KR20070043051A - 변형된 비타민 ｋ 의존적 폴리펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 향상된 안정성과 연장된 혈장 반감기를 갖는 비타민 K-의존적 폴리펩타이드, 특히 사람 인자 VII, 사람 인자 VIIa, 사람 인자 IX 및 사람 단백질 C 및 이들의 유도체를 암호화하는 변형된 cDNA 서열, 이러한 cDNA 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터, 이러한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 변형되지 않은 야생형 단백질의 생물학적 활성을 갖지만 향상된 안정성을 갖는 재조합 폴리펩타이드 및 유도체 및 이러한 재조합 단백질 및 이의 유도체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 변형된 DNA 서열을 포함하는, 사람 유전자 치료법에서 사용하기 위한 전달 벡터에 관한 것이다.
비타민 K-의존적 폴리펩타이드, 사람 인자 VII, 사람 인자 IX, 사람 단백질 C, 혈장 반감기, 안정성, 활성화 펩타이드, 변형

Description

변형된 비타민 Ｋ 의존적 폴리펩타이드{Modified vitamin K dependent polypeptides}
본 발명은 향상된 안정성과 연장된 혈장 반감기를 갖는 비타민 K-의존적 폴리펩타이드, 특히 사람 인자 VII, 사람 인자 VIIa, 사람 인자 IX 및 사람 단백질 C 및 이들의 유도체를 암호화하는 변형된 cDNA 서열, 이러한 cDNA 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터, 이러한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 변형되지 않은 야생형 단백질의 생물학적 활성을 갖지만 향상된 안정성을 갖는 재조합 폴리펩타이드 및 유도체, 및 이러한 재조합 단백질 및 이의 유도체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 변형된 DNA 서열을 포함하는, 사람 유전자 치료법에서 사용하기 위한 전달 벡터에 관한 것이다.
비타민 K-의존적 단백질은 특정 유형의 혈우병을 치료하는데 사용된다. 고전적 혈우병 또는 A형 혈우병은 유전적 출혈 질환이다. 이는 혈액 응고 인자 VIII의 X 염색체-관련 결핍에 의해 발생하며 10,000명당 1명 내지 2명의 발생율로 거의 전적으로 남성만이 걸린다. X 염색체 결함은 자신은 혈우병 환자가 아닌 여성 보 인자에 의해 전달된다. A형 혈우병의 임상적 증상은 출혈 경향의 증가이다. 인자 VIII를 이용한 치료가 도입되기 전에, 중증 혈우병 환자의 평균 수명은 20년 미만이었다. 혈장으로부터의 인자 VIII의 농축물 및 이후의 FVIII의 재조합 형태의 농축물의 사용은 혈우병 환자의 상태를 상당히 향상시켜 평균 수명을 매우 증가시키고 대다수의 혈우병 환자에게 대체로 정상적 수명으로 살 수 있는 가능성을 제공하였다. A형 혈우병보다 5배 덜 만연한 B형 혈우병은 비기능성 또는 상실된 FIX에 의해 유발되며 혈장으로부터의 FIX 농축물 및 FIX의 재조합 형태를 이용하여 치료된다. A형 혈우병 및 B형 혈우병 둘다에서, 질병을 치료하는데 있어 가장 심각한 의학적 문제는 대체 인자에 대한 동종항체(alloantibody)의 발생이다. 모든 A형 혈우병 환자중 최대 30%에서 FVIII에 대한 항체가 발생한다. FIX에 대한 항체는 이보다 덜 발생하지만, 이 항체가 면역 관용(immune tolerance) 유도 치료법에 덜 민감하기 때문에 보다 심각한 결과를 초래한다.
통상적 응고 모델에서, 응고작용의 생리학적 유발인자는 정상적으로는 맥관계 외부에 위치하는 조직 인자(TF) 발현 세포의 표면상의 TF와 인자 VIIa(FVIIa) 간의 복합체의 형성인 것으로 언급된다. 이는 FIX 및 FX의 활성화를 유도하여 궁극적으로 일부 트롬빈을 발생시킨다. 양성 피드백 루프에서, 트롬빈은 혈액 응고 연쇄증폭반응(cascade)의 소위 "내인성" 부분인 FVIII 및 FIX를 활성화시켜, 충분한 트롬빈 방출의 발생을 위해 필수적인 FXa의 발생을 증폭시켜, 완전한 지혈작용을 달성한다. 생리학적 농도 이상의 농도의 FVIIa를 투여함으로써 FVIIIa 및 FIXa의 필요성 없이 지혈작용이 달성됨이 제시되었다. FVII에 대한 cDNA의 클로닝(US 4,784,950)은 혈장 유래의 응고 인자의 재조합 대체물을 개발할 수 있게 하였다. 이러한 FVIIa는 1988년에 최초로 FVIII에 대한 억제성 항체의 높은 역가를 갖는 환자에게 성공적으로 투여되었다. 현재까지 FVIIa가 보편적 지혈제가 될 수 있다는 잠재성을 보여주는 증거의 수가 꾸준히 증가하고 있다[참조: Erhardtsen, 2002].
FVII는 간 세포에 의해 406개 아미노산의 효소원으로서 혈류로 분비되는 분자량이 50kDa의 일본쇄 당단백질이다. 이는 단백질의 Gla-도메인에 위치하는 10개의 γ-카복시-글루탐산 잔기(위치 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 35)를 함유한다. Gla 잔기는 이의 생합성을 위해 비타민 K를 필요로 한다. Gla 도메인에 대한 C-말단에는 2개의 표피 성장 인자 도메인이 위치하며 그 다음에는 트립신형 세린 프로테아제 도메인이 위치한다. 추가로, FVII의 추가적 해독후 변형은 하이드록실화(Asp 63), N-형 글리코실화(Asn145 및 Asn322) 뿐만 아니라 O-형 글리코실화(Ser52 및 Ser60)를 포함한다.
FVII는 Arg152-Ile153에서 단일 펩타이드 결합의 단백질분해에 의해 이의 활성형 FVIIa로 전환되고, 이는 1개의 디설파이드 브릿지에 의해 서로 연결되어 있는 2개의 폴리펩타이드 쇄, 즉 N-말단 경쇄(17kDa) 및 C-말단 중쇄(28 kDa)의 형성을 유도한다. 다른 비타민 K-의존적 폴리펩타이드와 달리, FVII의 경우에 활성화 동안 절단되는 활성화 펩타이드는 기술된 바 없다. 상동성 비교에 의하면 Arg152-Ile153 절단 부위는 다른 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 C-말단 활성화 절단 부위에 상응한다. 그러나, Arg144도 또한 프로테아제 절단 부위를 구성하기 때문에, 통상적 개념과 대조적으로 FVII가 Arg144와 Arg152 사이에 8개 아미노산의 활성화 펩타이드를 지니고 있다는 사실을 배제할 수는 없다.
FVIIa의 활성 입체형태를 이루는데 필수적인 것은 Ile153과 Asp343 사이의 활성화 절단 후의 염 브릿지 형성이다. FVII의 활성화는 시험관내에서 FXa, FXIIa, FIXa, FVIIa, FSAP 및 트롬빈에 의해 달성될 수 있다. 몰러루프(Mollerup) 등[참조: Biotechnol. Bioeng. (1995) 48: 501-505]은 중쇄내 Arg290 및/또는 Arg315에서 몇가지 절단이 발생함을 보고하였다.
FVII는 혈장 중에 500 ng/ml의 농도로 존재한다. 1%, 예를 들면, 5 ng/ml의 FVII가 FVIIa로서 존재한다. FVII의 혈장 반감기는 약 4시간이고 FVIIa의 혈장 반감기는 약 2시간인 것으로 확인되었다. 2시간이라는 FVIIa의 반감기가 활성화된 응고 인자에 있어 비교적 긴 시간이지만(다른 경우라면 세르핀(Serpin) 유사 안티트롬빈 III에 의한 비가역적 억제로 인해 대략 수분 정도 더 길다), 그럼에도 불구하고 이는 FVIIa의 치료학적 사용에 대한 심각한 결점이 되는데, 그 이유는 지혈작용을 달성하기 위해 수차례의 정맥내 주사 또는 연속적 주입이 요구되어 환자에게 매우 높은 치료 비용과 불편함을 초래하기 때문이다. 다른 한편으로 FVIIa는 보편적 지혈제로서 사용될 수 있다는 잠재성을 갖기 때문에, 보다 긴 작용성 반감기를 갖는 FVIIa 형태의 개발이 의학적으로 매우 요구된다.
FVII를 변형시키고자 하는 몇가지 시도가 있었다:
니콜라이센(Nicolaisen) 등[참조: WO 88/10295, 1987년 6월 25일]은 다음의 아미노산들을 결실시키거나 변형시킴으로써 FVII가 단백질분해성 분해에 대해 안정화될 수 있음을 제시한다: Lys32, Lys38, Lys143, Arg290, Arg315, Lys316, Lys341, Arg392, Arg 396, Arg 402, Ile42 및 Tyr44.
니콜라이슨(Nicolaison)[참조: US 5,580,560, 1989년 11월 13일]은 FVII/FVIIa가 단백질분해에 덜 감수성이 되도록 하는 Arg304, Phe278 및 Tyr332에서의 돌연변이 또는 결실을 또한 포함하도록 WO 88/10295를 확장시켰다.
바라드와즈(Bharadwai) 등[참조: JBC (1996), 48 pp. 30685-30691]은 FX를 활성화시키지 못하고 검출가능한 아미드분해성(amidolytic) 활성을 나타내지 않는 FVII 돌연변이체 Phe328Ser를 발현시켰다.
디킨슨(Dickinson) 등[참조: PNAS (1996) 93, 14379-14384]은 Lys157, Val158, Glu296, Met298, Asp334, Ser336 또는 Lys337이 Ala로 대체된 FVIIa 변이체를 제안하였다.
넬세스투엔(Nelsestuen)[참조: WO 99/29767, 1997년 10월 23일]은 Gla 도메인을 인지질 막에 대한 이의 친화성이 증가되도록 점 돌연변이 도입에 의해 변형시켜, 특이적 활성이 증가된 변형된 FVIIa를 수득하였다. 제안된 점 돌연변이는 Pro10, GIy11, Arg28 및 Lys32에서의 돌연변이이다.
넬세스투엔[참조: WO 00/66753, 1999년 4월 29일]은 Gla 도메인을 인지질 막에 대한 이의 친화성이 증가되도록 점 돌연변이 도입에 의해 변형시켜, 특이적 활성이 증가된 변형된 FVIIa를 수득하였다. 제안된 점 돌연변이는 5, 9, 11 , 12, 29, 33, 34, 35 및/또는 36에서의 돌연변이이다.
코른펠트(Kornfelt) 등[참조; Archiv. Biochem. and Biophys., 363, pp 43-54]은, Met298 및 Met306의 산화가, 야생형 FVIIa과 비교하여 30% 높은 TF로부터의 FVIIa-ox의 해리율 및 20% 낮은 FX 활성화를 유도함을 제시하였다.
켐볼-쿡(Kemball-Cook) 등[참조: JBC (1998), 14 pp.8516-8521]은 FVII 돌연변이체 Gln1OOArg를 발현시켰으며, 이 돌연변이체가 야생형 FVIIa과 필적하는 아미드분해 활성을 가짐으로써 검출가능한 응혈 활성을 갖지 않았음을 제시하였고 이는 손상된 TF와의 결합 때문일 수 있다고 추측하였다.
리노(lino) 등[참조: Arch. Biochem. Biophys. (1998) 352:182-192]은 O-글리코실화 부위 Ser-52 및 Ser-60의 돌연변이가 가능하게는 TF와의 상호작용을 간섭하여 FVIIa의 응혈 활성을 감소시킴을 제시하였다.
루프(Ruf) 등[참조: Biochemistry (1999) 16, pp. 1957-66]은 돌연변이 Arg36Ala가 감소된 FX 활성화 속도를 유도함을 제시하였다.
이와나가(Iwanaga) 등[참조: Thromb. Haemost. (supplement August 1999), 466 abstract 1474]은 잔기 316 내지 320가 결실되었거나 잔기 311 내지 322가 트립신의 상응하는 잔기로 대체된 FVII 변이체를 언급한다.
소에지마 켄지(Soejima Kenji) 등[참조; JP2001061479, August 24, 1999]은Cys159와 Cys164 사이의 디설파이드 그룹을 절단시키거나, Thr233 내지 Asp244의 루프 구조의 적어도 일부분을 치환, 부가 또는 결실시키거나, Arg304와 Cys329 사이의 개재 서열의 적어도 일부분을 치환, 부가 또는 결실시킴으로써 특이적 활성이 증가된 변형된 FVIIa를 생성시켰다.
페더센(Pedersen) 등[참조: US 2003/0096338, 2000년 2월 11일]은 FVIIa 반감기를 연장시키는 것을 목적으로 하여 당을 포함하는 FVII 및 FVIIa와 비-폴리펩 타이드 잔기와의 접합체를 청구한다. 특허청구범위는 생체내 당접합체를 수득하기 위한, 새로운 N-형 및/또는 O-형 글리코실화 부위의 도입 또는 기존의 N-형 및/또는 O-형 글리코실화 부위의 제거와 병용된 새로운 N-형 및/또는 O-형 글리코실화 부위의 도입을 또한 포함한다.
페르슨(Persson) 및 올젠(Qlsen)[참조: US 2003/0170863, 2000년 5월 3일]은 Leu305 또는 Phe374가 다른 아미노산으로 대체된 변형된 FVIIa를 교시하였다. 프로테아제 도메인 내의 최대 20개의 아미노산(153-406)이 상기 언급한 돌연변이와 함께 대체되었다. Leu305 및 Phe374와 함께 임의로 위치 274, 300-304 및 306-312에 다른 아미노산을 갖는 다른 변형된 FVII 분자가 개시되어 있다. 이러한 변형은 FVIIa가 정상적으로는 TF에 의해 유도되야 하는 보다 활성의 입체형태를 자발적으로 달성할 수 있다는 효과를 갖는다.
페르슨 및 올젠[참조: US 2003/0104978 및 2003/0100740, 2000년 9월 29일]은 위치 Lys157, Lys337, Asp334, Ser336, Val158, Glu296 및 Met298에 Ala 치환 이외의 점 돌연변이를 갖는 다른 변형된 FVIIa 분자를 또한 교시하였다.
핀겔(Pingel) 및 클라우센(Klausen)[참조: US 2002/0151471 및 US 2002/0137673, 2000년 10월 2일]은 특정한 비율의 상이한 N-형 글리코실화를 포함하는 다수의 FVII 또는 관련 폴리펩타이드를 청구한다.
루프(Ruf) 등[참조: WO 02/38162, 2000년 11월 9일]은 TF 부재하의 보다 큰 아미드분해성 활성 및 보다 큰 TF에 대한 친화성을 유도하는 변형 Met298Gln, Glu296Ile 및 Val158Asn 또는 이들의 조합을 갖는 FVII/FVIIa 변이체를 청구하였 다. 상기 인자는 추가로 변형되었으며, Lys32, Lys38, Arg290, Arg304, Arg315 및 Lys341의 트립신-유사 절단 부위 및 Ile42, Tyr44, Phe278 및 Tyr332의 키모트립신-유사 부위를 변형시키는 경우 이의 안정성이 증가되었다.
페르슨[참조: WO 02/077218, March 22, 2001]은 FVII/FVIIa의 반감기를 증가시키는 것을 목적으로 하여, 아미노산 247-260, 393-405 및 Pro406, 보다 구체적으로 R396, Q250 및 Pro406, 바람직하게는 화학 그룹이 부착될 수 있는 아미노산이 돌연변이된 FVII/FVIIa 돌연변이체를 교시한다. 이는 FVII/FVIIa의 활성을 증가시키는 K157, V158, E296, M298, L305, D334, S336, K337 및 F374에서의 돌연변이와 조합될 수 있다.
페르슨 및 올젠[참조: US 2003/0100075, 2001년 9월 21일]은 Leu305가 FVIIa의 TF 복합체화된 형태에서 발견되는 α-나선의 말단에 위치하며, 이것이 활성에 중요한 것으로 사료됨을 교시한다. 유리 FVIIa에서, 상기 나선은 뒤틀려지고 따라서 불안정해질 수 있다. 상기 발명에 따르면, Leu305를 다른 아미노산으로 대체시키는 것은 다른 상황에서는 TF에 의해 유도되는 활성 입체형태를 달성하는 변이체를 유도한다. 아미노산 Lys157, Lys337, Asp334, Ser336, Val158, Glu296 및 Met298은 Ile153과 Asp343 사이의 염 브릿지 형성에 영향을 주는 영역에 위치한다. 상기 발명에 따르면, 이들 아미노산을 대체시키는 것은 프로테아제의 N-말단의 삽입, 예를 들면, 활성에 필수적인 염 브릿지의 생성을 촉진한다.
페르슨 및 올젠[참조: US 2003/0130191, 2001년 11월 2일]은 위치 313-329, 364, 366, 373 및 376 뿐만 아니라 위치 330-339가 다른 아미노산으로 치환된, 특 이적 활성이 증가된 변형된 FVII/VIIa 돌연변이체를 추가로 교시한다.
하닝(Haaning) 등[참조: WO 03/093465, 2002년 4월 30일]은 넬세스투엔의 교시(인지질 결합을 증진시키는 Gla 도메인의 변형)를, 추가의 N-글리코실화 부위의 도입과 병용된 Pro10, 바람직하게는 Gln, Lys32, 바람직하게는 Glu, Asp33, 바람직하게는 소수성 아미노산, 바람직하게는 Phe, Ala34, 바람직하게는 음으로 하전된 아미노산, 바람직하게는 Glu에서의 치환 및 Ala3 이후의 아미노산, 바람직하게는 Tyr의 삽입으로 확장시켰다.
폰큐베르타(Foncuberta) 등[참조: WO 2004/011675, 2002년 7월 25일]은 이론적으로 FVIIa의 보다 높은 발현 수준 및 향상된 기능을 유도할 수 있는 FVII의 천연발생 대립형질 변이체를 기술한다. 이러한 향상된 특성에 관한 데이타는 제시되어 있지 않다. 49개 중 2개의 변이체가 엑손에서 발견되었으며 아미노산 A294V 및 R353Q의 치환을 유도한다.
페르슨 및 올젠[참조: WO 2004/029090, 2002년 9월 25일]은 일부 다른 아미노산과 함께 Phe374를 돌연변이시키는 것이 FVIIa의 TF 독립적 활성의 증가를 유도함을 제시하였다. 즉, L305V, S314E, K337A 및 F374Y는 TF 아미드분해성 활성의 증가를 유도하였다.
하닝 등[참조: WO 2004/029091, 2002년 9월 30일]은 FVII/FVIIa의 TF 결합 부위내 L39, I42, S43, K62, L65, F71, E82 및 F275에서 FVII를 변형시켜 TF에 대한 친화성을 증가시켰다.
앤더슨(Andersen) 등[참조: WO 2004/083361, 2003년 5월 20일]은 위치 196(D196N/K), 237 (G237L 또는 삽입 GAA GAAA 또는 GAAAA) 및 341(K341 N/Q)에서 FVII/FVIIa를 변형시켜 TF에 대한 친화성을 증가시켰다.
블라즈크만(Blajchman) 등[참조: WO 2004/108763, 2003년 6월 5일]은, 토끼 인자 VIIa가 사람 인자 VIIa보다 사람 TF에 대한 친화성이 더 높기 때문에, 사람 및 토끼 EGF 도메메인 간의 차이의 분석에 기초하여 EGF 도메인 내에서 FVII/FVIIa를 변형시켰다. 위치 53, 62, 74, 75 및 83에서의 돌연변이가 청구되었으며 이것은 사람 TF에 대한 보다 높은 친화성 및 증가된 지혈 잠재력을 갖는 것으로 제시되어 있다.
하닝(Haaning) 등[참조: WO 2004/111242, 2003년 6월 19일]은 위치 4, 10, 28, 32, 33, 34, 36, 74, 77, 116, 바람직하게는 A3Y, P10Q, R28F, K32E, D33F, A34L, R36E, K38E, P74S, E77A, E116D에서 FVII/FVIIa를 변형시켰다. R36E 돌연변이는 TF에 대한 결합을 감소시켰고, TF-의존적 검정에서는 트롬빈 발생을 감소시킨 반면 PL-의존적 검정에서는 동일한 활성을 유지하였다.
요한센(Johansen) 등[참조: WO 2005/032581, 2003년 10월 7일]은 증량제(bulking agent), 바람직하게는 PEG에 임의로 커플링된 인자 VII 활성 도메인에 커플링된 지질 막 결합 도메인으로 이루어진 하이브리드 분자를 교시한다.
마운(Maun) 등[참조: Protein Sci. (2005) 14:1171-80]은 FVII 입체형태를 활성 TF*FVIIa-유사 상태로 고정시키는 새로운 디설파이드 결합을 도입하였다. 아미드분해성 활성의 반응속도론 분석에 의해, 모든 인자 VIIa 변이체가 단독으로 야생형과 비교해 증가된 특이적 활성을 가졌으며, 이러한 활성은 기질 S-2765를 이용 한 경우 변이체 136:160 및 138:160가 가장 컸으며 각각 670배 및 330배 증가되었다. 인자 VIIa 디설파이드-고정된 변이체는 아미드분해성 검정에서 최대 활성화를 위해 보조인자로서 TF를 더이상 필요로 하지 않았다. 가용성 TF의 존재하에, 변이체 136:160 및 138:160의 경우, 활성은 야생형과 비교하여 각각 20배 및 12배 증가되었다.
본 발명의 목적은 보다 긴 기능적 반감기를 갖는 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드, 예를 들면, 변형된 FVII 및 변형된 FVIIa를 제공하는 것이다.
FVII는 FIX, FX, 단백질 C, 단백질 Z, 프로트롬빈, GAS6 및 단백질 S와 같은 다른 Gla 도메인 단백질과 관련된다. N-말단 도메인 다음에 2개의 표피 성장 인자(EGF) 도메인이 있고 이어서 트립신형 세린 프로테아제 도메인이 있는 FVII, FIX, FX 및 단백질 C와 보다 밀접하게 관련된다. 단백질 Z는 유사한 구조를 갖지만 불활성 프로테아제 도메인을 갖는다. 프로트롬빈에서는, Gla 도메인 다음에, 2개의 EGF 도메인 대신에 2개의 크링글(kringle) 도메인이 위치하고 이어서 트립신형 프로테아제 도메인이 위치한다. GAS6 및 단백질 S에서는, Gla 도메인 다음에 4개의 EGF 도메인이 있고 이어서 프로테아제 도메인 대신에 2개의 라미닌-G 도메인이 있다.
주목할만한 것은 밀접하게 관련된 이들 혈장 단백질들의 혈장 반감기에서의 큰 차이이다:
FVII 2 내지 4시간
단백질 C: 6-8시간
FIX: 18-30시간
FX: 20-42시간
단백질 S: 24-58시간
프로트롬빈: 41-72시간
이들 단백질의 밀접하게 관련된 특정 아그룹은 FVII, FIX, FX 및 단백질 C를 포함한다.
도 1에서, 사람 기원 및 다른 종 기원의 FVII, 단백질 C, FIX 및 FX 간의 상동성이 비교되어 있다. 분자는 고도로 보존되어 있으며, 활성화 도메인 간에 가장 큰 차이가 있다. FVII의 경우, 활성화 펩타이드는 기술된 바 없다. 그러나, 활성화 동안 FVII는 Arg152에서의 절단 이외에 Arg144에서도 절단되어, 보존된 N-글리코실화 부위를 함유하는 8개 아미노산의 추정상의 활성화 펩타이드를 방출할 수 있다.
놀랍게도, 상기 활성화 펩타이드의 길이 및 상기 활성화 펩타이드의 해독후 변형은 증가된 반감기와 상관관계가 있다.
혈장 반감기 사람 활성화 펩타이드의 길이 활성화 펩타이드내 N-글리코실화 부위
FVII 2 내지 4시간 활성화 펩타이드(또는 추정상의 8개 아미노산 활성화 펩타이드) 없음 추정상의 8개 아미노산 활성화 펩타이드내의 1개
단백질 C 6 내지 8시간 16개 아미노산 0개
FIX 18 내지 30시간 34개 아미노산 2개
FX 20 내지 42시간 51개 아미노산 2개
따라서, 본 발명은 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드를 변형시켜, 당해 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드가 활성화 펩타이드가 변형되지 않은 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드와 비교해 증가된 반감기를 갖도록 함을 포함하는, 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성 펩타이드의 적어도 일부분을 부가함으로써 또는 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 적어도 일부분을 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 적어도 일부분으로 대체시킴으로써 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드를 변형시킴을 포함하는, 이러한 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.
비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 이의 단백질 전구체의 글루탐산 잔기의 측쇄를 카복실화시키는 생합성 경로에서 비타민 K를 필요로 하는 단백질 그룹이다. 비타민 K-의존적 폴리펩타이드로는 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 X, 인자 Xa, 인자 II(프로트롬빈), 단백질 C, 활성화된 단백질 C, 단백질 S, 활성화된 단백질 S, GAS6, 활성화된 GAS6, 단백질 Z, 활성화된 단백질 Z 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 게다가, 유용한 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 야생형일 수 있거나 돌연변이를 함유할 수 있다. 글리코실화 또는 다른 해독후 변형의 정도 및 위치는 선택된 숙주 세포 및 숙주 세포 환경의 성질에 따라 달라질 수 있다. 특이적 아미노산 서열을 언급하는 경우, 이러한 서열의 해독후 변형은 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 "인자 VII/VIIa"는 비활성화 형태(인자 VII) 또는 활성화 형태(인자 VIIa) 또는 이들의 혼합물로 이루어진 생성물을 의미한다. 상기 정의 내에서 "인자 VII/VIIa"는 천연의 사람 인자 VII/VIIa의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 이는 또한, 당해 단백질이 인자 VIIa의 활성을 실질적으로 유지하는 한, 다소 변형된 아미노산 서열, 예를 들면, N-말단 아미노산 결실 또는 부가를 포함하는 변형된 N-말단을 갖는 단백질을 포함한다. 상기 정의내에서 "인자 VII"는 개체마다 존재하거나 발생할 수 있는 천연 대립형질 변이를 포함한다. 상기 정의 내에서 "인자 VII"는 FVII/FVIIa의 변이체를 추가로 포함한다. 이러한 변이체들은 야생형 서열과 1개 이상의 아미노산 잔기가 상이하다. 이러한 차이의 예로는 하나 이상의 아미노산 잔기(예를 들면, 1 내지 10개의 아미노산 잔기)만큼의 N-말단 및/또는 C-말단의 절두 또는 N-말단에의 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 예를 들면, N-말단에의 메티오닌 잔기의 부가 뿐만 아니라, 보존적 아미노산 치환, 즉 유사한 특성을 갖는 아미노산 그룹, 예를 들면, (1) 소형 아미노산, (2) 산성 아미노산, (3) 극성 아미노산, (4) 염기성 아미노산, (5) 소수성 아미노산 및 (6) 방향족 아미노산 내에서 수행된 치환이 포함될 수 있다. 이러한 보존적 치환의 예는 하기 표 2에 제시되어 있다.
(1) 알라닌 글리신
(2) 아스파르트산 글루탐산
(3) 아스파라긴 글루탐산 세린 트레오닌
(4) 아르기닌 히스티딘 라이신
(5) 이소류신 류신 메티오닌 발린
(6) 페닐알라닌 티로신 트립토판
각종 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 cDNA 서열은 서열목록에 제시되어 있다.
비타민 K-의존적 폴리펩타이드 cDNA 서열의 서열번호 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열의 서열번호 성숙한 폴리펩타이드의 서열번호
사람 인자 VII 1 2 3
사람 단백질 C 4 5 6
사람 인자 IX 7 8 9
사람 인자 X 10 11 12
사람 프로트롬빈 13 14 15
제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 바람직하게는 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 IX, 인자 IXa, 단백질 C 및 활성화된 단백질 C로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 사람 인자 VII, 사람 인자 VIIa, 사람 인자 IX, 사람 인자 IXa, 사람 단백질 C 및 사람 활성화된 단백질 C로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 사람 인자 VII 또는 사람 인자 VIIa이다. 구체적 양태에서, 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 서열번호 3, 6 및 9로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드와 상이하다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드에서 천연적으로 발생하지 않는 활성화 펩타이드의 적어도 일부분을 포함한다.
제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드보다 긴 혈장 반감기를 갖는다. 다른 양태에서, 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 길이는 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 길이보다 길다.
바람직하게는, 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 인자 IX, 인자 X 및 프로트롬빈으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 사람 인자 IX, 사람 인자 X 및 사람 프로트롬빈으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 구체적 양태에서, 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 서열번호 9, 12 및 15로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
부가되는 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 일부분은 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 아미노산 서열내의 바람직하게는 8개 이상, 보다 바람직하게는 12개 이상, 보다 더욱 바람직하게는 15개 이상의 연속적 아미노산으로 이루어진다.
다른 양태에서, 부가되는 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 일부분은 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 아미노산 서열내의 0.15·N개 이상의 연속적 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 여기서, N은 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 아미노산의 총 수이다. 바람직하게는, 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 일부분은 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 아미노산 서열내의 0.5·N개 이상, 보다 바람직하게는 0.75·N개 이상, 보다 바람직하게는 0.9·N개 이상, 가장 바람직하게는 0.95·N개 이상의 연속적 아미노산으로 이루어진다.
또 다른 양태에서, 부가되는 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 일부분은 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 아미노산 서열내의 (N-x)개 이상의 연속적 아미노산으로 이루어지고, 여기서, N은 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 아미노산의 총 수이고, x는 7일 수 있고, 바람직하게는 x는 5이고, 보다 바람직하게는 x는 4이고, 보다 바람직하게는 x는 3이고, 보다 더욱 바람직하게는 x는 2이다.
또한, 부가되는 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 일부분은 활성화 펩타이드의 중심 부분으로 이루어질 수 있으며, 즉, 활성화 펩타이드의 가장 C-말단의 아미노산 및 가장 N-말단의 아미노산을 포함할 수 있다.
가장 바람직하게는, 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화의 특이성이 유지되면서 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 완전한 활성화 펩타이드가 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 부가된다. 대안으로, 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 완전한 활성 펩타이드의 변이체가 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 부가될 수 있다. 변이체는, 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 7개, 보다 바람직하게는 1 내지 5개, 가장 바람직하게는 1 내지 3개 아미노산이 부가, 결실 및/또는 치환된 활성화 펩타이드를 포함한다.
오직 효소원의 반감기만이 연장되어야 하는 경우, 바람직하게는 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단 활성화 절단 부위가 변이체 활성화 펩타이드에서 유지된다. 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 형태의 반감기가 또한 연장되어야 하는 경우, 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 N- 또는 C-말단 활성화 절단 부위 중 어느 하나가 결실된다. 바람직하게는, N-말단 활성화 절단 부위가 결실된다. FVIIa의 반감기가 연장되어야 하는 경우, 바람직하게는 N-말단 활성화 절단 부위는 결실되어야 하는 반면, 바람직하게는 C-말단 활성화 절단 부위는 유지되어야 한다.
하기 표에는 몇가지 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 서열이 요약되어 있다.
비타민 K-의존적 폴리펩타이드 활성화 펩타이드의 아미노산 서열 활성화 펩타이드의 서열번호
사람 인자 VII NASKPQGR (추정상) (서열번호 3의 aa 145-152) 16
사람 단백질 C SHLKRDTEDQEDQVDPR (서열번호 6의 aa 153-169) 17
사람 인자 IX AETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTR (서열번호 9의 aa 146-180) 18
사람 인자 X SVAQATSSSGEAPDSITWKPYDAADLDPTE NPFDLLDFNQTQPERGDNNLTR (서열번호 12의 aa 143-194) 19
사람 프로트롬빈 TATSEYQTFFNPRTFGSGEADCGLRPLFEKKSLE DKTERELLESYIDGR (서열번호 15의 aa 272-320) 20
본원에서 사용되는 "활성화 펩타이드"란 용어는 공지된 활성화 펩타이드 및 추정상의 활성화 펩타이드, 예를 들면, 인자 VII의 추정상의 활성화 펩타이드를 포함한다.
비제한적 예로서, 다음 아미노산 서열 중 어느 하나를 서열번호 3 또는 6의 아미노산 서열에 부가할 수 있다.
서열번호 18의 aa 1 내지 35 ;
서열번호 18의 aa 1 내지 34;
서열번호 18의 aa 1 내지 33;
[....]
서열번호 18의 aa 1 내지 8;
서열번호 18의 aa 1 내지 7;
서열번호 18의 aa 1 내지 6;
서열번호 18의 aa 1 내지 5;
서열번호 18의 aa 2 내지 35;
서열번호 18의 aa 2 내지 34;
서열번호 18의 aa 2 내지 33;
[....]
서열번호 18의 aa 2 내지 9;
서열번호 18의 aa 2 내지 8;
서열번호 18의aa 2 내지 7;
서열번호 18의 aa 2 내지 6;
서열번호 18의 aa 3 내지 35;
서열번호 18의 aa 3 내지 34;
서열번호 18의 aa 3 내지 33;
[....]
서열번호 18의 aa 3 내지 10;
서열번호 18의 aa 3 내지 9;
서열번호 18의 aa 3 내지 8;
서열번호 18의 aa 3 내지 7 등.
비제한적 예로서, 다음 아미노산 서열 중 어느 하나를 서열번호 3, 6 또는 9의 아미노산 서열에 부가할 수 있다.
서열번호 19의 aa 1 내지 52;
서열번호 19의 aa 1 내지 51;
서열번호 19의 aa 1 내지 50;
[....]
서열번호 19의 aa 1 내지 8;
서열번호 19의 aa 1 내지 7;
서열번호 19의 aa 1 내지 6 ;
서열번호 19의 aa 1 내지 5 ;
서열번호 19의 aa 2 내지 52 ;
서열번호 19의 aa 2 내지 51 ;
서열번호 19의 aa 2 내지 50 ;
[....]
서열번호 19의 aa 2 내지 9 ;
서열번호 19의 aa 2 내지 8 ;
서열번호 19의 aa 2 내지 7 ;
서열번호 19의 aa 2 내지 6 ;
서열번호 19의 aa 3 내지 52 ;
서열번호 19의 aa 3 내지 51 ;
서열번호 19의 aa 3 내지 50 ;
[....]
서열번호 19의 aa 3 내지 10 ;
서열번호 19의 aa 3 내지 9 ;
서열번호 19의 aa 3 내지 8 ;
서열번호 19의 aa 3 내지 7 등.
제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 완전한 활성화 펩타이드의 일부분은 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드 영역의 부근에 삽입된다. 이는 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 아미노산을 결실시킴 없이 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 두 아미노산 사이에 삽입될 수 있다. 예를 들면, FVII가 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드인 경우, 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 완전한 활성화 펩타이드의 일부분은 아미노산 144번과 145번 사이, 아미노산 145번과 146번 사이, 아미노산 146번과 147번 사이, 아미노산 147번과 148번 사이, 아미노산 148번과 149번 사이, 아미노산 149번과 150번 사이, 아미노산 150번과 151번 사이, 아미노산 151번과 152번 사이 또는 아미노산 152번과 153번 사이에 삽입될 수 있으며, 여기서, 번호매김은 서열번호 3에 관한 것이다. 바람직하게는, 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 완전한 활성화 펩타이드의 일부분은 아미노산 144번과 145번 사이에 삽입되며, 여기서, 번호매김은 서열번호 3에 관한 것이다. 바람직하게는, 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 C-말단 절단 부위 및 활성화의 특이성은 삽입에 의해 보존된다. N-말단 절단 부위는 삽입에 의해 결실될 수 있다.
다른 측면에서, 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 완전한 활성화 펩타이드의 일부분은 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드내 아미노산의 신장부(streach)를 대체한다. 예를 들면, FVII가 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드인 경우, 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 일부분 또는 완전한 활성화 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 140번 내지 152번을 대체할 수 있다. 바람직하게는, 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 C-말단 절단 부위 및 활성화의 특이성은 대체에 의해 보존된다. N-말단 절단 부위는 대체에 의해 결실될 수 있다.
N-말단 절단 부위는 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 특정 아미노산을 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 완전한 활성화 펩타이드 또는 이의 일부분으로 대체시킴으로써 결실될 수 있다. 따라서, 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 완전한 활성화 펩타이드 또는 이의 일부분은 서열번호 3의 다음 아미노산 서열 중 어느 하나를 대체할 수 있다.
aa 140번 내지 145번;
aa 141번 내지 145번;
aa 142번 내지 145번;
aa 143번 내지 145번;
aa 144번 내지 145번;
aa 145번;
aa 140번 내지 144번;
aa 141번 내지 144번;
aa 142번 내지 144번;
aa 143번 내지 144번;
또는 aa 144번.
또 다른 양태에서, 활성화 펩타이드 영역에 대한 N-말단 및 C-말단에 있는 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드내의 단백질분해성 절단 부위는 변형 동안 유지된다. 따라서, 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화의 특이성이 유지된다.
또 다른 양태에서, 효소원의 혈장 반감기가 연장되어야 하는 경우, 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단 활성화 절단 부위가 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단 활성화 절단 부위를 대체하거나, 또는 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드로부터의 N-말단 활성화 절단 부위가 유지될 수 있고 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드로부터의 C-말단 활성화 절단 부위가 유지될 수 있거나 그 반대가 될 수 있다. 활성화된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 혈장 반감기가 안정화되어야 하는 경우, N-말단 또는 C-말단 활성화 절단 부위 중 어느 하나가 결실된다. 안정화된 FVIIa 변이체의 경우, 활성화 펩타이드가 N-말단 경쇄와 함께 유지되어야 한다. 이는 C-말단 활성화 절단 부위는 유지되어야 하는 반면, 비타민 K-의존적 폴리펩타이드로부터 전달된 N-말단 활성화 절단 부위는 결실되어야 함을 내포한다. 또한, Arg144에서 가정상의 활성화 펩타이드 절단 부위를 결실시키는 것이 필수적일 수 있다.
변형은 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드 또는 이의 변이체의 삽입에 추가하여, 바람직하게는 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화의 특이성을 유지시키면서 부수적으로 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 적어도 일부분을 결실시킴을 또한 포함할 수 있다. 결실될 부분은 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 2개 이상, 바람직하게는 4개 이상, 보다 바람직하게는 6개 이상, 보다 더욱 바람직하게는 8개 이상의 연속적 아미노산으로 이루어질 수 있다.
또 다른 양태에서, 결실되는 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드는 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 아미노산 서열내의 0.15·N개 이상의 연속적 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 여기서, N은 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 아미노산의 총 수이다. 바람직하게는, 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 일부분은 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 아미노산 서열내의 0.5·N개 이상, 보다 바람직하게는 0.75·N개 이상, 보다 바람직하게는 0.9·N개 이상, 가장 바람직하게는 0.95·N개 이상의 연속적 아미노산으로 이루어진다.
또 다른 양태에서, 결실되는 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 일부분은 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 아미노산 서열내의 (N-x)개 이상의 연속적 아미노산으로 이루어지고, 여기서, N은 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 아미노산의 총 수이고, x는 7일 수 있고, 바람직하게는 x는 5이고, 보다 바람직하게는 x는 4이고, 보다 바람직하게는 x는 3이고, 보다 더욱 바람직하게는 x는 2이다.
또한, 결실되는 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 일부분은 활성화 펩타이드의 중심 부분으로 이루어질 수 있으며, 즉, 활성화 펩타이드의 가장 C-말단의 아미노산 및 가장 N-말단의 아미노산을 포함하지 않는다.
구체적 양태에서, 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 완전한 활성화 펩타이드가 결실된다.
일반적으로, 변형은 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 적어도 일부분을 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 적어도 일부분으로 대체시킴을 포함한다. 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 일부분 및 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 바람직한 양태는 상기한 양태들에 상응한다.
특정한 양태에서, 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 완전한 활성화 펩타이드는, 당해 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화의 특이성을 유지하는데 필수적인 아미노산이 유지되면서 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 완전한 활성화 펩타이드 또는 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 완전한 활성화 펩타이드의 변이체로 대체된다.
비제한적 예로서, 본 발명은 동물 비타민 K-의존적 폴리펩타이드(일부는 도 1에 도시되어 있다), 예를 들면, 쥐, 개, 소, 돼지 또는 설치류 프로트롬빈 인자 뿐만 아니라 이들의 배합물로부터의 활성화 펩타이드 서열을 도입시킴을 포함한다.
비제한적 예로서, 본 발명은 FIX 또는 FX의 활성화 펩타이드의 FVII의 활성화 부위의 부근으로의 도입 뿐만 아니라, 단백질 C의 활성화 펩타이드의 FIX 또는 FX의 활성화 펩타이드로의 치환 및 FIX의 활성화 펩타이드의 FX의 활성화 펩타이드로의 치환을 포함한다. 이러한 본 발명의 측면의 범주를 바람직한 FVII 분자를 예로 들어 설명하면, FVII의 반감기는, 단순히 8개 아미노산의 추정상의 활성화 펩타이드를 단백질 C, FIX 또는 FX로부터 취해진 활성화 펩타이드 중 하나로 완전히 치환시킴으로써 또는 단백질 C, FIX 또는 FX로부터 취해진 활성화 펩타이드 중 하나를 하나의 아미노 말단 인접 아미노산 내지 완전한 추정상의 FVII 활성화 펩타이드에 부가하여 하이브리드 활성화 펩타이드를 생성시킴으로써 증가시킨다.
본 발명의 다른 측면은 이들 전달된 활성화 펩타이드의 해독후 변형의 변경이며, 비제한적 예로서 전달된 활성화 펩타이드내 N-글리코실화 부위의 제거 또는 FVII의 추정상의 활성화 펩타이드내 Arg144와 Arg152 사이의 N-글리코실화 부위의 제거는 응고 인자의 보다 적은 아시알로단백질-수용체 매개된 제거를 유도할 수 있다. 바람직하게는, 변형은 활성화 펩타이드 내의 하나 이상의 N-글리코실화 부위의 제거를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 수명이 긴 비타민 K-의존적 단백질의 활성화 펩타이드의 유사체의 전달에 의한 혈장 반감기의 연장이다. 광의적 의미의 유사체는, 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 효소원의 반감기가 연장되어야 하는 경우에는 이의 N-말단 및 C-말단 활성화 절단 부위를 보존하면서 또는 활성화된 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 반감기도 또한 연장되어야 하는 경우에는 이의 N-말단 또는 C-말단 활성화 절단 부위를 보존하면서 수명이 긴 야생형 비타민 K-의존적 단백질의 활성화 펩타이드의 8개 초과의 연속적 아미노산 또는 이들 아미노산의 보존적 치환을 갖는 삽입체이다.
보존적 아미노산 치환은 유사한 특성을 갖는 아미노산 그룹, 예를 들면, (1) 소형 아미노산, (2) 산성 아미노산, (3) 극성 아미노산, (4) 염기성 아미노산, (5) 소수성 아미노산 및 (6) 방향족 아미노산 내에서 수행된 치환이다. 이러한 보존적 치환의 예는 표 2에 제시되어 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드를 변형시킴을 포함하는, 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 안정성을 증가시키는 방법이다. 본 발명의 또 다른 측면은 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드를 변형시킴을 포함하는, 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 기능적 반감기 또는 혈장 반감기를 증가시키는 방법이다. 이들 방법은 상기한 변형된 K-의존적 폴리펩타이드의 생산 방법과 동일한 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 방법으로 수득할 수 있는 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드에 관한 것이다. 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 변형된 활성화 펩타이드를 포함할 수 있어, 당해 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 활성화 펩타이드가 변형되지 않은 비타민 K-의존적 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 반감기를 갖는다.
본 발명의 또 다른 측면은 상이한 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 적어도 일부분을 포함하는 변형된 활성화 펩타이드를 포함하는 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드이다. 대안으로, 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 상이한 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 유사체 또는 변이체를 포함할 수 있다. 유사체 및 변이체는 상기 정의된 바와 같은 분자이다.
바람직하게는, 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 상기 정의된 바와 같은 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드이다. "상이한 비타민 K-의존적 폴리펩타이드"는 상기 정의된 바와 같은 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드이다. 본 발명의 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 바람직한 양태는 본 발명의 방법과 관련하여 상기 기술한 바람직한 양태에 상응한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 비변형된 형태 및/또는 야생형과 비교하여 증가된 기능적 반감기를 나타낸다. 기능적 반감기는 문헌[참조: Lindley et al. (Pharmacokinetics and pharmacodynamics of recombinant Factor VIIa, Clin. Pharmacol Ther. 1994 55:638-648)]에 제시된 바와 같이 시험관내에서 측정될 수 있다.
기능적 반감기는 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 비변형된 형태 및/또는 야생형과 비교하여 일반적으로 50% 이상, 바람직하게는 100% 이상, 보다 바람직하게는 200% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 500% 이상 증가된다.
사람 인자 VII의 야생형의 기능적 반감기는 약 4시간이다. 본 발명의 변형된 인자 VII 분자의 기능적 반감기는 통상적으로 약 6시간 이상, 바람직하게는 약 10시간 이상, 보다 바람직하게는 약 15시간 이상, 가장 바람직하게는 약 24시간 이상이다.
사람 인자 VIIa의 야생형의 기능적 반감기는 약 2시간이다. 본 발명의 변형된 인자 VIIa 분자의 기능적 반감기는 통상적으로 약 3시간 이상, 바람직하게는 약 5시간 이상, 보다 바람직하게는 약 8시간 이상, 가장 바람직하게는 약 12시간 이상이다.
일반적으로, 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 비변형된 형태 및/또는 야생형과 비교하여 증가된 안정성을 갖는다. 변형된 인자 VII 분자의 안정성의 증가는 예를 들면, 기능적 검정에 의해 이미 기술한 바와 같이 측정할 수 있다.
본 발명의 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 통상적으로, 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 상응하는 야생형 및/또는 비변형된 형태와 실질적으로 동일한 활성을 갖는다. "실질적으로 동일한" 활성은 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 상응하는 야생형 및/또는 비변형된 형태의 활성의 약 10% 이상, 바람직하게는 약 50% 이상, 보다 바람직하게는 약 75% 이상, 가장 바람직하게는 약 100% 이상을 의미한다. 인자 VII/VIIa의 활성은 기질 인자 X를 활성 인자 Xa로 전환시키는 능력이다. 인자 VII/VIIa 폴리펩타이드의 활성은 문헌[참조: Shaw et al., 1998, PNAS, Vol. 95, pp. 4229-4234] 또는 문헌[참조: Gabriel et al. 2004, Sem. Hematol. VoI 41 , Suppl. 1 pp20-24]에 기술된 검정으로 측정할 수 있다.
본 발명은 추가로 본 명세서에서 기술한 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. "폴리펩타이드(들)"이란 용어는 일반적으로 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 일본쇄 또는 이본쇄 DNA, 일본쇄 또는 이본쇄 RNA일 수 있다. 본원에서 사용되는 "폴리뉴클레오타이드(들)"이란 용어는 하나 이상의 변형된 염기 및/또는 비통상적 염기, 예를 들면, 이노신을 또한 포함한다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된 많은 유용한 목적을 충족시킬 수 있는 각종 변형이 DNA 및 RNA에 가해질 수 있음이 인식될 것이다. "폴리뉴클레오타이드(들)"이란 용어는 본원에서 사용되는 경우 이러한 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태의 폴리뉴클레오타이드 뿐만 아니라 예를 들면, 단순세포 및 복합세포를 포함하는 세포 및 바이러스의 특징적인 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 포함한다.
당해 분야의 숙련가는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 소정의 폴리펩타이드가 상이한 폴리뉴클레오타이드들에 의해 암호화될 수 있음을 이해할 것이다. 이들 "변이체"는 본 발명에 의해 포함된다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 분리된 폴리뉴클레오타이드이다. "분리된" 폴리뉴클레오타이드란 용어는 다른 염색체성 및 염색체외 DNA 및 RNA를 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 핵산 서열로부터 실질적으로 유리되어 있는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 분리된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된 통상의 핵산 정제 방법을 사용하여 분리된 폴리뉴클레오타이드를 수득할 수 있다. 당해 용어는 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드를 또한 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 또는 벡터이다. 바람직하게는, 플라스미드 또는 벡터는 발현 벡터이다. 특정한 양태에서, 벡터는 사람 유전자 치료법에서 사용하기 위한 전달 벡터이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.
본 발명의 숙주 세포는
(a) 본 발명의 숙주 세포를 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드가 발현되도록 하는 조건하에 배양하는 단계; 및
(b) 임의로, 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 일부분인 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 생산방법에서 사용될 수 있다.
제안된 변이체의 발현
적합한 숙주 세포에서 고수준의 재조합 단백질의 생산은, 상기 언급한 변형된 cDNA를 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 따라서 다양한 발현 시스템에서 증식될 수 있는 재조합 발현 벡터내의 적합한 조절 요소와 함께 효율적 전사 단위로 어셈블리함을 필요로 한다. 효율적 전사 조절 요소는 동물 세포가 천연 숙주인 바이러스로부터 또는 동물 세포의 염색체 DNA로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 시미안 바이러스 40, 아데노바이러스, BK 폴리오마 바이러스, 사람 사이토메갈로바이러스 또는 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복부로부터 유래된 프로모터-인핸서 조합물 또는 베타-액틴 또는 GRP78과 같은, 동물 세포내에서 강력하게 구성적으로(constitutively) 전사되는 유전자를 포함하는 프로모터-인핸서 조합물이 사용될 수 있다. cDNA로부터 전사되는 mRNA의 안정한 고수준을 달성하기 위해, 전사 단위는 이의 3'-인접 부분에 전사 종결-폴리아데닐화 서열을 암호화하는 DNA 영역을 함유해야 한다. 바람직하게는, 이러한 서열은 시미안 바이러스 40 조기 전사 영역, 토끼 베타-글로빈 유전자 또는 사람 조직 플라스미노겐 활성화인자 유전자로부터 유래된다.
그 다음, cDNA는 하이브리드, 변형된 Gla 도메인 단백질, 바람직하게는 FIX, FX, 단백질 C, 가장 바람직하게는 인자 VII 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포의 게놈내로 통합된다. 바람직하게는, 당해 세포주는 정확한 폴딩, Gla-도메인 합성, 디설파이드 결합 형성, 아스파라긴-연결된 글리코실화, O-연결 글리코실화 및 기타 해독후 변형 뿐만 아니라 배양 배지로의 분비를 보장하기 위해 척추동물 기원의 동물 세포주여야 한다. 다른 해독후 변형의 예로는 발생기 펩타이드의 쇄의 티로신 O-황산화, 하이드록실화 및 단백질분해성 프로세싱이 있다. 사용될 수 있는 세포주의 예는 원숭이 COS-세포, 마우스 L-세포, 마우스 C127-세포, 햄스터 BHK-21 세포, 사람 배아 신장 293 세포 및 바람직하게는 햄스터 CHO-세포이다.
상응하는 cDNA를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 수가지의 상이한 방식으로 동물 세포주로 도입시킬 수 있다. 예를 들면, 재조합 발현 벡터는 상이한 동물 바이러스에 기초한 벡터로부터 생성될 수 있다. 이의 예로는 배큘로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 및 바람직하게는 소 파필로마 바이러스에 기초한 벡터가 있다.
또한, 재조합 DNA가 게놈내로 통합되어진 특정 세포 클론의 분리를 촉진하기 위해, 상응하는 DNA를 암호화하는 전사 단위를 해당 동물 세포에서 우세한 선택가능한 마커로서 작용할 수 있는 다른 재조합 유전자와 함께 당해 동물 세포내로 도입시킬 수 있다. 이러한 유형의 우세한 선택가능한 마커 유전자의 예는 제니티신에 대한 내성을 부여하는 Tn5 아미노 글리코시드 포스포트랜스퍼라제(G418), 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 및 푸로마이신에 대한 내성을 부여하는 푸로마이신 아세틸 트랜스퍼라제이다. 이러한 선택가능한 마커를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 목적 단백질의 cDNA를 암호화하는 하나의 벡터로서 동일한 벡터상에 존재할 수 있거나, 숙주 세포의 게놈내로 동시에 도입되어 통합되는 별개의 벡터상에 암호화되어 흔히 상이한 전사 단위들 간의 단단한 물리적 연결을 초래할 수 있다.
목적 단백질의 cDNA와 함께 사용될 수 있는 다른 유형의 선택가능한 마커는 디하이드로폴레이트 리덕타제(dhfr)를 암호화하는 다양한 전사 단위에 기초한다. 이러한 유형의 유전자를 내인성 dhfr-활성이 결여된 세포, 바람직하게는 CHO-세포(DUKX-B11 , DG-44)에 도입시킨 후, 당해 세포를 뉴클레오시드가 결여된 배지에서 성장시킬 수 있다. 이러한 배지의 예는 하이포크산틴, 티미딘 및 글리신을 함유하지 않는 햄스(Ham's) F12이다. 이들 dhfr-유전자는 응고 인자 cDNA 전사 단위와 함께 동일한 벡터상에서 또는 상이한 벡터상에서 상기한 유형의 CHO-세포내로 도입되어, 재조합 단백질을 생산하는 dhfr-양성 세포주를 생성시킬 수 있다.
상기 세포주가 세포독성 dhfr-억제제 메토트렉세이트의 존재하에 성장한다면, 메토트렉세이트에 내성인 새로운 세포주가 출현한 것이다. 이들 세포주는 연결된 dhfr 및 목적 단백질의 전사 단위의 증폭된 수로 인해 증가된 속도로 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 이들 세포를 메토트렉세이트의 농도를 증가시키면서(1 내지 10000 nM) 증식시키는 경우, 목적 단백질을 매우 높은 속도로 생산하는 새로운 세포주가 수득될 수 있다.
목적 단백질을 생산하는 상기 세포주는 현탁액 배양물 중에서 또는 각종 고체 지지체상에서 대규모로 성장시킬 수 있다. 이들 지지체의 예는 덱스트란 또는 콜라겐 매트릭스에 기초한 미립담체 또는 중공 섬유 또는 각종 세라믹 물질 형태의 고체 지지체이다. 세포 현탁액 배양물 중에서 또는 미립담체상에서 성장시키는 경우, 상기 세포주의 배양은 회분 배양으로서 또는 연장된 기간에 걸친 조건화된 배지의 연속적 생산을 이용한 관류 배양으로서 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라서, 상기한 세포주는 목적하는 재조합 단백질의 산업적 생산방법의 개발에 매우 적합하다.
상기한 유형의 분비 세포의 배지에 축적되는 재조합 단백질은 세포 배양 배지 중의 목적 단백질과 다른 물질 간의 크기, 전사, 소수성, 용해도, 특이적 친화성 등에서의 차이를 이용한 방법을 포함하여 다양한 생화학 및 크로마토그래피 방법으로 농축 및 정제할 수 있다.
이러한 정제법의 예는 고체상에 고정된 모노클로날 항체에 재조합 단백질을 흡착시키는 것이다. 탈착 후, 당해 단백질을 상기 특성에 기초하여 다양한 크로마토그래피 방법으로 추가 정제할 수 있다.
본 발명의 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 80% 이상의 순도, 보다 바람직하게는 95% 이상의 순도로 정제하는 것이 바람직하며, 특히 바람직하게는 오염성 분자, 특히 다른 단백질 및 핵산에 대해 99.9% 초과로 순수하고 감염성 및 발열성 인자를 함유하지 않는 약제학적으로 순수한 상태로 정제한다. 바람직하게는, 본 발명의 분리 또는 정제된 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드는 실질적으로 다른 폴리펩타이드를 함유하지 않는다.
본 발명에서 기술되는 재조합 단백질은 치료용 약제학적 제제로 제형화될 수 있다. 정제된 단백질은 약제학적 제제를 제조하기 위해 임의로 약제학적 부형제가 부가될 수 있는 통상의 생리학적으로 적합한 수성 완충 용액에 용해될 수 있다.
본 발명의 다양한 생성물은 의약으로서 유용하다. 따라서, 본원에서 기술하는 본 발명은 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 변형된 DNA는 사람 유전자 치료법에서 사용하기 위한 전달 벡터내로 통합될 수도 있다.
본 발명의 다른 측면은 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방용 의약의 제조를 위한, 본원에서 기술하는 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 본 발명의 플라스미드 또는 벡터 또는 본 발명의 숙주 세포의 용도이다. 혈액 응고 장애는 A형 혈우병을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 치료는 사람 유전자 치료법을 포함한다.
본 발명은 또한 A형 혈우병과 같은 혈액 응고 장애를 앓는 개체의 치료방법에 관한 것이다. 당해 방법은 상기 개체에게 본원에서 기술하는 바와 같은 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 유효량을 투여함을 포함한다. 다른 양태에서, 당해 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 플라스미드 또는 벡터의 유효량을 개체에게 투여함을 포함한다. 대안으로, 당해 방법은 본원에서 기술하는 숙주 세포의 유효량을 개체에게 투여함을 포함할 수 있다.
도 1: 사람 기원 및 다른 종의 FVII, 단백질 C, FIX 및 FX 간의 상동성 비교
도 2: 수명이 긴 비타민-K 의존적 폴리펩타이드로부터의 활성화 펩타이드가 삽입된 FVII 변이체의 약동학
본 발명은 하기 실시예에서 보다 상세히 추가로 설명될 것이다. 이러한 구체적 양태는 첨부된 도면과 관련하여 설명될 것이다.
실시예 1: 인자 VII 암호화 서열내로의 인자 IX 활성화 펩타이드 서열의 삽입
본 실시예에서는, FVII 활성화 부위가 보존되면서 대다수의 FIX 활성화 펩타이드가 FVII cDNA 내의 각각의 위치로 삽입된다. 먼저, 아미노산 Ala146과 Ser147 사이(번호매김은 서열번호 3에 관한 것이다)에 제한 부위, Nhel를 도입시켜 외래 활성화 펩타이드 서열을 삽입시키기 위해, 클로닝 벡터 pIRESpuro3(Becton Dickinson; pFVII-538wt로 명명된 플라스미드) 내로 삽입된 FVII cDNA를 제조하였다. 부위 지시된 돌연변이유발을 제조업자의 지침에 따라서 시판되는 돌연변이유발 키트(예를 들면, Stratagene QuickChange SiteDirected Mutagenesis Kit)를 이용하여 수행하였다. 돌연변이유발을 위해 사용되는 프라이머는 하기에 기재한다; 돌연변이유발성 염기는 볼드체로 표시한다.
정방향 프라이머 5' CCTATTCTAGAAAAAAGAAATGCTAGCAAACCCCAAGGCCG 3'(서열번호 21)
역방향 프라이머 5' CGGCCTTGGGGTTTGCTAGCATTTCTTTTTTCTAGAATAGG 3' (서열번호 22)
수득된 플라스미드를 pFVII-Nhel186이라 명명하였다.
둘째로, FIX 활성화 펩타이드의 아미노산 165번 내지 194번(번호매김은 서열번호 9에 관한 것이다)을 다음 프라이머들을 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 FIX cDNA 작제물상에서 증폭시켰다.
정방향 프라이머 5' GTGGCTAGCGCTGAGACTGTTTTTCCTG 3' (서열번호 23)
역방향 프라이머 5' CACGCTAGCTTGGGTGCTTTGAGTGATG 3' (서열번호 24)
두 프라이머 모두 NheI 제한 부위(밑줄 부분)를 부가하였다. 증폭 생성물을 NheI로 분해시키고, 상기한 NheI 분해된 pFVII-NheI186으로 클로닝시켰다.
DNA 서열분석으로 올바른 배향을 확인한 후, 2회의 돌연변이유발을 수행하여 NheI 부위를 천연 FVII/FIX 서열로 역돌연변이시켰다. 돌연변이유발성 프라이머를 하기에 나타낸다.
FIX 삽입체의 5'-말단에서 NheI 부위를 역돌연변이시키는 프라이머:
정방향 프라이머 5' CTAGAAAAAAGAAATGCTCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGG 3'(서열번호 25)
역방향 프라이머 5' CCACATCAGGAAAAACAGTCTCAGCACGAGCATTTCTTTTTTCTAG 3' (서열번호 26)
FIX 삽입체의 3'-말단에서 NheI 부위를 역돌연변이시키는 프라이머:
정방향 프라이머 5' CATCACTCAAAGCACCCAATCAAGCAAACCCCAAGGCCGAATTG 3' (서열번호 27)
역방향 프라이머 5' CAATTCGGCCTTGGGGTTTGCTTGATTGGGTGCTTTGAGTGATG 3' (서열번호 28)
수득된 발현 플라스미드를 pFVII-552라 명명하였다. 수득된 성숙한 FVII/FIX 키메릭 단백질 서열(서열번호 29)은 하기에 기재되어 있으며, 여기서, 삽입된 FIX 활성화 펩타이드 서열은 밑줄로 표시되어 있다.
Figure 112007021439370-PCT00001
클로닝을 위해 어떠한 cDNA 서열이 사용되는지에 따라서, 키메릭 단백질은 FIX 활성화 펩타이드 RAE A VFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQS (서열번호 30) 다형성과 같은 FVII 및 FIX의 다형성을 또한 함유할 수 있다.
플라스미드 pFVII-552에 기초하여, FVII cDNA와 FIX 활성화 펩타이드 서열 사이의 상이한 전이 서열을 갖는 또 다른 발현 플라스미드를 작제하였다. 이를 위해 2회의 돌연변이유발을 상기한 pFVI 1-552에 적용하였다. 첫번째 돌연변이유발은 서열번호 29의 아미노산 145번 내지 147번을 결실시켰으며 다음의 프라이머들을 사용하였다:
정방향 프라이머 5' CTATTCTAGAAAAAAGAGCTGAGACTGTTTTTCCTGATG 3'(서열번호 42)
역방향 프라이머 5' CATCAGGAAAAACAGTCTCAGCTCTTTTTTCTAGAATAG 3'(서열번호 43)
두번째 돌연변이유발은 서열번호 29의 아미노산 176번과 177번 사이에 4개의 아미노산을 삽입시켰으며 다음의 프라이머를 사용하였다:
정방향 프라이머 5' CAAAGCACCCAATCAAAGCGGAATGCTAGCAAACCCCAAGG 3'(서열번호 44)
역방향 프라이머 5' CCTTGGGGTTTGCTAGCATTCCGCTTTGATTGGGTGCTTTG 3'(서열번호 45)
수득된 플라스미드는 pFVII-681이라 지칭하였다. 수득된 성숙한 FVII/FIX 키메릭 단백질 서열(서열번호 46)은 하기에 기재하며, 여기서, 삽입된 FIX 활성화 펩타이드 서열은 밑줄로 표시한다.
Figure 112007021439370-PCT00002
실시예 2: 인자 VII 암호화 서열 내로의 인자 X 활성화 펩타이드 서열의 삽입
FX 활성화 펩타이드를 Nhel 제한 부위(밑줄 부분)를 결합시키는 다음의 프라이머를 사용하여 클로닝된 FX cDNA상에서 PCR로 증폭시켰다.
정방향 프라이머 5' GTGCTAGCCAGGCCACCAGCAGCAG 3'(서열번호 47)
역방향 프라이머 5' GCGGCTAGCATTCCGCTTCTCAGGCtGCGTCTGGTTG 3'(서열번호 48)
이어서, FX 활성화 펩타이드를 함유한 PCR 단편을 Nhel로 분해시키고 Nhel 분해된 플라스미드 pFVII-Nhel186(실시예 1)에 연결시켰다. 상기한 바와 같은 2회의 후속적 부위 지시된 돌연변이유발에서, FVII cDNA 서열과 FX 활성화 펩타이드 사이의 전이 서열이 교정되었다.
하기의 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 첫번째 돌연변이유발을 수행하였다:
정방향 프라이머 5' CCTATTCTAGAAAAAAGAAATGCCCAGGCCACCAGCAGCAGCGG 3' (서열 번호 49)
역방향 프라이머 5' CCGCTGCTGCTGGTGGCCTGGGCATTTCTTTTTTCTAGAATAGG 3' (서열번호 50)
하기의 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 두번째 돌연변이유발을 수행하였다:
정방향 프라이머 5' CCTATTCTAGAAAAAAGCGTGGCCCAGGCCACCAGCAGCAGCGGGG 3' (서열번호 51)
역방향 프라이머 5' CCCGCTGCTGCTGGTGGCCTGGGCCACGCTTTTTTCTAGAATAGG 3'(서열번호 52)
수득된 플라스미드는 pFVII-611이라 지칭하였다. 수득된 성숙한 FVII/FX 키메릭 단백질 서열(서열번호 53)은 하기에 기재되어 있으며, 여기서, 삽입된 FX 활성화 펩타이드 서열은 밑줄로 표시되어 있다.
Figure 112007021439370-PCT00003
실시예 3: 인자 IX 암호화 서열 내로의 인자 X 활성화 펩타이드 서열의 삽입
본 실시예에서는, FIX 활성화 부위가 보존되면서 FX 활성화 펩타이드가 FIX cDNA 내의 각각의 위치내로 삽입된다.
먼저, 두 제한 부위, 즉 아미노산 Ser161과 Lys162 사이의 Xbal 부위 및 Thr1 92와 Gln193 사이(번호매김은 서열번호 9에 관한 것이다)의 PinAI 부위를 도입시켜 외래 활성화 펩타이드 서열을 삽입하기 위해, 클로닝 벡터 pIRESpuro3(Becton Dickinson) 내의 FIX cDNA를 제조하였다. 부위 지시된 돌연변이유발을 제조업자의 지침에 따라서 시판되는 돌연변이유발 키트(예를 들면, Stratagene QuickChange SiteDirected Mutagenesis Kit)를 이용하여 수행하였다. 돌연변이유발을 위해 사용되는 프라이머는 하기에 기재한다; 돌연변이유발성 염기는 볼드체로 표시한다.
Xbal 부위의 도입을 위한 돌연변이유발성 프라이머:
정방향 프라이머 5' GAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAGACTCACCCGTGCTGAGAC 3'(서열번호 31)
역방향 프라이머 5' GTCTCAGCACGGGTGAGTCTAGAAGTTTGTGAAACAGAAACTCTTC 3'(서열번호 32)
PinAI 부위의 도입을 위한 돌연변이유발성 프라이머:
정방향 프라이머 5' GGATAACATCACTCAAAGCACCGGTTCATTTAATGACTTCACTCGGGTTG 3' (서열번호 33)
역방향 프라이머 5' CAACCCGAGTGAAGTCATTAAATGAACCGGTGCTTTGAGTGATGTTATCC 3' (서열번호 34)
둘째로, FX 활성화 펩타이드의 아미노산 159번 내지 213번(번호매김은 서열번호 12에 관한 것이다)을 5'-말단 Xbal 및 3'-말단 PinAI 부위(밑줄 부분)을 부가하는 다음의 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응으로 증폭시켰다:
정방향 프라이머 5' GTGTCTAGAAGGAAGAGGTCAGTGGCCC 3'(서열번호 35)
역방향 프라이머 5'CACACCGGTGAGGTTGTTGTCGCCC 3'(서열번호 36)
증폭 산물을 Xbal 및 PinAI로 분해시키고, 상기와 같이 변형된 Xbal 및 PinAI 분해된 FIX cDNA로 클로닝하였다. 후속적으로 2회의 돌연변이유발을 수행하여 Xbal 및 PinAI 부위를 천연 FIX 및 FX 서열로 역돌연변이시켰다. 돌연변이유발성 프라이머는 하기에 나타낸다:
FX 삽입체의 5'-말단에서 Xbal 부위를 역돌연변이시키는 프라이머:
정방향 프라이머 5' GAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTCGCAGGAAGAGGTCAGTGG 3'(서열번호 37)
역방향 프라이머 5' CCACTGACCTCTTCCTGCGAGAAGTTTGTGAAACAGAAACTC 3'(서열번호 38)
FX 삽입체의 3'-말단에서 PinAI 부위를 역돌연변이시키는 프라이머:
정방향 프라이머 5' GCGACAACAACCTCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGGGTTG 3'(서열번호 39)
역방향 프라이머 5' CAACCCGAGTGAAGTCATTAAATGATTGGGTGAGGTTGTTGTCGC 3'(서열번호 40)
수득된 성숙한 FIX/FX 키메릭 단백질 서열(서열번호 41)은 하기에 기재되어 있으며, 여기서, 삽입된 FX 활성화 펩타이드 서열은 밑줄로 표시되어 있다.
Figure 112007021439370-PCT00004
실시예 4: 변형된 FVII 및 FIX 단백질의 형질감염 및 발현
발현 플라스미드를 이. 콜라이 TOP10(Invitrogen)에서 성장시키고 표준 프로토콜(Qiagen)을 사용하여 정제하였다. HEK 293 세포(Invitrogen)를 리포펙타민 2000 시약(Invitrogen)을 사용하여 형질감염시키고 50ng/ml 비타민 K3 및 4㎍/ml 푸로마이신의 존재하에 혈청 비함유 배지(Invitrogen 293 Express)에서 성장시켰다. 형질감염된 세포 집단을 T-플라스크를 통해서 롤러 병내로 확산시키고, 정제를 위해 이로부터 상청액을 수거하였다.
실시예 5: 변형된 FVII 단백질의 정제
FVII 단백질을 특허 EP 0770625에 기술된 바와 같이 정제하였다. 간략하게 언급하면, 가용성 조직 인자를 시안화브롬에 의해 세파로스 비이드에 공유적으로 커플링시켰다. FVII 함유 세포 배양물 상청액을 10mM 칼슘 완충액에 부하하였다. 미결합 단백질을 동일한 완충액으로 세척 제거하였다. 결합된 FVII 단백질을 100mM 나트륨 시트레이트 완충액으로 용출시켰다.
실시예 6: FVII 활성 및 항원의 측정
FVII 항원을 성능이 당해 분야의 숙련가에게 공지된 ELISA를 이용하여 측정하였다. 간략하게 언급하면, 마이크로플레이트를 웰당 포획 항체(양 항 사람 FVII IgG, Cedarlane CL20030AP, 완충액 A[Sigma C3041]에 1:1000으로 희석됨) 120㎕와 함께 주위 온도로 밤새 항온처리하였다. 플레이트를 완충액 B(Sigma P3563)로 3회 세척한 후, 각 웰을 200㎕ 완충액 C(Sigma P3688)와 함께 주위 온도에서 1시간 동안 항온처리하였다. 다시 완충액 B로의 3회 세척 단계 후, 완충액 B 중의 시험 샘플의 연속적 희석액 및 완충액 B 중의 표준 사람 혈장의 연속적 희석액(Dade Behring; 50 내지 0.5mU/mL)(웰당 용적: 100㎕)을 주위 온도에서 2시간 동안 항온처리하였다. 완충액 B로의 3회 세척 단계 후, 완충액 B 중의 검출 항체(양 항 사람 FVII IgG, Cedarlane CL20030K, 퍼옥시다제 표지됨)의 1:5000 희석액 100㎕을 각 웰에 부가하고 추가로 2시간 동안 주위 온도에서 항온처리하였다. 완충액 B로 의 3회 세척 단계 후, 100㎕의 기질 용액(TMB, Dade Behring, OUVF)을 웰마다 부가하고 암실에서 주위 온도에서 30분 동안 항온처리하였다. 100㎕의 비희석된 정지 용액(Dade Behring, OSFA)을 부가하여, 450nm 파장에서 적합한 마이크로플레이트 판독기에서의 판독을 위한 샘플을 제조하였다. 이어서, 표준 사람 혈장을 참조로 하여 표준 곡선을 이용하여 시험 샘플의 농도를 계산하였다.
실시예 7: 변형된 FVII 단백질의 약동학
야생형 및 변형된 FVII 단백질을 마취된 CD/루이스 랫트(기질당 6마리 랫트)에게 100㎍/체중 kg의 투여량으로 정맥내 투여하였다. 시험 물질을 적용한 후 혈액 샘플을 5분, 30분, 60분, 120분 및 140분에서 3마리 랫트로부터 경동맥에서 채취하고, 15분, 45분, 90분 및 240분에서 나머지 3마리 랫트로부터 경동맥에서 채취하였다. 이어서, FVII 항원 함량을 사람 인자 VII(상기 참조)에 특이적인 ELISA 검정으로 정량하였다. 각 그룹에 대한 평균 FVII 항원 농도는 도 2에 도시한다. 표 5에는 소실의 알파상(alpha phase) 및 베타상(beta phase) 동안의 계산된 반감기가 요약되어 있으며, 여기서, 알파상은 5분부터 50분까지로 정의되며 베타상은 30분부터 항원 검정의 검출 한계치 이상의 농도를 갖는 마지막 시점까지로 정의되었다. 식 T1/2 = In2/k(여기서, k는 회귀 선의 기울기이다)에 따라 계산하였다.
작제물 알파상 반감기 (분) 베타상 반감기 (분) 다음 시점에서 계산된 반감기 FVII 야생형과 비교한 반감기 연장(베타상)
pFVII-538wt 10 29 30 내지 90분
pFVII-552 20 128 30 내지 480분 4.4배
pFVII-611 19 102 30 내지 240분 3.5배
pFVII-681 22 178 30 내지 480분 6.1배
당해 데이타는 천연의 추정상 FVII 활성화 펩타이드를 수명이 긴 프로트롬빈 인자의 활성화 펩타이드로 대체시키는 것이 야생형 FVII 단백질과 비교해 당해 단백질의 생체내 반감기를 현저하게 연장시켰음을 명백히 보여준다.
<110> ZLB BEHRING GMBH <120> Modified vitamin K dependent polypeptides <130> 2004/M009-A90 <150> EP 04019485.4 <151> 2004-08-17 <160> 53 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1401 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> mat_peptide <222> (181)..(1398) <223> <220> <221> CDS <222> (1)..(1398) <223> <400> 1 atg gtc tcc cag gcc ctc agg ctc ctc tgc ctt ctg ctt ggg ctt cag 48 Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln -60 -55 -50 -45 ggc tgc ctg gct gca ggc ggg gtc gct aag gcc tca gga gga gaa aca 96 Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr -40 -35 -30 cgg gac atg ccg tgg aag ccg ggg cct cac aga gtc ttc gta acc cag 144 Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gln -25 -20 -15 gag gaa gcc cac ggc gtc ctg cac cgg cgc cgg cgc gcc aac gcg ttc 192 Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe -10 -5 -1 1 ctg gag gag ctg cgg ccg ggc tcc ctg gag agg gag tgc aag gag gag 240 Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 5 10 15 20 cag tgc tcc ttc gag gag gcc cgg gag atc ttc aag gac gcg gag agg 288 Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg 25 30 35 acg aag ctg ttc tgg att tct tac agt gat ggg gac cag tgt gcc tca 336 Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser 40 45 50 agt cca tgc cag aat ggg ggc tcc tgc aag gac cag ctc cag tcc tat 384 Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr 55 60 65 atc tgc ttc tgc ctc cct gcc ttc gag ggc cgg aac tgt gag acg cac 432 Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 70 75 80 aag gat gac cag ctg atc tgt gtg aac gag aac ggc ggc tgt gag cag 480 Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln 85 90 95 100 tac tgc agt gac cac acg ggc acc aag cgc tcc tgt cgg tgc cac gag 528 Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 105 110 115 ggg tac tct ctg ctg gca gac ggg gtg tcc tgc aca ccc aca gtt gaa 576 Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 120 125 130 tat cca tgt gga aaa ata cct att cta gaa aaa aga aat gcc agc aaa 624 Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 135 140 145 ccc caa ggc cga att gtg ggg ggc aag gtg tgc ccc aaa ggg gag tgt 672 Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 150 155 160 cca tgg cag gtc ctg ttg ttg gtg aat gga gct cag ttg tgt ggg ggg 720 Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly 165 170 175 180 acc ctg atc aac acc atc tgg gtg gtc tcc gcg gcc cac tgt ttc gac 768 Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 185 190 195 aaa atc aag aac tgg agg aac ctg atc gcg gtg ctg ggc gag cac gac 816 Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp 200 205 210 ctc agc gag cac gac ggg gat gag cag agc cgg cgg gtg gcg cag gtc 864 Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val 215 220 225 atc atc ccc agc acg tac gtc ccg ggc acc acc aac cac gac atc gcg 912 Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala 230 235 240 ctg ctc cgc ctg cac cag ccc gtg gtc ctc act gac cat gtg gtg ccc 960 Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 245 250 255 260 ctc tgc ctg ccc gaa cgg acg ttc tct gag agg acg ctg gcc ttc gtg 1008 Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 265 270 275 cgc ttc tca ttg gtc agc ggc tgg ggc cag ctg ctg gac cgt ggc gcc 1056 Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala 280 285 290 acg gcc ctg gag ctc atg gtg ctc aac gtg ccc cgg ctg atg acc cag 1104 Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln 295 300 305 gac tgc ctg cag cag tca cgg aag gtg gga gac tcc cca aat atc acg 1152 Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr 310 315 320 gag tac atg ttc tgt gcc ggc tac tcg gat ggc agc aag gac tcc tgc 1200 Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 325 330 335 340 aag ggg gac agt gga ggc cca cat gcc acc cac tac cgg ggc acg tgg 1248 Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 345 350 355 tac ctg acg ggc atc gtc agc tgg ggc cag ggc tgc gca acc gtg ggc 1296 Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly 360 365 370 cac ttt ggg gtg tac acc agg gtc tcc cag tac atc gag tgg ctg caa 1344 His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln 375 380 385 aag ctc atg cgc tca gag cca cgc cca gga gtc ctc ctg cga gcc cca 1392 Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 390 395 400 ttt ccc tag 1401 Phe Pro 405 <210> 2 <211> 466 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln -60 -55 -50 -45 Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr -40 -35 -30 Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gln -25 -20 -15 Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe -10 -5 -1 1 Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 5 10 15 20 Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg 25 30 35 Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser 40 45 50 Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr 55 60 65 Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 70 75 80 Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln 85 90 95 100 Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 105 110 115 Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 120 125 130 Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 135 140 145 Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 150 155 160 Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly 165 170 175 180 Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 185 190 195 Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp 200 205 210 Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val 215 220 225 Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala 230 235 240 Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 245 250 255 260 Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 265 270 275 Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala 280 285 290 Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln 295 300 305 Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr 310 315 320 Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 325 330 335 340 Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 345 350 355 Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly 360 365 370 His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln 375 380 385 Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 390 395 400 Phe Pro 405 <210> 3 <211> 406 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(7) <223> Xaa can be Glu or gamma-carboxyglutamic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa can be Glu or gamma-carboxyglutamic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa can be Glu or gamma-carboxyglutamic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(20) <223> Xaa can be Glu or gamma-carboxyglutamic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(26) <223> Xaa can be Glu or gamma-carboxyglutamic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa can be Glu or gamma-carboxyglutamic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa can be Glu or gamma-carboxyglutamic acid <400> 3 Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp 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can be Glu or gamma-carboxyglutamic acid <400> 9 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Xaa Xaa Phe Val Gln Gly Asn Leu Xaa Arg 1 5 10 15 Xaa Cys Met Xaa Xaa Lys Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe 20 25 30 Xaa Asn Thr Xaa Arg Thr Thr Xaa Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly 35 40 45 Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp 50 55 60 Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys 65 70 75 80 Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu 85 90 95 Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr 100 105 110 Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val 115 120 125 Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr 130 135 140 Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu 145 150 155 160 Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn 165 170 175 Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe 180 185 190 Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala 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tac aag cct gat gaa ggg aaa cga 1680 Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg 505 510 515 ggg gat gcc tgt gaa ggt gac agt ggg gga ccc ttt gtc atg aag agc 1728 Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys Ser 520 525 530 ccc ttt aac aac cgc tgg tat caa atg ggc atc gtc tca tgg ggt gaa 1776 Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr Gln Met Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu 535 540 545 ggc tgt gac cgg gat ggg aaa tat ggc ttc tac aca cat gtg ttc cgc 1824 Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Tyr Thr His Val Phe Arg 550 555 560 565 ctg aag aag tgg ata cag aag gtc att gat cag ttt gga gag tag 1869 Leu Lys Lys Trp Ile Gln Lys Val Ile Asp Gln Phe Gly Glu 570 575 <210> 14 <211> 622 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 14 Met Ala His Val Arg Gly Leu Gln Leu Pro Gly Cys Leu Ala Leu Ala -40 -35 -30 Ala Leu Cys Ser Leu Val His Ser Gln His Val Phe Leu Ala Pro Gln -25 -20 -15 Gln Ala Arg Ser Leu Leu Gln Arg Val Arg Arg Ala Asn Thr Phe Leu -10 -5 -1 1 5 Glu Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu 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46 <210> 27 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 27 catcactcaa agcacccaat caagcaaacc ccaaggccga attg 44 <210> 28 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 28 caattcggcc ttggggtttg cttgattggg tgctttgagt gatg 44 <210> 29 <211> 436 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FVII/FIX chimera <220> <221> FVII/FIX chimera <222> (1)..(436) <223> <400> 29 Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15 Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly 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Sequence <220> <223> reverse primer <400> 40 caacccgagt gaagtcatta aatgattggg tgaggttgtt gtcgc 45 <210> 41 <211> 439 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FIX/FX chimeric protein sequence <220> <221> FIX/FX chimera <222> (1)..(439) <223> <400> 41 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg 1 5 10 15 Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe 20 25 30 Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly 35 40 45 Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp 50 55 60 Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys 65 70 75 80 Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu 85 90 95 Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr 100 105 110 Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val 115 120 125 Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Arg Arg Lys 130 135 140 Arg Ser Val Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly Glu Ala Pro Asp Ser 145 150 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Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser 165 170 175 Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly 180 185 190 Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys 195 200 205 Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys 210 215 220 Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu 225 230 235 240 His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala 245 250 255 Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp 260 265 270 Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His Val 275 280 285 Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala 290 295 300 Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg 305 310 315 320 Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met 325 330 335 Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn 340 345 350 Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp 355 360 365 Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly 370 375 380 Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr 385 390 395 400 Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp 405 410 415 Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg 420 425 430 Ala Pro Phe Pro 435 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <220> <221> Forward Primer <222> (1)..(26) <223> <400> 47 gtggctagcc aggccaccag cagcag 26 <210> 48 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <220> <221> Reverse Primer <222> (1)..(37) <223> <400> 48 gcggctagca ttccgcttct caggctgcgt ctggttg 37 <210> 49 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <220> <221> Forward Primer <222> (1)..(44) <223> <400> 49 cctattctag aaaaaagaaa tgcccaggcc accagcagca gcgg 44 <210> 50 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <220> <221> Reverse Primer <222> (1)..(44) <223> <400> 50 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Claims (42)

  1. 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드를 변형시켜, 당해 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드가 활성화 펩타이드가 변형되지 않은 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 반감기를 갖도록 함을 포함하는, 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 변형이 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 적어도 일부분의 부가 또는 상기 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 유사체의 부가를 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 혈장 반감기가 비변형된 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 혈장 반감기보다 큰 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 변형이 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 적어도 일부분을 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 적어도 일부분으로 대체시킴을 포함하는 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 일부분이 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 아미노산 서열내의 8개 이상의 연속적 아미노산으로 이루어지는 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 변형이 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화의 특이성을 보존시키면서 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 완전한 활성화 펩타이드를 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 완전한 활성화 펩타이드로 대체시킴을 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 변형이 (i) 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 경쇄와 활성화 펩타이드 사이의 절단 부위를 제거하거나, (ii) 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 중쇄와 활성화 펩타이드 사이의 절단 부위를 제거함을 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 형태가 비변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 형태와 비교하여 증가된 혈장 반감기를 갖는 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 효소원 형태가 비변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 효소원 형태와 비교하여 증가된 혈장 반감기를 갖고, 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 변형된 활성화 펩타이드가 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화시에 방 출되는 방법.
  10. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 형태가 비변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 형태와 비교하여 증가된 혈장 반감기를 갖고, 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 변형된 활성화 펩타이드가 당해 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화시에 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 경쇄 또는 중쇄 중 어느 하나에 공유 결합된 상태를 유지하는 방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 효소원 형태가 비변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 효소원 형태와 비교하여 증가된 혈장 반감기를 갖고, 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 변형된 활성화 펩타이드가 당해 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화시에 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 경쇄 또는 중쇄 중 어느 하나에 공유 결합된 상태를 유지하는 방법.
  12. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 형태가 비변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 형태와 비교하여 증가된 혈장 반감기를 갖고, 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 변형된 활성화 펩타이드가 변형된 당해 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화시 에 방출되는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 변형이 활성화 펩타이드 내의 해독후 변형 부위를 변형시킴을 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 변형이 활성화 펩타이드 내의 하나 이상의 N-글리코실화 부위를 제거함을 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드가 사람 인자 VII 또는 VIIa인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 아미노산 서열이 서열번호 18 및 서열번호 19로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  17. 제2항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드가 사람 단백질 C이고, 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 아미노산 서열이 서열번호 18 및 서열번호 19로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  18. 제2항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드가 사람 인자 IX이고, 제2 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드가 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 변형이 제1 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화의 특이성을 실질적으로 변경시키지 않는 방법.
  20. 활성화 펩타이드가 변형되지 않은 비타민 K-의존적 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 반감기를 갖는, 변형된 활성화 펩타이드를 포함하는 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드.
  21. 제20항에 있어서, 변형된 활성화 펩타이드가 상이한 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 적어도 일부분 또는 상이한 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 유사체를 포함하는 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드.
  22. 제21항에 있어서, 상이한 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 일부분이 상이한 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 펩타이드의 아미노산 서열내의 8개 이상의 연속적 아미노산 서열로 이루어진 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드.
  23. 제20항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드가 변형된 사람 인자 VII, 변형된 사람 인자 IX 및 변형된 사람 단백질 C로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드.
  24. 제20항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 활성화 펩타이드의 적어도 일부분이 서열번호 18 및 서열번호 19로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 대체되어진 변형된 사람 인자 VII인 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드.
  25. 제20항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 활성화 펩타이드의 적어도 일부분이 서열번호 18 및 서열번호 19로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 대체되어진 변형된 사람 단백질 C인 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드.
  26. 제20항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 활성화 펩타이드가 서열번호 19의 아미노산 서열로 대체되어진 변형된 인자 IX인 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드.
  27. 제20항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 활성화 펩타이드내의 N-글리코실화 부위가 결실된 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드.
  28. 제20항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 반감기가 활성화 펩타이드가 변형되지 않은 상응하는 비타민 K-의존적 폴리펩타이드와 비교하여 50% 이상 증가된 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드.
  29. 제20항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 활성화 펩타이드가 변형되지 않은 상응하는 비타민 K-의존적 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 안정성을 갖는 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드.
  30. 제20항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 혈액응고 활성을 갖는 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드.
  31. 제20항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, (i) 활성화 형태가 변형된 활성화 펩타이드를 포함하지 않고, (ii) 효소원 형태가 비변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 효소원 형태와 비교하여 증가된 반감기를 가짐을 특징으로 하는 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드.
  32. 제20항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, (i) 활성화 형태가 변형된 활성화 펩타이드를 포함하고, (ii) 활성화 형태가 비변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 활성화 형태와 비교하여 증가된 반감기를 가짐을 특징으로 하는 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드.
  33. 제20항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 따른 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  34. 제33항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 또는 벡터.
  35. 제34항에 있어서, 발현 벡터인 플라스미드 또는 벡터.
  36. 제35항에 있어서, 사람 유전자 치료법에서 사용하기 위한 전달 벡터인 플라스미드 또는 벡터.
  37. 제33항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제34항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 따른 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  38. - 제34항에 따른 숙주 세포를 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드가 발현되도록 하는 조건하에 배양하는 단계; 및
    - 임의로, 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드의 생산방법.
  39. 제20항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 따른 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드, 제33항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제34항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 따른 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
  40. 혈액응고 장애의 치료 또는 예방용 의약의 제조를 위한, 제20항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 따른 변형된 비타민 K-의존적 폴리펩타이드, 제33항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제34항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 따른 플라스미드 또는 벡터 또는 제37항에 따른 숙주 세포의 용도.
  41. 제40항에 있어서, 혈액응고 장애가 A형 혈우병인 용도.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 치료가 사람 유전자 치료법을 포함하는 용도.
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