RU2799048C2 - Улучшение клинических параметров посредством экспрессии фактора viii - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины, а именно к способам увеличения и повышения уровня белка фактора VIII (FVIII) у человека с гемофилией А, включающего внутривенное введение человеку одной или более доз от 5×10¹² до 5×10¹³ вг/кг вектора на основе аденовирус-ассоциированного вируса (AAV), который кодирует белок FVIII. Технический результат заключается в обеспечении у человека с гемофилией А повышения уровня FVIII или нормальных уровней FVIII. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 10 ил., 2 табл., 7 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ПАТЕНТНЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет каждой из временной заявки на патент США № 62/714553, поданной 3 августа 2018 года; временной заявки на патент США № 62/826887, поданной 29 марта 2019 года; и временной заявки на США № 62/869445, поданной 1 июля 2019 года, каждая из которых включена в качестве ссылки в полном объеме.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Настоящая заявка содержит список последовательностей, который предоставлен в электронной форме в формате ASCII и, таким образом, включен в качестве ссылки в полном объеме. Указанная копия ASCII, созданная 1 августа 2019 года, названа 1147465 _SL.txt и имеет размер 28207 байт.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Генную терапию можно использовать для генетической модификации клетки так, чтобы она имела один или более инактивированных генов и/или чтобы обеспечить экспрессию в клетке продукта, который ранее не продуцировался в этой клетке (например, посредством встраивания трансгена и/или посредством коррекции эндогенной последовательности). Примеры применений вставки трансгена включают вставку одного или более генов, кодирующих один или более новых терапевтических белков, вставку кодирующей последовательности, кодирующей белок, отсутствующий в клетке или у индивидуума, вставку гена дикого типа в клетке, содержащей мутантную последовательность гена, и/или вставку последовательности, которая кодирует структурную нуклеиновую кислоту, такую как микроРНК или миРНК. Примеры пригодных применений "коррекции" эндогенной последовательности гена включают изменения ассоциированных с заболеванием мутаций генов, изменения последовательностей, кодирующих участки сплайсинга, изменения регуляторных последовательностей и/или направленные изменения последовательностей, кодирующих структурные элементы белка.

[0004] Печеночный перенос генов обеспечивает эффективный способ доставки трансгенов индивидууму для лечения и/или предупреждения различных нарушений, включая гемофилии и лизосомальные болезни накопления. См., например, патент США № 9150847 и публикации США № 20130177983 и 20140017212. Также описаны векторы, специфические для направленной печеночной генной терапии. См., например, WO 2014064277; WO 2009130208; EP 2451474B1, Chuah et al., (2014) Molecular Therapy, 22, 1605-1613; и Nair et al. (2014) Blood 123:3195-3199. Эти векторы могут включать последовательность интрона минутного вируса мыши (MVM). См., например, Haut and Pintel (1998) J. Virol. 72: 1834-1843; Haut and Pintel (1998) Virol. 258:84-94.

[0005] Гемофилии, такие как гемофилия A и гемофилия B, представляют собой генетические нарушения системы свертывания крови, характеризующиеся кровотечением в суставы и мягкие ткани и чрезмерным кровотечением в любой области, в которой произошла травма или проводится хирургическая операция. Гемофилия A клинически неотличима от гемофилии B, однако у пациентов с гемофилией A возникает дефицит или отсутствие фактора VIII (FVIII или F8), в то время как у пациентов с гемофилией B возникает дефицит или отсутствие фактора IX (FIX или F.IX). Ген F8 кодирует гликопротеин плазмы, который циркулирует в ассоциации с фактором фон Виллебранда в его неактивной форме. При поверхностном повреждении запускается внутренний каскад свертывания и FVIII высвобождается из комплекса и активируется. Активированная форма действует вместе с фактором IX, активируя фактор X, который становится активированным Xa, что в конечном итоге приводит к изменению фибриногена в фибрин и индукции образования тромба. См., Levinson et al. (1990) Genomics 7(1): 1-11. 40-50% пациентов с гемофилией A имеют хромосомную инверсию, вовлекающую интрон 22 F8 (также известная как IVS22). Эта инверсия вызывается внутрихромосомным событием рекомбинации между последовательностью размером 9,6 т.п.н. в интроне 22 гена F8 и одной из двух близкородственных обратно ориентированных последовательностей, находящихся приблизительно на 300 т.п.н. дистальнее гена F8, что приводит к инверсии экзонов 1-22 относительно экзонов 23-26. См., Textbook of Haemophilia. Lee et al. (eds) 2005, Blackwell Publishing. Другие пациенты с гемофилией A имеют дефекты в F8, включая мутации активного центра и нонсенс- и миссенс-мутации.

[0006] Клинически пациентов с гемофилией A оценивают и классифицируют в зависимости от того, как часто пациент имеет эпизоды кровотечения и как долго эти эпизоды длятся. Обе из этих характеристик прямо зависят от количества белка FVIII в крови пациента. Пациенты с тяжелой гемофилией, как правило, имеют менее 1% от нормального уровня FVIII в крови, у них происходит кровотечение после повреждения и часто спонтанное кровоизлияние в их суставы. Пациенты с умеренной формой имеют 1-5% от нормального уровня FVIII, в то время как пациенты с мягкой формой имеют 6% или более от нормального уровня FVIII и имеют эпизоды кровотечения только после серьезного повреждения, травмы или хирургической операции (Kulkami et al. (2009) Haemophilia 15: 1281-90). Пациентов с гемофилией A лечат заместительным белком FVIII (часто, упоминаемым как "фактор"), либо происходящим из плазмы человека, либо получаемым рекомбинантным путем, где частота лечения основана на характере кровотечений и тяжести гемофилии. Пациенты с тяжелой гемофилией A получают профилактическое лечение на регулярной основе для предотвращения кровотечений, в то время как пациенты с менее тяжелыми формами могут получать лечение только при необходимости после повреждения.

[0007] Описана генная терапия для пациентов с гемофилией A или B, вовлекающая введение плазмидных и других векторов (например, AAV), кодирующих функциональные белки FVIII или F.IX (см., например, патенты США № 6936243; 7238346 и 6200560; Shi et al. (2007) J Thromb Haemost. (2): 352-61; Lee et al. (2004) Pharm. Res. 7: 1229-1232; Graham et al. (2008) Genet Vaccine Ther. 3:6-9; Manno et al. (2003) Blood 101(8): 2963-72; Manno et al. (2006) Nature Medicine 12(3): 342-7; Nathwani et al. (2011) Mol Ther 19(5): 876-85; Nathwani et al. (201 1); N Engl J Med. 365(25): 2357-65 и Mcintosh et al. (2013) Blood 121 (17): 3335-44).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] Описаны векторы на основе AAV, экспрессирующие фактор VIII, и способы лечения гемофилии, а также другие аспекты. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу предоставления белка фактора VIII (FVIII) человеку. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение человеку одной или более доз от 6×10¹¹ до 1×10¹³ или 3×10¹³, от 1×10¹³ до 1×10¹⁴, или от 1×10¹³ до 5×10¹³, или от 2×10¹³ до 4×10¹³ вг/кг вектора на основе аденовирус-ассоциированного вируса (AAV), как описано в настоящем описании, где введение вектора на основе AAV приводит к продуцированию белка фактора VIII у человека. В некоторых вариантах осуществления доза составляет 9×10¹¹ вг/кг, 2×10¹² вг/кг, 1×10¹³ вг/кг, 2×10¹³ вг/кг, 3×10¹³ вг/кг или 4×10¹³ вг/кг. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе AAV имеет серотип AAV6, содержащий нуклеотидную последовательность, содержащую последовательности инвертированных концевых повторов AAV2, фланкирующие экспрессирующую кассету, содержащую специфический для печени энхансер и промотор, функционально связанные с полинуклеотидом, кодирующим SEQ ID NO: 1.

[0009] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает измерение уровня белка FVIII в крови человека до и после введения.

[0010] В некоторых вариантах осуществления введение вектора на основе AAV, например, в дозе в диапазоне от 1×10¹³ вг/кг до 3×10¹³ или от 1×10¹³ до 1×10¹⁴, или от 1×10¹³ до 5×10¹³, или от 2×10¹³ до 4×10¹³ вг/кг, приводит к клинически значимому увеличению активности FVIII относительно пациента с активностью циркулирующего FVIII, оцененной у пациента до введения, в диапазоне от 5% до 150%, или более. В некоторых вариантах осуществления введение вектора на основе AAV, например, в дозе 3×10¹³ вг/кг, приводит к клинически значимому повышению активности FVIII в диапазоне от 20% до 150%, или более. В некоторых вариантах осуществления введение приводит к одному или нулю случаев возникновения эпизодов спонтанного кровотечения у человека в течение 3-12 месяцев (или, например, 3-6 месяцев, 3 месяца-1, 2, 5 или 10 лет, или более) после введения.

[0011] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу увеличения уровня белка фактора VIII (FVIII) у человека, включающему введение человеку одной или более доз от 2×10¹² вг/кг до 3×10¹³ или от 1×10¹³ до 1×10¹⁴, или от 1×10¹³ до 5×10¹³, или от 2×10¹³ до 4×10¹³ вг/кг вектора на основе аденовирус-ассоциированного вируса (AAV), который кодирует белок FVIII (необязательно содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1), где введение вектора на основе AAV приводит к клинически значимому повышению активности циркулирующего FVIII, например, на 5%-150%; или на 50%-150%. В некоторых вариантах осуществления одна или более доз фактора VIII, вводимых пациенту, находятся в диапазоне от 1×10¹³ вг/кг до 3×10¹³ вг/кг. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе AAV имеет серотип AAV6. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе AAV содержит экспрессирующую кассету, содержащую полинуклеотид, который кодирует белок FVIII, функционально связанный со специфическим для печени энхансером и промотором. В некоторых вариантах осуществления специфический для печени энхансер представляет собой энхансер серпина 1, и/или промотор представляет собой минимальный промотор транстиретина. В некоторых вариантах осуществления специфический для печени энхансер содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 и/или промотор содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе AAV содержит последовательность 5’-инвертированного концевого повтора (ITR) AAV2 и последовательность 3’-ITR AAV2, которая фланкирует экспрессирующую кассету. В некоторых вариантах осуществления 5’-ITR AAV2 содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 12 и/или 3’ITR AAV2 содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления последовательность экспрессирующей кассеты содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления человек имеет гемофилию.

[0012] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу повышения уровня белка фактора VIII (FVIII) у человека, включающему введение человеку одной или более доз от 2×10¹² вг/кг до 3×10¹³ или от 1×10¹³ до 1×10¹⁴, или от 1×10¹³ до 5×10¹³, или от 2×10¹³ до 4×10¹³ вг/кг вектора на основе аденовирус-ассоциированного вируса (AAV), который кодирует белок FVIII (необязательно содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1), где введение вектора на основе AAV приводит к уменьшению количества введений FVIII, которые проводят человеку. В некоторых вариантах осуществления человеку не проводят никаких введений FVIII в течение 3-12 месяцев (или, например, 3-6 месяцев, 3 месяцев-1, 2, 5 или 10 лет или более) после введения. В некоторых вариантах осуществления одна или более доз фактора VIII, вводимых пациенту, находятся в диапазоне от 1×10¹³ вг/кг до 3×10¹³ вг/кг. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе AAV имеет серотип AAV6. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе AAV содержит экспрессирующую кассету, содержащую полинуклеотид, который кодирует белок FVIII, функционально связанный со специфическим для печени энхансером и промотором. В некоторых вариантах осуществления специфический для печени энхансер представляет собой энхансер серпина 1, и/или промотор представляет собой минимальный промотор транстиретина. В некоторых вариантах осуществления, специфический для печени энхансер содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, и/или промотор содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе AAV содержит последовательность 5’-инвертированного концевого повтора (ITR) AAV2 и последовательность 3’-ITR AAV2, которая фланкирует экспрессирующую кассету. В некоторых вариантах осуществления 5’-ITR AAV2 содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 12 и/или 3’-ITR AAV2 содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления последовательность экспрессирующей кассеты содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления человек имеет гемофилию.

[0013] В некоторых вариантах осуществления введение вектора AAV, например, в дозе в диапазоне от 2×10¹² вг/кг до 3×10¹³ или от 1×10¹³ до 1×10¹⁴, или от 1×10¹³ до 5×10¹³, или от 2×10¹³ до 4×10¹³ вг/кг, приводит к сокращению введений FVIII, например, к сокращению количества инъекций FVIII, которые пациент получает в неделю или в месяц. В некоторых вариантах осуществления применение FVIII сокращается по меньшей мере на 20%. В следующих вариантах осуществления применение FVIII сокращается по меньшей мере на 50%. В некоторых вариантах осуществления применение FVIII сокращается на 90% или более.

[0014] В некоторых вариантах осуществления перед ведением человек имеет менее 1% от нормальной активности циркулирующего FVIII у человека и в течение 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48 или 52 недель после введения человек имеет по меньшей мере 1% от нормальной активности циркулирующего FVIII человека.

[0015] В некоторых вариантах осуществления перед введением человек имеет менее 5% от нормальной активности циркулирующего FVIII человека и в течение 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48 или 52 недель после введения человек имеет по меньшей мере 5% от нормальной активности циркулирующего FVIII человека.

[0016] В некоторых вариантах осуществления человек имеет не более чем в 1,5 раза больше верхнего предела нормы (ULN) по меньшей мере одного из аланинаминотрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST), билирубина, щелочной фосфатазы или альбумина в течение 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48 или 52 недель после введения.

[0017] В некоторых вариантах осуществления человек не имеет поддающихся обнаружению уровней ингибитора FVIII в течение 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48 или 52 недель после введения.

[0018] В некоторых вариантах осуществления индивидууму, которому намереваются вводить вектор на основе AAV, проводят профилактическое лечение стероидами.

[0019] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает измерение уровня по меньшей мере одного из фактора фон Виллебранда (vWF), растворимого рецептора эпидермального фактора роста (sEGFR), галектин-3-связывающего белка (GAL3BP), C-реактивного белка (CRP), IL-6, циркулирующего фетопротеина альфа, перед введением и в течение 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48 или 52 недель после введения.

[0020] В некоторых вариантах осуществления уровень фактора фон Виллебранда (vWF), растворимого рецептора эпидермального фактора роста (sEGFR), галектин-3-связывающего белка (GAL3BP), C-реактивного белка (CRP), IL-6, циркулирующего альфа-фетопротеина, в течение 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, или 52 недель после введения не превышает более чем в 1,5 раза уровень в течение двух недель перед введением.

[0021] В некоторых вариантах осуществления человек имеет меньше эпизодов кровотечения после введения. В некоторых вариантах осуществления человек имеет на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% меньше эпизодов кровотечения после введения.

[0022] В некоторых вариантах осуществления человек имеет уменьшенную необходимость в лечении заместительным белком фактора VIII. В некоторых вариантах осуществления человеку требуется на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% меньше введения заместительного белка фактора VIII после введения.

[0023] В некоторых вариантах осуществления человек имеет гемофилию.

[0024] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность содержит SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления последовательности инвертированных концевых повторов AAV2 представляют собой SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0025] На фиг.1 представлены данные активности FVIII согласно примеру 6 с использованием хромогенного анализа, как описано в примере 1.

[0026] На фиг.2 представлены данные активности FVIII согласно примеру 6 с использованием хромогенного анализа, как описано в примере 1.

[0027] На фиг.3 представлены данные активности FVIII согласно примеру 6 с использованием одностадийного анализа свертывания, как описано в примере 1.

[0028] На фиг.4 представлена активность FVIII на основе одностадийного анализа свертывания, как описано в примере 1, у десяти пациентов с течением времени после введения вектора.

[0029] На фиг.5 представлена активность FVIII на основе хромогенного анализа, как описано в примере 1, у десяти пациентов с течением времени после введения вектора.

[0030] На фиг.6 представлены данные для эпизодов спонтанного кровотечения у пациентов по меньшей мере через 3 недели после введения вектора в указанной дозировке.

[0031] На фиг.7 представлено использование FVIII у пациентов через три или более недель после инъекции вектора.

[0032] На фиг.8 представлено обобщение серьезных неблагоприятных явлений (SAE).

[0033] На фиг.9 представлено обобщение связанных с лечением неблагоприятных явлений (AE).

[0034] На фиг.10 представлено обобщение результатов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Введение

[0035] Авторы изобретения обнаружили, что определенные векторы на основе AAV, экспрессирующие фактор VIII (FVIII), являются эффективными для обеспечения увеличенной активности FVIII у человека, включая людей, имеющих гемофилию. Например, было обнаружено, что введение вектора на основе AAV, как описано в настоящем описании, в некоторых вариантах осуществления приводит к повышению активности циркулирующего от FVIII от менее 1% от нормальной активности FVIII до по меньшей мере 1% и в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 2, 3, 4 или 5% от нормальной активности FVIII. Более того, в некоторых вариантах осуществления активность циркулирующего FVIII возрастает у человека с небольшими неблагоприятными явлениями в отношении функции печени или других биомаркеров, как описано в настоящем описании, или их отсутствием. При вводимых концентрациях вектора 1×10¹³ вг/кг или выше, частоты эпизодов кровотечения через 3 недели (или более 3 недель) после введения снижались до нуля для большинства пациентов, что указывает на то, что концентрации 1×10¹³ вг/кг или выше (например, от 1×10¹³ вг/кг до 1×10¹⁴ вг/кг, например 2-4×10¹³ вг/кг) обеспечивали высокоэффективное лечение. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления пациентам, которым вводят вектор в этих концентрациях, не требуется дополнительных инфузий FVIII, или по меньшей мере они не требуются в течение 3, 6, 9 или 12 месяцев после введения вектора.

[0036] Изобретение относится к векторам на основе аденоассоциированного вируса (AAV), которые кодируют FVIII. Иллюстративные векторы на основе AAV имеют серотип AAV6 и содержат инвертированные концевые (ITR) последовательности, фланкирующие экспрессирующую кассету, содержащие специфический для печени энхансер и промотор, функционально связанный с интроном и полинуклеотидом, кодирующим FVIII. Иллюстративным FVIII является SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления последовательности ITR представляют собой ITR AAV2, и, таким образом, вектор может быть обозначен как вектор "AAV2/6". Для геномной последовательности серотипов AAV и обсуждения геномного сходства см., например, номер доступа GenBank № AF028704.1; номер доступа GenBank № J01901,1; Chiorini et al., J. Vir. 71: 6823-33(1997); Srivastava et al., J. Vir. 45:555-64 (1983); Chiorini et al., J. Vir. 73: 1309-1319 (1999); Rutledge et al., J. Vir. 72:309-319 (1998); и Wu et al., J. Vir. 74: 8635-47 (2000). Иллюстративные последовательности ITR AAV2 представляют собой:

5’-ITR AAV2: CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT (SEQ ID NO: 12).

3’-ITR AAV2: AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (SEQ ID NO: 13).

[0037] Иллюстративные специфические для печени энхансеры включают, например, энхансеры серпина 1 дикого типа или мутантные энхансеры серпина 1, и иллюстративным промотором является минимальный промотор транстиретина (TTRm). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления вектор на основе AAV представляет собой вектор на основе AAV2/6, содержащий последовательности ITR AAV2, фланкирующие энхансер серпина 1 дикого типа или мутантный энхансер серпина 1, связанный с промотором TTRm, функционально связанным с полинуклеотидом, кодирующим FVIII (например, SEQ ID NO: 1). Иллюстративные последовательности векторов описаны, например, в WO 2017/074526.

[0038] В SEQ ID NO: 1 представлена аминокислотная последовательность FVIII человека с сигнальным пептидом:

MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY.

[0039] Часть в виде сигнального пептида в SEQ ID NO: 1 представляет собой MQIELSTCFFLCLLRFCFS (SEQ ID NO: 14), который отщепляется, когда белок секретируется.

[0040] Например, иллюстративный энхансер серпина 1 представляет собой GGGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGATCACCCCAGTTACCGGAGGAGCAAACAGGGACTAAGTTCACACGCGTGGTACC (SEQ ID NO: 2).

[0041] Иллюстративный промотор TTRm представляет собой GTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCTAGGCAAGGTTCATATTTGTGTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTG (SEQ ID NO: 3).

[0042] Иллюстративная кодирующая последовательность для FVIII представляет собой:

ATGCAGATCGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTGTTGAGATTCTGCTTCAGCGCCACCAGGAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAGCTGAGCTGGGACTACATGCAGTCTGACCTGGGGGAGCTGCCTGTGGATGCCAGGTTCCCCCCCAGAGTGCCCAAGAGCTTCCCCTTCAACACCTCTGTGGTGTACAAGAAGACCCTGTTTGTGGAGTTCACTGACCACCTGTTCAACATTGCCAAGCCCAGGCCCCCCTGGATGGGCCTGCTGGGCCCCACCATCCAGGCTGAGGTGTATGACACTGTGGTGATCACCCTGAAGAACATGGCCAGCCACCCTGTGAGCCTGCATGCTGTGGGGGTGAGCTACTGGAAGGCCTCTGAGGGGGCTGAGTATGATGACCAGACCAGCCAGAGGGAGAAGGAGGATGACAAGGTGTTCCCTGGGGGCAGCCACACCTATGTGTGGCAGGTGCTGAAGGAGAATGGCCCCATGGCCTCTGACCCCCTGTGCCTGACCTACAGCTACCTGAGCCATGTGGACCTGGTGAAGGACCTGAACTCTGGCCTGATTGGGGCCCTGCTGGTGTGCAGGGAGGGCAGCCTGGCCAAGGAGAAGACCCAGACCCTGCACAAGTTCATCCTGCTGTTTGCTGTGTTTGATGAGGGCAAGAGCTGGCACTCTGAAACCAAGAACAGCCTGATGCAGGACAGGGATGCTGCCTCTGCCAGGGCCTGGCCCAAGATGCACACTGTGAATGGCTATGTGAACAGGAGCCTGCCTGGCCTGATTGGCTGCCACAGGAAGTCTGTGTACTGGCATGTGATTGGCATGGGCACCACCCCTGAGGTGCACAGCATCTTCCTGGAGGGCCACACCTTCCTGGTCAGGAACCACAGGCAGGCCAGCCTGGAGATCAGCCCCATCACCTTCCTGACTGCCCAGACCCTGCTGATGGACCTGGGCCAGTTCCTGCTGTTCTGCCACATCAGCAGCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTATGTGAAGGTGGACAGCTGCCCTGAGGAGCCCCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAGGCTGAGGACTATGATGATGACCTGACTGACTCTGAGATGGATGTGGTGAGGTTTGATGATGACAACAGCCCCAGCTTCATCCAGATCAGGTCTGTGGCCAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTACATTGCTGCTGAGGAGGAGGACTGGGACTATGCCCCCCTGGTGCTGGCCCCTGATGACAGGAGCTACAAGAGCCAGTACCTGAACAATGGCCCCCAGAGGATTGGCAGGAAGTACAAGAAGGTCAGGTTCATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGACCAGGGAGGCCATCCAGCATGAGTCTGGCATCCTGGGCCCCCTGCTGTATGGGGAGGTGGGGGACACCCTGCTGATCATCTTCAAGAACCAGGCCAGCAGGCCCTACAACATCTACCCCCATGGCATCACTGATGTGAGGCCCCTGTACAGCAGGAGGCTGCCCAAGGGGGTGAAGCACCTGAAGGACTTCCCCATCCTGCCTGGGGAGATCTTCAAGTACAAGTGGACTGTGACTGTGGAGGATGGCCCCACCAAGTCTGACCCCAGGTGCCTGACCAGATACTACAGCAGCTTTGTGAACATGGAGAGGGACCTGGCCTCTGGCCTGATTGGCCCCCTGCTGATCTGCTACAAGGAGTCTGTGGACCAGAGGGGCAACCAGATCATGTCTGACAAGAGGAATGTGATCCTGTTCTCTGTGTTTGATGAGAACAGGAGCTGGTACCTGACTGAGAACATCCAGAGGTTCCTGCCCAACCCTGCTGGGGTGCAGCTGGAGGACCCTGAGTTCCAGGCCAGCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTGTTTGACAGCCTGCAGCTGTCTGTGTGCCTGCATGAGGTGGCCTACTGGTACATCCTGAGCATTGGGGCCCAGACTGACTTCCTGTCTGTGTTCTTCTCTGGCTACACCTTCAAGCACAAGATGGTGTATGAGGACACCCTGACCCTGTTCCCCTTCTCTGGGGAGACTGTGTTCATGAGCATGGAGAACCCTGGCCTGTGGATTCTGGGCTGCCACAACTCTGACTTCAGGAACAGGGGCATGACTGCCCTGCTGAAAGTCTCCAGCTGTGACAAGAACACTGGGGACTACTATGAGGACAGCTATGAGGACATCTCTGCCTACCTGCTGAGCAAGAACAATGCCATTGAGCCCAGGAGCTTCAGCCAGAATCCACCCGTCCTTAAGCGCCATCAGCGCGAGATCACCAGGACCACCCTGCAGTCTGACCAGGAGGAGATTGACTATGATGACACCATCTCTGTGGAGATGAAGAAGGAGGACTTTGACATCTACGACGAGGACGAGAACCAGAGCCCCAGGAGCTTCCAGAAGAAGACCAGGCACTACTTCATTGCTGCTGTGGAGAGGCTGTGGGACTATGGCATGAGCAGCAGCCCCCATGTGCTGAGGAACAGGGCCCAGTCTGGCTCTGTGCCCCAGTTCAAGAAGGTGGTGTTCCAGGAGTTCACTGATGGCAGCTTCACCCAGCCCCTGTACAGAGGGGAGCTGAATGAGCACCTGGGCCTGCTGGGCCCCTACATCAGGGCTGAGGTGGAGGACAACATCATGGTGACCTTCAGGAACCAGGCCAGCAGGCCCTACAGCTTCTACAGCAGCCTGATCAGCTATGAGGAGGACCAGAGGCAGGGGGCTGAGCCCAGGAAGAACTTTGTGAAGCCCAATGAAACCAAGACCTACTTCTGGAAGGTGCAGCACCACATGGCCCCCACCAAGGATGAGTTTGACTGCAAGGCCTGGGCCTACTTCTCTGATGTGGACCTGGAGAAGGATGTGCACTCTGGCCTGATTGGCCCCCTGCTGGTGTGCCACACCAACACCCTGAACCCTGCCCATGGCAGGCAGGTGACTGTGCAGGAGTTTGCCCTGTTCTTCACCATCTTTGATGAAACCAAGAGCTGGTACTTCACTGAGAACATGGAGAGGAACTGCAGGGCCCCCTGCAACATCCAGATGGAGGACCCCACCTTCAAGGAGAACTACAGGTTCCATGCCATCAATGGCTACATCATGGACACCCTGCCTGGCCTGGTGATGGCCCAGGACCAGAGGATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGCAGCAATGAGAACATCCACAGCATCCACTTCTCTGGCCATGTGTTCACTGTGAGGAAGAAGGAGGAGTACAAGATGGCCCTGTACAACCTGTACCCTGGGGTGTTTGAGACTGTGGAGATGCTGCCCAGCAAGGCTGGCATCTGGAGGGTGGAGTGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCTGGCATGAGCACCCTGTTCCTGGTGTACAGCAACAAGTGCCAGACCCCCCTGGGCATGGCCTCTGGCCACATCAGGGACTTCCAGATCACTGCCTCTGGCCAGTATGGCCAGTGGGCCCCCAAGCTGGCCAGGCTGCACTACTCTGGCAGCATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTCAGCTGGATCAAGGTGGACCTGCTGGCCCCCATGATCATCCATGGCATCAAGACCCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCAGCAGCCTGTACATCAGCCAGTTCATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAGTGGCAGACCTACAGGGGCAACAGCACTGGCACCCTGATGGTGTTCTTTGGCAATGTGGACAGCTCTGGCATCAAGCACAACATCTTCAACCCCCCCATCATTGCCAGATACATCAGGCTGCACCCCACCCACTACAGCATCAGGAGCACCCTGAGGATGGAGCTGATGGGCTGTGACCTGAACAGCTGCAGCATGCCCCTGGGCATGGAGAGCAAGGCCATCTCTGATGCCCAGATCACTGCCAGCAGCTACTTCACCAACATGTTTGCCACCTGGAGCCCCAGCAAGGCCAGGCTGCATCTGCAGGGCAGGAGCAATGCCTGGAGGCCCCAGGTCAACAACCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTGGACTTCCAGAAGACCATGAAGGTGACTGGGGTGACCACCCAGGGGGTGAAGAGCCTGCTGACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTGATCAGCAGCAGCCAGGATGGCCACCAGTGGACCCTGTTCTTCCAGAATGGCAAGGTGAAGGTGTTCCAGGGCAACCAGGACAGCTTCACCCCTGTGGTGAACAGCCTGGACCCCCCCCTGCTGACCAGATACCTGAGGATTCACCCCCAGAGCTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTGCTGGGCTGTGAGGCCCAGGACCTGTACTGA (SEQ ID NO: 4).

[0043] Иллюстративная последовательность для экспрессирующей кассеты, фланкированной последовательностями инвертированных концевых повторов, представляет собой:

GCGGCCTAAGCTTGGAACCATTGCCACCTTCAGGGGGAGGCTGCTGGTGA - 50

ATATTAACCAAGATCACCCCAGTTACCGGAGGAGCAAACAGGGACTAAGT - 100

TCACACGCGTGGTACCGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCG - 150

ATACTCTAATCTCCCTAGGCAAGGTTCATATTTGTGTAGGTTACTTATTC - 200

TCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGC - 250

TTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCT - 300

TCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGAAGAGGTAAGG - 350

GTTTAAGTTATCGTTAGTTCGTGCACCATTAATGTTTAATTACCTGGAGC - 400

ACCTGCCTGAAATCATTTTTTTTTCAGGTTGGCTAGTATGCAGATCGAGC - 450

TCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTGTTGAGATTCTGCTTCAGCGCCACC - 500

AGGAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAGCTGAGCTGGGACTACATGCAGTC - 550

TGACCTGGGGGAGCTGCCTGTGGATGCCAGGTTCCCCCCCAGAGTGCCCA - 600

AGAGCTTCCCCTTCAACACCTCTGTGGTGTACAAGAAGACCCTGTTTGTG - 650

GAGTTCACTGACCACCTGTTCAACATTGCCAAGCCCAGGCCCCCCTGGAT - 700

GGGCCTGCTGGGCCCCACCATCCAGGCTGAGGTGTATGACACTGTGGTGA - 750

TCACCCTGAAGAACATGGCCAGCCACCCTGTGAGCCTGCATGCTGTGGGG - 800

GTGAGCTACTGGAAGGCCTCTGAGGGGGCTGAGTATGATGACCAGACCAG - 850

CCAGAGGGAGAAGGAGGATGACAAGGTGTTCCCTGGGGGCAGCCACACCT - 900

ATGTGTGGCAGGTGCTGAAGGAGAATGGCCCCATGGCCTCTGACCCCCTG - 950

TGCCTGACCTACAGCTACCTGAGCCATGTGGACCTGGTGAAGGACCTGAA - 1000

CTCTGGCCTGATTGGGGCCCTGCTGGTGTGCAGGGAGGGCAGCCTGGCCA - 1050

AGGAGAAGACCCAGACCCTGCACAAGTTCATCCTGCTGTTTGCTGTGTTT - 1100

GATGAGGGCAAGAGCTGGCACTCTGAAACCAAGAACAGCCTGATGCAGGA - 1150

CAGGGATGCTGCCTCTGCCAGGGCCTGGCCCAAGATGCACACTGTGAATG - 1200

GCTATGTGAACAGGAGCCTGCCTGGCCTGATTGGCTGCCACAGGAAGTCT - 1250

GTGTACTGGCATGTGATTGGCATGGGCACCACCCCTGAGGTGCACAGCAT - 1300

CTTCCTGGAGGGCCACACCTTCCTGGTCAGGAACCACAGGCAGGCCAGCC - 1350

TGGAGATCAGCCCCATCACCTTCCTGACTGCCCAGACCCTGCTGATGGAC - 1400

CTGGGCCAGTTCCTGCTGTTCTGCCACATCAGCAGCCACCAGCATGATGG - 1450

CATGGAGGCCTATGTGAAGGTGGACAGCTGCCCTGAGGAGCCCCAGCTGA - 1500

GGATGAAGAACAATGAGGAGGCTGAGGACTATGATGATGACCTGACTGAC - 1550

TCTGAGATGGATGTGGTGAGGTTTGATGATGACAACAGCCCCAGCTTCAT - 1600

CCAGATCAGGTCTGTGGCCAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTACA - 1650

TTGCTGCTGAGGAGGAGGACTGGGACTATGCCCCCCTGGTGCTGGCCCCT - 1700

GATGACAGGAGCTACAAGAGCCAGTACCTGAACAATGGCCCCCAGAGGAT - 1750

TGGCAGGAAGTACAAGAAGGTCAGGTTCATGGCCTACACTGATGAAACCT - 1800

TCAAGACCAGGGAGGCCATCCAGCATGAGTCTGGCATCCTGGGCCCCCTG - 1850

CTGTATGGGGAGGTGGGGGACACCCTGCTGATCATCTTCAAGAACCAGGC - 1900

CAGCAGGCCCTACAACATCTACCCCCATGGCATCACTGATGTGAGGCCCC - 1950

TGTACAGCAGGAGGCTGCCCAAGGGGGTGAAGCACCTGAAGGACTTCCCC - 2000

ATCCTGCCTGGGGAGATCTTCAAGTACAAGTGGACTGTGACTGTGGAGGA - 2050

TGGCCCCACCAAGTCTGACCCCAGGTGCCTGACCAGATACTACAGCAGCT - 2100

TTGTGAACATGGAGAGGGACCTGGCCTCTGGCCTGATTGGCCCCCTGCTG - 2150

ATCTGCTACAAGGAGTCTGTGGACCAGAGGGGCAACCAGATCATGTCTGA - 2200

CAAGAGGAATGTGATCCTGTTCTCTGTGTTTGATGAGAACAGGAGCTGGT - 2250

ACCTGACTGAGAACATCCAGAGGTTCCTGCCCAACCCTGCTGGGGTGCAG - 2300

CTGGAGGACCCTGAGTTCCAGGCCAGCAACATCATGCACAGCATCAATGG - 2350

CTATGTGTTTGACAGCCTGCAGCTGTCTGTGTGCCTGCATGAGGTGGCCT - 2400

ACTGGTACATCCTGAGCATTGGGGCCCAGACTGACTTCCTGTCTGTGTTC - 2450

TTCTCTGGCTACACCTTCAAGCACAAGATGGTGTATGAGGACACCCTGAC - 2500

CCTGTTCCCCTTCTCTGGGGAGACTGTGTTCATGAGCATGGAGAACCCTG - 2550

GCCTGTGGATTCTGGGCTGCCACAACTCTGACTTCAGGAACAGGGGCATG - 2600

ACTGCCCTGCTGAAAGTCTCCAGCTGTGACAAGAACACTGGGGACTACTA - 2650

TGAGGACAGCTATGAGGACATCTCTGCCTACCTGCTGAGCAAGAACAATG - 2700

CCATTGAGCCCAGGAGCTTCAGCCAGAATCCACCCGTCCTTAAGCGCCAT - 2750

CAGCGCGAGATCACCAGGACCACCCTGCAGTCTGACCAGGAGGAGATTGA - 2800

CTATGATGACACCATCTCTGTGGAGATGAAGAAGGAGGACTTTGACATCT - 2850

ACGACGAGGACGAGAACCAGAGCCCCAGGAGCTTCCAGAAGAAGACCAGG - 2900

CACTACTTCATTGCTGCTGTGGAGAGGCTGTGGGACTATGGCATGAGCAG - 2950

CAGCCCCCATGTGCTGAGGAACAGGGCCCAGTCTGGCTCTGTGCCCCAGT - 3000

TCAAGAAGGTGGTGTTCCAGGAGTTCACTGATGGCAGCTTCACCCAGCCC - 3050

CTGTACAGAGGGGAGCTGAATGAGCACCTGGGCCTGCTGGGCCCCTACAT - 3100

CAGGGCTGAGGTGGAGGACAACATCATGGTGACCTTCAGGAACCAGGCCA - 3150

GCAGGCCCTACAGCTTCTACAGCAGCCTGATCAGCTATGAGGAGGACCAG - 3200

AGGCAGGGGGCTGAGCCCAGGAAGAACTTTGTGAAGCCCAATGAAACCAA - 3250

GACCTACTTCTGGAAGGTGCAGCACCACATGGCCCCCACCAAGGATGAGT - 3300

TTGACTGCAAGGCCTGGGCCTACTTCTCTGATGTGGACCTGGAGAAGGAT - 3350

GTGCACTCTGGCCTGATTGGCCCCCTGCTGGTGTGCCACACCAACACCCT - 3400

GAACCCTGCCCATGGCAGGCAGGTGACTGTGCAGGAGTTTGCCCTGTTCT - 3450

TCACCATCTTTGATGAAACCAAGAGCTGGTACTTCACTGAGAACATGGAG - 3500

AGGAACTGCAGGGCCCCCTGCAACATCCAGATGGAGGACCCCACCTTCAA - 3550

GGAGAACTACAGGTTCCATGCCATCAATGGCTACATCATGGACACCCTGC - 3600

CTGGCCTGGTGATGGCCCAGGACCAGAGGATCAGGTGGTACCTGCTGAGC - 3650

ATGGGCAGCAATGAGAACATCCACAGCATCCACTTCTCTGGCCATGTGTT - 3700

CACTGTGAGGAAGAAGGAGGAGTACAAGATGGCCCTGTACAACCTGTACC - 3750

CTGGGGTGTTTGAGACTGTGGAGATGCTGCCCAGCAAGGCTGGCATCTGG - 3800

AGGGTGGAGTGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCTGGCATGAGCACCCT - 3850

GTTCCTGGTGTACAGCAACAAGTGCCAGACCCCCCTGGGCATGGCCTCTG - 3900

GCCACATCAGGGACTTCCAGATCACTGCCTCTGGCCAGTATGGCCAGTGG - 3950

GCCCCCAAGCTGGCCAGGCTGCACTACTCTGGCAGCATCAATGCCTGGAG - 4000

CACCAAGGAGCCCTTCAGCTGGATCAAGGTGGACCTGCTGGCCCCCATGA - 4050

TCATCCATGGCATCAAGACCCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCAGCAGCCTG - 4100

TACATCAGCCAGTTCATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAGTGGCA - 4150

GACCTACAGGGGCAACAGCACTGGCACCCTGATGGTGTTCTTTGGCAATG - 4200

TGGACAGCTCTGGCATCAAGCACAACATCTTCAACCCCCCCATCATTGCC - 4250

AGATACATCAGGCTGCACCCCACCCACTACAGCATCAGGAGCACCCTGAG - 4300

GATGGAGCTGATGGGCTGTGACCTGAACAGCTGCAGCATGCCCCTGGGCA - 4350

TGGAGAGCAAGGCCATCTCTGATGCCCAGATCACTGCCAGCAGCTACTTC - 4400

ACCAACATGTTTGCCACCTGGAGCCCCAGCAAGGCCAGGCTGCATCTGCA - 4450

GGGCAGGAGCAATGCCTGGAGGCCCCAGGTCAACAACCCCAAGGAGTGGC - 4500

TGCAGGTGGACTTCCAGAAGACCATGAAGGTGACTGGGGTGACCACCCAG - 4550

GGGGTGAAGAGCCTGCTGACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTGATCAG - 4600

CAGCAGCCAGGATGGCCACCAGTGGACCCTGTTCTTCCAGAATGGCAAGG - 4650

TGAAGGTGTTCCAGGGCAACCAGGACAGCTTCACCCCTGTGGTGAACAGC - 4700

CTGGACCCCCCCCTGCTGACCAGATACCTGAGGATTCACCCCCAGAGCTG - 4750

GGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTGCTGGGCTGTGAGGCCCAGG - 4800

ACCTGTACTGAGGATCCAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGT - 4850

GTTGGTTTTTTGTGTGTTTTCCTGTAACGATCGGGCTCGAGCGC

(SEQ ID NO: 5). SEQ ID NO: 5 содержит (от 5’ к 3’) последовательность инсулятора(спейсера) Ins1 (nt 14-32 of SEQ ID NO: 5), энхансер серпина 1 CRMSBS2 (нт 33-104 SEQ ID NO: 5), минимальный промотор транстиретина TTRm (нт 117-339 SEQ ID NO: 5), интрон 3 SBR (нт 340-432 SEQ ID NO: 5), кодирующую FVIII последовательность hF8 BDD (438-4811 SEQ ID NO: 5), синтетическую последовательность поли-A SPA51 (нт 4818-4868 SEQ ID NO: 5) и последовательность инсулятора Ins3 (нт 4869-4885 SEQ ID NO: 5), как описано в публикации PCT № WO 2017/074526.

[0044] Конструирование рекомбинантных векторов AAV описано в ряде публикаций, включая патент США № 5173414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); и Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989). Отличительными признаками этой векторной системы являются эффективный перенос генов и стабильная доставка трансгенов вследствие интеграции в геномы трансдуцированных клеток. См., например, Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996).

[0045] Эффективное количество вектора на основе AAV, подлежащее введению, может варьировать от пациента к пациенту. В некоторых вариантах осуществления эффективные количества определяются врачом, вводящим композиции (векторы на основе AAV). Анализ уровней в сыворотке, плазме или других тканях терапевтического полипептида и сравнение с первоначальным уровнем перед введением может позволять определение того, является ли вводимое количество слишком низким, входящим в правильный диапазон или слишком высоким. Подходящие режимы для первоначального и последующего введения также варьируются, однако иллюстрируются первоначальным введением, после которого необязательно при необходимости следуют последующие введения. Последующие введения можно проводить с различными интервалами в диапазоне от раза в сутки до раза в год и до раза в несколько лет. В некоторых вариантах осуществления могут быть рекомендованы подходящие способы иммуносупрессии, чтобы избежать ингибирования или блокады трансдукции векторов для доставки посредством иммуносупрессии. См., например, Vilquin et al., (1995) Human Gene Ther., 6:1391-1401.

[0046] Введение можно проводить любыми способами. Могут быть рассмотрены способы как in vivo, так и ex vivo. В некоторых вариантах осуществления способом введения является внутривенная инъекция (например, но не ограничиваясь этим, через портальную вену). В некоторых вариантах осуществления введение проводят посредством стандартного внутривенного введения. Другие способы введения in vivo включают, например, прямую инъекцию в доли печени или желчный проток и внутривенную инъекцию дистальнее печени, в том числе через печеночную артерию, прямую инъекцию в паренхиму печени, инъекцию через печеночную артерию и/или ретроградную инъекцию через желчные протоки. Способы введения ex vivo включают трансдукцию in vitro резектированных гепатоцитов или других клеток печени с последующей инфузией трансдуцированных резектированных гепатоцитов обратно в портальные сосуды, паренхиму печени или желчные протоки пациента-человека, см., например, Grossman et al., (1994) Nature Genetics, 6:335-341.

[0047] Иллюстративные внутривенные дозы вектора на основе AAV, как описано в настоящем описании, в некоторых вариантах осуществления могут составлять от 6×10¹¹ до 1×10¹³ или 3×10¹³, или от 1×10¹³ до 1×10¹⁴, или от 1×10¹³ до 5×10¹³, или от 2×10¹³ до 4×10¹³ вг/кг, например, от 1×10¹² или 2×10¹² до 3×10¹³, вирусных генов/килограмм (вг/кг) реципиента-человека. В некоторых вариантах осуществления дозировка составляет от 1×10¹¹ до 1×10¹² вг/кг. В некоторых вариантах осуществления дозировка составляет от 1×10¹² до 1×10¹³ вг/кг или 3×10¹³. В некоторых вариантах осуществления дозировка составляет от 2×10¹² до 3×10¹³. В некоторых вариантах осуществления дозировка составляет от 5×10¹² до 5×10¹³ вг/кг. Как отмечалось выше, в некоторых вариантах осуществления вектор на основе AAV предоставляют реципиенту в качестве однократной дозы. В некоторых вариантах осуществления дозировка составляет 6×10¹¹, 9×10¹¹, 1,2×10¹², 2×10¹², 4×10¹², 6×10¹², 1×10¹³, 3×10¹³, 4×10¹³ или 5×10¹³ вг/кг. В некоторых вариантах осуществления пациенту вводят однократную дозу вектора на основе AAV.

[0048] В качестве части введенного состава может быть включен фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемые носители определяются отчасти конкретной вводимой композицией, а также конкретным способом, используемым для введения композиции. Таким образом, существует широкое множество доступных подходящих составов фармацевтических композиций, как описано ниже (см., например, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989).

[0049] Составы для введения как ex vivo, так и in vivo, могут включать суспензии (например, генетически модифицированных клеток, липосом или наночастиц) в жидких или эмульгированных жидкостях. Активные ингредиенты можно смешивать с эксципиентами, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. Подходящие эксципиенты включают, например, воду, солевой раствор, декстрозу, глицерин, этанол и т.п., и их комбинации. Кроме того, композиция может содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие вещества или эмульгаторы, pH-буферные средства, стабилизаторы или другие реагенты, которые повышают эффективность фармацевтической композиции.

[0050] Индивидуумом, которому вводят описанный вектор на основе AAV, может являться любой человек. Иллюстративные реципиенты включают, например, индивидуумов, имеющих гемофилию (например, гемофилию A). В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество с точки зрения лечения гемофилии A или для применения в способе уменьшения времени кровотечения в ходе эпизода кровотечения у индивидуума, страдающего от гемофилии A, относится к количеству, способному вызывать один или более из следующих эффектов: (1) снижение, ингибирование или предупреждение до некоторой степени одного или более физиологических симптомов гемофилии A, включая, например, кровоизлияние, боль или опухание суставов, длительную головную боль, рвоту или усталость, (2) повышение способности к свертыванию крови, (3) уменьшение общего времени кровотечения в ходе эпизода кровотечения, (4) возникновение в результате введения поддающегося измерению увеличения концентрации или активности функционального белка FVIII в плазме индивидуума, и/или (5) облегчение до некоторой степени одного или более симптомов, ассоциированных с нарушением.

[0051] В некоторых вариантах осуществления концентрация FVIII в крови, которая превышает 1% от концентрации фактора, обнаруживаемой у нормального индивидуума, является результатом введения вектора на основе AAV, как описано в настоящем описании, тем самым изменяя тяжелый фенотип заболевания на умеренный. Тяжелый фенотип характеризуется повреждением суставов и угрожающими жизни кровотечениями. В некоторых вариантах осуществления введение вектора на основе AAV, как описано в настоящем описании, приводит к концентрации FVIII в крови по меньшей мере 5% от нормы. В некоторых вариантах осуществления для конвертирования умеренного фенотипа заболевания в мягкий необходима концентрация FVIII в крови более 5% от нормы. Уровни FVIII у нормальных людей составляют приблизительно 1,14±0,48 нМ в плазме, например, в соответствии с одностадийным анализом свертывания - активированным частичным тромбопластиновым временем (aPTT) (см., например, Butenas, et al., Thromb Res. (2010 Aug); 126(2): 119-123). Таким образом, терапевтического эффекта можно достигать посредством экспрессии FVIII, так чтобы общее количество FVIII у индивидуума/человека превышало 1% от FVIII, присутствующего у нормальных индивидуумов/людей, например, 1% от 1,14±0,48 нМ.

[0052] В некоторых вариантах осуществления перед введением человек имеет 1%, 2%, 3%, 4% или 5% от нормальной активности циркулирующего FVIII у человека и в пределах 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48 или 52 недель после введения человек имеет по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4% или 5%, соответственно, от нормальной активности циркулирующего FVIII человека. В некоторых вариантах осуществления введение вектора на основе AAV, как описано в настоящем описании, приводит к повышению активности функционального белка FVIII в плазме реципиента-человека, составляющему по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более МЕ/дл, по сравнению с величиной активности функционального белка FVIII, присутствующего в плазме индивидуума, перед (например, в пределах 14 суток до введения) введением. В некоторых вариантах осуществления введение вектора на основе AAV, как описано в настоящем описании, приводит к проявлению активности циркулирующего FVIII в плазме индивидуума по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более МЕ/дл. В этом отношении, термин "МЕ" или "международная единица" в отношении активности FVIII является широко понятным термином, где 1 МЕ активности FVIII эквивалентна количеству FVIII в одном мл нормальной плазмы человека. В некоторых вариантах осуществления нормальная активность FVIII человека составляет 0,500-1,500 МЕ/мл плазмы. Всемирная организация здравоохранения описывает уровни тяжести гемофилии следующим образом:

Уровень	Процент от нормальной активности фактора в крови	Количество международных (IU) на миллилитр (мл) цельной крови
Нормальный диапазон	50%-150%	0,50-1,5 МЕ
Мягкая гемофилия	5%-40%	0,05-0,40 МЕ
Умеренная гемофилия	1%-5%	0,01-0,05 МЕ
Тяжелая гемофилия	менее 1%	Менее 0,01 МЕ

[0053] Активность FVIII в плазме можно количественно определять рядом хорошо известных и общепризнанных способов, включая, например, способ активированного частичного тромбопластинового времени (APPT) (см., например, Miletich JP: Activated partial thromboplastin time. In Williams Hematology. Fifth edition. Edited by E Beutler, MA Lichtman, BA Coller, TJ Kipps. New York, McGraw-Hill, 1995, pp L85-86, Greaves and Preston, Approach to the bleeding patient. In Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice. Fourth edition. Edited by RW Colman, J Hirsh, VJ Marder, et al. Philadelphia, JB Lippincott Co, 2001, pp 1197-1234 and Olson et al, Arch. Pathol. Lab. Med. 122:782-798 (1998)) или хромогенного анализа FXa (Harris et al., Thromb. Res. 128(6): 125-129 (2011)).

[0054] В других вариантах осуществления время кровотечения у индивидуума можно измерять хорошо известными и общепризнанными способами, включая, например, способ Ivy (см., например, Ivy et al., Surg. Gynec. Obstet. 60:781 (1935) и Ivy et al., J. Lab. Clin. Med. 26: 1812 (1941)) или способ Duke (см., например, Duke et al., JAMA 55: 1185 (1910)). "Эпизод кровотечения" у индивидуума относится к повреждению, которое приводит к кровотечению у индивидуума, либо наружному, либо внутреннему, и, как правило, включает период времени от повреждения до образования сгустка крови. В некоторых вариантах осуществления частота эпизодов кровотечения уменьшается у индивидуума после введения векторов на основе AAV, описанных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления частота эпизодов кровотечения снижается на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% после введения.

[0055] В некоторых вариантах осуществления концентрацию белка FVIII в крови человека измеряют до, после или и до, и после введения. Можно использовать прямые или непрямые способы анализа для измерения концентрации FVIII в крови. Иллюстративные непрямые способы включают, например, способы, описанные в Over, J. (1986) Scand. J. Haematol. 33 (Suool. 41), 13-24; Kemball-Cook, G., et al. (1993) Brit. J. Haematol. 84, 273-278. Способы прямой детекции включают способы, описанные, например, в патенте США № 8715951. В некоторых вариантах осуществления концентрацию FVIII в крови определяют в пределах двух недель до введения вектора на основе AAV для наилучшего определения эффекта после введения.

[0056] В некоторых вариантах осуществления введение и лечение векторами на основе AAV, описанными в настоящем описании, вызывает сокращение потребности в лечении заместительным белком фактора VIII у индивидуума. Это можно измерять, отмечая необходимую частоту введения до введения векторов на основе AAV, описанных в настоящем описании, а затем отмечая необходимую частоту введения после введения. В некоторых вариантах осуществления уменьшение необходимости в лечении составляет снижение на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% после введения.

[0057] В некоторых вариантах осуществления введение и лечение векторами на основе AAV, описанными в настоящем описании, вызывают небольшой вред для печени или не вызывают его. Состояние печени можно определять, например, путем измерения одного или более маркеров в крови индивидуумов. Иллюстративные маркеры, указывающие на здоровье печени, включают, но не ограничиваются ими, аланинаминотрансферазу (ALT) или аспартатаминотрансферазу (AST)), билирубин, щелочную фосфатазу и альбумин. В некоторых вариантах осуществления человек демонстрирует не более чем в 1,0, 1,2, 1,5, 1,7 или 2,0 раза выше верхнего предела нормы (ULN) по меньшей мере одного из аланинаминотрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST), билирубина, щелочной фосфатазы или альбумина в течение 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48 или 52 недель после введения. ULN, как правило, может быть определен в популяции. См., например, Neuschwander-Tetri, B., et al., Arch Intern Med. 2004 Mar 24; 168(6): 663-666 для обсуждения ALT. В некоторых вариантах осуществления ULN для ALT составляет 44 Е/л. В некоторых вариантах осуществления ULN для AST составляет 39 Е/л. В некоторых вариантах осуществления ULN для билирубина составляет 0,1-1,0 мг/дл для общего билирубина 0,2-0,7 мг/дл для связанного билирубина и 0,1-0,4 мг/дл для свободного билирубина. См., например, Lisa B, VanWagner (2015). Journal of American Medical Association (JAMA) 313 (5): 516-517. В некоторых вариантах осуществления ULN для щелочной фосфатазы составляет 129 или 133 Е/л. См., например, Gowda, et al., Pan Afr Med J. (2009) 3:17. В некоторых вариантах осуществления нормальный диапазон для альбумина составляет 35-55 г/литр (Burtis and Ashwood (1999) Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3^rd edition. Saunders Editor).

[0058] В некоторых вариантах осуществления введение и лечение векторами на основе AAV, описанными в настоящем описании, не приводит к поддающимся обнаружению уровням ингибитора FVIII, например, в любой один или более из моментов времени: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48 или 52 недель после введения. Ингибиторы FVIII определяют с использованием анализа Nijmegen-Bethesda (Duncan, et al., Methods Mol Biol. 2013;992:321-33 и Miller CH, et al. Am J Hematol. 90:871-876 (2015)). Предел детекции этого анализа составляет 0,6 BU) Любые результаты ниже 0,6 BU считается не поддающимся обнаружению.

[0059] В некоторых вариантах осуществления введение и лечение векторами на основе AAV, описанными в настоящем описании, не оказывает значительного влияния на экспрессию определенных биомаркеров и в идеальном случае приводит к улучшенным результатам для биомаркеров. Иллюстративные биомаркеры включают, например, фактор фон Виллебранда (vWF), растворимый рецептор эпидермального фактора роста (sEGFR), галектин-3-связывающий белок (GAL3BP), C-реактивный белок (CRP), IL-6, циркулирующий альфа-фетопротеин. В некоторых вариантах осуществления уровень одного или более из приведенных выше биомаркеров определяют в крови индивидуума до или после введения, или и до, и после введения. В некоторых вариантах осуществления уровень в крови одного или более биомаркеров при анализе в течение 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48 или 52 недель после введения не более чем в 1,0, 1,2, 1,5, 1,7 или 2,0 раз превышает уровень в течение двух недель до введения.

Основные положения

[0060] Для применения способов, а также получения и применения композиций, описанных в настоящем описании, используются, если нет иных указаний, общепринятые способы молекулярной биологии, биохимии, анализа структуры хроматина, вычислительной химии, клеточной культуры, рекомбинантных ДНК и сходных областей, которые входят в пределы способностей специалиста в данной области. Эти способы полностью объяснены в литературе. См., например, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 и периодические переиздания; серию METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; и METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

Определения

[0061] Термины "нуклеиновая кислота", "полинуклеотид" и "олигонуклеотид" используются взаимозаменяемо, и они относятся к дезоксирибонуклеотидному или рибонуклеотидному полимеру в линейной или кольцевой конформации, и либо в одноцепочечной, либо в двухцепочечной форме. Для целей раскрытия настоящего изобретения, эти термины не следует истолковывать как ограничивающие в отношении длины полимера. Эти термины могут охватывать известные аналоги природных нуклеотидов, а также нуклеотиды с модифицированными частями оснований, сахаров и/или фосфатов (например, фосфоротиоатная основная цепь). Как правило, аналог конкретного нуклеотида имеет ту же специфичность образования пар оснований; т.е. аналог A образует пару с T.

[0062] Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются взаимозаменяемо указания на полимер из аминокислотных остатков. Термин также относится к полимерам из аминокислот, в которых одна или более аминокислот являются химическими аналогами или модифицированными производными соответствующих встречающихся в природе аминокислот.

[0063] В любом из способов, описанных в настоящем описании, экзогенная нуклеотидная последовательность ("экспрессирующая конструкция", или "экспрессирующая кассета", или "вектор") может содержать последовательности, которые гомологичны, но не идентичны, геномным последовательностям в представляющей интерес области, тем самым стимулируя гомологичную рекомбинацию для вставки неидентичной последовательности в представляющую интерес область. Таким образом, в определенных вариантах осуществления части последовательности экспрессирующей кассеты, которые гомологичны последовательностям в представляющей интерес области, демонстрируют идентичность последовательности приблизительно от 80 до 99% (или любое целое число между ними) с геномной последовательностью, которую заменяют. В других вариантах осуществления гомология между экспрессирующей кассетой и геномной последовательностью превышает 99%, например, если только 1 нуклеотид отличается между областями гомологии экспрессирующей кассеты и геномными последовательностями из более чем 100 последовательных пер оснований. В определенных случаях негомологичная часть экспрессирующей кассеты может содержать последовательности, не присутствующие в представляющей интерес области, так что новые последовательности вводятся в представляющую интерес область. В этих случаях, негомологичная последовательность, как правило, фланкируется последовательностями из 50-1000 пар оснований (или любого целого числа в этом диапазоне) или любым количеством пар оснований, превышающим 1000, которые гомологичны или идентичны последовательностям в представляющей интерес области.

[0064] Термин "последовательность" относится к нуклеотидной последовательности любой длины, которая может представлять собой ДНК или РНК; может быть линейной, кольцевой или разветвленной, и может быть либо одноцепочечной, либо двухцепочечной. Термин "трансген" относится к нуклеотидной последовательности, которую встраивают в геном. Трансген может иметь любую длину, например, от 2 до 100000000 нуклеотидов в длину (или любое целое число между ними или выше), предпочтительно приблизительно от 100 до 100000 нуклеотидов в длину (или любое целое число между ними), более предпочтительно приблизительно от 2000 до 20000 нуклеотидов в длину (или любое целое число между ними) и еще более предпочтительно приблизительно от 5 до 15 т.п.н. (или любое целое число между ними).

[0065] "Хромосома" представляет собой комплекс хроматина, содержащий весь или часть генома клетки. Геном клетки часто характеризуется его кариотипом, который представляет собой совокупность всех хромосом, которые содержат геном клетки. Геном клетки может содержать одну или несколько хромосом.

[0066] "Эписома" представляет собой реплицирующуюся нуклеиновую кислоту, комплекс нуклеопротеинов или другую структуру, содержащую нуклеиновую кислоту, которая не является частью хромосомного кариотипа клетки. Примеры эписом включают плазмиды и определенные вирусные геномы. Специфические для печени конструкции, описанные в настоящем описании, могут поддерживаться эписомно или альтернативно могут стабильно интегрироваться в клетку.

[0067] "Экзогенная" молекула представляет собой молекулу, которая в норме не присутствует в клетке, но может быть введена в клетку посредством одного или более способов генетики, биохимии или других способов. "Нормальное присутствие в клетке" определяют в отношении конкретной стадии развития и условий окружения клетки. Таким образом, например, молекула, которая присутствует только в ходе эмбрионального развития мышцы, является экзогенной молекулой в отношении взрослой мышечной клетки. Аналогично, молекула, индуцированная тепловым шоком, представляет собой экзогенную молекулу в отношении клетки, не подвергнутой тепловому шоку. Экзогенная молекула может содержать, например, функционирующую версию эндогенной молекулы, функция которой нарушена, или версию с нарушенной функцией для нормально функционирующей эндогенной молекулы.

[0068] Экзогенная молекула может представлять собой, среди прочего, низкомолекулярное соединение, такое как соединение, которое получают способом комбинаторной химии, или макромолекулу, такую как белок, нуклеиновая кислота, углевод, липид, гликопротеин, липопротеин, полисахарид, любое модифицированное производное вышеуказанных молекул, или любой комплекс, содержащий одну или несколько из указанных выше молекул. Нуклеиновые кислоты включают ДНК и РНК, могут быть одноцепочечными или двухцепочечными; могут быть линейными, разветвленными или кольцевыми; и могут иметь любую длину. Нуклеиновые кислоты включают нуклеиновые кислоты, способные образовывать дуплексы, а также нуклеиновые кислоты, образующие триплекс. См., например, патенты США № 5176996 и 5422251. Белки включают, но не ограничиваются ими, ДНК-связывающие белки, факторы транскрипции, ремоделирующие хроматин факторы, метилированные ДНК-связывающие белки, полимеразы, метилазы, деметилазы, ацетилазы, деацетилазы, киназы, фосфатазы, лигазы, деубиквитиназы, интегразы, рекомбиназы, лигазы, топоизомеразы, гиразы и хеликазы.

[0069] Экзогенная молекула может представлять собой молекулу того же типа, что и эндогенная молекула, например, экзогенный белок или нуклеиновая кислота. Например, экзогенная нуклеиновая кислота может включать инфицирующий вирусный геном, плазмиду или эписому, введенные в клетку, или хромосому, которая в норме не присутствует в клетке. Способы введения экзогенных молекул в клетки известны специалистам в данной области и включают, но не ограничиваются ими, опосредуемый липидами перенос (т.е. липосомы, включающие нейтральные и катионные липиды), электропорацию, прямую инъекцию, слияние клеток, бомбардировку частицами, копреципитацию с фосфатом кальция, опосредуемый DEAE-декстраном перенос и опосредуемый вирусным вектором перенос. Экзогенная молекула также может представлять собой молекулу того же типа, что и эндогенная молекула, но происходящую из вида, отличного от вида, из которого происходит клетка. Например, последовательность нуклеиновой кислоты человека можно вводить в клеточную линию, изначально происходящую из мыши или хомячка. Способы введения экзогенных молекул в клетки растений известны специалистам в данной области и включают, но не ограничиваются ими, трансформацию протопластов, карбид кремния (например, WHISKERS™), опосредуемую Agrobacterium трансформацию, опосредуемый липидами перенос (т.е. липосомы, включая нейтральные и катионные липиды), электропорацию, прямую инъекцию, слияние клеток, бомбардировку частицами (например, с использованием "генной пушки"), копреципитацию с фосфатом кальция, опосредуемый DEAE-декстраном перенос и опосредуемый вирусным вектором перенос.

[0070] Напротив, "эндогенная" молекула представляет собой молекулу, которая в норме присутствует в конкретной клетке на конкретной стадии развития в конкретных условиях окружающей среды. Например, эндогенная нуклеиновая кислота может содержать хромосому, геном митохондрии, хлоропласт или другую органеллу, или встречающуюся в природе эписомальную нуклеиновую кислоту. Дополнительные эндогенные молекулы могут включать белки, например, факторы транскрипции и ферменты.

[0071] Как используют в рамках изобретения, термин "продукт экзогенной нуклеиновой кислоты" включает как полинуклеотидные, так и полипептидные продукты, например, продукты транскрипции (полинуклеотиды, такие как РНК) и продукты трансляции (полипептиды).

[0072] "Ген" для целей раскрытия настоящего изобретения включает область ДНК, кодирующую продукт гена (см. ниже), а также все области ДНК, которые регулируют продуцирование продукта гена, независимо от того, являются ли такие регуляторные последовательности соседними с кодирующими и/или транскрибируемыми последовательностями. Таким образом, ген включает, но не обязательно ограничивается ими, промоторные последовательности, терминаторы, последовательности регуляции трансляции, такие как участки связывания рибосом и участки внутренней посадки рибосом, энхансеры, сайленсеры, инсуляторы, пограничные элементы, ориджины репликации, связывающие матрикс участки и контролирующие области локуса.

[0073] "Экспрессия генов" относится к конвертированию информации, содержащейся в гене, в продукт гена. Продукт гена может представлять собой прямой продукт транскрипции гена (например, мРНК, тРНК, рРНК, антисмысловая РНК, рибозим, структурная РНК или любой другой тип РНК) или белок, продуцируемый посредством трансляции мРНК. Продукты генов также включают РНК, которые модифицированы, посредством таких процессов, как кэппирвоание, полиаденилирование, метилирование и редактирование, и белки, модифицированные посредством, например, метилирования, ацетилирования, фосфорилирования, убиквитинилирования, ADP-рибозилирования, миристилирования и гликозилирования.

[0074] "Модулирование" экспрессии гена относится к изменению активности гена. Модулирование экспрессии может включать, но не ограничиваться ими, активацию генов и репрессию генов. Для модулирования экспрессии можно использовать редактирование генома (например, расщепление, изменение, инактивация, случайная мутация). Инактивация гена относится к любому снижению экспрессии гена по сравнению с клеткой, которая не включает ZFP, TALE или систему CRISPR/Cas, как описано в настоящем описании. Таким образом, инактивация гена может быть частичной или полной.

[0075] "Эукариотические" клетки включают, но не ограничиваются ими, клетки грибов (таких как дрожжи), клетки растений, клетки животных, клетки млекопитающих и клетки человека (например, T-клетки), включая стволовые клетки (плюрипотентные и мультипотентные).

[0076] Термины "функциональная связь" и "функционально связанный" (или "эффективно связанный") используются взаимозаменяемо в отношении соседнего положения двух или более компонентов (таких как элементы последовательности), где компоненты организованы таким образом, что оба компонента функционируют нормально и обеспечивают возможность того, что по меньшей мере один из компонентов может опосредовать функцию, которую демонстрирует по меньшей мере один из других компонентов. В качестве иллюстрации, последовательность регуляции транскрипции, такая как промотор, функционально связана с кодирующей последовательностью, если последовательность регуляции транскрипции контролирует уровень транскрипции кодирующей последовательности в ответ на присутствие или отсутствие одного или более факторов регуляции транскрипции. Последовательность регуляции транскрипции, как правило, функционально связана в цис-формате с кодирующей последовательностью, но она не должна быть непосредственно соседней с ней. Например, энхансер представляет собой последовательность регуляции транскрипции, которая функционально связана с кодирующей последовательностью, даже если они не являются смежными.

[0077] "Функциональный фрагмент" белка, полипептида или нуклеиновой кислоты представляет собой белок, полипептид или нуклеиновую кислоту, чья последовательность не является идентичной полноразмерному белку, полипептиду или нуклеиновой кислоте, но, тем не менее, сохраняет ту же функцию, что и полноразмерный белок, полипептид или нуклеиновая кислота. Функциональный фрагмент может обладать большим, меньшим или тем же количеством остатков, что и соответствующая нативная молекула, и/или может содержать одну или несколько аминокислотных или нуклеотидных замен. Способы определения функции нуклеиновой кислоты (например, функция кодирования, способность гибридизоваться с другой нуклеиновой кислотой) хорошо известны в данной области. Аналогично, способы определения функции белка хорошо известны. Например, фактор VIII человека с делецией B-домена представляет собой функциональный фрагмент полноразмерного белка фактора VIII.

[0078] Полинуклеотидный "вектор" или "конструкция" способны переносить последовательности генов в клетки-мишени. Как правило, "векторная конструкция", "экспрессирующий вектор", "экспрессирующая конструкция", "экспрессирующая кассета" и "вектор для переноса генов" означает любую конструкцию нуклеиновой кислоты, способную направлять экспрессию представляющего интерес гена и способную переносить последовательности генов в клетки-мишени. Таким образом, термин включает клонирующие и экспрессирующие носители, а также встраивающиеся векторы.

[0079] Термины "индивидуум" и "пациент" используются взаимозаменяемо, и они относятся к млекопитающим, таким как пациенты-люди и не являющиеся человеком приматы, а также к экспериментальным животным, таким как кролики, собаки, кошки, крысы, мыши и другие животные. Таким образом, термин "индивидуум" или "пациент", как используют в рамках изобретения, означает любого пациента или индивидуума, являющегося млекопитающим, которому можно вводить экспрессирующие кассеты по изобретению. Индивидуумы по настоящему изобретению включают индивидуумов с нарушением.

[0080] Термины "проведение лечения" и "лечение", как используют в рамках изобретения, относятся к снижению тяжести и/или частоты симптомов, устранению симптомов и/или лежащей в их основе причины, предупреждению возникновения симптомов и/или лежащей в основе причины, и улучшению или восстановлению после повреждения. Неограничивающими примерами состояний, которые можно лечить с использованием композиций и способов, описанных в настоящем описании, являются злокачественная опухоль и реакция "трансплантат против хозяина". Таким образом, "проведение лечения" и "лечение" включает:

(i) предупреждение возникновения заболевания или состояния у млекопитающего, в частности, когда такое млекопитающее предрасположено к состоянию, но у него еще не диагностировано его наличие;

(ii) ингибирование заболевания или состояния, т.е. остановку его развития;

(iii) облегчение заболевания или состояния, т.е. обеспечение регрессии заболевания или состояния; и/или

(iv) облегчение или устранение симптомов в результате заболевания или состояния, т.е. облегчение боли без воздействия на лежащее в ее основе заболевание или состояние.

[0081] В рамках изобретения термины "заболевание" и "состояние" могут использоваться взаимозаменяемо или могут отличаться тем, что конкретное расстройство или состояние может не иметь известного этиологического фактора (так что этиология еще не установлена) и, таким образом, еще не признано в качестве заболевания, а только в качестве нежелательного состояния или синдрома, где клиницисты идентифицируют более или менее конкретный набор симптомов.

[0082] "Фармацевтическая композиция" относится к составу соединения по изобретению и среды, общепризнанных в области доставки биологических активных соединений млекопитающим, например, человеку. Такая среда включает все фармацевтически приемлемые носители, разбавители или эксципиенты.

[0083] "Эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" относится к количеству соединения по изобретению, которое при введении млекопитающему, предпочтительно человеку, является достаточным для обеспечения лечения у млекопитающего, предпочтительно человека. Количество композиции по изобретению, которое составляет "терапевтически эффективное количество", варьируется в зависимости от соединения, состояния и его тяжести, способа введения, и возраста млекопитающего, подвергаемого лечению, а также оно может определяться стандартным образом специалистом в данной области с учетом известной информации и настоящего изобретения.

Специфические для печени экспрессирующие конструкции

[0084] Также в настоящем описании описаны экспрессирующие кассеты (конструкции) для применения для направления экспрессии трансгена в клетки печени, в том числе in vivo после введения экспрессирующей кассеты(кассет) индивидууму (например, доставка в печень). Экспрессирующая конструкция может поддерживаться эписомно и может запускать экспрессию трансгена внехромосомно или, альтернативно, экспрессирующая конструкция может встраиваться в геном клетки печени, например, посредством опосредуемого нуклеазой направленного встраивания.

[0085] Полинуклеотидная экспрессирующая конструкция содержит последовательность энхансера, последовательность промотора и один или более трансгенов. Необязательно включены одно одна или более из следующих: последовательность интрона, последовательность полиаденилирования и/или сигнальный пептид. В экспрессирующих конструкциях, описанных в настоящем описании можно использовать любую последовательность энхансера. В определенных вариантах осуществления энхансер представляет собой энхансер дикого типа или модифицированный энхансер серпина 1 (Chuah et al., (2014) Molecular Therapy, 22, 1605-1613; Nair et al., (2014) Blood, 123, 3195-3199).

[0086] Как будет понятно, в конструкциях, описанных в настоящем описании, можно использовать любой трансген. Более того, индивидуальные компоненты (промотор, энхансер, инсулятор, трансген и т.д.) конструкций, описанных в настоящем описании, можно смешивать и подбирать в любой комбинации.

[0087] Конструкции, описанные в настоящем описании, могут содержаться в любом вирусном или невирусном векторе. Конструкции можно поддерживать эписомно или можно встраивать в геном клетки (например, посредством опосредуемого нуклеазой направленного встраивания).

[0088] Невирусные векторы включают ДНК- или РНК-плазмиды, MC ДНК, голую нуклеиновую кислоту и нуклеиновую кислоту в комплексе с носителем для доставки, таким как липосома, наночастица или полоксамер. Вирусные векторы, которые можно использовать для вмещения экспрессирующих кассет, описанных в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, ретровирусные, лентивирусные, аденовирусные, аденоассоциированные вирусные векторы, векторы на основе вируса коровьей оспы и вируса простого герпеса. Встраивание в геном хозяина возможно в случае способов переноса генов с использованием ретровируса, лентивируса и аденоассоциированного вируса, и, как описано в настоящем описании, может облегчаться опосредуемым нуклеазой встраиванием.

[0089] В определенных вариантах осуществления конструкции включены в вектор или векторную систему на основе аденоассоциированного вируса ("AAV"), которые могут поддерживаться эписомно или встраиваться в геном клетки печени (например, посредством опосредуемого нуклеазой направленного встраивания). Конструирование рекомбинантных векторов на основе AAV описано в ряде публикаций, включая патент США № 5173414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); и Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989).

[0090] Таким образом, в определенных вариантах осуществления, экспрессирующая конструкция находится на конструкции AAV и дополнительно содержит 5’- и 3’-ITR, фланкирующие элементы экспрессирующей конструкции (например, энхансер, промотор, необязательный интрон, трансген и т.д.), как описано в настоящем описании. Необязательно, спейсерные молекулы также включены между одним или несколькими из компонентов экспрессирующей конструкции, например, между 5’-ITR и энхансером и/или между сигналом полиаденилирования и 3’-ITR. Спейсеры могут функционировать в качестве плеч гомологии для облегчения рекомбинации в локус "безопасной гавани" (например, альбумин).

[0091] В определенных вариантах осуществления векторы на основе AAV, как описано в настоящем описании, могут происходить из любого AAV. В определенных вариантах осуществления вектор на основе AAV происходит из дефектного и непатогенного парвовируса, аденоассоциированного вируса типа 2. Все такие векторы происходят из плазмиды, в которой сохранены только инвертированные концевые повторы AAV размером 145 п.о., фланкирующие экспрессирующую кассету трансгена. Эффективный перенос генов и стабильная доставка трансгена вследствие встраивания в геномы трансдуцированной клетки являются ключевыми признаками этой векторной системы (Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)). Также в соответствии с настоящим изобретением можно использовать другие серотипы AAV, включая AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 и AAVrh.10, и любой новый серотип AAV. В некоторых вариантах осуществления используют химерный AAV, где последовательности LTR вирусной нуклеиновой кислоты вирусного происхождения являются гетерологичными относительно капсидных последовательностей вирусного происхождения. Неограничивающие примеры включают химерный вирус с LTR, происходящими из AAV2, и капсидами, происходящими из AAV5, AAV6, AAV8 или AAV9 (т.е. AAV2/5, AAV2/6, AAV2/8 и AAV2/9, соответственно).

[0092] Для формирования вирусных частиц, которые способны инфицировать клетку-хозяина, используют упаковывающие клетки. Такие клетки включают клетки HEK293 и Sf9, которые можно использовать для упаковывания AAV и аденовируса, и клетки ψ2 или клетки PA317, которые упаковывают ретровирус. Вирусные векторы, используемые в генной терапии, обычно продуцируются продуцирующей клеточной линией, которая упаковывает вектор на основе нуклеиновой кислоты в вирусную частицу. Векторы, как правило, содержат минимальные вирусные последовательности, требуемые для упаковывания и последующего встраивания в хозяина (если это применимо), а другие вирусные последовательности заменены экспрессирующей кассетой, кодирующей белок, подлежащий экспрессии. Недостающие вирусные функции предоставляются в транс-формате упаковывающей клеточной линией. Например, векторы на основе AAV, используемые для генной терапии, имеют только последовательности инвертированных концевых повторов (ITR) из генома AAV, которые необходимы для упаковывания и встраивания в геном хозяина. Вирусная ДНК упаковывается в клеточной линии, которая содержит плазмиду-помощника, кодирующую другие гены AAV, а именно, rep и cap, но лишенную последовательностей ITR. Клеточную линию также инфицируют аденовирусом в качестве помощника. Вирус-помощник способствует репликации вектора AAV и экспрессии генов AAV с плазмиды-помощника. Плазмида-помощник не упаковывается в значительных количествах вследствие отсутствия последовательностей ITR. Контаминация аденовирусом может быть снижена, например, посредством тепловой обработки, к которой аденовирус более чувствителен, чем AAV. В некоторых вариантах осуществления AAV продуцируется с использованием бакуловирусной экспрессирующей системы.

[0093] Во многих применениях генной терапии является желательной доставка вектора для генной терапии с высокой степенью специфичности к конкретному типу тканей. Таким образом, вирусный вектор может быть модифицирован так, чтобы он обладал специфичностью к данному типу клеток, посредством экспрессии лиганда в качестве слитого белка с вирусным белком оболочки на наружной поверхности вируса. Лиганд выбирают так, чтобы он обладал аффинностью в отношении рецептора, о котором известно, что он присутствует на представляющем интерес типе клеток. Например, Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995), описали, что вирус лейкоза мышей Молони может быть модифицирован для экспрессии херегулина человека, слитого с gp70, и рекомбинантный вирус инфицирует определенные клетки рака молочной железы, экспрессирующие рецептор эпидермального фактора роста человека. Этот принцип может быть распространен на другие пары вирус:клетка-мишень, в которых клетка-мишень экспрессирует рецептор и вирус экспрессирует слитый белок, содержащий лиганд для рецептора клеточной поверхности. Например, нитчатый фаг можно модифицировать способами инженерии для экспонирования фрагментов антител (например, FAB или Fv), обладающих аффинностью специфического связывания практически для любого выбранного клеточного рецептора. Хотя приведенное выше описание относится в основном к вирусным векторам, те же принципы могут быть применены к невирусным векторам. Такие векторы можно модифицировать способами инженерии так, чтобы они содержали определенные последовательности для захвата, которые облегчают захват определенными клетками-мишенями.

[0094] Полинуклеотиды, описанные в настоящем описании, могут включать одно или несколько неприродных оснований и/или остовов. В частности, экспрессирующая кассета, как описано в настоящем описании, может включать метилированные цитозины для достижения состояния транскрипционного покоя в представляющей интерес области.

[0095] Более того, экспрессирующие конструкции, как описано в настоящем описании, также могут включать дополнительные последовательности регуляции транскрипции или трансляции или другие последовательности, например, последовательности Козака, дополнительные промоторы, энхансеры, инсуляторы, участки внутренней посадки рибосом, последовательности, кодирующие пептиды 2A, участки расщепления фурином и/или сигналы полиаденилирования. Кроме того, представляющие интерес элементы контроля генов могут быть функционально связаны с репортерными генами с получением химерных генов (например, репортерные экспрессирующие кассеты).

Доставка

[0096] Конструкции, описанные в настоящем описании, можно доставлять in vivo или ex vivo любыми подходящими способами в любой тип клеток, предпочтительно в печень (печеночная доставка). Аналогично, когда их используют в комбинации с нуклеазами для направленного встраивания, нуклеазы можно доставлять в форме полинуклеотида и/или белка, например, с использованием невирусного вектора(ов), вирусного вектора(ов) и/или в форме РНК, например, в качестве мРНК.

[0097] Общепринятые способы вирусного и невирусного переноса генов можно использовать для введения нуклеиновых кислот, кодирующих модифицированные способами инженерии модуляторы генов, в клетки (например, клетки млекопитающих) и ткани-мишени. Такие способы также можно использовать для введения нуклеиновых кислот, кодирующих такие репрессоры (или их компоненты), в клетки in vitro. В определенных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, кодирующие репрессоры, вводят для применений в генной терапии in vivo или ex vivo. Невирусные системы доставки векторов включают ДНК-плазмиды, голую нуклеиновую кислоту и нуклеиновую кислоту в комплексе с носителем для доставки, таким как липосома или полоксамер. Вирусные системы доставки векторов включают ДНК- и РНК-вирусы, которые имеют либо эписомальные, либо встроенные геномы после доставки в клетки. Для обзора методик генной терапии, см. Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Böhm (eds.) (1995); и Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).

[0098] Можно использовать любые векторные системы, включая, но не ограничиваясь ими, плазмидные векторы, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы, аденовирусные векторы, поксвирусные векторы; герпесвирусные векторы и векторы на основе аденоассоциированного вируса, и т.д. Также см. патенты США № 8586526; 6534261; 6607882; 6824978; 6933113; 6979539; 7013219 и 7163824, включенные в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.

[0099] Способы невирусной доставки нуклеиновых кислот включают электропорацию, липофекцию, микроинъекцию, биолистические способы доставки, виросомы, липосомы, иммунолипосомы, другие наночастицы, конъюгаты поликатион или липид:нуклеиновая кислота, голую ДНК, искусственные вирионы и усиленный агентом захват ДНК. Также для доставки нуклеиновых кислот можно использовать сонопорацию с использованием, например, системы Sonitron 2000 (Rich-Mar). Дополнительные иллюстративные системы доставки нуклеиновых кислот включают системы доставки, предоставляемые AmaxaBiosystems (Cologne, Германия), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) и Copernicus Therapeutics Inc. (см., например, US6008336).

[00100] В некоторых вариантах осуществления экспрессирующие конструкции представляют собой векторы на основе AAV. Необязательные нуклеазы можно вводить в форме мРНК или с использованием одного или более вирусных векторов (AAV, Ad, и т.д.). Введение можно проводить любыми способами, посредством которых полинуклеотиды доставляют в желаемые клетки-мишени. Предусматриваются способы как in vivo, так и ex vivo. Возможным способом введения является внутривенная инъекция в воротную вену. Другие способы введения in vivo включают, например, прямую инъекцию в доли печени или желчный проток, и внутривенную инъекцию дистальнее печени, в том числе через печеночную артерию, прямую инъекцию в паренхиму печени, инъекцию через печеночную артерию и/или ретроградную инъекцию через желчные протоки. Способы введения ex vivo включают трансдукцию in vitro резектированных гепатоцитов или других клеток печени с последующей инфузией трансдуцированных резектированных гепатоцитов обратно в портальные сосуды, паренхиму печени или желчные протоки пациента-человека, см., например, Grossman et al., (1994) Nature Genetics, 6:335-341.

[00101] В системах, вовлекающих доставку более чем одного полинуклеотида (например, конструкция, как описано в настоящем описании, и нуклеаза в форме полинуклеотида), два или более полинуклеотида(ов) доставляют с использованием одного или более одинаковых и/или различных векторов. Например, нуклеазу в форме полинуклеотида можно доставлять в форме мРНК и специфические для печени конструкции, как описано в настоящем описании, можно доставлять любыми способами, такими как вирусные векторы (например, AAV), миникольцевая ДНК, плазмидная ДНК, линейная ДНК, липосомы, наночастицы и т.п.

[00102] Дополнительные иллюстративные системы доставки нуклеиновых кислот включают системы доставки, предоставляемые Amaxa Biosystems (Cologne, Германия), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) и Copernicus Therapeutics Inc (см., например, US6008336). Липофекция описана, например, в патентах США № 5049386; 4946787 и 4897355) и реагенты для липофекции продаются коммерчески (например, Transfectam^® и Lipofectin^® и Lipofectamine^® RNAiMAX). Катионные и нейтральные липиды, которые являются пригодными для эффективной липофекции с распознаванием рецепторов полинуклеотидов, включают липиды согласно Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024. Доставка может осуществляться в клетки (введение ex vivo) или ткани-мишени (введение in vivo).

[00103] Получение комплексов липид:нуклеиновая кислота, включая нацеленные липосомы, такие как иммунолипидные комплексы, хорошо известно специалисту в данной области (см., например, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); патент США № 4186183, 4217344, 4235871, 4261975, 4485054, 4501728, 4774085, 4837028 и 4946787).

[00104] Дополнительные способы доставки включают использование упаковывающих нуклеиновых кислот для доставки в системы доставки EnGeneIC (EDV). Эти EDV специфически доставляются к клеткам-мишеням с использованием биспецифических антител, где одно плечо антитела обладает специфичностью к ткани-мишени, а другое обладает специфичностью к EDV. Антитело доставляет EDV к поверхности клетки-мишени, а затем EDV переносится в клетку посредством эндоцитоза. После попадания в клетку содержимое высвобождается (см. MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643).

[00105] В применениях, в которых является желательной временная экспрессия, можно использовать системы на основе аденовируса. Векторы на основе аденовируса способны к очень высокой эффективности трансдукции во многих типах клеток и не требуют деления клеток. В случае таких векторов достигают высоких титров и высоких уровней экспрессии. Этот вектор можно получать в больших количествах в относительно простой системе. Векторы на основе аденоассоциированного вируса ("AAV") также используют для трансдукции клеток нуклеиновыми кислотами-мишенями, например, при продуцировании нуклеиновых кислот и пептидов in vitro, и для методик генной терапии in vivo и ex vivo (см., например, West et al., Virology 160:38-47 (1987); патент США № 4797368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). Конструирование рекомбинантных векторов на основе AAV описано в ряде публикаций, включая патент США № 5173414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); и Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989).

[00106] Рекомбинантные векторы на основе аденоассоциированного вируса (rAAV) являются перспективными альтернативными системами доставки генов на основе дефектного и непатогенного парвовируса, аденоасссоциированного вируса 2 типа. Все векторы происходят из плазмиды, в которой сохранены только инвертированные концевые повторы AAV размером 145 п.о., фланкирующие трансгенную экспрессирующую кассету. Эффективный генной перенос и стабильная доставка трансгена вследствие встраивания в геномы трансдуцированной клетки являются ключевыми признаками этой векторной системе (Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)). Другие серотипы AAV, включая AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8AAV 8,2, AAV9, и AAV rh10 и псевдотипированный AAV, такой как AAV2/8, AAV2/9, AAV2/5 и AAV2/6, также можно использовать в соответствии с настоящим изобретением. Также в соответствии с настоящим изобретением можно использовать новые серотипы AAV, способные проходить через гематоэнцефалический барьер (см., например, US20150079038). В некоторых вариантах осуществления используют AAV6.

[00107] Упаковывающие клетки используют для формирования вирусных частиц, которые способны инфицировать клетку-хозяина. Такие клетки включают клетки 293, которые упаковывают аденовирус, и клетки ψ2 или клетки PA317, которые упаковывают ретровирус. Вирусные векторы, используемые для генной терапии, обычно продуцируются продуцирующей клеточной линией, которая упаковывает вектор нуклеиновой кислоты в вирусную частицу. Векторы, как правило, содержат минимальные вирусные последовательности, требуемые для упаковывания и последующей интеграции в хозяина (если это применимо), а другие вирусные последовательности заменены экспрессирующей кассетой, кодирующей белок, подлежащий экспрессии. Недостающие вирусные функции предоставляются в транс-формате упаковывающей клеточной линией. Например, векторы AAV, используемые для генной терапии, имеют только последовательности инвертированных концевых повторов (ITR) из генома AAV, которые необходимы для упаковывания и встраивания в геном хозяина. Вирусная ДНК упаковывается в клеточной линии, которая содержит плазмиду-помощника, кодирующую другие гены AAV, а именно, rep и cap, но лишенную последовательностей ITR. Клеточную линию также инфицируют аденовирусом в качестве помощника. Вирус-помощник способствует репликации вектора AAV и экспрессии генов AAV с плазмиды-помощника. Плазмида-помощник не упаковывается в значительных количествах вследствие отсутствия последовательностей ITR. Контаминация аденовирусом может быть снижена, например, посредством тепловой обработки, к которой аденовирус более чувствителен, чем AAV.

[00108] Очистка частиц AAV из 293 или бакуловирусной системы, как правило, вовлекает выращивание клеток, которые продуцируют вирус, с последующим сбором вирусных частиц из клеточного супернатанта или лизисом клеток или сбором вируса из неочищенного лизата. Затем AAV очищают способами, известными в данной области, включая ионообменную хроматографию (например, см. патенты США 7419817 и 6989264), ионообменную хроматографию и центрифугирование в плотности CsCl (например, публикация PCT WO2011094198A10), иммунооаффинную хроматографию (например, WO2016128408) или очистку с использованием AVB Sepharose (например, GE Healthcare Life Sciences).

[00109] Во многих применениях генной терапии является желательной доставка вектора для генной терапии с высокой степенью специфичности к конкретному типу тканей. Таким образом, вирусный вектор может быть модифицирован так, чтобы он обладал специфичностью к данному типу клеток, посредством экспрессии лиганда в качестве слитого белка с вирусным белком оболочки на наружной поверхности вируса. Лиганд выбирают так, чтобы он обладал аффинностью в отношении рецептора, о котором известно, что он присутствует на представляющем интерес типе клеток. Например, Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995), описали, что вирус лейкоза мышей Молони может быть модифицирован для экспрессии херегулина человека, слитого с gp70, и рекомбинантный вирус инфицирует определенные клетки рака молочной железы, экспрессирующие рецептор эпидермального фактора роста человека. Этот принцип может быть распространен на другие пары вирус:клетка-мишень, в которых клетка-мишень экспрессирует рецептор и вирус экспрессирует слитый белок, содержащий лиганд для рецептора клеточной поверхности. Например, нитчатый фаг можно модифицировать способами инженерии для экспонирования фрагментов антител (например, FAB или Fv), обладающих аффинностью специфического связывания практически для любого выбранного клеточного рецептора. Хотя приведенное выше описание относится в основном к вирусным векторам, те же принципы могут быть применены к невирусным векторам. Такие векторы можно модифицировать способами инженерии так, чтобы они содержали определенные последовательности для захвата, которые облегчают захват определенными клетками-мишенями.

[00110] Векторы генной терапии можно доставлять in vivo посредством введения конкретному пациенту, как правило, посредством системного введения (например, внутривенной, внутрибрюшинной, внутримышечной, подкожной или внутричерепной инфузии, включая прямую инъекцию в головной мозг) или местного применения, как описано ниже.

[00111] Фармацевтически приемлемые носители определяются отчасти конкретной вводимой композицией, а также конкретным способом, используемым для введения композиции. Таким образом, существует широкое множество доступных подходящих составов фармацевтических композиций, как описано ниже (см., например, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989).

[00112] Эффективное количество экспрессирующей кассеты (и необязательной нуклеазы(нуклеаз) и/или модифицированных клеток), подлежащей введению, варьируется от пациента к пациенту. Таким образом, эффективные количества лучше всего определяются врачом, вводящим композиции (например, клетки) и соответствующие дозировки могут быть без труда определены специалистом в данной области. Анализ уровней в сыворотке, плазме или других тканях терапевтического полипептида и сравнение с первоначальным уровнем перед введением может позволять определение того, является ли вводимое количество слишком низким, входящим в правильный диапазон или слишком высоким. Подходящие режимы для первоначального и последующего введения также варьируются, однако иллюстрируются первоначальным введением, после которого необязательно при необходимости следуют последующие введения. Последующие введения можно проводить с различными интервалами в диапазоне от раза в сутки до раза в год и до раза в несколько лет. Специалисту в данной области будет понятно, что могут быть рекомендованы подходящие способы иммуносупрессии, чтобы избежать ингибирования или блокады трансдукции векторов для доставки посредством иммуносупрессии, см., например, Vilquin et al., (1995) Human Gene Ther., 6:1391-1401.

[00113] Составы для введения как ex vivo, так и in vivo, включают суспензии (например, генетически модифицированных клеток, липосом или наночастиц) в жидких или эмульгированных жидкостях. Активные ингредиенты часто смешивают с эксципиентами, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. Подходящие эксципиенты включают, например, воду, солевой раствор, декстрозу, глицерин, этанол и т.п., и их комбинации. Кроме того, композиция может содержать небольшие количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие вещества или эмульгаторы, pH-буферные средства, стабилизаторы или другие реагенты, которые повышают эффективность фармацевтической композиции.

Применения

[00114] Способы и композиции, описанные в настоящем описании, предназначены для предоставления способов терапии любого заболевания посредством предоставления трансгена, который экспрессирует продукт, который отсутствует или в дефиците при заболевании или иным образом лечит или предупреждает заболевание.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Клинические способы

Количественная ПЦР

[00115] кОТ-ПЦР (для уровней мРНК фактора VIII человека): РНК/ДНК выделяют из плазмы с использованием набора AllPrep DNA/RNA kit в соответствии с инструкциями изготовителя (Qiagen, Carlsbad CA). Затем экстрагированную РНК используют для получения кДНК с использованием набора для синтеза кДНК Quantitect (Qiagen, Carlsbad CA). Затем проводят количественную ПЦР с использованием зондов SsoAdvanced Universal Probes Supermix (Biorad, Hercules CA) на Biorad CFX 96 с использованием анализа с меченным праймером/зондом от IDT (Coralville IA). Для специфической детекции мРНК фактора VIII мРНК специально разрабатывают анализ с праймером/зондом; прямой праймер (GGAGATGAAGAAGGAGGACTTTG) (SEQ ID NO: 6), зонд (ACATCTACGACGAGGACGAGAACCA) (SEQ ID NO: 7) и обратный праймер (TCCACAGCAGCAATGAAGTAG) (SEQ ID NO: 8). Количественную кОТ-ПЦР (не абсолютная) используют с нормализацией к GAPDH для каждого образца, и результат анализа конечных данных сообщают в качестве относительного показателя, взятого за 1,0. Контроль без матрицы и контроли без обратной транскриптазы исследуют для всех образцов, и они не генерируют поддающийся обнаружению сигнал.

[00116] кПЦР (для векторного генома, VG, анализы): РНК/ДНК выделяют из плазмы с использованием набора AllPrep DNA/RNA kit в соответствии с инструкциями изготовителя (Qiagen, Carlsbad CA). Экстрагированную ДНК используют для количественной ПЦР с основной смесью для ПЦР TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG (Applied Biosystems, Foster City, CA) на системе для ПЦР в реальном времени AB 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Для специфической детекции фактора VIII человека разрабатывают специализированный анализ с праймером/зондом; прямой праймер (CCTGGGCCAGTTCCTGCT) (SEQ ID NO: 9), зонд (TTCTGCCACATCAGCAGCCACCA) (SEQ ID NO: 10) и обратный праймер (GGCCTCCATGCCATCATG) (SEQ ID NO: 11). Контроли без матрицы исследуют для всех образцов, и они не генерируют поддающийся обнаружению сигнал. Строят стандартную кривую для полученной посредством кПЦР ДНК из семи серийных 4-кратных разведений известного количества очищенной линеаризованной плазмиды фактора VIII человека.

[00117] Общий иммуноанализ антигена FVIII человека. Общий антиген фактора VIII человека с делетированным B-доменом (hFVIII-BDD) в цитратной плазме человека количественно определяют с использованием иммуноанализа hFVIIIBDD, разработанного в Sangamo Therapeutics, Inc. В качестве калибратора используют эталонный материал Xyntha® (рекомбинантный BDD-FVIII человека). Xyntha® также используют в качестве QC для представления антигена hFVlll-BDD. Анализ представляет собой сэндвич-ELISA, в котором используется моноклональное антитело (mAb) в качестве улавливающего антитела и биотинилированное mAb в качестве антитела для детекции, оба из которых имеют домен A2 FVIII в качестве эпитопа. После покрытия улавливающим mAb (GMA-8023; Green Mountain Антитела), блокирования и промывания, образцы плазмы, образцы для калибровки и контроля качестве в минимальном требуемом разведении (MRD), равным 5, инкубируют в планшете для анализа с последующим промыванием. Биотинилированное mAb (GMA-8024; Green Mountain Antibodies) наносят на планшет с инкубацией и последующим промыванием до добавления конъюгированного реагента стрептавидин-пероксидаза хрена (SA-HRP). После инкубации с SA-HRP и промывания добавляют раствор субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB) в течение 10 минут перед добавлением кислотного стоп-раствора для гашения реакции перед детекцией при 450 нм. Уловленный антиген hFVIII-BDD количественно определяют против линейной стандартной кривой, которую подвергают регрессии с использованием линейной аппроксимации log-log в диапазоне от 0,020 МЕ/мл до 0,500 МЕ/мл. Калибраторы получают с использованием 10,0 МЕ/мл рабочего раствора Xyntha®, приготовленного в объединенной плазме с врожденным дефицитом FVIII (George King Bio-Medical, или эквивалент).

[00118] Калибровочную кривую из 9 точек (диапазон количественного определения от 0,500 МЕ/мл до 0,020 МЕ/мл с якорными точками 0,010 МЕ/мл и 0,000 МЕ/мл) строят с использованием калибратора анализа, разбавленного до подходящих уровней разбавителем для анализа. Калибровку проводят в качестве единичной кривой в двух экземплярах с использованием линейной аппроксимации log-log с измеренным содержанием общего антигена hFVIII-BDD в МЕ/мл по оси x, и оптической плотностью (OD, измеренная при 450 нм) по оси y. Последние два стандартных уровня представляют собой якорные точки, полученные при 0,010 МЕ/мл и 0,000 МЕ/мл, не удовлетворяющие критериям допустимости. Образцы и QC анализируют в двух экземплярах, и проводят их обратное вычисление по калибровочной кривой для определения общего антигена hFVIII-BDD (концентрация, указанная в качестве МЕ/мл).

[00119] Хромогенный анализ активности фактора VIII человека. Активность секретируемого фактора VIII человека в плазме определяют с использованием анализа Diapharma Chromogenic Coamatic Factor VIII assay (West Chester, OH) в соответствии с протоколом изготовителя, за исключением стандарта фактора VIII человека. Стандарт фактора VIII человека, используемый в анализе ELISA, представляет собой рекомбинантный очищенный фактор VIII человека (#F0016-06) от US Biologicals (Salem, MA).

[00120] Анализ активности свертывания Активность секретируемого фактора VIII человека в плазме определяют с использованием анализа активированного частичного тромбопластинового времени (aPTT) от Diagnostica Stago (Boston MA) в соответствии с протоколом изготовителя, за исключением стандарта фактора VIII человека и плазмы с дефицитом фактора VIII человека. Стандарт фактора VIII человека является тем же, который используется в анализе ELISA (рекомбинантный очищенный фактор VIII человека, #F0016-06 от US Biologicals, Salem, MA). Реагент с дефицитом FVIII, используемый в анализе свертывания, представляет собой FVIII-CD < 1% FVIII Activity (замороженный дефицитный FVIII) от Haematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT).

Пример 2: Получение SB-525

[00121] Основный буфер для составления конечного продукта, SBR-0099, состоявший из фосфатно-солевого буфера (PBS), содержавшего CaCl₂, MgCl₂, 35 мМ NaCl (т.е. 0,90 мМ CaCl₂, 0,49 мМ MgCl₂, 2,68 мМ KCl, 1,47 мМ KH₂PO₄, 172 мМ NaCl, 8,10 мМ Na₂HPO₄), получали с использованием реагентов категории USP. SB-525 Bulk доводили до заданной концентрации 1,0×10¹³ вг/мл в буфере для конечного составления, состоявшем из PBS, содержавшего CaCl₂, MgCl₂, 35 мМ NaCl, 1% сахарозу, 0,05% Kolliphor (полоксамер) P 188.

[00122] Вектор SB-525 представляет собой вектор на основе AAV, содержавший капсид AAV6 и содержавший SEQ ID NO: 5, фланкированную с 5’- и 3’-стороны посредством ITR AAV2, SEQ ID NO: 12 и 13, соответственно.

[00123] Продукт SB-525 получали путем вычисления объема компонента продукта путем умножения уровня дозы (вг/кг) на массу индивидуума (кг), а затем деления на концентрацию вирусного генома (вг/мл). Объем нормального солевого раствора (NS) вычисляли до достижения соотношения 1:1 с продуктом SB-525. Общий объем вычисляли суммированием объема NS и объема продукта SB-525. Иллюстративные дозы для продукта SB-525 представлены ниже в таблице I ниже:

Таблица I: Иллюстративные дозы SB-525

Уровень дозы	Общая доза AAV SB-525 (вг/кг)
1	6,00×1011
2	9,00×1011
3	1,20×1012
4	2,00×1012
5	4,00×1012
6	6,00×1012
7	1,00×1013

Пример 3: Протокол инфузии

[00124] Ожидалось, что общие объемы будут составлять от 4 мл до 200 мл в зависимости от назначенного уровня дозы для индивидуума и массы тела. Если общий объем составлял менее 50 мл, тогда инфузируемый продукт вводили посредством шприца, в то время как, когда объем превышал 50 мл, инфузируемый продукт вводили посредством пакета для инфузий. В обоих случаях скорость инфузии составляла 100 мл/час с использованием инфузионного насоса постоянной скорости.

Пример 4: Задачи исследования и клинические результаты

[00125] Критерии включения и исключения: для исследования критерии включения включали мужской пол и возраст ≥ 18 лет, которым проводили лечение или воздействие концентратов FVIII или криопреципитата в течение по меньшей мере 150 дней воздействия. Кроме того, индивидуум должен был иметь ≥ 12 эпизодов кровотечения на протяжении предшествующих 12 месяцев. Критерии исключения включали наличие нейтрализующих антител у индивидуума против капсида AAV6, ингибитор FVIII или наличие в анамнезе одного из гиперчувствительности к FVIII, признаков какого-либо нарушения свертываемости в дополнение к гемофилии A, маркеров воспаления печени и применения системного (в/в или перорального) иммуномодулирующего средства.

[00126] Задачи исследования: основной задачей этого исследования была оценка безопасности. Эти основные задачи представляли собой исследование безопасности и переносимости SB-525 и оценку динамики профиля активности FVIII после дозирования SB-525. Вторичные результаты включали наблюдение изменения относительно исходного уровня применения FVIII-заместительной терапии ("фактор") и частоты и тяжести эпизодов кровотечения, оценку клинического влияния на гемофилию A после дозирования, а также оценку иммунного ответа на FVIII и исчезновения вектора AAV2/6. Исследовательские задачи включали оценку согласованности между уровнями FVIII согласно ELISA и анализам активности FVIII и оценку какого-либо иммунного ответа на SB-525.

[00127] В исследование может быть включено приблизительно 20 индивидуумов. Выбор дозы и количество исследованных индивидуумов при каждом уровне дозы основаны на безопасности и совокупном фармакодинамическом ответе (кинетика уровней циркулирующего FVIII), наблюдаемых у индивидуумов, которым ранее проводили дозирование.

[00128] Приблизительно 7 уровней доз может быть необходимо исследовать для идентификации безопасного и переносимого терапевтического диапазона. Потенциальные уровни дозы составляют 6×10¹¹, 9×10¹¹, 1,2×10¹², 2×10¹², 4×10¹², 6×10¹² и 1×10¹³ вг/кг. Стандартный уровень дозы (9×10¹¹ вг/кг) ассоциирован сс активностью FVIII 12% от нормы в исследовании NHP.

Пример 5: Предварительные результаты

[00129] Пять пациентов лечились предварительно. Было обнаружено, что SB-525 в основном хорошо переносился без связанных с лечением серьезных неблагоприятных явлений и без использования снижающихся доз стероидов. Один пациент, которого лечили в третьей группе (уровень дозы 3) достигал экспрессии фактора VIII на терапевтически значимом уровне, который может быть предсказывающим значительное снижение или устранение спонтанных кровотечений и применения фактора. Во второй группе (уровень дозы 2), после лечения наблюдалось уменьшение употребления фактора.

Пример 6: Восемь пациентов, которых лечили посредством генной терапии SB-525, продемонстрировали зависимое от дозы повышение активности FVIII, причем два пациента, которых лечили дозой 3×10¹³ вг/кг, достигали нормальных уровней FVIII

[00130] Исследование фазы 1/2 Alta представляет собой открытое клиническое испытание в диапазоне доз, предназначенное для оценки безопасности и переносимости SB-525 у вплоть до 20 взрослых пациентов с тяжелой гемофилией A. Данные указывают на то, что SB-525 в основном хорошо переносился и продемонстрировал зависимое от дозы повышение уровней фактора VIII (FVIII) в группах четырех дозировок.

[00131] Данные первых восьми пациентов с гемофилией A, которых лечили генной терапией SB-525, являются обнадеживающими и демонстрируют зависимую от дозы взаимосвязь, признаки устойчивых уровней фактора и низкую вариабельность как у каждого пациента, так и в каждой группе.

[00132] Данные испытания фазы 1/2 включают восемь пациентов, которых подвергали лечению в четырех группах с возрастающей дозировкой (9×10¹¹ вг/кг, 2×10¹² вг/кг, 1×10¹³ вг/кг и 3×10¹³ вг/кг, с двумя пациентами на группу). Пациенты продемонстрировали зависимое от дозы повышение уровней FVIII, достигшее клинически значимого повышения активности FVIII в группах более высокой дозировки и нормальных уровней FVIII в группе дозировки 3×10¹³ вг/кг (нормальный диапазон: 50-150%). Также наблюдали зависимое от дозы применение заместительной терапии фактором VIII, причем в группах более высокой дозы наблюдалось значительно снижение. SB-525 в основном хорошо переносился, причем один пациент (которому вводили дозу 3×10¹³ вг/кг) описал связанное с лечением серьезное неблагоприятное явление в виде гипотензии и лихорадки, которое произошло после инфузии вектора и разрешилось посредством лечения в течение 24 часов после завершения инфузии вектора.

[00133] Пациентов в исследовании не лечили профилактическими стероидами. В первых трех группах не наблюдали связанных с лечением серьезных неблагоприятных явлений и повышений ALT, требующих лечения кортикостероидами в течение более чем семи суток. У одного пациента в четвертой группе произошло повышение уровня ALT (>1,5× ULN) на четвертой неделе, которое потребовало курса с постепенным снижением дозы пероральных стероидов. Пациент не имел никакого ассоциированного снижения активности фактора VIII или повышения уровня ALT через 7 недель после начала терапии стероидами. У того же пациента происходила связанная с лечением инфузионная реакция, однако она прошла на следующие сутки в соответствии с определяемым протоколом расписанием.

[00134] В таблице II представлены данные, иллюстрирующие введение дозировок вектора AAV 9×10¹¹, 2×10¹², 1×10¹³ и 3×10¹³ вг/кг. На фиг.1-3 представлены данные по активности FVIII, полученные после введения.

Таблица II. Результаты введения дозировок AAV. "Наблюдение" относится к периоду времени после введения, когда измеряли уровни активности FVIII (столбец 2) и частоту введений FVIII (столбец 5).

Доза SB-525 (вг/ кг)	Уровни активности FVIII (односта-дийный анализ свертывания)	Наблюдение	Количество введений FVIII до инъекции SB-525	Количество введений FVIII после инъекции SB-525
9×1011	˂1%˂	52 недели	2-3/неделя	Профилактическое, 12 неделя
9×1011	˂1%˂	52 недели	2/неделя	Профилактическое, 13 неделя
2×1012	˂1%˂	52 недели	2-3/месяц	9 за 12 месяцев
2×1012	2-3%	48 недели	3/неделя	7 за 12 месяцев
1×1013	13-20%	40 недель	3/неделя	7 за 36 недели
1×1013	5-10%	28 недель	1/3 недели	0 за 16 недель
3×1013	115-172%	12 недель	2/неделя	0 за 12 недель
3×1013	23-41%	6 недель	3-4/неделя	Профилактическое, на 1-х 3 неделях

Пример 7: Десять пациентов, которых лечили посредством генной терапии SB-525, продемонстрировали зависимое от дозы повышение активности FVIII, причем четыре пациента, которых лечили дозой 3×10¹³ вг/кг, достигли нормальных уровней FVIII

[00135] Восемь пациентов, описанных в примере 6, наблюдали в течение большего периода времени, и дополнительных двух пациентов (пациенты 9 и 10) включали в испытание в дозе 3×10¹³ вг/кг. На фиг.4 и 5 проиллюстрирована активность FVIII у всех десяти пациентов с течением времени после введения вектора.

[00136] По мере повышения дозы спонтанные эпизоды кровотечения исчезают и не было описано эпизода кровотечения для какого-либо из пациентов с высокой дозой. См., фиг.6. Применение FVIII после периода приблизительно 3 недели после инъекции сокращалось до нуля для одного пациента в группе 3 (1×10¹³ вг/кг) и у всех пациентов в группе высокой дозы (3×10¹³ вг/кг). Пациенту 9 проводили последнюю инфузию через 3 недели и 2 суток, но не проводили инфузию после этого. См., фиг.7 (звездочка обозначает инфузию, проведенную на 2 суток позже, чем через 3 недели).

[00137] На фиг.8-10 обобщенно представлены данные о неблагоприятных явлениях в клиническом испытании.

[00138] Все патенты, патентные заявки и публикации, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.

[00139] Хотя изобретение описано в некоторых деталях посредством иллюстраций и примеров для цели ясности понимания, специалистам в данной области будет понятно, что различные изменения и модификации можно применят на практике без отклонения от сущности или объема настоящего изобретения. Таким образом, вышеуказанное описание и примеры не следует истолковывать как ограничивающие.

--->

СПИСОК ПОЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> SANGAMO THERAPEUTICS, INC.

<120> УЛУЧШЕНИЕ КЛИНИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ПОСРЕДСТВОМ ЭКСПРЕССИИ ФАКТОРА VIII

<130> 1147465

<140>

<141>

<150> 62/869,445

<151> 2019-07-01

<150> 62/826,887

<151> 2019-03-29

<150> 62/714,553

<151> 2018-08-03

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1457

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe

1 5 10 15

Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser

20 25 30

Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg

35 40 45

Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val

50 55 60

Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile

65 70 75 80

Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln

85 90 95

Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser

100 105 110

His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser

115 120 125

Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp

130 135 140

Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu

145 150 155 160

Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser

165 170 175

Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile

180 185 190

Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr

195 200 205

Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly

210 215 220

Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp

225 230 235 240

Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr

245 250 255

Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val

260 265 270

Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile

275 280 285

Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser

290 295 300

Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met

305 310 315 320

Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His

325 330 335

Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro

340 345 350

Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp

355 360 365

Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser

370 375 380

Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr

385 390 395 400

Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro

405 410 415

Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn

420 425 430

Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met

435 440 445

Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu

450 455 460

Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu

465 470 475 480

Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro

485 490 495

His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys

500 505 510

Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe

515 520 525

Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp

530 535 540

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg

545 550 555 560

Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu

565 570 575

Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val

580 585 590

Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu

595 600 605

Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp

610 615 620

Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val

625 630 635 640

Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp

645 650 655

Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe

660 665 670

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr

675 680 685

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro

690 695 700

Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly

705 710 715 720

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp

725 730 735

Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys

740 745 750

Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu

755 760 765

Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln

770 775 780

Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu

785 790 795 800

Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe

805 810 815

Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp

820 825 830

Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln

835 840 845

Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr

850 855 860

Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His

865 870 875 880

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile

885 890 895

Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser

900 905 910

Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg

915 920 925

Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val

930 935 940

Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp

945 950 955 960

Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu

965 970 975

Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His

980 985 990

Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe

995 1000 1005

Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn

1010 1015 1020

Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys

1025 1030 1035

Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr

1040 1045 1050

Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr

1055 1060 1065

Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe

1070 1075 1080

Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met

1085 1090 1095

Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met

1100 1105 1110

Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly

1115 1120 1125

Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser

1130 1135 1140

Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg

1145 1150 1155

Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro

1160 1165 1170

Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser

1175 1180 1185

Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro

1190 1195 1200

Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe

1205 1210 1215

Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp

1220 1225 1230

Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu

1235 1240 1245

Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn

1250 1255 1260

Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro

1265 1270 1275

Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly

1280 1285 1290

Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys

1295 1300 1305

Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn

1310 1315 1320

Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln

1325 1330 1335

Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu

1340 1345 1350

Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val

1355 1360 1365

Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys

1370 1375 1380

Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu

1385 1390 1395

Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp

1400 1405 1410

Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr

1415 1420 1425

Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala

1430 1435 1440

Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr

1445 1450 1455

<210> 2

<211> 84

<212> ДНК

<213> Неизвестная

<220>

<223> Описание неизвестной последовательности:

последовательность энхансера SERPIN1

<400> 2

gggggaggct gctggtgaat attaaccaag atcaccccag ttaccggagg agcaaacagg 60

gactaagttc acacgcgtgg tacc 84

<210> 3

<211> 223

<212> ДНК

<213> Неизвестная

<220>

<223> Описание неизвестной последовательности:

последовательность промотора TTRm

<400> 3

gtctgtctgc acatttcgta gagcgagtgt tccgatactc taatctccct aggcaaggtt 60

catatttgtg taggttactt attctccttt tgttgactaa gtcaataatc agaatcagca 120

ggtttggagt cagcttggca gggatcagca gcctgggttg gaaggagggg gtataaaagc 180

cccttcacca ggagaagccg tcacacagat ccacaagctc ctg 223

<210> 4

<211> 4374

<212> ДНК

<213> Неизвестная

<220>

<223> Описание неизвестной последовательности:

кодирующая последовательность для FVIII

<400> 4

atgcagatcg agctctccac ctgcttcttt ctgtgcctgt tgagattctg cttcagcgcc 60

accaggagat actacctggg ggctgtggag ctgagctggg actacatgca gtctgacctg 120

ggggagctgc ctgtggatgc caggttcccc cccagagtgc ccaagagctt ccccttcaac 180

acctctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttca ctgaccacct gttcaacatt 240

gccaagccca ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccca ccatccaggc tgaggtgtat 300

gacactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccacc ctgtgagcct gcatgctgtg 360

ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgaccagac cagccagagg 420

gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccaca cctatgtgtg gcaggtgctg 480

aaggagaatg gccccatggc ctctgacccc ctgtgcctga cctacagcta cctgagccat 540

gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag 600

ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagt tcatcctgct gtttgctgtg 660

tttgatgagg gcaagagctg gcactctgaa accaagaaca gcctgatgca ggacagggat 720

gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtga atggctatgt gaacaggagc 780

ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtact ggcatgtgat tggcatgggc 840

accacccctg aggtgcacag catcttcctg gagggccaca ccttcctggt caggaaccac 900

aggcaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctga ctgcccagac cctgctgatg 960

gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagcc accagcatga tggcatggag 1020

gcctatgtga aggtggacag ctgccctgag gagccccagc tgaggatgaa gaacaatgag 1080

gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgaga tggatgtggt gaggtttgat 1140

gatgacaaca gccccagctt catccagatc aggtctgtgg ccaagaagca ccccaagacc 1200

tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggact atgcccccct ggtgctggcc 1260

cctgatgaca ggagctacaa gagccagtac ctgaacaatg gcccccagag gattggcagg 1320

aagtacaaga aggtcaggtt catggcctac actgatgaaa ccttcaagac cagggaggcc 1380

atccagcatg agtctggcat cctgggcccc ctgctgtatg gggaggtggg ggacaccctg 1440

ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccctacaaca tctaccccca tggcatcact 1500

gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cccaaggggg tgaagcacct gaaggacttc 1560

cccatcctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactg tgactgtgga ggatggcccc 1620

accaagtctg accccaggtg cctgaccaga tactacagca gctttgtgaa catggagagg 1680

gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgct acaaggagtc tgtggaccag 1740

aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcc tgttctctgt gtttgatgag 1800

aacaggagct ggtacctgac tgagaacatc cagaggttcc tgcccaaccc tgctggggtg 1860

cagctggagg accctgagtt ccaggccagc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtg 1920

tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctactggta catcctgagc 1980

attggggccc agactgactt cctgtctgtg ttcttctctg gctacacctt caagcacaag 2040

atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cccttctctg gggagactgt gttcatgagc 2100

atggagaacc ctggcctgtg gattctgggc tgccacaact ctgacttcag gaacaggggc 2160

atgactgccc tgctgaaagt ctccagctgt gacaagaaca ctggggacta ctatgaggac 2220

agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaaca atgccattga gcccaggagc 2280

ttcagccaga atccacccgt ccttaagcgc catcagcgcg agatcaccag gaccaccctg 2340

cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gacaccatct ctgtggagat gaagaaggag 2400

gactttgaca tctacgacga ggacgagaac cagagcccca ggagcttcca gaagaagacc 2460

aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgag cagcagcccc 2520

catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc tctgtgcccc agttcaagaa ggtggtgttc 2580

caggagttca ctgatggcag cttcacccag cccctgtaca gaggggagct gaatgagcac 2640

ctgggcctgc tgggccccta catcagggct gaggtggagg acaacatcat ggtgaccttc 2700

aggaaccagg ccagcaggcc ctacagcttc tacagcagcc tgatcagcta tgaggaggac 2760

cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagc ccaatgaaac caagacctac 2820

ttctggaagg tgcagcacca catggccccc accaaggatg agtttgactg caaggcctgg 2880

gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcact ctggcctgat tggccccctg 2940

ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct gcccatggca ggcaggtgac tgtgcaggag 3000

tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgaa accaagagct ggtacttcac tgagaacatg 3060

gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc cagatggagg accccacctt caaggagaac 3120

tacaggttcc atgccatcaa tggctacatc atggacaccc tgcctggcct ggtgatggcc 3180

caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatgggca gcaatgagaa catccacagc 3240

atccacttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggccctg 3300

tacaacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgc tgcccagcaa ggctggcatc 3360

tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctg gcatgagcac cctgttcctg 3420

gtgtacagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcct ctggccacat cagggacttc 3480

cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggccccca agctggccag gctgcactac 3540

tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagcccttca gctggatcaa ggtggacctg 3600

ctggccccca tgatcatcca tggcatcaag acccaggggg ccaggcagaa gttcagcagc 3660

ctgtacatca gccagttcat catcatgtac agcctggatg gcaagaagtg gcagacctac 3720

aggggcaaca gcactggcac cctgatggtg ttctttggca atgtggacag ctctggcatc 3780

aagcacaaca tcttcaaccc ccccatcatt gccagataca tcaggctgca ccccacccac 3840

tacagcatca ggagcaccct gaggatggag ctgatgggct gtgacctgaa cagctgcagc 3900

atgcccctgg gcatggagag caaggccatc tctgatgccc agatcactgc cagcagctac 3960

ttcaccaaca tgtttgccac ctggagcccc agcaaggcca ggctgcatct gcagggcagg 4020

agcaatgcct ggaggcccca ggtcaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag 4080

aagaccatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtga agagcctgct gaccagcatg 4140

tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatggcc accagtggac cctgttcttc 4200

cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aaccaggaca gcttcacccc tgtggtgaac 4260

agcctggacc cccccctgct gaccagatac ctgaggattc acccccagag ctgggtgcac 4320

cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggccc aggacctgta ctga 4374

<210> 5

<211> 4894

<212> ДНК

<213> Неизвестная

<220>

<223> Описание неизвестной последовательности:

последовательность экспрессирующей кассеты

<400> 5

gcggcctaag cttggaacca ttgccacctt cagggggagg ctgctggtga atattaacca 60

agatcacccc agttaccgga ggagcaaaca gggactaagt tcacacgcgt ggtaccgtct 120

gtctgcacat ttcgtagagc gagtgttccg atactctaat ctccctaggc aaggttcata 180

tttgtgtagg ttacttattc tccttttgtt gactaagtca ataatcagaa tcagcaggtt 240

tggagtcagc ttggcaggga tcagcagcct gggttggaag gagggggtat aaaagcccct 300

tcaccaggag aagccgtcac acagatccac aagctcctga agaggtaagg gtttaagtta 360

tcgttagttc gtgcaccatt aatgtttaat tacctggagc acctgcctga aatcattttt 420

ttttcaggtt ggctagtatg cagatcgagc tctccacctg cttctttctg tgcctgttga 480

gattctgctt cagcgccacc aggagatact acctgggggc tgtggagctg agctgggact 540

acatgcagtc tgacctgggg gagctgcctg tggatgccag gttccccccc agagtgccca 600

agagcttccc cttcaacacc tctgtggtgt acaagaagac cctgtttgtg gagttcactg 660

accacctgtt caacattgcc aagcccaggc ccccctggat gggcctgctg ggccccacca 720

tccaggctga ggtgtatgac actgtggtga tcaccctgaa gaacatggcc agccaccctg 780

tgagcctgca tgctgtgggg gtgagctact ggaaggcctc tgagggggct gagtatgatg 840

accagaccag ccagagggag aaggaggatg acaaggtgtt ccctgggggc agccacacct 900

atgtgtggca ggtgctgaag gagaatggcc ccatggcctc tgaccccctg tgcctgacct 960

acagctacct gagccatgtg gacctggtga aggacctgaa ctctggcctg attggggccc 1020

tgctggtgtg cagggagggc agcctggcca aggagaagac ccagaccctg cacaagttca 1080

tcctgctgtt tgctgtgttt gatgagggca agagctggca ctctgaaacc aagaacagcc 1140

tgatgcagga cagggatgct gcctctgcca gggcctggcc caagatgcac actgtgaatg 1200

gctatgtgaa caggagcctg cctggcctga ttggctgcca caggaagtct gtgtactggc 1260

atgtgattgg catgggcacc acccctgagg tgcacagcat cttcctggag ggccacacct 1320

tcctggtcag gaaccacagg caggccagcc tggagatcag ccccatcacc ttcctgactg 1380

cccagaccct gctgatggac ctgggccagt tcctgctgtt ctgccacatc agcagccacc 1440

agcatgatgg catggaggcc tatgtgaagg tggacagctg ccctgaggag ccccagctga 1500

ggatgaagaa caatgaggag gctgaggact atgatgatga cctgactgac tctgagatgg 1560

atgtggtgag gtttgatgat gacaacagcc ccagcttcat ccagatcagg tctgtggcca 1620

agaagcaccc caagacctgg gtgcactaca ttgctgctga ggaggaggac tgggactatg 1680

cccccctggt gctggcccct gatgacagga gctacaagag ccagtacctg aacaatggcc 1740

cccagaggat tggcaggaag tacaagaagg tcaggttcat ggcctacact gatgaaacct 1800

tcaagaccag ggaggccatc cagcatgagt ctggcatcct gggccccctg ctgtatgggg 1860

aggtggggga caccctgctg atcatcttca agaaccaggc cagcaggccc tacaacatct 1920

acccccatgg catcactgat gtgaggcccc tgtacagcag gaggctgccc aagggggtga 1980

agcacctgaa ggacttcccc atcctgcctg gggagatctt caagtacaag tggactgtga 2040

ctgtggagga tggccccacc aagtctgacc ccaggtgcct gaccagatac tacagcagct 2100

ttgtgaacat ggagagggac ctggcctctg gcctgattgg ccccctgctg atctgctaca 2160

aggagtctgt ggaccagagg ggcaaccaga tcatgtctga caagaggaat gtgatcctgt 2220

tctctgtgtt tgatgagaac aggagctggt acctgactga gaacatccag aggttcctgc 2280

ccaaccctgc tggggtgcag ctggaggacc ctgagttcca ggccagcaac atcatgcaca 2340

gcatcaatgg ctatgtgttt gacagcctgc agctgtctgt gtgcctgcat gaggtggcct 2400

actggtacat cctgagcatt ggggcccaga ctgacttcct gtctgtgttc ttctctggct 2460

acaccttcaa gcacaagatg gtgtatgagg acaccctgac cctgttcccc ttctctgggg 2520

agactgtgtt catgagcatg gagaaccctg gcctgtggat tctgggctgc cacaactctg 2580

acttcaggaa caggggcatg actgccctgc tgaaagtctc cagctgtgac aagaacactg 2640

gggactacta tgaggacagc tatgaggaca tctctgccta cctgctgagc aagaacaatg 2700

ccattgagcc caggagcttc agccagaatc cacccgtcct taagcgccat cagcgcgaga 2760

tcaccaggac caccctgcag tctgaccagg aggagattga ctatgatgac accatctctg 2820

tggagatgaa gaaggaggac tttgacatct acgacgagga cgagaaccag agccccagga 2880

gcttccagaa gaagaccagg cactacttca ttgctgctgt ggagaggctg tgggactatg 2940

gcatgagcag cagcccccat gtgctgagga acagggccca gtctggctct gtgccccagt 3000

tcaagaaggt ggtgttccag gagttcactg atggcagctt cacccagccc ctgtacagag 3060

gggagctgaa tgagcacctg ggcctgctgg gcccctacat cagggctgag gtggaggaca 3120

acatcatggt gaccttcagg aaccaggcca gcaggcccta cagcttctac agcagcctga 3180

tcagctatga ggaggaccag aggcaggggg ctgagcccag gaagaacttt gtgaagccca 3240

atgaaaccaa gacctacttc tggaaggtgc agcaccacat ggcccccacc aaggatgagt 3300

ttgactgcaa ggcctgggcc tacttctctg atgtggacct ggagaaggat gtgcactctg 3360

gcctgattgg ccccctgctg gtgtgccaca ccaacaccct gaaccctgcc catggcaggc 3420

aggtgactgt gcaggagttt gccctgttct tcaccatctt tgatgaaacc aagagctggt 3480

acttcactga gaacatggag aggaactgca gggccccctg caacatccag atggaggacc 3540

ccaccttcaa ggagaactac aggttccatg ccatcaatgg ctacatcatg gacaccctgc 3600

ctggcctggt gatggcccag gaccagagga tcaggtggta cctgctgagc atgggcagca 3660

atgagaacat ccacagcatc cacttctctg gccatgtgtt cactgtgagg aagaaggagg 3720

agtacaagat ggccctgtac aacctgtacc ctggggtgtt tgagactgtg gagatgctgc 3780

ccagcaaggc tggcatctgg agggtggagt gcctgattgg ggagcacctg catgctggca 3840

tgagcaccct gttcctggtg tacagcaaca agtgccagac ccccctgggc atggcctctg 3900

gccacatcag ggacttccag atcactgcct ctggccagta tggccagtgg gcccccaagc 3960

tggccaggct gcactactct ggcagcatca atgcctggag caccaaggag cccttcagct 4020

ggatcaaggt ggacctgctg gcccccatga tcatccatgg catcaagacc cagggggcca 4080

ggcagaagtt cagcagcctg tacatcagcc agttcatcat catgtacagc ctggatggca 4140

agaagtggca gacctacagg ggcaacagca ctggcaccct gatggtgttc tttggcaatg 4200

tggacagctc tggcatcaag cacaacatct tcaacccccc catcattgcc agatacatca 4260

ggctgcaccc cacccactac agcatcagga gcaccctgag gatggagctg atgggctgtg 4320

acctgaacag ctgcagcatg cccctgggca tggagagcaa ggccatctct gatgcccaga 4380

tcactgccag cagctacttc accaacatgt ttgccacctg gagccccagc aaggccaggc 4440

tgcatctgca gggcaggagc aatgcctgga ggccccaggt caacaacccc aaggagtggc 4500

tgcaggtgga cttccagaag accatgaagg tgactggggt gaccacccag ggggtgaaga 4560

gcctgctgac cagcatgtat gtgaaggagt tcctgatcag cagcagccag gatggccacc 4620

agtggaccct gttcttccag aatggcaagg tgaaggtgtt ccagggcaac caggacagct 4680

tcacccctgt ggtgaacagc ctggaccccc ccctgctgac cagatacctg aggattcacc 4740

cccagagctg ggtgcaccag attgccctga ggatggaggt gctgggctgt gaggcccagg 4800

acctgtactg aggatccaat aaaatatctt tattttcatt acatctgtgt gttggttttt 4860

tgtgtgtttt cctgtaacga tcgggctcga gcgc 4894

<210> 6

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер

<400> 6

ggagatgaag aaggaggact ttg 23

<210> 7

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический зонд

<400> 7

acatctacga cgaggacgag aacca 25

<210> 8

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер

<400> 8

tccacagcag caatgaagta g 21

<210> 9

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер

<400> 9

cctgggccag ttcctgct 18

<210> 10

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический зонд

<400> 10

ttctgccaca tcagcagcca cca 23

<210> 11

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер

<400> 11

ggcctccatg ccatcatg 18

<210> 12

<211> 130

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 12

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct 130

<210> 13

<211> 108

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 13

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcag 108

<210> 14

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 14

Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe

1 5 10 15

Cys Phe Ser

<---

Claims (24)

1. Способ увеличения уровня белка фактора VIII (FVIII) у человека с гемофилией А, включающий внутривенное введение человеку одной или более доз от 5×10¹² до 5×10¹³ вг/кг вектора на основе аденовирус-ассоциированного вируса (AAV), который кодирует белок FVIII, где

вектор на основе AAV содержит экспрессирующую кассету, которая кодирует белок FVIII, содержащий SEQ ID NO: 1, и где экспрессирующая кассета дополнительно содержит

последовательность энхансера, содержащую SEQ ID NO: 2,

последовательность промотора, содержащую SEQ ID NO: 3,

первую последовательность инсулятора, содержащую нуклеотиды 14-32 SEQ ID NO: 5,

вторую последовательность инсулятора, содержащую нуклеотиды 4869-4885 SEQ ID NO: 5, и

введение вектора на основе AAV приводит к повышению уровня активности циркулирующего FVIII.

2. Способ повышения уровня белка фактора VIII (FVIII) у человека с гемофилией А, включающий внутривенное введение человеку одной или более доз от 5×10¹² до 5×10¹³ вг/кг вектора на основе аденовирус-ассоциированного вируса (AAV), который кодирует белок FVIII, где

вектор на основе AAV содержит экспрессирующую кассету, которая кодирует белок FVIII, содержащий SEQ ID NO: 1, и где экспрессирующая кассета дополнительно содержит

последовательность энхансера, содержащую SEQ ID NO: 2,

последовательность промотора, содержащую SEQ ID NO: 3,

первую последовательность инсулятора, содержащую нуклеотиды 14-32 SEQ ID NO: 5,

вторую последовательность инсулятора, содержащую нуклеотиды 4869-4885 SEQ ID NO: 5, и

введение вектора на основе AAV приводит к уменьшению количества введений FVIII, которые проводят человеку.

3. Способ по п. 1 или 2, где введение приводит к одному или нулю случаев возникновения эпизодов кровотечения у человека в течение 3-12 месяцев после введения.

4. Способ по п. 1 или 2, включающий введение одной или более доз от 1×10¹³ вг/кг до 3×10¹³ вг/кг.

5. Способ по п. 1 или 2, включающий введение одной или более доз от 2×10¹³ вг/кг до 4×10¹³ вг/кг.

6. Способ по п. 1 или 2, включающий введение одной или более доз 3×10¹³ вг/кг.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где экспрессирующая кассета содержит SEQ ID NO:5.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где вектор на основе AAV содержит последовательность 5’-инвертированного концевого повтора (ITR) AAV2 и последовательность 3’-ITR AAV2, которые фланкируют экспрессирующую кассету.

9. Способ по п. 8, где 5’-ITR AAV2 содержит SEQ ID NO: 12 и/или 3’-ITR AAV2 содержит SEQ ID NO: 13.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где вектор на основе AAV имеет серотип AAV6.

11. Способ по любому из пп. 2-10, где человеку не проводят никакого введения FVIII в течение 3-12 месяцев после введения вектора на основе AAV.

12. Способ по любому из пп. 1-11, где вектор на основе AAV вводят внутривенно в портальную вену человека.

Images