ES2945160T3 - Dominios Gla como agentes terapéuticos - Google Patents

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ES2945160T3 ES19160280T ES19160280T ES2945160T3 ES 2945160 T3 ES2945160 T3 ES 2945160T3 ES 19160280 T ES19160280 T ES 19160280T ES 19160280 T ES19160280 T ES 19160280T ES 2945160 T3 ES2945160 T3 ES 2945160T3
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cancer
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Maxine Bauzon
Terry Hermiston
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Gladiator Biosciences Inc
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Abstract

La divulgación se relaciona con las proteínas del dominio Gla recombinante y su uso dirigido a restos de fosfatidilserina (PtdS) en la superficie de las células, particularmente aquellas que expresan niveles elevados de PtdS, como las células que experimentan apoptosis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Dominios Gla como agentes terapéuticos
ANTECEDENTES
[0001] Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad para la solicitud provisional de EE. UU. con número de serie 61/791,537 presentada el 15 de marzo de 2013 y la solicitud provisional de EE. UU. con número de serie 61/787,753, presentada el 15 de marzo de 2013.
1. Campo
[0002] Esta descripción se refiere a la dirección de la fosfatidilserina (PtdS) en las membranas celulares usando péptidos y polipéptidos del dominio Gla. Se describe el uso de estos péptidos y polipéptidos como agentes terapéuticos.
2. Técnica relacionada
[0003] La fosfatidliserina (PtdS) es un componente de fosfolípido con carga negativa normalmente localizado en la hoja interna (el lado citoplásmico) de la membrana celular. Sin embargo, la scramblasa (un miembro de la familia de las flipasas) puede transportar la PtdS desde la hoja interna a la hoja externa y exponerla en la superficie celular. Con muy pocas excepciones, esta externalización activa de PtdS es una respuesta al daño celular (van den Eijnde et al., 2001; Erwig y Henson, 2008). Por ejemplo, la lesión tisular indica a las plaquetas, los leucocitos y las células endoteliales que redistribuyan rápida y reversiblemente el PtdS, lo que conduce a la promoción de la coagulación y la activación del complemento en las superficies celulares. De manera similar, las señales apoptóticas dan como resultado la externalización de PtdS, aunque de una manera más gradual y sostenida. Este PtdS externo proporciona un marcador de reconocimiento clave que permite a los macrófagos ingerir células moribundas del tejido circundante mientras suprime una respuesta inmunitaria completa y perjudicial (Erwig y Henson, 2008). Este proceso de eliminación es esencial para la homeostasis de los tejidos y en un ambiente "saludable" es extremadamente eficiente. De hecho, a pesar de la pérdida de >109 células por día, la detección histológica de células apoptóticas es un evento raro en tejidos normales (Elltiot y Ravichandran, 2010; Elltiot et al., 2009). Sin embargo, existe evidencia de que en muchas condiciones patológicas el proceso de eliminación de células apoptóticas se ve abrumado, retrasado o ausente (Elltiot y Ravichandran, 2010; Lahorte et al., 2004). Por ejemplo, varios estudios de oncología sugieren que un índice apoptótico alto se asocia con tumores de mayor grado, mayor tasa de metástasis y un mal pronóstico para el paciente (Naresh et al., 2001; Loose et al., 2007; Kurihara et al., 2008); Kietselaer et al., 2002). Estos estudios, y otros similares, sugieren que la apoptosis y la expresión de PtdS externa pueden ser un poderoso marcador de enfermedad (Elltiot y Ravichandran, 2010).
Hay varias proteínas con una alta afinidad por las superficies de fosfolípidos aniónicos, siendo la anexina-V la más ampliamente utilizada como sonda dirigida a PtdS (Lahorte et al., 2004). Con una alta afinidad por las vesículas que contienen PtdS (Kd = 0,5-7 nM) y un peso molecular (37 kDa) que cae por debajo del umbral para la filtración renal (aproximadamente 60 kDa), la anexina-V se ha mostrado prometedora en la clínica como apoptosis -sonda (Lin et al., 2010; Tait y Gibson, 1992). Además, se ha utilizado para una amplia gama de indicaciones, incluidas las de oncología, neurología y cardiología (Lahorte et al., 2004; Boersma et al., 2005; Reutelingsperger et al., 2002). Se ha demostrado el uso de sondas biológicas que se dirigen a la expresión de la superficie celular de PtdS tanto in vitro como in vivo: Blankenberg, 2009 revela la obtención de imágenes de las firmas moleculares de la lesión por apoptosis con anexina V radiomarcada. Si bien su utilidad en la clínica es prometedora, tienen, en su mayor parte, aún no ha sido explotado.
[0004] Okada et al, 2010 analiza una nueva mutación del sitio de empalme en el intrón C de PROS1 que conduce a un nivel de ARNm mutante notablemente reducido, ausencia de región sensible a la trombina y alteración de la secreción y la actividad del cofactor de la proteína S mutante.
[0005] Wijnen et al, 1998 analiza la caracterización de la miniproteína S, que es una variante recombinante de la proteína S que carece del dominio similar a la globulina que se une a la hormona sexual.
[0006] Schutters y Reutelingsperger, 2010 analiza el direccionamiento de fosfatidilserina para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades humanas. El documento US 6.312.694 describe métodos para tratar el cáncer utilizando conjugados terapéuticos que se unen a aminofosfolípidos.
RESUMEN
[0007] Por lo tanto, de acuerdo con la presente divulgación, se proporciona una sonda y/o un polipéptido terapéutico adecuado para dirigirse a la expresión de la superficie celular de fosfatidilserina tanto in vitro como in vivo, dicho polipéptido que comprende:
una proteína S gamma-ácido carboxiglutámico (Gla) y
un dominio EGF,
en el que dicho polipéptido está fusionado con una secuencia proteica; y
en el que dicho polipéptido carece de un dominio de proteasa y también carece de un dominio de unión a hormonas. Las moléculas de acuerdo con la descripción se dirigen a la fosfatidilserina de la membrana celular diana. La membrana celular puede ser una membrana celular cardíaca, una membrana celular neuronal, una membrana celular endotelial, una membrana celular infectada por virus, una membrana celular apoptótica, una membrana plaquetaria, una verícula derivada de membrana plasmática (PMV) o una membrana celular cancerosa. El polipéptido puede comprender además un dominio Kringle y/o un dominio de pila de aminoácidos aromáticos. El polipéptido puede comprender un marcador detectable, tal como un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador radiactivo, una enzima, un colorante o un ligando.
[0008] El polipéptido puede tener 300 residuos o menos, 200 residuos o menos, o 100 residuos o menos, incluyendo rangos de 100-200 y 100-300 residuos. El polipéptido puede comprender de 5 a 15 residuos de Gla, de 9 a 13 residuos de Gla, incluidos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 residuos de Gla. El polipéptido puede comprender más de 13 residuos Gla, pero menos del 30 % de residuos Gla totales. El polipéptido puede tener un tamaño de entre aproximadamente 4,5 y 30 kD. El polipéptido puede comprender al menos un enlace disulfuro o 2-5 enlaces disulfuro. El polipéptido puede comprender un dominio EGF de proteína S. El polipéptido puede comprender además una región Fc de anticuerpo. Cualquiera de los anteriores puede contener sustituciones conservativas de las secuencias nativas de las proteínas anteriores y/o exhibir un porcentaje de homología con los dominios nativos establecidos.
[0009] El polipéptido descrito en el presente documento es útil para tratar el cáncer en un sujeto. El cáncer puede ser cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de estómago, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de testículo, cáncer de colon, cáncer de piel, cáncer de recto, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de cabeza y cuello o cáncer de esófago. El sujeto puede tratarse con una segunda terapia contra el cáncer, tal como una inmunoterapia, una radioterapia, una quimioterapia, una terapia con toxinas, una terapia con citoquinas o una terapia con hormonas.
[0010] El polipéptido descrito en el presente documento es útil para tratar una enfermedad autoinmune. La enfermedad autoinmune puede ser espondiloartropatía, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, artritis reactiva, artritis enteropática, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad del intestino irritable, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, fiebre mediterránea familiar, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de Sjogren, artritis temprana, artritis viral, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, psoriasis, vasculitis, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Addison, alopecia, síndrome antifosfolípido, enfermedad de Behcet, enfermedad celíaca, síndrome de fatiga crónica, colitis ulcerosa, diabetes tipo I, fibromialgia, gastritis autoinmune, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), miastenia grave, pénfigo vulgar, cirrosis biliar primaria, fiebre reumática, sarcoidosis, esclerodermia, vitíligo, vasculitis, vasculitis de vasos pequeños, hepatitis, cirrosis biliar primaria, sarcoidosis, esclerodermia, enfermedad de injerto contra huésped (aguda y crónica), anemia aplásica o neutropenia cíclica. El sujeto también puede tratarse con una segunda terapia de enfermedad autoinmune, como prednisona, metilprednisona, Venipred, Celestone, hidrocortisona, triamcinoclona, inyección intraarticular de Aristonpan, Metapred, Rayos oral, betametasona o etanercept.
[0011] El polipéptido descrito en el presente documento es útil para tratar una enfermedad viral en un sujeto. La enfermedad viral puede ser influenza, virus de la inmunodeficiencia humana, virus del dengue, virus del Nilo Occidental, virus de la viruela, virus respiratorio sincitial, virus de la fiebre hemorrágica coreana, varicela, virus de la varicela zoster, virus del herpes simple 1 o 2, virus de Epstein-Barr, virus de Marburg., hantavirus, virus de la fiebre amarilla, hepatitis A, B, C o E, virus del Ébola, virus del papiloma humano, rinovirus, virus Coxsackie, virus de la poliomielitis, virus del sarampión, virus de la rubéola, virus de la rabia, virus de la enfermedad de Newcastle, rotavirus, HTLV-1 y -2.
[0012] El sujeto puede tratarse adicionalmente con una segunda terapia antiviral, como Abacavir, Aciclovir, Aciclovir, Adefovir, Amantadina, Amprenavir, Ampligen, Arbidol, Atazanavir, Atripla, Boceprevirertet, Cidofovir, Combivir, Darunavir, Delavirdina, Didanosina, Docosanol, Edoxudina, Efavirenz, Emtricitabina, Enfuvirtida, Entecavir, Inhibidores de entrada, Famciclovir, Fomivirsen, Fosamprenavir, Foscarnet, Fosfonet, Ganciclovir, Ibacitabina, Imunovir, Idoxuridina, Imiquimod, Indinavir, Inosina, Inhibidor de la integrasa, Interferón tipo III, Interferón tipo II, interferón tipo I, interferón, lamivudina, lopinavir, loviride, maraviroc, moroxidina, metisazona, nelfinavir, nevirapina, nexavir, análogos de nucleósidos, oseltamivir, peginterferón alfa-2a, penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, inhibidor de la proteasa, raltegravir, transcriptasa inversa inhibidor, ribavirina, rimantadina, ritonavir, piramidina, saquinavir, estavudina, potenciador sinérgico (antirretroviral), aceite de árbol de té, telaprevir, tenofovir, tenofovir disoproxilo, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, vaganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, Zalcitabina, Zanamivir o Zidovudina.
[0013] El polipéptido descrito en el presente documento es útil para tratar un trastorno de hipercoagulación. El sujeto puede tratarse además con uno o más anticoagulantes adicionales.
[0014] El polipéptido descrito en el presente documento es útil para modular la coagulación en un sujeto. Al sujeto se le puede administrar además un factor de coagulación.
[0015] El polipéptido descrito en el presente documento es útil para tratar la sepsis en un sujeto. El polipéptido descrito en el presente documento es útil en el tratamiento de la crisis vasooclusiva en un sujeto con células falciformes.
[0016] Finalmente, el polipéptido descrito en el presente documento es útil en el tratamiento de un trastorno caracterizado por la expresión patológica de fosfatidilserina en la superficie de una célula.
[0017] Otros objetos, características y ventajas de la presente descripción se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, si bien indican formas de realización específicas de la divulgación, se proporcionan únicamente a modo de ilustración.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0018] Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente divulgación. La descripción puede entenderse mejor con referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con los detallados.
FIG. 1 - Construcción de un panel de proteínas de dominio Gla y Gla-EGHKringle.
FIG. 2 - Prueba de construcciones de proteína de dominio Gla para la expresión. Transfección transitoria en células 293 utilizando 293cellFectin. Geles al 10% con muestras reducidas, 23,3 μl de medio cargado.
FIG. 3 - Prueba de expresión de construcciones de proteína de dominio Gla. Transfección transitoria en células BHK21. Geles al 10 % con muestras reducidas, 20 μl (1 /100 del sedimento celular total) cargados.
FIG. 4 - Cambio de secuencia de la señal altera la secreción. Transfección transitoria en células BHK21. Geles al 10% con muestras reducidas, 13,3 μl cargados.
FIG. 5 - Proteína S Gla secuencia EGF.
FIG.6 - Purificación de Proteína S Gla EGF. F1-F4 son fracciones de cromatografía en columna. Geles al 10%, condiciones no reductoras.
FIG. 7 - Ensayos de Apoptosis para Proteína S Gla EGF. Los paneles superior e inferior representan procedimientos duplicados idénticos excepto que se redujeron las cantidades de Proteína S Gla EGF y se redujo la cantidad de anticuerpo anti-dominio His.
FIG. 8 - Ensayos de Apoptosis para Proteína S Gla EGF. Los paneles superior e inferior representan procedimientos duplicados idénticos excepto por las cantidades de anexina V utilizadas, que son el doble en los paneles inferiores.
DESCRIPCIÓN DE FORMAS DE REALIZACIÓN ILUSTRATIVAS
[0019] Al igual que la anexina, las proteínas del dominio del ácido gamma-carboxiglutámico (Gla) tales como los Factores II, VII, IX, X, la proteína C y la proteína S se unen a las membranas aniónicas. De hecho, el dominio Gla se ha utilizado como modelo para una molécula pequeña que se diseñó racionalmente para ser una sonda específica de apoptosis (Cohen et al., 2009). El uso de estas proteínas específicas y de origen natural puede dar lugar a una mayor especificidad en relación con las sondas actuales con la ventaja añadida de un tamaño más pequeño (<30 kDa). Incluso en formas de realización más grandes, que incluirían dominios EGF y/o Kringle, estas proteínas aún pueden ser más pequeñas que la anexina V (37 kDa), y potencialmente tan pequeñas como <5 kDa. Estas sondas biológicas pueden dirigirse a la expresión de la superficie celular de PtdS tanto in vitro como in vivo. Por tanto, es posible desarrollar una sonda dirigida a la apoptosis/enfermedad que sea superior a la anexina V en afinidad, especificidad y tamaño con el potencial añadido para su uso como agente terapéutico. Estos y otros aspectos de la divulgación se describen con mayor detalle a continuación.
[0020] Cuando sea apropiado, los términos usados en singular también incluirán el plural y viceversa. En el caso de que cualquier definición establecida a continuación entre en conflicto con el uso de esa palabra en cualquier otro documento, la definición establecida a continuación siempre prevalecerá a efectos de interpretar esta especificación y sus reivindicaciones asociadas, a menos que se pretenda claramente un significado contrario (por ejemplo, en el documento donde se usa originalmente el término). El uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. El uso de "un" aquí significa "uno o más" a menos que se indique lo contrario o cuando el uso de "uno o más" sea claramente inapropiado. El uso de "comprende", "comprende", "que comprende", "incluye", "incluye" e "incluyendo" son intercambiables y no limitativos. Por ejemplo, el término "incluido" significará "incluido, entre otros". La palabra "sobre" significa más o menos el 5% del número indicado.
[0021] Un "péptido o polipéptido aislado", como se usa en el presente documento, se refiere a un péptido o polipéptido que está sustancialmente libre de otras moléculas biológicas, incluidos péptidos o polipéptidos que tienen secuencias distintas. En algunas formas de realización, el péptido o polipéptido aislado es al menos aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 99 %, aproximadamente un 99,9 % o aproximadamente un 100 % puro en peso seco. En algunas formas de realización, la pureza se puede medir mediante un método como cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis HPLC.
[0022] Como se usa en este documento, "sustituciones conservadoras" se refiere a modificaciones de un polipéptido que implican la sustitución de uno o más aminoácidos por aminoácidos que tienen propiedades bioquímicas similares que no dan como resultado la pérdida de una función biológica o bioquímica del polipéptido. Una "sustitución conservativa de aminoácidos" es aquella en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificación p (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Los anticuerpos de la presente descripción pueden tener una o más sustituciones de aminoácidos conservativas y aún así conservar la actividad de unión al antígeno.
[0023] Para ácidos nucleicos y polipéptidos, el término "homología sustancial" indica que dos ácidos nucleicos o dos polipéptidos, o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean y comparan de manera óptima, son idénticos, con inserciones o deleciones de nucleótidos o aminoácidos apropiadas, en al menos menos alrededor del 80% de los nucleótidos o aminoácidos, generalmente al menos alrededor del 85 %, en algunas formas de realización alrededor del 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 %, en al menos una forma de realización en al menos aproximadamente el 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 % o 99,5 % de los nucleótidos o aminoácidos. Alternativamente, existe una homología sustancial para los ácidos nucleicos cuando los segmentos se hibridarán en condiciones de hibridación selectiva con el complemento de la hebra. También se incluyen secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de polipéptidos que tienen una homología sustancial con las secuencias de ácidos nucleicos y las secuencias de aminoácidos específicas enumeradas en el presente documento.
[0024] El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada espacio, que debe introducirse para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matemático, como, entre otros, el módulo AlignX™ de VectorNTI™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Para AlignX™, los parámetros predeterminados de alineación múltiple son: penalización por apertura de espacios: 10; penalización de extensión de brecha: 0,05; rango de penalización de separación de huecos: 8; % de identidad para retraso de alineación: 40. (más detalles en world-wide-web en invitrogen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEA-CommunitiesNector-NTI-Community/Sequenceanalysisand- software de administración de datos para PC/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance.reg.us.html).
[0025] Otro método para determinar la mejor coincidencia general entre una secuencia de consulta (una secuencia de la presente divulgación) y una secuencia de sujeto, también denominada alineación de secuencia global se puede determinar utilizando el programa informático CLUSTALW (Thompson et al., Nucleic Acids Res, 1994, 2(22): 4673-4680), que se basa en el algoritmo de Higgins et al., Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 1992, 8(2): 189-191). En una alineación de secuencias, las secuencias de consulta y sujeto son secuencias de ADN. El resultado de la alineación de la secuencia global está en porcentaje de identidad. Los parámetros que se pueden usar en una alineación CLUSTALW de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad a través de alineaciones por pares son: Matriz = IUB, k-tupla = 1, Número de diagonales superiores = 5, Penalización de brecha = 3, Penalización de brecha abierta = 10, Brecha Penalización de Extensión = 0,1. Para alineaciones múltiples, se pueden usar los siguientes parámetros CLUSTALW: penalización por apertura de espacio = 10, parámetro de extensión de espacio = 0,05; Intervalo de penalización por separación de huecos = 8; % de identidad para retraso de alineación = 40.
[0026] Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico se "aísla" o "se vuelve sustancialmente puro" cuando se purifica de otros componentes celulares con los que normalmente se asocia en el entorno natural. Para aislar un ácido nucleico, se pueden usar técnicas estándar como las siguientes: tratamiento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras bien conocidas en la técnica.
I. Fosfatidilserina (PtdS)
A. Estructura y síntesis
[0027] La fosfatidilserina (abreviada PtdS, Ptd-L-Ser o PS) es un componente de fosfolípido, generalmente mantenido en la valva interna (el lado citosólico) de las membranas celulares por una enzima llamada flipasa. Cuando una célula sufre apoptosis, la fosfatidilserina ya no está restringida a la parte citosólica de la membrana, sino que queda expuesta en la superficie de la célula. La fórmula química de PtdS es C13H24NO10P y tiene una masa molecular de 385,304. La estructura se muestra a continuación:
Figure imgf000006_0001
[0028] La fosfatidilserina se biosintetiza en bacterias condensando el aminoácido serina con ácido fosfatídico activado por CDP (difosfato de citidina). En los mamíferos, la fosfatidilserina se produce mediante reacciones de intercambio de bases con fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina. Por el contrario, la fosfatidilserina también puede dar lugar a fosfatidiletanolamina y fosfatidilcolina, aunque en los animales la vía para generar fosfatidilcolina a partir de fosfatidilserina solo opera en el hígado.
B. Función
[0029] Los primeros estudios de fosfatidilserina destilaron la sustancia química del cerebro bovino. Estudios de módem y comercialmente. Los productos disponibles están hechos de soja, debido a preocupaciones sobre la enfermedad de las vacas locas. Los ácidos grasos unidos a la serina en el producto de soja no son idénticos a los del producto bovino y también son impuros. Los estudios preliminares en ratas indican que el producto de soya es al menos tan potente como el de origen bovino.
[0030] La FDA de EE. UU. ha otorgado el estado de "declaración de propiedades saludables calificada" a la fosfatidilserina, afirmando que "el consumo de fosfatidilserina puede reducir el riesgo de demencia en los ancianos" y "el consumo de fosfatidilserina puede reducir el riesgo de disfunción cognitiva en los ancianos."
[0031] Se ha demostrado que la fosfatidilserina acelera la recuperación, previene el dolor muscular, mejora el bienestar y podría poseer propiedades ergogénicas en atletas que practican ciclismo, entrenamiento con pesas y carreras de resistencia. Se ha informado que Soy-PtdS, de manera dependiente de la dosis (400 mg), es un suplemento eficaz para combatir el estrés inducido por el ejercicio al mitigar el aumento inducido por el ejercicio en los niveles de cortisol. La suplementación con PtdS promueve un equilibrio hormonal deseable para los atletas y podría atenuar el deterioro fisiológico que acompaña al sobreentrenamiento y/o estiramiento excesivo. En estudios recientes, se ha demostrado que PtdS mejora el estado de ánimo en una cohorte de jóvenes durante el estrés mental y mejora la precisión durante el golpe de salida al aumentar la resistencia al estrés de los golfistas. Los primeros estudios piloto indican que la suplementación con PtdS podría ser beneficiosa para los niños con trastorno por déficit de atención con hiperactividad.
[0032] Tradicionalmente, los suplementos de PtdS se derivaban de la corteza bovina (BC-PS); sin embargo, debido a la posible transferencia de enfermedades infecciosas, el PS (S-PS) derivado de la soja se ha establecido como una posible alternativa segura. El PS derivado de la soja se reconoce generalmente como seguro (GRAS) y es un suplemento nutricional seguro para las personas mayores si se toma hasta una dosis de 200 mg tres veces al día. Se ha demostrado que la fosfatidilserina reduce la respuesta inmunitaria específica en ratones.
[0033] El PtdS se puede encontrar en la carne, pero es más abundante en el cerebro y en las vísceras tales como el hígado y los riñones. Solo se pueden encontrar pequeñas cantidades de PS en los productos lácteos o en las verduras, con la excepción de los frijoles blancos.
[0034] La anexina -A5 es una proteína de origen natural con una ávida afinidad de unión por PtdS. La anexina-A5 marcada permite la visualización de células en el estado apoptótico temprano o medio in vitro o in vivo. Otra proteína de unión a PtdS es Mfge8. La anexina-A5 marcada con tecnecio permite distinguir entre tumores malignos y benignos cuya patología incluye una alta tasa de división celular y apoptosis en tumores malignos en comparación con una baja tasa de apoptosis en tumores benignos.
II. Proteínas del dominio Gla
A. Dominios Gla
[0035] La estructura general para las proteínas del dominio Gla es la de un dominio Gla seguido de dominios EGF y luego un dominio de serina proteasa C terminal. Las excepciones son la protrombina, que contiene dominios Kringle en lugar de dominios EGF, y la proteína S, que no tiene un dominio de serina proteasa sino dominios similares a globulina fijadora de hormonas sexuales (SHBG) (Hansson y Stenflo, 2005). Las afinidades de las proteínas del dominio Gla con las membranas aniónicas varían. Aproximadamente, se dividen en 3 categorías 1) aglutinantes de alta afinidad con una Kd de 30-50 nM, 2) aglutinantes de afinidad media con una Kd de 100-200 nM y 3) aglutinantes de baja afinidad con una Kd de 1000-2000 nM. Se ha demostrado que las proteínas del dominio Gla de alta afinidad se unen a las membranas aniónicas con la Proteína S, demostrando específicamente la unión a las células apoptóticas a través de su interacción con PtdS (Webb et al., 2002). Las proteínas del dominio Gla de baja afinidad utilizan un receptor secundario para unirse a la membrana celular. Por ejemplo, FVII utiliza factor tisular (TF). Se cree que el dominio Gla/primer dominio EGF constituye el dominio de unión a TF de alta afinidad del FVII. Es importante destacar que, para este enfoque, hay muchos estudios que han demostrado una regulación positiva de TF en la superficie de las células cancerosas, incluido el cáncer colorrectal, el carcinoma NSCL y el cáncer de mama, y estos niveles altos de TF se han asociado con un mal pronóstico (Yu et al., 2004). Aunque la afinidad por las membranas aniónicas es relativamente baja para FVII, la adición de la interacción TF de alta afinidad junto con la regulación positiva documentada de TF en el cáncer lo convierte en una sonda específica de cáncer potencialmente interesante.
B. Proteínas que contienen el dominio Gla
1. Factor II
[0036] La protrombina, también conocida como factor de coagulación II, se escinde proteolíticamente para formar trombina en la cascada de coagulación, lo que finalmente da como resultado la detención de la pérdida de sangre.
2. Factor VII
[0037] El factor VII (anteriormente conocido como proconvertina) es una de las proteínas que provoca la coagulación de la sangre en la cascada de la coagulación.
3. Factor IX
[0038] El factor IX (o factor Christmas) es una de las serina proteasas del sistema de coagulación; pertenece a la familia de peptidasas S1.
[0039] Los factores VII, IX y X juegan todos papeles clave en la coagulación de la sangre y también comparten una arquitectura de dominio común. La proteína del factor IX está compuesta por cuatro dominios proteicos. Estos son el dominio Gla, dos copias en tándem del dominio EGF y un dominio de peptidasa tipo tripsina C-terminal que lleva a cabo la escisión catalítica. Se ha demostrado que el dominio EGF N-terminal es responsable, al menos en parte, de la unión del factor tisular. Wilkinson et al. concluyen que los residuos 88 a 109 del segundo dominio EGF median la unión a las plaquetas y el ensamblaje del complejo activador del Factor X. Las estructuras de los cuatro dominios han sido resueltas. Se determinó una estructura de los dos dominios EGF y el dominio similar a tripsina para la proteína de cerdo. La estructura del dominio Gla, que es responsable de la unión de fosfolípidos dependiente de Ca(II), también se determinó mediante RMN. Se han resuelto varias estructuras de mutantes "superactivos" que revelan la naturaleza de la activación del Factor IX por otras proteínas en la cascada de la coagulación.
4. Factor X
[0040] El factor X (factor de Stuart-Prower; protrombinasa) es una enzima de la cascada de la coagulación.
5. Proteína S
[0041] La proteína S es una glicoproteína plasmática dependiente de vitamina K sintetizada en el endotelio. En la circulación, la Proteína S existe en dos formas: una forma libre y una forma compleja unida a la proteína de unión a C4b del complemento (C4BP). En humanos, la Proteína S está codificada por el gen PROS1. La función mejor caracterizada de la Proteína S es su papel en la vía anticoagulante, donde funciona como cofactor de la Proteína C en la inactivación de los Factores Va y Villa. Solo la forma libre tiene actividad de cofactor.
[0042] La proteína S puede unirse a fosfolípidos cargados negativamente a través del dominio GLA carboxilado. Esta propiedad permite que la Proteína S funcione en la eliminación de células que están experimentando apoptosis. La apoptosis es una forma de muerte celular que utiliza el cuerpo para eliminar células no deseadas o dañadas de los tejidos. Las células que son apoptóticas (es decir, en proceso de apoptosis) ya no gestionan activamente la distribución de fosfolípidos en su membrana externa y, por lo tanto, comienzan a mostrar fosfolípidos cargados negativamente, como fosfatidilserina, en la superficie celular. En las células sanas, una enzima dependiente de ATP (trifosfato de adenosina) los elimina de la hoja externa de la membrana celular. Estos fosfolípidos cargados negativamente son reconocidos por fagocitos como los macrófagos. La proteína S puede unirse a los fosfolípidos cargados negativamente y funcionar como una molécula puente entre la célula apoptótica y el fagocito. La propiedad de puente de la Proteína S mejora la fagocitosis de la célula apoptótica, lo que permite que se elimine "limpiamente" sin ningún síntoma de daño tisular, como la inflamación.
[0043] Las mutaciones en el gen PROS1 pueden conducir a una deficiencia de Proteína S, que es un trastorno sanguíneo raro que puede conducir a un mayor riesgo de trombosis. Se ha demostrado que la proteína S interactúa con el factor V.
6. Proteína C
[0044] La proteína C, también conocida como autoprotrombina IIA y factor de coagulación sanguínea XIV, es una proteína zimógena (inactiva), cuya forma activada juega un papel importante en regular la coagulación sanguínea, la inflamación, la muerte celular y mantener la permeabilidad de las paredes de los vasos sanguíneos en humanos y otros animales. La proteína C activada (APC) realiza estas operaciones principalmente mediante la inactivación proteolítica de las proteínas Factor Va y Factor VIIIa . APC se clasifica como una serina proteasa ya que contiene un residuo de serina en su sitio activo.
[0045] La proteína C humana es una glicoproteína dependiente de la vitamina K estructuralmente similar a otras proteínas dependientes de la vitamina K que afectan a la coagulación de la sangre, como la protrombina, el factor VII, el factor IX y el factor X. La síntesis de la proteína C se produce en el hígado y comienza con una molécula precursora de cadena sencilla: un péptido señal N-terminal de 32 aminoácidos que precede a un propéptido. La proteína C se forma cuando se elimina un dipéptido de Lys198 y Arg199; esto provoca la transformación en un heterodímero con carbohidratos N-enlazados en cada cadena. La proteína tiene una cadena ligera (21 kDa) y una cadena pesada (41 kDa) conectadas por un enlace disulfuro entre Cys183 y Cys319.
[0046] La proteína C inactiva comprende 419 aminoácidos en múltiples dominios: un dominio Gla (residuos 43-88); un segmento aromático helicoidal (89-96); dos dominios similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF) (97-132 y 136­ 176); un péptido de activación (200-211); y un dominio de serina proteasa de tipo tripsina (212-450). La cadena ligera contiene los dominios similares a Gla y EGF y el segmento aromático. La cadena pesada contiene el dominio de proteasa y el péptido de activación. Es de esta forma que el 85-90% de la proteína C circula en el plasma como zimógeno, esperando ser activado. El zimógeno de proteína C restante comprende formas ligeramente modificadas de la proteína. La activación de la enzima se produce cuando una molécula de trombina escinde el péptido de activación del extremo N de la cadena pesada. El sitio activo contiene una tríada catalítica típica de serina proteasas (His253, Asp299 y Ser402).
C. Péptidos y polipéptidos del dominio Gla
[0047] La presente descripción contempla el diseño, la producción y el uso de diversos péptidos y polipéptidos que contienen el dominio Gla. Las características estructurales de estas moléculas son las siguientes. Primero, los péptidos o polipéptidos tienen un dominio Gla que contiene alrededor de 30-45 residuos consecutivos que comprenden un dominio Gla. Por lo tanto, el término "un péptido que no tiene más de "X" residuos consecutivos", incluso cuando incluye el término "que comprende", no puede entenderse que comprenda un mayor número de residuos consecutivos. En segundo lugar, los péptidos y polipéptidos pueden contener residuos de dominio no Gla adicionales, como dominios EGF, dominios Kringle, dominios Fc, etc.
[0048] En general, los péptidos y polipéptidos tendrán 300 residuos o menos, nuevamente, que comprenden 30-45 residuos consecutivos del dominio Gla. La longitud total puede ser de 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 y hasta 300 residuos. Se contemplan rangos de longitud de péptido de 50-300 residuos, 100-300 residuos, 150-300 residuos, 200-300 residuos, 50-200 residuos, 100-200 residuos y 150-300 residuos y 150-200 residuos. El número de residuos de Gla consecutivos puede ser 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15.
[0049] La presente descripción puede utilizar aminoácidos de configuración L, aminoácidos de configuración D, o una mezcla de los mismos. Mientras que los aminoácidos L representan la gran mayoría de los aminoácidos que se encuentran en las proteínas, los aminoácidos D se encuentran en algunas proteínas producidas por organismos exóticos que habitan en el mar, como los caracoles cónicos. También son componentes abundantes de las paredes celulares de peptidoglicano de las bacterias. La serina D puede actuar como un neurotransmisor en el cerebro. La convención L y D para la configuración de aminoácidos no se refiere a la actividad óptica del aminoácido en sí, sino a la actividad óptica del isómero de gliceraldehído a partir del cual teóricamente se puede sintetizar ese aminoácido (gliceraldehído D es dextrógiro; gliceraldehído L es levógiro).
[0050] Una forma de un péptido "todo D" es un péptido retro-inverso. La modificación retro-inversa de polipéptidos naturales implica el ensamblaje sintético de aminoácidos con estereoquímica de carbono a opuesta a la de los aminoácidos L correspondientes, es decir, aminoácidos D en orden inverso con respecto a la secuencia peptídica nativa. Por lo tanto, un análogo retroinverso tiene extremos invertidos y dirección invertida de los enlaces peptídicos (NH-CO en lugar de CO-NH) mientras mantiene aproximadamente la topología de las cadenas laterales como en la secuencia peptídica nativa. Véase la Patente de e E. UU. 6.261.569.
D. Síntesis
[0051] Será ventajoso producir péptidos y polipéptidos utilizando técnicas de síntesis en fase sólida (Merrifield, 1963). Otras técnicas de síntesis de péptidos son bien conocidas por los expertos en la técnica (Bodanszky et al., 1976; Peptide Synthesis, 1985; Solid Phase Peptide Synthelia, 1984). Los grupos protectores apropiados para uso en tales síntesis se encontrarán en los textos anteriores, así como en Grupos protectores en química orgánica (1973). Estos métodos sintéticos implican la adición secuencial de uno o más residuos de aminoácidos o residuos de aminoácidos protegidos adecuados a una cadena peptídica en crecimiento. Normalmente, el grupo amino o carboxilo del primer residuo de aminoácido está protegido por un grupo protector adecuado que puede eliminarse selectivamente. Se utiliza un grupo protector diferente, eliminable selectivamente, para los aminoácidos que contienen un grupo lateral reactivo, como la lisina.
[0052] Usando la síntesis en fase sólida como ejemplo, el aminoácido protegido o derivatizado se une a un soporte sólido inerte a través de su grupo carboxilo o amino desprotegido. A continuación, se elimina selectivamente el grupo protector del grupo amino o carboxilo y se mezcla el siguiente aminoácido de la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) adecuadamente protegido y se hace reaccionar con el residuo ya unido al soporte sólido. A continuación, se elimina el grupo protector del grupo amino o carboxilo de este residuo de aminoácido recién agregado y luego se agrega el siguiente aminoácido (adecuadamente protegido), y así sucesivamente. Después de que todos los aminoácidos deseados se hayan unido en la secuencia apropiada, cualquier grupo protector de grupo lateral y terminal restante (y el soporte sólido) se elimina secuencialmente o simultáneamente, para proporcionar el péptido final. Los péptidos y polipéptidos de la divulgación preferiblemente están desprovistos de aminoácidos bencilados o metilbencilados. Dichos restos de grupos protectores pueden usarse en el curso de la síntesis, pero se eliminan antes de que se usen los péptidos y polipéptidos. Pueden ser necesarias reacciones adicionales, como se describe en otra parte, para formar enlaces intramoleculares para restringir la conformación.
[0053] Además de los veinte aminoácidos estándar que se pueden usar, hay un gran número de aminoácidos "no estándar". Dos de estos pueden ser especificados por el código genético, pero son bastante raros en las proteínas. La selenocisteína se incorpora a algunas proteínas en un codón UGA, que normalmente es un codón de parada. La pirrolisina es utilizada por algunas arqueas metanogénicas en enzimas que utilizan para producir metano. Se codifica con el codón UAG. Los ejemplos de aminoácidos no estándar que no se encuentran en las proteínas incluyen lantionina, ácido 2-aminoisobutírico, dehidroalanina y el neurotransmisor ácido gamma-aminobutírico. Los aminoácidos no estándar a menudo se presentan como intermediarios en las vías metabólicas de los aminoácidos estándar; por ejemplo, la ornitina y la citrulina se encuentran en el ciclo de la urea, parte del catabolismo de los aminoácidos. Los aminoácidos no estándar generalmente se forman a través de modificaciones en los aminoácidos estándar. Por ejemplo, la homocisteína se forma a través de la vía de transsulfuración o por la desmetilación de la metionina a través del metabolito intermedio metionina de S-adenosilo, mientras que la hidroxiprolina se obtiene mediante una modificación postraduccional de la prolina.
E. Enlazadores
[0054] Los enlazadores o agentes de entrecruzamiento pueden usarse para fusionar péptidos o polipéptidos del dominio Gla con otras secuencias proteicas (p. ej., dominios Fc de anticuerpos). Los reactivos de reticulación bifuncionales se han utilizado ampliamente para una variedad de propósitos, incluida la preparación de matrices de afinidad, la modificación y estabilización de diversas estructuras, la identificación de sitios de unión a ligandos y receptores, y estudios estructurales. Los reactivos homobifuncionales que portan dos grupos funcionales idénticos demostraron ser muy eficaces para inducir la reticulación entre macromoléculas o subunidades de una macromolécula idénticas y diferentes, y la unión de ligandos polipeptídicos a sus sitios de unión específicos. Los reactivos heterobifuncionales contienen dos grupos funcionales diferentes. Aprovechando las reactividades diferenciales de los dos grupos funcionales diferentes, el entrecruzamiento puede controlarse tanto de forma selectiva como secuencial. Los reactivos de reticulación bifuncionales se pueden dividir según la especificidad de sus grupos funcionales, por ejemplo, grupos específicos de amino, sulfhidrilo, guanidino, indol o carboxilo. De estos, los reactivos dirigidos a los grupos amino libres se han vuelto especialmente populares debido a su disponibilidad comercial, facilidad de síntesis y las condiciones de reacción suaves en las que se pueden aplicar. La mayoría de los reactivos de reticulación heterobifuncionales contienen un grupo reactivo con amina primaria y un grupo reactivo con tiol.
[0055] En otro ejemplo, los reactivos de reticulación heterobifuncionales y los métodos para usar los reactivos de reticulación se describen en el documento US5.889.155. Los reactivos de reticulación combinan un residuo de hidrazida nucleófilo con un residuo de maleimida electrofílico, lo que permite el acoplamiento en un ejemplo de aldehídos a tioles libres. El reactivo de entrecruzamiento se puede modificar para entrecruzar varios grupos funcionales y, por lo tanto, es útil para entrecruzar polipéptidos. En los casos en los que un péptido particular no contiene un residuo susceptible de un reactivo de reticulación dado en su secuencia nativa, se pueden utilizar cambios de aminoácidos sintéticos o genéticos conservativos en la secuencia primaria.
F. Secuencias de péptidos/polipéptidos adicionales
[0056] Un factor del desarrollo de fármacos es lograr vidas medias circulantes adecuadas, que impactan en la dosificación, la administración del fármaco y la eficacia, y esto tiene una importancia particular para la bioterapéutica. Las proteínas pequeñas por debajo de 60 kD se eliminan rápidamente por el riñón y, por lo tanto, no alcanzan su objetivo. Esto significa que se necesitan dosis altas para alcanzar la eficacia. Las modificaciones utilizadas actualmente para aumentar la vida media de las proteínas en circulación incluyen: PEGilación; conjugación o fusión genética con proteínas, por ejemplo, transferrina (WO2006/096515), albúmina, hormona del crecimiento (US2003/104578); conjugación con celulosa (Levy y Shoseyov, 2002); conjugación o fusión con fragmentos Fc; enfoques de glicosilación y mutagénesis (Carter, 2006).
[0057] En el caso de la PEGilación, el polietilenglicol (PEG) se conjuga con la proteína, que puede ser, por ejemplo, una proteína plasmática, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Los primeros estudios sobre el efecto de la PEGilación de anticuerpos se realizaron en la década de 1980. La conjugación se puede realizar de forma enzimática o química y está bien establecida en la técnica (Chapman, 2002; Veronese y Pasut, 2005). Con la PEGilación se puede aumentar el tamaño total, lo que reduce la posibilidad de filtración renal. La PEGilación protege aún más de la degradación proteolítica y retarda el aclaramiento de la sangre. Además, se ha informado que la PEGilación puede reducir la inmunogenicidad y aumentar la solubilidad. La farmacocinética mejorada por la adición de PEG se debe a varios mecanismos diferentes: aumento en el tamaño de la molécula, protección contra la proteolisis, antigenicidad reducida y el enmascaramiento de secuencias específicas de los receptores celulares. En el caso de fragmentos de anticuerpos (Fab), se ha logrado un aumento de 20 veces en la vida media plasmática mediante PEGilación (Chapman, 2002).
[0058] Hasta la fecha, hay varios fármacos PEGilados aprobados, por ejemplo, PEG-interferón alfa2b (PEG-INTRON) comercializado en 2000 y alfa2a (Pegasys) comercializado en 2002. Un fragmento de anticuerpo PEGilado contra TNF alfa, llamado Cimzia o Certolizumab Pegol, se solicitó la aprobación de la FDA para el tratamiento de la enfermedad de Crohn en 2007 y se aprobó el 22 de abril de 2008. Una limitación de la PEGilación es la dificultad para sintetizar especies monodispersas largas, especialmente cuando se necesitan cadenas de PEG de más de 1000 kD. Para muchas aplicaciones, se utiliza PEG polidisperso con una longitud de cadena de más de 10000 kD, lo que da como resultado una población de conjugados que tienen cadenas de PEG de diferente longitud, que necesitan análisis exhaustivos para garantizar lotes equivalentes entre producciones. La diferente longitud de las cadenas de PEG puede dar como resultado diferentes actividades biológicas y, por lo tanto, diferentes farmacocinéticas. Otra limitación de la PEGilación es una disminución de la afinidad o la actividad, como se ha observado con el alfa-interferón Pegasys, que tiene solo el 7 % de la actividad antiviral de la proteína nativa, pero tiene una farmacocinética mejorada debido a la vida media plasmática mejorada.
[0059] Otro enfoque es conjugar el fármaco con una proteína de vida prolongada, por ejemplo, albúmina, que es de 67 kD y tiene una vida media en plasma de 19 días en humanos. La albúmina es la proteína más abundante en el plasma y está involucrada en la regulación del pH plasmático, pero también sirve como transportador de sustancias en el plasma. En el caso de CD4, se ha logrado un aumento de la vida media en plasma después de fusionarlo con albúmina sérica humana (Yeh et al., 1992). Otros ejemplos de proteínas de fusión son la insulina, la hormona del crecimiento humano, la transferrina y las citocinas (Duttaroy et al., 2005; Melder et al., 2005; Osborn et al., 2002a; Osborn et al., 2002b; Sung et al., 2003).) y ver (US 2003/104578, WO2006/096515 y WO2007/047504).
[0060] El efecto de la glicosilación sobre la vida media en plasma y la actividad de la proteína también se ha estudiado extensamente. En el caso del activador tisular del plasminógeno (tPA), la adición de nuevos sitios de glicosilación disminuyó el aclaramiento plasmático y mejoró la potencia (Keyt et al., 1994). La glicoingeniería se ha aplicado con éxito a varias proteínas e inmunoglobulinas recombinantes (Elliott et al., 2003; Raju y Scallon, 2007; Sinclair y Elliott, 2005; Umana et al., 1999). Además, la glicosilación influye en la estabilidad de las inmunoglobulinas (Mimura et al., 2000; Raju y Scallon, 2006).
[0061] Otra molécula utilizada para las proteínas de fusión es el fragmento Fc de una IgG (Ashkenazi y Chamow, 1997). El enfoque de fusión de Fc se ha utilizado, por ejemplo, en la tecnología Trap desarrollada por Regeneron (p. ej., trampa IL1 y trampa VEGF). El uso de albúmina para prolongar la vida media de los péptidos se ha descrito en el documento US2004/001827. También se han informado efectos positivos de la albúmina para los fragmentos Fab y la proteína de fusión scFv-HSA. Se ha demostrado que la vida media sérica prolongada de la albúmina se debe a un proceso de reciclaje mediado por el FcRn (Anderson et al., 2006; Chaudhury et al., 2003).
[0062] Otra estrategia es utilizar técnicas de mutagénesis dirigida dirigidas a la interacción de las inmunoglobulinas con su receptor para mejorar las propiedades de unión, es decir, la maduración de la afinidad en la región Fc. Con una mayor afinidad por FcRn, se puede lograr una vida media prolongada in vivo (Ghetie et al., 1997; Hinton et al., 2006; Jain et al., 2007; Petkova et al., 2006a; Vaccaro et al., 2005). Sin embargo, las estrategias de maduración por afinidad requieren varias rondas de mutagénesis y pruebas. Esto lleva tiempo, es costoso y está limitado por la cantidad de aminoácidos que, cuando mutan, dan como resultado vidas medias prolongadas. Por lo tanto, se necesitan enfoques alternativos simples para mejorar la vida media in vivo de los productos bioterapéuticos. Las terapias con vidas medias prolongadas in vivo son especialmente importantes para el tratamiento de enfermedades crónicas, trastornos autoinmunes, enfermedades inflamatorias, metabólicas, infecciosas y oculares, y cáncer, especialmente cuando se requiere una terapia durante un largo período de tiempo. En consecuencia, todavía existe la necesidad de desarrollar agentes terapéuticos (p. ej., anticuerpos y proteínas de fusión Fc) con mayor persistencia y vida media en circulación, para reducir la dosis y/o la frecuencia de las inyecciones de una variedad de agentes terapéuticos.
G. Marcas
[0063] Los péptidos y polipéptidos de la presente descripción pueden conjugarse con marcas para fines de diagnóstico. Un marcador de acuerdo con la presente descripción se define como cualquier resto que pueda detectarse utilizando un ensayo. Los ejemplos no limitativos de moléculas indicadoras incluyen enzimas, radiomarcadores, haptenos, marcadores fluorescentes, moléculas fosforescentes, moléculas quimioluminiscentes, cromóforos, moléculas de fotoafinidad, partículas coloreadas o ligandos, como la biotina.
[0064] Los conjugados de marca generalmente se prefieren para usar como agentes de diagnóstico. Los agentes de diagnóstico generalmente caen dentro de dos clases, los que se usan en diagnósticos in vitro y los que se usan en protocolos de diagnóstico in vivo, generalmente conocidos como “imágenes dirigidas”. En la técnica se conocen muchos agentes de formación de imágenes apropiados, así como métodos para su unión a péptidos y polipéptidos (véanse, por ejemplo, los documentos US5.021.236, US4.938.948 y US4.472.509). Los restos de formación de imágenes utilizados pueden ser iones paramagnéticos, isótopos radiactivos, fluorocromos, sustancias detectables por RMN y agentes de formación de imágenes por rayos X.
[0065] En el caso de los iones paramagnéticos, se podrían citar a modo de ejemplo iones tales como cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III) y/o erbio (III), siendo particularmente preferido el gadolinio. Los iones útiles en otros contextos, como la formación de imágenes por rayos X, incluyen, entre otros, lantano (III), oro (III), plomo (II) y especialmente bismuto (III).
[0066] En el caso de isótopos radiactivos para aplicación terapéutica y/o diagnóstica, se podría mencionar astato211, 14carbono, 51cromo, 36cloro, 57cobalto, 58cobalto, cobre67, 152Eu, galio67, 3hidrógeno, yodo123, yodo125, yodo131, indio111, 59hierro, 32fósforo, renio186, renio188, 75selenio, 35azufre, tecnicio99m y/o itrio90. A menudo se prefiere el 125I para su uso en ciertas formas de realización, y también se prefieren a menudo el tecnicio99m y/o el indio111 debido a su baja energía y su idoneidad para la detección de largo alcance. Los péptidos y polipéptidos marcados radiactivamente pueden producirse según métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los péptidos y polipéptidos se pueden yodar por contacto con yoduro de sodio y/o potasio y un agente oxidante químico tal como hipoclorito de sodio, o un agente oxidante enzimático, tal como lactoperoxidasa. Los péptidos se pueden marcar con tecnecio99m mediante un proceso de intercambio de ligandos, por ejemplo, reduciendo el pertecnato con solución estannosa, quelando el tecnecio reducido en una columna de Sephadex y aplicando el péptido a esta columna. Alternativamente, se pueden usar técnicas de marcaje directo, por ejemplo, incubando pertecnato, un agente reductor como SNCl2, una solución tampón como solución de ftalato de sodio y potasio y el péptido. Los grupos funcionales intermediarios que se utilizan a menudo para unir radioisótopos que existen como iones metálicos al péptido son el ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
[0067] Entre los marcadores fluorescentes contemplados para usar como conjugados se incluyen Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, Cy3, Cy5,6-FAM, isotiocianato de fluoresceína, HEX, 6-JOE, verde de Oregón 488, verde de Oregón 500, verde de Oregón 514, azul Pacífico, REG, verde de rodamina, rojo de rodamina, renografina, ROX, TAMRA, TET, tetrametilrodamina, y/o Texas Red.
[0068] Otro tipo de conjugado contemplado es el destinado principalmente para uso in vitro, donde el péptido está unido a un ligando de unión secundario y/o a una enzima (una etiqueta de enzima) que generará un producto coloreado al entrar en contacto con un sustrato cromogénico. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen ureasa, fosfatasa alcalina, hidrógeno peroxidasa (rábano picante) o glucosa oxidasa. Los ligandos de unión secundarios preferidos son compuestos de biotina y avidina y estreptavidina. El uso de dichas etiquetas es bien conocido por los expertos en la técnica y se describe, por ejemplo, en los documentos US3.817.837, US3.850.752, US3.939.350, Us 3.996.345, US4.277.437, US4.275.149 y US4.366.241.
[0069] Se conocen en la técnica otros métodos para la unión o conjugación de un péptido a su resto conjugado. Algunos métodos de unión implican el uso de un complejo de quelato metálico que emplea, por ejemplo, un agente quelante orgánico tal como anhídrido de ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA); ácido etilentriaminotetraacético; N-cloro-ptoluenosulfonamida; y/o tetracloro-3a-6a-difenilglicouril-3 unido al anticuerpo (US4.472.509 y US4.938.948). Los polipéptidos también se pueden hacer reaccionar con una enzima en presencia de un agente de acoplamiento como glutaraldehído o peryodato. Los conjugados con marcadores de fluoresceína se preparan en presencia de estos agentes de acoplamiento o por reacción con un isotiocianato.
IV. Terapias
A. Formulaciones farmacéuticas y vías de administración
[0070] Cuando se contemplan aplicaciones clínicas, será necesario preparar composiciones farmacéuticas en una forma apropiada para la aplicación prevista. Generalmente, esto supondrá la preparación de composiciones que estén esencialmente libres de pirógenos, así como de otras impurezas que podrían ser dañinas para humanos o animales.
[0071] En general, se deseará emplear sales y tampones apropiados para hacer que los vectores de administración sean estables y permitir la absorción por las células diana. También se emplearán tampones cuando se introduzcan células recombinantes en un paciente. Las composiciones acuosas de la presente descripción comprenden una cantidad eficaz del vector para las células, disuelto o disperso en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones también se denominan inóculos. La frase "farmacéuticamente o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen reacciones adversas, alérgicas u otras reacciones adversas cuando se administran a un animal oa un ser humano. Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con los vectores o células de la presente divulgación, se contempla su uso en composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar a las composiciones ingredientes activos suplementarios.
[0072] Las composiciones activas de la presente descripción pueden incluir preparaciones farmacéuticas clásicas. La administración de estas composiciones de acuerdo con la presente descripción se realizará a través de cualquier ruta común siempre que el tejido diana esté disponible a través de esa ruta. Dichas rutas incluyen la ruta oral, nasal, bucal, rectal, vaginal o tópica. Alternativamente, la administración puede ser por inyección ortotópica, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intratumoral, intraperitoneal o intravenosa. Tales composiciones se administrarían normalmente como composiciones farmacéuticamente aceptables, descritas anteriormente.
[0073] Los compuestos activos también pueden administrarse por vía parenteral o intraperitoneal. Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estos preparados contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.
[0074] Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe ser preservado contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
[0075] Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son las técnicas de secado al vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución del mismo filtrada previamente en condiciones estériles.
[0076] Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes para principios activos farmacéuticos es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar ingredientes activos complementarios en las composiciones.
[0077] Para la administración oral, los péptidos y polipéptidos de la presente descripción pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de enjuagues bucales y dentífricos no ingeribles. Se puede preparar un enjuague bucal incorporando el ingrediente activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado, como una solución de borato de sodio (Solución de Dobell). Alternativamente, el ingrediente activo puede incorporarse a un lavado antiséptico que contenga borato de sodio, glicerina y bicarbonato de potasio. El ingrediente activo también se puede dispersar en dentífricos que incluyen: geles, pastas, polvos y lodos. El ingrediente activo se puede añadir en una cantidad terapéuticamente eficaz a un dentífrico en pasta que puede incluir agua, aglutinantes, abrasivos, agentes aromatizantes, agentes espumantes y humectantes.
[0078] Las composiciones de la presente descripción se pueden formular en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.
[0079] T ras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos y similares. Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido primero debe volverse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la técnica conocerán los medios acuosos estériles que pueden emplearse a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosis podría disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y agregarse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el lugar propuesto para la infusión (consulte, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15.a edición, páginas 1035- 1038 y 1570-1580). Necesariamente ocurrirá alguna variación en la dosificación dependiendo de la condición del sujeto que se está tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para la administración humana, las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza según lo exigen los estándares de la Oficina de productos biológicos de la FDA.
B. Estados y condiciones de enfermedad
1. Cáncer
[0080] Antecedentes. El cáncer resulta del crecimiento de una población clonal de células del tejido. El desarrollo del cáncer, denominado carcinogénesis, se puede modelar y caracterizar de varias maneras. Hace tiempo que se aprecia una asociación entre el desarrollo de cáncer y la inflamación. La respuesta inflamatoria está involucrada en la defensa del huésped contra la infección microbiana y también impulsa la reparación y regeneración de tejidos. Pruebas considerables apuntan a una conexión entre la inflamación y el riesgo de desarrollar cáncer, es decir, la inflamación crónica puede provocar displasia. Hay cientos de formas diferentes de cánceres humanos, y con una comprensión cada vez mayor de la genética y la biología subyacentes del cáncer, estas formas se subdividen y reclasifican aún más.
[0081] Determinar qué causa el cáncer es complejo. Se sabe que muchas cosas aumentan el riesgo de cáncer, incluido el consumo de tabaco, ciertas infecciones, la radiación, la falta de actividad física, la obesidad y los contaminantes ambientales. Estos pueden dañar directamente los genes o combinarse con fallas genéticas existentes dentro de las células para causar la enfermedad. Aproximadamente del cinco al diez por ciento de los cánceres son enteramente hereditarios.
[0082] El cáncer se puede detectar de varias maneras, incluida la presencia de ciertos signos y síntomas, pruebas de detección o imágenes médicas. Una vez que se detecta un posible cáncer, se diagnostica mediante un examen microscópico de una muestra de tejido. El cáncer generalmente se trata con quimioterapia, radioterapia y cirugía. Las posibilidades de sobrevivir a la enfermedad varían mucho según el tipo y la ubicación del cáncer y la extensión de la enfermedad al comienzo del tratamiento. Si bien el cáncer puede afectar a personas de todas las edades y algunos tipos de cáncer son más comunes en los niños, el riesgo de desarrollar cáncer generalmente aumenta con la edad. En 2007, el cáncer causó alrededor del 13% de todas las muertes humanas en todo el mundo (7,9 millones). Las tasas están aumentando a medida que más personas viven hasta una edad avanzada y se producen cambios masivos en el estilo de vida en el mundo en desarrollo.
[0083] Los tratamientos se dividen en cinco categorías generales: cirugía, quimioterapia, radiación, medicina alternativa y cuidados paliativos. La cirugía es el principal método de tratamiento de la mayoría de los cánceres sólidos aislados y puede desempeñar un papel en la paliación y la prolongación de la supervivencia. Por lo general, es una parte importante del diagnóstico definitivo y la estadificación del tumor, ya que generalmente se requieren biopsias. En la cirugía de cáncer localizado, normalmente se intenta extirpar toda la masa junto con, en ciertos casos, los ganglios linfáticos de la zona. Para algunos tipos de cáncer, esto es todo lo que se necesita para eliminar el cáncer.
[0084] La quimioterapia además de la cirugía ha demostrado ser útil en varios tipos de cáncer diferentes que incluyen: cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, sarcoma osteogénico, cáncer testicular, cáncer de ovario y ciertos cánceres de pulmón. La eficacia de la quimioterapia a menudo se ve limitada por la toxicidad en otros tejidos del cuerpo.
[0085] La radioterapia implica el uso de radiación ionizante en un intento de curar o mejorar los síntomas del cáncer. Se usa en aproximadamente la mitad de todos los casos y la radiación puede provenir de fuentes internas en forma de braquiterapia o de fuentes externas. La radiación generalmente se usa además de la cirugía o la quimioterapia, pero para ciertos tipos de cáncer, como el cáncer temprano de cabeza y cuello, se puede usar sola. Para metástasis óseas dolorosas, se ha encontrado que es efectivo en alrededor del 70% de las personas.
[0086] Los tratamientos alternativos y complementarios incluyen un grupo diverso de sistemas, prácticas y productos de atención médica que no forman parte de la medicina convencional. "Medicina complementaria" se refiere a métodos y sustancias que se usan junto con la medicina convencional, mientras que "medicina alternativa" se refiere a compuestos utilizado en lugar de la medicina convencional. La mayoría de los medicamentos complementarios y alternativos para el cáncer no se han estudiado ni probado rigurosamente. Se han investigado algunos tratamientos alternativos y se ha demostrado que son ineficaces, pero aún continúan comercializándose y promoviéndose.
[0087] Finalmente, los cuidados paliativos se refieren al tratamiento que intenta hacer que el paciente se sienta mejor y puede combinarse o no con un intento de atacar el cáncer. Los cuidados paliativos incluyen acciones para reducir el sufrimiento físico, emocional, espiritual y psicosocial que experimentan las personas con cáncer. A diferencia del tratamiento que tiene como objetivo eliminar directamente las células cancerosas, el objetivo principal de los cuidados paliativos es mejorar la calidad de vida del paciente.
[0088] Actividad del dominio Gla. En el contexto de la presente descripción, se contempla que las proteínas Gla modificadas por ingeniería genética se pueden usar como agentes anticancerígenos de varias maneras diferentes. En primer lugar, los pacientes con cáncer a menudo sufren de un estado de hipercoagulabilidad que puede provocar embolia y muerte. En esta realización, las proteínas del dominio Gla (opcionalmente unidas a una región Fc) se administran en la vasculatura del sujeto en cantidades suficientes para reducir la formación de émbolos y la coagulación patológica. Dichas proteínas del dominio Gla descritas en el presente documento son útiles para reducir, bloquear y/o inhibir la coagulación patológica en dichos pacientes.
[0089] También, se sabe que PtdS desempeña un papel en la supresión de la respuesta inmunitaria al cáncer. Por lo tanto, en otra forma de realización, los inventores prevén el uso de proteínas de dominio Gla para unir y bloquear/enmascarar PtdS en células cancerosas. Esto sirve para prevenir la señalización tolerogénica a través de PtdS que induce citocinas antiinflamatorias y suprime las citocinas proinflamatorias, lo que facilita el escape inmunitario de las células cancerosas. Esto puede resultar un enfoque particularmente útil cuando se combina con otras terapias contra el cáncer "estándar", como se analiza en detalle a continuación.
2. Enfermedad autoinmune/inflamatoria
[0090] Antecedentes. La presente divulgación contempla el tratamiento de una variedad de estados de enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias tales como espondiloartropatía, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, artritis reactiva, artritis enteropática, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad del intestino irritable, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, fiebre mediterránea familiar, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de Sjogren, artritis temprana, artritis viral, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, psoriasis, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Addison, alopecia, síndrome antifosfolípido, enfermedad de Bechet, enfermedad celíaca, síndrome de fatiga crónica, colitis ulcerosa, diabetes tipo I, fibromialgia, gastritis autoinmune, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), miastenia grave, pénfigo vulgar, cirrosis biliar primaria, fiebre reumática, sarcoidosis, esclerodermia, vitíligo, vasculitis, vasos pequeños vasculitis, hepatitis, cirrosis biliar primaria, sarcoidosis, esclerodermia, enfermedad de injerto contra huésped (aguda y crónica), anemia aplásica o neutropenia cíclica. El diagnóstico y tratamiento de estas enfermedades están bien documentados en la literatura.
[0091] Actividad del dominio Gla. Se sabe que ciertos trastornos inmunitarios se caracterizan por una fagocitosis deficiente de las células apoptóticas, lo que conduce a una necrosis secundaria, señalización proinflamatoria y producción de autoanticuerpos. Además, las vesículas derivadas de la membrana plasmática (PMV) que contienen PtdS en su superficie se desprenden de las células apoptóticas y se cree que se unen a las células inmunitarias, como los macrófagos (DeRose et al., 2011). Las proteínas del dominio Gla se pueden usar para enmascarar el PtdS que se encuentra en la superficie de los PMV, lo que reduce el efecto "señuelo" de los PMV y permite la fagocitosis de las células apoptóticas. Esto debería romper el ciclo de señalización inflamatoria continua y reducir la hiperactivación inmune.
3. Trastornos de hipercoagulación
[0092] Antecedentes. Los trastornos de hipercoagulación dan lugar a una mayor tendencia a la coagulación de la sangre, lo que pone al paciente en riesgo de obstrucción de venas y arterias. En la hemostasia normal, o la detención del sangrado, se forman coágulos en el sitio de la lesión del vaso sanguíneo. En la hipercoagulación, se desarrollan coágulos en la sangre circulante. Cuando esto ocurre a lo largo de los vasos sanguíneos del cuerpo, puede surgir una afección conocida como trombosis. La trombosis puede provocar un infarto o la muerte del tejido. Los trastornos de hipercoagulación incluyen hiperhomocistinemia, deficiencia de antitrombina III, factor V leyden y deficiencia de proteína C o proteína S.
[0093] El diagnóstico de trastornos de hipercoagulación se completa con una combinación de examen físico, historial médico y análisis de sangre. Cuando se encuentran, se pueden administrar anticoagulantes cumadina y heparina para reducir los efectos de la coagulación y mantener la fluidez en la sangre. El pronóstico para los pacientes con trastornos de hipercoagulación varía según la gravedad de la coagulación y la trombosis, pero si no se detecta ni se trata, la trombosis podría provocar una embolia pulmonar y la muerte.
[0094] La enfermedad de células falciformes (SCD), aunque no es un trastorno de la coagulación, tiene algunas de las mismas manifestaciones. Curiosamente, un nivel aumentado de PtdS expresado en superficie en una subpoblación de eritrocitos es una característica universal de esta enfermedad (Wood et al., Blood, Vol 88, No 5 (1 de septiembre), 1996). La SCD es un trastorno sanguíneo genético autosómico recesivo con sobredominio, caracterizado por glóbulos rojos que adoptan una forma de hoz anormal y rígida. La falcificación disminuye la flexibilidad de las células y da como resultado un riesgo de diversas complicaciones. La falcificación ocurre debido a una mutación en el gen de la hemoglobina. Se acorta la esperanza de vida. La enfermedad de células falciformes ocurre más comúnmente en personas (o sus descendientes) de partes de las regiones subsaharianas tropicales y subtropicales donde la malaria es o era común. En áreas donde la malaria es común, existe un beneficio de aptitud física al portar un solo gen de células falciformes (rasgo de células falciformes). Los que tienen solo uno de los dos alelos de la enfermedad de células falciformes, aunque no son totalmente resistentes, son más tolerantes a la infección y, por lo tanto, muestran síntomas menos graves cuando se infectan.
[0095] La anemia de células falciformes es el nombre de una forma específica de enfermedad de células falciformes en la que existe homocigosidad para la mutación que causa la HbS. La anemia de células falciformes también se denomina "HbSS", "enfermedad de SS", "hemoglobina S" o permutaciones de las mismas. En las personas heterocigotas, que tienen solo un gen falciforme y un gen de hemoglobina adulto normal, se denomina "HbAS" o "rasgo de células falciformes". Otras formas más raras de enfermedad de células falciformes incluyen la enfermedad falciforme de hemoglobina C (HbSC), falciformes beta-talasemia (HbS/p+) y falciformes beta-cero-talasemia (HbS/p0). Estas otras formas de enfermedad de células falciformes son estados heterocigóticos compuestos en los que la persona tiene solo una copia de la mutación que causa la HbS y una copia de otro alelo de hemoglobina anormal.
[0096] En aspectos particulares, SCD puede relacionarse con el flujo sanguíneo. La crisis vasooclusiva es causada por glóbulos rojos en forma de hoz que obstruyen los capilares y restringen el flujo de sangre a un órgano, lo que provoca isquemia, dolor, necrosis y, a menudo, daño orgánico. La frecuencia, severidad y duración de estas crisis varían considerablemente. Las crisis dolorosas se tratan con hidratación, analgésicos y transfusiones de sangre; el manejo del dolor requiere la administración de opioides a intervalos regulares hasta que la crisis se haya resuelto. Para las crisis más leves, un subgrupo de pacientes se maneja con AINE (como diclofenaco o naproxeno). Para crisis más severas, la mayoría de los pacientes requieren manejo hospitalario para opioides intravenosos; Los dispositivos de analgesia controlada por el paciente (PCA, por sus siglas en inglés) se usan comúnmente en este entorno. Las crisis vasooclusivas que involucran órganos como el pene o los pulmones se consideran una emergencia y se tratan con transfusiones de glóbulos rojos. La difenhidramina a veces es efectiva para la picazón asociada con el uso de opioides. Se recomienda la espirometría de incentivo, una técnica para estimular la respiración profunda para minimizar el desarrollo de atelectasias.
[0097] Actividad del dominio Gla. La presente invención contempla el uso de dominios Gla para controlar o modular las acciones procoagulantes de PtdS en hipercoagulación. La expresión superficial de PtdS es un potente estimulador de la cascada de la coagulación. El enmascaramiento de PtdS expuesto mediante el uso de polipéptidos de dominio Gla podría inhibir o amortiguar esta cascada. Este tratamiento podría ser particularmente beneficioso para individuos con SCA en los que se cree que solo una pequeña población de glóbulos rojos puede ser responsable de la hipercoagulabilidad asociada con la enfermedad.
4. Infección viral
[0098] Antecedentes. Un virus es un pequeño agente infeccioso que puede replicarse solo dentro de las células vivas de un organismo. Los virus pueden infectar todo tipo de organismos, desde animales y plantas hasta bacterias y arqueas. Se han descrito con detalle unos 5.000 virus, aunque existen millones de tipos diferentes. Los virus se encuentran en casi todos los ecosistemas de la Tierra y son el tipo de entidad biológica más abundante.
[0099] Las partículas de virus (conocidas como viriones) constan de dos o tres partes: i) el material genético hecho de ADN o ARN, moléculas largas que transportan información genética; ii) una cubierta proteica que protege estos genes; y en algunos casos iii) una envoltura de lípidos que rodea la cubierta proteica cuando están fuera de una célula. Las formas de los virus van desde simples formas helicoidales e icosaédricas hasta estructuras más complejas. El virus promedio es aproximadamente una centésima parte del tamaño de la bacteria promedio. La mayoría de los virus son demasiado pequeños para verse directamente con un microscopio óptico.
[0100] Los virus se propagan de muchas maneras; los virus en las plantas a menudo se transmiten de una planta a otra a través de insectos que se alimentan de la savia de las plantas, como los áfidos; los virus en los animales pueden ser transportados por insectos chupadores de sangre. Estos organismos portadores de enfermedades se conocen como vectores. Los virus de la influenza se propagan al toser y estornudar. El norovirus y el rotavirus, causas comunes de gastroenteritis viral, se transmiten por vía fecal-oral y se transmiten de persona a persona por contacto, ingresando al cuerpo a través de alimentos o agua. El VIH es uno de varios virus transmitidos a través del contacto sexual y por exposición a sangre infectada. El rango de células huésped que un virus puede infectar se denomina "rango de huéspedes". Esto puede ser estrecho o, como cuando un virus es capaz de infectar muchas especies, amplio.
[0101] Las infecciones víricas en animales provocan una respuesta inmunitaria que normalmente elimina el virus infectante. Las vacunas también pueden producir respuestas inmunitarias, que confieren una inmunidad adquirida artificialmente a la infección viral específica. Sin embargo, algunos virus, incluidos los que causan el SIDA y la hepatitis viral, evaden estas respuestas inmunitarias y provocan infecciones crónicas. Los antibióticos no tienen efecto sobre los virus, pero se han desarrollado varios medicamentos antivirales.
[0102] Las infecciones por virus fomentan una variedad de enfermedades, que incluyen influenza, virus de inmunodeficiencia humana, virus del dengue, virus del Nilo Occidental, virus de la viruela, virus respiratorio sincitial, virus de la fiebre hemorrágica coreana, varicela, virus de la varicela zoster, virus del herpes simple 1 o 2, virus de Epstein-Barr, virus de Marburg, hantavirus, virus de la fiebre amarilla, hepatitis A, B, C o E, virus del Ébola, virus del papiloma humano, rinovirus, virus de Coxsackie, virus de la poliomielitis, virus del sarampión, virus de la rubéola, virus de la rabia, Newcastle virus de la enfermedad, rotavirus, HTLV-1 y -2.
[0103] Actividad del dominio Gla. PtdS se segrega en la hoja interna de la membrana plasmática de las células de mamíferos en reposo. La pérdida de asimetría de fosfatidilserina se produce durante la apoptosis, la lesión celular y la activación celular tal como se observa durante la infección viral. Esto se debe a la inhibición de las translocasas o la activación de los exportadores de fosfatidilserina, o enzimas codificadoras de lípidos, como las scramblasas (Soares et al., 2008). Los virus activan las células huésped para que se repliquen de manera eficiente, y la activación celular inducida por virus puede conducir a aumentos en el Ca2+ intracelular que, a su vez, provocan la externalización de fosfatidilserina al activar los exportadores de fosfatidilserina y al inhibir la importación de fosfatidilserina por parte de las translocasas. Además, la translocación de fosfatidilserina a la superficie externa de la célula huésped podría ser un evento temprano asociado con la apoptosis inducida por virus (Soares et al., 2008).
[0104] PtdS en la superficie de células infectadas, viriones en gemación o microvesículas derivadas de células preapoptóticas conduce a la evasión inmune. Usando los polipéptidos del dominio Gla de la presente divulgación para enmascarar el PtdS en estas membranas, la función inmunitaria normal puede abordar más eficazmente el desafío viral, reduciendo así la carga viral, limitando la infección y destruyendo viriones y células infectadas.
5. Sepsis
[0105] Antecedentes. En la sepsis, la inflamación y la trombosis son tanto la causa como el resultado de interacciones entre las células circulantes (por ejemplo, leucocitos y plaquetas), endoteliales y del músculo liso. Las micropartículas son fragmentos proinflamatorios y procoagulantes que se originan en la membrana plasmática generados después de la activación celular y liberados en los fluidos corporales. En el vaso, constituyen un conjunto de efectores bioactivos extraídos de diversos orígenes celulares y pueden actuar como mensajeros intercelulares. Las micropartículas exponen la fosfatidilserina, un fosfolípido procoagulante que se hace accesible después de la remodelación de la membrana, y el factor tisular (TF), el iniciador de la coagulación sanguínea en la superficie endotelial y leucocitaria. Constituyen una vía de secreción de IL-1 p y regular al alza la respuesta proinflamatoria de las células diana. Las micropartículas circulan en niveles bajos en individuos sanos, pero sufren cambios fenotípicos y cuantitativos que podrían desempeñar un papel fisiopatológico en enfermedades inflamatorias. Las micropartículas (MP) pueden participar en la patogenia de la sepsis de múltiples formas. Son capaces de regular el tono vascular y son potentes mediadores vasculares proinflamatorios y procoagulantes. Las capacidades de las micropartículas son de creciente interés para descifrar los mecanismos subyacentes a la disfunción multiorgánica del shock séptico.
[0106] La membrana plasmática de las células endoteliales y los monocitos se reorganiza con la externalización de fosfatidilserina y la expresión cifrada del factor tisular TF, lo que permite la activación del factor VII (FVIIa) y la generación de trombina (FIIa) en la superficie celular. Se produce formación de ampollas, con liberación de micropartículas que contienen TF, lo que da como resultado una mayor superficie para las reacciones procoagulantes. La adhesión y agregación de plaquetas también ocurren con la liberación de MP; las plaquetas y las MP portan GPIb a, un cofactor para la activación del factor XI por la trombina, lo que conduce a la fase de propagación con altos niveles de generación de trombina y formación de fibrina. Los MP que contienen TF endoteliales permiten la transferencia de TF a PMN, lo que aumenta la diseminación de TF y la microangiopatía trombótica o la coagulopatía intravascular diseminada. El inicio de la coagulación sanguínea por TF se regula rápidamente a la baja por el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) en las superficies de células endoteliales y monocíticas, como en las MP. La proteína C unida al receptor de la proteína C endotelial (EPCR) es activada por el complejo trombina-trombomodulina y la proteína C activada (APC) inhibe el factor Va y el factor VIIIa, lo que limita la fase de propagación de la generación de trombina. La APC unida a EPCR también regula NF-κΒ, con efectos citoprotectores sobre las células endoteliales y los monocitos. APC induce la formación de ampollas, con emisión de MP que contienen EPCR capaces de activar la proteína C, lo que resulta en la diseminación de actividades anticoagulantes y antiapoptóticas.
[0107] Actividad del dominio Gla. La presente invención contempla el uso de dominios Gla para controlar o modular las acciones pro-coagulantes de micropartículas que contienen PtdS y TF en su superficie. También pueden regular a la baja la señalización proinflamatoria relacionada que se produce en la sepsis, por ejemplo, a través de IL-1 p, así como modular los efectos de las micropartículas que contienen PtdS en el tono vascular.
C. Métodos de tratamiento
[0108] Los péptidos y polipéptidos se pueden administrar a sujetos mamíferos (p. ej., pacientes humanos) solos o en junto con otros fármacos que tratan las enfermedades expuestas anteriormente. La dosis requerida depende de la elección de la vía de administración; la naturaleza de la formulación, incluidos los agentes adicionales unidos al polipéptido; la naturaleza de la enfermedad del paciente; el tamaño, el peso, el área superficial, la edad y el sexo del sujeto; otras terapias de combinación; y el juicio del médico tratante. Las dosis adecuadas están en el intervalo de 0,0001 a 100 mg/kg. Cabe esperar amplias variaciones en la dosis necesaria en vista de la variedad de compuestos disponibles y las diferentes eficacias de las diversas vías de administración. Por ejemplo, se esperaría que la administración oral requiera dosis más altas que la administración por inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajustar utilizando rutinas empíricas estándar para la optimización, como se entiende bien en la técnica. Las administraciones pueden ser únicas o múltiples (por ejemplo, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 20, 50, 100, 150 o más veces). La encapsulación del polipéptido en un vehículo de administración adecuado (p. ej., micropartículas poliméricas o dispositivos implantables) puede aumentar la eficacia de la administración, particularmente para la administración oral.
D. Terapias combinadas
[0109] Es común en muchos campos de la medicina tratar una enfermedad con múltiples modalidades terapéuticas, a menudo denominadas "terapias combinadas". Para tratar trastornos usando los métodos y composiciones de la presente divulgación, generalmente se pondría en contacto una célula objetivo o un sujeto con un polipéptido de dominio Gla y al menos otra terapia. Estas terapias se proporcionarían en una cantidad combinada eficaz para lograr una reducción en uno o más parámetros de la enfermedad. Este proceso puede implicar el contacto de las células/sujetos con ambos agentes/terapias al mismo tiempo, por ejemplo, utilizando una sola composición o formulación farmacológica que incluya ambos agentes, o poniendo en contacto a la célula/sujeto con dos composiciones o formulaciones distintas, al mismo tiempo. al mismo tiempo, donde una composición incluye el polipéptido del dominio Gla y la otra incluye el otro agente.
[0110] Alternativamente, el polipéptido del dominio Gla puede preceder o seguir al otro tratamiento en intervalos que van desde minutos hasta semanas. En general, se aseguraría de que no transcurriera un período de tiempo significativo entre el momento de cada entrega, de modo que las terapias aún pudieran ejercer un efecto combinado ventajoso sobre la célula/sujeto. En tales casos, se contempla que uno contactaría la célula con ambas modalidades dentro de aproximadamente 12-24 horas entre sí, dentro de aproximadamente 6-12 horas entre sí, o con un tiempo de retraso de solo aproximadamente 12 horas. En algunas situaciones, puede ser deseable extender significativamente el período de tiempo para el tratamiento; sin embargo, cuando transcurren varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) entre las administraciones respectivas.
[0111] También es concebible que se desee más de una administración de la proteína del dominio Gla o de la otra terapia/agente. Se pueden emplear varias combinaciones, donde la proteína del dominio Gla es "A" y la otra terapia es "B", como se ejemplifica a continuación:
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Se contemplan otras combinaciones.
[0112] Los agentes o factores adecuados para usar en una terapia combinada contra un cáncer incluyen radionúclidos, agentes quimioterapéuticos o toxinas. Los quimioterapéuticos específicos incluyen temozolomida, epotilonas, melfalán, carmustina, busulfán, lomustina, ciclofosfamida, dacarbazina, polifeprosán, ifosfamida, clorambucilo, mecloretamina, busulfán, ciclofosfamida, carboplatino, cisplatino, tiotepa, capecitabina, estreptozocina, bicalutamida, flutamida, nilutamida, acetato de leuprolida, clorhidrato de doxorrubicina, sulfato de bleomicina, clorhidrato de daunorrubicina, dactinomicina, citrato de daunorrubicina liposomal, clorhidrato de doxorrubicina liposomal, clorhidrato de epirrubicina, clorhidrato de idarrubicina, mitomicina, doxorrubicina, valrrubicina, anastrozol, citrato de toremifeno, citarabina, fluorouracilo, fludarabina, floxuridina, interferón a-2b, plicamicina, mercaptopurina, metotrexato, interferóna-2a, acetato de medroxiprogesterona, fosfato de estramustina sódica, estradiol, acetato de leuprolida, acetato de megestrol, acetato de octreotida, difosfato de deitilestilbestrol, testolactona, acetato de goserelina, fosfato de etopósido, sulfato de vincristina, etopósido, vinblastina, etopósido, sulfato de vincristina, tenipósido, trastuzumab, gemtuzumab ozogamicina, rituximab, exemestano, clorhidrato de irinotecán, asparaginasa, clorhidrato de gemcitabina, altretamina, clorhidrato de topotecán, hidroxiurea, cladribina, mitotano, clorhidrato de procarbazina, tartrato de vinorelbina, pentrostatina sódica, mitoxantrona, pegaspargasa, denileucina dift. itix, altretinoína, porfímero, bexaroteno, paclitaxel, docetaxel, trióxido de arsénico o tretinαna. Las toxinas incluyen exotoxina de Pseudomonas (PE38), cadena A de ricina, toxina diftérica, además de PE y RT, proteína antiviral de hierba carmín (PAP), saporina y gelonina. Los radionúclidos para la terapia del cáncer incluyen Y-90, P-32, I-131, In-111, Sr-89, Re-186, Sm-153 y Sn-117m.
[0113] Los agentes o factores adecuados para usar en una terapia combinada contra un trastorno autoinmune incluyen composiciones antiinflamatorias y moduladoras del sistema inmunológico. Estos incluyen prednisona, metilprednisona, Venipred, Celestone, hidrocortisona, triamcinoclona, inyección intraarticular de Aristonpan, Metapred, Rayos oral, betametasona y etanercept.
[0114] Los agentes o factores adecuados para usar en una terapia combinada contra enfermedades cardiovasculares incluyen bloqueadores beta, antihipertensivos, cardiotónicos, antitrombóticos, vasodilatadores, hormonas antagonistas, antagonistas de la endotelina, inhibidores/bloqueadores de citocinas, bloqueadores de los canales de calcio, inhibidores de la fosfodiesterasa y antagonistas de la angiotensina tipo 2.
[0115] Los agentes o factores adecuados para usar en una terapia combinada contra un trastorno de hipercoagulación incluyen anticoagulantes tales como heparina y warfarina.
[0116] Los agentes o factores adecuados para usar en una terapia combinada contra infecciones virales incluyen abacavir, aciclovir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, ampligen, arbidol, atazanavir, atripla, boceprevirertet, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosina, Docosanol, Edoxudina, Efavirenz, Emtricitabina, Enfuvirtida, Entecavir, Inhibidores de entrada, Famciclovir, Fomivirsen, Fosamprenavir, Foscarnet, Fosfonet, Ganciclovir, Ibacitabina, Imunovir, Idoxuridina, Imiquimod, Indinavir, Inosina, Inhibidor de la integrasa, Interferón tipo III, Interferón tipo II, Interferón tipo I, interferón, lamivudina, lopinavir, loviride, maraviroc, moroxidina, metisazona, nelfinavir, nevirapina, nexavir, análogos de nucleósidos, oseltamivir, peginterferón alfa-2a, penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, inhibidor de la proteasa, raltegravir, inhibidor de la transcriptasa inversa, Ribavirina, Rimantadina, Ritonavir, Pyramidina, Saquinavir, Estavudina, Potenciador sinérgico (antirretroviral), Aceite de árbol de té, Telaprevir, Tenofovir, Tenofovir disoproxilo, Tipranavir, Trifluridina, Trizivir, Tromantadina, Truvada, Valaciclovir, Valganciclovir, Vicriviroc, Vidarabina, Viramidina, Zalcitabina, Zanamivir y Zidovudina.
[0117] El experto en la materia se dirige a "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15a edición, capítulo 33, en particular las páginas 624-652. Necesariamente ocurrirá alguna variación en la dosificación dependiendo de la condición del sujeto que se está tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para la administración humana, las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza según lo exigen los estándares de la oficina de productos biológicos de la FDA.
[0118] También debe señalarse que cualquiera de las terapias anteriores puede resultar útil por sí misma en el tratamiento.
V. Ejemplos
EJEMPLO 1
[0119] Las afinidades de las proteínas del dominio Gla por las membranas celulares se han determinado in vitro usando vesículas de fosfolípidos preparadas (Shah et al., 1998; Nelsestuen, 1999). Sin embargo, no se ha dilucidado completamente cómo estos valores in vitro se traducen en un contexto in vivo. La interacción de FVII con TF, por ejemplo, subraya el hecho de que aunque los dominios Gla de estas proteínas son muy homólogos, las diferencias adicionales en su especificidad y afinidad de unión a la membrana celular pueden estar mediadas por sus dominios EGF y/o Kringle. Desafortunadamente, estas interacciones no pueden recapitularse mediante estudios basados únicamente en vesículas de fosfolípidos y pueden permanecer sin identificar.
[0120] Por lo tanto, los inventores propusieron hacer y probar los dominios Gla+EGHKringle, así como el dominio Gla solo del siguiente panel de proteínas: hS (aglutinante de alta afinidad), hZ (aglutinante de afinidad media), hPT (aglutinante de afinidad media). que contiene kringle), hFVII (baja afinidad: utiliza un "receptor" secundario que también está regulado al alza en el cáncer) y B0178 (hFVII con mayor afinidad por los fosfolípidos). Estas proteínas tienen potencialmente diversas características de unión in vivo que pueden ser beneficiosas para su uso como sondas (y, si se validan y son selectivas, potencialmente como agentes terapéuticos) y que hasta la fecha no se han reconocido.
[0121] El enfoque general fue construir proteínas recombinantes y probar su expresión. A continuación, se desarrollarían ensayos para evaluar la unión. A continuación, se optimizarían los métodos de expresión y purificación, seguidos del control de calidad de la carboxilación gamma.
[0122] La FIG. 1 muestra secuencias de una variedad de proteínas de dominio Gla que incluyen sitios de carboxilación. FIG. 2 muestra la expresión de una variedad de diferentes proteínas de dominio Gla que se diseñaron y se expresaron transitoriamente en células 293. FIG. 3 muestra un estudio similar en células BHK21. Dado que una de las construcciones de mejor expresión era una construcción de Proteína S EGF, la secuencia señal de la Proteína S se utilizó con Protrombina Gla Kringle y Proteína Z EGF. Sin embargo, la expresión solo se observó intracelularmente (Figura 4).
[0123] Se seleccionó Proteína S Gla EGF para estudio adicional. La secuencia se muestra en la FIG. 5. La proteína se produjo en células BHK21 usando medio RF286. Se recogieron 600 ml y se concentraron 4X. La purificación utilizó tres pasos:
1. Columna Ni-NTA, 10 ml, recién empaquetada. El medio se carga en la columna y se eluye con un gradiente de imidazol. Todas las fracciones se someten a una transferencia western Gla para identificar la proteína Gla S G+E etiquetada con His.
2. Hitrap Q con cada paso de elución. Las fracciones positivas para Gla se agrupan y se someten a 1 ml de Hitrap Q con una elución de 10 mM cada una.
3. Hitrap Q con cada gradiente (gradiente de sombra de 0-10 mM). Las proteínas Gla purificadas en el paso se aplicaron a Q y se eluyeron con gradiente cada uno (hasta 10 mM). Se produjo un total de 0,9 mg de proteína con un nivel de pureza del 95 %. FIG. 6 muestra las fracciones de purificación en condiciones tanto reductoras como no reductoras. FIGS. 7 y 8 muestran diferentes ensayos de apoptosis basados en FAC. Ambos muestran que la construcción Proteína S Gla EGF es específica para las células que experimentan apoptosis al igual que la Anexina V (Figura 7), y que la Anexina V puede competir con la unión de Proteína S Gla EGF.
[0124] En resumen, se expresó y purificó Proteína S Gla+EGF. El análisis del material purificado sugirió que estaba altamente gamma-carboxilado. Los ensayos de apoptosis basados en FAC demostraron que la proteína S G+E (11 Gla) podía unirse a las células "apoptóticas", y que esta unión a las células se realizaba a través de la fosfatidilserina, como lo demuestran los ensayos de competencia de anexina V.
VI. Referencias
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una sonda y/o un polipéptido terapéutico adecuado para dirigirse a la expresión de la superficie celular de la fosfatidilserina tanto in vitro como in vivo, comprendiendo dicho polipéptido:
un dominio de proteína S gamma-carboxiglutámico-ácido (Gla) y
un dominio EGF,
en el que dicho polipéptido está fusionado con una secuencia proteica; y
en el que dicho polipéptido carece de un dominio de proteasa y también carece de un dominio de unión a hormonas.
2. El polipéptido según la reivindicación 1 que comprende un dominio EGF de la proteína S.
3. El polipéptido según la reivindicación 2, en el que el dominio GLA tiene la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1.
4. El polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el polipéptido tiene 300 aminoácidos o menos.
5. El polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende SEQ ID NO: 6.
6. El polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el polipéptido comprende además una región Fc de anticuerpo.
7. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en el tratamiento.
8. Un polipéptido según la reivindicación 7, para uso en el tratamiento en una terapia de combinación.
9. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en el tratamiento del cáncer.
10. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en el tratamiento de una infección viral.
11. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10, para uso en el tratamiento de una infección viral seleccionada del grupo que consiste en influenza, virus de inmunodeficiencia humana, virus del dengue, virus del Nilo Occidental, virus de la viruela, virus respiratorio sincitial, virus de la fiebre hemorrágica coreana, varicela, virus de la varicela zóster, virus del herpes simple 1 o 2, virus de Epstein-Barr, virus de Marburg, hantavirus, virus de la fiebre amarilla, hepatitis A, B, C o E, virus del Ébola, virus del papiloma humano, rinovirus, virus Coxsackie, virus de la poliomielitis, virus del sarampión, virus de la rubéola, virus de la rabia, virus de la enfermedad de Newcastle, rotavirus, HTLV-1 y -2.
12. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en el tratamiento de trastornos de hipercoagulación.
13. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en el tratamiento de un estado de enfermedad autoinmune y/o inflamatoria.
14. Un polipéptido para su uso según la reivindicación 13, en el que el estado patológico se selecciona del grupo que consiste en espondiloartropatía, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, artritis reactiva, artritis enteropática, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad del intestino irritable, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, fiebre mediterránea familiar, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de Sjogren, artritis temprana, artritis viral, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, psoriasis, vasculitis, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Addison, alopecia, síndrome antifosfolípido, enfermedad de Behcet, celíaca crónica, síndrome de fatiga crónica, colitis ulcerosa, diabetes tipo I, fibromialgia, gastritis autoinmune, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), miastenia grave, pénfigo vulgar, cirrosis biliar primaria, fiebre reumática, sarcoidosis, esclerodermia, vitíligo, vasculitis, vasculitis de vasos pequeños, hepatitis, cirrosis biliar primaria, sarcoidosis, esclerodermia, enfermedad de injerto contra huésped (aguda y crónica), anemia aplásica y neutropenia cíclica.
15. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en el tratamiento de sepsis.
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