KR101191779B1 - 인자 ⅶ 또는 ⅶ에이 지엘에이 도메인 변종들 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 인자 VII 또는 인간 인자 VIIa에 상대적인 1-15 아미노산 변형들을 포함하고, 여기서 소수성 아미노산 잔기는 위치 34에서 치환에 의해 도입되거나, 또는 위치 36에서 아미노산 치환을 갖거나, 또는 위치들 10 및 32에서 아미노산 치환들을 갖고, 74, 77 및 116에서 선택된 위치에서 적어도 하나의 추가의 아미노산 치환을 갖는 인간 인자 VII 또는 인간 인자 VIIa의 Gla 도메인 변종들을 개시한다.

Description

인자 Ⅶ 또는 Ⅶ에이 지엘에이 도메인 변종들 {FACTOR VII OR VIIa GLA DOMAIN VARIANTS}
본 발명은 인자 FVII (FVII) 또는 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩티드들의 신규한 Gla 도메인 변종들 뿐만 아니라 그러한 폴리펩티드 변종들의 치료 용도, 특히 각종 응고-관련 질환들의 치료에서 그 용도에 관한 것이다.
혈액 응고는 결과적으로 피브린 응혈을 초래하는 여러 가지 혈액 성분들 (또는 인자들) 의 복잡한 상호 작용으로 구성된 과정이다. 일반적으로, "응고 캐스케이드"라 칭해지는 과정에 참여하는 혈액 성분들은 프로엔자임들 또는 자이모겐들, 즉, 활성화제에 의한 작용에 의해 활성 형태로 변환되는 효소적으로 불활성인 단백질들이다. 이들 응고 인자들 중의 하나는 FVII이다.
FVII는 53 kDa의 분자량을 갖는 단쇄 글리코프로테인으로서 간에서 합성되고 혈액으로 분비되는 비타민 K-의존형 플라즈마 단백질이다(Broze & Majerus, J. Biol. Chem. 1980; 255:1242-1247). FVII 자이모겐은 단일 부위, R152-I153에서 단백질 분해 분열에 의해 활성화된 형태(FVIIa)로 변환되어, 단일 이황화물 다리에 의해 링크된 2개의 사슬을 초래한다. 조직 인자와의 착물 중의 FVIIa (FVIIa 착물)은 인자 IX (FIX) 및 인자 X (FX) 모두를 그들의 활성화된 형태로 변환시킬 수 있고, 고속 트롬빈 생산 및 피브린 형성을 유도하는 반응들이 후속한다 (øterud & Rapaport, Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74:5260-5264).
FVII는 분자의 N-말단 영역에서 10개의 γ-카르복시글루탐산 잔기들을 초래하는 비타민 K-의존형 카르복실화를 포함하는 후-해독 변형들을 수행한다. 따라서, SEQ ID NO:1에 나타낸 잔기 번호 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 35는 FVII 활성을 위해 중요한 Gla 도메인에서 γ-카르복시글루탐산 잔기들이다. 기타 후-해독 변형들은 위치 145 및 322에서 각각 2개의 천연 발생 N-글리코실화 부위들에서 및 위치 52 및 60에서 각각 2개의 천연 발생 O-글리코실화 부위들에서 당 모이어티 부착을 포함한다.
인간 FVII (hFVII)에 대한 유전자 코딩은 q34-qter 9에서 크로모좀 13으로 매핑되었다 (de Grouchy 등, Hum Genet 1984; 66:230-233). 그것은 9개의 엑손들 및 스팬들 12.8 Kb을 함유한다 (O'Hara 등, Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84:5158-5162).
FVII의 유전자 조직화 및 단백질 구조는 신호 서열에 대해 인코딩하는 엑손들 1a 및 1b; 엑손 2 프로펩티드 및 Gla 도메인; 엑손 3 짧은 소수성 영역; 엑손들 4 및 5 상피 성장 인자-형 도메인들; 및 엑손 6 내지 8 세린 프로테아제 촉매 도메인에 의해 다른 비타민 K-의존형 응혈 촉진제 단백질들의 그것들과 유사하다 (Yoshitake 등, 생화학 1985; 24: 3736-3750).
hFVIIa (Pike 등, Proc Natl Acad Sci USA, 1999; 96:8925-30 및 Kemball-Cook 등, J. Struct. Biol., 1999; 127:213-223); X-선 결정학적 방법들을 사용하 여 가용성 조직 인자와의 착물 중의 hFVIIa (Banner 등, Nature, 1996; 380:41 및 Zhang 등, J. Mol. Biol., 1999; 285: 2089); 및 hFVII의 보다 작은 단편들 (Muranyi 등, 생화학, 1998; 37:10605 및 Kao 등, 생화학, 1999; 38:7097)의 실험에 의한 3차원 구조들에 대한 보고서들이 있다.
FVII의 비교적 적은 단백질-조작된 변종들이 보고되고 있다 (Dickinson & Ruf, J Biol Chem, 1997;272:19875-19879; Kemball-Cook 등, J Biol Chem, 1998; 273:8516-8521; Bharadwaj 등, J Biol Chem, 1996; 271:30685-30691; Ruf 등, 생화학, 1999; 38:1957-1966).
BHK 또는 기타 포유 동물 세포들 중의 FVII의 발현 (WO 92/15686, WO 91/11514 및 WO 88/10295) 및 진핵 생물 세포들에서 FVII 및 kex2 엔도프로테아제의 동시-발현에 대한 보고서들이 있다 (WO 00/28065).
재조합 인간 FVIIa (rhFVIIa)의 상용 제제들은 상표명 NovoSeven?으로 시판되고 있다. NovoSeven?은 혈우병 A 또는 B 환자들에서 출혈 증상들의 치료를 지시한다. NovoSeven?은 현재 시판중인 출혈 증상들의 효과적이고 신뢰할 수 있는 치료용의 유일한 rhFVIIa이다.
아르기닌 152 및(또는) 이소류신 153이 변형된 FVII의 불활성 형태는 WO 91/11514에 보고되어 있다. 이들 아미노산들은 활성화 부위에 위치한다. WO 96/12800는 세린 프로테이나제 억제제에 의한 FVIIa의 불활성화를 기재한다. α-아미노산기 I153에서 FVIIa의 카르바밀화에 의한 불활성화는 Petersen 등에 의해, Eur J Biochem, 1999;261:124-129에 개시되어 있다. 불활성화된 형태는 조직 인자 에 결합하고, 응혈 활성을 억제하기 위해 야생형 FVII 또는 FVIIa와 경쟁할 수 있다. FVIIa의 불활성화된 형태는 패혈증, 심근 경색 또는 혈전성 발작의 위험이 있는 환자들 과 같이 과응고 상태들로 고통받는 환자들의 치료에 사용되도록 제안된다.
외상 등의 제어되지 않는 출혈의 치료와 관련하여, FVIIa는 조직 인자에 대한 결합 없이 FX를 FXa로 활성화시킬 수 있는 것으로 믿어지고, 이러한 활성화 반응은 활성화된 혈소판들에 대해 주로 발생하는 것으로 믿어진다 (Hedner 등, 혈액 응고 & 섬유소 용해, 2000;11;107-111). 그러나, hFVIIa 또는 rhFVIIa는 조직 인자의 부재 하에 FX를 향한 낮은 활성을 갖고, 결과적으로, 예를 들면 외상 환자들에서 제어되지 않는 출혈의 치료는 비교적 많은 다중 복용량의 hFVIIa 또는 rhFVIIa를 요한다. 따라서, 제어되지 않는 출혈들을 보다 효율적으로 치료하기 위해 (혈액 손실을 최소화하기 위해) 조직 인자의 부재 하에 FX 쪽으로 큰 활성을 갖는 개선된 FVIIa 분자들이 필요하다. 그와 같이 개선된 FVIIa 분자들은 제어되지 않는 출혈들과 관련하여 투여될 때 rhFVIIa에 비교한 바 느린 응혈 시간 (보다 빠른 작용/증가된 응혈 활성)을 보여야 한다.
FVII/FVIIa의 Gla 도메인 변종들은 WO 99/20767, US 6,017,882 및 WO 00/66753에 개시되어 있으며, 여기서 Gla 도메인에 위치하는 일부 잔기들은 인지질 멤브레인 결합에 대해서 및 그에 따라 FX 활성화를 위해 중요한 것으로서 식별되었다. 특히, 잔기들 10 및 32는 중요하고, 증가된 인지질 멤브레인 결합 친화도, 및 그에 따라 증가된 FX 활성화는 연변이들 P10Q 및 K32E를 수행함으로써 달성될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 특히, FX 활성화는 낮은 레벨의 조직 인자가 존재하는 상황들 하에서와 같이 한계 응고 상황에서 rhFVIIa에 비교한 바 증진된 것으로 밝혀졌다.
WO 01/58935는 무엇보다도 검출된 글리코실화 또는 PEG일화(PEGylation)에 의해 증가된 반감기를 갖는 FVII 또는 FVIIa 분자들을 개발하는 새로운 전략을 개시한다.
WO 03/093465는 Gla 도메인에서 특정 변형들을 갖고, Gla 도메인 외부에 도입된 1개 이상의 N-글리코실화 부위들을 갖는 FVII 또는 FVIIa 변종들을 개시한다.
WO 2004/029091은 조직 인자 결합부위에 특정 변형들을 갖는 FVII 또는 FVIIa 변종들을 개시한다.
본 발명자들은 인지질 멤브레인 결합 친화도를 추가로 증가시키고, 따라서 FX 활성화를 추가로 증가시키는 Gla 도메인 중의 추가의 잔기들을 이제 식별한다. 본 발명의 FVII 또는 FVIIa 변종들은 또한 감소된 조직 인자 결합 친화도를 나타낼 수 있다.
본 발명의 목적은 hFVIIa, rhFVIIa 또는 [P10Q+K32E]rhFVIIa보다 더 효율적으로 FX를 FXa로 활성화시킬 수 있는 개선된 FVII 또는 FVIIa 분자들 (FVII 또는 FVIIa 변종들)을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 조직 인자의 부재 하에 hFVIIa, rhFVIIa 또는 [P10Q+K32E]rhFVIIa보다 효율적으로 FX를 FXa로 활성화시킬 수 있는 개선된 FVII 또는 FVIIa 분자들 (FVII 또는 FVIIa 변종들)을 제공하는 것이다. 이들 목적은 본원에 제공된 FVII 또는 FVIIa 변종들에 의해 다루어진다.
발명의 간단한 설명
제1 국면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 인간 인자 VII (hFVII) 또는 인간 인자 VIIa (hFVIIa)에 상대적인 1-15 아미노산 변형들을 포함하고, 여기서 소수성 아미노산 잔기는 위치 34에서 치환에 의해 도입되는 것인 아미노산 서열을 갖는 인자 VII (FVII) 또는 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩티드 변종에 관한 것이다.
제2 국면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 인간 인자 VII (hFVII) 또는 인간 인자 VIIa (hFVIIa)에 상대적인 1-15 아미노산 변형들을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 여기서 아미노산 서열은 위치 36에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 인자 VII (FVII) 또는 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩티드 변종에 관한 것이다.
제3 국면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 인간 인자 VII (hFVII) 또는 인간 인자 VIIa (hFVIIa)에 상대적인 3-15 아미노산 변형들을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 여기서 아미노산 서열은 위치들 10 및 32에서 아미노산 치환 및 위치들 74, 77 및 116로 구성된 군에서 선택된 위치에서 적어도 하나의 추가의 아미노산 치환을 포함하는 것인 인자 VII (FVII) 또는 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩티드 변종에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 국면들은 본 발명의 폴리펩티드 변종들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터, 및 뉴클레오티드 서열 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 추가의 국면들은 본 발명의 폴리펩티드 변종들을 포함하는 제약 조성물, 의약으로서 본 발명의 폴리펩티드 변종들 또는 본 발명의 제약 조성물의 용도, 뿐만 아니라 본 발명의 폴리펩티드 변종들 또는 제약 조성물들을 사용한 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 국면들은 아래 상세한 설명 뿐만 아니라 첨부된 특허 청구의 범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 "전혈 분석"에서 평가될 때 본 발명의 변종들에 대한 클로팅 시간 대 농도를 보여주는 도면.
도 2는 "트롬보그램 분석"에서 결정된 본 발명의 변종들에 대한 최대 조직 인자-의존형 트롬빈 발생률을 보여주는 도면.
도 3은 "트롬보그램 분석"에서 결정된 본 발명의 변종들에 대한 인지질-의존형 트롬빈 발생률을 보여주는 도면.
정의
본원 명세서 및 특허 청구의 범위의 문맥에서 다음 정의들이 적용된다.
"FVII" 또는 "FVII 폴리펩티드"라는 용어는 단일 사슬 형태로 제공되는 FVII 분자를 의미한다. a FVII 폴리펩티드의 일 예는 SEQ ID NO:1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 야생형 인체 FVII (hFVII)이다. 그러나, "FVII 폴리펩티드"라는 용어는 SEQ ID NO:1의 단편들 또는 변종들, 특히 그 서열이 SEQ ID NO:1에 비교한 바 적어도 하나, 예를 들면 15 이하, 바람직하게는 10개 이하의 아미노산 변형들을 포함하는 변종들과 같은 hFVII-형 분자들을 커버하기도 함을 이해해야 한다.
"FVIIa" 또는 "FVIIa 폴리펩티드"라는 용어는 그의 활성화된 2-사슬 형태로 제공된 FVIIa 분자를 의미한다. SEQ ID NO:1의 아미노산 서열이 FVIIa의 아미노산 서열을 개시하기 위해 사용될 때, 단일-사슬 형태의 R152 및 I153 사이의 펩티드 결합이 분열되었고, 사슬들 중의 하나는 아미노산 잔기들 1-152를 포함하고, 나머지 사슬은 아미노산 잔기들 153-406을 포함하는 것을 이해할 것이다.
"rFVII" 및 "rFVIIa"라는 용어는 재조합 기술들에 의해 생산된 FVII 및 FVIIa 폴리펩티드들을 의미한다.
"hFVII" 및 "hFVIIa"라는 용어는 SEQ ID NO:1에 나타난 아미노산 서열을 갖는 인간 야생형 FVII 및 FVIIa 각각을 의미한다.
"rhFVII" 및 "rhFVIIa"라는 용어는 재조합 수단에 의해 생산되는, SEQ ID NO:1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 인간 야생형 FVII 및 FVIIa를 의미한다. rhFVIIa의 예는 NovoSeven?이다.
본원에 사용될 때, "Gla 도메인"이라는 용어는 SEQ ID NO:1의 아미노산 잔기들 1 내지 45를 커버하도록 의도된다.
따라서, "Gla 도메인 외부에 위치하는 위치"라는 용어는 SEQ ID NO:1의 아미노산 잔기들 46-406을 커버한다.
약어들 "FX", "TF" 및 "TFPI"는 인자 X, 조직 인자 및 조직 인자 경로 억제제, 각각을 의미한다.
"프로테아제 도메인"이라는 용어는 N-말단으로부터 카운트된 잔기들 153-406에 대해 사용된다.
"촉매 부위"라는 용어는 폴리펩티드 변종의 S344, D242 및 H193으로 구성된 촉매 트라이애드를 의미하도록 사용된다.
"부모"라는 용어는 본 발명에 따라 변형/개선되어야 하는 분자를 지시하도록 의도된다. 본 발명에 의해 변형되어야 할 부모 폴리펩티드는 임의의 FVII 또는 FVIIa 폴리펩티드일 수 있고, 따라서 임의의 기원, 예를 들면 인간외 포유 동물 기원으로부터 유도될 수 있지만, 부모 폴리펩티드는 hFVII 또는 hFVIIa인 것이 바람직하다.
"변종"이라는 용어는 그의 부모 폴리펩티드와는 1개 이상의 아미노산 잔기들이 상이하고, 보편적으로 1-15 아미노산 잔기들 (예. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 아미노산 잔기들), 예를 들면 1-10 아미노산 잔기들, 예. 1-8, 1-6, 1-5 또는 1-3 아미노산 잔기들이 상이하다. 보편적으로, 부모 폴리펩티드는 hFVII 또는 hFVIIa이다.
"콘쥬게이트" (또는 상호 교환적으로 "콘쥬게이트된 폴리펩티드")라는 용어는 1개 이상의 폴리펩티드들을 1개 이상의 비-폴리펩티드 모이어티들, 예를 들면 중합체 분자들, 친유성 화합물들, 당 모이어티들 또는 유기 유도제들에 공유 부착시킴으로써 형성된 이형 (복합체 또는 키메라 의미에서) 분자를 지시하도록 의도된다. 바람직하게는, 콘쥬게이트는 관련 농도들 및 조건들에서 가용성이고, 즉, 혈액 등의 생리적 유체들 중에 용해된다.
본 발명의 콘쥬게이트된 폴리펩티드들의 예들은 글리코실화 및(또는) PEG일화된 폴리펩티드들을 포함한다.
"공유 부착" 또는 "공유적으로 부착된"이라는 용어는 폴리펩티드 변종 및 비-폴리펩티드 모이어티가 상호 직접적으로 공유로 결합되거나 또는 적어도 하나의 개입하는 모이어티, 예를 들면 브리지, 스페이서 또는 연결 모이어티를 통해 상호 간접적으로 공유로 결합되는 것을 의미한다.
"비-폴리펩티드 모이어티"라는 용어는 아미노산 단량체로 구성되고 펩티드 결합들에 의해 함께 링크된 펩티드 중합체와 상이한 분자를 의미하고, 여기서 분자는 본 발명의 폴리펩티드 변종의 부착기에 콘쥬게이트될 수 있다. 그러한 분자들의 바람직한 예들은 중합체 분자들, 당 모이어티들, 친유성 화합물들 또는 유기 유도제들을 포함한다. 본 발명의 콘쥬게이트된 변종의 맥락에서 사용될 때, 비-폴리펩티드 모이어티는 폴리펩티드의 부착기를 통해 콘쥬게이트된 변종의 폴리펩티드 부분에 링크되는 것을 이해해야 한다. 상기 설명된 바와 같이, 비-폴리펩티드 모이어티는 부착기에 직접적으로 또는 간접적으로 공유로 결합될 수 있다.
"중합체 분자"라는 용어는 단량체들 중의 어느 것도 아미노산 잔기가 아닌 2개 이상의 단량체의 공유 결합에 의해 형성된 분자이고, 단, 여기서 중합체는 인간 알부민 또는 다른 여분의 플라즈마 단백질이다. "중합체"라는 용어는 "중합체 분자"와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 이 용어는 또한 보편적으로 폴리펩티드 변종의 부착기에 탄수화물 분자를 공유 결합시키는 것을 포함하고, 임의로 가교제를 사용하여 시험관 내에서 수행되는 시험관 내 글리코실화, 즉, 합성 글리코실화에 의해 부착된 탄수화물 분자들을 커버하도록 의도된다.
"당 모이어티"라는 용어는 1개 이상의 단당류를 포함하고, 생체내 글리코실화에 의해 폴리펩티드 변종에 부착될 수 있는 (글리코실화된 폴리펩티드 변종 형태의 폴리펩티드 변종을 생산함) 탄수화물-함유 분자를 지시하도록 의도된다. "생체 내 글리코실화"라는 용어는 예를 들면 N-링크된 및 O-링크된 글리코실화에 의해 폴리펩티드 변종의 발현을 위해 사용된 글리코실화되는 세포에서 해독후 프로세싱 동안 생체 내에서 발생하는 당 모이어티의 임의의 부착을 의미하도록 의도된다. 정확한 올리고당류 구조는 광범위하게는 문제의 글리코실화 유기체에 의존한다.
"N-글리코실화 부위"는 서열 N-X-S/T/C를 갖고, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기이고, N은 아스파라긴이고, S/T/C는 세린, 트레오닌 또는 시스테인이고, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌이고, 가장 바람직하게는 트레오닌이다. 바람직하게는, 아스파라긴 잔기에 상대적인 위치 +3에서 아미노산 잔기는 프롤린 잔기가 아니다.
"O-글리코실화 부위"는 세린 또는 트레오닌 잔기의 OH-기이다.
"부착기"라는 용어는 폴리펩티드 변종, 특히 그의 아미노산 잔기의 관능기 또는 탄수화물 모이어티를 지시하도록 의도되고, 비-폴리펩티드 모이어티, 예를 들면 중합체 분자, 친유성 분자, 당 모이어티 또는 유기 유도제를 부착시킬 수 있다. 유용한 부착기들 및 이들의 매치되는 비-폴리펩티드 모이어티들은 아래 표로부터 명백하다.
부착기 아미노산 비-폴리펩티드 모이어티의 예 콘쥬게이션 방법/-활성화된 PEG 참조
-NH2 N-말단, Lys 중합체, 예. PEG, 아미드 또는 이민기를 가짐 mPEG-SPA
트레실화된 mPEG		 Nektar Therapeutics
Delgado et al, Critical reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9(3,4):249-304 (1992)
-COOH C-말단, Asp, Glu 중합체, 예. PEG, 에스테르 또는 아미드 기를 가짐

탄수화물 모이어티		 mPEG-Hz



시험관 내 커플링		 Nektar Therapeutics
-SH Cys 중합체, 예. PEG, 이황화물, 말레이미드 또는 비닐 술폰기를 가짐

탄수화물 모이어티		 PEG-비닐술폰
PEG-말레이미드


시험관 내 커플링		 Nektar Therapeutics
Delgado et al, Critical reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9(3,4):249-304 (1992)
-OH Ser, Thr, Lys, OH- 당 모이어티

PEG
에스테르, 에테르, 카르바메이트, 카보네이트를 가짐		 생체내 O-링크된 글리코실화
-CONH2 Asn
N-글리코실화 부위의 일부로서		 당 모이어티

중합체, 예. PEG		 생체내 N-글리코실화
방향족 잔기 Phe, Tyr, Trp 탄수화물 모이어티 시험관 내 커플링
-CONH2 Gln 탄수화물 모이어티 시험관 내 커플링 Yan 및 Wold, 생화학, 1984, Jul 31; 23(16): 3759-65
알데히드
케톤
 산화된
올리고당류		 중합체, 예. PEG,
PEG-히드라지드 		PEG일화 Andresz 등, 1978, Macromol. Chem. 179:301, WO 92/16555, WO 00/23114
구아니디노 Arg 탄수화물 모이어티 시험관 내 커플링 Lundblad 및 Noyes, 단백질 변형을 위한 화학적 시약들, CRC Press Inc., Florida, USA
이미다졸 고리 His 탄수화물 모이어티 시험관 내 커플링 구아니딘에 대해서와 같음
생체내 N-글리코실화를 위해, "부착기"라는 용어는 N-글리코실화 부위 (상기한 바와 같이 서열 N-X-S/T/C를 가짐)를 구성하는 아미노산 잔기를 지시하는 비통상적 방식으로 사용된다. N-글리코실화 부위의 아스파라긴 잔기는 당 모이어티가 글리코실화 동안 부착된 것이고, 그러한 부착은 N-글리코실화 부위의 다른 아미노산 잔기들이 존재하는 한 달성될 수 없다.
따라서, 비-폴리펩티드 모이어티가 당 모이어티이고 콘쥬게이션이 생체내 N-글리코실화에 의해 달성되어야 할 때, 폴리펩티드의 아미노산 서열의 수정과 관련하여 사용되는 바의 "비-폴리펩티드 모이어티에 대한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기"라는 용어는 생체내 N-글리코실화 부위를 구성하는 아미노산 잔기들이 관능성 생체내 N-글리코실화 부위가 아미노산 서열 내로 도입되는 방식으로 변경되어야 하는 것을 의미함을 이해해야 한다.
본원에서, 아미노산 명칭들 및 원자명들 (예, CA, CB, CD, CG, SG, NZ, N, O, C, etc)는 IUPAC 명명법 (아미노산들 및 펩티드들에 대한 IUPAC 명명법 및 기호학 (잔기 명칭들, 원자 명칭들, 등.), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984)과 함께 Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985))에서 이들의 수정안에 기초하여 단백질 데이터뱅크 (PDB) (www.pdb.org)에 정의된 바와 같이 사용된다.
"아미노산 잔기"라는 용어는 임의의 천연 또는 합성 아미노산 잔기를 포함하도록 의도되고, 주로 20개의 천연적으로 발생하는 아미노산들로 구성된 군에 포함된, 즉, 알라닌 (Ala 또는 A), 시스테인 (Cys 또는 C), 아스파르트산 (Asp 또는 D), 글루탐산 (Glu 또는 E), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 글리신 (Gly 또는 G), 히스티딘 (His 또는 H), 이소류신 (Ile 또는 I), 리신 (Lys 또는 K), 류신 (Leu 또는 L), 메티오닌 (Met 또는 M), 아르기닌 (Asn 또는 N), 프롤린 (Pro 또는 P), 글루타민 (Gln 또는 Q), 아르기닌 (Arg 또는 R), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 발린 (Val 또는 V), 트립토판 (Trp 또는 W), 및 티로신 (Tyr 또는 Y) 잔기들로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 지시하도록 의도된다.
아미노산 위치들을 식별하기 위해 사용된 용어학은 다음과 같이 예시된다: G124는 위치 124가 SEQ ID NO:1에 나타낸 아미노산 서열 중의 글리신 잔기에 의해 점유되는 것을 지시한다. G124R는 위치 124의 글리신 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된 것을 지시한다. 대안의 치환들은 "/"로 지시되고, 예를 들면 N145S/T는 위치 145에서 아스파라긴이 세린 또는 트레오닌으로 치환된 아미노산 서열을 의미한다. 다중 치환들은 "+"로 지시되고, 예를 들면 K143N+N145S/T는 위치 143에서 리신 잔기가 아스파라긴 잔기로 치환된 것 및 위치 145에서 아스파라긴 잔기가 세린 또는 트레오닌 잔기로 치환된 것을 포함하는 아미노산 서열을 의미한다. 추가의 아미노산 잔기의 삽입, 예를 들면. G124후에 알라닌 잔기의 삽입은 G124GA에 의해 지시된다. G124후에 2개의 추가의 알라닌 잔기들의 삽입은 G124GAA, 등에 의해 지시된다. 본원에 사용될 때, "위치 X에 삽입된" 또는 "위치 X에서 삽입된"이라는 용어는 아미노산 잔기(들)이 아미노산 잔기 X와 X+1 사이에 삽입되는 것을 의미한다. 아미노산 잔기의 삭제는 별표로 지시된다. 예를 들면, 위치 124에서 글리신 잔기의 삭제는 G124*로 지시된다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에서 이루어진 아미노산 잔기들의 번호매김은 hFVII/hFVIIa 폴리펩티드 (SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열에 상대적으로 이루어진다.
특이적 돌연변이들과 관련하여 사용된 바의 "와 상이하다"라는 용어는 명시된 아미노산 차이와 달리 존재하는 추가의 차이들을 허용하도록 의도된다. 예를 들면, FX 활성화를 증가시키는 것을 목표로 하는 Gla 도메인에서 수행된 변형들 외에, 폴리펩티드는 이러한 효과에 반드시 관련될 필요가 없는 다른 변형들을 포함할 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 아미노산 변형들 외에. 본 발명의 폴리펩티드 변종의 아미노산 서열은 필요할 경우 다른 수종들, 즉 다른 치환들, 삽입들 또는 삭제들을 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 이들은 예를 들면, 1개 이상의 아미노산 잔기들에 의한 (예. 1-10 아미노산 잔기들에 의해) N- 및(또는) C-말단들의 절삭, 또는 N- 및(또는) C-말단들에서 1개 이상의 여분의 잔기들의 부가, 예를 들면 N-말단에서 메티오닌 잔기의 부가 또는 C-말단에서 또는 그 근처에서 시스테인 잔기의 도입 뿐만 아니라 "보수적 아미노산 치환들", 즉 유사한 특성들을 갖는 아미노산들, 예를 들면 작은 아미노산들, 산성 아미노산들, 극성 아미노산들, 염기성 아미노산들, 소수성 아미노산들 및 방향족 아미노산들의 그룹 내에서 수행된 치환들을 포함할 수 있다.
그러한 보수적 치환들의 예들은 아래 표에 나타낸다.
1 알라닌 (A) 글리신 (G) 세린 (S) 트레오닌(T)
2 아스파르트산(D) 글루탐산 (E)
3 아스파라긴 (N) 글루탐산 (Q)
4 아르기닌 (R) 히스티딘 (H) 리신 (K)
5 이소류신 (I) 류신 (L) 메티오닌 (M) 발린 (V)
6 페닐알라닌 (F) 티로신 (Y) 트립토판 (W)
추가의 변형들의 또 다른 실시예들은 "Gla 도메인 외부의 변형들" 및 "Gla 도메인 외부의 다른 변형들"이라는 표제의 섹션들에 개시되어 있다.
"뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 2개 이상의 뉴클레오티드 분자들의 연속적인 스트레치를 지시하도록 의도된다. 뉴클레오티드 서열은 게놈, cDNA, RNA, 반합성, 합성 기원, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
"벡터"라는 용어는 숙주 세포 내에서 복제될 수 있거나 또는 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있는 플라스미드 또는 기타 뉴클레오티드 서열을 의미하고,
뉴클레오티드 서열의 클로닝을 고무시키기 위해, 즉, 유용한 양의 서열을 생산하고, 그 서열에 의해 인코딩된 유전자 생성물의 발현을 지향시키기 위해서, 및 숙주 세포의 게놈 내로 뉴클레오티드 서열을 통합하기 위해 상용성 숙주 세포들(벡터-숙주 시스템)과 관련하여 상이한 기능들을 수행하는데 유용하다. 벡터는 그것이 수행해야할 기능에 따라 상이한 성분들을 포함할 것이다.
"세포, "숙주 세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 본원에 상호 교환 가능하게 사용되고, 그러한 모든 용어들은 세포의 성장 또는 배양에서 기인하는 프로게니를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"형질 전환" 및 "형질 감염"은 DNA를 세포 내로 도입하는 과정을 의미하는 것으로 상호 교환 가능하게 사용된다.
"작동 가능하게 링크된"은 효소적 결찰에 의해서 또는 그렇지 않으면 서열들의 정상적인 기능이 수행될 수 있는 상호 상대적인 구성으로 2개 이상의 뉴클레오티드 서열들의 공유 결합을 의미한다. 링킹은 편리한 제한 부위들에서 결찰에 의해 수행된다. 그러한 부위들이 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터들 또는 링커들은 표준 재조합 DNA 방법들과 관련하여 사용된다.
본 발명의 맥락에서, "변형" 또는 "아미노산 변형"이라는 용어는 아미노산 측쇄의 대체, 아미노산 잔기의 치환, 아미노산 잔기의 삭제 또는 아미노산 잔기의 삽입을 커버하도록 의도된다.
"도입"이라는 용어는 특히 현존하는 아미노산 잔기의 치환 또는 대안으로 추가의 아미노산 잔기의 삽입에 의한 아미노산 잔기의 도입을 의미한다.
"제거"라는 용어는 특히 제거되어야 할 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하거나 또는 대안으로 제거되어야 할 아미노산 잔기를 (치환 없이) 삭제함으로써 아미노산 잔기를 제거하는 것을 의미한다.
현재의 맥락에서, "활성"이라는 용어는 활성이 실제로 측정되는 분석과 연관된 관련 활성으로서 이해되어야 한다.
"아미도리틱 활성"이라는 용어는 본원에 개시된 "아미도리틱 분석"에서 측정된 활성을 의미하도록 사용된다. "아미도리틱 활성"을 나타내기 위해, 활성화된 형태의 본 발명의 변종은 본원에 개시된 "아미도리틱 분석"에서 분석될 때 rhFVIIa의 아미도리틱 활성의 적어도 10%를 가져야 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 활성화된 형태의 변종은 rhFVIIa의 아미도리틱 활성의 적어도 20%, 예를 들면 적어도 30%, 예. 적어도 40%를 갖고, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 예를 들면 적어도 60%, 예, 적어도 70%, 훨씬 더 바람직하게는 본원에 개시된 "아미도리틱 분석"에서 분석될 때 rhFVIIa의 아미도리틱 활성의 적어도 80%, 예를 들면 적어도 90%를 가져야 한다. 흥미로운 실시예에서, 활성화된 형태의 변종은 rhFVIIa와 실질적으로 동일한 아미도리틱 활성, 예를 들면 rhFVIIa의 아미도리틱 활성의 75-125%의 아미도리틱 활성을 갖는다.
"응혈 활성"이라는 용어는 본원에 개시된 "전혈 분석"에서 측정된 활성, 즉 응혈 형성을 얻는데 필요한 시간을 의미한다. 따라서, 보다 느린 응혈 시간은 보다 높은 응혈 활성에 대응한다.
"증가된 응혈 활성"이라는 용어는 폴리펩티드 변종의 응혈 시간이 본원에 개시된 "전혈 분석"에서 측정될 때 및 필적하는 조건들 하에 결정된 바와 같이 rhFVIIa 또는 [P10Q+K32E]rhFVIIa에 의해 발생된 것에 비해 통계적으로 현저히 감소되었음을 지시하기 위해 사용된다.
본원의 맥락에서, "활성"이라는 용어는 또한 FX를 FXa로 활성화시킬 수 있는 변종의 능력과 관련하여 사용된다. 이러한 활성은 또한 "FX 활성화 활성" 또는 "FXa 발생 활성"을 제공하고, 본원에 개시된 "TF-독립형 인자 X 활성화 분석"에서 결정될 수 있다.
"증가된 FX 활성화 활성" 또는 "증가된 FXa 발생 활성"이라는 용어는 활성화된 형태의 본 발명의 변종이 기준 분자, 예를 들면 rhFVIIa 또는 [P10Q+K32E]rhFVIIa에 비해 FX를 FXa로 활성화시키는 통계적으로 현저히 증가된 능력을 갖는 것을 지시하기 위해 사용된다. 본 발명의 변종(그의 활성화된 형태로)이 어느 정도까지 증가된 FX 활성화 활성을 갖는지는 본원에 개시된 "TF-독립형 인자 X 활성화 분석"에서 편리하게 결정될 수 있다.
주어진 기질과 관련하여 사용된 바의 "면역유발성(immunogenicity)"이라는 용어는 면역 시스템으로부터 반응을 유도하는 기질의 능력을 지시하도록 의도된다 (예, 면역유발성의 추가의 정의를 위해 Roitt: 필수 면역학 (제10판, Blackwell) 참조). 보편적으로, 감소된 항체 반응성은 감소된 면역유발성의 지시일 것이다. 면역유발성은 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법, 예 생체내 또는 시험관 내 방법에 의해 결정될 수 있다.
"관능성 생체내 반감기"라는 용어는 그의 통상적인 의미로 사용되고, 즉 폴리펩티드의 생물학적 활성의 50%가 신체/타겟 장기에 여전히 존재하는 시간 또는 폴리펩티드의 활성이 초기 값의 50%인 시간을 의미한다.
관능성 생체내 반감기에 대한 대안으로서, "혈청 반감기"가 결정될 수 있고, 즉, 폴리펩티드의 50%는 클리어되기에 앞서 플라즈마 또는 혈류 중에서 순환한다. 혈청 반감기의 결정은 종종 관능성 생체내 반감기를 측정하는 것보다 단순하고, 혈청 반감기의 크기는 보편적으로 관능성 생체내 반감기의 크기의 양호한 지시자이다. 혈청 반감기에 대한 대체 용어는 "플라즈마 반감기", "순환하는 반감기", "혈청 클리어런스", "플라즈마 클리어런스" 및 "클리어런스 반감기"를 포함한다. 폴리펩티드는 1개 이상의 망상 내피계 시스템들 (RES), 신장, 비장 또는 간의 작용에 의해서, 조직 인자, SEC 수용체 또는 기타 수용체 매개된 제거에 의해서 또는 특이적 또는 비특이적 단백질 분해에 의해 세정된다. 보편적으로, 클리어런스는 크기 (사구체 여과에 대한 컷오프에 상대적), 전하, 부착된 탄수화물 사슬들 및 단백질에 대한 셀룰러 수용체들의 존재에 의존한다. 보유되어야 할 관능성은 보편적으로 응혈 촉진제, 단백질 분해 또는 수용체 결합 활성으로부터 선택된다. 기능성 생체내 반감기 및 혈청 반감기는 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 결정될 수 있다.
관능성 생체내 반감기 또는 혈청 반감기에 관하여 사용된 바의 "증가된"이라는 용어는 폴리펩티드 변종의 관련 반감기가 필적하는 조건들 하에 결정된 바와 같이 (전형적으로 동물, 예를 들면 쥐, 토끼, 돼지 또는 원숭이 실험에서 결정됨) 기준 분자, 예를 들면 rhFVIIa 또는 [P10Q+K32E]rhFVIIa의 그것에 비해 통계적으로 현저히 증가되었음을 지시하도록 사용된다.
"AUCiv" 또는 "정맥내로 투여될 때 커브 아래 영역"이라는 용어는 그의 통상적인 의미로 사용되고, 즉, 혈청-시간 곡선에서 활성 아래 영역을 의미하고, 여기서 폴리펩티드 변종은 정맥 내로 투여되고, 특히 쥐들에서 정맥 내로 투여된다. 전형적으로 측정된 활성은 상기 정의된 바의 "응혈 활성"이다. 일단 실험에 의한 활성-시간 지점들이 결정되면, AUCiv는 GraphPad Prism 3.01 등의 컴퓨터 프로그램에 의해 편리하게 산출될 수 있다.
상이한 분자들의 AUCiv-값들 사이의 (예, rhFVIIa 또는 [P10Q+K32E]rhFVIIa 등의 기준 분자와 본 발명의 변종들 사이) 직접적인 비교를 위해, 동일한 양의 활성이 투여되어야 함을 이해할 것이다. 결과적으로, AUCiv-값들은 전형적으로 노르말화되고 (즉, 주사된 복용량의 차이들에 대해 정정되고), AUCiv/투여된 복용량으로서 표현된다.
"단백질 분해 저하에 대한 감소된 민감도"라는 용어는 주로 폴리펩티드 변종들이 필적하는 조건들 하에 측정된 바와 같이 hFVIIa, rhFVIIa 또는 [P10Q+K32E]rhFVIIa에 비교한 바 단백질 저하에 대한 감수된 민감도를 갖는 것을 의미하도록 의도된다. 바람직하게는, 단백질 분해 저하는 적어도 10% 만큼 (예 10-25% 만큼 또는 10-50% 만큼), 예를 들면 적어도 25% (예 25-50%, 25-75% 만큼 또는 25-100% 만큼), 보다 바람직하게는 적어도 35% 만큼, 예를 들면 적어도 50%, (예 50-75% 만큼 또는 50-100% 만큼) 보다 더 바람직하게는 적어도 60% 만큼, 예를 들면 적어도 75% 만큼 (예 75-100% 만큼) 또는 심지어 적어도 90% 만큼 감소된다.
"신장 클리어런스"라는 용어는 그의 보편적인 의미로 신장에 의해 발생하는 임의의 클리어런스를 의미하고, 예를 들면 사구체 여과, 관상 분비 또는 관상 세포들에서의 저하에 의한 것을 의미하도록 사용된다. 신장의 클리어런스는 크기(직경), 하이드로다이내믹 부피, 시메트리, 형상/강도 및 전하의 물리적 특성들에 의존한다. 보편적으로, 약 67 kDa의 분자량은 신장 클리어런스에 대한 컷-오프 값인 것으로 고려된다. 신장 클리어런스는 임의의 적절한 분석에 의해, 예를 들면 확립된 생체내 분석에 의해 확립될 수 있다. 전형적으로, 신장의 클리어런스는 환자에게 라벨된 (예, 방사선 라벨되거나 또는 형광 라벨된) 폴리펩티드를 투여하고, 환자로부터 수집된 소변 중의 라벨 활성을 측정함으로써 측정된다. 감소된 신장의 클리어런스는 필적하는 조건들 하에 대응하는 기준 폴리펩티드, 예 rhFVIIa 또는 [P10Q+K32E]rhFVIIa에 상대적으로 측정된다. 바람직하게는, 폴리펩티드 변종의 신장 클리어런스는 rhFVIIa 또는 [P10Q+K32E]rhFVIIa에 비해 적어도 50% 만큼, 바람직하게는 적어도 75% 만큼, 및 가장 바람직하게는 적어도 90% 만큼 감소된다.
"조직 인자 결합 부위", "활성 부위 영역" 및 "활성 부위 결합 클레프트의 리지"라는 용어들은 실시예 1을 참조하여 정의된다.
"소수성 아미노산 잔기"라는 용어는 다음 아미노산 잔기들을 포함한다: 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y) 및 트립토판 (W).
"음으로 하전된 아미노산 잔기"라는 용어는 다음 아미노산 잔기들을 포함한다: 아스파르트산 (D) 및 글루탐산 (E).
"양으로 하전된 아미노산 잔기"라는 용어는 다음 아미노산 잔기들을 포함한다: 리신 (K), 아르기닌 (R) 및 히스티딘 (H).
본 발명의 변종들
부모 폴리펩티드의 Gla 도메인에서 수행된 변형들은 증가된 인지질 멤브레인 결합 친화도, FX를 Fxa로 활성화시키는 개선된 능력, 및(또는) 증가된 응혈 활성을 갖는 결과의 분자를 제공하는 것이 바람직하다. 본 발명의 변종들은 조직 인자에 결합될 때 감소된 조직 인자 결합 친화도 및 감소된 활성을 가질 수도 있다.
임의의 특정 이론으로 제한되지 않고, 증진된 인지질 멤브레인 결합 친화도는 다른 응고 인자들, 특히 FX에 가장 근사하는 활성화된 폴리펩티드 변종들의 높은 국소 농도를 초래하는 것으로 현재 믿어진다. 따라서, FX의 FXa로의 활성화 속도는 간단히 FX에 대한 활성화된 FVII 변종의 보다 큰 몰비로 인해 더 높아질 것이다. 이어서, FX의 증가된 활성화 속도는 보다 많은 양의 활성 트롬빈, 및 그에 따른 피브린의 보다 큰 가교 속도를 초래한다.
결과적으로, 본 발명에 따른 폴리펩티드 변종은 현재 입수할 수 있는 rhFVIIa 화합물 (NovoSeven?)에 비해 장점들, 예를 들면 보다 적은 복용량, 증가된 효능 및(또는) 보다 빠른 작용을 제공할 수 있을 것으로 예상된다.
더욱이, 조직 인자-독립형 변종들, 즉, 야생형 인간 인자 VIIa에 비교한 바 조직 인자에 결합될 때 감소된 활성을 갖는 변종들은 특히 외상 등의 제어되지 않는 급성 출혈 사건들의 치료를 위해 사용될 때 바람직하지 않은 혈액 응혈 형성 (예, 트롬보시스 또는 트롬보엠볼리즘)의 감소된 위험성의 견지에서 특정 안전성 장점들을 제공할 수 있는 것으로 믿어진다.
따라서, 본 발명의 고도로 바람직한 실시예에서, 활성 형태의 폴리펩티드 변종은 기준 분자, 예를 들면 rhFVIIa 또는 [P10Q+K32E]rhFVIIa에 비교될 때 특히 본원에 개시된 "TF-독립형 인자 X 활성화 분석" 등의 조직 인자-독립형 분석에서 분석될 때 증가된 FX 활성화 활성을 갖는다. 특히, 활성화된 형태의 폴리펩티드 변종의 FX 활성화 활성과 기준 분자의 FX 활성화 활성 사이의 비율은 본원에 개시된 "TF-독립형 인자 X 활성화 분석"에서 분석될 때 적어도 1.25인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 이 비율은 적어도 1.5, 예를 들면 적어도 1.75, 예, 적어도 2, 보다 더 바람직하게는 적어도 3, 예를 들면 적어도 4, 가장 바람직하게는 적어도 5이다.
기준 분자가 rhFVIIa일 때, 활성화된 형태의 폴리펩티드 변종의 FX 활성화 활성과 rhFVIIa의 FX 활성화 활성 사이의 비율은 바람직하게는 적어도 약 5, 전형적으로 적어도 약 10이고, 본원에 개시된 "TF-독립형 인자 X 활성화 분석"에서 분석될 때 예를 들면 적어도 약 15 또는 20이다.
본 발명의 다른 고도로 바람직한 실시예에서, 본 발명의 변종들은 rhFVIIa 또는 [P10Q+K32E]rhFVIIa에 비교한 바 증가된 응혈 활성 (즉, 감소된 응혈 시간)을 갖는다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 변종을 위한 응혈 형성에 도달하는 시간 (t변종)과 rhFVIIa (twt) 또는 [P10Q+K32E]rhFVIIa (tP10Q+K32E)에 대한 응혈 형성에 도달하는 시간 사이의 비율은 본원에 개시된 "전혈 분석"에서 분석될 때 기껏 0.9이다. 보다 바람직하게는, 이 비율은 기껏 0.75, 예를 들면 0.7, 보다 더 바람직하게는 이 비율은 기껏 0.6이고, 가장 바람직하게는 이 비율은 기껏 0.5이다.
1개 이상의 상기 특성들은 본원에 개시된 변형들에 의해 달성될 수 있다.
위치 34에서 소수성 아미노산 잔기를 포함하는 본 발명의 변종들
상기 지시된 바와 같이, 본 발명은 제1 국면에서 hFVII 또는 hFVIIa (SEQ ID NO:1)에 대해 상대적으로 1-15 아미노산 변형들을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 소수성 아미노산 잔기가 위치 34에서 치환에 의해 도입되는 FVII 또는 FVIIa 폴리펩티드 변종에 관한 것이다.
위치 34에서 도입되어야 할 소수성 아미노산 잔기는 I, L, M, V, F, Y 및 W, 바람직하게는 I, L 및 V, 특히 L로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 이 변종은 위치 10에서 아미노산 치환, 특히 P10Q, 및(또는) 위치 32에서 아미노산 치환, 특히 K32E를 추가로 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 이 변종은 P10Q+K32E 등과 같이 위치들 10 및 32 모두에서 치환들을 포함한다.
따라서, 본 발명의 흥미로운 실시예에서, 이 변종은 치환들 P10Q+K32E+A34L을 포함한다.
본 발명의 특히 흥미로운 실시예에서, 이 변종은 위치 3과 4 사이에 적어도 하나의 (전형적으로 하나) 아미노산 잔기의 삽입을 포함한다. 삽입된 아미노산 잔기는 소수성 아미노산 잔기인 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 그 삽입은 A3AY이다. 따라서, 본 발명의 특히 흥미로운 실시예에서, 그 변종은 변형들 A3AY+P10Q+K32E+A34L을 포함한다.
임의의 상기 변형들 외에, 그 변종은 위치 33에서 추가의 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 소수성 아미노산 잔기는 위치 33에서의 치환, 특히 D33F에 의해 도입된다.
Gla 도메인은 또한 다른 위치들, 특히 위치들 8, 11 및 28에서 변형들, 예를 들면 R28F 또는 R28E를 포함할 수 있다. 다른 한편, Gla 도메인은 멤브레인 결합 특성들이 손상되는 정도까지는 변형되지 않아야 하는 것이 이해되어야 한다. 따라서, γ-카르복실화되는 잔기들에서 어떠한 변형도 이루어지지 않는 것이 바람직하고, 즉, 잔기들 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 35에서 어떠한 변형들도 이루어지지 않는 것이 바람직하다. 유사한 방식으로, 일반적으로 비-폴리펩티드 모이어티들, 예를 들면 당 모이어티들 및(또는) PEG 기들이 Gla 도메인에 도입되는 것은 바람직하지 않다. 결과적으로, 생체내 N-글리코실화 부위를 생성하는 Gla 도메인에서 어떠한 변형도 이루어지지 않는 것이 바람직하다.
마지막으로, 이 단락에서 고찰되는 Gla 도메인에서의 변형들은 Gla 도메인 외부에 위치한 위치들에서 1개 이상의 변형들과 유리하게 조합될 수 있음이 이해될 것이다 (아래 "Gla 도메인 외부의 변형들" 및 "Gla 도메인 외부의 다른 변형들"이라는 표제의 섹션들 참조).
위치 36에서 아미노산 치환을 포함하는 본 발명의 변종들
상기 지시된 바와 같이, 본 발명은 제2 국면에서 hFVII 또는 hFVIIa (SEQ ID NO:1)에 상대적으로 1-15 아미노산 변형들을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 여기서 상기 아미노산 서열은 위치 36에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 FVII 또는 FVIIa 폴리펩티드 변종에 관한 것이다.
바람직하게는, 위치 36에서 치환에 의해 도입되는 아미노산 잔기 톱은 음으로 하전된 아미노산 잔기, 예 R36E 또는 R36D, 특히 R36E이다.
바람직한 실시예에서, 이 변종은 위치 10에서 아미노산 치환, 특히 P10Q, 및(또는) 위치 32에서 아미노산 치환, 특히 K32E를 추가로 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 그 변종은 위치들 10 및 32 모두에서 치환들, 예를 들면 P10Q+K32E를 포함한다.
본 발명의 변종은 위치 38에서 치환을 추가로 포함할 수 있다. 음으로 하전된 아미노산 잔기는 위치 38에서 치환, 예 K38E 또는 K38D, 특히 K38E에 의해 도입되는 것이 바람직하다.
따라서, 흥미로운 변종들은 다음 치환들 P10Q+K32E+R36E 또는 P10Q+K32E+R36E+K38E을 포함하는 것들이다.
특히 흥미로운 실시예에서, 그 변종은 위치 34에서 아미노산 치환을 추가로 포함한다 (즉, 결과의 변종은 다음 잔기들 10+32+34+36 또는 10+32+34+36+38에서 치환들을 포함한다). 바람직하게는, 음으로 하전된 아미노산 잔기는 위치 34에서 치환, 예 A34E 또는 A34D에 의해 도입된다.
바람직한 변종들의 특정 예는 다음 치환들 P10Q+K32E+A34E+R36E 또는 P10Q+K32E+A34D+R36E+K38E를 포함하는 것들이다.
본 발명의 흥미로운 실시예에서, 그 변종은 위치 3과 4 사이에 적어도 하나의 (적형적으로 하나) 아미노산 잔기의 삽입을 추가로 포함한다. 삽입된 아미노산 잔기는 소수성 아미노산 잔기인 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 그 삽입은 A3AY이다.
임의의 상기 변형들 외에, 그 변종은 위치 33에서 추가의 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 소수성 아미노산 잔기는 위치 33에서 치환, 특히 D33F에 의해 도입된다.
Gla 도메인은 다른 위치들, 특히 위치들 8, 11 및 28에서 변형들, 예를 들면 R28F 또는 R28E를 포함할 수도 있다. 다른 한편, Gla 도메인은 멤브레인 결합 특성들이 손상되는 정도까지는 변형되지 않아야 하는 것이 이해되어야 한다. 따라서, γ-카르복실화되는 잔기들에서 어떠한 변형도 이루어지지 않는 것이 바람직하고, 즉, 잔기들 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 35에서 어떠한 변형들도 이루어지지 않는 것이 바람직하다. 유사한 방식으로, 일반적으로 비-폴리펩티드 모이어티들, 예를 들면 당 모이어티들 및(또는) PEG 기들이 Gla 도메인에 도입되는 것은 바람직하지 않다. 결과적으로, 생체내 N-글리코실화 부위를 생성하는 Gla 도메인에서 어떠한 변형도 이루어지지 않는 것이 바람직하다.
마지막으로, 이 단락에서 고찰되는 Gla 도메인에서의 변형들은 Gla 도메인 외부에 위치한 위치들에서 1개 이상의 변형들과 유리하게 조합될 수 있음이 이해될 것이다 (아래 "Gla 도메인 외부의 변형들" 및 "Gla 도메인 외부의 다른 변형들"이라는 표제의 섹션들 참조).
위치 74, 77 또는 116에서 아미노산 치환을 포함하는 본 발명의 변종들
상기 지시된 바와 같이, 본 발명은 제3 국면에서 hFVII 또는 hFVIIa (SEQ ID NO:1)에 상대적으로 3-15 아미노산 변형들을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 여기서 상기 아미노산 서열은 위치 10, 36에서 아미노산 치환 및 위치 74, 77 및 116으로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 추가의 아미노산 치환을 포함하는 것인 FVII 또는 FVIIa 폴리펩티드 변종에 관한 것이다.
바람직한 실시예에서, 위치 10에서 아미노산 치환은 P10Q이고 위치 32에서 아미노산 치환은K32E이다.
위치 74, 77 또는 116에서 치환은 P74S, E77A 및 E116D로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 더욱 바람직하다.
흥미로운 실시예에서, 그 변종은 위치 34에서 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 음으로 하전된 아미노산 잔기는 위치 34에서 치환, 예 A34E 또는 A34D, 특히 A34E에 의해 도입된다.
본 발명의 다른 흥미로운 실시예에서, 그 변종은 위치 3과 4 사이에 적어도 하나의 (적형적으로 하나) 아미노산 잔기의 삽입을 추가로 포함한다. 삽입된 아미노산 잔기는 소수성 아미노산 잔기인 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 그 삽입은 A3AY이다.
따라서, 흥미로운 변종들의 특정 예들은 다음 변형들 A3AY+P10Q+K32E+E116D, A3AY+P10Q+K32E+E77A 및 P10Q+K32E+A34E+P74S를 포함하는 변종들을 포함한다.
임의의 상기 변형들 외에, 그 변종은 위치 33에서 추가의 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 소수성 아미노산 잔기는 위치 33에서 치환, 특히 D33F에 의해 도입된다.
Gla 도메인은 다른 위치들, 특히 위치들 8, 11 및 28에서 변형들, 예를 들면 R28F 또는 R28E를 포함할 수도 있다. 상기 설명된 바와 같이, Gla 도메인은 멤브레인 결합 특성들이 손상되는 정도까지는 변형되지 않아야 하고, 즉, 잔기들 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 35에서 어떠한 변형들도 이루어지지 않는 것이 바람직하고, 생체내 N-글리코실화 부위는 Gla 도메인에 생성되지 않는 것이 바람직하다.
마지막으로, 이 단락에서 고찰되는 Gla 도메인에서의 변형들은 Gla 도메인 외부에 위치한 위치들에서 1개 이상의 변형들과 유리하게 조합될 수 있음이 이해될 것이다 (아래 "Gla 도메인 외부의 변형들" 및 "Gla 도메인 외부의 다른 변형들"이라는 표제의 섹션들 참조).
Gla 도메인 외부의 변형들
2.3시간의 순환하는 rhFVIIa 반감기는 "NovoSeven?에 대한 승인의 기본 요약서", FDA 참조 번호 96-0597에 보고되어 있다. 비교적 높은 복용량 및 빈도의 투여가 목적하는 치료 효과 및 예방 효과에 도달하고, 그것을 지속시키는데 필요하다. 결과적으로, 적절한 복용량 조절은 얻기 곤란하고, 빈번한 정맥내 투여에 대한 필요성은 환자의 생활 방식을 구속한다.
보다 긴 순환 반감기 및(또는) 증가된 생체적합성을 갖는 분자 (정맥내로 투여될 때 rhFVIIa에 비교한 바 곡선 아래 증가된 영역)는 필요한 투여 횟수를 감소시킬 수 있다.
빈번한 주사에 대한 현행 필요성 및 부수적인 증진된 치료 효과를 갖는 보다 최적의 치료 FVIIa 레벨을 얻을 가능성이 주어짐으로써, 개선된 FVII- 또는 FVIIa-like 분자들에 대한 분명한 필요성이 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 목적은 증가된 생체적합성 (예를 들면 정맥내로 투여될 때 기준 분자, 예를 들면 rhFVIIa 또는 [P10Q+K32E]rhFVIIa에 비교한 바 곡선 아래 증가된 영역)을 갖고, 기준 분자, 예를 들면 rhFVIIa 또는 [P10Q+K32E]rhFVIIa보다 효율적으로 인자 X를 인자 Xa로 활성화시킬 수 있는 능력 (결합 내지 조직 인자 없음)을 갖고 (그에 따라 외상 등의 조절되지 않는 출혈, 또는 혈우병 등의 만성 증상들을 보다 효과적으로 치료할 수 있는) 개선된 FVII 또는 FVII 분자들 (FVII 또는 FVIIa 변종들)을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명의 흥미로운 변종들은 이들의 활성화된 형태로, 기준 분자, 예를 들면 rhFVIIa 또는 [P10Q+K32E]rhFVIIa와 비교될 때, 정맥 내로 (AUCiv) 투여할 때 곡선 아래 증가된 영역을 발생시키는 것들이다. 이는 쥐들에서 정맥 내로 투여함으로써 편리하게 측정될 수 있다. 특히, 본 발명의 흥미로운 변종들은 활성화된 형태의 상기 변종의 AUCiv와 기준 분자, 예를 들면 rhFVIIa 또는 [P10Q+K32E]rhFVIIa의 AUCiv 사이의 비율이 특히 쥐들에서 (정맥 내로) 투여될 때 적어도 1.25, 예를 들면 적어도 1.5, 예, 적어도 1.75, 보다 바람직하게는 적어도 2, 예를 들면 적어도 3, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 4, 예를 들면 적어도 5인 것들이다.
이러한 효과는 종종 기준 분자, 예를 들면 rhFVIIa 또는 [P10Q+K32E]rhFVIIa에 비교한 바 증가된 관능성 생체내 반감기 및(또는) 증가된 혈청 반감기에 대응할 것이다. 따라서, 본 발명의 다른 흥미로운 실시예에서, 활성화된 형태의 변종들에 대한 관능성 생체내 반감기 또는 혈청 반감기와 기준 분자, 예를 들면 rhFVIIa 또는 [P10Q+K32E]rhFVIIa에 대한 관능성 생체내 반감기 또는 혈청 반감기 사이의 비율은 적어도 1.25이다. 보다 바람직하게는, 활성화된 형태의 변종에 대한 관련 반감기와 기준 분자, 예를 들면 rhFVIIa 또는 [P10Q+K32E]rhFVIIa에 대한 관련 반감기 사이의 비율은 적어도 1.5, 예를 들면 적어도 1.75, 예, 적어도 2, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 3, 예를 들면 적어도 4, 예, 적어도 5이다.
단백질의 순환 반감기를 증가시키는 한가지 방식은 신장 클리어런스가 감소되는 것을 보장하는 것이다. 이는 단백질에 대한 감소된 신장 클리어런스를 제공할 수 있는 화학적 모이어티, 예, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 단백질을 콘쥬게이트시킴으로써 달성될 수 있다.
더욱이, 단백질에 화학적 모이어티의 부가 또는 단백질 분해에 노출된 아미노산들의 치환은 그렇지 않으면 단백질의 단백질 분해 저해를 유도하는 접촉으로부터 단백질 분해 효소를 효과적으로 블로킹할 수 있다.
상기 지시된 바와 같이, 단백질 분해 저하로 인한 불안전성은 현행 rhFVIIa 치료에서 공지된 문제점이다. 따라서, 단백질 분해 저하는 친액화된 제품과 반대료 용액 중의 제제를 얻는 주요 장애물이다. 안정한 가용성 제제를 얻는 장점은 환자들을 위해 다루기 용이하고, 위급하고, 신속한 액션을 취해야 하는 경우에 생명을 구하게 될 가능성이 있다는 것이다. 주요 단백질 분해 부위들에서 부위 지향된 뮤타겐시스에 의한 단백질 분해 저하를 방지하려는 시도들은 WO 88/10295에 개시되어 있다.
WO 01/58935는 AUCiv, 관능성 생체내 반감기 및(또는) 혈청 반감기의 증가를 유도하는 많은 적절한 변형들을 개시한다. WO 01/58935에 개시된 변종들은 일반적으로 개선된 FVII 또는 FVIIa 분자들을 개발하려는 새로운 전략의 결과이고, 이는 또한 본 발명의 부모 FVII 또는 FVIIa 폴리펩티드에 대해 사용될 수도 있다.
보다 상세하게는, 부모 FVII 또는 FVIIa 폴리펩티드에서 비-폴리펩티드 모이어티를 위한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기를 제거 및(또는) 도입함으로써, 분자가 선택된 비-폴리펩티드 모이어티에 대한 콘쥬게이션에 보다 민감해지도록 폴리펩티드를 구체적으로 채택하고, 콘쥬게이션 패턴을 최적화시키고 (예, FVII 또는 FVIIa 폴리펩티드 변종의 표면에 대한 비-폴리펩티드 모이어티들의 수 및 최적 분포를 보장하고, 콘쥬게이트되도록 의도된 부착기들만이 분자 내에 존재하는 것을 보장하고), 그에 따라 rhFVIIa에 비교한 바 아미도리틱 활성 및 부가적으로 1개 이상의 개선된 특성들을 갖는 신규 콘쥬게이트 분자를 얻는 것이 가능하다.
본 발명의 흥미로운 실시예들에서, Gla 도메인 외부에 위치하는 1개 이상의 아미노산 잔기는 변경되고, 예를 들면 그 변경은 선택된 비-폴리펩티드 모이어티를 위한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기들의 제거 뿐만 아니라 도입을 포함한다. 아미노산 잔기들의 제거 및(또는) 도입 외에, 폴리펩티드 변종은 비-폴리펩티드 모이어티를 위한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기들의 도입 및(또는) 제거에 관련되지 않는다.
또한, 폴리펩티드 변종은 폴리펩티드 변종의 촉매 부위를 억제하기 위해 세린 프로테이나제 억제제에 부착될 수 있다. 대안으로, 촉매 부위 (S344, D242 및 H193)에 존재하는 1개 이상의 아미노산 잔기들은 생성된 변종이 불활성이 되게 하기 위해 돌연변이될 수 있다. 그러한 돌연 변이의 일 예는 S344A이다.
비-폴리펩티드 모이어티를 위한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기는 그것이 제거되거나 또는 도입되거나 무관하게 선택된 비-폴리펩티드 모이어티의 특성에 기초하고, 대부분의 경우에 폴리펩티드 변종과 비-폴리펩티드 모이어티 사이의 콘쥬게이션이 달성되어야 하는 방법에 기초하여 선택된다. 예를 들면, 비-폴리펩티드 모이어티가 중합체 분자, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리알킬렌 산화물 유도 분자일 때, 부착기를 포함하는 아미노산 잔기들은 리신, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 히스티딘, 및 티로신, 바람직하게는 리신, 시스테인, 아스파르트산 및 글루탐산, 보다 바람직하게는 리신 및 시스테인으로 이루어진 군으로부터, 특히 시스테인으로부터 선택될 수 있다.
비-폴리펩티드 모이어티에 대한 부착기가 부모 폴리펩티드 내로 도입되거나 또는 그로부터 제거되어야 할 때마다, 변형되어야 할 아미노산 잔기의 위치는 바람직하게는 부모 FVII 또는 FVIIa 폴리펩티드의 표면에 위치하고, 보다 바람직하게는 표면에 노출된 그의 측쇄의 적어도 25%를 갖는 아미노산 잔기에 의해 점유되고 (여기서 실시예 1에 정의된 바와 같음), 바람직하게는 표면에 노출된 그의 측쇄의 적어도 50%이다 (여기서 실시예 1에 정의된 바와 같음). 그러한 위치들은 WO 01/58935에 개시된 바와 같이 hFVII 또는 hFVIIa 분자의 3D 구조의 분석에 기초하여 식별되고 있다.
더욱이, 변형되어야 할 위치는 바람직하게는 조직 인자 결합부위 외부, 및(또는) 활성 부위 영역 외부, 및(또는) 활성 부위 결합 클레프트의 리지 외부에 위치하는 FVII 또는 FVIIa 분자의 일부로부터 선택된다. 이들 부위들/영역들은 본원의 실시예 1 및 WO 01/58935에서 식별된다.
부착기를 제거하는 경우에, 그러한 기를 포함하고, 상기한 바의 위치를 점유하는 관련 아미노산 잔기는 바람직하게는 문제의 비-폴리펩티드 모이어티에 대한 부착기를 포함하지 않는 상이한 아미노산 잔기로 치환된다. 보편적으로, 제거되어야 할 아미노산 잔기는 콘쥬게이션이 불리한 것이고, 예를 들면 폴리펩티드의 관능성 부위 또는 그 근처에 위치하는 아미노산이다 (그러한 부위에서 콘쥬게이션은 예를 들면 손상된 수용체 인식으로 인해 결과의 콘쥬게이트의 불활성화 또는 감소된 활성을 초래할 수 있기 때문에). 본 발명의 맥락에서, "관능적 부위"라는 용어는 FVII 또는 FVIIa에 필수적이거나 또는 그렇지 않으면 그의 기능 또는 성능에 연루되는 1개 이상의 아미노산 잔기들을 지시하도록 의도된다. 그러한 아미노산 잔기들은 관능적 부위의 일부이다. 관능적 부위는 당업계에 공지된 방법들에 의해 측정될 수 있고, 바람직하게는 FVIIa-조직 인자 착물의 구조물의 분석에 의해 식별된다 (Banner 등, Nature 1996; 380:41-46 참조).
부착기를 도입하는 경우에, 그러한 기를 포함하는 아미노산 잔기는 바람직하게는 그러한 위치를 점유하는 아미노산 잔기의 치환에 의해 관련 위치 내로 도입된다.
FVII 또는 FVIIa 폴리펩티드의 콘쥬게이션을 위해 존재하고 이용될 수 있는 부착기들의 정확한 수는 콘쥬게이션에 의해 달성되어야 하는 목적하는 효과에 의존한다. 얻어야 할 효과는 예를 들면 콘쥬게이션 특성 및 그 정도에 의존한다 (예, 비-폴리펩티드 모이어티의 식별, 폴리펩티드 변종을 콘쥬게이트하는데 바람직하거나 또는 가능한 비-폴리펩티드 모이어티들의 수, 이것들이 콘쥬게이트되어야 하는 경우 또는 콘쥬게이션이 피해져야 하는 경우).
부모 FVII 또는 FVIIa 폴리펩티드에서 Gla 도메인 외부에서 변형되어야 할 아미노산 잔기들의 전체수는 (SEQ ID NO:1에 나타낸 아미노산 서열에 비교한 바) 전형적으로 10을 초과하지 않을 것이다. 바람직하게는, FVII 또는 FVIIa 변종은 SEQ ID NO:1에 나타낸 아미노산 잔기들 46-406로부터 1-10 아미노산 잔기들이 상이한 아미노산 서열을 포함하고, 전형적으로 SEQ ID NO:1에 나타낸 아미노산 잔기들 46-406로부터 1-8 또는 2-8 아미노산 잔기들, 예 1-5 또는 2-5 아미노산 잔기들, 예를 들면 1-4 또는 1-3 아미노산 잔기들, 예, 1, 2 또는 3 아미노산 잔기들이 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
유사하게, 본 발명의 폴리펩티드 변종은 1-10 (추가의) 비-폴리펩티드 모이어티들, 전형적으로 1-8 또는 2-8 (추가의) 비-폴리펩티드 모이어티들, 바람직하게는 1-5 또는 2-5 (추가의) 비-폴리펩티드 모이어티들, 예를 들면 1-4 또는 1-3 (추가의) 비-폴리펩티드 모이어티들, 예, 1, 2 또는 3 (추가의) 비-폴리펩티드 모이어티들을 포함할 수 있다. 그러한 추가의 비-폴리펩티드 모이어티들은 Gla 도메인 외부에 위치하는 부착기에 공유로 결합되는 것이 이해될 것이다.
비-폴리펩티드 모이어티가 당 모이어티인 본 발명의 폴리펩티드 변종들
본 발명의 바람직한 실시예에서, 당 모이어티, 예를 들면 글리코실화 부위, 특히 생체내 글리코실화 부위, 예를 들면 생체내 N-글리코실화 부위에 대한 부착기는 도입되고(되거나) 제거되고, 바람직하게는 Gla 도메인 외부에 위치하는 위치에 도입된다.
본원의 맥락에 사용될 때, "천연적으로 발생하는 글리코실화 부위"라는 용어는 위치들 N145, N322, S52 및 S60에서 글리코실화 부위들을 커버한다. "천연적으로 발생하는 생체내 O-글리코실화 부위"라는 용어는 위치들 S52 및 S60을 포함하는 한편, "천연적으로 발생하는 생체내 N-글리코실화 부위"라는 용어는 위치들 N145 및 N322를 포함한다.
따라서, 본 발명의 매우 흥미로운 실시예에서, 비-폴리펩티드 모이어티는 당 모이어티이고, 도입된 부착기는 글리코실화 부위이고, 바람직하게는 생체내 글리코실화 부위, 예를 들면 생체내 O-글리코실화 부위 또는 생체내 N-글리코실화 부위, 특히 생체내 N-글리코실화 부위이다. 전형적으로, 1-10 글리코실화 부위들, 특히 생체내 N-글리코실화 부위들이 바람직하게는 1-8, 1-6, 1-4 또는 1-3 글리코실화 부위들에 도입되고, 특히 생체내 N-글리코실화 부위들은 Gla 도메인 외부에 위치하는 1개 이상의 위치들로 도입된다. 예를 들면, 1, 2 또는 3 글리코실화 부위들, 특히 생체내 N-글리코실화 부위들은 바람직하게는 치환에 의해 Gla 도메인 외부로 도입될 수 있다.
폴리펩티드 변종이 1개 이상의 글리코실화 부위들을 포함하는 폴리펩티드 변종을 제조하기 위해, 이 폴리펩티드 변종은 글리코실화 부위(들)에서 당 (올리고당류) 모이어티들을 부착할 수 있는 숙주 세포 내에서 발현되어야 하거나, 또는 대안으로 시험관 내 글리코실화에 적용되어야 하는 것이 이해될 것이다. 글리코실화되는 숙주 세포들의 예는 "당 모이어티에 대한 커플링"이라는 표제의 아래 추가의 섹션에 주어진다.
글리코실화 부위들, 특히 생체내 N-글리코실화 부위들이 도입될 수 있는 위치들의 예들은 표면에 노출된 이들의 측쇄의 적어도 25% (본원에서 실시예 1에 정의된 바와 같음), 예를 들면 표면에 노출된 측쇄의 적어도 50%를 갖는 아미노산 잔기들을 포함한다. 그 위치는 바람직하게는 본원의 실시예 1에 정의된 바와 같이 조직 인자 결합부위 외부 및(또는) 활성 부위 영역 및(또는) 활성 부위 클레프트의 리지의 외부에 위치하는 분자의 일부로부터 선택된다. "표면에 노출된 그의 측쇄의 적어도 25% (또는 적어도 50%)"라는 용어가 생체내 N-글리코실화 부위의 도입과 관련하여 사용될 때, 이 용어는 당 모이어티가 실제로 부착되는 위치에서 아미노산 측쇄의 표면 접근성을 의미함을 이해해야 한다. 많은 경우에, 당 모이어티가 실제로 부착되는 아스파라긴 잔기에 상대적으로 위치 +2에 세린 또는 트레오닌 잔기를 도입할 필요가 있고, 세린 또는 트레오닌 잔기들이 도입되는 이들 위치들이 매립되도록 허용되고, 즉, 표면에 노출된 이들의 측쇄들의 25% 미만을 갖도록 허용한다.
생체내 N-글리코실화 부위를 생성하는 그러한 치환의 특정 예 및 바람직한 예는 A51N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, I205S, I205T, V253N, T267N, T267N+S269T, S314N+K316S, S314N+K316T, R315N+V317S, R315N+V317T, K316N+G318S, K316N+G318T, G318N, D334N 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 치환을 포함한다. 보다 바람직하게는, 생체내 N-글리코실화 부위는 A51N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, I205T, V253N, T267N+S269T, S314N+K316T, R315N+V317T, K316N+G318T, G318N, D334N 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 치환을 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, 생체내 N-글리코실화 부위는 T106N, A175T, I205T, V253N, T267N+S269T 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터, 특히 T106N, I205T 및 V253N중의 하나, 둘 또는 세개로부터 선택된 치환을 포함한다.
일 실시예에서, 단지 하나의 생체내 N-글리코실화 부위는 치환에 의해 도입된다. 다른 실시예에서, 2개 이상의 (예를 들면 2개) 생체내 N-글리코실화 부위들은 치환에 의해 도입되었다. 2개의 생체내 N-글리코실화 부위들을 생성하는 바람직한 치환들의 예는
A51N+G58N, A51N+T106N, A51N+K109N, A51N+G124N, A51N+K143N+N145T, A51N+A175T, A51N+I205T, A51N+V253N, A51N+T267N+S269T, A51N+S314N+K316T, A51N+R315N+V317T, A51N+K316N+G318T, A51N+G318N, A51N+D334N, G58N+T106N, G58N+K109N, G58N+G124N, G58N+K143N+N145T, G58N+A175T, G58N+I205T, G58N+V253N, G58N+T267N+S269T, G58N+S314N+K316T, G58N+R315N+V317T, G58N+K316N+G318T, G58N+G318N, G58N+D334N, T106N+K109N, T106N+G124N, T106N+K143N+N145T, T106N+A175T, T106N+I205T, T106N+V253N, T106N+T267N+S269T, T106N+S314N+K316T, T106N+R315N+V317T, T106N+K316N+G318T, T106N+G318N, T106N+D334N, K109N+G124N, K109N+K143N+N145T, K109N+A175T, K109N+I205T, K109N+V253N, K109N+T267N+S269T, K109N+S314N+K316T, K109N+R315N+V317T, K109N+K316N+G318T, K109N+G318N, K109N+D334N, G124N+K143N+N145T, G124N+A175T, G124N+I205T, G124N+V253N, G124N+T267N+S269T, G124N+S314N+K316T, G124N+R315N+V317T, G124N+K316N+G318T, G124N+G318N, G124N+D334N, K143N+N145T+A175T, K143N+N145T+I205T, K143N+N145T+V253N, K143N+N145T+T267N+S269T, K143N+N145T+S314N+K316T, K143N+N145T+R315N+V317T, K143N+N145T+K316N+G318T, K143N+N145T+G318N, K143N+N145T+D334N, A175T+I205T, A175T+V253N, A175T+T267N+S269T, A175T+S314N+K316T, A175T+R315N+V317T, A175T+K316N+G318T, A175T+G318N, A175T+D334N, I205T+V253N, I205T+T267N+S269T, I205T+S314N+K316T, I205T+R315N+V317T, I205T+K316N+G318T, I205T+G318N, I205T+D334N, V253N+T267N+S269T, V253N+S314N+K316T, V253N+R315N+V317T, V253N+K316N+G318T, V253N+G318N, V253N+D334N, T267N+S269T+S314N+K316T, T267N+S269T+R315N+V317T, T267N+S269T+K316N+G318T, T267N+S269T+G318N, T267N+S269T+D334N, S314N+K316T+R315N+V317T, S314N+K316T+G318N, S314N+K316T+D334N, R315N+V317T+K316N+G318T, R315N+V317T+G318N, R315N+V317T+D334N 및 G318N+D334N로 구성된 군으로부터 선택된 치환들을 포함한다. 보다 바람직하게는, 이 치환들은 T106N+A175T, T106N+I205T, T106N+V253N, T106N+T267N+S269T, A175T+I205T, A175T+V253N, A175T+T267N+S269T, I205T+V253N, I205T+T267N+S269T 및 V253N+T267N+S269T로 구성된 군으로부터 선택되고, 훨씬 더 바람직하게는 T106N+I205T, T106N+V253N 및 I205T+V253N로 구성된 군으로부터 선택된다.
추가의 실시예에서, 3개 이상의 (예를 들면 3개) 생체내 N-글리코실화 부위들은 치환에 의해 도입되고 있다. 3개의 생체내 N-글리코실화 부위들을 생성하는 바람직한 치환들의 예는 I205T+ V253N+T267N+S269T 및 T106N+I205T+V253N로 구성된 군으로부터 선택된 치환들을 포함한다.
상기 고찰된 바와 같이, 생체내 N-글리코실화 부위는 본원에 정의된 바의 조직 인자 결합부위, 활성 부위 영역 또는 활성 부위 결합 클레프트의 리지의 일부를 형성하지 않는 위치에 도입되는 것이 바람직하다.
상기 섹션들에 언급된 임의의 변형들은 상호 조합될 수 있고, 그 외에 위치 34 및(또는) 36에서의 상기 치환들, 특히 A34E/L 및(또는) R36E과 조합될 수 있고, 바람직하게는 위치 10 및(또는) 32에서의 상기 치환들, 특히 P10Q 및(또는) K32E와 조합될 수 있음이 이해될 것이다. 생체내 N-글리코실화 부위를 도입하기 위한 상기 변형들 중에서, 바람직한 변형들은 T106N, I205T 및 V253N 중의 하나, 둘 또는 셋, 특히 이들 변형들중 둘, 즉 T106N+I205T, T106N+V253N 또는 I205T+V253N을 포함한다.
따라서, 본 발명의 하나의 바람직한 실시예에서 FVII 또는 FVIIa 변종은 변형들 P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+I205T를 포함한다.
추가의 바람직한 실시예에서 FVII 또는 FVIIa 변종은 변형들 P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+V253N을 포함한다.
추가의 바람직한 실시예에서 FVII 또는 FVIIa 변종은 변형들 P10Q+K32E+A34E+R36E+I205T+V253N을 포함한다.
추가의 바람직한 실시예에서 FVII 또는 FVIIa 변종은 변형들 P10Q+K32E+A34L+T106N+I205T를 포함한다.
추가의 바람직한 실시예에서 FVII 또는 FVIIa 변종은 변형들 P10Q+K32E+A34L+T106N+V253N을 포함한다.
추가의 바람직한 실시예에서 FVII 또는 FVIIa 변종은 변형들 P10Q+K32E+A34L+I205T+V253N를 포함한다.
추가의 바람직한 실시예에서 the FVII 또는 FVIIa 변종은 변형들 P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+I205T를 포함한다.
추가의 바람직한 실시예에서 FVII 또는 FVIIa 변종은 변형들 P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+V253N을 포함한다.
추가의 바람직한 실시예에서 FVII 또는 FVIIa 변종은 변형들 P10Q+K32E+A34L+R36E+I205T+V253N을 포함한다.
또한 상기 설명된 바와 같이, 임의의 1개 이상의 이들 변형들은 위치 3과 4 사이에서 추가로 적어도 하나의 아미노산 잔기, 전형적으로 단일 아미노산 잔기의 삽입과 조합될 수 있고, 여기서 삽입된 잔기는 바람직하게는 소수성 아미노산 잔기이다. 가장 바람직하게는 삽입은 A3AY이다. 따라서, 본 발명의 추가의 바람직한 실시예들에서 FVII 또는 FVIIa 변종은 다음으로부터 선택되는 변형들을 포함한다:
A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+I205T;
A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+V253N;
A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36E+I205T+V253N;
A3AY+P10Q+K32E+A34L+T106N+I205T;
A3AY+P10Q+K32E+A34L+T106N+V253N;
A3AY+P10Q+K32E+A34L+I205T+V253N;
A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+I205T;
A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+V253N;
A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36E+I205T+V253N.
Gla 도메인 외부의 기타 변형들
본 발명의 추가의 실시예에서, FVII 또는 FVIIa 변종은 상기 섹션들에 개시된 변형들 외에 폴리펩티드의 고유 활성을 증가시키기 위해 이미 공지된 돌연 변이들, 예를 들면 WO 02/22776에 개시된 것들을 포함하기도 한다.
예를 들면, 이 변종은 157, 158, 296, 298, 305, 334, 336, 337 및 374로 구성된 군으로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 변형을 포함할 수 있다. 바람직한 치환들의 예는 V158D, E296D, M298Q, L305V 및 K337A로 구성된 군으로부터 선택된 치환들을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 치환들은 V158D+E296D+M298Q+L305V+K337A, V158D+E296D+M298Q+K337A, V158D+E296D+M298Q+ L305V, V158D+E296D+M298Q, M298Q, L305V+K337A, L305V 및 K337A로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 추가의 실시예에서, FVII 또는 FVIIa 변종은 상기 섹션들에 기재된 변형들 외에 다른 돌연변이들, 예를 들면 Neuenschwander 등에 의해, 생화학, 1995; 34:8701-8707에 개시된 치환 K341Q을 포함하기도 한다. 다른 가능한 추가의 치환들은 D196K, D196N, G237L, G237GAA 및 이들의 조합물들을 포함한다.
비-폴리펩티드 모이어티들에 대한 FVII 및 FVIIa 변종들의 콘쥬게이션에 대한 추가의 상세한 정보는 WO 01/58935 및 WO 03/093465에서 발견되고, 그에 대해 참조하고, 참고 문헌으로서 본원에 인용한다
본 발명의 콘쥬게이트된 변종의 제조 방법들
일반적으로, 본 발명에 따라 콘쥬게이트된 변종은 변종 폴리펩티드의 발현을 위해 도전성인 조건들 하에 적절한 숙주 세포를 배양하고, 변종 폴리펩티드를 회수함으로써 생산될 수 있고, 여기서 a) 변종 폴리펩티드는 적어도 하나의 N- 또는 O-글리코실화 부위를 포함하고, 숙주 세포는 생체내 글리코실화 가능한 진핵 생물 숙주 세포이고, 및(또는) b) 변종 폴리펩티드는 시험관 내 비-폴리펩티드 모이어티로의 콘쥬게이션에 적용된다.
중합체 분자에 대한 콘쥬게이션
변종 폴리펩티드에 결합되어야 할 중합체 분자는 임의의 적절한 중합체 분자, 예를 들면 천연 또는 합성 호모-중합체 또는 헤테로-중합체일 수 있고, 전형적으로 약 300-100,000 Da 범위, 예를 들면 약 500-20,000 Da, 보다 바람직하게는 약 500-15,000 Da 범위, 훨씬 더 바람직하게는 약 2-12 kDa, 예를 들면 약 3-10 kDa 범위의 분자량을 갖는다. "약"이라는 용어가 특정 분자량과 관련하여 본원에 사용될 때, "약"이라는 단어는 대략적인 평균 분자량을 지시하고, 보편적으로 주어진 중합체 제제에서 특정 분자량 분포가 존재할 것이라는 사실을 반영한다.
호모-중합체들의 예들은 폴리올 (즉 폴리-OH), 폴리아민 (즉 폴리-NH2) 및 폴리카르복실산 (즉 폴리-COOH)을 포함한다. 헤테로-중합체는 상이한 커플링 기들, 예를 들면 히드록실기 및 아민기를 포함하는 중합체이다.
적절한 중합체 분자들의 예들은 폴리알킬렌 산화물 (PAO), 예, 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 분지된 PEGs, 폴리-비닐 알콜 (PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리-(비닐피롤리돈), 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 덱스트란, 예, 카르복시메틸-덱스트란, 또는 면역원성을 감소시키고(시키거나) 관능성 생체내 반감기 및(또는) 혈청 반감기를 증가시키는데 적절한 임의의 기타 생중합체로 구성된 군으로부터 선택된 중합체 분자들을 포함한다. 중합체 분자의 다른 예는 인간 알부민 또는 다른 여분의 플라즈마 단백질이다. 일반적으로, 폴리알킬렌 글리콜-유도 중합체들은 생체 적합성, 무-독성, 비-항원성, 비-면역원성, 수용성이고 살아있는 유기체들로부터 용이하게 추출된다.
PEG는 그것이 예를 들면 덱스트란 등의 다당류에 비교하여 가교될 수 있는 반응성 기들을 거의 갖지 않기 때문에 바람직한 중합체 분자이다. 특히, 일관능성 PEG, 예 메톡시프로필에틸렌 글리콜 (mPEG)은 그의 커플링 화학이 비교적 단순하기 때문에 흥미롭다 (하나의 반응성 기만이 폴리펩티드에 대한 부착기들과 콘쥬게이트될 수 있음). 결과적으로, 가교 위험이 제거됨에 따라, 결과의 콘쥬게이트된 변종들은 보다 동질성이고, 중합체 분자들과 변종 폴리펩티드의 반응은 더욱 제어하기 쉬워진다.
중합체 분자(들)의 변종 폴리펩티드에 대한 공유 부착을 실시하기 위해, 중합체 분자의 히드록실 말단 기들은 활성화된 형태로 제공되어야 하고, 즉 반응성 관능기들 (그 예들은 주로 아미노기들, 히드라지드 (HZ), 티올, 숙시네이트 (SUC), 숙신이미딜 숙시네이트 (SS), 숙신이미딜 숙신아미드 (SSA), 숙신이미딜 프로피오네이트 (SPA), 숙신이미딜 부티레이트 (SBA), 숙신이미딜 카르복시메틸레이트 (SCM), 벤조트리아졸 카르보네이트 (BTC), N-히드록시숙신이미드 (NHS), 알데히드, 니트로페닐카르보네이트 (NPC), 및 트레실레이트 (TRES))을 갖는다. 적절한 활성화된 중합체 분자들은 예 Nektar Therapeutics, Huntsville, AL, USA로부터 또는 from PolyMASC 파마슈티칼스 plc, UK로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 활성화된 선형 또는 분지된 중합체 분자들의 특정 예들은 Nektar 분자 엔지니어링 카탈로그 2003 (Nektar Therapeutics)에 개시되어 있으며, 이를 참고 문헌으로서 본원에 인용한다.
활성화된 PEG 중합체들의 특정 예들은 다음 선형 PEGs을 포함한다: NHS-PEG (예 SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, 및 SCM-PEG), 및 NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG, 및 MAL-PEG, 및 분지된 PEGs 예를 들면 PEG2-NHS 및 US 5,932,462 및 US 5,643,575에 개시된 것들, 이 둘은 참고 문헌으로서 본원에 인용한다. 유용한 중합체 분자들, PEG일화 화학 및 콘쥬게이션 방법들을 개시하는 추가의 공개 문헌들은 WO 01/58935 및 WO 03/093465에 열거되어 있다.
시스테인 잔기들에 대한 커플링에 특히 바람직한 활성화된 PEG 중합체들의 특정 예들은 다음 선형 PEGs를 포함한다: 비닐술폰-PEG (VS-PEG), 바람직하게는 비닐술폰-mPEG (VS-mPEG); 말레이미드-PEG (MAL-PEG), 바람직하게는 말레이미드-mPEG (MAL-mPEG) 및 오르토피리딜-이황화물-PEG (OPSS-PEG), 바람직하게는 오르토피리딜-이황화물-mPEG (OPSS-mPEG). 전형적으로, 그러한 PEG 또는 mPEG 중합체들은 약 5 kDa, 약 10 kD, 약 12 kDa 또는 약 20 kDa의 크기를 가질 것이다.
숙련자라면 사용되어야 할 활성화 방법 및(또는) 콘쥬게이션 화학이 변종 폴리펩티드의 부착기(들) (그의 예들은 상기 주어짐) 뿐만 아니라 중합체의 관능기들 (예 아민, 히드록실, 카르복실, 알데히드, 설피릴, 숙신이미딜, 말레이미드, 비닐술폰 또는 할로아세테이트)에 의존한다. PEG일화은 변종 폴리펩티드에 대한 모든 유용한 부착기들에 대한 콘쥬게이션 쪽으로 지향될 수 있거나 (즉, 폴리펩티드의 표면에 노출된 그러한 부착기들) 또는 1개 이상의 특정 부착기들, 예, US 5,985,265에 개시된 바의 N-말단 아미노기 또는 시스테인 잔기들 쪽으로 지향될 수 있다. 더욱이, 콘쥬게이션은 일 단계로 또는 단계별 방식으로 달성될 수 있다 (예, WO 99/55377에 개시된 바와 같음).
시스테인 잔기들로의 PEG일화를 위해 (상기 참조), FVII 또는 FVIIa 변종은 보편적으로 PEG일화에 앞서 환원제, 예를 들면 디티오트레이톨 (DDT)로 처리된다. 환원제는 순차로 임의의 종래 방법에 의해, 예를 들면 탈염제에 의해 제거된다. 시스테인 잔기로의 PEG의 콘쥬게이션은 전형적으로 16시간에 이르는 시간 동안 4℃ 내지 25℃로 변화하는 온도에서 pH 6-9의 적절한 완충액에서 발생한다.
PEG일화는 부착된 PEG 분자들의 수, 그러한 분자들의 크기 및 형태 (예, 이들이 선형이거나 또는 분지되거나 무관하게), 및 변종 폴리펩티드에서 부착 부위(들)에 관하여 최적 분자를 생산하도록 디자인되는 것이 이해될 것이다. 사용될 중합체의 분자량은 예를 들면 달성되어야 할 목적 효과에 기초하여 선택될 수 있다.
단백질 상의 유일한 단일 부착기로의 콘쥬게이션과 관련하여 (예, N-말단 아미노기), 선형 또는 분지쇄일 수 있는 중합체 분자는 고 분자량, 바람직하게는 약 10-25 kDa, 예를 들면 약 15-25 kDa, 예, 약 20 kDa을 갖는 것이 유리할 수 있다.
보편적으로, 중합체 콘쥬게이션은 중합체 분자들과 가능한 한 많은 유효 중합체 부착기들이 반응하는 것을 목표하는 조건들 하에 수행된다. 이는 폴리펩티드에 상대적으로 적절한 몰 과량의 중합체에 의해 달성된다. 전형적으로, 폴리펩티드에 대한 활성화된 중합체 분자들의 몰비는 약 1000-1에 이르기까지, 예를 들면 약 200-1, 또는 약 100-1에 이른다. 그러나, 일부 경우들에서 그 비율은 최적 반응을 얻기 위해 다소 낮고, 예를 들면 약 50-1, 10-1, 5-1, 2-1 또는 1-1에 이르기까지이다.
또한 링커를 통해 중합체 분자들을 폴리펩티드에 결합시키는 것이 본 발명에 따라 예상된다. 적절한 링커들은 당업자들에게 잘 공지되어 있다; 또한 WO 01/58935 참조.
콘쥬게이션에 후속하여, 잔류 활성화된 중합체 분자들은 당업계에 공지된 방법들에 따라, 예, 1차 아민을 반응 혼합물에 부가함으로써 블로킹되고, 결과의 활성화된 중합체 분자들은 적절한 방법에 의해 제거된다.
예를 들면, 변종 폴리펩티드의 아미노산 서열, 사용되고 있는 활성화된 PEG 화합물의 특성 및 특정 PEG일화 조건들, 예, 폴리펩티드에 대한 PEG의 몰비 등의 상황들에 따라, 변화하는 PEG일화 정도가 얻어질 수 있고, 단, 고도의 PEG일화는 일반적으로 변종 폴리펩티드에 대한 보다 큰 비율의 PEG에 의해 얻어지는 것이다. 그러나, 임의의 주어진 PEG일화 공정으로부터 초래되는 PEG일화된 변종 폴리펩티드들은 보편적으로 약간 상이한 PEG일화 정도를 갖는 콘쥬게이트된 폴리펩티드의 추계학적 분포를 포함할 것이다.
당 모이어티에 대한 커플링
1개 이상의 글리코실화 부위들을 포함하는 FVII 분자의 생체내 글리코실화를 달성하기 위해, 변종 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 글리코실화하는 진핵 생물 발현 숙주에 삽입되어야 한다. 발현 숙주 세포는 진균 (사상체 진균 또는 효모), 곤충 또는 동물 세포들로부터 또는 유전 형질 전환 식물 세포들로부터 선택될 수 있다. 일 실시예에서, 숙주 세포는 포유 동물 세포, 예를 들면 CHO 세포, BHK 또는 HEK, 예 HEK 293, 세포, 또는 곤충 세포, 예를 들면 SF9 세포, 또는 효모 세포, 예 맥주 효모균(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피히아속 패스토리스(Pichia pastoris), 또는 이하 언급되는 임의의 숙주 세포들로부터 선택될 수 있다.
변종 폴리펩티드의 아미노산 잔기들에 대한 당 모이어티들 (예를 들면 덱스트란)의 공유 시험관 내 커플링은 또한 예를 들면 WO 87/05330 및 Aplin 등의, CRC Crit Rev. Biochem, pp. 259-306, 1981에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 또한 FVII 또는 FVIIa의 변종들의 시험관 내 글리코실화에 대한 추가의 정보를 위해서는 WO 03/093465 참조.
세린 프로테아제 억제제의 부착
세린 프로테아제 억제제의 부착은 WO 96/12800에 개시된 방법에 따라 수행될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 변종의 제조 방법들
임의로 글리코실화된 형태의 본 발명의 폴리펩티드 변종은 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 생산될 수 있다. 그러한 방법들은 폴리펩티드 변종을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 구축하고, 적절히 전환되거나 또는 형질 감염된 숙주에서 그 서열을 발현시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 포유 동물 세포 등의 γ-카르복실화 숙주 세포이다. 그러나, 본 발명의 폴리펩티드 변종은 효율이 적기는 하나, 화학적 합성 또는 화학적 합성과 재조합 DNA 기술의 조합에 의해 생산될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 hFVII와 같은 부모 FVII를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 단리시키거나 또는 합성하고, 이어서 관련 아미노산 잔기(들)의 도입 (예, 삽입 또는 치환) 또는 제거 (예, 삭제 또는 치환)을 실시하도록 뉴클레오티드 서열을 변화시킴으로써 구축될 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 종래 방법들에 따라 부위-지향된 뮤타겐시스에 의해 편리하게 변형된다. 대안으로, 뉴클레오티드 서열은 화학적 합성에 의해, 예를 들면 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하고 (여기서 올리고뉴클레오티드들은 목적하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 고안됨), 바람직하게는 재조합 폴리펩티드가 생산될 숙주 세포에서 선호되는 코돈들을 선택함으로써 제조된다. 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드의 부분들에 대해 코딩하는 여러 개의 작은 올리고뉴클레오티드들은 PCR (폴리머라제 연쇄 반응), 결찰 또는 결찰 연쇄 반응 (LCR) (Barany, Proc Natl Acad Sci USA 88:189-193, 1991)에 의해 합성될 수 있고 어셈블될 수 있다. 개개의 올리고뉴클레오티드들은 전형적으로 상보적 어셈블리에 대한 5' 또는 3' 오버행들을 포함한다.
일단 어셈블되면 (합성, 부위-지향된 뮤타겐시스 또는 기타 방법에 의해), 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 재조합 벡터에 삽입되고, 목적하는 전환된 숙주 세포에서 FVII의 발현에 필요한 서열들을 제어하기 위해 작동 가능하게 링크된다.
당업계의 숙련자라면 적절한 벡터들, 발현 제어 서열들 및 폴리펩티드를 발현시키기 위한 숙주들을 선택할 수 있을 것이다. 재조합 벡터는 독자적으로 복제하는 벡터, 즉 염색체 외의 실체로서 존재하는 벡터일 수 있고, 그의 복제는 염색체 복제, 예를 들면 플라스미드와 독립적이다. 대안으로, 그 벡터는 숙주 세포에 도입될 때 숙주 세포 게놈 내로 통합되고, 그것이 통합된 염색체(들)과 함께 복제되는 것이다.
그 벡터는 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드 변종을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 그 뉴클레오티드 서열의 전사에 필요한 추가의 단면들에 작동 가능하게 링크되는 발현 벡터이다. 그 벡터는 전형적으로 플라스미드 또는 바이러스의 DNA로부터 유도된다. 본원에 언급된 숙주 세포들 중에서 발현을 위한 많은 적절한 발현 벡터들은 상업적으로 입수할 수 있고, 문헌에 개시되어 있다. FVII를 발현시키기 위한 적절한 벡터들에 대한 상세한 정보는 WO 01/58935에서 찾을 수 있으며, 이를 참조 문헌으로 인용한다.
"조절 서열들"이라는 용어는 여기서 본 발명의 폴리펩티드 변종의 발현에 필요하고, 그에 대해 유리한 모든 성분들을 포함하도록 정의된다. 각각의 조절 서열은 폴리펩티드 변종을 인코딩하는 핵산 서열에 고유하거나 또는 이질화될 수 있다. 그러한 조절 서열들은 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 인핸서 또는 상류 활성화 서열, 신호 펩티드 서열, 및 전사 종결자를 포함하지만 이들로만 제한되지 않는다. 최소 조절 서열들은 프로모터를 포함한다.
광범위한 발현 조절 서열들이 본 발명에 사용될 수 있고, 예를 들면 WO 01/58935에 개시된 임의의 조절 서열들이 사용될 수 있고, 이것이 참조 문헌으로서 인용된다.
폴리펩티드 변종을 인코딩하는 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 부위-지향 뮤타겐시스, 합성, PCR 또는 기타 방법들에 의해 제조되든지 무관하게 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 임의로 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 폴리펩티드 변종이 그것이 발현되는 세포들로부터 분비되어야 할 때 존재한다. 그러한 신호 펩티드는 존재하는 경우 폴리펩티드 변종의 발현을 위해 선택된 세포에 의해 인식되는 것이어야 한다. 신호 펩티드는 폴리펩티드에 대해 동형 (즉, 보편적으로 hFVII와 연관됨) 또는 이형 (즉, hFVII 이외의 다른 소스들로부터 기원함)일 수 있거나, 또는 숙주 세포에 대해 동형 또는 이형일 수 있고, 즉, 신호 펩티드는 보편적으로 숙주 세포로부터 발현되거나 또는 보편적으로 숙주 세포로부터 발현되지 않는다. 적절한 신호 펩티드들에 대한 추가의 정보를 위해, WO 01/58935 참조.
임의의 적절한 숙주는 세균 (특히 바람직하지는 않음), 진균 (효모들을 포함함), 식물, 곤충, 포유 동물, 또는 기타 적절한 동물 세포들 또는 세포주들 뿐만 아니라 유전 형질 전환 동물들 또는 식물들을 포함하는 폴리펩티드 변종을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 포유 동물 세포들이 바람직하다. 세균성 숙주 세포들의 예들은 그램-양성 세균들, 예를 들면 바실러스 균주들, 예 B. brevis 또는 B. subtilis, 슈도모나스속 (Pseudomonas) 또는 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 또는 그램-음성 세균들, 예를 들면 대장균 균주를 포함한다. 적절한 사상체 진균 숙주 세포들의 예들은 아스페르길루스속 (Aspergillus) 균주, 예 누룩 곰팡이(A. oryzae), 흑색국균(A. niger), 또는 위소성 국균(A. nidulans), 푸자륨속(Fusarium) 또는 트리코더마(Trichoderma)를 포함한다. 적절한 효모
숙주 세포들의 예는 효모균속 (Saccharomyces), 예 맥주 효모균(S. cerevisiae), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 클리베로마이세스 (Klyveromyces), 피히아(Pichia), 예를 들면 패스토리스(P. pastoris) 또는 메타놀리카(P. methanolica), 한세눌라(Hansenula), 예를 들면 폴리모르파(H. Polymorpha) 또는 야로위아(Yarrowia)를 포함한다. 적절한 곤충 숙주 세포들의 예는 나비(Lepidoptora) 세포주, 예를 들면 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (Sf9 또는 Sf21) 또는 트리코플루지아니(Trichoplusioa ni) 세포들 (High Five) (US 5,077,214)을 포함한다. 적절한 포유 동물 숙주 세포들의 예는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주들, (예 CHO-K1; ATCC CCL-61), 녹색 원숭이 세포주들 (COS) (예 COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); 생쥐 세포들 (예 NS/O), 아기 햅스터 신장 (BHK) 세포주들 (예 ATCC CRL-1632 또는 ATCC CCL-10), 및 인간 세포들 (예 HEK 293 (ATCC CRL-1573))을 포함한다. 추가의 적절한 세포주들은 당업계에 공지되어 있으며, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 등의 공용 수탁 기관으로부터 입수할 수 있다. 또한, 포유 동물 세포들, 예를 들면 CHO 세포는 폴의 개선된 글리코실화를 제공하기 위해 US 5,047,335에 개시된 바와 같이 시알릴트랜스퍼라제, 예 1,6-시알릴트랜스퍼라제를 발현시키도록 변형될 수 있다.
분비를 증가시키기 위해, 엔도프로테아제, 특히 a PACE (짝지은 염기성 아미노산 전환 효소) (예 US 5,986,079에 개시된 바와 같음), 예를 들면 a Kex2 엔도프로테아제 (예 WO 00/28065에 개시된 바와 같음)와 함께 본 발명의 폴리펩티드 변종을 생산하는 것이 특히 흥미로울 수 있다.
외인성 DNA를 상기 세포 유형들 내로 도입하는 방법 뿐만 아니라 FVII 변종들의 발현, 생산 및 정제에 관한 다른 정보는 WO 01/58935에서 찾게 되고, 이를 참조 문헌으로 본원에 인용한다.
본 발명의 제약 조성물 및 그의 용도
추가의 국면에서, 본 발명은 조성물, 특히 본 발명의 폴리펩티드 변종 및 제약학상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩티드 변종 또는 제약 조성물은 의약으로서 사용될 수 있다.
상기 개선된 특성들로 인해, 본 발명의 폴리펩티드 변종들, 또는 제약 조성물은 외상 환자들, 혈소판 감소증 환자들, 항응혈 치료 중인 환자들, 및 정맥류(variceal) 출혈 또는 기타 상부 위장관 출혈인 경변 환자들, 오르토토픽 간 이식 또는 절제 (수혈 없는 수술에 대해 허용됨) 중인 환자들 또는 혈우병 환자들에서 조절되지 않는 출혈 증상들의 치료에 특히 유용하다.
외상은 외부 시약에 의해 유발되는 살아있는 조직으로서 정의된다. 이는 US에서 제4위 사망 원인이고, 경제적으로 큰 부담이 된다.
외상은 무딘 상태와 예리한 상태로 분류된다. 무딘 외상은 내부 압박, 장기 손상 및 내부 출혈을 초래하는 반면, 예리한 외상 (신체를 관통하고, 조직, 혈관 및 장기들을 파괴하는 시약의 결과로서)은 외부 출혈을 초래한다.
외상은 수많은 사건들, 예를 들면 교통 사고, 총기 부상, 낙상, 기계류 사고들 및 칼에 찔린 부상들에 의해 유발된다.
간 경변은 만성 알콜 중독, 만성 바이러스성 간염 (타입 B, C, 및 D), 및 자가 면역 간염을 포함하는 직접적인 간 부상에 의해서 뿐만 아니라 일차 담낭 경변, 일차 경화성 담관염 및 담도 폐쇄를 포함하는 담도 손상에 의한 간접적인 부상에 의해 유발될 수 있다. 경변의 적은 공통 원인들은 유전성 질병, 예를 들면 낭포성 섬유증, 알파-1-안티트립신 결핍증, 헤마크로마토시스, 윌슨병(Wilson’s disease), 갈락토스 혈증 및 글리코겐 저장 질병으로부터 직접적인 간 부상을 포함한다. 이식이 말기 단계 경변 환자들을 위한 주요 중재법이다.
따라서, 추가의 국면에서 본 발명은 응혈 형성이 바람직한 질병 또는 질환의 치료를 위한 의약의 제조에 이용되는 본 발명의 폴리펩티드 변종에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 국면은 효과량의 본 발명의 폴리펩티드 변종 또는 그의 제약 조성물을 필요를 요하는 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는, 응혈 형성이 바람지한 질병 또는 질환인 환자들의 치료 방법에 관한 것이다.
증가된 응혈 형성이 바람직한 질병/질환의 예들은 뇌출혈을 포함하는 출혈 뿐만 아니라 외상 등의 심한 조절되지 않는 출혈을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 추가의 예들은 생체 이식을 겪는 환자들, 절제를 겪는 환자들 및 정맥류 출혈인 환자들을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드들이 증가되는 응혈 형성에 유용할 것으로 예상되는 다른 만연된 질병/질환은 혈우병, 예를 들면 폰 윌리브랜드병(von Willebrand), 혈우병 A, 혈우병 B 또는 혈우병 C이다.
본 발명의 폴리펩티드 변종들은 치료에 효과적인 복용량으로, 보편적으로 NovoSeven?등의 rFVII와 함께 치료에 사용되는 거의 병행적인 것으로 또는 보다 낮은 복용량으로 환자들에게 투여된다. 본원에서 "치료에 효과적인 복용량"은 그것이 투여되는 증상과 관련하여 바람직한 효과를 내기에 충분한 용량을 의미한다. 정확한 복용량은 상황들에 의존할 것이고, 공지된 기술들을 사용하는 당업자들에 의해 확인될 것이다. 보편적으로, 그 복용량은 치료 중인 증상 또는 징후의 심각도 또는 만연도를 예방 또는 약화시킬 수 있어야 한다. 당업계의 숙련자들에게는 효과량의 본 발명의 폴리펩티드 변종 또는 조성물이 무엇보다도 질병, 복용량, 투여 스케줄에 의존하고, 폴리펩티드 변종 또는 조성물이 단독으로 투여되거나 또는 다른 치료제들과 관련하여 투여되는지 무관하게, 조성물들의 플라즈마 반감기 및 환자의 일반적 건강에 의존하는 것이 명백할 것이다.
본 발명의 폴리펩티드 변종은 바람직하게는 제약학상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물로 투여된다. "제약학상 허용되는"은 그것이 투여되는 환자들에서 임의의 곤란한 효과들을 유발하지 않는 담체 또는 부형제를 의미한다. 그와 같이 제약학상 허용되는 담체들 및 부형제들 뿐만 아니라 적절한 제약학적 제형 방법들은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들면, Remington's 제약학 사이언스, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; 펩티드들 및 단백질들의 제약학적 제형 개발, S. Frokjaer 및 L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; 및 제약 부형제들의 안내서, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., 제약 Press [2000] 참조).
본 발명의 폴리펩티드 변종은 "그대로" 및(또는) 그의 염 형태로 사용될 수 있다. 적절한 염들은 알칼리 금속들 또는 알칼리 토금속들과의 염, 예를 들면 나트륨, 칼륨 칼슘 및 마그네슘의 염, 뿐만 아니라 아연 염들을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 이들 염들 또는 착물들은 결정질 및(또는) 무정형 구조로 존재할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제들과 관련하여 투여될 수 있다. 이들 시약들은 동일한 제약 조성물의 일부로서 혼입될 수 있거나, 또는 본 발명의 폴리펩티드 변종과 별도로, 또는 다른 치료 스케줄과 동시에 또는 그에 따라 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드 변종 또는 제약 조성물은 다른 치료들에 대한 아쥬반트로서 사용될 수 있다.
본 발명의 목적을 위한 "환자"는 인간 또는 다른 포유동물들을 포함한다. 따라서, 그 방법들은 인간 치료 및 수의학적 용도 모두, 특히 인간 치료에 적용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 변종을 포함하는 제약 조성물은 각종 형태, 예를 들면 액체, 겔, 친액된 형태 또는 압축된 고체로서 제형될 수 있다. 바람직한 형태는 치료중인 특정 징후에 의존할 것이고, 당업계의 숙련자에게 명백할 것이다.
특히, 본 발명의 폴리펩티드 변종을 포함하는 제약 조성물은 친액된 형태 또는 안정한 가용성 형태로 제형화될 수 있다. 폴리펩티드 변종은 당업계에 공지된 각종 공정들에 의해 친액화될 수 있다. 폴리펩티드 변종은 본원에 개시된 바의 단백질 분해 저하 부위들을 제거 또는 차폐함으로써 적절한 가용성 형태로 존재할 수 있다. 안정한 가용성 제제를 얻는 장점은 환자들을 위해 다루기 용이하고, 위급하고, 신속한 액션을 취해야 하는 경우에 생명을 구하게 될 가능성이 있다는 것이다. 바람직한 형태는 치료중인 특정 징후에 의존할 것이고, 당업계의 숙련자에게 명백할 것이다.
본 발명의 제형들의 투여는 여러 방식으로, 예를 들면 경구로, 피하로, 정맥 내로, 소뇌 내로, 비강 내로, 경피로, 복강 내로, 근육 내로, 허파 내로, 질 내로, 직장 내로, 안구 내로 또는 임의의 기타 허용되는 방식으로 수행되지만 이들로만 제한되지 않는다. 제형들은 주입에 의해 연속적으로 투여될 수 있지만, 펌프 또는 주입과 같이 당업계에 잘 공지된 기술들을 사용하는 거환 주입이 허용될 수 있다. 일부 경우들에서, 제형들은 용액제 또는 분무제로서 직접적으로 도포될 수 있다.
부모(Parentals)
제약 조성물의 바람직한 예는 용액제, 특히 비경구적 투여용으로 고안된 수용액제이다. 많은 경우에, 제약학적 용액 제형들이 즉시 사용에 적절한 액체 형태로 제공되지만, 그러한 부모 제형들은 냉동되거나 또는 친액된 형태로 제공될 수도 있다. 전자의 경우에, 그 조성물은 사용 전에 해동되어야 한다. 후자의 형태는 종종 광범위한 저장 조건들 하에 조성물 중에 함유된 활성 화합물의 안전성을 증진시키기 위해 사용되고, 친액된 제제들은 일반적으로 이들의 액체 대상물보다 더 안정함이 당업자들에게 인식되고 있다. 그러한 친액된 제제들은 주사용 멸균수 또는 멸균성 생리적 염수 용액 등의 1개 이상의 적절한 제약학상 허용되는 희석제들의 부가에 의해 사용 전에 재구성된다.
부모의 경우에, 이들은 목적하는 순도를 갖는 폴리펩티드 변종을 적절히 당업계에 사용되는 1개 이상의 제약학상 허용되는 담체들, 부형제들 또는 안정제들(이들 모두는 "부형제들"이라 칭함), 예를 들면 완충제들, 안정화제들, 방부제들, 등장제, 비이온성 계면활성제 또는 세제들, 항산화제들, 및(또는) 기타 혼화성 부가제들, 예를 들면 벌킹제들 또는 충전재들, 킬레이트제들, 항산화제들 및 공용매들을 혼합시킴으로써 친액화된 제형들 또는 수용액들로서 저장하도록 제조된다.
FVII 변종들의 투여에 적절한 부모 제형들 뿐만 아니라 서방형 제제들에 대한 상세한 정보는 WO 01/58935 및 WO 03/093465에서 찾을 수 있고, 참고 문헌으로서 본원에 인용한다.
본 발명은 다음의 비제한적인 실시예들에 의해 추가로 설명된다.
재료들 및 방법들
활성 부위 영역
활성 부위 영역은 촉매 트라이애드에서 10 Å의 임의의 원자 내에서 적어도 하나의 원자를 갖는 임의의 잔기들로서 정의된다 (잔기들 H193, D242, S344).
단백질 분해 저하에 대한 감소된 민감도의 측정
단백질 분해 저하는 US 5,580,560, 실시예 5에 개시된 분석을 사용하여 측정될 수 있고, 여기서 단백질 분해는 자동 단백질 분해이다.
더욱이, 감소된 단백질 분해는 방사선 라벨된 시료들을 사용하고, 혈액 시료들을 회수하고 이들을 SDS-PAGE 및 방사선 사진 촬영술에 적용시킴으로써 rhFVIIa 및 본 발명의 폴리펩티드 변종의 단백질 분해를 비교함으로써 생체 내 모델 중에서 시험될 수 있다.
단백질 분해 저하를 측정하기 위해 사용된 분석과 무관하게, "감소된 단백질 분해 저하"는 쿠마지(Coomassie) 염색된 SDS-PAGE 겔들의 겔 스캐닝, HPLC에 의해 측정되고, 아래 기재된 조직 인자 독립형 활성을 사용하는 야생형과 비교한 바 보존된 촉매적 활성에 의해 측정되는 바와 같이 rhFVIIa에 의해 얻어진 것에 비해 분열의 측정 가능한 감소를 의미하도록 의도된다.
폴리펩티드 변종들의 분자량의 측정
폴리펩티드 변종들의 분자량은 SDS-PAGE, 겔 여과, 웨스턴 블롯(Western Blots), 매트릭스 보조된 레이저 디솝션 질량 분광계 또는 평형 원심 분리, 예, Laemmli에 따른 SDS-PAGE, U.K., Nature Vol 227 (1970), pp. 680-85에 의해 결정된다.
인지질 멤브레인 결합 친화도의 측정
인지질 멤브레인 결합 친화도는 Nelsestuen 등, 생화학, 1977; 30;10819-10824에 개시된 바와 같이 또는 US 6,017,882의 실시예 1에 개시된 바와 같이 측정될 수 있다.
TF-독립형 인자 X 활성화 분석
이 분석은 Nelsestuen 등, J Biol Chem, 2001; 276:39825-39831의 39826페이지에 상세히 개시되어 있다.
간단히, 분석되어야 할 분자 (hFVIIa, rhFVIIa 또는 활성화된 형태의 본 발명의 폴리펩티드 변종)는 인지질의 소스 (바람직하게는 8:2 비율의 포스파티딜콜린 및 포스파티딜세린)와 혼합되고 BSA를 함유하는 트리스 완충액 중에서 인자 X를 재지방질화한다. 규정된 인큐베이션 시간 후, 반응은 과량의 EDTA를 부가함으로써 종료된다. 이어서, 인자 Xa의 농도는 크로모겐성 기질 (S-2222, Chromogenix)을 부가한 후 405 nm에서 흡수율 변화로 측정된다. 배경에 대한 정정 후, rhFVIIa의 조직 인자 독립형 활성 (awt)은 10분 후 흡수율 변화로서 측정되고, 본 발명의 폴리펩티드 변종의 조직 인자 독립형 활성 (a변종)은 또한 10분 후 흡수율 변화로서 측정된다. 활성 형태의 폴리펩티드 변종의 활성과 rhFVIIa의 활성 사이의 비율은 a변종/awt로 정의된다.
응혈 분석
FVIIa 및 그의 변종들의 응혈 활성은 일-단계 분석으로 측정되었고, 응혈 시간들은 트롬보트랙 IV 응고계 (Medinor) 상에 기록되었다. 인자 VII-결핍 인간 플라즈마 (American Diagnostica)는 재구성되고, 15-20분 동안 실온에서 평형에 이르렀다. 이어서, 50 마이크로리터의 플라즈마가 응고계 컵으로 전이되었다.
FVIIa 및 그의 변종들은 글리옥살린 완충액 중에서 희석되었다 (5.7 mM 바르비트레이트, 4.3 mM 시트르산 나트륨, 117 mM NaCl, 1 mg/ml BSA, pH 7.35). 시료들이 50 ㎕ 컵에 부가되고 및 2분 동안 37℃에서 인큐베이션되었다.
트롬보플라스틴 (Medinor)은 물과 재구성되고, CaCl2가 4.5 mM의 최종 농도에 부가되었다. 반응은 100㎕의 트롬보플라스틴을 부가함으로써 개시되었다.
TF의 부재 하에 응혈 활성을 측정하기 위해, 트롬보플라스틴의 부가 없이 동일한 분석이 사용되었다. 데이터는 PRISM 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.
전혈 분석
FVIIa 및 그의 변종들의 응혈 활성은 일단계 분석으로 측정되고, 응혈 시간은 트롬보트랙 IV 응고계 (Medinor) 상에 기록되었다. 100 ml의 FVIIa 또는 그의 변종들은 10 mM 글리실글리신, 50 mM NaCl, 37.5 mM CaCl2, pH 7.35를 함유하는 완충액 중에서 희석되고, 반응 컵으로 전이되었다. 응혈 반응은 항응고제로서 10% 0.13 M 시트르산 삼나트륨을 함유하는 50㎕ 혈액을 부가함으로써 개시되었다. 데이터는 Excel 또는 PRISM 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.
아미도리틱 분석
변종들이 작은 펩티드 기질들을 분해하는 능력은 크로모겐성 기질 S-2288 (D-Ile-Pro-Arg-p-니트로아닐리드)를 사용하여 측정될 수 있다. FVIIa는 분석 완충액 (50 mM Na-Hepes pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1% BSA, 1U/ml 헤파린) 중에서 약 10-90 nM로 희석된다. 더욱이, 가용성 TF (sTF)는 분석 완충액 중에서 50-450 nM로 희석된다. 120 ㎕의 분석 완충액이 20 ㎕의 FVIIa 시료 및 20 ㎕의 sTF와 혼합된다. 완만한 진탕 하에 실온에서 5분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시킨 후, 반응은 S-2288 기질을 1 mM로 부가함으로써 시작되고, 405 nm에서 흡수는 여러 시점에서 측정되었다.
ELISA 분석
FVII/FVIIa (또는 변종) 농도들은 ELISA에 의해 측정되었다. 마이크로 적정 플레이트의 웰들은 PBS 중의 2 μg/ml의 용액 (웰당 100 ㎕)의 용액을 사용하여 프로테아제 도메인에 반하여 지향된 항체로 코팅된다. R.T. (실온)에서 철야 코팅 후, 웰들을 THT 완충액 (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.2 0.05% Tween-20)으로 4회 세척하였다. 순차로, 200 ㎕의 1% 카제인 (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.2를 사용하여 2.5% 스톡으로부터 희석됨)이 브로킹을 위해 웰당 부가된다. R.T.에서 1시간 동안 인큐베이션된 후, 웰들은 비워지고, 100 ㎕의 시료 (임의로 희석 완충액 (THT + 0.1% 카제인) 중에서 희석됨)가 부가된다. 실온에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 웰들은 THT 완충액으로 4회 세척되고, EGF-형 도메인 (1μg/ml)에 반하여 지향된 100 ㎕의 비오틴-라벨된 항체가 부가된다. R.T.에서 1시간 동안 추가로 인큐베이션시키고, 이어서 THT 완충액으로 4회 더 세척한 후, 100 ㎕의 스트렙티비딘-고추 냉이 퍼옥시다제 (DAKO A/S, Glostrup, Denmark, 1/10000 희석됨)가 부가되었다. R.T.에서 1시간 동안 추가로 인큐베이션시키고, 이어서 THT 완충액으로 4회 더 세척한 후, 100 ㎕의 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, Kem-en-Tech A/S, Denmark)가 부가되었다. 암실에서 R.T.에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 100㎕의 1 M H2SO4가 부가되고 OD450nm가 측정되었다. 표준 곡선은 rhFVIIa (NovoSeven?)를 사용하여 제조하였다.
대안으로, FVII/FVIIa 또는 변종들은 프로테아제 도메인을 통해서보다는 Gla 도메인을 통해서 정량화될 수 있다. 이러한 ELISA 셋업에서, 웰들은 EGF-형 도메인에 반하여 지향된 항체에 의해 철야 코팅되고, 검출을 위해, 칼슘-의존형 비오틴-라벨된 모노클로날 항-GLa 도메인 항체가 사용된다 (2 μg/ml, 웰당 100 ㎕). 이러한 셋업에서, 5 mM CaCl2가 THT 및 희석 완충액들에 부가되었다.
트롬보그램 분석
인간 플라즈마에서 트롬빈 발생에 대한 hFVIIa, rhFVIIa 또는 FVIIa 변종들의 효과는 Hemker 등 (2000) Thromb Haemost 83:589-91의 589페이지에 개시된 분석의 변형된 버전에서 시험되었다. 간단히, 분석되어야 할 분자 (hFVIIa, rhFVIIa 또는 변종)는 재지방질화된 재조합 조직 인자 (예를 들면 Dade Behring으로부터 Innovin) 또는 인지질 (8:2 비율의 포스파티딜콜린 및 포스파티딜세린, 또는 4:2:4 비율의 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 포스파티딜에탄올)을 함유하는 FVII-고갈된 혈소판 불량 플라즈마 (PPP)와 혼합된다.
반응은 플루오로겐성 트롬빈 기질 및 염화 칼슘을 부가함으로써 시작된다. 형광은 연속적으로 측정되고, 트롬빈 아미도리틱 활성은 형광 곡선의 기울기를 산출함으로써 측정된다 (시간 경과에 따른 형광의 증가). 이러한 방식으로, 최대 트롬빈 아미도리틱 활성이 얻어지는 시간(Tmax), 및 트롬빈 발생률 (트롬빈 활성의 최대 증가) 및 전체 트롬빈 작업 (곡선 아래 영역 (AUC))이 산출될 수 있다.
냉동된 시트레이트 FVII-고갈된 플라즈마는 응고의 접촉 경로를 억제하기 위해 옥수수 트립신 억제제 (100 ㎕/ml 혈청)의 존재 하에 해동된다. 96-웰 마이크로 적정 플레이트의 각각의 웰에 0.1 내지 100 nM의 최종 농도로 시험될 rhFVII 또는 변종을 함유하는 80㎕ 플라즈마 및 20㎕ 완충액이 부가된다. 재조합 인간 조직 인자 (rTF)는 1 pM의 최종 농도까지 5㎕ 분석 완충액에 부가된다. 분석 완충액은 증류수 중에서 20mM Hepes, 150mM NaCl 및 60mg/ml BSA로 구성된다. 반응은 0.1 M 염화칼슘을 함유하는 20㎕의 기질 용액을 부가함으로써 시작된다. 분석 플레이트 및 시약들은 37℃로 예비-가온되고, 반응은 이 온도에서 발생한다. 사용된 형광계는 390 nm에서 여자 필터 및 460 nm에서 방출 필터를 갖는 BMG 형광계이다. 형광은 96-웰 투명 바닥 플레이트들의 각각의 벽에서 30-180분에 걸쳐 20-40초 간격으로 측정된다. 데이터는 PRISM 소프트웨어를 사용하여 분석된다.
조직 인자 결합 표면 플라스몬 공명 분석 (Biacore 분석) 표면 플라스몬 공명 분석은 가용성 조직 인자에 대한 야생형 인자 VIIa 및 그의 변종들의 상대적 결합을 측정하기 위해 사용되었다. 세포외 도메인을 함유하는 재조합 가용성 조직 인자는 NHS/EDC 커플링을 사용하여 Biacore CM5 칩 상에서 270 응답 유닛들에 결합되었다. 가용성 조직 인자는 칩 표면과의 상호 작용을 인에이블시키기 위해 4.5의 pH에서 결합되었다.
이러한 분석에서, 인자 VII 단백질의 조직 인자 결합은 단일 농도의 FVIIa 또는 변종에 비교되어 이 변종들의 야생형에 대한 상대적 비교를 허용하였다. 이러한 농도는 75 내지 0 μg/ml의 농도로 칩 상에서 유동하는 야생형 FVIIa의 표준 곡선에 의해 측정되었다. FVIIa는 10mM EDTA를 부가함으로써 제거되었다. 이러한 방식으로, 15μg/ml의 농도는 선형 범위의 결합을 제공하는 것으로 측정되었다. 이어서 FVIIa의 조직 인자에 대한 FVIIa 또는 변종들의 상대적 결합 강도를 측정하기 위해 15μg/ml로 칩 상에서 흐르게 되었다.
실시예 1
Banner 등(J Mol Biol, 1996; 285:2089)에 의한 가용성 조직 인자들과의 착물 중의 hFVIIa의 X-선 구조가 이 실시예에 사용된다. 이 실시예에서 계산들에 대한 추가의 정보에 대해서는 WO 01/58935 참조.
표면 노출
분율 ASA 계산들의 수행은 표면에 노출된 이들의 측쇄의 25% 이상을 갖는 것으로 측정된 다음 잔기들을 초래하였다: A1, N2, A3, F4, L5, E6, E7, L8, R9, P10, S12, L13, E14, E16, K18, E19, E20, Q21, S23, F24, E25, E26, R28, E29, F31, K32, D33, A34, E35, R36, K38, L39, W41, I42, S43, S45, G47, D48, Q49, A51, S52, S53, Q56, G58, S60, K62, D63, Q64, L65, Q66, S67, I69, F71, L73, P74, A75, E77, G78, R79, E82, T83, H84, K85, D86, D87, Q88, L89, I90, V92, N93, E94, G97, E99, S103, D104, H105, T106, G107, T108, K109, S111, R113, E116, G117, S119, L120, L121, A122, D123, G124, V125, S126, T128, P129, T130, V131, E132, I140, L141, E142, K143, R144, N145, A146, S147, K148, P149, Q150, G151, R152, G155, K157, V158, P160, K161, E163, L171, N173, G174, A175, N184, T185, I186, H193, K197, K199, N200, R202, N203, I205, S214, E215, H216, D217, G218, D219, S222, R224, S232, T233, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H249, Q250, P251, V253, T255, D256, E265, R266, T267, E270, R271, F275, V276, R277, F278, L280, L287, L288, D289, R290, G291, A292, T293, L295, E296, N301, M306, T307, Q308, D309, L311, Q312, Q313, R315, K316, V317, G318, D319, S320, P321, N322, T324, E325, Y326, Y332, S333, D334, S336, K337, K341, G342, H351, R353, G354, Q366, G367, T370, V371, G372, R379, E385, Q388, K389, R392, S393, E394, P395, R396, P397, G398, V399, L400, L401, R402, P404 및 P406 (A1-S45는 Gla 도메인에 위치하고, 나머지 위치들은 Gla 도메인 외부에 위치한다).
다음 잔기들은 표면에 노출된 이들의 측쇄의 50% 이상을 갖는 것으로 결정되었다: A1, A3, F4, L5, E6, E7, L8, R9, P10, E14, E16, K18, E19, E20, Q21, S23, E25, E26, E29, K32, A34, E35, R36, K38, L39, I42, S43, G47, D48, A51, S52, S53, Q56, G58, S60, K62, L65, Q66, S67, I69, F71, L73, P74, A75, E77, G78, R79, E82, H84, K85, D86, D87, Q88, L89, I90, V92, N93, E94, G97, T106, G107, T108, K109, S111, E116, S119, L121, A122, D123, G124, V131, E132, L141, E142, K143, R144, N145, A146, S147, K148, P149, Q150, G151, R152, G155, K157, P160, N173, G174, A175, K197, K199, N200, R202, S214, E215, H216, G218, R224, V235, P236, G237, T238, H249, Q250, V253, D256, T267, F275, R277, F278, L288, D289, R290, G291, A292, T293, L295, N301, M306, Q308, D309, L311, Q312, Q313, R315, K316, G318, D319, N322, E325, D334, K341, G354, G367, V371, E385, K389, R392, E394, R396, P397, G398, R402, P404 및 P406 (A1-S43은 Gla 도메인에 위치하고, 나머지 위치들은 Gla 도메인 외부에 위치한다).
조직 인자 결합 부위
이는 hFVII의 다음 잔기들이 착물 중의 이들의 ASA를 변화시키는 ASA 계산들을 사용하여 측정하였다. 이들 잔기들은 수용체 결합 부위를 구성하는 것으로서 한정되었다: L13, K18, F31, E35, R36, L39, F40, I42, S43, S60, K62, D63, Q64, L65, I69, C70, F71, C72, L73, P74, F76, E77, G78, R79, E82, K85, Q88, I90, V92, N93, E94, R271, A274, F275, V276, R277, F278, R304, L305, M306, T307, Q308, D309, Q312, Q313, E325 및 R379.
활성 부위 영역
활성 부위 영역은 촉매 트라이애드(잔기들 H193, D242, S344)에서 임의의 원자로부터 10Å 거리 내에 적어도 하나의 원자를 갖는 임의의 잔기로서 정의된다: I153, Q167, V168, L169, L170, L171, Q176, L177, C178, G179, G180, T181, V188, V189, S190, A191, A192, H193, C194, F195, D196, K197, I198, W201, V228, I229, I230, P231, S232, T233, Y234, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H241, D242, I243, A244, L245, L246, V281, S282, G283, W284, G285, Q286, T293, T324, E325, Y326, M327, F328, D338, S339, C340, K341, G342, D343, S344, G345, G346, P347, H348, L358, T359, G360, I361, V362, S363, W364, G365, C368, V376, Y377, T378, R379, V380, Q382, Y383, W386, L387, L400 및 F405.
활성 부위 결합 플레프트의 리지
활성 부위 결합 클레프트 영역의 리지는 FVIIa 구조 1FAK.pdb의 육안 검사에 의해 다음과 같이 정의되었다: N173, A175, K199, N200, N203, D289, R290, G291, A292, P321 및 T370.
실시예 2
포유 동물 세포들에서 rhFVII의 발현을 위한 발현 카세트의 디자인
rhFVII의 발현을 위한 발현 카세트는 제WO 01/58935호의 실시예 2에 개시된 바와 같이 디자인되고 클론화되었다.
실시예 3
본 발명의 변종들을 인코딩하는 발현 카세트의 구축
서열 돌출 확장 (SOE) PCR은 표준 방법들을 사용함으로써 치환된 코돈들을 갖는 프레임들을 개방 판독하는 변종 FVII를 갖는 구조물들을 발생시키기 위해 사용되었다.
실시예 4
CHO K1 세포들에서 폴리펩티드 변종들의 발현
세포주 CHO K1 (ATCC # CCL-61)는 MEMa, 10% FCS (Gibco/BRL Cat # 10091), P/S 및 5 ㎍/ml 필로퀴논을 사용하여 T-25 플라스크 중에서 50% 합류로 접종하고 융합될 때까지 성장시켰다. 융합 단일 세포층은 제조업자의 명령에 따라 리포펙타민 2000 형질 감염제(Life Technologies)를 사용하여 5㎍의 상기 관련 플라스미드에 의해 형질 감염되었다. 형질 감염된지 24시간 후, 시료가 회수되고, 예를 들면 hFVII의 EGF1 도메인을 인지하는 ELISA를 사용하여 정량화되었다. 이 시점에서 관련 선택(예, 하이그로마이신 B)는 안정한 트랜스펙턴트들의 푸울을 발생시킬 목적으로 세포들에 적용될 수 있다. 플라스미드 상의 선택 가능한 마커로서 CHO K1 세포들 및 하이그로마이신 B 내성 유전자를 사용할 때, 이는 보편적으로 1주일 내에 달성된다.
실시예 5
폴리펩티드 변종들을 안정하게 발현시키는 CHO K1 세포들의 발생
CHO-K1 트랜스펙턴트 푸울의 바이알은 해빙시키고, 세포들은 25 ml의 MEMa, 10% FCS, 필로퀴논 (5 ㎍/ml), 100 U/l 페니실린, 100㎍/l 스트렙토마이신을 함유하는 175 cm2 조직 플라스크에서 접종하고 24시간 동안 성장시킨다. 세포들을 수확하고, 희석시키고, ½-1 세포/웰의 세포 밀도로 96-웰 마이크로 적정 플레이트들 내에 플레이팅한다. 1주일 성장 후, 20-100 세포들의 콜로니들이 웰들 내에 존재하고, 단 하나의 콜로니를 함유하는 웰들이 라벨링된다. 추가로 2주 후, 단 하나의 콜로니를 함유하는 모든 웰들 내의 매질은 200 ㎕ 신선 매질로 치환된다. 24시간 후, 매질 시료가 회수되고 예를 들면 ELISA에 의해 분석된다. 고도로 생산된 클론들이 선택되고, FVII 또는 변종들의 대규모 생산을 위해 사용된다.
실시예 6
폴리펩티드 변종들의 정제 및 후속 활성화
FVII 및 FVII 변종들은 다음과 같이 정제된다: 그 공정은 4℃에서 수행된다. 대규모 생산에서 수확된 배양 매질은 30 kDa 컷-오프 펠리콘 멤브레인들을 갖는 밀리포어 TFF 시스템을 사용하여 한외여과된다. 매질의 농축 후, 시트르산염이 5 mM로 부가되고 pH는 8.6으로 조절된다. 필요할 경우, 도전성은 10 mS/cm 이하로 저하된다. 순차로, 시료는 Q-세파로스 FF 컬럼에 도포되고, 50 mM NaCl, 10 mM 트리스 pH 8.6로 평형을 이룬다. 컬럼을 100 mM NaCl, 10 mM 트리스 pH 8.6, 이어서 150 mM NaCl, 10 mM 트리스 pH 8.6로 세척한 후, FVII는 10 mM 트리스, 25 mM NaCl, 35 mM CaCl2, pH 8.6를 사용하여 용출된다.
제2 크로마토그래피 단계를 위해, 친화도 컬럼은 모노클로날 칼슘-의존형 안티Gla-도메인 항체를 CNBr-활성화된 세파로스 FF에 결합시킴으로써 제조된다. 약 5.5 mg 항체가 ml 수지당 결합된다. 컬럼은 10 mM 트리스, 100 mM NaCl, 35 mM CaCl2, pH 7.5로 평형을 이룬다. NaCl은 100 mM NaCl 농도까지 시료에 부가되고, pH는 7.4 -7.6로 조절된다. 시료의 O/N 도포 후, 컬럼은 100 mM NaCl, 35 mM CaCl2, 10 mM 트리스 pH 7.5로 세척되고, FVII 단백질은 100 mM NaCl, 50 mM 시트르산염, 75 mM 트리스 pH 7.5로 용출된다.
제3 크로마토그래피를 위해, 시료의 도전성은 10 mS/cm 이하로 저하되고, 필 요할 경우 pH는 8.6로 조절된다. 이어서, 시료는 효율적인 활성화를 얻기 위해 ml 겔당 약 3-5 mg 단백질의 밀도로 Q-세파로스 컬럼 (50 mM NaCl, 10 mM 트리스 pH 8.6로 평형됨)에 도포된다. 도포 후, 컬럼은 50 mM NaCl, 10 mM 트리스 pH 8.6로 약 4 시간 동안 시간당 3-4 컬럼 부피 (cv)의 유량으로 세척된다. FVII 단백질은 40cv에 걸쳐 0-100% 구배의 500 mM NaCl, 10 mM Tris pH 8.6를 사용하여 용출된다. 분획들을 함유하는 FVII가 푸울된다.
최종 크로마토그래피를 위해, 도전성은 10 mS/cm 이하로 저하된다. 순차로, 시료는 ml 겔당 3-5 mg 단백질의 농도로 Q-세파로스 컬럼 (140 mM NaCl, 10 mM 글리실글리신 pH 8.6로 평형을 이룸)에 도포된다. 이어서, 컬럼은 140 mM NaCl, 10 mM 글리실글리신 pH 8.6으로 세척되고, FVII는 140 mM NaCl, 15 mM CaCl2, 10 mM 글리실글리신 pH 8.6로 용출된다. 용출액은 10 mM CaCl2로 희석되고, pH는 6.8-7.2로 조절된다. 마지막으로, 트윈-80이 0.01%에 부가되고 pH는 -80℃에서 저장되는 동안 5.5로 조절된다.
실시예 7
실험 결과들 - FX 활성화 활성
본 발명의 변종들을 "TF-독립형 인자 X 활성화 분석"에 적용시킴으로써, 다음 결과들이 얻어졌다 (그 결과들은 기준으로서 P10Q+K32E 변종의 활성의 백분율로서 표현되었다):
TF-독립형 FX 활성화
변종 (a변종/aP10QK32E)*100
rhFVIIa 10
P10Q+K32E (기준) 100
A3AY+P10Q+K32E+A34L 216
P10Q+K32E+D33F+A34E 194
P10Q+K32E+A34E+P74S 190
P10Q+K32E+A34E+R36E+K38E 144
P10Q+K32E+A34D+R36E 140
표 1
상기 결과들로부터 나타나듯이, 본 발명의 변종들은 rhFVIIa에 비교하고, 또한 [P10Q+K32E]rhFVIIa에 역시 비교한 바 FX 활성화 활성에서 실질적인 개선을 보였다.
실시예 8
실험 결과들 - "전혈 분석"에서 응혈 활성
본 발명의 변종들을 "전혈 분석"에 적용시킴으로써 이들 변종이 rhFVIIa 뿐만 아니라 [P10Q+K32E]rhFVIIa에 비교한 바 현저히 증가된 응혈 활성 (즉, 감소된 응혈 시간)을 보였음을 나타냈다. 실험 결과들은 도 1 및 아래 표 2에 나타낸다.
응혈 시간 (전혈 분석)
변종 t변종/twt
rhFVIIa (기준) 1
A3AY+P10Q+K32E+E116D 0.4
A3AY+P10Q+K32E+A34L 0.3
P10Q+K32E+A34E+P74S 0.3
A3AY+P10Q+K32E+E77A 0.4
표 2
실시예 9
실험 결과들 - "응혈 분석"에서 응혈 활성
TF-의존형 응혈 분석 (재료들 및 방법들 섹션에서 상기된 "응혈 분석")에서 분석될 때, R36E 치환을 갖는 본 발명의 변종들은 rhFVII 또는 본 발명의 다른 변종들에 비교할 때 현저히 감소된 응혈 활성을 갖는 것이 명백하다. 아래 표 3 참조. 더욱이, 상기 실시예 7에 예시된 바와 같이, R36E 치환을 갖는 변종들은 "TF-독립형 인자 X 활성화 분석"에서 증가된 인자 X 활성화 활성을 갖는다.
평균 응혈 활성
변종 (유닛들/mg변종/유닛들/mgwt)
(n = 2-3)
NovoSeven?(기준) 52,119 (100 %)
P10Q+K32E 52,714 (101 %)
A3AY+P10Q+K32E+A34L 56,948 (107 %)
P10Q+K32E+A34E+R36E 1,439 (2.7 %)
P10Q+K32E+A34D+R36E+K38E 1,232 (2.4 %)
표 3
실시예 10
실험 결과들 - 트롬보그램 분석에서 트롬빈 발생
인지질(PL)-의존형 및 조직 인자(TF)-의존형 트롬보그램들 (상기 트롬보그램 분석의 설명 참조) 모두를 사용함으로써, 최대 트롬빈 발생률이 상이한 농도의 변종 단백질들에서 FVIIa 변종들에 대해 결정되었다. pM의 변종 농도의 함수로서 최대 트롬빈 발생률들 (FU (형광 유닛들)/sec2으로 표현됨)을 플로팅함으로써, 도 2 (최대 조직 인자-의존형 트롬빈 발생률) 및 도 3 (최대 인지질-의존형 트롬빈 발생률)에 나타낸 결과들이 얻어졌다.
이들 결과들로부터, FVIIa 변종 P10Q K32E A34E R36E는 반응이 PL-의존형인지 또는 TF-의존형인지에 따라 차별화된 트롬빈 발생 능력을 갖는 것이 명백하다. 이 변종의 최대 TF-의존형 트롬빈 발생률은 FVIIa 변종들 P10Q K32E 또는 A3AY P10Q K32E A34L과 비교할 때 약 10-배(도 2에서 점선) 만큼 감소된다. 또한, 래그 시간, 피크까지 시간, 피크 높이 및 (보다 적은 정도까지) AUC는 다른 변종들에 비해 P10Q K32E A34E R36E에 대해 감소된다(결과들은 도시되지 않음). TF-의존형 활성과 대조적으로, P10Q K32E A34E R36E 변종의 PL-의존형 활성은 시험된 다른 변종들의 그것과 등가이고 (도 3 참조), 즉, 이 변종은 TF-의존형 활성이 실질적으로 감소되더라도 완전한 PL-의존형 활성을 갖는다.
동일한 실험에서, 변종 P10Q K32E A34E R36E은 변종 P10Q K32E A34E P74S에 직접적으로 비교되었고, 이는 도 2에 나타낸 높은 TF-의존형 트롬빈 발생률을 갖는다. 이들 2개의 변종들 간의 TF-결합의 차이 (즉, 변종 P10Q K32E A34E R36E의 감소된 TF-결합)는 환의 존재에 직접적으로 기여하고, 가능하게는 A34E 치환에 의한 상승 효과를 가질 것으로 믿어진다.
실시예 11
실험 결과들 - Biacore 분석에서 조직 인자에 대한 FVIIa 결합
본 발명의 변종들을 재료들 및 방법들 섹션에 개시된 바와 같이 TF 칩을 사용하여 Biacore 분석에 대한 표면 플라즈몬 공명에 의해 분석에 적용시킴으로써, 다음 결과들이 얻어졌다:
평균 응답 유닛들
변종 (n = 5)
야생형 FVIIa 888
P10Q; K32E 714
A3AY; P10Q; K32E; A34L 967*
P10Q; K32E; A34E; R36E 414
표 4 * n = 2
트롬보그램 분석으로부터 TF-의존형 트롬빈 발생률 데이터에 따라 (실시예 10), 표 4의 결과들은 R36E 치환이 조직 인자에 대한 적은 결합을 제공함을 지시한 다.
동일한 Biacore 분석에서, 2개의 글리코실화 부위들 (T106N 및 V253N 또는 I205T)을 도입한 2개의 추가의 변형들과 함께 표 4에 열거된 변종들과 동일한 변형들을 갖는 FVIIa 변종들이 역시 조직 인자에 대한 결합에 대해 시험되었다. 그 결과들은 아래 표 5에 나타낸다.
평균 응답 유닛들
변종 (n = 5)
T106N; V253N 717
T106N; I205T 612
P10Q; K32E; T106N; I205T 502
P10Q; K32E; T106N; V253N 498
A3AY; P10Q; K32E; A34L; T106N; V253N 522
P10Q; K32E; A34E; R36E; T106N; I205T 216
표 5
이들 결과들은 표 4의 결과들과 일치하고, 추가의 글리코실화 부위들 없이 표 4에서 동일한 변종들 (또는 야생형)과 비교될 때 표 5의 변종들에서 새로운 글리코실화 부위들의 존재는 조직 인자 결합의 (추가의) 감소를 제공함을 보여준다. 표 4의 변종들에 대한 경우와 같이, 글리코실화 변종에서 R36E 치환의 존재 역시 이러한 치환을 갖지 않는 다른 글리코실화 변종들의 조직 인자 결합보다 실질적으로 더 낮은 조직 인자 결합 레벨을 초래한다.
SEQUENCE LISTING <110> Maxygen ApS Maxygen Holdings Ltd. Haaning, Jesper Mortensen Andersen, Kim Vilbour Born?, Claus <120> FVII or FVIIa Gla Domain Variants <130> 0274wo310 <150> US 60/479,780 <151> 2003-06-19 <150> DK PA 2004 00930 <151> 2004-06-15 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15 Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

Claims (71)

  1. SEQ ID NO:1에 나타난 아미노산 서열을 갖는 인자 VII (FVII) 또는 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩티드 변종으로서,
    위치 36에서 음으로 하전된 아미노산 잔기가 치환에 의해 도입되고,
    상기 폴리펩티드 변종은 그의 활성화된 형태에서 재조합 인간 인자 VIIa에 비교하여 증가된 FX 활성화 활성을 가지며,
    상기 치환은 R36D 또는 R36E인,
    인자 VII (FVII) 또는 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩티드 변종.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 위치 34에서 아미노산 치환을 추가로 포함하고, 음으로 하전된 아미노산 잔기는 위치 34에서 치환에 의해 도입되고, 상기 치환은 A34E+R36E 치환들을 포함하는 변종.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 치환은 10 및(또는) 32 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함하고, 치환 K32E를 포함하는 변종.
  9. 제1항에 있어서, 상기 치환은 10 및(또는) 32 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함하고, 치환 P10Q를 포함하는 변종.
  10. 제1항에 있어서, 상기 치환은 10 및(또는) 32 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함하고, 치환 P10Q+K32E를 포함하는 변종.
  11. 제10항에 있어서, 치환 P10Q+K32E+A34E+R36E를 포함하는 변종.
  12. 제10항에 있어서, 치환 P10Q+K32E+A34L+R36E를 포함하는 변종.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제1항에 있어서, 비-폴리펩티드 모이어티에 대한 부착기를 포함하는 적어도 하나의 아미노산 잔기는 Gla 도메인 외부 위치로 도입되고,
    상기 부착기는 치환에 의해 도입된 생체내 N-글리코실화 사이트이며,
    상기 생체내 N-글리코실화 사이트는 A51N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, I205S, I205T, V253N, T267N, T267N+S269T, S314N+K316S, S314N+K316T, R315N+V317S, R315N+V317T, K316N+G318S, K316N+G318T, G318N, D334N 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 치환에 의해 도입되는 것인 변종.
  16. 제15항에 있어서, T106N, I205T 및 V253N로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함하는 변종.
  17. 제16항에 있어서, T106N+I205T, T106N+V253N, I205T+V253N으로 구성된 군으로부터 선택된 치환에 의해 도입된 2개의 생체내 N-글리코실화 사이트를 포함하는 변종.
  18. 제17항에 있어서, 치환들 P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+I205T를 포함하는 변종.
  19. 제17항에 있어서, 치환들 P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+V253N를 포함하는 변종.
  20. 제17항에 있어서, 치환들 P10Q+K32E+A34E+R36E+I205T+V253N을 포함하는 변종.
  21. 제17항에 있어서, 치환들 P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+I205T를 포함하는 변종.
  22. 제17항에 있어서, 치환들 P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+V253N을 포함하는 변종.
  23. 제17항에 있어서, 치환들 P10Q+K32E+A34L+R36E+I205T+V253N을 포함하는 변종.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 제1항에 있어서, 위치 3과 4 사이에 하나의 아미노산 잔기의 삽입을 추가로 포함하되, 소수성 아미노산 잔기가 위치 3과 4 사이에 삽입되며, 상기 삽입은 A3AY인 변종.
  28. 제27항에 있어서, 삽입 A3AY와 치환들 P10Q+K32E+A34E+R36E를 포함하는 변종.
  29. 제27항에 있어서, 삽입 A3AY와 치환들 P10Q+K32E+A34L+R36E를 포함하는 변종.
  30. 제27항에 있어서, 삽입 A3AY와 치환들 P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+I205T를 포함하는 변종.
  31. 제27항에 있어서, 삽입 A3AY와 치환들 P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+V253N을 포함하는 변종.
  32. 제27항에 있어서, 삽입 A3AY와 치환들 P10Q+K32E+A34E+R36E+I205T+V253N을 포함하는 변종.
  33. 제27항에 있어서, 삽입 A3AY와 치환들 P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+I205T를 포함하는 변종.
  34. 제27항에 있어서, 삽입 A3AY와 치환들 P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+V253N을 포함하는 변종.
  35. 제27항에 있어서, 삽입 A3AY와 치환들 P10Q+K32E+A34L+R36E+I205T+V253N을 포함하는 변종.
  36. 제1항에 있어서, 상기 변종은 그의 활성화된 형태인 변종.
  37. 제1항의 변종을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열.
  38. 제37항의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  39. 제37항의 뉴클레오티드 서열 또는 제38항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 응혈 형성이 필요한 질병 또는 질환의 치료를 위한 제1항의 변종을 포함하는 의약품으로서,
    상기 질병 또는 질환은 뇌출혈, 심각한 제어되지 않는 출혈, 외상, 이식 또는 적출 중인 환자들에서 출혈, 정맥류(variceal) 출혈 및 혈우병을 포함하는 출혈들로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 의약품.
  43. 제1항에 있어서, 상기 변종은 응혈 형성이 필요한 질병 또는 질환의 치료에 사용되며, 상기 질병 또는 질환은 뇌출혈, 심각한 제어되지 않는 출혈, 외상, 이식 또는 적출 중인 환자들에서 출혈, 정맥류(variceal) 출혈 및 혈우병을 포함하는 출혈들로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 변종.
  44. 삭제
  45. 삭제
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