ES2346072T3 - Polipeptidos modificados dependientes de la vitamina k. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la preparación de un polipéptido modificado dependiente de la vitamina K que comprende la modificación del péptido de activación de un primer polipéptido dependiente de la vitamina K de forma que el polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tiene una semivida aumentada en comparación con el primer polipéptido dependiente de la vitamina K en el que el péptido de activación no se ha modificado, procedimiento en el que la proteína dependiente de la vitamina K se selecciona entre un listado compuesto por factor VII, factor IX, factor X, protrombina y sus formas activadas, proteína S, proteína C y proteína Z y a. en el que el péptido de activación modificado comprende, como mínimo, parte de la secuencia de aminoácidos de un segundo polipéptido dependiente de la vitamina K y b. en el que la citada parte de la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K es i.como mínimo, 3 aminoácidos contiguos del péptido de activación del FVII, ii.como mínimo, 5 aminoácidos contiguos del péptido de activación del FX, o iii.como mínimo, 5 aminoácidos contiguos del péptido de activación del FIX a condición de que se excluya el péptido QSFNDFTR, o iv.como mínimo, 8 aminoácidos contiguos del péptido de activación de la protrombina, o v.como mínimo, un tramo de aminoácidos contiguos del péptido de activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K que tiene una longitud de, como mínimo, 15% de la longitud total de la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K, en el que el segundo polipéptido dependiente de la vitamina K se selecciona entre el grupo compuesto por proteína Z y proteína S.
Description
Polipéptidos modificados dependientes de la
vitamina K.
La presente invención se refiere a secuencias de
ADNc modificado que codifican para polipéptidos dependientes de la
vitamina K, en particular al factor VII humano, factor VIIa humano,
factor IX humano y proteína C humana y a sus derivados con una
estabilidad mejorada y una semivida plasmática prolongada, a
vectores de expresión recombinante que contienen dichas secuencias
de ADNc, a células huésped transformadas con dichos vectores de
expresión recombinante, a polipéptidos recombinantes y a derivados
que tienen las actividades biológicas de la proteína natural sin
modificar pero que tienen estabilidad mejorada y a procedimientos
para la fabricación de dichas proteínas recombinantes y de sus
derivados. La invención también cubre un vector de transferencia
para su uso en terapia génica humana, que comprende dichas
secuencias de ADN modificado.
Las proteínas dependientes de la vitamina K se
utilizan para tratar ciertos tipos de hemofilia. La hemofilia
clásica o hemofilia A es un trastorno hemorrágico hereditario. Es el
resultado de una deficiencia ligada al cromosoma X del factor VIII
de la coagulación sanguínea y afecta casi de forma exclusiva a
varones con una incidencia de entre uno y dos individuos por cada
10 000. El defecto del cromosoma X es transmitido por portadores de
sexo femenino que no son hemofílicas. La manifestación clínica de la
hemofilia A es un aumento de la tendencia a la hemorragia. Antes de
que se introdujese el tratamiento con concentrados del factor VIII,
la esperanza media de vida para una persona con hemofilia grave era
de menos de 20 años. La utilización de concentrados del factor VIII
procedentes de plasma y más tarde de formas recombinantes del FVIII
ha mejorado de forma considerable la situación para los pacientes
con hemofilia, aumentando en gran medida la esperanza media de vida,
lo que les proporciona a la mayoría de ellos la posibilidad de
vivir una vida más o menos normal. La hemofilia B es 5 veces menos
prevalente que la hemofilia A y es causada por un FIX no funcional o
ausente y se trata con concentrados del FIX procedentes de plasma o
con una forma recombinante del FIX. Tanto en la hemofilia A como en
la hemofilia B, el problema médico más grave en el tratamiento de la
enfermedad es la generación de aloanticuerpos contra los factores
de sustitución. Hasta el 30% de todos los pacientes con hemofilia A
desarrollan anticuerpos para el FVIII. Los anticuerpos para el FIX
surgen en una menor medida aunque con consecuencias más graves, ya
que son menos susceptibles a la terapia de inducción de tolerancia
inmunológica.
El modelo actual de coagulación afirma que el
desencadenante fisiológico de la coagulación es la formación de un
complejo entre el factor tisular (FT) y el factor VIIa (FVIIa) en la
superficie de las células que expresan el FT que normalmente se
encuentran situadas fuera de la red vascular. Esto conduce a la
activación del FIX y del FX que a la larga genera algo de trombina.
En un bucle de retroalimentación positiva la trombina activa los
FVIII y FIX, el denominado brazo "intrínseco" de la cascada de
la coagulación sanguínea, lo que amplifica de este modo la
generación del FXa, que es necesario para la generación de un gran
incremento de la cantidad de trombina total para lograr la
hemostasia completa. Se demostró que mediante la administración de
concentraciones suprafisiológicas del FVIIa, se conseguía la
hemostasia eludiendo la necesidad del FVIIIa y del FIXa. La
clonación del ADNc para el FVII (patente de EUA 4,784,950) hizo
posible el desarrollo de una sustitución recombinante de ese factor
de coagulación procedente del plasma. Este FVIIa se administró con
éxito por primera vez en 1988 a un paciente con una alta
concentración de anticuerpos inhibidores para el FVIII. Desde
entonces el número de indicaciones del FVIIa ha crecido
continuamente, lo que demuestra que tiene potencial para llegar a
ser un agente hemostático universal (Erhardtsen, 2002).
El FVII es una glicoproteína de cadena sencilla
con un peso molecular de 50 kDa, que es secretada por parte de las
células hepáticas hacia el interior de la corriente sanguínea como
un zimógeno inactivo de 406 aminoácidos. Contiene residuos de ácido
10-\gamma-carboxi-glutámico
(posiciones 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35) situados en el
dominio Gla de la proteína. Los residuos Gla requieren vitamina K
para su biosíntesis. Situados en el extremo
C-terminal respecto del dominio Gla se encuentran
dos dominios del factor de crecimiento epidérmico seguidos por un
dominio de serina proteasa de tipo tripsina. Modificaciones
postranslacionales adicionales del FVII abarcan la hidroxilación
(Asp 63), N-(Asn145 y Asn322) así como la glicosilación de tipo O
(Ser52 y Ser60).
El FVII se convierte en su forma activa FVIIa
mediante la proteolisis del enlace peptídico sencillo en
Arg152-Ile153, lo que conduce a la formación de dos
cadenas de polipéptidos, una cadena ligera con
N-terminal (17 kDa) y una cadena pesada con
C-terminal (28 kDa) que se mantienen juntas mediante
un puente disulfuro. En contraposición a otros polipéptidos
dependientes de la vitamina K, no se ha descrito ningún péptido de
activación que se separe durante la activación para el FVII. El
sitio de corte Arg152-Ile153 se corresponde mediante
comparación de homologías con el sitio de corte de activación con
C-terminal de otros polipéptidos dependientes de la
vitamina K. No obstante, como la Arg144 también puede constituir un
sitio de corte de proteasa, no se puede excluir que, en
contraposición con el pensamiento actual, el FVII posea un péptido
de activación de 8 aminoácidos entre Arg144 y Arg152.
Para alcanzar la conformación activa del FVIIa
resulta esencial la formación de un puente salino después del corte
de activación entre Ile153 y Asp343. La activación del FVII se puede
lograr in vitro mediante FXa, FXIIa, FIXa, FVIIa, FSAP y
trombina. Mollerup y otros (Biotechnol. Bioeng. (1995) 48:
501-505) informaron que también tiene lugar algo de
corte en la cadena pesada en Arg290 y/o en Arg315.
El FVII se encuentra presente en el plasma en
una concentración de 500 ng/ml. El 1%, por ejemplo 5 ng/ml del
FVII, se encuentra presente como FVIIa. Se descubrió que la semivida
plasmática del FVII era de aproximadamente 4 horas y que la del
FVIIa era de aproximadamente 2 horas. Aunque la semivida del FVIIa
de 2 horas es comparativamente larga para un factor de coagulación
activado y, por otra parte, se encuentra más en el orden de los
minutos debido a la inhibición irreversible por Serpinas como la
antitrombina III, lo que, sin embargo, constituye un grave
inconveniente para la utilización terapéutica del FVIIa, ya que
conduce a la necesidad de múltiples inyecciones por vía i.v. o a
una infusión continua para conseguir la hemostasia, lo que da como
resultado un tratamiento de coste muy elevado e inconvenientes para
el paciente. Como por otra parte el FVIIa tiene el potencial de
utilizarse como un agente hemostático universal, hay una gran
necesidad médica de desarrollar formas del FVIIa que tengan una
semivida funcional más larga.
Se han hecho varios intentos para modificar el
FVII:
- Nicolaisen y otros (documento WO 88/10295, 25 de junio, 1987) sugieren que mediante la eliminación o la modificación de los siguientes aminoácidos, el FVII se estabilizará contra la degradación proteolítica: Lys32, Lys38, Lys143, Arg290, Arg315, Lys316, Lys341, Arg392, Arg 396, Arg 402, Ile42 y Tyr44.
- Nicolaison (patente de EUA 5,580,560, 13 de noviembre, 1989) amplía el documento WO 88/10295 para incluir además mutaciones o supresiones en Arg304, Phe278 y Tyr332 para volver al FVII/FVIIa menos susceptible a la proteolisis.
- Bharadwaj y otros (JBC (1996), 48 pp. 30685-30691) expresaron el Phe328Ser mutante del FVII que no activaba el FX y que no mostraba actividad amidolítica detectable.
- Dickinson y otros (PNAS (1996) 93, 14379-14384) propusieron variantes del FVIIa en las que Lys157, Val158, Glu296, Met298, Asp334, Ser336 o Lys337 habían sido sustituidos por Ala.
- Nelsestuen (documento WO 99/29767, 23 de octubre, 1997) modificó el dominio Gla mediante la introducción de mutaciones puntuales de forma que se mejorase su afinidad hacia las membranas fosfolipídicas, lo que dio como resultado de ese modo un FVIIa modificado con actividad específica mejorada. Las mutaciones puntuales propuestas eran en Pro10, Gly11, Arg28 y Lys32.
- Nelsestuen (documento WO 00/66753, 29 de abril, 1999) modificó el dominio Gla mediante la introducción de mutaciones puntuales de forma que se mejorase su afinidad hacia las membranas fosfolipídicas, lo que dio como resultado de ese modo un FVIIa modificado con actividad específica mejorada. Las mutaciones puntuales propuestas fueron en 5, 9, 11, 12, 29, 33, 34, 35 y/o 36.
- Kornfelt y otros (Archiv. Biochem. and Biophys., 363, pp 43-54) mostraron que la oxidación de Met298 y Met306 conduce a una velocidad de disociación un 30% mayor del FVIIa-ox desde el FT y una activación del FX un 20% menor en comparación con el FVIIa natural.
- Kemball-Cook y otros (JBC (1998), 14 pp. 8516-8521) expresaron Gln100Arg mutante del FVII y mostraron que no tenía actividad coagulante detectable a pesar de tener una actividad amidolítica comparable a la del FVIIa natural y especularon que esto se podía deber a una asociación empeorada con el FT.
- Lino y otros Arch. Biochem. Biophys. (1998) 352:182-192, mostraron que la mutación de los sitios de O-glicosilación Ser-52 y Ser-60 disminuye la actividad coagulatoria del FVIIa posiblemente interfiriendo con la interacción con el FT.
- Ruf y otros (Biochemistry (1999) 16, pp. 1957-66) mostraron que la mutación Arg36Ala conduce a una tasa de activación disminuida del FX.
- Iwanaga y otros (Thromb. Haemost. (suplemento agosto 1999), 466 resumen 1474) se refieren a una variante del FVII en la que se eliminan los residuos 316-320 o en la que los residuos 311-322 se sustituyen con los residuos correspondientes de tripsina.
- Soejima Kenji y otros (documento JP2001061479, 24 de agosto, 1999) crearon un FVIIa modificado con actividad específica mejorada mediante la escisión del grupo disulfuro entre Cys159 y Cys164 o mediante la sustitución, adición o eliminación de, como mínimo, una parte de la estructura de lazo entre Thr233 y Asp244, o mediante la sustitución, adición o eliminación de, como mínimo, una parte de la secuencia interpuesta entre Arg304 y Cys329.
- Pedersen y otros (documento US 2003/0096338, 11 de febrero, 2000) reivindican conjugados del FVII y del FVIIa con fracciones no polipeptídicas que también incluyen azúcares con el objetivo de prolongar la semivida del FVIIa. Las reivindicaciones también abarcan la introducción de nuevos sitios de glicosilación de tipo N- y/o de tipo O- o la introducción de sitios nuevos, combinada con la eliminación de sitios de glicosilación de tipo N- y/o de tipo O- preexistentes para obtener glicoconjugados in vivo.
- Persson y Olsen (documento US 2003/0170863, 3 de mayo, 2000) describieron el FVIIa modificado en el que se había sustituido Leu305 o Phe374 por otro aminoácido. Como máximo se habían sustituido 20 aminoácidos en el dominio de la proteasa (153-406) en combinación con las mutaciones mencionadas anteriormente. Se describen otras moléculas del FVII modificado, que tienen opcionalmente otros aminoácidos sustituidos en las posiciones 274, 300-304 y 306-312 en combinación con Leu305 y Phe374. Estas modificaciones tienen el efecto de que el FVIIa alcanzará de forma espontánea una conformación más activa que la que normalmente se introduce por el FT.
- Persson y Olsen (documentos US 2003/0104978 y 2003/0100740, 29 de septiembre, 2000) describieron además otras moléculas del FVIIa modificado con mutaciones puntuales distintas de las sustituciones de Ala en las posiciones Lys157, Lys337, Asp334, Ser336, Val158, Glu296 y Met298.
- Pingel y Klausen (documentos US 2002/0151471 y US 2002/0137673, 2 de octubre, 2000) reivindican un preparado que comprende una serie del FVII o de polipéptidos relacionados, que comprenden ciertas proporciones de distintas glicosilaciones de tipo N-.
- Ruf y otros (documento WO 02/38162, 9 de noviembre, 2000) reivindicaron variantes del FVII/FVIIa con las modificaciones Met298Gln, Glu296Ile y Val158Asn o combinaciones de las mismas, que conducen a una mayor actividad amidolítica en ausencia del FT y a una mayor afinidad por el FT. Además, el factor se modificó para aumentar su estabilidad en la modificación de los sitios de corte similares a la tripsina en Lys32, Lys38, Arg290, Arg304, Arg315 y Lys341 y en los sitios similares a la quimotripsina en Ile42, Tyr44, Phe278 y Tyr332.
- Persson (documento WO 02/077218, 22 de marzo, 2001) describe mutantes del FVII/FVIIa en los que se mutan los aminoácidos 247-260, 393-405 y Pro406, de forma más específica R396, Q250 y Pro406, preferentemente un aminoácido al que se pueda unir un grupo químico con la finalidad de aumentar la semivida del FVII/FVIIa. Esto se puede combinar con mutaciones que aumenten la actividad del FVII/FVIIa en K157, V158, E296, M298, L305, D334, S336, K337 y F374.
- Persson y Olsen (documento US 2003/0100075, 27 de septiembre, 2001) describen que Leu305 se sitúa en el extremo de una hélice \alpha encontrada en la forma complejada del FT del FVIIa, lo que se cree que es importante para la actividad. En el FVIIa libre, esta hélice se encuentra distorsionada y así posiblemente es inestable. La sustitución de Leu305 con otros aminoácidos conduce de acuerdo con esta invención a variantes que alcanzan la conformación activa que de cualquier otra manera se induce por el FT. Los aminoácidos Lys157, Lys337, Asp334, Ser336, Val 158, Glu296 y Met298 se sitúan en áreas que afectan a la formación del puente salino entre Ile153 y Asp343. La sustitución de estos aminoácidos conduce, de acuerdo con esta invención, a facilitar la inserción del extremo N-terminal de la proteasa para, por ejemplo, la generación del puente salino esencial para la actividad.
- Persson y Olsen (documento US 2003/0130191, 2 de noviembre, 2001) describe además mutantes del FVII/VIIa modificado con actividad específica aumentada que se sustituyen con otros aminoácidos en las posiciones: 313-329, 364, 366, 373 y 376, así como en las posiciones 330-339.
- Haaning y otros (documento WO 03/093465, 30 de abril, 2002) amplían las explicaciones de Nelsestuen (modificación del dominio Gla para mejorar la unión fosfolipídica), concretamente una sustitución en Pro10 preferentemente Gln, en Lys32 preferentemente Glu, en Asp33 preferentemente un aminoácido hidrófobo preferentemente Phe, en Ala34 preferentemente un aminoácido cargado negativamente preferentemente Glu y una inserción de un aminoácido después de Ala3 preferentemente Tyr con la introducción de más sitios de N-glicosilación.
- Foncuberta y otros (documento WO 2004/011675, 25 de julio, 2002) describen variantes alélicas de origen natural del FVII que teóricamente podrían conducir a mayores niveles de expresión y a una función mejorada del FVIIa. No se muestran datos para dichas propiedades mejoradas. En los exones se encontraron dos variantes de cada 49 y condujeron a una sustitución de los aminoácidos: A294V y R353Q.
- Persson y Olsen (documento WO 2004/029090, 25 de septiembre, 2002) mostraron que la mutación de Phe374 en combinación con algunos otros aminoácidos conduce a un aumento de la actividad independiente del FT del FVIIa, concretamente L305V, S314E, K337A y F374Y conducen a un aumento de la actividad amidolítica del FT.
- Haaning y otros (documento WO 2004/029091, 30 de septiembre, 2002) modificaron el FVII en L39, I42, S43, K62, L65, F71, E82 y F275 en el sitio de unión del FT del FVII/FVIIa aumentando la afinidad para el FT.
- Andersen y otros (documento WO 2004/083361, 20 de marzo, 2003) modificaron el FVII/FVIIa en las posiciones 196 (D196N/K), 237 (G237L o inserciones GAA GAAA o GAAAA) y 341 (K341 N/Q) para aumentar la afinidad hacia el FT.
\newpage
- Blajchman y otros (documento WO 2004/108763, 5 de junio, 2003) modificaron el FVII/FVIIa dentro del dominio del EGF en base a un análisis de diferencias entre el dominio del EGF humano y de conejo, ya que el factor VIIa de conejo tiene una mayor afinidad hacia el FT humano que el Factor VIIa humano. Se reivindican los mutantes en la posición 53, 62, 74, 75 y 83 y se muestra que tienen mayor afinidad hacia el FT humano y un potencial hemostático aumentado.
- Haaning y otros (documento WO 2004/111242, 19 de junio, 2003) modificaron el FVII/FVIIa en las posiciones 4, 10, 28, 32, 33, 34, 36, 74, 77, 116 preferentemente A3Y, P10Q, R28F, K32E, D33F, A34L, R36E, K38E, P74S, E77A, E116D. La mutación R36E causa una unión reducida al FT y una generación reducida de trombina en ensayos dependientes del FT, al tiempo que en ensayos dependientes del PL se mantiene la misma actividad.
- Johansen y otros (documento WO 2005/032581, 7 de octubre, 2003) describen moléculas híbridas que constan de un dominio de unión de membrana de lípido acoplado a un dominio de actividad del factor VII acoplado opcionalmente a un agente de carga, preferentemente a PEG.
- Maun y otros Protein Sci. (2005) 14:1171-80 introdujeron nuevos enlaces de disulfuro para bloquear la conformación del FVII en un estado activo similar a FT*FVIIa. El análisis cinético de la actividad amidolítica reveló que todas las variantes del factor VIIa por sí solas habían aumentado la actividad específica en comparación con los factores naturales, siendo el mayor aumento de actividad para las variantes 136:160 y 138:160 con el sustrato S-2765, que tenían unos aumentos de 670 y 330 veces, respectivamente. Las variantes del factor VIIa bloqueadas con disulfuro dejaron de requerir FT como un cofactor para la actividad máxima en ensayos amidolíticos. En presencia de FT soluble, la actividad se mejoró 20 y 12 veces para las variantes 136:160 y 138:160, respectivamente, en comparación con el factor natural.
- Foster y otros (documento WO 91/09960) describen una proteína C modificada de forma recombinante (híbrida) con secuencias de corte modificadas entre las cadenas ligeras y pesadas. Esta variante de la proteína muestra ser más resistente a la inactivación plasmática que la proteína C humana nativa.
- Le Bonniec y otros (documento WO 03/035861) describen una proteína C modificada en la que una parte del péptido de activación (DTEDQEDQVDPR) se sustituye por fibrinopéptido A o por una parte del mismo (DFLAEGGGVR). Se informa que esta variante de la proteína tiene una semivida más larga que la de la proteína C nativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Un objetivo de la presente invención es dar a
conocer polipéptidos modificados dependientes de la vitamina K, por
ejemplo el FVII modificado y el FVIIa modificado, con una semivida
funcional más larga.
El FVII se encuentra relacionado con otras
proteínas con dominio Gla como el FIX, FX, proteína C, proteína Z,
protrombina, GAS6 y proteína S. Se encuentran relacionados de forma
más próxima el FVII, FIX, FX y la proteína C, en las que el dominio
Gla con N-terminal viene seguido por dos dominios
del factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en
inglés), seguidos por el dominio de serina proteasa de tipo
tripsina. La proteína Z tiene una estructura similar, aunque tiene
un dominio de proteasa inactivo. En la protrombina, el dominio Gla
está seguido por dos dominios kringle en lugar de por dos dominios
del EGF, seguidos a continuación por el dominio de proteasa de tipo
tripsina. En GAS6 y en la proteína S el dominio Gla viene seguido
por 4 dominios del EGF y a continuación por dos dominios de
laminina-G, en lugar del dominio de proteasa.
Resulta llamativa la gran diferencia que existe
en la semivida plasmática de estas proteínas plasmáticas
estrechamente relacionadas:
- FVII:
- 2-4 horas
- Proteína C:
- 6-8 horas
- FIX:
- 18-30 horas
- FX:
- 20-42 horas
- Proteína S:
- 24-58 horas
- Protrombina:
- 41-72 horas
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Un subgrupo en particular estrechamente
relacionado de estas proteínas comprende el FVII, FIX, FX y la
proteína C.
\newpage
En la figura 1 se compara la homología entre el
FVII, proteína C, FIX y FX de origen humano y de otras especies. Las
moléculas se encuentran muy conservadas, y la diferencia más
llamativa se encuentra dentro del dominio de activación. Para el
FVII no se ha descrito ningún péptido de activación. No obstante,
durante la activación el FVII puede escindirse además de en Arg152,
también en Arg144, lo que a continuación da como resultado la
liberación de un presunto péptido de activación de 8 aminoácidos que
contiene un sitio conservado de N-glicosilación.
De forma sorprendente, la longitud de los
péptidos de activación y las modificaciones postranslacionales de
los péptidos de activación se correlacionan con una semivida
aumentada:
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\vskip1.000000\baselineskip
Por consiguiente, la invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de un polipéptido modificado
dependiente de la vitamina K, que comprende la modificación del
péptido de activación de un primer polipéptido dependiente de la
vitamina K, de forma que el polipéptido modificado dependiente de la
vitamina K tiene una semivida aumentada en comparación con el primer
polipéptido dependiente de la vitamina K en el que el péptido de
activación no se ha modificado.
Además, la invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de dicho polipéptido modificado
dependiente de la vitamina K, que comprende la modificación del
péptido de activación de un primer polipéptido dependiente de la
vitamina K mediante la adición de, como mínimo, parte de un péptido
de activación de un segundo polipéptido dependiente de la vitamina
K o mediante la sustitución de, como mínimo, parte de un péptido de
activación de un primer polipéptido dependiente de la vitamina K
con, como mínimo, parte de un péptido de activación de un segundo
polipéptido dependiente de la vitamina K.
Los polipéptidos dependientes de la vitamina K
son un grupo de proteínas que necesitan vitamina K en sus rutas
biosintéticas para carboxilar las cadenas laterales de los residuos
de ácido glutámico de sus precursores de proteína. Los polipéptidos
dependientes de la vitamina K incluyen, pero no se limitan a ellos,
factor VII, factor VIIa, factor IX, factor IXa, factor X, factor
Xa, factor II (protrombina), proteína C, proteína C activada,
proteína S, proteína S activada, GAS6, GAS6 activado, proteína Z,
proteína Z activada y similares. Además, los polipéptidos útiles
dependientes de la vitamina K pueden ser naturales o pueden contener
mutaciones. El grado y la localización de la glicosilación o de
otras modificaciones postranslacionales puede variar dependiendo de
las células huésped escogidas y de la naturaleza y del ambiente
celular huésped. Cuando se hace referencia a secuencias específicas
de aminoácidos, las modificaciones postranslacionales de dichas
secuencias se encuentran abarcadas en esta solicitud.
Tal como se utiliza en esta solicitud, "factor
VII/VIIa" quiere decir un producto constituido por la forma no
activada (factor VII) o por la forma activada (factor VIIa) o por
mezclas de los mismos. Dentro de la definición anterior, "factor
VII/VIIa" incluye a proteínas que tienen la secuencia de
aminoácidos del factor VII/VIIa humano nativo. También incluye a
proteínas con una secuencia de aminoácidos ligeramente modificada,
por ejemplo, un extremo N-terminal modificado que
incluye supresiones o adiciones de aminoácido con
N-terminal con la condición de que esas proteínas
retengan sustancialmente la actividad del factor VIIa. Dentro de la
definición anterior "factor VII" también incluye variaciones
alélicas naturales que pueden existir y tener lugar entre un
individuo y otro. Dentro de la definición anterior "factor
VII" incluye además variantes del FVII/FVIIa. Dichas variantes
difieren de la secuencia natural en uno o más residuos de
aminoácido. Los ejemplos de dichas diferencias pueden incluir el
truncamiento del extremo N- y/o C-terminal por uno o
más residuos de aminoácido (por ejemplo, residuos de entre 1 y 10
aminoácidos), o la adición de uno o más residuos extra en el extremo
N- y/o C-terminal, por ejemplo la adición de un
residuo de metionina en el extremo N-terminal, así
como sustituciones conservativas de aminoácidos, es decir,
sustituciones realizadas dentro de grupos de aminoácidos con
características similares, por ejemplo (1) aminoácidos pequeños,
(2) aminoácidos ácidos, (3) aminoácidos polares, (4) aminoácidos
básicos, (5) aminoácidos hidrófobos y (6) aminoácidos aromáticos.
En la siguiente tabla se muestran ejemplos de dichas sustituciones
conservativas.
Las secuencias de aminoácidos de los distintos
polipéptidos dependientes de la vitamina K y las secuencias de ADNc
que los codifican se muestran en el listado de secuencias:
El primer polipéptido dependiente de la vitamina
K se selecciona preferentemente entre el grupo compuesto por factor
VII, factor VIIa, factor IX, factor IXa, proteína C y proteína C
activada. Más preferentemente, el primer polipéptido dependiente de
la vitamina K se selecciona entre el grupo compuesto por factor VII
humano, factor VIIa humano, factor IX humano, factor IXa humano,
proteína C humana y proteína C humana activada. Los más preferente,
el primer polipéptido dependiente de la vitamina K es el factor VII
humano o el factor VIIa humano. En una realización específica, el
primer polipéptido dependiente de la vitamina K comprende una
secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por
los IDENTIFICADORES DE SECUENCIA N.^{os}: 3, 6 y 9.
El segundo polipéptido dependiente de la
vitamina K es diferente del primer polipéptido dependiente de la
vitamina K. Por consiguiente, el polipéptido modificado dependiente
de la vitamina K que se puede obtener mediante el procedimiento de
la invención comprende, como mínimo, parte de un péptido de
activación que no es de origen natural en el primer polipéptido
dependiente de la vitamina K.
El segundo polipéptido dependiente de la
vitamina K tiene una semivida plasmática más larga que el primer
polipéptido dependiente de la vitamina K. En otra realización, la
longitud del péptido de activación del segundo polipéptido
dependiente de la vitamina K es mayor que la longitud del péptido de
activación del primer polipéptido dependiente de la vitamina K.
Preferentemente, el segundo polipéptido
dependiente de la vitamina K se selecciona entre el grupo compuesto
por el factor IX, factor X y protrombina. Más preferentemente, el
segundo polipéptido dependiente de la vitamina K se selecciona
entre el grupo compuesto por el factor IX humano, factor X humano y
protrombina humana. En una realización específica, el segundo
polipéptido dependiente de la vitamina K comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por los
IDENTIFICADORES DE SECUENCIA N.^{os}: 9, 12 y 15.
La parte del péptido de activación del péptido
de activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K,
que se añade, consta preferentemente de, como mínimo, 8, más
preferentemente, como mínimo, 12, incluso más preferentemente, como
mínimo, 15 aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos del
péptido de activación del segundo polipéptido dependiente de la
vitamina K.
En otra realización, la parte del péptido de
activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K,
que se añade, puede constar de, como mínimo, 0,15\cdotN
aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos del péptido de
activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K, en
la que N es el número total de aminoácidos del péptido de
activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K.
Preferentemente, la parte del péptido de activación del segundo
polipéptido dependiente de la vitamina K, consta de, como mínimo,
0,5\cdotN, más preferentemente de, como mínimo, 0,75\cdotN, más
preferentemente de, como mínimo, 0,9\cdotN, los más preferente
de, como mínimo, 0,95\cdotN aminoácidos contiguos en la secuencia
de aminoácidos del péptido de activación del segundo polipéptido
dependiente de la vitamina K.
En otra realización, la parte del péptido de
activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K,
que se añade, consta de, como mínimo, (N-x)
aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos del péptido de
activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K, en
la que N es el número total de aminoácidos del péptido de
activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K y en
la que x puede ser 7, preferentemente x es 5, más preferentemente x
es 4, más preferentemente x es 3, incluso más preferentemente x es
2.
También es posible que la parte del péptido de
activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K,
que se añade, conste de una parte central del péptido de activación,
es decir, que no comprenda al propio aminoácido con
C-terminal o al propio aminoácido con
N-terminal del péptido de activación.
Los más preferente, el péptido de activación
completo del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K se
añade a la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido
dependiente de la vitamina K, al tiempo que retiene la
especificidad de activación del primer polipéptido dependiente de la
vitamina K. De forma alternativa, se puede añadir una variante del
péptido de activación completo del segundo polipéptido dependiente
de la vitamina K a la secuencia de aminoácidos del primer
polipéptido dependiente de la vitamina K. Las variantes incluyen
péptidos de activación en los que se han añadido, eliminado y/o
sustituido entre 1 y 10, preferentemente entre 1 y 7, más
preferentemente entre 1 y 5, los más preferente entre 1 y 3
aminoácidos.
Si solo se va a prolongar la semivida del
zimógeno, los sitios de corte de activación con N- y
C-terminales del primer polipéptido dependiente de
la vitamina K se retienen preferentemente en los péptidos de
activación de la variante. Si además se va a prolongar la semivida
de la forma activada del polipéptido dependiente de la vitamina K,
se eliminará un sitio de corte de activación con
N-terminal o con C-terminal del
primer polipéptido dependiente de la vitamina K. Preferentemente se
elimina el sitio de corte de activación con
N-terminal. Si se va a prolongar la semivida del
FVIIa, preferentemente se eliminarán los sitios de corte de
activación con N-terminal, mientras que
preferentemente se retendrán los sitios de corte de activación con
C-terminal.
La siguiente tabla resume las secuencias de los
péptidos de activación de varios polipéptidos dependientes de la
vitamina K.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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\newpage
La expresión "péptido de activación", según
se emplea en el presente documento, incluye péptidos de activación
conocidos y presuntos péptidos de activación tales como los del
factor VII.
A modo de ejemplo no limitante, se puede añadir
cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos a la
secuencia de aminoácidos del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 3 ó
6.
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\vskip1.000000\baselineskip
A modo de ejemplo no limitante, se puede añadir
cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos a la
secuencia de aminoácidos del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 3, 6 ó
9.
\newpage
La parte de o el péptido de activación completo
del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K se inserta
cerca de la región del péptido de activación del primer polipéptido
dependiente de la vitamina K. Se puede insertar entre dos
aminoácidos del primer polipéptido dependiente de la vitamina K sin
la supresión de aminoácidos del primer polipéptido dependiente de
la vitamina K. Por ejemplo, en el caso de que el FVII sea el primer
polipéptido dependiente de la vitamina K, la parte de o el péptido
de activación completo del segundo polipéptido dependiente de la
vitamina K se puede insertar entre los aminoácidos 144 y 145, entre
los aminoácidos 145 y 146, entre los aminoácidos 146 y 147, entre
los aminoácidos 147 y 148, entre los aminoácidos 148 y 149, entre
los aminoácidos 149 y 150, entre los aminoácidos 150 y 151, entre
los aminoácidos 151 y 152 o entre los aminoácidos 152 y 153, en los
que la numeración se refiere al IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 3.
Preferentemente, la parte de o el péptido de activación completo
del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K se inserta
entre los aminoácidos 144 y 145, en los que la numeración se refiere
al IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 3. Preferentemente, mediante la
inserción se preservan el sitio de corte con
C-terminal y la especificidad de la activación del
primer polipéptido dependiente de la vitamina K. El sitio de corte
con N-terminal se puede eliminar mediante la
inserción.
inserción.
En otro aspecto, la parte de o el péptido de
activación completo del segundo polipéptido dependiente de la
vitamina K sustituye un tramo de aminoácidos en el primer
polipéptido dependiente de la vitamina K. Por ejemplo, en el caso
de que el FVII sea el primer polipéptido dependiente de la vitamina
K, la parte de o el péptido de activación completo del segundo
polipéptido dependiente de la vitamina K puede sustituir los
aminoácidos 140 a 152 del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 3.
Preferentemente, mediante la sustitución se preservan el sitio de
corte con C-terminal y la especificidad de la
activación del primer polipéptido dependiente de la vitamina K. El
sitio de corte con N-terminal se puede eliminar
mediante la sustitución.
El sitio de corte con N-terminal
se puede eliminar mediante la sustitución de determinados
aminoácidos del primer polipéptido dependiente de la vitamina K con
la parte de o con el péptido de activación completo del segundo
polipéptido dependiente de la vitamina K. Por consiguiente, la
parte de o el péptido de activación completo del segundo
polipéptido dependiente de la vitamina K puede sustituir a
cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos del
IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 3:
aa 140 a 145;
aa 141 a 145;
aa 142 a 145;
aa 143 a 145;
aa 144 a 145;
aa 145;
aa 140 a 144;
aa 141 a 144;
aa 142 a 144;
aa 143 a 144 ó
aa 144.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, durante la modificación se
retienen los sitios de degradación proteolítica en el primer
polipéptido dependiente de la vitamina K, que son
N-terminal y C-terminal para la
región del péptido de activación. Así, se retiene la especificidad
de la activación del primer polipéptido dependiente de la vitamina
K.
En otra realización, si se va a prolongar la
semivida plasmática del zimógeno, los sitios de corte de activación
con N-terminal y con C-terminal del
segundo polipéptido dependiente de la vitamina K reemplazan a los
del primer polipéptido dependiente de la vitamina K, o se puede
retener un sitio de corte de activación con
N-terminal del primer polipéptido dependiente de la
vitamina K y se puede retener un sitio de corte de activación con
C-terminal del segundo polipéptido dependiente de la
vitamina K, o viceversa. Si se va a estabilizar la semivida
plasmática del polipéptido dependiente de la vitamina K activado, se
eliminará un sitio de corte de activación con
N-terminal o uno con C-terminal. En
el caso de una variante del FVIIa estabilizado, el péptido de
activación se debe retener con la cadena ligera con
N-terminal. Esto implica que el sitio de corte de
activación con C-terminal se debe retener, mientras
que el sitio de corte de activación con N-terminal
transferido desde un polipéptido dependiente de la vitamina K se
debe eliminar. Además puede ser necesario eliminar el hipotético
sitio de corte del péptido de activación
en Arg144.
en Arg144.
La modificación también puede comprender, además
de la inserción del péptido de activación de un segundo polipéptido
dependiente de la vitamina K o de una variante del mismo, la
supresión simultánea de, como mínimo, parte del péptido de
activación del primer polipéptido dependiente de la vitamina K, al
tiempo que preferentemente se retiene la especificidad de
activación del primer polipéptido dependiente de la vitamina K. La
parte que se va a eliminar consta de, como mínimo, 2,
preferentemente, como mínimo, 4, más preferentemente, como mínimo,
6, incluso más preferentemente, como mínimo, 8 aminoácidos contiguos
del péptido de activación del primer polipéptido dependiente de la
vitamina K.
En otra realización, la parte del péptido de
activación del primer polipéptido dependiente de la vitamina K, que
se elimina, puede constar de, como mínimo, 0,15\cdotN aminoácidos
contiguos en la secuencia de aminoácidos del péptido de activación
del primer polipéptido dependiente de la vitamina K, en la que N es
el número total de aminoácidos del péptido de activación del primer
polipéptido dependiente de la vitamina K. Preferentemente, la parte
del péptido de activación del primer polipéptido dependiente de la
vitamina K consta de, como mínimo, 0,5\cdotN, más preferentemente
de, como mínimo, 0,75\cdotN, más preferentemente de, como mínimo,
0,9\cdotN, los más preferente, como mínimo, 0,95\cdotN
aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos del péptido de
activación del primer polipéptido dependiente de la vitamina K.
En otra realización, la parte del péptido de
activación del primer polipéptido dependiente de la vitamina K, que
se elimina, consta de, como mínimo, (N-x)
aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos del péptido de
activación del primer polipéptido dependiente de la vitamina K, en
la que N es el número total de aminoácidos del péptido de
activación del primer polipéptido dependiente de la vitamina K, en
la que x puede ser 7, preferentemente x es 5, más preferentemente x
es 4, más preferentemente x es 3, incluso más preferentemente x es
2.
También es posible que la parte del péptido de
activación del primer polipéptido dependiente de la vitamina K, que
se elimina, conste de una parte central del péptido de activación,
es decir, no comprenda al propio aminoácido con
C-terminal o al propio aminoácido con
N-terminal del péptido de activación.
En una realización específica, se elimina el
péptido de activación completo del primer polipéptido dependiente de
la vitamina K.
Por lo general, la modificación comprende la
sustitución de, como mínimo, parte del péptido de activación del
primer polipéptido dependiente de la vitamina K con, como mínimo,
parte del péptido de activación del segundo polipéptido dependiente
de la vitamina K. Las realizaciones preferentes de las partes del
péptido de activación del primer polipéptido dependiente de la
vitamina K y de las del péptido de activación del segundo
polipéptido dependiente de la vitamina K se corresponden con las
descritas anteriormente.
En una realización en particular, el péptido de
activación completo del primer polipéptido dependiente de la
vitamina K se sustituye con el péptido de activación completo del
segundo polipéptido dependiente de la vitamina K o con una variante
del péptido de activación completo del segundo polipéptido
dependiente de la vitamina K, al tiempo que retiene los aminoácidos
necesarios para retener la especificidad de activación del primer
polipéptido dependiente de la vitamina K.
A modo de ejemplo no limitante, la invención
abarca la introducción de secuencias de péptido de activación
procedentes de polipéptidos dependientes de la vitamina K de origen
animal (algunos de los cuales se muestran en la figura 1), tales
como factores de protrombina de ratones, factores de protrombina
caninos, bovinos, porcinos o de roedores, así como combinaciones de
los mismos.
A modo de ejemplo no limitante, la invención
abarca la introducción del péptido de activación del FIX o del FX
dentro de la vecindad del sitio de activación del FVII, así como la
sustitución del péptido de activación de la proteína C por el del
FIX o por el del FX, así como la sustitución del péptido de
activación del FIX por el del FX. A modo de ilustración de la
amplitud de este aspecto de la invención con la molécula del FVII
preferente, la semivida del FVII se aumenta simplemente mediante la
sustitución del presunto péptido de activación de 8 aminoácidos en
su totalidad por uno de los péptidos de activación tomados de la
proteína C, del FIX o del FX, o mediante la creación de un péptido
de activación híbrido mediante la adición de los péptidos de
activación tomados de la proteína C, del FIX o del FX, de un
aminoácido del extremo terminal proximal hasta el presunto péptido
de activación completo del FVII.
Otro aspecto de la invención es la variación de
la modificación postranslacional de estos péptidos de activación
transferidos, ya que a modo de ejemplo no limitante la eliminación
de los sitios de N-glicosilación en los péptidos de
activación transferidos o, de forma alternativa, la eliminación del
sitio de N-glicosilación en el presunto péptido de
activación del FVII entre Arg144 y Arg152, puede conducir a una
menor eliminación del factor de coagulación mediada por el receptor
de la asialoproteína. En una realización de la invención, la
modificación comprende por consiguiente sitios de modificación de
modificación postranslacional dentro del péptido de activación.
Preferentemente, la modificación comprende la eliminación de, como
mínimo, un sitio de N-glicosilación dentro del
péptido de
activación.
activación.
Otro aspecto de la invención es la prolongación
de la semivida plasmática mediante la transferencia de análogos de
los péptidos de activación de proteínas dependientes de la vitamina
K de vida más larga. Un análogo, en su sentido más amplio, es una
inserción que tiene una secuencia de aminoácidos continuos más larga
de 8 o sustituciones conservativas de estos aminoácidos del péptido
de activación de una proteína natural dependiente de la vitamina K
de vida más larga, al tiempo que preserva sus sitios de corte de
activación con N- y C-terminal si la semivida del
zimógeno del primer polipéptido dependiente de la vitamina K se va a
prolongar, o al tiempo que se preserva su sitio de corte de
activación con N- o con C-terminal si además se va a
prolongar la semivida del polipéptido activado dependiente de la
vitamina K.
Sustituciones conservativas de aminoácidos son
sustituciones llevadas a cabo dentro de grupos de aminoácidos con
características similares, por ejemplo (1) aminoácidos pequeños, (2)
aminoácidos ácidos, (3) aminoácidos polares, (4) aminoácidos
básicos, (5) aminoácidos hidrófobos y (6) aminoácidos aromáticos. En
la Tabla 2 se muestran ejemplos de dichas sustituciones
conservativas.
Otro aspecto de la invención es un procedimiento
para aumentar la estabilidad de un polipéptido dependiente de la
vitamina K, que comprende la modificación de su péptido de
activación. Otro aspecto más de la invención es un procedimiento
para aumentar la semivida funcional o la semivida plasmática de un
polipéptido dependiente de la vitamina K, que comprende la
modificación de su péptido de activación. Estos procedimientos
pueden comprender las mismas etapas que las del procedimiento para
la producción de un polipéptido modificado dependiente de la
vitamina K descrito anteriormente.
Además, la invención se refiere a un polipéptido
modificado dependiente de la vitamina K que se puede obtener
mediante un procedimiento de la invención. El polipéptido modificado
dependiente de la vitamina K puede comprender un péptido de
activación modificado, en el que el polipéptido modificado
dependiente de la vitamina K tiene una semivida aumentada en
comparación con el polipéptido dependiente de la vitamina K en el
que no se ha modificado el péptido de activación.
Otro aspecto de la invención es un polipéptido
modificado dependiente de la vitamina K que comprende un péptido de
activación modificado, en el que el citado péptido de activación
modificado comprende, como mínimo, parte de un péptido de
activación de un polipéptido dependiente de la vitamina K distinto.
De forma alternativa, el polipéptido modificado dependiente de la
vitamina K puede comprender un análogo o una variante de un péptido
de activación de un polipéptido dependiente de la vitamina K
distinto. Análogos y variantes son moléculas tal como se definieron
anteriormente.
Preferentemente, el polipéptido dependiente de
la vitamina K es un primer polipéptido dependiente de la vitamina K
tal como se definió anteriormente. El "polipéptido dependiente de
la vitamina K distinto" es un segundo polipéptido dependiente de
la vitamina K tal como se definió anteriormente. Las realizaciones
preferentes del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K
de la invención se corresponden con las realizaciones preferentes
descritas anteriormente con respecto al procedimiento de la
invención.
En otra realización, el polipéptido modificado
dependiente de la vitamina K de la invención muestra una semivida
funcional aumentada en comparación con la forma no modificada y/o
con la forma natural del polipéptido dependiente de la vitamina K.
La semivida funcional se puede determinar in vitro tal como
se muestra en Lindley y otros (Pharmacokinetics and
pharmacodynamics of recombinant Factor VIIa (Farmacocinéticas y
farmacodinámicas del factor VIIa recombinante), Clin. Pharmacol
Ther. 1994 55:638-648).
La semivida funcional se incrementa normalmente
en, como mínimo, 50%, preferentemente, como mínimo, 100%, más
preferentemente, como mínimo, 200%, incluso más preferentemente,
como mínimo, 500%, en comparación con la forma no modificada y/o con
la forma natural del polipéptido dependiente de la vitamina K.
La semivida funcional de la forma natural del
factor VII humano es de aproximadamente 4 horas. La semivida
funcional de la molécula del factor VII modificado de la invención
es normalmente de, como mínimo, aproximadamente 6 horas,
preferentemente, como mínimo, aproximadamente 10 horas, más
preferentemente, como mínimo, aproximadamente 15 horas, los más
preferente, como mínimo, aproximadamente 24 horas.
La semivida funcional de la forma natural del
factor VIIa humano es de aproximadamente 2 horas. La semivida
funcional de la molécula del factor VIIa modificado de la invención
es normalmente de, como mínimo, aproximadamente 3 horas,
preferentemente, como mínimo, aproximadamente 5 horas, más
preferentemente, como mínimo, aproximadamente 8 horas, los más
preferente, como mínimo, aproximadamente 12 horas.
En general, el polipéptido modificado
dependiente de la vitamina K tiene una estabilidad aumentada en
comparación con la forma no modificada y/o en comparación con la
forma natural del polipéptido dependiente de la vitamina K. Un
aumento en la estabilidad de las moléculas del factor VII modificado
se puede medir, por ejemplo, tal como se describió anteriormente por
los ensayos funcionales.
El polipéptido modificado dependiente de la
vitamina K de la invención normalmente tiene sustancialmente la
misma actividad que la correspondiente a la forma natural y/o a la
forma no modificada del polipéptido dependiente de la vitamina K.
Una actividad "sustancialmente igual" quiere decir, como
mínimo, aproximadamente 10%, preferentemente aproximadamente 50%,
más preferentemente, como mínimo, aproximadamente 75%, los más
preferente, como mínimo, aproximadamente 100% de la actividad de la
forma natural correspondiente y/o de la forma no modificada
correspondiente del polipéptido dependiente de la vitamina K. La
actividad del factor VII/VIIa es la capacidad para convertir el
factor X del sustrato en el factor Xa activo. La actividad de un
polipéptido del factor VII/VIIa se puede medir con los ensayos
descritos en Shaw y otros, 1998, PNAS, Vol. 95, pp.
4229-4234 o en Gabriel y otros 2004, Sem. Hematol.
Vol 41, Supl. 1 pp. 20-24.
La invención se refiere además a un
polinucleótido que codifica un polipéptido modificado dependiente de
la vitamina K tal como se describe en esta solicitud. El término
"polinucleótido(s)" se refiere en general a cualquier
poliribonucleótido o polideoxiribonucleótido que puede ser ARN o ADN
sin modificar, o ARN o ADN modificados. El polinucleótido puede ser
ADN de cadena sencilla o de doble cadena, ARN de cadena sencilla o
de doble cadena. Según se emplea en el presente documento, el
término "polinucleótido(s)" también incluye ADN o ARN
que comprenden una o más bases modificadas y/o bases inusuales,
tales como inosina. Se comprenderá que se pueden hacer una variedad
de modificaciones al ADN y al ARN que servirán para muchos
propósitos útiles conocidos por los expertos en la técnica. El
término "polinucleótido(s)", según se emplea en el
presente documento, abarca formas de polinucleótidos modificados
tanto química, como enzimática o metabólicamente, así como las
formas químicas de ADN y de ARN características de los virus y de
las células, que incluyen, por ejemplo, células simples y
complejas.
El experto en la materia comprenderá que, debido
a la degeneración del código genético, un polipéptido dado se puede
codificar por polinucleótidos diferentes. Estas "variantes" se
encuentran abarcadas por esta invención.
Preferentemente, el polinucleótido de la
invención es un polinucleótido aislado. La expresión polinucleótido
"aislado" se refiere a un polinucleótido que se encuentra
sustancialmente libre de otras secuencias de ácidos nucleicos tales
como y sin limitarse a ellos, otros ADN y ARN cromosómicos y
extracromosómicos. Los polinucleótidos aislados se pueden purificar
desde una célula huésped. Para obtener polinucleótidos aislados, se
pueden utilizar los procedimientos convencionales de purificación
de ácido nucleico conocidos por los expertos en la técnica. La
expresión también incluye polinucleótidos recombinantes y
polinucleótidos sintetizados químicamente.
Otro aspecto más de la invención es un plásmido
o un vector que comprende un polinucleótido de acuerdo con la
invención. Preferentemente, el plásmido o el vector es un vector de
expresión. En una realización en particular, el vector es un vector
de transferencia para su utilización en terapia génica humana.
Otro aspecto adicional de la invención es una
célula huésped que comprende un polinucleótido de la invención o un
plásmido o un vector de la invención.
Las células huésped de la invención se pueden
emplear en un procedimiento de producción de un polipéptido
modificado dependiente de la vitamina K, que es parte de esta
invención. El procedimiento comprende:
- (a)
- el cultivo de células huésped de la invención bajo condiciones tales que se exprese el polipéptido modificado dependiente de la vitamina K y
- (b)
- opcionalmente la recuperación del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K de las células huésped o del medio de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
La producción de proteínas recombinantes en
niveles elevados en células huésped adecuadas requiere el ensamblaje
de los ADNc modificados mencionados anteriormente dentro de
unidades de transcripción eficientes junto con elementos
reguladores adecuados en un vector de expresión recombinante, que se
puede propagar en distintos sistemas de expresión de acuerdo con
procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Los
elementos transcripcionales reguladores eficientes podrían proceder
de virus que tienen células animales como sus huéspedes naturales o
de ADN cromosómico de células animales. Preferentemente, se pueden
utilizar combinaciones de promotor-potenciador
procedentes del Virus Simio 40, adenovirus, poliomavirus BK,
citomegalovirus humano o de la repetición terminal larga del virus
del sarcoma de Rous, o combinaciones de
promotor-potenciador que incluyan genes fuertemente
transcritos de forma constitutiva en células animales como
beta-actina o GRP78. A fin de lograr niveles altos
y estables de ARNm transcrito desde los ADNc, la unidad de
transcripción debería contener en su parte
3'-proximal una región de ADN que codifique una
secuencia transcripcional de
terminación-poliadenilación. Preferentemente, esta
secuencia procede de la región transcripcional temprana del Virus
Simio 40, del gen de beta-globina de conejo, o del
gen activador de plasminógeno de tejido humano.
A continuación los ADNc se integran dentro del
genoma de una línea celular huésped adecuada para la expresión de
las proteínas con dominio Gla modificadas, híbridas,
preferentemente del FIX, FX, proteína C, lo más preferente proteínas
del factor VII. Preferentemente, esta línea celular debería ser
una línea celular de animales de origen vertebrado a efectos de
asegurar un plegamiento correcto, síntesis de dominio Gla,
formación de enlace disulfuro, glicosilación ligada a la asparagina,
glicosilación O-ligada y otras modificaciones
postranslacionales, así como para asegurar la secreción dentro del
medio de cultivo. Ejemplos de otras modificaciones
postranslacionales son la O-sulfatación de tirosina,
hidroxilación y procesado proteolítico de la cadena de polipéptido
naciente. Ejemplos de líneas celulares que se pueden utilizar son
células COS de mono, células L de ratón, células C127 de ratón,
células BHK-21 de hámster, células 293 renales
embrionarias humanas y preferentemente células CHO de hámster.
El vector de expresión recombinante que codifica
los ADNc correspondientes se puede introducir dentro de una línea
celular animal de varias formas diferentes. Por ejemplo, se pueden
crear vectores de expresión recombinante a partir de vectores
basados en distintos virus de animales. Ejemplos de estos son
vectores basados en baculovirus, virus vacunal, adenovirus y
preferentemente virus del papiloma bovino.
Las unidades de transcripción que codifican los
ADN correspondientes también se pueden introducir dentro de células
animales junto con otro gen recombinante que puede funcionar como un
marcador seleccionable dominante en estas células, a fin de
facilitar el aislamiento de clones de células específicas que han
integrado el ADN recombinante dentro de su genoma. Ejemplos de este
tipo de genes marcadores seleccionables dominantes son las
aminoglicósido fosfotransferasas Tn5, que confieren resistencia a la
geneticina (G418), higromicina fosfotransferasa, que confiere
resistencia a la higromicina y puromicina acetil transferasa, que
confiere resistencia a la puromicina. El vector de expresión
recombinante que codifica dicho marcador seleccionable puede
residir en el propio vector como el que codifica el ADNc de la
proteína deseada, o se puede codificar en un vector independiente
que se introduce y se integra de forma simultánea en el genoma de la
célula huésped, lo que con frecuencia da como resultado un fuerte
enlace físico entre las distintas unidades de transcripción.
Otros tipos de genes marcadores seleccionables
que se pueden utilizar junto con el ADNc de la proteína deseada se
basan en varias unidades de transcripción que codifican
dihidrofolato reductasa (dhfr). Después de la introducción de este
tipo de gen dentro de las células que carecen de actividad dhfr
endógena, con preferencia células CHO (DUKX-B11,
DG-44), esto permitirá a estas células crecer en
medios que carezcan de nucleósidos. Un ejemplo de dicho medio es
Ham's F12 sin hipoxantina, timidina ni glicina. Estos
genes-dhfr se pueden introducir junto con las
unidades de transcripción del ADNc del factor de coagulación dentro
de células CHO del tipo anterior, o enlazadas en el mismo vector o
en vectores diferentes, lo que crea de ese modo líneas celulares
dhfr-positivas que producen proteína
recombinante.
Si las líneas celulares anteriores se cultivan
en presencia de metotrexato citotóxico inhibidor de la dhfr,
emergerán nuevas líneas celulares resistentes al metotrexato. Estas
líneas celulares pueden producir proteína recombinante a una
velocidad incrementada debido al número amplificado de dhfr enlazada
y a las unidades de transcripción de las proteínas deseadas. Cuando
se propaguen estas líneas celulares en concentraciones crecientes
de metotrexato (1-10000 nM), se pueden obtener
nuevas líneas celulares que produzcan la proteína deseada a una
velocidad muy elevada.
Las líneas celulares anteriores que producen la
proteína deseada se pueden cultivar a gran escala, en un cultivo en
suspensión o sobre distintos soportes sólidos. Ejemplos de estos
soportes son microvehículos basados en dextrano o en matrices de
colágeno, o soportes sólidos en forma de fibras huecas o distintos
materiales cerámicos. Cuando se cultivan en un cultivo de
suspensión celular o sobre microvehículos, el cultivo de las líneas
celulares anteriores se puede llevar a cabo como un baño de
cultivo, o como un cultivo por perfusión con producción continua de
medio acondicionado durante periodos de tiempo prolongados. Por lo
tanto, de acuerdo con la presente invención, las líneas celulares
anteriores son adecuadas para el desarrollo de un procedimiento
industrial para la producción de las proteínas recombinantes
deseadas.
La proteína recombinante, que se acumula en el
medio de las células secretoras de los tipos anteriores, se puede
concentrar y purificar mediante una diversidad de procedimientos
bioquímicos y cromatográficos, que incluyen procedimientos que
utilizan diferencias en el tamaño, carga, hidrofobicidad,
solubilidad, afinidad específica, etc., entre la proteína deseada y
otras sustancias en el medio de cultivo celular.
Un ejemplo de dicha purificación es la adsorción
de la proteína recombinante en un anticuerpo monoclonal que se
encuentra inmovilizado en un soporte sólido. Después de la
desorción, la proteína puede purificarse de forma adicional mediante
una diversidad de técnicas cromatográficas basadas en las
propiedades anteriores.
Se prefiere purificar el polipéptido modificado
dependiente de la vitamina K de la presente invención hasta una
pureza \geq80%, más preferentemente hasta una pureza \geq95% y
se prefiere en particular un estado farmacéuticamente puro que
tenga una pureza mayor de 99,9% en relación con macromoléculas
contaminantes, en particular con otras proteínas y ácidos nucleicos
y que esté libre de agentes infecciosos y pirogénicos.
Preferentemente, un polipéptido modificado dependiente de la
vitamina K aislado o purificado de la invención se encuentra
sustancialmente libre de otros polipéptidos.
Las proteínas recombinantes descritas en esta
invención se pueden formular dentro de preparados farmacéuticos
para su utilización terapéutica. Las proteínas purificadas se pueden
disolver en disoluciones tampón acuosas convencionales
fisiológicamente compatibles a las que se pueden añadir, de forma
opcional, excipientes farmacéuticos para proporcionar preparados
farmacéuticos.
Los distintos productos de la invención son
útiles como medicamentos. Por consiguiente, la invención se refiere
a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido
modificado dependiente de la vitamina K tal como se describe en el
presente documento, un polinucleótido de la invención, o un plásmido
o un vector de la invención.
Los ADN modificados de esta invención también se
pueden integrar dentro de un vector de transferencia para su
utilización en la terapia génica humana.
Otro aspecto de la invención es la utilización
de un polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tal como
se describe en el presente documento, de un polinucleótido de la
invención, de un plásmido o de un vector de la invención, o de una
célula huésped de la invención para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento o la prevención de un trastorno de la
coagulación sanguínea. Los trastornos de la coagulación sanguínea
incluyen, pero sin limitarse a ella, la hemofilia A.
Preferentemente, el tratamiento comprende terapia génica humana.
La invención también trata de un procedimiento
de tratamiento de un individuo que padece un trastorno de la
coagulación sanguínea tal como la hemofilia A. El procedimiento
comprende la administración al citado individuo de una cantidad
eficaz del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tal
como se describe en el presente documento. En otra realización, el
procedimiento comprende la administración al individuo de una
cantidad eficaz del polinucleótido de la invención o de un plásmido
o un vector de la invención. De forma alternativa, el procedimiento
puede comprender la administración al individuo de una cantidad
eficaz de las células huésped de la invención descrita en el
presente documento.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: comparación de homologías entre el
FVII, proteína C, FIX y FX de origen humano y los de otras
especies.
Figura 2: farmacocinéticas de variantes del FVII
con péptidos de activación insertados de polipéptidos dependientes
de la vitamina K de vida larga.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se describirá además de
forma más detallada en los siguientes ejemplos de la misma. Esta
descripción de realizaciones específicas de la invención se hará
junto con las figuras adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo se inserta la mayor parte del
péptido de activación del FIX dentro del sitio respectivo en el ADNc
del FVII, al tiempo que se preserva el sitio de activación del
FVII.
En primer lugar, ADNc del FVII, insertado dentro
del vector de clonación pIRESpuro3 (Becton Dickinson; plásmido
denominado pFVII-538wt), se preparó para inserción
de secuencias ajenas del péptido de activación mediante la
introducción de un sitio de restricción, NheI, entre los aminoácidos
Ala146 y Ser147 (la numeración se refiere al IDENTIFICADOR DE
SECUENCIA N.º 3). La mutagénesis de centros específicos se llevó a
cabo con un kit de mutagénesis disponible comercialmente (por
ejemplo, Stratagene QuickChange SiteDirected Mutagenesis Kit) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores
utilizados para la mutagénesis se enuncian a continuación, las bases
mutagénicas se indican con letras en negrita.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido resultante se denominó
pFVII-NheI186.
En segundo lugar, los aminoácidos 165 a 194 del
péptido de activación del FIX (la numeración se refiere al
IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 9) se amplificaron en una
construcción de ADNc del FIX mediante reacción en cadena de la
polimerasa utilizando los siguientes cebadores.
Ambos cebadores añadieron un sitio de
restricción NheI (subrayado). El producto de la amplificación se
digirió con NheI y se clonó dentro del pFVII-NheI186
del NheI digerido descrito anteriormente. Después de la verificación
de la orientación correcta, mediante secuenciación de ADN se
llevaron a cabo dos rondas de mutagénesis para realizar la
retromutación de los sitios NheI dentro de las secuencias naturales
del FVII/FIX. Los cebadores mutagénicos se indican a
continuación:
Cebadores para realizar la retromutación del
sitio NheI en el extremo 5'- del inserto del FIX:
Cebadores para realizar la retromutación del
sitio NheI en el extremo 3'- del inserto del FIX:
\newpage
El plásmido de expresión resultante se denominó
pFVII-552. La secuencia de proteína quimérica del
FVII/FIX madura (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 29) resultante se
proporciona a continuación, donde se subraya la secuencia insertada
del péptido de activación del FIX.
Dependiendo de qué secuencias de ADNc se estén
utilizando para la clonación, la proteína quimérica también puede
contener polimorfismos del FVII y del FIX como el polimorfismo del
péptido de activación del FIX
RAE A VFPDVD
YVNSTEAETILDNITQSTQS (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 30).
YVNSTEAETILDNITQSTQS (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 30).
En base al plásmido pFVII-552
se construyó otro plásmido de expresión con secuencias de transición
distintas entre el ADNc del FVII y las secuencias del péptido de
activación del FIX. Para éste, se aplicaron dos rondas de
mutagénesis al pFVII-552 tal como se describió
anteriormente. La primera ronda eliminó los aminoácidos 145 a 147
del IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 29 y utilizó los siguientes
cebadores:
La segunda ronda de mutagénesis insertó 4
aminoácidos entre los aminoácidos 176 y 177 del IDENTIFICADOR DE
SECUENCIA N.º 29 y utilizó los siguientes cebadores:
El plásmido resultante se denominó
pFVII-681. La secuencia de proteína quimérica del
FVII/FIX madura (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 46) resultante se
proporciona a continuación, donde se subraya la secuencia insertada
del péptido de activación del FIX.
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido de activación del FX se amplificó
mediante PCR en un ADNc clonado del FX utilizando los siguientes
cebadores que unen un sitio de restricción NheI (subrayado).
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de PCR que contiene el péptido de
activación del FX se digirió a continuación con NheI y se ligó
dentro de plásmido pFVII-NheI186 (ejemplo 1) del
NheI digerido. En 2 rondas posteriores de mutagénesis de centros
específicos tal como se describió anteriormente, se corrigió la
transición entre la secuencia del ADNc del FVII y el péptido de
activación del FX.
La primera ronda de mutagénesis se llevó a cabo
con los siguientes oligonucleótidos:
La segunda ronda de mutagénesis se llevó a cabo
con los siguientes oligonucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido resultante se denominó
pFVII-611. La secuencia de proteína quimérica del
FVII/FX madura (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 53) resultante se
proporciona a continuación, donde se subraya la secuencia insertada
del péptido de activación del FX.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo el péptido de activación del FX
se inserta dentro del sitio respectivo en el ADNc del FIX
preservando el sitio de activación del FIX.
En primer lugar, el ADNc del FIX en el vector de
clonación pIRESpuro3 (Becton Dickinson) se preparó para inserción de
secuencias ajenas de péptidos de activación mediante la introducción
de dos sitios de restricción: un sitio XbaI entre los aminoácidos
Ser161 y Lys162 y un sitio PinAI entre Thr192 y Gln193 (la
numeración se refiere al IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 9). La
mutagénesis de centros específicos se llevó a cabo con un kit de
mutagénesis disponible comercialmente (por ejemplo, Stratagene
QuickChange SiteDirected Mutagenesis Kit) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Los cebadores utilizados para la
mutagénesis se enuncian a continuación; las bases mutagénicas se
indican con letras en negrita.
\newpage
Cebadores mutagénicos para la introducción del
sitio XbaI:
Cebadores mutagénicos para la introducción del
sitio PinAI:
En segundo lugar, los aminoácidos 159 a 213 del
péptido de activación del FX (la numeración se refiere al
IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 12) se amplificaron mediante la
reacción en cadena de la polimerasa mediante la utilización de los
siguientes cebadores que añaden un sitio XbaI con extremo
5'-terminal y un sitio PinAI con extremo
3'-terminal (subrayados).
El producto de amplificación se digirió con XbaI
y PinAI y se clonó dentro del ADNc del FIX modificado del XbaI y
PinAI digeridos tal como se describió anteriormente. Posteriormente
se llevaron a cabo dos rondas de mutagénesis para realizar la
retromutación de los sitios XbaI y PinAI dentro de secuencias
naturales del FIX y del FX. Los cebadores mutagénicos se indican a
continuación:
Cebadores para realizar la retromutación del
sitio XbaI en el extremo 5'- del inserto del FX:
Cebadores para realizar la retromutación del
sitio PinAI en el extremo 3'- del inserto del FX:
La secuencia de proteína quimérica del FIX/FX
madura (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 41) resultante se proporciona
a continuación, donde se subraya la secuencia insertada del péptido
de activación del FX.
Se cultivaron plásmidos de expresión en E.
coli TOP10 (Invitrogen) y se purificaron mediante la utilización
de protocolos estándar (Qiagen). Se transfectaron células HEK 293
(Invitrogen) mediante la utilización de reactivo Lipofectamine 2000
(Invitrogen) y se cultivaron en medio libre de suero (Invitrogen 293
Express) en presencia de 50 ng/ml de vitamina K3 y de 4 \mug/ml
de puromicina. Las poblaciones de células transfectadas se
dispersaron a través de botellas de cultivo dentro de botellas de
cultivo rotatorias de las que se recolectó el sobrenadante para su
purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se purificaron proteínas del FVII tal como se
describe en la patente EP 0770625. En síntesis, el factor tisular
soluble se acopló de forma covalente a perlas de sefarosa mediante
cianuro de bromo. El sobrenadante del cultivo celular que contiene
el FVII se cargó en un tampón de calcio 10 mM. Las proteínas que no
estaban unidas se quitaron lavando con el mismo tampón. La elución
de las proteínas unidas del FVII se llevó a cabo con un tampón de
citrato de sodio 100 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
El antígeno del FVII se determinó mediante un
ensayo ELISA cuya realización es conocida por los expertos en la
técnica. En síntesis, se incubaron durante la noche a temperatura
ambiente microplacas con 120 \muL por pocillo del anticuerpo de
captura (FVII IgG antihumano de oveja, Cedarlane CL20030AP, diluido
1:1000 en tampón A [Sigma C3041]). Después de lavar las placas tres
veces con tampón B (Sigma P3563), se incubó cada pocillo con 200
\muL de tampón C (Sigma P3688) durante una hora a temperatura
ambiente. Después de otras tres etapas de lavado con tampón B, se
incubaron durante dos horas a temperatura ambiente diluciones en
serie de la muestra de ensayo en tampón B, así como diluciones en
serie de plasma humano estándar (Dade Behring;
50-0,5 mU/mL) en tampón B (volúmenes por pocillo:
100 \muL). Después de tres etapas de lavado con tampón B, se
añadieron a cada pocillo 100 \muL de una dilución 1:5000 en
tampón B del anticuerpo de detección (FVII IgG antihumano de oveja,
Cedarlane CL20030K, marcado con peroxidasa) y se incubaron durante
otras dos horas a temperatura ambiente. Después de tres etapas de
lavado con tampón B, se añadieron 100 \muL de disolución de
sustrato (TMB, Dade Behring, OUVF) por pocillo y se incubaron
durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La
adición de 100 \muL de disolución de parada sin diluir (Dade
Behring, OSFA) preparó las muestras para su lectura en un lector de
microplacas adecuado a una longitud de onda de 450 nm. Las
concentraciones de las muestras de ensayo se calcularon a
continuación mediante la utilización de la curva estándar con plasma
humano estándar como referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se administraron por vía intravenosa proteínas
naturales y modificadas del FVII a ratas Lewis CD narcotizadas (6
ratas por sustancia) con una dosis de 100 \mug/kg de peso
corporal. Se extrajeron muestras de sangre de la arteria carótida de
3 ratas a los 5, 30, 60, 120 y 480 minutos y de las otras 3 a los
15, 45, 90 y 240 minutos después de la aplicación de las sustancias
de ensayo. Posteriormente se cuantificó el contenido del antígeno
del FVII mediante un ensayo ELISA específico para el factor VII
humano (véase anteriormente). En la figura 2 se muestran las
concentraciones medias del antígeno del FVII para cada grupo. La
Tabla 5 resume las semividas calculadas para las fases de
eliminación alfa y beta, mediante lo cual la fase alfa se definió
entre 5 y 30 minutos y la fase beta a partir de 30 min hasta el
último punto de tiempo con concentraciones por encima del límite de
detección del ensayo del antígeno. Los cálculos se hicieron de
acuerdo con la fórmula T_{1/2}=In2/k, bajo la cual k es la
pendiente de la línea de regresión.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos muestran claramente que la sustitución
del presunto péptido de activación nativo del FVII por un péptido de
activación procedente de factores de protrombina de vida más larga
amplía de forma significativa las semividas in vivo de las
proteínas en comparación con la proteína natural del FVII.
<110> ZLB Behring GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Polipéptidos modificados
dependientes de la vitamina K
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2004/M009-A90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 04019485.4
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-08-17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sápiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (181)..(1398)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1398)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 466
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sápiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 406
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sápiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Glu o ácido
gamma-carboxiglutámico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Glu o ácido
gamma-carboxiglutámico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Glu o ácido
gamma-carboxiglutámico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Glu o ácido
gamma-carboxiglutámico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Glu o ácido
gamma-carboxiglutámico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29)..(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Glu o ácido
gamma-carboxiglutámico
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggccttggg gtttgctagc atttcttttt tctagaatag g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggctagcg ctgagactgt ttttcctg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgctagct tgggtgcttt gagtgatg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagaaaaaa gaaatgctcg tgctgagact gtttttcctg atgtgg
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacatcagg aaaaacagtc tcagcacgag catttctttt ttctag
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcactcaa agcacccaat caagcaaacc ccaaggccga attg
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaattcggcc ttggggtttg cttgattggg tgctttgagt gatg
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 436
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Quimera del FVII/FIX
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Quimera del FVII/FIX
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(436)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sápiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagagtttc tgtttcacaa acttctagac tcacccgtgc tgagac
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtctcagcac gggtgagtct agaagtttgt gaaacagaaa ctcttc
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggataacatc actcaaagca ccggttcatt taatgacttc actcgggttg
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacccgagt gaagtcatta aatgaaccgg tgctttgagt gatgttatcc
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgtctagaa ggaagaggtc agtggccc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacaccggtg aggttgttgt cgccc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagtttctgt ttcacaaact tctcgcagga agaggtcagt gg
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccactgacct cttcctgcga gaagtttgtg aaacagaaac tc
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgacaacaa cctcacccaa tcatttaatg acttcactcg ggttg
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacccgagt gaagtcatta aatgattggg tgaggttgtt gtcgc
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 439
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de proteína quimérica del
FIX/FX
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Quimera del FIX/FX
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(439)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador directo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctattctaga aaaaagagct gagactgttt ttcctgatg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador inverso
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcaggaaa aacagtctca gctctttttt ctagaatag
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador directo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(41)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaagcaccc aatcaaagcg gaatgctagc aaaccccaag g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador inverso
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(41)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttggggtt tgctagcatt ccgctttgat tgggtgcttt g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 436
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Quimera del FVII/FIX
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Quimera del FVII/FIX
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(436)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador directo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggctagcc aggccaccag cagcag
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador inverso
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(37)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggctagca ttccgcttct caggctgcgt ctggttg
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador directo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(44)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctattctag aaaaaagaaa tgcccaggcc accagcagca gcgg
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador inverso
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(44)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgctgctgc tggtggcctg ggcatttctt ttttctagaa tagg
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador directo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(46)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctattctag aaaaaagcgt ggcccaggcc accagcagca gcgggg
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador inverso
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(46)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccccgctgct gctggtggcc tgggccacgc ttttttctag aatagg
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 451
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Quimera del FVII/FX
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Quimera del FVII/FX
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(451)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (36)
1. Procedimiento para la preparación de un
polipéptido modificado dependiente de la vitamina K que comprende la
modificación del péptido de activación de un primer polipéptido
dependiente de la vitamina K de forma que el polipéptido modificado
dependiente de la vitamina K tiene una semivida aumentada en
comparación con el primer polipéptido dependiente de la vitamina K
en el que el péptido de activación no se ha modificado,
procedimiento en el que la proteína dependiente de la vitamina K se
selecciona entre un listado compuesto por factor VII, factor IX,
factor X, protrombina y sus formas activadas, proteína S, proteína C
y proteína Z y
- a.
- en el que el péptido de activación modificado comprende, como mínimo, parte de la secuencia de aminoácidos de un segundo polipéptido dependiente de la vitamina K y
- b.
- en el que la citada parte de la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K es
- i.
- como mínimo, 3 aminoácidos contiguos del péptido de activación del FVII,
- ii.
- como mínimo, 5 aminoácidos contiguos del péptido de activación del FX, o
- iii.
- como mínimo, 5 aminoácidos contiguos del péptido de activación del FIX a condición de que se excluya el péptido QSFNDFTR, o
- iv.
- como mínimo, 8 aminoácidos contiguos del péptido de activación de la protrombina, o
- v.
- como mínimo, un tramo de aminoácidos contiguos del péptido de activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K que tiene una longitud de, como mínimo, 15% de la longitud total de la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K, en el que el segundo polipéptido dependiente de la vitamina K se selecciona entre el grupo compuesto por proteína Z y proteína S.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en
el que la semivida plasmática del segundo polipéptido dependiente de
la vitamina K es mayor que la del primer polipéptido no modificado
dependiente de la vitamina K.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1 y 2,
en el que la modificación comprende la sustitución de, como mínimo,
dos aminoácidos del péptido de activación del primer polipéptido
dependiente de la vitamina K.
4. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la citada parte del péptido de
activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K
consta de, como mínimo, 8 aminoácidos contiguos en la secuencia de
aminoácidos del péptido de activación del segundo polipéptido
dependiente de la vitamina K.
5. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la modificación comprende la
sustitución del péptido de activación completo del primer
polipéptido dependiente de la vitamina K con el péptido de
activación completo del segundo polipéptido dependiente de la
vitamina K, al tiempo que se preserva la especificidad de activación
del primer polipéptido dependiente de la vitamina K.
6. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la modificación comprende (i) la
eliminación del sitio de corte entre la cadena ligera y el péptido
de activación del primer polipéptido dependiente de la vitamina K o
(ii) la eliminación del sitio de corte entre el péptido de
activación y la cadena pesada del primer polipéptido dependiente de
la vitamina K.
7. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la forma activada del polipéptido
modificado dependiente de la vitamina K tiene una semivida
plasmática aumentada en comparación con la forma activada del
polipéptido no modificado dependiente de la vitamina K.
8. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la forma activada del polipéptido
modificado dependiente de la vitamina K tiene una semivida
plasmática aumentada en comparación con la forma activada del
polipéptido no modificado dependiente de la vitamina K y en el que
el péptido de activación modificado del polipéptido modificado
dependiente de la vitamina K se libera después de la activación del
polipéptido modificado dependiente de la vitamina K.
9. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la forma del zimógeno del
polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tiene una
semivida plasmática aumentada en comparación con la forma del
zimógeno del polipéptido no modificado dependiente de la vitamina K
y en el que el péptido de activación modificado del polipéptido
modificado dependiente de la vitamina K se libera después de la
activación del polipéptido modificado dependiente de la vitamina
K.
10. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la forma activada del polipéptido
modificado dependiente de la vitamina K tiene una semivida
plasmática aumentada en comparación con la forma activada del
polipéptido no modificado dependiente de la vitamina K y en el que
el péptido de activación modificado del polipéptido modificado
dependiente de la vitamina K después de la activación del
polipéptido modificado dependiente de la vitamina K permanece unido
de forma covalente a la cadena ligera o a la cadena pesada del
polipéptido modificado dependiente de la vitamina K.
11. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la forma del zimógeno del
polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tiene una
semivida plasmática aumentada en comparación con la forma del
zimógeno del polipéptido no modificado dependiente de la vitamina K
y en el que el péptido de activación modificado del polipéptido
modificado dependiente de la vitamina K después de la activación del
polipéptido modificado dependiente de la vitamina K permanece unido
de forma covalente a la cadena ligera o a la cadena pesada del
polipéptido modificado dependiente de la vitamina K.
12. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que el primer polipéptido dependiente
de la vitamina K es el factor VII o el VIIa humano.
13. Procedimiento, según la reivindicación 12,
en el que la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del
segundo polipéptido dependiente de la vitamina K se selecciona entre
el grupo compuesto por el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 18 y el
IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 19.
14. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que el primer polipéptido dependiente
de la vitamina K es la proteína C humana y en el que la secuencia de
aminoácidos del péptido de activación del segundo polipéptido
dependiente de la vitamina K se selecciona entre el grupo compuesto
por el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 18 y el IDENTIFICADOR DE
SECUENCIA N.º 19.
15. Procedimiento, según la reivindicación 13,
en el que el primer polipéptido dependiente de la vitamina K es el
factor IX humano y en el que el péptido de activación del segundo
polipéptido dependiente de la vitamina K tiene la secuencia de
aminoácidos tal como la que se muestra en el IDENTIFICADOR DE
SECUENCIA N.º 19.
16. Polipéptido modificado dependiente de la
vitamina K que comprende un péptido de activación modificado, en el
que el polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tiene una
semivida aumentada en comparación con el polipéptido dependiente de
la vitamina K en el que el péptido de activación no se ha
modificado, procedimiento en el que la proteína dependiente de la
vitamina K se selecciona entre un listado compuesto por factor VII,
factor IX, actor X, protrombina y sus formas activadas, proteína S,
proteína C y proteína Z y
- a.
- en el que el péptido de activación modificado comprende, como mínimo, parte de la secuencia de aminoácidos de un segundo polipéptido dependiente de la vitamina K y
- b.
- en el que la citada parte de la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K es
- i.
- como mínimo, 3 aminoácidos contiguos del péptido de activación del FVII, o
- ii.
- como mínimo, 5 aminoácidos contiguos del péptido de activación del FX, o
- iii.
- como mínimo, 5 aminoácidos contiguos del péptido de activación del FIX a condición de que se excluya el péptido QSFNDFTR, o
- iv.
- como mínimo, 8 aminoácidos contiguos del péptido de activación de la protrombina, o
- v.
- como mínimo, un tramo de aminoácidos contiguos del péptido de activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K que tiene una longitud de, como mínimo, el 15% de la longitud total de la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del segundo polipéptido dependiente de la vitamina K, en el que el segundo polipéptido dependiente de la vitamina K se selecciona entre el grupo compuesto por proteína Z y proteína S.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Polipéptido modificado dependiente de la
vitamina K según la reivindicación 16, en el que la parte del
péptido de activación de los polipéptidos diferentes dependientes de
la vitamina K consta de, como mínimo, 8 aminoácidos contiguos en la
secuencia de aminoácidos del péptido de activación del polipéptido
diferente dependiente de la vitamina K.
18. Polipéptido modificado dependiente de la
vitamina K, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17, en
el que el polipéptido modificado dependiente de la vitamina K se
selecciona entre el grupo compuesto por factor VII humano
modificado, factor IX humano modificado y proteína C humana
modificada.
\newpage
19. Polipéptido modificado dependiente de la
vitamina K, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en
el que el polipéptido modificado dependiente de la vitamina K es el
factor VII humano modificado en el que, como mínimo, se han
sustituido dos aminoácidos del péptido de activación con una
secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por
el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 18 y por el IDENTIFICADOR DE
SECUENCIA N.º 19.
20. Polipéptido modificado dependiente de la
vitamina K, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en
el que el polipéptido modificado dependiente de la vitamina K es
proteína C humana modificada en la que, como mínimo, se han
sustituido dos aminoácidos del péptido de activación con una
secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por
el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 18 y por el IDENTIFICADOR DE
SECUENCIA N.º 19.
21. Polipéptido modificado dependiente de la
vitamina K, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en
el que el polipéptido modificado dependiente de la vitamina K es el
factor IX modificado en el que el péptido de activación se ha
sustituido con la secuencia de aminoácidos tal como la que se
muestra en el IDENTIFICADOR DE SECUENCIA N.º 19.
22. Polipéptido modificado dependiente de la
vitamina K, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, en
el que la semivida del polipéptido modificado dependiente de la
vitamina K se incrementa en, como mínimo, 50% en comparación con el
polipéptido dependiente de la vitamina K correspondiente en el que
no se ha modificado el péptido de activación.
23. Polipéptido modificado dependiente de la
vitamina K, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, en
el que el polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tiene
una estabilidad aumentada en comparación con el polipéptido
dependiente de la vitamina K correspondiente en el que no se ha
modificado el péptido de activación.
24. Polipéptido modificado dependiente de la
vitamina K, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23,
que tiene actividad coagulante.
25. Polipéptido modificado dependiente de la
vitamina K, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24,
caracterizado por que
- i.
- la forma activada del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K no comprende el péptido de activación modificado y
- ii.
- la forma del zimógeno del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tiene una semivida aumentada en comparación con la forma del zimógeno del polipéptido no modificado dependiente de la vitamina K.
\vskip1.000000\baselineskip
26. Polipéptido modificado dependiente de la
vitamina K, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24,
caracterizado por que
- i.
- la forma activada del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K comprende el péptido de activación modificado y
- ii.
- la forma activada del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K tiene una semivida aumentada en comparación con la forma activada del polipéptido no modificado dependiente de la vitamina K.
\vskip1.000000\baselineskip
27. Polinucleótido que codifica un polipéptido
modificado dependiente de la vitamina K según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 26.
28. Plásmido o vector que comprende un
polinucleótido según la reivindicación 27.
29. Plásmido o vector, según la reivindicación
28, que es un vector de expresión.
30. Vector, según la reivindicación 28, que es
un vector de transferencia para su utilización en terapia génica
humana.
31. Célula huésped que comprende un
polinucleótido según la reivindicación 27 o un plásmido o un vector
según una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 excepto células
embrionarias humanas y células germinales humanas.
32. Procedimiento para la producción de un
polipéptido modificado dependiente de la vitamina K, que
comprende:
- -
- el cultivo de células huésped, según la reivindicación 31, bajo condiciones tales que se exprese el polipéptido modificado dependiente de la vitamina K y
- -
- opcionalmente la recuperación del polipéptido modificado dependiente de la vitamina K de las células huésped o del medio de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
33. Composición farmacéutica que comprende un
polipéptido modificado dependiente de la vitamina K según una
cualquiera de las reivindicaciones 16 a 26, un polinucleótido según
la reivindicación 27, o un plásmido o un vector según una cualquiera
de las reivindicaciones 28 a 30.
34. Utilización de un polipéptido modificado
dependiente de la vitamina K según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 26, de un polinucleótido según la
reivindicación 27, de un plásmido o de un vector según una
cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, o de una célula huésped
según la reivindicación 31 para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento o la prevención de un trastorno de la
coagulación sanguínea.
35. Utilización, según la reivindicación 34, en
la que el trastorno de la coagulación sanguínea es hemofilia A.
36. Utilización, según las reivindicaciones 34 ó
35, en la que el tratamiento comprende terapia génica humana.
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