JP2008509688A - 改変ビタミンk依存性ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、改善された安定性と長い血漿半減期を有する、ビタミンK依存性ポリペプチド、具体的にはヒトVII因子、ヒトVIIa因子、ヒトIX因子、および、ヒトプロテインC、および、それらの誘導体をコードする改変されたcDNA配列、このようなcDNA配列を含む組換え発現ベクター、このような組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞、改変されていない野生型タンパク質の生物活性を有するが、改善された安定性を有する組換えポリペプチドおよび誘導体、ならびに、このような組換えタンパク質およびそれらの誘導体の製造方法に関する。本発明はまた、このような改変されたDNA配列を含むヒト遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターも包含する。
Description
本発明は、改善された安定性と長い血漿中半減期を有するビタミンK依存性ポリペプチド、具体的にはヒトVII因子、ヒトVIIa因子、ヒトIX因子、および、ヒトプロテインCおよびそれらの誘導体をコードする改変されたcDNA配列、このようなcDNA配列を含む組換え発現ベクター、このような組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞、改変されていない野生型タンパク質の生物活性を有するが、改善された安定性を有する組換えポリペプチドおよび誘導体、および、このような組換えタンパク質およびそれらの誘導体の製造方法に関する。本発明はまた、このような改変されたDNA配列を含む、ヒト遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターも含む。
ビタミンK依存性タンパク質は、ある種のタイプの血友病を治療するのに用いられる。典型的な血友病または血友病Aは、遺伝性の出血障害である。これはX染色体伴性の血液凝固第VIII因子欠乏症により発症し、ほとんど雄のみが10,000人中1〜2人の発生率で影響を受ける。X染色体異常は、雌のキャリアー(自身は血友病者ではない)によって遺伝する。血友病Aの臨床症状は、高い出血傾向である。濃縮VIII因子での治療が導入される以前は、重度の血友病に罹った人の平均寿命は、20歳未満であった。血漿由来の濃縮VIII因子の使用、その後のFVIIIの組換え型の使用によって、血友病患者を取り巻く状況は顕著に改善され、平均寿命は大幅に伸び、その人々の多くに程度の差はあるが普通の生活を送る可能性を与えた。血友病B(その罹患率は血友病Aよりも5倍少ない)は、FIXが機能しないか、または、欠失していることによって引き起こされるものであり、血漿由来の濃縮FIXまたはFIXの組換え型で治療される。血友病Aと血友病Bのいずれにおいても、病気の治療における最も重篤な医学的問題は、補充された因子に対する同種異型抗体の生成である。全ての血友病A患者の30%もが、FVIIIに対する抗体を発生させる。それほどではないにせよFIXに対する抗体も発生し、免疫寛容誘導治療への感度が低くなるにつれてより重度の結果が生じる。
現在の凝固モデルによれば、生理学的な凝固のきかっけは、通常血管系の外側に位置するTF発現細胞の表面での組織因子(TF)とVIIa因子(FVIIa)との複合体の形成であると言われている。これによりFIXの活性化が起こり、最終的にFXはいくつかのトロンビンを生産する。正のフィードバックループで、トロンビンは、FVIIIおよびFIXを活性化し(これが、いわゆる血液凝固カスケード「本来の」目的である)、それによって、完全な止血を達成するための完全なトロンビンのバーストを発生させるのに必要なFXaの生成を増幅する。通常の生理学的レベルを超える濃度のFVIIaを投与することによって、FVIIIaおよびFIXaの必要性を迂回して止血が達成されることが示されている。FVIIに関するcDNAのクローニング(US4,784,950)により、その血漿から誘導された凝固因子の組換え代替物を開発することが可能になった。1988年に、このFVIIaの高いタイターのFVIII阻害抗体を有する患者への投与が初めて成功した。それ以来FVIIaの効能(indications)の数は徐々に増えており、これは、万能な止血剤になる可能性があるということの現れである(Erhardtsen,2002)。
FVIIは、分子量50kDaの単鎖糖タンパク質であり、これは、肝細胞によって406個のアミノ酸からなる不活性な酵素原として血流に分泌される。FVIIは、このタンパク質のGlaドメインに位置する10個のγ−カルボキシ−グルタミン酸残基(6、7、14、16、19、20、25、26、29および35位)を含む。Gla残基は、それらの生合成のためにビタミンKを必要とする。C末端からGlaドメインに向かって、2
つの上皮増殖因子ドメイン、続いてトリプシン様セリンプロテアーゼドメインが存在する。FVIIのさらなる翻訳後修飾としては、水酸化(Asp63)、N型(Asn145、および、Asn322)、同様に、O型糖鎖付加(Ser52およびSer60)が挙げられる。
つの上皮増殖因子ドメイン、続いてトリプシン様セリンプロテアーゼドメインが存在する。FVIIのさらなる翻訳後修飾としては、水酸化(Asp63)、N型(Asn145、および、Asn322)、同様に、O型糖鎖付加(Ser52およびSer60)が挙げられる。
FVIIは、Arg152−Ile153での単一のペプチド結合のタンパク質分解によってその活性化された形態であるFVIIaに変換され、ここで2個のポリペプチド鎖、N末端軽鎖(17kDa)とC末端重鎖(28kDa)とが形成され、これらは1個のジスルフィド架橋で連結されている。その他のビタミンK依存性ポリペプチドとは対照的に、FVIIに関して、活性化の際に切り離される活性化ペプチドは説明されていない。相同性比較によれば、Arg152−Ile153切断部位は、その他のビタミンK依存性ポリペプチドのC末端の活性化切断部位に相当する。しかしながら、Arg144もまたプロテアーゼの切断部位を構成する可能性があることから、現在の考えに対して、FVIIは、Arg144〜Arg152の8個のアミノ酸からなる活性化ペプチドを有するということは排除できない。
FVIIaの活性なコンフォメーションを達成するためには、Ile153〜Asp343間の活性化による切断の後の塩架橋の形成が必須である。インビトロで、FVIIの活性化は、FXa、FXIIa、FIXa、FVIIa、FSAPおよびトロンビンによって達成できる。Mollerup等(Biotechnol.Bioeng.(1995)48:501〜505)は、いくつかの切断が、重鎖のArg290および/またはArg315でも起こることを報告している。
FVIIは、血漿中に濃度500ng/mlで存在する。FVIIのうち1%(例えば5ng/ml)が、FVIIaとして存在する。FVIIの血漿中半減期は約4時間であり、FVIIaの血漿中半減期は約2時間であることがわかっている。アンチトロンビンIIIのようなセルピンによる回復不能の阻害のために、FVIIaの2時間の半減期は、活性化された凝固因子としては比較的長いが(他の場合では分単位であることが多い)、それにもかかわらず、止血を達成するためには複数回の静脈注射または持続点滴が必要になり、患者にとって極めて高い治療コストと不便を強いるために、これはFVIIaの治療用途に関して深刻な欠点の一つである。一方で、FVIIaは、万能な止血剤としての使用可能性があるため、より長い有効半減期を有するFVIIaの形態を開発するために医療上の高い必要性がある。
FVIIを改変するために数々の試みがなされてきた:
Nicolaisen等(WO88/10295,1987年6月25日)によれば、以下のアミノ酸を欠失または改変することによって、FVIIは、タンパク質分解に対して安定化されることが示唆されている:Lys32、Lys38、Lys143、Arg290、Arg315、Lys316、Lys341、Arg392、Arg396、Arg402、Ile42およびTyr44。
Nicolaisen等(WO88/10295,1987年6月25日)によれば、以下のアミノ酸を欠失または改変することによって、FVIIは、タンパク質分解に対して安定化されることが示唆されている:Lys32、Lys38、Lys143、Arg290、Arg315、Lys316、Lys341、Arg392、Arg396、Arg402、Ile42およびTyr44。
Nicolaison(US5,580,560,1989年11月13日)は、WO88/10295を発展させて、FVII/FVIIaのタンパク質分解に対する感受性を低くするために、Arg304、Phe278およびTyr332に突然変異または欠失を入れることも挙げている。
Bharadwaj等(JBC(1996),48,30685〜30691頁)は、FXを活性化できないFVII突然変異体Phe328Serを発現させて、アミド分解活性が検出されなかったことを示している。
Dickinson等(PNAS(1996)93,14379〜14384)は、Lys157、Val158、Glu296、Met298、Asp334、Ser336またはLys337がAlaで置換されたFVIIa変異体を提唱している。
Nelsestuen(WO99/29767,1997年10月23日)は、Glaドメインのリン脂質膜への親和性が強化されるように点突然変異を導入することによってGlaドメインを改変し、それによって、特異的活性を強化した改変型FVIIaを得ている。提唱されている点突然変異は、Pro10、Gly11、Arg28およびLys32での変異である。
Nelsestuen(WO00/66753,1999年4月29日)は、Glaドメインのリン脂質膜への親和性が強化されるように点突然変異を導入することによってGlaドメインを改変し、それによって、特異的活性を強化した改変型FVIIaを得ている。提唱されている点突然変異は、5、9、11、12、29、33、34、35および/または36での変異である。
Kornfelt等(Archiv.Biochem.and Biophys., 363,43〜54頁)は、Met298およびMet306の酸化により、野生型FVIIaと比較して30%高いTFからのFVIIa−oxの解離速度、および、20%低いFX活性化が得られることを示している。
Kemball−Cook等(JBC(1998),14,8516〜8521頁)は、FVII突然変異体Gln100Argを発現させ、これらは、凝固活性が検出されないが、野生型FVIIaに匹敵するアミド分解活性を有することを示し、さらにこれは、TFとの結合が損なわれたためである、という仮説を立てている。
Iino等,Arch.Biochem.Biophys.(1998)352:182〜192は、O型糖鎖付加部位のSer−52およびSer−60を突然変異させることによって、FVIIaの凝固活性を減少させ、場合によってはTFとの相互作用を妨害することを示している。
Ruf等(Biochemistry(1999)16,1957〜66頁)は、突然変異Arg36Alaにより、FX活性化速度の減少が起こることを示している。
Iwanaga等(Thromb.Haemost.(1999年8月増刊号),466,抄録1474)は、316〜320残基が欠失しているか、または、311〜322残基が、トリプシンからそれに対応する残基に置換されているFVII変異体に言及している。
Soejima Kenji等(JP2001061479,1999年8月24日)は、Cys159とCys164との間のジスルフィド基を切断することによって、または、Thr233〜Asp244のループ構造の少なくとも一部を置換、付加または欠失させることによって、または、Arg304〜Cys329の介在配列の少なくとも一部を置換、付加または欠失させることによって、特異的活性を強化した改変型FVIIaを作製している。
Pedersen等(US2003/0096338,2000年2月11日)は、FVIIaの半減期を延長させるための、糖類などの非ポリペプチド部分構造を含むFVIIとFVIIaとの結合体を特許請求している。また、本件請求項は、新規のN型および/またはO型糖鎖付加部位の導入、または、インビボで複合糖質を得るための、もとから存在する
N型および/またはO型糖鎖付加部位の除去を用いた新規の組み合わせの導入も包含する。
N型および/またはO型糖鎖付加部位の除去を用いた新規の組み合わせの導入も包含する。
PerssonおよびOlsen(US2003/0170863,2000年5月3日)は、Leu305またはPhe374がその他のアミノ酸で置換された改変型FVIIaを教示している。上述の突然変異と組み合わせて、プロテアーゼドメイン(153〜406)中の最大20個のアミノ酸が置換されている。場合によりLeu305およびPhe374と組み合わせて、274位、300〜304位および306〜312位でその他のアミノ酸を置換したその他の改変型FVII分子が開示されている。これらの改変は、FVIIaが、通常はTFにより誘導されるべきより活性なコンフォメーションを自発的に達成する効果を有する。
PerssonおよびOlsen(US2003/0104978および2003/0100740,2000年9月29日)はさらに、Ala置換以外に、Lys157、Lys337、Asp334、Ser336、Val158、Glu296およびMet298の位置での点突然変異を有するその他の改変型FVIIa分子を教示している。
PingelおよびKlausen(US2002/0151471およびUS2002/0137673,2000年10月2日)は、所定の比率の異なるN型糖鎖付加を含む複数のFVIIまたは関連ポリペプチドを含む調製物を特許請求している。
Ruf等(WO02/38162,2000年11月9日)は、TFの非存在下でより高いアミド分解活性と、より高いTFへの親和性をもたらす、Met298Gln、Glu296IleおよびVal158Asnの改変、またはそれらの組み合わせの改変を含むFVII/FVIIa変異体を特許請求している。これらの要素をさらに改変して、Lys32、Lys38、Arg290、Arg304、Arg315およびLys341でトリプシン様の切断部位を改変すること、および、Ile42、Tyr44、Phe278、および、Tyr332でキモトリプシン様の部位を改変することにおけるその安定性を増加させている。
Persson(WO02/077218,2001年3月22日)は、FVII/FVIIaの半減期を長くするという目的で、アミノ酸247〜260、393〜405およびPro406、より具体的にはR396、Q250およびPro406、好ましくは化学基を結合させることができるアミノ酸を突然変異させたFVII/FVIIa突然変異体を教示している。これは、K157、V158、E296、M298、L305、D334、S336、K337およびF374でのFVII/FVIIaの活性を高める突然変異と組み合わせることができる。
PerssonおよびOlsen(US2003/0100075,2001年9月27日)は、Leu305は、活性に重要であると考えられるFVIIaのTF錯体化型に見出されるα−へリックスの末端に位置することを教示している。遊離のFVIIaにおいて、このヘリックスは歪んでいるため、場合によっては不安定である。本発明に従ってLeu305をその他のアミノ酸で置換することにより、その他の場合ではTFにより誘導される活性なコンフォメーションを達成する変異体が得られる。アミノ酸Lys157、Lys337、Asp334、Ser336、Val158、Glu296およびMet298は、Ile153とAsp343との間の塩架橋の形成に影響を与える領域に位置する。本発明に従ってこれらのアミノ酸を置換することによって、プロテアーゼのN末端の挿入、例えば活性に必須な塩架橋の生成を容易にすることができる。
PerssonおよびOlsen(US2003/0130191,2001年11月
2日)は、313〜329、364、366、373および376位、同様に330〜339位がその他のアミノ酸で置換された、高い特異的活性を有するさらなる改変型FVII/VIIa突然変異体を教示している。
2日)は、313〜329、364、366、373および376位、同様に330〜339位がその他のアミノ酸で置換された、高い特異的活性を有するさらなる改変型FVII/VIIa突然変異体を教示している。
Haaning等(WO03/093465,2002年4月30日)は、Nelsestuenの教示(リン脂質の結合を強化するためのGlaドメインの改変)を発展させており、すなわちPro10を好ましくはGlnで、Lys32を好ましくはGluで、Asp33を好ましくは疎水性アミノ酸、好ましくはPheで、Ala34を好ましくは負電荷を有するアミノ酸で、好ましくはGluで置換し、さらに、Ala3の後にアミノ酸(好ましくはTyr)を挿入し、さらにN型糖鎖付加部位を導入している。
Foncuberta等(WO2004/011675,2002年7月25日)は、論理上より高い発現レベルとFVIIaの改善された機能が得られる、天然に存在するFVIIの対立遺伝子変異体を説明している。このような改善された特性のデータは示されていない。49種のうち2種の変異体はエキソンに存在しており、それにより、アミノ酸置換:A294VおよびR353Qが起こる。
PerssonおよびOlsen(WO2004/029090,2002年9月25日)は、いくつかのその他のアミノ酸と共にPhe374を突然変異させることにより、FVIIaの活性から独立したTFの増加が得られることを示している。すなわちL305V、S314E、K337AおよびF374Yは、TFのアミド分解活性を増加させた。
Haaning等(WO2004/029091,2002年9月30日)は、FVII/FVIIaのTF結合部位におけるL39、I42、S43、K62、L65、F71、E82およびF275でFVIIを改変しており、TFへの親和性を高めている。
Andersen等(WO2004/083361,2003年3月20日)は、196位(D196N/K)、237位(G237L、または、GAA GAAAまたはGAAAAの挿入)、および、341位(K341N/Q)でFVII/FVIIaを改変しており、TFへの親和性を高めている。
Blajchman等(WO2004/108763,2003年6月5日)は、ウサギVIIa因子は、ヒトTFに対して、ヒトVIIa因子より高い親和性を有することから、ヒトEGFドメインとウサギEGFドメインとの差の解析に基づいて、EGFドメイン内でFVII/FVIIaを改変している。53、62、74、75および83位での突然変異体が特許請求されており、これらはヒトTFに対してより高い親和性を有し、止血薬としての将来性が高いことが示されている。
Haaning等(WO2004/111242,2003年6月19日)は、4、10、28、32、33、34、36、74、77、116位でFVII/FVIIaを改変しており、好ましくはA3Y、P10Q、R28F、K32E、D33F、A34L、R36E、K38E、P74S、E77A、E116Dである。R36E突然変異は、TF依存性の分析において、TFへの結合の減少とトロンビン生成の減少を引き起こし、同時に、PL依存性の分析においても同じ活性を維持している。
Johansen等(WO2005/032581,2003年10月7日)は、場合により充填剤(選択的にはPEG)と組み合わされた、VII因子活性ドメインにカップリングされた脂質膜結合ドメインからなるハイブリッド分子を教示している。
Maun等 Protein Sci.(2005)14:1171〜80は、FVII
コンフォメーションを、活性なTF*FVIIa様の状態に固定するために、新しいジスルフィド結合を導入している。アミド分解活性の反応速度論解析により、野生型と比較して、全てのVIIa因子変異体は、単独で、特異的活性を高めることが明らかになり、変異体136:160および138:160について、基質S−2765を用いた場合、最大でそれぞれ670倍および330倍増加した。アミド分解性の分析において、VIIa因子のジスルフィドが固定された変異体は、最大限の活性のために補因子としてTFを必要としなくなった。可溶性TFの存在下で、野生型と比較して、変異体136:160および138:160についてそれぞれ20倍および12倍、活性が強化された。
コンフォメーションを、活性なTF*FVIIa様の状態に固定するために、新しいジスルフィド結合を導入している。アミド分解活性の反応速度論解析により、野生型と比較して、全てのVIIa因子変異体は、単独で、特異的活性を高めることが明らかになり、変異体136:160および138:160について、基質S−2765を用いた場合、最大でそれぞれ670倍および330倍増加した。アミド分解性の分析において、VIIa因子のジスルフィドが固定された変異体は、最大限の活性のために補因子としてTFを必要としなくなった。可溶性TFの存在下で、野生型と比較して、変異体136:160および138:160についてそれぞれ20倍および12倍、活性が強化された。
本発明の目的は、より長い有効半減期を有する改変型ビタミンK依存性ポリペプチド、例えば改変型FVII、および、改変型FVIIaを提供することである。
FVIIは、その他のGlaドメインタンパク質、例えばFIX、FX、プロテインC、プロテインZ、プロトロンビン、GAS6およびプロテインSに関する。より密接に関連するのは、FVII、FIX、FXおよびプロテインCであり、これらは、N末端Glaドメイン、それ続いて2個の上皮増殖因子(EGF)ドメイン、それに続いてトリプシン様セリンプロテアーゼドメインからなる。プロテインZは、類似の構造を有するが、不活性なプロテアーゼドメインである。プロトロンビンは、Glaドメイン、それに続いて、2個のEGFドメインの代わりに2個のクリングルドメイン、それに続いてトリプシン型プロテアーゼドメインからなる。GAS6およびプロテインSは、Glaドメイン、それに続いて4個のEGFドメイン、それに続いて、プロテアーゼドメインの代わりに2個のラミニン−Gドメインからなる。
特筆すべきは、これらの密接に関連した血漿タンパク質の血漿半減期の大きな差である:
FVII:2〜4時間
プロテインC:6〜8時間
FIX:18〜30時間
FX:20〜42時間
プロテインS:24〜58時間
プロトロンビン:41〜72時間。
FVII:2〜4時間
プロテインC:6〜8時間
FIX:18〜30時間
FX:20〜42時間
プロテインS:24〜58時間
プロトロンビン:41〜72時間。
これらのタンパク質の特に密接に関連したサブグループには、FVII、FIX、FX、および、プロテインCが含まれる。
図1では、ヒト由来、および、その他の種由来のFVII、プロテインC、FIXおよびFX間の相同性を比較している。これらの分子は高度に保存されており、最も目立つ差は、活性化ドメイン内にある。FVIIに関して、活性化ペプチドは説明されていない。しかしながら、活性化の際に、FVIIはArg152での切断に加えてArg144でも切断される可能性もある、その場合、保存されたN型糖鎖付加部位を含む8個のアミノ酸からなる推定上の活性化ペプチドの放出が起こる。
それゆえに、本発明は、改変型ビタミンK依存性ポリペプチドを製造する方法に関し、本方法は、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドを改変することを含み、それによって、改変型ビタミンK依存性ポリペプチドが、活性化ペプチドが改変されていない第一のビタミンK依存性ポリペプチドと比較して増加した半減期を有するようになる。
本発明はさらに、このような改変型ビタミンK依存性ポリペプチドを製造する方法に関し、本方法は、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部を付加すること、または、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部を、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部で置換することによって、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドを改変することを含む。
ビタミンK依存性ポリペプチドは、それらの生合成経路において、それらのタンパク質前駆体のグルタミン酸残基の側鎖をカルボキシ化するのにビタミンKを必要とするタンパク質群である。ビタミンK依存性ポリペプチドとしては、これらに限定されないが、VII因子、VIIa因子、IX因子、IXa因子、X因子、Xa因子、II因子(プロトロンビン)、プロテインC、活性化プロテインC、タンパク質S、活性化タンパク質S、GAS6、活性化GAS6、プロテインZ、活性化プロテインZなどが挙げられる。さらに、有用なビタミンK依存性ポリペプチドは、野生型であってもよいし、または、突然変異を含んでいてもよい。糖鎖付加またはその他の翻訳後修飾の程度と位置は、選択された宿主細胞や宿主細胞の環境の性質に応じて様々であってよい。特定のアミノ酸配列について言及する場合、このような配列の翻訳後修飾も本願に包含される。
本願で用いられる「VII/VIIa因子」は、活性化されていない形態(VII因子)、または、活性化された形態(VIIa因子)のいずれか、または、それらの混合物からなる生成物を意味する。上記の定義に含まれる「VII/VIIa因子」としては、天然型のヒトVII/VIIa因子のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。また、わずかに改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質も挙げられ、例えば、上記タンパク質が実質的にVIIa因子活性を保持する範囲でのN末端のアミノ酸の欠失または付加など、改変されたN末端を含むタンパク質である。上記の定義に含まれる「VII因子」としては、個体ごとに存在し、発生する可能性がある天然の対立遺伝子変異も挙げられる。上記の定義に含まれる「VII因子」としてはさらに、FVII/FVIIaの変異体も挙げられる。このような変異体は、野生型配列とは1またはそれ以上のアミノ酸残基が異なっている。このような差の例としては、N末端および/またはC末端の1またはそれ以上のアミノ酸残基(例えば1〜10個のアミノ酸残基)によるトランケーション、または、N末端および/またはC末端での1またはそれ以上の余分な残基の付加、例えばN末端でのメチオニン残基の付加、加えて、保存的アミノ酸置換、すなわち類似の特徴を有するアミノ酸群、例えば(1)小さいア
ミノ酸、(2)酸性アミノ酸、(3)極性アミノ酸、(4)塩基性アミノ酸、(5)疎水性アミノ酸、および、(6)芳香族アミノ酸の範囲内で行われる置換が挙げられる。以下の表に、このような保存的置換の例を示す。
ミノ酸、(2)酸性アミノ酸、(3)極性アミノ酸、(4)塩基性アミノ酸、(5)疎水性アミノ酸、および、(6)芳香族アミノ酸の範囲内で行われる置換が挙げられる。以下の表に、このような保存的置換の例を示す。
第一のビタミンK依存性ポリペプチドは、好ましくは、VII因子、VIIa因子、IX因子、IXa因子、プロテインCおよび活性化されたプロテインCからなる群より選択される。より好ましくは、第一のビタミンK依存性ポリペプチドは、ヒトVII因子、ヒトVIIa因子、ヒトIX因子、ヒトIXa因子、ヒトプロテインCおよびヒト活性化されたプロテインCからなる群より選択される。最も好ましくは、第一のビタミンK依存性ポリペプチドは、ヒトVII因子、または、ヒトVIIa因子である。具体的な実施形態において、第一のビタミンK依存性ポリペプチドは、配列番号3、6および9からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
第二のビタミンK依存性ポリペプチドは、第一のビタミンK依存性ポリペプチドとは異なる。従って、本発明の方法によって得られる改変型ビタミンK依存性ポリペプチドは、第一のビタミンK依存性ポリペプチドに天然に存在しない活性化ペプチドの少なくとも一部を含む。
第二のビタミンK依存性ポリペプチドは、第一のビタミンK依存性ポリペプチドよりも長い血漿半減期を有する。他の実施形態において、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの長さは、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの長さより長い。
好ましくは、第二のビタミンK依存性ポリペプチドは、IX因子、X因子およびプロトロンビンからなる群より選択される。より好ましくは、第二のビタミンK依存性ポリペプチドは、ヒトIX因子、ヒトX因子およびヒトプロトロンビンからなる群より選択される。具体的な実施形態において、第二のビタミンK依存性ポリペプチドは、配列番号9、12および15からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
付加された第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの活性化ペプチドの一部は、好ましくは、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも8個、より好ましくは少なくとも12個、さらにより好ましくは少なくとも15個の連続したアミノ酸からなる。
他の実施形態において、付加された第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部は、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも0.15×N個の連続したアミノ酸からなっていてもよく、ここにおいてNは、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸の総数である)。好ましくは、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部は、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも0.5×N、より好ましくは少なくとも0.75×N、より好ましくは少なくとも0.9×N、最も好ましくは少なくとも0.95×N個の連続したアミノ酸からなる。
他の実施形態において、付加された第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部は、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも(N−x)個の連続したアミノ酸からなり、ここにおいてNは、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸の総数であり、xは7が可能であり、好ましくはxは5であり、より好ましくはxは4であり、より好ましくはxは3であり、さらにより好ましくはxは2である。
また、付加された第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部は、活性化ペプチドの中央部分からなっていてもよく、すなわち、活性化ペプチドの最も端のC末端のアミノ酸、または、最も端のN末端のアミノ酸を含まない。
最も好ましくは、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの完全な活性化ペプチドは、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化の特異性を保持しながら、第一のビタミンK依存性ポリペプチドのアミノ酸配列に付加される。あるいは、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの完全な活性化ペプチドの変異体を、第一のビタミンK依存性ポリペプチドのアミノ酸配列に添加してもよい。変異体は、1〜10、好ましくは1〜7、より好ましくは1〜5、最も好ましくは1〜3個のアミノ酸が付加、欠失および/または置換された活性化ペプチドを含む。
酵素原の半減期だけを延長させようとする場合、第一のビタミンK依存性ポリペプチドのN末端およびC末端活性化の切断部位が、変異体の活性化ペプチド中に保持されることが好ましい。さらにビタミンK依存性ポリペプチドの活性化された形態の半減期も延長させようとする場合、第一のビタミンK依存性ポリペプチドのN末端またはC末端いずれかの活性化の切断部位が欠失していればよい。好ましくは、N末端活性化の切断部位が欠失している。FVIIaの半減期を延長させようとする場合、N末端活性化の切断部位を選択的に欠失させればよく、それに対して、C末端活性化の切断部位を選択的に保持させればよい。
本明細書で用いられる用語「活性化ペプチド」は、既知の活性化ペプチド、および、推定上の活性化ペプチドを含み、例えばVII因子中の活性化ペプチドである。
非限定的な例を挙げれば、以下のアミノ酸配列のいずれか一つを、配列番号3または6のアミノ酸配列に付加することができる:
配列番号18のアミノ酸1〜35;
配列番号18のアミノ酸1〜34;
配列番号18のアミノ酸1〜33;
[……]
配列番号18のアミノ酸1〜8;
配列番号18のアミノ酸1〜7;
配列番号18のアミノ酸1〜6;
配列番号18のアミノ酸1〜5;
配列番号18のアミノ酸2〜35;
配列番号18のアミノ酸2〜34;
配列番号18のアミノ酸2〜33;
[……]
配列番号18のアミノ酸2〜9;
配列番号18のアミノ酸2〜8;
配列番号18のアミノ酸2〜7;
配列番号18のアミノ酸2〜6;
配列番号18のアミノ酸3〜35;
配列番号18のアミノ酸3〜34;
配列番号18のアミノ酸3〜33;
[……]
配列番号18のアミノ酸3〜10;
配列番号18のアミノ酸3〜9;
配列番号18のアミノ酸3〜8;
配列番号18のアミノ酸3〜7;
など。
配列番号18のアミノ酸1〜35;
配列番号18のアミノ酸1〜34;
配列番号18のアミノ酸1〜33;
[……]
配列番号18のアミノ酸1〜8;
配列番号18のアミノ酸1〜7;
配列番号18のアミノ酸1〜6;
配列番号18のアミノ酸1〜5;
配列番号18のアミノ酸2〜35;
配列番号18のアミノ酸2〜34;
配列番号18のアミノ酸2〜33;
[……]
配列番号18のアミノ酸2〜9;
配列番号18のアミノ酸2〜8;
配列番号18のアミノ酸2〜7;
配列番号18のアミノ酸2〜6;
配列番号18のアミノ酸3〜35;
配列番号18のアミノ酸3〜34;
配列番号18のアミノ酸3〜33;
[……]
配列番号18のアミノ酸3〜10;
配列番号18のアミノ酸3〜9;
配列番号18のアミノ酸3〜8;
配列番号18のアミノ酸3〜7;
など。
非限定的な例を挙げれば、以下のアミノ酸配列のいずれか一つを、配列番号3、6または9のアミノ酸配列に付加することができる:
配列番号19のアミノ酸1〜52;
配列番号19のアミノ酸1〜51;
配列番号19のアミノ酸1〜50;
[……]
配列番号19のアミノ酸1〜8;
配列番号19のアミノ酸1〜7;
配列番号19のアミノ酸1〜6;
配列番号19のアミノ酸1〜5;
配列番号19のアミノ酸2〜52;
配列番号19のアミノ酸2〜51;
配列番号19のアミノ酸2〜50;
[……]
配列番号19のアミノ酸2〜9;
配列番号19のアミノ酸2〜8;
配列番号19のアミノ酸2〜7;
配列番号19のアミノ酸2〜6;
配列番号19のアミノ酸3〜52;
配列番号19のアミノ酸3〜51;
配列番号19のアミノ酸3〜50;
[……]
配列番号19のアミノ酸3〜10;
配列番号19のアミノ酸3〜9;
配列番号19のアミノ酸3〜8;
配列番号19のアミノ酸3〜7;
など。
配列番号19のアミノ酸1〜52;
配列番号19のアミノ酸1〜51;
配列番号19のアミノ酸1〜50;
[……]
配列番号19のアミノ酸1〜8;
配列番号19のアミノ酸1〜7;
配列番号19のアミノ酸1〜6;
配列番号19のアミノ酸1〜5;
配列番号19のアミノ酸2〜52;
配列番号19のアミノ酸2〜51;
配列番号19のアミノ酸2〜50;
[……]
配列番号19のアミノ酸2〜9;
配列番号19のアミノ酸2〜8;
配列番号19のアミノ酸2〜7;
配列番号19のアミノ酸2〜6;
配列番号19のアミノ酸3〜52;
配列番号19のアミノ酸3〜51;
配列番号19のアミノ酸3〜50;
[……]
配列番号19のアミノ酸3〜10;
配列番号19のアミノ酸3〜9;
配列番号19のアミノ酸3〜8;
配列番号19のアミノ酸3〜7;
など。
第二のビタミンK依存性ポリペプチドの部分的または完全な活性化ペプチドは、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチド領域の近くに挿入される。これは、第一のビタミンK依存性ポリペプチドのアミノ酸を欠失させないで、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの2個のアミノ酸の間に挿入されてもよい。例えば、FVIIが第一のビタミンK依存性ポリペプチドの場合、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの部分的または完全な活性化ペプチドは、アミノ酸144と145との間、アミノ酸145と146との間、アミノ酸146と147との間、アミノ酸147と148との間、アミノ酸148と149との間、アミノ酸149と150との間、アミノ酸150と151との間、アミノ酸151と152との間、または、アミノ酸152と153との間に挿入されてもよい(番号付けは配列番号3を参考にしている)。好ましくは、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの部分的または完全な活性化ペプチドは、アミノ酸144と145との間に挿入される(番号付けは、配列番号3を参考にしている)。好ましくは、上記挿入によっても、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化のC末端の切断部位と特異性は保存される。N末端の切断部位は、上記挿入によって欠失させてもよい。
その他の形態において、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの部分的または完全な活性化ペプチドは、第一のビタミンK依存性ポリペプチド中のアミノ酸の伸張を置換する。例えば、FVIIが第一のビタミンK依存性ポリペプチドの場合、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの部分的または完全な活性化ペプチドは、配列番号3のアミノ酸140〜152が置換されていてもよい。好ましくは、上記置換によっても、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化のC末端の切断部位と特異性は保存される。N末端の切断部位は、上記置換によって欠失させてもよい。
N末端の切断部位は、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの所定のアミノ酸を、第二
のビタミンK依存性ポリペプチドの部分的または完全な活性化ペプチドで置換することによって、欠失させてもよい。従って、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの部分的または完全な活性化ペプチドは、以下の配列番号3のアミノ酸配列のいずれか一つを置換していてもよい:
アミノ酸140〜145;
アミノ酸141〜145;
アミノ酸142〜145;
アミノ酸143〜145;
アミノ酸144〜145;
アミノ酸145;
アミノ酸140〜144;
アミノ酸141〜144;
アミノ酸142〜144;
アミノ酸143〜144;または
アミノ酸144。
のビタミンK依存性ポリペプチドの部分的または完全な活性化ペプチドで置換することによって、欠失させてもよい。従って、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの部分的または完全な活性化ペプチドは、以下の配列番号3のアミノ酸配列のいずれか一つを置換していてもよい:
アミノ酸140〜145;
アミノ酸141〜145;
アミノ酸142〜145;
アミノ酸143〜145;
アミノ酸144〜145;
アミノ酸145;
アミノ酸140〜144;
アミノ酸141〜144;
アミノ酸142〜144;
アミノ酸143〜144;または
アミノ酸144。
他の実施形態において、第一のビタミンK依存性ポリペプチド中のタンパク質分解による切断部位は、活性化ペプチド領域に対してN末端およびC末端であり、これらは改変中に保持される。従って、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化の特異性は保持される。
他の実施形態において、酵素原の血漿中半減期を延長させようとする場合、第二のビタミンK依存性ポリペプチドのN末端およびC末端活性化の切断部位が、第一のビタミンK依存性ポリペプチドのN末端およびC末端活性化の切断部位を置換するか、または、N末端活性化の切断部位は、第一のビタミンK依存性ポリペプチドから保持されていてもよく、さらに、C末端活性化の切断部位は、第二のビタミンK依存性ポリペプチドから保持されていてもよい(逆もまた同様)。活性化されたビタミンK依存性ポリペプチドの血漿中半減期を安定化しようとする場合、N末端またはC末端活性化の切断部位のいずれかが欠失していればよい。安定化されたFVIIa変異体の場合、活性化ペプチドは、N末端の軽鎖と共に保持されなければならない。これは、C末端活性化の切断部位は保持され、それに対して、ビタミンK依存性ポリペプチドから移動させたN末端活性化の切断部位は欠失させなければならない、ということを伴う。また、これは、Arg144で仮定の活性化ペプチドの切断部位を欠失させるのにも必要な場合がある。
改変は、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチド、または、それらの変異体の挿入に加えて、それに付随する第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部の欠失をさらに含んでいてもよく、同時に、選択的に第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化の特異性を保持する。欠失させる部分は、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも2個、好ましくは少なくとも4個、より好ましくは少なくとも6個、さらにより好ましくは少なくとも8個の連続したアミノ酸からなっていてもよい。
他の実施形態において、欠失させた第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部は、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも0.15×N個の連続したアミノ酸からなっていてもよく、ここにおいてNは、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸の総数である)。好ましくは、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部は、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも0.5×N、より好ましくは少なくとも0.75×N、より好ましくは少なくとも0.9×N、最も好ましくは少なくとも0.95×N個の連続したアミノ酸からなる。
他の実施形態において、欠失させた第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部は、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも(N−x)個の連続したアミノ酸からなり、ここにおいてNは、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸の総数であり、xは7が可能であり、好ましくはxは5であり、より好ましくはxは4であり、より好ましくはxは3であり、さらにより好ましくはxは2である。
欠失させた第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部は、活性化ペプチドの中央部分からなっていてもよく、すなわち、活性化ペプチドの最も端のC末端のアミノ酸、または、最も端のN末端のアミノ酸を含まない。
具体的な実施形態において、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの完全な活性化ペプチドは、欠失している。
通常、改変は、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部を、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部で置換することを含む。第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部、および、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部の好ましい実施形態は、上述したものに相当する。
具体的な実施形態において、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの完全な活性化ペプチドは、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化の特異性を保持するのに必要なアミノ酸を保持しながら、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの完全な活性化ペプチド、または、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの完全な活性化ペプチドの変異体で置換されている。
非限定的な例を挙げれば、本発明は、例えばマウス、イヌ、ウシ、ブタまたはげっ歯類のプロトロンビン因子のような、動物のビタミンK依存性ポリペプチド由来の活性化ペプチド配列(図1に、そのうちいくつかを示す)、加えてそれらの組み合わせの導入を包含する。
非限定的な例を挙げれば、本発明は、FVIIの活性化部位の近傍に、FIXまたはFXの活性化ペプチドを導入すること、同様に、プロテインCの活性化ペプチドをFIXまたはFXの活性化ペプチドで置換すること、同様に、FIXの活性化ペプチドをFXの活性化ペプチドで置換することを包含する。本発明のこれらの好ましいFVII分子を用いた広範な形態を説明すれば、単に、8個のアミノ酸からなる推定上の活性化ペプチドを、プロテインC、FIXまたはFXから採取した活性化ペプチドのいずれか1つで完全に置換すること、または、1個のアミノ末端近傍のアミノ酸ないし完全な推定上のFVIIの活性化ペプチドに、プロテインC、FIXまたはFXから採取した活性化ペプチドを付加して、ハイブリッド活性化ペプチドを作成することによって、FVIIの半減期は増加する。
本発明のその他の形態は、これらの移動させた活性化ペプチドの翻訳後修飾の変形形態であり、例えば、非限定的な例を挙げれば、移動させた活性化ペプチド中のN型糖鎖付加部位の除去、またあるいは、FVIIのArg144〜Arg152からなる推定上の活性化ペプチド中のN型糖鎖付加部位の除去によって、アシアロタンパク質受容体が介在する凝固因子の除去を少なくすることができる。それゆえに、本発明の一実施形態において、改変は、活性化ペプチド中の翻訳後修飾部位を改変することを含む。好ましくは、改変は、活性化ペプチド中の少なくとも1個のN型糖鎖付加部位を除去することを含む。
本発明のその他の形態は、より寿命が長いビタミンK依存性タンパク質の活性化ペプチドの類似体を移動させることによる、血漿中半減期の延長である。類似体とは、その最も広義の意味で、より長い寿命の野生型ビタミンK依存性タンパク質の活性化ペプチドの8個よりも長い連続したアミノ酸を有する挿入物であるか、または、より長い寿命の野生型ビタミンK依存性タンパク質の活性化ペプチドのこれらアミノ酸の保存的置換を有する挿入物であり、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの酵素原の半減期を延長させようとする場合、そのN末端及びそのC末端活性化の切断部位を保存したもの、または、活性化されたビタミンK依存性ポリペプチドの半減期も延長させようとする場合、そのN末端またはそのC末端活性化の切断部位のどちらかを保存したものである。
保存的アミノ酸置換は、類似の特徴を有するアミノ酸群、例えば(1)小さいアミノ酸、(2)酸性アミノ酸、(3)極性アミノ酸、(4)塩基性アミノ酸、(5)疎水性アミノ酸および(6)芳香族アミノ酸の範囲内で行われる置換である。表2に、このような保存的置換の例を示す。
本発明のその他の形態は、ビタミンK依存性ポリペプチドの安定性を高める方法であって、本方法は、その活性化ペプチドを改変することを含む。本発明のさらにその他の形態は、ビタミンK依存性ポリペプチドの有効半減期または血漿中半減期を高める方法であって、本方法は、その活性化ペプチドを改変することを含む。これらの方法は、上述の改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの製造方法と同じ工程を含んでいてもよい。
本発明はさらに、本発明の方法で得ることができる改変型ビタミンK依存性ポリペプチドに関する。改変型ビタミンK依存性ポリペプチドは、改変された活性化ペプチドを含んでいてもよく、ここにおいて、改変型ビタミンK依存性ポリペプチドは、活性化ペプチドが改変されていないビタミンK依存性ポリペプチドと比較して増加した半減期を有する。
本発明のその他の形態は、改変された活性化ペプチドを含む改変型ビタミンK依存性ポリペプチドであり、前記改変された活性化ペプチドは、異なるビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部を含む。あるいは、改変型ビタミンK依存性ポリペプチドは、異なるビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの類似体または変異体を含んでいてもよい。類似体および変異体は、上記で定義された分子である。
好ましくは、上記ビタミンK依存性ポリペプチドは、上記で定義された第一のビタミンK依存性ポリペプチドである。「異なるビタミンK依存性ポリペプチド」は、上記で定義された第二のビタミンK依存性ポリペプチドである。本発明の改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの好ましい実施形態は、上記で本発明の方法に関して説明された好ましい実施形態に対応する。
他の実施形態において、本発明の改変型ビタミンK依存性ポリペプチドは、ビタミンK依存性ポリペプチドの未改変型および/または野生型と比較して、増加した有効半減期を示す。有効半減期は、Lindley等(Pharmacokinetics and pharmacodynamics of recombinant Factor VIIa,Clin.Pharmacol Ther.1994 55:638〜648)で示されるようにしてインビトロで測定することができる。
有効半減期は、通常、ビタミンK依存性ポリペプチドの未改変型および/または野生型と比較して、少なくとも50%、好ましくは少なくとも100%、より好ましくは少なくとも200%、さらにより好ましくは少なくとも500%増加する。
ヒトVII因子の野生型の有効半減期は、約4時間である。本発明の改変されたVII因子分
子の有効半減期は、通常、少なくとも約6時間、好ましくは少なくとも約10時間、より好ましくは少なくとも約15時間、最も好ましくは少なくとも約24時間である。
子の有効半減期は、通常、少なくとも約6時間、好ましくは少なくとも約10時間、より好ましくは少なくとも約15時間、最も好ましくは少なくとも約24時間である。
ヒトVIIa因子の野生型の有効半減期は、約2時間である。本発明の改変されたVIIa因子分子の有効半減期は、通常、少なくとも約3時間、好ましくは少なくとも約5時間、より好ましくは少なくとも約8時間、最も好ましくは少なくとも約12時間である。
一般的に、上記改変型ビタミンK依存性ポリペプチドは、未改変型と比較して、および/または、ビタミンK依存性ポリペプチドの野生型と比較して、高い安定性を有する。改変されたVII因子分子の安定性の増加は、例えば、これまで機能分析で説明されているようにして測定することができる。
本発明の改変型ビタミンK依存性ポリペプチドは、通常、それに対応するビタミンK依存性ポリペプチドの野生型および/または未改変型と実質的に同じ活性を有する。「実質的に同じ」活性は、それに対応するビタミンK依存性ポリペプチドの野生型および/または未改変型の活性の、少なくとも約10%、好ましくは約50%、より好ましくは少なくとも約75%、最も好ましくは少なくとも約100%を意味する。VII/VIIa因子の活性は、基質であるX因子を、活性なXa因子に変換する能力である。VII/VIIa因子ポリペプチドの活性は、Shaw等,1998,PNAS,第95巻,4229〜4234頁、または、Gabriel等,2004,Sem.Hematol.第41巻,Suppl.1,20〜24頁で説明されている分析を用いて測定することもできる。
本発明はさらに、本願で説明されている改変型ビタミンK依存性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。用語「ポリヌクレオチド」は、一般的に、あらゆるポリリボヌクレオチド、または、ポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、改変されていないRNAまたはDNA、または、改変されたRNAまたはDNAであり得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖DNAでもよいし、一本鎖または二本鎖RNAでもよい。本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、1またはそれ以上の修飾塩基および/または通常ではない塩基(例えばイノシン)を含むDNAまたはRNAも含む。当然のことながら、当業者既知の多くの有用な目的に役立つ多種多様な改変をDNAおよびRNAに施してもよい。本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、このような化学的、酵素的または代謝的に改変されたポリヌクレオチドの形態、同様に、ウイルスおよび細胞(例えば単細胞および複雑型細胞など)に特徴的なDNAおよびRNAの化学的な形態を包含する。
当業者であれば当然と思われるが、遺伝子コードの縮重により、所定のポリペプチドは、異なるポリヌクレオチドによってコードされている場合もある。これらの「変異体」も本発明に包含される。
好ましくは、 本発明のポリヌクレオチド は、単離されたポリヌクレオチドである。用語「単離された」ポリヌクレオチドは、その他の核酸配列、例えば、これらに限定されないが、その他の染色体のDNAおよびRNA、ならびに、 染色体外のDNAおよびRNAを実質的に含まないポリヌクレオチドを意味する。単離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞から精製してもよい。当業者既知の従来の核酸精製方法を用いて、単離されたポリヌクレオチドを得てもよい。このような用語は、組換えポリヌクレオチド、および、 化学合成されたポリヌクレオチドも含む。
本発明のさらにその他の形態は、本発明に係るポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはベクターである。好ましくは、上記プラスミドまたはベクターは、発現ベクターである。具体的な実施形態において、上記ベクターは、ヒト遺伝子治療に使用するためのトラン
スファーベクターである。
スファーベクターである。
本発明のさらにその他の形態は、本発明のポリヌクレオチド、または、本発明のプラスミドまたはベクターを含む宿主細胞である。
本発明の宿主細胞は、改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの製造方法で用いてもよく、本発明の一部を構成する。本方法は、以下を含む:
(a)改変型ビタミンK依存性ポリペプチドが発現されるような条件下で本発明の宿主細胞を培養すること;および、
(b)場合により、該宿主細胞または培地から改変型ビタミンK依存性ポリペプチドを回収すること。
(a)改変型ビタミンK依存性ポリペプチドが発現されるような条件下で本発明の宿主細胞を培養すること;および、
(b)場合により、該宿主細胞または培地から改変型ビタミンK依存性ポリペプチドを回収すること。
上述した変異体の発現:
適切な宿主細胞中での組換えタンパク質の大量生産は、当業者既知の方法に従って、上述の改変されたcDNAを、様々な発現系で増殖が可能な組換え発現ベクター中に、適切な調節因子と共に効率的な転写単位に構築することを必要とする。効率的な転写調節因子は、それらの天然の宿主と同様の動物細胞を有するウイルス、または、動物細胞の染色体DNAから誘導することができる。好ましくは、シミアンウイルス40、アデノウイルス、BKポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、または、ラウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピートから誘導されたプロモーター−エンハンサーの組み合わせ、または、ベータ−アクチンまたはGRP78のような動物細胞中で強く構成的に転写された遺伝子を含むプロモーター−エンハンサーの組み合わせを用いることができる。cDNAから転写されたmRNAの安定した高レベルを達成するためには、転写単位は、その3’近位部分に、転写終結のためのポリアデニル化配列をコードするDNA領域を含むべきである。好ましくは、この配列は、シミアンウイルス40初期転写領域、ウサギベータ−グロビン遺伝子、または、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子遺伝子から誘導される。
適切な宿主細胞中での組換えタンパク質の大量生産は、当業者既知の方法に従って、上述の改変されたcDNAを、様々な発現系で増殖が可能な組換え発現ベクター中に、適切な調節因子と共に効率的な転写単位に構築することを必要とする。効率的な転写調節因子は、それらの天然の宿主と同様の動物細胞を有するウイルス、または、動物細胞の染色体DNAから誘導することができる。好ましくは、シミアンウイルス40、アデノウイルス、BKポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、または、ラウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピートから誘導されたプロモーター−エンハンサーの組み合わせ、または、ベータ−アクチンまたはGRP78のような動物細胞中で強く構成的に転写された遺伝子を含むプロモーター−エンハンサーの組み合わせを用いることができる。cDNAから転写されたmRNAの安定した高レベルを達成するためには、転写単位は、その3’近位部分に、転写終結のためのポリアデニル化配列をコードするDNA領域を含むべきである。好ましくは、この配列は、シミアンウイルス40初期転写領域、ウサギベータ−グロビン遺伝子、または、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子遺伝子から誘導される。
次に、cDNAは、ハイブリッドの改変されたGlaドメインタンパク質、好ましくはFIX、FX、プロテインC、最も好ましくはVII因子タンパク質を発現させるための適切な宿主細胞系のゲノムに統合される。好ましくは、正しいフォールディング、Glaドメイン合成、ジスルフィド結合結合形成、アスパラギン結合型の糖鎖付加、O結合型の糖鎖付加、および、その他の翻訳後修飾、同様に、培地への分泌を確実にするために、この細胞系は脊椎動物由来の動物細胞系と予想される。その他の翻訳後修飾の例は、新生ポリペプチド鎖のチロシンのO−硫酸化、水酸化、および、タンパク質分解プロセシングである。使用可能な細胞系の例は、サルCOS細胞、マウスL細胞、マウスC127細胞、ハムスターBHK−21細胞、ヒト胎児腎臓293細胞であり、選択的にはハムスターCHO細胞である。
対応するcDNAをコードする組換え発現ベクターは、数種の様々な方法で、動物細胞系に導入することができる。例えば、組換え発現ベクターは、異なる動物ウイルスをベースとしたベクターから作製することができる。これらの例は、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、および、好ましくはウシパピローマウイルスをベースとしたベクターである。
また、それらのゲノムに組換えDNAが統合された特定の細胞クローンの単離を容易にするために、対応するDNAをコードする転写単位は、これらの細胞中で優勢な選択マーカーとして機能する可能性があるその他の組換え遺伝子と共に動物細胞に導入することもできる。このタイプの優勢な選択マーカー遺伝子の例は、Tn5アミノ配糖体ホスホトランスフェラーゼ(ゲネチシン(G418)耐性を付与する)、ハイグロマイシン ホスホトランスフェラーゼ(ハイグロマイシン耐性を付与する)、および、ピューロマイシンア
セチルトランスフェラーゼ(ピューロマイシン耐性を付与する)である。このような選択マーカーをコードする組換え発現ベクターは、望ましいタンパク質のcDNAをコードするベクターと同じベクターに含ませてもよいし、または、同時に導入されて宿主細胞のゲノムに統合される別個のベクターにコードされてもよい(これは、異なる転写単位間で堅い物理的な連結を形成することが多い)。
セチルトランスフェラーゼ(ピューロマイシン耐性を付与する)である。このような選択マーカーをコードする組換え発現ベクターは、望ましいタンパク質のcDNAをコードするベクターと同じベクターに含ませてもよいし、または、同時に導入されて宿主細胞のゲノムに統合される別個のベクターにコードされてもよい(これは、異なる転写単位間で堅い物理的な連結を形成することが多い)。
望ましいタンパク質のcDNAと共に用いることができるその他のタイプの選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)をコードする様々な転写単位をベースとしたものである。このタイプの遺伝子を内因性dhfr活性が失われた細胞、選択的にはCHO細胞(DUKX−B11、DG−44)に導入した後、ヌクレオシドを含まない培地中でこれらを増殖させることが可能になると予想される。このような培地の例は、ヒポキサンチン、チミジンおよびグリシンを含まないハムF12である。これらのdhfr遺伝子は、凝固因子のcDNA転写単位と共に、同じベクターまたは異なるベクターのいずれかに連結させて上記のタイプのCHO細胞に導入することができるため、組換えタンパク質を生産するdhfr陽性細胞系を作製することができる。
上記の細胞系を細胞毒性のdhfr阻害剤であるメトトレキセートの存在下で増殖させる場合、メトトレキセート耐性の新しい細胞系が出現すると予想される。これらの細胞系は、連結されたdhfrと望ましいタンパク質の転写単位の数が増幅されているために、組換えタンパク質を高速で生産する可能性がある。高濃度のメトトレキセート(1〜10000nM)中でこれらの細胞系を増殖させると、極めて高速で望ましいタンパク質を生産する新しい細胞系を得ることができる。
上記の望ましいタンパク質を生産する細胞系は、懸濁培養、または、様々な固体支持体のいずれかでラージスケールで増殖させることができる。これらの支持体の例は、デキストランまたはコラーゲンマトリックスをベースとしたマイクロキャリアー、または、中空糸の形態の固体支持体、または、 様々なセラミック材料である。細胞懸濁培養またはマイクロキャリアーで増殖させる場合、上記の細胞系培養は、槽培養として、または、長期間にわたり調整培地の連続的な供給を伴う潅流培養のどちらかとして行うことができる。従って、 本発明によれば、上記の細胞系 は、望ましい組換えタンパク質の生産のための工業的プロセスの開発によく適している。
上記のタイプの分泌細胞の培地中に蓄積する組換えタンパク質は、濃縮し、多種多様な生化学的な方法やクロマトグラフィー法によって精製することができ、例えば、細胞培地中での望ましいタンパク質とその他の物質との、大きさ、電荷、疎水性、溶解性、特異的な親和性などの差を利用する方法が挙げられる。
このような精製の例は、固体支持体に固定したモノクローナル抗体へ組換えタンパク質を吸着させることである。脱離させた後、タンパク質を、上記の特性に基づいて多種多様なクロマトグラフィー技術によってさらに精製してもよい。
本発明の改変型ビタミンK依存性ポリペプチドは、純度80%以上、より好ましくは純度95%以上に精製することが好ましく、具体的には、汚染高分子、具体的にはその他のタンパク質や核酸に関して純度が99.9%より大きい製薬的に純粋な状態であり、さらに感染性の物質や発熱性の物質を含まないことが好ましい。好ましくは、単離された、または、精製された本発明の改変型ビタミンK依存性ポリペプチドは、その他のポリペプチドを実質的に含まない。
本発明で説明される組換えタンパク質は、治療用途に応じた医薬配合物に製剤化することができる。精製したタンパク質は、従来の生理学的に適合する水性の緩衝溶液に溶解さ
せてもよく、そこに場合により、医薬配合物を提供するための製薬用賦形剤を添加してもよい。
せてもよく、そこに場合により、医薬配合物を提供するための製薬用賦形剤を添加してもよい。
本発明の様々な生成物が、医薬品として有用である。従って、本発明は、本明細書で説明されているような改変型ビタミンK依存性ポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、または、本発明のプラスミドまたはベクターを含む医薬組成物に関する。
また、本発明の改変されたDNAは、ヒト遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターに統合されてもよい。
本発明のその他の形態は、血液凝固障害を治療または予防する医薬品を製造するための、本明細書で説明されているような改変型ビタミンK依存性ポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のプラスミドまたはベクター、または、本発明の宿主細胞の使用である。血液凝固障害としては、これらに限定されないが、血友病Aが挙げられる。好ましくは、上記治療は、ヒト遺伝子治療を含む。
本発明はまた、血液凝固障害(例えば血友病A)に罹った個体を治療する方法に関する。本方法は、前記個体に、本明細書で説明されているような改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの有効量を投与することを含む。他の実施形態において、本方法は、前記個体に、本発明のポリヌクレオチド、または、本発明のプラスミドまたはベクターの有効量を投与することを含む。あるいは、本方法は、前記個体に、本明細書で説明されている本発明の宿主細胞の有効量を投与することを含んでいてもよい。
図面の説明:
図1:ヒト由来、および、その他の種の、FVII、プロテインC、FIXおよびFX間の相同性の比較である。
図2:寿命が長いビタミンK依存性ポリペプチドから挿入された活性化ペプチドを含むFVII変異体の薬物動態である。
図1:ヒト由来、および、その他の種の、FVII、プロテインC、FIXおよびFX間の相同性の比較である。
図2:寿命が長いビタミンK依存性ポリペプチドから挿入された活性化ペプチドを含むFVII変異体の薬物動態である。
さらに、以下に記載のそれらの実施例で本発明をより詳細に説明する。この本発明の具体的な実施形態の説明は、添付の図とあわせて作製されたものとする。
実施例1:VII因子コード配列へのIX因子の活性化ペプチド配列の挿入
この実施例において、FIX活性化ペプチドの大半が、FVII活性化部位を保存しつつFVIIのcDNA中のそれぞれの位置に挿入される。まず、クローニングベクターpIRESpuro3(ベクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson);pFVII−538wtと命名されたプラスミド)に挿入されたFVIIのcDNAを、アミノ酸Ala146とSer147(番号付けは、配列番号3を参考にした)との間に制限部位NheIを導入することによって外来の活性化ペプチド配列を挿入するために製造した。市販の変異誘発キット(例えばストラタジーン(Stratagene)のクイックチェンジ(QuickChange)部位特異的変異誘発キット)を製造元の説明書に従って用いて、部位特異的変異誘発を行った。変異誘発に用いられたプライマーを以下に列挙する;突然変異誘発性の塩基は太字で示す。
この実施例において、FIX活性化ペプチドの大半が、FVII活性化部位を保存しつつFVIIのcDNA中のそれぞれの位置に挿入される。まず、クローニングベクターpIRESpuro3(ベクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson);pFVII−538wtと命名されたプラスミド)に挿入されたFVIIのcDNAを、アミノ酸Ala146とSer147(番号付けは、配列番号3を参考にした)との間に制限部位NheIを導入することによって外来の活性化ペプチド配列を挿入するために製造した。市販の変異誘発キット(例えばストラタジーン(Stratagene)のクイックチェンジ(QuickChange)部位特異的変異誘発キット)を製造元の説明書に従って用いて、部位特異的変異誘発を行った。変異誘発に用いられたプライマーを以下に列挙する;突然変異誘発性の塩基は太字で示す。
得られたプラスミドを、pFVII−NheI186と命名した。
次に、FIX活性化ペプチドのアミノ酸165〜194(番号付けは、配列番号9を参考にした)を、以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によってFIXのcDNAコンストラクトで増幅した。
次に、FIX活性化ペプチドのアミノ酸165〜194(番号付けは、配列番号9を参考にした)を、以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によってFIXのcDNAコンストラクトで増幅した。
両方のプライマーに、NheI制限部位(下線で示した)を付加した。増幅産物をNheIで消化し、NheIで消化した上述のpFVII−NheI186にクローニングした。
DNA配列解析で正しい方向であることを確かめた後、2回の変異誘発を行い、NheI部位を天然のFVII/FIX配列に復帰突然変異させた。突然変異誘発プライマーを以下に示す:
FIX挿入物の5’末端でNheI部位を復帰突然変異させるためのプライマー:
FIX挿入物の5’末端でNheI部位を復帰突然変異させるためのプライマー:
得られた発現プラスミドを、pFVII−552と命名した。得られた成熟FVII/FIXキメラタンパク質配列(配列番号29)は、以下に示す通りであり、挿入されたFIXの活性化ペプチド配列は下線で示した。
どのcDNA配列がクローニングに用いられるかによって、キメラタンパク質は、FIX活性化ペプチド RAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQS(配列番号30)の多型のような、FVIIおよびFIXの多型を含む場合もある。
プラスミドpFVII−552に基づいて、FVIIのcDNAとFIXの活性化ペプチド配列との間に異なる転位配列によりその他の発現プラスミドを構築した。そのために、2回の変異誘発を上述のようにしてpFVII−552に施した。第一回目で、配列番号29のアミノ酸145〜147を欠失させ、ここで以下のプライマーを用いた:
得られたプラスミドを、pFVII−681と命名した。得られた成熟FVII/FIXキメラタンパク質配列(配列番号46)は、以下に示す通りであり、挿入されたFIXの活性化ペプチド配列は下線で示した。
実施例2:VII因子コード配列へのX因子の活性化ペプチド配列の挿入
FXの活性化ペプチドを、PCRによってクローニングされたFXのcDNAで以下のプライマーを用いて増幅し、NheI制限部位(下線で示した)を結合させた。
FXの活性化ペプチドを、PCRによってクローニングされたFXのcDNAで以下のプライマーを用いて増幅し、NheI制限部位(下線で示した)を結合させた。
次に、FXの活性化ペプチドを含むPCRフラグメントを、NheIで消化し、NheIで消化したプラスミドpFVII−NheI186(実施例1)にライゲーションした。
それに続く上記で説明されているような2回の部位特異的変異誘発で、FVIIのcDNA
配列とFXの活性化ペプチドとの転位を修正した。
それに続く上記で説明されているような2回の部位特異的変異誘発で、FVIIのcDNA
配列とFXの活性化ペプチドとの転位を修正した。
得られたプラスミドを、pFVII−611と命名した。得られた成熟FVII/FXキメラタンパク質配列(配列番号53)は、以下に示す通りであり、挿入されたFXの活性化ペプチド配列は下線で示した。
実施例3:IX因子のコード配列へのX因子の活性化ペプチド配列の挿入
この実施例において、FXの活性化ペプチドは、FIXの活性化部位を保存しているFIXのcDNA中のそれぞれの位置に挿入された。
まず、2個の制限部位:XbaI部位(アミノ酸Ser161とLys162との間)、および、PinAI部位(Thr192とGln193との間)(番号付けは、配列番号9を参考にした)の導入によって外来の活性化ペプチド配列を挿入するために、クローニングベクターpIRESpuro3(ベクトン・ディッキンソン)中のFIXのcDNAを製造した。部位特異的変異誘発を、市販の変異誘発キット(例えばストラタジーンのクイックチェンジ部位特異的変異誘発キット)を製造元の説明書に従って用いて行った。変異誘発に用いられたプライマーを以下に列挙する;突然変異誘発性の塩基は太字で示す。
この実施例において、FXの活性化ペプチドは、FIXの活性化部位を保存しているFIXのcDNA中のそれぞれの位置に挿入された。
まず、2個の制限部位:XbaI部位(アミノ酸Ser161とLys162との間)、および、PinAI部位(Thr192とGln193との間)(番号付けは、配列番号9を参考にした)の導入によって外来の活性化ペプチド配列を挿入するために、クローニングベクターpIRESpuro3(ベクトン・ディッキンソン)中のFIXのcDNAを製造した。部位特異的変異誘発を、市販の変異誘発キット(例えばストラタジーンのクイックチェンジ部位特異的変異誘発キット)を製造元の説明書に従って用いて行った。変異誘発に用いられたプライマーを以下に列挙する;突然変異誘発性の塩基は太字で示す。
次に、FXの活性化ペプチドのアミノ酸159〜213(番号付けは、配列番号12を参考にした)を、ポリメラーゼ連鎖反応によって、以下のプライマーを5’末端のXbaIおよび3’末端のPinAI部位に付加して用いて増幅した(下線で示した)。
増幅産物をXbaIとPinAIで消化し、上述のようにして改変されたXbaIとPinAIで消化したFIXのcDNAにクローニングした。その後、2回の変異誘発を行い、XbaIおよびPinAI部位を天然のFIXおよびFX配列に復帰突然変異させた。突然変異誘発プライマーを以下に示す:
FX挿入物の5’末端で、XbaI部位を復帰突然変異させるためのプライマー:
FX挿入物の5’末端で、XbaI部位を復帰突然変異させるためのプライマー:
実施例4:改変型FVIIおよびFIXタンパク質のトランスフェクションおよび発現
発現プラスミドをE.coli TOP10(インビトロジェン(Invitrogen))中で増殖させ、標準的なプロトコールを用いて(キアゲン(Qiagen))精製した。HEK293細胞(インビトロジェン)をリポフェクトアミン2000試薬(インビトロジェン)を用いてトランスフェクションし、無血清培地(インビトロジェン293エクスプレス(Invitrogen 293 Express))中で、50ng/mlの
ビタミンK3、および、4μg/mlのピューロマイシンの存在下で増殖させた。トランスフェクションされた細胞群をT−フラスコを介してローラーボトルに拡散させ、そこから精製のために上清を回収した。
発現プラスミドをE.coli TOP10(インビトロジェン(Invitrogen))中で増殖させ、標準的なプロトコールを用いて(キアゲン(Qiagen))精製した。HEK293細胞(インビトロジェン)をリポフェクトアミン2000試薬(インビトロジェン)を用いてトランスフェクションし、無血清培地(インビトロジェン293エクスプレス(Invitrogen 293 Express))中で、50ng/mlの
ビタミンK3、および、4μg/mlのピューロマイシンの存在下で増殖させた。トランスフェクションされた細胞群をT−フラスコを介してローラーボトルに拡散させ、そこから精製のために上清を回収した。
実施例5:改変型FVIIタンパク質の精製
欧州特許第0770625号で説明されているようにしてFVIIタンパク質を精製した。簡単に言えば、可溶性の組織因子をシアン化臭素によってセファロースビーズに共有結合させた。FVIIを含む細胞培養上清を10mMカルシウム緩衝液に入れた。同じ緩衝液で未結合のタンパク質を洗浄して除いた。結合したFVIIタンパク質の溶出を100mMクエン酸ナトリウム緩衝液を用いて行った。
欧州特許第0770625号で説明されているようにしてFVIIタンパク質を精製した。簡単に言えば、可溶性の組織因子をシアン化臭素によってセファロースビーズに共有結合させた。FVIIを含む細胞培養上清を10mMカルシウム緩衝液に入れた。同じ緩衝液で未結合のタンパク質を洗浄して除いた。結合したFVIIタンパク質の溶出を100mMクエン酸ナトリウム緩衝液を用いて行った。
実施例6:FVII活性および抗原の測定
FVII抗原を、当業者に性能が既知のELISAによって測定した。簡単に言えば、マイクロプレートを、ウェルあたり120μLのキャプチャー抗体(ヒツジ抗ヒトFVII IgG,セダレーン(Cedarlane)CL20030AP,緩衝液A[シグマ(Sigma)C3041]で1:1000に希釈)と周囲温度で一晩インキュベートした。プレートを緩衝液B(シグマP3563)で3回洗浄した後、各ウェルを、緩衝液C(シグマP3688)200μLと周囲温度で1時間インキュベートした。さらに緩衝液Bで3回洗浄工程を行った後、試験サンプルの緩衝液Bでの連続希釈液、同様に、標準ヒト血漿(デイド・ベーリング(Dade Behring);50〜0.5mU/mL)の緩衝液B(ウェルあたりの体積:100μL)での連続希釈液を、周囲温度で2時間インキュベートした。緩衝液Bでの3回の洗浄工程の後、検出抗体(ヒツジ抗ヒトFVII IgG,セダレーンCL20030K,ペルオキシダーゼで標識された)の緩衝液Bでの1:5000の希釈液100μLを各ウェルに添加し、周囲温度でさらに2時間インキュベートした。緩衝液Bでの3回の洗浄工程の後、基質溶液(TMB,デイド・ベーリング,OUVF)をウェルあたり100μLで添加し、暗所で周囲温度で30分間インキュベートした。希釈していない停止溶液(デイド・ベーリング,OSFA)100μLを添加して、適切なマイクロプレートリーダーで波長450nmで読み取るためのサンプルを製造した。次に、参照として標準ヒト血漿を用いた標準曲線を用いて、試験サンプルの濃度を計算した。
FVII抗原を、当業者に性能が既知のELISAによって測定した。簡単に言えば、マイクロプレートを、ウェルあたり120μLのキャプチャー抗体(ヒツジ抗ヒトFVII IgG,セダレーン(Cedarlane)CL20030AP,緩衝液A[シグマ(Sigma)C3041]で1:1000に希釈)と周囲温度で一晩インキュベートした。プレートを緩衝液B(シグマP3563)で3回洗浄した後、各ウェルを、緩衝液C(シグマP3688)200μLと周囲温度で1時間インキュベートした。さらに緩衝液Bで3回洗浄工程を行った後、試験サンプルの緩衝液Bでの連続希釈液、同様に、標準ヒト血漿(デイド・ベーリング(Dade Behring);50〜0.5mU/mL)の緩衝液B(ウェルあたりの体積:100μL)での連続希釈液を、周囲温度で2時間インキュベートした。緩衝液Bでの3回の洗浄工程の後、検出抗体(ヒツジ抗ヒトFVII IgG,セダレーンCL20030K,ペルオキシダーゼで標識された)の緩衝液Bでの1:5000の希釈液100μLを各ウェルに添加し、周囲温度でさらに2時間インキュベートした。緩衝液Bでの3回の洗浄工程の後、基質溶液(TMB,デイド・ベーリング,OUVF)をウェルあたり100μLで添加し、暗所で周囲温度で30分間インキュベートした。希釈していない停止溶液(デイド・ベーリング,OSFA)100μLを添加して、適切なマイクロプレートリーダーで波長450nmで読み取るためのサンプルを製造した。次に、参照として標準ヒト血漿を用いた標準曲線を用いて、試験サンプルの濃度を計算した。
実施例7:改変型FVIIタンパク質の薬物動態
麻酔したCD/ルイスラット(物質あたりラット6匹)に、野生型および改変型FVIIタンパク質を100μg/kg体重の用量で静脈内投与した。試験物質の投与後、5、30、60、120および480分間で3匹のラットから、さらに、15、45、90、および、240分間で残りの3匹のラットから、血液サンプルを頚動脈から採取した。その後、ヒトVII因子に特異的なELISA分析(上記参照)によって、FVII抗原の含量を定量した。図2に、各群の平均FVII抗原濃度を示す。表5は、排除のアルファおよびベータ相に関して計算された半減期を要約したものであり、これから、アルファ相が5〜30分間、ベータ相が30分間〜抗原分析の検出限界を超える濃度の最後のタイムポイントと定義された。計算は、式T1/2=ln2/k(式中、kは、回帰線の傾きである)に従ってなされた。
麻酔したCD/ルイスラット(物質あたりラット6匹)に、野生型および改変型FVIIタンパク質を100μg/kg体重の用量で静脈内投与した。試験物質の投与後、5、30、60、120および480分間で3匹のラットから、さらに、15、45、90、および、240分間で残りの3匹のラットから、血液サンプルを頚動脈から採取した。その後、ヒトVII因子に特異的なELISA分析(上記参照)によって、FVII抗原の含量を定量した。図2に、各群の平均FVII抗原濃度を示す。表5は、排除のアルファおよびベータ相に関して計算された半減期を要約したものであり、これから、アルファ相が5〜30分間、ベータ相が30分間〜抗原分析の検出限界を超える濃度の最後のタイムポイントと定義された。計算は、式T1/2=ln2/k(式中、kは、回帰線の傾きである)に従ってなされた。
このデータから明らかに、天然型の推定上のFVIIの活性化ペプチドを、より長い寿命のプロトロンビン因子からの活性化ペプチドで置換することによって、タンパク質のインビボでの半減期が野生型FVIIタンパク質と比較して有意に長くなることが示される。
Claims (42)
- 改変型ビタミンK依存性ポリペプチドを製造する方法であって、該方法は、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドを改変することを含み、それによって、改変型ビタミンK依存性ポリペプチドは、活性化ペプチドが改変されていない第一のビタミンK依存性ポリペプチドと比較して増加した半減期を有するようになる、上記方法。
- 改変は、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部を付加すること、または、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの類似体を付加することを含む、請求項1に記載の方法。
- 第二のビタミンK依存性ポリペプチドの血漿中半減期は、改変されていない第一のビタミンK依存性ポリペプチドの血漿中半減期より大きい、請求項2に記載の方法。
- 改変は、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部を、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部で置換することを含む、請求項2または3に記載の方法。
- 第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの一部は、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも8個の連続したアミノ酸からなる、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 改変は、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化の特異性を保存しながら、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの完全な活性化ペプチドを、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの完全な活性化ペプチドで置換することを含む、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 改変は、(i)第一のビタミンK依存性ポリペプチドの軽鎖と活性化ペプチドとの間の切断部位を除去すること、または、(ii)第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドと重鎖との間の切断部位を除去することを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの活性化された形態は、非改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの活性化された形態と比較して増加した血漿中半減期を有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの酵素原の形態は、非改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの酵素原の形態と比較して増加した血漿中半減期を有し、ここにおいて、改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの改変された活性化ペプチドは、改変型ビタミンK依存性ポリペプチドが活性化された際に放出される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの活性化された形態は、非改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの活性化された形態と比較して増加した血漿中半減期を有し、ここにおいて、改変型ビタミンK依存性ポリペプチドが活性化された際の改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの改変された活性化ペプチドは、改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの軽鎖または重鎖のいずれかに共有結合したままである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの酵素原の形態は、非改変型ビタミンK依存性ポ
リペプチドの酵素原の形態と比較して増加した血漿中半減期を有し、ここにおいて、改変型ビタミンK依存性ポリペプチドが活性化された際の改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの改変された活性化ペプチドは、改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの軽鎖または重鎖のいずれかに共有結合したままである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。 - 改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの活性化された形態は、非改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの活性化された形態と比較して増加した血漿中半減期を有し、ここにおいて、改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの改変された活性化ペプチドは、改変型ビタミンK依存性ポリペプチドが活性化された際に放出される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 改変は、活性化ペプチド中の翻訳後修飾部位を改変することを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 改変は、活性化ペプチド中の少なくとも1個のN型糖鎖付加部位を除去することを含む、請求項13に記載の方法。
- 第一のビタミンK依存性ポリペプチドは、ヒトVIIまたはVIIa因子である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号18および配列番号19からなる群より選択される、請求項15に記載の方法。
- 第一のビタミンK依存性ポリペプチドは、ヒトプロテインCであり、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号18および配列番号19からなる群より選択される、請求項2〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 第一のビタミンK依存性ポリペプチドは、ヒトIX因子であり、第二のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドは、配列番号19で示されるアミノ酸配列を有する、請求項2〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 改変は、第一のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化の特異性を実質的に改変しない、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 改変型ビタミンK依存性ポリペプチドは、活性化ペプチドが改変されていないビタミンK依存性ポリペプチドと比較して増加した半減期を有する、改変された活性化ペプチドを含む改変型ビタミンK依存性ポリペプチド。
- 改変された活性化ペプチドは、異なるビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部、または、この異なるビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの類似体を含む、請求項20に記載の改変型ビタミンK依存性ポリペプチド。
- 異なるビタミンK依存性の活性化ペプチドの一部は、異なるビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも8個の連続したアミノ酸からなる、請求項21に記載の改変型ビタミンK依存性ポリペプチド。
- 改変型ビタミンK依存性ポリペプチドは、改変ヒトVII因子、改変ヒトIX因子、および、改変ヒトプロテインCからなる群より選択される、請求項20〜22のいずれか一項に記載の改変型ビタミンK依存性ポリペプチド。
- 改変型ビタミンK依存性ポリペプチドは、活性化ペプチドの少なくとも一部が、配列番号18および配列番号19からなる群より選択されるアミノ酸配列で置換された改変ヒトVII因子である、請求項20〜23のいずれか一項に記載の改変型ビタミンK依存性ポリペプチド。
- 改変型ビタミンK依存性ポリペプチドは、活性化ペプチドの少なくとも一部が配列番号18および配列番号19からなる群より選択されるアミノ酸配列で置換された改変ヒトプロテインCである、請求項20〜23のいずれか一項に記載の改変型ビタミンK依存性ポリペプチド。
- 改変型ビタミンK依存性ポリペプチドは、活性化ペプチドが配列番号19で示されるアミノ酸配列で置換された改変IX因子である、請求項20〜23のいずれか一項に記載の改変型ビタミンK依存性ポリペプチド。
- 改変型ビタミンK依存性ポリペプチドは、その活性化ペプチド中のN型糖鎖付加部位を欠失している、請求項20〜26のいずれか一項に記載の改変型ビタミンK依存性ポリペプチド。
- 改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの半減期は、それに対応する活性化ペプチドが改変されていないビタミンK依存性ポリペプチドと比較して少なくとも50%増加する、請求項20〜27のいずれか一項に記載の改変型ビタミンK依存性ポリペプチド。
- 改変型ビタミンK依存性ポリペプチドは、それに対応する活性化ペプチドが改変されていないビタミンK依存性ポリペプチドと比較して高い安定性を有する、請求項20〜28のいずれか一項に記載の改変型ビタミンK依存性ポリペプチド。
- 凝血活性を有する、請求項20〜29のいずれか一項に記載の改変型ビタミンK依存性ポリペプチド。
- (i)改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの活性化された形態は、改変された活性化ペプチドを含まないこと、および、(ii)改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの酵素原の形態は、非改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの酵素原の形態と比較して増加した半減期を有することを特徴とする、請求項20〜30のいずれか一項に記載の改変型ビタミンK依存性ポリペプチド。
- (i)改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの活性化された形態は、改変された活性化ペプチドを含むこと、および、(ii)改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの活性化された形態は、非改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの活性化された形態と比較して増加した半減期を有することを特徴とする、請求項20〜30のいずれか一項に記載の改変型ビタミンK依存性ポリペプチド。
- 請求項20〜32のいずれか一項に記載の改変型ビタミンK依存性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項33に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはベクター。
- 発現ベクターである、請求項34に記載のプラスミドまたはベクター。
- ヒト遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターである、請求項35に記載のベクター。
- 請求項33に記載のポリヌクレオチド、または、請求項34〜36のいずれか一項に記載のプラスミドまたはベクターを含む宿主細胞。
- −改変型ビタミンK依存性ポリペプチドが発現するような条件下で請求項34に記載の宿主細胞を培養すること;および、
−場合により、該宿主細胞または培地から改変型ビタミンK依存性ポリペプチドを回収すること、
を含む、改変型ビタミンK依存性ポリペプチドの製造方法。 - 請求項20〜32のいずれか一項に記載の改変型ビタミンK依存性ポリペプチド、請求項33に記載のポリヌクレオチド、または、請求項34〜36のいずれか一項に記載のプラスミドまたはベクターを含む医薬組成物。
- 血液凝固障害を治療または予防する医薬品を製造するための、請求項20〜32のいずれか一項に記載の改変型ビタミンK依存性ポリペプチド、請求項33に記載のポリヌクレオチド、請求項34〜36のいずれか一項に記載のプラスミドまたはベクター、または、請求項37に記載の宿主細胞の使用。
- 血液凝固障害は、血友病Aである、請求項40に記載の使用。
- 治療は、ヒト遺伝子治療を含む、請求項40または41に記載の使用。
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