CN104520428B - 将基因转移到细胞、器官和组织的aav载体组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及腺相关病毒(AAV)血清型AAV‑Rh74及相关的AAV载体，和AAV‑Rh74及相关的AAV载体介导的基因转移的方法和用途。特别地，AAV‑Rh74将多核苷酸靶向至细胞、组织或器官，以表达(转录)编码治疗性蛋白质和肽的基因，和充当或者被转录成抑制性核酸序列的多核苷酸。

Description

将基因转移到细胞、器官和组织的AAV载体组合物和方法
相关申请信息
本申请要求于2012年2月17日提交的申请序列号为61/600,415的申请的优先权，并且特别地通过引用将该申请的全文并入本文。
背景技术
由在期望有的基因中的缺失或缺陷(功能丧失)或不期望有的基因或有缺陷的基因的表达或(增益功能)引起的遗传性病症导致各种疾病。一个功能缺失型遗传病症的例子是血友病，即或者由缺乏凝血因子Ⅷ引起的(FVIII，血友病A)或者由缺乏凝血因子IX引起的(FIX，血友病B)遗传性出血性病症。一个功能增益型遗传病症的例子是亨廷顿氏舞蹈症，即由编码突变蛋白的病理性的“HTT”基因(编码亨廷顿蛋白)引起的一种疾病，该突变蛋白尤其是在基底神经节和大脑皮层的神经元内积聚并导致神经元逐渐破坏。
血友病目前的治疗在于或者如果发生出血则根据需要静脉施用重组凝血因子或者预防性地静脉施用重组凝血因子。然而，这种治疗方法有几个缺点，例如，需要进行重复注射、治疗的成本、研发抗治疗性因子免疫反应的风险、以及潜在地致命性出血的风险。这些局限性促使血友病的基因疗法的发展。为了实现这个目标，血友病对于基于基因转移的疗法是理想的，这是因为1)治疗窗是非常宽的，当水平刚刚超过正常量的1％时，已经能够导致表型从严重改变到中度，并且100％的水平也不关联到任何副作用；2)并不严格地要求治疗性转基因的组织特异性表达；以及3)在衡量治疗效果的端点方面有相当多的经验。此外，凝血因子的肝表达已被证明能诱导对凝血因子本身的免疫耐受性，降低了对凝血因子潜在地有害免疫反应的可能性。
目前，腺相关病毒(AAV)载体由于它们具有输送基因至体内的最佳的安全性和有效性而被确认为基因转移载体的选择。到目前为止分离的AAV的血清型中，AAV2和AAV8已被用于靶向患有严重血友病B的人的肝脏。这两种载体都有效，并在AAV8的情况下，治疗性转基因的长期表达被确证。人类中最近的数据表明，使用AAV载体靶向肝脏实现了FIX转基因在治疗水平的长期表达。
虽然这些数据是有希望的，但是具有对肝脏的高亲和性和在人(野生型AAV的天然宿主)中具有低血清阳性率的AAV血清型的鉴定是基础，因为1)以最低载体剂量实现在肝脏转基因表达的治疗水平可以降低触发抗AAV衣壳免疫反应的风险；2)交替具有独特的血清阳性率的AAV血清型将使得能够治疗这些患者群体，否则由于对各种AAV预先存在体液免疫性而没有资格进行AAV基因转移。本发明解决了这些需求并提供了额外的好处。
发明内容
本发明提供了腺相关病毒(AAV)血清型AAV-Rh74载体，以及相关的AAV载体。这样的载体尤其包括靶向肝脏的肝细胞的AAV-Rh74。AAV-Rh74及相关的AAV载体作为多核苷酸序列输送的载体驱动细胞中的多核苷酸的表达。编码诸如用于治疗应用的蛋白质之类的蛋白质的多核苷酸在给药后能够在治疗水平表达。此外，相比于几个目前在临床前和临床环境中研究的其它血清型，AAV-Rh74及相关的AAV载体介导的多核苷酸转移产生的蛋白质的表达水平显著要高(参见，例如，图1和图2)。特别地，AAV-Rh74能够有效地将多核苷酸靶向肝脏，至少无论是在小鼠中还是在患有血友病B的狗中都相当于或优于AAV8肝脏转导的金标准。因此，AAV-Rh74可以用来输送诸如编码序列的基因之类的多核苷酸，以表达提供期望的或治疗的益处的蛋白质，以及用于降低或抑制不期望的或有缺陷的基因的表达的抑制性核苷酸，从而治疗各种疾病。例如，AAV-Rh74可以用于输送治疗性基因(例如，FIX，FVIII)来治疗血友病A、血友病B，以及输送用于为范围广泛的其它代谢的或血浆蛋白缺陷的基因，或者输送用于为其它治疗目的基因，诸如但不限于编码锌指核酸酶的基因以在肝脏执行基因组编辑，并用于局部(肝)输送免疫调节剂(如α-干扰素)以治疗肝炎病毒感染、或者实际上治疗或者需要肝脏转导或者在血液中存在治疗性转基因产物(其可以通过靶向用于肝脏表达的转基因实现)的任何疾病。
除了通过AAV-Rh74和相关的载体有效地将多核苷酸输送至体外细胞、离体细胞和体内细胞之外，人体中的抗AAV-Rh74抗体的优势比抗AAV2抗体低，并且不同于抗AAV8抗体的优势(表1)。AAV-Rh74和相关的载体由于低的血清阳性率(seroprevealence)而可以以较大的比例在人体内使用，否则将没有资格进行基因转移，例如，人类对其它AAV血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11等)可能是血清反应阳性。此外，AAV-Rh74可以有效地以高滴度产生(表2)。因此，可以大量地生产用于更普遍的临床疾病的AAV-Rh74和相关的载体。
根据本发明，提供了用于将异源多核苷酸序列输送或转移至哺乳动物或哺乳动物的细胞的方法。在一个实施方式中，方法包括在合适的条件下向哺乳动物或哺乳动物的细胞施用包括异源多核苷酸序列的腺相关病毒(AAV)载体，以将异源多核苷酸序列输送或转移至哺乳动物中或哺乳动物的细胞中，从而输送或转移异源多核苷酸。在一方面，该方法使得异源多核苷酸能够转移/输送至哺乳动物和/或细胞中。在另一方面，该方法使得异源多核苷酸能够转移/输送至哺乳动物和/或细胞中，并且使得异源多核苷酸随后能够转录，从而形成转录物。在进一步的方面，该方法使得异源多核苷酸能够转移/输送至细胞中，使得随后能够转录以形成转录物并且使得随后能够翻译以形成基因产物(蛋白质)。特别地，例如，在后两个方面中，异源多核苷酸序列可操作地连接于使异源多核苷酸序列具有转录性能的以及任选地随后使转录物具有翻译性能的表达调控元件。
附图说明
图1示出了经由尾静脉注射有在肝脏特异性启动子的控制下表达FIX转基因的AAV载体的C57BL/6小鼠(每组n＝5)中的人凝血因子IX(FIX)血浆水平。载体剂量每只小鼠2.510载体基因组。通过ELISA测定在基因转移1周、2周和4周后的FIX转基因产物(FIX蛋白)血浆水平。AAV-Rh74赋予最高水平的FIX转基因表达。
图2示出了按每千克(kg)重量312载体基因组给药后患有血友病B的狗中的犬FIX血浆水平。通过隐静脉静脉注入(IV)AAV载体并通过ELISA监测FIX水平。由肝脏特异性启动子驱动治疗FIX转基因的表达。在患有血友病B的狗中采用了大致相等的AAV8和AAV-Rh74载体，并且均优于AAV6。
图3示出了AAV-Rh74VP1氨基酸序列、VP2氨基酸序列和VP3氨基酸序列以及，VP1多核苷酸(DNA)序列(SEQ ID NOs：1～4)。
图4示出了向恒河猴、非人类灵长类动物施用表达人凝血因子IX(FIX)(在肝脏特异性启动子的控制下)的AAV8和AAVrh74载体，以及动物中的FIX的表达。接收AAVrh74-FIX载体的动物(朝右边界最后两条)与注射相同剂量的其它组动物相比，以较高水平表达FIX转基因。
具体实施方式
本发明是至少部分地基于表明腺相关病毒(AAV)血清型AAV-Rh74具有对肝细胞的高亲和性的数据，该肝细胞是肝脏的细胞。AAV-Rh74作为将多核苷酸(例如，基因、抑制性核酸等)转移/输送到细胞中的载体在静脉内给药后可以驱动在肝脏中治疗水平的表达。此外，相比于其它几个血清型，AAV-Rh74介导的基因转移/输送产生的蛋白表达水平显著要高(参见，例如，图1和图2)。特别地，AAV-Rh74有效地将基因靶向输送到肝脏，至少无论是在小鼠中还是在患有血友病B的狗中都相当于或优于AAV8肝脏转导的金标准。因此，AAV-Rh74可以用来转移/输送用于蛋白质的诸如编码序列(基因)之类的多核苷酸以提供期望的或治疗的益处，以及降低或抑制不期望的或有缺陷的(例如，病理性的)基因的表达的抑制性(反义)核苷酸，从而治疗各种疾病。例如，AAV-Rh74可以用于转移/输送治疗性基因来治疗血友病A、血友病B，以及转移/输送用于为范围广泛的其它代谢的或血浆蛋白缺陷或者用于为其它治疗目的基因，诸如但不限于编码锌指核酸酶以在肝脏执行基因组编辑的基因，并用于局部(肝)输送免疫调节剂(如α-干扰素)以治疗肝炎病毒感染，以及治疗实际上或者需要肝脏转导或者血液中存在治疗性转基因产物(其可以通过靶向用于肝脏表达的转基因实现)的任何疾病。
如本文所述，腺相关病毒(AAV)血清型AAV-Rh74和相关的载体将多核苷酸输送至离体细胞、体外细胞和体内细胞。这样的多核苷酸序列可以编码蛋白质，使得被输送有多核苷酸的细胞表达所编码的蛋白质。例如，AAV-Rh74和相关的AAV载体可以包括编码所需蛋白质或肽的多核苷酸，或者被转录时包括抑制序列(例如，RNA)的多核苷酸，该抑制序列例如，靶向用于抑制表达的基因的序列。因此，向受试者(例如，哺乳动物)输送或施用载体不仅向受试者提供了编码蛋白质和肽的多核苷酸，而且提供了靶向用于抑制受试者体内的表达或功能的基因的抑制性核苷酸。
因此，根据本发明提供了腺相关病毒(AAV)血清型AAV-Rh74以及相关的AAV载体，其包括编码肽和蛋白质的多核苷酸序列，以及其直接或转录时包括抑制性核苷酸的多核苷酸序列，该抑制性核苷酸靶向用于抑制表达或功能的基因。这样的AAV-Rh74和相关的AAV载体血清型(例如，VP1序列、VP2序列和/或VP3序列)与包括例如AAV1-AAV11或Rh10的其它AAV血清型不同(例如，与AAV1-AAV11或Rh10血清型中的任何血清型的VP1序列、VP2序列和/或VP3序列不同)。
如本文中所使用的，术语“血清型”是一种用来表示具有衣壳的在血清学上与其它AAV血清型不同的AAV的特征。血清学特征是基于一种AAV的抗体与另一种AAV的抗体之间没有交叉反应来确定的。这种交叉反应性的差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇中的差异(例如，由于AAV血清型的VP1序列差异、VP2序列差异和/或VP3序列差异)引起的。
AAV-Rh74具有与AAV-Rh74特征序列相同的基因/蛋白质序列(参见，例如，图3的VP1、VP2、VP3)。如本文中所使用的，“与AAV-Rh74相关的AAV载体”及其语法变体是指与一种或多种包含AAV-Rh74的多核苷酸或多肽序列具有实质性序列同一性的一种或多种AAV蛋白质(例如，VP1序列、VP2序列和/或VP3序列)。因此，这样的与AAV-Rh74相关的AAV载体可以具有一种或多种不同于AAV-Rh74的序列，但能相对于一种或多种基因表现出实质性序列同一性和/或具有一种或多种AAV-Rh74的功能特性(例如，如细胞/组织亲和性)。示例性的AAV-Rh74序列包括图3中所示的VP1、VP2和/或VP3。在一个非限制性的示例性实施方式中，与AAV-Rh74相关的AAV载体具有多核苷酸、多肽或其子序列，该多核苷酸、多肽或其子序列包括与一种或多种图3中所示的AAV-Rh74VP1序列、AAV-Rh74VP2序列和/或AAV-Rh74VP3序列具有至少80％或更多(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)相同的序列，或由与一种或多种图3中所示的AAV-Rh74VP1序列、AAV-Rh74VP2序列和/或AAV-Rh74VP3序列具有至少80％或更多(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)相同的序列组成。
根据本发明的方法和用途包括AAV-Rh74序列(多肽和核苷酸)和其子序列，该AAV-Rh74序列和其子序列相对于参照AAV-Rh74基因或蛋白质序列(例如，图3中所示的VP1序列、VP2序列、和/或VP3序列)少于100％表现出序列同一性，但是与诸如AAV1-AAV11、AAV-Rh10、基因或蛋白质等已知的AAV基因或蛋白质不同并且不具同一性。在一个实施方式中，AAV-Rh74多肽或其子序列包括与任何参照AAV-Rh74序列或其子序列(例如，图3中所示的VP1序列、VP2序列、和/或VP3序列)具有至少80％或更多(例如，85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％)相同的序列，或由与任何参照AAV-Rh74序列或其子序列(例如，图3中所示的VP1序列、VP2序列、和/或VP3序列)具有至少80％或更多(例如，85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％)相同的序列组成。
可以使用本领域技术人员已知的重组技术构建包括AAV-Rh74的AAV载体和AAV-Rh74相关的载体以包含一种或多种侧接有功能性AAV ITRs的异源多核苷酸序列。异源多核苷酸的掺入将AAV限定为重组载体、或者“rAAV载体”。这样的载体可以有一个或多个全部或部分缺失的野生型AAV基因，例如，rep基因和/或cap基因，但由于为救援、复制和包裹AVV颗粒所需保留至少一个功能性侧翼ITR序列。因此，AAV载体包括顺式的对于病毒复制和包裹所需的序列(例如，功能性ITR)。
术语“多核苷酸”和“核苷酸”在本文中可互换使用来指所有形式的包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)在内的核苷酸、寡核苷酸。多核苷酸包括基因组DNA、cDNA和反义DNA、剪接的mRNA或未剪接的mRNA、rRNA、tRNA和抑制性DNA或RNA(RNAi，例如，小或短发夹(sh)RNA、microRNA、小或短干扰(si)RNA、反式剪接RNA、或反义RNA)。多核苷酸包括天然存在的、合成的、并有意改变的或修饰的多核苷酸以及类似物和衍生物。多核苷酸可以是单链、双链或三链、直链的或环状的、并且可以是任意长度的。
“异源”多核苷酸仅仅是指插入AAV的多核苷酸，目的是为了AAV介导转移/输送该多核苷酸进入细胞。异源多核苷酸通常不同于AAV核酸。包含在rAAV病毒粒子中的异源多核苷酸一旦转移/输送进入细胞内，就可以被表达(例如，转录，并在合适时翻译)。替代地，在细胞中的包含在rAAV病毒粒子中的被转移/输送的异源多核苷酸不一定被表达。一旦源核苷酸在细胞所含的重组腺相关病毒的病毒粒子中，虽然“异源”一词在本文中并不总是关联于多核苷酸使用的，但是即使在没有修饰词“异源”的情况下提及的多核苷酸也包括异源多核苷酸，而不考虑所述省略。
由“多核苷酸序列”编码的“多肽”、“蛋白质”和“肽”包括天然全长序列，如同天然产生的蛋白，以及功能性子序列、修饰形式或序列变体，只要子序列、修饰形式或变体保持天然全长蛋白质的一定程度的功能即可。在本发明的方法和用途中，由该多核苷酸序列编码的这样的多肽、蛋白质和肽可以是但不必须是与有缺陷的、或者其表达是不充分的、或者在经治疗的哺乳动物中缺乏的内源性蛋白质相同。
本发明腺相关病毒(AAV)血清型AAV-Rh74以及相关的AAV载体可被用于稳定或瞬时导入/输送多核苷酸进入细胞和其后代。术语“转基因”用于方便地指代已经导入细胞或生物体中的这样的异源多核苷酸。转基因包括任何多核苷酸，如编码多肽或蛋白质的基因，转录成抑制性多核苷酸的多核苷酸，或者是未被转录的多核苷酸(例如，缺少表达调控元件，如驱动转录的启动子)。例如，在具有转基因的细胞中，所述转基因已经通过细胞的AAV“转化”导入/转移。已导入转基因的细胞或其后代被称为“转化细胞”或“转化体”。通常，转基因是包含在转化体的后代中或成为从细胞发育而成的生物体的一部分。因此，“转化”或“转染”的细胞(例如，在哺乳动物中，诸如细胞或组织或器官的细胞)是指例如多核苷酸或蛋白质(例如，转基因)之类外源分子掺入细胞中后在该细胞中的基因变化。因此，“转染”或“转化”细胞是例如已导入了外源分子的细胞或者其后代。这样的细胞可以被传播，并且所导入的蛋白质可以被表达或者核酸可以被转录。
根据本发明的编码有用的基因产物(蛋白质)的多核苷酸特定的非限制性实施例包括，但不限于：构成或编码CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节蛋白)的基因，包括功能凝血因子的增益功能的血液凝固(凝血)因子(因子XIII，因子IX，因子X，因子VIII，因子VIIa，蛋白C等)，抗体，视网膜色素上皮细胞特异性65kDa蛋白(RPE65)，促红细胞生成素，LDL受体，脂蛋白脂肪酶，鸟氨酸转氨甲酰酶，β-球蛋白，α-球蛋白，血影蛋白，α-抗胰蛋白酶，腺苷脱氨酶(ADA)，金属转运体(ATP7A或ATP7)，磺酰胺酶，涉及溶酶体贮积症的酶(ARSA)，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶，β-25葡糖脑苷脂酶，鞘磷脂酶，溶酶体氨基己糖苷酶，支链酮酸脱氢酶，激素，生长因子(例如，胰岛素样生长因子1和胰岛素样生长因子2，血小板衍生的生长因子，表皮生长因子，神经生长因子，神经营养因子-3和神经营养因子-4，脑源性神经营养因子，神经胶质源生长因子，转化生长因子α和转化生长因子β，等等)，细胞因子(如α-干扰素，β-干扰素，γ-干扰素，白介素-2，白介素-4，白介素12，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，淋巴毒素等)，自杀基因产物(例如，单纯疱疹病毒胸苷激酶，胞嘧啶脱氨酶，白喉毒素，细胞色素P450，脱氧胞苷激酶，肿瘤坏死因子等)，耐药相关蛋白(例如，其提供对癌症治疗中使用的药物的抗性)，肿瘤抑制蛋白(如p53，Rb，Wt-1，NF1，冯·希佩尔-林道(VHL)，腺瘤性结肠息肉病(APC))，具有免疫调节特性的肽，耐受性和免疫原性肽或蛋白质Tregitopes[de Groot et al.,Blood 2008Oct 15；112(8):3303]，或hCDR1[Sharabi et al.,ProcNatl Acad Sci U S A.2006Jun 6；103(23):8810-5]，胰岛素，葡萄糖激酶，鸟苷酸环化酶2D(LCA-GUCY2D)，Rab护送蛋白1(无脉络膜)，LCA5(LCA-Lebercilin)，鸟氨酸酮酸转氨酶(回旋形萎缩)，人视网膜劈裂蛋白1(X-连锁视网膜劈裂)，USH1C(亚瑟综合征1C)，X-连锁视网膜色素变性GTP酶(XLRP)，MERTK(AR形式的RP：色素性视网膜炎)，DFNB1(连接蛋白26耳聋)，ACHM2、3和4(色盲)，PKD-1或PKD-2(多囊性肾病)，TPP1，CLN2，溶酶体贮积病致病的基因缺陷(例如，硫酸酯酶，N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸转移酶，组织蛋白酶A，GM2-AP，NPC1，VPC2，鞘脂激活蛋白等)，用于基因组编辑的一个或多个锌指核酸酶，或用作基因组编辑的修复模板的供体序列。
所有的哺乳动物和非哺乳动物形式的编码基因产物的多核苷酸，包括本文中所公开的非限制性的基因和蛋白质，无论已知的还是未知的，都明确包括在内。因此，本发明包括来自非哺乳动物，人类以外的哺乳动物和人类的基因和蛋白质，这些基因和蛋白质以与本文所描述的人类基因和蛋白质基本相同的方式运行。非哺乳动物基因的非限制性的实例是Fok核酸酶结构域，其是来源于细菌的。哺乳动物的非人FIX序列的非限制性的实例在下述文献中有描述：Yoshitake et al.,1985,supra；Kurachi et al.,1995,supra；Jallatet al.,1990,supra；Kurachi et al.,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6461-6464；Jaye et al.,1983,Nucl.Acids Res.11:2325-2335；Anson et al.,1984,EMBO J.3:1053-1060；Wu et al.,1990,Gene 86:275-278；Evans et al.,Proc Natl Acad Sci USA 86:10095(1989),Blood 74:207-212；Pendurthi et al.,1992,Thromb.Res.65:177-186；Sakar et al.,1990,Genomics 1990,6:133-143；以及Katayama et al.,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4990-4994。
多核苷酸，多肽和其子序列包括修饰形式和变体形式。如本文中所使用的，术语“修饰”或“变体”及其语法变体意指多核苷酸、多肽或其子序列与参照序列有区别。因此，修饰的和变体的序列可具有与参照序列实质上相同的活性或功能，或者具有比参照序列大或小的活性或功能，但至少保留参照序列的部分活性或功能。
因此，本发明还包括天然和非天然存在的变体。此类变体包括功能变体的增益和缺失。例如，野生型人类FIX DNA序列，该蛋白的变体或突变体保持活性，或在治疗上是有效的，或者与在本发明的方法和用途中的不变的人类FIX是相当的，或者甚至比该不变的人类FIX更具治疗活性。在一个特定实例中，IV型胶原用于捕获FIX，即FIX当被导入哺乳动物的肌肉组织中时，FIX中的部分不能用于参与血液凝固，因为它被保持在在肌肉组织中的间隙空间内。导致蛋白质对IV型胶原的结合减弱(例如，功能缺失)的FIX序列中的突变是在本发明的方法中例如用于治疗血友病有效的突变体。这样的突变体人类FIX基因编码人类FIX蛋白的示例，用氨基酸丙氨酸代替从成熟蛋白质的起始位置开始的第五个氨基酸位置的赖氨酸。
非限制性的修饰的实例包括参照序列的一个或多个氨基酸(例如，1-3，3-5，5-10，10-15，15-20，20-25，25-30，30-40，40-50或更多个残基)的取代、添加(如插入或1-3，3-5，5-10，10-15，15-20，20-25，25-30，30-40，40-50，或更多个残基)和去除(例如，子序列或片段)。在具体实施方式中，修饰序列或变体序列保留未经修饰序列的功能或活性的至少一部分。这种修饰形式和变体可以例如具有小于、等于或大于参照序列的功能或活性的功能或活性，但是具有参照序列的功能或活性的至少一部分，如本文所述。
一种变体可以具有一个或多个非保守的或保守的氨基酸序列的差异或修饰，或两者兼而有之。“保守取代”是通过生物学上、化学上或结构上相似的残基置换一个氨基酸。生物学相似意味着取代不破坏生物活性。结构相似意味着氨基酸具有相似长度或类似尺寸的侧链，如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸。化学相似性是指残基具有相同电荷或都为亲水性或都为疏水性。具体实例包括如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸之类的疏水残基取代另一个疏水残基，或一个极性残基取代另一个极性残基，例如精氨酸取代赖氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺，丝氨酸取代苏氨酸，以及类似情形。保守取代的具体实例包括如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸之类的疏水残基取代另一疏水残基，极性残基取代另一极性残基，例如精氨酸取代赖氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺，以及类似情形。例如，保守性氨基酸取代物通常包括在以下组内的取代物：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；以及苯丙氨酸，酪氨酸。“保守取代”还包括使用经取代的氨基酸置换未经取代的母本氨基酸。
因此，本发明包括基因和蛋白质的变体(例如，本文所述的编码蛋白质的多核苷酸的变体)，其保留一种或多种生物活性(例如，在血液凝固中的功能等)。蛋白质或多肽的此类变体包括已经或可以使用重组DNA技术进行修饰的蛋白质或多肽，使得该蛋白质或多肽具有改变的或附加的属性，例如，变体赋予蛋白质在血浆中增强的蛋白质稳定性或赋予蛋白质增强的活性。变体可以不同于参照序列，如不同于天然存在的多核苷酸、蛋白质或肽。
在核苷酸序列水平，天然存在的变体基因和非天然存在的变体基因与参照基因将典型地至少约50％相同，更典型地至少约70％相同，甚至更典型地至少约80％相同(90％或更高同一性)。在氨基酸序列水平上，天然存在的变异蛋白质和非天然存在的变异蛋白质与参照蛋白质将典型地至少约70％相同，更典型地至少约80％相同，甚至更典型地至少约90％或者有更高的同一性，但在非保守区域允许有大部分非同一性的区域(例如，相同部分小于70％，诸如小于60％，小于50％或者甚至小于40％)。在其他实施方式中，所述序列与参照序列具有至少60％，70％，75％或更高的同一性(例如，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的同一性)。对于本领域技术人员而言，在多核苷酸、蛋白或多肽中导入核苷酸和氨基酸的变化的程序是已知的(参见，例如，Sambrook et al.(1989))。
术语“同一性”，“同源性”及其语法变体意指两个或更多个实体是“对齐”的序列时，它们是相同的。因此，通过举例的方式，当两个多肽序列是相同的时，它们至少所参照的区域或部分之内具有相同的氨基酸序列。如果两个多核苷酸序列是相同的，则它们至少在所参照的区域或部分之内具有相同的多核苷酸序列。同一性可以是序列的所限定的区(区域或结构域)。同一性的“区”或“区域”是指两个或两个以上所参照的实体的相同的部分。因此，如果两个蛋白质或核酸序列在一个或多个序列区或区域内是相同的，则它们在该区域内有同一性。“对齐”的序列是指多个多核苷酸或蛋白质(氨基酸)序列，相比于参照序列，常含补正缺失或附加的碱基或氨基酸(间隙)。
同一性可以延伸到整个序列长度或序列的部分。在具体的方面，享有同一性百分比的序列的长度为2，3，4，5或更多个邻接的多核苷酸或氨基酸，例如，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20个等邻接的氨基酸。在另外的具体的方面，共享同一性的序列长度是20个或更多个邻接的多核苷酸或氨基酸，例如，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35个等邻接的氨基酸。在进一步的具体方面，共享同一性的序列长度为35或更多个邻接的多核苷酸或氨基酸，例如，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，45，47，48，49，50个等邻接的氨基酸。在又一个进一步的具体方面，共享同一性的序列长度为50个或更多个邻接的多核苷酸或氨基酸，例如50-55，55-60，60-65，65-70，70-75，75-80，80-85，85-90，90-95，95-100，100-110个等邻接的多核苷酸或氨基酸。
术语“同源”或“同源性”意指两个或更多个参照的实体共享在给定区域或部分上的至少部分的同一性。同源性或同一性的“区、区域或结构域”意指两个或更多个参照的实体的一部分共享同源性或者是相同的。因此，如果两个序列在一个或多个序列区域是相同的，则它们共享在这些区域中的同一性。“基本同源”意指一种分子在结构上或功能上是保守的，使得其具有或者被预测为具有参照分子的一个或多个结构或功能(例如，生物功能或活性)中的至少部分结构或功能，或具有参照分子的与该一种分子共享同源性的相关/相应的区域或部分。
两个序列之间的同一性(同源性)的程度可以使用计算机程序和数学算法确定。计算百分比序列同一性(同源性)的这样的算法一般计算比较区域或区的序列间隙和不匹配。例如，BLAST(例如，BLAST 2.0)搜索算法(参见，例如,Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403(1990),公众可通过NCBI获得)具有示范性的搜索参数如下：不匹配-2；间隙打开5；间隙延伸2。对于多肽序列比较，BLASTP算法通常结合例如PAM100，PAM250，BLOSUM 62或BLOSUM50等打分矩阵使用。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)和SSEARCH序列比较程序也用于将同一性的程度量化(Pearson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)；Pearson,Methods Mol Biol.132:185(2000)；以及Smith et al.,J.Mol.Biol.147:195(1981))。也已开发出用于使用基于德朗奈(Delaunay)的拓扑绘图方案的量化蛋白质结构相似性的程序(Bostick et al.,Biochem Biophys Res Commun.304:320(2003))。
多核苷酸包括添加和插入，例如，异源结构域。添加(例如，异源结构域)可以是任何类型的分子与组合物的共价或非共价连接。通常情况下添加和插入(例如，异源结构域)赋予互补或不同的功能或活性。
添加和插入包括嵌合和融合的序列，该序列是具有与该序列共价连接的一个或多个分子的多核苷酸或蛋白质序列，该一个或多个分子在参照天然分子(野生型)序列中通常不存在。术语“融合”或“嵌合”及其语法变体在关联于分子使用时意指该分子的部分或局部含有不同于该分子的(异源的)不同的实体，因为它们通常不会一起存在于自然界。也就是说，例如，该融合或嵌合体的一部分包括不一起存在于自然界并且结构不同的部分或者由不一起存在于自然界并且结构不同的部分组成。
如本文所述，多核苷酸序列包括抑制性核酸序列和反义核酸序列。抑制性、反义的miRNA、shRNA和RNAi核酸可以调节靶基因的表达。反义包括结合RNA转录或DNA(例如，基因组DNA)的单链、双链或三链多核苷酸和肽核酸(PNA)。从靶基因的转录起始位点(例如从该起始位点开始的位置-10和10之间)衍生的寡核苷酸是另一特殊的例子。形成反义的三链体可以结合双链DNA，从而抑制该基因的转录。“RNAi”是使用单链或双链RNA序列以抑制基因表达(参见例如,Kennerdell et al.,Cell 95:1017(1998)；以及Fire et al.,Nature,391:806(1998))。因此，根据本发明的方法和用途，来自靶基因编码区的双链RNA序列可以用于抑制或阻止基因表达/转录。反义和RNAi可以基于核酸编码靶基因序列(例如，HTT)来制造，如基于核酸编码哺乳动物和人类HTT来制造。例如，单链或双链核酸(例如，RNA)可以靶向HTT转录物(例如，mRNA)。
根据本发明的可以靶向于抑制性的核酸序列的具体的非限制性的基因(例如，基因组DNA)或致病基因(参见，例如，RNA或mRNA)的转录物的例子可以包括，但不限于：与多核苷酸重复疾病相关的致病基因，如亨廷顿(HTT)基因，与齿状核红核苍白球路易体萎缩症(如atrophin1，ATN1)相关的致病基因；在脊髓延髓肌肉萎缩症中在X染色体上的雄激素受体，人类共济失调蛋白-1、人类共济失调蛋白-2、人类共济失调蛋白-3和人类共济失调蛋白-7，由(CACNA1A)编码的P/Q型电压依赖性钙通道Cav2.1，TATA-结合蛋白，共济失调蛋白8反义链，也称为ATXN8OS，在脊髓小脑性共济失调中的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A 55kDa调节亚基B的β同种型(1型，2型，3型，6型，7型，8型，1217型)，在脆性X综合征中的FMR1(脆性X智力低下1)，在脆性X-相关震颤/共济失调综合征中的FMR1(脆性X智力低下1)，脆弱XE智力低下中的FMR1(脆性X智力低下2)或AF4/FMR2的家族成员2；在强直性肌营养不良中的肌强直蛋白-蛋白激酶(MT-PK)；在弗里德共济失调中的Frataxin；在肌萎缩侧索硬化中的超氧化物歧化酶1(SOD1)突变基因；涉及帕金森氏病和/或阿尔茨海默氏病的发病机制的基因；载脂蛋白B(APOB)和前蛋白转化枯草杆菌/可欣型9(PCSK9)，高胆固醇血症(hypercoloesterolemia)；HIV Tat，在HIV感染中的人类免疫缺陷病毒反式激活的转录基因；HIV TAR，HIV TAR，在HIV感染中的人类免疫缺陷病毒反式激活反应元件基因；在HIV感染中的C-C趋化因子受体(CCR5)；在RSV感染中的劳斯肉瘤病毒(RSV)核衣壳蛋白，在丙型肝炎病毒感染中的肝特异性微microRNA(miR-122)；P53，急性肾损伤或肾移植术后移植肾功能延迟恢复或肾损伤的急性肾功能衰竭；提前复发或转移性实体肿瘤中的蛋白激酶N3(PKN3)；LMP2，LMP2也被称为蛋白酶体亚基β-9型(PSMB9)，转移性黑色素瘤；LMP7，也被称为蛋白酶体亚基β-8型(PSMB8)，转移性黑素瘤；也称为蛋白酶体亚基β型10(PSMB10)的MECL1，转移性黑素瘤；在实体肿瘤中的血管内皮生长因子(VEGF)；在实体肿瘤中的纺锤体驱动蛋白，在慢性髓性白血病中的细胞凋亡抑制B-细胞CLL/淋巴瘤(BCL-2)；在实体肿瘤中的核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)；在实体肿瘤中的弗林蛋白酶；在肝肿瘤中的Polo样激酶1(PLK1)，在丙型肝炎感染中的二酰基甘油酰基转移酶1(DGAT1)，在家族性腺瘤性息肉病中的β-连环蛋白(catenin)；在青光眼中的β2肾上腺素受体；在糖尿病性黄斑水肿(DME)或与年龄有关的黄斑变性中的RTP801/Redd1，也称为DNA损伤诱导转录蛋白4；在年龄相关性黄斑变性或脉络膜新生血管(neivascularization)中的血管内皮生长因子受体I(VEGFR1)，在非动脉炎性缺血性视神经病变中的胱天蛋白酶2；在先天性厚甲症(pachyonychia)中的角蛋白6AN17K突变蛋白；在流感感染中的A型流感病毒基因组/基因序列；在严重急性呼吸道综合征(SARS)感染中的SARS冠状病毒基因组/基因序列；在呼吸道合胞病毒感染中的呼吸道合胞病毒基因组/基因序列；在埃博拉病毒感染中的埃博拉纤维病毒基因组/基因序列；在乙型和丙型肝炎感染中的乙型和丙型肝炎病毒基因组/基因序列；在单纯疱疹病毒(HSV)感染中的HSV基因组/基因序列，在柯萨奇病毒B3感染中的柯萨奇病毒B3基因组/基因序列；在原发性肌张力障碍中的致病等位基因的沉默(等位基因特异性沉默)类耐扭蛋白A(TOR1A)，在移植中的特异性泛I类和HLA等位基因；或在常染色体显性遗传性色素性视网膜炎(adRP)中的视紫红质的突变基因(RHO)。
如本文所使用的，术语“重组”作为AAV的修饰语，如重组AAV-Rh74及相关的AAV载体，以及作为序列的修饰语，如重组多核苷酸和多肽，意指该组合物已经被以一般不会在自然界中发生的方式进行了操纵(即设计加工)。重组AAV的具体实例会是：其中通常在野生型AAV中不存在的多核苷酸是在AAV颗粒和/或基因组内。例如，一种重组多核苷酸的具体例子会是：其中编码蛋白质的多核苷酸(例如，基因)被克隆到载体中，该载体具有或不具有基因正常在AAV基因组内关联的5'，3'端和/或内含子区域。虽然在本文中术语“重组”并不总是关联于AAV(例如AAV-Rh74及相关的AAV载体)以及序列(例如多核苷酸和多肽)使用，但是AAV、AAV-Rh74和相关的AAV载体以及包括多核苷酸和多肽的序列的重组形式都明确地被包括，而不考虑任何这样的省略。
按照本发明所述的多核苷酸序列可插入到载体中。术语“载体”是指质粒、病毒(例如AAV)或可以通过掺入或结合多核苷酸进行操作的其它载体。这些载体可以用于基因操作(即，“克隆载体”)，以导入/转移多核苷酸到细胞中，和转录或翻译在细胞中的插入的多核苷酸。载体通常包含用于在细胞和表达调控元件(如启动子)中传播的复制起点。包括出现在载体中的调控元件(含有如本文所述的表达调控元件)以促进适当的转录以及在适当条件下的适当的翻译(例如，内含子的剪接信号，维持基因的正确阅读框以允许在框内翻译mRNA以及终止密码子等)。
本发明的包括AAV-Rh74和相关的AAV载体的载体可以包括一个或更多的“表达调控元件”。通常，表达调控元件是核酸序列(S)，如启动子和增强子，其影响可操作地连接的多核苷酸的表达。这些元件通常顺式操作，但也可能反式操作。
表达调控可在转录、翻译、剪接、消息稳定性等层级上起作用。通常，调节转录的表达调控元件并列靠近转录的多核苷酸的5'端(即“上游”)。表达调控元件也可位于转录序列的3'端(即，“下游”)或转录物内(例如，在内含子内)。表达调控元件可被定位在远离该转录序列一定距离处(例如，远离多核苷酸100至500，500至1000，2000至5000，5000至10,000或更多个核苷酸处)，甚至在相当远的距离处。然而，由于多核苷酸长度的限制，所以对于AAV-Rh74及相关的AAV载体而言，这样的表达调控元件通常距离多核苷酸在1至1000个核苷酸内。
功能上，可操作地连接的多核苷酸的表达能由元件(如启动子)至少部分地控制，使得该元件调节多核苷酸的转录，并在适当的条件下调节转录物的翻译。表达调控元件的一个具体实例是启动子，启动子通常位于转录序列的5'端。表达调控元件的另一实例是增强子，增强子可以位于转录序列的5'端、3'端或转录序列内。
表达调控元件和启动子包括在特定的组织或细胞类型中活跃的那些表达调控元件和启动子，本文中称为“组织特异性表达调控元件/启动子。”组织特异性表达调控元件是在特定细胞或组织(例如，肝，脑，中枢神经系统，脊髓，眼，视网膜或肺)中通常是活跃的。表达调控元件在这些细胞、组织或器官中通常是活跃的，因为它们是通过为特定细胞、组织或器官类型所特有的转录激活蛋白或其它的转录调节剂识别。
表达调控元件还包括普遍存在的或混杂的启动子/增强子，从而能够驱动多核苷酸在许多不同的细胞类型中的表达。这样的元件包括，但不限于紧邻启动子/增强子序列的巨细胞病毒(CMV)、Rous肉瘤病毒(RSV)启动子/增强子序列和在多种哺乳动物细胞类型中有活性的其他病毒启动子/增强子，或在自然界中不存在的合成元件。
表达调控元件还能够以可调节的方式赋予表达，即，信号或刺激物增加或减少可操作地连接的多核苷酸的表达。响应于信号或刺激物增加可操作地连接的多核苷酸的表达的可调节元件也被称为“诱导型元件”(即，通过信号诱导)。具体的例子包括，但不限于，激素(如类固醇)诱导型启动子。响应于信号或刺激物减少可操作地连接的多核苷酸的表达的可调节元件被称为“阻遏元件”(即，信号减少表达，使得当所述信号被去除或不存在时，表达是增加的)。通常情况下，由这些元件所赋予的增加或减少的量是与存在的信号或刺激物的量成比例的；信号或刺激物的量越大，在表达方面的增加或减少就越大。
如本文所用的术语“可操作连接”或“可操作地连接”是指如此描述的组分的物理或功能并置，以允许它们以其所预期的方式发挥功能。在与多核苷酸可操作连接的表达调控元件的实例中，这种关系使得该调控元件调节核酸的表达。更具体地，例如，可操作地连接的两个DNA序列是指两个DNA以使得这些DNA序列中的至少一个能够对另一序列施加生理作用这样的关系排列(顺式或反式)。
本发明的包括AAV-Rh74和相关的AAV载体的载体仍然可包括另外的核酸元件。这些元件包括但不限于AAV ITR序列的一个或多个拷贝、启动子/增强子元件、转录终止信号、位于多核苷酸序列的两侧的5'或3'端的未转化区(例如，聚腺苷酸化序列)、或者内含子I的全部或部分。这样的元件还任选包括转录终止信号。转录终止信号的一个特定的非限制性的例子是SV40转录终止信号。
与不存在内含子元件时的表达相比，包含内含子元件可增强表达(Kurachi etal.,1995，同上(supra))。AAV载体通常接受具有规定尺寸范围的DNA插入，该规定尺寸范围通常是约4kb至约5.2kb或稍大。因此，对于较短的序列，为了获得所要求的能被AAV载体接受的长度，在插入片段中包括另外的核酸可能是必要的。内含子和内含子片段(例如FIX的内含子I的部分)满足这一要求，同时还增强表达。因此，本发明并不限定于在AAV载体中包含内含子I序列，并包括代替内含子I的部分的其他内含子或其它DNA序列。因此，核酸的其它5'和3'端未转化区可以是代替那些为人类FIX所列举的区，尤其是在本发明的AAV-Rh74及相关的AAV载体中使用与人类FIX不同的编码蛋白质的多核苷酸时。
如本文使用的“内含子I的部分”是指内含子I的具有约0.1kb到约1.7kb的核苷酸长度的部分，该区域增强FIX的表达，与在没有内含子I的部分的情况下FIX的表达相比，对质粒或病毒载体模板通常增强约1.5倍或更多。更具体的部分是内含子I的1.3kb的部分。
包括修饰形式的多核苷酸和多肽可以使用各种标准的克隆、重组DNA技术，通过细胞表达或体外转化和化学合成技术进行。多核苷酸的纯度可以通过测序、凝胶电泳等来测定。例如，核酸可以使用杂交或基于计算机的数据库筛选技术来分离。这样的技术包括，但不限于：(1)基因组DNA或cDNA文库的杂交，用探针检测同源的核苷酸序列；(2)例如使用表达文库来检测具有共同的结构特征的多肽的抗体筛选；(3)使用能够复性到所讨论的核酸序列的引物对基因组DNA或cDNA进行聚合酶链式反应(PCR)；(4)计算机检索相关序列的序列数据库；以及(5)缩减的核酸库中的差分筛选。
包括经修改的形式的多核苷酸和多肽也可以通过使用本技术领域中已知的方法，例如，自动合成装置(参见，例如，Applied Biosystems,Foster City,CA)进行化学合成来制备。肽可以利用化学方法全部或部分合成(参见，例如，Caruthers(1980).Nucleic AcidsRes.Symp.Ser.215；Horn(1980)；以及Banga,A.K.,Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation,Processing and Delivery Systems(1995)Technomic Publishing Co.,Lancaster,PA)。肽合成可以使用各种固相技术进行(参见，例如，Roberge Science 269:202(1995)；Merrifield,Methods Enzymol.289:3(1997))并且自动合成可以例如按照制造商的说明使用ABI 431A肽合成仪(Perkin Elmer)来实现。
术语“分离的”在用作组合物的修饰语时，意味着该组合物是通过人工制成或与它们天然存在的生物体内的环境完全或至少部分分离。通常，分离的组合物基本上不含一种或多种材料，它们通常在自然界中关联于，例如，一个或多个蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、细胞膜。术语“分离的”不排除其它物理形式的组合物，如融合物/嵌合体，多聚体/低聚物，修饰(如磷酸化、糖基化、脂质化)或衍生的形式，或在由人工所产生的宿主细胞中的表达形式。
根据本发明，提供了治疗方法和用途，包含治疗方法和用途。本发明的方法和用途通过引入编码蛋白质的基因，或提高或刺激基因的表达或功能(例如，基因添加或取代)广泛适用于适合治疗的疾病。本发明的方法和用途也通过减少或降低基因的表达或功能(例如，基因敲除或减少基因表达)广泛地适用于适合治疗的疾病。
能根据本发明进行治疗的非限制性的疾病的具体实例包括本文所阐述的那些疾病以及肺病(例如，囊性纤维化)，凝血或出血性疾病(例如，具有或不具有抑制剂的血友病A或血友病B)，地中海贫血，血液疾病(如，贫血)，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，亨廷顿氏舞蹈病，肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，癫痫症，溶酶体贮积症，铜或铁的蓄积失调(例如，威尔森氏或门克斯病)、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症，神经疾病或神经退行性疾病，癌症，1型糖尿病或2型糖尿病，高歇氏病，胡尔勒氏病，腺苷脱氨酶缺乏症，代谢缺陷(例如，糖原贮积病)，视网膜退行性疾病(如RPE65缺乏、无脉络膜和其他眼病)，以及实体器官(如脑，肝，肾，心脏)的疾病。
因此，在一个实施方式中，本发明的方法包括：(a)提供腺相关病毒(AAV)载体，所述载体包含编码蛋白质的异源多核苷酸，其中，所述异源多核苷酸序列可操作地连接到赋予所述多核苷酸序列的转录的表达控制元件；以及(b)施用一定量的AAV载体到哺乳动物，其中所述蛋白表达于哺乳动物中。在具体的方面，所述蛋白质的表达对哺乳动物提供了治疗益处。
本发明的方法包括治疗方法，该治疗方法导致任何治疗的或有益的效果。在各种方法实施方式中，本发明的方法还包括抑制、降低或减少一个或多个不利的(例如，物理的)症状、失调、疾病、病症或由疾病引起的或与该疾病相关的并发症，例如减少血液凝结时间，补充凝血因子蛋白的减少给药量。
因此，治疗的诊疗或有益的效果是提供给特定受试者的任何客观或主观的可衡量或者可检测的改善或利益。一种治疗或有益的效果可以但不一定完全消除全部或任何特定的不良症状、失调、病症、或疾病的并发症。因此，当在不良的症状、失调、病症、或由疾病引起的或与该疾病相关的并发症方面有渐进的改善或部分的减缓时，或在短的或长的持续时间(小时、天、周、月等)抑制、降低、减少、遏制、预防、限制或控制不良的症状、失调、病症、或由疾病引起的或与该疾病相关的并发症的恶化或进展时，实现满意的临床结果。
本发明的组合物、方法和用途可以足够量或有效量给药于有此需要的受试者。“有效量”或“足够量”是指以单剂量或多剂量单独或与一种或一种以上其他组合物(诸如药物之类的治疗剂)、治疗、方案或治疗方案、药剂组合提供受试者中的任何持续时间(长期或短期)的可检测的反应、任何可测量或可检测程度或任何持续时间(例如，持续数分钟、数小时、数天、数月、数年或持续到治愈)的期望或理想的结果或者益处的量。
实现治疗作用的AAV载体剂量，例如载体基因组/每千克体重(vg/kg)的剂量，可根据几种因素发生变化，所述因素包括，但不限于：给药途径、达到治疗作用所需的异源多核苷酸表达水平、所治疗的特定疾病、针对AAV载体的任何宿主免疫反应、针对异源多核苷酸或表达产物(蛋白质)的宿主免疫反应以及所表达的蛋白质的稳定性。本领域技术人员可根据前述因素和其他因素容易地确定治疗患有特定疾病或病症的患者的AAV病毒粒子剂量范围。通常，剂量范围为至少1X108，或更多，例如1X109,1X1010,1X1011,1X1012,1X1013或1X1014，或更多载体基因组/千克(vg/kg)受试者体重，从而实现治疗作用。
以血友病为例，一般认为为了实现治疗作用，需要使凝血因子浓度比在正常个体中发现的凝血因子浓度大1％来使严重疾病表型变成中等严重表型。严重表型的特征为关节损伤和威胁生命的出血。为了使中等严重疾病表型转化为轻微严重表型，认为需要使凝血因子浓度比正常的凝血因子浓度大5％。关于治疗这种血友病受试者，典型剂量为至少1X1010载体基因组(vg)/千克(vg/kg)受试者体重，或介于约1X1010至1X1011vg/kg受试者体重之间，或介于约1X1011至1X1012vg/kg受试者体重之间，或介于约1X1012至1X1013vg/kg受试者体重之间，从而实现期望的治疗作用。
虽然减少、降低、抑制、压制、限制或控制疾病的发展或恶化是令人满意的结果，但是“有效量”或“足够量”的治疗(例如，缓解或提供治疗益处或改善)剂量一般可有效地提供对疾病的一种、多种或所有不利症状、结果或并发症，例如，由所述疾病引起或与所述疾病有关的一种或一种以上不利症状、紊乱、病症、病理或并发症的反应至可检测的程度。
有效量或足够量可以但不必需单一给药，可以要求多次给药，以及可以但不必需单独或与另一组合物(例如，药剂)、治疗、方案或治疗方案组合给药。例如，所述量可根据受试者需要、所治疗的疾病类型、状态和严重程度或者治疗的副作用(若有的话)按比例增加。此外，如果以单剂量或多剂量给药而没有第二组合物(例如，另一药物或药剂)、治疗、方案或治疗方案，则有效量或足够量不必是有效的或足够的，因为高于或超过这些剂量的额外的剂量、量或时间，或者额外的组合物(例如，药物或药剂)、治疗、方案或治疗方案可被包括在内以被认为是在受试者体内是有效的或足够的。被认为是有效的量还包括引起另一治疗、治疗方案或方案的使用量的减少，所述治疗、治疗方案或方案例如给药用于治疗凝血紊乱(例如，血友病A或B)的重组凝血因子蛋白。
有效量或足够量在所治疗的各受试者和每一受试者中不必是有效的，在指定组或指定人群中的大多数被治疗的受试者中也不必是有效的。有效量或足够量是指在特定受试者，而不是一组人或一般人群中的有效性和充分性。对这些方法而言典型的是，一些受试者会表现出对给定的治疗方法或用途具有更大反应或更少反应或没有反应。因此，合适的量会取决于所治疗的病症、期望的治疗作用以及受试者个体(例如，受试者体内的生物利用度、性别、年龄等)。
术语“缓解”是指受试者的疾病或其症状，或者潜在的细胞反应的可检测的或可测量的改善。可检测的或可测量的改善包括疾病或由疾病引起的或与疾病相关的并发症的发生、频率、严重程度、发展或持续时间的主观或客观的减少、降低、抑制、压制、限制或控制，或者疾病的症状或潜在病因或结果的改善，或者疾病的逆转。
因此，成功的治疗结果可引起减少、降低、抑制、压制、限制、控制或防止疾病或受试者体内疾病的一种或一种以上不利症状或潜在病因或结果的发生、频率、严重程度、发展或持续时间的“治疗作用”或“益处”。因此，认为影响一种或一种以上潜在病因或不利症状的治疗方法和用途是有益的。疾病恶化的减少或降低(例如稳定病情或其不利症状)也是成功的治疗结果。
因此，治疗益处或改善不必是疾病或者与疾病有关的任何一种、大多数或所有不利症状、并发症、结果或潜在病因的完全消失。因此，当在短期或长期时间(数小时、数天、数周、数月等)内受试者疾病的改善增加，或者部分减少、降低、抑制、压制、限制、控制或防止疾病的发生、频率、严重程度、发展或持续时间，或者抑制或逆转疾病(例如，稳定一种或一种以上症状或并发症)时，得到令人满意的结果。方法或用途的有效性通过各种方法确定，所述方法或用途例如提供对疾病的潜在治疗益处或改善的治疗。
发明方法和用途可与具有理想的治疗的、有益的、额外的、协同的或互补的活性或作用的任何化合物、药剂、药物、治疗或其他治疗方法或方案组合。组合物和治疗的示例性组合包括第二活性剂，例如，生物制剂(蛋白质)、药剂和药物。可在本发明的任何其他方法或用途之前、基本同时或在本发明的任何其他方法或用途之后给药这些生物制剂(蛋白质)、药剂、药物、或实施这些治疗和疗法，所述本发明的任何其他方法或用途例如治疗受试者的凝血疾病的治疗方法。
可以将化合物、药剂、药物、治疗或其他治疗方法或方案作为联合组合物给药，或独立给药化合物、药剂、药物、治疗或其他治疗方法或方案，例如在给药本发明的AAV载体的同时给药所述化合物、药剂、药物、治疗或其他治疗方法或方案，或按顺序给药本发明的AAV载体、所述化合物、药剂、药物、治疗或其他治疗方案或方案，或者连续(在前或在后)给药本发明的AAV载体、所述化合物、药剂、药物、治疗或其他治疗方案或方案。因此，本发明提供组合，在该组合中，本发明的方法或用途与本文列举的或本领域技术人员熟知的任何化合物、药剂、药物、治疗方案、治疗方法、过程、疗法或组合物联合。所述化合物、药剂、药物、治疗方案、治疗方法、过程、疗法或组合物可在给药本发明的AAV载体之前、同时或之后给药于受试者。因此，组合的实施方式的具体的非限定性实例包括上述化合物、药剂、药物、治疗方案、治疗方法、过程、疗法或组合物，或者其他化合物、药剂、药物、治疗方案、治疗方法、过程、疗法或组合物。
本发明的方法和用途还尤其包括引起另一化合物、药剂、药物、治疗方案、治疗方法、过程或疗法的需求或使用减少方法和用途。例如，就凝血疾病而言，如果在给定受试者中，给药重组凝血因子蛋白以补充受试者体内的内源凝血因子不足或缺陷(异常或突变)的频率减少或该给药的剂量降低或者该给药消除，则本发明的方法或用途具有治疗益处。因此，本发明提供减少另一治疗或疗法的需要或使用的方法或用途。
术语“受试者”是指动物，一般是哺乳动物，例如人，非人类灵长动物(猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴)、家畜(狗和猫)、农畜(诸如鸡和鸭之类的家禽、马、牛、山羊、绵羊、猪)，以及实验动物(小鼠、大鼠、兔子、豚鼠)。受试者包括动物疾病模型，例如，凝血疾病和本领域技术人员已知的其他疾病的小鼠模型或其他动物模型。
适于根据本发明的治疗的受试者包括有功能基因产物(蛋白质)产生量不足的风险或处于该风险中的那些受试者，或具有功能基因产物(蛋白质)缺陷的那些受试者，或者所述适于根据本发明的治疗的受试者产生可引起疾病的异常的部分功能性或非功能性基因产物(蛋白质)。适于根据本发明的治疗的受试者还包括有产生引起疾病的异常的或缺陷型(突变的)基因产物(蛋白质)的风险或处于该风险中的那些受试者，从而减少异常的或缺陷的(突变)基因产物(蛋白质)的量、表达或功能可导致对疾病的治疗，或可减少一种或一种以上症状或缓解疾病。因此，目标受试者包括具有这些缺陷的受试者，不管疾病类型、发作时间或程度、发展、严重度、频率或症状的类型或持续时间。
适于根据本发明的治疗的受试者还包括具有产生AAV抗体的风险或处于该风险中的那些受试者。可使用多种技术将AAV载体给药或输送至这些受试者中。例如，可输送空壳体AAV(即，缺少异源多核苷酸的AAV)以与AAV抗体结合从而使载有异源多核苷酸的AAV载体能转化受试者的细胞。待给药的空壳体AAV的量可根据特定受试者中产生的AAV抗体的量进行调整。可选地，或者此外，可通过直接肌肉注射(例如，一种或一种以上慢肌纤维)递送AAV载体。另一可选的方式中，可使用引入股动脉的导管通过肝动脉将AAV载体输送至肝脏。还可采用非手术方式(例如内镜逆行胰胆管造影(ERCP))直接将AAV载体递送至肝脏，由此绕过血流和AAV抗体。其他导管系统(例如颌下腺管道)也可用作将AAV载体递送至具有预先存在的抗AAV抗体的受试者的入口。
“预防”及其语法上的变体是指先于疾病接触、给药或体内输送至受试者的方法。给药或体内输送至受试者可在由疾病引起或与疾病相关的不利的症状、病症、并发症等发展之前进行。例如，可使用筛查(例如，基因筛查)鉴别作为本发明的方法和用途的候选者的这样的受试者，但是所述受试者可能不表现出疾病。因此，这些受试者包括可引起疾病的功能性基因产物(蛋白质)量不足或功能性基因产物(蛋白质)缺陷，或者产生异常的部分功能性或非功能性基因产物(蛋白质)的筛查结果呈阳性的那些受试者；以及引起疾病的异常的或缺陷的(突变)基因产物(蛋白质)的筛查结果呈阳性的那些受试者，虽然这些受试者不表型出所述疾病的症状也如此。
本发明的方法和用途包括全身、区域性或局部地通过任何途径输送和给药，所述途径例如，注射、输注、口服(例如，摄入或吸入)，或局部施用(经皮)。这些输送和给药包括静脉内输送和给药、肌肉内输送和给药、腹腔内输送和给药、皮内输送和给药、皮下输送和给药、腔内输送和给药、颅内输送和给药、经皮(局部)输送和给药、肠胃外输送和给药(例如经粘膜或直肠输送和给药)。示例性给药和输送途径包括静脉内(i.v.)、腹膜内(i.p.)、动脉内、肌肉内、肠胃外、皮下、胸膜内、局部、皮肤、皮内、经皮、例如经粘膜的肠胃外，颅内、脊髓内、口服(饮食性)、粘膜、呼吸、鼻内、插管、肺内、肺腔灌注、颊部、舌下、血管内、鞘内、腔内、电子导入、眼内、眼的、眼睛、腺内、器官内、淋巴管内给药和输送。
输送和给药的剂量可基于目前已有的方案通过使用动物疾病模型或任选地在人体临床试验中根据经验确定。开始的研究剂量可基于本文列举的动物研究，例如，用于小鼠或狗的动物研究。
剂量可以根据以下因素改变：治疗是为预防性的还是治疗性的，治疗所涉及的疾病的类型、发作、发展、严重程度、频率、持续时间或几率，所期望的临床结果，先前治疗或同时进行的治疗，受试者的总体健康状况、年龄、性别、种族或免疫力以及本领域技术人员知晓的其他因素。根据治疗或疗法的任何不利副作用、并发症或其他风险因素以及受试者的状况，制剂的量、数目、频率或持续时间可按比例增加或减少。本领域技术人员知晓可影响提供足以产生治疗或预防益处的量所需的剂量和时间的因素。
本文公开的发明方法和用途可在受试者被鉴定为患有治疗所针对的疾病、具有所述疾病的一种或一种以上症状，或者虽然受试者不具有所述疾病的一种或一种以上症状，但是如上文所述筛查并鉴定结果呈阳性之后的1-2,2-4,4-12,12-24或24-72小时内实施。当然，本发明的方法和用途可在受试者被鉴定为患有所述治疗所针对的疾病、具有所述疾病的一种或一种以上症状，或者如上文所述筛查并鉴定结果呈阳性之后实施1-7,7-14,14-21,21-48天或更多天数、月数或年数。
AAV载体和其他组合物、药剂、药物、生物制剂(蛋白质)可并入药物组合物中，例如，药学上可接受的载体或赋形剂。这些药物组合物尤其可用于，体内或间接体内给药和输送至受试者。
本文使用的术语“药学上可接受的”和“生理学上可接受的”是指生物学上可接受的制剂(气体、液体或固体或其混合物)，所述生物学上可接受的制剂适于一种或一种以上给药途径、体内输送或接触。这些制剂包括与药物的给药或体内接触或输送相容的溶剂(水性或非水性)、溶液(水性或非水性)、乳液(例如水包油或油包水)、悬浮液、糖浆、酏剂、分散和悬浮介质、包衣、等渗和吸收促进或延迟剂。水性和非水性溶剂、溶液和悬浮液可包括悬浮剂和增稠剂。这些药学上可接受的载体包括片剂(包被的或未包被的)、胶囊(硬胶囊或软胶囊)、微珠、粉末、颗粒和晶体。补充活性化合物(例如，防腐剂、抗菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂)也可并入所述组合物中。
可将药物组合物配制成与特定给药或输送途径相容，如本文列举的或本领域技术人员已知的。因此，药物组合物包括适于通过各种不同途径给药的载体、稀释剂或赋形剂。
适于肠胃外给药的制剂包括活性化合物的水性和非水性溶液、悬浮液或乳液，该制剂一般为无菌的，可与预期接受者的血液等渗。非限定性实例包括水、盐水、右旋糖、果糖、乙醇、动物油、植物油或合成油。
就经粘膜给药或经皮给药(例如，局部接触)而言，可将渗透液包括在药物组合物中。渗透液是本领域已知的，包括，例如，用于经粘膜给药、洗涤剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。就经皮给药而言，可将活性成分配制成本领域公知的气雾剂、喷雾剂、软膏剂、药膏、凝胶或霜剂。用于接触皮肤的药物组合物一般包括软膏剂、霜剂、洗剂、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油。可以使用的载体包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、乙醇、经皮促进剂和它们组合。
可将共溶剂和助剂加至所述制剂中。共溶剂的非限定性实例包括羟基或其他极性基团，例如，醇类，如异丙醇；二醇类，如丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇乙醚；丙三醇；聚氧乙烯和聚氧乙烯脂肪酸酯。助剂包括，例如，表面活性剂，如大豆磷脂和油酸；山梨酸酯，如脱水山梨糖醇三油酸酯；和聚乙烯比咯烷酮。
适于本发明的组合物和方法的药物制剂和输送系统是本领域已知的(参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(2003)20thed.,Mack PublishingCo.,Easton,PA；Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)18th ed.,MackPublishing Co.,Easton,PA；The Merck Index(1996)12th ed.,Merck Publishing Group,Whitehouse,NJ；Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms(1993),TechnonicPublishing Co.,Inc.,Lancaster,Pa.；Ansel and Stoklosa,Pharmaceutical Calculations(2001)11th ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD；andPoznansky et al.,Drug Delivery Systems(1980),R.L.Juliano,ed.,Oxford,N.Y.,pp.253-315)。
本文使用的“单位剂型”是指适于作为待治疗的受试者的单位剂量的生理上的离散单元；在以一个或一个以上剂量给药时，计算含有预先确定的任选地与药物载体(赋形剂、稀释剂、载剂或填充剂)相关的量的每一单元以产生期望的效果(例如，预防或治疗效果)。单位剂型可在例如安瓿和药水瓶中，其可包括液体组合物，或冷冻-干燥或冻干状态的组合物；例如，可在给药或体内输送之前加入无菌液体载体。单个单位剂型可包括在多剂量试剂盒或容器内。可以单一单位剂型或多单位剂型包装药物制剂，以便于给药和使剂量一致。
本发明提供具有包装材料和其中的一种或一种以上组分的试剂盒。试剂盒通常包括标签或说明书，所述标签或说明书包括组分的描述或关于体外、体内或间接体内使用其中的组分的说明。试剂盒可包含如下这些组分的集合：例如，AAV载体和任选地，第二活性剂，如另一化合物、药剂、药物或组合物。
术语“包装材料”是指容纳试剂盒的组分的物理结构。所述包装材料可无菌地保持组分，可由常用于上述目的的材料(例如，纸、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、药水瓶、管等)制成。
标签或说明书可包括其中的一种或一种以上组分的鉴别信息、剂量、包括作用机理的活性成分的临床药理学、药代动力学和药效学。标签或说明书可包括鉴别生产商、批号、产地和生产日期、失效期的信息。标签或说明书可包括鉴别生产商信息、批号、产地和生产日期的信息。标签或说明书可包括可使用试剂盒组分的疾病的信息。标签或说明书可包括针对临床医生或受试者的在方法、用途或治疗方案或治疗方法中使用一种或一种以上试剂盒组分的说明。说明可包括制剂剂量、频率或持续时间，以及用于实施本文描述的方法、用途、治疗方案或预防或治疗方法中的任何一种的介绍。
标签或说明书可包括有关组分可提供例如预防或治疗益处等任何益处的信息。标签或说明书可包括有关潜在的不利副作用、并发症或反应的信息，例如给受试者或临床医生的与可能不适于使用特定组合物的情况有关的警告信息。当受试者已经、将会或者正在服用一种或一种以上可能与所述组合物不相容的其他药物时，或者当受试者已经、将会或正在经历另一可能与所述组合物不相容的治疗方案或治疗方法时，也可发生不利副作用或并发症，因此，说明应包括关于这些不相容性的信息。
标签或说明书包括“印刷品”，例如纸或纸板，所述“印刷品”为独立的或附着于组分、试剂盒或包装材料(例如，盒子)，或者粘附于含有试剂盒组分的安瓿、管或药水瓶。标签或说明书还可包括计算机可读介质，例如印刷有条形码的标签、磁盘、诸如CD-或DVD-ROM/RAM之类的光盘、DVD、MP3、磁带或诸如RAM和ROM之类的电子储存介质或者它们的组合物，例如磁/光储存介质、FLASH介质或存储型卡。
除非另有说明，否则本文使用的所有科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管在本发明的实践和试验中可使用与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料，但是适合的方法和材料如本文中所述。
本文引用的所有申请、出版物、专利和其他引用文献、GenBank的引用和ATCC的引用的全部内容通过引用并入本文。在有争议的情况下，说明书(包括定义)起控制作用。
可以任何组合方式对本文公开的所有特征进行组合。说明书中公开的每一特征可被用于相同、等同或相似目的的可选特征代替。因此，除非另外明确说明，否则公开的特征(例如，化合物结构)为一类等同或相似特征的实例。
除非文中另外清楚说明，本文使用的单数形式“一”(“a”)、“一个”(“and”)和“该”(“the”)包括复数指代物。因此，例如，提及的“多核苷酸”包括多个这种多核苷酸，例如多个基因。
除非本文另外清楚说明，否则本文使用的所有数值或数值范围包括该范围内的整数和该值的分数或者范围内的整数的分数。因此，例如，所提及的至少90％一致性包括91％,92％,93％,94％,95％,95％,97％,98％,99％等，以及91.1％,91.2％,91.3％,91.4％,91.5％等,92.1％,92.2％,92.3％,92.4％,92.5％等，以及类似情形。
以多于(大于)或少于提及的数字包括分别大于或少于所涉及的数字的任何数目。因此，例如，少于1,000包括999,998,997等，一直减少至数字一(1)；少于100包括99,98,97等，一直减少至数字一(1)。
除非文中另外清楚说明，本文使用的所有数值或范围包括所述值的分数和所述范围内的整数以及所述范围内的整数的分数。因此，例如，提及的数字范围，如百分数范围90-100％，包括91％,92％,93％,94％,95％,95％,97％等，以及91.1％,91.2％,91.3％,91.4％,91.5％等,92.1％,92.2％,92.3％,92.4％,92.5％等等。因此，提及的范围1-50包括1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20等，以及1.1,1.2,1.3,1.4,1.5等，2.1,2.2,2.3,2.4,2.5等等。
提及的一系列范围包括合并了该系列内不同范围的边界值的范围。因此。例如，提及的一系列范围2-72小时，2-48小时，4-24小时，4-18小时，和6-12小时，包括范围2-6小时，2,12小时，2-18小时，2-24小时等，以及4-27小时，4-48小时，4-6小时，等等。
总体上，本发明通过使用描述多种实施方式和方面的确定语言而在本文中公开。具体而言，本发明还包括其中完全或部分排除特定主题的实施方式，所述主题例如物质或材料、方法步骤和条件、方案或过程。例如，在本发明的一些实施方式或方面中，排除了材料和/或方法步骤。因此，虽然本发明在本文中没有总体表达，但是鉴于本发明没有明确排除本发明未包括的方面，这些方面仍被本文公开。
本文描述了本发明的多种实施方式。然而，在不背离本发明的实质和范围的条件下，本领域技术人员可对本发明做出各种改变和改良以使其适于各种不同用途和条件。因此，下列实施例意在举例说明而不对本发明的范围构成限制。
实施例
实施例1
该实施例包括对各种材料和方法的描述。
小鼠：雄性C57BL/6J(WT)小鼠，8至10周龄，每试验组n＝5。狗为来自NorthCarolina Chapel Hill大学的携带FIX基因中的突变的克隆的HB狗(Evans et al.,ProcNatl Acad Sci USA 86:10095(1989))。
AAV载体构建体：使用在ApoE-hAAT肝脏特异性启动子的控制下表达人类FIX的构建体进行小鼠体内研究。狗体内研究使用几乎相同的启动子和犬FIX转基因。
基因导入方法：通过静脉注射输送所有载体。在小鼠中，通过尾静脉(给药200微升/小鼠的量，用PBS稀释载体)。在狗中，通过隐静脉输送载体。
FIX表达的确定：使用ELISA检测FIX水平。在小鼠中，人类FIX ELISA抗体对(捕获抗体和二抗)来自Affinity Biologicals。在狗中，根据Haurigot等(Mol Ther 18:1318(2010))所述使用同样来自Affinity Biologicals的抗体对。
统计分析：通过不成对的、双尾t检验进行统计分析。P值＜0.05被认为是有统计学意义的。
AAV抗体检测：将Manno等(Nat Med 12:342(2006))和Mingozzi等(Nat Med 13:419(2007))中描述的体内中和实验用于抗体检测。简言之，在实验中使用两种AAV载体构建体，在CMV启动子控制下表达β-半乳糖苷酶的单链载体(ssAAV-LacZ)或者在鸡β-肌动蛋白启动子(CBA)控制下表达Renilla报告基因的自身互补载体(AAV-Rh74-CBA-Renilla)。为了提高体外转化AAV载体的有效性，使用2V6.11细胞(ATCC)，该细胞在诱导型启动子的控制下表达腺病毒基因E4。以1.25x104细胞/孔的密度将细胞接种于96孔板中，将1:1000稀释度的脱皮素A(Invitrogen)加至培养基中以诱导E4表达。在实验那天，将连续半对数稀释的热灭活的测试血清与含有病毒的培养基混合。就ssAAV-LacZ载体而言，实验中使用的病毒浓度为：约1x1010vg/ml AAV2，和约5.5x1010vg/ml AAV5,6或8。就scAAV-Luc载体而言，实验中的病毒浓度低约50至150倍。报告转基因的剩余活性使用比色法(ssAAV-LacZ)或光度计(scAAV-Luc)检测。
抗AAV壳体的总IgG或Ig亚类通过捕获实验检测；用5x1010个壳体粒子/ml的AAV空壳体包被ELISA板。在室温下，用2％BSA,0.05％Tween 20的PBS溶液封闭板2小时，将连续稀释的样品加至孔中，在4℃下孵育过夜。结合生物素的抗人IgG1，IgG2,IgG3,IgG4,或IgM抗体(Sigma)用作检测抗体；加入链霉亲和素-HRP用于底物检测；对照通过连续稀释的人纯化IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,或IgM(Sigma)绘制的标准曲线确定Ig浓度。
AAV制备：载体制备过程在Ayuso等(Gene Ther 17:503(2010))中有详细描述。
实施例2
该实施例包括对人类FIX基因导入动物(小鼠)研究和基因导入后FIX
表达的描述。
通过尾静脉将含有因子IX(FIX)基因的肝脏特异性载体控制下的AAV载体注射到C57BL/6小鼠(每组n＝5)中(2.510载体基因组/小鼠)。在基因导入后的第1、2和4周用ELISA确定小鼠中的人类FIX转基因产物(蛋白质)血浆水平，并在图1中说明。AAV-Rh74表现出动物中最高水平的转基因表达。
实施例3
该实施例包括对表明血友病狗中在治疗水平下的有效的AAV-Rh74介导
的FIX输送的动物研究和数据的描述。
简言之，以3X1012载体基因组/kg体重通过隐静脉向血友病B狗进行静脉注射(IV)。治疗性FIX转基因的表达由肝脏特异性启动子驱动。通过ELISA监测载体和FIX的水平。犬FIX血浆水平在图2中示出。在血友病B狗中AAV-Rh74和AAV8大致等同地起作用，两者均优于AAV6。
实施例4
该实施例包括对显示人体内存在抗-AAV中和抗体(NAb)的研究的描述。
表1中的数据显示体外实验检测到的人体中的抗AAV中和抗体(NAb)。将NAB滴度为1:1的受试者定义为抗AAV抗体的空白()滴度或低滴度，适于AAV血清型的基因导入(灰色突出部分)。与AAV-2和AAV-8相比，AAV-Rh74表现出最低的抗AAV Nab。
表1
受试者ID AAV2 NAb AAV8 NAb AAV-Rh74 NAb
Genlmm 005 ＜1∶3.16 1∶1 1∶1
Genlmm 006 1∶31.6-1∶100 1∶10-1∶31.6 1∶31.6-1∶100
Genlmm 015 1∶3.1-1∶10 1∶1 1∶1
Genlmm 016 1∶10-1∶31.6 1∶31.6-1∶100 1∶31.6-1∶100
Genlmm 017 ＞1∶3160 ＞3160 ＞1∶3160
Genlmm 028 1∶3.1-1∶10 1∶10-1∶31.6 1∶1
Genlmm 035 ＞1∶3160 1∶100-1∶316 1∶316-1∶1000
Genlmm 040 1∶1 1∶1 1∶1
Genlmm 049 1∶1 1∶3.1-1∶10 1∶3.1-1∶10
Genlmm 053 1∶3160 1∶31.6-1∶100 1∶316-1∶1000
Genlmm 054 1∶1000-1∶3160 1∶10-1∶31.6 1∶31.6-1∶100
Genlmm 055 1∶1000-1∶3160 1∶31.6-1∶100 1∶100-1∶316
Genlmm 056 1∶10-1∶31.6 1∶10-1∶31.6 1∶3.1-1∶10
Genlmm 058 1∶3.1-1∶10 1∶1 1∶1
Genlmm 060 ＞1∶3160 1∶1000-1∶3160 1∶1000-1∶3160
Genlmm 068 1∶3160 1∶316-1∶1000 1∶316-1∶1000
Genlmm 069 ＞1∶3160 ＞1∶3160 ＞1∶3160
Genlmm 070 1∶10-1∶31.6 1∶1 1∶1
Genlmm 072 1∶3.1-1∶10 1∶100-1∶316 1∶1
Genlmm 074 1∶3160 1∶100-1∶316 1∶316-1∶1000
Genlmm 075 1∶316-1∶1000 1∶31.6-1∶100 1∶31.6-1∶100
Genlmm 080 1∶10-1∶31.6 1∶1 1∶1
Genlmm 082 1∶3.1-1∶10 1∶1 1∶1
Genlmm 083 1∶1 1∶1 1∶1
Genlmm 084 1∶3.1-1∶10 1∶3.1-1∶10 1∶1
Genlmm 087 1∶3.1-1∶10 1∶1 1∶1
Genlmm 088 ＞1∶3160
Genlmm 095 1∶1
Genlmm 100 1∶3.1-1∶10 1∶1 1∶1
实施例5
该实施例包括对显示包括AAV-Rh74在内的不同AAV血清型的制备量的数据的描述。
表2中的数据显示不同AAV血清型的产量。记录的是滚瓶中病毒批量大小、总载体产量和每瓶产量。所有血清型以相同表达盒包装。AAV-Rh74具有与所评价的其他血清型相当的或大于所评价的其他血清型的产量，所述其他血清型即AAV-8,AAV-dj,和AAV-2。
表2
实施例6
该实施例包括对显示如下结果的数据的描述：将在肝脏特异性启动子控制下的表达人类因子IX(FIX)的AAVrh74载体给药于恒河猴以高于以相同量给药的AAV8载体的水平在动物中产生制备量的FIX。
简言之，以2x1012载体基因组(vg)/kg体重的剂量将AAV8或AAVrh74给药于动物。在盐水中或在载体和空AAV壳体(表示为EC)的混合物中配制载体。
图4为平均(2至8周)和标准误差或者由ELISA检测的人类FIX的平均值的柱状图，所述ELISA特异性检测恒河猴血浆中的人类FIX。接收AAVrh74-FIX载体的动物在朝向右侧的最后两条中显示。数据显示接收AAVrh74载体的动物(朝向右侧的最后两条)以高于以相同剂量注射的其他组动物(黑柱和白柱)的水平表达FIX转基因。平均水平使用不成对的双尾t检验进行比较。

Claims (47)

1.腺相关病毒(AAV)载体在制备用于将异源多核苷酸序列输送或转移至哺乳动物中或哺乳动物的细胞中的药物中的应用，其中所述AAV载体包含异源多核苷酸序列，并且其中所述载体包含AAV-Rh74的如SEQ ID NO:1所示的VP1序列、如SEQ ID NO:3所示的VP2序列和如SEQ ID NO:4所示的VP3序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述异源多核苷酸序列能操作地连接于使所述异源多核苷酸序列具有转录性能的表达调控元件。
3.腺相关病毒(AAV)载体在制备治疗哺乳动物蛋白质表达或功能缺陷的药物中的应用，其中所述载体包含编码多肽的能纠正所述蛋白质表达或功能缺陷的异源多核苷酸，其中所述异源多核苷酸序列能操作地连接于使所述异源多核苷酸序列具有转录性能的表达调控元件；并且其中所述载体包含AAV-Rh74的如SEQ ID NO:1所示的VP1序列、如SEQ IDNO:3所示的VP2序列和如SEQ ID NO:4所示的VP3序列。
4.腺相关病毒(AAV)载体在制备用于将异源多核苷酸序列输送或转移至哺乳动物中或哺乳动物的细胞中的药物中的应用，其中所述哺乳动物对于AAV-Rh74是血清反应阴性的，且所述腺相关病毒载体包含AAV-Rh74的如SEQ ID NO:1所示的VP1序列、如SEQ ID NO:3所示的VP2序列和如SEQ ID NO:4所示的VP3序列。
5.腺相关病毒(AAV)载体和空衣壳AAV-Rh74在制备用于将异源多核苷酸序列输送或转移至哺乳动物中或哺乳动物的细胞中的药物中的应用，其中，所述腺相关病毒载体包含AAV-Rh74的如SEQ ID NO:1所示的VP1序列、如SEQ ID NO:3所示的VP2序列和如SEQ ID NO:4所示的VP3序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的应用，其中所述异源多核苷酸序列，或所述蛋白质在对所述哺乳动物具有治疗效果的水平表达。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的应用，其中所述腺相关病毒(AAV)载体相比于AAV2或AAV8增加了肝细胞的亲和性。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的应用，其中所述异源多核苷酸序列或所述蛋白质在所述哺乳动物的细胞、组织或器官中表达。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述细胞包括分泌细胞。
10.根据权利要求8所述的应用，其中所述细胞包括内分泌细胞。
11.根据权利要求8所述的应用，其中所述细胞包括肝细胞、神经细胞、神经胶质细胞、视网膜细胞、上皮细胞、肺细胞或全能性干细胞、亚全能干细胞或多能干细胞。
12.根据权利要求8所述的应用，其中所述哺乳动物的所述组织或所述器官包括肝、脑、中枢神经系统、脊髓、眼、视网膜或肺。
13.根据权利要求1至5中任一项所述的应用，其中所述哺乳动物产生蛋白质的量不足、或产生有缺陷的或异常的蛋白质。
14.根据权利要求13所述的应用，其中所述蛋白质包括囊性纤维化跨膜传导调节蛋白、血液凝固因子、抗体、视网膜色素上皮细胞特异性65kDa蛋白、LDL受体、脂蛋白脂肪酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、β-球蛋白、α-球蛋白、血影蛋白、α-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶、金属转运蛋白、磺酰胺酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、β-25葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、溶酶体氨基己糖苷酶、支链酮酸脱氢酶、激素、细胞因子、自杀基因产物、耐药相关蛋白、肿瘤抑制蛋白、具有免疫调节特性的肽、致耐受性或免疫原性肽或蛋白质Tregitope或hCDR1、葡萄糖激酶，鸟苷酸环化酶2D、Rab护送蛋白1、LCA-Lebercilin蛋白、鸟氨酸酮酸转氨酶、人视网膜劈裂蛋白1、尤塞氏综合征1C、X连锁视网膜色素变性GTP酶、MERTK、DFNB1、ACHM2、ACHM 3和ACHM4、PKD-1或PKD-2、TPP1、CLN2、溶酶体贮积症牵连的基因产物或一个或多个用于基因组编辑的锌指核酸酶、或用作用于基因组编辑的修复模板的供体序列。
15.根据权利要求14所述的应用，其中所述血液凝固因子是功能增强型血液凝固因子，所述激素是促红细胞生成素或胰岛素，所述细胞因子是生长因子、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、白介素-2、白介素-4、白介素12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子或淋巴毒素，所述自杀基因产物是单纯疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、细胞色素P450、脱氧胞苷激酶或肿瘤坏死因子。
16.根据权利要求15所述的应用，其中所述生长因子是胰岛素样生长因子1或胰岛素样生长因子2、血小板衍生的生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3和神经营养因子-4、脑源性神经营养因子、神经胶质源生长因子、转化生长因子α或转化生长因子β。
17.根据权利要求14所述的应用，其中，所述血液凝固因子是因子XIII、因子IX、因子X、因子VIII、因子VIIa或蛋白质C，所述金属转运蛋白是ATP7A或ATP7，所述肿瘤抑制蛋白是p53、Rb、Wt-1、NF1、冯·希佩尔-林道蛋白或腺瘤性结肠息肉病蛋白，所述鸟苷酸环化酶2D是LCA-GUCY2D，所述Rab护送蛋白1与无脉络膜症有关，所述鸟氨酸酮酸转氨酶与回旋形萎缩有关，所述人视网膜劈裂蛋白1与X连锁视网膜劈裂症有关，所述MERTK与AR形式的RP：视网膜色素变性有关，所述DFNB1与连接蛋白26耳聋有关，所述ACHM2、ACHM 3和ACHM 4与色盲有关，所述PKD-1或PKD-2与多囊性肾病有关，所述溶酶体贮积症牵连的基因产物是硫酸酯酶、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸转移酶、组织蛋白酶A、GM2-AP、NPC1、VPC2、或鞘脂激活蛋白。
18.根据权利要求13所述的应用，其中所述蛋白质包括涉及溶酶体贮积症的酶。
19.根据权利要求18所述的应用，其中所述涉及溶酶体贮积症的酶是ARSA。
20.根据权利要求1至5中任一项所述的应用，其中所述异源多核苷酸序列包括编码的多肽、肽或蛋白质的基因。
21.根据权利要求20所述的应用，其中所述基因编码治疗性的肽或蛋白质。
22.根据权利要求20所述的应用，其中所述基因编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白、血液凝固因子、抗体、视网膜色素上皮细胞特异性65kDa蛋白、LDL受体、脂蛋白脂肪酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、β-球蛋白、α-球蛋白、血影蛋白、α-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶、金属转运蛋白、磺酰胺酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、β-25葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、溶酶体氨基己糖苷酶、支链酮酸脱氢酶、激素、细胞因子、自杀基因产物、耐药相关蛋白、肿瘤抑制蛋白、具有免疫调节特性的肽、致耐受性或免疫原性肽或蛋白质Tregitope或hCDR1、葡萄糖激酶，鸟苷酸环化酶2D、Rab护送蛋白1、LCA-Lebercilin蛋白、鸟氨酸酮酸转氨酶、人视网膜劈裂蛋白1、尤塞氏综合征1C、X连锁视网膜色素变性GTP酶、MERTK、DFNB1、ACHM2、ACHM 3和ACHM 4、PKD-1或PKD-2、TPP1、CLN2、溶酶体贮积病牵连的基因产物或一个或多个用于基因组编辑的锌指核酸酶。
23.根据权利要求20所述的应用，其中所述基因包括用作基因组编辑的修复模板的供体序列。
24.根据权利要求22所述的应用，其中所述血液凝固因子是功能增强型血液凝固因子，所述激素是促红细胞生成素或胰岛素，所述细胞因子是生长因子、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、白介素-2、白介素-4、白介素12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子或淋巴毒素，以及所述自杀基因产物是单纯疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、细胞色素P450、脱氧胞苷激酶或肿瘤坏死因子。
25.根据权利要求24所述的应用，其中所述生长因子是胰岛素样生长因子1或胰岛素样生长因子2、血小板衍生的生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3和神经营养因子-4、脑源性神经营养因子、神经胶质源生长因子、转化生长因子α或转化生长因子β。
26.根据权利要求22所述的应用，其中，所述血液凝固因子是因子XIII、因子IX、因子X、因子VIII、因子VIIa或蛋白质C，所述金属转运蛋白是ATP7A或ATP7，所述肿瘤抑制蛋白是p53、Rb、Wt-1、NF1、冯·希佩尔-林道蛋白或腺瘤性结肠息肉病蛋白，所述鸟苷酸环化酶2D是LCA-GUCY2D，所述Rab护送蛋白1与无脉络膜症有关，所述鸟氨酸酮酸转氨酶与回旋形萎缩有关，所述人视网膜劈裂蛋白1与X连锁视网膜劈裂症有关，所述MERTK与AR形式的RP：视网膜色素变性有关，所述DFNB1与连接蛋白26耳聋有关，所述ACHM2、ACHM 3和ACHM 4与色盲有关，所述PKD-1或PKD-2与多囊性肾病有关，所述溶酶体贮积症牵连的基因产物是硫酸酯酶、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸转移酶、组织蛋白酶A、GM2-AP、NPC1、VPC2、或鞘脂激活蛋白。
27.根据权利要求1所述的应用，其中所述异源多核苷酸序列包括抑制性核酸。
28.根据权利要求27所述的应用，其中所述抑制性核酸包括micro-RNA(miRNA)、siRNA、shRNA、反式剪接RNA、反义RNA或三链形成RNA。
29.根据权利要求27所述的应用，其中所述抑制性核酸结合到致病基因，致病基因的转录物，或与多核苷酸重复性疾病有关的基因转录物，或与以下相关的基因：齿状核红核苍白球路易体萎缩症、脊髓延髓肌萎缩症中在X染色体上的雄激素受体、人类脊髓小脑共济失调蛋白-1、人类脊髓小脑共济失调蛋白-2、人类脊髓小脑共济失调蛋白-3、和人类脊髓小脑共济失调蛋白-7、由CACNA1A编码的P/Q型电压依赖性钙通道Cav2.1、TATA结合蛋白、也称为ATXN8OS的脊髓小脑共济失调蛋白8反义链、脊髓小脑性共济失调中的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A 55kDa调节亚基B的β同种型、脆性X综合征中的FMR1、脆性X相关震颤和/或共济失调综合征中的FMR1或脆性XE的智力低下中的FMR1或AF4/FMR2家族成员2；强直性肌营养不良中的肌强直素蛋白激酶；弗里德赖希共济失调中的Frataxin；肌萎缩侧索硬化中的超氧化物歧化酶1基因突变体；涉及帕金森氏病和/或阿尔茨海默氏病的发病机制的基因；载脂蛋白B和前蛋白转化酶枯草溶菌素/可欣型9、高胆固醇血症；HIV Tat，HIV感染中的人类免疫缺陷病毒反式激活的转录基因；HIV TAR，HIV感染中的人类免疫缺陷病毒反式激活反应元件基因；HIV感染中的C-C趋化因子受体；RSV感染中的劳斯肉瘤病毒核衣壳蛋白、丙型肝炎病毒感染中的肝特异性microRNA；p53，急性肾损伤或肾移植术后移植肾功能延迟恢复或肾损伤的急性肾功能衰竭；提前复发或转移性实体肿瘤中的蛋白激酶N3；LMP2，LMP2也被称为蛋白酶体亚基β-型9，转移性黑色素瘤；LMP7，也被称为蛋白酶体亚基β-型8，转移性黑素瘤；MECL1，也被称为蛋白酶体亚基β-型10，转移性黑素瘤；实体肿瘤中的血管内皮生长因子；实体肿瘤中的纺锤体驱动蛋白、慢性髓性白血病中的细胞凋亡抑制基因B-细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤；实体肿瘤中的核糖核苷酸还原酶M2；实体肿瘤中的弗林蛋白酶；肝肿瘤中的Polo样激酶1、丙型肝炎感染中的二酰基甘油酰基转移酶1、家族性腺瘤性息肉病中的β-连环蛋白；青光眼中的β2肾上腺素受体；糖尿病性黄斑水肿或年龄相关性黄斑变性中的RTP801/Redd1，也称为DNA损伤诱导转录蛋白4；年龄相关性黄斑变性或脉络膜新生血管性疾病中的血管内皮生长因子受体I、非动脉炎性缺血性视神经病变中的胱天蛋白酶2；先天性厚甲症中的角蛋白6A N17K突变蛋白；流感感染中的A型流感病毒基因组/基因序列；严重急性呼吸综合征感染中的SARS冠状病毒基因组/基因序列；呼吸道融合病毒感染中的呼吸道合胞病毒基因组/基因序列；埃博拉病毒感染中的埃博拉纤维病毒基因组/基因序列；乙型和丙型肝炎病毒感染中的乙型和丙型肝炎病毒基因组/基因序列；单纯疱疹病毒感染中的HSV基因组/基因序列、柯萨奇病毒B3感染中的柯萨奇病毒B3基因组/基因序列；原发性肌张力障碍中的基因的致病等位基因的沉默、移植中的特异性泛I类和HLA等位基因；或常染色体显性遗传性色素性视网膜炎中的视紫红质的突变基因。
30.根据权利要求29所述的应用，其中，所述抑制性核酸结合到亨廷顿基因。
31.根据权利要求29所述的应用，其中，所述与齿状核红核苍白球路易体萎缩症相关的基因是atrophin1基因，其中与原发性肌张力障碍相关的基因编码耐扭蛋白A，所述脊髓小脑性共济失调中的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A 55kDa调节亚基B的β同种型是1型、2型、3型、6型、7型、8型或12 17型，所述脆性X综合征中的FMR1是脆性X智力低下1基因，所述脆性X相关震颤和/或共济失调综合征中的FMR1是脆性X智力低下1基因，所述脆性XE的智力低下中的FMR1是脆性X智力低下2基因，所述HIV感染中的C-C趋化因子受体是CCR5，所述丙型肝炎病毒感染中的肝特异性microRNA是miR-122，所述原发性肌张力障碍中的基因的致病等位基因的沉默是等位基因特异性沉默。
32.根据权利要求1至5中任一项所述的应用，其中所述哺乳动物有肺病、血液疾病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性侧索硬化症、癫痫症、溶酶体贮积症、铜或铁的蓄积失调、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、神经疾病或神经退行性疾病、癌症、1型或2型糖尿病、高歇氏病、赫尔勒氏症、腺苷脱氨酶缺乏症、代谢缺陷、视网膜退行性疾病、实体器官的疾病、或感染病毒、细菌或真菌疾病。
33.根据权利要求32所述的应用，其中所述血液疾病是出血性疾病或贫血。
34.根据权利要求33所述的应用，其中，所述肺病为囊性纤维化，所述出血性疾病为有或无抑制剂的血友病A或血友病B，所述贫血为地中海贫血，所述铜或铁的蓄积失调为威尔森氏或门克斯病，所述代谢缺陷为糖原贮积病，所述视网膜退行性疾病为RPE65缺乏、无脉络膜或眼睛的其它疾病，所述实体器官为脑、肝、肾或心脏，所述病毒为乙型肝炎、丙型肝炎或HIV病毒。
35.根据权利要求1至5中任一项所述的应用，其中所述表达调控元件包括组成型调控元件或调节型调控元件。
36.根据权利要求1至5中任一项所述的应用，其中所述表达调控元件包括组织特异性表达调控元件或启动子。
37.根据权利要求1至5中任一项所述的应用，其中所述AAV载体被制备成通过静脉给药、动脉内给药、肌内给药、皮下给药、口服给药、通过插管给药、经导管给药、经皮给药、内颅给药、经由吸入给药、腔内给药、或粘膜给药。
38.根据权利要求1至5中任一项所述的应用，其中所述哺乳动物是人。
39.根据权利要求1至5中任一项所述的应用，其中所述哺乳动物对除了AAV-Rh74以外的AAV血清型是血清反应阳性的。
40.根据权利要求1至5中任一项所述的应用，其中所述哺乳动物对AAV血清型AAV1、AAV血清型AAV2、AAV血清型AAV3、AAV血清型AAV4、AAV血清型AAV5、AAV血清型AAV6、AAV血清型AAV7、AAV血清型AAV8、AAV血清型AAV9、AAV血清型AAV10或AAV血清型AAV11是血清反应阳性的。
41.根据权利要求1至3或5中任一项所述的应用，其中所述哺乳动物对AAV-Rh74是血清反应阴性的。
42.根据权利要求1至4中任一项所述的应用，其进一步包括空衣壳AAV在制备药物中的应用。
43.根据权利要求1至4中任一项所述的应用，其进一步包括空衣壳AAV-Rh74的应用。
44.根据权利要求1至4中任一项所述的应用，其中所述AAV载体被包含在药物组合物中。
45.根据权利要求44所述的应用，其中药物组合物包含空衣壳AAV。
46.根据权利要求44所述的应用，其中药物组合物包含空衣壳AAV-Rh74。
47.根据权利要求5所述的应用，其中所述AAV载体被包含在药物组合物中。
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