕＭ化合物６と共に２４時間インキュベートした。図４３Ａ～Ｅは、編集細胞からのＤＭＰＫのＰＣＲ増幅３’ＵＴＲ領域のエレクトロフェログラムの複合体を示す。以下の表１２Ａ～Ｅに示されるように、試料（図４２Ａ～Ｅに示される結果に対応する）を、５つのプレート上で実行した。
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１０．個々のフラタキシンｓｇＲＮＡのスクリーニング
ａ．材料及び方法
ｓｇＲＮＡの選択。ＦＸＮ遺伝子のイントロン１内にＧＡＡリピートを含有する選択された領域を、センス鎖（＋１）またはアンチセンス鎖（－１）のいずれかでＮＧＧ ＳｐＣａｓ９プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）について走査し、ＰＡＭに隣接する２０ヌクレオチドのｓｇＲＮＡスペーサー配列に基づいてガイド配列を生成した。ＧＡＡリピートの上流領域（ｃｈｒ９：６９ ０３５ ９５０～６９ ０３７ ２９５）内で２１８個のｓｇＲＮＡが同定され、ＧＡＡリピートの下流領域（ｃｈｒ９：６９ ０３７ ３０７～６９ ０３８ ６００）内で１７３個のｓｇＲＮＡが同定された（表１３）。社内アルゴリズムを使用した計算によるオフターゲット予測を、上流領域と下流領域の両方で各ｓｇＲＮＡに対して実行した。合計３９１個のｓｇＲＮＡのうち、９６個のｓｇＲＮＡのサブセットを選択して、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ濃度のスクリーニングのための２つのＲＮＰ（リボ核タンパク質）複合体濃度（図４４を参照）で、長いリピート長の２つの患者細胞株における編集効果を評価するスクリーニングに進んだ。ｓｇＲＮＡの選択基準には、低いオフターゲットスコア及びゲノム位置が含まれていた。このシングルカットｓｇＲＮＡスクリーニングから、合計４５個のｓｇＲＮＡ（ＧＡＡリピートの上流に２５個のｓｇＲＮＡ、ＧＡＡリピートの下流に２０個のｓｇＲＮＡ）を選択して、ｓｇＲＮＡ対の組み合わせスクリーニングに進んだ（表１４）。選択基準には、試験された条件全体での高い編集効果、ゲノム位置、及びＳＮＰ（一塩基多型）の存在が含まれていた。
ＦＡ患者細胞へのＲＮＰ複合体のエレクトロポレーション。Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ９６ウェルシャトルシステムを使用して、Ｃａｓ９（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）及び化学修飾ｓｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）を、ＧＡＡリピートが長い２人の患者に由来する２つの細胞株（ＧＭ１４５１８（リンパ芽細胞株）及びＧＭ０３６６５（線維芽細胞株）（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に送達した。最初に、１２ｕＬの体積のエレクトロポレーション緩衝液に、３６ｐｍｏｌのＣａｓ９及び１０８ｐｍｏｌのｓｇＲＮＡを含むＲＮＰ複合体を構築した。室温で３０分間インキュベートした後、この溶液を２つの希釈で細胞と混合し、各細胞株に対して２つの濃度のＲＮＰを送達した：１つは１５ｐｍｏｌ Ｃａｓ９＋４５ｐｍｏｌ ｓｇＲＮＡ（「高」）、もう１つは７．５ｐｍｏｌ Ｃａｓ９＋２２．５ｐｍｏｌ ｓｇＲＮＡ（「低」）。エレクトロポレーション後、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で７２時間培養し、ＤＮＡ抽出のために採取した。
サンガーシーケンシング及びＩＣＥ分析。各ガイドに関連する遺伝子座を、ＰＣＲによって増幅し、産物をサンガーシーケンシングのためにＧｅｎｅＷｉｚに送った。分析される遺伝子座の長さ及び複雑性のために、シーケンシングプライマーを、各ｓｇＲＮＡ用にカスタマイズした。適切な遺伝子座の増幅及び配列決定に使用されるプライマー配列は、追加の配列の表（配列番号３６～５４）に示されている。インデル値を、ＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論）分析アルゴリズム（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）を使用して推定した。ＩＣＥ分析は、サンガーシーケンシングデータを使用してインデルの同一性及び頻度を定量化する方法である（Ｈｓｉａｕ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２０１８） ｂｉｏＲｘｉｖ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／２５１０８２ｖ３）。
ｂ．フラタキシンｓｇＲＮＡのシングルカットスクリーニングの結果
ＦＸＮ遺伝子のＧＡＡリピートに隣接する９６個のｓｇＲＮＡを包含するセットが、編集有効性評価のために選択された。これらの中で、５６個のｓｇＲＮＡがＧＡＡリピートの上流に配置され、４０個のｓｇＲＮＡがＧＡＡリピートの下流に配置された。編集の有効性を評価するために、化学修飾ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質を含有するＲＮＰ複合体を、ヌクレオフェクションによって患者の細胞株に送達した。２つのＲＮＰ濃度を使用して、編集効率の包括的な概要を取得し、最高の切断効率を有する主要なｓｇＲＮＡを区別した。さらに、異なる細胞型／ドナー間のインデル効果の一貫性を、各ｓｇＲＮＡについて評価した。これらの細胞型は、長いリピート長の患者のリンパ芽球及び線維芽細胞で構成されていた。図４５ ８は、ＧＡＡリピート伸長の上流に位置する５６個のｓｇＲＮＡのインデル効果を示す。これらのうち、２９個のｓｇＲＮＡは、５０％を超えるインデル効果を示し、これは試験された条件間で一貫していた。図４６は、ＧＡＡリピートの下流に位置する４０個のｓｇＲＮＡのインデル効果を示しており、２１個のｓｇＲＮＡはすべての条件で５０％を超える効果を有している。これらの結果は、ゲノム位置及びＳＮＰ評価に加えて、リピート切除効率のｓｇＲＮＡ対組み合わせスクリーニングで評価するための４５個のｓｇＲＮＡのセット（ＧＡＡリピートの上流に２５個のｓｇＲＮＡ、ＧＡＡリピートの下流に２０のｓｇＲＮＡ）を選択する基準を提供した。評価される他の読み出しには、ＦＸＮ ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの救出が含まれる。ｓｇＲＮＡ対スクリーニングでは、選択された２５個の上流ｓｇＲＮＡと２０個の下流ｓｇＲＮＡのすべての可能な組み合わせを評価し、合計５００個の組み合わせが得られる。
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１１．ＤＮＡ－ＰＫ阻害を伴う心筋細胞のＦＸＮのフラタキシン遺伝子座でのＧＡＡリピート切除
ＦＡ有糸分裂後の心筋細胞を、実施例１に記載されているように、ｉＰＳＣの培養物から調製した。
細胞を、ｓｐＣａｓ９及びＧＡＡリピート（配列番号５２６６６及び２６５６２）に隣接するガイド対及び化合物６（３μＭ）で２４時間またはＤＭＳＯにより処理した。リピート切除の比率は、７日目及び１４日目にｄｄＰＣＲアッセイによって評価された（図４７Ａ）。１４日目のＦＸＮｍＲＮＡの相対レベルをｑＰＣＲで評価し（図４７Ｂ）、１４日目にウエスタンブロットでフラタキシンタンパク質のレベルを測定した（図４７Ｃ）。ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤による治療は、有糸分裂後の心筋細胞におけるＧＡＡリピート切除率を高め、ＦＸＮ ｍＲＮＡレベル及びフラタキシンタンパク質の増加をもたらした。
１２．ＦＡ ｉＰＳＣにおけるＦＸＮのフラタキシン遺伝子座でのＧＡＡリピート切除
ＧＡＡリピート切除を、ＲＮＰエレクトロポレーションを使用した野生型（ＷＴ）及びＦＡ ｉＰＳＣ（４６７０）において、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）及びＳｐＣａｓ９について評価した。ＤＮＡゲル電気泳動は、Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡ（ＧＤ１＆２）（配列番号４７０４７及び７４４７）及びＳｐＣａｓ９ガイドＲＮＡ（Ｃａｓ９ ＬＧ５＆１１）（配列番号５２６６６及び２６５６２）を使用して、Ｃｐｆ１（ボックス、図４８）によりＧＡＡリピートを切除した後の切除されたＤＮＡバンドを示した。
１３．Ｃｐｆ１を用いた皮質ニューロンのＦＸＮのフラタキシン遺伝子座でのＧＡＡリピート切除
以下の表１５に示すように、ｉＰＳＣ由来の皮質ニューロンにおけるＧＡＡリピート切除のために、追加のＣｐｆ１ガイド対を選択した。
Figure 2022545921000180
配列番号４７０４５、７４４５、７４６１、４６７６６、７６７８、及び４７０３０の１８量体スペーサー配列を含むｇＲＮＡを試験した。より具体的には、試験されたガイドは、表１５に示すように試験された２０量体ガイドであった。
ｇＲＮＡの対を、ｉＰＳＣ由来の皮質ニューロンでＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を使用して試験した。以下のガイド対を使用した：ガイド１＆２（配列番号４７０４７及び７４４７）。ガイド３＆４（配列番号７４６３及び４６９６７）；ガイド５＆６（配列番号４６７６８及び７６８０）；ガイド７＆２（配列番号４７０３２及び７４４７）。ＰＣＲ産物のＤＮＡゲル電気泳動は、ＧＡＡリピート切除後に切除されたＤＮＡバンドを示した（図４９）。
ＧＡＡリピート切除を、Ｃｐｆ１及びｇＲＮＡ（配列番号４７０４７及び７４４７）を使用して、野生型ｉＰＳＣ由来皮質ニューロンの単一細胞核でさらに確認した。細胞核を、Ｎｕｃｌｅｉ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ：Ｎｕｃｌｅｉ ＥＺ ｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、ＮＵＣ１０１）を製造元のプロトコルに従って使用して調製した。マウスの脳から核を分離するために、組織試料を、それぞれ乳棒Ａと乳棒Ｂ（Ｓｉｇｍａ）を用いて２ｍｌの溶解緩衝液に２×２５×でダウンスした。次に、溶解物を５分間、氷上の１ｍｌファルコンチューブに移した。溶解物を５００×ｇで５分間スピンダウンし、ペレットを１ｍｌの溶解緩衝液に再懸濁し、さらに３ｍｌの溶解緩衝液を加えて氷上で５分間保持した。溶解物を５００×ｇで５分間スピンダウンし、ペレットを１ｍｌの再懸濁緩衝液に再懸濁した。核の蛍光標識のために、Ｖｙｂｒａｎｔ ＤｙｅＣｙｃｌｅ Ｒｕｂｙ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｖ１０３０９、１：８００）またはＨｏｅｃｈｓｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｈ３５７０、１：１０，０００）を加えた。次に、単離された核を、ＢＤ ＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、ＱＥ９０５０）にソートした。シーケンシングの結果は、均一なＧＡＡリピート切除を伴う８／１０の核と、不均一なＧＡＡ切除を伴う２／１０の核を示した。
１４．成体マウスの脳におけるＦＸＮのフラタキシン遺伝子座でのインビボＧＡＡリピート切除
ＡＡＶベクターを、成体ＹＧ８＋／－マウスのニューロンを標的とするように設計した（図５０）。ＹＧ８＋／－マウスは、伸長ＧＡＡリピートを含むヒトフラタキシン導入遺伝子を有する。ｈＳｙｎａｐｓｉｎ １プロモーターは、ニューロンにおけるＡｓＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ、ベクター１）及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＫＡＳＨ（ベクター２）の発現を促進する。２つのＣｐｆ１ ｇＲＮＡ（配列番号４７０４７及び７４４７）は、ＧＡＡリピートを切除するために１つのＵ６プロモーターの制御下でタンデムでクローン化された。
成体ＹＧ８＋／－マウスの線条体（ｓｔｒａｔｕｍ）へのデュアルＡＡＶ送達（１：１比）を伴うフリードライヒ運動失調症のマウスモデルで、ＡｓＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を使用してデュアルガイド切除実験を実施した。
ヘテロ接合性の成体雄ＦＸＮｅｍ２．１ＬｕｔｚｙＴｇ（ＦＸＮ）ＹＧ８Ｐｏｏｋ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、０３０９３０）に麻酔をかけ、ＩＡＣＵＣ承認手順に従って開頭術を行った。１ｕｌの混合ＡＡＶ（１：１）を線条体（Ｂｒｅｇｍａ０．５ｍｍ、側部１．５ｍｍ、深さ２．５ｍｍ）に注射した。漏れを防ぐために、ピペットは引き込む前に３分間そのままにした。切開を縫合し、術後鎮痛薬を投与し、ＩＡＣＵＣ承認プロトコル及び動物の安楽死のためのＡＶＭＡガイドラインに従って、ＡＡＶ注射の２週間後にマウスを安楽死させた。脳試料を、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＫＡＳＨ標識化線条体ニューロンのビブラトームセクショニング及び蛍光イメージングのために、４％ＰＦＡで固定した。核の単離及びＦＡＣＳのために、線条体を解剖し、ショック凍結した。以下のＡＡＶ１ベクターが使用されている：ａ）ｈＳｙｎ－Ｃａｓ１２ａ及びｂ）Ｃａｓ１２ａ ｓｇＲＮＡ（ＳａｐＩ）＿ｈＳｙｎ＿ｍＣｈ－ＫＡＳＨ（ＳｉｇｎａＧｅｎ、約２．５×１０＾６Ｖｇ／ｍｌ）（以下の表１６及び配列番号５３４１１及び５３４１２をそれぞれ参照）。
すべてのＡＡＶコンストラクトを、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔによって合成した。Ｃａｓ１２ａ及びｇＲＮＡアレイ配列は他の場所で公開されている（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０１７）。ｇＲＮＡアレイＤＮＡオリゴは、一方向アニーリングを使用し、他の場所で説明されているように、粘着末端設計及びＣａｓ１２ａ ｓｇＲＮＡベクターのＳａｐＩ制限を使用してクローン化した（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０１７）。
デュアルＣａｓ１２ａ ｓｇＲＮＡアレイをクローニングするための以下のｆｗオリゴを使用した：
Figure 2022545921000181
結果は、デュアルＣａｓ１２ａ ｓｇＲＮＡを使用したインビボでのニューロンにおけるＧＡＡリピートの切除の成功を示した。定位注射の２週間後の脳の組織学は、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性線条体を示した（図５１Ａ）。標的化ニューロンの核は、ＦＡＣＳによってソートされた（図５１Ｂ）。ＤＮＡゲル電気泳動は、標的化ニューロン（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）対非標的化細胞（ｍＣｈｅｒｒｙ－）におけるＣｐｆ１によるＧＡＡリピート切除後の切除されたＤＮＡバンドを示した（図５１Ｃ）。切除されたＤＮＡバンドの単一クローンサンガーシーケンシング分析によって、インビボでのニューロンのＧＡＡリピート切除の成功が示された。
Figure 2022545921000182
Figure 2022545921000183
Figure 2022545921000184
Figure 2022545921000185
１５．ＤＭＰＫにおけるガイド対を用いたＣＴＧリピート切除
ａ．材料及び方法
ガイド及びプライマー配列。プライマー配列は、追加配列の表（配列番号５５～６２）に示されている。ＳｐＣａｓ９と共にｇＲＮＡに使用されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号９８）であった。ＳａＣａｓ９と共にｇＲＮＡに使用されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、ＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＵＣＵＡＣＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＵＧＣＣＧＵＧＵＵＵＡＵＣＵＣＧＵＣＡＡＣＵＵＧＵＵＧＧＣＧＡＧＡＵ（配列番号９７）であった。
ＳｐＣａｓ９を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の調製及びトランスフェクション。ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ヌクレアーゼを安定して発現する細胞株は、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａから購入した。Ｃａｓ９は、ヒトＡＡＶＳ１セーフハーバー遺伝子座（ＰＰＰ１Ｒ２Ｃとしても知られている）に組み込まれている。この細胞株は、ｃｏｐＧＦＰ及びピューロマイシン耐性遺伝子も発現している。別々にトランスフェクトまたは形質導入された単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と組み合わせて、この細胞株は標的化ゲノム部位で二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を維持する。Ｃａｓ９発現ＨＥＫ ２９３ Ｔ細胞に、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘリポフェクタミンベース送達を使用して個々のＩＶＴ ｇＲＮＡをトランスフェクトした。ゲノムＤＮＡを細胞から分離し、ＰＣＲで増幅させた。サンガーシーケンシング及びＴＩＤＥ分析を使用して、各ｓｇＲＮＡによって生成されたインデルの頻度を定量化した。
ＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株の調製及びエレクトロポレーション。ＳＢ１細胞株：成人女性ＤＭ１患者の末梢血単核細胞（Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｅ． Ｊｏｈｎｓｏｎ （Ｖｉｒｇｉｎｉａ Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）からの細胞源）から細胞を分離し、ＣｙｔｏＴｕｎｅ（登録商標）－ｉＰＳ Ｓｅｎｄａｉ再プログラミングキットで再プログラミングした。クローンＳＢ１を含む個々のｉＰＳＣクローンを単離した。ＳＢ１細胞株は、ナノストリングアッセイによるｉＰＳＣ細胞株と一致する多能性シグネチャーを有していた。高解像度のａＣＧＨ核型分析では、肉眼的ゲノム異常は見られなかった。サザン分析により、ＳＢ１細胞株に病原性ＣＴＧリピート伸長（約３００ ＣＴＧリピート）が含まれていることが確認された（図５２）。
４０３３－４細胞株：成人ＤＭ１男性（ＧＭ０４０３３、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に由来する親線維芽細胞株を、ＣｙｔｏＴｕｎｅ（登録商標）－ｉＰＳ Ｓｅｎｄａｉ再プログラミングキットを使用して再プログラミングした。クローン４０３３－４を含む個々のｉＰＳＣクローンを単離した。サザンブロット分析により、４０３３－４細胞株に病原性ＣＴＧリピート伸長（約３０００ ＣＴＧリピート）が含まれていることが確認された。
ＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞のエレクトロポレーション：ＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞（反応あたり２００，０００）を以下のように調製したＲＮＰと混合した。
概して、図５４～６０及び図６７～６８に対応する実験用のＲＮＰ複合体は、それぞれ１．５μｇの５’ガイド、３’ガイド、及び３μｇのＳｐＣａｓ９（図５４～６０）またはＳａＣａｓ９ヌクレアーゼ（図６７～６８）を合わせることによって調製した。ガイドＲＮＡを１．５μｇ／μｌに希釈し、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを３μｇ／μｌに希釈し、各成分の１μｌを合わせて、室温で最低１０分間複合体化した。
図５５～５６に対応する実験用のＲＮＰ複合体は、２μｇのガイド及び２μｇのＳａＣａｓ９ヌクレアーゼを合わせることによって調製した。個々の化学的に合成されたＲＮＡを２μｇ／μｌに希釈し、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを２μｇ／μｌに希釈し、各成分の１μｌを合わせて、室温で最低１０分間複合体化した。
Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＣＡ－１３７設定）で細胞をエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションの７２時間後に採取した。ゲノムＤＮＡを単離し、ＴＩＤＥ分析及びｄｄＰＣＲ欠失分析のための後続のＰＣＲのテンプレートとして使用した。
シーケンシング及びＴＩＤＥ分析。ＰＣＲは以下のようにゲノムＤＮＡに対して行った。
Figure 2022545921000186
ＰＣＲ産物を、ＡＭＰｕｒｅビーズベースのＰＣＲ精製（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してクリーンアップした。ＡＭＰｕｒｅビーズボトルをボルテックスし、ファルコンチューブに分注した。室温で３０分間インキュベートした後、８５μＬのビーズをＰＣＲ産物の各ウェルに加え、１０回ピペットで上下させ、１０分間インキュベートした。次に、ビーズ混合物を磁石上に５分間置いた。液体を吸引し、プレートを磁石上に置いたまま、ビーズを７０％ＥｔＯＨで２回洗浄した。次に、プレートを磁石から取り外し、２０μＬのｄＨ２Ｏをビーズに加え、ピペットで上下させて混合した。５～１０分間のインキュベーション後、プレートを磁石上に１分間置いた。ＤＮＡを含有するｄＨ２Ｏを除去し、ＰＣＲ濃度をｎａｎｏｄｒｏｐで分析した。
ＰＣＲ産物を、フォワードプライマー（配列番号５７）及びリバースプライマー（配列番号５８）を使用して配列決定するために送った。インデル値を、ＴＩＤＥ分析アルゴリズムを使用して推定した。ＴＩＤＥは、シーケンシング電気泳動図からのインデルのスペクトルの回復に基づいて、テンプレート媒介編集イベントの割合を定量化する方法である（Ｂｒｉｎｋｍａｎ， Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４２： ｅ１６８；ＰＭＩＤ： ２５３００４８４）。
２つのシグナル喪失（ＬＯＳ）ドロップレットデジタル（ｄｄＰＣＲ）アッセイ。シグナル喪失ｄｄＰＣＲアッセイは、ＣＴＧリピート領域の５’またはＣＴＧ領域の３’であるＤＭＰＫの３’ＵＴＲの領域を増幅し、ＣＴＧリピート領域の欠失が成功した結果として、増幅された領域を標的とするプローブのシグナル喪失を検出する。（アッセイの図５３の概略図を参照のこと）。「デュアル」または「２」ＬＯＳ ｄｄＰＣＲアッセイは、５’ＬＯＳ及び３’ＬＯＳアッセイの両方からの結果を指す。
５’ＬＯＳ ｄｄＰＣＲアッセイでは、フォワードプライマー（配列番号５９）、リバースプライマー（配列番号６０）、及びプローブ（配列番号６１）を使用した。
３’ＬＯＳ ｄｄＰＣＲアッセイでは、フォワードプライマー（配列番号６２）、リバースプライマー（配列番号６３）、及びプローブ（配列番号６４）を使用した。
ｄｄＰＣＲ試料を、室温でセットアップした。ＤＮＡ試料を、１０～２０ｎｇ／μＬの濃度に希釈した。希釈したＤＮＡ（４μＬ）を２１μＬのｄｄＰＣＲミックスに加えた。
Figure 2022545921000187
プレートをヒートシールで密封し、ボルテックスで混合した後、短時間遠心分離した。最終体積は２５μＬであった。
試料を、自動デジタル生成のために９６ウェルプレートに移した。液滴（４０μＬ）を生成し、プレートをＰＣＲ機械に移した。
３ステップサイクリングプロトコルを実行した。
Figure 2022545921000188
５’及び３’シグナル喪失（ＬＯＳ）ｄｄＰＣＲに使用された参照遺伝子は、ＲＰＰ３０であった。
ＤＭ１心筋細胞の分化プロトコル。ＤＭ１心筋細胞は、ＤＭ１ ｉＳＰＣ細胞株ＳＢ１から調製した。細胞をＷｎｔ（４μＭ ＣＨＩＲ）で２日間活性化し、続いてＷｎｔ（４μＭ ＷＮＴ－Ｃ５９）で２日間非活性化した。細胞をＣＤＭ３培地で６日間の回復期間休止させた。次に、細胞を、代謝選択のために１日間ＣＤＭ３グルコース非含有培地に移した。
ＤＭ１心筋細胞（反応あたり２５０，０００）を以下のように調製したＲＮＰと混合した。個々の化学的に合成されたガイドＲＮＡを１．５μｇ／μｌに希釈し、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを３μｇ／μｌに希釈し、各成分の１μｌを合わせて、室温で最低１０分間複合体化した。
図６１～６４に対応する実験用のＲＮＰ複合体は、それぞれ１．５μｇの５’ガイド、３’ガイド、及び３μｇのＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼを合わせることによって調製した。
細胞をＬｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＣＡ－１３７設定）でエレクトロポレーションし、ｉＣｅｌｌ維持培地でインキュベートした。エレクトロポレーションの７２時間後に細胞を採取した。ゲノムＤＮＡを単離し、ＴＩＤＥ分析及びｄｄＰＣＲ欠失分析のための後続のＰＣＲのテンプレートとして使用した。
オフターゲット分析及びハイブリッド捕捉アッセイ。相同性依存オフターゲット部位の指名。３つの予測アルゴリズム；ＣＣＴｏｐ、ＣＲＩＳＰＯＲ、ＣＯＳＭＩＤを使用して、ｈｇ３８ヒト参照ゲノムとの配列類似性及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の存在に基づいて、各ｓｇＲＮＡのオフターゲット部位を計算により予測した。ＣＣＴｏｐ及びＣＲＩＳＰＯＲを使用して、ｓｇＲＮＡ配列に対して最大３つのミスマッチを含む潜在的なオフターゲット部位を指定した。ＣＯＳＭＩＤアルゴリズムは、ギャップを含むオフターゲット部位を指定することができ、これをｓｇＲＮＡ配列に対して最大３つのミスマッチ（ギャップなし）または最大２つのミスマッチ（１つのギャップ）を含む潜在的なオフターゲット部位を指定するために使用した。３つのアルゴリズムはすべて、最適なＳｐＣａｓ９ ＮＧＧ ＰＡＭを使用して潜在的なオフターゲット部位を指定した。代替ＰＡＭも、ＣＯＳＭＩＤ（ＮＡＧ）及びＣＣＴｏｐ（ＮＡＧ、ＮＧＡ、ＮＡＡ、ＮＣＧ、ＮＧＣ、ＮＴＧ、及びＮＧＴ）を使用した検索に含まれていた。低複雑度領域は、無差別なプローブ濃縮及びシーケンシングエラーの影響を受け、誤ったリードマッピング及びインデルコールをもたらすため、予測されたオフターゲット部位を、これらの領域と重複する部位を除外するためにフィルタリングした。合計５７７個の潜在的なオフターゲット部位が１２個のｓｇＲＮＡ全体で指名された（配列番号：３７７８、４０２６、３７９４、４０１０、３９０６、３７４６、１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、１９１４、及び２２１０）。
ハイブリッド捕捉プローブライブラリの設計。オンターゲット部位及びオフターゲット部位での編集率を、ハイブリッド捕捉アッセイを使用して測定した。ハイブリッド捕捉プローブを生成して、オンターゲット部位及び予測されたオフターゲットを含有するゲノムの領域を濃縮した。各部位について、１００ｂｐの隣接領域を、部位の上流と下流の両方に付加し、次に１２０ｂｐのプローブを、両方の隣接領域を含む部位全体にタイリングした。予測されるすべてのオフターゲット部位及びオンターゲット部位について、部位ごとに複数のプローブを設計した。１２個すべてのｓｇＲＮＡからのハイブリッド捕捉プローブを一緒にプールし、１つのＡｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔプローブセットを順に並べた。ハイブリッド捕捉ライブラリの合計標的領域は１２４．８５キロベースであった。
編集済み試料及び対照試料の生成。ハイブリッド捕捉アッセイ試料を、２つのＷＴドナーｉＰＳＣ株（反応あたり１０００，０００細胞）に、１０μｇのｓｇＲＮＡと１０μｇのＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼを合わせて調製したＲＮＰをエレクトロポレーションすることによって生成した。Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＣＡ－１３７設定）を用いて細胞をエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションの７２時間後に採取した。試料を、１２個のｓｇＲＮＡ（配列番号３７７８、４０２６、３７９４、４０１０、３９０６、３７４６、１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、１９１４、及び２２１０）に対して生成した。わずか１０μｇのＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼでエレクトロポレーションされた対照試料も生成した。ハイブリッド捕捉及びそれに続くシーケンシングのために、ゲノムＤＮＡを単離した（ＱＩＡａｍｐ ＵＣＰ Ｍｉｃｒｏキット）。ｓｇＲＮＡ配列番号２２１０に利用できるドナーは１つだけであった。
ハイブリッド捕捉ライブラリの調製。ハイブリッド捕捉プローブを使用したオンターゲット及びオフターゲット領域のハイブリッド捕捉濃縮を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴ ＨＳ製造元プロトコル （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）において２００ｎｇの入力ゲノムＤＮＡ試料について説明されている試料調製に従って実行した。簡単に説明すると、ゲノムＤＮＡを、ＣｏｖａｒｉｓＬＥ２２０機器を使用した音響せん断によって断片化した。ＤＮＡフラグメントは末端が修復され、３’末端がアデニル化された。５’及び３’特異的アダプターをＤＮＡフラグメントにライゲーションし、アダプターライゲーションＤＮＡフラグメントを増幅し、インデックスプライマーを使用してインデックスを作成した。アダプターライゲーションＤＮＡフラグメントを、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎでＡｇｉｌｅｎｔ Ｄ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅアッセイを使用して検証し、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＢＲアッセイキットを備えたＱｕｂｉｔ３．０蛍光光度計を使用して定量化した。１０００ｎｇのアダプターライゲーションＤＮＡフラグメントを、製造推奨事項に従って１．５時間、事前プログラム化ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒを使用してビオチン化ＲＮＡベイトとハイブリダイズした。ハイブリダイズされたＤＮＡは、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＴ１）によって捕捉された。徹底的に洗浄した後、捕捉されたＤＮＡフラグメントを、制限サイクルＰＣＲにより濃縮した。捕捉後のＤＮＡライブラリを、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎでＡｇｉｌｅｎｔ Ｄ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅアッセイを使用して検証し、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキットを備えたＱｕｂｉｔ３．０蛍光光度計を使用して定量化した。ライブラリは５０ｎｇ／ライブラリの濃度でサブプールされ、サブプールあたり４～５個のライブラリが存在していた。サブプールを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０で１：１０に希釈し、ＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎキット－Ｕｎｉｖｅｒｓａｌを使用してｑＰＣＲにより定量した。サブプールを４ｎＭに正規化し、均等に合わせて最終シーケンシングプールを作成した。
ハイブリッド捕捉ライブラリのシーケンシング及び分析。最終シーケンシングプールは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑマシン （Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）に最終濃度１．８ｐＭでロードされ、５％ＰｈｉＸがスパイクされ、以下の構成のＩｌｌｕｍｉｎａ高出力ｖ２．５試薬キット：１５０×８×８×１５０で、３０００Ｘカバレッジを実現、を使用して配列決定された。
ＩｌｌｕｍｉｎａのベースコールをＦＡＳＴＱ形式に変換し、ｂｃｌ２ｆａｓｔｑ Ｃｏｎｖｅｒｓａｔｉｏｎソフトウェアを使用して試料固有のバーコードによって逆多重化した。ヒトゲノムビルドｈｇ３８に対するデフォルトパラメータを用いたＢＷＡ ＭＥＭアルゴリズムを用いて、シーケンシングデータをアラインメントさせた。アラインメントされたリードの重複排除は、ＳＡＭｔｏｏｌｓを使用して完了した。各オンターゲット部位及び予測されるオフターゲット部位について、部位及び両端に追加の２０塩基を包含するプライマリリードアラインメントが、インデルの定量化のために考慮された。潜在的なＳｐＣａｓ９切断部位から１０ｂｐ以内にインデルを含有するすべてのリードの合計を、フィルタリング基準に合格した切断部位にアラインされたリードの総数で割って、その候補切断部位でのインデル頻度を求めた。編集済み試料及び対照試料の少なくとも１つの対の間に少なくとも０．２％のインデル頻度の差がある部位を、有意なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集を示す可能性のある部位を同定するために統計的検定にかけた。このような部位について、片側の対応のあるスチューデントのｔ検定を実行して、対照と比較して編集済み試料における編集が有意に多いかどうかを試験した。試験結果がＰ＜０．０５で有意であった場合、この部位は確認されたオフターゲットと見なされた。１１個のｓｇＲＮＡについては２つのドナーしか利用できず、１２番目のｓｇＲＮＡ（配列番号２２１０）については１つのドナーしか利用できなかったため、統計的検定に失敗した部位を手動で検査し、必要に応じて「潜在的なオフターゲット部位」と注釈を付けた。より多くのドナー及びより高いシーケンシング深度でさらに調査することができる。
ハイブリッド捕捉アッセイ試料を、以下に示すように調製した。
Figure 2022545921000189
ｂ．ＳｐＣａｓ９を用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｇＲＮＡのスクリーニング
個々のｇＲＮＡの編集効率を評価するために、ＤＭＰＫ遺伝子のＣＴＧリピート領域に隣接する１６９個のｇＲＮＡを選択して、ＳｐＣａｓ９を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてスクリーニングした。リポフェクタミンベースの送達を使用して、細胞に個々のｇＲＮＡをトランスフェクトした。ゲノムＤＮＡを細胞から分離し、ＰＣＲで増幅させた。サンガーシーケンシング及びＴＩＤＥ分析を使用して、各ｓｇＲＮＡによって生成されたインデルの頻度を定量化した。結果は、ＴＩＤＥ分析による編集効率％として示されている（表１７）。
Figure 2022545921000190
Figure 2022545921000191
Figure 2022545921000192
Figure 2022545921000193
Figure 2022545921000194
ｃ．ＳｐＣａｓ９を用いたＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株におけるｇＲＮＡのスクリーニング
ガイドＲＮＡを、２つのＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株（ＳＢ１及び４０３３－４）においてスクリーニングするために選択した。両方の細胞株には、病原性ＣＴＧリピート領域が含まれている。
６つの上流ｇＲＮＡ（ＣＴＧリピート領域の５’側）（配列番号３７７８、４０２６、３７９４、４０１０、３９０６、及び３７４６）及び６つの下流ｇＲＮＡ（ＣＴＧリピート領域の３’側））（配列番号１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、１９１４、及び２２１０）（図５４の概略図を参照）を、ＳｐＣａｓ９と共にＲＮＰとして送達されるＳＢ１細胞における編集効率について試験した。結果を、編集効率パーセントとして示す（図５５）。
同じｇＲＮＡを、ＤＭＰＫ遺伝子のＣＴＧリピート領域を単独またはＳＢ１細胞の対で欠失させる能力についてさらに評価した。３６対の組み合わせを、ＣＴＧリピート領域の欠失について評価した。２つのシグナル喪失ｄｄＰＣＲアッセイを使用して、リピート欠失を検出した（図５３の概略図を参照）。ＣＴＧリピート領域の欠失のパーセンテージは、ＳＢ１細胞の３６対全体で２７％～６５％の範囲であった（表１８）。図５６に示されている欠失％は、個々のｇＲＮＡ及び対の両方のＬＯＳアッセイからの平均リピート欠失の組み合わせである。５’及び３’ＬＯＳアッセイのそれぞれから得られた欠失効率、及び両方のＬＯＳアッセイからの平均リピート欠失を、個々のｇＲＮＡ及び対について表１８に示す。ＳｐＣａｓ９対及び個々のｇＲＮＡにわたる５’及び３’のＬＯＳ ｄｄＰＣＲの結果の比較を、図５７に示す。ガイドＲＮＡ（Ｔ３４）は、個々のガイドとしてＣＴＧリピート領域の欠失活性を示し、単独でリピート欠失を引き起こすことができる（図５６、図５７）。
Figure 2022545921000195
Figure 2022545921000196
別のＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株（４０３３－４）においてＳｐＣａｓ９を用いてさらに試験するために、ガイドＲＮＡを選択した。５つの上流ｇＲＮＡ（配列番号３７７８、４０２６、３７９４、３９０６、及び３７４６）及び５つの下流ｇＲＮＡ（配列番号１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、及び２２１０）を選択した（図５８の概略図を参照）。２つのシグナル喪失ｄｄＰＣＲアッセイを使用して、リピート欠失を検出した（図５３の概略図を参照）。図５９は、４０３３－４細胞におけるＳｐＣａｓ９ ｇＲＮＡ対及び個々のｇＲＮＡにわたる５’及び３’ＬＯＳ ｄｄＰＣＲの結果の比較を示す。結果は欠失パーセントとして示される。
同様のＣＴＧリピート欠失が、ＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株ＳＢ１（図６０Ａ）とＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株４０３３－４（図６０Ｂ）の間で観察された。さらに、ＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株ＳＢ１は約１ｋｂのＣＴＧリピート対立遺伝子を有し、ＤＭ１ ｉＰＳＣ細胞株４０３３－４は約７．５ｋｂのＣＴＧリピート対立遺伝子を有すると判定された。
ｄ．ＳｐＣａｓ９を用いたＤＭ１心筋細胞におけるｇＲＮＡ対のスクリーニング
ＳｐＣａｓ９を用いたＤＭ１心筋細胞におけるさらなる試験のためにガイドＲＮＡを選択した。ＤＭＰＫの３’ＵＴＲにおけるＣＴＧリピートに対し５つの上流ｇＲＮＡ（配列番号３７７８、４０２６、３７９４、３９０６、及び３７４６）及び５つの下流ｇＲＮＡ（配列番号１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、及び２２１０）（図６１の概略図を参照）を、ＤＭ１心筋細胞におけるＳｐＣａｓ９を用いた個々の編集効率について最初に評価した（図６２）。編集結果は、ＤＭ１心筋細胞でも、ＤＭ１ ｉＰＳＣ ＳＢ１細胞について得られたのと同様であった（図６２）。
３対のｇＲＮＡ（配列番号３７４６及び２２１０；４０２６及び１５８６；３７７８及び１７７８）を、ＤＭ１心筋細胞におけるＣＴＧリピート欠失について試験して、５’ＬＯＳ ｄｄＰＣＲ及び３’ＬＯＳ ｄｄＰＣＲによってＤＭ１ ｉＰＳＣ ＳＢ１細胞について得られたのと同様の欠失％を示した（図６３）
ｅ．オフターゲット分析
ハイブリッド捕捉アッセイ（配列番号３７７８、４０２６、３７９４、４０１０、３９０６、３７４６、１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、１９１４、及び２２１０）を使用して、１２個のガイドＲＮＡをＳｐＣａｓ９と共にオフターゲット活性について試験した。表１９に、オンターゲット部位での編集結果と、部位及び２つのドナーにわたる最大オフターゲット編集の結果を示す。
Figure 2022545921000197
オフターゲットデータに基づいて、ｇＲＮＡの対を、「クリーン」、「オフターゲット＜１％」、または「オフターゲット＞１％」として同定した。ＳｐＣａｓ９との複数の「クリーンな」ｇＲＮＡ対が同定され、ＳＢ１細胞でも２５％を超えるＣＴＧリピート欠失が見られた（図６４）。
ｆ．ＳａＣａｓ９を用いたｇＲＮＡのスクリーニング
ＤＭＰＫの３’ＵＴＲにおけるＣＴＧリピートの３０個の上流ｇＲＮＡと３０個の下流ｇＲＮＡを選択し（図６５の概略図を参照）、野生型ｉＰＳＣ株（図６６、表２０）において、ＳａＣａｓ９を用いて個々の編集効率をＴＩＤＥ分析により試験した。使用されている野生型ｉＰＳＣ細胞、細胞株番号００５２は、Ｒｕｔｇｅｒｓ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＣｅｌｌ ａｎｄ ＤＮＡ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから入手できるＧＭＰグレードのｉＰＳＣ株である。
Figure 2022545921000198
Figure 2022545921000199
４つの上流ｇＲＮＡ（配列番号３２５６、２８９６、３１３６、及び３２２４）及び６つの下流ｇＲＮＡ（配列番号４９８９、５６０、６７２、９７６、７６０、９８４、及び６１６）を、ＳＡＣａｓ９を用いたＤＭ１ ｉＰＳＣ ＳＢ１細胞におけるＣＴＧリピート領域の欠失の評価のために選択した。（図６７の概略図を参照）。３’ＬＯＳ ｄｄＰＣＲアッセイの結果に基づいて、ｓａＣａｓ９ ｇＲＮＡ対及び個々のｓａＣａｓ９ｇＲＮＡに対するＣＴＧリピート領域の欠失のパーセンテージを図６８Ａに示す。５’ＬＯＳアッセイは、単一ｇＲＮＡがｄｄＰＣＲプライマー部位をノックアウトしたために、欠失を正確に示さなかった（ｎ＝１）。５’及び３’ＬＯＳ ｄｄＰＣＲのデータを表２１に示す。ｓｐＣａｓ９ ｇＲＮＡ対（配列番号３７４６／２２１０）を対照として使用した。図６８Ｂには、個々のｓａＣａｓ９ｇＲＮＡの編集効率パーセントが示されている。
Figure 2022545921000200
この説明及び例示的な実施形態は、限定として解釈されるべきではない。本明細書及び添付の特許請求の範囲の目的のために、特に明記しない限り、数量、パーセンテージ、または割合を表すすべての数値、ならびに明細書及び特許請求の範囲で使用される他の数値は、すべての場合において、「約」という用語によって、それらがまだそのように修飾されていない範囲で、修飾されているものとして、理解されるべきである。したがって、特に異議を唱えない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。最低限において、また特許請求の範囲と同等である原理の適用を限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは少なくとも、通常の丸め技術を適用することによって、報告される有効桁数を考慮して解釈されるべきである。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」、ならびに任意の単語の単数形の使用は、明示的かつ明確に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語及びその文法上の変形は、リスト内の項目の列挙が、列挙された項目に置換または追加することができる他の同様の項目を除外しないように、非限定的であることを意図している。
Figure 2022545921000201
Figure 2022545921000202
Figure 2022545921000203
Figure 2022545921000204
Figure 2022545921000205
プライマーは、それぞれＦとＲを使用したフォワードまたはリバースプライマーとして示されている。所定の形態のｍＲＮＡに特異的な産物を増幅するためのｑＰＣＲプライマーには、例えば「Ｅｘ５ｉｎ」、これは、プライマーが示されたｍＲＮＡのエクソン５の存在下で産物を与えることを示している、などのテキストを含む説明がある。予想されるすべての形態のｍＲＮＡからの産物を増幅するためのｑＰＣＲプライマーには、「トータル」を含む記述がある。

Claims (95)

  1. 組成物であって、
    ｉ）スペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸であって、
    ａ．配列番号４０１８、４０１０、４００２、４０４２、４０３４、４０２６、３９５４、３９４６、３９９４、３９１４、３９７８、３９０６、３８９８、３９３８、３９２２、３８５８、３８５０、３８８２、３８２６、３８１８、３８４２、３７９４、３７８６、３７６２、３８１０、３７４６、３７７８、３７３８、３７７０、３７２２、３７５４、３６９０、３６６６、３６５８、３６３４、３５８６、３５４６、３５３０、３６４２、３５１４、３５０６、３４９０、３６１８、３６１０、３６０２、３５７８、３４４２、３５２２、３４１０、３３７８、３４３４、３３７０、３４２６、３４１８、３３９４、３３８６、３３３０、３３５４、３３４６、３３１４、３９３０、３８９０、３８３４、３８０２、３７０６、３６９８、３６８２、３６７４、３５７０、３５５４、３５３８、３４９８、３４８２、３４５８、３４７４、３４５０、２６６７、２６６６、２６５０、２６４２、２６２６、２６１８、２７０６、２６９０、２６８２、２６１０、２６７４、２６５８、２６０２、２５９４、２６３４、２５５４、２５４６、２５８６、２５３８、２５７８、２５７０、２５２２、２４９８、２４９０、２４６６、２４５８、２４５０、２５１４、２５０６、２４１８、２４８２、２４７４、２３９４、２４４２、２４３４、２３７０、２３７８、２３５４、２３４６、２３３８、２３１４、２２９８、２２８２、２２７４、２２６６、２３３０、２２５８、２３２２、２２４２、２２３４、２２９０、２２５０、２２１８、２２２６、２２１０、２１９４、２１４６、２１３８、２１２２、２１０６、２０９８、２０９０、２１３０、２１１４、２０３４、２０２６、２０５８、２０５０、２０４２、１９１４、１７８６、１７７８、１７７０、１８４２、１７３８、１７０６、１６９０、１７４６、１７１４、１６５０、１６４２、１６１０、１５８６、１５６２、１５４６、１５７８、１５３８、１３７８、１３７０、１９２２、１８９８、１９０６、１７９４、１７６２、１６９８、１６７４、１７２２、１３６２、１４５０、２２０２、２１７８、２１７０、２１６２、２０１８、２０１０、１８９０、１９６２、１９４６、１８５０、１８１８、１６５８、１６３４、１６０２、１５５４、１４３４、１４２６、１３３８、１３４６、１９７８、１９９４、１９８６、１９７０、１９３８、１９３０、１８１０、１８３４、１８２６、１８０２、１６２６、１５９４、１５１４、１４９８、１４９０、１４８２、１４７４、１４５８、１４４２、１４１８、１４１０、１４０２、１３９４、及び１３８６から選択されるスペーサー配列；または
    ｂ．配列番号３３３０、３９１４、３４１８、３７４６、３７７８、３３９４、４０２６、３６９０、３７９４、３３８６、３９３８、３６８２、３８１８、３６５８、３７２２、３８０２、３８５８、３５１４、３７７０、３３７０、３３５４、４０１０、２２０２、１７０６、２２１０、２１７０、１７７８、２２５８、２１１４、２１７８、１６４２、１７３８、１７４６、２３２２、１７７０、１５３８、２５１４、２４５８、２１９４、２５９４、２１６２、及び２６１８から選択されるスペーサー配列；または
    ｃ．配列番号３７４６、３７７８、３３９４、３３８６、３９３８、３８１８、３７２２、３８５８、３３７０、１７０６、２２１０、２１１４、１５３８、及び２５９４から選択されるスペーサー配列；または
    ｄ．配列番号３３３０、３７４６、３７７８、３３９４、４０２６、３３８６、３９３８、３８１８、３７２２、３８０２、３８５８、３５１４、３７７０、３３７０、２２０２、１７０６、２２１０、１７７８、２１１４、１７３８、１７４６、２３２２、１５３８、２５１４、２４５８、２１９４、及び２５９４から選択されるスペーサー配列；または
    ｅ．配列番号３３３０、３９１４、３４１８、３７４６、３７７８、３３９４、４０２６、３６９０、３７９４、３３８６、３９３８、３６８２、３８１８、３６５８、及び３７２２から選択されるスペーサー配列；または
    ｆ．配列番号２２０２、１７０６、２２１０、２１７０、１７７８、２２５８、２１１４、２１７８、１６４２、１７３８、１７４６、及び２３２２から選択されるスペーサー配列；または
    ｇ．配列番号３７７８、４０２６、３７９４、４０１０、３９０６、３７４６、１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、１９１４、及び２２１０から選択されるスペーサー配列；または
    ｈ．配列番号３３７８、３３５４、３３４６、３３３０、３３１４、２６５８、２６９０、２５４６、２５５４、２４９８、及び２５０６から選択されるスペーサー配列；または；
    ｉ．配列番号３３３０、３３１４、２６５８、２６９０、２５５４、及び２４９８から選択されるスペーサー配列；または
    ｊ．配列番号３３１４、２６９０、２５５４、及び２４９８から選択されるスペーサー配列；または
    ｋ．配列番号３９１４、３５１４、１７７８、２４５８、３８５８、３４１８、１７０６、及び２２５８から選択されるスペーサー配列；または
    ｌ．配列番号３９１４；または
    ｍ．配列番号３４１８；または
    ｎ．配列番号３９３８；または
    ｏ．配列番号３９１６、３４２０、及び３９４０から選択されるスペーサー配列；または
    ｐ．ａ）からｏ）までの前記スペーサー配列のいずれか１つの少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続したヌクレオチドを含むスペーサー配列；または
    ｑ．ａ）からｐ）までの前記スペーサー配列のいずれか１つと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるスペーサー配列を含む、前記スペーサー配列を含む前記ガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする前記核酸；あるいは
    ｉｉ）第１及び第２のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸であって、
    ａ．配列番号２２０２及び３４１８；２２０２及び３３７０；２２０２及び３５１４；２２０２及び３６５８；２１７８及び３４１８；２１７８及び３３７０；２１７８及び３５１４；２１７８及び３６５８；２１７０及び３４１８；２１７０及び３３７０；２１７０及び３５１４；２１７０及び３６５８；２１６２及び３４１８；２１６２及び３３７０；２１６２及び３５１４；２１６２及び３６５８；２２０２及び４０１０；２２０２及び４０２６；２２０２及び３９１４；２２０２及び３９３８；２２０２及び３８５８；２２０２及び３８１８；２２０２及び３７９４；２２０２及び３８０２；２２０２及び３７４６；２２０２及び３７７８；２２０２及び３７７０；２２０２及び３７２２；２２０２及び３６９０；２２０２及び３６８２；２２０２及び３３３０；２２０２及び３３５４；２２０２及び３３９４；２２０２及び３３８６；２１７８及び４０１０；２１７８及び４０２６；２１７８及び３９１４；２１７８及び３９３８；２１７８及び３８５８；２１７８及び３８１８；２１７８及び３７９４；２１７８及び３８０２；２１７８及び３７４６；２１７８及び３７７８；２１７８及び３７７０；２１７８及び３７２２；２１７８及び３６９０；２１７８及び３６８２；２１７８及び３３３０；２１７８及び３３５４；２１７８及び３３９４；２１７８及び３３８６；２１７０及び４０１０；２１７０及び４０２６；２１７０及び３９１４；２１７０及び３９３８；２１７０及び３８５８；２１７０及び３８１８；２１７０及び３７９４；２１７０及び３８０２；２１７０及び３７４６；２１７０及び３７７８；２１７０及び３７７０；２１７０及び３７２２；２１７０及び３６９０；２１７０及び３６８２；２１７０及び３３３０；２１７０及び３３５４；２１７０及び３３９４；２１７０及び３３８６；２１６２及び４０１０；２１６２及び４０２６；２１６２及び３９１４；２１６２及び３９３８；２１６２及び３８５８；２１６２及び３８１８；２１６２及び３７９４；２１６２及び３８０２；２１６２及び３７４６；２１６２及び３７７８；２１６２及び３７７０；２１６２及び３７２２；２１６２及び３６９０；２１６２及び３６８２；２１６２及び３３３０；２１６２及び３３５４；２１６２及び３３９４；２１６２及び３３８６；１７０６及び３４１８；１７０６及び３３７０；１７０６及び３５１４；１７０６及び３６５８；１７０６及び４０１０；１７０６及び４０２６；１７０６及び３９１４；１７０６及び３９３８；１７０６及び３８５８；１７０６及び３８１８；１７０６及び３７９４；１７０６及び３８０２；１７０６及び３７４６；１７０６及び３７７８；１７０６及び３７７０；１７０６及び３７２２；１７０６及び３６９０；１７０６及び３６８２；１７０６及び３３３０；１７０６及び３３５４；１７０６及び３３９４；１７０６及び３３８６；２２１０及び３４１８；２２１０及び３３７０；２２１０及び３５１４；２２１０及び３６５８；２２１０及び４０１０；２２１０及び４０２６；２２１０及び３９１４；２２１０及び３９３８；２２１０及び３８５８；２２１０及び３８１８；２２１０及び３７９４；２２１０及び３８０２；２２１０及び３７４６；２２１０及び３７７８；２２１０及び３７７０；２２１０及び３７２２；２２１０及び３６９０；２２１０及び３６８２；２２１０及び３３３０；２２１０及び３３５４；２２１０及び３３９４；２２１０及び３３８６；１７７８及び３４１８；１７７８及び３３７０；１７７８及び３５１４；１７７８及び３６５８；１７７８及び４０１０；１７７８及び４０２６；１７７８及び３９１４；１７７８及び３９３８；１７７８及び３８５８；１７７８及び３８１８；１７７８及び３７９４；１７７８及び３８０２；１７７８及び３７４６；１７７８及び３７７８；１７７８及び３７７０；１７７８及び３７２２；１７７８及び３６９０；１７７８及び３６８２；１７７８及び３３３０；１７７８及び３３５４；１７７８及び３３９４；１７７８及び３３８６；２２５８及び３４１８；２２５８及び３３７０；２２５８及び３５１４；２２５８及び３６５８；２２５８及び４０１０；２２５８及び４０２６；２２５８及び３９１４；２２５８及び３９３８；２２５８及び３８５８；２２５８及び３８１８；２２５８及び３７９４；２２５８及び３８０２；２２５８及び３７４６；２２５８及び３７７８；２２５８及び３７７０；２２５８及び３７２２；２２５８及び３６９０；２２５８及び３６８２；２２５８及び３３３０；２２５８及び３３５４；２２５８及び３３９４；２２５８及び３３８６；２１１４及び３４１８；２１１４及び３３７０；２１１４及び３５１４；２１１４及び３６５８；２１１４及び４０１０；２１１４及び４０２６；２１１４及び３９１４；２１１４及び３９３８；２１１４及び３８５８；２１１４及び３８１８；２１１４及び３７９４；２１１４及び３８０２；２１１４及び３７４６；２１１４及び３７７８；２１１４及び３７７０；２１１４及び３７２２；２１１４及び３６９０；２１１４及び３６８２；２１１４及び３３３０；２１１４及び３３５４；２１１４及び３３９４；２１１４及び３３８６；１６４２及び３４１８；１６４２及び３３７０；１６４２及び３５１４；１６４２及び３６５８；１６４２及び４０１０；１６４２及び４０２６；１６４２及び３９１４；１６４２及び３９３８；１６４２及び３８５８；１６４２及び３８１８；１６４２及び３７９４；１６４２及び３８０２；１６４２及び３７４６；１６４２及び３７７８；１６４２及び３７７０；１６４２及び３７２２；１６４２及び３６９０；１６４２及び３６８２；１６４２及び３３３０；１６４２及び３３５４；１６４２及び３３９４；１６４２及び３３８６；１７３８及び３４１８；１７３８及び３３７０；１７３８及び３５１４；１７３８及び３６５８；１７３８及び４０１０；１７３８及び４０２６；１７３８及び３９１４；１７３８及び３９３８；１７３８及び３８５８；１７３８及び３８１８；１７３８及び３７９４；１７３８及び３８０２；１７３８及び３７４６；１７３８及び３７７８；１７３８及び３７７０；１７３８及び３７２２；１７３８及び３６９０；１７３８及び３６８２；１７３８及び３３３０；１７３８及び３３５４；１７３８及び３３９４；１７３８及び３３８６；２２５８及び３４１８；２２５８及び３３７０；２２５８及び３５１４；２２５８及び３６５８；２２５８及び４０１０；２２５８及び４０２６；２２５８及び３９１４；２２５８及び３９３８；２２５８及び３８５８；２２５８及び３８１８；２２５８及び３７９４；２２５８及び３８０２；２２５８及び３７４６；２２５８及び３７７８；２２５８及び３７７０；２２５８及び３７２２；２２５８及び３６９０；２２５８及び３６８２；２２５８及び３３３０；２２５８及び３３５４；２２５８及び３３９４；２２５８及び３３８６；２１１４及び３４１８；２１１４及び３３７０；２１１４及び３５１４；２１１４及び３６５８；２１１４及び４０１０；２１１４及び４０２６；２１１４及び３９１４；２１１４及び３９３８；２１１４及び３８５８；２１１４及び３８１８；２１１４及び３７９４；２１１４及び３８０２；２１１４及び３７４６；２１１４及び３７７８；２１１４及び３７７０；２１１４及び３７２２；２１１４及び３６９０；２１１４及び３６８２；２１１４及び３３３０；２１１４及び３３５４；２１１４及び３３９４；１７０６及び３３８６；１６４２及び３４１８；１６４２及び３３７０；１６４２及び３５１４；１６４２及び３６５８；１６４２及び４０１０；１６４２及び４０２６；１６４２及び３９１４；１６４２及び３９３８；１６４２及び３８５８；１６４２及び３８１８；１６４２及び３７９４；１６４２及び３８０２；１６４２及び３７４６；１６４２及び３７７８；１６４２及び３７７０；１６４２及び３７２２；１６４２及び３６９０；１６４２及び３６８２；１６４２及び３３３０；１６４２及び３３５４；１６４２及び３３９４；１６４２及び３３８６；１７３８及び３４１８；１７３８及び３３７０；１７３８及び３５１４；１７３８及び３６５８；１７３８及び４０１０；１７３８及び４０２６；１７３８及び３９１４；１７３８及び３９３８；１７３８及び３８５８；１７３８及び３８１８；１７３８及び３７９４；１７３８及び３８０２；１７３８及び３７４６；１７３８及び３７７８；１７３８及び３７７０；１７３８及び３７２２；１７３８及び３６９０；１７３８及び３６８２；１７３８及び３３３０；１７３８及び３３５４；１７３８及び３３９４；１７３８及び３３８６；１７４６及び３４１８；１７４６及び３３７０；１７４６及び３５１４；１７４６及び３６５８；１７４６及び４０１０；１７４６及び４０２６；１７４６及び３９１４；１７４６及び３９３８；１７４６及び３８５８；１７４６及び３８１８；１７４６及び３７９４；１７４６及び３８０２；１７４６及び３７４６；１７４６及び３７７８；１７４６及び３７７０；１７４６及び３７２２；１７４６及び３６９０；１７４６及び３６８２；１７４６及び３３３０；１７４６及び３３５４；１７４６及び３３９４；１７４６及び３３８６；２３２２及び３４１８；２３２２及び３３７０；２３２２及び３５１４；２３２２及び３６５８；２３２２及び４０１０；２３２２及び４０２６；２３２２及び３９１４；２３２２及び３９３８；２３２２及び３８５８；２３２２及び３８１８；２３２２及び３７９４；２３２２及び３８０２；２３２２及び３７４６；２３２２及び３７７８；２３２２及び３７７０；２３２２及び３７２２；２３２２及び３６９０；２３２２及び３６８２；２３２２及び３３３０；２３２２及び３３５４；２３２２及び３３９４；２３２２及び３３８６；１７７０及び３４１８；１７７０及び３３７０；１７７０及び３５１４；１７７０及び３６５８；１７７０及び４０１０；１７７０及び４０２６；１７７０及び３９１４；１７７０及び３９３８；１７７０及び３８５８；１７７０及び３８１８；１７７０及び３７９４；１７７０及び３８０２；１７７０及び３７４６；１７７０及び３７７８；１７７０及び３７７０；１７７０及び３７２２；１７７０及び３６９０；１７７０及び３６８２；１７７０及び３３３０；１７７０及び３３５４；１７７０及び３３９４；１７７０及び３３８６；１５３８及び３４１８；１５３８及び３３７０；１５３８及び３５１４；１５３８及び３６５８；１５３８及び４０１０；１５３８及び４０２６；１５３８及び３９１４；１５３８及び３９３８；１５３８及び３８５８；１５３８及び３８１８；１５３８及び３７９４；１５３８及び３８０２；１５３８及び３７４６；１５３８及び３７７８；１５３８及び３７７０；１５３８及び３７２２；１５３８及び３６９０；１５３８及び３６８２；１５３８及び３３３０；１５３８及び３３５４；１５３８及び３３９４；１５３８及び３３８６；２５１４及び３４１８；２５１４及び３３７０；２５１４及び３５１４；２５１４及び３６５８；２５１４及び４０１０；２５１４及び４０２６；２５１４及び３９１４；２５１４及び３９３８；２５１４及び３８５８；２５１４及び３８１８；２５１４及び３７９４；２５１４及び３８０２；２５１４及び３７４６；２５１４及び３７７８；２５１４及び３７７０；２５１４及び３７２２；２５１４及び３６９０；２５１４及び３６８２；２５１４及び３３３０；２５１４及び３３５４；２５１４及び３３９４；２５１４及び３３８６；２４５８及び３４１８；２４５８及び３３７０；２４５８及び３５１４；２４５８及び３６５８；２４５８及び４０１０；２４５８及び４０２６；２４５８及び３９１４；２４５８及び３９３８；２４５８及び３８５８；２４５８及び３８１８；２４５８及び３７９４；２４５８及び３８０２；２４５８及び３７４６；２４５８及び３７７８；２４５８及び３７７０；２４５８及び３７２２；２４５８及び３６９０；２４５８及び３６８２；２４５８及び３３３０；２４５８及び３３５４；２４５８及び３３９４；２４５８及び３３８６；２１９４及び３４１８；２１９４及び３３７０；２１９４及び３５１４；


    ２１９４及び３６５８；２１９４及び４０１０；２１９４及び４０２６；２１９４及び３９１４；２１９４及び３９３８；２１９４及び３８５８；２１９４及び３８１８；２１９４及び３７９４；２１９４及び３８０２；２１９４及び３７４６；２１９４及び３７７８；２１９４及び３７７０；２１９４及び３７２２；２１９４及び３６９０；２１９４及び３６８２；２１９４及び３３３０；２１９４及び３３５４；２１９４及び３３９４；２１９４及び３３８６；２５９４及び３４１８；２５９４及び３３７０；２５９４及び３５１４；２５９４及び３６５８；２５９４及び４０１０；２５９４及び４０２６；２５９４及び３９１４；２５９４及び３９３８；２５９４及び３８５８；２５９４及び３８１８；２５９４及び３７９４；２５９４及び３８０２；２５９４及び３７４６；２５９４及び３７７８；２５９４及び３７７０；２５９４及び３７２２；２５９４及び３６９０；２５９４及び３６８２；２５９４及び３３３０；２５９４及び３３５４；２５９４及び３３９４；２５９４及び３３８６；２６１８及び３４１８；２６１８及び３３７０；２６１８及び３５１４；２６１８及び３６５８；２６１８及び４０１０；２６１８及び４０２６；２６１８及び３９１４；２６１８及び３９３８；２６１８及び３８５８；２６１８及び３８１８；２６１８及び３７９４；２６１８及び３８０２；２６１８及び３７４６；２６１８及び３７７８；２６１８及び３７７０；２６１８及び３７２２；２６１８及び３６９０；２６１８及び３６８２；２６１８及び３３３０；２６１８及び３３５４；２６１８及び３３９４；ならびに２６１８及び３３８６から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
    ｂ．配列番号２２０２及び３４１８；２２０２及び３３７０；２２０２及び３５１４；２２０２及び３６５８；２１７８及び３４１８；２１７８及び３３７０；２１７８及び３５１４；２１７８及び３６５８；２１７０及び３４１８；２１７０及び３３７０；２１７０及び３５１４；２１７０及び３６５８；２１６２及び３４１８；２１６２及び３３７０；２１６２及び３５１４；２１６２及び３６５８；２２０２及び４０１０；２２０２及び４０２６；２２０２及び３９１４；２２０２及び３９３８；２２０２及び３８５８；２２０２及び３８１８；２２０２及び３７９４；２２０２及び３８０２；２２０２及び３７４６；２２０２及び３７７８；２２０２及び３７７０；２２０２及び３７２２；２２０２及び３６９０；２２０２及び３６８２；２２０２及び３３３０；２２０２及び３３５４；２２０２及び３３９４；２２０２及び３３８６；２１７８及び４０１０；２１７８及び４０２６；２１７８及び３９１４；２１７８及び３９３８；２１７８及び３８５８；２１７８及び３８１８；２１７８及び３７９４；２１７８及び３８０２；２１７８及び３７４６；２１７８及び３７７８；２１７８及び３７７０；２１７８及び３７２２；２１７８及び３６９０；２１７８及び３６８２；２１７８及び３３３０；２１７８及び３３５４；２１７８及び３３９４；２１７８及び３３８６；２１７０及び４０１０；２１７０及び４０２６；２１７０及び３９１４；２１７０及び３９３８；２１７０及び３８５８；２１７０及び３８１８；２１７０及び３７９４；２１７０及び３８０２；２１７０及び３７４６；２１７０及び３７７８；２１７０及び３７７０；２１７０及び３７２２；２１７０及び３６９０；２１７０及び３６８２；２１７０及び３３３０；２１７０及び３３５４；２１７０及び３３９４；２１７０及び３３８６；２１６２及び４０１０；２１６２及び４０２６；２１６２及び３９１４；２１６２及び３９３８；２１６２及び３８５８；２１６２及び３８１８；２１６２及び３７９４；２１６２及び３８０２；２１６２及び３７４６；２１６２及び３７７８；２１６２及び３７７０；２１６２及び３７２２；２１６２及び３６９０；２１６２及び３６８２；２１６２及び３３３０；２１６２及び３３５４；２１６２及び３３９４；及び２１６２；ならびに３３８６から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
    ｃ．配列番号２２０２及び３４１８；２２０２及び３３７０；２２０２及び３５１４；２２０２及び３６５８；２１７８及び３４１８；２１７８及び３３７０；２１７８及び３５１４；２１７８及び３６５８；２１７０及び３４１８；２１７０及び３３７０；２１７０及び３５１４；２１７０及び３６５８；２１６２及び３４１８；２１６２及び３３７０；２１６２及び３５１４；ならびに２１６２及び３６５８から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
    ｄ．配列番号３７７８及び２５１４；３７７８及び２２５８；３７７８及び２２１０；３３８６及び２５１４；３３８６及び２２５８；３３８６及び２２１０；３３５４及び２５１４；３３５４及び２２５８；ならびに３３５４及び２２１０から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
    ｅ．配列番号３７７８及び２２５８；３７７８及び２２１０；３３８６及び２２５８；３３８６及び２２１０；ならびに３３５４及び２５１４から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
    ｆ．配列番号３３４６及び２５５４；３３４６及び２４９８；３３３０及び２５５４；３３３０及び２４９８；３３３０及び２５０６；ならびに３３３０及び２５４６から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
    ｇ．配列番号１１５３及び１１２９；または
    ｈ．配列番号３３４６及び２５５４；３３４６及び２４９８；３３３０及び２５５４；３３３０及び２４９８；３３５４及び２５４６；３３５４及び２５０６；３３７８及び２５４６；ならびに３３７８及び２５０６から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
    ｉ．配列番号３３４６及び２５５４；３３４６及び２４９８；３３３０及び２５５４；ならびに３３３０及び２４９８から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
    ｊ．ａ）からｉ）までの前記第１及び第２のスペーサー配列のいずれかの少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続したヌクレオチドを含む第１及び第２のスペーサー配列；または
    ｋ．ａ）からｊ）までの前記第１及び第２のスペーサー配列のいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である第１及び第２のスペーサー配列、を含む、前記第１及び第２のスペーサー配列を含む前記１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする前記１つ以上の核酸、を含む、前記組成物。
  2. 組成物であって、
    １対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸を含み、前記１対のスペーサー配列が、
    ａ．配列番号２８５６、２８６４、２８８０、２８９６、２９０４、２９１２、２９３６、２９４４、２９６０、２９９２、３０１６、３０２４、３０６４、３０９６、３１１２、３１２８、３１３６、３１４４、３１６０、３１６８、３１９２、３２００、３２０８、３２１６、３２２４、３２３２、３２４０、３２４８、３２５６、３２６４、３３１４、３３３０、３３４６、３３５４、３３７０、３３７８、３３８６、３３９４、３４１０、３４１８、３４２６、３４３４、３４４２、３４５０、３４５８、３４７４、３４８２、３４９０、３４９８、３５０６、３５１４、３５２２、３５３０、３５３８、３５４６、３５５４、３５７０、３５７８、３５８６、３６０２、３６１０、３６１８、３６３４、３６４２、３６５８、３６７４、３６８２、３６９０、３６９８、３７０６、３７２２、３７４６、３７６２、３７７０、３７７８、３７９４、３８０２、３８１８、３８２６、３８３４、３８５０、３８５８、３８９０、３８９８、３９０６、３９１４、３９２２、３９３０、３９３８、３９４６、３９９４、４０１０、４０１８、４０２６、４０３４、４０４２、４２０８、及び４５０６から選択される第１のスペーサー配列、ならびに配列番号５６０、５８４、６０８、６１６、６５６、６７２、６８８、６９６、７１２、７４４、７５２、７６０、８４０、８６４、９６０、９７６、９８４、１００８、１０５６、１１２８、１１３６、１１５２、１２２４、１２４０、１２７２、１３３８、１３４６、１３７０、１３７８、１３８６、１３９４、１４０２、１４１０、１４１８、１４２６、１４３４、１４４２、１４５８、１４７４、１４８２、１４９０、１４９８、１５１４、１５３８、１５４６、１５５４、１５６２、１５７８、１５８６、１５９４、１６０２、１６１０、１６２６、１６３４、１６４２、１６５０、１６５８、１６９０、１７０６、１７１４、１７３８、１７４６、１７７０、１７７８、１７８６、１８０２、１８１０、１８１８、１８２６、１８３４、１８４２、１８５０、１８９０、１９１４、１９３０、１９３８、１９４６、１９６２、１９７０、１９７８、１９８６、１９９４、２０１０、２０１８、２０２６、２０４２、２０５０、２０５８、２０９０、２１１４、２１３０、２１６２、２１７０、２１７８、２２０２、２２１０、２２２６、２２４２、２２５８、２２６６、２２７４、２２８２、２２９８、２３１４、２３２２、２３３０、２３３８、２３４６、２３５４、２３７０、２３７８、２３９４、２４１８、２４３４、２４４２、２４５８、２４６６、２４７４、２４９８、２５０６、２５１４、２５２２、２５４６、２５５４、２５７０、２５８６、２６５８、４９８９、４９９０、４９９１、及び４９９２から選択される第２のスペーサー配列または；
    ｂ．配列番号３７７８、４０２６、３７９４、４０１０、３９０６及び３７４６から選択される第１のスペーサー配列、ならびに配列番号１７７８、１７４６、１７７０、１５８６、１９１４、及び２２１０から選択される第２のスペーサー配列；または
    ｃ．配列番号３７７８及び１７７８；３７７８及び１７４６；３７７８及び１７７０；３７７８及び１５８６；３７７８及び１９１４；３７７８及び２２１０；４０２６及び１７７８；４０２６及び１７４６；４０２６及び１７７０；４０２６及び１５８６；４０２６及び１９１４；４０２６及び２２１０；３７９４及び１７７８；３７９４及び１７４６；３７９４及び１７７０；３７９４及び１５８６；３７９４及び１５８６；３７９４及び１９１４；３７９４及び２２１０；４０１０及び１７７８；４０１０及び１７７０；４０１０及び１７４６；４０１０及び１５８６；４０１０及び１９１４；４０１０及び２２１０；３９０６及び１７７８；３９０６及び１７７８；３９０６及び１７４６；３９０６及び１７７０；３９０６及び１５８６；３９０６及び１９１４；３９０６及び２２１０；３７４６及び１７７８；３７４６及び１７４６；３７４６及び１７７０；３７４６及び１５８６；３７４６及び１９１４；ならびに３７４６及び２２１０から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
    ｄ．配列番号３２５６、２８９６、３１３６、及び３２２４から選択される第１のスペーサー配列、ならびに４９８９、５６０、６７２、９７６、７６０、９８４、及び６１６から選択される第２のスペーサー配列；または
    ｅ．配列番号３２５６及び４９８９；３２５６及び９８４；３２５６及び６１６；２８９６及び４９８９；２８９６及び６７２；２８９６及び７６０；３１３６及び４９８９；３１３６及び５６０；３２２４及び４９８９；３２２４及び９７６；ならびに３２２４及び７６０から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
    ｆ．ａ）からｅ）までの前記第１及び第２のスペーサー配列のいずれかの少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続したヌクレオチドを含む第１及び第２のスペーサー配列；または
    ｇ．ａ）からｆ）までの前記第１及び第２のスペーサー配列のいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である第１及び第２のスペーサー配列、を含む、前記組成物。
  3. 組成物であって、
    ｉ）スペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸であって、
    ａ．配列番号５２６２、５７８２、５８３０、５９２６、５９５０、５９９８、６０２２、５３１０、及び５３３４から選択されるスペーサー配列；または
    ｂ．配列番号５８３０、６０２２、５２６２、及び５３１０から選択されるスペーサー配列；または
    ｃ．配列番号５２６２、５３３４、及び５８３０から選択されるスペーサー配列；または
    ｄ．配列番号５２６２；または
    ｅ．配列番号５２６４、５３３６、５８３２、６０２４、及び５３１２から選択されるスペーサー配列；または
    ｆ．ａ）からｅ）までの前記スペーサー配列のいずれか１つの少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続したヌクレオチドを含むスペーサー配列；または
    ｇ．ａ）からｆ）までの前記スペーサー配列のいずれか１つと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるスペーサー配列を含む、前記スペーサー配列を含む前記ガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする前記核酸；あるいは
    ｉｉ）第１及び第２のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸であって、
    ａ．配列番号５７８２及び５２６２；５８３０及び５２６２；５９２６及び５２６２；５９５０及び５２６２；ならびに５９９８及び５２６２から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
    ｂ．配列番号５８３０及び５２６２；ならびに６０２２及び５３１０から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
    ｃ．配列番号：５３３４及び５８３０；または
    ｄ．ａ）からｃ）までの前記第１及び第２のスペーサー配列のいずれかの少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続したヌクレオチドを含む第１及び第２のスペーサー配列；または
    ｅ．ａ）からｄ）までの前記第１及び第２のスペーサー配列のいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である第１及び第２のスペーサー配列、を含む、前記第１及び第２のスペーサー配列を含む前記１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする前記１つ以上の核酸、を含む、前記組成物。
  4. 組成物であって、
    ｉ）スペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸であって、
    ａ．配列番号２８１３０、３４４４２、４５９０６、２６５６２、５２６６６、５１３２２、４６５９９、５２８９８、２６５４６、７４４７、４７０４７、４９９８６、５１７６２、５１７５４、５２２９０、５２２９８、５１４７４、５２３０６、５０６８２、５１７０６、５２０９８、５０７１４、５１４９８、５２４９８、５０９７８、５１７４６、５２１０６、５１５０６、５０６７４、５２０８２、５２５０６、５０５３８、５２０６６、５２３８６、５２０９０、５２２６６、５２４７４、５２２５８、５２４３４、５０７０６、５１４９０、５２４５８、５１４６６、５２３５４、５１９１４、５１３６２、５１０５８、５０１７０、５１９５４、５２２５０、５１９３０、５１６８２、５２５９４、５２６１０、５１１６２、４９１６２、５０８９８、４９２２６、５１６５８、５２５５４、５２６３４、５１３９４、４９０３４、５２５４６、５２５２２、５２６１８、５２５３０、２８３２２、２６５３０、２６５７８、２６６０２、２６６３４、２６６２６、２６６９８、２６７４６、２６７５４、２６７８６、２６８８２、２７７２２、２７７３０、２７７３８、２７７７０、２７７５４、２７７６２、２７８０２、２７８５０、２７８４２、２７９２２、２７９４６、２７９８６、２８１１４、２８１２２、２８１４６、２８１８６、２８１９４、２８３３８、２８３４６、２８３２２、２８３７８、２８３７０、２８４５８、２８５０６、２８６３４、２８６４２、２８６５０、３４４４２、及び４５９０６から選択されるスペーサー配列；または
    ｂ．配列番号５１７０６、５１０５８、５１７５４、５２０９０、５２５９４、５２０９８、５２２９８、５２１０６、５１６８２、５２０６６、５２３５４、５２４５８、５２２９０、５２４９８、５１６５８、５１９３０、５１１６２、５２５０６、５１７６２、５１７４６、５２３８６、５２２５８、５２５３０、５２６３４、２７８５０、２８６３４、２６８８２、２８６５０、２８３７０、２８１９４、２６６２６、２６６３４、２６７８６、２６７５４、２７７７０、２６５７８、２８１３０、２７７３８、２８３３８、２８６４２、２６６０２、２７７５４、２７７３０、及び２８１２２から選択されるスペーサー配列；または
    ｃ．配列番号４７０４７、７４４７、７４６３、４６９６７、４６７６８、７６８０、及び４７０３２から選択されるスペーサー配列；または
    ｄ．配列番号４７０４５、７４４５、７４６１、４６７６６、７６７８、及び４７０３０から選択されるスペーサー配列；または
    ｅ．ａ）からｄ）までの前記スペーサー配列のいずれか１つの少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続したヌクレオチドを含むスペーサー配列；または
    ｆ．ａ）からｅ）までの前記スペーサー配列のいずれか１つと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるスペーサー配列を含む、前記スペーサー配列を含む前記ガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする前記核酸；あるいは
    ｉｉ）第１及び第２のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸であって、
    ａ．配列番号４７０４７及び７４４７；７４６３及び４６９６７；４６７６８及び７６８０；ならびに４７０３２及び７４４７から選択される第１及び第２のスペーサー配列；または
    ｂ．配列番号：４７０４７及び７４４７；または
    ｃ．配列番号５２８９８及び２６５４６；または
    ｄ．ａ）からｃ）までの前記第１及び第２のスペーサー配列のいずれかの少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続したヌクレオチドを含む第１及び第２のスペーサー配列；または
    ｅ．ａ）からｄ）までの前記第１及び第２のスペーサー配列のいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である第１及び第２のスペーサー配列、を含む、前記第１及び第２のスペーサー配列を含む前記１対のガイドＲＮＡ、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする前記１つ以上の核酸を含む、前記組成物。
  5. ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ、または前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  6. 前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼがＣａｓヌクレアーゼである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 前記ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼがＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに由来する、請求項７に記載の組成物。
  10. 前記ＣａｓヌクレアーゼがＣｐｆ１ヌクレアーゼである、請求項６に記載の組成物。
  11. ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 前記ガイドＲＮＡがｓｇＲＮＡである、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
  13. 前記ｓｇＲＮＡが修飾されている、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記修飾により、１つ以上の２’位置及び／またはホスホジエステル結合が改変される、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記修飾により、前記ｓｇＲＮＡの最初の３つのヌクレオチドのうちの１つ以上、またはすべてが改変される、請求項１３～１４のいずれか１項に記載の組成物。
  16. 前記修飾により、前記ｓｇＲＮＡの最後の３つのヌクレオチドのうちの１つ以上、またはすべてが改変される、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の組成物。
  17. 前記修飾が、ホスホロチオエート修飾、２’－ＯＭｅ修飾、２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾、２’－Ｆ修飾、２’－Ｏ－メチン－４’ブリッジ修飾、３’－チオホスホノアセテート修飾、または２’－デオキシ修飾のうちの１つ以上を含む、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の組成物。
  18. 先行請求項のいずれか１項に記載の組成物であって、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、前記組成物。
  19. 前記ガイドＲＮＡが脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）またはウイルスベクターと会合している、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  20. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アルファウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１９に記載の組成物。
  22. 前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、またはＡＡＶ９ベクターであり、ＡＡＶに続く番号がＡＡＶ血清型を示す、請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ血清型９ベクターである、請求項２２に記載の組成物。
  24. 前記ＡＡＶベクターがＡＡＶｒｈ１０ベクターである、請求項２２に記載の組成物。
  25. 前記ＡＡＶベクターがＡＡＶｒｈ７４ベクターである、請求項２２に記載の組成物。
  26. 前記ウイルスベクターが組織特異的プロモーターを含む、請求項１９～２５のいずれか１項に記載の組成物。
  27. ウイルスベクターを含み、前記ウイルスベクターが筋肉特異的プロモーターを含み、任意選択で、前記筋肉特異的プロモーターが筋肉クレアチンキナーゼプロモーター、デスミンプロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター、ＳＰｃ５－１２プロモーター、またはＣＫ８ｅプロモーターである、請求項１９～２６のいずれか１項に記載の組成物。
  28. 前記ウイルスベクターがニューロン特異的プロモーターを含み、任意選択で前記ニューロン特異的プロモーターがエノラーゼプロモーターである、請求項１９～２５のいずれか１項に記載の組成物。
  29. ＤＮＡ中のトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを前記ＴＮＲにまたはその近くに誘導する、スペーサー配列もしくは１対のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡもしくは１対のガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡもしくは前記１対のガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含む、前記方法。
  30. ＤＮＡ中の自己相補的領域を切除する方法であって、前記自己相補的領域を含む細胞に、ｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを前記自己相補的領域にまたはその近くに誘導する、スペーサー配列もしくは１対のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡもしくは１対のガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡもしくは前記１対のガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含み、前記自己相補的領域が切除される、前記方法。
  31. ＤＮＡ中のトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、前記ＴＮＲを含む細胞に、ｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼを前記ＴＮＲにまたはその近くに誘導する、スペーサー配列もしくは１対のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡもしくは１対のガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡもしくは前記１対のガイドＲＮＡをコードする核酸；ｉｉ）ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼまたは前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸；及びｉｉｉ）ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、を送達することを含み、少なくとも１つのＴＮＲが切除される、前記方法。
  32. 前記自己相補的領域が、パリンドローム配列、同一方向リピート、逆方向リピート、ＧＣリッチ配列、またはＡＴリッチ配列を含み、任意選択で、ＧＣリッチネスまたはＡＴリッチネスは、ループ形成配列によって任意選択で中断される少なくとも１０ヌクレオチドの長さ全体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％である、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＴＮＲまたは自己相補的領域にまたはその近くに送達する、１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡを含む、または前記１対のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸が前記細胞に送達される、請求項２９～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記標的が（ｉ）前記ＴＮＲもしくは前記自己相補的領域内にあるか、または（ｉｉ）前記ＴＮＲもしくは前記自己相補的領域の１０、１５、２０、２５、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド内にある、請求項２９～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. ＤＭ１、ＨＤ、ＦＡ、ＦＸＳ、ＦＸＴＡＳ、ＦＸＰＯＩ、ＦＸＥＳ、ＸＳＢＭＡ、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１２、ＳＣＡ１７、またはＤＲＰＬＡを有するヒト対象を治療するための医薬を調製するための、請求項２９～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記ＴＮＲが、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）におけるＣＴＧである、請求項２９または３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲの少なくとも一部を切除することを含み、前記切除が筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）の治療をもたらす、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記ＴＮＲがＦＭＲ１遺伝子内にある、請求項２９または３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記切除が脆弱Ｘ症候群の治療をもたらす、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記ＴＮＲがＦＸＮ遺伝子内にある、請求項２９または３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記切除がフリードライヒ運動失調症（ＦＡ）の治療をもたらす、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記ＴＮＲが、ハンチンチン、フラタキシン（ＦＸＮ）、脆弱Ｘ精神遅滞１（ＦＭＲ１）、脆弱Ｘ精神遅滞２（ＦＭＲ２）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、アリスタレス関連ホメオボックス（ＡＲＸ）、アタキシン１（ＡＴＸＮ１）、アタキシン２（ＡＴＸＮ２）、アタキシン３（ＡＴＸＮ３）、カルシウム電位依存性チャネルサブユニットアルファ１Ａ（ＣＡＣＮＡ１Ａ）、アタキシン７（ＡＴＸＮ７）、ＡＴＸＮ８反対鎖ｌｎｃＲＮＡ（ＡＴＸＮ８ＯＳ）、セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼ２Ａ ５５ｋＤａ調節サブユニットＢベータアイソフォーム（ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ）、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）、もしくはアトロフィン－１（ＡＴＮ１）遺伝子内にあるか、または前記ＴＮＲが、ＦＭＲ２の５’ＵＴＲに隣接している、請求項２９または３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  43. ハンチンチン（ＨＴＴ）における切除により、ハンチントン病（ＨＤ）の治療がもたらされる；ＦＸＮにおける切除により、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）の治療がもたらされる；ＦＭＲ１における切除により、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能不全（ＦＸＰＯＩ）、または脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）の治療がもたらされる；ＦＭＲ２におけるまたはＦＭＲ２の５’ＵＴＲに隣接する切除により、脆弱ＸＥ症候群（ＦＸＥＳ）の治療がもたらされる；ＡＲにおける切除により、Ｘ連鎖性球脊髄性筋萎縮症（ＸＳＢＭＡ）の治療がもたらされる；ＡＴＸＮ１における切除により、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）の治療がもたらされる；ＡＴＸＮ２における切除により、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）の治療がもたらされる；ＡＴＸＮ３における切除により、脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）の治療がもたらされる；ＣＡＣＮＡ１Ａにおける切除により、脊髄小脳失調症６型（ＳＣＡ６）の治療がもたらされる；ＡＴＸＮ７における切除により、脊髄小脳失調症７型（ＳＣＡ７）の治療がもたらされる；ＡＴＸＮ８ＯＳにおける切除により、脊髄小脳失調症８型（ＳＣＡ８）の治療がもたらされる；ＰＰＰ２Ｒ２Ｂにおける切除により、脊髄小脳失調症１２型（ＳＣＡ１２）の治療がもたらされる；ＴＢＰにおける切除により、脊髄小脳失調症１７型（ＳＣＡ１７）の治療がもたらされる；またはＡＴＮ１における切除により、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）の治療がもたらされる、請求項４２に記載の方法。
  44. 少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１０，０００ＴＮＲが切除される、請求項２９または３１～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. １～５、５～１０、１０～２０、２０～３０、４０～６０、６０～８０、８０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～３００、３００～５００、５００～７００、７００～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、７０００～８０００、８０００～９０００、または９０００～１０，０００ＴＮＲが切除される、請求項２９または３１～４３のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記ＴＮＲがＤＭＰＫ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＤＭＰＫ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ活性の増加；ホスホレンマン、ジヒドロピリジン受容体、ミオジェニン、Ｌ型カルシウムチャネルベータサブユニット、及び／またはミオシンホスファターゼ標的化サブユニットのリン酸化の増加；ミオシンホスファターゼの阻害の増加；及び／または筋肉喪失、筋衰弱、過眠症、１つ以上の実行機能障害、インスリン抵抗性、白内障形成、禿毛、または男性不妊症もしくは受精能低下の改善、のうちの１つ以上を任意選択で含む、請求項２９または３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記ＴＮＲがＨＴＴ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＨＴＴ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、線条体ニューロン喪失、不随意運動、易刺激性、うつ病、小不随意運動、協調性の欠如、新しい情報の学習や意思決定の困難、歩行、発話、及び／または嚥下の困難、及び／または思考及び／または推論能力の低下、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、請求項２９または３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記ＴＮＲが、ＦＭＲ１遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＦＭＲ１遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なＦＭＲ１転写物または脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質レベル、通常ＦＭＲＰに関連するｍＲＮＡの翻訳調節不全、ホスホコフィリン（ＣＦＬ１）のレベルの低下、ホスホコフィリンホスファターゼＰＰＰ２ＣＡのレベルの上昇、神経シナプスへのｍＲＮＡ輸送の低下、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０、及び／またはＣＲＹＡＢの発現の増加、ラミンＡ／Ｃアイソフォームの異常な細胞分布、４０歳未満の閉経などの早期発症閉経、卵巣の発達または機能の欠陥、血清ゴナドトロピン（例えばＦＳＨ）のレベルの上昇、進行性意図振戦、パーキンソニズム、認知機能低下、全身性脳萎縮、インポテンス、及び／または発達遅延、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、請求項２９または３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記ＴＮＲがＦＭＲ２遺伝子内にあるか、またはＦＭＲ２の５’ＵＴＲに隣接しており、前記ＴＮＲの切除により、ＦＭＲ２遺伝子内にあるかまたはＦＭＲ２遺伝子に隣接する伸長リピートに関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なＦＭＲ２発現、発達遅延、アイコンタクト不良、言語の反復使用、及びハンドフラッピング、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、請求項２９または３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記ＴＮＲが、ＡＲ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＲ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なＡＲ発現、アンドロゲン受容体タンパク質のＣ末端短縮化断片の生成；カスパーゼ－３及び／またはユビキチン－プロテアソーム経路を介したアンドロゲン受容体タンパク質のタンパク質分解；ＣＲＥＢ結合タンパク質を含む核内封入体の形成；ｐ４４／４２、ｐ３８、及び／またはＳＡＰＫ／ＪＮＫの異常なリン酸化；筋衰弱；筋消耗；歩行、嚥下、及び／または発話の困難；女性化乳房；及び／または男性不妊症、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、請求項２９または３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記ＴＮＲが、ＡＴＸＮ１遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ１遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、ＡＴＸＮ１を含む凝集体の形成；プルキンエ細胞死；運動失調；筋肉のこわばり；急速な、不随意の眼球運動；手足のしびれ、うずき、または疼痛；及び／または筋肉の痙攣、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、請求項２９または３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記ＴＮＲが、ＡＴＸＮ２遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ２遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なＡＴＸＮ２産生；プルキンエ細胞死；運動失調；発話または嚥下の困難；手足の感覚喪失及び脱力；認知症；筋消耗；制御不良の筋緊張；及び／または不随意の筋反射運動、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、請求項２９または３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記ＴＮＲが、ＡＴＸＮ３遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ３遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なＡＴＸＮ３レベル；異常なベクリン－１レベル；オートファジーの阻害；スーパーオキシドジスムターゼ２の調節障害；運動失調；嚥下困難；手足の感覚喪失及び脱力；認知症；筋肉のこわばり；制御不良の筋緊張；振戦；レストレスレッグス症候群；及び／または筋肉の痙攣、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、請求項２９または３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記ＴＮＲが、ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、ＣＡＣＮＡ１Ａ発現細胞における異常なＣａＶ２．１電位依存性カルシウムチャネル；運動失調；発話困難；不随意の眼球運動；複視；腕協調運動の喪失；振戦；及び／または制御不良の筋緊張、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、請求項２９または３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記ＴＮＲが、ＡＴＸＮ７遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ７遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なヒストンアセチル化；異常なヒストン脱ユビキチン化；ＣＲＸによるトランス活性化の障害；ＡＴＸＮ７を含む核内封入体の形成；運動失調；歩行の協調運動障害；手、発話及び／または眼球運動の不十分な協調；網膜変性；及び／または色素性黄斑ジストロフィー、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、請求項２９または３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記ＴＮＲが、ＡＴＸＮ８ＯＳ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＸＮ８ＯＳ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、ＡＴＸＮ８ＯＳ ｍＲＮＡを含むリボ核封入体の形成；異常なＫＬＨＬ１タンパク質発現；運動失調；発話及び／または歩行困難；及び／または不随意の眼球運動、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、請求項２９または３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記ＴＮＲが、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＰＰＰ２Ｒ２Ｂ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常なＰＰＰ２Ｒ２Ｂ発現；異常なホスファターゼ２活性；運動失調；小脳変性；歩行困難；及び／または手、発話及び／または眼球運動の不十分な協調、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、請求項２９または３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記ＴＮＲが、ＴＢＰ遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＴＢＰ遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常な転写開始；異常なＴＢＰタンパク質の蓄積（例えば、小脳ニューロンにおける）；異常な小脳ニューロン細胞死；運動失調；歩行困難；筋力低下；及び／または認知能力の喪失、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、請求項２９または３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記ＴＮＲが、ＡＴＮ１遺伝子内にあり、前記ＴＮＲの切除により、伸長リピートＡＴＮ１遺伝子に関連する１つ以上の表現型が改善され、前記改善は、異常な転写調節；異常なＡＴＮ１タンパク質の蓄積（例えば、ニューロンにおける）；異常なニューロン細胞死；不随意運動；及び／または認知能力の喪失、のうちの１つ以上を改善することを任意選択で含む、請求項２９または３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  60. 請求項１～２８のいずれか１項に記載の組成物を含む医薬組成物。
  61. ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、請求項１～２または５～２８のいずれか１項に記載の組成物、または請求項６０に記載の医薬製剤を投与することを含む、前記方法。
  62. 前記ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、請求項１～２、または５～２８のいずれか１項に記載の組成物、または請求項６０に記載の医薬製剤を投与することを含む、前記方法。
  63. １つのｇＲＮＡのみが投与され、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるＣＴＧリピートが切除される、請求項６１または６２に記載の方法。
  64. 前記ｇＲＮＡが、
    ａ．配列番号３７４６、３７７８、３３９４、３３８６、３９３８、３８１８、３７２２、３８５８、３３７０、１７０６、２２１０、２１１４、１５３８、及び２５９４から選択されるスペーサー配列；または
    ｂ．配列番号３３３０、３７４６、３７７８、３３９４、４０２６、３３８６、３９３８、３８１８、３７２２、３８０２、３８５８、３５１４、３７７０、３３７０、２２０２、１７０６、２２１０、１７７８、２１１４、１７３８、１７４６、２３２２、１５３８、２５１４、２４５８、２１９４、及び２５９４から選択されるスペーサー配列；または
    ｃ．配列番号３３３０、３３１４、２６５８、２６９０、２５５４、及び２４９８から選択されるスペーサー配列；または
    ｄ．配列番号３３１４、２６９０、２５５４、及び２４９８から選択されるスペーサー配列；または
    ｅ．配列番号３９１４、３５１４、１７７８、２４５８、３８５８、３４１８、１７０６、及び２２５８から選択されるスペーサー配列；または
    ｆ．配列番号３９１４；または
    ｇ．配列番号３４１８；または
    ｈ．配列番号３９３８；または
    ｉ．配列番号３９１６、３４２０、及び３９４０から選択されるスペーサー配列、を含むスペーサー配列を含む、請求項６３に記載の方法。
  65. ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、請求項３または５～２８のいずれか１項に記載の組成物、または請求項６０に記載の医薬製剤を投与することを含む、前記方法。
  66. ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、請求項３、または５～２８のいずれか１項に記載の組成物、または請求項６０に記載の医薬製剤を投与することを含む、前記方法。
  67. １つのｇＲＮＡのみが投与され、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲにおけるＴＮＲが切除される、請求項６５または請求項６６に記載の方法。
  68. 前記ｇＲＮＡが、
    ａ．配列番号５８３０、６０２２、５２６２、及び５３１０から選択されるスペーサー配列；または
    ｂ．配列番号５２６２、５３３４、及び５８３０から選択されるスペーサー配列；または
    ｃ．配列番号５２６２、
    ｄ．配列番号５２６４、５３３６、５８３２、６０２４、及び５３１２から選択されるスペーサー配列、を含むスペーサー配列を含む、請求項６７に記載の方法。
  69. ＦＸＮ遺伝子のイントロンにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、請求項４～２８のいずれか１項に記載の組成物、または請求項６０に記載の医薬製剤を投与することを含む、前記方法。
  70. ＦＸＮ遺伝子の５’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、請求項４～２８のいずれか１項に記載の組成物、または請求項６０に記載の医薬製剤を投与することを含む、前記方法。
  71. １つのｇＲＮＡのみが投与され、ＦＸＮ遺伝子の５’ＵＴＲにおけるＴＮＲが切除される、請求項６９または請求項７０に記載の方法。
  72. 前記ｇＲＮＡが、
    ａ．配列番号４７０４７、７４４７、７４６３、４６９６７、４６７６８、７６８０、及び４７０３２から選択されるスペーサー配列；または
    ｂ．配列番号４７０４５、７４４５、７４６１、４６７６６、７６７８、及び４７０３０から選択されるスペーサー配列、を含むスペーサー配列を含む、請求項７１に記載の方法。
  73. ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含む、請求項２９～５９または６１～７２のいずれか１項に記載の方法。
  74. 前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が化合物６である、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が化合物３である、請求項７３に記載の方法。
  76. ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡを投与することを含み、第１のスペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを、配列の第１のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導し、ここで、前記第１のストレッチは、
    ａ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｕ２９切断部位の１ヌクレオチドから開始し、前記リピートまで続くか；または
    ｂ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｕ３０切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｕ５６切断部位の１ヌクレオチド前まで続くか；または
    ｃ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｕ３０切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｕ５２切断部位の１ヌクレオチド前まで続くか；または
    ｄ．配列番号５３４１３であるか；または
    ｅ．配列番号５３４１４であるか；または
    ｆ．配列番号５３４１５である、前記方法。
  77. ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡを投与することを含み、第２のスペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを、配列の第２のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導し、ここで、前記第２のストレッチは、
    ａ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｄ１５切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｄ５１切断部位の１ヌクレオチド前まで続くか；または
    ｂ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｄ３５切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｄ５１切断部位の１ヌクレオチド前まで続くか；または
    ｃ．配列番号５３４１６であるか；または
    ｄ．配列番号５３４１７である、前記方法。
  78. ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切除する方法であって、１対のスペーサー配列を含む１対のガイドＲＮＡを投与することを含み、
    ｉ．第１のスペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを、配列の第１のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導し、ここで、前記第１のストレッチは、
    ａ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｕ２９切断部位の１ヌクレオチドから開始し、前記リピートまで続くか；または
    ｂ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｕ３０切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｕ５６切断部位の１ヌクレオチド前まで続くか；または
    ｃ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｕ３０切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｕ５２切断部位の１ヌクレオチド前まで続くか；または
    ｄ．配列番号５３４１３であるか；または
    ｅ．配列番号５３４１４であるか；または
    ｆ．配列番号５３４１５であり；及び
    ｉｉ．第２のスペーサー配列は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡヌクレアーゼを、配列の第２のストレッチ内の任意のヌクレオチドに誘導し、ここで、前記第２のストレッチは、
    ａ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｄ１５切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｄ５１切断部位の１ヌクレオチド前まで続くか；または
    ｂ．ｓｐＣａｓ９によるＤＭＰＫ－Ｄ３５切断部位の１ヌクレオチドから開始し、ＤＭＰＫ－Ｄ５１切断部位の１ヌクレオチド前まで続くか；または
    ｃ．配列番号５３４１６であるか；または
    ｄ．配列番号５３４１７である、前記方法。
  79. ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を投与することをさらに含む、請求項７６～７８に記載の方法。
  80. 前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が化合物６である、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が化合物３である、請求項７９に記載の方法。
  82. ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ、または前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸を投与することをさらに含む、請求項７６～８１のいずれか１項に記載の方法。
  83. 前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼがＣａｓヌクレアーゼである、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼがＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに由来する、請求項８４に記載の方法。
  87. 前記ＣａｓヌクレアーゼがＣｐｆ１ヌクレアーゼである、請求項８３に記載の方法。
  88. ａ．前記Ｕ２９切断部位は、ｃｈｒ１９：ヌクレオチド４５，７７０，３８３と４５，７７０，３８４との間にあり、これは、以下の配列：ｔｔｃａｃａａｃｃｇｃｔｃｃｇａｇ＊ｃｇｔｇｇｇ中の＊に対応しており；
    ｂ．前記Ｕ３０切断部位は、ｃｈｒ１９：４５，７７０，３８５と４５，７７０，３８６との間にあり、これは、以下の配列：ｇｃｔｇｇｇｃｇｇａｇａｃｃｃａｃ＊ｇｃｔｃｇｇ中の＊に対応しており；
    ｃ．前記Ｄ１５切断部位は、ｃｈｒ１９：４５，７７０，１５４と４５，７７０，１５５との間にあり、これは、以下の配列：ｇｇｃｔｇａｇｇｃｃｃｔｇａｃｇｔ＊ｇｇａｔｇｇ中の＊に対応しており；
    ｄ．前記Ｄ３５切断部位は、ｃｈｒ１９：４５，７７０，０７８と４５，７７０，０７９との間にあり、これは、以下の配列：ｃａｃｇｃａｃｃｃｃｃａｃｃｔａｔ＊ｃｇｔｔｇｇ中の＊に対応している、請求項７６～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. ＴＮＲまたは自己相補的領域を切除することができるガイドＲＮＡをスクリーニングする方法であって、
    ａ．ｉ．細胞を、ガイドＲＮＡ、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ、及びＤＮＡ－ＰＫ阻害剤と接触させることと；
    ｉｉ．ｉ）で使用されたものと同じタイプの細胞を、前記ガイドＲＮＡ、前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼと接触させるがＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は用いないことと；
    ｂ．ステップａ）ｉ）で接触させた前記細胞からの前記ＴＮＲまたは自己相補的領域の前記切除をステップａ）ｉｉ）で接触させた前記細胞と比較することと；
    ｃ．前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を用いない場合と比較して、前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤の存在下で前記切除が改善されるガイドＲＮＡを選択することと、を含む、前記方法。
  90. ＴＮＲまたは自己相補的領域を切除することができる１対のガイドＲＮＡをスクリーニングする方法であって、
    ａ．ｉ．細胞を、１対のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼ、及びＤＮＡ－ＰＫ阻害剤と接触させることと；
    ｉｉ．ｉ）で使用されたものと同じタイプの細胞を、前記ガイドＲＮＡ、前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼと接触させるがＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を用いないことと；
    ｂ．ステップａ）ｉ）で接触させた前記細胞からの前記ＴＮＲまたは自己相補的領域の前記切除をステップａ）ｉｉ）で接触させた前記細胞と比較することと；
    ｃ．前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤を用いない場合と比較して、前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤の存在下で前記切除が改善される１対のガイドＲＮＡを選択することと、を含む、前記方法。
  91. 前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が化合物６である、請求項８９または請求項９０に記載の方法。
  92. 前記ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤が化合物３である、請求項８９または請求項９０に記載の方法。
  93. 前記ガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡが、前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲに誘導する、請求項８９～９２のいずれか１項に記載の方法。
  94. 前記ガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡが、前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲに誘導する、請求項８９～９２のいずれか１項に記載の方法。
  95. 前記ガイドＲＮＡまたは１対のガイドＲＮＡが、前記ＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼをＦＸＮ遺伝子の５’ＵＴＲに誘導する、請求項８９～９２のいずれか１項に記載の方法。
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