TW202045534A - 使用編碼表現增加之重組fix變異體之病毒載體的b型血友病基因療法 - Google Patents

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Abstract

本揭示案尤其提供用於在哺乳動物細胞中表現的編碼第IX因子變異體之密碼子改變之聚核苷酸。在一些實施例中，本揭示案亦提供哺乳動物基因療法載體及用於治療B型血友病之方法。在一些實施例中，本揭示案提供用於向B型血友病患者給與編碼第IX因子多肽之聚核苷酸，例如密碼子改變之聚核苷酸的方法。

Description

使用編碼表現增加之重組FIX變異體之病毒載體的B型血友病基因療法
血液凝結經由相互依賴之生物化學反應之複雜及動態生物路徑而繼續進行，該生物路徑稱作凝血級聯。第VIII凝血因子(FVIII)及第IX因子(FIX)為該級聯中之關鍵組分。第VIII因子募集至出血部位，且與經活化之第IX因子及第X因子(FX)形成Xase複合物。Xase複合物活化FX，FX繼而將凝血酶原活化為凝血酶，凝血酶接著活化凝血級聯中之其他組分以產生穩定凝塊(Saenko等人,Trends Cardiovasc. Med ., 9:185-192 (1999)；Lenting等人,Blood , 92:3983-3996 (1998)中評述)。
B型血友病為以第IX因子活性之缺乏為特徵之先天性X連鎖出血病症。一般而言，減小之第VIII因子/第IX因子活性抑制凝血級聯中之正向反饋迴路。此導致不完全凝血，該不完全凝血表現為持續時間增加之出血事件、廣泛瘀血、自發性口鼻出血、關節僵直及慢性疼痛，及在嚴重情況下可能發生之內出血及貧血。(Zhang等人,Clinic. Rev. Allerg. Immunol. , 37:114-124 (2009))。
B型血友病常規藉由第IX因子置換療法治療，該置換療法由向患有B型血友病之個體投與第IX因子蛋白(例如源自血漿或重組產生之第IX因子)組成。預防性地投與第IX因子以對急性出血事件作出反應而預防或減少出血事件之頻率，及/或術前投與以控制在手術期間之出血。然而，第IX因子置換療法存在若干不合需要之特徵。
第一，第IX因子置換療法用於治療或控制B型血友病，但不治癒潛在第IX因子缺乏。由於此原因，患有B型血友病之個體需要第IX因子置換療法持續終身。連續治療為昂貴的且需要個體維持嚴格順應性，此係因為僅錯失數個預防劑量可能對患有重度B型血友病之個體具有嚴重後果。
第二，因為常規第IX因子產品具有約24小時之相對較短活體內半衰期，所以預防性第IX因子置換療法需要每週投與兩次或三次。此對個體在其整個生命中維持順應性造成負擔。儘管第三代「長效」第IX因子藥物可減少投藥頻率，但使用此等藥物之預防性因子FIX置換療法仍需要無限期地每月、每週或更頻繁投藥。舉例而言，使用聚乙二醇化諾那凝血素β (Nonacog beta pegol) [聚乙二醇化重組第IX因子] (諾和諾德(Novo Nordisk)，美國及歐洲監管批准待定)之預防性治療仍需要每週投藥(Collins P.W.等人, Blood, 124(26):3880-86 (2014))。此外，尚未完全瞭解經化學修飾之生物製劑(例如聚乙二醇化多肽)之長期作用。
第三，在高達5%之重度B型血友病患者中，第IX因子置換療法形成抗第IX因子抑制劑抗體，致使療法無效(Osooli及Berntorp, J. Intern. Med., 277(1):1-15 (2015))。不同於可用於治療已發展抗第VIII因子抑制性抗體之A型血友病患者之第VIII因子旁路療法，不存在用於治療B型血友病之第IX因子旁路療法。
第四，第IX因子置換療法為昂貴的，視患者體重而定，每劑在約1,000美元至約3,000美元之範圍內(美國血友病聯盟(Hemophilia Federation of America)線上材料)。因此，每週給藥兩次，第IX因子置換療法每年可花費高達300,000美元。
基因療法對於B型血友病之治療擁有巨大前景，此係因為其將補救功能性第IX因子活性之潛在表現不足(例如歸因於誤義或無義突變)，而非向個體提供第IX因子活性之一次性劑量。由於提供第IX因子之機制相較於第IX因子置換療法之差異，第IX因子基因療法載體之單次投與可向個體提供足夠水準之第IX因子持續數年，甚至更長時間。此降低治療成本且消除對持續患者順應性之需要。
對於B型血友病之第IX因子基因療法治療之概念驗證已有顯示。參見例如Manno C.S.等人, Nat Med., 12(3):342-47 (2006)。然而，關於是否可表現治療有效量之第IX因子持續足夠時間段的問題仍存在。參見例如Giangrande, Semin Thromb Hemost. 42(5):513-17 (2016)。
已作出若干嘗試來構築密碼子最佳化之第IX因子。舉例而言，WO 2006/036502揭示具有ApoE HCR-1增強子及α-1抗胰蛋白酶(AAT)啟動子之密碼子最佳化之第IX因子AAV基因療法載體。類似地，WO 2014/064277及WO 2016/146757揭示包括肝特異性SERPIN調節元件之一或多個複本之密碼子最佳化之第VIII因子及第IX因子AAV基因療法載體。最後，WO 2016/210170揭示具有ApoE HCR-1增強子及α-1抗胰蛋白酶(AAT)啟動子之密碼子最佳化之第IX因子AAV基因療法載體。
因此，需要經改良之第IX因子基因療法構築體及使用經改良之第IX因子基因療法構築體治療B型血友病之方法。舉例而言，需要編碼第IX因子之合成的密碼子改變之核酸，該等核酸更有效地封裝至基因療法載體中且經由基因療法載體遞送。亦需要更有效地表現第IX因子之合成的密碼子改變之核酸。亦需要編碼第IX因子多肽之密碼子改變之核酸，該等第IX因子多肽與野生型第IX因子相比摺疊特性改良、自表現細胞之分泌改良及/或活性增加。此類編碼第IX因子之密碼子改變之核酸允許改良第IX因子缺乏(例如B型血友病)之治療。上述缺乏及與第IX因子缺乏(例如B型血友病)之治療相關聯之其他問題係由所揭示之編碼第IX因子蛋白之密碼子改變之核酸減少或消除。
在一個態樣中，揭示藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注具有編碼第IX因子多肽之密碼子改變之第IX因子聚核苷酸的腺相關病毒(AAV)粒子來治療B型血友病之方法。在一些實施例中，以每公斤人類個體體重2.5x1011 至2x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量投與AAV粒子。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸為核酸組合物，例如本文所述之任何核酸組合物之一部分，且具有與本文所述之CS02、CS03、CS04、CS05或CS06序列具有高度序列一致性之核酸序列。
在一個態樣中，描述編碼第IX因子及第IX因子變異體之核酸組合物(例如密碼子改變之聚核苷酸)。核酸組合物包括與如本文所述之編碼第IX因子之CS02、CS03、CS04、CS05及CS06序列具有高度序列一致性之聚核苷酸。本文所述之核酸組合物提供相對於野生型第IX因子編碼序列增加之第IX因子表現。核酸組合物亦允許增加基於AAV之基因療法病毒體的產生。在一些實施例中，與編碼第IX因子之野生型序列相比，本文所述之核酸組合物具有降低之GC含量及或包括較少之CpG二核苷酸。
在一些實施例中，核酸組合物包括編碼第IX因子之聚核苷酸，其具有與選自CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)、CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)、CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)、CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)、CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)、CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)、CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)、CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)、CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)及CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之所揭示序列具有至少95%序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性)之核苷酸序列。
在一些實施例中，核酸組合物包括編碼第IX因子之聚核苷酸，其具有與編碼第IX因子輕鏈之所揭示序列(例如CS02-LC-NA (SEQ ID NO:42)、CS03-LC-NA (SEQ ID NO:44)、CS04-LC-NA (SEQ ID NO:46)、CS05-LC-NA (SEQ ID NO:48)或CS06-LC-NA (SEQ ID NO:50))及編碼第IX因子重鏈之所揭示序列(例如CS02-HC-NA (SEQ ID NO:41)、CS03-HC-NA (SEQ ID NO:43)、CS04-HC-NA (SEQ ID NO:45)、CS05-HC-NA (SEQ ID NO:47)或CS06-HC-NA (SEQ ID NO:49))具有至少95%序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性)之核苷酸序列。
在一些實施例中，核酸組合物包括編碼第IX因子多肽之聚核苷酸，該第IX因子多肽具有輕鏈、重鏈及將輕鏈之C端連接至重鏈之N端的多肽連接子(例如活化肽)。第IX因子多肽之輕鏈係由第一核苷酸序列編碼，該第一核苷酸序列與CS02-LC-NA (SEQ ID NO:42)、CS03-LC-NA (SEQ ID NO:44)、CS04-LC-NA (SEQ ID NO:46)、CS05-LC-NA (SEQ ID NO:48)及CS06-LC-NA (SEQ ID NO:50)中之一者具有高度序列一致性。第IX因子多肽之重鏈係由第二核苷酸序列編碼，該第二核苷酸序列與CS02-HC-NA (SEQ ID NO:41)、CS03-HC-NA (SEQ ID NO:43)、CS04-HC-NA (SEQ ID NO:45)、CS05-HC-NA (SEQ ID NO:47)及CS06-HC-NA (SEQ ID NO:49)中之一者具有高度序列一致性。多肽連接子包含蛋白酶裂解位點(例如兩個第XIa因子裂解位點)。
在上文所述之聚核苷酸之一些實施例中，多肽連接子具有與野生型第IX因子活化肽FIX-AP-AA (SEQ ID NO:56；FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)之胺基酸192-226)具有高度序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽連接子係由第三核酸序列編碼，該第三核酸序列與CS02-AP-NA (SEQ ID NO:57)、CS03-AP-NA (SEQ ID NO:58)、CS04-AP-NA (SEQ ID NO:59)、CS05-AP-NA (SEQ ID NO:60)及CS06-AP-NA (SEQ ID NO:61)中之一者具有高度序列一致性。
在一些實施例中，本文所述之密碼子改變之聚核苷酸編碼前原第IX因子多肽，例如，其中經編碼之第IX因子蛋白包括信號肽及原肽。在一些實施例中，信號肽、原肽或信號肽與原肽兩者係由密碼子改變之序列編碼。在一些實施例中，信號肽、原肽或信號肽與原肽兩者係由野生型序列編碼，而編碼成熟第IX因子單鏈多肽(例如FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)；FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)之胺基酸47-461)之核酸部分經密碼子改變。
在某個實施例中，本文所述之密碼子改變之聚核苷酸編碼第IX因子變異體多肽，例如，關於野生型第IX因子胺基酸序列(例如FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)或FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10))具有一或多個胺基酸取代。在一些實施例中，第IX因子變異體為與野生型第IX因子相比具有增加之第IX因子活性的超活性第IX因子變異體。在特定實施例中，經編碼之第IX因子多肽具有『Padua』 R384L胺基酸取代(相對於第IX因子前原多肽序列FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)，相對於成熟第IX因子單鏈序列FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)之R338L胺基酸取代)。
在一個態樣中，描述用於治療B型血友病之方法。該等方法包括向有需要之患者投與本文所述之核酸組合物(例如密碼子改變之第IX因子聚核苷酸構築體) (例如與CS02、CS03、CS04、CS05或CS06第IX因子編碼序列具有高度序列一致性之聚核苷酸)。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸構築體為如本文所述之哺乳動物基因療法載體。在特定實施例中，第IX因子聚核苷酸構築體為腺相關病毒(AAV)載體。在一些實施例中，基因療法載體包括肝特異性調控元件之一或多個複本(例如CRM8調控元件之1至3個複本)。
在一個態樣中，描述用於產生腺相關病毒(AAV)粒子之方法。該方法包括將本文所述之核酸組合物(例如密碼子改變之第IX因子聚核苷酸構築體) (例如與CS02、CS03、CS04、CS05或CS06第IX因子編碼序列具有高度序列一致性之聚核苷酸)引入哺乳動物宿主細胞中，其中聚核苷酸能夠在哺乳動物宿主細胞中複製。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2019年2月1日申請之美國臨時專利申請案第62/800,338號之優先權，該臨時專利申請案之揭示內容出於所有目的藉此以全文引用之方式併入本文中。I. 引言
基於AAV之基因療法對於血友病之治療擁有巨大前景。對於B型血友病，約10%之FIX水準可在至少一些患者中維持長於1年之第一臨床資料為令人鼓舞的。舉例而言，在初始人類試驗中展示AVV-FIX構築體之肝動脈插管引起活體內第IX因子之短暫表現。Kay M.等人, Nat Genet. 24(3):257-61 (2000)。然而，轉導引起針對源自AAV之衣殼抗原之免疫系統的適度活化。Manno C.S.等人, Nat Med. 12(3):342-47 (2006)及Mingozzi F.等人, Nat Med. 13(4):419-22 (2007)。
因為非病毒載體係基於裸DNA或與非抗原性運載體(例如惰性聚合物、脂質或奈米粒子)相關聯之DNA的遞送，所以該等非病毒載體可具有較小免疫原性。然而，非病毒載體之細胞轉染率低於病毒遞送載體之彼等細胞轉染率。另外，自非病毒載體之長期表現因用於大規模產生構築體之細菌序列的存在而受阻。因此，需要用以改良FIX表現之策略以使FIX基因療法成為用於B型血友病患者之可行治療選項。
因此，支持改良之第IX因子表現及活性之經改良第IX因子多肽構築體將改良兩種治療方法。舉例而言，病毒遞送方法將藉由減小構築體之初始劑量，從而減少個體之免疫系統之刺激來改良。依賴於投與裸DNA之方法將藉由用治療性聚核苷酸之較少複本支持較大第IX因子活性來改良。
本揭示案係關於發現密碼子改變之第IX因子變異體編碼序列，其解決與第IX因子基因療法相關聯之此等及其他問題。舉例而言，本文所揭示之聚核苷酸提供哺乳動物宿主中明顯改良之第IX因子表現及活性。在一些實施中，藉由使用與密碼子改變之CS02、CS03、CS04、CS05及CS06構築體具有高度序列一致性之第IX因子編碼聚核苷酸來實現此等優點。在一些實施例中，如下文更全面描述，此等序列包括與野生型構築體相比顯著較少之CpG二核苷酸。
有利地，本文所述之CS02、CS03、CS04、CS05及CS06密碼子改變之第IX因子序列與等效野生型序列相比提供活體內優異之第IX因子表現。舉例而言，實例1顯示，相對於運載野生型第IX因子編碼序列之自身互補AAV載體，運載CS02、CS03、CS04、CS05或CS06密碼子改變之第IX因子(R384L)編碼序列之自身互補AAV載體提供活體內第IX因子活性之20倍至40倍增加。類似地，相對於運載野生型第IX因子(R384L)編碼序列之自身互補AAV載體，觀察到第IX因子表現之2倍至4倍增加(表2)。
有利地，自CS02、CS03、CS04、CS05及CS06密碼子改變之序列產生的改良之第IX因子活性可藉由在第IX因子編碼序列上游引入肝特異性調節元件之一或多個複本而進一步增強。舉例而言，如實例2及3中所展示，在自身互補AAV第IX因子載體中包括一或多個肝特異性CRM8調控元件使第IX因子表現在小鼠模型中進一步增加2倍至3倍且在人類肝細胞中進一步增加2倍至13倍(分別為表3及表4)。同樣地，在單股AAV第IX因子載體中包括肝特異性CRM8調控元件之一或多個複本使第IX因子活性在活體內增加2倍(小鼠模型；表5)且在人類肝細胞中增加高達26倍(表6)。
令人驚訝地，儘管編碼缺乏肝特異性CRM8調控元件之密碼子改變之第IX因子多肽的自身互補AAV載體提供第IX因子表現相比類似單股AAV載體之更大增加(將表6中由CS06-CRM.0-scV提供之FIX活性之6.2倍增加與由CS06-CRM.0-ssV (SEQ ID NO:40)提供之第IX因子活性之3.9倍增加相比較)，但含有肝特異性CRM8調控元件之多個複本之單股AAV第IX因子載體顯著優於類似自身互補AAV載體(將表4中由CS02-CRM8.3-scV提供之第IX因子活性相對於CS02-CRM8.0-scV之12.8倍增加與表6中由CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO:40)提供之第IX因子活性相對於CS06-CRM8.0-scV之16.8倍增加相比較)。II. 定義
除非另有規定，否則如本文所用，以下術語具有賦予其之含義。
如本文所用，術語「第IX因子」及「FIX」 (其中「IX」係指羅馬數字以意指「九」)可互換使用，且係指具有第IX因子活性之任何蛋白質(例如活性FIX，常稱作「FIXa」)或具有第IX因子活性之蛋白質的蛋白質前驅體(例如原蛋白或前原蛋白，常稱作pFIX及ppFIX)，該活性尤其為在第VIII因子存在下之第X因子裂解活性，例如，如使用歐洲藥典9.0 (European Pharmacopoeia 9.0)之第2.7.11章中所述之一期第IX因子凝集檢定所量測，其內容藉此以引用之方式併入。
第IX因子轉譯為包括信號肽、原肽、輕鏈、活化肽及重鏈之非活性單鏈多肽，常稱作第IX因子前原多肽。第IX因子前原肽經歷轉譯後加工以形成活性第IX因子蛋白(例如FIXa)。此加工包括移除(例如藉由裂解)信號肽，繼而移除(例如藉由裂解)原肽，以形成含有第IX因子輕鏈及第IX因子重鏈之單鏈成熟第IX因子多肽，其仍為非活性的。成熟第IX因子多肽進一步裂解以切除第IX因子輕鏈與第IX因子重鏈之間的活化肽，形成活性第IX因子蛋白(例如FIXa)。第IX因子輕鏈及第IX因子輕鏈保持經二硫鍵締合。
舉例而言，野生型人類第IX因子前原蛋白首先裂解以釋放經編碼之信號肽(FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)之胺基酸1-28)，形成第一單鏈原蛋白。此單鏈原肽接著裂解以釋放原肽(FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)之胺基酸29-46)，形成第二單鏈原蛋白(例如FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)，其中「MP」符號代表「成熟蛋白」)。第二單鏈原蛋白接著由第XIa因子在FIX輕鏈與FIX重鏈之間二次裂解，以釋放活化肽(FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)之胺基酸192-226)。此形成由經二硫鍵締合之獨立輕鏈及重鏈組成之活性第IX因子a蛋白。對於第IX因子之結構、功能及活化之額外資訊，參見例如Brandstetter H.等人 P.N.A.S. USA, 92(21):9796-800 (1995)，Hopfner KP等人, Structure, 7(8):989-96 (1999)，及Gailani D.等人, Thromb Res., 133 增刊1:S48-51 (2014)，其內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
如本文所述，此活性第IX因子a蛋白可包括一或多個變異體，其中R338L變異體尤其可用於一些實施例中。此稱作「FIXp-MP-AA」 (SEQ ID NO:12)且核酸序列在本文中稱作「FIXp-MP-NA」；「FIXp」代表在最終蛋白中包括Padua R338L變異體。應注意，本文所例示之密碼子最佳化之序列CS02-CS06編碼FIXp蛋白，包括R338L變異體。因此，FIX之定義中特別包括FIXp。
如本文所用，術語「第IX因子多肽」及「FIX多肽」係指在特定條件下具有第IX因子絲胺酸蛋白酶活性之多肽，例如，如使用歐洲藥典9.0之第2.7.11章中所述之一期第IX因子凝集檢定所量測。第IX因子多肽包括單鏈前驅體多肽(包括第IX因子前原多肽、第IX因子原肽及成熟單鏈第IX因子多肽)，其當藉由上文所述之轉譯後加工而活化時，變成具有第IX因子絲胺酸蛋白酶活性之活性第IX因子蛋白以及活性第IX因子蛋白本身。第IX因子多肽之定義中特別包括包含R338L變異體之第IX因子多肽。在例示性實施例中，人類第IX因子多肽係指包括胺基酸序列之多肽，該胺基酸序列與包括輕鏈及重鏈之野生型人類第IX因子多肽部分FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10，圖11A中所示)或與包括輕鏈及重鏈之padua人類第IX因子多肽部分FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12，圖12中所示)具有高度序列一致性(例如至少85%、90%、95%、99%或更大)。
如本文所用，術語「第IX因子輕鏈」或簡單的「輕鏈」係指經活化之第IX因子a蛋白中來源於第IX因子單鏈多肽之N端部分的多肽，其含有第IX因子之Gla模組、EGF樣1及EGF樣2結構域。在例示性實施例中，人類前原第IX因子多肽(FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2))之胺基酸47-191構成第IX因子輕鏈。如本文所用，野生型第IX因子輕鏈之胺基酸序列稱作FIX-LC-AA (SEQ ID NO:62)。
如本文所用，術語「第IX因子重鏈」或簡單的「重鏈」係指經活化之第IX因子a蛋白中來源於第IX因子單鏈多肽之C端部分的多肽，其含有第IX因子之肽酶S1結構域。在例示性實施例中，人類前原第IX因子多肽(FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2))之胺基酸227-461構成第IX因子重鏈。如本文所用，野生型第IX因子重鏈之胺基酸序列稱作FIX-HC-AA (SEQ ID NO:63)且當包括R338L變異體時稱作FIXp-HC-AA (SEQ ID NO:64)。
一般而言，第IX因子輕鏈及重鏈表現為單一多肽鏈，例如與活化肽一起。然而，在一些實施例中，第IX因子輕鏈及第VIII因子重鏈表現為獨立多肽鏈(例如共表現)，且經重構以形成第IX因子蛋白(例如活體內或試管內)。一般而言，出於本發明之目的，即使獨立地表現兩條鏈，其一般亦在相同表現載體(例如病毒基因組)上，而非不同表現載體上。
如本文所用，術語「第IX因子活化肽」或簡單的「活化肽」係指在第IX因子a蛋白活化後自第IX因子單鏈多肽切除之肽。在例示性實施例中，人類前原第IX因子多肽(FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2))之胺基酸192-226構成第IX因子活化肽。如本文所用，野生型第IX因子活化肽之胺基酸序列稱作FIX-AP-AA (SEQ ID NO:56)。
如本文所用，術語「第IX因子信號肽」或簡單的「信號肽」係指由信號肽酶自第IX因子前原多肽之N端切除之肽。信號肽將新轉譯之第IX因子前原蛋白引導至內質網。在例示性實施例中，人類前原第IX因子多肽(FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2))之胺基酸1-28構成第IX因子信號肽。如本文所用，野生型第IX因子信號肽之胺基酸序列稱作FIX-SP-AA (SEQ ID NO:37)。本發明之許多信號肽示於圖19及圖22中。
如本文所用，術語「第IX因子原肽」或簡單的「原肽」係指由弗林蛋白酶(Furin)自第IX因子原多肽之N端(例如在信號肽裂解後)切除之肽。原肽包括γ-羧化識別位點，該識別位點將羧化酶募集至鄰近Gla模組，從而促進麩醯胺酸殘基之羧化。在例示性實施例中，人類前原第IX因子多肽(FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2))之胺基酸29-46構成第IX因子原肽。如本文所用，野生型第IX因子原肽之胺基酸序列稱作FIX-PP-AA (SEQ ID NO:38)。
如本文所用，術語「第IX因子前原肽」或簡單的「前原肽」係指第IX因子信號肽及原多肽之聚集體。在例示性實施例中，人類前原第IX因子多肽(FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2))之胺基酸1-46構成第IX因子前原肽。如本文所用，野生型第IX因子前原肽之胺基酸序列稱作FIX-PPP-AA (SEQ ID NO:36)且圖18中所示之核酸序列稱作FIX-PPP-NA (SEQ ID NO:18) (當使用R338L變異體時，對應於FIXp-PPP-AA及FIXp-PPP-NA)。
除非本文另有規定，否則第IX因子胺基酸之編號係指全長野生型人類第IX因子前原多肽序列(FIX-FL-AA)中之相應胺基酸，在圖3A中以SEQ ID NO:2呈現。因而，當提及本文所揭示之第IX因子多肽中之胺基酸取代時，所敍述之胺基酸編號係指全長野生型第IX因子前原多肽序列中之類似(例如結構上或功能上等效)及/或同源(例如在主要胺基酸序列中進化上保守)胺基酸。舉例而言，R384L胺基酸取代係指在全長野生型人類第IX因子前原肽序列(FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2))之位置384處之R至L取代、在成熟野生型第IX因子單鏈多肽(FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)之位置338處之R至L取代、在全長野生型人類第IX因子前原肽同功型2序列(FIX2-FL-AA (SEQ ID NO:3))之位置346處之R至L取代、在成熟野生型人類第IX因子前原肽同功型2序列(FIX2-FL-AA (SEQ ID NO:3))之位置300處之R至L取代及在野生型人類第IX因子重鏈序列(FIX-HC-AA (SEQ ID NO:63))之位置158處之R至L取代。因此，所有此等命名描述不同第IX因子構築體中之相同「Padua」胺基酸取代。
如本文所述，第IX因子胺基酸編號系統取決於是否包括第IX因子前原肽(例如全長野生型人類第IX因子序列之胺基酸1-46，包括信號肽及原肽)。在包括前原肽之情況下，編號稱作「包括前原肽」或「PPI」。在不包括前原肽之情況下，編號稱作「排除前原肽」或「PPE」。舉例而言，R384L為與PPE編號中之R338L相同之胺基酸取代的PPI編號。類似地，第IX因子胺基酸編號亦取決於第IX因子同功型。舉例而言，R384L為與同功型2編號中之R346L相同之胺基酸取代的同功型1編號。除非另有指示，否則所有胺基酸編號係指全長野生型人類第IX因子同功型1序列(FIX-FL-AA)中之相應胺基酸，在圖3A中以SEQ ID NO:2呈現。此編號對於除R384L 「Padua」突變以外具有相同胺基酸序列之FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)為一致的。
野生型第IX因子多肽之非限制性實例包括人類前原第IX因子(例如GenBank寄存編號NP_000124.1 (FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2))及NP_001300842.1 (FIX2-FL-AA (SEQ ID NO:3))、缺乏信號肽(前原蛋白之胺基酸1-28)及/或原肽(前原蛋白之胺基酸29-46)之相應單鏈第IX因子，及其天然變異體；豬前原第IX因子(例如UniProt寄存編號P00741)、缺乏信號肽之相應單鏈第IX因子，及其天然變異體；鼠類前原第IX因子(例如UniProt寄存編號P16294)、缺乏信號肽之相應單鏈第IX因子，及其天然變異體；大鼠前原第IX因子(例如UniProt寄存編號P16296)、缺乏信號肽之相應單鏈第IX因子，及其天然變異體；及其他哺乳動物第VIII因子同源物(例如黑猩猩、猿、倉鼠、天竺鼠等)。
如本文所用，第IX因子多肽包括在第VIII因子存在下具有第X因子裂解活性之天然變異體及人工構築體。如本揭示案中所用之第IX因子涵蓋任何天然變異體、替代性序列、同功型或突變體蛋白，其保留一些基礎第IX因子裂解活性(例如相應野生型活性之至少5%、10%、25%、50%、75%或更大，如根據歐洲藥典9.0之第2.7.11章之一期凝集檢定中所檢定，第2.7.11章中之人類凝血第IX因子檢定(Assay of Human Coagulation Factor IX)之教示內容以引用之方式特別併入本文中)。在人類群體中所發現之第IX因子胺基酸變異(相對於FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2))之實例包括但不限於I17N、L20S、C28R、C28Y、V30I、R43L、R43Q、R43W、K45N、R46S、R46T、N48I、S49P、L52S、E53A、E54D、E54G、F55C、G58A、G58E、G58R、E66V、E67K、F71S、E73K、E73V、R75Q、E79D、T84R、Y91C、D93G、Q96P、C97S、P101R、C102R、C102R、G106D、G106S、C108S、D110N、I112S、N113K、Y115C、C119F、C119R、E124K、G125E、G125R、G125V、C134Y、I136T、N138H、G139D、G139S、C155F、G160E、Q167H、S169C、C170F、C178R、C178W、R191C、R191H、R226G、R226Q、R226W、V227D、V227F、V228F、V228L、Q241H、Q241K、C252S、C252Y、G253E、G253R、A265T、C268W、A279T、N283D、E291V、R294G、R294Q、V296M、H302R、N306S、I316F、L318R、L321Q、N328K、N328Y、P333H、P333T、T342K、T342M、I344L、G351D、W356C、G357E、G357R、K362E、G363W、A366D、R379G、R379Q、C382Y、L392F、L383I、R384L、K387E、I390F、M394K、F395I、F395L、C396F、C396S、A397P、R404T、C407R、C407S、D410H、S411G、S411I、G412E、G413R、P414T、V419E、F424V、T426P、S430T、W431G、W431R、G432S、E433A、G433K、C435Y、A436V、G442E、G442R、I443T、R449Q、R449W、Y450C、W453R及I454T。如下文更全面論述，此編號相對於野生型人類FIX。在人類群體中所鑑別之其他胺基酸變異為已知的且可例如使用國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，「NCBI」)變異檢視器，寄存編號GCF_000001405.25找到。第VIII因子蛋白亦包括含有轉譯後修飾之多肽。
本揭示案中尤其使用FIX蛋白，其包括所謂的「Padua」突變，在成熟單股第IX因子蛋白之位置338處之精胺酸至白胺酸變化(R338L)、在第IX因子前原多肽之位置384處之精胺酸至白胺酸變化(R384L)。此突變向FIX蛋白賦予超功能活性。舉例而言，顯示「Padua」蛋白(例如含有R338L突變之第IX因子)在活體內與野生型第IX因子相比活性大5倍至10倍。美國專利第6,531,298號；Simioni P.等人, N Engl J Med. 361(17):1671-75 (2009)，藉此以全文引用之方式併入。因此，本揭示案提供編碼Padua-FIX蛋白，有時稱作「FIXp」或「pFIX」之胺基酸及核酸構築體。
如本文所用，術語「第IX因子聚核苷酸」及「FIX聚核苷酸」係指編碼在特定條件下具有第IX因子絲胺酸蛋白酶活性之第IX因子多肽的聚核苷酸，例如，如使用歐洲藥典9.0之第2.7.11章中所述之一期第IX因子凝集檢定所量測。第IX因子聚核苷酸包括編碼第IX因子單鏈前驅體多肽之聚核苷酸，該等第IX因子單鏈前驅體多肽包括第IX因子前原多肽、第IX因子原肽及成熟單鏈第IX因子多肽，其當藉由上文所述之轉譯後加工而活化時，變成具有第IX因子絲胺酸蛋白酶活性之活性第IX因子蛋白。第IX因子聚核苷酸之定義中特別包括編碼包括R338L變異體之第IX因子多肽的聚核苷酸。在例示性實施例中，人類第IX因子聚核苷酸係指編碼包括胺基酸序列之多肽的聚核苷酸，該胺基酸序列與包括輕鏈及重鏈之野生型人類第IX因子多肽部分FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10，圖11A中所示)或與包括輕鏈及重鏈之padua人類第IX因子多肽部分FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12，圖12中所示)具有高度序列一致性(例如至少85%、90%、95%、99%或更大)。
如本文所述，第IX因子聚核苷酸可包括調節元件，諸如啟動子、增強子、終止子、聚腺苷酸化序列及內含子；以及病毒封裝元件，諸如反向末端重複(「ITR」)；及/或支持非病毒宿主細胞中之聚核苷酸複製之其他元件，例如，支持例如細菌、酵母或哺乳動物宿主細胞中之聚核苷酸增殖之複製子。
本揭示案中尤其使用密碼子改變之第IX因子聚核苷酸。如本文所述，與由天然編碼之第IX因子構築體(例如編碼使用野生型人類密碼子之相同第IX因子胺基酸序列之聚核苷酸)提供之第IX因子表現的水準相比，密碼子改變之FIX聚核苷酸提供活體內基因轉殖第IX因子之表現增加。如本文所用，術語「表現增加」係指與投與天然編碼之第IX因子構築體之動物血液中之基因轉殖第IX因子蛋白的水準相比，投與編碼第IX因子之密碼子改變之聚核苷酸之動物血液中之基因轉殖第IX因子蛋白的水準增加。蛋白質之表現增加引起第IX因子活性之增加；因此，表現增加引起活性增加。
在一些實施例中，表現增加係指與投與天然編碼之第IX因子聚核苷酸之動物血液中之基因轉殖第IX因子多肽的水準相比，投與密碼子改變之第IX因子聚核苷酸之動物血液中之基因轉殖第IX因子多肽至少高25%。出於本揭示案之目的，表現增加係指藉由改變密碼子序列產生之作用，而非由潛在胺基酸取代，例如「Padua」突變引起之超活性。亦即，將自編碼「Padua」第IX因子聚核苷酸之密碼子最佳化之序列獲得之表現水準相對於自天然編碼之「Padua」蛋白獲得之表現水準作比較。在一些實施例中，表現增加係指與投與天然編碼之第IX因子聚核苷酸之動物血液中之基因轉殖第IX因子多肽的水準相比，投與密碼子改變之第IX因子聚核苷酸之動物血液中之基因轉殖第IX因子多肽至少高50%、至少高75%、至少高100%、至少高3倍、至少高4倍、至少高5倍、至少高6倍、至少高7倍、至少高8倍、至少高9倍、至少高10倍、至少高15倍、至少高20倍、至少高25倍、至少高30倍、至少高40倍、至少高50倍、至少高60倍、至少高70倍、至少高80倍、至少高90倍、至少高100倍、至少高125倍、至少高150倍、至少高175倍、至少高200倍、至少高225倍或至少高250倍。動物血液中之第IX因子多肽水準可例如使用特異性地用於第IX因子多肽之ELISA檢定來量測。
「第IX因子活性」或「第IX因子絲胺酸蛋白酶活性」在本文中意指在第VIIIa因子輔因子存在下使第X因子多肽裂解之能力，例如經由野生型第IX因子中之Arg194-Ile195肽鍵水解，由此將第X因子活化為第Xa因子。活性水準可使用此項技術中已知之任何第IX因子活性來量測；適合之檢定概述於本文中；用於確定第IX因子活性之例示性檢定為歐洲藥典9.0之第2.7.11章中所述之一期第IX因子凝集檢定，其用於本文所提供之實例中。在一些實施例中，缺乏FIX活性之人類血漿在一期凝集檢定中用作對照以確定第IX因子特異性。
因為某些第IX因子變異體與野生型第IX因子相比在活體內具有增強之特異活性，例如人類『Padua』變異體相比天然編碼型人類第IX因子具有高5倍至10倍之第IX因子絲胺酸蛋白酶活性，所以在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸組合物之治療潛力係由投與第IX因子聚核苷酸之動物血液中之第IX因子活性增加來評價，例如替代第IX因子表現增加或除第IX因子表現增加以外。在一些實施例中，如本文所用，第IX因子活性增加係指與投與天然編碼之第IX因子聚核苷酸之動物血液中之第IX因子活性相對於投與天然編碼之第IX因子聚核苷酸之前動物血液中之基線第IX因子活性的增加相比，投與密碼子改變之第IX因子聚核苷酸之動物血液中之第IX因子活性相對於投與密碼子改變之第IX因子聚核苷酸之前動物血液中之基線第IX因子活性的增加更高。在一些實施例中，第IX因子活性增加係指與投與天然編碼之第IX因子聚核苷酸之動物血液中之第IX因子活性水準相對於投與天然編碼之第IX因子聚核苷酸之前動物中之基線第IX因子活性水準的增加相比，投與密碼子改變之第IX因子聚核苷酸之動物血液中之第IX因子活性相對於投與密碼子改變之第IX因子聚核苷酸之前動物血液中之基線第IX因子活性水準的增加至少高25%。在一些實施例中，第IX因子活性增加係指與投與天然編碼之第IX因子聚核苷酸之動物血液中之第IX因子活性水準相對於投與天然編碼之第IX因子聚核苷酸之前動物中之基線第IX因子活性水準的增加相比，投與密碼子改變之第IX因子聚核苷酸之動物血液中之第IX因子活性相對於投與密碼子改變之第IX因子聚核苷酸之前動物血液中之基線第IX因子活性水準的增加至少高50%、至少高75%、至少高100%、至少高3倍、至少高4倍、至少高5倍、至少高6倍、至少高7倍、至少高8倍、至少高9倍、至少高10倍、至少高15倍、至少高20倍、至少高25倍、至少高30倍、至少高40倍、至少高50倍、至少高60倍、至少高70倍、至少高80倍、至少高90倍、至少高100倍、至少高125倍、至少高150倍、至少高175倍、至少高200倍、至少高225倍或至少高250倍。如本文所述，活性係使用歐洲藥典9.0之第2.7.11章中所述之一期第IX因子凝集檢定來量測。
如本文所用，術語「血友病」係指廣泛地以血液凝集或凝結減少為特徵之一組疾病病況。血友病可指A型、B型或C型血友病，或指所有三種疾病類型之複合病。A型血友病(Type A hemophilia/hemophilia A)由第VIII因子(FVIII)活性之降低或損失引起且為最主要之血友病亞型。B型血友病(Type B hemophilia/hemophilia B)由第IX因子(FIX)凝集功能之損失或降低引起。C型血友病(Type C hemophilia/hemophilia C)為第XI因子(FXI)凝集活性之損失或降低的結果。A型及B型血友病為X連鎖疾病，而C型血友病為體染色體的。用於血友病之常規治療包括預防性投與及按需投與凝集因子，諸如FVIII、FIX，包括Bebulin®-VH及FXI，以及FEIBA-VH、去氨加壓素(desmopressin)及血漿輸注。
如本文所用，術語「第IX因子基因療法」或「FIX基因療法」包括向患者提供編碼第IX因子之核酸以緩解、減少或預防與第IX因子缺乏(例如B型血友病)相關聯之一或多種症狀(例如臨床因子)復發的任何治療方法。該術語涵蓋投與包含編碼第IX因子分子，包括第IX因子之任何經修飾形式(例如第VIII因子R384L變異體)之核酸的任何化合物、藥物、程序或方案，用於維持或改良具有第IX因子缺乏(例如B型血友病)之個體的健康。熟習此項技術者將瞭解，FIX基因療法之過程或FIX基因療法治療劑之劑量可例如基於根據本揭示案所獲得之結果而變化。
術語「治療有效量或劑量」或「治療足夠量或劑量」或「有效或足夠量或劑量」係指投與其產生治療作用之劑量。舉例而言，適用於治療血友病之藥物之治療有效量可為能夠預防或緩解與血友病相關聯之一或多種症狀的量。
在一些實施例中，治療有效之治療引起受試者之出血事件之頻率及/或嚴重性降低。
如本文所用，術語「基因」係指編碼多肽鏈之DNA分子區段(例如編碼區)。在一些實施例中，基因係由產生多肽鏈(例如調節元件，諸如啟動子、增強子、聚腺苷酸化序列、5'-未轉譯區、3'-未轉譯區或內含子)中所涉及的緊鄰編碼區之前、之後及/或插入編碼區之區域定位。
如本文所用，術語「調節元件」係指提供細胞中之編碼序列之表現的核苷酸序列，諸如啟動子、增強子、終止子、聚腺苷酸化序列、內含子等。
如本文所用，術語「啟動子元件」係指幫助控制編碼序列之表現的核苷酸序列。一般而言，啟動子元件位於基因之轉譯起始位點之5'處。然而，在某些實施例中，啟動子元件可位於內含子序列內或編碼序列之3'處。在一些實施例中，適用於基因療法載體之啟動子來源於靶蛋白之原生基因(例如第VIII因子啟動子)。在一些實施例中，適用於基因療法載體之啟動子特異性地用於靶生物體之特定細胞或組織中之表現(例如肝特異性啟動子)。在其他實施例中，複數個充分特徵化之啟動子元件中之一者用於本文所述之基因療法載體中。充分特徵化之啟動子元件之非限制性實例包括CMV早期啟動子、β-肌動蛋白啟動子及甲基CpG結合蛋白2 (MeCP2)啟動子。在一些實施例中，啟動子為組成型啟動子，其驅動實質上恆定之靶蛋白表現。在其他實施例中，啟動子為可誘導型啟動子，其對特定刺激(例如暴露於特定治療或劑)作出反應而驅動靶蛋白之表現。對於設計用於AAV介導之基因療法之啟動子的評述，參見Gray等人 (Human Gene Therapy 22:1143-53 (2011))，其內容出於所有目的以全文引用之方式明確併入。
如本文所用，「CRM8」元件係指以肝特異性方式增強操作性連接之基因，例如編碼第IX因子多肽之序列之表現的來源於SERPINA1基因(NCBI寄存編號NM_000295.4)之順式作用調節模組，其與SEQ ID NO:39具有高度序列一致性。如本文所用，CRM8元件係指調節元件之單一複本，其在一些實施例中包括於第IX因子聚核苷酸內之一或多個複本，例如1個、2個、3個或更多個複本中。對於CRM元件，諸如CRM8之進一步資訊，參見Chuah MK等人, Mol Ther., 22(9):1605-13 (2014)，其藉此以引用之方式併入。
如本文所用，「MVM內含子」係指來源於小鼠之微小病毒之內含子序列，其與SEQ ID NO:53具有高度序列一致性。對於MVM內含子本身之進一步資訊，參見Haut及Pintel, J Virol. 72(3):1834-43 (1998)，且對於MVM內含子在AAV基因療法載體中之用途，參見Wu Z等人, Mol Ther., 16(2):280-9 (2008)，兩者均藉此以引用之方式併入。
如本文所用，術語「可操作地連接」係指第一參考核苷酸序列(例如基因)與第二核苷酸序列(例如調控元件)之間的關係，其允許第二核苷酸序列影響與第一參考核苷酸序列相關聯之一或多種特性(例如轉錄速率)。在本揭示案之情形中，當調節元件定位於基因療法載體內以使得其對第IX因子轉殖基因之轉錄施加影響(例如促進性或組織選擇性影響)時，調控元件可操作地連接至第IX因子轉殖基因。
如本文所用，術語「載體」係指用於將第IX因子核酸轉移至宿主細胞中之任何核酸構築體。在一些實施例中，載體包括複製子，其發揮功能以複製核酸構築體。適用於基因療法之載體之非限制性實例包括質體、噬菌體、黏接質體、人工染色體及病毒，其在活體內發揮自主複製單位之功能。在一些實施例中，載體為用於將第IX因子核酸引入宿主細胞中之病毒載體。適用於基因療法之許多經修飾之真核病毒在此項技術中為已知的。舉例而言，腺相關病毒(AAV)尤其充分適用於人類基因療法中，此係因為人類為病毒之天然宿主，原生病毒已知不促成任何疾病，且病毒引發輕微免疫反應。
如本文所用，術語「第IX因子病毒載體」係指包含編碼第IX因子多肽之第IX因子聚核苷酸的重組病毒，當引入適合之動物宿主(例如人類)中時其足以用於第IX因子多肽之表現。第IX因子病毒載體之定義內特別包括重組病毒，其中編碼第IX因子多肽之密碼子改變之第IX因子聚核苷酸已插入病毒之基因組中。第IX因子病毒載體之定義內亦特別包括重組病毒，其中病毒之原生基因組已由編碼第IX因子多肽之第IX因子聚核苷酸置換。第IX因子病毒載體之定義內包括重組病毒，其包含編碼第IX因子之「Padua」變異體的第IX因子聚核苷酸。
如本文所用，術語「第IX因子病毒粒子」係指囊封編碼第IX因子多肽之第IX因子聚核苷酸的病毒粒子，當引入適合之動物宿主(例如人類)中時其特異性地用於第IX因子多肽之表現。第IX因子病毒粒子之定義內特別包括囊封基因組之重組病毒粒子，在該基因組中已插入編碼第IX因子多肽之密碼子改變之第IX因子聚核苷酸。第IX因子病毒粒子之定義內亦特別包括囊封編碼第IX因子多肽之第IX因子聚核苷酸的重組病毒粒子，該第IX因子聚核苷酸置換病毒之原生基因組。第IX因子病毒粒子之定義內包括囊封第IX因子聚核苷酸之重組病毒粒子，該第IX因子聚核苷酸編碼第IX因子之「Padua」變異體。
「AAV」或「腺相關病毒」在本文中意指在病毒之細小病毒屬內之依賴細小病毒(Dependoparvovirus)。如本文所用，AAV可指來源於其中已插入第IX因子聚核苷酸之天然存在之「野生型」 AAV基因組的病毒、來源於使用由天然存在之AAV cap基因編碼之衣殼蛋白封裝至衣殼中之重組第IX因子聚核苷酸的重組病毒，或來源於使用由非天然衣殼cap基因編碼之衣殼蛋白封裝至衣殼中之重組第IX因子聚核苷酸的重組病毒。AAV之定義內包括囊封第IX因子聚核苷酸之1型AAV (AAV1)、2型AAV (AAV2)、3型AAV (AAV3)、4型AAV (AAV4)、5型AAV (AAV5)、6型AAV (AAV6)、7型AAV (AAV7)、8型AAV (AAV8)及9型AAV (AAV9)病毒，及囊封第IX因子聚核苷酸之由一或多個變異體AAV衣殼蛋白形成之病毒。
「AAV8」、「AAV-8」或「AAV第8血清型」在本文中意指囊封第IX因子聚核苷酸之由AAV8衣殼病毒蛋白形成之病毒。
如本文所用，術語「CpG」係指沿DNA單股之胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸，其中「p」表示兩者之間的磷酸酯鍵聯。
如本文所用，術語「CpG島」係指聚核苷酸內具有統計上升高密度之CpG二核苷酸的區域。如本文所用，聚核苷酸(例如編碼密碼子改變之第IX因子蛋白之聚核苷酸)之區域為CpG島，其條件為在200個鹼基對之窗口上：(i)該區域具有大於50%之GC含量，及(ii)所觀測之CpG二核苷酸與預期CpG二核苷酸之比率為至少0.6，如由以下關係所定義：
Figure 02_image001
≥ 0.6。
對於用於鑑別CpG島之方法的額外資訊，參見Gardiner-Garden M.等人, J Mol Biol., 196(2):261-82 (1987)，其內容出於所有目的以全文引用之方式明確併入本文中。
如本文所用，術語「核酸」係指呈單股或雙股形式之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，及其補體。該術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或經修飾之骨架殘基或鍵聯之核酸，其為合成的、天然存在的及非天然存在的，具有與參考核酸類似之結合特性，且以類似於參考核苷酸之方式代謝。此類類似物之實例包括但不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基膦酸酯、對掌性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸及肽核酸(PNA)。然而，本文中尤其適用於患者之基因療法中之實施例使用磷酸二酯鍵。
「核酸組合物」在本文中意指包括編碼第IX因子聚核苷酸之第IX因子聚核苷酸之任何分子或分子調配物。核酸組合物之定義內包括第IX因子聚核苷酸、第IX因子聚核苷酸之水溶液、囊封第IX因子聚核苷酸之病毒粒子，及囊封第IX因子聚核苷酸之病毒粒子之水性調配物。如本文所揭示之核酸組合物包括編碼FIX多肽之密碼子改變之FIX基因。
術語「胺基酸」係指天然存在之胺基酸及非天然胺基酸，包括以類似於天然存在之胺基酸之方式發揮功能之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然存在之胺基酸包括由遺傳密碼編碼之彼等，以及後來經修飾之彼等胺基酸，例如羥脯胺酸、y-羧基麩胺酸鹽及O-磷酸絲胺酸。天然存在之胺基酸可包括例如D-胺基酸及L-胺基酸。關於胺基酸序列，一般熟習此項技術者將認識到，改變、添加或缺失經編碼序列中之單一胺基酸或小百分比之胺基酸的核酸或肽序列之個別取代、缺失或添加為「保守修飾之變異體」，其中改變使得胺基酸經化學上類似之胺基酸取代。提供功能上類似之胺基酸之保守性取代表在此項技術中為熟知的。此類保守修飾之變異體加上且不排除本揭示案之多態性變異體、種間同源物及對偶基因。
提供功能上類似之胺基酸之保守性胺基酸取代在此項技術中為熟知的。視特定胺基酸，例如催化性、結構性或空間上重要之胺基酸的功能性而定，胺基酸之不同分組可視為彼此之保守性取代。表 1 提供基於胺基酸之電荷及極性、胺基酸之疏水性、胺基酸之表面暴露/結構性質及胺基酸之二級結構偏向性而視為保守性取代之胺基酸分組。表 1 . 基於蛋白質中之殘基之功能性的保守性胺基酸取代之分組.
重要特徵 保守性分組
電荷/極性 1. H、R及K 2. D及E 3. C、T、S、G、N、Q及Y 4. A、P、M、L、I、V、F及W
疏水性 1. D、E、N、Q、R及K 2. C、S、T、P、G、H及Y 3. A、M、I、L、V、F及W
結構/表面暴露 1. D、E、N、Q、H、R及K 2. C、S、T、P、A、G、W及Y 3. M、I、L、V及F
二級結構偏向性 1. A、E、Q、H、K、M、L及R 2. C、T、I、V、F、Y及W 3. S、G、P、D及N
進化保守性 1. D及E 2. H、K及R 3. N及Q 4. S及T 5. L、I及V 6. F、Y及W 7. A及G 8. M及C
術語「一致」或百分比「一致性」在兩個或更多個核酸或肽序列之情形中係指兩個或更多個序列或子序列，其為相同的或具有特定百分比之相同胺基酸殘基或核苷酸(亦即，當在比較窗口或指定區域上比較且比對最大對應性時，在特定區域上約60%一致性，較佳65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性)，如使用具有下文所述之內定參數之BLAST或BLAST 2.0序列比較演算法或藉由手動比對及目視檢查來量測。
如此項技術中所知，許多不同程式可用於鑑別蛋白質(或如下文所論述之核酸)與已知序列是否具有序列一致性或相似性。序列一致性及/或相似性係使用此項技術中已知之標準技術來確定，包括但不限於Smith及Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)之局部序列一致性演算法；藉由Needleman及Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)之序列一致性比對演算法；藉由Pearson及Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444 (1988)之相似性搜索法；藉由此等演算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics套裝軟體, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)；Devereux等人, Nucl. Acid Res., 12:387-395 (1984)所述之Best Fit序列程式，較佳使用內定設置；或藉由檢查。較佳地，百分比一致性係由FastDB基於以下參數計算：錯配罰分1；空位罰分1；空位大小罰分0.33；及歸併罰分30，「Current Methods in Sequence Comparison and Analysis」, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, 第127-149頁 (1988), Alan R. Liss, Inc，其全部以引用之方式併入。
適用演算法之實例為PILEUP。PILEUP使用漸進成對比對自一組相關序列創建多個序列比對。PILEUP亦可繪製展示用於創建比對之聚類關係之樹。PILEUP使用Feng及Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)之漸進比對法之簡化；該方法類似於Higgins及Sharp CABIOS 5:151-153 (1989)所述之方法，兩者以引用之方式併入。適用之PILEUP參數包括內定空位權重3.00、內定空位長度權重0.10及加權末端空位。
適用演算法之另一個實例為BLAST演算法，描述於以下文獻中：Altschul等人, J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1990)；Altschul等人, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)；及Karlin等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787 (1993)，均以引用之方式併入。尤其適用之BLAST程式為WU-BLAST-2程式，其獲自Altschul等人, Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)；http://blast.wustl/edu/blast/ README.html]。WU-BLAST-2使用若干搜索參數，其中大多數設定為內定值。可調參數以下列值設定：重疊跨度 =1，重疊分數 = 0.125，字組閾值(T) = 11。HSP S及HSP S2參數為動態值且由程式本身視特定序列之組成及正在搜索所關注序列之特定資料庫之組成而確立；然而，可調整該等值以增加靈敏度。
額外適用之演算法為空位BLAST，如Altschul等人, Nucl. Acids Res., 25:3389-3402所報導，其以引用之方式併入。空位BLAST使用BLOSUM-62取代得分；閾值T參數設定為9；兩命中點法(two-hit method)用以觸發無空位延伸；空位長度k要求以支出10+k為代價；Xu設定為16，且Xg對於資料庫搜索階段設定為40且對於演算法輸出階段設定為67。由對應於約22位元之得分觸發空位比對。
藉由用匹配一致殘基之數目除以比對區域中「較長」序列之殘基總數來確定%胺基酸序列一致性值。「較長」序列為在比對區域中具有最多實際殘基之序列(忽略由WU-Blast-2引入以使比對得分達到最大之空位)。以類似方式，關於所鑑別多肽之編碼序列之「百分比(%)核酸序列一致性」定義為在候選序列中與細胞週期蛋白之編碼序列中之核苷酸殘基一致的核苷酸殘基之百分比。較佳方法利用設定為內定參數之WU-BLAST-2之BLASTN模組，其中重疊跨度及重疊分數分別設定為1及0.125。
比對可包括在有待比對之序列中引入空位。另外，對於相比由圖3A之野生型第IX因子序列(SEQ ID NO:2)編碼之蛋白質具有較短或較少胺基酸之序列，應瞭解，在一個實施例中，序列一致性百分比將基於相對於胺基酸或核苷酸總數之一致胺基酸或核苷酸之數目來確定。因此，舉例而言，在一個實施例中，如下文所論述，相比圖3A中所示之序列(SEQ ID NO:2)較短之序列的序列一致性將使用較短序列中之核苷酸數目來確定。在百分比一致性計算中，相對權重不指派給序列變異之各種表現，諸如插入、缺失、取代等。
在一個實施例中，僅一致性得分為正(+1)且包括空位之序列變異之所有形式指派為值「0」，此排除如下文對於序列相似性計算所述之加權標度或參數的需要。百分比序列一致性可例如藉由用匹配一致殘基之數目除以比對區域中「較短」序列之殘基總數且乘以100來計算。「較長」序列為在比對區域中具有最多實際殘基之序列。
術語「對偶基因變異體」係指在特定遺傳基因座處基因之多態形式，以及來源於基因之mRNA轉錄物之cDNA及由其編碼之多肽。術語「較佳哺乳動物密碼子」係指在哺乳動物細胞中表現之蛋白質中最頻繁使用之來自編碼胺基酸之密碼子組的密碼子子組，如選自以下清單：Gly (GGC、GGG)；Glu (GAG)；Asp (GAC)；Val (GTG、GTC)；Ala (GCC、GCT)；Ser (AGC、TCC)；Lys (AAG)；Asn (AAC)；Met (ATG)；Ile (ATC)；Thr (ACC)；Trp (TGG)；Cys (TGC)；Tyr (TAT、TAC)；Leu (CTG)；Phe (TTC)；Arg (CGC、AGG、AGA)；Gln (CAG)；His (CAC)；及Pro (CCC)。
如本文所用，術語密碼子改變係指編碼多肽(例如第IX因子蛋白)之聚核苷酸序列，其中已改變編碼多肽之原生聚核苷酸之至少一個密碼子以改良聚核苷酸序列之特性。在一些實施例中，改良之特性促進編碼多肽之mRNA之轉錄增加、mRNA之穩定性增加(例如mRNA半衰期改良)、多肽之轉譯增加及/或聚核苷酸於載體內之封裝增加。可用於達成改良特性之改變的非限制性實例包括改變特定胺基酸之密碼子之使用及/或分佈、調整整體及/或局部GC含量、移除富含AT序列、移除重複序列元件、調整整體及/或局部CpG二核苷酸含量、移除隱秘調節元件(例如TATA盒及CCAAT盒元件)、移除內含子/外顯子剪接位點、移除調節序列(例如引入Kozak共通序列)，及移除能夠形成經轉錄mRNA中之二級結構(例如莖環)的序列元件。
如本文所論述，各種命名用於在本文中提及本揭示案之組分。「CS編號」 (例如「CS02」、「CS03」、「CS04」、「CS05」、「CS06」等)係指編碼FIX多肽之密碼子改變之聚核苷酸及/或經編碼之多肽，包括變異體。舉例而言，CS02-FL係指全長密碼子改變之CS02聚核苷酸序列或由CS02聚核苷酸序列編碼之胺基酸序列(對於胺基酸序列有時在本文中稱作「CS02-FL-AA」且對於核酸序列稱作「CS02-FL-NA」 (SEQ ID NO:5))。類似地，「CS02-LC」係指編碼FIX多肽之輕鏈的密碼子改變之核酸序列(「CS02-LC-NA」 (SEQ ID NO:42))或由CS02聚核苷酸序列編碼之FIX輕鏈之胺基酸序列(有時在本文中亦稱作「CS02-LC-AA」)。同樣地，CS02-HC、CS02-HC-AA及CS02-HC-NA (SEQ ID NO:41)對於FIX重鏈為相同的。如熟習此項技術者將瞭解，對於僅密碼子改變之諸如CS02、CS03、CS04、CS05、CS06等構築體(例如，其與Padua第IX因子變異體相比不含額外胺基酸取代)，胺基酸序列將為一致的，此係因為胺基酸序列不由密碼子最佳化而改變。因此，本揭示案之序列構築體包括但不限於CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)、CS02-FL-AA、CS02-LC-NA (SEQ ID NO:42)、CS02-LC-AA、CS02-HC-AA、CS02-HC-NA (SEQ ID NO:41)、CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)、CS03-FL-AA、CS03-LC-NA (SEQ ID NO:44)、CS03-LC-AA、CS03-HC-AA、CS03-HC-NA (SEQ ID NO:43)、CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)、CS04-FL-AA、CS04-LC-NA (SEQ ID NO:46)、CS04-LC-AA、CS04-HC-AA、CS04-HC-NA、CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)、CS05-FL-AA、CS05-LC-NA (SEQ ID NO:48)、CS05-LC-AA、CS05-HC-AA、CS05-HC-NA (SEQ ID NO:47)、CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)、CS06-FL-AA、CS06-LC-NA (SEQ ID NO:50)、CS06-LC-AA、CS06-HC-AA及CS06-HC-NA (SEQ ID NO:49)。應注意，所有「CS」構築體在本文中編碼或含有FIXp胺基酸序列，不過CS構築體之定義內包括編碼或含有人類野生型FIX胺基酸序列之彼等構築體。
如本文所用，術語「肝特異性表現」係指與其他組織中相比，肝組織中特定基因(例如密碼子改變之基因轉殖第IX因子基因)之優先或主要活體內表現。在一些實施例中，肝特異性表現意指特定基因之所有表現之至少50%在個體之肝組織內發生。在其他實施例中，肝特異性表現意指特定基因之所有表現之至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%在個體之肝組織內發生。因此，肝特異性調節元件為驅動肝組織中基因之肝特異性表現的調節元件。
如本文所用，術語「小於」 X及「小於」 X%係指0至X之範圍，不包括值X，例如0%至X%，不包括X%。如本文所用，該等術語與始於0或0%直至但不包括X或X%之範圍可互換使用。
如本文所用，術語「不大於」 X或「不大於」 X%係指0至X之範圍，包括值X，例如0%至X%，包括X%。如本文所用，該等術語與始於0或0%直至且包括X或X%之範圍可互換使用。
如本文所用，術語「大於」 X或「大於」 X%係指X至上限之範圍，不包括值X，例如X%至100%，不包括X%。如本文所用，該等術語與始於但不包括X或X%直至上限(在百分比之情形中為100%)之範圍可互換使用。
如本文所用，術語「至少」 X或「至少」 X%係指X至上限之範圍，包括值X，例如X%至100%，包括X%。如本文所用，該等術語與始於且包括X或X%直至上限(在百分比之情形中為100%)之範圍可互換使用。
如本文所用，術語「介於『X』與『Y』之間」、「介於『X』%與『Y』%之間」、「『X』至『Y』」及「『X』%至『Y』%」係指X至Y之範圍，包括值X及Y，例如X%至Y%，包括X%及Y%。如本文所用，該等術語與始於X或X%直至且包括Y或Y%之範圍可互換使用。III. 密碼子改變之第 IX 因子聚核苷酸
在一些實施例中，本揭示案提供編碼第IX因子或第IX因子變異體(其中FIXp可用於特定實施例中)之密碼子改變之核酸組合物。此等密碼子改變之聚核苷酸當在基於AAV之基因療法構築體中投與時提供明顯改良之第IX因子表現。與常規密碼子最佳化之構築體相比，密碼子改變之聚核苷酸亦展示改良之AAV-病毒體封裝。如實例1中所展示，申請者經由發現編碼具有超活性R338L胺基酸取代(基於成熟單鏈第IX因子多肽序列；基於第IX因子前原蛋白序列之R384L)之第IX因子p多肽的若干密碼子改變之聚核苷酸(例如CS02-FL-NA、CS03-FL-NA、CS04-FL-NA、CS05-FL-NA及CS06-FL-NA (分別為SEQ ID NO:5-9))已達成此等優點。如實例2及3中所展示，將一或多個肝特異性調控元件(例如CRM8)併入編碼第IX因子分子之基因療法載體中進一步增加第IX因子之活體內及試管內表現及第IX因子活性。
野生型第IX因子經編碼具有28個胺基酸之信號肽(FIX-SP-AA (SEQ ID NO:37))及18個胺基酸之原肽(FIX-PP-AA (SEQ ID NO:38))，該信號肽及該原肽在第IX因子a活化之前自經編碼之多肽裂解。如熟習此項技術者所瞭解，信號肽及/或原肽可經突變，由來自其他基因或其他生物體之信號肽及/或原肽置換，或完全移除，而不影響在藉由細胞加工移除信號及原肽之後保留之成熟多肽的序列。
因此，在一些實施例中，本文所提供之密碼子改變之聚核苷酸(例如核酸組合物)具有核苷酸序列，該核苷酸序列與編碼成熟第IX因子單鏈多肽，亦即，第IX因子輕鏈、活化肽及重鏈(例如由野生型第IX因子基因編碼之全長多肽之胺基酸47-461；FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2))之CS02-FL-NA、CS03-FL-NA、CS04-FL-NA、CS05-FL-NA或CS06-FL-NA (分別為SEQ ID NO:5-9)具有高度序列一致性。
另外，如此項技術中所知，人類野生型第IX因子具有定位於第IX因子輕鏈與重鏈之間的34個胺基酸之活化肽，其在蛋白質活化後自單鏈第IX因子多肽切除。因為活化肽自活性第IX因子多肽移除，所以肽本身對於最終第IX因子活性為非必需的。因此，不需要由本文所揭示之密碼子改變之聚核苷酸編碼之第IX因子多肽與人類野生型活化肽序列(FIX-AP-AA (SEQ ID NO:56))具有高度序列一致性。然而，經編碼之活化肽應在第IX因子多肽活化後可切除。舉例而言，在一些實施例中，經編碼之活化肽應包括在其N端及C端處之第XI因子裂解位點，其由活體內人類第IX因子可識別及可裂解。
因此，在一些實施例中，本文所提供之密碼子改變之聚核苷酸(例如核酸組合物)編碼與人類野生型FIX輕鏈序列(FIX-LC-AA (SEQ ID NO:62))及人類野生型FIX重鏈序列(FIX-HC-AA (SEQ ID NO:63))具有高度序列一致性之單鏈第IX因子多肽，且另外編碼具有兩個第XI因子裂解位點之將輕鏈之C端連接至重鏈之N端的多肽連接子(例如活化肽)。
在一些實施例中，由密碼子改變之聚核苷酸編碼之第IX因子輕鏈及重鏈分別為人類第IX因子輕鏈及重鏈，包括FIXp重鏈。在其他實施例中，由密碼子改變之聚核苷酸編碼之第IX因子輕鏈及重鏈為來自另一種哺乳動物(例如豬第IX因子)之重鏈及輕鏈序列。在其他實施例中，第IX因子輕鏈及重鏈為嵌合輕鏈及重鏈(例如人類及第二種哺乳動物序列之組合)。在其他實施例中，第IX因子輕鏈及重鏈為來自另一種哺乳動物之輕鏈及重鏈之人源化型式，例如，來自另一種哺乳動物之輕鏈及重鏈序列，其中人類殘基在所選位置處經取代以降低在投與人類時所得肽之免疫原性。
人類基因之GC含量自小於25%至大於90%廣泛變化。然而，一般而言，具有較高GC含量之人類基因以較高水準表現。舉例而言，Kudla等人 (PLoS Biol., 4(6):80 (2006))展示，增加基因之GC含量主要藉由增加轉錄且實現mRNA轉錄物之較高穩態水準來增加經編碼多肽之表現。一般而言，據信密碼子最佳化之基因構築體之所需GC含量等於或大於60%。舉例而言，使用GeneOptimizer軟體(Geneart)對scAAV8.FIXR338L基因療法載體中之第IX因子基因特異性地進行密碼子改變，以使野生型編碼序列之GC含量自41% GC增至61% GC。參見Wu Z.等人, Mol Ther 16:280-89 (2008)及Monahan PE等人, Hum Gene Ther., 26(2):69-81 (2015)。然而，原生AAV基因組具有約56%之GC含量。
因此，在一些實施例中，本文所提供之密碼子改變之聚核苷酸(例如核酸組合物)具有更接近地匹配原生AAV病毒體之GC含量(例如約56% GC)之CG含量，其低於常規密碼子最佳化用於在哺乳動物細胞中表現之聚核苷酸之較佳CG含量(例如處於或高於60% GC)。舉例而言，CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有約54%之GC含量，CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有約55%之GC含量，CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有約54.5%之GC含量，CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有約56.6%之GC含量，且CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有約55%之GC含量。與具有較高GC含量之類似密碼子改變之序列相比，此等構築體應提供改良之病毒體封裝。
因此，在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸(例如與CS02-CS06第IX因子編碼序列中之一者具有高度序列一致性之聚核苷酸)的總GC含量小於60%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量小於59%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量小於58%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量小於57%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量不大於56%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量不大於55%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量不大於54%。
在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為53%至59%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為54%至59%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為55%至59%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為56%至59%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為53%至58%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為54%至58%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為55%至58%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為56%至58%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為53%至57%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為54%至57%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為55%至57%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為56%至57%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為53%至56%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為54%至56%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為55%至56%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為53%至55%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為54%至55%。
在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為54±0.5%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為54±0.4%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為54±0.3%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為54±0.2%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為54±0.1%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為54%。
在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為55±0.5%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為55±0.4%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為55±0.3%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為55±0.2%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為55±0.1%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為55%。
在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為56±0.5%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為56±0.4%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為56±0.3%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為56±0.2%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為56±0.1%。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的總GC含量為56%。
已建立如下理論：此等CpG二核苷酸(亦即，胞嘧啶核苷酸繼之以鳥嘌呤核苷酸)活體內經由toll樣受體誘導免疫反應。一些證據表明，CpG耗盡之AAV載體在某些情況下逃避小鼠中之免疫偵測(Faust等人, J. Clin. Invest. 2013; 123, 2994-3001)。野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))含有20個CpG二核苷酸。
因此，在一些實施例中，本文所提供之核酸組合物(例如密碼子改變之聚核苷酸)經密碼子改變以減少第IX因子編碼序列中之CpG二核苷酸數目。舉例而言，CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)不具有CpG二核苷酸，CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)不具有CpG二核苷酸，CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)不具有CpG二核苷酸，CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有11個CpG二核苷酸，且CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有3個CpG二核苷酸。此等構築體相比野生型第IX因子編碼序列及具有較高數目之CpG二核苷酸的類似密碼子改變之序列應引發較少免疫原性反應。
因此，在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸(例如與CS02-CS06第IX因子編碼序列中之一者具有高度序列一致性之聚核苷酸)的序列具有少於20個CpG二核苷酸。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的序列具有少於15個CpG二核苷酸。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的序列具有少於12個CpG二核苷酸。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的序列具有少於10個CpG二核苷酸。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的序列具有少於5個CpG二核苷酸。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的序列具有少於3個CpG二核苷酸。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的序列不具有CpG二核苷酸。
在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的序列具有多於15個CpG二核苷酸。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的序列具有不多於12個CpG二核苷酸。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的序列具有不多於10個CpG二核苷酸。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的序列具有不多於5個CpG二核苷酸。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的序列具有不多於3個CpG二核苷酸。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的序列不具有CpG二核苷酸。在一些實施例中，編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸的序列具有不多於18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個或不具有CpG二核苷酸。A. 第 IX 因子胺基酸取代
為進一步增加本文所述之第IX因子構築體之基於AAV載體之表現的效率，根據一些實施，進一步併入已知改良分泌、增加特異活性及/或增強第IX因子穩定性之胺基酸取代。在此項技術中已知許多潛在第IX因子變異體增加FIX活性之血漿水準。此等變異體包括增加第IX因子催化活性(例如超活性突變體)、增加對抗凝血酶III及/或肝素之抗性、增加血清半衰期及使得轉譯後修飾之模式改變的胺基酸取代。
舉例而言，殘基R338 (PPE)之突變可增加第IX因子之凝集活性。對於評述，參見美國專利第6,531,298號，其內容出於所有目的藉此以全文引用之方式併入。如美國專利第6,531,298號中所揭示，在此位置處之精胺酸至白胺酸胺基酸取代增加第IX因子之活性。此種情況後來在活體內得到確認，其中R338L (PPE)突變使活體內第IX因子活性增加5倍至10倍。對於評述，參見Simioni P.等人, N Engl J Med. 361(17):1671-75 (2009)，藉此以全文引用之方式併入。因此，在一些實施例中，本文所述之密碼子改變之聚核苷酸編碼在精胺酸384 (PPI；殘基338 (PPE))處具有胺基酸取代之第IX因子多肽。在特定實施例中，胺基酸取代為R384L (PPI)。在其他實施例中，在殘基384 (PPI)/338 (PPE)處胺基酸取代為除白胺酸以外之殘基。舉例而言，據報導R384A (PPI)胺基酸取代在小鼠中提供高2倍至6倍之活性。Schuettrumpf J等人, Blood, 105(6):2316-23 (2005)，其內容出於所有目的以全文引用之方式明確併入本文中。
類似地，殘基Y305、K311、S365及Y391之突變使得對合成受質之第IX因子活性增加。特別地，K311M及K311T單突變使得對合成裂解受質之活性增加2.8倍及6.7倍。Sichler K.等人, J Biol Chem. 278(6):4121-26 (2003) (使用不同殘基編號)。此外，Y305F/K311T/Y391T三突變體使得對合成受質之活性增加7000倍。同上。因此，在一些實施例中，本文所述之密碼子改變之聚核苷酸編碼在酪胺酸305 (PPI)、離胺酸311 (PPI)及酪胺酸391 (PPI)中之一或多者處具有胺基酸取代之第IX因子多肽。在特定實施例中，胺基酸取代為K311M (PPI)。在特定實施例中，胺基酸取代為K311T (PPI)。在另一個特定實施例中，胺基酸取代為Y305F/K311T/Y391T (PPI)。
提供改良特性之其他胺基酸取代在此項技術中為已知的且可併入所述密碼子改變之第IX因子聚核苷酸中。舉例而言，參見美國專利第8,778,870號，其內容出於所有目的以全文引用之方式明確併入本文中。B. 編碼第 IX 因子蛋白之密碼子改變之聚核苷酸 CS02 密碼子改變之聚核苷酸
在一個實施例中，本文所提供之核酸組合物包括編碼單鏈第IX因子多肽之第IX因子聚核苷酸(例如密碼子最佳化之聚核苷酸)，其中第IX因子聚核苷酸包括與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有降低之GC含量。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有數目減少之CpG二核苷酸。
在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有至少95%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有至少96%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有至少97%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有至少98%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有至少99%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有至少99.5%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有至少99.9%一致性。在另一個特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列為CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)。
在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於60%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於59%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於58%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於57%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於56%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於55%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至60%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至59%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至58%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至57%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至56%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至55%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±1.0之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.8之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.6之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.5之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.4之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.3之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.2之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.1之GC含量。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%之GC含量。
在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於15個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於12個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於10個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於9個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於8個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於7個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於6個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於5個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於4個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於3個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於2個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於1個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列不具有CpG二核苷酸。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽，例如由與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列同源性之聚核苷酸編碼之多肽，與野生型第IX因子前原蛋白序列FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)及/或Padua (hFIX(R384L))前原蛋白序列FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有高度序列一致性。經編碼之第IX因子多肽應保留變得活化為功能第IX因子a蛋白之能力(例如藉由移除信號肽及原肽，及藉由切除活化多肽)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少85%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少90%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少95%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少96%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少97%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少98%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少99%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少99.5%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少99.9%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少85%一致性且包括在前原多肽之位置384 (例如成熟第IX因子單鏈多肽FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之位置338)處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少90%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少95%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少96%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少97%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少98%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少99%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少99.5%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少99.9%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)。
在一個實施例中，本文所提供之核酸組合物包括編碼單鏈第IX因子多肽(例如具有絲胺酸蛋白酶活性)之第IX因子聚核苷酸(例如密碼子改變之聚核苷酸)，其中第IX因子聚核苷酸包括與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有降低之GC含量。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有數目減少之CpG二核苷酸。
在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有至少95%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有至少96%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有至少97%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有至少98%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有至少99%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有至少99.5%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有至少99.9%一致性。在另一個特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列為CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)。
在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於60%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於59%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於58%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於57%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於56%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於55%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至60%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至59%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至58%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至57%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至56%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至55%之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±1.0之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.8之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.6之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.5之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.4之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.3之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.2之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.1之GC含量。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%之GC含量。
在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於15個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於12個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於10個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於9個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於8個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於7個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於6個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於5個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於4個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於3個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於2個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於1個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列不具有CpG二核苷酸。
在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸進一步包括編碼具有FIX-SP-AA (SEQ ID NO:37)之胺基酸序列之第IX因子信號肽的第IX因子信號聚核苷酸。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。
在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸進一步包括編碼具有FIX-PP-AA (SEQ ID NO:38)之胺基酸序列之第IX因子原肽的第IX因子原肽聚核苷酸。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。
在一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸進一步包括編碼具有FIX-PPP-AA (SEQ ID NO:36)之胺基酸序列之第IX因子前原肽的第IX因子前原肽聚核苷酸。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS02-PPP-NA (SEQ ID NO:19)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS03-PPP-NA (SEQ ID NO:20)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS04-PPP-NA (SEQ ID NO:21)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS05-PPP-NA (SEQ ID NO:22)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS06-PPP-NA (SEQ ID NO:23)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽，例如由與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有高度序列同源性之聚核苷酸編碼之多肽，與野生型成熟第IX因子單鏈多肽序列FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)及/或成熟Padua (hFIX(R384L))單鏈序列FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有高度序列一致性。經編碼之第IX因子多肽應保留變得活化為功能第IX因子a蛋白之能力(例如藉由移除任何信號肽及原肽，及藉由切除活化多肽)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少85%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少90%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少95%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少96%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少97%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少98%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.5%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.9%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少85%一致性且包括在前原多肽之位置384 (例如成熟第IX因子單鏈多肽FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之位置338)處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少90%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少95%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少96%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少97%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少98%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.5%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.9%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)。
在一個實施例中，本文所提供之密碼子改變之聚核苷酸編碼單鏈第IX因子多肽，其包括輕鏈、重鏈及將輕鏈之C端連接至重鏈之N端的多肽連接子。第IX因子多肽之輕鏈係由與CS02-LC-NA (SEQ ID NO:42)具有高度序列一致性之第一核苷酸序列編碼，該第一核苷酸序列為編碼第IX因子輕鏈之CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)之部分。第IX因子多肽之重鏈係由與CS02-HC-NA (SEQ ID NO:41)具有高度序列一致性之第二核苷酸序列編碼，該第二核苷酸序列為編碼第IX因子重鏈之CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)之部分。多肽連接子包括第XI因子裂解位點，其允許活體內成熟(例如在前驅體單鏈第IX因子多肽表現之後)。
在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS02-LC-NA及CS02-HC-NA (SEQ ID NO:42及41)具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS02-LC-NA及CS02-HC-NA (SEQ ID NO:42及41)具有至少96%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS02-LC-NA及CS02-HC-NA (SEQ ID NO:42及41)具有至少97%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS02-LC-NA及CS02-HC-NA (SEQ ID NO:42及41)具有至少98%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS02-LC-NA及CS02-HC-NA (SEQ ID NO:42及41)具有至少99%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS02-LC-NA及CS02-HC-NA (SEQ ID NO:42及41)具有至少99.5%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS02-LC-NA及CS02-HC-NA (SEQ ID NO:42及41)具有至少99.9%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別為CS02-LC-NA及CS02-HC-NA (SEQ ID NO:42及41)。
在一些實施例中，第IX因子構築體之多肽連接子係由與CS02-AP-NA (SEQ ID NO:57)具有高度序列一致性之第三核苷酸序列編碼，該第三核苷酸序列為編碼野生型第IX因子活化多肽，例如FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)之胺基酸192-226的密碼子改變之序列。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS02-AP-NA (SEQ ID NO:57)具有至少80%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS02-AP-NA (SEQ ID NO:57)具有至少90%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS02-AP-NA (SEQ ID NO:57)具有至少95%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS02-AP-NA (SEQ ID NO:57)具有至少96%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS02-AP-NA (SEQ ID NO:57)具有至少97%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS02-AP-NA (SEQ ID NO:57)具有至少98%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS02-AP-NA (SEQ ID NO:57)具有至少99%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列為CS02-AP-NA (SEQ ID NO:57)。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽亦包括信號肽(例如第IX因子信號肽)及/或原肽(例如第IX因子原肽)。在一些實施例中，信號肽為野生型第IX因子信號肽(FIX-SP-AA (SEQ ID NO:37))。在一些實施例中，信號肽係由與CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)具有高度序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%或99%)的密碼子改變之聚核苷酸序列編碼。在一些實施例中，原肽為野生型第IX因子原肽(FIX-PP-AA (SEQ ID NO:38))。在一些實施例中，原肽係由與CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)具有高度序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%或99%)的密碼子改變之聚核苷酸序列編碼。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽，例如由與CS02-LC-NA (SEQ ID NO:42)及CS02-HC-NA (SEQ ID NO:41)具有高度序列同源性之聚核苷酸編碼之多肽，與野生型成熟第IX因子單鏈多肽序列FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)及/或成熟Padua (hFIX(R384L))單鏈序列FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有高度序列一致性。經編碼之第IX因子多肽應保留變得活化為功能第IX因子a蛋白之能力(例如藉由移除任何信號肽及原肽，及藉由切除活化多肽)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少85%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少90%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少95%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少96%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少97%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少98%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.5%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.9%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少85%一致性且包括在前原多肽之位置384 (例如成熟第IX因子單鏈多肽FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之位置338)處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少90%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少95%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少96%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少97%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少98%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.5%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.9%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構A之自身互補聚核苷酸之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構B之自身互補聚核苷酸之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構C之聚核苷酸(例如單股聚核苷酸)之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構D之聚核苷酸(例如單股聚核苷酸)之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。CS03 密碼子改變之聚核苷酸
在一個實施例中，本文所提供之核酸組合物包括編碼單鏈第IX因子多肽之第IX因子聚核苷酸(例如密碼子改變之聚核苷酸)，其中第IX因子聚核苷酸包括與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有降低之GC含量。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有數目減少之CpG二核苷酸。
在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有至少95%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有至少96%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有至少97%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有至少98%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有至少99%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有至少99.5%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有至少99.9%一致性。在另一個特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列為CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)。
在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於60%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於59%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於58%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於57%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於56%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於55%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至60%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至59%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至58%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至57%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至56%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至55%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±1.0之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.8之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.6之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.5之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.4之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.3之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.2之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.1之GC含量。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%之GC含量。
在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於15個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於12個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於10個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於9個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於8個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於7個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於6個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於5個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於4個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於3個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於2個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於1個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列不具有CpG二核苷酸。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽，例如由與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列同源性之聚核苷酸編碼之多肽，與野生型第IX因子前原蛋白序列FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)及/或Padua (hFIX(R384L))前原蛋白序列FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有高度序列一致性。經編碼之第IX因子多肽應保留變得活化為功能第IX因子a蛋白之能力(例如藉由移除信號肽及原肽，及藉由切除活化多肽)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少85%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少90%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少95%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少96%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少97%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少98%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少99%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少99.5%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少99.9%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少85%一致性且包括在前原多肽之位置384 (例如成熟第IX因子單鏈多肽FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之位置338)處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少90%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少95%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少96%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少97%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少98%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少99%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少99.5%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少99.9%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)。
在一個實施例中，本文所提供之核酸組合物包括編碼單鏈第IX因子多肽(例如具有絲胺酸蛋白酶活性)之第IX因子聚核苷酸(例如密碼子改變之聚核苷酸)，其中第IX因子聚核苷酸包括與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有降低之GC含量。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有數目減少之CpG二核苷酸。
在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有至少95%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有至少96%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有至少97%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有至少98%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有至少99%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有至少99.5%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有至少99.9%一致性。在另一個特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列為CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)。
在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於60%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於59%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於58%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於57%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於56%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於55%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至60%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至59%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至58%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至57%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至56%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至55%之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±1.0之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.8之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.6之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.5之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.4之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.3之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.2之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.1之GC含量。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%之GC含量。
在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於15個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於12個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於10個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於9個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於8個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於7個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於6個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於5個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於4個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於3個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於2個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於1個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列不具有CpG二核苷酸。
在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸進一步包括編碼具有FIX-SP-AA (SEQ ID NO:37)之胺基酸序列之第IX因子信號肽的第IX因子信號聚核苷酸。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。
在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸進一步包括編碼具有FIX-PP-AA (SEQ ID NO:38)之胺基酸序列之第IX因子原肽的第IX因子原肽聚核苷酸。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。
在一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸進一步包括編碼具有FIX-PPP-AA (SEQ ID NO:36)之胺基酸序列之第IX因子前原肽的第IX因子前原肽聚核苷酸。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS02-PPP-NA (SEQ ID NO:19)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS03-PPP-NA (SEQ ID NO:20)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS04-PPP-NA (SEQ ID NO:21)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS05-PPP-NA (SEQ ID NO:22)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS06-PPP-NA (SEQ ID NO:23)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽，例如由與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有高度序列同源性之聚核苷酸編碼之多肽，與野生型成熟第IX因子單鏈多肽序列FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)及/或成熟Padua (hFIX(R384L))單鏈序列FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有高度序列一致性。經編碼之第IX因子多肽應保留變得活化為功能第IX因子a蛋白之能力(例如藉由移除任何信號肽及原肽，及藉由切除活化多肽)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少85%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少90%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少95%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少96%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少97%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少98%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.5%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.9%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少85%一致性且包括在前原多肽之位置384 (例如成熟第IX因子單鏈多肽FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之位置338)處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少90%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少95%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少96%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少97%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少98%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.5%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.9%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)。
在一個實施例中，本文所提供之密碼子改變之聚核苷酸編碼單鏈第IX因子多肽，其包括輕鏈、重鏈及將輕鏈之C端連接至重鏈之N端的多肽連接子。第IX因子多肽之輕鏈係由與CS03-LC-NA (SEQ ID NO:44)具有高度序列一致性之第一核苷酸序列編碼，該第一核苷酸序列為編碼第IX因子輕鏈之CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)之部分。第IX因子多肽之重鏈係由與CS03-HC-NA (SEQ ID NO:43)具有高度序列一致性之第二核苷酸序列編碼，該第二核苷酸序列為編碼第IX因子重鏈之CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)之部分。多肽連接子包括第XI因子裂解位點，其允許活體內成熟(例如在前驅體單鏈第IX因子多肽表現之後)。
在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS03-LC-NA (SEQ ID NO:44)及CS03-HC-NA (SEQ ID NO:43)具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS03-LC-NA (SEQ ID NO:44)及CS03-HC-NA (SEQ ID NO:43)具有至少96%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS03-LC-NA (SEQ ID NO:44)及CS03-HC-NA (SEQ ID NO:43)具有至少97%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS03-LC-NA (SEQ ID NO:44)及CS03-HC-NA (SEQ ID NO:43)具有至少98%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS03-LC-NA (SEQ ID NO:44)及CS03-HC-NA (SEQ ID NO:43)具有至少99%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS03-LC-NA (SEQ ID NO:44)及CS03-HC-NA (SEQ ID NO:43)具有至少99.5%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS03-LC-NA (SEQ ID NO:44)及CS03-HC-NA (SEQ ID NO:43)具有至少99.9%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別為CS03-LC-NA (SEQ ID NO:44)及CS03-HC-NA (SEQ ID NO:43)。
在一些實施例中，第IX因子構築體之多肽連接子係由與CS03-AP-NA (SEQ ID NO:58)具有高度序列一致性之第三核苷酸序列編碼，該第三核苷酸序列為編碼野生型第IX因子活化多肽，例如FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)之胺基酸192-226的密碼子改變之序列。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS03-AP-NA (SEQ ID NO:58)具有至少80%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS03-AP-NA (SEQ ID NO:58)具有至少90%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS03-AP-NA (SEQ ID NO:58)具有至少95%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS03-AP-NA (SEQ ID NO:58)具有至少96%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS03-AP-NA (SEQ ID NO:58)具有至少97%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS03-AP-NA (SEQ ID NO:58)具有至少98%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS03-AP-NA (SEQ ID NO:58)具有至少99%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列為CS03-AP-NA (SEQ ID NO:58)。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽亦包括信號肽(例如第IX因子信號肽)及/或原肽(例如第IX因子原肽)。在一些實施例中，信號肽為野生型第IX因子信號肽(FIX-SP-AA (SEQ ID NO:37))。在一些實施例中，信號肽係由與CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)具有高度序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%或99%)的密碼子改變之聚核苷酸序列編碼。在一些實施例中，原肽為野生型第IX因子原肽(FIX-PP-AA (SEQ ID NO:38))。在一些實施例中，原肽係由與CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)具有高度序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%或99%)的密碼子改變之聚核苷酸序列編碼。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽，例如由與CS03-LC-NA (SEQ ID NO:44)及CS03-HC-NA (SEQ ID NO:43)具有高度序列同源性之聚核苷酸編碼之多肽，與野生型成熟第IX因子單鏈多肽序列FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)及/或成熟Padua (hFIX(R384L))單鏈序列FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有高度序列一致性。經編碼之第IX因子多肽應保留變得活化為功能第IX因子a蛋白之能力(例如藉由移除任何信號肽及原肽，及藉由切除活化多肽)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少85%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少90%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少95%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少96%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少97%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少98%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.5%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.9%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少85%一致性且包括在前原多肽之位置384 (例如成熟第IX因子單鏈多肽FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之位置338)處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少90%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少95%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少96%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少97%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少98%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.5%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.9%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構A之自身互補聚核苷酸之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構B之自身互補聚核苷酸之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構C之聚核苷酸(例如單股聚核苷酸)之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構D之聚核苷酸(例如單股聚核苷酸)之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。CS04 密碼子改變之聚核苷酸
在一個實施例中，本文所提供之核酸組合物包括編碼單鏈第IX因子多肽之第IX因子聚核苷酸(例如密碼子改變之聚核苷酸)，其中第IX因子聚核苷酸包括與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有降低之GC含量。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有數目減少之CpG二核苷酸。
在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有至少95%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有至少96%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有至少97%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有至少98%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有至少99%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有至少99.5%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有至少99.9%一致性。在另一個特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列為CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)。
在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於60%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於59%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於58%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於57%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於56%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於55%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至60%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至59%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至58%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至57%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至56%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至55%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±1.0之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.8之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.6之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.5之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.4之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.3之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.2之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.1之GC含量。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%之GC含量。
在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於15個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於12個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於10個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於9個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於8個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於7個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於6個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於5個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於4個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於3個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於2個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於1個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列不具有CpG二核苷酸。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽，例如由與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列同源性之聚核苷酸編碼之多肽，與野生型第IX因子前原蛋白序列FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)及/或Padua (hFIX(R384L))前原蛋白序列FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有高度序列一致性。經編碼之第IX因子多肽應保留變得活化為功能第IX因子a蛋白之能力(例如藉由移除信號肽及原肽，及藉由切除活化多肽)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少85%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少90%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少95%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少96%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少97%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少98%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少99%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少99.5%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少99.9%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少85%一致性且包括在前原多肽之位置384 (例如成熟第IX因子單鏈多肽FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之位置338)處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少90%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少95%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少96%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少97%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少98%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少99%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少99.5%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少99.9%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)。
在一個實施例中，本文所提供之核酸組合物包括編碼單鏈第IX因子多肽(例如具有絲胺酸蛋白酶活性)之第IX因子聚核苷酸(例如密碼子改變之聚核苷酸)，其中第IX因子聚核苷酸包括與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有降低之GC含量。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有數目減少之CpG二核苷酸。
在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有至少95%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有至少96%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有至少97%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有至少98%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有至少99%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有至少99.5%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有至少99.9%一致性。在另一個特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列為CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)。
在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於60%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於59%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於58%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於57%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於56%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於55%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至60%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至59%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至58%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至57%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至56%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至55%之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±1.0之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.8之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.6之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.5之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.4之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.3之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.2之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.1之GC含量。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%之GC含量。
在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於15個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於12個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於10個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於9個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於8個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於7個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於6個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於5個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於4個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於3個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於2個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於1個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列不具有CpG二核苷酸。
在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸進一步包括編碼具有FIX-SP-AA (SEQ ID NO:37)之胺基酸序列之第IX因子信號肽的第IX因子信號聚核苷酸。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。
在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸進一步包括編碼具有FIX-PP-AA (SEQ ID NO:38)之胺基酸序列之第IX因子原肽的第IX因子原肽聚核苷酸。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。
在一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸進一步包括編碼具有FIX-PPP-AA (SEQ ID NO:36)之胺基酸序列之第IX因子前原肽的第IX因子前原肽聚核苷酸。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS02-PPP-NA (SEQ ID NO:19)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS03-PPP-NA (SEQ ID NO:20)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS04-PPP-NA (SEQ ID NO:21)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS05-PPP-NA (SEQ ID NO:22)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS06-PPP-NA (SEQ ID NO:23)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽，例如由與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有高度序列同源性之聚核苷酸編碼之多肽，與野生型成熟第IX因子單鏈多肽序列FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)及/或成熟Padua (hFIX(R384L))單鏈序列FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有高度序列一致性。經編碼之第IX因子多肽應保留變得活化為功能第IX因子a蛋白之能力(例如藉由移除任何信號肽及原肽，及藉由切除活化多肽)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少85%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少90%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少95%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少96%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少97%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少98%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.5%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.9%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少85%一致性且包括在前原多肽之位置384 (例如成熟第IX因子單鏈多肽FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之位置338)處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少90%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少95%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少96%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少97%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少98%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.5%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.9%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)。
在一個實施例中，本文所提供之密碼子改變之聚核苷酸編碼單鏈第IX因子多肽，其包括輕鏈、重鏈及將輕鏈之C端連接至重鏈之N端的多肽連接子。第IX因子多肽之輕鏈係由與CS04-LC-NA (SEQ ID NO:46)具有高度序列一致性之第一核苷酸序列編碼，該第一核苷酸序列為編碼第IX因子輕鏈之CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)之部分。第IX因子多肽之重鏈係由與CS04-HC-NA (SEQ ID NO:45)具有高度序列一致性之第二核苷酸序列編碼，該第二核苷酸序列為編碼第IX因子重鏈之CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)之部分。多肽連接子包括第XI因子裂解位點，其允許活體內成熟(例如在前驅體單鏈第IX因子多肽表現之後)。
在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS04-LC-NA及CS04-HC-NA (SEQ ID NO:46及45)具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS04-LC-NA及CS04-HC-NA (SEQ ID NO:46及45)具有至少96%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS04-LC-NA及CS04-HC-NA (SEQ ID NO:46及45)具有至少97%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS04-LC-NA及CS04-HC-NA (SEQ ID NO:46及45)具有至少98%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS04-LC-NA及CS04-HC-NA (SEQ ID NO:46及45)具有至少99%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS04-LC-NA及CS04-HC-NA (SEQ ID NO:46及45)具有至少99.5%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS04-LC-NA及CS04-HC-NA (SEQ ID NO:46及45)具有至少99.9%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別為CS04-LC-NA及CS04-HC-NA (SEQ ID NO:46及45)。
在一些實施例中，第IX因子構築體之多肽連接子係由與CS04-AP-NA (SEQ ID NO:59)具有高度序列一致性之第三核苷酸序列編碼，該第三核苷酸序列為編碼野生型第IX因子活化多肽，例如FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)之胺基酸192-226的密碼子改變之序列。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS04-AP-NA (SEQ ID NO:59)具有至少80%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS04-AP-NA (SEQ ID NO:59)具有至少90%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS04-AP-NA (SEQ ID NO:59)具有至少95%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS04-AP-NA (SEQ ID NO:59)具有至少96%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS04-AP-NA (SEQ ID NO:59)具有至少97%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS04-AP-NA (SEQ ID NO:59)具有至少98%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS04-AP-NA (SEQ ID NO:59)具有至少99%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列為CS04-AP-NA (SEQ ID NO:59)。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽亦包括信號肽(例如第IX因子信號肽)及/或原肽(例如第IX因子原肽)。在一些實施例中，信號肽為野生型第IX因子信號肽(FIX-SP-AA (SEQ ID NO:37))。在一些實施例中，信號肽係由與CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)具有高度序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%或99%)的密碼子改變之聚核苷酸序列編碼。在一些實施例中，原肽為野生型第IX因子原肽(FIX-PP-AA (SEQ ID NO:38))。在一些實施例中，原肽係由與CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)具有高度序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%或99%)的密碼子改變之聚核苷酸序列編碼。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽，例如由與CS04-LC-NA (SEQ ID NO:46)及CS04-HC-NA (SEQ ID NO:45)具有高度序列同源性之聚核苷酸編碼之多肽，與野生型成熟第IX因子單鏈多肽序列FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)及/或成熟Padua (hFIX(R384L))單鏈序列FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有高度序列一致性。經編碼之第IX因子多肽應保留變得活化為功能第IX因子a蛋白之能力(例如藉由移除任何信號肽及原肽，及藉由切除活化多肽)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少85%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少90%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少95%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少96%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少97%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少98%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.5%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.9%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少85%一致性且包括在前原多肽之位置384 (例如成熟第IX因子單鏈多肽FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之位置338)處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少90%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少95%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少96%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少97%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少98%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.5%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.9%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構A之自身互補聚核苷酸之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構B之自身互補聚核苷酸之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構C之聚核苷酸(例如單股聚核苷酸)之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構D之聚核苷酸(例如單股聚核苷酸)之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。CS05 密碼子改變之聚核苷酸
在一個實施例中，本文所提供之核酸組合物包括編碼單鏈第IX因子多肽之第IX因子聚核苷酸(例如密碼子改變之聚核苷酸)，其中第IX因子聚核苷酸包括與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有降低之GC含量。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有數目減少之CpG二核苷酸。
在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有至少95%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有至少96%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有至少97%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有至少98%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有至少99%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有至少99.5%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有至少99.9%一致性。在另一個特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列為CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)。
在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於60%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於59%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於58%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於57%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於56%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於55%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至60%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至59%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至58%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至57%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至56%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至55%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±1.0之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.8之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.6之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.5之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.4之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.3之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.2之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.1之GC含量。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%之GC含量。
在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於15個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於12個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於10個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於9個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於8個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於7個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於6個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於5個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於4個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於3個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於2個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於1個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列不具有CpG二核苷酸。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽，例如由與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列同源性之聚核苷酸編碼之多肽，與野生型第IX因子前原蛋白序列FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)及/或Padua (hFIX(R384L))前原蛋白序列FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有高度序列一致性。經編碼之第IX因子多肽應保留變得活化為功能第IX因子a蛋白之能力(例如藉由移除信號肽及原肽，及藉由切除活化多肽)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少85%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少90%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少95%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少96%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少97%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少98%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少99%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少99.5%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少99.9%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少85%一致性且包括在前原多肽之位置384 (例如成熟第IX因子單鏈多肽FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之位置338)處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少90%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少95%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少96%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少97%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少98%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少99%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少99.5%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少99.9%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)。
在一個實施例中，本文所提供之核酸組合物包括編碼單鏈第IX因子多肽(例如具有絲胺酸蛋白酶活性)之第IX因子聚核苷酸(例如密碼子改變之聚核苷酸)，其中第IX因子聚核苷酸包括與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有降低之GC含量。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有數目減少之CpG二核苷酸。
在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有至少95%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有至少96%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有至少97%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有至少98%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有至少99%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有至少99.5%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有至少99.9%一致性。在另一個特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列為CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)。
在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於60%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於59%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於58%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於57%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於56%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於55%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至60%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至59%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至58%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至57%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至56%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至55%之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±1.0之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.8之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.6之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.5之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.4之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.3之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.2之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.1之GC含量。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%之GC含量。
在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於15個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於12個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於10個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於9個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於8個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於7個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於6個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於5個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於4個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於3個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於2個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於1個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列不具有CpG二核苷酸。
在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸進一步包括編碼具有FIX-SP-AA (SEQ ID NO:37)之胺基酸序列之第IX因子信號肽的第IX因子信號聚核苷酸。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。
在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸進一步包括編碼具有FIX-PP-AA (SEQ ID NO:38)之胺基酸序列之第IX因子原肽的第IX因子原肽聚核苷酸。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。
在一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸進一步包括編碼具有FIX-PPP-AA (SEQ ID NO:36)之胺基酸序列之第IX因子前原肽的第IX因子前原肽聚核苷酸。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS02-PPP-NA (SEQ ID NO:19)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS03-PPP-NA (SEQ ID NO:20)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS04-PPP-NA (SEQ ID NO:21)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS05-PPP-NA (SEQ ID NO:22)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS06-PPP-NA (SEQ ID NO:23)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽，例如由與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有高度序列同源性之聚核苷酸編碼之多肽，與野生型成熟第IX因子單鏈多肽序列FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)及/或成熟Padua (hFIX(R384L))單鏈序列FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有高度序列一致性。經編碼之第IX因子多肽應保留變得活化為功能第IX因子a蛋白之能力(例如藉由移除任何信號肽及原肽，及藉由切除活化多肽)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少85%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少90%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少95%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少96%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少97%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少98%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.5%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.9%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少85%一致性且包括在前原多肽之位置384 (例如成熟第IX因子單鏈多肽FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之位置338)處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少90%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少95%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少96%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少97%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少98%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.5%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.9%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)。
在一個實施例中，本文所提供之密碼子改變之聚核苷酸編碼單鏈第IX因子多肽，其包括輕鏈、重鏈及將輕鏈之C端連接至重鏈之N端的多肽連接子。第IX因子多肽之輕鏈係由與CS05-LC-NA (SEQ ID NO:48)具有高度序列一致性之第一核苷酸序列編碼，該第一核苷酸序列為編碼第IX因子輕鏈之CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)之部分。第IX因子多肽之重鏈係由與CS05-HC-NA (SEQ ID NO:47)具有高度序列一致性之第二核苷酸序列編碼，該第二核苷酸序列為編碼第IX因子重鏈之CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)之部分。多肽連接子包括第XI因子裂解位點，其允許活體內成熟(例如在前驅體單鏈第IX因子多肽表現之後)。
在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS05-LC-NA及CS05-HC-NA (SEQ ID NO:48及47)具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS05-LC-NA及CS05-HC-NA (SEQ ID NO:48及47)具有至少96%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS05-LC-NA及CS05-HC-NA (SEQ ID NO:48及47)具有至少97%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS05-LC-NA及CS05-HC-NA (SEQ ID NO:48及47)具有至少98%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS05-LC-NA及CS05-HC-NA (SEQ ID NO:48及47)具有至少99%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS05-LC-NA及CS05-HC-NA (SEQ ID NO:48及47)具有至少99.5%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS05-LC-NA及CS05-HC-NA (SEQ ID NO:48及47)具有至少99.9%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別為CS05-LC-NA及CS05-HC-NA (SEQ ID NO:48及47)。
在一些實施例中，第IX因子構築體之多肽連接子係由與CS05-AP-NA (SEQ ID NO:60)具有高度序列一致性之第三核苷酸序列編碼，該第三核苷酸序列為編碼野生型第IX因子活化多肽，例如FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)之胺基酸192-226的密碼子改變之序列。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS05-AP-NA (SEQ ID NO:60)具有至少80%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS05-AP-NA (SEQ ID NO:60)具有至少90%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS05-AP-NA (SEQ ID NO:60)具有至少95%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS05-AP-NA (SEQ ID NO:60)具有至少96%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS05-AP-NA (SEQ ID NO:60)具有至少97%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS05-AP-NA (SEQ ID NO:60)具有至少98%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS05-AP-NA (SEQ ID NO:60)具有至少99%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列為CS05-AP-NA (SEQ ID NO:60)。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽亦包括信號肽(例如第IX因子信號肽)及/或原肽(例如第IX因子原肽)。在一些實施例中，信號肽為野生型第IX因子信號肽(FIX-SP-AA (SEQ ID NO:37))。在一些實施例中，信號肽係由與CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)具有高度序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%或99%)的密碼子改變之聚核苷酸序列編碼。在一些實施例中，原肽為野生型第IX因子原肽(FIX-PP-AA (SEQ ID NO:38))。在一些實施例中，原肽係由與CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)具有高度序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%或99%)的密碼子改變之聚核苷酸序列編碼。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽，例如由與CS05-LC-NA (SEQ ID NO:48)及CS05-HC-NA (SEQ ID NO:47)具有高度序列同源性之聚核苷酸編碼之多肽，與野生型成熟第IX因子單鏈多肽序列FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)及/或成熟Padua (hFIX(R384L))單鏈序列FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有高度序列一致性。經編碼之第IX因子多肽應保留變得活化為功能第IX因子a蛋白之能力(例如藉由移除任何信號肽及原肽，及藉由切除活化多肽)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少85%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少90%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少95%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少96%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少97%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少98%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.5%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.9%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少85%一致性且包括在前原多肽之位置384 (例如成熟第IX因子單鏈多肽FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之位置338)處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少90%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少95%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少96%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少97%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少98%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.5%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.9%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構A之自身互補聚核苷酸之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構B之自身互補聚核苷酸之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構C之聚核苷酸(例如單股聚核苷酸)之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構D之聚核苷酸(例如單股聚核苷酸)之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。CS06 密碼子改變之聚核苷酸
在一個實施例中，本文所提供之核酸組合物包括編碼單鏈第IX因子多肽之第IX因子聚核苷酸(例如密碼子改變之聚核苷酸)，其中第IX因子聚核苷酸包括與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有降低之GC含量。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有數目減少之CpG二核苷酸。
在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有至少95%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有至少96%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有至少97%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有至少98%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有至少99%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有至少99.5%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有至少99.9%一致性。在另一個特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列為CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)。
在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於60%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於59%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於58%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於57%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於56%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於55%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至60%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至59%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至58%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至57%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至56%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至55%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±1.0之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.8之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.6之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.5之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.4之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.3之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.2之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.1之GC含量。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%之GC含量。
在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於15個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於12個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於10個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於9個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於8個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於7個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於6個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於5個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於4個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於3個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於2個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於1個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列不具有CpG二核苷酸。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽，例如由與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列同源性之聚核苷酸編碼之多肽，與野生型第IX因子前原蛋白序列FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)及/或Padua (hFIX(R384L))前原蛋白序列FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有高度序列一致性。經編碼之第IX因子多肽應保留變得活化為功能第IX因子a蛋白之能力(例如藉由移除信號肽及原肽，及藉由切除活化多肽)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少85%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少90%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少95%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少96%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少97%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少98%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少99%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少99.5%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)具有至少99.9%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少85%一致性且包括在前原多肽之位置384 (例如成熟第IX因子單鏈多肽FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之位置338)處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少90%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少95%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少96%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少97%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少98%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少99%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少99.5%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)具有至少99.9%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4)。
在一個實施例中，本文所提供之核酸組合物包括編碼單鏈第IX因子多肽(例如具有絲胺酸蛋白酶活性)之第IX因子聚核苷酸(例如密碼子改變之聚核苷酸)，其中第IX因子聚核苷酸包括與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有降低之GC含量。在一些實施例中，與野生型第IX因子編碼序列(FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1))相比，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之核苷酸序列具有數目減少之CpG二核苷酸。
在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有至少95%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有至少96%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有至少97%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有至少98%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有至少99%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有至少99.5%一致性。在特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有至少99.9%一致性。在另一個特定實施例中，密碼子改變之聚核苷酸之序列為CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)。
在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於60%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於59%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於58%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於57%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於56%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於55%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有小於54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至60%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至59%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至58%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至57%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至56%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至55%之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有50%至54%之GC含量。
在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±1.0之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.8之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.6之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.5之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.4之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.3之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.2之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%±0.1之GC含量。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有53.8%之GC含量。
在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於15個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於12個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於10個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於9個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於8個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於7個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於6個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於5個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於4個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於3個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於2個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列具有不多於1個CpG二核苷酸。在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性的密碼子改變之聚核苷酸之序列不具有CpG二核苷酸。
在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸進一步包括編碼具有FIX-SP-AA (SEQ ID NO:37)之胺基酸序列之第IX因子信號肽的第IX因子信號聚核苷酸。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子信號聚核苷酸具有與CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。
在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸進一步包括編碼具有FIX-PP-AA (SEQ ID NO:38)之胺基酸序列之第IX因子原肽的第IX因子原肽聚核苷酸。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子原肽聚核苷酸具有與CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。
在一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸進一步包括編碼具有FIX-PPP-AA (SEQ ID NO:36)之胺基酸序列之第IX因子前原肽的第IX因子前原肽聚核苷酸。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS02-PPP-NA (SEQ ID NO:19)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS03-PPP-NA (SEQ ID NO:20)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS04-PPP-NA (SEQ ID NO:21)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS05-PPP-NA (SEQ ID NO:22)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子前原肽聚核苷酸具有與CS06-PPP-NA (SEQ ID NO:23)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽，例如由與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有高度序列同源性之聚核苷酸編碼之多肽，與野生型成熟第IX因子單鏈多肽序列FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)及/或成熟Padua (hFIX(R384L))單鏈序列FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有高度序列一致性。經編碼之第IX因子多肽應保留變得活化為功能第IX因子a蛋白之能力(例如藉由移除任何信號肽及原肽，及藉由切除活化多肽)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少85%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少90%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少95%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少96%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少97%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少98%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.5%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.9%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少85%一致性且包括在前原多肽之位置384 (例如成熟第IX因子單鏈多肽FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之位置338)處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少90%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少95%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少96%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少97%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少98%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.5%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.9%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)。
在一個實施例中，本文所提供之密碼子改變之聚核苷酸編碼單鏈第IX因子多肽，其包括輕鏈、重鏈及將輕鏈之C端連接至重鏈之N端的多肽連接子。第IX因子多肽之輕鏈係由與CS06-LC-NA (SEQ ID NO:50)具有高度序列一致性之第一核苷酸序列編碼，該第一核苷酸序列為編碼第IX因子輕鏈之CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)之部分。第IX因子多肽之重鏈係由與CS06-HC-NA (SEQ ID NO:49)具有高度序列一致性之第二核苷酸序列編碼，該第二核苷酸序列為編碼第IX因子重鏈之CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)之部分。多肽連接子包括第XI因子裂解位點，其允許活體內成熟(例如在前驅體單鏈第IX因子多肽表現之後)。
在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS06-LC-NA及CS06-HC-NA (SEQ ID NO:50及49)具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS06-LC-NA及CS06-HC-NA (SEQ ID NO:50及49)具有至少96%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS06-LC-NA及CS06-HC-NA (SEQ ID NO:50及49)具有至少97%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS06-LC-NA及CS06-HC-NA (SEQ ID NO:50及49)具有至少98%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS06-LC-NA及CS06-HC-NA (SEQ ID NO:50及49)具有至少99%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS06-LC-NA及CS06-HC-NA (SEQ ID NO:50及49)具有至少99.5%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別與CS06-LC-NA及CS06-HC-NA (SEQ ID NO:50及49)具有至少99.9%序列一致性。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別為CS06-LC-NA及CS06-HC-NA (SEQ ID NO:50及49)。
在一些實施例中，第IX因子構築體之多肽連接子係由與CS06-AP-NA (SEQ ID NO:61)具有高度序列一致性之第三核苷酸序列編碼，該第三核苷酸序列為編碼野生型第IX因子活化多肽，例如FIX-FL-AA (SEQ ID NO:2)之胺基酸192-226的密碼子改變之序列。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS06-AP-NA (SEQ ID NO:61)具有至少80%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS06-AP-NA (SEQ ID NO:61)具有至少90%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS06-AP-NA (SEQ ID NO:61)具有至少95%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS06-AP-NA (SEQ ID NO:61)具有至少96%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS06-AP-NA (SEQ ID NO:61)具有至少97%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS06-AP-NA (SEQ ID NO:61)具有至少98%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與CS06-AP-NA (SEQ ID NO:61)具有至少99%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列為CS06-AP-NA (SEQ ID NO:61)。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽亦包括信號肽(例如第IX因子信號肽)及/或原肽(例如第IX因子原肽)。在一些實施例中，信號肽為野生型第IX因子信號肽(FIX-SP-AA (SEQ ID NO:37))。在一些實施例中，信號肽係由與CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)具有高度序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%或99%)的密碼子改變之聚核苷酸序列編碼。在一些實施例中，原肽為野生型第IX因子原肽(FIX-PP-AA (SEQ ID NO:38))。在一些實施例中，原肽係由與CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)具有高度序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%或99%)的密碼子改變之聚核苷酸序列編碼。
在一些實施例中，經編碼之第IX因子多肽，例如由與CS06-LC-NA (SEQ ID NO:50)及CS06-HC-NA (SEQ ID NO:49)具有高度序列同源性之聚核苷酸編碼之多肽，與野生型成熟第IX因子單鏈多肽序列FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)及/或成熟Padua (hFIX(R384L))單鏈序列FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有高度序列一致性。經編碼之第IX因子多肽應保留變得活化為功能第IX因子a蛋白之能力(例如藉由移除任何信號肽及原肽，及藉由切除活化多肽)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少85%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少90%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少95%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少96%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少97%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少98%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.5%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)具有至少99.9%一致性。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIX-MP-AA (SEQ ID NO:10)。
在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少85%一致性且包括在前原多肽之位置384 (例如成熟第IX因子單鏈多肽FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之位置338)處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少90%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少95%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少96%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少97%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少98%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.5%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)具有至少99.9%一致性且包括在前原多肽之位置384處之白胺酸。在一個實施例中，經編碼之第IX因子多肽之序列為FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構A之自身互補聚核苷酸之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構B之自身互補聚核苷酸之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構C之聚核苷酸(例如單股聚核苷酸)之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。
在一些實施例中，參考圖1，提供包括結構D之聚核苷酸(例如單股聚核苷酸)之核酸組合物，其中聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼成熟第IX因子多肽之核酸序列，其與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子信號肽之核酸序列，其與FIX-SP-NA (SEQ ID NO:24)、CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)及CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分亦包括編碼第IX因子原肽之核酸序列(視情況與如上文所述之針對第IX因子信號肽之核酸序列組合)，其與FIX-PP-NA (SEQ ID NO:30)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)及CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)中之一者具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。在一些實施例中，聚核苷酸之FIX編碼序列部分包括編碼前原第IX因子多肽之核酸序列，其與CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性。C. 密碼子改變之第 IX 因子信號及原肽
在一個態樣中，本揭示案提供編碼第IX因子信號肽、第IX因子原肽及兩者(例如第IX因子前原肽)之密碼子改變之聚核苷酸。此等密碼子改變之聚核苷酸改良第IX因子表現且可置放於例如經密碼子改變或以其他方式編碼第IX因子單鏈多肽(例如第IX因子輕鏈、活化肽及重鏈)之聚核苷酸的上游。一般而言，經編碼之肽為野生型第IX因子信號肽(例如FIX-SP-AA (SEQ ID NO:37))、原肽(例如FIX-PP-AA (SEQ ID NO:38)及前原肽(FIX-PPP-AA (SEQ ID NO:36))。
在某些實施例中，編碼第IX因子信號肽、原肽及前原肽之密碼子改變之聚核苷酸的序列與CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)、CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)、CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)、CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)、CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)、CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)、CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)、CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)、CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)、CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)、CS02-PPP-NA (SEQ ID NO:19)、CS03-PPP-NA (SEQ ID NO:20)、CS04-PPP-NA (SEQ ID NO:21)、CS05-PPP-NA (SEQ ID NO:22)及CS06-PPP-NA (SEQ ID NO:23)中之一者具有高度一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)。CS02 信號及原肽
在一個實施例中，編碼第IX因子信號肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)具有至少95%序列一致性。在其他實施例中，編碼第IX因子信號肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25)具有至少96%、97%、98%、99%或100%一致性。
在一個實施例中，編碼第IX因子原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)具有至少95%序列一致性。在其他實施例中，編碼第IX因子原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31)具有至少96%、97%、98%、99%或100%一致性。
在一個實施例中，編碼第IX因子前原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS02-PPP-NA (SEQ ID NO:19)具有至少95%序列一致性。在其他實施例中，編碼第IX因子前原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS02-PPP-NA (SEQ ID NO:19)具有至少96%、97%、98%、99%或100%一致性。CS03 信號及原肽
在一個實施例中，編碼第IX因子信號肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)具有至少95%序列一致性。在其他實施例中，編碼第IX因子信號肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26)具有至少96%、97%、98%、99%或100%一致性。
在一個實施例中，編碼第IX因子原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)具有至少95%序列一致性。在其他實施例中，編碼第IX因子原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32)具有至少96%、97%、98%、99%或100%一致性。
在一個實施例中，編碼第IX因子前原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS03-PPP-NA (SEQ ID NO:20)具有至少95%序列一致性。在其他實施例中，編碼第IX因子前原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS03-PPP-NA (SEQ ID NO:20)具有至少96%、97%、98%、99%或100%一致性。CS04 信號及原肽
在一個實施例中，編碼第IX因子信號肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)具有至少95%序列一致性。在其他實施例中，編碼第IX因子信號肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27)具有至少96%、97%、98%、99%或100%一致性。
在一個實施例中，編碼第IX因子原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)具有至少95%序列一致性。在其他實施例中，編碼第IX因子原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33)具有至少96%、97%、98%、99%或100%一致性。
在一個實施例中，編碼第IX因子前原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS04-PPP-NA (SEQ ID NO:21)具有至少95%序列一致性。在其他實施例中，編碼第IX因子前原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS04-PPP-NA (SEQ ID NO:21)具有至少96%、97%、98%、99%或100%一致性。CS05 信號及原肽
在一個實施例中，編碼第IX因子信號肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)具有至少95%序列一致性。在其他實施例中，編碼第IX因子信號肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28)具有至少96%、97%、98%、99%或100%一致性。
在一個實施例中，編碼第IX因子原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)具有至少95%序列一致性。在其他實施例中，編碼第IX因子原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34)具有至少96%、97%、98%、99%或100%一致性。
在一個實施例中，編碼第IX因子前原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS05-PPP-NA (SEQ ID NO:22)具有至少95%序列一致性。在其他實施例中，編碼第IX因子前原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS05-PPP-NA (SEQ ID NO:22)具有至少96%、97%、98%、99%或100%一致性。CS06 信號及原肽
在一個實施例中，編碼第IX因子信號肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)具有至少95%序列一致性。在其他實施例中，編碼第IX因子信號肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29)具有至少96%、97%、98%、99%或100%一致性。
在一個實施例中，編碼第IX因子原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)具有至少95%序列一致性。在其他實施例中，編碼第IX因子原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35)具有至少96%、97%、98%、99%或100%一致性。
在一個實施例中，編碼第IX因子前原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS06-PPP-NA (SEQ ID NO:23)具有至少95%序列一致性。在其他實施例中，編碼第IX因子前原肽之密碼子改變之聚核苷酸與CS06-PPP-NA (SEQ ID NO:23)具有至少96%、97%、98%、99%或100%一致性。IV. 第 IX 因子表現載體
在一些實施例中，本文所述之密碼子改變之聚核苷酸整合至表現載體中。如熟習此項技術者將瞭解，許多形式之載體可用於實行使用本文所揭示之密碼子改變之第IX因子聚核苷酸序列的第IX因子基因療法。表現載體之非限制性實例包括病毒載體(例如適合用於基因療法之載體)、質體載體、噬菌體載體、黏接質體、噬菌粒、人工染色體及其類似物。
在一些實施例中，本文所述之密碼子改變之聚核苷酸整合至病毒基因療法載體中。病毒載體之非限制性實例包括：反轉錄病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MMLV)、哈維鼠肉瘤病毒(Harvey murine sarcoma virus)、鼠類乳房腫瘤病毒及勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)；腺病毒、腺相關病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)；乳頭狀瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒；及脊髓灰質炎病毒。
第IX因子在活體內主要在肝中合成。因而，已靶向肝細胞作為用於第IX因子基因療法構築體之適合宿主細胞。已顯示若干種類之病毒載體能夠肝靶向遞送基因療法構築體，包括反轉錄病毒載體(參見例如Axelrod等人, 1990；Kay等人, 1992；Van den Driessche等人, 1999；及Xu等人, 2003, 2005，其揭示內容出於所有目的藉此以全文引用之方式明確併入)、慢病毒(參見例如Ward等人, 2011；Brown等人, 2007；及Matrai等人, 2011，其揭示內容出於所有目的藉此以全文引用之方式明確併入)、腺相關病毒(AAV) (參見例如Herzog等人, 1999，其揭示內容出於所有目的藉此以全文引用之方式明確併入)及腺病毒載體(參見例如Brown等人, 2004；及Ehrhardt與Kay, 2002，其揭示內容出於所有目的藉此以全文引用之方式明確併入)。
在一些實施例中，基因療法載體為反轉錄病毒且尤其為複製缺陷型反轉錄病毒。用於產生複製缺陷型反轉錄病毒之方案在此項技術中為已知的。對於評述，參見Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990)；及Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, 第7卷, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991)。
在一個實施例中，基因療法載體為基於腺相關病毒(AAV)之基因療法載體。AAV系統先前已有描述且在此項技術中一般為熟知的(Kelleher及Vos, Biotechniques, 17(6):1110-17 (1994)；Cotten等人, P.N.A.S. U.S.A., 89(13):6094-98 (1992)；Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64 (1994)；Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129 (1992)；及Asokan A等人, Mol. Ther., 20(4):699-708 (2012)，其各自出於所有目的以全文引用之方式併入本文中)。關於產生及使用rAAV載體之細節描述於例如美國專利第5,139,941號及第4,797,368號中，其各自出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。在特定實施例中，AAV載體為AAV-8載體。
用於肝特異性第IX因子表現之例示性AAV遞送載體描述於WO 2009/130208中，其內容出於所有目的以全文引用之方式明確併入本文中。載體為編碼人類第IX因子之單股AAV載體，且包括驅動因子cDNA之TTR Serp調節序列。載體亦包括人類第IX因子基因之內含子I及聚腺苷酸化信號。
在一些實施例中，本文所述之密碼子改變之聚核苷酸整合至反轉錄病毒表現載體中。此等系統先前已有描述且在此項技術中一般為熟知的(Mann等人,Cell , 33:153-159, 1983；Nicolas及Rubinstein, Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez及Denhardt編, Stoneham: Butterworth, 第494-513頁, 1988；Temin, Gene Transfer, Kucherlapati (編), New York: Plenum Press, 第149-188頁, 1986)。在特定實施例中，反轉錄病毒載體為慢病毒載體(參見例如Naldini等人,Science , 272(5259):263-267, 1996；Zufferey等人,Nat Biotechnol , 15(9):871-875, 1997；Blomer等人,J Virol. , 71(9):6641-6649, 1997；美國專利第6,013,516號及第5,994,136號)。
在一些實施例中，可藉由非病毒方法向個體投與本文所述之密碼子改變之聚核苷酸。舉例而言，可藉由電穿孔、聲孔效應、粒子轟擊或流體動力學遞送向細胞中投與裸DNA。亦可用聚合物，例如脂質體、聚核糖體、聚合物複合物(polypleses)、樹枝狀聚合物囊封或偶合DNA，且作為複合物向個體投與。同樣地，DNA可偶合至無機奈米粒子，例如金、二氧化矽、氧化鐵或磷酸鈣粒子，或附接至細胞穿透肽用於活體內遞送至細胞。
密碼子改變之第IX因子編碼聚核苷酸亦可併入人工染色體中，諸如人工染色體表現(ACE) (參見例如Lindenbaum等人, Nucleic Acids Res., 32(21):e172 (2004))及哺乳動物人工染色體(MAC)。對於評述，參見例如Pérez-Luz及Díaz-Nido, J Biomed Biotechnol. 2010：文章編號642804 (2010)。
多種載體可用於來自密碼子改變之多肽的第IX因子多肽在細胞培養物中之表現，包括真核及原核表現載體。在某些實施例中，質體載體預期用於在細胞培養物中表現第IX因子多肽。一般而言，含有來源於與宿主細胞相容之物種之複製子及控制序列的質體載體與此等宿主相結合使用。載體可運載複製位點，以及能夠在經轉型細胞中提供表型選擇之標記序列。質體將包括編碼第IX因子多肽之密碼子改變之聚核苷酸，其可操作地連接至一或多個控制序列，例如啟動子。
用於原核表現之載體之非限制性實例包括質體，諸如pRSET、pET、pBAD等，其中用於原核表現載體中之啟動子包括lac、trc、trp、recA、araBAD等。用於真核表現之載體之實例包括：(i)對於在酵母中表現，載體諸如pAO、pPIC、pYES、pMET，使用諸如AOX1、GAP、GAL1、AUG1等啟動子；(ii)對於在昆蟲細胞中表現，載體諸如pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC等，使用諸如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等啟動子；及(iii)對於在哺乳動物細胞中表現，載體諸如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等，及來源於諸如牛痘病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、反轉錄病毒等病毒系統之載體，使用諸如CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV及β-肌動蛋白之啟動子。
在一些實施例中，本揭示案提供AAV基因療法載體，其包括如本文所述之密碼子改變之第IX因子聚核苷酸、在載體之5'及3'端之內部末端重複(ITR)序列、可操作地連接至第IX因子聚核苷酸之一或多個啟動子及/或增強子序列，及在第IX因子聚核苷酸序列之3'端之後的聚腺苷酸化信號。在一些實施例中，一或多個啟動子及/或增強子序列包括肝特異性調控元件之一或多個複本。
圖1說明根據一些實施之第IX因子基因療法載體之若干例示性架構。圖1A說明自身互補AAV載體，其具有突變之5' ITR、截短之TTR增強子/啟動子序列、MVM病毒內含子序列、密碼子改變之第IX因子編碼序列、聚腺苷酸化序列及3'-ITR。圖1B說明編碼第IX因子多肽之自身互補AAV載體，其類似於圖1A，但進一步包括一或多個(例如一個、兩個、三個或更多個)肝特異性調控元件。圖1C說明單股載體，其具有與圖1A相同之元件，不同之處在於5'-ITR未突變，防止自身互補。圖1D說明編碼第IX因子多肽之單股AAV載體，其類似於圖1A，但進一步包括一或多個(例如一個、兩個、三個或更多個)肝特異性調控元件。儘管在圖1中參考包括R384L 『Padua』胺基酸取代之第IX因子蛋白說明，但在一些實施例中，具有如圖1中所描繪之一般結構(例如結構A、B、C或D)之第IX因子核苷酸構築體編碼不包括R384L 『Padua』胺基酸取代之第IX因子蛋白。
圖25展示AAV第IX因子基因療法載體CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO:40)之核苷酸序列，其例示圖1D中所說明之基因療法載體架構。CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO:40)之核苷酸1-145為AAV2 5'-ITR序列(SEQ ID NO:51)。5'-ITR序列之後為在核苷酸165-236、238-309及311-382處之肝特異性CRM8調控元件CRM8 (SEQ ID NO:39)之三個複本。CRM8序列之後為在核苷酸383-712處之截短之TTR增強子/啟動子序列(SEQ ID NO:52)。接著，載體包括在核苷酸724-800處之小鼠(MVM)內含子(SEQ ID NO:53)之微小病毒。載體之核苷酸814-2199為CS06密碼子改變之第IX因子(R384L)編碼序列(CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9))。第IX因子聚核苷酸序列之後為在核苷酸2208-2441處之BGH聚腺苷酸化信號，且最後為在核苷酸2458-2602處之AAV2 3'-ITR序列(SEQ ID NO:55)。
在一些實施例中，本揭示案提供第IX因子聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO:40之核苷酸1-2602具有至少95%一致性之序列。在一些實施例中，本揭示案提供第IX因子聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO:40之核苷酸1-2602具有至少99%一致性之序列。在一些實施例中，本揭示案提供第IX因子聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO:40之核苷酸1-2602具有至少99.5%一致性之序列。在一些實施例中，本揭示案提供第IX因子聚核苷酸，其包含SEQ ID NO:40之核苷酸1-2602之序列。
已對若干AAV血清型進行特徵化，包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8及AAV9。一般而言，任何AAV血清型可用於本文所述之第IX因子基因療法構築體。然而，血清型具有不同趨向性，例如其優先感染不同組織。在一個實施例中，因為第IX因子主要在肝中產生，所以基於肝趨向性選擇所揭示之基因療法構築體之AAV血清型，所述肝趨向性至少在血清型AAV7、AAV8及AAV9中發現。因此，在一個實施例中，第IX因子基因療法構築體為AAV7血清型載體。在另一個實施例中，第IX因子基因療法構築體為AAV8血清型載體。在又一個實施例中，第IX因子基因療法構築體為AAV9血清型載體。
本文所述之第IX因子基因療法構築體可為單股(例如ssAAV載體，如圖1C及1D中所說明)或自身互補(例如scAAV載體，如圖1A及1B中所說明)。儘管研究及理論已表明自身互補AAV載體應有助於更佳轉殖基因表現，但如實例5中所報導，藉由避開在轉譯之前第二股合成之需要，鑑別出可比得上自身互補載體之促進更佳第IX因子表現之單股AAV載體。啟動子及增強子
本文所述之第IX因子基因療法構築體一般包括驅動活體內基因表現之一或多個啟動子及/或增強子元件，例如調節元件。在一些實施例中，啟動子或增強子元件以組織依賴性方式，例如主要在特異性組織中驅動表現。因為第IX因子主要在肝中合成，所以在一些實施例中，本文所述之基因療法載體包括肝特異性調節元件，其實質上將基因療法載體之表現限於肝細胞。
一般而言，肝特異性調節元件可來源於已知在肝中排他性地表現之任何基因。WO 2009/130208鑑別以肝特異性方式表現之若干基因，包括絲胺酸蛋白酶抑制因子肽酶抑制劑(serpin peptidase inhibitor)進化枝A成員1，亦稱為α-抗胰蛋白酶(SERPINA1；GeneID 5265)、脂蛋白元C-I (APOC1；GeneID 341)、脂蛋白元C-IV (APOC4；GeneID 346)、脂蛋白元H (APOH；GeneID 350)；轉甲狀腺素蛋白(transthyretin) (TTR；GeneID 7276)、白蛋白(ALB；GeneID 213)、醛縮酶B (ALDOB；GeneID 229)、細胞色素P450家族2亞家族E多肽1 (CYP2E1；GeneID 1571)、纖維蛋白原α鏈(FGA；GeneID 2243)、轉鐵蛋白(TF；GeneID 7018)、結合球蛋白相關蛋白(haptoglobin related protein) (HPR；GeneID 3250)。在一些實施例中，本文所述之第IX因子基因療法構築體包括來源於此等蛋白質中之一或多者之基因組基因座的肝特異性調節元件。此類元件之若干實例描述於WO 2009/130208中，其內容出於所有目的以全文引用之方式明確併入本文中。
肝特異性調節元件之一個實例來自轉甲狀腺素蛋白(TTR)基因，通常稱作「TTRe」或「TTREnh」。Hsieh J.L.等人, Cancer Sci., 100(3):537-45 (2009)，其內容出於所有目的以全文引用之方式明確併入本文中。在一些實施例中，本文所述之第IX因子基因療法構築體包括截短之TTR增強子及啟動子元件。此等元件之實例在以圖25提供之CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO:40)之核苷酸383-712處提供。在一些實施例中，截短之TTR增強子及啟動子元件與CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO:40)之核苷酸383-712具有至少85%序列一致性。在其他實施例中，截短之TTR增強子及啟動子元件與CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO:40)之核苷酸383-712具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%序列一致性。
肝特異性調節元件之另一個實例來自SERPINA1基因，如PCT公開案第WO 2016/146757號中所述，其內容出於所有目的以全文引用之方式明確併入本文中。此種元件之實例為在CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO:40)之核苷酸165-236處提供之CRM8調控元件(SEQ ID NO:39)。在一些實施例中，源自SERPINA1之調控元件與CRM8 (SEQ ID NO:39)具有至少85%序列一致性。在其他實施例中，截短之源自SERPINA1之調控元件與CRM8 (SEQ ID NO:39)具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。
在一些實施例中，第IX因子基因療法構築體包括一或多個源自SERPINA1之調控元件，如由圖1B及圖1D中說明之構築體所例示。在一個實施例中，構築體包括一個源自SERPINA1之調控元件(例如CRM8)。在另一個實施例中，構築體包括兩個源自SERPINA1之調控元件(例如CRM8)。在另一個實施例中，構築體包括三個源自SERPINA1之調控元件(例如CRM8)。在其他實施例中，構築體包括4個、5個、6個或更多個源自SERPINA1之調控元件(例如CRM8)。
在一個實施例中，第IX因子基因療法構築體包括一或多個源自SERPINA1之調控元件(例如CRM8)及截短之TTR增強子及啟動子元件，如圖1B、圖1D及圖25中所例示。內含子
在一些實施例中，本文所述之第IX因子基因療法構築體包括內含子，例如源自病毒之內含子，以增加第IX因子基因之表現。用於基因療法構築體之表現之適合內含子在此項技術中為已知的。典型地，內含子定位於轉殖基因編碼序列之5'處，如圖1及圖25所示之第IX因子構築體中所例示。然而，在一些實施例中，內含子可定位於轉殖基因編碼序列內，例如在天然第IX因子內含子接合點或別處，或在轉殖基因編碼序列之3'處。可用於本文所述之第IX因子基因療法構築體中之內含子之非限制性實例包括來源於小鼠(MVM)內含子、β-球蛋白內含子(betalVS-ll)、第IX因子(FIX)內含子A、猿猴病毒40 (SV40)小T內含子及β-肌動蛋白內含子之微小病毒之內含子。
在一個實施例中，本文所述之第IX因子基因療法構築體包括源自MVM之內含子，例如，如圖1中所說明及由圖25中在CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO:40)之核苷酸724-800處之MVM內含子(SEQ ID NO:53)所例示。在一些實施例中，用於本文所述之基因療法構築體中之內含子與MVM (SEQ ID NO:53)具有至少85%序列一致性。在其他實施例中，用於本文所述之基因療法構築體中之內含子與MVM (SEQ ID NO:53)具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。聚腺苷酸化信號
在一些實施例中，本文所述之第IX因子基因療法構築體包括聚腺苷酸化信號，例如，如圖1中所說明。聚腺苷酸化信號引導自第IX因子轉殖基因產生之mRNA轉錄物之3'端上之聚A尾(poly-A tail)的合成。因此，聚腺苷酸化信號定位於第IX因子編碼序列之3'處。可用於本文所述之第IX因子基因療法構築體中之聚腺苷酸化信號之非限制性實例包括來源於猿猴病毒40 (SV40)晚期基因、牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號及最小兔β-球蛋白(mRBG)基因之聚腺苷酸化信號。
在一個實施例中，本文所述之第IX因子基因療法構築體包括來源於牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號之聚腺苷酸化信號，例如，如圖1中所說明及由圖25中在CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO:40)之核苷酸2208-2441處之BGHpA信號(SEQ ID NO:54)所例示。在一些實施例中，用於本文所述之基因療法構築體中之聚腺苷酸化信號與BGHpA信號(SEQ ID NO:54)具有至少85%序列一致性。在其他實施例中，用於本文所述之基因療法構築體中之聚腺苷酸化信號與BGHpA信號(SEQ ID NO:54)具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。V. 方法 產生
本文所述之密碼子改變之第IX因子聚核苷酸及病毒載體(例如核酸組合物)係根據用於核酸擴增及載體產生之常規方法產生。已開發兩個主要平台用於大規模產生重組AAV載體。第一個平台係基於哺乳動物細胞中之複製，而第二個係基於無脊椎動物細胞中之複製。對於評述，參見Kotin R.M., Hum. Mol. Genet., 20(R1):R2-6 (2011)，其內容出於所有目的以全文引用之方式明確併入本文中。
因此，本揭示案提供用於產生腺相關病毒(AAV)粒子之方法。在一些實施例中，該等方法包括將如本文所述之與CS02、CS03、CS04、CS05或CS06序列中之一者具有高度核苷酸序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%)的密碼子改變之第IX因子聚核苷酸構築體引入宿主細胞中，其中聚核苷酸構築體能夠在該宿主細胞中複製。
在一些實施例中，宿主細胞為哺乳動物宿主細胞，例如HEK、CHO或BHK細胞。在特定實施例中，宿主細胞為HEK 293細胞。在一些實施例中，宿主細胞為無脊椎動物細胞，例如昆蟲細胞。在特定實施例中，宿主細胞為SF9細胞。調配物
本文提供用於治療出血病症之組合物。此類組合物含有治療有效量之密碼子改變之第IX因子聚核苷酸，例如包括如本文所述之編碼第IX因子之密碼子改變之聚核苷酸的AAV基因療法載體。將治療有效量之密碼子改變之FIX聚核苷酸(例如包括密碼子改變之第IX因子編碼序列之AAV基因療法載體)與適合之醫藥載劑或媒劑混合用於全身、表面或局部投與。本文所揭示之密碼子改變之第IX因子聚核苷酸的最終調配物將在熟習此項技術者之能力範圍內。劑量
向有需要之患者投與本發明之核酸組合物。所投與之基因療法治療劑之量或劑量視以下因素而定，諸如特定密碼子改變之FIX聚核苷酸構築體、所使用之遞送載體、疾病之嚴重性及個體之一般特徵。精確劑量將視治療目的而定，且將由熟習此項技術者使用已知技術可確定(參見例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms (第1-3卷, 1992)；Lloyd,The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)；Pickar,Dosage Calculations (1999)；及Remington: The Science and Practice of Pharmacy , 第20版, 2003, Gennaro編, Lippincott, Williams & Wilkins)。確定用於特定個體之治療的特定劑量及給藥方案在熟練醫師之能力範圍內。
在一些實施例中，向有需要之個體(例如患有輕度、中度或重度B型血友病之個體)以治療有效劑量靜脈內投與具有密碼子改變之第IX因子聚核苷酸之基因療法載體(例如AAV基因療法載體粒子)。在一些實施例中，治療有效劑量介於每公斤個體體重約2x1011 個與2x1014 個載體基因組之間。在特定實施例中，治療有效劑量介於每公斤個體體重約2x1012 個與2x1013 個載體基因組之間。在一些實施例中，向個體投與每公斤個體體重約2x1011 個、3x1011 個、4x1011 個、5x1011 個、6x1011 個、7x1011 個、8x1011 個、9x1011 個、1x1012 個、2x1012 個、3x1012 個、4x1012 個、5x1012 個、6x1012 個、7x1012 個、8x1012 個、9x1012 個、1x1013 個、2x1013 個、3x1013 個、4x1013 個、5x1013 個、6x1013 個、7x1013 個、8x1013 個、9x1013 個、1x1014 個或2x1014 個載體基因組。
因此，本揭示案提供用於治療第IX因子缺乏(例如B型血友病)之方法。在一些實施例中，該等方法包括向有需要之患者投與如本文所述之與CS02、CS03、CS04、CS05或CS06序列中之一者具有高度核苷酸序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%)的密碼子改變之第IX因子聚核苷酸構築體。在一些實施例中，密碼子改變之因子聚核苷酸與密碼子改變之第IX因子前原多肽編碼序列具有高度序列一致性，例如與CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5)、CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6)、CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7)、CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8)或CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9)中之一者具有高度序列一致性。在一些實施例中，密碼子改變之因子聚核苷酸與密碼子改變之成熟第IX因子單鏈多肽編碼序列具有高度序列一致性，例如與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)、CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)、CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)、CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)或CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)中之一者具有高度序列一致性。
在一些實施例中，治療包括向有需要之患者投與基因療法載體，其包括如本文所述之與CS02、CS03、CS04、CS05或CS06序列中之一者具有高度核苷酸序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%)的密碼子改變之第IX因子聚核苷酸構築體。在一個實施例中，基因療法載體為哺乳動物基因療法載體。在特定實施例中，哺乳動物基因療法載體為病毒載體，例如慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒或腺相關病毒載體。
在一個實施例中，基因療法載體為帶有編碼密碼子改變之第IX因子編碼序列之病毒載體的腺相關病毒(AAV)粒子。一般而言，病毒載體包括在各端處之反向末端重複(ITR)、一或多個表現調節元件、密碼子改變之第IX因子編碼序列及聚A信號序列。在特定實施例中，基因療法載體包括肝特異性調控元件(例如CRM8元件之一或多個複本)。投與含有 CS06 第 IX 因子聚核苷酸之 AAV 粒子
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重2.5x1011 個至2x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少97%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重2.5x1011 個至7.5x1011 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少97%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重7.5x1011 個至1.25x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少97%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重5x1011 個相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少97%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重1x1012 個相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少97%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)相比具有1至10個胺基酸取代。在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)相比具有1至5個胺基酸取代。在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)相比具有不多於1個胺基酸取代。在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白具有FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之胺基酸序列。
在藉由靜脈內輸注腺相關病毒(AAV)粒子用於治療B型血友病之方法的一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸操作性地連接至肝特異性啟動子元件。在一些實施例中，肝特異性啟動子元件包括與CRM8 (SEQ ID NO:39)具有至少95%序列一致性之啟動子聚核苷酸。在一些實施例中，肝特異性啟動子元件包括與CRM8 (SEQ ID NO:39)具有至少95%序列一致性之啟動子聚核苷酸之多個複本，例如啟動子聚核苷酸之2個、3個、4個或更多個複本。在一些實施例中，肝特異性啟動子元件包括與CRM8 (SEQ ID NO:39)具有至少95%序列一致性之啟動子聚核苷酸之三個複本。在一些實施例中，啟動子聚核苷酸具有CRM8 (SEQ ID NO:39)之核酸序列。
在藉由靜脈內輸注腺相關病毒(AAV)粒子用於治療B型血友病之方法的一些實施例中，與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸操作性地連接至內含子。在一些實施例中，內含子包括具有與MVMI (SEQ ID NO:53)至少95%一致之核酸序列的MVM內含子聚核苷酸。在一些實施例中，MVM內含子聚核苷酸具有MVMI (SEQ ID NO:53)之核酸序列。在一些實施例中，內含子定位於啟動子元件與編碼第IX因子多肽之核苷酸序列之轉譯起始位點之間。
在藉由靜脈內輸注包括與CS06-MP-NA (SEQ ID NO:17)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之腺相關病毒(AAV)粒子用於治療B型血友病之方法的一些實施例中，AAV粒子具有肝趨向性。在一些實施例中，AAV粒子具有AAV7血清型。在一些實施例中，AAV粒子具有AAV8血清型。在一些實施例中，AAV粒子具有AAV9血清型。投與含有 CS02 第 IX 因子聚核苷酸之 AAV 粒子
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重2.5x1011 個至2x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少95%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少96%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少97%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重2.5x1011 個至7.5x1011 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少95%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少96%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少97%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重7.5x1011 個至1.25x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少95%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少96%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少97%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重5x1011 個相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少95%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少96%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少97%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重1x1012 個相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少95%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少96%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少97%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)相比具有1至10個胺基酸取代。在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)相比具有1至5個胺基酸取代。在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)相比具有不多於1個胺基酸取代。在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白具有FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之胺基酸序列。
在藉由靜脈內輸注腺相關病毒(AAV)粒子用於治療B型血友病之方法的一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸操作性地連接至肝特異性啟動子元件。在一些實施例中，肝特異性啟動子元件包括與CRM8 (SEQ ID NO:39)具有至少95%序列一致性之啟動子聚核苷酸。在一些實施例中，肝特異性啟動子元件包括與CRM8 (SEQ ID NO:39)具有至少95%序列一致性之啟動子聚核苷酸之多個複本，例如啟動子聚核苷酸之2個、3個、4個或更多個複本。在一些實施例中，肝特異性啟動子元件包括與CRM8 (SEQ ID NO:39)具有至少95%序列一致性之啟動子聚核苷酸之三個複本。在一些實施例中，啟動子聚核苷酸具有CRM8 (SEQ ID NO:39)之核酸序列。
在藉由靜脈內輸注腺相關病毒(AAV)粒子用於治療B型血友病之方法的一些實施例中，與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸操作性地連接至內含子。在一些實施例中，內含子包括具有與MVMI (SEQ ID NO:53)至少95%一致之核酸序列的MVM內含子聚核苷酸。在一些實施例中，MVM內含子聚核苷酸具有MVMI (SEQ ID NO:53)之核酸序列。在一些實施例中，內含子定位於啟動子元件與編碼第IX因子多肽之核苷酸序列之轉譯起始位點之間。
在藉由靜脈內輸注包括與CS02-MP-NA (SEQ ID NO:13)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之腺相關病毒(AAV)粒子用於治療B型血友病之方法的一些實施例中，AAV粒子具有肝趨向性。在一些實施例中，AAV粒子具有AAV7血清型。在一些實施例中，AAV粒子具有AAV8血清型。在一些實施例中，AAV粒子具有AAV9血清型。投與含有 CS03 第 IX 因子聚核苷酸之 AAV 粒子
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重2.5x1011 個至2x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重2.5x1011 個至7.5x1011 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重7.5x1011 個至1.25x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重5x1011 個相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重1x1012 個相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)相比具有1至10個胺基酸取代。在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)相比具有1至5個胺基酸取代。在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)相比具有不多於1個胺基酸取代。在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白具有FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之胺基酸序列。
在藉由靜脈內輸注腺相關病毒(AAV)粒子用於治療B型血友病之方法的一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸操作性地連接至肝特異性啟動子元件。在一些實施例中，肝特異性啟動子元件包括與CRM8 (SEQ ID NO:39)具有至少95%序列一致性之啟動子聚核苷酸。在一些實施例中，肝特異性啟動子元件包括與CRM8 (SEQ ID NO:39)具有至少95%序列一致性之啟動子聚核苷酸之多個複本，例如啟動子聚核苷酸之2個、3個、4個或更多個複本。在一些實施例中，肝特異性啟動子元件包括與CRM8 (SEQ ID NO:39)具有至少95%序列一致性之啟動子聚核苷酸之三個複本。在一些實施例中，啟動子聚核苷酸具有CRM8 (SEQ ID NO:39)之核酸序列。
在藉由靜脈內輸注腺相關病毒(AAV)粒子用於治療B型血友病之方法的一些實施例中，與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸操作性地連接至內含子。在一些實施例中，內含子包括具有與MVMI (SEQ ID NO:53)至少95%一致之核酸序列的MVM內含子聚核苷酸。在一些實施例中，MVM內含子聚核苷酸具有MVMI (SEQ ID NO:53)之核酸序列。在一些實施例中，內含子定位於啟動子元件與編碼第IX因子多肽之核苷酸序列之轉譯起始位點之間。
在藉由靜脈內輸注包括與CS03-MP-NA (SEQ ID NO:14)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之腺相關病毒(AAV)粒子用於治療B型血友病之方法的一些實施例中，AAV粒子具有肝趨向性。在一些實施例中，AAV粒子具有AAV7血清型。在一些實施例中，AAV粒子具有AAV8血清型。在一些實施例中，AAV粒子具有AAV9血清型。投與含有 CS04 第 IX 因子聚核苷酸之 AAV 粒子
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重2.5x1011 個至2x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重2.5x1011 個至7.5x1011 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重7.5x1011 個至1.25x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重5x1011 個相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重1x1012 個相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)相比具有1至10個胺基酸取代。在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)相比具有1至5個胺基酸取代。在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)相比具有不多於1個胺基酸取代。在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白具有FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之胺基酸序列。
在藉由靜脈內輸注腺相關病毒(AAV)粒子用於治療B型血友病之方法的一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸操作性地連接至肝特異性啟動子元件。在一些實施例中，肝特異性啟動子元件包括與CRM8 (SEQ ID NO:39)具有至少95%序列一致性之啟動子聚核苷酸。在一些實施例中，肝特異性啟動子元件包括與CRM8 (SEQ ID NO:39)具有至少95%序列一致性之啟動子聚核苷酸之多個複本，例如啟動子聚核苷酸之2個、3個、4個或更多個複本。在一些實施例中，肝特異性啟動子元件包括與CRM8 (SEQ ID NO:39)具有至少95%序列一致性之啟動子聚核苷酸之三個複本。在一些實施例中，啟動子聚核苷酸具有CRM8 (SEQ ID NO:39)之核酸序列。
在藉由靜脈內輸注腺相關病毒(AAV)粒子用於治療B型血友病之方法的一些實施例中，與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸操作性地連接至內含子。在一些實施例中，內含子包括具有與MVMI (SEQ ID NO:53)至少95%一致之核酸序列的MVM內含子聚核苷酸。在一些實施例中，MVM內含子聚核苷酸具有MVMI (SEQ ID NO:53)之核酸序列。在一些實施例中，內含子定位於啟動子元件與編碼第IX因子多肽之核苷酸序列之轉譯起始位點之間。
在藉由靜脈內輸注包括與CS04-MP-NA (SEQ ID NO:15)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之腺相關病毒(AAV)粒子用於治療B型血友病之方法的一些實施例中，AAV粒子具有肝趨向性。在一些實施例中，AAV粒子具有AAV7血清型。在一些實施例中，AAV粒子具有AAV8血清型。在一些實施例中，AAV粒子具有AAV9血清型。投與含有 CS05 第 IX 因子聚核苷酸之 AAV 粒子
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重2.5x1011 個至2x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重2.5x1011 個至7.5x1011 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重7.5x1011 個至1.25x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重5x1011 個相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在一些實施例中，提供藉由向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤人類個體體重1x1012 個相關病毒(AAV)粒子之劑量用於治療B型血友病之方法，其中AAV粒子包括編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸具有與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列至少98%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列至少99%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列至少99.5%一致之核酸序列。在一些實施例中，第IX因子聚核苷酸具有CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)之核酸序列。在一些實施例中，相對於FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)，第IX因子聚核苷酸編碼在核苷酸位置1150-1152處之白胺酸。
在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)相比具有1至10個胺基酸取代。在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)相比具有1至5個胺基酸取代。在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白與FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)相比具有不多於1個胺基酸取代。在如上文所述之治療B型血友病之方法的一些實施例中，由第IX因子聚核苷酸編碼之第IX因子蛋白具有FIXp-MP-AA (SEQ ID NO:12)之胺基酸序列。
在藉由靜脈內輸注腺相關病毒(AAV)粒子用於治療B型血友病之方法的一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸操作性地連接至肝特異性啟動子元件。在一些實施例中，肝特異性啟動子元件包括與CRM8 (SEQ ID NO:39)具有至少95%序列一致性之啟動子聚核苷酸。在一些實施例中，肝特異性啟動子元件包括與CRM8 (SEQ ID NO:39)具有至少95%序列一致性之啟動子聚核苷酸之多個複本，例如啟動子聚核苷酸之2個、3個、4個或更多個複本。在一些實施例中，肝特異性啟動子元件包括與CRM8 (SEQ ID NO:39)具有至少95%序列一致性之啟動子聚核苷酸之三個複本。在一些實施例中，啟動子聚核苷酸具有CRM8 (SEQ ID NO:39)之核酸序列。
在藉由靜脈內輸注腺相關病毒(AAV)粒子用於治療B型血友病之方法的一些實施例中，與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸操作性地連接至內含子。在一些實施例中，內含子包括具有與MVMI (SEQ ID NO:53)至少95%一致之核酸序列的MVM內含子聚核苷酸。在一些實施例中，MVM內含子聚核苷酸具有MVMI (SEQ ID NO:53)之核酸序列。在一些實施例中，內含子定位於啟動子元件與編碼第IX因子多肽之核苷酸序列之轉譯起始位點之間。
在藉由靜脈內輸注包括與CS05-MP-NA (SEQ ID NO:16)具有高度序列一致性之第IX因子聚核苷酸之腺相關病毒(AAV)粒子用於治療B型血友病之方法的一些實施例中，AAV粒子具有肝趨向性。在一些實施例中，AAV粒子具有AAV7血清型。在一些實施例中，AAV粒子具有AAV8血清型。在一些實施例中，AAV粒子具有AAV9血清型。產生
本文所述之密碼子改變之第IX因子聚核苷酸及病毒載體(例如核酸組合物)係根據用於核酸擴增及載體產生之常規方法產生。已開發兩個主要平台用於大規模產生重組AAV載體。第一個平台係基於哺乳動物細胞中之複製，而第二個係基於無脊椎動物細胞中之複製。對於評述，參見Kotin R.M., Hum. Mol. Genet., 20(R1):R2-6 (2011)，其內容出於所有目的以全文引用之方式明確併入本文中。
因此，本揭示案提供用於產生腺相關病毒(AAV)粒子之方法。在一些實施例中，該等方法包括將如本文所述之與CS02、CS03、CS04、CS05或CS06序列中之一者具有高度核苷酸序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%)的密碼子改變之第IX因子聚核苷酸構築體引入宿主細胞中，其中聚核苷酸構築體能夠在該宿主細胞中複製。
在一些實施例中，宿主細胞為哺乳動物宿主細胞，例如HEK、CHO或BHK細胞。在特定實施例中，宿主細胞為HEK 293細胞。在一些實施例中，宿主細胞為無脊椎動物細胞，例如昆蟲細胞。在特定實施例中，宿主細胞為SF9細胞。治療
在一些實施例中，根據已知投藥方法向有需要之個體投與本文所述之核酸組合物(例如密碼子改變之聚核苷酸)。用於投與基因療法載體之方法在此項技術中為熟知的。此等方法包括但不限於靜脈內投與、肌肉內注射、間質注射及肝內投與(例如肝內動脈或靜脈)。舉例而言，對於評述，參見Chuah MK等人, Hum Gene Ther., 23(6):557-65 (2012)；Chuah MK等人, J Thromb Haemost., 10(8):1566-69 (2012)；Chuah MK等人, J Thromb Haemost. 11 增刊1:99-110 (2013)；VandenDriessche等人, Hum Gene Ther. 23(1):4-6 (2012)；High KA, Blood, 120(23):4482-87 (2012)；Matrai等人, Mol Ther., 18(3):477-90 (2010)；及Matrai等人, Curr Opin Hematol., 17(5):387-92 (2010)，其各自藉此以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本揭示案提供用於向已診斷患有B型血友病之人類患者(「B型血友病患者」或「患者」)投與本發明之密碼子最佳化之構築體的方法。一般而言，如本文所概述，使用含有本揭示案之密碼子最佳化之構築體的AAV粒子完成投與。評估治療功效
B型血友病治療之治療功效可例如藉由量測來自所治療個體之血液的第IX因子依賴性凝結潛力來評價。用於評估凝結潛力之度量包括但不限於試管內活化部分凝血激酶時間檢定(APPT)、第IX因子顯色活性檢定、血液凝集時間及第IX因子抗原水準(例如使用第IX因子特異性ELISA)。應注意，治療劑量不需要促成患者中FIX之野生型水準；而實際上，以有意義或可量測之方式減少症狀之充分表現就本發明之目的而言視為治療性的。
根據國家血友病基金會(National Hemophilia Foundation)，當個體之血漿含有介於6%與49%之間的正常人類血漿之第IX因子活性時將其歸類為患有輕度B型血友病。患有輕度B型血友病之個體典型地僅在嚴重損傷、創傷或手術後經歷出血。在許多情況下，直至損傷、手術或拔牙導致出血延長時方診斷出輕度血友病。首發事件可能直至成年期方發生。患有輕度血友病之女性常常經歷月經過多、量大月經期，且可在分娩後出血。
根據國家血友病基金會，當個體之血漿含有介於1%與5%之間的正常人類血漿之第IX因子活性時將其歸類為患有中度B型血友病。患有中度B型血友病之個體傾向於在損傷後具有出血事件。無明顯原因之出血稱為自發出血事件。
根據國家血友病基金會，當個體之血漿含有小於1%的正常人類血漿之第IX因子活性時將其歸類為患有重度B型血友病。患有重度B型血友病之個體在損傷後經歷出血且可具有頻繁自發出血事件，常常進入其關節及肌肉中。
在一些實施例中，正常人類血漿定義為每mL含有1 IU第IX因子活性。因此，在一些實施例中，來自歸類為患有輕度B型血友病之個體之血漿每mL含有介於0.06與0.49 IU之間的第IX因子活性。在一些實施例中，來自歸類為患有中度B型血友病之個體之血漿每mL含有介於0.01與0.05 IU之間的第IX因子活性。在一些實施例中，來自歸類為患有重度B型血友病之個體之血漿每mL含有介於0.01與0.05 IU之間的第IX因子活性。
因此，在一些實施例中，B型血友病療法當升高個體血液/血漿中第IX因子活性之平均水準時為治療有效的。在一些實施例中，治療有效之治療使個體血液/血漿中第IX因子活性之平均水準升高至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。在特定實施例中，治療有效之血友病療法使個體血液/血漿中之平均第IX因子活性增加至少5%。在另一個特定實施例中，治療有效之血友病療法使個體血液/血漿中之平均第IX因子活性增加至少10%。在另一個特定實施例中，治療有效之血友病療法使個體血液/血漿中之平均第IX因子活性增加至少15%。在另一個特定實施例中，治療有效之血友病療法使個體血液/血漿中之平均第IX因子活性增加至少20%。在另一個特定實施例中，治療有效之血友病療法使個體血液/血漿中之平均第IX因子活性增加至少25%。在另一個特定實施例中，治療有效之血友病療法使個體血液/血漿中之平均第IX因子活性增加至少30%。
在一些實施例中，治療有效之治療升高個體血液中第IX因子活性之平均水準以使得將該個體歸類為患有嚴重性較低形式之B型血友病。舉例而言，在一個實施例中，在經歷治療有效之治療後，將最初歸類為患有重度B型血友病之個體重新歸類為患有中度B型血友病或輕度B型血友病。在另一個實施例中，在經歷治療有效之治療後，將最初歸類為患有中度B型血友病之個體重新歸類為患有輕度B型血友病。VI. 實例 實例 1 - 密碼子改變之第 IX 因子表現序列增強 FIX 表現水準
為產生提供活體內異源第IX因子之改良表現之基因療法構築體，構築編碼具有R384L胺基酸取代之全長第IX因子前原蛋白(FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4))的一組自身互補之基於AAV8之載體。改變各構築體之第IX因子編碼序列以經若干步驟改良人類中之表現。根據經設計以說明較佳/不佳序列基元且使密碼子使用偏向於較佳人類密碼子之演算法修飾各第IX因子編碼序列。如表2中所報導，若干演算法用於此第一步驟。接著進一步手動修飾藉由應用表2中所報導之演算法所得之中間密碼子改變之序列以減少或消除CpG二核苷酸，調整最終GC含量，調整以允許較佳密碼子對，調整以避免不佳密碼子對，且調整最終密碼子使用。對於此等考慮因素之進一步資訊，參見例如Fath S.等人, PLoS. One., 6, e17596 (2011)；Haas J.等人, Curr. Biol., 6, 315-324 (1996)；Tats A., BMC Genomics. 9:463 (2008)；Grote A.等人, Nucleic Acids Research, 33(網站伺服器發佈), W526-W531 (2005)；Mirsafian H.等人, Scientific World Journal., 639682 (2014)；及Pechmann S.等人, Nat Struct Mol Biol. 20(2):237-43 (2013)，其內容出於所有目的以全文引用之方式明確併入本文中，特別關於其密碼子改變考慮因素之教示內容。
各所產生之密碼子改變之編碼序列(例如CS02、CS03、CS04、CS05及CS06，分別示於圖5至圖9中)編碼一致FIX(R384L)蛋白(FIXp-FL-AA (SEQ ID NO:4))。CS02、CS03及CS04構築體不含有CpG基元，而CS05及CS06分別含有11個及3個CpG。
為用作對照，亦產生合併具有及不具有R384L Padua胺基酸取代之野生型FIX編碼序列的載體構築體。WH01構築體編碼不具有R384L Padua突變之野生型FIX前原蛋白，且包括20個CpG二核苷酸。WH02構築體編碼具有R384L Padua突變之野生型FIX前原蛋白，且包括19個CpG二核苷酸。
WH01及WH02構築體在其編碼序列中分別包括20個及19個CpG。相比之下，CS02、CS03及CS04構築體不含有CpG基元，而CS05及CS06構築體分別含有11個及3個CpG。
如圖1A中所示，將密碼子改變之第IX因子編碼序列插入腺相關病毒(「AAV」)轉殖基因卡匣中，該卡匣含有小鼠轉甲狀腺素蛋白增強子/啟動子(SEQ ID NO:52)、小鼠微小病毒(「MVM」)內含子(SEQ ID NO:53)、包括R384L 「Padua」胺基酸取代之密碼子改變之FIX構築體(美國專利第6,531,298號；Simione等人, NEJM 361:1671-75 (2009)；R384L突變通常報導為R338L突變，涉及缺乏信號及原肽之人類單鏈FIX蛋白中之野生型精胺酸之位置)，繼之以牛生長激素聚A元件(SEQ ID NO:54)。基因卡匣側接有AAV2反向末端重複(「ITR」) (SEQ ID NO:51及55)。剩餘ITR重複包括末端多聯體解析位點中之突變，產生載體之自身互補(sc)表型。基本載體設計詳細描述於Wu等人, Mol. Ther. 16:280-89 (2008)及PCT公開案第WO 2014/064277 A1號中，其內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
向B6/129P2-F9tm1Dws FIX基因剔除小鼠投與CS及WH第IX因子AAV構築體(描述於Lin等人, Blood, 90:3962-66 (1997)中，其內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中)。基於個別動物體重(4x1011 個載體基因組/公斤(vg/kg)體重)將AAV載體稀釋液經由側尾靜脈注射至動物中(每組4-8隻動物)。在根據已知程序使用玻璃毛細管給藥之後以規定時間間隔藉由眶後穿刺收集血液樣品。接著將血液轉移至預填充有檸檬酸鈉抗凝劑之管中，且藉由標準程序獲得血漿且在-20℃下冷凍。
如表2中所報導，在將載體尾靜脈注射至小鼠中之後確定各種第IX因子構築體之表現且第14天FIX基因剔除小鼠中之血漿FIX水準用於判斷構築體之效能。截止第14天，基因剔除小鼠模型中之表現水準已幾乎達到最大FIX表現。如表2中所示，WH02 FIX(R384L)對照構築體在投與4x1011 個載體基因組/公斤(vg/kg)體重之後第14天以1.03單位FIX表現。此表現水準用作基線以確定密碼子改變之第IX因子構築體之倍數富集。如表2中所報導，與由野生型聚核苷酸序列編碼之WH02對照構築體相比，CS密碼子改變之構築體提供介於約2倍與4倍之間的表現增加。最顯著地，CS06密碼子改變之構築體提供比WH02對照構築體高4.2倍之第IX因子活性且比WH01 (野生型第IX因子)對照構築體高21.6倍之第IX因子活性。表 2. 來自與野生型密碼子序列(WH01 - wtFIX；WH02 - FIX(R384L))及密碼子改變之序列(CS02-CS06)對比之第IX因子表現
AAV 構築體 載體基因組之修飾 CpG 之數目 第14 天表現水準 [% 人類FIX] 與WH01 相比之倍數表現 與WH02 相比之倍數表現
WH01 不具有R338L (Padua)突變之人類FIX野生型序列(GeneBank NM000133.3) 20 0.20 1.0 0.19
WH02 具有R338L (Padua)突變之人類FIX野生型序列 19 1.03 5.2 1.0
CS02 具有R338L突變之人類FIX序列；Geneart基本演算法對人類血清白蛋白密碼子進一步最佳化。 0 2.12 10.6 2.1
CS03 具有R338L突變之人類FIX序列；Geneart基本演算法對最頻繁使用之人類密碼子進一步最佳化(Haas等人, 1996. Curr Biol. 6, 315-324)。 0 1.98 9.9 1.9
CS04 具有R338L突變之人類FIX序列；Geneart基本演算法對肝密碼子使用進一步最佳化，如Uhlen等人, 2015 Science 347, 6220中所述。 0 2.77 13.9 2.7
CS05 具有R338L突變之人類FIX序列；JCAT演算法經修改以減少CpG；(Grote等人, 2005. Nucleic Acids Res 1,33)。 11 3.93 19.7 3.8
CS06 具有R338L突變之人類FIX序列；Geneart基本演算法對最頻繁使用之人類密碼子進一步最佳化(Haas等人, 1996. Curr Biol. 6, 315-324)。 3 4.32 21.6 4.2
實例 2 -- 肝特異性 CRM8 元件增強小鼠中 FIX 之表現
為進一步增加來自密碼子改變之構築體之第IX因子表現及活性，如Nair等人, Blood 123:3195-99 (2014)中所報導將肝特異性順式調控元件(CRM8 (SEQ ID NO:39))之一至三個複本併入基因卡匣中，建立圖1B中所圖示之構築體。將帶有具有零個(CS02-CRM8.0-V)、一個(CS02-CRM8.1-V)、兩個(CS02-CRM8.2-V)或三個(CS02-CRM8.3-V) CRM8控制元件之CS02密碼子改變之FIX編碼序列的AAV載體藉由尾靜脈途徑注射至野生型小鼠中。接著用人類FIX特異性ELISA檢定隨時間量測小鼠血漿中之人類FIX抗原。
如表3中所報導，在感染後21天，與來自缺乏CRM8元件之對照構築體之表現相比，CRM8調節元件之使用使活體內第IX因子表現增加約2倍及4倍。舉例而言，含有單一CRM8元件之CS02-CRM8.1-V載體提供CS02-CRM8.0-V對照載體之兩倍的FIX表現。包括CRM8元件之多個複本進一步改良此表現。舉例而言，相對於對照載體，含有CRM8元件之2個複本之載體提供三倍表現且含有CRM8元件之3個複本之載體提供3.4倍表現。表 3. 用具有CRM8調控元件之0-3個複本之密碼子改變之AAV載體注射的野生型小鼠之血漿中之第IX因子表現水準.
編號 AAV 構築體 CRM8 元件之數目 FIX (ng/ml) 第 4 天 FIX (ng/ml) 第 11 天 FIX (ng/ml) 第 21 天 倍數增加 第21 天
1 CS02-CRM8.0-scV 0 65.8 133.4 239.2 1.0
2 CS02-CRM8.1-scV 1 120.7 250.7 442.8 1.9
3 CS02-CRM8.2-scV 2 152.9 417.3 713.8 3.0
4 CS02-CRM8.3-scV 3 130.9 432.6 800.9 3.4
實例 3 - 肝特異性 CRM8 元件增強人類肝細胞中 FIX 之表現
藉由用人類肝細胞株HepG2進行之試管內生物效能檢定進一步測試如實例2中所述含有CRM8肝特異性調控元件之0-3個複本之CS02第IX因子基因療法構築體。簡言之，用如實例2中所述之CS02-CRM8-V AAV載體中之一者感染HepG2細胞，且在感染後三天藉由顯色受質檢定量測FIX活性。與實例2中所報導之結果一致，如表4中所報導，含有CRM8調控元件之所有載體提供較高FIX表現。引人注目地，使用多個CRM8元件之作用在人類HepG2細胞中比小鼠模型中甚至更加明顯。舉例而言，相對於對照載體，含有CRM8元件之2個複本之載體提供6.7倍表現且含有CRM8元件之3個複本之載體提供12.8倍表現。此確認CRM8調控元件對此等載體中之FIX表現所具有的正向作用。表 4. 用具有CRM8調控元件之0-3個複本之密碼子改變之AAV載體注射的人類肝HepG2細胞中之第IX因子表現水準.
AAV 構築體 CRM8 元件之數目 FIX 活性 [ 生物效能單位 ] 倍數增加
CS02-CRM8.0-scV 0 0.35 1
CS02-CRM8.1-scV 1 0.82 2.3
CS02-CRM8.2-scV 2 2.36 6.7
CS02-CRM8.3-scV 3 4.48 12.8
實例 4 - 單股 FIX AAV8 載體提供與可比自身互補載體類似之活體內表現
在一些情況下，自身互補(sc) AAV載體比類似單股(ss) AAV載體更有效地表現轉殖基因卡匣。此據推測係歸因於在細胞核中之自身互補載體基因組脫殼之後更快速的雙股形成。對於評述，參見McCarty D., Mol. Ther., (16):1648-56 (2008)，其內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
新近研究使用EGFP載體確認此作用。Bell等人, Hum. Gene Ther. Methods, (27):228-37 (2016)。然而，研究亦顯示此作用為轉殖基因及劑量依賴性的。舉例而言，與相應單股載體相比，自身互補AAV8載體中之人類鳥胺酸轉胺甲醯酶(hOTC)基因卡匣在小鼠之肝中在低劑量下顯示更佳表現。然而，在高劑量可能不展示此作用，表明該作用至少在所研究之非分泌基因中為轉殖基因及劑量依賴性的。同上。
為探索在單股及自身互補設計之情形中所揭示之密碼子改變之FIX基因構築體的特性，構築帶有CS06密碼子改變之FIX(R338L)基因及兩個完整ITR之單股構築體，其具有及不具有CRM8調控元件，分別如圖1D及圖1C中所圖示。在HEK293細胞系統中產生單股(ss)載體，且將第IX因子表現與實例1-3中所報導之自身互補構築體之表現相比較。
首先，如上文所述，在注射至B6/129P2-F9tm1Dws FIX基因剔除小鼠中之後活體內測試自身互補(sc)及單股(ss) CS06-CRM8.0-V構築體。令人驚訝地，如表5中所報導，自身互補(sc)及單股(ss) CS06載體構築體顯示極其類似之血漿FIX活性水準，表明與ss載體相比sc載體所報導之優點不適用於本文所述之密碼子改變之第IX因子構築體。表現視許多參數而定，包括轉殖基因構築體、轉錄物之穩定性、構築體中所使用之一或多個啟動子、時間及劑量。如表5中所示，在經選擇以矯正出血且在FIX ko小鼠中獲得長期表現之條件下，相應sc及ss載體提供實質上類似之表現水準。
在單股載體背景下亦研究肝特異性CRM8調控元件對FIX表現之作用。如表5中所報導，在單股載體中包括一個CRM8元件改良B6/129P2-F9tm1Dws FIX基因剔除小鼠中之FIX表現。包括三個CRM8元件進一步改良來自單股CS06構築體之FIX表現，達到比缺乏CRM8元件之自身互補CS06對照略高2倍之水準。與野生型WH02構築體相比，單股CS06載體當與三個CRM8調控元件配對時提供高達7倍之更高表現。表 5. 用各種單股(ss)及自身互補(sc) AAV第IX因子載體注射之FIX基因剔除小鼠中之第IX因子表現水準.
AAV 構築體 CRM8 元件之數目 表現水準1 (d7) 表現水準 (d14) 表現水準(d28) 對比CS06 之倍數增加 (d7 / d14 / d28) 對比WH02 之倍數增加 (d7 / d14 / d28)
CS06-CRM8.0-ssV 0 1.38 2.73 2.99 0.7 / 0.9 / 0.9 1.5 / 2.7 /2.7
CS06-CRM8.1-ssV 1 1.92 3.57 3.47 1.0 / 1.1 / 1.0 2.1 / 3.5 / 3.2
CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO:40) 3 4.43 6.65 7.78 2.3 / 2.1 / 2.2 4.9 / 6.5 / 7.1
CS06-CRM8.0-scV 0 1.89 3.17 3.50 1.0 / 1.0/ 1.0 2.1 / 3.1 / 3.2
WH02-CRM8.0-scV 0 0.90 1.03 1.10 0.5 / 0.3 / 0.3 1.0
1 國際單位之FIX活性(7-8隻小鼠之平均值)；d，天；
實例 5 - 單股 FIX AAV8 載體在人類肝細胞中提供比可比自身互補載體更佳之 FIX 表現
接著在人類HepG2細胞中研究來自實例4中所述之單股CS06載體之第IX因子表現且與類似自身互補載體構築體相比較。與實例4中所報導之活體內結果一致，不具有CRM8元件之單股CS06載體在HepG2細胞中提供略低於可比自身互補載體之水準的FIX表現。然而，如表6中所報導，包括單一CRM8元件使來自單股CS06載體之FIX表現增至比來自自身互補CS06載體之表現高2.6倍之水準。
最令人驚訝地，然而，在單股CS06載體中包括三個CRM8元件使FIX表現增至比來自自身互補CS06載體之表現高16.8倍之水準。增加之FIX表現比來自WH02對照載體之FIX表現高100倍以上。總而言之，含有三個CRM8元件之單股CS06載體在活體內與試管內生物效能檢定中均提供最高表現水準。表 6. 人類肝細胞中來自單股(ss)及自身互補載體之第IX因子表現水準.
AAV 構築體 CRM8 元件之數目 FIX 活性 [ 生物效能單位 ] 對比 CS06-CRM8.0-scV 之倍數增加 對比 WH02-CRM8.0-scV 之倍數增加
CS06-CRM8.0-ssV 0 0.24 0.6 3.9
CS06-CRM8.1-ssV 1 0.95 2.6 15.9
CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO: 40) 3 6.20 16.8 103.3
CS06-CRM8.0-scV 0 0.37 1.0 6.2
WH02-CRM8.0-scV 0 0.06 0.2 1.0
用於實例 1-5 之材料及方法
動物實驗 . 對於FIX基因剔除模型中之實驗，使用FIX ko小鼠品系B6/129P2-F9tm1Dws (由Lin等人, 1997. Blood 90 :3962-6開發)。在野生型小鼠模型中，使用4-5週齡雄性C57BL6-J Bl6小鼠。兩種品系均獲自商業育種商。基於個別動物體重將AAV載體稀釋液經由側尾靜脈注射至動物中(每組4-8隻動物)。在根據已知程序使用玻璃毛細管給藥之後以規定時間間隔藉由眶後穿刺完成血液取樣。接著將血液轉移至預填充有檸檬酸鈉抗凝劑之管中，且藉由標準程序獲得血漿且在-20℃下冷凍。
包括 FIX 顯色受質檢定之 HepG2 細胞中之試管內生物效能檢定 . 在人類肝細胞株HepG2 (ATCC HB-8065)中進行基因療法載體製劑之試管內生物效能檢定。在用羥基脲處理之後，用AAV8FIX載體感染細胞且培育約96小時。在培育時間內，使FIX表現且釋放至細胞上清液中，且藉由顯色終點量測(Rossix AB, Sweden)確定FIX活性。各檢定操作包括使用範圍介於700與7000之間的MOI之經純化AAV-FIX載體材料之標準曲線。在MOI 3270下之標準物之FIX活性設定為生物效能單位(BPU) 1。
小鼠血漿中之人類 FIX 定量 . 為定量基因剔除小鼠血漿中之人類FIX，使用標準FIX凝結分析進行FIX凝結檢定。為定量野生型小鼠血漿中之人類FIX抗原，使用市售ELISA套組(ASSERACHROM IX:AG (目錄號00943 Stago BNL)，其特異性地偵測人類FIX。 實例 6 - 藉由併入 CRM8 元件改良轉錄功效
為解決含CRM8載體之改良之生物效能是否由增加之轉錄功效引起，用含有0個、1個或3個CRM8元件之單股CS06載體轉導人類肝細胞株(HepG2)及小鼠肝細胞(FIX基因剔除小鼠)。確定FIX mRNA及DNA水準且以正規化之FIX mRNA與DNA水準之間的比率呈現。
在試管內模型中，包括一個CRM8元件(CS06-CRM8.1-ssV)或三個CRM8元件(CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO:40))使得經轉導之人類肝細胞中之人類FIX mRNA水準比用缺乏CRM8元件之載體(CS06-CRM8.0-ssV)轉導之細胞分別高5倍及23倍(表6)。類似地，在活體內模型中，鼠類肝中來自含有一個或三個CRM8元件之載體之FIX表現比來自缺乏CRM8元件之載體之FIX表現分別高2.0倍及2.8倍(表6)。兩種模型均支持一或多個CRM8元件在改良FIX構築體之轉錄活性中提供有益作用。表 7. 在人類肝細胞株或小鼠肝之AAV8-FIX轉導之後的FIX mRNA水準.
   試管內肝細胞株(HepG2) 活體內小鼠肝組織
AAV 構築體 正規化之FIX比率：mRNA/DNA 對比CS06-CRM8.0-ssV之倍數增加 正規化之FIX比率：mRNA/DNA 對比CS06-CRM8.0-ssV之倍數增加
CS06-CRM8.0-ssV 0.025 1 0.38 1
CS06-CRM8.1-ssV 0.14 5.4 0.78 2.0
CS06-CRM8.3-ssV 0.58 23.4 1.09 2.8
用於實例 6 之方法
包括RNA及DNA提取之定量即時聚合酶鏈反應。藉由標準程序自冷凍肝(參見動物實驗)或HepG2細胞(參見HepG2細胞中之試管內生物效能檢定)提取基因組DNA及總RNA。對於活體內實驗之分析，選擇接近於第14天各別組之平均FIX活性(在平均值 ± SD以內)的每個處理組三隻動物之子組。根據手冊(DNeasy血液及組織套組, Qiagen, Germany；RNeasy微型套組, Qiagen)使用寡聚(dT20)引子、SuperScript III反轉錄酶(RT)及DNase處理之總RNA合成cDNA。
藉由基於螢光之定量即時聚合酶鏈反應(qPCR)，擴增FIX外顯子6之96 bp序列來確定gDNA與cDNA兩種樣品中之FIX轉殖基因複本數。鼠類β-肌動蛋白充當內源對照且使用市售TaqMan檢定進行定量。使用特定裝置之軟體，基於標準曲線之線性回歸參數計算每個反應之FIX或β-肌動蛋白複本來進行qPCR資料分析。此外，將結果針對1 µg RNA或DNA正規化且計算mRNA:DNA比率。 實例 7 - 小鼠中 FIX AAV8 載體投與之安全性評價
B型血友病為藉由用源自血漿或重組之FIX濃縮液置換缺失或缺陷第IX因子(FIX)治療之遺傳性出血病症。此等濃縮液需要定期輸注以維持足夠之FIX水準來預防出血事件。此造成顯著治療負擔、潛在次最佳之療法順應性且因此出血風險增加。Srivastava A等人, Haemophilia, 19:e1-47 (2013)。考慮到蛋白質置換療法之挑戰，基因療法可為用於患有B型血友病之患者的替代方案。藉由將功能性F9基因複本引入靶肝細胞中，頻繁輸注可能不再有必要。VandenDriessche T, Chuah MK., Hum Gen Ther, 28:1013-23 (2017)。
基於腺相關病毒(AAV)之基因療法具有在患有B型血友病之患者中提供臨床效益之潛力。在一些實施例中，本文所述之第IX因子基因療法載體包括插入3個肝細胞特異性順式調節元件(CRM8)以增加驅動人類FIX Padua轉殖基因表現之肝特異性轉甲狀腺素蛋白啟動子之強度。Chuah MK等人 Mol Ther, 22:1605-13 (2014)；Nair N等人, Blood 123:3195-99 (2014)。
使用重組AAV (rAAV)之基因療法中之公認安全性問題為病毒基因組整合至宿主基因組中。因此有理由進行新開發之rAAV載體之整合位點(IS)分析以評估AAV基因療法產品之生物安全性。
在全身暴露於含有3個CRM8元件之單股CS06基因療法載體(CS06-CRM8.3-ssV)之後研究小鼠基因組中之毒性及載體整合事件。
為評價毒性，如表8中所概述，向雄性C57BL/6J小鼠(每組n=20)靜脈內注射單次劑量之3×1011 個、1×1012 個或2×1012 個載體基因組(vg)/kg之CS06-CRM8.3-ssV或調配物緩衝液。表 8. 實驗研究設計
   組大小(雄性)
測試項目 劑量 (vg/kg) 終止 第 3 天 終止 第 3 週 終止 第 18 週
緩衝液(對照) 0 20 20 20
CS06-CRM8.3-ssV 3 × 1011 20 20 20
CS06-CRM8.3-ssV 1 × 1012 20 20 20
CS06-CRM8.3-ssV 2 × 1012 20 20 20
簡言之，在3×1011 、1×1012 及2×1012 vg/kg之劑量水準下CS06-CRM8.3-ssV之單次靜脈內速注投與在C57BL/6J小鼠中良好耐受。在研究期間無死亡發生，且無臨床徵象或給藥後觀測結果視為與SHP648相關。均未觀測到處理相關之眼科發現及對體重或食物消耗之影響。此外，臨床病理學測試結果在C57BL/6小鼠中未展現出不良作用。在所研究之任何時間點未觀測到與SHP648投與相關之巨觀或微觀發現。
未處理之C57BL/6J小鼠具有0.4 IU/mL之平均基線FIX活性水準。相比之下，接受CS06-CRM8.3-ssV之動物顯示平均血漿huFIX抗原水準(圖26A)及因此FIX活性(圖26B)之劑量依賴性增加，從而確認CS06-CRM8.3-ssV之暴露及轉導功效。
在處理後僅3天後觀測到升高之FIX血漿水準且使得第18週內平均huFIX抗原水準在3.6 μg/mL (3×1011 vg/kg組)至15.8 μg/mL (2×1012 vg/kg組)之範圍內。相應地，平均FIX活性水準顯示一致時程，使得第18週內平均血漿活性為7.8 IU/mL (3×1011 vg/kg組)至26.3 IU/mL (2×1012 vg/kg組)。發現中和抗huFIX抗體之效價在所有動物中低於定量下限(資料未示出)。
為研究載體整合事件，4隻雄性FIX基因剔除(ko)小鼠接受1×1012 或1×1013 vg/kg SHP648之靜脈內注射。為評估轉導功效，在載體投與之後第7天、第14天及第28天獲取血液樣品且使用一期凝集檢定分析FIX活性。第28天收集肝組織且使用市售套組分離DNA。藉由載體特異性即時定量(q)PCR確定載體複本數。非限制性(nr)及標準線性擴增介導(LAM)之PCR用於鑑別側接整合之AAV載體DNA之基因組序列。在樣品製備之後對(nr)LAM-PCR擴增子進行定序。對細胞數之正規化係基於1 μg DNA對應於172,000個二倍體細胞之假設。
用1×1012 或1×1013 vg/kg CS06-CRM8.3-ssV靜脈內處理之所有FIX ko小鼠(n=4/組)在預定研究時段後存活而無任何臨床症狀。藉由一期凝集檢定確定FIX活性揭露劑量依賴性值，使得處理後28天之超生理平均活性水準為45.4 IU/mL (1×1012 vg/kg組)至241.4 IU/mL (1×1013 vg/kg組)，指示成功轉導(圖27A)。使用qPCR研究肝轉導水準。分析揭露每個細胞之劑量依賴性平均載體複本數對於1×1012 vg/kg為13.4且對於1×1013 vg/kg為122.0 (圖27B)。
整合位點之分析揭露頻率≤0.01%。在1×1013 vg/kg劑量水準下，整合位點之數目比用較低劑量處理之小鼠高3.6倍(圖28A)。因此，對載體複本數之正規化使得在用1×1013 vg/kg CS06-CRM8.3-ssV處理後之整合頻率比接受1×1012 vg/kg之小鼠低2.6倍(圖28B)。隨後，進行解決生物相關整合位點之綜合共同整合位點(CIS)分析。所偵測之CIS區域中無一者與不良事件相關聯，該等不良事件諸如最近所報導之臨床基因療法試驗中之純系過度生長或惡性轉型。重要地，所檢索之CIS中無一者位於先前與野生型或重組AAV感染及肝癌發展有關之任何基因組區域內。
總之，此等資料顯示用劑量高達2×1012 vg/kg之CS06-CRM8.3-ssV處理小鼠良好耐受，而未觀測到毒理學相關作用。無明顯不良作用水準(NOAEL)為2×1012 vg/kg，毒性研究中所測試之最高劑量。在向小鼠中投與CS06-CRM8.3-ssV之後整合位點分析未表明任何安全性風險。 實例 8 - 小鼠及恆河猴中 FIX AAV8 載體投與之藥理學
基於腺相關病毒(AAV)之FIX基因療法具有在患有B型血友病之患者中提供臨床效益之潛力。如本文所述，CS06-CRM8.3-ssV為展現改良之載體設計的下一代載體，其包括三個順式調節元件(CRM8)以增加驅動人類FIX轉殖基因表現之肝特異性轉甲狀腺素蛋白(TTR)啟動子之強度。本研究檢查FIX基因剔除小鼠中及恆河猴中之CS06-CRM8.3-ssV劑量-反應關係。
向雄性FIX基因剔除小鼠(n=12/組)投與單次靜脈內劑量之3.9x1010 個、7.7x1010 個、3.9x1011 個或7.7x1011 個載體基因組(vg)/kg CS06-CRM8.3-ssV或緩衝液。第7天、第14天、第28天、第42天及第56天確定FIX血漿活性水準。在觀測時段結束時，在尾尖出血檢定中評估出血表型。每組三隻雄性恆河猴接受單次靜脈內快速注射5.0x1011 或1.0x1012 vg/kg CS06-CRM8.3-ssV。每週獲取血液樣品直至第18週。主要終點為血漿中之FIX活性及人類FIX抗原。
自第7天至第56天在FIX基因剔除小鼠之血漿中CS06-CRM8.3-ssV介導之FIX活性在所有劑量水準下皆可偵測。用CS06-CRM8.3-ssV處理使得劑量依賴性超生理平均FIX水準高達41.0 IU/mL (7.7x1011 vg/kg群組)。在尾尖出血檢定中處於或高於3.9x1010 vg/kg之CS06-CRM8.3-ssV劑量與緩衝液處理之小鼠相比顯著減少失血(p值：＜0.05)。向恆河猴投與之CS06-CRM8.3-ssV產生平均血漿人類FIX活性及抗原之劑量依賴性增加，使得個別峰值在1.4 IU/mL (5x1011 vg/kg群組)至3.7 IU/mL (1.0x1012 vg/kg群組)之範圍內。無臨床徵象或給藥後觀測結果視為與CS06-CRM8.3-ssV相關。
總之，結果顯示用CS06-CRM8.3-ssV處理促成劑量依賴性血漿FIX活性且在FIX基因剔除小鼠及恆河猴中良好耐受且有效。
應瞭解，本文所述之實例及實施例僅用於說明之目的且鑒於其之各種修改或變化將由熟習此項技術者提出且欲包括於本申請案之精神與範圍及隨附申請專利範圍之範疇內。本文所引用之所有公開案、專利及專利申請案出於所有目的藉此以全文引用之方式併入。
無
[圖1]說明根據一些實施之例示性第IX因子基因療法構築體。展示自身互補(A、B)及單股(C、D)載體之序列元件，其不具有(A、C)及具有(B、D)肝特異性順式調節模組(CRM8)。
[圖2]展示寄存編號CCDS14666.1 (「FIX-FL-NA」)之野生型第IX因子編碼序列(SEQ ID NO:1)。
[圖3A及圖3B]展示在人類中表現之兩個野生型第IX因子前原多肽同功型之胺基酸序列。圖3A展示對應於UniProt寄存編號P00740及NCBI寄存編號NP_000124.1 (「FIX-FL-AA」)之第一較長第IX因子前原多肽同功型(SEQ ID NO:2)之野生型胺基酸序列。圖3B展示對應於NCBI寄存編號NP_001300842.1 (「FIX2-FL-AA」)之第二較短第IX因子前原多肽同功型(SEQ ID NO:3)之野生型胺基酸序列。
[圖4]展示Padua (R384L)第IX因子胺基酸序列(SEQ ID NO:4；「FIXp-FL-AA」)。
[圖5]展示根據一些實施，編碼具有R384L胺基酸取代之第IX因子變異體的CS02密碼子改變之核苷酸序列(SEQ ID NO:5) (CS02-FL-NA)。
[圖6]展示根據一些實施，編碼具有R384L胺基酸取代之第IX因子變異體的CS03密碼子改變之核苷酸序列(SEQ ID NO:6) (CS03-FL-NA)。
[圖7]展示根據一些實施，編碼具有R384L胺基酸取代之第IX因子變異體的CS04密碼子改變之核苷酸序列(SEQ ID NO:7) (CS04-FL-NA)。
[圖8]展示根據一些實施，編碼具有R384L胺基酸取代之第IX因子變異體的CS05密碼子改變之核苷酸序列(SEQ ID NO:8) (CS05-FL-NA)。
[圖9]展示根據一些實施，編碼具有R384L胺基酸取代之第IX因子變異體的CS06密碼子改變之核苷酸序列(SEQ ID NO:9) (CS06-FL-NA)。
[圖10]說明以每公斤體重2x10E11 vg之劑量注射具有CRM8肝特異性順式調控元件之0、1、2或3個複本之CS02基因療法構築體的野生型小鼠中之FIX抗原水準。
[圖11A及圖11B]展示在人類中表現之兩個單鏈野生型第IX因子蛋白同功型(例如缺乏信號及原肽)之胺基酸序列。圖11A展示對應於UniProt寄存編號P00740及NCBI寄存編號NP_000124.1 (「FIX-MA-AA」)之第一較長第IX因子前原多肽同功型(SEQ ID NO:10)之野生型胺基酸序列。圖11B展示對應於NCBI寄存編號NP_001300842.1 (「FIX2-MA-AA」)之第二較短第IX因子前原多肽同功型(SEQ ID NO:11)之野生型胺基酸序列。
[圖12]展示單鏈第IX因子(R338L) 「Padua」胺基酸序列(SEQ ID NO:12；「FIXp-MP-AA」)。
[圖13]展示根據一些實施，編碼具有R338L胺基酸取代之單鏈第IX因子變異體的CS02密碼子改變之核苷酸序列(SEQ ID NO:13) (CS02-MP-NA)。
[圖14]展示根據一些實施，編碼具有R338L胺基酸取代之單鏈第IX因子變異體的CS03密碼子改變之核苷酸序列(SEQ ID NO:14) (CS03-MP-NA)。
[圖15]展示根據一些實施，編碼具有R338L胺基酸取代之單鏈第IX因子變異體的CS04密碼子改變之核苷酸序列(SEQ ID NO:15) (CS04-MP-NA)。
[圖16]展示根據一些實施，編碼具有R338L胺基酸取代之單鏈第IX因子變異體的CS05密碼子改變之核苷酸序列(SEQ ID NO:16) (CS05-MP-NA)。
[圖17]展示根據一些實施，編碼具有R338L胺基酸取代之單鏈第IX因子變異體的CS06密碼子改變之核苷酸序列(SEQ ID NO:17) (CS06-MP-NA)。
[圖18]展示根據一些實施，編碼本文所述之許多構築體之前原肽(PPP)的核酸序列(NA)。
[圖19]展示根據一些實施，編碼本文所述之許多構築體之信號肽(SP)的核酸序列(NA)。
[圖20]展示根據一些實施，編碼本文所述之許多構築體之原肽(PP)的核酸序列(NA)。
[圖21]展示FIX前原肽(PPP)之胺基酸序列(AA)。
[圖22]展示FIX信號肽(SP)之胺基酸序列(AA)。
[圖23]展示FIX原肽(PP)之胺基酸序列(AA)。
[圖24]展示CRM8序列之核酸序列(SEQ ID NO:39)。
[圖25A及圖25B]展示CS06-CRM8.3-ssV構築體之核酸序列(SEQ ID NO:40)。
[圖26A及圖26B]展示在靜脈內投與CS06-CRM8.3-ssV AAV8基因療法構築體之後小鼠中之FIX表現。
[圖27A及圖27B]展示CS06-CRM8.3-ssV AAV8基因療法構築體在小鼠中之轉導效率。
[圖28A及圖28B]展示小鼠中CS06-CRM8.3-ssV AAV8基因療法構築體之載體相關整合位點之定量總結。

Claims (21)

  1. 一種用於治療B型血友病之方法，該方法包括向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤該人類個體體重2.5x1011 個至2x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量，其中該等AAV粒子包含編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸包含SEQ ID NO: 17之核酸序列。
  2. 如請求項1之用於治療B型血友病之方法，其中該靜脈內輸注之劑量為每公斤該人類個體體重2.5x1011 個至7.5x1011 個腺相關病毒(AAV)粒子。
  3. 如請求項1之用於治療B型血友病之方法，其中該靜脈內輸注之劑量為每公斤該人類個體體重5x1011 個腺相關病毒(AAV)粒子。
  4. 如請求項1之用於治療B型血友病之方法，其中該靜脈內輸注之劑量為每公斤該人類個體體重7.5x1011 個至1.25x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子。
  5. 如請求項1之用於治療B型血友病之方法，其中該靜脈內輸注之劑量為每公斤該人類個體體重1x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子。
  6. 如請求項1至5中任一項之用於治療B型血友病之方法，其中由該第IX因子聚核苷酸編碼之該第IX因子蛋白具有SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。
  7. 一種用於治療B型血友病之方法，該方法包括向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤該人類個體體重2.5x1011 個至2x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量，其中該等AAV粒子包含編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸包含SEQ ID NO: 13之核酸序列。
  8. 一種用於治療B型血友病之方法，該方法包括向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤該人類個體體重2.5x1011 個至2x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量，其中該等AAV粒子包含編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸包含SEQ ID NO: 14之核酸序列。
  9. 一種用於治療B型血友病之方法，該方法包括向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤該人類個體體重2.5x1011 個至2x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量，其中該等AAV粒子包含編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸包含SEQ ID NO: 15之核酸序列。
  10. 一種用於治療B型血友病之方法，該方法包括向經診斷患有B型血友病之人類個體靜脈內輸注每公斤該人類個體體重2.5x1011 個至2x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子之劑量，其中該等AAV粒子包含編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸包含SEQ ID NO: 16之核酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之用於治療B型血友病之方法，其中該等AAV粒子進一步包含可操作地連接至該第IX因子聚核苷酸之肝特異性啟動子元件。
  12. 如請求項11之用於治療B型血友病之方法，其中該肝特異性啟動子元件包含啟動子聚核苷酸之一個複本，該啟動子聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 39至少95%一致之核酸序列。
  13. 如請求項11之用於治療B型血友病之方法，其中該肝特異性啟動子元件包含啟動子聚核苷酸之三個複本，該啟動子聚核苷酸包含與SEQ ID NO:39至少95%一致之核酸序列。
  14. 如請求項12或13之用於治療B型血友病之方法，其中該啟動子聚核苷酸包含SEQ ID NO: 39之核酸序列。
  15. 如請求項1至14中任一項之用於治療B型血友病之方法，其中該等AAV粒子進一步包含操作性連接至該第IX因子聚核苷酸之內含子。
  16. 如請求項15之用於治療B型血友病之方法，其中該內含子包含MVM內含子聚核苷酸，該MVM內含子聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 53至少95%一致之核酸序列。
  17. 如請求項15之用於治療B型血友病之方法，其中該MVM內含子聚核苷酸包含SEQ ID NO: 53之核酸序列。
  18. 如請求項15至17中任一項之用於治療B型血友病之方法，其中該內含子定位於啟動子元件與編碼第IX因子多肽之核苷酸序列之轉譯起始位點之間。
  19. 如請求項1至17中任一項之用於治療B型血友病之方法，其中該等AAV粒子為第8血清型腺相關病毒(AAV-8)粒子。
  20. 一種腺相關病毒(AAV)粒子用於製造用以治療B型血友病之藥劑之用途，其中： 該等AAV粒子包含編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸包含SEQ ID NO: 17之核酸序列，且 該等AAV粒子經調配用於靜脈內輸注每公斤經診斷患有B型血友病之人類個體體重2.5x1011 個至2x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子。
  21. 一種用於治療B型血友病之腺相關病毒(AAV)粒子，其中： 該等AAV粒子包含編碼第IX因子蛋白之第IX因子聚核苷酸，該第IX因子聚核苷酸包含SEQ ID NO: 17之核酸序列，且 該等AAV粒子經調配用於靜脈內輸注每公斤經診斷患有B型血友病之人類個體體重2.5x1011 個至2x1012 個腺相關病毒(AAV)粒子。
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