CN114277057B

CN114277057B - 用于治疗或预防b型血友病的重组腺相关病毒载体和方法

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Publication number: CN114277057B
Application number: CN202110778026.9A
Authority: CN
Inventors: 郭璐; 韩稼葆; 李伟; 田幸雪; 刘宾; 朱晰; 赵小平
Original assignee: Shanghai Tianze Yuntai Biomedical Co ltd
Current assignee: Shanghai Tianze Yuntai Biomedical Co ltd
Priority date: 2021-07-09
Filing date: 2021-07-09
Publication date: 2023-10-13
Anticipated expiration: 2041-07-09
Also published as: WO2023280323A1; CN114277057A

Abstract

本发明涉及表达凝血因子IX的表达构建体和重组腺相关病毒(rAAV)载体，包含所述rAAV载体的病毒颗粒和药物组合物，以及它们用于治疗或预防B型血友病的用途。

Description

用于治疗或预防B型血友病的重组腺相关病毒载体和方法

技术领域

本发明涉及基因治疗领域。具体来说本发明涉及表达(人)凝血因子IX的表达构建体和重组腺相关病毒(rAAV)，包含所述rAAV的病毒颗粒和组合物，以及它们用于治疗或预防由于人凝血因子IX缺乏导致的凝血功能障引起的B型血友病(简称HB)的出血症状的用途。

背景技术

血友病(hemophilia)是一组遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，由基因突变导致活性凝血活酶生成障碍，为X染色体隐性遗传，根据缺乏因子类型分为血友病A(缺乏凝血因子VIII即FVIII)和HB(缺乏凝血因子IX即FIX)。HB的主要临床表现为关节内出血和肌肉内出血，由此产生的永久性关节变形会限制运动能力，严重影响生活质量。

FIX是一类具有丝氨酸蛋白酶活性的凝血因子，主要由肝脏产生并以无活性的酶原形式分泌入血浆。FIX通过FXIa或FVIIa·TF复合物转化为激活的FIX(FIXa)，FIXa能与FVIIIa、磷脂和Ca²⁺一起将FX激活成FXa，启动共同凝血途径，发挥止血作用。

目前，HB的主流疗法仍旧是静脉注射FIX生物制品。但由于凝血因子半衰期短，患者需要终生接受频繁的注射。这虽可在一定程度上控制病程，但仍有出血风险。由于FIX制品生产工艺复杂，产能较低，而且价格昂贵，造成国内凝血因子供需缺口较大，至今人均用量还不到全球平均水平的1/6。另外，患者在使用凝血因子替代治疗时，会产生针对注射因子的抑制物(抗药物抗体)并发症。对这些产生了抑制物的患者而言，使用凝血因子进行预防性治疗的效果将受到影响。

与直接注射凝血因子相比，通过病毒载体递送其编码基因的基因疗法能够实现稳定、持久的表达。HB疾病是由单基因突变引起，致病机理明确。FIX的cDNA长度较短，因此便于载体携带。另外也已存在成熟的模型动物，包括大动物(HB犬)和小动物(HB小鼠)模型。因此，HB成为了基因疗法的研究热点。

多项有关HB基因疗法的研究已经取得了深入进展，其中临床数据也证明了其有效性、持续性与安全性。UniQure的AMT-061和Spark的SPK-9001临床数据显示，通过AAV载体递送肝脏可以使受试者体内FIX活性维持水平超过流行病学研究推荐的最低标准(>15％)，目前已随访1～3年以上，活性仍然维持在较高水平，年化出血率和FIX用量及输注频次均显著降低，且在现有临床研究中均未发生严重不良事件，证明通过AAV载体基因疗法治疗可以大大提高中重度HB患者的生活质量。

UniQure公司的AMT-061是一种基于腺相关病毒5(AAV5)的针对HB的基因疗法。UniQure公司在WO2019011893A1中提供了筛选可能预先具有抗AAV抗体的患者的方法，也提到AAV5相对于其他血清型在人体内局部中和抗体滴度更低。

CN111647625A中描述了一种提高凝血因子IX表达水平的方法，包括密码子优化和Kozak序列的替换，然后构建到AAV病毒载体，采用三质粒包装系统转染细胞以进行表达。该申请仅在体外证明了凝血因子IX的成功表达，并未进行任何体内实验。

本领域仍然需要高效且安全的针对HB的基因疗法。

发明内容

本发明的发明人通过表达盒、FIX突变体的筛选和目的基因编码序列优化，得到了能够高效稳定表达FIX的AAV载体构建体，其在人肝脏细胞及动物模型中均能介导稳定高效的FIX表达，使外源FIX达到有效治疗剂量，并且不存在安全性风险，由此完成了本发明。

因此，在第一方面，本发明提供一种表达构建体，其从5’到3’包含可操作地连接的如下元件：

(1)转录调控元件，其选自LP1、HLP、TTR、HLP2、enTTR、APOE-hAAT启动子；

(2)内含子，其选自SV40内含子或FIX基因内含子；

(3)基因编码序列，其编码具有R338L突变的凝血因子IX；

(4)聚腺苷酸化序列。

在优选的实施方案中，所述转录调控元件为如SEQ ID NO:5所示的HLP2启动子或如SEQ ID NO:6所示的enTTR启动子。在更优选的实施方案中，所述转录调控元件为如SEQID NO:6所示的enTTR启动子。

在优选的实施方案中，所述内含子选自SEQ ID NO:8所示的FIX Ti299、SEQ IDNO:9所示的modified SV40 intron、SEQ ID NO:10所示的FIX intronA、SEQ ID NO:11所示的FIX intronAco内含子，更优选SEQ ID NO:11所示的FIX intronAco内含子。

在优选的实施方案中，所述基因编码序列针对人细胞内的表达进行了密码子优化。

在一些实施方案中，所述基因编码序列具有如下特征：

(1)与SEQ ID NO:13的FIX野生型序列或SEQ ID NO:12的FIX^PADUA野生型编码序列相比，序列同一性低于80％；并且

(2)与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:23中任一所示的序列相比，序列同一性高于85％，优选高于90％。

在进一步的实施方案中，所述基因编码序列具有如下特征：

(1)与SEQ ID NO:13的FIX野生型序列或SEQ ID NO:12的FIX^PADUA野生型编码序列相比，序列同一性低于80％；

(2)与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:23中任一所示的序列相比，序列同一性高于85％，优选高于90％；

(3)与SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22所示序列相比，序列同一性低于80％。

在进一步的或另外的实施方案中，所述基因编码序列具有如SEQ ID NOs:16、17、18、20、21和23中任一项所示的核苷酸序列，或与其具有至少85％同一性，优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性，还更优选至少98％同一性的核苷酸序列。在进一步的或另外的实施方案中，所述基因编码序列具有如SEQ ID NOs:17、20和23中任一项所示的核苷酸序列，或与其具有至少85％同一性，优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性，还更优选至少98％同一性的核苷酸序列。在更优选的实施方案中，所述基因编码序列为如SEQ IDNOs:16、17、18、20、21和23中任一项所示的核苷酸序列。在最优选的实施方案中，所述基因编码序列为SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述基因编码序列的CpG数小于100，优选小于10，最优选为0。在一些实施方案中，所述基因编码序列不含CpG岛。

在优选的实施方案中，所述聚腺苷酸化序列选自SEQ ID NO:14所示的SV40 polyA或SEQ ID NO:15所示的bGH polyA，优选SEQ ID NO:14所示的SV40 polyA。

在一个具体的实施方案中，本发明第一方面所述的表达构建体用于治疗或预防由于人凝血因子IX缺乏导致的凝血功能障引起的HB的出血症状。

第二方面，本发明提供一种重组腺相关病毒(rAAV)载体，其包含第一方面的核酸构建体和至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)。优选地，所述rAAV载体包含两个AAV ITR。优选地，所述AAV ITR来自于AAV2 ITR，例如AAV2 ITR或其变体，例如缺少1个C区或C’区的AAV2 ITR。在一个具体的实施方案中，所述rAAV载体包含一个AAV2 ITR和一个缺少1个C区或C’区的AAV2 ITR变体。在一个具体的实施方案中，所述rAAV载体在编码序列上游包含一个AAV2 ITR，并且在编码序列下游包含一个缺少1个C区的AAV2 ITR变体。

在一个具体的实施方案中，本发明第二方面所述的rAAV载体用于治疗或预防由于人凝血因子IX缺乏导致的凝血功能障引起的HB的出血症状。

第三方面，本发明提供rAAV病毒颗粒，其包含第二方面的rAAV载体和衣壳。优选地，所述衣壳选自AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVLK03、AAVS3、AAVKP1、AAVrh10、AAVNP40、AAVNP59、AAV-DJ、AAVAnc80L65、AAVsL65、AAVHSC15、AAVC102、AAV204、AAV214血清型衣壳及其变体。优选地，所述rAAV病毒颗粒包含AAV8血清型衣壳。

在一个具体的实施方案中，本发明第三方面所述的rAAV病毒颗粒用于治疗或预防由于人凝血因子IX缺乏导致的凝血功能障引起的HB的出血症状。

第四方面，本发明提供一种药物组合物，其包含第一方面的核酸构建体、第二方面的rAAV载体或第三方面的rAAV病毒颗粒，和药学上可接受的载体。

在一个具体的实施方案中，本发明第四方面的药物组合物用于治疗或预防由于人凝血因子IX缺乏导致的凝血功能障引起的HB的出血症状。

第五方面，本发明涉及第一方面的核酸构建体、第二方面的rAAV载体或第三方面的rAAV颗粒在制备用于治疗受试者中B型血友病的药物中的用途。优选地，所述药物用于静脉施用。

在优选的实施方案中，所述药物以4×10¹¹-2×10¹²个病毒基因组每千克体重(vg/kg)体重施用。

在具体的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，优选人。

在优选的实施方案中，所述受试者产生不足量的凝血因子IX蛋白，或产生有缺陷的或异常的凝血因子Ⅸ蛋白。

附图说明

图1的柱状图显示了scAAV载体介导的在HepG2细胞中的FIX突变体表达水平和活性检测的结果。

图2的柱状图显示了ssAAV载体介导的在HepG2细胞中的FIX突变体表达水平和活性检测的结果。

图3显示了本发明构建的9种scAAV载体表达盒(HB1-HB9)、8种ssAAV载体表达盒(HB10-HB17)和对照构建体(HB0)的结构示意图。白色箭头为启动子，黑色方框或黑色虚线为内含子，中间的箭头为FIX-PADUA编码序列，右侧灰色方框为poly(A)信号。

图4的柱状图显示了HB1-HB7和作为对照的HB0介导的在HepG2细胞中的FIX表达水平检测结果。

图5的柱状图显示了HB1、HB8、HB9、HB0介导的在HepG2细胞中的FIX表达水平检测结果(左、右为两次重复实验)。

图6的柱状图显示了HB1、HB8、HB9、HB0介导的在Huh7细胞中的FIX表达水平检测结果。

图7的柱状图显示了HB10-HB14和作为对照的HB0介导的在HepG2细胞中的FIX表达水平检测结果。

图8的柱状图显示了HB11、HB15-HB17、HB0介导的在HepG2细胞中的FIX表达水平检测结果。

图9的柱状图显示了HB11、HB15-HB17、HB0介导的在Huh7细胞中的FIX表达水平检测结果。

图10的柱状图显示了通过HB9载体递送的不同密码子优化FIX^PADUA编码序列在HepG2细胞中的表达水平和活性的检测结果。

图11的柱状图显示了通过HB17载体递送的不同密码子优化FIX^PADUA编码序列在HepG2和Huh7细胞中的表达水平和活性检测的结果。

发明详述

除非另有说明，否则本文公开的一些方法的实践采用植物学、生物化学、化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学和重组DNA的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。参见例如Sambrook和Green，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，4th Edition(2012)等。

术语“约”或“近似”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1或大于1的标准偏差内。或者，“约”可表示给定值的最多20％，最多10％，最多5％或最多1％的范围。或者，特别是对于生物系统或过程，该术语可以表示数值的一个数量级即10倍，优选地在5倍内，更优选地在2倍内。在申请和权利要求中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应当将术语“约”理解为在该语境下可接受的误差范围内。

如本文所用的术语“基因”是指核酸(例如DNA，例如基因组DNA和cDNA)及其相应的编码RNA转录物的核苷酸序列。如本文所用，关于基因组DNA的术语包括插入的非编码区以及调节区，并且可包括5'和3'末端。在一些用途中，该术语包括转录序列，包括5'和3'非翻译区(5'-UTR和3'-UTR)，外显子和内含子。在一些基因中，转录区域将包含编码多肽的“开放阅读框”。在该术语的一些用途中，“基因”仅包含编码多肽所必需的编码序列(例如，“开放阅读框”或“编码区”)。在一些情况下，基因不编码多肽，例如核糖体RNA基因(rRNA)和转移RNA(tRNA)基因。在一些情况下，术语“基因”不仅包括转录序列，而且还包括非转录区域，包括上游和下游调节区，增强子和启动子。基因可以指生物基因组中其天然位置中的“内源基因”或天然基因。基因可以指“外源基因”或非天然基因。非天然基因可以指通常不在宿主生物体中发现但通过基因转移引入宿主生物体的基因。非天然基因也可以指不在生物体基因组中的天然位置的基因。非天然基因还可以指天然存在的核酸或多肽序列，其包含突变，插入和/或缺失(例如，非天然序列)。

如本文所用的术语“核苷酸”通常是指碱-糖-磷酸盐组合。核苷酸可包含合成核苷酸。核苷酸可包含合成的核苷酸类似物。核苷酸可以是核酸序列的单体单元(例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA))。术语核苷酸可包括核糖核苷三磷酸腺苷三磷酸(ATP)，尿苷三磷酸(UTP)，三磷酸胞嘧啶(CTP)，三磷酸鸟苷(GTP)和脱氧核糖核苷三磷酸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。这些衍生物可包括，例如，[αS]dATP，7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP，以及赋予含有它们的核酸分子核酸酶抗性的核苷酸衍生物。本文使用的术语核苷酸可以指双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。双脱氧核糖核苷三磷酸的说明性实例可包括但不限于ddATP，ddCTP，ddGTP，ddITP和ddTTP。核苷酸可以通过众所周知的技术进行未标记或可检测标记。标记也可以用量子点进行。可检测标记可包括例如放射性同位素，荧光标记，化学发光标记，生物发光标记和酶标记。

术语“多核苷酸”，“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，指任何长度的聚合形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物，可以是单链、双链或多链形式。多核苷酸对细胞可以是外源的或内源的。多核苷酸可以存在于无细胞环境中。多核苷酸可以是其基因或片段。多核苷酸可以是DNA。多核苷酸可以是RNA。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。多核苷酸可包含一种或多种类似物(例如改变的主链，糖或核碱基)。

术语“B型血友病”和“乙型血友病”在本发明的上下文中具有相同含义，并且可以缩写为“HB”。HB是一种因凝血因子IX(FIX)缺陷导致的遗传疾病，为染色体隐性遗传病。由于凝血因子的缺乏，患者会存在凝血障碍，以出血为主要临床表现。

术语“治疗”包括治愈疾病，或者至少部分缓解、减轻疾病的一种或多种症状。例如，在本发明的上下文中，治疗可以减少出血频率、缩短出血时间或减少出血总量等。

术语“受试者”在本发明中指动物，优选脊椎动物，更优选哺乳动物，如啮齿动物，例如小鼠、大鼠；灵长类动物，例如猴；最优选人。

FIX表达构建体

在本发明的上下文中，“表达构建体”与“表达盒”同义，通常是某个载体或构建体的一部分或者将会被引入载体或构建体中，其通常包含一个或多个待表达的编码序列和与之可操作地连接的调控所述编码序列表达的调控序列，如启动子、增强子、翻译终止信号如聚腺苷酸化序列等。

术语“可操作地连接”意指各个元件之间以各自能够发挥其应有功能的方式进行连接。

本发明的表达盒还可以包含非编码序列如内含子、非翻译区序列等。

可以根据特定目的选择调控序列。例如，可以选择组织特异性启动子用于在特定组织中表达目的基因。然而，当包括编码序列和控制序列在内的各种元件以不同方式组合时的效果，以及它们在作用于特定目的基因编码序列时产生的效果，通常是难以预见的。

本发明的表达构建体被设计用于高效、稳定表达FIX基因，特别是在肝脏中，因此其至少包含转录调控元件(如启动子、增强子-启动子)、内含子、FIX基因编码序列和翻译终止信号。

转录调控元件

在本发明的上下文中，“转录调控元件”指调节目标基因转录的非编码DNA序列。转录调控元件可以分为顺式作用元件和反式作用元件。顺式作用元件与被调控的基因处于同一核酸分子上，通常较为接近。顺式作用元件包含转录因子结合位点，通过与转录因子结合来起始基因转录并调控转录效率。顺式作用元件通常包括启动子、增强子、沉默子。反式作用元件处于不同的染色体或核酸分子上，其编码反式作用因子即转录因子，通过与顺式作用元件发生相互作用来调节基因表达。

本发明的构建体和重组载体中的转录调控元件包含启动子或增强子-启动子元件。

“启动子”是起始基因转录的5’顺式作用DNA序列。根据启动子作用的特点，可以将其分为组成型启动子，组织或细胞特异性启动子，和发育阶段特异性启动子。启动子可以是天然存在的基因的固有启动子，也可以是经过人工改造的修饰的启动子。

“增强子”也是一种顺式作用元件，其作用于启动子，发挥激活、增强基因转录水平的作用。

为了实现本发明的目的，特别希望本发明构建体或载体中或增强子-启动子能够在肝脏中介导FIX的高表达。因此可以使用强力的组成型启动子，更优选具有肝脏特异性的启动子。

本领域已知多种肝脏特异性启动子或增强子-启动子元件，包括但不限于Alb(白蛋白)启动子、Cyp3a4(细胞色素P450 3A4)启动子、ET(转甲状腺素蛋白)启动子、hAAT(humanα1-antitrypsin；人α-1-抗胰蛋白酶)启动子、HLP(hybrid liver-specificpromoter；杂交肝特异性启动子)、HLP2、载脂蛋白2启动子、LP1(liver-specificpromoter；肝特异性启动子1)、miR-122(miRNA-122)启动子、血红素结合蛋白启动子、TTR(甲状腺素运载蛋白)启动子、enTTR、APOE-hAAT。

在优选的实施方案中，启动子或增强子-启动子元件选自LP1、HLP、TTR、HLP2、enTTR、APOE-hAAT，最优选enTTR。

“LP1启动子”是一种具有高特异性的肝脏特异性启动子(Amit C.Nathwani etal.,Blood.2006,107(7):2653-2661)。LP1启动子包含来自人载脂蛋白E/C-I基因座的肝调控区(HCR)的肝脏特异性元件和SERPINA1(Serpin家族A成员1)编码的hAAT启动子。本发明的LP1启动子具有如SEQ ID NO:2所示的序列。在包括前述Amit C.Nathwani等人的研究在内的多项研究中(Amit C.Nathwani等，2006，见上文；Wei Lu等，Front Med.2016Jun；10(2):212-8)，均使用了LP1启动子来构建表达人凝血因子IX的重组AAV载体。

“HLP”和“HLP2”均意指杂交肝特异性启动子。在本发明中，HLP和HLP2的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所示。

“TTR”包含甲状腺素运载蛋白的增强子和启动子，常用的TTR序列不尽相同。本发明的TTR序列如SEQ ID NO:4所示。虽然其包含增强子区，在本发明的上下文中有时也将其称为“TTR启动子”。

“enTTR”在TTR的基础上进一步包含了肝脏特异性的顺式调控元件——3xSERP(其详细序列可参见EP3270944B1)，在本发明中其序列如SEQ ID NO:6所示。虽然其包含增强子区和顺式调控元件，在本发明的上下文中有时也将其称为“enTTR启动子”。

“APOE-hAAT”由载脂蛋白E(APOE)基因的肝基因座调控元件和AAT启动子组成。LP1、HLP、HLP2均是APOE-hAAT的截短版本。本发明的APOE-hAAT如SEQ ID NO:7所示。

内含子

本发明的表达构建体还包含内含子序列，其通常位于启动子序列下游，FIX基因编码序列上游。在一些情况下，内含子可以增强表达构建体或重组载体中的基因在真核细胞中的表达。

可以使用其他基因的天然内含子或经修饰的内含子，如修饰的SV40内含子，如SEQID NO:9所示的SV40内含子。也可以使用人FIX基因本身的内含子。在优选的实施方案中，可以使用如SEQ ID NO:8所示的FIX Ti299、SEQ ID NO:10所示的FIX intronA、SEQ ID NO:11所示的FIX intronAco内含子，优选SEQ ID NO:11所示的FIX intronAco内含子。

聚腺苷酸化序列

本发明的表达构建体还包含聚腺苷酸化序列，也称作polyA或poly(A)。聚腺苷酸化序列是编码序列3’的非翻译区。本领域已知多种常用于表达构建体的聚腺苷酸化序列。在本发明的实施方案中，所述polyA可以是SV40polyA或bGH polyA，例如SEQ ID NO:14的SV40 polyA或SEQ ID NO:15的bGH polyA。在优选的实施方案中，所述聚腺苷酸化序列是如SEQ ID NO:14所示的SV40 polyA。

编码序列

作为通过病毒载体递送的目的基因编码序列，编码FIX基因的序列可以编码野生型FIX，也可以编码突变型FIX，如编码活性高于野生型的突变型FIX，如编码具有R338L突变的凝血因子IX的FIX^PADUA。

在一些实施方案中，目的基因编码序列是经过密码子优化的编码序列，以实现在受试者体内更好的表达，例如更加安全、高效的表达。尽管密码子优化的一些原则是本领域已知的，但具体到FIX和FIX^PADUA编码序列，在未经进一步实验验证之前，很难预先知晓何种序列会具有更好的表达效率或是活性水平，特别是体内的表达效率或活性水平。

在优选的实施方案中，经过密码子优化的序列相比于未经优化的序列可以具有更高的表达水平和/或更高的蛋白活性，例如高至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，甚至至少100％的表达水平和/或蛋白活性。表达水平、蛋白活性的测量可以按照本领域技术人员已知的方法进行，如按照本发明实施例部分描述的方法进行。

另一方面，本发明也考虑编码序列的CpG含量和分布。“CpG含量”指一段DNA序列中通过磷酸(p)相连的胞嘧啶(C)鸟嘌呤(G)二核苷酸的含量。“CpG岛”是基因组中CpG二核苷酸以较高概率出现的区域。例如，在本发明中使用Gardiner-Garden和Frommer(1987)所描述的算法确定CpG岛的存在。具体来说，一段至少含有200bp的区域，其中GC所占比例超过50％，且CpG的观察值/预测值比例高于0.6时，将这段区域称作“CpG岛”。CpG的预测值为：窗口内C的数量乘以窗口内G的数量，再除以窗口长度。在哺乳动物体内，外源基因未甲基化的CpG会被TLR9识别，激活CD8⁺T细胞清除被感染细胞，不利于外源基因的长时表达。因此，为了在人体内更加安全、高效地表达FIX编码基因，本发明中最优选将CpG岛数量降低至0。本发明的编码序列也优选含有较低的CpG含量。在将CpG含量和CpG岛数量也作为序列优化时考虑的条件时，其进一步加大了序列设计的难度。

本发明的发明人开发了多种优化的FIX^PADUA编码序列，并惊讶地发现其中的一些相对于野生型FIX^PADUA编码序列具有显著改进的表达水平和提高的蛋白活性。在此基础上，还发现这些效果改进的序列之间具有很高的序列同一性，而与其他序列(如效果改进不显著或效果未得到改进的优化序列，或野生型序列)相比时，序列同一性则较低。

“序列同一性”在本发明中是用于描述两条核苷酸序列的相似程度的百分数，其计算方式如下：将两条核苷酸对齐后，两条核苷酸序列中具有相同核苷酸的位置的总数除以总核苷酸数再乘以100％。对齐核苷酸序列的方式以及计算序列同一性的方法是本领域技术人员已知的，例如可以通过NCBI提供的工具blastn以“highly similar sequences(megablast)”模式进行。

rAAV载体和病毒颗粒

在健康人体内，FIX因子产生于肝脏。为增强肝脏的表达效率，避免不必要的表达，本发明的AAV基因疗法通过AAV载体特异性地向肝脏递送FIX因子基因，借由肝脏特异性表达调控序列介导FIX因子的时空特异性表达。

“载体”在本领域通常指用于递送核酸的重组质粒或病毒。本发明的重组AAV(rAAV)载体是指包含待递送的异源核酸的AAV病毒载体，所述异源核酸的两端或至少一端为AAV反向末端重复(inverted terminal repeat；ITR)序列。

所述异源核酸可以是本发明的重组构建体或表达盒，或包含本发明的重组构建体或表达盒。在一个实施方案中，本发明的rAAV载体可以包含一个或多个重组构建体或表达盒。

AAV ITR序列是指天然单链AAV基因组的两端的序列，大约为145个核苷酸长。其中最外侧的125个核苷酸含有多个可以自互补的区域，包括一个大回文序列A-A’，以及两个小回文序列B-B’和C-C’。最外侧125个核苷酸中还包括一个20个核苷酸的D区。D区中包含一段末端识别序列TRS，其在病毒DNA复制期间被AAV rep蛋白切下。本发明的ITR序列可以是任何AAV血清型的ITR序列或其变体，优选是AAV2 ITR或其变体。ITR序列可以来自与衣壳相同或不同的AAV血清型。

自身互补型AAV的设计(scAAV)通过删除一侧的ITR末端识别序列TRS，把两条互补链连接在一起，类似于双链DNA分子，感染后可以自行折叠成具有转录活性的双链，提高病毒的复制效率，大幅提高感染效率，实现FIX高表达。虽然自身互补的结构也缩小了表达盒允许的包装尺寸(单链形式最大允许包装5kb，自身互补的每条单链最大只能允许3.3kb)，但FIX cDNA只有1.4kb，所以能够满足使用scAAV的包装设计。

本发明还提供包含重组AAV载体的病毒颗粒，所述病毒颗粒进一步包含衣壳。用于本发明的衣壳可以选自任何血清型的衣壳，包括但不限于衣壳选自AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVLK03、AAVS3、AAVKP1、AAVrh10、AAVNP40、AAVNP59、AAV-DJ、AAVAnc80L65、AAVsL65、AAVHSC15、AAVC102、AAV204、AAV214血清型衣壳及其变体。在优选的实施方案中，所述病毒颗粒包含对肝脏具有组织嗜性(tissue tropism)的衣壳，特别是在通过静脉施用系统性递送所述病毒颗粒时。例如，本发明的病毒颗粒可以具有AAV8血清型的衣壳。

药物组合物

本发明的药物组合物可以包含本发明的表达构建体、rAAV载体、rAAV病毒颗粒和药学上可接受的载体。

“药学上可接受的载体”意指适合于递送到受试者体内，并且符合本发明的治疗目的的赋形剂，其不会在受试者体内引起不可接受的毒性、过敏反应或其他问题。药学上可接受的载体可以是液体，如水、乙醇，也可以是固体，如淀粉等。

除了用于递送FIX编码基因的有效成分和药学上可接受的载体之外，药物组合物还可以包含其他添加剂，如稳定剂、稀释剂、着色剂等。

施用

可以通过将本发明的表达构建体、rAAV载体、rAAV病毒颗粒和药物组合物施用给动物来递送编码FIX或FIX变体的转基因，从而治疗HB。

施用可以通过系统性施用进行，也可以局部施用到期望的器官、组织或细胞，例如肝脏中。

在一些情况下，静脉内施用本发明的rAAV载体或rAAV病毒颗粒或包含它们的药物组合物，如通过静脉输注进行。

施用的剂量可以在1×10¹¹-1×10¹³vg/kg的范围内，优选4×10¹¹-2×10¹²vg/kg体重范围内。

本发明还涉及以下各项：

项1.一种核酸构建体，其从5’到3’包含可操作地连接的如下元件：

(1)转录调控元件，其选自LP1、HLP、TTR、HLP2、enTTR、APOE-hAAT；

(2)内含子，其选自SV40内含子或FIX基因内含子；

(3)基因编码序列，其编码具有R338L突变的凝血因子IX；

(4)聚腺苷酸化序列，其选自SV40 polyA或bGH polyA。

项2.项1的核酸构建体，其中所述转录调控元件为如SEQ ID NO:5所示的HLP2启动子或如SEQ ID NO:6所示的enTTR启动子，优选如SEQ ID NO:6所示的enTTR启动子。

项3.项1或2的核酸构建体，其中所述内含子选自SEQ ID NO:8所示的FIX Ti299、SEQ ID NO:9所示的修饰的SV40内含子(mSV40)、SEQ ID NO:10所示的FIX intronA、SEQ IDNO:11所示的FIX intronAco内含子，优选SEQ ID NO:11所示的FIX intronAco内含子。

项4.项1-3中任一项的核酸构建体，其中所述基因编码序列针对人细胞内的表达进行了密码子优化。

项5.项4的核酸构建体，所述基因编码序列具有如下特征：

项6.项5的核酸构建体，所述基因编码序列进一步具有如下特征：

项7.项4-6中任一项的核酸构建体，所述基因编码序列具有如SEQ ID NOs:16、17、18、20、21和23中任一项所示的核苷酸序列，或与其具有至少85％同一性，优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性，还更优选至少98％同一性的核苷酸序列。

项8.项4-7中任一项的核酸构建体，所述基因编码序列具有如SEQ ID NOs:17、20和23中任一项所示的核苷酸序列，或与其具有至少85％同一性，优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性，还更优选至少98％同一性的核苷酸序列。

项9.项4-8中任一项的核酸构建体，所述基因编码序列为SEQ ID NOs:16、17、18、20、21和23中任一项所示的核苷酸序列。

项10.项4-9中任一项的核酸构建体，所述基因编码序列具有低于100、低于90、低于80、低于70、低于60、低于50、低于40、低于30、低于20、低于10、低于5或为0的CpG含量。

项11.项4-10中任一项的核酸构建体，所述基因编码序列不含CpG岛。

项12.项1-11中任一项所述的核酸构建体，其中所述聚腺苷酸化序列为SEQ IDNO:14所示SV40 polyA或SEQ ID NO:15所示的bGH polyA，优选SEQ ID NO:14所示的SV40polyA。

项13.一种重组腺相关病毒(rAAV)载体，其包含项1-12中任一项的核酸构建体和至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)。

项14.项13的rAAV载体，其包含两个AAV ITR。

项15.项13或14的rAAV载体，所述AAV ITR来自于AAV2 ITR。

项16.项15的rAAV载体，所述rAAV载体包含一个AAV2 ITR和一个AAV2 ITR变体。

项17.项16的rAAV载体，所述AAV2 ITR变体是缺少1个C区或C’区的AAV2 ITR变体。

项18.项16或17的rAAV载体，所述AAV2 ITR位于编码序列上游，并且所述AAV2 ITR变体位于编码序列下游。

项19.一种rAAV病毒颗粒，其包含项13-18中任一项的rAAV载体和衣壳。

项20.项19的rAAV病毒颗粒，其包含AAV8血清型衣壳。

项21.一种药物组合物，其包含项1-12中任一项所述的核酸构建体，项13-18中任一项所述的rAAV构建体，或项19或20所述的rAAV病毒颗粒，和药学上可接受的载体。

项22.项1-12中任一项所述的核酸构建体，项13-18中任一项所述的rAAV构建体，或项19或20所述的rAAV病毒颗粒在制备用于治疗或预防受试者中B型血友病或与之相关的出血症状的药物中的用途。

项23.项22的用途，所述药物用于静脉施用。

项24.项23的用途，所述药物以4×10¹¹-2×10¹²个病毒基因组每千克体重(vg/kg)的剂量施用。

项25.项22-24中任一项的用途，所述受试者为哺乳动物，优选人。

项26.项22-25中任一项的用途，所述受试者产生不足量或缺陷或异常的凝血因子Ⅸ蛋白。

实施例

为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实验材料和方法

在下文中描述实施例中使用的实验材料和方法。

在没有特别说明的情况下，本发明的重组腺相关病毒载体使用AAV8血清型进行递送。

1.基于ELISA法的凝血因子IX浓度检测方法

1.1方法原理

采用凝血因子IX/FIX/F9抗体,兔单克隆抗体(Rabbit Mab)作为捕获试剂，包被至96孔酶标板。结合待测物后，加入检测抗体Biotin-F2645(生物素抗因子IV抗体，小鼠单克隆-克隆HIX-1，纯化子杂交瘤细胞培养物)与待测物结合，加入酶标链霉亲和素(SA-HRP)，随后加入底物TMB，产生颜色反应。颜色的深浅与待测物的浓度呈正比。加入终止液终止反应，酶标仪在450nm波长下检测(参比波长为630nm)，振荡5s读取OD值。以理论浓度为横坐标，测得矫正后的OD值与空白复孔OD均值的差为纵坐标，通过四参数回归模型来拟合标准曲线的相关参数，从而可计算样品浓度。

1.2实验步骤

a)往96孔板中加入包被液，孵育后用洗涤缓冲液洗板；

b)加入封闭液，孵育后用洗涤缓冲液洗板；

c)分别加入标曲、质控和待测样品，孵育后用洗涤缓冲液洗板；

d)加入检测抗体，孵育后用洗涤缓冲液洗板；

e)加入SA-HRP，孵育后用洗涤缓冲液洗板；

f)加入TMB显色；

g)加入终止液终止反应；

h)使用酶标仪在450-630nm条件下读取吸光值。

2.凝血因子FIX的活性检测方法

2.1方法原理

采用BIOPHEN FIX活性测定试剂盒检测hFIX活性。该方法原理如下：在磷脂和钙的作用下，XIa因子激活待测样品中存在的固定的Ⅸ因子，将其转化为激活状态的因子Ⅸ。因子Ⅷ:C被凝血酶激活，与因子Ⅸa形成酶复合物激活因子Ⅹ。由此产生的因子Ⅹa水解生色底物，导致对氨基苯胺的释放，释放的对氨基苯胺与样品中因子Ⅸ的浓度成正比，加入2％柠檬酸终止反应，酶标仪在405nm波长下检测读取OD值。以理论FⅨ活性(IU/mL)为横坐标，测得矫正后的标准曲线复孔OD均值与空白复孔OD均值的差为纵坐标，通过四参数回归模型来拟合标准曲线的相关参数，从而可计算样品中FⅨ活性。

2.2实验步骤

a)将稀释好的标准曲线、质控和样品分别加到96孔板中；

b)加入R1(Reagent 1；试剂1)：人凝血因子X和冻干的FVIII:C(Human Factor Xand lyophilized FVIII:C)，混匀，孵育；

c)加入R2(Reagent 2；试剂2)：激活试剂(Activator reagent)，混匀，孵育；

d)加入R3(Reagent 3；试剂3)：底物-因子Xa特异性冻干显色底物(Substrate-Lyophilized chromogenic substrate specific to Factor Xa)，混匀，孵育；

e)加入2％柠檬酸终止反应；

f)用酶标仪检测405nm处吸光度值。

3.AAV8中和抗体(NAB)检测方法

3.1方法原理

HEK293细胞在感染携带荧光素酶基因的重组腺相关病毒8(AAV8)后可表达荧光素酶。加入相应底物后，荧光素酶可催化底物生成可发光的产物，产物越多荧光值越高。若存在抗AAV8中和抗体，携带荧光素酶基因的AAV8即无法感染HEK293细胞并表达荧光素酶，荧光值因而减低。因此通过检测荧光值可评估在血浆中抗AAV8中和抗体的含量。

3.2实验步骤

a)将HEK293细胞回收并重悬；

b)铺板：向细胞培养板中加入细胞重悬液，孵育；

c)样品稀释板封闭：另取细胞培养板加入1％BSA溶液，孵育，使用1xPBS洗板；

d)样品孵育：加入稀释后的待测样品和AAV8-Luciferase Work Solution于封闭后的细胞培养板内混合，孵育；

e)加样：向铺入细胞的培养板中加入孵育后的样品，轻轻晃动，孵育后用1xPBS洗板；

f)细胞裂解：向细胞培养板中加入细胞裂解液，室温振荡；

g)检测：吸取细胞裂解后的上清液，转移至96F NONTREATED WHITE MICROWELL SH中，加入荧光素酶检测试剂，避光振荡；

h)读数：使用酶标仪测定RLU。

4.凝血因子FIX-padua中和抗体检测方法(FⅨ-padua NAB assay)

4.1方法原理

采用人乏hFⅨ血浆按一定稀释倍数系列稀释待测样品，随后与标准人血浆混合后采用BIOPHEN FⅨ活性测定试剂盒检测残留hFⅨ活性。抗hFⅨ-Padua中和抗体的量采用Bethesda Unit(Bu)表示，当残留活性比(残留活性与空白对照样品活性的比值)为50％时即为1BU。

采用BIOPHEN FⅨ活性测定试剂盒检测hFⅨ活性原理如下：在磷脂和钙的作用下，XIa因子激活待测样品中存在的固定的Ⅸ因子，将其转化为激活状态的因子Ⅸ。因子Ⅷ:C被凝血酶激活，与因子Ⅸa形成酶复合物激活因子Ⅹ。由此产生的因子Ⅹa水解生色底物，导致对氨基苯胺的释放，释放的对氨基苯胺与样品中因子Ⅸ的浓度成正比，加入2％柠檬酸终止反应，酶标仪在405nm波长下检测读取OD值。hFIX残留活性(100％，％RA)＝待测样品中hFIX活性/阴性对照样品中hFIX活性*100。

BU＝(2-log％RA)/0.301*稀释倍数。≥0.5BU判断为抗hFIX中和抗体阳性。

4.2实验步骤

a)向96孔板中加入标曲、质控、待测样品和阴性对照样品；

b)加入R1，混匀，孵育；

c)加入R2，混匀，孵育；

d)加入R3，混匀，孵育；

e)加入2％柠檬酸终止反应；

f)用酶标仪检测405nm处吸光度值。

实施例1.高活性FIX突变体的选择

早期FIX基因疗法临床试验选择野生型FIX蛋白序列，未对FIX编码序列进行密码子优化，FIX活性稳态维持水平较低且时间较短。

FIX^PADUA是一种天然存在的FIX突变体，发现于一位意大利青少年静脉血栓患者体内，具有单个氨基酸突变(R338L)。与野生型FIX相比，在表达水平(FIX:Ag)相同的情况下，凝血活性(FIX:C)可以提高5-10倍。Spark的SPK-9001、UniQure的AMT-061和Freeline的FLT180a均选择了高活性FIX^PADUA变体作为转导基因。

为了确认FIX^PADUA变体相对于野生型FIX是否确实具有改进的表达水平和蛋白活性，将FIX^WT、FIX^PADUA连接到scAAV载体和ssAAV载体中，并用于转染人肝脏肿瘤细胞系HepG2和Huh7。

具体方法而言，将HepG2和Huh7细胞在高糖DMEM+10％FBS中培养，传代时用TrypLE消化。转染前1天以2.2×10⁵个细胞/孔接种于12孔板。转染采用Lipofectamine 3000试剂盒(Invitrogen，L3000008)并遵循官网推荐的HepG2转染实验步骤进行。每孔转染1μg质粒，每个质粒转染3个重复孔。转染后更换培养基为DMEM+1％GlutaMax+10μg/mL维生素K。转染后72小时收集细胞培养上清用于FIX ELISA检测(abcam,ab168546)。

使用HepG2细胞的实验结果表明，FIX^WT表达量高但蛋白比活性低(图1)；FIX^PADUA表达量稍低于FIX^WT但蛋白比活性提高了10.01-12.85倍(图2)。因此，选择FIX^PADUA用于进一步的开发。

实施例2.FIX基因表达盒中调控元件的筛选

发明人选取不同调控元件设计并制备了9个scAAV载体表达盒(HB1-HB9)及8个ssAAV载体表达盒(HB10-HB17)(图3和表1)，比较了它们在人肝脏肿瘤细胞HepG2和Huh7中的表达效率，并以CMV-FIX^PADUA作为对照(HB0)。考虑到scAAV和ssAAV的DNA承载量不同，所以将scAAV和ssAAV载体的FIX表达效率分开比较。

表1.构建体中调控元件的组合

/>

转染条件与实施例1中相同。转染后72小时收集细胞培养上清用于FIX ELISA检测(abcam,ab168546)及Biophen FIX活性检测(HYPHEN BioMed，221802)。

第一批构建的7个scAAV载体(HB1-HB7)的HepG2细胞实验结果表明，内含子FIXTi299(Ti299)介导的表达效率高于SV40内含子(mSV40，即修饰的SV40内含子)(HB1高于其他各个构建体)；LP1、HLP、TTR、HLP2、enTTR五个启动子中表达效率最高的是enTTR和HLP2(HB5、HB6、HB7，其中HB5和HB6的区别仅在于启动子)；翻译终止信号SV40 polyA和bGHpolyA对于表达效率的贡献相近(HB6与HB7表现相近，区别仅在于polyA)(图4)。基于这些结果，选择了效果更好的FIX Ti299作为第二轮筛选中的内含子。在翻译终止信号方面，考虑到AAV载体的容量，选择了更短的SV40polyA用于第二轮scAAV表达盒筛选。

将FIX Ti299接入第一轮筛选中表达效率最高的两个启动子——HLP2和enTTR，并使用SV40 polyA后，构建了第二批的两个构建体HB8和HB9。将这两个构建体与上一轮表现最佳的HB1一起进行第二轮scAAV载体筛选，并仍然以HB0为对照，在HepG2和Huh7两种细胞中进行了同样的实验。结果表明，在两种细胞中表达效率最高的构建体均为HB9，其采用了enTTR启动子和Ti299内含子(图5、图6)。

选择CMV-FIX^PADUA作为对照比较ssAAV表达盒的表达效率。第一批构建的5个ssAAV载体(HB10-HB14)的HepG2细胞实验结果表明，内含子FIX intronAco介导的表达效率高于FIX intronA(HB11高于HB10，差别仅在于内含子)；APOE-hAAT、LP1、HLP2、enTTR四个启动子中表达效率最高的是enTTR(HB14)(图7)。因此，将FIX intronAco接入APOE-hAAT、LP1、HLP2、enTTR后，进行了第二轮ssAAV载体筛选，并在HepG2和Huh7两种细胞中进行了实验。结果表明，在两种细胞中表达效率最高的构建体均为HB17，其含有enTTR启动子和FIXintronAco内含子(图8、图9)。这个结果进一步验证了enTTR是效率最高的启动子。

实施例3.编码序列的优化

发明人设计并合成了8条经过密码子优化的FIX^PADUA编码序列，分别命名为FIX-PADUA-co1至FIX-PADUA-co8，其核苷酸序列分别如SEQ ID NOs:16-23所示。使用这些密码子优化的编码序列，构建了相应的重组载体，并在HepG2和Huh7细胞中重复了如先前实施例所述的转导实验。

图10显示了通过HB9载体递送的以上8种不同的密码子优化序列在HepG2细胞中的表达水平和活性的检测结果，并与未经密码子优化的SEQ ID NO:12的FIX^PADUA编码序列进行了比较。从图10的结果可知，FIX-PADUA-co8、FIX-PADUA-co5和FIX-PADUA-co2为表现最佳的三个密码子优化序列，特别是FIX-PADUA-co8和FIX-PADUA-co5的表现是对照的2倍以上。另外，FIX-PADUA-co3、FIX-PADUA-co6和FIX-PADUA-co1的表达水平相对于对照也有显著的提高。

申请人通过序列比对分析了这些优化序列与未经优化序列的序列相似性，以及序列中的CpG含量、CpG岛数量，结果如下表2所示。

表2.8个经优化的FIX^PADUA编码序列与未经优化的FIX^PADUA编码序列的比较

	CpG数	CpG岛	同一性％
				PADUA_co1	78	有	76.63
PADUA_co2	87	有	76.12
				PADUA_co3	123	有	73.52
PADUA_co4	63	有	77.27
				PADUA_co5	94	有	74.31
PADUA_co6	113	有	73.73
				PADUA_co7	75	有	75.18
PADUA_co8	0	无	78.51
				PADUA_wt	19	无	100

从上表2可知，优化序列与未优化序列的同一性均低于80％，说明他们在结构上相似度较低。申请人还通过比对分析了各个优化序列之间的序列相似性。比对采用NCBI的blastn以“highly similar sequences(megablast)”模式进行，结果如下表3所示。

表3.8个经优化的FIX^PADUA编码序列之间的核苷酸序列同一性

N.S.S.＝无显著相似性

结合表3中的序列相似性数据与图10中的结果，意外地发现序列相似性与优化序列的表达水平具有一定的对应关系。例如，根据图10中的表达水平结果，仅FIX-PADUA-co4和FIX-PADUA-co7的效果不如未优化序列，而表3中的这两个序列与其他六个优化序列均无显著相似性，或者同一性低于80％(FIX-PADUA-co7仅仅与FIX-PADUA-co1有78.27％的同一性％)。另一方面，图10中的表现超过未优化序列的六个优化序列两两之间均有85％以上的序列同一性％，例如FIX-PADUA-co5与除了FIX-PADUA-co4和FIX-PADUA-co7之外的其他优化序列均具有90％以上的相似性。这些结果说明，与效果较好的本发明的优化序列，如SEQID NO:17的FIX-PADUA-co2、SEQ ID NO:20的FIX-PADUA-co5或SEQ ID NO:23的FIX-PADUA-co8的任一具有较高序列同一性，如至少85％同一性，或者甚至至少90％同一性的优化序列，更有可能相对于未经优化的序列具有改进的表达水平。

图11显示了表达效率表现最佳的三个优化序列(FIX-PADUA-co2、FIX-PADUA-co5和FIX-PADUA-co8)使用ssAAV HB17递送时，在HepG2和Huh7两种细胞中的表达结果。无论是scAAV还是ssAAV递送的条件下，三个优化序列相对于未优化序列均有显著的表达效率提升。

在后续实验中，同时考虑编码序列的GC含量(表2)，最终选择了PADUA_co8(SEQ IDNO:23)用于构建基因治疗载体，以进行后续实验。

考虑到AAV侵染到体内后，scAAV的突变ITR序列会被TLR9识别，引起免疫反应，因此scAAV比ssAAV免疫原性风险更大，因此选择了ssAAV-enTTR-FIXintronAco-FIX^PADUA_co8-SV40 polyA作为最终AAV载体进行后续实验，并将其命名为VGB-R04。

实施例4.体内药效试验

本实施例描述了使用ssAAV-enTTR-FIXintronAco-FIX^PADUA_co8-SV40polyA(VGB-R04)在小鼠体内进行的药效试验。

1.C57BL/6小鼠单次静脉注射给予VGB-R04的药效学预实验

C57BL/6小鼠对于AAV8高度敏感，且乙型血友病为X染色体连锁隐性遗传病，发病人群为男性。因此本研究仅采用雄性小鼠进行评价。

本试验所有动物均分别单次静脉注射给与相应剂量的VGB-R04；共设2个剂量组(组1-3)，具体如下表4所示。

表4.剂量分组

有动物在给药前、给药后第一周(W1)、给药后第二周(W2)三个时间点采集血浆进行FIX^PADUA活性分析。结果如下表5所示。

表5.试验结果

从表5的结果可知，本发明的VGB-R04在小鼠中可以提高血浆凝血因子FIX活性至超生理水平，并表现出明显的剂量-效应关系。

2.B型血友病(HB)小鼠单次静脉注射给予VGB-R04的药效学长效性试验

进一步研究了VGB-R04在乙型血友病(HB)病理模型动物即HB小鼠中的药效学特征，尤其是长效性。

试验采用HB小鼠即FIX基因敲除小鼠(FIX KO mice)进行，并以正常C57小鼠作为对照。FIX基因敲除小鼠模型具有明确的凝血障碍等HB表型。本试验采用的HB小鼠由中国科学院动物研究所构建，为利用CRISPR/Cas技术在C57小鼠FIX基因的第二个外显子及第二个内含子处切割基因组，造成第二个外显子部分缺失，突变基因序列发生移码突变，导致转录提前终止，错误蛋白被机体降解。

HB为X染色体连锁隐性遗传疾病，发病人群为男性，因此该试验均采用雄性动物。

本试验所有动物均分别单次静脉注射给与相应剂量的VGB-R04。共设5个剂量组(组1-5)，另外设计1组溶媒(vehicle)对照组(组6)及一组野生C57对照组(组7，急性断尾出血研究野生型对照)，具体动物数量和剂量水平信息见表6。

表6.剂量分组

组1-组6所有动物交叉采集血浆进行FIX^PADUA活性及蛋白浓度分析。每个采样点确保至少6个个体，采血时间点如下(W＝周)：

组1-组5：给药前(D-3～D-1)，W1，W2，W4，W8，W12，W16，W20，W24，W28，W30；

组6：给药前(D-3～D-1)，W12，W30。

组1-组7全部存活小鼠在W30进行断尾药效评价，观察断尾后出血量及出血时间。试验测得的FIX活性结果如下表7所示，其中将人标准血浆的FIX活性设为100％，以之为参照用百分比表示检测到的小鼠血浆中人FIX的活性。

表7.给药前后小鼠血浆中的FIX活性

从表7的结果可知，本发明的VGB-R04在HB小鼠中可以显著提高HB小鼠血浆FIX活性至生理水平或超生理水平，并表现出明显的剂量-效应关系。

3.食蟹猴单次静脉注射给予VGB-R04的药效学试验

进一步研究了VGB-R04在健康食蟹猴体内的药效学特征。

食蟹猴对AAV敏感在已有报道的研究中，食蟹猴与人体临床量效关系相关性良好，是评估AAV基因治疗产品体内药效动力学行为较为理想的动物种属。乙型血友病发病人群为男性。因此本试验采用雄性动物。

给药前需进行动物体内抗AAV8中和抗体筛选并选择中和抗体滴度<1:5的动物进行试验。本试验所有动物均分别单次静脉注射给与相应剂量的VGB-R04；共设3个剂量组(组1-3)，具体如下表8所示。

表8.剂量分组

所有动物于给药前及给药后D8、D15、D22、D29、D36(D＝天)进行血液学和血生化检测。

所有动物采集血浆进行FIX^PADUA活性、FIX^PADUA蛋白浓度及抗hFIX抑制物分析，采血时间点如下：

组1-组3：给药前(D-3～D-1，D1)，给药后从D8起每周1次，共18周。

本发明的序列编号和对应的序列如下表所示。

/>

序列表

<110> 上海天泽云泰生物医药有限公司

<120> 用于治疗或预防B型血友病的重组腺相关病毒载体和方法

<130> PS12926VIT33CN

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 584

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 420

ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480

ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 540

tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agct 584

<210> 2

<211> 448

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60

tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120

cactcgaccc cttggaattt cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt 180

agtgtgagag gggaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc 240

aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt 300

ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc 360

ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg 420

caccaccact gacctgggac agtgaatc 448

<210> 3

<211> 252

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtttgctgc ttgcaatgtt tgcccatttt agggtggaca caggacgctg tggtttctga 60

gccagggggc gactcagatc ccagccagtg gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac 120

tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg 180

cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc tcctcagctt caggcaccac cactgacctg 240

ggacagtgaa tc 252

<210> 4

<211> 302

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cactgggagg atgttgagta agatggaaaa ctactgatga cccttgcaga gacagagtat 60

taggacatgt ttgaacaggg gccgggcgat cagcaggtag gtctgtctgc acatttcgta 120

gagcgagtgt tccgatactc taatctccct aggcaaggtt catatttgtg taggttactt 180

attctccttt tgttgactaa gtcaataatc agaatcagca ggtttggagt cagcttggca 240

gggatcagca gcctgggttg gaaggagggg gtataaaagc cccttcacca ggagaagccg 300

tc 302

<210> 5

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60

tgaccttgga gctggggcag aggtcagaca cctctctggg cccatgccac ctccaactgg 120

acacaggacg ctgtggtttc tgagccaggg ggcgactcag atcccagcca gtggacttag 180

cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg accttggtta atattcacca gcagcctccc 240

ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat acggacgagg acagggccct gtctcctcag 300

cttcaggcac caccactgac ctgggacagt gaatgatccc cctgatctgc ggcc 354

<210> 6

<211> 520

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg 60

ggctaagtcc accgggggag gctgctggtg aatattaacc aaggtcaccc cagttatcgg 120

aggagcaaac aggggctaag tccaccgggg gaggctgctg gtgaatatta accaaggtca 180

ccccagttat cggaggagca aacaggggct aagtccacca ctgggaggat gttgagtaag 240

atggaaaact actgatgacc cttgcagaga cagagtatta ggacatgttt gaacaggggc 300

cgggcgatca gcaggtaggt ctgtctgcac atttcgtaga gcgagtgttc cgatactcta 360

atctccctag gcaaggttca tatttgtgta ggttacttat tctccttttg ttgactaagt 420

caataatcag aatcagcagg tttggagtca gcttggcagg gatcagcagc ctgggttgga 480

aggagggggt ataaaagccc cttcaccagg agaagccgtc 520

<210> 7

<211> 748

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60

ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120

tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180

cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240

tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300

ggtttaggta gtgtgagagg gggtacccgg ggatcttgct accagtggaa cagccactaa 360

ggattctgca gtgagagcag agggccagct aagtggtact ctcccagaga ctgtctgact 420

cacgccaccc cctccacctt ggacacagga cgctgtggtt tctgagccag gtacaatgac 480

tcctttcggt aagtgcagtg gaagctgtac actgcccagg caaagcgtcc gggcagcgta 540

ggcgggcgac tcagatccca gccagtggac ttagcccctg tttgctcctc cgataactgg 600

ggtgaccttg gttaatattc accagcagcc tcccccgttg cccctctgga tccactgctt 660

aaatacggac gaggacaggg ccctgtctcc tcagcttcag gcaccaccac tgacctggga 720

cagtgaatga tccccctgat ctgcggcc 748

<210> 8

<211> 299

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtttgtttcc ttttttaaaa tacattgagt atgcttgcct tttagatata gaaatatctg 60

atgctgtctt cttcactaaa ttttgattac atgatttgac agcaatattg aagagtctaa 120

cagccagcac gcaggttggt aagtactgtg ggaacatcac agattttggc tccatgccct 180

aaagagaaat tggctttcag attatttgga ttaaaaacaa agactttctt aagagatgta 240

aaattttcat gatgttttct tttttgctaa aactaaagaa ttattctttt acatttcag 299

<210> 9

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctctaaggta aatataaaat ttttaagtgt ataatgtgtt aaactactga ttctaattgt 60

ttctctcttt tagattccaa cctttggaac tg 92

<210> 10

<211> 1438

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtttgtttcc ttttttaaaa tacattgagt atgcttgcct tttagatata gaaatatctg 60

atgctgtctt cttcactaaa ttttgattac atgatttgac agcaatattg aagagtctaa 120

cagccagcac gcaggttggt aagtactggt tctttgttag ctaggttttc ttcttcttca 180

tttttaaaac taaatagatc gacaatgctt atgatgcatt tatgtttaat aaacactgtt 240

cagttcatga tttggtcatg taattcctgt tagaaaacat tcatctcctt ggtttaaaaa 300

aattaaaagt gggaaaacaa agaaatagca gaatatagtg aaaaaaaata accacattat 360

ttttgtttgg acttaccact ttgaaatcaa aatgggaaac aaaagcacaa acaatggcct 420

tatttacaca aaaagtctga ttttaagata tatgacattt caaggtttca gaagtatgta 480

atgaggtgtg tctctaattt tttaaattat atatcttcaa tttaaagttt tagttaaaac 540

ataaagatta acctttcatt agcaagctgt tagttatcac caaagctttt catggattag 600

gaaaaaatca ttttgtctct atgtcaaaca tcttggagtt gatatttggg gaaacacaat 660

actcagttga gttccctagg ggagaaaagc aagcttaaga attgacataa agagtaggaa 720

gttagctaat gcaacatata tcactttgtt ttttcacaac tacagtgact ttatgtattt 780

cccagaggaa ggcatacagg gaagaaatta tcccatttgg acaaacagca tgttctcaca 840

ggaagcattt atcacactta cttgtcaact ttctagaatc aaatctagta gctgacagta 900

ccaggatcag gggtgccaac cctaagcacc cccagaaagc tgactggccc tgtggttccc 960

actccagaca tgatgtcagc tgtgaaatcg acgtcgctgg accataatta ggcttctgtt 1020

cttcaggaga catttgttca aagtcatttg ggcaaccata ttctgaaaac agcccagcca 1080

gggtgatgga tcactttgca aagatcctca atgagctatt ttcaagtgat gacaaagtgt 1140

gaagttaacc gctcatttga gaactttctt tttcatccaa agtaaattca aatatgatta 1200

gaaatctgac cttttattac tggaattctc ttgactaaaa gtaaaattga attttaattc 1260

ctaaatctcc atgtgtatac agtactgtgg gaacatcaca gattttggct ccatgcccta 1320

aagagaaatt ggctttcaga ttatttggat taaaaacaaa gactttctta agagatgtaa 1380

aattttcatg atgttttctt ttttgctaaa actaaagaat tattctttta catttcag 1438

<210> 11

<211> 1438

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtctttttcc ttttcttaaa tatattgaat atgcttgtct tcttgatatt gaaattagtg 60

atgcagtttt ctttactaaa ttttgacttc atgatcttac tgctattctt aaatcattaa 120

ctgcatctac acaagttgga aaatattggt ttttcgtttc ttaagttttc tttttcttta 180

tctttaaaac aaaatgaatt gataatgctt atgatgcttt tatgtttaac aaacattgtt 240

ctgttcatga tcttgtaatg tgatttcttt tagaaaatat tcatctactt ggacttaaaa 300

aacttaaagt tggtaaacaa agaaattctc gaatttgatg aaagaaaatt acaactctat 360

ttctttttgg attaacaact ctaaaaagta aatgggaaac taaagctcaa acaatggcac 420

tttttactca aaaagtttga ttttgagata tttgacactt taaagtttct gaagtatgta 480

atgaagtatg tctatgattt ttcaaactat atatctttaa tcttaaattt tgacttaaac 540

ataaagattg accttttatt agtaaactac tagttattac aaaagcattt catggacttg 600

gtaaaaatca ttttgtatct atgagtaata ttcttgaact aatttttgga gaaactcaat 660

attctgttga atttccaaga ggtgaaaaac aagcttaaga attaacatga cgagtaggat 720

catgacttat gcaacatatt tctctttgtt tctttacaac tacagttact ctttgtattt 780

ctcaaagaaa agcatatcga gaagaaatta ttccttttgg tcaaacagct tgtagtcata 840

gaaaacatct ttcacatctt ttagttaatt ttcttgaatc taatcttgta gctgatagta 900

ctagaattcg aggagcaaat cctaaacatc cacaaaaagc tgattggcct tgtggttcac 960

attctagaca tgatgtttct tgtgaaattg atgtagcagg accatgactt ggtttttgtt 1020

ctagtggaga tatttgtagt aaatcatttg gtcaacctta ttctgaaaat agtccagcta 1080

gagttatgga tcattttgca aaaattctta atgaattatt ttcatctgat gataaagttt 1140

gaagttaacc actaatttga gaacttagtt ttagttcaaa agtaaattca aatatgatta 1200

gaaatcttac tttttattat tggaattcac ttgattgaaa atgaaattga attcttattc 1260

ctaaaagtcc atgcgtttat tcaactgtag gaacatctca aattctagca ccttgtccaa 1320

aagaaaaact tgcttttaga ctatttggtc ttaaaactaa aacatttctt cgagatgtta 1380

aattttcttg atgttttcta ttttgttgaa attgacgaat tattcttctt catttcag 1438

<210> 12

<211> 1386

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta 60

ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc caacaaaatt 120

ctgaatcggc caaagaggta taattcaggt aaattggaag agtttgttca agggaacctt 180

gagagagaat gtatggaaga aaagtgtagt tttgaagaag cacgagaagt ttttgaaaac 240

actgaaagaa caactgaatt ttggaagcag tatgttgatg gagatcagtg tgagtccaat 300

ccatgtttaa atggcggcag ttgcaaggat gacattaatt cctatgaatg ttggtgtccc 360

tttggatttg aaggaaagaa ctgtgaatta gatgtaacat gtaacattaa gaatggcaga 420

tgcgagcagt tttgtaaaaa tagtgctgat aacaaggtgg tttgctcctg tactgaggga 480

tatcgacttg cagaaaacca gaagtcctgt gaaccagcag tgccatttcc atgtggaaga 540

gtttctgttt cacaaacttc taagctcacc cgtgctgaga ctgtttttcc tgatgtggac 600

tatgtaaatt ctactgaagc tgaaaccatt ttggataaca tcactcaaag cacccaatca 660

tttaatgact tcactcgggt tgttggtgga gaagatgcca aaccaggtca attcccttgg 720

caggttgttt tgaatggtaa agttgatgca ttctgtggag gctctatcgt taatgaaaaa 780

tggattgtaa ctgctgccca ctgtgttgaa actggtgtta aaattacagt tgtcgcaggt 840

gaacataata ttgaggagac agaacataca gagcaaaagc gaaatgtgat tcgaattatt 900

cctcaccaca actacaatgc agctattaat aagtacaacc atgacattgc ccttctggaa 960

ctggacgaac ccttagtgct aaacagctac gttacaccta tttgcattgc tgacaaggaa 1020

tacacgaaca tcttcctcaa atttggatct ggctatgtaa gtggctgggg aagagtcttc 1080

cacaaaggga gatcagcttt agttcttcag taccttagag ttccacttgt tgaccgagcc 1140

acatgtcttc tatctacaaa gttcaccatc tataacaaca tgttctgtgc tggcttccat 1200

gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat agtgggggac cccatgttac tgaagtggaa 1260

gggaccagtt tcttaactgg aattattagc tggggtgaag agtgtgcaat gaaaggcaaa 1320

tatggaatat ataccaaggt atcccggtat gtcaactgga ttaaggaaaa aacaaagctc 1380

acttaa 1386

<210> 13

<211> 1386

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta 60

ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc caacaaaatt 120

ctgaatcggc caaagaggta taattcaggt aaattggaag agtttgttca agggaacctt 180

gagagagaat gtatggaaga aaagtgtagt tttgaagaag cacgagaagt ttttgaaaac 240

actgaaagaa caactgaatt ttggaagcag tatgttgatg gagatcagtg tgagtccaat 300

ccatgtttaa atggcggcag ttgcaaggat gacattaatt cctatgaatg ttggtgtccc 360

tttggatttg aaggaaagaa ctgtgaatta gatgtaacat gtaacattaa gaatggcaga 420

tgcgagcagt tttgtaaaaa tagtgctgat aacaaggtgg tttgctcctg tactgaggga 480

tatcgacttg cagaaaacca gaagtcctgt gaaccagcag tgccatttcc atgtggaaga 540

gtttctgttt cacaaacttc taagctcacc cgtgctgaga ctgtttttcc tgatgtggac 600

tatgtaaatt ctactgaagc tgaaaccatt ttggataaca tcactcaaag cacccaatca 660

tttaatgact tcactcgggt tgttggtgga gaagatgcca aaccaggtca attcccttgg 720

caggttgttt tgaatggtaa agttgatgca ttctgtggag gctctatcgt taatgaaaaa 780

tggattgtaa ctgctgccca ctgtgttgaa actggtgtta aaattacagt tgtcgcaggt 840

gaacataata ttgaggagac agaacataca gagcaaaagc gaaatgtgat tcgaattatt 900

cctcaccaca actacaatgc agctattaat aagtacaacc atgacattgc ccttctggaa 960

ctggacgaac ccttagtgct aaacagctac gttacaccta tttgcattgc tgacaaggaa 1020

tacacgaaca tcttcctcaa atttggatct ggctatgtaa gtggctgggg aagagtcttc 1080

cacaaaggga gatcagcttt agttcttcag taccttagag ttccacttgt tgaccgagcc 1140

acatgtcttc gatctacaaa gttcaccatc tataacaaca tgttctgtgc tggcttccat 1200

gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat agtgggggac cccatgttac tgaagtggaa 1260

gggaccagtt tcttaactgg aattattagc tggggtgaag agtgtgcaat gaaaggcaaa 1320

tatggaatat ataccaaggt atcccggtat gtcaactgga ttaaggaaaa aacaaagctc 1380

acttaa 1386

<210> 14

<211> 122

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta 60

tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag 120

tt 122

<210> 15

<211> 208

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180

gggaagagaa tagcaggcat gctgggga 208

<210> 16

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atgcaaagag tgaacatgat catggccgag agccctggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgagtgccga gtgtacagtt ttcctggatc acgagaacgc caacaagatc 120

ctgaaccggc ctaagcggta caacagcgga aagctggaag agttcgtaca gggaaacctg 180

gaacgggaat gcatggaaga aaagtgcagc tttgaagagg ctagagaggt gttcgaaaac 240

accgagagaa caacagagtt ctggaagcag tatgtggacg gcgatcagtg cgagtccaac 300

ccctgcctga acggaggcag ctgtaaagac gacatcaaca gctacgagtg ctggtgccct 360

ttcggatttg agggaaaaaa ttgcgaactg gatgtgacct gcaacatcaa gaatggcaga 420

tgtgagcaat tttgcaagaa cagcgccgac aacaaggtgg tgtgcagctg caccgagggc 480

tacagactgg ccgagaacca gaagagctgc gagcccgccg tgccattccc ttgtggccgc 540

gtgagcgtgt cccagacctc taagctgaca agagctgaaa ccgtgttccc cgacgtggac 600

tacgtgaata gcaccgaagc cgagaccatc ctggacaaca tcacacagag cacccagagc 660

ttcaacgact tcaccagagt ggtgggcggc gaggacgcca agcctggcca gttcccatgg 720

caggtggtgc tgaatggcaa ggtcgatgcc ttttgcggcg gatctatcgt gaacgagaag 780

tggatcgtga ccgccgccca ctgcgtggaa accggcgtga agatcaccgt ggtcgccggc 840

gagcacaaca tcgaggaaac agaacacacc gagcagaaac ggaacgtgat ccggatcatc 900

cctcaccaca attacaacgc tgctatcaac aagtacaatc acgacattgc tctgctggaa 960

ctggatgagc ctctggtgct gaattcttac gttacaccta tctgcatcgc cgataaagag 1020

tacacaaaca tcttcctcaa gttcggcagc ggctatgtgt ctggctgggg ccgggtgttt 1080

cacaagggca ggagcgccct ggtgctgcag taccttagag tgcccctggt cgacagagcc 1140

acctgtctgc tgtctacaaa attcaccatc tacaacaaca tgttctgtgc cggcttccac 1200

gagggaggca gagactcctg tcagggcgac agcggcggcc ctcatgtgac ggaggttgag 1260

ggtaccagct tcctgacagg cattattagc tggggagagg aatgcgccat gaaaggcaag 1320

tacggcatct acaccaaggt gtccagatac gtgaactgga tcaaggaaaa gaccaagctg 1380

acctga 1386

<210> 17

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgcagcgcg tgaacatgat tatggccgag tctcccggcc tgatcaccat ctgtctgctg 60

ggctatctgc tgagcgccga gtgtacagtg ttcctggacc acgagaacgc caacaagatc 120

ctgaacagac ccaagcggta caacagcggc aagctggaag agttcgtgca gggcaacctg 180

gaacgcgagt gcatggaaga gaagtgcagc ttcgaagagg ccagagaggt gttcgagaac 240

accgagagaa ccaccgagtt ctggaagcag tacgtggacg gcgatcagtg cgagagcaac 300

ccttgtctga atggcggcag ctgcaaggac gacatcaaca gctacgagtg ctggtgcccc 360

ttcggcttcg agggcaagaa ttgcgagctg gacgtgacct gcaacatcaa gaacggcaga 420

tgcgagcagt tctgcaagaa cagcgccgac aacaaggtcg tgtgctcctg cacagagggc 480

tacagactgg ccgagaacca gaagtcttgc gagcccgctg tgccctttcc atgtggcaga 540

gtgtctgtgt cccagaccag caagctgacc agagccgaga cagtgtttcc cgacgtggac 600

tacgtgaaca gcaccgaggc cgagacaatc ctggacaaca tcacccagag cacccagtcc 660

ttcaacgact tcaccagagt cgtcggcggc gaggatgcta agcctggaca gtttccttgg 720

caagtggtgc tgaacggcaa ggtggacgct ttttgtggcg gctccatcgt gaacgagaag 780

tggatcgtga ccgccgctca ctgtgtggaa accggcgtga agattacagt ggtggccggc 840

gagcacaaca tcgaggaaac agagcacacc gagcagaaac ggaacgtgat cagaatcatc 900

cctcaccaca actacaacgc cgccatcaac aagtacaacc acgatatcgc cctgctggaa 960

ctggacgagc ccctggtcct gaactcttac gtgaccccta tctgtatcgc cgacaaagag 1020

tacaccaaca tctttctgaa gttcggcagc ggctacgtgt ccggctgggg aagagttttc 1080

cacaagggca gatcagccct ggtgctgcag tacctgagag tgcccctggt ggatagagcc 1140

acatgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgcgc cggcttccac 1200

gaaggcggca gagattcttg tcaaggcgat tctggcggcc ctcacgtgac agaagtcgag 1260

ggcacatctt ttctgaccgg catcatcagc tggggcgaag agtgtgccat gaaggggaag 1320

tacggcatct acaccaaggt gtccagatac gtgaactgga tcaaagaaaa gaccaagctc 1380

acctga 1386

<210> 18

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atgcagcgcg tgaacatgat catggccgag agccccggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgagcgccga gtgcaccgtg ttcctggacc acgagaacgc caacaagatc 120

ctgaaccgcc ccaagcgcta caacagcggc aagctggagg agttcgtgca gggcaacctg 180

gagcgcgagt gcatggagga gaagtgcagc ttcgaggagg cccgcgaggt gttcgagaac 240

accgagcgca ccaccgagtt ctggaagcag tacgtggacg gcgaccagtg cgagagcaac 300

ccctgcctga acggcggcag ctgcaaggac gacatcaaca gctacgagtg ctggtgcccc 360

ttcggcttcg agggcaagaa ctgcgagctg gacgtgacct gcaacatcaa gaacggccgc 420

tgcgagcagt tctgcaagaa cagcgccgac aacaaggtgg tgtgcagctg caccgagggc 480

taccgcctgg ccgagaacca gaagagctgc gagcccgccg tgcccttccc ctgcggccgc 540

gtgagcgtga gccagaccag caagctgacc cgcgccgaga ccgtgttccc cgacgtggac 600

tacgtgaaca gcaccgaggc cgagaccatc ctggacaaca tcacccagag cacccagagc 660

ttcaacgact tcacccgcgt ggtgggcggc gaggacgcca agcccggcca gttcccctgg 720

caggtggtgc tgaacggcaa ggtggacgcc ttctgcggcg gcagcatcgt gaacgagaag 780

tggatcgtga ccgccgccca ctgcgtggag accggcgtga agatcaccgt ggtggccggc 840

gagcacaaca tcgaggagac cgagcacacc gagcagaagc gcaacgtgat ccgcatcatc 900

ccccaccaca actacaacgc cgccatcaac aagtacaacc acgacatcgc cctgctggag 960

ctggacgagc ccctggtgct gaacagctac gtgaccccca tctgcatcgc cgacaaggag 1020

tacaccaaca tcttcctgaa gttcggcagc ggctacgtga gcggctgggg ccgcgtgttc 1080

cacaagggcc gcagcgccct ggtgctgcag tacctgcgcg tgcccctggt ggaccgcgcc 1140

acctgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgcgc cggcttccac 1200

gagggcggcc gcgacagctg ccagggcgac agcggcggcc cccacgtgac cgaggtggag 1260

ggcaccagct tcctgaccgg catcatcagc tggggcgagg agtgcgccat gaagggcaag 1320

tacggcatct acaccaaggt gagccgctac gtgaactgga tcaaggagaa gaccaagctg 1380

acctaa 1386

<210> 19

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atgcaacgcg ttaacatgat tatggcggag tccccaggcc tcattacaat ctgtctcctc 60

gggtacctgc tctccgccga atgtaccgtc tttttggacc acgagaatgc gaacaagatc 120

ctgaatagac caaagagata caactccggc aagctggaag agtttgtcca gggtaatctt 180

gaaagggaat gtatggagga gaagtgctcc ttcgaagagg ccagagaggt gttcgaaaac 240

acagagcgaa caacggaatt ctggaagcaa tatgtggacg gcgaccagtg tgagtctaac 300

ccttgtctga atggcgggtc ttgtaaggat gatatcaaca gttacgaatg ttggtgtccg 360

tttggttttg aaggcaaaaa ttgtgaactc gacgtgactt gcaacattaa aaatggacgg 420

tgtgaacaat tttgtaagaa tagtgctgac aataaagtgg tgtgctcttg cacggaaggc 480

tataggctgg ctgagaacca gaagtcctgc gagcccgctg ttcctttccc gtgcggtcga 540

gtatccgtgt ctcaaacatc caaattgacc agggctgaaa ctgtgtttcc tgacgtcgat 600

tacgtgaaca gcacagaggc agagaccatt ctggataaca tcactcaaag cacccagtcc 660

ttcaatgact ttactcgggt agttggggga gaggacgcta agcccggtca gtttccctgg 720

caggttgtcc tgaatggtaa ggtggacgcc ttttgcggag ggtccattgt gaacgagaaa 780

tggattgtta cagccgcgca ctgtgtggag actggtgtga agatcactgt cgtggcgggt 840

gaacataaca ttgaagaaac cgagcacaca gagcagaagc gaaacgtgat ccgcatcatt 900

ccacaccaca attacaacgc agcaatcaac aagtataatc atgatatagc ccttctggag 960

ctggatgaac ctctggttct taactcctac gttacgccca tttgtatagc ggacaaggag 1020

tatacaaata tattcctcaa attcgggagt gggtatgtgt ctgggtgggg acgggtattt 1080

cataaaggga gatctgccct ggtactccag tatctgcggg tgcctcttgt ggacagggca 1140

acatgcctgc tgtccactaa attcacgatc tacaataaca tgttctgcgc cggatttcac 1200

gaaggcggca gggattcttg tcagggagac tccgggggac cccacgttac tgaagttgaa 1260

ggaacatctt tcttgacagg aattattagt tggggtgaag agtgtgcaat gaagggtaag 1320

tacgggatct ataccaaagt atccagatac gtcaattgga ttaaagagaa gacgaagctg 1380

acataa 1386

<210> 20

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atgcagagag tgaacatgat catggccgag agccccggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgagcgccga gtgcaccgtg ttcctggacc acgagaacgc caacaagatc 120

ctgaacagac ccaagagata caacagcggc aagctggagg agttcgtgca gggcaacctg 180

gagagagagt gcatggagga gaagtgcagc ttcgaggagg ccagagaggt gttcgagaac 240

accgagagaa ccaccgagtt ctggaagcag tacgtggacg gcgaccagtg cgagagcaac 300

ccctgcctga acggcggcag ctgcaaggac gacatcaaca gctacgagtg ctggtgcccc 360

ttcggcttcg agggcaagaa ctgcgagctg gacgtgacct gcaacatcaa gaacggcaga 420

tgcgagcagt tctgcaagaa cagcgccgac aacaaggtgg tgtgcagctg caccgagggc 480

tacagactgg ccgagaacca gaagagctgc gagcccgccg tgcccttccc ctgcggcaga 540

gtgagcgtga gccagaccag caagctgacc agagccgaga ccgtgttccc cgacgtggac 600

tacgtgaaca gcaccgaggc cgagaccatc ctggacaaca tcacccagag cacccagagc 660

ttcaacgact tcaccagagt ggtgggcggc gaggacgcca agcccggcca gttcccctgg 720

caggtggtgc tgaacggcaa ggtggacgcc ttctgcggcg gcagcatcgt gaacgagaag 780

tggatcgtga ccgccgccca ctgcgtggag accggcgtga agatcaccgt ggtggccggc 840

gagcacaaca tcgaggagac cgagcacacc gagcagaaga gaaacgtgat cagaatcatc 900

ccccaccaca actacaacgc cgccatcaac aagtacaacc acgacatcgc cctgctggag 960

ctggacgagc ccctggtgct gaacagctac gtgaccccca tctgcatcgc cgacaaggag 1020

tacaccaaca tcttcctgaa gttcggcagc ggctacgtga gcggctgggg cagagtgttc 1080

cacaagggca gaagcgccct ggtgctgcag tacctgagag tgcccctggt ggacagagcc 1140

acctgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgcgc cggcttccac 1200

gagggcggca gagacagctg ccagggcgac agcggcggcc cccacgtgac cgaggtggag 1260

ggcaccagct tcctgaccgg catcatcagc tggggcgagg agtgcgccat gaagggcaag 1320

tacggcatct acaccaaggt gagcagatac gtgaactgga tcaaggagaa gaccaagctg 1380

acctga 1386

<210> 21

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atgcagcggg tgaacatgat catggccgag agccccggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgagcgccga gtgcaccgtg ttcctggacc acgagaacgc caacaagatc 120

ctgaaccggc ccaagcggta caacagcggc aagctggagg agttcgtgca gggcaacctg 180

gagcgggagt gcatggagga gaagtgcagc ttcgaggagg cccgggaggt gttcgagaac 240

accgagcgga ccaccgagtt ctggaagcag tacgtggacg gcgaccagtg cgagagcaac 300

ccctgcctga acggcggcag ctgcaaggac gacatcaaca gctacgagtg ctggtgcccc 360

ttcggcttcg agggcaagaa ctgcgagctg gacgtgacct gcaacatcaa gaacggccgg 420

tgcgagcagt tctgcaagaa cagcgccgac aacaaggtgg tgtgcagctg caccgagggc 480

taccggctgg ccgagaacca gaagagctgc gagcccgccg tgcccttccc ctgcggccgg 540

gtgagcgtga gccagaccag caagctgacc cgggccgaga ccgtgttccc cgacgtggac 600

tacgtgaaca gcaccgaggc cgagaccatc ctggacaaca tcacccagag cacccagagc 660

ttcaacgact tcacccgggt ggtgggcggc gaggacgcca agcccggcca gttcccctgg 720

caggtggtgc tgaacggcaa ggtggacgcc ttctgcggcg gcagcatcgt gaacgagaag 780

tggatcgtga ccgccgccca ctgcgtggag accggcgtga agatcaccgt ggtggccggc 840

gagcacaaca tcgaggagac cgagcacacc gagcagaagc ggaacgtgat ccggatcatc 900

ccccaccaca actacaacgc cgccatcaac aagtacaacc acgacatcgc cctgctggag 960

ctggacgagc ccctggtgct gaacagctac gtgaccccca tctgcatcgc cgacaaggag 1020

tacaccaaca tcttcctgaa gttcggcagc ggctacgtga gcggctgggg ccgggtgttc 1080

cacaagggcc ggagcgccct ggtgctgcag tacctgcggg tgcccctggt ggaccgggcc 1140

acctgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgcgc cggcttccac 1200

gagggcggcc gggacagctg ccagggcgac agcggcggcc cccacgtgac cgaggtggag 1260

ggcaccagct tcctgaccgg catcatcagc tggggcgagg agtgcgccat gaagggcaag 1320

tacggcatct acaccaaggt gagccggtac gtgaactgga tcaaggagaa gaccaagctg 1380

acctga 1386

<210> 22

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atgcaacgag taaatatgat catggccgag agccctggcc tgattacgat ttgcctgttg 60

gggtacttgc ttagtgctga gtgtacggtt ttcttggacc acgagaacgc gaataagatc 120

ttgaatcgac ccaaacgcta caactccggg aaacttgaag agtttgtcca aggtaacctg 180

gaacgcgaat gcatggagga gaagtgtagc ttcgaagaag cgcgagaagt cttcgaaaac 240

accgagagga caacggagtt ttggaagcag tacgtagatg gcgatcagtg cgagtccaat 300

ccttgcctca acggaggcag ttgtaaggat gatattaata gttacgagtg ctggtgtcct 360

tttggctttg aggggaagaa ttgtgagctt gatgtaacct gcaatatcaa aaacggtcgc 420

tgcgaacaat tttgcaagaa tagtgccgac aataaggtag tatgtagctg cacggaagga 480

tacagattgg ctgaaaatca gaagagttgt gaacccgccg taccctttcc ttgcggccgg 540

gtcagtgtaa gccagactag caagctcact cgagcggaaa ctgttttccc cgatgttgac 600

tatgtcaaca gcactgaggc ggaaacgatc cttgacaata tcacgcagtc cactcagagc 660

tttaacgact tcacccgcgt tgtcggaggg gaagatgcta aaccaggtca atttccttgg 720

caagtggtcc tcaatgggaa ggtcgatgct ttctgcggag ggtctatagt caatgaaaag 780

tggattgtta ccgcagccca ttgtgtcgag accggggtca agattacggt tgtagctgga 840

gagcacaata tcgaagagac agaacacacg gagcagaaaa ggaatgtgat tagaataata 900

ccccaccata attacaacgc cgccatcaat aaatataacc acgatattgc gctcttggag 960

cttgatgaac cattggtgct taattcttac gtgactccca tttgcatcgc tgacaaagag 1020

tacacaaata tatttcttaa attcggttca ggatacgttt ccggttgggg gagggtattc 1080

cataaggggc gatctgcttt ggttctgcag tatttgcggg tccccttggt agatcgcgcg 1140

acctgcctgc ttagtacgaa gtttacgata tataacaaca tgttttgcgc aggtttccat 1200

gagggcggcc gggattcatg tcagggcgac tctggtgggc cccatgtcac cgaagtggaa 1260

ggcacgagtt tcttgactgg aattataagc tggggtgaag agtgtgccat gaagggtaag 1320

tacggtattt atacaaaagt tagcagatac gtaaattgga taaaggagaa gacgaaactg 1380

acataa 1386

<210> 23

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

atgcagagag tgaacatgat catggctgag agccctggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgtctgctga gtgtacagtg ttcctggacc atgagaatgc caacaagatc 120

ctgaacagac ccaagagata caactctggc aagctggagg agtttgtgca aggcaacctg 180

gagagagagt gcatggagga gaagtgcagc tttgaggagg ctagagaggt gtttgagaac 240

acagagagaa ccacagagtt ctggaagcag tatgtggatg gggatcagtg tgagagcaac 300

ccctgcctga atgggggcag ctgcaaggat gacatcaaca gctatgagtg ctggtgcccc 360

tttggctttg agggcaagaa ctgtgagctg gatgtgacct gcaacatcaa gaatggcaga 420

tgtgagcagt tctgcaagaa ctctgctgac aacaaggtgg tgtgcagctg cacagagggc 480

tacagactgg ctgagaatca gaagagctgt gagcctgctg tgcccttccc ctgtggcaga 540

gtgtctgtgt ctcagacaag caagctgaca agagctgaga cagtgttccc tgatgtggac 600

tatgtgaaca gcacagaggc tgagaccatc ctggacaaca tcacacagag cacacagagc 660

ttcaatgact tcacaagagt ggtggggggg gaggatgcca agcctgggca gttcccctgg 720

caagtggtgc tgaatggcaa ggtggatgcc ttctgtgggg gcagcattgt gaatgagaag 780

tggattgtga cagctgccca ctgtgtggag actggggtga agatcacagt ggtggctggg 840

gagcacaaca ttgaggagac agagcacaca gagcagaaga gaaatgtgat cagaatcatc 900

ccccaccaca actacaatgc tgccatcaac aagtacaacc atgacattgc cctgctggag 960

ctggatgagc ccctggtgct gaacagctat gtgaccccca tctgcattgc tgacaaggag 1020

tacaccaaca tcttcctgaa gtttggctct ggctatgtgt ctggctgggg cagagtgttc 1080

cacaagggca gatctgccct ggtgctgcag tacctgagag tgcccctggt ggacagagcc 1140

acctgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgtgc tggcttccat 1200

gaggggggca gagacagctg ccaaggggac tctggggggc cccatgtgac agaggtggag 1260

ggcactagct tcctgactgg catcatcagc tggggggagg agtgtgccat gaagggcaag 1320

tatggcatct acaccaaggt gagcagatat gtgaactgga tcaaggagaa aaccaagctg 1380

acctga 1386

<210> 24

<211> 461

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr

1 5 10 15

Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu

20 25 30

Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn

35 40 45

Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys

50 55 60

Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn

65 70 75 80

Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln

85 90 95

Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile

100 105 110

Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys

115 120 125

Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe

130 135 140

Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe

165 170 175

Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala

180 185 190

Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu

195 200 205

Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe

210 215 220

Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp

225 230 235 240

Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile

245 250 255

Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly

260 265 270

Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu

275 280 285

His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn

290 295 300

Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu

305 310 315 320

Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile

325 330 335

Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr

340 345 350

Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val

355 360 365

Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Leu

370 375 380

Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His

385 390 395 400

Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val

405 410 415

Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly

420 425 430

Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser

435 440 445

Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

450 455 460

<210> 25

<211> 461

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr

1 5 10 15

Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu

20 25 30

Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn

35 40 45

Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys

50 55 60

Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn

65 70 75 80

Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln

85 90 95

Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile

100 105 110

Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys

115 120 125

Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe

130 135 140

Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe

165 170 175

Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala

180 185 190

Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu

195 200 205

Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe

210 215 220

Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp

225 230 235 240

Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile

245 250 255

Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly

260 265 270

Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu

275 280 285

His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn

290 295 300

Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu

305 310 315 320

Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile

325 330 335

Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr

340 345 350

Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val

355 360 365

Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Leu

370 375 380

Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His

385 390 395 400

Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val

405 410 415

Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly

420 425 430

Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser

435 440 445

Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

450 455 460

Claims

1.一种核酸构建体，其从5’到3’包含可操作地连接的如下元件：

(1)转录调控元件，其选自LP1、HLP、TTR、HLP2、enTTR、APOE-hAAT；

(2)内含子，其选自SV40内含子或FIX基因内含子；

(3)基因编码序列，其编码具有R338L突变的凝血因子IX，并且其核苷酸序列如SEQ IDNO:23所示；

(4)聚腺苷酸化序列，其选自SV40 polyA或bGHpolyA。

2.权利要求1的核酸构建体，其中所述转录调控元件为如SEQ ID NO:5所示的HLP2启动子或如SEQ ID NO:6所示的enTTR启动子。

3.权利要求1的核酸构建体，其中所述内含子选自SEQ ID NO:8所示的FIX Ti299、SEQID NO:9所示的修饰的SV40内含子(mSV40)、SEQ ID NO:10所示的FIX intronA、SEQ ID NO:11所示的FIX intronAco内含子。

4.权利要求1的核酸构建体，其中所述聚腺苷酸化序列为SEQ ID NO:14所示SV40polyA或SEQ ID NO:15所示的bGHpolyA。

5.权利要求1的核酸构建体，其中所述转录调控元件为如SEQ ID NO:6所示的enTTR启动子，所述内含子为SEQ ID NO:11所示的FIX intronAco内含子，且所述聚腺苷酸化序列为SEQ ID NO:14所示SV40 polyA。

6.一种重组腺相关病毒(rAAV)载体，其包含权利要求1-5中任一项的核酸构建体和至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)。

7.一种rAAV病毒颗粒，其包含权利要求6的rAAV载体和衣壳。

8.一种药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的核酸构建体，权利要求6所述的rAAV载体，或权利要求7所述的rAAV病毒颗粒，和药学上可接受的载体。

9.包含权利要求1-5中任一项所述的核酸构建体，权利要求6所述的rAAV载体，或权利要求7的rAAV病毒颗粒在制备用于治疗或预防受试者中B型血友病或与之相关的出血症状的药物中的用途。