KR20180053335A - 아데노-관련 바이러스 인자 viii 벡터, 연합된 바이러스 입자 및 이를 포함하는 치료학적 제형 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아데노-관련 바이러스(AAV) 인자 VIII(FVIII)-암호화/발현 벡터, 및 고발현 활성을 갖는 AAV FVIII 벡터 및 전장 또는 절단된 기능적 FVIII 단백질을 발현하는 AAV FVIII 벡터를 포함하는 바이러스를 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 AAV FVIII 벡터의 제조 방법, 상기 벡터를 포함하거나 발현하는 재조합체 AAV FVIII 바이러스 입자, 이를 포함하는 관련된 약제학적 제형 및 이의 치료학적 용도에 관한 것이다.
Description
본원은 2015년 9월 24일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/232,242호, 2016년 4월 15일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/323,182호 및 2016년 7월 22일자로 출원된 미국 가출원 번호 제62/365,544호의 우선권 이득을 주장하고 이들은은 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
발명의 분야
본 발명은 고발현 활성을 갖는 AAV FVIII 벡터 및 전장 또는 절단된 기능적 FVIII 단백질을 발현하는 AAV-FVIII 벡터를 포함하는, 아데노-관련 바이러스 (AAV) 인자 VIII (FVIII) 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 AAV FVIII 벡터의 제조 방법, 상기 벡터를 포함하거나 발현하는 재조합체 AAV FVIII 바이러스 입자, 이를 포함하는 관련된 약제학적 제형 및 이의 치료학적 용도에 관한 것이다.
아데노-관련 바이러스 (AAV)는 인간 및 일부 다른 영장류 종을 감염시키는 소형 복제-결함 비-외피 동물 바이러스이다. AAV의 몇가지 특징은 이 바이러스를 유전자 치료요법에 의해 치료학적 단백질을 전달하기 위한 매력적인 비히클이 되게 하며, 이는 예를 들어, AAV는 인간 질환을 일으키고 경미한 면역 반응을 유도하는 것으로 공지되어 있지 않으며, AAV 벡터는 숙주 세포 게놈에 통합하는 것 없이 분열 및 정지 세포 둘 다를 감염시킬 수 있음을 포함한다. AAV를 사용하는 유전자 치료요법 벡터는, 예를 들어, 혈우병 B의 치료를 위해 간에 인간 인자 IX (FIX)의 전달을 위한 일부 임상 시험에서 성공적으로 사용되었다 (문헌참조: Nathwani 등, New Engl. J. Med. 365:2357-2365, 2011).
그러나, AAV 유전자 치료요법 벡터에는 몇몇 단점이 있다. 특히, AAV 벡터의 클로닝 능력은 바이러스의 DNA 팩키징 능력의 결과로서 제한된다. 야생형 AAV의 단일-가닥 DNA 게놈은 약 4.7 킬로베이스 (kb)이다. 실제로, 약 5.0 kb 이하의 AAV 게놈은 AAV 바이러스 입자로 완전히 팩키징되는 것, 즉, 전장되는 것으로 보인다. AAV 벡터에서 핵산 게놈은 약 145 염기의 2개의 AAV 역위 말단 반복체 (ITR)룰 가져야한다는 요구에 따라, AAV 벡터의 DNA 팩키징 능력은 최대 약 4.4 kb의 단백질-암호화 서열이 캡시드화될 수 있는 것이다.
이러한 크기 제약으로 인해, 큰 치료학적 유전자, 즉, 약 4.4 kb 초과 길이의 유전자는 일반적으로 AAV 벡터에서 사용하기에 적합하지 않다. 하나의 이러한 치료학적 유전자는 인자 VIII (FVIII) 유전자이며 이는 N-말단으로부터 C-말단까지 19 아미노산 신호 펩타이드, 및 3개의 큰 도메인 (즉, 중쇄 또는 A 도메인, 중앙 또는 B 도메인, 및 경쇄 또는 C 도메인)을 포함하는 2332 아미노산의 폴리펩타이드를 암호화하는 약 7.0 kb의 mRNA를 갖는다. FVIII에 대한 AAV 벡터 크기 제한을 극복하기 위해 사용된 하나의 전략은 2개의 AAV 벡터를 사용하는 것인데, 하나는 중쇄 또는 A 도메인을 암호화하고, 나머지 하나는 경쇄 또는 C 도메인을 암호화한다 (참조: 예를 들어, Coutu 등, U.S. Pat. Nos. 6,221,349, 6,200,560 및 7,351,577). 이 크기 제약을 피하기 위한 또 다른 전략은 단백질의 중심 부분 또는 B 도메인이 결실되고 SQ 서열로 공지되어 있는 14 아미노산 링커로 대체된 FVIII를 암호화하는 AAV 벡터를 생성하는 것이었다 (문헌참조: Ward 등, Blood 117:798-807, 2011, 및 McIntosh 등, Blood 121:3335-3344, 2013).
> 5.0 kb의 AAV 게놈을 갖는 AAV 벡터가 문헌에 보고되어 있지만, 이러한 많은 경우에 암호화된 유전자의 5’또는 3' 말단은 절단된 것으로 보인다 (참조: Hirsch 등, Molec. Ther. 18:6-8, 2010 및 Ghosh 등, Biotech. Genet. Engin. Rev. 24:165-178, 2007). 그러나, 중첩된 상동성 재조합이 5’말단 절단 및 3' 말단 절단을 갖는 핵산 사이의 AAV 감염 세포에서 일어나서 큰 단백질을 암호화하는 “완전한”핵산이 생성되어, 이로써 기능적 전장 유전자를 재구성하는 것으로 밝혀졌다.
A형 혈우병의 치료를 위한 유전자 치료요법 접근법에 유용한, 기능적 인자 VIII 단백질을 암호화하는 신규한 AAV 벡터, 및 이를 포함하는 재조합체 AAV 바이러스 입자가 필요하다. 이와 같이, 본 발명은 재조합체 AAV 바이러스가 치료학적 단백질을 암호화하는 전체 핵산, 즉, 완전히 팩키징된 AAV FVIII 벡터를 캡시드화하는 기능적으로 활성인 FVIII를 암호화하여, 이로써 오버사이즈 게놈의 상기 언급된 문제를 피하거나, 적어도 절단될 수 있거나 절단될 수 없는 기능적으로 활성인 인자 VIII 단백질을 생성하는 AAV 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 고 FVIII 발현 활성을 갖는 AAV FVIII 벡터의 제조에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 AAV 인자 VIII 벡터 및/또는 본원에 기재된 AAV FVIII 벡터 중 어느 하나를 포함하는 재조합체 인자 VIII AAV 입자/바이러스를 포함하는 약제학적 제형, 관련된 약제학적 제형, 및 A형 혈우병를 앓고 있는 대상체에서 이의 치료를 위한 관련된 투여 방법에 관한 것이다.
발명의 요약
본 발명은 기능적으로 활성인 FVIII를 암호화하는 AAV 벡터 (본원에서 "AAV FVIII 벡터"로서 언급됨)를 제공한다. 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 기능적FVIII 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 도입된 AAV 바이러스의 비-천연적으로 발생하는 유도체를 포함한다. 기능적으로 활성인 FVIII를 암호화하는 게놈은 바람직하게 최대 7.0 kb 길이, 보다 바람직하게 최대 6.5 kb 길이, 보다 더 바람직하게 최대 6.0 kb 길이, 보다 더 바람직하게 최대 5.5 kb 길이, 보다 더 바람직하게 최대 5.0 kb 길이이고, 강화된 프로모터 기능을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은 "기능적으로 활성인 FVIII"는 배양된 세포에서 발현될 때 시험관내 또는 세포 또는 체내 조직에서 발현될 때 생체내 야생형 FVIII 단백질의 기능을 갖는 FVIII 단백질이다. 이것은, 예를 들어, 혈액 응고 캐스케이드에 기능적으로 기여하고/하거나 A형 혈우병를 앓고 있는 대상체에서 혈액이 응고하는데 걸리는 시간을 감소시키는 것을 포함한다. 야생형 FVIII는 칼슘 이온과 인지질의 존재하에 인자 X (Fx)를 활성화된 FX (Fxa)로 전환시키는 복합체를 형성하는, 활성화된 FIX (FIXa)에 대한 보조-인자로서 작용하는 응고 캐스케이드를 통해 혈액 응고에 관여한다. 따라서, 기능적으로 활성인 FVIII는 FX를 Fxa로 전환시킬 수 있는, FIXa와 복합체를 형성할 수 있다. 기능적으로 활성인 FVIII 단백질의 일례는 본원에 참조로 인용된 WO 2015/038625에 기재된 바와 같은 FVIII SQ 단백질이다.
본원에 사용된 바와 같은 "AAV 벡터"는 AAV 바이러스 게놈, 즉, 하나 이상의 프로모터 및/또는 인핸서 및, 임의로, 폴리아데닐화 서열 및/또는 단백질-암호화 서열의 엑손 사이에 삽입된 하나 이상의 인트론에 이종인 전사 조절 요소에 작동적으로 연결된, AAV 5’역위 말단 반복체 (ITR) 서열 및 단백질-암호화 서열 (바람직하게는 기능적 인자 VIII-암호화 서열)에 플랭킹한 AAV 3’ITR을 갖는 단일-가닥 또는 이중-가닥인 핵산을 언급한다. 단일-가닥 AAV 벡터는 AAV 바이러스 입자의 게놈에 존재하는 핵산을 언급하며, 본원에 개시된 핵산 서열의 센스 가닥 또는 안티-센스 가닥일 수 있다. 그러한 단일-가단 핵산의 크기는 염기로 제공된다. 이중-가닥 AAV 벡터는 AAV 벡터 핵산을 발현 또는 전달하는데 사용되는, 플라스미드, 예를 들어, pUC19의 DNA, 또는 이중-가닥 바이러스, 예를 들어, 바큘로바이러스의 게놈에 존재하는 핵산을 언급한다. 상기 이중-가닥 핵산의 크기는 염기 쌍 (bp)으로 존재한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "역위 말단 반복체 (ITR)"는 DNA 복제이 오리진으로서 그리고 바이러스 게놈에 대한 팩키징 신호로서 시스로 기능하는 AAV 게놈의 5’및 3' 말단에서 발견된 당업계에서 인정된 영역을 언급한다. AAV rep 암호화 영역과 함께 AAV ITR은 2개의 플랭킹 ITR 사이에 삽입된 뉴클레오타이드 서열을 숙주 세포 게놈으로 효율적으로 절단 및 구조하고 이를 통합하는 것을 제공한다. 특정 AAV-관련 ITR의 서열은 문헌 (참조: Yan 등, J. Virol. 79(1):364-379 (2005))에 개시되어 있으며 이는 전문이 본원에 참조로 인용된다. 본원에서 용도를 발견한 ITR 서열은 기능적 능력을 보유하는 전장, 야생형 AAV ITR 또는 이의 단편일 수 있거나, 복제 기원으로서 시스에 기능할 수 있는 전장, 야생형 AAV ITR의 서열 변이체일 수 있다. 본 발명의 재조합체 AAV FVIII 벡터에 유용한 AAV ITR은 임의의 공지된 AAV 혈청형으로부터 유래할 수 있고, 특정 바람직한 구현예에서, AAV2 또는 AAV5 혈청형으로부터 유래할 수 있다.
"전사 조절 요소"는 프로모터 + 반응 요소, 활성제 및 RNA 폴리머라제 결합과 발현 촉진을 돕기 위해 전사 인자의 결합을 위한 인핸서 서열, 및 RNA 폴리머라제 부착을 차단하고 발현을 방지하기 위해 리프레서 단백질이 결합된 오퍼레이터 또는 사일런스 서열을 포함하는 유전자 전사의 조절에 관여하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다. 용어 "간 특이적 전사 조절 요소"는 간 조직에서 특이적으로 유전자 발현을 조절하는 조절 요소를 언급한다. 간 특이적 조절 요소의 예는 마우스 티레틴 프로모터 (mTTR), 내인성 인간 인자 VIII 프로모터 (F8), 인간 알파-1-항트립신 프로모터 (hAAT) 및 이의 활성 단편, 인간 알부민 최소 프로모터, 및 마우스 알부민 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. Enh1과 함께 EBP, DBP, HNF1, HNF3, HNF4, HNF6과 같은 간 특이적 전사 인자 결합 부위로부터 유래된 인핸서도 고려된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 14 아미노산 SQ 서열에 의해 대체된 B 도메인을 갖는 기능적으로 활성인 FVIII 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다. SQ 서열은 문헌 (참조: Ward 등, Blood, 117:798-807, 2011, McIntosh 등, Blood 121:3335-3344, 2013, WO 2013/186563 및 WO 2015/038625)에 개시되어 있다. FVIII 암호화 영역 서열은 코돈-최적화된 FVIII-암호화 서열 (참조: 예를 들어, WO 2011/005968 (공개일: 2011년 1월 13일), WO 2015/038625 (공개일: 2015년 3월 19일), 및 McIntosh 등, Blood 121:3335-3344, 2013, 이들은 이들의 전문이 본원에 참조로 인용되어 있음)일 수 있다. 바람직한 구현예에서, AAV 벡터 또는 재조합체 AAV 바이러스 입자의 기능적으로 활성인 인간 FVIII 단백질을 암호화하는 핵산은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 403 내지 4776으로 이루어진다. 상기 서열은 본원에서 "FVIII - SQ"로 연급된다.
제1 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 도 2a에 개략적으로 도시되어 있는 프로토 1을 포함하며, 서열번호 1에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
제2 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 도 2b에 개략적으로 도시되어 있는 프로토 1S를 포함하며, 서열번호 2에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
제3 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 도 2c에 개략적으로 도시되어 있는 프로토 2S를 포함하며, 서열번호 3에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
제4 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 도 2d에 개략적으로 도시되어 있는 프로토 3S를 포함하며, 서열번호 4에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 SQ 서열을 포함하는 전체 B 도메인, 및 경쇄 또는 C 도메인의 단지 N-말단에 위치하는 a3 도메인이 없는 기능적 FVIII를 암호화하는 핵산을 포함한다. FVIII 암호화 영역 서열은 코돈-최적화된 서열 (참조: 예를 들어, WO 2011/005968 (공개일: 2011년 1월 13일), WO 2015/038625 (공개일: 2015년 3월 19일), 및 McIntosh 등, Blood 121:3335-3344, 2013)일 수 있다.
제1 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 도 3a에 개략적으로 도시되어 있는 프로토 4를 포함하며, 서열번호 5에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
제2 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 도 3b에 개략적으로 도시되어 있는 프로토 5를 포함하며, 서열번호 6에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
제3 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 도 3c에 개략적으로 도시되어 있는 프로토 6을 포함하며, 서열번호 7에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
제4 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 도 3d에 개략적으로 도시되어 있는 프로토 7을 포함하며, 서열번호 8에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 AAV2 5’역위 말단 반복체 (ITR) (당업계에 공지된 바와 같이 변형될 수도 있거나 변형되지 않을 수도 있음)를 포함하는 핵산, 간-특이적 전사 조절 영역, 코돈-체적화된 기능적으로 활성인 FVIII 암호화 영역, 임의로 하나 이상의 인트론, 폴리아데닐화 서열, 및 AAV2 3’ITR (당업계에 공지된 바와 같이 변형될 수도 있거나 변형되지 않을 수도 있음)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 간-특이적 전사 조절 영역은 짧아진 ApoE 인핸서 서열, 5’비해독된 영역 (UTR)의 42 염기를 포함하는 186 염기 인간 알파 항-트립신 (hAAT) 근위 프로모터, 및 (i) 34 염기 인간 ApoE/C1 인핸서, (ii) 32 염기 인간 AAT 프로모터 원위 X 영역 및 (iii) 인간 AAT 근위 프로모터의 원위 요소의 80 추가의 염기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 인핸서; 및 FVIII - SQ 변이체를 암호화하는 코돈-체적화된 기능적으로 활성인 FVIII 암호화 영역을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 간 특이적 전사 조절 영역은 α1-마이크로글로불린 인핸서 서열 및 186 염기 인간 알파 항-트립신 (AAT) 근위 프로모터를 포함한다.
제1 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 9에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 100ATG를 포함한다.
제2 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 10에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 100ATG bGH poly A를 포함한다.
제3 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 11에 제시된 작제물 100ATG 짧은 bGH polyA 서열을 포함한다.
제4 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 12에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 103ATG를 포함한다.
제5 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 13에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 103ATG 짧은 bGH poly A를 포함한다.
제6 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 14에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 105ATG 짧은 bGH poly A를 포함한다.
제7 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 15에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 1DC172ATG FVIII를 포함한다.
제8 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 16에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 DC172ATG FVIII hAAT를 포함한다.
제9 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 17에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 DC172 2xHCR ATG FVIII를 포함한다.
제10 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 18에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 DC172 2xHCR ATG FVIII hAAT를 포함한다.
제11 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 19에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 2x SerpinA hAAT ATG FVIII를 포함한다.
제12 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 20에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 2x SerpinA hAAT ATG FVIII 2x μ-글로불린 인핸서를 포함한다.
제13 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 21에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 100ATG 짧은 polyA 2x μ-글로불린 인핸서를 포함한다.
제14 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 22에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 인자 VIII-BMN001을 포함한다.
제15 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 23에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 인자 VIII-BMN002를 포함한다.
제16 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 24에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 99를 포함한다.
제17 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 25에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 100을 포함한다.
제18 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 26에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 100 역 배향을 포함한다.
제19 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 27에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 100AT를 포함한다.
제20 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 28에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 100AT 2x MG를 포함한다.
제21 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 29에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 100AT 2x MG bGH polyA를 포함한다.
제22 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 30에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 100AT 2x MG (역) bGH polyA를 포함한다.
제23 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 31에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 100 bGH poly A를 포함한다.
제24 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 32에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 100-400을 포함한다.
제25 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 33에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 101을 포함한다.
제26 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 34에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 102를 포함한다.
제27 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 35에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 103을 포함한다.
제29 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 36에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 103 역 배향을 포함한다.
제30 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 37에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 103AT를 포함한다.
제31 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 38에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 103AT 2xMG를 포함한다.
제32 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 39에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 103AT 2xMG bGH polyA를 포함한다.
제33 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 40에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 103 bGH poly A를 포함한다.
제34 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 41에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 104를 포함한다.
제35 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 42에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 105를 포함한다.
제36 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 43에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 106을 포함한다.
제37 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 44에 제시된 핵산 서열을 포함하는 작제물 106AT를 포함한다.
제38 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV 벡터는 서열번호 45에 제시된 핵산 서열을 포함하는 p-100 ATGB를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 기능적 인자 VIII 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터 작제물에 관한 것이며, 여기서, 상기 작제물은 하나 이상의 상이한 배향(들)으로 상기 기재된 작제물 및 이의 조합의 개별적인 요소를 하나 이상을 포함한다. 본 발명은 또한 반대 배향으로 상기 기재된 작제물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 AAV FVIII 벡터를 포함하는 재조합체 AAV 바이러스 입자 및 A형 혈우병의 치료를 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
단일 가닥 형태의 본 발명의 AAV 벡터는 약 7.0 kb 미만 길이이거나, 6.5 kb 미만 길이이거나, 6.4 kb 미만 길이이거나, 6.3 kb 미만 길이이거나, 6.2 kb 미만길이이거나, 6.0 kb 미만 길이이거나, 5.8 kb 미만 길이이거나, 5.6 kb 미만 길이이거나, 5.5 kb 미만 길이이거나, 5.4 kb 미만 길이이거나, 5.4 kb 미만 길이이거나, 5.2 kb 미만 길이이거나, 5.0 kb 미만 길이이다. 단일 가닥 형태의 본 발명의 AAV 벡터는 약 5.0 kb 내지 약 6.5 kb 길이, 또는 약 4.8 kb 내지 약 5.2 kb 길이, 또는 4.8 kb 내지 5.3 kb 길이, 또는 약 4.9 kb 내지 약 5.5 kb 길이, 또는 약 4.8 kb 내지 약 6.0 kb 길이, 또는 약 5.0 kb 내지 6.2 kb 길이, 또는 약 5.1 kb 내지 약 6.3 kb 길이, 또는 약 5.2 kb 내지 약 6.4 kb 길이, 또는 약 5.5 kb 내지 약 6.5 kb 길이에 이른다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 AAV 벡터를 포함하는 재조합체 아데노-관련 바이러스 (AAV) 입자를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 임의의 AAV 벡터로 형질감염된 세포 (다양한 AAV cap 및 rep 유전자와 연합하여)를 배향하는 단계 및 상기 형질감염된 세포의 상등액으로부터 재조합체 AAV FVIII 바이러스 입자를 회수하는 단계를 포함한다.
재조합체 AAV 생산에 유용한 본 발명의 세포는 하이 파이브 (High Five), Sf9, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf9, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, BM-N, Ha2302, Hz2E5 및 Ao38과 같은 곤충 세포를 포함하는, 바큘로바이러스 감염에 민감한 임의의 세포 유형이다. 사용된 바람직한 포유동물 세포는 HEK293, HeLa, CHO, NS0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19 및 MRC-5일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 AAV 벡터 또는 본 발명의 상기 방법에 의해 제조된 임의의 바이러스 입자를 포함하는 재조합체 바이러스 입자를 제공한다.
"AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자" 또는 "AAV 바이러스"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질로 구성된 바이러스 입자 및 본원에 기재된 바와 같은 캡시드화된 폴리뉴클레오타이드 AAV 벡터에 관한 것이다. 입자가 이종성 폴리뉴클레오타이드 (즉, 포유동물 세포에 전달되는 전이유전자와 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드)를 포함하는 경우, 이는 전형적으로 "AAV 벡터 입자" 또는 간단히 "AAV 벡터"로 언급된다. 따라서, AAV 벡터 입자의 제조는 반드시 AAV 벡터의 제조를 포함하고, 이와 같이 벡터는 AAV 벡터 입자 내에 함유된다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 AAV 벡터를 포함하는 세포, 및 본 발명의 이들 세포에 의해 제조된 바이러스 입자를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 AAV 벡터, 또는 본 발명의 바이러스 입자 또는 본 발명의 방법에 의해 제조된 바이러스 입자 중 어느 하나를 환자에게 투여함을 포함하여 A형 혈우병를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 AAV 벡터, 또는 본 발명의 바이러스 입자 또는 본 발명의 방법에 의해 제조된 바이러스 입자 중 어느 하나를 대상체에게 투여함을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 순환하는 FVIII 단백질 수준을 증가시키는 방법을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 AAV 벡터, 또는 본 발명의 바이러스 입자 또는 본 발명의 방법에 의해 제조된 바이러스 입자 중 어느 하나를 대상체에게 투여함을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 FVIII 단백질의 발현을 유도하는 방법을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 AAV 벡터, 또는 본 발명의 바이러스 입자 또는 본 발명의 방법에 의해 제조된 바이러스 입자를 대상체에게 투여함을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 FVIII 단백질 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 치료학적 유효량의 상기 재조합체 AAV FVIII 바이러스의 투여 후에 상기 대상체의 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체의 부재 또는 존재를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 대상체의 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체의 존재의 결정을 수행한 후에 상기 대상체에 유효량의 코르티코스테로이드를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 본 발명의 임의의 방법을 제공한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 A형 혈우병의 치료를 위한 약물을 제조하기 위한, 본 발명의 본 발명의 AAV 벡터 또는 재조합체 AAV 바이러스 입자 중 어느 하나의 용도를 제공한다. 하나의 양상에서, 상기 약물은 일정량의 AAV 벡터 또는 A형 혈우병를 치료하기 위한 유효량으로 인간 FVIII를 발현하는 재조합체 AAV FVIII 바이러스 입자를 포함한다. 본 발명은 또한 약물의 투여 후에, 대상체의 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체의 부재 또는 존재가 결정되는 본 발명의 임의의 용도를 제공한다. 대상체가 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체를 갖는 것으로 결정되는 경우, 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체를 갖는 대상체에 투여하기 위한 약물의 제조를 위한 유효량의 코르티코스테로이드의 용도.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 A형 혈우병를 치료하기 위한 본 발명의 AAV 벡터 또는 재조합체 AAV 바이러스 입자 중 어느 하나를 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 A형 혈우병를 치료하기 위한 유효량으로 인간 FVIII를 발현하는 일정량의 AAV 벡터 또는 재조합체 AAV 바이러스 입자를 포함한다. 또한, 본 발명의 임의의 조성물은 상기 조성물의 투여 후에 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체를 갖는 것으로 결정된 대상체에서 유효량의 코르티코스테로이드와 함께 투여된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 A형 혈우병를 앓고 있는 환자를 치료하는데 유용한 AAV 바이러스 입자를 제조하기 위해 사용된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 재조합체 FVIII-암호화 AAV 바이러스 입자를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 보다 구체적으로, 특정 양상에서, 본 발명은 재조합체 AAV FVIII-암호화 바이러스, 완충제, 등장화제, 증량제 및 계면활성제를 포함하는 약제학적 제형에 관한 것이다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 약제학적 제형은 AAV5-FVIII-SQ, p-100 ATGB 또는 본원에 기재된 임의의 다른 벡터를 포함하고/하거나 적어도 2주 동안 ≤ 65 ℃에서 저장 동안에 안정하다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 약제학적 제형은 약 0.1 mg/ml 내지 약 3 mg/ml의 농도에서 제이인산나트륨, 약 0.1 mg/ml 내지 약 3 mg/ml의 농도에서 제일인산나트륨 일수화물, 약 1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도에서 염화나트륨, 약 5 mg/ml 내지 약 40 mg/ml의 농도에서 만니톨, 및 약 0.1 mg/ml 내지 약 4 mg/ml의 농도에서 폴록사머 188을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 약제학적 제형은 약 1.42 mg/ml의 농도에서 제이인산나트륨, 약 1.38 mg/ml의 농도에서 제일인산나트륨 일수화물, 약 8.18 mg/ml의 농도에서 염화나트륨, 약 20 mg/ml의 농도에서 만니톨, 및 약 2 mg/ml의 농도에서 폴록사머 188을 포함한다. 본 발명의 약제학적 제형은 액체 형태일 수 있고 약 1E12 vg/ml 내지 약 2E14 vg/ml의 농도에서, 보다 바람직하게 약 2E13 vg/ml의 농도에서 AAV FVIII 바이러스 입자를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 약제학적 제형은 A형 혈우병를 앓는 인간에게 정맥내 투여하는데 유용하다.
본 발명은 또한, 임의로 상기된 바와 같이 제형화될 수 있는 치료학적 유효량의 재조합체 AAV FVIII 바이러스를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 A형 혈우병를 앓는 대상체를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, A형 혈우병를 앓는 대상체는 인간이다. 하나의 구현예에서, 재조합체 AAV FVIII 바이러스는 AAV5-FVIII-SQ이다. 하나의 구현예에서, 투여하는 단계는 정맥내 (IV) 투여에 의해 성취된다. 본 발명의 특정 양상에서, 투여하는 단계는 대상체의 혈류 중에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상 IU/dl의 인자 VIII 단백질, 바람직하게 대상체의 혈류 중에 적어도 약 5 IU/dl의 인자 VIII 단백질의 발현을 유도한다. 특정 구현예에서, 투여하는 단계는 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 주에 대상체의 혈류 중에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상 IU/dl의 인자 VIII 단백질의 발현을 유도한다. 특정 구현예에서, 대상체에게 투여되는 치료학적 유효량의 AAV FVIII 바이러스는 적어도 2E13 vg/kg 체중, 때때로 적어도 6E13 vg/kg 체중이다. 특정 구현예에서, 치료학적 유효량의 AAV FVIII 바이러스의 투여에 추가로, 대상체는 AAV FVIII 바이러스의 투여와 연관된 임의의 간독성을 예방하고/하거나 치료하기 위해 예방학적으로, 치료학적으로, 또는 둘 다로 코르티코스테로이드로 처리한다. 하나의 구현예에서, 연관된 간독성은 기준선 (즉, FVIII AAV를 사용한 투여 전) 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 수준을 처리 후 ALT 수준과 비교함에 의해 측정되고, 여기서, 투여 후 ALT 수준에서의 증가는 연관된 간독성의 증거이다. 예방학적 코르티코스테로이드 처리는 대상체에서 간독성을 예방하고/하거나 측정된 ALT 수준에서의 증가를 예방하기 위한 코르티코스테로이드의 투여를 언급하다. 치료학적 코르티코스테로이드 처리는 AVV FVIII 바이러스의 투여에 의해 유발된 간독성을 감소시키고/시키거나 AAV FVIII 바이러스의 투여에 의해 유발되는 대상체의 혈류에서 상승된 ALT 농도를 감소시키기 위한 코르티코스테로이드의 투여를 언급한다. 특정 구현예에서, 예방학적 또는 치료학적 코르티코스테로이드 처리는 대상체에게 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 이상의 mg/일의 코르티코스테로이드의 투여를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체의 예방학적 또는 치료학적 코르티코스테로이드 처리는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주 이상의 연속 기간 동안 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 A형 혈우병를 앓는 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 치료학적 유효량의 재조합체 AAV FVIII 바이러스를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, AAV FVIII 바이러스는 AAV5-FVIII-SQ이다. 또 다른 구현예에서, AAV FVIII 바이러스는 p-100 ATGB 벡터를 포함한다. 조성물은 임의로 상기된 바와 같이 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, 치료학적 유효량의 AAV FVIII 바이러스를 포함하는 조성물은 AAV FVIII 바이러스의 투여와 연관된 임의의 간독성을 예방하고/하거나 치료하는데 사용하기 위해 예방학적 및/또는 치료학적 코르티코스테로이드를 포함하는 조성물로 투여된다. 예방학적 또는 치료학적 코르티코스테로이드 처리를 포함하는 조성물은 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 이상의 mg/일의 코르티코스테로이드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 예방학적 또는 치료학적 코르티코스테로이드를 포함하는 조성물은 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주 이상의 연속 기간 동안 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 A형 혈우병를 앓는 대상체의 치료를 위한 약물의 제조용 치료학적 유효량의 재조합체 AAV FVIII 바이러스의 용도에 관한 것이다. 특정 구현예에서, AAVFVIII 바이러스는 AAV5-FVIII-SQ 또는 p-100 ATGB 벡터를 포함하는 바이러스이다. 약물은 임의로 상기된 바와 같이 제형화될 수 있다. 바람직한 구현예에서, A형 혈우병를 앓는 대상체는 인간이다. 하나의 구현예에서, 약물은 정맥내 (IV) 투여에 의해 투여된다. 본 발명의 하나의 양상에서, 약물의 투여는 투여 후 16주 이상의 시점에 대상체의 혈류 중에 적어도 약 5 IU/dl의 인자 VIII 단백질, 바람직하게 대상체의 혈류 중에 적어도 약 5 IU/dl의 인자 VIII 단백질의 발현을 유도한다. 특정 구현예에서, 약물은 또한 AAV FVIII 바이러스의 투여와 연관된 임의의 간독성의 예방 및/또는 치료를 위한 예방학적 및/또는 치료학적 코르티코스테로이드를 포함한다. 예방학적 또는 치료학적 코르티코스테로이드 처리를 포함하는 약물은 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 이상의 mg/일의 코르티코스테로이드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 예방학적 또는 치료학적 코르티코스테로이드를 포함하는 약물은 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주 이상의 연속 기간 동안 투여될 수 있다.
본 발명은 또한, 임의로 상기된 바와 같이 제형화될 수 있는 치료학적 유효량의 재조합체 AAV FVIII 바이러스를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, A형 혈우병를 앓는 대상체에서 출혈 에피소드 동안에 출혈 시간을 감소시키기 위한 방법에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, A형 혈우병를 앓는 대상체는 인간이다. 하나의 구현예에서, 투여하는 단계는 정맥내 (IV) 투여에 의해 성취된다. 특정 구현예에서, 투여하는 단계는 출혈 에피소드 전 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50주 이상에서 수행한다. 본 발명의 하나의 양상에서, 투여하는 단계는 대상체의 혈류 중에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상 IU/dl의 인자 VIII 단백질, 바람직하게 대상체의 혈류 중에 적어도 약 5 IU/dl의 인자 VIII 단백질의 발현을 유도한다. 특정 구현예에서, 투여하는 단계는 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 주에 대상체의 혈류 중에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상 IU/dl의 인자 VIII 단백질의 발현을 유도한다. 특정 구현예에서, 치료학적 유효량의 AAV FVIII 바이러스의 투여에 추가로, 대상체는 상기된 바와 같이 AAV FVIII 바이러스의 투여와 연관된 임의의 간독성을 예방하고/하거나 치료하기 위해 코르티코스테로이드로 예방학적으로, 치료학적으로, 또는 둘 다로 처리한다.
본 발명은 또한 A형 혈우병를 앓는 대상체에서 출혈 에피소드의 출혈 시간을 감소시키는데 사용하기 위한 치료학적 유효량의 재조합체 AAV FVIII 바이러스를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, AAV FVIII 바이러스는 AAV5-FVIII-SQ이다. 조성물은 임의로 상기된 바와 같이 제형화될 수 있다. 바람직한 구현예에서, A형 혈우병를 앓는 대상체는 인간이다. 조성물은 출혈 에피소드 전에 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 조성물은 출혈 에피소드 전 정맥내 (IV) 투여에 의해 투여된다. 본 발명의 하나의 양상에서, 투여하는 단계는 대상체의 혈류 중에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상 IU/dl의 인자 VIII 단백질, 바람직하게 대상체의 혈류 중에 적어도 약 5 IU/dl의 인자 VIII 단백질의 발현을 유도한다. 특정 구현예에서, 투여하는 단계는 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 주에 대상체의 혈류 중에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상 IU/dl의 인자 VIII 단백질의 발현을 유도한다. 특정 구현예에서, 출혈 시간을 감소시키는데 사용하기 위한 치료학적 유효량의 AAV FVIII 바이러스를 포함하는 조성물은 상기된 바와 같이 AAV FVIII 바이러스의 투여와 연관된 임의의 간독성을 예방하고/하거나 치료하는데 사용하기 위해 예방학적 및/또는 치료학적 코르티코스테로이드를 포함하는 조성물로 투여된다.
본 발명은 또한 상기 치료학적 유효량의 상기 재조합체 AAV FVIII 바이러스의 투여 후에 상기 대상체의 혈청에서의 항-AAV 캡시드 항체의 부재 또는 존재를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 출혈 시간을 감소시키는 임의의 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 대상체의 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체의 존재의 결정을 수행한 후에 상기 대상체에 유효량의 코르티코스테로이드를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 출혈 시간을 감소시키는 임의의 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 A형 혈우병를 앓는 대상체에서 출혈 에피소드의 출혈 시간을 감소시키기 위한 약물 제조용 치료학적 유효량의 재조합체 AAV FVIII 바이러스의 용도에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, AAV FVIII 바이러스는 AAV5-FVIII-SQ이다. 약물은 임의로 상기된 바와 같이 제형화될 수 있다. 바람직한 구현예에서, A형 혈우병를 앓는 대상체는 인간이다. 약물은 출혈 에피소드 전에 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 약물은 출혈 에피소드 전 정맥내 (IV) 투여에 의해 투여된다. 본 발명의 하나의 양상에서, 약물의 투여는 대상체의 혈류 중에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상 IU/dl의 인자 VIII 단백질, 바람직하게 대상체의 혈류 중에 적어도 약 5 IU/dl의 인자 VIII 단백질의 발현을 유도한다. 특정 구현예에서, 약물의 투여는 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 주에 대상체의 혈류 중에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상 IU/dl의 인자 VIII 단백질의 발현을 유도한다. 특정 구현예에서, 출혈 시간을 감소시키기 위한 치료학적 유효량의 AAV FVIII 바이러스를 포함하는 약물은 또한 상기된 바와 같이 AAV FVIII 바이러스의 투여와 연관된 임의의 간독성을 예방하고/하거나 치료하기 위해 예방학적 및/또는 치료학적 코르티코스테로이드를 포함한다. 또한, 출혈 시간을 감소시키는데 사용하기 위한 본 발명의 임의의 조성물은 조성물의 투여 후 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체를 갖는 것으로 결정된 대상체에서 유효량의 코르티코스테로이드로 투여된다.
본 발명은 또한, 임의로 상기된 바와 같이 제형화될 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 재조합체 AAV FVIII 바이러스를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 기능적 FVIII 단백질의 발현을 유도하기 위한 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 투여는 대상체의 혈류 중 기능적 FVIII 단백질의 증가된 발현 또는 기능적 FVIII 단백질의 증가된 농도를 유도한다. 바람직한 구현예에서, 필요로 하는 대상체는 인간이다. 하나의 구현예에서, 투여하는 단계는 정맥내 (IV) 투여에 의해 성취된다. 본 발명의 하나의 양상에서, 투여하는 단계는 대상체의 혈류 중에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상 IU/dl의 인자 VIII 단백질, 바람직하게 대상체의 혈류 중에 적어도 약 5 IU/dl의 인자 VIII 단백질의 발현을 유도한다. 특정 구현예에서, 투여하는 단계는 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 주에 대상체의 혈류 중에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상 IU/dl의 인자 VIII 단백질의 발현을 유도한다. 특정 구현예에서, AAV FVIII 바이러스의 투여에 추가로, 대상체는 상기된 바와 같이 AAV FVIII 바이러스의 투여와 연관된 임의의 간독성을 예방하고/하거나 치료하기 위해 코르티코스테로이드로 예방학적으로, 치료학적으로, 또는 둘 다로 처리한다. 또한, 출혈 시간을 감소시키기 위한 약물의 투여 후 본 발명의 임의의 용도에서, 대상체의 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체의 부재 또는 존재를 결정한다. 대상체가 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체를 갖는 것으로 결정되는 경우, 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체를 갖는 대상체에 투여하기 위한 약제의 제조를 위한 유효량의 코르티코스테로이드의 용도가 고려된다.
본 발명은 또한, 임의로 상기된 바와 같이 제형화될 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 재조합체 AAV FVIII 바이러스를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 FVIII 단백질의 발현을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 투여는 대상체의 혈류 중 기능적 FVIII 단백질의 증가된 발현 또는 기능적 FVIII 단백질의 증가된 농도를 유도한다. 바람직한 구현예에서, 필요로 하는 대상체는 인간이다. 하나의 구현예에서, 투여하는 단계는 정맥내 (IV) 투여에 의해 성취된다. 본 발명의 하나의 양상에서, 투여하는 단계는 대상체의 혈류 중에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상 IU/dl의 인자 VIII 단백질, 바람직하게 대상체의 혈류 중에 적어도 약 5 IU/dl의 인자 VIII 단백질의 발현을 유도한다. 특정 구현예에서, 투여하는 단계는 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 주에 대상체의 혈류 중에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상 IU/dl의 인자 VIII 단백질의 발현을 유도한다. 특정 구현예에서, AAV FVIII 바이러스의 투여에 추가로, 대상체는 상기된 바와 같이 AAV FVIII 바이러스의 투여와 연관된 임의의 간독성을 예방하고/하거나 치료하기 위해 코르티코스테로이드로 예방학적으로, 치료학적으로, 또는 둘 다로 처리한다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 FVIII 단백질의 발현을 증가시키거나 유도하는데 사용하기 위한 치료학적 유효량의 재조합체 AAV FVIII 바이러스를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, AAVFVIII 바이러스는 AAV5-FVIII-SQ이다. 조성물은 임의로 상기된 바와 같이 제형화될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 A형 혈우병를 앓는 인간이다. 조성물은 출혈 에피소드 전에 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 조성물은 출혈 에피소드 전 정맥내 (IV) 투여에 의해 투여된다. 본 발명의 하나의 양상에서, 투여하는 단계는 대상체의 혈류 중에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상 IU/dl의 인자 VIII 단백질, 바람직하게 대상체의 혈류 중에 적어도 약 5 IU/dl의 인자 VIII 단백질의 발현을 유도한다. 특정 구현예에서, 투여하는 단계는 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 주에 대상체의 혈류 중에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상 IU/dl의 인자 VIII 단백질의 발현을 유도한다. 특정 구현예에서, FVIII 단백질의 발현을 증가시키거나 유도하는데 사용하기 위한 치료학적 유효량의 AAV FVIII 바이러스를 포함하는 조성물은 상기된 바와 같이 AAV FVIII 바이러스의 투여와 연관된 임의의 간독소를 예방하고/하거나 치료하는데 사용하기 위한 예방학적 및/또는 치료학적 코르티코스테로이드를 포함하는 조성물로 투여된다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 FVIII 단백질의 발현을 증가시키거나 유도하기 위한 약물의 제조용 치료학적 유효량의 재조합체 AAV FVIII 바이러스의 용도에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 필요로 하는 대상체는 A형 혈우병를 앓는 인간이다. 하나의 구현예에서, AAVFVIII 바이러스는 AAV5-FVIII-SQ이다. 약물은 임의로 상기된 바와 같이 제형화될 수 있다. 약물은 출혈 에피소드 전에 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 약물은 출혈 에피소드 전 정맥내 (IV) 투여에 의해 투여된다. 본 발명의 하나의 양상에서, 약물의 투여는 대상체의 혈류 중에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상 IU/dl의 인자 VIII 단백질, 바람직하게 대상체의 혈류 중에 적어도 약 5 IU/dl의 인자 VIII 단백질의 발현을 유도한다. 특정 구현예에서, 약물의 투여는 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 주에 대상체의 혈류 중에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상 IU/dl의 인자 VIII 단백질의 발현을 유도한다. 특정 구현예에서, FVIIII 단백질의 발현을 증가시키거나 유도하기 위한 치료학적 유효량의 AAV FVIII 바이러스를 포함하는 약물은 또한 상기된 바와 같이 AAV FVIII 바이러스의 투여와 연관된 임의의 간독성을 예방하고/하거나 치료하기 위해 예방학적 및/또는 치료학적 코르티코스테로이드를 포함한다.
본 발명은 또한 (i) 상기 대상체의 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체의 부재를 결정하는 단계, 및 (ii) 상기 대상체에게 치료학적 유효량의 재조합체 AAV FVIII 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는, A형 혈우병를 앓는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 A형 혈우병를 앓는 대상체의 치료를 위한 약물의 제조용 치료학적 유효량의 재조합체 AAV FVIII 바이러스의 용도에 관한 것이고, 여기서, 항-AAV 캡시드 항체는 대상체의 혈청으로부터 부재이다.
본 발명은 또한 A형 혈우병를 앓는 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 치료학적 유효량의 재조합체 AAV FVIII 바이러스를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서, 항-AAV 캡시드 항체는 대상체의 혈청으로부터 부재이다.
본 발명은 또한 (i) 치료학적 유효량의 재조합체 AAV FVIII 바이러스를 대상체에게 투여하는 단계, 및 (ii) 상기 치료학적 유효량의 상기 재조합체 AAV FVIII 바이러스의 투여 후, 상기 대상체의 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체의 부재 또는 존재를 결정하는 단계를 포함하는 A형 혈우병를 앓는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 방법은 상기 대상체의 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체의 존재의 결정을 수행한 후에 상기 대상체에 유효량의 코르티코스테로이드를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 A형 혈우병의 치료를 위한 약물 제조용 치료학적 유효량의 재조합체 AAV FVIII 바이러스의 용도에 관한 것이고, 여기서, 약물의 투여 후, 대상체의 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체의 부재 또는 존재가 결정된다. 대상체가 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체를 갖는 것으로 결정되는 경우, 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체를 갖는 대상체에 투여하기 위한 약제의 제조를 위한 유효량의 코르티코스테로이드의 용도. 본 발명은 또한 A형 혈우병의 치료를 위해 유효량의 재조합체 AAV FVIII를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서, 상기 조성물은 상기 조성물의 투여 후 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체를 갖는 것으로 결정된 대상체에서 유효량의 코르티코스테로이드와 함께 투여된다.
본 발명의 다른 구현예는 본원 명세서를 검토 즉시 당업자에게 자명할 것이다.
도 1은 예시적 FVIII-암호화 재조합체 AAV 벡터의 도식을 제공한다. 좌측에서 우측으로 벡터는 AAV2 5' ITR 서열, 야생형 AAV2 바이러스 서열, 34 염기 인간 ApoE/C1 인핸서 서열, 32 염기 인간 AAT 프로모터 원위 X 영역 서열, 5’UTR 서열의 42개 염기를 포함하는 186 염기 인간 AAT 프로모터 서열, 코돈-체적화된 인간 FVIII SQ 서열, 49 염기 합성 프라우드풋 폴리아데닐화 서열, 야생형 AAV2 바이러스 서열, 및 AAV2 3’서열 (문헌참조: 이의 전문이 본원에 참조로 인용된, 2011년 1월 13일자로 공개된 WO 2011/005968, 및 McIntosh 등, Blood 121:3335-3344, 2013)을 포함한다. 상기 벡터는 5081 염기 길이이다.
도 2a - 도 2d는 본 발명의 특정 재조합체 AAV FVIII 벡터의 도식을 제공한다. (A) 프로토 1, (B) 프로토 1S, (C) 프로토 2S 및 (D) 프로토 3S.
도 3a - 도 3d는 본 발명의 특정 재조합체 AAV FVIII 벡터의 도식을 제공한다. (A) 프로토 4, (B) 프로토 5, (C) 프로토 6 및 (D) 프로토 7.
도 4a - 도 4jj는 본 발명의 특정 재조합체 AAV FVIII 벡터의 도식을 제공한다. (A) 작제물 100ATG, (B) 작제물 100ATG bGH polyA, (C) 작제물 100ATG 짧은 bGH poly A, (D) 작제물 103ATG, (E) 작제물 103ATG 짧은 bGH poly A, (F) 작제물 105ATG bGH polyA, (G) 작제물 DC172ATG FVIII, (H) 작제물 DC172ATG FVIII hAAT, (I) 작제물 DC172 2xHCR ATG FVIII, (J) 작제물 DC172 2xHCR ATG FVIII hAAT, (K) 작제물 2x SerpinA hAAT ATG FVIII, (L) 작제물 2x SerpinA hAAT ATG FVIII 2x μ-글로불린 인핸서, (M) 작제물 100ATG 짧은 bGH poly A 2x μ-글로불린 인핸서, (N) 작제물 인자 VIII-BMN001, (O) 작제물 인자 VIII-BMN002, (P) 작제물 99, (Q) 작제물 100, (R) 작제물 100 역배향, (S) 작제물 100AT, (T) 작제물 100AT 2x MG, (U) 작제물 100AT 2x MG bGH polyA, (V) 작제물 100AT 2x MG (역) bGH poly A, (W) 작제물 100 bGH poly A, (X) 작제물 100-400, (Y) 작제물 101, (Z) 작제물 102, (AA) 작제물 103, (BB) 작제물 103 역배향, (CC) 작제물 103AT, (DD) 작제물 103AT 2x MG, (EE) 작제물 103AT 2x MG bGH poly A, (FF) 작제물 103 bGH poly A, (GG) 작제물 104, (HH) 작제물 105, (II) 작제물 106 및 (JJ) 작제물 106AT.
도 5는 Rag2 마우스에서 재조합체 AAV FVIII 프로토 작제물의 평가 결과를 제공하고 상기 프로토 바이러스 작제물은 도 1에 나타낸 벡터와 유사하게 FVIII를 형질도입함을 입증하고, 여기서, 상기 y-축은 ELISA 분석에 의해 결정된 FVIII 단백질의 ng/ml를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 다양한 재조합체 AAV FVIII 작제물이 마우스 꼬리 정맥 수력학적 주사 검정에서 측정된 바와 같이 FVIII 단백질의 생체내 발현을 유도함을 입증한다.
도 7은 본 발명의 다양한 재조합체 AAV FVIII 작제물이 마우스 꼬리 정맥 수력학적 주사 검정에서 측정된 바와 같이 FVIII 단백질의 생체내 발현을 유도함을 입증한다.
도 8은 본 발명의 다양한 재조합체 AAV FVIII 작제물이 마우스 꼬리 정맥 수력학적 주사 검정에서 측정된 바와 같이 FVIII 단백질의 생체내 발현을 유도함을 입증한다.
도 2a - 도 2d는 본 발명의 특정 재조합체 AAV FVIII 벡터의 도식을 제공한다. (A) 프로토 1, (B) 프로토 1S, (C) 프로토 2S 및 (D) 프로토 3S.
도 3a - 도 3d는 본 발명의 특정 재조합체 AAV FVIII 벡터의 도식을 제공한다. (A) 프로토 4, (B) 프로토 5, (C) 프로토 6 및 (D) 프로토 7.
도 4a - 도 4jj는 본 발명의 특정 재조합체 AAV FVIII 벡터의 도식을 제공한다. (A) 작제물 100ATG, (B) 작제물 100ATG bGH polyA, (C) 작제물 100ATG 짧은 bGH poly A, (D) 작제물 103ATG, (E) 작제물 103ATG 짧은 bGH poly A, (F) 작제물 105ATG bGH polyA, (G) 작제물 DC172ATG FVIII, (H) 작제물 DC172ATG FVIII hAAT, (I) 작제물 DC172 2xHCR ATG FVIII, (J) 작제물 DC172 2xHCR ATG FVIII hAAT, (K) 작제물 2x SerpinA hAAT ATG FVIII, (L) 작제물 2x SerpinA hAAT ATG FVIII 2x μ-글로불린 인핸서, (M) 작제물 100ATG 짧은 bGH poly A 2x μ-글로불린 인핸서, (N) 작제물 인자 VIII-BMN001, (O) 작제물 인자 VIII-BMN002, (P) 작제물 99, (Q) 작제물 100, (R) 작제물 100 역배향, (S) 작제물 100AT, (T) 작제물 100AT 2x MG, (U) 작제물 100AT 2x MG bGH polyA, (V) 작제물 100AT 2x MG (역) bGH poly A, (W) 작제물 100 bGH poly A, (X) 작제물 100-400, (Y) 작제물 101, (Z) 작제물 102, (AA) 작제물 103, (BB) 작제물 103 역배향, (CC) 작제물 103AT, (DD) 작제물 103AT 2x MG, (EE) 작제물 103AT 2x MG bGH poly A, (FF) 작제물 103 bGH poly A, (GG) 작제물 104, (HH) 작제물 105, (II) 작제물 106 및 (JJ) 작제물 106AT.
도 5는 Rag2 마우스에서 재조합체 AAV FVIII 프로토 작제물의 평가 결과를 제공하고 상기 프로토 바이러스 작제물은 도 1에 나타낸 벡터와 유사하게 FVIII를 형질도입함을 입증하고, 여기서, 상기 y-축은 ELISA 분석에 의해 결정된 FVIII 단백질의 ng/ml를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 다양한 재조합체 AAV FVIII 작제물이 마우스 꼬리 정맥 수력학적 주사 검정에서 측정된 바와 같이 FVIII 단백질의 생체내 발현을 유도함을 입증한다.
도 7은 본 발명의 다양한 재조합체 AAV FVIII 작제물이 마우스 꼬리 정맥 수력학적 주사 검정에서 측정된 바와 같이 FVIII 단백질의 생체내 발현을 유도함을 입증한다.
도 8은 본 발명의 다양한 재조합체 AAV FVIII 작제물이 마우스 꼬리 정맥 수력학적 주사 검정에서 측정된 바와 같이 FVIII 단백질의 생체내 발현을 유도함을 입증한다.
본 발명은 기능적으로 활성인 FVIII를 암호화하는 AAV 벡터, 예를 들어, 완전히 팩키징된 AAV FVIII 벡터 또는 고발현 활성을 갖는 AAV FVIII 벡터를 제공한다. 본 발명의 재조합체 AAV FVIII 벡터는 개선된 전이유전자 발현, 및 개선된 AAV 바이러스 생성 수율 및 단순화된 정제를 갖는다. FVIII 단백질-암호화 영역으로 하나 이상의 인트론의 도입은 발현을 증진시킨다. 인핸서의 수 및 위치의 재구성은 또한 발현을 증진시킨다.
예시적 AAV FVIII 벡터
도 1에 나타낸 예시적 재조합체 AAV FVIII 벡터는 2011년 1월 13일자로 공개된 WO 2011/005968 (이의 전문이 본원에 참조로 인용된다) 및 문헌 (McIntosh 등, Blood 121:3335-3344, 2013)에 기재되어 있고 오버사이즈, 즉, 5.0 kb 초과의 AAV FVIII 벡터이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 AAV FVIII 벡터는 좌측에서 우측으로 AAV 혈청형 2 (AAV2) 5' ITR, 야생형 AAV2-유래된 바이러스 서열, 34 염기 인간 아포지질단백질 E (ApoE)/C1 인핸서 요소, 32 염기 인간 알파 항-트립신 (AAT) 프로모터 원위 X 영역, 5’비해독 영역 (UTR) 서열의 42 염기를 포함하는 186 염기 인간 AAT (hAAT) 프로모터, 코돈-최적화된 인간 FVIII 서열을 포함하고, 여기서, FVIII B 도메인은 14 아미노산 SQ 서열, 49 염기 합성 프라우드풋 폴리아데닐화 서열, 야생형 AAV2-유래된 바이러스 서열 및 AAV2 3’ITR로 대체되어 있다. 상기 벡터는 5081 염기 길이이고, WO 2011/005968에 나타낸바와 같이, 시험관내 및 생체내 둘 다에서 기능적으로 활성인 FVIII를 발현한다.
프로토 1, 프로토 1S, 프로토 2S 및 프로토 3S 벡터
오버사이즈 AAV 벡터와 연관된 문제점을 회피하고/하거나 AAV 벡터로부터 FVIII 전이유전자의 발현을 증가시키기 위해, 본 발명은 기능적 FVIII 단백질을 암호화하는 완전히 팩키징된 보다 작은, 즉, 5.0 kb 미만의 AAV 벡터를 제공한다. 재조합체 AAV 프로토 1 작제물의 4970 bp 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1로 제공된다.
재조합체 AAV FVIII 벡터 프로토 1을 생성하기 위해, 기능적으로 활성인 FVIII의 생산을 위해 불필요한 것으로 결정된 서열은 도 1에 나타낸 벡터로부터 제거하였다. 실시예 1에 나타낸 바와 같이, 외인성 DNA의 111 염기를 제거하였고, 이는 AAV2 5' ITR의 3'에 있는 야생형 AAV2 바이러스 서열의 53 염기, AAV2 3’ITR의 5'에 있는 AAV2 바이러스 서열의 46 염기, 및 코돈-최적화된 FVIII 단백질 암호화 영역에 인접한 12 염기를 포함한다. 도 1에 나타낸 벡터의 코돈-최적화된 FVIII SQ 서열은 또한 본원에서 "FVIII-SQ"로서 언급되는 신규한 코돈-최적화된 FVIII SQ 서열로 대체하였다. FVIII-SQ 암호화 서열 (서열번호 1의 염기 403-4776)은 이어서 프로토 1 벡터에 도입하였다. 수득한 프로토 1 벡터는 4970 염기 길이이고, 좌측에서 우측으로 변형된 AAV 혈청형 2 (AAV2) 5' ITR, 34 염기 인간 아포지질단백질 E (ApoE)/C1 인핸서 요소, 32 염기 인간 알파 항-트립신 (AAT) 프로모터 원위 X 영역, 5’비해독 영역 (UTR) 서열의 42 염기를 포함하는 186 염기 인간 AAT (hAAT) 프로모터, 신규 코돈-최적화된 인간 FVIII 서열을 포함하고, 여기서, FVIII B 도메인은 14 아미노산 SQ 서열, 49 염기 합성 프라우드풋 폴리아데닐화 서열, 및 변형된 AAV2 3’ITR로 대체되어 있다. 디자인되는 경우, 프로토 1 벡터가 시험관내 또는 생체내에서 기능적 FVIII 폴리펩타이드를 발현할 수 있을지는 공지되어 있지 않다.
AAV 벡터 프로토 1S를 생성하기 위해, AAV2 5' ITR의 3' 말단에 10개 염기, 및 AAV2 3' ITR의 5’말단에 10개 염기를 프로토 1 벡터로부터 제거하였다. 수득한 프로토 1S 벡터는 4950 염기 길이이다. 프로토 1S의 서열의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2에 제시한다.
AAV 벡터 프로토 2S를 생성하기 위해, 합성 100개 염기 인트론을 프로토 1S 벡터에서 FVIII - SQ 서열의 엑손 1과 2 사이에 삽입하였다. 34 염기 ApoE/C1 인핸서 및 32 염기 인간 AAT 프로모터 원위 X 영역은 인간 AAT 프로모터의 업스트림으로부터 제거하고 역배향 (이들 요소가 인간 AAT 프로모터의 업스트림에 위치하는 경우의 배향과 비교하여)으로 합성 인트론에 삽입하였다. 수득한 프로토 2S 벡터는 4983 염기 길이이다. 프로토 2S의 서열의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3에 제시한다.
AAV 벡터 프로토 3S를 생성하기 위해, 인간 AAT 프로모터 원위 X 영역은 프로토 2S 벡터로부터 제거하고 역배향으로 34 염기 ApoE/C1 인핸서의 제2 카피물로 대체하였다. 수득한 프로토 3S 벡터는 4984 염기 길이이다. 프로토 3S의 서열의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4에 제시한다.
프로토 4, 프로토 S, 프로토 6 및 프로토 7 벡터
AAV FVIII 벡터의 크기를 추가로 감소시키고/시키거나 AAV 벡터로부터 FVIII 전이유전자의 발현을 증가시키는 시도에서, 본 발명은 또한 B 도메인 및 a3 도메인 결실된 FVIII를 암호화하는 완전히 팩키징된 보다 작은, 즉, 5.0 kb 미만의 AAV 벡터를 제공한다.
AAV 벡터 프로토 4를 생성하기 위해, C 도메인에 인접하게 위치한 14개 아미노산 SQ 서열 및 a3 도메인은 프로토 1 벡터로부터 제거하였다. 결실된 FVIII 서열의 총량은 55 아미노산 또는 165 염기이다. 수득한 프로토 4 벡터는 4805 염기 길이이다. 프로토 4의 서열의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5에 제시한다.
AAV 벡터 프로토 5를 생성하기 위해, 129 염기 절단된 FVIII 인트론은 프로토 4 벡터에서 코돈-최적화된 FVIII 서열의 엑손 1과 2 사이에 삽입하였다. 수득한 프로토 5 벡터는 4934 염기 길이이다. 프로토 5의 서열의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 6에 제시한다.
AAV 프로토 6 벡터를 생성하기 위해, FVIII 인트론의 34 염기는 프로토 5 벡터에서 정배향으로 34 염기 인간 ApoE/C1 인핸서의 제2 카피물로 대체하였다. 수득한 프로토 6 벡터는 4934 염기 길이이다. 프로토 6의 서열의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7에 제시한다.
AAV 프로토 7 벡터를 생성하기 위해, FVIII 인트론의 34 염기는 프로토 5 벡터에서 역배향으로 34 염기 인간 ApoE/C1 인핸서의 제2 카피물로 대체하였다. 수득한 프로토 7 벡터는 4934 염기 길이이다. 프로토 7의 서열의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 8에 제시한다.
개선된 프로모터/인핸서 서열을 갖는 추가의 재조합체 AAV FVIII 벡터
강한 프로모터를 갖는 오버사이즈 AAV 벡터는 B 도메인 및 a3 도메인 결실된 FVIII의 발현을 증가시키기 위해 생성되었고 이들 작제물은 변형된 인핸서 및/또는 프로모터 서열과 함께 생성되었다. 일부 구현예에서, AAV FVIII 벡터는 절단된 기능적 FVIII를 발현한다. 이들 작제물은 하나 이상의 프로모터 및 인핸서 서열, 예를 들어, ApoE HCR 또는 이의 단편, μ-글로불린 인핸서 또는 이의 단편, 인간 알파 1 항트립신 프로모터 (hAAT) 또는 이의 단편, 세르핀 A 인핸서 또는 이의 단편, LP1 프로모터 인핸서 또는 이의 단편 또는 마크로글로불린 인핸서 또는 이의 단편을 포함한다. 이들 작제물은 폴리아데닐화 서열, 예를 들어, bGH poly A 서열 또는 합성 토끼 β-글로빈 poly A 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 작제물은 인트론 또는 인트론의 단편, 예를 들어 hAAT 인트론 또는 인간 β-글로빈 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합체 AAV FVIII 벡터는 신규한 코돈-최적화된 FVIII-SQ 암호화 서열을 포함한다.
작제물 100ATG (도 4a)는 5511 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 160-502는 ApoE HCR이고, 염기 509-726은 hAAT 프로모터이고, 염기 727-910은 변형된 인간 β-글로빈 2번째 인트론이고, 염기 923-5296은 FVIII-SQ이고, 염기 5305-5352는 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5367-5511은 3' AAV2 ITR이다.
작제물 100ATG bGH poly A (도 4b)는 5688 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 160-502는 ApoE HCR이고, 염기 509-726은 hAAT 프로모터이고, 염기 727-910은 변형된 인간 β-글로빈 2번째 인트론이고, 염기 923-5296은 FVIII-SQ이고, 염기 5305-5529는 bGH poly A이고, 염기 5544-5688은 3' AAV2 ITR이다.
작제물 100ATG 짧은 bGH poly A (도 4c)는 5613 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 11에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 160-502는 ApoE HCR이고, 염기 509-726은 hAAT 프로모터이고, 염기 727-910은 변형된 인간 β-글로빈 2번째 인트론이고, 염기 923-5296은 FVIII-SQ이고, 염기 5305-5454는 짧은 bGH poly A이고, 염기 5469-5613은 3' AAV2 ITR이다.
작제물 103ATG (도 4d)는 5362 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 169-344는 44bp ApoE 반복체의 4개의 카피물 (4x)이고, 염기 360-577은 hAAT 프로모터이고, 염기 578-761은 변형된 인간 β-글로빈 2번째 인트론이고, 염기 774-5147은 FVIII-SQ이고, 염기 5156-5203은 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5218-5362는 3' AAV2 ITR이다.
작제물 103ATG 짧은 bGH poly A (도 4e)는 5464 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 13에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 169-344는 44bp ApoE 반복체의 4개 카피물 (4x)이고, 염기 360-577은 hAAT 프로모터이고, 염기 578-761은 변형된 인간 β-글로빈 2번째 인트론이고, 염기 774-5147은 FVIII-SQ이고, 염기 5156-5305는 bGH 짧은 poly A이고, 염기 5320-5464는 3' AAV2 ITR이다.
작제물 105ATG bGH poly A (도 4f)는 6354 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 14에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 173-512는 170 bp 마이크로글로불린 인핸서의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 519-736은 hAAT 프로모터이고, 염기 737-920은 변형된 인간 β-글로빈 2번째 인트론이고, 염기 933-5306은 FVIII-SQ이고, 염기 5315-5539는 bGH poly A이고, 염기 5546-6195는 325bp ApoE HCR의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 6210-6354는 3' AAV2 ITR이다.
작제물 DC172ATG FVIII (도 4g)는 6308 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 15에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 160-449는 145bp 마이크로글로불린 인핸서의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 450-1347은 898 bp hAAT 프로모터이고, 염기 1348-1531은 변형된 인간 β-글로빈 2번째 인트론이고, 염기 1544-5917은 FVIII-SQ이고, 염기 5926-6149는 bGH 짧은 poly A이고, 염기 6164-6308은 3' AAV2 ITR이다.
작제물 DC172ATG FVIII hAAT (도 4h)는 5635 염기 길이이고, 상기 작제물은 서열번호 16에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 160-449는 145 bp 마크로글로불린 인핸서의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 457-674는 hAAT 프로모터이고, 염기 675-858은 변형된 인간 β-글로빈 2번째 인트론이고, 염기 871-5244는 FVIII-SQ이고, 염기 5253-5476은 bGH poly A이고 염기 5490-5635는 3' AAV2 ITR이다.
작제물 DC172 2xHCR ATG FVIII (도 4i)는 6962 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 17에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 160-807은 321bp ApoE HCR의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 814-1103은 145 bp 마크로글로불린 인핸서의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 1104-2001은 898 bp hAAT 프로모터이고, 염기 2002-2185은 변형된 인간 β-글로빈 2번째 인트론이고, 염기 2198-6571은 FVIII-SQ이고, 염기 6580-6803는 bGH poly A이고, 염기 6818-6962는 3' AAV2 ITR이다.
작제물 DC172 2xHCR ATG FVIII hAAT (도 4j)는 6289 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 18에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 160-807은 321bp ApoE HCR의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 814-1103은 145 bp 마크로글로불린 인핸서의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 1111-1328은 hAAT 프로모터이고, 염기 1329-1512는 변형된 인간 β-글로빈 2번째 인트론이고, 염기 1525-5898은 FVIII-SQ이고, 염기 5907-6130은 bGH 짧은 poly A이고, 염기 6245-6289는 3' AAV2 ITR이다.
작제물 2x 세르핀A hAAT ATG FVIII (도 4k)는 5430 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 19에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 168-309는 71bp 세르핀 A 인핸서의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 326-543은 hAAT 프로모터이고, 염기 544-727은 변형된 인간 β-글로빈 2번째 인트론이고, 염기 740-5113은 FVIII-SQ이고, 염기 5122-5271는 짧은 bGH poly A이고, 염기 5286-5430은 3' AAV2 ITR이다.
작제물 2x 세르핀A hAAT ATG FVIII 2x μ-글로불린 인핸서 (도 4l)은 5779 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 20에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 168-309는 71bp 세르핀 A 인핸서의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 326-543은 hAAT 프로모터이고, 염기 544-727은 변형된 인간 β-글로빈 2번째 인트론이고, 염기 740-5113은 FVIII-SQ이고, 염기 5122-5271은 짧은 bGH poly A이고, 염기 5279-5618는 170 bp μ-글로불린 인핸서의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 5635-5779는 3' AAV2 ITR이다.
작제물 100ATG 짧은 bGH poly A 2x μ-글로불린 인핸서 (도 4m)는 5962 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 21에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 160-502는 ApoE HCR이고, 염기 509-726은 hAAT 프로모터이고, 염기 727-910은 변형된 인간 β-글로빈 2번째 인트론이고, 염기 923-5296은 FVIII-SQ이고, 염기 5305-5454는 bGH poly A이고, 염기 5462-5801은 170 bp 마이크로글로불린 인핸서의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 5818-5962는 3' AAV2 ITR이다.
작제물 인자 VIII-BMN001 (도 4n)은 5919 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 22에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 160-480은 ApoE HCR이고, 염기 487-884는 398bp의 hAAT 프로모터이고, 염기 885-1145는 절단된 hAAT 인트론이고, 염기 1155-5528은 FVIII-SQ이고, 염기 5537-5760은 bGH poly A이고, 염기 5775-5919는 3' AAV2 ITR이다.
작제물 인자 VIII-BMN002 (도 4o)는 5306 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 23에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 175-705는 LP1 프로모터/인핸서이고, 염기 718-5091은 FVIII-SQ이고, 염기 5100-5147은 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5162-5306은 3' AAV2 ITR이다.
작제물 99 (도 4p)는 5461 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 24에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 169-627은 ApoE HCR/MAR이고, 염기 634-866은 hAAT 프로모터이고, 염기 873-5246은 FVIII-SQ이고, 염기 5255-5302는 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5317-5461은 3' AAV2 ITR이다.
작제물 100 (도 4q)은 5327 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 25에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 169-493은 ApoE HCR이고, 염기 509-726은 hAAT 프로모터이고, 염기 739-5112는 FVIII SQ이고, 염기 5121-5168은 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5183-5327은 3' AAV2 ITR이다.
작제물 100 역배향 (도 4r)은 5309 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 26에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 160-484는 역배향의 ApoE HCR이고, 염기 491-708은 hAAT 프로모터이고, 염기 721-5094는 FVIII-SQ이고, 염기 5103-5150은 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5165-5309는 3' AAV2 ITR이다.
작제물 100AT (도 4s)는 5532 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 27에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 169-493은 ApoE HCR이고, 염기 509-726은 hAAT 프로모터이고, 염기 727-931은 hAAT 인트론이고, 염기 944-5317은 FVIII-SQ이고, 염기 5326-5373은 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5388-5532는 3' AAV2 ITR이다.
작제물 100AT 2x MG (도 4t)는 5877 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 28에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 169-493은 ApoE HCR이고, 염기 508-847은 170 bp μ-글로불린 인핸서의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 854-1071은 hAAT 프로모터이고, 염기 1072-1276은 hAAT 인트론이고, 염기 1289-5662는 FVIII-SQ이고, 염기 5671-5718은 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5733-5877은 3' AAV2 ITR이다.
작제물 100AT 2x MG bGH poly A (도 4u)는 6054 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 29에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 169-493은 ApoE HCR이고, 염기 508-847은 170 bp μ-글로불린 인핸서의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 854-1071은 hAAT 프로모터이고. 염기 1072-1276은 hAAT 인트론이고, 염기 1289-5662는 FVIII-SQ이고, 염기 5671-5895는 bGH poly A이고, 염기 5910-6054는 3' AAV2 ITR이다.
작제물 100AT 2x MG (역배향) bGH poly A (도 4v)는 6054 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 30에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 169-493은 ApoE HCR이고, 염기 508-847은 역배향의 170 bp μ-글로불린 인핸서의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 854-1071은 hAAT 프로모터이고, 염기 1072-1276은 hAAT 인트론이고, 염기 1289-5662는 FVIII-SQ이고, 염기 5671-5895는 bGH poly A이고 염기 5910-6054는 3' AAV2 ITR이다.
작제물 100 bGH poly A (도 4w)는 5504 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 31에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 169-493은 ApoE HCR이고, 염기 509-726은 hAAT 프로모터이고, 염기 739-5112는 FVIII SQ이고, 염기 쌍 5121-5345는 bGH poly A이고 염기 5360-5504는 3' AAV2 ITR이다.
작제물 100-400 (도 4x)은 5507 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 32에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 169-493은 ApoE HCR이고, 염기 512-906은 398bp hAAT 프로모터이고, 염기 919-5292는 FVIII SQ이고, 염기 5301-5348은 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5363-5507은 3' AAV2 ITR이다.
작제물 101 (도 4y)은 5311 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 33에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 170-477은 154bp ApoE HCR의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 493-710은 hAAT 프로모터이고, 염기 723-5096은 FVIII SQ이고, 염기 5105-5152는 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5167-5311은 3' AAV2 ITR이다.
작제물 102 (도 4z)는 5156 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 34에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 169-322는 154bp ApoE HCR이고, 염기 338-555는 hAAT 프로모터이고, 염기 568-4941은 FVIII SQ이고, 염기 4950-4997은 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5012-5156은 3' AAV2 ITR이다.
작제물 103 (도 4aa)은 5178 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 35에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 169-344는 44bp ApoE HCR의 4개의 카피물 (4x)이고, 염기 360-577은 hAAT 프로모터이고, 염기 590-4963은 FVIII SQ이고, 염기 4972-5019는 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5034-5178은 3' AAV2 ITR이다.
작제물 103 역배향 (도 4bb)은 5160 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 36에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 160-335는 역배향의 44bp ApoE HCR의 4개의 카피물 (4x)이고, 염기 342-559는 hAAT 프로모터이고, 염기 572-4945는 FVIII SQ이고, 염기 4954-5001은 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5016-5160은 3' AAV2 ITR이다.
작제물 103AT (도 4cc)는 5383 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 37에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 169-344는 ApoE HCR의 4개의 카피물 (4x)이고, 염기 360-577은 hAAT 프로모터이고, 염기 578-782는 hAAT 인트론이고, 염기 795-4374는 FVIII-SQ이고, 염기 5177-5224는 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5239-5383은 3' AAV2 ITR이다.
작제물 103AT 2x MG (도 4dd)는 5728 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 38에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 169-344는 44bp ApoE HCR의 4개의 카피물 (4x)이고, 염기 359-698은 170 bp μ-글로불린 인핸서의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 705-922는 hAAT 프로모터이고, 염기 923-1127은 hAAT 인트론이고, 염기 1140-5513은 FVIII-SQ이고, 염기 5522-5569는 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5584-5728은 3' AAV2 ITR이다.
작제물 103AT 2x MG bGH poly A (도 4ee)는 5905 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 39에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 169-344는 44bp ApoE HCR의 4개의 카피물 (4x)이고, 염기 359-698은 170 bp μ-글로불린 인핸서의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 705-922는 hAAT 프로모터이고, 염기 923-1127은 hAAT 인트론이고, 염기 1140-5513은 FVIII-SQ이고, 염기 5522-5746은 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5761-5905는 5' AAV2 ITR이다.
작제물 103 bGH poly A (도 4ff)는 5355 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 40에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 169-344는 44bp ApoE HCR의 4개의 카피물 (4x)이고, 염기 360-577은 hAAT 프로모터이고, 염기 590-4963은 FVIII SQ이고, 염기 4972-5196은 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5211-5355는 3' AAV2 ITR이다.
작제물 104 (도 4gg)는 5618 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 41에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 169-784는 154bp ApoE HCR의 4개의 카피물 (4x)이고, 염기 800-1017은 hAAT 프로모터이고, 염기 1030-5403은 FVIII SQ이고, 염기 5412-5459는 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5474-5618은 3' AAV2 ITR이다.
작제물 105 (도 4hh)는 5993 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 42에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 173-512는 170 bp μ-글로불린 인핸서의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 519-736은 hAAT 프로모터이고, 염기 749-5122는 FVIII SQ이고, 염기 5131-5178은 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5185-5834는 ApoE HCR의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 5849-5993은 3' AAV2 ITR이다.
작제물 106 (도 4ii)은 5337 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 43에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 173-512는 170 bp μ-글로불린 인핸서의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 519-736은 hAAT 프로모터이고, 염기 749-5122는 FVIII SQ이고, 염기 5131-5178은 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5193-5337은 3' AAV2 ITR이다.
작제물 106AT (도 4jj)는 5542 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 44에 제시되어 있고, 여기서, 염기 1-145는 5' AAV2 ITR이고, 염기 173-512는 170 bp μ-글로불린 인핸서의 2개의 카피물 (2x)이고, 염기 519-736은 hAAT 프로모터이고, 염기 737-941은 hAAT 인트론이고, 염기 954-5327는 FVIII-SQ이고, 염기 5336-5383은 합성 토끼 β-글로빈 poly A이고 염기 5398-5542는 3' AAV2 ITR이다.
작제물 p-100 ATGB는 5640 염기 길이이다. 상기 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 45에 제시되어 있고 5' AAV2 ITR, ApoE HCR, hAAT 프로모터, 변형된 인간 β-글로빈 2번째 인트론, FVIII-SQ 암호화 서열, bGH poly A 서열 및 3' AAV2 ITR을 포함한다.
AAV 벡터
본원에 사용된 바와 같은 용어 "AAV"는 아데노-관련 바이러스에 대한 표준 약어이다. 아데노-관련 바이러스는 특정 기능이 동시-감염 헬퍼 바이러스에 의해 제공된 세포에서만 성장하는 단일-가닥의 DNA 파르보바이러스이다. 현재 하기 표 1에서 나타낸 바와 같이, 특성 분석된 AAV의 13개의 혈청형이 있다. AAV의 일반적인 정보 및 검토는 예를 들어, 문헌 [참조: Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169-228, 및 Berns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York)]에서 찾을 수 있다. 그러나, 이들 동일한 원리는 이것이 다양한 혈청형이 구조적으로 및 기능적으로 둘 다, 심지어 유전학적 수준에서 매우 밀접하게 관련된 것으로 널리 공지되어 있기 때문에 추가의 AAV 혈청형에 적용될 수 있는 것으로 완전히 예상된다. (문헌참조: 예를 들어, Blacklowe, 1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; 및 Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)). 예를 들어, 모든 AAV 혈청형은 명백히 상동성 rep 유전자에 의해 매개된 매우 유사한 복제 성질을 나타내고; 모두는 3개의 관련된 캡시드 단백질을 함유한다. 관련성 정도는 게놈의 길이를 따라 혈청형 간의 광범위한 교차-하이브리드화; 및 "역위 말단 반복체 서열" (ITR)에 상응하는 말단에서 유사한 자기-어닐링 분절의 존재를 밝히는 헤테로듀플렉스 분석에 의해 추가로 제안된다. 유사한 감염성 패턴은 또한 각각의 혈청형에서 복제 기능이 유사한 조절 제어하에 있음을 시사한다.
본원에 사용된 바와 같은 "AAV 벡터"는 AAV 말단 반복 서열 (ITR)에 의해 플랭킹되어 있고 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동적으로 연결된 목적하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 (또는 전이유전자)를 포함하는 벡터를 언급한다. 상기 AAV 벡터는 rep 및 cap 유전자 생성물을 암호화하고 발현하는 벡터로 형질감염된 숙주 세포에 존재하는 경우 복제될 수 있고 감염성 바이러스 입자로 팩키징될 수 있다.
"AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 폴리뉴클레오타이드 AAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 언급한다. 입자가 이종성 폴리뉴클레오타이드 (즉, 포유동물 세포에 전달되는 전이유전자와 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드)를 포함하는 경우, 이는 전형적으로 "AAV 벡터 입자" 또는 간단히 "AAV 벡터"로 언급된다. 따라서, AAV 벡터 입자의 생성은 상기 벡터가 AAV 벡터 입자 내에 함유됨으로써 필연적으로 AAV 벡터의 생성을 포함한다.
AAV "rep" 및 "cap" 유전자는 각각 복제 및 캡시드화 단백질을 암호화하는 유전자이다. AAV rep 및 cap 유전자는 지금까지 조사된 모든 AAV 혈청형에서 발견되었고 본원 및 인용 문헌에 기재되어 있다. 야생형 AAV에서, rep 및 cap 유전자는 일반적으로 바이러스 게놈에서 서로 인접해 있는 것으로 밝혀졌고 (즉, 이들은 인접 또는 중첩된 전사 유니트로서 함께 "커플링"되어 있다), 이들은 일반적으로 AAV 혈청형 중에 보존되어 있다. AAV rep 및 cap 유전자는 또한 개별적으로 및 총체적으로 "AAV 팩키징 유전자"로서 언급된다. 본 발명에 따른 AAV cap 유전자는 rep 및 adeno 헬퍼 기능의 존재하에 AAV 벡터를 팩키징할 수 있고 표적 세포 수용체에 결합할 수 있는 Cap 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, AAV cap 유전자는 특정 AAV 혈청형, 예를 들어, 표 1에 나타낸 혈청형으로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질을 암호화한다.
표 1. AAV 혈청형
AAV의 생산을 위해 사용되는 AAV 서열은 임의의 AAV 혈청형의 게놈으로부터 유래할 수 있다. 일반적으로, AAV 혈청형은 아미노산 및 핵산 수준에서 상당한 상동성의 게놈 서열을 갖고, 유사한 세트의 유전자 기능을 제공하고, 필수적으로 물리적으로 및 기능적으로 균등한 비리온을 생성하고 실제로 동일한 기작에 의해 복제하고 어셈블리한다. AAV 혈청형의 게놈 서열 및 게놈 유사성의 논의를 위해 예를 들어, 문헌 (GenBank Accession number U89790; GenBank Accession number J01901; GenBank Accession number AF043303; GenBank Accession number AF085716; Chiorini 등, J. Vir. 71: 6823-33(1997); Srivastava 등, J. Vir. 45:555-64 (1983); Chiorini 등, J. Vir. 73:1309-1319 (1999); Rutledge 등, J. Vir. 72:309-319 (1998); 및 Wu 등, J. Vir. 74: 8635-47 (2000))을 참조한다.
모든 공지된 AAV 혈청형의 게놈 구성은 매우 유사하다. AAV의 게놈은 약 5,000 뉴클레오타이드 (nt) 미만 길이인 선형의 단일 가닥 DNA 분자이다. 역위 말단 반복체 (ITR)는 비-구조적 복제 (Rep) 단백질 및 구조적 (VP) 단백질에 대해 고유 암호화 뉴클레오타이드 서열을 플랭킹한다. VP 단백질은 캡시드를 형성한다. 말단 145 nt는 자기-상보성이고 T-형 헤어핀을 형성하는 효과적으로 안정한 분자내 듀플렉스가 형성될 수 있도록 구성된다. 이들 헤어핀 구조는 바이러스 DNA 복제를 위한 오리진으로서 기능하고 세포 DNA 폴리머라제 복합체에 대한 프라이머로서 작용한다. Rep 유전자는 Rep 단백질, Rep78, Rep68, Rep52, 및 Rep40을 암호화한다. Rep78 및 Rep68은 p5 프로모터로부터 전사되고, Rep 52 및 Rep40은 p19 프로모터로부터 전사된다. cap 유전자는 VP 단백질, VP1, VP2, 및 Vp3을 암호화한다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 전사된다. 본 발명의 벡터에 사용되는 ITR은 연합된 cap 유전자와 동일한 혈청형에 상응할 수 있거나 상이할 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터에 사용되는 ITR은 AAV2 혈청형에 상응하고 cap 유전자는 AAV5 혈청형에 상응한다.
일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 특정 세포 유형, 예를 들어, Sf9 또는 HEK 세포에서 발현을 위해 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된다. 곤충 숙주 세포 또는 포유동물 숙주 세포에서 외래 유전자를 발현하기 위해 당업자에게 공지된 기술은 발명을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 곤충 세포에서 폴리펩타이드의 분자 조작 및 발현을 위한 방법은 예를 들어, 문헌[참조: Summers 및 Smith. 1986. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex.; Luckow. 1991. In Prokop 등, Cloning and Expression of Heterologous genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152; King, L. A. 및 R. D. Possee, 1992, The baculovirus expression system, Chapman 및 Hall, United Kingdom; O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckow, 1992, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York; W.H. Freeman 및 Richardson, C. D., 1995, Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39; U.S. Pat. No. 4,745,051; US2003148506; 및 WO 03/074714)에 기재되어 있다. AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 전사에 특히 적합한 프로모터는 예를 들어, 폴리헤드론 프로모터이다. 그러나, 곤충 세포에서 활성인 다른 프로모터는 당업계에 공지된, 예를 들어, p10, p35 또는 IE-1 프로모터가 있고 추가로 상기 문헌에 기재된 프로모터가 또한 고려된다.
이종성 단백질의 발현을 위한 곤충 세포의 용도는 널리 보고되었고 벡터, 예를 들어, 곤충-세포 양립가능한 벡터와 같은 핵산을 상기 세포로 도입하는 방법 및 상기 세포를 배양물 중에 유지하는 방법으로서 널리 보고되었다. 예를 들어, 문헌 (METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed. Richard, Humana Press, NJ (1995); O'Reilly 등, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS, A LABORATORY MANUAL, Oxford Univ. Press (1994); Samulski 등, J. Vir. 63:3822-8 (1989); Kajigaya 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50 (1991); Ruffing 등, J. Vir. 66:6922-30 (1992); Kirnbauer 등, Vir. 219:37-44 (1996); Zhao 등, Vir. 272:382-93 (2000); 및 Samulski 등, U.S. Pat. No. 6,204,059)을 참조한다. 일부 구현예에서, 곤충 세포에서 AAV를 암호화하는 핵산 작제물은 곤충 세포-양립가능한 벡터이다. "곤충 세포-양립가능한 벡터" 또는 본원에 사용된 바와 같은 "벡터"는 곤충 또는 곤충 세포의 생산적 형질전환 또는 형질감염을 가능하게 하는 핵산 분자를 언급한다. 예시적 생물학적 벡터는 플라스미드, 선형 핵산 분자 및 재조합 바이러스를 포함한다. 임의의 벡터는 이것이 곤충 세포-양립가능한 이상 사용될 수 있다. 상기 벡터는 곤충 세포 게놈으로 통합될 수 있지만 곤충 세포 내 벡터의 존재는 영구적일 필요는 없고 일시적 에피좀 벡터가 또한 포함된다. 상기 벡터는 공지된 임의의 수단, 예를 들어, 세포의 화학적 처리, 전기천공 또는 감염에 의해 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 바큘로바이러스, 바이러스 벡터 또는 플라스미드이다. 보다 바람직한 구현예에서, 벡터는 바큘로바이러스이고, 즉, 작제물은 바큘로바이러스 벡터이다. 바큘로바이러스 벡터 및 이들의 사용 방법은 곤충 세포의 분자 조작에 대해 상기 인용된 문헌에 기재되어 있다.
바큘로바이러스는 절지동물의 외피 DNA 바이러스이고 이중 2개의 구성원은 세포 배양 중에 재조합체 단백질을 생산하기 위해 널리 공지된 발현 벡터이다. 바큘로바이러스는 대형 게놈 내용물의 특정 세포로의 전달을 가능하게 하도록 조작될 수 있는 환형 이중 나선 게놈 (80-200kbp)을 갖는다. 벡터로서 사용된 바이러스는 일반적으로 오토그라파 칼리포니카 (Autographa californica) 멀티캡시드 뉴클레오폴리헤드로바이러스 (AcMNPV) 또는 봄빅스 모리 (Bombyx mori)(Bm)NPV) (Kato 등, 2010)이다.
바큘로바이러스는 통상적으로 재조합체 단백질의 발현을 위해 곤충 세포의 감염을 위해 통상적으로 사용된다. 특히, 곤충에서 이종성 유전자의 발현은 예를 들어, 미국 특허 제4,745,051호; Friesen 등 (1986); EP 127,839; EP 155,476; Vlak 등 (1988); Miller 등 (1988); Carbonell 등 (1988); Maeda 등 (1985); Lebacq-Verheyden 등 (1988); Smith 등 (1985); Miyajima 등 (1987); 및 Martin 등 (1988)에 기재된 바와 같이 성취될 수 있다. 단백질 생산을 위해 사용될 수 있는 많은 바큘로바이러스 종 및 변이체 및 상응하는 허용되는 곤충 숙주 세포는 문헌 (참조: Luckow 등 (1988), Miller 등 (1986); Maeda 등 (1985) 및 McKenna (1989))에 기재되어 있다.
재조합체 AAV를 생산하기 위한 방법
본원의 개시내용은 곤충 또는 포유동물 세포에서 재조합체 AAV를 생산하기 위한 재료 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 바이러스 작제물은 추가로 목적하는 하나 이상의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 삽입을 가능하게 하는 프로모터 및 상기 프로모터의 다운스트림에 있는 제한 부위를 포함하고, 여기서, 상기 프로모터 및 상기 제한 부위는 5' AAV ITR의 다운스트림 및 3' AAV ITR의 업스트림에 위치한다. 일부 구현예에서, 바이러스 작제물은 추가로 제한 부위의 다운스트림 및 3' AAV ITR의 업스트림에 전사후 조절 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 작제물은 추가로 제한 부위에 삽입되고 프로모터에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서, 폴리뉴클레오타이드는 목적하는 단백질의 암호화 영역을 포함한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 본원에 기재된 AAV 벡터의 임의의 하나는 재조합체 AAV를 생산하기 위한 바이러스 작제물로서 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 헬퍼 기능은 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스 헬퍼 유전자를 포함하는 하나 이상의 헬퍼 플라스미드 또는 헬퍼 바이러스에 의해 제공된다. 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스 헬퍼 유전자의 비제한적인 예는 AAV 팩키징에 헬퍼 기능을 제공할 수 있는 E1A, E1B, E2A, E4 및 VA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
AAV의 헬퍼 바이러스는 당업계에 공지되어 있고 예를 들어, 아데노비리대 (Adenoviridae)과 및 헤르페스비리대 (Herpesviridae)과로부터의 바이러스를 포함한다. AAV의 헬퍼 바이러스의 예는 미국 공개 번호 제20110201088호 (이의 개시내용은 본원에 참조로 인용된다)에 기재된 SAdV-13 헬퍼 바이러스 및 SAdV-13-유사 헬퍼 바이러스, 헬퍼 벡터 pHELP (Applied Viromics)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 당업자는 AAV에 적당한 헬퍼 기능을 제공할 수 있는 AAV의 임의의 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드가 본원에 사용될 수 있음을 인지한다.
일부 구현예에서, AAV cap 유전자는 플라스미드에 존재한다. 플라스미드는 cap 유전자와 동일한 혈청형에 상응할 수 있거나 상응할 수 없는 AAV rep 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 AAV 혈청형 (AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 및 이의 임의의 변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는)으로부터의 cap 유전자 및/또는 rep 유전자는 본원에서 재조합체 AAV를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV cap 유전자는 혈청형 1, 혈청형 2, 혈청형 4, 혈청형 5, 혈청형 6, 혈청형 7, 혈청형 8, 혈청형 9, 혈청형 10, 혈청형 11, 혈청형 12, 혈청형 13 또는 이의 변이체로부터의 캡시드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 곤충 또는 포유동물 세포는 헬퍼 플라스미드 또는 헬퍼 바이러스, 바이러스 작제물 및 AAV cap 유전자를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시킬 수 있고 재조합체 AAV 바이러스는 동시-형질감염 후 다양한 시점에서 수거될 수 있다. 예를 들어, 재조합체 AAV 바이러스는 동시-형질감염 후 약 12시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 72시간, 약 96시간, 약 120시간, 또는 이들 임의의 2개 시점 사이의 시간에 수거될 수 있다.
재조합체 AAV는 또한 감염성 재조합체 AAV를 생산하기 위해 적합한 당업계에 공지된 임의의 통상적인 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 일부 경우에, 재조합체 AAV는 AAV 입자 생산을 위해 필요한 성분들의 일부를 안정하게 발현하는 곤충 또는 포유동물 세포를 사용함에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자, 및 선택가능한 마커, 예를 들어, 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 플라스미드 (또는 다중 플라스미드)는 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 곤충 또는 포유동물 세포는 이어서 헬퍼 바이러스 (예를 들어, 헬퍼 기능을 제공하는 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스) 및 5' 및 3' AAV ITR을 포함하는 바이러스 벡터 (및 요구되는 경우 이종성 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열)로 동시 형질감염시킬 수 있다. 상기 방법의 이점은 세포가 선택가능하고 재조합체 AAV의 대규모 생산에 적합하다는 것이다. 또 다른 비제한적인 예로서, 플라스미드 보다는 차라리 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스는 rep 및 cap 유전자를 팩키징 세포로 도입하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 5' 및 3' AAV LTR을 함유하는 바이러스 벡터 및 rep-cap 유전자를 함유하는 바이러스 벡터 둘 다는 생산자 세포의 DNA로 안정하게 통합될 수 있고 헬퍼 기능은 야생형 아데노바이러스에 의해 제공되어 재조합체 AAV를 생산할 수 있다.
AAV 생산에 사용되는 세포 유형
본 발명의 AAV 벡터를 포함하는 바이러스 입자는 AAV 또는 생물학적 생성물의 생산을 가능하게 하고 배양 중에 유지될 수 있는 임의의 무척추 세포 유형을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 사용된 곤충 세포주는 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda)로부터 기원할 수 있고, 예를 들어, SF9, SF21, SF900+, 드로소필라 세포주, 모기 세포주, 예를 들어, 아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) 유래된 세포주, 국내 누에 세포주, 예를 들어. 봄빅스모리 (Bombyxmori) 세포주, 트리코플루시아 니 (Trichoplusia ni) 세포주, 예를 들어, 하이 파이브 (High Five) 세포 또는 레피도프테라 세포주 예를 들어, 아스칼라파 오도라타 (Ascalapha odorata) 세포주로부터일 수 있다. 바람직한 곤충 세포는 하이 파이브, Sf9, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf9, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, BM-N, Ha2302, Hz2E5 및 Ao38을 포함하는 바큘로바이러스 감염에 민감할 수 있는 곤충 종으로부터 기원하는 세포이다.
바큘로바이러스는 절지동물의 외피 DNA 바이러스이고 이중 2개의 구성원은 세포 배양 중에 재조합체 단백질을 생산하기 위해 널리 공지된 발현 벡터이다. 바큘로바이러스는 대형 게놈 내용물의 특정 세포로의 전달을 가능하게 하도록 조작될 수 있는 환형 이중 나선 게놈 (80-200kbp)을 갖는다. 벡터로서 사용된 바이러스는 일반적으로 오토그라파 칼리포니카 (Autographa californica) 멀티캡시드 뉴클레오폴리헤드로바이러스 (AcMNPV) 또는 봄빅스 모리 (Bombyx mori)(Bm)NPV) (Kato 등, 2010)이다.
바큘로바이러스는 통상적으로 재조합체 단백질의 발현을 위해 곤충 세포의 감염을 위해 통상적으로 사용된다. 특히, 곤충에서 이종성 유전자의 발현은 예를 들어, 미국 특허 제4,745,051호; Friesen 등 (1986); EP 127,839; EP 155,476; Vlak 등 (1988); Miller 등 (1988); Carbonell 등 (1988); Maeda 등 (1985); Lebacq-Verheyden 등 (1988); Smith 등 (1985); Miyajima 등 (1987); 및 Martin 등 (1988)에 기재된 바와 같이 성취될 수 있다. 단백질 생산을 위해 사용될 수 있는 많은 바큘로바이러스 종 및 변이체 및 상응하는 허용되는 곤충 숙주 세포는 문헌 (참조: Luckow 등 (1988), Miller 등 (1986); Maeda 등 (1985) 및 McKenna (1989))에 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 본 발명의 방법은 또한 AAV의 복제 또는 생물학적 생성물의 생산을 가능하게 하고 배양 중에 유지될 수 있는 임의의 포유동물 세포 유형을 사용하여 수행된다. 사용되는 바람직한 포유동물 세포는 HEK293, HeLa, CHO, NS0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19 및 MRC-5 세포일 수 있다.
AAV FVIII 벡터의 시험
본 발명의 완전히 팩키징된 AAV FVIII 벡터를 시험하기 위한 검정은 예를 들어, (1) 시험관내 간-특이적 mRNA 발현 및 스플라이싱 및 FVIII 단백질 생산 및 분비를 조사하기 위한 인간 간으로부터 유래된 세포주인 HepG2 세포에서 AAV 벡터 핵산을 포함하는 이중 가닥 DNA 플라스미드의 일시적 형질감염; (2) HEK293 세포 및 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포에서 AAV FVIII 벡터를 포함하는 AAV 비리온의 생산; (3) 알칼린 겔 분석 및 복제 검정에 의한 AAV 벡터 핵산의 평가; 및 (4) Rag2 마우스에서 FVIII 발현, FVIII 활성, 및 FVIII 비활성의 평가를 포함한다. 이들 검정은 실시예에 보다 상세하게 기재되어 있다.
본 발명의 완전히 팩키징된 AAV FVIII 벡터는 도 1에 나타낸 대표적 벡터와 적어도 동일한 발현 벡터 및/또는 활성을 나타내고 바람직하게 도 1에 나타낸 벡터와 비교하여 바람직하게 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 또는 5-배 이상의 발현 및/또는 활성을 나타낸다.
본 발명의 완전히 팩키징된 AAV FVIII 벡터는 거의 단편 게놈 오염물 없이 높은 벡터 수율을 갖고 도 1에 나타낸 벡터와 비교하여 바람직하게 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 또는 5-배 초과의 벡터 수율을 갖는다.
약제학적 제형
다른 구현예에서, 본 발명은 A형 혈우병를 앓는 대상체에게 투여하는데 유용한 FVIII AAV 벡터/비리온의 약제학적 제형에 관한 것이다. 특정 양상에서, 본 발명의 약제학적 제형은 본원에 기재된 벡터로부터 생산된 재조합체 AAV FVIII 비리온을 포함하는 액체 제형이고, 여기서, 상기 제형 중 재조합체 AAV FVIII 비리온의 농도는 광범위하게 다양할 수 있다. 특정 구현예에서, 제형 중 재조합체 AAV FVIII 비리온의 농도는 1E12 vg/ml 내지 2E14 vg/ml의 범위일 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 제형 중 재조합체 AAV FVIII 비리온의 농도는 약 2E13 vg/ml이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 제형 중 존재하는 재조합체 AAV FVIII 비리온은 AAV5 캡시드에서 도 2a에 도식적으로 나타낸 프로토 1 벡터의 캡시드화로부터 유래된 AAV5-FVIII-SQ이다.
다른 양상에서, 본 발명의 AAV FVIII 약제학적 제형은 저장을 위해 유리한 성질을 갖는 제형 및 A형 혈우병의 치료를 위한 대상체로의 투여를 제공하기 위해 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 약제학적 제형은 안정성에 있어서 검출가능한 변화 없이 적어도 2주,바람직하게 적어도 4주, 보다 바람직하게 적어도 6주 및 여전히 보다 바람직하게 적어도 약 8주의 기간 동안 ≤ 65 ℃에서 저장될 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "안정한"은 제형 중에 존재하는 재조합체 AAV FVIII 바이러스가 필수적으로 저장 동안에 이의 물리적 안정성, 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 보유함을 의미한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 약제학적 제형 중에 존재하는 재조합체 AAV FVIII 바이러스는 -65 ℃에서 소정의 기간 동안 저장 동안에 인간 환자에서 생물학적 활성의 적어도 약 80 %, 보다 바람직하게 인간 환자에서 이의 생물학적 활성의 적어도 약 85 %, 90 %, 95 %, 98 % 또는 99 %를 보유한다.
특정 양상에서, 재조합체 AAV FVIII 비리온을 포함하는 제형은 하나 이상의 완충제를 추가로 포함한다. 예를 들어, 다양한 양상에서, 본 발명의 제형은 약 0.1 mg/ml 내지 약 3 mg/ml, 약 0.5 mg/ml 내지 약 2.5 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 2 mg/ml, 또는 약 1.4 mg/ml 내지 약 1.6 mg/ml의 농도에서 제이인산나트륨을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 AAV FVIII 제형은 약 1.42 mg/ml의 이염기성 인산나트륨 (건조된)을 포함한다. 본 발명의 재조합체 AAV FVIII 제형 중에 사용될 수 있는 또 다른 완충제는 일부 구현예에서, 약 0.1 mg/ml 내지 약 3 mg/ml, 약 0.5 mg/ml 내지 약 2.5 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 2 mg/ml, 또는 약 1.3 mg/ml 내지 약 1.5 mg/ml의 농도에서 사용되는 일염기성 일수화물의 인산나트륨이다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 AAV FVIII 제형은 약 1.38 mg/ml의 일염기성 일수화물의 인산나트륨을 포함한다. 본 발명의 보다 더 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합체 AAV FVIII 제형은 약 1.42 mg/ml의 이염기성의 인산나트륨 및 약 1.38 mg/ml의 일염기성 일수화물의 인산나트륨을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV FVIII 제형은 바람직하게 약 1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 예를 들어, 약 1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 5 mg/ml 내지 약 15 mg/ml, 또는 약 8 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도에서 염화나트륨과 같은 하나 이상의 등장화제를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제형은 약 8.18 mg/ml의 염화나트륨을 포함한다. 당업계에 공지된 다른 완충제 및 등장화제는 적합하고 일상적으로 본 발명의 제형에 사용하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV FVIII 제형은 하나 이상의 증량제를 포함할 수 있다. 예시적 증량제는 제한 없이 만니톨, 슈크로서, 덱스트란, 락토스, 트레할로스, 및 포비돈 (PVP K24)을 포함한다. 특정 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제형은 약 5 mg/ml 내지 약 40 mg/ml, 또는 약 10 mg/ml 내지 약 30 mg/ml, 또는 약 15 mg/ml 내지 약 25 mg/ml의 양으로 존재할 수 있는 만니톨을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 만니톨은 약 20 mg/ml의 농도로 존재한다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 재조합체 AAV FVIII 제형은 비-이온 계면활성제인 하나 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다. 예시적 계면활성제는 이온 계면활성제, 비-이온 계면활성제 및 이의 배합물을 포함한다. 예를 들어, 계면활성제는 제한 없이 TWEEN 80 (또한 폴리소르베이트 80으로서 또는 이의 화학적명 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트로서 공지된), 나트륨 도데실설페이트, 나트륨 스테아레이트, 암모늄 라우릴 설페이트, TRITON AG 98 (Rhone-Poulenc), 폴록사머 407, 폴록사머 188 등 및 이의 배합물일 수 있다. 특정 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제형은 약 0.1 mg/ml 내지 약 4 mg/ml, 또는 약 0.5 mg/ml 내지 약 3 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 3 mg/ml, 약 1.5 mg/ml 내지 약 2.5 mg/ml, 또는 약 1.8 mg/ml 내지 약 2.2 mg/ml의 농도로 존재할 수 있는 폴록사머 188을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 폴록사머 188은 약 2.0 mg/ml의 농도로 존재한다.
본 발명의 특정 바람직한 구현예에서, 본 발명의 약제학적 제형은 약 1.42 mg/ml의 이염기성 인산나트륨, 약 1.38 mg/ml의 일염기성 일수화물 인산나트륨, 약 8.18 mg/ml의 염화나트륨, 약 20 mg/ml 만니톨 및 약 2 mg/ml의 폴록사머 188을 포함하는 액체 용액 중에 제형화된 AAV5-FVIII-SQ를 포함한다.
본원의 개시내용의 재조합체 AAV FVIII 바이러스-함유 제형은 안정하고 품질, 효능 또는 순도에서 허용되지 않는 변화 없이 연장된 기간 동안 저장될 수 있다. 하나의 양상에서, 제형은 적어도 1개월, 예를 들어, 적어도 1 개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 24개월 이상 동안 약 5 ℃ (예를 들어, 2 ℃ 내지 8 ℃)의 온도에서 안정하다. 다른 양상에서, 제형은 약 -20 ℃ 이하의 온도에서, 적어도 6개월, 예를 들어, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 24개월, 적어도 36개월 이상 동안 안정하다. 또 다른 양상에서, 제형은 약 -40 ℃ 이하의 온도에서, 적어도 6개월, 예를 들어, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 24개월, 적어도 36개월 이상 동안 안정하다. 또 다른 양상에서, 제형은 약 -60 ℃ 이하의 온도에서, 적어도 6개월, 예를 들어, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 24개월 동안, 적어도 36개월 이상 동안 안정하다.
치료 방법
특정 구현예에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 AAV FVIII 벡터, 재조합체 AAV FVIII 바이러스 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여함을 포함하는 A형 혈우병를 앓는 대상체를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 AAV FVIII 벡터, 재조합체 AAV FVIII 바이러스 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여함을 포함하는 A형 혈우병를 앓는 대상체에서 출혈 에피소드 동안에 출혈 시간을 감소시키기 위한 방법에 관한 것이다. 이와 관련하여, A형 혈우병의 치료와 관련하여 또는 A형 혈우병를 앓는 대상체에서 출혈 에피소드 동안에 출혈 시간을 감소시키는 방법에 사용하기 위한 "치료학적 유효량"은 하기의 효과 중 하나 이상을 유발할 수 있는 양을 언급한다: (1) 예를 들어, 손상, 관절통 또는 종창, 지속적 두통, 구토 또는 피로를 포함하는 A형 혈우병의 생리학적 증상 중 하나 이상의 어느 정도의 감소, 억제 또는 예방, (2) 혈액을 응고시키는 능력에서의 개선, (3) 출혈 에피소드 동안에 전체 출혈 시간의 감소, (4) 대상체의 혈장에서 기능적 FVIII 단백질의 농도 또는 활성에서 측정가능한 증가를 유도하는 투여, 및/또는 (5) 장애와 연관된 하나 이상의 어느 정도의 경감. 본원에 기재된 바와 같은 치료 목'을 위해 AAV FVIII 벡터 또는 바이러스 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물의 "치료학적 유효량"은 경험적으로 및 통상적인 방식으로 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 그러나, 재조합체 AAV FVIII 바이러스의 "치료학적 유효량"은 약 1E12 vg/kg 체중 내지 약 1E14 vg/kg 체중, 바람직하게 약 6E12 vg/kg 체중 내지 약 6E13 vg/kg 체중 범위이다. 특히 바람직한 구현예에서, 치료학적 유효량의 재조합체 AAV FVIII 바이러스는 약 2E13 vg/kg 체중이다. 또 다른 특히 바람직한 구현예에서, 치료학적 유효량의 재조합체 AAV FVIII 바이러스는 약 6E13 vg/kg 체중이다.
본 발명의 재조합체 AAV FVIII 벡터/바이러스는 다양한 공지된 투여 기술을 통해 대상체, 바람직하게 포유동물 대상체, 보다 바람직하게 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 재조합체 AAV FVIII 유전자 치료요법 바이러스는 단일 볼러스로서 또는 적어도 약 1, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150, 180, 210 또는 240분 이상일 수 있는 연장된 기간 동안 정맥내 주사에 의해 투여된다. 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 투여된 재조합체 AAV FVIII 바이러스는 AAV5-FVIII-SQ이다.
본 발명의 재조합체 AAV FVIII 벡터/바이러스, 또는 이를 포함하는 약제학적 제형의 투여는 바람직하게 투여 전, 대상체에서 혈장 중 존재하는 기능적 FVIII 단백질 활성의 양과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 이상의 IU/dl의 대상체의 혈장 중 기능적 FVIII 단백질 활성의 증가를 유도한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 재조합체 AAV FVIII 벡터/바이러스, 또는 이를 포함하는 약제학적 제형의 투여는 대상체의 혈장 중에 기능적 FVIII 단백질 활성의 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 IU/dl의 기능적 FVIII 단백질 활성의 발현을 유도한다. 이와 관련하여, FVIII 활성과 관련하여 용어 "IU" 또는 "국제 유니트"는 널리 이해되고 허용되는 용어이고, 여기서, 1 IU의 FVIII 활성은 1 ml의 정상 인간 혈장에서 FVIII 양과 균등하다. 혈장 중 FVIII 활성은 예를 들어, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (APPT) 방법 (문헌참조: 예를 들어, Miletich JP: Activated partial thromboplastin time. In Williams Hematology. Fifth edition. Edited by E Beutler, MA Lichtman, BA Coller, TJ Kipps. New York, McGraw-Hill, 1995, pp L85-86, Greaves 및 Preston, Approach to the bleeding patient. In Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice. Fourth edition. Edited by RW Colman, J Hirsh, VJ Marder, 등 Philadelphia, JB Lippincott Co, 2001, pp 1197-1234 및 Olson 등, Arch. Pathol. Lab. Med. 122:782-798 (1998)) 또는 발색 FXa 검정 (문헌참조: Harris 등, Thromb. Res. 128(6):125-129 (2011))을 포함하는 다수의 널리 공지되고 허용되는 검정에 의해 정량적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 대상체에서 출혈 시간은 예를 들어, Ivy 방법 방법 (문헌참조: 예를 들어, Ivy 등, Surg. Gynec. Obstet. 60:781 (1935) 및 Ivy 등, J. Lab. Clin. Med. 26:1812 (1941)) 또는 듀크 (Duke) 방법 (문헌참조: 예를 들어, Duke 등, JAMA 55:1185 (1910))을 포함하는 널리 공지되고 허용되는 기술에 의해 측정될 수 있다. 대상체에서 "출혈 에피소드"는 외적으로 또는 내적으로 대상체에서 출혈을 유도하는 손상을 언급하고 일반적으로 손상으로부터 혈액 응고의 형성까지의 기간을 포함한다.
본 발명의 AAV FVIII 바이러스의 투여는 일부 경우에 관찰가능한 정도의 간독성을 유도한다. 간독성은 예를 들어, AAV FVIII 투여 전 (즉, 기준선) 및 AAV FVIII 투여 후 둘 다에서 대상체의 혈류 중에 특정 간-연관 효소(들) (예를 들어, 알라닌 트랜스아미나제, ALT) 의 농도를 측정하는, 다양한 널리 공지되고 통상적으로 사용되는 기술에 의해 측정될 수 있다. AAV FVIII 투여 후 ALT 농도의 관찰가능한 증가 (투여 전과 비교하여)는 약물-유도된 간독성을 지적한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 치료학적 유효량의 AAV FVIII 바이러스의 투여에 추가로, 대상체는 AAV FVIII 바이러스의 투여와 연관된 임의의 간독성을 예방하고/하거나 치료하기 위해 예방학적으로, 치료학적으로, 또는 둘 다로 코르티코스테로이드로 처리한다. “예방학적”코르티코스테로이드 처리는 대상체에서 간독성을 예방하고/하거나 측정된 ALT 수준에서의 증가를 예방하기 위한 코르티코스테로이드의 투여를 언급하다. 치료학적 코르티코스테로이드 처리는 AVV FVIII 바이러스의 투여에 의해 유발된 간독성을 감소시키고/시키거나 AAV FVIII 바이러스의 투여에 의해 유발되는 대상체의 혈류에서 상승된 ALT 농도를 감소시키기 위한 코르티코스테로이드의 투여를 언급한다. 특정 구현예에서, 예방학적 또는 치료학적 코르티코스테로이드 처리는 대상체에게 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 이상의 mg/일의 코르티코스테로이드의 투여를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체의 예방학적 또는 치료학적 코르티코스테로이드 처리는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주 이상의 연속 기간 동안 수행할 수 있다. 본원에 기재된 방법에 사용하는 코르티코스테로이드는 예를 들어, 덱사메타손, 프레드니손, 플루드로코르티손, 하이드로클로라이드 등을 포함하는 임의의 공지되거나 통상적으로 사용되는 코르티코스테로이드를 포함한다.
항-AAV 항체의 검출
상기된 바와 같이, 치료학적 용법에서 AAV 벡터의 인간 환자로의 투여 전, 전신 AAV-매개된 인자 VIII 유전자 전달을 사용한 성공적인 간 형질도입의 가능성을 최대화하기 위해, 유망한 환자는 세포 형질도입을 차단시킬 수 있거나 다르게는 치료학적 용법의 전체 효능을 감소시킬 수 있는 항-AAV 캡시드 항체의 존재에 대해 평가될 수 있다. 상기 항체는 유망한 환자의 혈청 중에 존재할 수 있고 임의의 혈청형의 AAV 캡시드에 대해 지시될 수 있다. 하나의 구현예에서, 기존의 항체가 지시된 혈청형은 AAV5이다.
기존의 AAV 면역력을 검출하는 방법은 널리 공지되어 있고 당업계에서 통상적으로 사용되고 세포 기반 시험관내 형질도입 억제 (TI) 검정, 생체내 (예를 들어, 마우스에서) T1 검정 및 총 항-캡시드 항체 (Tab)의 ELISA-기반 검출을 포함한다 (문헌참조: 예를 들어, Masat 등, Discov. Med. 15:379-389 (2013) 및 Boutin 등, Hum. Gene Ther. 21:704-712 (2010)). 상기 검정은 AAV-유도가능한 리포터 벡터가 이전에 도입된 숙주 세포를 사용할 수 있다. 리포터 벡터는 GFP 등과 같은 유도가능한 리포터 유전자를 포함할 수 있고, 이의 발현은 AAV 바이러스에 의한 숙주 세포의 형질도입시 유도된다. 숙주 세포 형질도입을 예방하고/감소시킬 수 있는 인간 혈청에 존재하는 항-AAV 캡시드 항체는 이로써 시스템 중에 리포터 유전자의 전체 발현을 감소시킨다. 따라서, 상기 검정은 치료학적 FVIII AAV 바이러스에 의한 세포 형질도입을 예방하고/감소시킬 수 있는 인간 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
항-AAV 캡시드 항체를 검출하기 위한 TAb 검정은 인간 혈청이 통과됨에 따라 혈청 중 존재하는 항-캡시드 항체가 고체상 결합된 캡시드 "포획제"에 결합되도록 하는 “포획제”로서 고체상 결합된 AAV 캡시드를 사용할 수 있다. 비특이적 결합을 제거하기 위해 세척되는 즉시, "검출제"는 포획제에 결합된 항-캡시드 항체의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 검출제는 항체, AAV 캡시드 등일 수 있고, 결합된 항-캡시드 항체의 검출 및 정량을 보조하기 위해 검출가능하게 표지될 수 있다. 하나의 구현예에서, 검출제는 전기화학발광 기술 및 장비를 사용하여 검출될 수 있는 루테늄 또는 루테늄-복합체로 표지시킨다.
동일한 상기된 방법은 목적하는 치료학적 AAV 바이러스로 이전에 처리된 환자에서 항-AAV 캡시드 면역반응의 생성을 평가하고 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이와 같이, 이들 기술은 치료학적 FVIII AV 바이러스로 처리 전 항-AAV 캡시드 항체의 존재를 평가하기 위해 사용될 수 있을 뿐만 아니라 이들은 또한 투여후 투여된 치료학적 FVIII AAV 바이러스에 대한 면역 반응의 유도를 평가하고 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 인간 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체를 검출하기 위한 기술 및 A형 혈우병의 치료를 위한 치료학적 FVIII AAV 바이러스의 투여를 조합한 방법을 고려하고, 여기서, 인간 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체를 검출하기 위한 기술은 치료학적 FVIII AAV 바이러스의 투여 전 또는 투여 후 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 양상 및 이점은 하기의 실례의 실시예의 고려시 이해된다.
실시예
실시예 1
프로토 1, 프로토 1S, 프로토 2S 및 프로토 3S 벡터의 생성
도 1에 개략적으로 나타낸 재조합체 AAV FVIII 벡터는 2011년 1월 13일자로 공개된 WO 2011/005968 (이의 전문이 본원에 참조로 인용된다) 및 문헌 (McIntosh 등, Blood 121:3335-3344, 2013)에 상세히 기재되어 있고 오버사이즈, 즉, 5.0 kb 초과의 AAV 벡터이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 벡터는 좌측에서 우측으로 AAV 혈청형 2 (AAV2) 5' ITR, 야생형 AAV2 바이러스 서열, 34 염기 인간 아포지질단백질 E (ApoE)/C1 인핸서, 32 염기 인간 알파 항-트립신 (AAT) 프로모터 원위 X 영역, 5’비해독 영역 (UTR) 서열의 42 염기를 포함하는 186 염기 인간 AAT 프로모터, 코돈-최적화된 인간 FVIII 서열을 포함하고, 여기서, B 도메인은 14 아미노산 SQ 서열, 49 염기 합성 폴리아데닐화 서열, 야생형 AAV2 바이러스 서열 및 AAV2 3' ITR로 대체되어 있다. 상기 벡터는 5081 염기 길이이다.
도 1에 나타낸 FVIII 벡터보다 작은 벡터를 얻기 위해, 본원 발명자에 의해 FVIII 발현 및/또는 활성, AAV 비리온 생산에 불필요하다고 여겨지는 DNA 서열을 본래의 벡터 서열로부터 제거하였다. 외인성 DNA 서열을 제거하였고, 이는 AAV2 5' ITR의 3’에 있는 AAV2 바이러스 서열의 53 염기, AAV2 3’ITR의 5'에 있는 AAV2 바이러스 서열의 46 염기, 및 코돈-최적화된 FVIII SQ 암호화 영역에 인접한 11 염기를 포함한다. SQ 링커를 보유하는 신규한 코돈-최적화된 B-도메인-유래된 FVIII-암호화 서열은 또한 생산되어 신규한 재조합체 AAV FVIII 벡터로 도입되었다. AAV2 5' 및 3' ITR에 특정 서열 변화가 이루어졌다. 4970 염기 길이인 수득한 프로토 1 벡터는 도 2a에 개략적 형태로 나타내었고 완전한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1에 제시되어 있다. 본 발명자들은 프로토 1은 감염성 재조합체 AAV 바이러스를 생산하고 기능적 인자 VIII 폴리펩타이드를 암호화함을 입증하였다.
AAV2 ITR에서 헤어핀 루프에 인접한 서열은 또한 재조합체 AAV 벡터에서 불필요할 수 있다 (참조: Srivastava 등, US Pat. No. 6,521,225; Wang 등, J. Virol. 70:1668-1677, 1996; 및 Wang 등, J. Virol. 71:3077-3082, 1997). 프로토 1 벡터의 크기를 추가로 감소시키기 위해, AAV2 서열의 10 염기를 AAV2 5' ITR에서 헤어핀 루프의 3'에서 직접적으로 제거하였고 AAV2 서열의 10 염기를 AAV2 3’ITR에서 헤어핀 루프의 5'에서 직접적으로 제거하였다. 4950 염기 길이인 수득한 프로토 1S 벡터는 도 2b에 개략적 형태로 나타내고 서열은 서열번호 2로 기재된다.
프로토 1S 벡터에서 FVIII SQ 변이체의 발현을 증가시키기 위한 노력으로, 100 염기 합성 인트론이 코돈-최적화된 FVIII 서열에서 엑손 1과 2 사이에 삽입되었다. 인트론의 삽입은 아마 예를 들어, 인터페론 유전자와 같은 다른 인트론-적은 유전자에서 mRNA 발현의 증가된 수준을 초래할 수 있는 것으로 공지되어 있다.
인핸서는 거리- 및 배향-독립적인 방식으로 작동하는 것으로 정의되어 있다. 34 염기 ApoE/C1 인핸서는 미국 특허 제8,030,065호 (FIX 발현) 및 WO 2011/005968 (FVIII 발현)에서 이의 추정 인핸서 활성에 의해 예시되는 바와 같이, FVIII 발현에 대해 거리- 및 배향-독립적인 방식으로 작용하며, 상기 특허문헌들을 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다. 문헌 (참조: Di Simone 등, EMBO J. 6:2759-2766, 1987)에 기재된 32 염기 인간 AAT 프로모터 원위 X 영역은 이종성 프로모터의 발현을 증진시키는 조절 도메인 내에 위치한다.
프로토 1S 벡터에서 FVIII SQ 변이체의 발현을 추가로 증가시키기 위한 또 다른 시도에서, 합성 인트론 서열은 인간 AAT 프로모터의 업스트림의 위치로부터 이동된, 34 염기 인간 ApoE/C1 인핸서 및 32 염기 인간 AAT 프로모터 원위 X 영역을 통합했다. 이들 두 조절 요소는 프로토 1S의 배향에 대해 역 방향으로 삽입되었다. 4983 염기 길이인 수득한 프로토 2S 벡터는 도 2c에 개략적 형태로 나타내었고 서열은 서열번호 3에 제시되어 있다.
인간 AAT 프로모터 원위 X 영역이 인트론에서 전사 시작 부위로부터 하부스트림에 기능하는 것으로 이전에 밝혀지지 않았기 때문에, 프로토 2S 벡터에서 이 조절 요소는 인트론에서 인핸서의 제1 카피물과 동일한 배향으로 34 염기 인간 ApoE/C1 인핸서의 제2 카피물로 대체되었다. 4985 염기 길이인 수득한 프로토 3S 벡터는 도 2d에 개략적 형태로 나타내고 서열은 서열번호 4에 제시되어 있다.
프로토 1, 프로토 1S, 프로토 2S 및 프로토 3S 벡터 핵산을 pUC19 박테리아 발현 플라스미드에 클로닝하여, AAV FVIII 벡터의 이중-가닥 형태를 생성하였다.
실시예 2
프로토 4, 프로토 5, 프로토 6 및 프로토 7 벡터의 생성
프로토 1 벡터의 크기를 추가로 감소시키고/시키거나 프로토 1 벡터와 비교하여 FVIII의 발현을 증가시키기 위해, 경쇄 또는 C 도메인에 인접하여 위치하는 a3 도메인을 결실시켰다. a3 도메인은 폰 빌레브란트 인자 (von Willenbrand Factor)와의 결합에 관련되어 있지만, 생체내 기능적으로 활성인 FVIII에 불필요할 수 있다.
프로토 1 벡터로부터 시작하여, 14 아미노산 SQ 서열 및 41 아미노산 a3 도메인 (야생형 FVIII의 아미노산 1649-1689에 상응함)을 삭제하였다. 4805 염기 길이인 수득한 프로토 4 벡터는 도 3a에 개략적 형태로 나타내고 서열은 서열번호 5에 제시되어 있다.
B 도메인 및 a3 도메인 결실된 FVIII의 발현을 증가시키기 위한 시도에서, 129 염기, 절단된 FVIII 인트론은 프로토 4 벡터에서 코돈-최적화된 FVIII 서열에서 엑손 1과 2 사이에 삽입하였다. 4934 염기 길이인 수득한 프로토 5 벡터는 도 3b에 개략적 형태로 나타내고 서열은 서열번호 6에 제시되어 있다.
B 도메인 및 a3 도메인 결실된 FVIII의 발현을 추가로 증가시키기 위한 시도에서, 34 염기 인간 ApoE/C1 인핸서의 제2 카피물을 프로토 5 벡터에서 정배향 또는 역배향으로 삽입하였다. 4934 염기 길이이고 순배향으로 인트론성 ApoE/C1 인핸서를 갖는 수득한 프로토 6 벡터를 도 3c에 개략적 형태로 나타내고 서열은 서열번호 7에 제시되어 있다.
4934 염기 길이이고 역배향으로 인트론성 ApoE/C1 인핸서를 갖는 수득한 프로토 7 벡터를 도 3d에 개략적 형태로 나타내고 서열은 서열번호 8에 제시되어 있다.
프로토 4, 프로토 5, 프로토 6 및 프로토 7 벡터 핵산을 pUC19 박테리아 발현 플라스미드에 클로닝하여, AAV FVIII 벡터의 이중-가닥 형태를 생성하였다.
실시예 3
AAVFVIII벡터의 발현 및 활성을 시험하기 위한 검정
본 발명의 재조합체 AAV FVIII 벡터를 시험하기 위한 검정은 예를 들어, (1) 시험관내 간-특이적 mRNA 발현 및 스플라이싱 및 FVIII 단백질 생산 및 분비를 조사하기 위한 인간 간으로부터 유래된 세포주인 HepG2 세포에서 AAV 벡터 핵산을 포함하는 이중 가닥 DNA 플라스미드의 일시적 형질감염; (2) 293 세포 및 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포에서 AAV FVIII 벡터를 포함하는 AAV 비리온의 생산; (3) 알칼린 겔 분석 및 복제 검정에 의한 AAV 벡터 핵산의 평가; 및 (4) Rag2 마우스에서 FVIII 발현, FVIII 활성, 및 FVIII 비활성의 평가를 포함한다.
일시적 형질감염 검정
예비 시험관내 검정은 FVIII 발현 및 본 발명의 AAV FVIII 벡터로부터의 활성을 도 1에 나타낸 FVIII-발현 벡터로부터의 활성과 비교하기 위해 수행된다. 본 발명의 AAV FVIII 벡터의 이중-가닥 형태는 인간 간 세포주, HepG2로 일시적으로 형질감염된다. 형질감염 후에, 예를 들어, 24 또는 48시간 후에, 배양 상등액 중에서 FVIII 항원 및 활성을 측정한다.
이 검정을 사용하여, 프로토 1, 프로토 1S 및 프로토 2S 벡터로 일시적으로 형질감염된 HepG2 세포에서 FVIII 활성은 도 1의 FVIII 벡터를 사용하여 수득한 FVIII 활성과 유사하였으며, 이는 프로토 1, 프로토 1S 및 프로토 2S 벡터가 기능적 인자 VIII 단백질을 발현할 수 있음을 입증하였다.
293 세포 및 바큘로바이러스-감염 곤충 세포에서의 AAV FVIII 비리온의 생산
본 발명의 재조합체 AAV FVIII 벡터가 실제로 FVIII를 암호화하는 핵산을 팩키징한다는 것을 입증하기 위해, 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 생성된 AAV FVIII 벡터의 이중-가닥 형태는 AAV 비리온을 생산할 수 있는 세포내로 도입된다. 제1 AAV 바이러스 생산 시스템에서, 이중-가닥 형태의 AAV FVIII 벡터 핵산을 포함하는 플라스미드를 AAV Cap 및 Rep 단백질을 발현하는 플라스미드 및 AAV 비리온 생산에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능을 발현하는 플라스미드와 함께 293 세포에 동시 형질감염시킨다. 제2 AAV 바이러스 생산 시스템에서, AAV FVIII 벡터 핵산 및 AAV Cap 및 Rep 단백질을 발현하는 바큘로바이러스 작제물을 생성한 다음 곤충 Sf9 세포에 동시-감염시킨다. 일시적으로 형질감염된 293 세포 또는 바큘로바이러스-감염 Sf9 세포에서 생산된다. 수득한 AAV 비리온을 당업계에 공지된 표준 방법으로 정제하고 분석한다.
알칼린 겔 및 복제 검정에 의한 평가
알칼린 겔 전기영동 검정은 팩키징된 핵산의 크기를 결정하기 위해 사용된다. 복제 센터 검정은 어떤 AAV FVIII 벡터가 두 가지 팩키징 방법에 의해 온전한 형태로 팩키징되는지를 결정하는데 사용된다.
프라이머 연장 검정은 완전한 말단을 갖는 AAV FVIII 벡터 핵산의 양을 정량하는데 사용되는데, 즉, AAV2 5' ITR (센스 가닥) 또는 3’ITR (안티-센스 가닥)에서 헤어핀 루프의 5’말단에서 종결된다.
또는, PCR 검정은 AAV FVIII 벡터 핵산이 완전한 말단을 갖는지를 결정하는데 사용되는데, 즉, AAV2 5' ITR (센스 가닥) 또는 3’ITR (안티-센스 가닥)에서 헤어핀 루프의 5’말단에서 종결된다.
Rag2 마우스에서의 평가
일시적으로 형질감염된 293 세포 또는 바큘로바이러스-감염 Sf9 세포 팩키징된 벡터에서 생산된 AAV 비리온은 정맥내 투여된 2e11, 2e12, 및 2e13 바이러스 게놈 (vg)/kg에서 Rag2 마우스에서 FVIII 발현 및 활성에 대해 시험한다. FVIII 발현 및/또는 활성이 AAV 바이러스 또는 인간 FVIII 단백질에 대한 숙주 면역 반응의 존재에 의해 복잡하지 않기 때문에 Rag2 마우스가 이 검정에 사용된다.
FVIII 항원은 ELISA-기반 검정을 사용하여 결정된다. FVIII 활성은 FXa 활성화 검정 및/또는 응고 검정을 사용하여 결정된다. FVIII 항원 및 활성 검정을 사용하여, FVIII 특이적 활성을 결정한다.
본 발명의 실시에 있어서 다수의 변형 및 변화는 본 발명의 바람직한 구현예를 고려하여 당업자에게 발생할 것으로 예상된다. 결론적으로, 본 발명의 범위에 적용되어야 할 유일한 제한은 첨부된 청구범위에 나타나는 것이다.
실시예 4
개선된 프로모터/인핸서 서열을 갖는 작제물의 생성
기능적 FVIII의 발현을 증가시키는 강력한 프로모터를 갖는 추가의 재조합체 AAV 벡터를 생성하기 위해, 변형된 인핸서 및/또는 프로모터 서열을 갖는 작제물을 생성하였다. 일부 구현예에서, 작제물은 ApoE 또는 μ-글로불린 인핸서의 단축된 벡터를 포함하였다. 이들 작제물은 표준 DNA 클로닝 기술을 사용하여 생성되었으며 이의 서열은 서열번호 9-45로 나타낸다.
실시예 5
AAV 바이러스 입자의 생성
재조합체 Bacmid의 생성
DH10 Bac 컴피턴트 세포 (competent cell)를 얼음 상에서 해동시켰다. 재조합체 셔틀 플라스미드 (예를 들어, pFB-GFP)를 첨가하고 컴피턴트 세포와 온화하게 혼합하고 얼음 상에서 30분 동안 항온처리하였다. 이어서 상기 컴피턴트 세포를 대략적으로 42 ℃의 온도에서 30초 동안 열 처리한 다음 얼음 상에서 2분 동안 냉각시켰다. 상기 컴피턴트 세포를 42 ℃에서 30초 동안 열 충격시키고 얼음 상에서 2분 동안 냉각시켰다. SOC를 세포에 첨가하고 재조합이 일어날 수 있도록 4시간 동안 진탕시키면서 37 ℃에서 항온처리하였다. 항온처리 기간 동안에, X-gal을 형질전환을 위해 2개의 LB-플레이트 (추가로 다양한 항생제 (예를 들어, 카나마이신, 겐타마이신 및 테트라사이클린)를 함유함)에 도말하고 이어서 IPTG를 수행한다.
일정량의 항온처리 혼합물을 수득하고, 희석시킨 다음 2개의 LB-플레이트 상에 도말하고 37 ℃에서 대략적으로 30-48시간 동안 항온처리한다. 여러 백색 콜로니를 각각의 플레이트로부터 선택하고 LB-플레이트에 제공된 항생제의 동일한 조합을 함유하는 LB 배지에서 밤새 배양하였다. 그 다음, Bacmid DNA 및 글리세롤 스톡을 제조하고 -80 ℃에서 저장하였다.
재조합체 Bacmid DNA의 정제
일정량의 Bacmid 글리세롤 스톡을 제거하고 상술된 LB-플레이트에 제공된 항생제의 동일한 조합을 함유하는 LB 배지에 접종한다. 배양물을 진탕하면서 37 ℃에서 밤새 성장하도록 하였다. 그 다음, 일정량의 배양물을 대략적으로 30초 동안 최고 속도로 소형원심분리기에서 회전시킨다.
펠렛을 피펫을 사용하여 재현탁 완충액에 이어서 용해 완충액에 재현탁하고, 튜브를 수회 뒤집어 완충액을 혼합한 다음 대략적으로 5분 동안 실온에서 항온처리하였다. 예시적인 재현탁 완충액은 50 mM Tris-CL, pH 8.0, 10 mM EDTA 및 100 ug/mL RNase A를 포함한다. 예시적인 용해 완충액은 200 mM NaOH 및 1 % SDS를 포함한다. 일정량의 침전 완충액 (예를 들어, 3.0 M 아세트산칼륨, pH 5.5를 포함하는 완충액)을 서서히 첨가하고 튜브를 수회 뒤집어 완충액을 혼합한 다음 얼음 상에서 대략적으로 10분 동안 항온처리하였다. 튜브를 대략적으로 10분 동안 최고 속도로 원심분리하고 상등액을 이소프로판올을 함유하는 튜브에 부어넣는다. 튜브를 수회 뒤집어 용액을 혼합하였다.
그 다음, 용액을 실온에서 대략적으로 15분 동안 최고 속도로 원심분리하고 상등액을 피펫으로 원심분리한 직후 제거하였다.
일정량의 70 % 에탄올을 첨가하여 펠렛을 헹구고 다시 1분 동안 최고 속도로 회전시켰다. 이어서 에탄올을 제거하고 용액을 다시 회전시켜 미량의 에탄올을 제거하였다. 일정량의 TE/EB 완충액을 각각의 튜브에 첨가하고 펠렛으로 조심스럽게 용해시켰다. 즉시 사용하지 않으면 상기 용액을 -20 ℃에서 저장하였다.
재조합체 바큘로바이러스의 P0 스톡의 생산
Sf9 세포를 6-웰 플레이트 (또는 10-cm 플레이트에서 6 x 106 세포 또는 15-cm 디쉬에서 1.7 x 107 세포)에 대략적으로 1 x 106세포/웰로 씨딩하고 세포를 형질감염 전 적어도 1시간 동안 부착시켰다.
형질감염 용액 A 및 B는 다음과 같이 제조한다: 용액 A: 일정량의 Bacmid를 15-mL 튜브에서 항생제가 없는 일정량의 무혈청 배지로 희석시켰다. 용액 B: 일정량의 CellFectin을 15-mL 튜브에서 일정량의 무항생제 무혈청 배지로 희석시켰다. 용액 B를 용액 A에 첨가하고 피펫으로 대략적으로 3회 온화하게 혼합하고 30 ~ 45분 동안 실온에서 항온처리하였다. 그 다음, 플레이트로부터 배지를 흡인하고 항생제가 없는 일정량의 무혈청 배지를 첨가하여 세포를 세정하였다. 항생제가 없는 일정량의 SF900II를 지질-DNA 혼합물을 함유하는 각각의 튜브에 첨가하였다.
세포로부터의 배지를 흡인하고 형질감염 용액을 세포에 첨가하고 세포를 28 ℃에서 대략적으로 5시간 동안 항온처리하였다. 형질감염 용액을 제거하고 일정량의 무혈청 배지 + 항생제를 첨가하고 28 ℃에서 대략적으로 4일 동안 항온처리하였다. 재조합체 바큘로바이러스를 함유하는 배지를 수거하고 1000 rpm에서 대략적으로 5분 동안 회전시켜 세포 파쇄물을 제거하였다. 바큘로바이러스를 암실에서 4 ℃에서 저장하였다.
바큘로바이러스 (P1)의 증폭
Sf9 세포를 대략적으로 4 x 106 세포/mL로 성장시키고 진탕 플라스크에서 신선한 배지로 대략적으로 2 x 106 세포/mL로 희석시켰다. 일정량의 Sf9 세포를 일정량의 P0 스톡 바큘로바이러스로 감염시켰다. 감염 다중도 (MOI)는 대략적으로 0.1이다.
Sf9 세포를 대략적으로 3일 동안 항온처리하고 바큘로바이러스를 수확하였다. 세포를 2,000 rpm에서 5분 동안 회전시켜 세포를 펠렛화하고 상등액을 수거하고 암실에서 4 ℃에서 저장하였다. 바큘로바이러스의 역가는 Clontech의 신속한 역가 키트 프로토콜 (Rapid Titer Kit protocol)에 따라 결정하였다.
P1 재조합체 바큘로바이러스를 사용하는 AAV의 생산
Sf9 세포를 약 1 x 107 세포/mL로 성장시키고 약 5 x 106 세포/mL로 희석시켰다. 일정량의 희석된 Sf9 세포를 Bac-벡터 (5Moi) 및 Bac-헬퍼(15Moi)로 3일 동안 감염시켰다. 세포 생존능은 3일째에 평가하였다 (대략적으로 50 % ~ 70 %의 죽은 세포가 관찰되었다).
3000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 수거하였다. 배지를 제거하고 세포를 용해시켰다 (또는 즉시 사용하지 않는다면 세포 펠렛을 -20 ℃에서 저장하였다).
용해 및 밴딩/정제 프로토콜
일정량의 Sf9 용해 완충액 + 벤조나제 (Benzonase)를 각각의 세포 펠렛에 첨가하고 상기 세포가 재현탁되도록 완전히 진탕시켰다. 재현탁된 Sf9 세포를 얼음 상에서 대략적으로 10분 동안 항온처리하여 용해물을 냉각시켰다. 용해물을 대략적으로 20초 동안 초음파처리하여 세포를 완전히 용해시킨 다음 37 ℃에서 대략적으로 30분 동안 항온처리하였다.
일정량의 5 M NaCl을 첨가하고 혼합물을 진탕시킨 다음 추가의 30분 동안 37 ℃에서 항온처리하였다. 염 농도가 약 500 mM이 되도록 일정량의 NaCl을 가하고 진탕시키고 8,000 rpm에서 20분 동안 15 ℃에서 원심분리하여 투명한 용해물을 생성하였다.
투명 용해물을 초원심분리 단계로 진행시킨다. 투명 용해물을 먼저 첨가한 다음 긴 바늘을 갖는 시린지를 통해 일정량의 1.32 g/cc와 일정량의 1.55g/cc CsCl 용액을 첨가함으로써 CsCl-구배를 제조하였다. CsCl 용액 간의 계면이 표시되었다. PBS를 원심분리 튜브의 상부까지 첨가하고 상기 튜브는 조심스럽게 균형을 이루고 밀봉하였다.
튜브를 55,000 rpm에서 대략적으로 20시간 동안 15 ℃에서 원심분리하였다. 각각의 튜브의 상부에 구멍이 뚫려 있고 두 CsCl 용액의 계면 표시 바로 위에 위치한 AAV 밴드가 표시되어 있다.
두번째 CsCl 원심분리는 AAV 용액을 70.1 Ti 로터용 원심분리 튜브로 이동시켜 수행되며 튜브의 상부 부근에 일정량의 CsCl 용액을 첨가하였다. 튜브는 균형을 이루었고 밀봉하였다. 튜브를 65,000 rpm에서 대략적으로 20시간 동안 원심분리하고 AAV 밴드 (더 낮은 밴드, 더 높은 밴드는 빈 캡시드임)를 수거하였다.
실시예 5
Rag2 마우스에서 작제물의 평가
코돈-체적화된 SQ FVIII-암호화 유전자 서열을 포함하는 AAV 비리온은 도 1, 프로토 1, 프로토 1S, 프로토 2S 및 프로토 3S 작제물의 FVIII 벡터를 사용하여 바큘로바이러스 및 293 세포를 사용하여 생성되었다. 팩키징 제한은 바큘로바이러스의 경우 약 4800 bp이고 293 세포의 경우 약 4950 bp이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 절단된 (T) 또는 비-절단된 (NT) 게놈으로 시험된 모든 작제물은 FVIII 발현을 유도할 수 있다. 이들 AAV가 바큘로바이러스 시스템에 의해 만들어지는 경우, 프로토 1로부터의 FVIII의 발현은 도 1의 FVIII 작제물과 유사하였다. 프로토 2S와 프로토 3S에 인트론이 포함되어 있어도 프로토 1에 비해 FVIII 발현이 개선되지 않았다. 293 세포에서 제조된 AAV 플랭킹 서열을 함유하는 도 1의 FVIII 벡터는 바큘로바이러스에서 만들어진 AAV 서열이 없는 동일한 벡터보다 더 강력하였다. 그 결과, 효능 및 관련 FVIII 발현을 증가시키기 위한 시도에서 추가의 인핸서를 프로토 1, 예를 들어, 작제물 101, 102, 102 및 104에 첨가하였다.
실시예 6
개선된 프로모터/인핸서 서열을 갖는 AAV FVIII 벡터의 발현 및 활성
추가의 재조합체 AAV FVIII 벡터의 발현 및 활성을 유체역학적 주입 프로토콜을 사용하여 시험하였다. 유체역학적 전달은 생체내 다양한 재조합체 AAV FVIII 벡터의 효율을 스크리닝하는 신속한 방법이다. 구체적으로, AAV FVIII 플라스미드 DNA는 상기한 바와 같이 생성한 다음 TransIT-QR 유체역학적 전달 용액에 희석시켰다. 플라스미드 DNA를 5-6 주령의 C57Bl/6 마우스 (18-25 g)의 꼬리 정맥에 (마우스 중량 (g)/10) = 0.1 ml 전달 용액)에 의해 결정된 용적으로 주입하였다. 주입 시간은 5초 미만이었다. 이어서 각각의 마우스로부터의 혈장을 주입 48시간 후에 수거하고 발현된 FVIII 단백질의 양을 ELISA 검정을 사용하여 측정하였다. 주입된 마우스의 혈장 내 FVIII의 양은 ELISA 시험을 사용하여 측정하였으며 재조합체 FVIII (Xyntha SQ 등가물)를 비교를 위한 표준으로서 사용하였다.
FVIII 발현을 조사하기 위해, 본 발명의 특정 재조합체 AAV FVIII 작제물을 유체역학적 주입 프로토콜에서 시험하여 생체내 기능적 FVIII 단백질의 발현을 초래하는 이들의 능력을 측정하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 5 ㎍의 플라스미드 용량에서 시험한 모든 작제물은 다양한 수준의 효율로 기능적 FVIII를 생산하였다.
도 7 및 8은 본 발명의 다양한 재조합체 AAV FVIII 작제물의 1 ㎍의 플라스미드의 용량에 대한 유체역학적 주입에 대한 데이터를 제공한다. 도 7 및 8에 나타낸 바와 같이, 모든 시험된 다양한 작제물의 주입은 다양한 수준의 효율을 갖는 FVIII 단백질의 생체내 발현을 초래하였다.
실시예 7
p-100 ATGB 벡터를 포함하는 AAV 바이러스의 분석
서열번호 45 ("AAV5-p100ATGB-FVIII")로서 본원에 나타낸 FVIII-SQ-암호화 벡터 p-100 ATGB를 포함하는 AAV 바이러스를 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 제조하고 Rag2 마우스에서 기능적 FVIII-SQ 단백질을 발현하는 능력을 평가하였다. 보다 구체적으로, Rag2 마우스에 6E12 vg/kg, 2E13 vg.kg 또는 6E13 vg/kg의 용량으로 단일 용량의 AAV5-FVIII-SQ 바이러스 또는 AAV5-p100ATGB-FVIII 바이러스를 투여하고 FVIII 단백질 농도를 후속적으로 마우스의 혈류에서 결정하였다. 이러한 분석 결과는 AAV5-p100ATGB-FVIII 바이러스의 투여가 시험된 2배 더 낮은 용량에서 AAV5-FVIII-SQ 바이러스보다 순환 기능적 FVIII 단백질의 대략적으로 3-배 더 높은 수준으로 생성됨을 입증하였다. 시험된 최고 용량에서도, AV5-p100ATGB-FVIII 바이러스는 AAV5-FVIII-SQ 바이러스보다 더 높은 수준의 순환 기능적 FVIII 단백질을 생성함에도 불구하고, 관찰된 발현에서의 차이는 시험된 최고 용량에서 다소 약화되었다. 이러한 결과는 AAV5-p100ATGB-FVIII 바이러스가 생체내에서 간 세포를 효율적으로 형질도입시키고 높은 수준의 기능적 FVIII 단백질의 발현을 제공함을 입증한다.
실시예 8
A형 혈우병에 대한 특이적 재조합체 FVIII AAV 벡터/바이러스의 연구
A형 혈우병 (HA)는 5,000명 남성 중 대략적으로 1명에게 영향을 미치는 X-연관된 열성 출혈 장애이다. 이는 내인성 응고 캐스케이드에 필수적인 보조인자인 응고 인자 VIII (FVIII)의 활성이 결핍되어 발생한다. 이 장애는 불충분한 양의 FVIII 또는 기능장애가 있는 FVIII를 유도하는 새로운 돌연변이 또는 후천적 면역학적 과정으로 인해 유전될 수 있지만 모두 결함이 있는 응고 과정을 특징으로 한다. HA 환자의 임상적 표현형은 잔여 발현 수준에 의해 크게 좌우된다. 중증 HA는 야생형의 1 % 미만의 FVIII 활성 (< 1 IU/dl)으로 분류되고, 중등도 질환은 1-5 %의 야생형 활성 (1 IU/dl - 5 IU/dl)을 포함하고 경증 형태는 5-40 % 활성 (5 IU/dl - 40 IU/dl)이다. 중증 HA의 임상 양상은 주로 관절과 연조질에서 자발적 출혈 에피소드가 자주 발생하며, 뇌가 관여할 때 출혈로 인한 사망 증가 위험이 상당히 증가한다.
중증 HA의 치료는 현재 출혈 에피소드를 각각 예방하거나 억제하기 위해 일주일에 2-3회 예방조치로서 그리고 출혈 시점에서 둘 다 혈장-유래된 또는 재조합체 FVIII 단백질 (rhFVIII) 농축물의 정맥 주사로 이루어진다. rhFVIII의 반감기 (대부분의 승인된 제품에 대해 24시간 미만)는 빈번한 주입을 필요로 하며, HA의 치료에 있어 주요 진전이 있더라도, 중증 HA 환자는 치료시 다발성 출혈 반응이 지속되는 것이 통상적이다 (주문형 치료의 경우 최대 30 내지 50개 예방법으로 평균 1 내지 7회 에피소드/년이다). 다발성 출혈 반응의 결과는 다발성-관절 병증을 쇠약하게 하고 사망 위험을 상당히 증가시키는 근본적인 병리학의 발달이다. 화학적 변형 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체의 직접 접합) 및 FVIII의 생체공학 (예를 들어, FVIII-Fc 융합 단백질)은 반감기를 대략적으로 50 % 까지 개선시키고, 따라서, 투여량이 감소되고 1 % 저점 (trough) 초과의 활동 수준의 가능성을 보여준다. 그러나, 이러한 더 길게 작용하는 FVIII는 중증 HA 환자에서 FVIII 활성의 임계 수준을 유지하기 위해 다중 주입에 의존한다. 따라서 정상 및 출혈없는 생활과 양립할 수 있는 FVIII 수준을 환자에게 제공하기 위해 HA의 완전한 예방적 치료에 대한 강력한 총족되지 않은 요구가 있다.
유전자 치료요법은 적절한 유전자 서열을 갖는 벡터의 단일 정맥내 투여 후에 활성 FVIII의 지속적인 내인성 생산에 의한 질환-변형 치료요법의 잠재력을 제공한다. 임상 양상의 혈장에서 미량 (200 ng/ml)으로 순환하는 단일 유전자 생성물 (FVIII)의 부재에 기인하기 때문에 A형 혈우병는 유전자 대체 접근법에 매우 적합하다. 엄격하게 조절된 유전자 발현의 제어는 필수적이 아니며 FVIII 수준의 완만한 증가 (혈장 수준을 2 ng/ml까지 임의로 증가시키면 활성의 1 % 증가를 유도함)는 심각한 형태의 질환을 완화시킬 수 있다. 따라서, 내인성 FVIII 활성에서의 비교적 작은 변화는 질환 표현형에서 임상적으로 관련된 개선을 초래한다. 마지막으로, 유전자 형질도입에 대한 반응은 확립된 실험실 기술을 사용하여 쉽게 검정된 정성적 종점 보다는 검증된 정량적 종점을 사용하여 평가할 수 있다.
FVIII 대체를 위한 여러 상이한 유전자 전달 전략이 평가되었지만, 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터는 가장 큰 가능성을 보여준다. 이들은 탁월하고 잘-정의된 안정성 프로파일을 가지며, 간과 같은 특정 조직 (특히 혈청형 2, 5 및 8의 경우)에 대한 친화성과 함께 장기간의 전이유전자 발현을 유도할 수 있다. 실제로, 관련 장애인 혈우병 B에 대한 진행중인 유전자 치료요법 임상 시험은 이들의 출혈 표현형의 중증에서 중증도 또는 중증에서 중등도 또는 경증으로의 전환에 충분한 수준에서 간 인자 IX의 안정한 (>36 개월) 발현이 재조합체 FIX AAV-8 벡터의 단일 말초 정맥 투여 후에 달성 가능하다는 것을 확립하였다. 이 시험의 몇몇 참가자들은 이전에 출혈을 유발하는 활동을 할 때조차도 자발적인 출혈 없이 인자 예방을 중단할 수 있었다. 따라서, 유전자 치료요법 치료는 삶의 질을 상당히 개선한다.
추가의 임상전 연구
재조합체 FVIII-SQ-암호화 벡터 프로토 1 (본원에서 도 2a 및 서열번호 1에 나타낸)을 사용하여 상기된 바와 같은 바큘로바이러스/Sf9-기반 발현 시스템을 사용하는 재조합체 AAV5 FVIII-SQ-암호화 바이러스를 생산하였다. 생성된 바이러스 (본원에서 "AAV5-FVIII-SQ"로 언급됨)는 0.001% 폴록사머 188을 함유하는 둘베코 인산염 완충 식염수 (DPBS) 중에서 임상전 동물 연구를 위해 정제하고 제형화하였다.
AAV5-FVIII-SQ 비임상 프로그램은 FVIII-SQ 단백질의 형질도입, 상대적 발현 및 활성 및 AAV5 캡시드의 전체 안정성 프로파일 및 인간 환자에서 재조합체 바이러스의 단일 IV 투여를 지지하기 위한 AV5-FVIII-SQ의 FVIII-SQ 전이유전자 생성물 성분을 설명하기 위해 디자인되었다. AAV5-FVIII-SQ의 비임상적 프로파일은 마우스, 정상 야생형 (WT), Rag2 -/- (B6.129S6-Rag2tm1Fwa N12) 및 Rag2 -/- 마우스 (Rag2 -/- x FVIII -/-), 및 시노몰구스 및 레서스 몽키와 교배된 인자 VIII -/- (B6;129S-F8tm1Kaz/J)에서 하나의 시험관내 연구 및 10개의 단일 용량 연구에 대해 평가되었다.
약동력학 (PD) 평가는 AAV5-FVIII-SQ 유전자 치료요법이 (i) 마우스에서 ReFacto® (rhFVIII-SQ; EU에서 ReFacto®로서 시판되고 US에서 Xyntha®로 시판되는)와 비교하여 올바른 크기의 FVIII-SQ (경쇄 및 중쇄)의 혈장 발현, (ii) 외인성으로 투여된 ReFacto®과 유사한 용량 의존적 양상으로 A형 혈우병의 마우스 모델에서 응고 장애에 대한 올바른 AAV5-FVIII-SQ의 투여 및 (iii) 혈장 FVIII-SQ 단백질 및 활성 또는 상응하는 간 RNA 및 DNA 수준이 마우스에 비교되는 경우 볼러스 투여 보다 유사하거나 양호한 것으로 보이는 IV 주입을 통한 제안된 임상 투여 경로를 유도함을 입증하였다.
비-인간 영장류에서 일시적 FVIII-SQ 발현은 종-특이적인 것으로 의심되고 인간 환자에서 안정한 전이유전자 발현을 성취한 다른 임상 연구에서 보여지는 바와 같이 임상에서 일어나는 것으로 예상되지 않는다. 면역원성은 임상에서 세심하게 모니터링되고 단백질 발현과의 관계가 평가된다.
전체 비임상 프로그램은 AAV5-FVIII-SQ 및 이의 주요 성분, AAV5 캡시드 및 전이유전자 생성물, FVIII-SQ로 인한 독성에 대한 잠재력을 고려하였다. FVIII-SQ는 시판되는 재조합체 인자 대체 치료, ReFacto®와 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 독성학 프로그램의 디자인은 표적 기관, 상대적 혈장 FVIII-SQ 단백질 및 상대적 활성, 면역원성 및 간 DNA 게놈 및 RNA의 동정을 포함하는 AAV5-FVIII-SQ의 독성학적 프로필을 특성 분석하기 위해 의도되었다. 4- 및 13-주 후속 기간과 함께 정상 CD-1 마우스에서 하나의 GLP 단일-용량 연구는 AAV5-FVIII-SQ를 사용하여 수행하였다. Rag2 -/- x FVIII -/- 마우스 및 정상 몽키에서 PD 연구는 병력 및 임상 병리학의 추가의 독성 파라미터를 포함하였다.
AAV5-FVIII-SQ의 비임상 안정성 프로파일은 면역원성의 예상된 관찰을 포하하였다: (i) 모든 AAV5 벡터 처리된 면역-컴피턴트 (CD1 마우스 및 몽키)의 혈장에서 항-AAV5 항체의 검출 및 (ii) 면역-컴피턴트에서 항-FVIII-SQ 항체의 검출은 FVIII 발현 또는 활성과 상호 관련이 없지만 6E12 또는 6E13 vg/kg AAV5-FVIII-SQ가 투여된 4마리의 몽키에서 약간 APTT 연장에서 기여자일 수 있는 하나의 마우스 및 여러 몽키에서 관찰되었다. 항체 수준은 이들이 성숙한 B 및 T 림프구가 없고 항체 반응을 생성할 수 없기 때문에 Rag2 -/- 유래된 마우스에서 결정되지 않았다. 그러나 항-FVIII-SQ 항체와 몽키 FVIII의 상호종 교차 반응성은 평가되지 않았고, 응고에 대한 항체의 영향에 관한 확고한 결론을 불가능하게 한다. 비-용량 의존적 최소 내지 경미한 신장 염증은 신장 기능부전을 지적하는 신장 임상 화학 파라미터에서 상응하는 변화 없이 8주 후 Rag2 -/- x FVIII -/- 마우스에서 관찰되었다. 신장 발견은 13-주 후 CD-1 마우스에서 관찰되지 않았고 이는 이종성 단백질에 대한 종 특이적 반응을 시사한다. 간 임상 화학에서 어떠한 AAV5-FVIII-SQ-관련 변화도 간 기능부전 또는 세포독성을 지적하는 몽키에서 관찰되지 않았다. 새환경 순응 및 연구 기간에 걸쳐 체중 손실로 인해 14일째 6E12 vg/kg가 투여된 레서스 몽키에서 하나의 스케줄되지 않은 안락사 및 이환율은 지속적 체중 손실 및 계속되는 결장 발견으로 인해 AAV5-FVIII-SQ와 관련되지 않은 것으로 간주되었다. 간 임상 화학 파라미터에서의 변화를 포함하는 어떠한 다른 AAV5-FVIII-SQ-관련 발견은 AAV5-FVIII-SQ가 투여된 몽키, 시노몰구스 또는 레서스에서 주지되지 않았다.
어떠한 특이적 발견도 예상된 면역원성 외에 FVIII-SQ 전이유전자 생성물과 연관되지 않았다. FVIII-SQ 전이유전자 생성물은 시판되는 효소 처리, ReFacto®과 동일한 최종 서열을 갖기 때문에, 어떠한 고유한 FVIII-특이적 표적 기관 독성이 동정되지 않았다.
예상된 면역원성에 추가로 어떠한 고유한 AAV5 캡시드 관련 독성은 비임상 프로그램에서 관찰되지 않았다. AAV 캡시드의 면역원성은 비임상 및 임상 프로그램에서 모니터링된다.
정상 및 질환 모델 마우스 둘 다 및 제한된 수의 몽키를 사용하여 개념 증명을 확립하였고, 잠재적 종 스케일링 및 용량 반응을 평가하여 6E12 vg/kg의 FIH 용량을 선택하였다. 출발 용량은 마우스 (정상 및 질환 모델, Rag2 -/- x FVIII -/-) 및 몽키에서 수행된 임상전 연구로부터의 전체 데이터를 고려하였다. 활성을 기반으로 하는 검출가능한 약리학적 반응은 마우스 및 몽키의 2개의 종에서 6E12 vg/kg에서 관찰되었다. 어떠한 일치된 상호종 스케일링도 보다 정확한 용량 추천을 확인할 수 있는 마우스와 시노몰구스 및 레서스 몽키 간에 주지되지 않았다. 10-배 안전성 차이는 투여된 최고 용량에서 정상 마우스에서 GLP 13주 연구에서 6E13 vg/kg AAV5-FVIII-SQ의 NOAEL을 기준으로 하였다. 임상 관찰 또는 화학에서 어떠한 AAV5-FVIII-SQ-관련 변화는 8주 후 10배-안전성 차이에서 6E13 vg/kg 이하 용량에서, 몽키에서 관찰되지 않았다. 전반적으로, 모든 동물에서 항-AAV5 항체의 예상된 형성 및 면역-컴피턴트 동물에서 항-FVIII-SQ 항체의 낮은 역가의 제한된 형성을 제외하고는 어떠한 AAV5-FVIII-SQ-관련 발견도 각각 정상 마우스 및 몽키에서 6E13 vg/kg의 최고 투여된 용량에서 관찰되지 않았다.
하나의 시험관내 및 9개의 생체내 연구를 수행하여 AAV5-FVIII-SQ (6개의 비-GLP 마우스 연구 및 3개의 비-GLP 몽키 연구)의 1차 약동력학 (PD)을 평가하였다. 모든 연구는 단일 용량이고 정맥내 (IV) 투여 경로를 사용하였다. 제안된 임상 투여 경로는 60분까지 IV 주입이다. 본 프로그램에서 대다수의 동물에 IV 볼러스 주사를 통해 AAV5-FVIII-SQ를 투여함에 따라 FVIII-SQ 발현에 대한 투여 지속 기간 (30분 동안 IV 볼러스 대 주입)의 평가는 하나의 마우스 연구에서 평가되었다. 2E10 내지 2E14 vg/kg AAV5-FVIII-SQ가 투여된 마우스에서 2개의 용량 반응 연구는 8주 후 간에서 DNA 및 RNA 발현을 포함하는 FVIII-SQ 단백질 및 활성 혈장 농도의 PD 관계를 확립하였다. 하나의 마우스 연구는 제조를 위한 바큘로바이러스-감염된 세포주의 선택을 지지하였다. 하나의 마우스 연구는 4-주 및 13-주 동안 간 DNA 및 RNA와 함께 혈장 FVIII 단백질 및 활성을 평가하였다. 하나의 마우스 연구는 응고의 기능적 평가로서 출혈 시간을 평가하였다. 2개의 몽키 연구는 제조를 위한 벡터 AAV5 및 바큘로바이러스-감염된 세포주의 선택을 지지하였다. 제3 몽키 연구는 시노몰구스 및 레서스 몽키에서 AAV5-FVIII-SQ의 PD 효과를 비교하였다.
PD 종점 (혈장 FVIII-SQ 단백질 및 활성, 간 DNA 벡터 게놈 및 RNA 전사 카피물)은 마우스 및 몽키 연구에서 평가하였다. 간 DNA 벡터 게놈 및 RNA 전사 카피물을 평가하여 AAV5-FVIII-SQ에 의한 간 형질도입을 확인하였다. 혈장 FVIII-SQ 단백질 및 활성은 FVIII-SQ 전이유전자의 간 발현의 바이오마커로서 사용하였다. 여러 독성 종점은 하나의 마우스 연구 (조직학) 및 3개의 몽키 연구 (임상 병리학)에 조합하여 2개의 종간에 용량 관계를 평가하였다.
Rag2-/- x FVIII-/- 마우스에서 AAV5-FVIII-SQ의 약동력학 평가
상기 연구의 목적은 6E12 또는 6E13 vg/kg AAV5-FVIII-SQ가 투여된 수컷 Rag2-/- x FVIII-/- 마우스에서 단일 IV 투여 후 4- 및 13-주 동안 AAV5-FVIII-SQ의 1차 PD를 평가하는 것이었다. PD 종점은 혈장 FVIII-SQ 단백질 및 활성 수준 및 간 FVIII-SQ RNA 및 DNA의 존재를 포함하였다. 60마리 수컷 Rag2-/- x FVIII-/- 마우스는 연구 개시 시점에 8주령이었다. 동물은 무작위로 6개 그룹 (10/그룹)에 할당하고 꼬리 정맥을 통해 비히클, 6E12 또는 6E13 vg/kg의 AAV5-FVIII-SQ를 단일 IV 주사로 투여하였다.
적당한 모노클로날 항체는 2 ㎍/ml의 최종 농도로 밤새 플레이트 상에 코팅하고, FVIII 중쇄에 대해서는 GMA8023으로 코팅하고 FVIII 경쇄에 대해서는 GMA8001로 코팅하였다. 다음 날, 웰은 미처린 희석제로 차단시키고 그룹 4 및 그룹 6으로부터의 마우스 혈장 샘플 (50 ㎕), 또는 Xyntha® (500 ng/ml)로 스파이킹된 정상 마우스 혈장 샘플은, 동등한 용적의 미처리 희석제로 희석하고 100 ㎕의 혼합물을 FVIII 중쇄 또는 경쇄의 집적을 위해 개별 웰에 첨가하였다. 집적된 혈장 샘플은 환원 폴리아크릴아미드 겔을 변성시킴에 의해 분리하고 웨스턴 분석을 위해 니트로셀룰로스 막으로 이전시켰다. FVIII 중쇄는 비오틴 접합된 항-FVIII 폴리클로날(SAFC-APBIO, 0.5 ㎍/ml) 및 스트렙타비딘 접합된 알칼린 포스파타제 (0.25 ㎍/ml)로 연속 항온처리하여 검출하였다. FVIII-SQ 경쇄는 항-FVIII 모노클로날 (GMA8025, 1.0 ㎍/ml) 및 동키 항-마우스 접합된 알칼린 포스파타제 (0.25 ㎍/ml)와 연속 항온처리함에 의해 검출하였다. 막은 비색측정 침전 알칼린 포스파타제 기질 (WesternBlue)을 사용하여 전개시키고 이미지화하였다.
6E13 vg/kg AAV5-FVIII-SQ가 투여된 동물로부터의 혈청의 AAV 전이유전자-유래된 FVIII-SQ 중쇄 및 경쇄의 분자량의 웨스턴 블롯에 의한 평가는 발현된 혈장 FVIII-SQ 중쇄 및 경쇄가 rhFVIII-SQ 단백질로서 유사한 분자 크기임을 확립하였다. 이것은 잠재적으로 절단된 게놈에도 불구하고, FVIII-SQ의 중쇄 및 경쇄 둘 다의 발현이 올바른 크기임을 지적한다. 상기 절단된 게놈과 함께 벡터로부터의 디스펠린 및 A형 혈우병 인자 VIII의 효율적이고 기능적인 발현은 이전에 입증되었다. 혈장 FVIII-SQ 단백질의 쇄 둘 다의 분자량은 올바른 크기이고 상응하는 마우스는 FVIII-SQ 활성을 가졌다.
Rag2-/- 마우스에서 IV 볼러스 및 주입 연구
본 연구의 목적은 투여 5주 후에 간 조직에서 FVIII-SQ DNA 및 RNA 및 Rag2-/- 마우스에서 혈장 FVIII-SQ 단백질 및 활성 수준에 대한 6.0E12 및 2.0E13 vg/kg의 단일 IV 볼러스 또는 30-분 IV 주입의 효과를 비교하였다. 60마리의 수컷 Rag2-/- 마우스는 대략적으로 연구 개시 시점에 대략적으로 8-주령이었다. 동물은 무작위로 6개 그룹으로 분포시켰다 (10마리 동물/그룹). 그룹 1-3 및 4-6에는 각각 꼬리 정맥을 통해 단일 IV 볼러스 또는 30-분 IV 주입물 (비히클, 6.0E12, 또는 2.0E13 vg/kg AAV5-FVIII-SQ)을 투여하였다.
6.0E12 vg/kg AAV5-FVIII-SQ가 투여된 동물에서, hFVIII-SQ 벡터 게놈/간 세포는 각각 IV 주입물 및 느린 볼러스 그룹에서 5.06E-2 및 3.50E-2였다. 간에서 FVIII-SQ 발현 카피물/㎍ RNA는 각각 IV 주입물 및 볼러스 그룹에서 3.76E4 및 1.87E4였다. 2.0E13vg/kg AAV5-FVIII-SQ가 투여된 동물에서, DNA 값은 주입 그룹에 대해 0.342 벡터 게놈/세포 및 볼러스 그룹에 대해 0.316 벡터 게놈/세포였다. 간에서 FVIII-SQ 발현 카피물/㎍ RNA는 주입 그룹에 대해 2.35E5였고 볼러스 그룹에 대해 1.53E5였다.
6.0E12 vg/kg AAV5-FVIII-SQ (저용량)가 투여된 동물에서, 볼러스 또는 30-분 주입에 의해 IV 투여되는 경우 간 RNA 및 DNA 수준 또는 혈장 FVIII-SQ 단백질 및 활성에서 거의 차이가 없었다. 2.0E13 vg/kg AAV5-FVIII-SQ가 투여된 동물에서, 30분 간 IV 주입에 의한 투여는 혈장에서 FVIII-SQ 단백질 및 활성을 대략적으로 2배로 유도하였고, 간 RNA 및 DNA 수준은 유사하게 유지되었다. 이들 데이터를 기준으로, IV 주입을 통한 AAV5-FVIII-SQ의 제안된 임상 투여는 볼러스 투여와 유사하거나 이보다 양호할 가능성이 있다.
Rag2-/- x FVIII-/- 마우스에서 출혈 시간 평가
본 연구의 목적은 야생형 마우스 (C57BL/6J)와 비교하여 수컷 Rag2-/- x FVIII-/- 마우스에서 AAV5-FVIII-SQ의 단일 투여 후 8주에 출혈 시간의 기능적 응고 종점을 평가하는 것이다. 추가로, AAV5-FVIII-SQ 처리 후 8주에 출혈 시간의 변화는 ReFacto®로 처리된 Rag2-/- x FVIII-/- 마우스에서 성취된 결과와 비교하였다. 100마리 수컷 Rag2-/- x FVIII-/- 마우스와 20마리 수컷 연령과 일치하는 C57BL/6J 마우스는 대략적으로 연구 개시 시점에 대략적으로 8주령이었다. 동물은 무작위로 4개의 그룹 (20마리 동물/용량)으로 분포시키고 꼬리 정맥을 통해 AAV5-FVIII-SQ의 단일 IV 주사 (C57BL/6J: 비히클; Rag2-/- x FVIII-/-: 비히클, 2.0E13 또는 1E14 vg/kg AAV5-FVIII-SQ)를 투여하였다.
ReFacto®이 투여된 Rag2 -/- x FVIII -/- 동물은 출혈 시간 및 용적에서 용량 관련 감소를 가졌다. 50 U/kg의 ReFacto®이 투여된 Rag2-/- x FVIII-/- 동물에서, 0.49 ±0.30 g의 평균 혈액 손실 및 18.1 ±9.39분의 평균 출혈 시간이 관찰되었다. 200 U/kg의 ReFacto®이 투여된 Rag2-/- x FVIII-/- 마우스는 0.134 ±0.19 g 및 4.29 ±6.16분의 평균 혈액 손실 및 출혈 시간을 가졌다.
ReFacto® 및 FVIII-SQ의 혈장 수준은 각각 50 U/kg의 ReFacto® 및 2E13 vg/kg의 AAV5-FVIII-SQ가 투여된 마우스에서 유사하였다.
AAV5-FVIII-SQ의 Rag2-/- x FVIII-/- 마우스로의 투여는 투여 후 8주에 혈액 손실 용적 및 출혈 시간에서 용량 의존적 감소를 유도하였다. 혈액 용적 손실 및 출혈 시간에서 용량 의존적 감소는 투여 후 8주에 관찰되었다. 1E14 vg/kg AAV5-FVIII-SQ가 투여된 동물에서, 혈액 손실 및 출혈 시간은 ReFacto® 처리로 성취된 보정에 상응하게 야생형 수준으로 보정되었다. AAV5-FVIII-SQ의 투여는 ReFacto®가 외인성으로 투여된 것과 유사하게 용량 의존적 방식으로 A형 혈우병의 마우스 모델에서 응고 질환을 보정할 수 있다.
Rag2-/- x FVIII-/- 마우스에서 용량 반응
2E11 내지 2E12 vg/kg의 AAV5-FVIII-SQ가 투여된 Rag2-/- x FVIII-/- 마우스에서, 어떠한 혈장 FVIII-SQ 단백질 또는 활성 수준이 검출되지 않았다.
본 연구에서, 60마리의 수컷 Rag2-/- x FVIII-/- 마우스는 연구 개시 시점에 대략적으로 8주령이었다. 동물은 무작위로 6개의 그룹 (10마리 동물/용량)으로 분포시키고 꼬리 정맥을 통해 AAV5-FVIII-SQ의 단일 IV 주사 (비히클, 2E12, 6E12, 2E13, 6E13 및 2E14 vg/kg AAV5-FVIII-SQ)를 투여하였다.
FVIII-SQ 혈장 단백질 수준은 일반적으로 ≥ 1.5E12 vg/kg AAV5-FVIII-SQ가 투여된 동물에서 용량과 관련되어 있다. FVIII-SQ 단백질 수준은 ≤ 1.7E11 vg/kg의 AAV5-FVIII-SQ가 투여된 동물에서 정량 수준 미만이었다. PD 활성 일반적으로 용량과 함께 증가하였고 활성과 서로 관련되었다. ≤ 1.8E13 vg/kg의 AAV5-FVIII-SQ가 투여된 동물에서, 상호 동물 (inter-animal) 가변성이 관찰되었고 동물의 서브세트만이 혈장 FVIII-SQ 및 활성의 검출가능한 수준을 가졌다.
FVIII-SQ 단백질 및 활성 수준과 일치하여, 벡터 게놈 카피물 및 발현 카피물 (RNA)은 ≥ 1.5E12 vg/kg AAV5-FVIII-SQ가 투여된 동물에서 관찰되었다. 벡터 게놈 DNA 카피물 및 발현 카피물 RNA/㎍ RNA는 일반적으로 용량과 함께 증가하였다.
FVIII-SQ 혈장 단백질 수준, 활성 수준 및 벡터 게놈 및 RNA 수준은 일반적으로 ≥ 1.5E12 vg/kg AAV5-FVIII-SQ가 투여된 Rag2-/- x FVIII-/- 동물에서 용량과 관련되어 있다. 1.5E12 (2개의 동물) 또는 1.8E13 vg/kg AAV5-FVIII-SQ (10마리의 동물 중 8개)가 투여된 동물의 서브세트에서, 6.0E12 vg/kg의 AAV5-FVIII-SQ의 제안된 FIH 임상 용량을 포괄하는 용량은 정상의 2.8 내지 66.4 %의 범위이다. 이것은 임상에서 PD 활성이 수득한 혈장 FVIII-SQ 단백질 및 활성 수준이 동물에서 보다 일관된 반응을 제공하기 때문에 6.0E12 용량 수준에서 성취될 수 있다.
시노몰구스 몽키에서 캡시드 선택
본 연구의 목적은 단일 IV 볼러스로서 시노몰구스 몽키로 투여되는 경우 8주 동안 FVIII-SQ 전이유전자와 함께 2개의 캡시드 (AAV5.2 FVIII-SQ 및 AAV8.2 FVIII-SQ, 즉, 각각 AAV5 및 AAV8 캡시드 단백질, 및 AAV2 ITR)의 상대적 활성을 평가하는 것이다. 8마리의 수컷 시노몰구스 몽키는 연구 개시 시점에 2.8 내지 4.1세령이고 무게는 2.6 내지 3.6 kg이었다. 모든 동물은 면역-고갈된 시노몰구스 몽키 혈청과 비교하여 항-AAV5 또는 항-AAV8 형질도입 억제 활성에 대해 예비 스크리닝하였다. 동물은 4개 그룹으로 할당하였고 단일의 느린 볼러스 정맥내 투여(각각, 0.5 및 5.0 mL/kg)로서 2.0E12 또는 2.0E13 vg/kg의 AAV5.2-hFVIII-SQ 또는 AAV8.2-hFVIII-SQ를 투여하였다.
AAV5.2 hFVIII-SQ 및 AAV8.2 hFVIII-SQ의 단일 주사 투여는 2.0E13 벡터/kg가 투여된 시노몰구스 몽키에서 매우 관용성인 검출가능한 수준의 혈장 FVIII-SQ 단백질 수준을 유도하였다. 간 임상 화학에서 어떠한 AAV5-FVIII-SQ-관련 변화도 관찰되지 않았고 이는 어떠한 간 기능부전도 관찰되지 않았음을 지적한다. AAV5 캡시드는 계속적인 발달을 위해 선택하였다.
시노몰구스 몽키에서 단일 용량 IV 연구
본 연구의 목적은 단일 IV 투여로서 시노몰구스 몽키로 투여되는 경우 8주 동안 2개의 세포주 (바큘로바이러스 감염된 sf9 곤충 및 인간 293 세포)에서 생산된 2개의 제조 로트의 AAV5-FVIII-SQ의 상대적 활성을 평가하는 것이었다. 8마리의 순수 수컷 몽키는 3.9 내지 4.3세령이고 치료 개시에서 무게가 2.8 내지 4.3 kg이었다. 모든 동물은 연구로의 할당 전 항-AAV5 항체 및 AAV5 형질도입 억제 활성을 위해 예비 스크리닝하였다. 각각의 몽키 (2/용량 그룹)에 단일의 느린 볼러스 IV 주사(2E13 및 6E13 vg/kg AAV5-FVIII-SQ)를 투여하였고 8주 동안 관찰하였다.
상대적 혈장 FVIII-SQ 단백질 수준은 8주 동안 평가하였다. 가능한 AAV5-FVIII-SQ-관련된 APTT 연장은 항-FVIII 항체 형성을 갖는 동물에서 관찰되었다. 이것은 외인성 인자 대체를 위한 공지된 잠재적 면역원성 결과이다. 간 임상 화학에서 어떠한 AAV5-FVIII-SQ-관련 변화도 관찰되지 않았고 이는 어떠한 간 기능부전이 관찰되지 않음을 지적한다. 혈장 FVIII-SQ 수준은 3 내지 6주 동안 증가하였지만 이후 감소하였다.
AAV5-FVIII-SQ가 투여된 모든 동물은 투여 2주 후에 혈장 중 FVIII-SQ의 수준을 발현하였다. 일반적으로, FVIII-SQ 수준은 시간 경과에 따라 증가함에 이어서 8주까지 감소하였다. 혈장 FVIII-SQ의 피크 수준은 4.8 ng 내지 67.4 ng의 FVIII-SQ/ml 범위였다.
시노몰구스 및 레서스 몽키에서 단일 용량 IV 연구
6E12 및 2E13 vg/kg AAV5-FVIII-SQ가 투여된 시노몰구스 및 레서스 몽키에서, FVIII-SQ의 상대적 발현은 6주 동안 평가하였다. 간 임상 화학에서 어떠한 AAV5-FVIII-SQ-관련 변화도 관찰되지 않았고 이는 어떠한 기능부전을 지적하지 않는다. 혈장 FVIII-SQ 단백질 수준은 레서스와 비교하여 시노몰구스 몽키에서 보다 컸다. 혈장 FVIII-SQ 수준은 4주 내지 5주 동안 증가하였고 이후 감소하였다. 간 벡터 게놈 DNA는 AAV5-FVIII-SQ가 투여된 모든 동물에서 검출되었고, 이는 AAV5-FVIII-SQ 형질도입의 수준이 모든 동물에 존재함을 의미하였다. 간 FVIII-SQ RNA 카피물은 혈장 FVIII-SQ 단백질을 발현하는 동물에서 관찰되었다. 간 임상 화학에서 어떠한 AAV5-FVIII-SQ-관련 변화도 생존 몽키에서 관찰되지 않았고 이는 어떠한 간 기능부전이 관찰되지 않음을 지적한다.
결론
전체적으로 다중 Rag2-/- x FVIII-/-마우스 연구에서, 혈장 FVIII-SQ 단백질 및 정상 인간 활성의 %는 일반적으로 용량과 비례하였고 이는 간에서 DNA 및 RNA에 대해 유사하였다. FVIII-SQ 활성 및 단백질 수준은 일반적으로 마우스에서 단일 용량의 AAV5-FVIII-SQ 후 시간과 함께 증가하였고, RNA는 시간과 함께 간에서 증가하였다. 혈장 FVIII-SQ 단백질 발현 및 활성은 이들 연구에서 서로 관련되는 경향이 있다. 혈장 FVIII-SQ 수준 및 활성에 의해 입증된 바와 같이 ≤ 6E12 vg/kg AAV5-FVIII-SQ가 투여된 동물에서 높은 상호-동물 및 상호-연구 가변성이 있다. 혈장 FVIII-SQ 단백질 수준의 일관된 발현은 ≥ 6E12 vg/kg AAV5-FVIII-SQ가 투여된 동물에서 관찰되었다.
2E12 내지 6E13 vg/kg의 AAV5-FVIII-SQ가 투여된 제한된 수의 몽키에서, 혈장 FVIII-SQ 수준은 ≥ 6E12 vg/mL가 투여된 동물에서 검출되었고 어떠한 검출가능한 혈장 수준도 2E12 vg/kg이 투여된 동물에서 관찰되지 않았다.
시노몰구스 몽키에서 수행된 연구에서, FVIII-SQ의 발현은 투여 후 3 내지 5주 사이에 피크에 도달하였고 연구 종료시까지 일부 경우에 검출 한계 미만인 수준까지 감소하였다. 일부 경우에, 항-FVIII항체는 혈장에서 피크 FVIII-SQ 수준 전 또는 후에 동물에서 검출되었다. 그러나, 항체는 감소된 FVIII-SQ의 발현을 갖는 모든 동물에서 검출되지 않았고, 이는 세포독성 T-림프구 (CTL) 매개된 형질도입된 세포의 소거 또는 능히 다른 발현의 비특이적 억제제와 같은 다른 잠재적 기작이 발현을 억제함을 시사한다. 비-인간 영장류에서 일시적 FVIII-SQ 발현은 종-특이적인 것으로 의심되고 임상에서 일어날 것으로 예상되지 않는다.
몽키에서 AAV5-FVIII-SQ의 단일 IV 볼러스는 제안된 임상 개시 용량 6E12 vg/kg에서 및 6E13 vg/kg 이하의 AAV5-FVIII-SQ에서 혈장 중 측정가능한 FVIII-SQ 단백질 수준을 유도하였고; 마우스에서 AAV5-FVIII-SQ의 투여는 상응하는 용량 범위에 대한 연구에서 일정하게 관찰된 혈장 FVIII-SQ 단백질 및 활성 수준을 유도하였다. 단계 1/2 인간 임상 시험의 제안된 개시 용량, 6E12 vg/kg의 AAV5-FVIII-SQ는 서브-치료학적 결과의 가능성을 감소시키는, 몽키 및 마우스 둘 다에서 검출가능한 혈장 FVIII-SQ 단백질 및 활성 수준을 또한 가졌던 10배 안전성 인자를 기준으로 선택하였다.
중증 A형 혈우병를 갖는 인간 환자에서 AAV5-FVIII-SQ의 용량 상승 안전성, 관용성 및 효능 연구
본 연구에서, 도 2a의 프로토 1 FVIII-SQ 벡터 (서열번호 1)를 포함하는 재조합체 FVIII AAV 비리온은 단일 정맥내 용량에 의해 인간 환자에게 전달된다. 상기 연구는 벡터-형질도입된 간 조직으로부터 합성되는, 혈장에서 활성 hFVIIII의 안전하고, 잠재적으로 지속적 발현을 성취하도록 디자인된다. 상기 임상적 연구는 벡터 용량과 잔여 FVIII 활성의 증강의 관계를 평가하고 이들 수준이 임상적 표현형을 변화시키기에 충분한지를 평가하기 위해 디자인된 인간에서의 최초 연구이다. 용량과 안전성의 관계는 중증 HA를 앓는 환자에서 hFVIII의 활성과 상호 관련된다.
본 연구의 주요 목적은 (i) 인간 FVIII-SQ를 암호화하는 재조합체 AAV의 단일 정맥내 투여의 안전성을 평가하고 (ii) 주입 후 16주째에 정상 활성(>5 IU/dl)의 5% 또는 이의 초과에서 FVIII의 발현을 성취하기 위해 요구되는 FVIII-SQ 암호화 재조합체 AAV의 용량을 결정하는 것이다. A형 혈우병를 갖는 개체에서 AAV-매개된 FVIII 활성의 역학, 지속성 및 정도를 결정하고 적당한 용량과 상호 관련시킨다.
본 연구의 2차 목적은 (i) 재조합체 FVIII AAV 바이러스의 전신 투여 후 FVIII 전이유전자 및/또는 AAV 캡시드 단백질에 대한 면역 반응을 기재하고, (ii) 연구 동안에 FVIII 대체 치료요법의 빈도에 대한 FVIII AAV 용량의 영향을 평가하고 (iii) 연구 동안에 치료를 요하는 출혈 에피소드의 횟수에 대한 용량 투여 영향을 평가하는 것이다.
재조합체 FVIII-SQ-암호화 벡터 프로토 1 (본원에서 도 2a 및 서열번호 1에 나타낸)을 사용하여 바큘로바이러스/Sf9-기반 발현 시스템을 사용하는 재조합체 AAV5-FVIII-SQ 바이러스를 제조하였다. 상기 AAV5-FVIII-SQ 공정은 배치 세포 배양, 수거, 정제 및 제형화로 이루어지고, 이는 제형화된 벌크 약물 물질 (FBDS)을 유도한다. FBDS는 탠덤 0.2 ㎛ 멸균화 필터를 통해 여과하고 충전 전 멸균 생물공정 수거 백으로 수거하였다. AAV5-FVIII-SQ는 이어서 1.1 ml의 멸균 FBDS를 2 ml의 냉동바이엘에 충전시키고 멸균 캡으로 폐쇄시킴에 의해 무균적으로 제조하였다. 상기 충전된 바이엘은 이어서 표지화, 팩키징 및 ≤ -65 ℃에서 동결 전에 가시적으로 조사한다.
임상적 AAV5-FVIII-SQ 액체 제형
비-/임상전 연구를 위해 상기되고 사용되는 AAV5-FVIII-SQ 액체 제형이 재조합체 AAV의 유리 및 플라스틱 표면으로의 상당한 흡착을 나타내기 때문에, 본원에서는 인간 임상 연구에 사용하기 위해 유리한 성질을 갖는 신규한 AAV5-FVIII-SQ 제형을 개발하기 위한 연구가 수행되었다. 정제된 AAV5-FVIII-SQ는 다음과 같이 인간 임상 연구를 위해 제형화하였다.
정제된 재조합체 AAV5-FVIII-SQ 바이러스는 1.38 mg/ml의 일염기성 일수화물의 인산나트륨, 1.42 mg/ml의 이염기성 인산나트륨 (건조된), 8.18 mg/ml의 염화나트륨, 20 mg/ml 만니톨 및 2.0 mg/ml 폴록사머 188 (Pluronic F-68), pH 7.4를 포함하는, 인간 환자로의 IV 투여를 위해 유용한 액체 제형 중 다양한 농도로 제형화하였다. 하나의 구현예에서, 상기된 제형 중 재조합체 AAV5-FVIII-SQ 바이러스의 농도는 2E13 vg/ml였다. 수득한 액체 제형은 IV 주입을 위해 유용한 멸균의 투명하고/무색 내지 담황색 용액이고, 상기된 비-/임상전 연구를 위해 사용된 제형과 비교하여, 유리 및 플라스틱으로의 결합에 의한 바이러스 흡착 손실을 허용되는 수준까지 감소시켰다. 상기 액체 제형은 ≤ - 65 ℃에서 저장 동안에 연장된 기간 동안 안정한 것으로 입증되었고 하기된 인간 임상 연구를 위해 사용된다.
인간 임상 연구 디자인
중증 A형 혈우병를 갖는 상기 인간에서 최초 용량 상승 연구에 참여자는 용량 수준에 따른 3개 이하의 코호트 중 하나로 연속으로 입회시켰다: (i) 단일 정맥내 용량 (iv)으로서 투여되는, 체중 킬로그램 당 6E12 벡터 게놈 [vg], (ii) 킬로그램 당 2E13 vg, iv, 또는 (iii) 안전성 및 효능 평가가 수행되는 16주 주입후 후속 기간으로 이어지는 킬로그램 당 6E13 vg. 16주에 1차 종점 분석 후, 안전성 및 효능은 이어서 대략적으로 5년 동안 평가된다.
환자는 코호트 사이에 3주 이상 마다 연속으로 입회시킨다. 용량 상승은 단일 환자가 3주에 수득한 FVIII 활성이 수득한 < 5 IU/dl인 경우 안전하게 용량 투여된 후 일어날 수 있다. 3주는 발현이 최대에 가까워지는 시간인 것으로 예측된다. 상기 상승 패러다임은 서브-치료학적 용량으로 노출된 환자 수를 최소화하기 위해 의도된다.
상기 출발 용량은 마우스 및 몽키의 비임상적 연구에서 관찰된 FVIII의 발현 및 안전성을 기반으로 하였다. 출발 용량은 비-인간 영장류에서 어떠한 관달되지 않는 부작용 수준 (NOAEL)으로부터 상당한 안전성 차이 (10배)를 갖는다.
대략적으로, 주사 3주 후에, 다음 용량 수준으로 상승시키기 위한 결정은 안전성 파라미터 및 FVIII 활성의 검토를 기반으로 수행한다. FVIII 활성이 ≥5 IU/dl인 경우, 용량 그룹의 다른 환자는 환자들 간에 3주 동안 대기 없이 입회시킨다.
환자 1은 체중 킬로그램 당 6E12 벡터 게놈 [vg]으로 정맥내 관류에 의해 투여된다. 활성 수준이 21일에 ≥5 IU/dl에 도달하지 못하는 경우, 보다 높은 용량 (킬로그램 당 2E13 vg)은 다음 환자를 위해 사용한다.
활성 수준이 환자 2 후에 ≥5 IU/dl에 도달하지 못하는 경우, 보다 높은 용량 (킬로그램 당 6E13 vg)은 다음 환자를 위해 사용한다.
각각의 용량에 대해, 활성 수준이 5 IU/dl에 도달하는 경우 및 어떠한 안전성이 문제가 발견되지 않는 경우, 4명 이하의 환자가 상기 용량을 투여받는다. 임의의 시점에 활성 수준이 10 IU/dl 이상에 도달하는 경우, 어떠한 추가의 용량 상승도 수행되지 않지만 추가의 환자들은 이어서 용량 당 총 6명의 환자에 대해 상기 용량 수준에서 투여된다.
간 효소의 빈번한 모니터링은 시험 중 모든 환자에 대해 수행된다. 기준선 (즉, FVIII 벡터 투여 전) 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 농도가 결정되고 투여 후 1.5 배 이상의 ALT 상승은 치료학적 코르티코스테로이드 사용을 유발한다. 환자는 또한 간독성으로부터 보호하기 위해 코르티코스테로이드를 사용하여 예방학적으로 (즉, FVIII 벡터 투여 전) 치료될 수 있다.
결과 - 환자 1
환자 1은 상기된 바와 같이 체중 킬로그램 당 6E12 벡터 게놈 [vg]의 AAV5-FVIII-SQ로 단일 정맥내 관류에 의해 투여하였다. 투여 시점에, 환자 1은 ≤ 0.5 IU/dl의 순환 혈액 인자 VIII를 가졌다. 투여 7일 후, 환자 1의 순환 혈액 인자 VIII 수준은 5.4 IU/dl로 증가하였고 추가로 투여 후 14일째에 19.2 IU/dl로 증가하였다. 투여 후 21일째에, 그러나, 환자 1의 순환 인자 VIII 수준은 ≤ 0.5 IU/dl로 감소하였고 이후 상기 수준에서 일정하게 유지되었다.
결과 - 환자 2
환자 1의 인자 VIII 활성 수준은 투여 후 21일째에 적어도 5 IU/dl이 아니기 때문에, 환자 2는 상기된 바와 같이 단일 정맥내 관류에 의해 체중 킬로그램 당 2E13 벡터 게놈 [vg]의 AAV5-FVIII-SQ의 용량으로 상승시켰다. 투여 시점에, 환자 2는 ≤ 0.1 IU/dl의 순환 혈액 인자 VIII 수준을 가졌다. 투여 후 21일째에, 환자 2의 순환 혈액 인자 VIII 수준은 투여 후 10주에 0.7 IU/dl, 2.1 IU/dl로, 투여 후 12주에 2.4 IU/dl로, 투여 후 16주에 1.9 IU/dl로 및 투여 후 28주에 2.4 IU/dl로 증가시켰고, 후자는 투여 전 수준과 비교하여 적어도 24배 증가를 나타낸다. 환자 2에 측정된 ALT 수준은 28주 관찰 기간 동안 임의의 시점에 상기 기준선 보다 1.5배 이상으로 증가하지 않았고, 이와 같이 어떠한 코르티코스테로이드 치료도 개시하지 않았다.
결과 - 환자 3
환자 3은 상기된 바와 같이 단일 정맥내 관류에 의해 체중 킬로그램 당 6E13 벡터 게놈 [vg]의 AAV5-FVIII-SQ의 용량으로 상승시켰다. 투여 시점에, 환자 3은 <1.0 UL/dl의 순환 혈액 인자 VIII 수준을 가졌다. 투여 후 21일째에, 환자 3의 순환 혈액 인자 VIII 수준은 투여 후 10주에 3.1 IU/dl, 20.8 IU/dl로, 투여 후 12주에 34.7 IU/dl로, 투여 후 16주에 56.6 IU/dl로 및 투여 후 28주에 89.3 IU/dl로 증가시켰고, 이는 인간에서 만족할만한 혈액 응고를 위해 요구되는 인자 VIII의 농도 초과이고 환자에서 출혈 반응 동안에 출혈 시점에서 감소한다.
환자 3에서 ALT 수준은 FVIII 벡터 투여 후 기준선의 1.5배 초과로 증가시키는 것으로 관찰되었기 때문에, 대상체는 계속되는 관찰 기간 동안 5 mg/일 내지 60 mg/일 농도 범위에서 코르티코스테로이드로 치료학적으로 치료하였다. 치료학적 코르티코스테로이드 치료는 간독성-관련된 ALT 농도를 인자 VIII 수준에서의 동시 감소 또는 임의의 연관된 중증 부작용 없이 허용되는 수준으로 감소시켰다.
결과 - 환자 4
환자 4는 상기된 바와 같이 단일 정맥내 관류에 의해 체중 킬로그램 당 6E13 벡터 게놈 [vg]의 AAV5-FVIII-SQ를 투여받았다. 투여 시점에, 환자 4는 <1.0 UL/dl의 순환 혈액 인자 VIII 수준을 가졌다. 투여 후 21일째에, 환자 4의 순환 혈액 인자 VIII 수준은 투여 후 10주에 5.6 IU/dl, 67.8 IU/dl로, 투여 후 12주에 89 IU/dl로, 투여 후 16주에 >170 IU/dl로 및 투여 후 20주에 219.2 IU/dl로 증가시켰고, 이는 인간에서 만족할만한 혈액 응고를 위해 요구되는 인자 VIII의 농도 초과이고 환자에서 출혈 반응 동안에 출혈 시점에서 감소한다.
환자 4는 연속되는 관찰 기간 동안 5 mg/일 내지 40 mg/일 농도 범위에서 코르티코스테로이드로 예방학적으로 치료하였다. 치료학적 코르티코스테로이드 치료는 간독성-관련된 ALT 농도를 인자 VIII 수준에서의 동시 감소 또는 임의의 연관된 중증 부작용 없이 허용되는 수준에서 유지시켰다.
결과 - 환자 5
환자 5는 상기된 바와 같이 단일 정맥내 관류에 의해 체중 킬로그램 당 6E13 벡터 게놈 [vg]의 AAV5-FVIII-SQ를 투여받았다. 투여 시점에, 환자 5는 <1.0 UL/dl의 순환 혈액 인자 VIII 수준을 가졌다. 투여 후 21일째에, 환자 5의 순환 혈액 인자 VIII 수준은 투여 후 10주에 2.2 IU/dl, 24.4 IU/dl로, 투여 후 12주에 59.4 IU/dl로, 투여 후 16주에 126.5 IU/dl로 및 투여 후 19주에 271.2 IU/dl로 증가시켰고, 이는 인간에서 만족할만한 혈액 응고를 위해 요구되는 인자 VIII의 농도 초과이고 환자에서 출혈 반응 동안에 출혈 시점에서 감소한다.
환자 5는 연속되는 관찰 기간 동안 5 mg/일 내지 40 mg/일 농도 범위에서 코르티코스테로이드로 예방학적 및 치료학적 둘 다로 치료하였다. 예방학적 및 치료학적 코르티코스테로이드 치료는 간독성-관련된 ALT 농도를 인자 VIII 수준에서의 동시 감소 또는 임의의 연관된 중증 부작용 없이 허용되는 수준에서 유지시켰다.
결과 - 환자 6
환자 6은 상기된 바와 같이 단일 정맥내 관류에 의해 체중 킬로그램 당 6E13 벡터 게놈 [vg]의 AAV5-FVIII-SQ를 투여받았다. 투여 시점에, 환자 6은 <1.0 UL/dl의 순환 혈액 인자 VIII 수준을 가졌다. 투여 후 21일째에, 환자 6의 순환 혈액 인자 VIII 수준은 투여 후 10주에 <1.0 IU/dl, 6.2 IU/dl로, 투여 후 12주에 19.6 IU/dl로, 투여 후 16주에 13 IU/dl로 및 투여 후 19주에 13 IU/dl로 증가시켰고, 이는 인간에서 만족할만한 혈액 응고를 위해 요구되는 인자 VIII의 농도 초과이고 환자에서 출혈 반응 동안에 출혈 시점에서 감소한다.
환자 6은 연속되는 관찰 기간 동안 5 mg/일 내지 60 mg/일 농도 범위에서 코르티코스테로이드로 치료학적으로 치료하였다. 치료학적 코르티코스테로이드 치료는 간독성-관련된 ALT 농도를 인자 VIII 수준에서의 동시 감소 또는 임의의 연관된 중증 부작용 없이 허용되는 수준에서 유지시켰다.
결과 - 환자 7
환자 7은 상기된 바와 같이 단일 정맥내 관류에 의해 체중 킬로그램 당 6E13 벡터 게놈 [vg]의 AAV5-FVIII-SQ를 투여받았다. 투여 시점에, 환자 7은 <1.0 UL/dl의 순환 혈액 인자 VIII 수준을 가졌다. 투여 후 21일째에, 환자 7의 순환 혈액 인자 VIII 수준은 투여 후 10주에 10.4 IU/dl, 56.4 IU/dl로, 투여 후 12주에 58 IU/dl로, 투여 후 16주에 93.1 IU/dl로 및 투여 후 18주에 135.8 IU/dl로 증가시켰고, 이는 인간에서 만족할만한 혈액 응고를 위해 요구되는 인자 VIII의 농도 초과이고 환자에서 출혈 반응 동안에 출혈 시점에서 감소한다.
환자 7은 연속되는 관찰 기간 동안 5 mg/일 내지 40 mg/일 농도 범위에서 코르티코스테로이드로 예방학적으로 치료하였다. 치료학적 코르티코스테로이드 치료는 간독성-관련된 ALT 농도를 인자 VIII 수준에서의 동시 감소 또는 임의의 연관된 중증 부작용 없이 허용되는 수준에서 유지시켰다.
결과 - 환자 8
환자 8은 상기된 바와 같이 단일 정맥내 관류에 의해 체중 킬로그램 당 6E13 벡터 게놈 [vg]의 AAV5-FVIII-SQ를 투여받았다. 투여 시점에, 환자 8은 <1.0 UL/dl의 순환 혈액 인자 VIII 수준을 가졌다. 투여 후 21일째에, 환자 8의 순환 혈액 인자 VIII 수준은 투여 후 10주에 5.1 IU/dl, 35.2 IU/dl로, 투여 후 12주에 42.7 IU/dl로, 투여 후 16주에 49.7 IU/dl로 및 투여 후 17주에 68.8 IU/dl로 증가시켰고, 이는 인간에서 만족할만한 혈액 응고를 위해 요구되는 인자 VIII의 농도 초과이고 환자에서 출혈 반응 동안에 출혈 시점에서 감소한다.
환자 8은 연속되는 관찰 기간 동안 10 mg/일 내지 40 mg/일 농도 범위에서 코르티코스테로이드로 예방학적으로 치료하였다. 치료학적 코르티코스테로이드 치료는 간독성-관련된 ALT 농도를 인자 VIII 수준에서의 동시 감소 또는 임의의 연관된 중증 부작용 없이 허용되는 수준에서 유지시켰다.
결과 - 환자 9
환자 9는 상기된 바와 같이 단일 정맥내 관류에 의해 체중 킬로그램 당 6E13 벡터 게놈 [vg]의 AAV5-FVIII-SQ를 투여받았다. 투여 시점에, 환자 9는 <1.0 UL/dl의 순환 혈액 인자 VIII 수준을 가졌다. 투여 후 12주에, 환자 9의 순환 혈액 인자 VIII 수준은 78.7 IU/dl로 증가시켰고, 이는 인간에서 만족할만한 혈액 응고를 위해 요구되는 인자 VIII의 농도 초과이고 환자에서 출혈 반응 동안에 출혈 시점에서 감소한다.
환자 9는 연속되는 관찰 기간 동안 10 mg/일 내지 40 mg/일 농도 범위에서 코르티코스테로이드로 치료학적으로 치료하였다. 치료학적 코르티코스테로이드 치료는 간독성-관련된 ALT 농도를 인자 VIII 수준에서의 동시 감소 또는 임의의 연관된 중증 부작용 없이 허용되는 수준에서 유지시켰다.
요약
본 실시예 8에서 제공된 결과는 인간 환자에서 A형 혈우병의 성공적인 치료요법이 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 성취될 수 있음을 입증한다. 보다 구체적으로, 본원에서 체중 킬로그램 당 적어도 2E13 벡터 게놈 [vg]의 AAV5-FVIII-SQ를 사용한 A형 혈우병를 앓는 인간의 치료가 투여 후 적어도 26주 동안 ≥2 IU/dl의 안정한 FVIII 활성을 유도하고 체중 킬로그램 당 적어도 6E13 벡터 게놈 [vg]의 AAV5-FVIII-SQ를 사용한 A형 혈우병를 앓는 인간의 치료가 치료된 모든 환자에서 >10 IU/dl의 높은 지속적 FVIII를 유도함을 입증하였다. 더욱이, 본원에 제공된 데이터는 AAV5-FVIII-SQ를 사용한 치료가 매우 관용성이고 어떠한 임상-관련 지속적 ALT 수준의 증가 또는 간독성의 다른 마커의 증가를 유도하지 않음을 입증한다. 환자의 예방학적 및/또는 치료학적 코르티코스테로이드 치료는 간독성-관련된 ALT 농도를 인자 VIII 수준에서의 동시 감소 또는 임의의 연관된 중증 부작용 없이 허용되는 수준에서 유지시킬 수 있다. 마지막으로, 초기 데이터는 예방학적으로 또는 치료학적으로 코르티코스테로이드로 치료된 환자가 FVIII 발현 또는 ALT 농도 수준에 대한 부작용 없이 스테로이드 치료를 성공적으로 감소시킬 수 있음을 입증한다.
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ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg 60
cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctgtttg ctgcttgcaa tgtttgccca ttttagggtg 180
gacacaggac gctgtggttt ctgagccagg gggcgactca gatcccagcc agtggactta 240
gcccctgttt gctcctccga taactggggt gaccttggtt aatattcacc agcagcctcc 300
cccgttgccc ctctggatcc actgcttaaa tacggacgag gacagggccc tgtctcctca 360
gcttcaggca ccaccactga cctgggacag tgaatcgcca ccatgcagat tgagctgagc 420
acctgcttct tcctgtgcct gctgaggttc tgcttctctg ccaccaggag atactacctg 480
ggggctgtgg agctgagctg ggactacatg cagtctgacc tgggggagct gcctgtggat 540
gccaggttcc cccccagagt gcccaagagc ttccccttca acacctctgt ggtgtacaag 600
aagaccctgt ttgtggagtt cactgaccac ctgttcaaca ttgccaagcc caggcccccc 660
tggatgggcc tgctgggccc caccatccag gctgaggtgt atgacactgt ggtgatcacc 720
ctgaagaaca tggccagcca ccctgtgagc ctgcatgctg tgggggtgag ctactggaag 780
gcctctgagg gggctgagta tgatgaccag accagccaga gggagaagga ggatgacaag 840
gtgttccctg ggggcagcca cacctatgtg tggcaggtgc tgaaggagaa tggccccatg 900
gcctctgacc ccctgtgcct gacctacagc tacctgagcc atgtggacct ggtgaaggac 960
ctgaactctg gcctgattgg ggccctgctg gtgtgcaggg agggcagcct ggccaaggag 1020
aagacccaga ccctgcacaa gttcatcctg ctgtttgctg tgtttgatga gggcaagagc 1080
tggcactctg aaaccaagaa cagcctgatg caggacaggg atgctgcctc tgccagggcc 1140
tggcccaaga tgcacactgt gaatggctat gtgaacagga gcctgcctgg cctgattggc 1200
tgccacagga agtctgtgta ctggcatgtg attggcatgg gcaccacccc tgaggtgcac 1260
agcatcttcc tggagggcca caccttcctg gtcaggaacc acaggcaggc cagcctggag 1320
atcagcccca tcaccttcct gactgcccag accctgctga tggacctggg ccagttcctg 1380
ctgttctgcc acatcagcag ccaccagcat gatggcatgg aggcctatgt gaaggtggac 1440
agctgccctg aggagcccca gctgaggatg aagaacaatg aggaggctga ggactatgat 1500
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ttcatccaga tcaggtctgt ggccaagaag caccccaaga cctgggtgca ctacattgct 1620
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<211> 4950
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<213> Adeno-Associated Virus
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<213> Adeno-Associated Virus 2
<400> 27
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<210> 28
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<212> DNA
<213> Adeno-Associated Virus 2
<400> 28
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<211> 6054
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gcatcaatgc ctggagcacc aaggagccct tcagctggat caaggtggac ctgctggccc 4560
ccatgatcat ccatggcatc aagacccagg gggccaggca gaagttcagc agcctgtaca 4620
tcagccagtt catcatcatg tacagcctgg atggcaagaa gtggcagacc tacaggggca 4680
acagcactgg caccctgatg gtgttctttg gcaatgtgga cagctctggc atcaagcaca 4740
acatcttcaa cccccccatc attgccagat acatcaggct gcaccccacc cactacagca 4800
tcaggagcac cctgaggatg gagctgatgg gctgtgacct gaacagctgc agcatgcccc 4860
tgggcatgga gagcaaggcc atctctgatg cccagatcac tgccagcagc tacttcacca 4920
acatgtttgc cacctggagc cccagcaagg ccaggctgca cctgcagggc aggagcaatg 4980
cctggaggcc ccaggtcaac aaccccaagg agtggctgca ggtggacttc cagaagacca 5040
tgaaggtgac tggggtgacc acccaggggg tgaagagcct gctgaccagc atgtatgtga 5100
aggagttcct gatcagcagc agccaggatg gccaccagtg gaccctgttc ttccagaatg 5160
gcaaggtgaa ggtgttccag ggcaaccagg acagcttcac ccctgtggtg aacagcctgg 5220
acccccccct gctgaccaga tacctgagga ttcaccccca gagctgggtg caccagattg 5280
ccctgaggat ggaggtgctg ggctgtgagg cccaggacct gtactgacct cgaggaataa 5340
aggaaattta ttttcattgc aatagtgtgt tggttttttg tgtcacgtgg cggccgcagg 5400
aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 5460
ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag 5520
cgcgcagaga gggagtggcc aa 5542
Claims (64)
- 재조합체 AAV FVIII(adeno-associated virus Factor VIII) 바이러스, 완충제, 등장화제, 증량제(bulking agent) 및 계면활성제를 포함하는 약제학적 제형.
- 청구항 1에 있어서, 상기 재조합체 AAV FVIII 바이러스가 AAV5-FVIII-SQ인, 약제학적 제형.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 적어도 2주 동안 65℃ 이하에서 저장 동안에 안정한, 약제학적 제형.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 약 0.1 mg/ml 내지 약 3 mg/ml의 농도의 제2 인산나트륨(sodium phosphate, dibasic), 약 0.1 mg/ml 내지 약 3 mg/ml의 농도의 제1 인산나트륨(sodium phosphate monobasic) 일수화물, 약 1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도의 염화나트륨, 약 5 mg/ml 내지 약 40 mg/ml의 농도의 만니톨, 및 약 0.1 mg/ml 내지 약 4 mg/ml의 농도의 폴록사머 188을 포함하는, 약제학적 제형.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 약 1.42 mg/ml의 농도의 제2 인산나트륨, 약 1.38 mg/ml의 농도의 제1 인산나트륨 일수화물, 약 8.18 mg/ml의 농도의 염화나트륨, 약 20 mg/ml의 농도의 만니톨, 및 약 2 mg/ml의 농도의 폴록사머 188을 포함하는, 약제학적 제형.
- 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 액체인, 약제학적 제형.
- 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 약 1E12 vg/ml 내지 약 2E14 vg/ml의 농도의 상기 AAV FVIII 바이러스를 포함하는, 약제학적 제형.
- 청구항 7에 있어서, 약 2E13 vg/ml의 농도의 상기 AAV FVIII 바이러스를 포함하는, 약제학적 제형.
- 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, A형 혈우병을 앓는 환자로의 정맥내(IV) 투여에 유용한, 약제학적 제형.
- 하기 단계를 포함하는, A형 혈우병을 앓는 대상체를 치료하는 방법:
치료학적 유효량의 재조합체 AAV FVIII 바이러스를 상기 대상체에게 투여하는 단계. - 청구항 10에 있어서, 상기 재조합체 AAV FVIII 바이러스가 AAV5-FVIII-SQ인, 방법.
- 청구항 10 또는 11에 있어서, 상기 투여하는 단계가 정맥내 투여에 의한 것인, 방법.
- 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 약 1E12 vg/kg 내지 약 1E14 vg/kg의 재조합체 AAV FVIII 바이러스를 상기 대상체에게 투여함을 포함하는, 방법.
- 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 약 6E12 vg/kg 내지 약 6E13 vg/kg의 재조합체 AAV FVIII 바이러스를 상기 대상체에게 투여함을 포함하는, 방법.
- 청구항 10 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 적어도 약 5 IU/dl의 기능적 인자 VIII 단백질의 발현을 유발시키는, 방법.
- 청구항 10 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 상기 투여 후 3주 이상에서 적어도 약 5 IU/dl의 기능적 인자 VIII 단백질을 발현하는, 방법.
- 청구항 10 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 적어도 약 1 IU/dl의 기능적 FVIII 활성의 증가를 유발시키는, 방법.
- 청구항 10 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 약제학적 제형을 투여함을 포함하는, 방법.
- 청구항 18에 있어서, 상기 약제학적 제형이 약 0.1 mg/ml 내지 약 3 mg/ml의 농도의 제2 인산나트륨, 약 0.1 mg/ml 내지 약 3 mg/ml의 농도의 제1 인산나트륨 일수화물, 약 1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도의 염화나트륨, 약 5 mg/ml 내지 약 40 mg/ml의 농도의 만니톨, 및 약 0.1 mg/ml 내지 약 4 mg/ml의 농도의 폴록사머 188을 포함하는, 방법.
- 청구항 18에 있어서, 상기 약제학적 제형이 약 1.42 mg/ml의 농도의 제2 인산나트륨, 약 1.38 mg/ml의 농도의 제1 인산나트륨 일수화물, 약 8.18 mg/ml의 농도의 염화나트륨, 약 20 mg/ml의 농도의 만니톨, 및 약 2 mg/ml의 농도의 폴록사머 188을 포함하는, 방법.
- 청구항 10 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 5 mg/일 내지 60 mg/일의 농도 범위의 코르티코스테로이드로 예방학적으로 치료되는, 방법.
- 청구항 10 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10주 이상의 연속 기간 동안 5 mg/일 내지 60 mg/일의 농도 범위의 코르티코스테로이드로 예방학적으로 치료되는, 방법.
- 청구항 10 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 5 mg/일 내지 60 mg/일의 농도 범위의 코르티코스테로이드로 치료학적으로 치료되는, 방법.
- 청구항 10 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10주 이상의 연속 기간 동안 5 mg/일 내지 60 mg/일의 농도 범위의 코르티코스테로이드로 치료학적으로 치료되는, 방법.
- 청구항 10 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료학적 유효량의 상기 재조합체 AAV FVIII 바이러스의 투여 후에 상기 대상체의 혈청 중 항-AAV 캡시드의 부재 또는 존재를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 청구항 25에 있어서, 상기 대상체의 혈청 중 상기 항-AAV 캡시드 항체의 존재의 결정을 수행한 후에 상기 대상체에게 유효량의 코르티코스테로이드를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 하기 단계를 포함하는, A형 혈우병을 앓는 대상체에서 출혈 에피소드의 출혈 시간을 감소시키는 방법:
치료학적 유효량의 재조합체 AAV FVIII 바이러스를, 상기 출혈 에피소드 전에, 상기 대상체에게 투여하는 단계. - 청구항 27에 있어서, 상기 투여하는 단계가 상기 출혈 에피소드 전 적어도 3주에 일어나는, 방법.
- 청구항 27 또는 28에 있어서, 상기 재조합체 AAV FVIII 바이러스가 AAV5-FVIII-SQ인, 방법.
- 청구항 27 내지 29 중 어느 한 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 정맥내 투여에 의한 것인, 방법.
- 청구항 27 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 약 1E12 vg/kg 내지 약 1E14 vg/kg의 재조합체 AAV FVIII 바이러스를 상기 대상체에게 투여함을 포함하는, 방법.
- 청구항 27 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 약 6E12 vg/kg 내지 약 6E13 vg/kg의 재조합체 AAV FVIII 바이러스를 상기 대상체에게 투여함을 포함하는, 방법.
- 청구항 27 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 적어도 약 5 IU/dl의 기능적 인자 VIII 단백질의 발현을 유발시키는, 방법.
- 청구항 27 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 상기 투여 후 3주 이상에서 적어도 약 5 IU/dl의 기능적 인자 VIII 단백질을 발현하는, 방법.
- 청구항 27 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 적어도 약 1 IU/dl의 기능적 FVIII 활성의 증가를 유발시키는, 방법.
- 청구항 27 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 약제학적 제형을 투여함을 포함하는, 방법.
- 청구항 36에 있어서, 상기 약제학적 제형이 약 0.1 mg/ml 내지 약 3 mg/ml의 농도의 제2 인산나트륨, 약 0.1 mg/ml 내지 약 3 mg/ml의 농도의 제1 인산나트륨 일수화물, 약 1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도의 염화나트륨, 약 5 mg/ml 내지 약 40 mg/ml의 농도의 만니톨, 및 약 0.1 mg/ml 내지 약 4 mg/ml의 농도의 폴록사머 188을 포함하는, 방법.
- 청구항 37에 있어서, 상기 약제학적 제형이 약 1.42 mg/ml의 농도의 제2 인산나트륨, 약 1.38 mg/ml의 농도의 제2 인산나트륨 일수화물, 약 8.18 mg/ml의 농도의 염화나트륨, 약 20 mg/ml의 농도의 만니톨, 및 약 2 mg/ml의 농도의 폴록사머 188을 포함하는, 방법.
- 청구항 27 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 5 mg/일 내지 60 mg/일의 농도 범위의 코르티코스테로이드로 예방학적으로 치료되는, 방법.
- 청구항 27 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10주 이상의 연속 기간 동안 5 mg/일 내지 60 mg/일의 농도 범위의 코르티코스테로이드로 예방학적으로 치료되는, 방법.
- 청구항 27 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 5 mg/일 내지 60 mg/일의 농도 범위의 코르티코스테로이드로 치료학적으로 치료되는, 방법.
- 청구항 41에 있어서, 상기 대상체가 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10주 이상의 연속 기간 동안 5 mg/일 내지 60 mg/일의 농도 범위의 코르티코스테로이드로 치료학적으로 치료되는, 방법.
- 하기 단계를 포함하는, 인자 VIII 단백질 발현의 증가를 필요로 하는 대상체에서 인자 VIII 단백질 발현을 증가시키는 방법:
재조합체 AAV FVIII 바이러스를 상기 대상체에게 투여하는 단계. - 청구항 43에 있어서, 상기 재조합체 AAV FVIII 바이러스가 AAV5-FVIII-SQ인, 방법.
- 청구항 43 또는 44에 있어서, 상기 투여하는 단계가 정맥내 투여에 의한 것인, 방법.
- 청구항 43 내지 45 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 약 1E12 vg/kg 내지 약 1E14 vg/kg의 재조합체 AAV FVIII 바이러스를 상기 대상체에게 투여함을 포함하는, 방법.
- 청구항 43 내지 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 약 6E12 vg/kg 내지 약 6E13 vg/kg의 재조합체 AAV FVIII 바이러스를 상기 대상체에게 투여함을 포함하는, 방법.
- 청구항 43 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 적어도 약 5 IU/dl의 기능적 인자 VIII 단백질의 발현을 유발시키는, 방법.
- 청구항 43 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 상기 투여 후 3주 이상에서 적어도 약 5 IU/dl의 기능적 인자 VIII 단백질을 발현하는, 방법.
- 청구항 43 내지 49 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 적어도 약 1 IU/dl의 기능적 인자 VIII 단백질의 발현을 유발시키는, 방법.
- 청구항 43 내지 50 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 상기 투여 후 3주 이상에서 적어도 약 1 IU/dl의 기능적 인자 VIII 단백질을 발현하는, 방법.
- 청구항 43 내지 51 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 적어도 약 1 IU/dl의 기능적 FVIII 활성의 증가를 유발시키는, 방법.
- 청구항 43 내지 52 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 약제학적 제형을 투여함을 포함하는, 방법.
- 청구항 53에 있어서, 상기 약제학적 제형이 약 0.1 mg/ml 내지 약 3 mg/ml의 농도의 제2 인산나트륨, 약 0.1 mg/ml 내지 약 3 mg/ml의 농도의 제1 인산나트륨 일수화물, 약 1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도의 염화나트륨, 약 5 mg/ml 내지 약 40 mg/ml의 농도의 만니톨, 및 약 0.1 mg/ml 내지 약 4 mg/ml의 농도의 폴록사머 188을 포함하는, 방법.
- 청구항 54에 있어서, 상기 약제학적 제형이 약 1.42 mg/ml의 농도의 제2 인산나트륨, 약 1.38 mg/ml의 농도의 제1 인산나트륨 일수화물, 약 8.18 mg/ml의 농도의 염화나트륨, 약 20 mg/ml의 농도의 만니톨, 및 약 2 mg/ml의 농도의 폴록사머 188을 포함하는, 방법.
- 청구항 43 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 5 mg/일 내지 60 mg/일의 농도 범위의 코르티코스테로이드로 치료되는, 방법.
- 청구항 56에 있어서, 상기 코르티코스테로이드 치료가 예방학적으로 수행되는, 방법.
- 청구항 56 또는 57에 있어서, 상기 코르티코스테로이드 치료가 치료학적으로 수행되는, 방법.
- 청구항 43 내지 58 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10주 이상의 연속 기간 동안 5 mg/일 내지 60 mg/일의 농도 범위의 코르티코스테로이드로 치료되는, 방법.
- 청구항 43 내지 59 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료학적 유효량의 상기 재조합체 AAV FVIII 바이러스의 투여 후에 상기 대상체의 혈청 중 항-AAV 캡시드의 부재 또는 존재를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 청구항 60에 있어서, 상기 대상체의 혈청 중 상기 항-AAV 캡시드 항체의 존재의 결정을 수행한 후에 상기 대상체에 유효량의 코르티코스테로이드를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 하기 단계들을 포함하는, A형 혈우병을 앓는 대상체를 치료하는 방법:
(i) 상기 대상체의 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체의 부재를 결정하는 단계 및 (ii) 치료학적 유효량의 재조합 AAV FVIII 바이러스를 상기 대상체에게 투여하는 단계. - 하기 단계들을 포함하는, A형 혈우병을 앓는 대상체를 치료하는 방법:
(i) 치료학적 유효량의 재조합체 AAV FVIII 바이러스를 상기 대상체에게 투여하는 단계, 및 (ii) 상기 치료학적 유효량의 상기 재조합체 AAV FVIII 바이러스의 투여 후, 상기 대상체의 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체의 부재 또는 존재를 결정하는 단계. - 청구항 63에 있어서, 상기 대상체의 혈청 중 항-AAV 캡시드 항체의 존재의 결정을 수행한 후에 상기 대상체에게 유효량의 코르티코스테로이드를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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