ES2338425T3 - Variantes de dominio de gla del factor vii o viia. - Google Patents

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Abstract

Una variante de polipéptido de factor VII (FVII) o factor VIIa (FVIIa) que presenta una secuencia de aminoácidos que difiere en 1 a 15 residuos de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos del factor VII humano (hFVII) o factor VIIa humano (hFVIIa) mostrada en la secuencia ID SEC Nº: 01, en la que se ha introducido un residuo de aminoácido cargado negativamente mediante sustitución en la posición 36, en la que dicha variante de polipéptido en su forma activada presenta una mayor actividad de activación de FX en comparación con el factor VIIa humano recombinante.

Description

Variantes de dominio de Gla del factor VII o VIIa.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a variantes de dominio de Gla nuevas de polipéptidos de factor FVII (FVII) o Factor VIIa (FVII), así como también a tales variantes de polipéptido para uso en terapia, de forma particular para el tratamiento de una variedad de trastornos relacionados con la coagulación.
Antecedentes de la invención
La coagulación sanguínea es un procedimiento que comprende una interacción compleja de distintos componentes sanguíneos (o factores) que eventualmente resultan en una coagulación de fibrina. Por lo general, los componentes de la sangre que participan en lo que se ha denominado como la "cascada de coagulación" son proenzimas o cimógenos, es decir, proteínas enzimáticamente inactivas que se transforman en una forma activa con la acción de un activador. Uno de estos factores de coagulación es FVII.
El FVII es una proteína del plasma dependiente de la vitamina K sintetizada en el hígado y secretada en la sangre como una glicoproteína de cadena simple con un peso molecular de 53 kDa (Broze & Majerus, J. Biol. Chem. 1980; 255: 1242-1247). El cimógeno del FVII se transforma en una forma activada (FVIIa) por escisión proteolítica en un único sitio, R152-I153, dando lugar a dos cadenas unidas por un puente disulfuro simple. El FVIIa en complejo con factor de tejido (complejo de FVIIa) es capaz de transformar ambos factores IX (FIX) y factor X (FX) en sus formas activadas, seguido de reacciones que conducen a la producción rápida de trombina y formación de fibrina (\diametersterud & Rapport, Proc. Natl. Acad Sci. EEUU 1977; 74; 5260-5264).
El FVII sufre modificaciones post-translacionales que incluyen carboxilación dependiente de la vitamina K que da lugar a diez residuos de ácido \gamma-carboxiglutámico en la región N-terminal de la molécula. Por tanto, los residuos número 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35 mostrados en la ID SEC Nº 1 son residuos de ácido \gamma-carboxiglutámico en el dominio de Gla importantes para la actividad del FVII. Otras modificaciones post-translacionales incluyen unión del resto de azúcar a dos sitios de N-glicosilación de origen natural en la posición 145 y 322, respectivamente, y en dos sitios de O-glicosilación de origen natural en la posición 52 y 60, respectivamente.
El gen que codifica el FVII humano (hFVII) se ha mapeado en el cromosoma 13 en q34-qter 9 (de Grouchy y col., Hun Genet 1984; 66:230-233). Este contiene nueve exones y se extiende 12,8 Kb (O'Hara y col., Proc. Natl Sci EEUU 1987; 84: 5158-5162). La estructura de organización y proteína génica de FVII son similares a las de otras proteínas procoagulantes dependientes de la vitamina K, con exones 1a y 1b que codifican la secuencia de señal; exón 2 el propéptido y dominio de Gla; exón 3 una región hidrófoba corta; exones 4 y 5 los dominios tipo factor de crecimiento epidérmico; y exón 6 a 8 el dominio catalítico de la serinproteasa (Yoshitake y col., Biochemistry 1985; 24: 3736-3750).
Hay estudios relativos a estructuras tridimensionales experimentales de hFVIIa (Pike y col. Proc. Natl Acad Sci EEUU, 1999; 96:8925-30 y Kemball-Cookl y col., J. Struct. Biol., 1999; 127:213-223); de hFVIIa en complejo con factor de tejido soluble que usan procedimientos cristalográficos por rayos X (Brenner y col., Nature, 1996; 380:41 y Zhang y col., J. Mol. Biol., 1999; 285: 2089); y de fragmentos menores de hFVII (Muranyi y col., Biochemistry, 1998; 37:10605 y Kao y col., Biochemistry, 1999; 38:7097).
Se han descrito relativamente varias variantes con proteínas diseñadas de FVII (Dickinson & Ruf, J. Biol. Chem, 1997; 272:19875-19879; Kemball-Cook y col., J. Biol. Chem, 1998; 273:8516-8521; Bharadwaj y col., J. Biol Chem, 1996; 271:30685-30691; Ruf y col., Biochemistry, 1999; 38:1957-1966).
Hay estudios relativos a la expresión de FVII en BHK u otras células de mamíferos (documentos WO 92/15686, WO 91/11514 y WO 88/10295) y co-expresión de FVII y endoproteasa kex2 en células eucarióticas (documento WO 00/28065).
Se comercializan preparaciones comerciales de FVIIa humano recombinante (rhFVIIa) con el nombre comercial NovoSeven®. NovoSeven® está indicado para el tratamiento de episodios de hemorragia en pacientes con hemofilia A o B. NovoSeven® es el único rhFVIIa para tratamiento efectivo y fiable de episodios hemorrágicos actualmente disponible en el mercado.
Se ha descrito una forma inactiva de FVII en la que están modificadas arginina 152 y/o isoleucina 153 en el documento WO 91/11514. Estos aminoácidos se encuentran localizados en el sitio de activación. El documento WO 96/12800 describe la inactivación de FVIIa con un inhibidor de la serinproteinasa. Se ha descrito la inactivación por carbamilación de FVIIa en el grupo I153 de \alpha-aminoácido por parte de Petersen y col., Eur J Biochem, 1999; 261:124-129. La forma inactivada es capaz de competir con el FVII o FVIIa de tipo salvaje por la unión al factor de tejido e inhibir la actividad coagulante. La forma inactivada de FVIIa se sugiere usar para el tratamiento de pacientes que sufren de estados hipercoagulables, tales como pacientes con sepsis o en riesgo de infarto de miocardio o apoplejía trombótica.
En relación con el tratamiento de hemorragias incontroladas tales como trauma, se cree que el FVIIa es capaz de activar FX a FXa sin unirse al factor de tejido, y se cree que esta reacción de activación ocurre principalmente en plaquetas sanguíneas activadas (Hedner y col., Blood Coagulation & Fibrinolysis, 2000; 11; 107-111). Sin embargo el hFVIIa o rhFVIIa tiene una baja actividad hacia el FX en ausencia de factor de tejido y, en consecuencia, el tratamiento de hemorragia incontrolada, por ejemplo en pacientes con trauma, requiere dosis relativamente elevadas y múltiples de hFVIIa o rhFVIIa. Por tanto con el fin de tratar hemorragias incontroladas más eficientemente (para minimizar la pérdida de sangre) hay la necesidad de moléculas de FVIIa mejoradas que posean una alta actividad hacia el FX en ausencia de factor de tejido. Tales moléculas de FVIIa mejoradas deberían mostrar un tiempo de coagulación reducido (acción más rápida/actividad de coagulación mejorada) en comparación con rhFVIIa cuando se administrar en relación con hemorragias incontroladas.
Las variantes de dominio de Gla de FVII/FVIIa se han descrito en los documentos WO 99/20767, US 6.017.882 y WO 00/66753, donde se identificaron algunos residuos localizados en el dominio de Gla como importantes para la unión de la membrana de fosfolípidos y de ahí activación de FX. De forma particular se ha encontrado que los residuos 10 y 32 eran críticos y que se podría conseguir mejor afinidad de unión de la membrana de fosfolípidos, y de ahí la mejor activación de FX, realizando las mutaciones P10Q y K32E. De forma particular se encontró que se mejoraba la activación de FX en comparación con rhFVIIa en condiciones de coagulación marginal, tales como bajo condiciones en las que está presente un bajo nivel de factor de tejido.
El documento WO 01/58935 describe una nueva estrategia para el desarrollo de moléculas de FVII o FVIIa que presenta, entre otros, una mejor vida media mediante glicosilación dirigida o PEGilación.
El documento WO 03/093465 describe variantes de FVII o FVIIa que presentan ciertas modificaciones en el dominio de Gla y presentan uno o más sitios de N-glicosilación introducidos fuera del dominio de Gla.
El documento WO 2004/029091 describe variantes de FVII o FVIIa que presentan ciertas modificaciones en el sitio de unión al factor de tejido.
Los inventores han identificado ahora residuos adicionales en el dominio de Gla que aumentan más la afinidad de unión de la membrana de fosfolípidos y de ahí que aumentan adicionalmente la activación de FX. Las variantes FVII o FVIIa de la invención pueden mostrar también afinidad de unión al factor de tejido reducida.
El objeto de la presente invención es proporcionar moléculas de FVII o FVIIa mejoradas (variantes de FVII o FVIIa) que son capaces de activar FX a FXa más eficientemente que hFVIIa, rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa. De forma particular es un objeto de la presente invención proporcionar moléculas de FVII o FVIIa mejoradas (variantes de FVII o FVIIa) que son capaces de activar FX a FXa más eficientemente que hFVIIa, rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa en ausencia de factor de tejido. Estos objetos están dirigidos por las variantes de FVII o FVIIa proporcionados en la presente invención.
Breve descripción de la invención
En un primer aspecto la presente invención se refiere a una variante de polipéptido del factor VII (FVII) o factor VIIa (FVIIa) que presenta una secuencia de aminoácidos que difiere en 1 a 15 residuos de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos del factor VII humano (hFVII) o factor VIIa humano (hFVIIa) mostrado en la Nº ID SEC: 1, en la que se ha introducido un residuo de aminoácido cargado negativamente mediante sustitución en la posición 36.
En un segundo aspecto la variante de polipéptido del factor VII (FVII) o factor VIIa (FVIIa) comprende además una sustitución de aminoácido en la posición 34.
En un tercer aspecto la variante de polipéptido del factor VII (FVII) o factor (VIIa) comprende además una sustitución de aminoácido en las posiciones 10 y/o 32.
Aspectos adicionales de la invención se refieren a una secuencia de nucleótido que codifica las variantes de polipéptido de la invención, un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos, y una célula huésped que comprende la secuencia de nucleótidos o vector de expresión.
Aspectos adicionales de la invención se refieren a una composición farmacéutica que comprende las variantes de polipéptido de la invención, las variantes de polipéptido de la invención o la composición farmacéutica de la invención para uso como un medicamento, así como también para uso en los procedimientos de tratamiento.
Aspectos adicionales de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción que sigue así como también de las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra el tiempo de coagulación frente a la concentración para variantes de la invención cuando se ensayan en el "ensayo de sangre completa".
La figura 2 muestra la tasa de generación de trombina dependiente del factor de tejido máxima para variantes de la invención determinadas en el "ensayo del trombograma".
La figura 3 muestra la tasa de generación de trombina dependiente de fosfolípido máxima para variantes de la invención determinadas en el "ensayo del trombograma".
Descripción detallada de la invención Definiciones
En el contexto de la presente descripción y reivindicaciones aplican las siguientes definiciones:
El término "FVII" o "polipéptido de FVII" se refiere a una molécula de FVII proporcionada en forma de cadena simple. Un ejemplo de un polipéptido de FVII es el FVII humano de tipo salvaje (hFVII) que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la Nº ID SEC: 1. Se debería entender no obstante que el término "polipéptido de FVII" también cubre moléculas de tipo hFVII, tales como fragmentos o variantes de Nº ID SEC: 1, de forma particular variantes en las que la secuencia comprende al menos uno, tal como hasta 15, preferiblemente hasta 10, modificaciones de aminoácidos en comparación con la Nº ID SEC: 1.
El término "FVIIa" o "polipéptido de FVIIa" se refiere a una molécula de FVIIa proporcionada en su forma de dos cadenas activada. Cuando la secuencia de aminoácido de Nº ID SEC: 1 se usa para describir la secuencia de aminoácido de FVIIa se entenderá que el enlace peptídico entre R152 e I153 de la forma de cadena simple se ha escindido, y que una de las cadenas comprende residuos de aminoácido 1 a 152, la otra cadena comprende residuos de aminoácido 153 a 406.
Los términos "vFVII" y "vFVIIa" se refieren a polipéptidos de FVII y FVIIa producidos por técnicas recombinantes.
Los términos "hFVII" y "hFVIIa" se refieren a FVII y FVIIa de tipo salvaje humanos, respectivamente, que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la Nº ID SEC: 1.
Los términos "rhFVII" y "rhFVIIa" se refieren a FVII y FVIIa de tipo salvaje humano, que presentan la secuencia de aminoácidos mostrada en la Nº ID SEC: 1, producidos por medios recombinantes. Un ejemplo de rhFVIIa es NovoSeven®.
Cuando se usa en la presente invención, el término "dominio de Gla" se pretende que cubra residuos de aminoácidos 1 a 45 de Nº ID SEC: 1.
De acuerdo con lo anterior, el término "posición localizada fuera del dominio Gla" cubre residuos de aminoácido 46 a 406 de Nº ID SEC: 1.
Las abreviaturas "FX", "TF" y "TFPI" significan factor X, factor de tejido e inhibidor de ruta del factor de tejido, respectivamente.
El término "dominio de proteasa" se usa aproximadamente para residuos 153 a 406 contados desde el término N.
El término "sitio catalítico" se usa para referirse a la triada catalítica constituida por S344, D242 y H193 de la variante de polipéptido.
El término "padre" se pretende que indique la molécula que se va a modificar/mejorar de acuerdo con la presente invención. Si bien el polipéptido padre que se va a modificar con la presente invención puede ser cualquier polipéptido de FVII o FVIIa, y por tanto derivarse de cualquier origen, por ejemplo, un origen mamífero no humano, se prefiere que el polipéptido padre sea hFVII o hFVIIa.
Una "variante" es un polipéptido que difiere en uno o varios residuos de aminoácido de su polipéptido padre, normalmente en 1 a 15 residuos de aminoácido (por ejemplo, en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 residuos de aminoácido), tal como en 1 a 10 residuos de aminoácido, por ejemplo en 1 a 8, 1 a 6, 1 a 5 ó 1 a 3 residuos de aminoácido. Normalmente el polipéptido padre es hFVII o hFVIIa.
El término "conjugado" (o de forma intercambiable "polipéptido conjugado") se pretende que indique una molécula heterogénea (en el sentido de compuesta o quimérica) formada por la unión covalente de uno o más polipéptidos a uno o más restos no polipéptidos tales como moléculas de polímero, compuestos lipófilos, restos de azúcar o agentes derivatizantes orgánicos. Preferiblemente, el conjugado es soluble en concentraciones y condiciones relevantes, es decir, soluble en fluidos fisiológicos tales como sangre. Ejemplos de polipéptidos conjugados de la invención incluyen polipéptidos glicosilados y/o PEGilados.
El término "unión covalente" o "unido covalentemente" significa que la variante de polipéptido y el resto no polipéptido se encuentran unidos bien de forma covalente directamente uno con otro, o bien están unidos de forma covalente indirectamente uno con otro a través de al menos un resto interviniente tal como un puente, espaciador, o resto de unión.
El término "resto no polipéptido" se pretende que signifique una molécula, diferente de un polímero peptídico compuesto por monómeros de aminoácido y unidos conjuntamente con enlaces peptídicos, cuya molécula sea capaz de conjugarse con un grupo de unión de la variante de polipéptido de la invención. Ejemplos preferidos de tales moléculas incluyen moléculas poliméricas, restos de azúcares, compuestos lipófilos o agentes derivatizantes orgánicos. Cuando se usa en el contexto de una variante conjugada de la invención se entenderá que el resto no polipeptídico está unido a la parte polipeptídica de la variante conjugada a través de un grupo de unión del polipéptido. Como se explicó anteriormente, el resto no polipéptido puede estar unido de forma covalente directa o indirectamente al grupo de unión.
Una "molécula de polímero" es una molécula formada por unión covalente de dos o más monómeros, en la que ninguno de los monómeros es un residuo de aminoácido, excepto cuando el polímero es albúmina humana u otra proteína de plasma abundante. El término "polímero" puede usarse de forma intercambiable con el término "molécula de polímero". El término se pretende que cubra también moléculas de carbohidrato unidas por glicosilación in vitro, es decir glicosilación sintética llevada a cabo normalmente in vitro lo que implica unión covalente de una molécula de carbohidrato a un grupo de unión de la variante de polipéptido, opcionalmente usando un agente reticulante.
El término "resto de azúcar" se pretende que indique una molécula que contenga carbohidrato que comprende uno o más residuos de monosacárido, capaz de unirse a la variante de polipéptido (para producir un conjugado de variante de polipéptido en la forma de una variante de polipéptido glicosilado) mediante glicosilación in vivo. Se pretende que el término "glicosilación in vivo" signifique cualquier unión de un resto de azúcar que se origine in vivo, es decir, durante procesamiento post-traslacional en una célula glicosilante para expresión de la variante de polipéptido, por ejemplo, a modo de glicosilación unida a N y unida a O. La estructura de oligosacáridos exacta depende, en gran medida, del organismo glicosilante en cuestión.
Un "sitio de N-glicosilación" tiene la secuencia N-X-S/T/C, en la que X es cualquier residuo de aminoácido excepto prolina, N es asparagina y S/T/C es serina, treonina o cisteína, preferiblemente serina o treonina, y lo más preferiblemente treonina. Preferiblemente el residuo de aminoácido en la posición +3 respecto al residuo de asparagina no es un residuo de prolina.
Un "sitio de glicosilación en O" es el grupo OH de un residuo de serina o treonina.
El término "grupo de unión" se pretende que indique un grupo funcional de la variante de polipéptido, de forma particular un residuo de aminoácido del mismo o un resto carbohidrato, capaz de unirse a un resto distinto de polipéptido tal como una molécula de polímero, una molécula lipófila, un resto de azúcar o un agente derivatizante orgánica. Son evidentes a partir de la tabla siguiente grupos de unión útiles y sus restos no polipéptidos que coinciden.
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Para N-glicosilación in vivo, el término "grupo de unión" se usa en un modo no convencional para indicar los residuos de aminoácido que constituyen un sitio de N-glicosilación (con la secuencia de N-X-S/T/C como se indicó anteriormente). Si bien el residuo de asparagina del sitio de N-glicosilación es aquel al que el resto de azúcar se une durante la glicosilación, tal unión no se puede conseguir a menos que estén presentes otros residuos de aminoácidos del sitio de N-glicosilación.
De acuerdo con lo anterior, cuando el resto no polipéptido es un resto de azúcar y la conjugación se tiene que conseguir mediante la N-glicosilación in vivo, el término "residuo de aminoácido que comprende un grupo de unión para un resto distinto de polipéptido" como se usa en relación con alteraciones de la secuencia de aminoácido del polipéptido se debe entender que significa que uno o más residuos de aminoácido que constituyen un sitio de N-glicosilación in vivo se tienen que alterar de forma tal que se introduce un sitio de N-glicosilación in vivo funcional en la secuencia de aminoácido.
En la presente solicitud, se usan nombres de aminoácido y nombres de átomo (por ejemplo, CA, CB, CD, CG, SG, NZ, N, O, C etc.) según se definen en Protein DataBanck (PDB) (www.pdb.org) en base a la nomenclatura IUPAC (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (nombres de residuo, nombres de átomo, etc.), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984) junto con sus correcciones en Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985)).
El término "residuo de aminoácido" se pretende que incluya cualquier residuo de aminoácido natural o sintético, y se pretende que indique principalmente un residuo de aminoácido contenido en el grupo constituido por los 20 aminoácidos de origen natural, es decir, seleccionados del grupo constituido por residuos de alanina (Ala o A), cisteína (Cys o C), ácido aspártico (Asp o D), ácido glutámico (Glu o E), fenilalanina (Phe o F), glicina (Gly o G), histidina (His OH), isoleucina (Ile o I), lisina (Lys o K), leucina (Leu o L), metionina (Met o M), asparagina (Asn o N), prolina (Pro o P), glutamina (Gln o Q), arginina (Arg o R), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), valina (Val o V), triptófano (Trp o W), y tirosina (Tyr o Y).
La terminología usada para identificar posiciones de aminoácido se ilustra como sigue: G124 indica que la posición 124 está ocupada por un residuo de glicina en la secuencia de aminoácido mostrada en la Nº ID SEC: 1. G124R indica que el residuo de glicina de la posición 124 ha sido sustituido con un residuo de arginina. Se indican sustituciones alternativas con un "/", por ejemplo, N145S/T significa una secuencia de aminoácido en la que asparagina está sustituida en la posición 145 bien con serina o con treonina. Se indican múltiples sustituciones con un "+", por ejemplo K143N+N145S/T significa una secuencia de aminoácido que comprende una sustitución del residuo de lisina en la posición 143 con un residuo de asparagina y una sustitución del residuo de asparagina en la posición 145 con un residuo de serina o un residuo de treonina. Se indica la inserción de un residuo de aminoácido adicional, por ejemplo, inserción de un residuo de alanina después de G124, con G124GA. La inserción de dos residuos de alanina adicionales después de G124 se indica con G124GAA, etc. Cuando se usa en la presente invención el término "insertado en la posición X" o "insertado en la posición X" significa que el (los) residuo(s) de aminoácido está (están) insertado(s) entre el residuo de aminoácido X y X+1. Una deleción de un residuo de aminoácido se indica con un asterisco. Por ejemplo, la deleción del residuo de glicina en la posición 124 se indica con G124*.
A menos que se indique de otra forma, la numeración de los residuos de aminoácido preparados en la presente invención se efectúa respecto a la secuencia de aminoácidos del polipéptido hFVII/hFVIIa (Nº ID SEC: 1).
El término "difiere de", tal como se usa en relación con mutaciones específicas, se pretende que permita que estén presentes diferencias adicionales a parte de la diferencia de aminoácido especificada. Por ejemplo, además de las modificaciones llevadas a cabo en el dominio de Gla tendentes al aumento de la activación del FX, el polipéptido puede contener otras modificaciones que no se relacionan necesariamente con este efecto.
Por tanto, además de las modificaciones de aminoácido descritas en la presente invención se entenderá que la secuencia de aminoácidos de la variante de polipéptido de la invención puede, si se desea, contener otras alteraciones, es decir, otras sustituciones, inserciones o deleciones. Estas pueden, por ejemplo, incluir truncamiento del término N y/o C con uno o más residuos de aminoácido (por ejemplo, con 1 a 10 residuos de aminoácido), o además de uno o más residuos extra en el término N y/o C, por ejemplo, adición de un residuo de metionina en el término N o introducción de un residuo de cisteína cerca o en el término C, así como también "sustituciones de aminoácido conservativas", es decir, sustituciones llevadas a cabo dentro de grupos de aminoácidos con características similares, por ejemplo, aminoácidos de pequeño tamaño, aminoácidos acídicos, aminoácidos polares, aminoácidos básicos, aminoácidos hidrófobos y aminoácidos aromáticos.
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Se muestran ejemplos de tales sustituciones conservativas en la tabla siguiente.
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Aún se describen otros ejemplos de modificaciones adicionales en las secciones tituladas "Modificaciones fuera del dominio de Gla" y "Otras modificaciones fuera del dominio de Gla".
El término "secuencia de nucleótidos" se pretende que indique una extensión consecutiva de dos o más moléculas de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede ser genómica, ADNc, ARN, semisintética, de origen sintético, o cualesquiera combinaciones de las mismas.
El término "vector" se refiere a un plásmido u otras secuencias de nucleótidos que son capaces de replicar dentro de una célula huésped o integrarse en el genoma de la célula huésped, y como tales, son útiles para llevar a cabo diferentes funciones junto con células huésped compatibles (un sistema vector-huésped) para facilitar la clonación de la secuencia de nucleótidos, es decir, para producir cantidades útiles de la secuencia, dirigiendo la expresión del producto génico codificado por la secuencia e integrando la secuencia de nucleótidos en el genoma de la célula huésped. El vector contendrá diferentes componentes dependiendo de la función que se va a realizar.
"Célula", "célula huésped", "línea celular" y "cultivo celular" se usan de forma intercambiable en la presente invención y se debería entender que tales términos incluyen la descendencia resultante del crecimiento o cultivo de una célula.
"Transformación" y "transfección" se usan de forma intercambiable para referirse al procedimiento de introducir ADN en una célula.
"Unido de forma manejable" se refiere a la unión covalente de dos o más secuencias de nucleótidos, mediante ligadura enzimática o de otro modo, en una configuración relativa una a otra tal que se puede realizar la función normal de las secuencias. Por lo general, "unido de forma manejable" significa que las secuencias de nucleótidos que se unen son contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora, contiguas y en fase de lectura. La unión se lleva a cabo por ligadura en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existieran entonces se usan adaptadores o conectores de oligonucleótidos, en combinación con procedimientos de ADN recombinante convencionales.
En el contexto de la presente invención el término "modificación" o "modificación de aminoácido" se pretende que cubra el reemplazo de una cadena lateral de aminoácido, sustitución de un residuo de aminoácido, deleción de un residuo de aminoácido o inserción de un residuo de aminoácido.
El término "introducir" se refiere a la introducción de un residuo de aminoácido, de forma particular por sustitución de un residuo de aminoácido existente, o de forma alternativa por inserción de un residuo de aminoácido adicional.
El término "eliminar" se refiere a la eliminación de un residuo de aminoácido, de forma particular por sustitución del residuo de aminoácido que se va a eliminar con otro residuo de aminoácido, o de forma alternativa por deleción (sin sustitución) del residuo de aminoácido que se va a eliminar.
En el presente contexto, el término "actividad" debería entenderse como la actividad relevante asociada con el ensayo en el que la actividad se mide realmente.
Por tanto, el término "actividad amidolítica" se usa para dar a entender la actividad medida en el "ensayo amidolítico" descrito en la presente invención. Con el fin de mostrar la "actividad amidolítica" una variante de la invención, en su forma activada, debería presentar al menos 10% de la actividad amidolítica del rhFVIIa cuando se ensaya en el "ensayo amidolítico" descrito en la presente invención. En una realización preferida de la invención la variante, en su forma activada, presente al menos 20% de la actividad amidolítica del rhFVIIa, tal como al menos 30%, por ejemplo, al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, tal como al menos 60%, por ejemplo al menos 70%, incluso más preferiblemente al menos 80%, tal como al menos 90% de la actividad amidolítica del rhFVIIa cuando se ensaya en el "ensayo amidolítico" descrito en la presente invención. En una realización de interés de la variante, en su forma activada, presenta sustancialmente la misma actividad amidolítica que rhFVIIa, tal como una actividad amidolítica de 75 a 125% de la actividad amidolítica de rhFVIIa.
El término "actividad coagulante" se refiere a la actividad medida en el "ensayo en sangre completa" descrito en la presente invención, es decir, el tiempo necesario para obtener la formación del coágulo. Por tanto, un tiempo de coagulación inferior corresponde a una actividad de coagulación mayor.
El término "mayor actividad de coagulación" se usa para indicar que el tiempo de coagulación de la variante de polipéptido se reduce estadísticamente de forma significativa respecto a la generada por rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa según se determina en condiciones comparables y cuando se mide en el "ensayo de sangre completo" descrito en la presente invención.
En el presente contexto el término "actividad" se usa también en relación con la capacidad de las variantes de activar FX o FXa. Esta capacidad se denota también como "actividad de activación de FX" o "actividad de generación de FXa" y se puede determinar en el "ensayo de activación del factor X independiente de TF".
El término "mayor actividad de activación de FX" o "mayor actividad de generación de FXa" se usa para indicar que una variante de la invención, en su forma activada, presenta una capacidad estadísticamente significativamente mayor de activar FX o FXa en comparación con una molécula de referencia, tal como rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa. La extensión en la que una variante de la invención (en su forma activada) presenta una actividad de activación de FX mayor se puede determinar de forma conveniente en el "ensayo de activación del factor X independiente de TF" descrito en la presente invención.
El término "inmunogenicidad" tal como se usa en relación con una sustancia dada se pretende que indique la capacidad de la sustancia de inducir una respuesta del sistema inmune. La respuesta inmune puede ser una respuesta mediada por célula o anticuerpo (véase, por ejemplo, Roitt: Essential Immunology (10ª edición, Blackwell) para definición adicional de inmunogenicidad). Normalmente la reactividad de anticuerpo reducida será una indicación de inmunogenicidad reducida. La inmunogenicidad se puede determinar con uso de cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, in vivo o in vitro.
El término "vida media in vivo funcional" se usa en su significado normal, es decir, el tiempo en el que el 50% de la actividad biológica del polipéptido está aún presente en el cuerpo/órgano diana, o el tiempo en el que la actividad del polipéptido es 50% del valor inicial.
Como una alternativa para determina la vida media in vivo funcional, se puede determinar la "vida media en suero", es decir, el tiempo en el que el 50% del polipéptido circula en el plasma o torrente sanguíneo antes de ser clarificado. La determinación de la vida media en suero es frecuentemente más simple que la determinación de la vida media in vivo funcional, y la magnitud de la vida media en suero es normalmente una buena indicación de la magnitud de la vida media in vivo funcional. De forma alternativa los términos de vida media en suero incluyen "vida media en plasma", "vida media circulante", "aclaramiento en suero", "aclaramiento en plasma" y "vida media con aclaramiento". El polipéptido se clarifica con la acción de uno o más sistemas reticuloendotelial (RES), riñón, bazo o hígado, por factor de tejido, receptor SEC u otra eliminación mediada por receptor, o por proteólisis específica y no específica. Normalmente, el aclaramiento depende del tamaño (respecto al corte para filtración glomerular), carga, cadenas de carbohidrato unidas, y la presencia de receptores celulares para la proteína. La funcionalidad que se retiene se selecciona normalmente de procoagulante, actividad de unión proteolítica o del receptor. La vida media in vivo funcional
y la vida media en suero se pueden determinar por cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica.
El término "mejorado" tal como se usa en relación a la vida media in vivo funcional o vida media en suero indica que la vida media relevante de la variante de polipéptido se ve mejorada de forma estadísticamente significativa respecto a la de la molécula de referencia, tal como rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa, según se determina en condiciones comparables (determinadas de forma típica en un animal experimental, tal como ratas, conejos, cerdos o monos).
El término "AUC_{iv}" o "área bajo la curva cuando se administra por vía intravenosa" se usa en su sentido normal, es decir, como el área bajo la actividad en la curva suero-tiempo, cuando la variante de polipéptido se ha administrado por vía intravenosa, de forma particular cuando se administra por vía intravenosa a ratas. De forma típica la actividad medida es la "actividad de coagulación" definida anteriormente. Una vez que los puntos de actividad-tiempo experimentales se han determinado, el "AUC_{iv}" se puede calcular convenientemente con un programa informático, tal como GraphPad Prism 3.01.
Se entenderá que con el fin de hacer una comparación directa entre los valores de AUC_{iv} de diferentes moléculas (por ejemplo, entre las variantes de la invención y una molécula de referencia tal como rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa) se debería administrar la misma cantidad de actividad. En consecuencia, los valores de AUC_{iv} se encuentran de forma típica normalizados (es decir, corregidos para diferencias en la dosis inyectada) y expresados como AUC_{iv}/dosis administrada.
El término "sensibilidad reducida a degradación proteolítica" se pretende principalmente que signifique que la variante de polipéptido presenta sensibilidad reducida a degradación proteolítica en comparación con hFVIIa, rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa determinado en condiciones comparables. Preferiblemente la degradación proteolítica se reduce en al menos 10% (e. g. en 10 a 25% o en 10 a 50%), tal como al menos 25% (por ejemplo, en 25 a 50%, en 25 a 75% o en 25 a 100%), más preferiblemente en al menos 35%, tal como al menos 50%, (por ejemplo, en 50 a 75% o en 50 a 100%) incluso más preferiblemente en al menos 60%, tal como al menos 75% (por ejemplo, en 75 a 100%) o incluso al menos en 90%.
El término "aclaramiento renal" se usa en su sentido normal para indicar cualquier aclaramiento que tenga lugar en los riñones, por ejemplo, por filtración glomerular, excreción tubular o degradación en las células tubulares. El aclaramiento renal depende de las características físicas del polipéptido, incluyendo el tamaño (diámetro), volumen hidrodinámico, simetría, forma/rigidez, y carga. Normalmente se considera que es un valor de corte para aclaramiento renal un peso molecular de aproximadamente 67 kDa. El aclaramiento renal puede establecerse en cualquier ensayo adecuado, por ejemplo un ensayo in vivo establecido. De forma típica se determina el aclaramiento renal administrando un polipéptido marcado (por ejemplo, radiomarcado o marcado con fluorescencia) a un paciente y midiendo la actividad de la etiqueta en orina recogida del paciente. El aclaramiento renal reducido se determina respecto a un polipéptido de referencia correspondiente, por ejemplo, rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa, en condiciones comparables. Preferiblemente la tasa de aclaramiento renal de la variante de polipéptido se reduce en al menos 50%, preferiblemente en al menos 75% y lo más preferiblemente en al menos 90% en comparación con rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa.
Los términos "sitio de unión al factor de tejido", "región de sitio activo" y "reborde de la hendidura de unión del sitio activo" se definen en referencia al ejemplo 1.
El término "residuo de aminoácido hidrófobo" incluye los siguientes residuos de aminoácido: isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W).
El término "residuo de aminoácido cargado negativamente" incluye los siguientes residuos de aminoácido: ácido aspártico (D) y ácido glutámico (E).
El término "residuo de aminoácido cargado positivamente" incluyen los siguientes residuos de aminoácido: lisina (K), arginina (R) e histidina (H).
Variantes de la invención
Las modificaciones llevadas a cabo en el dominio de Gla del polipéptido padre proporcionan preferiblemente la molécula resultante con una mayor afinidad de unión a la membrana de fosfolípidos, una mejor capacidad de activar FX a Fxa, y/o una mayor actividad de coagulación. Las variantes de la invención pueden presentar también una afinidad de unión al factor de tejido reducida y una actividad reducida cuando se unen al factor de tejido.
Sin limitarse a teoría particular alguna, en la actualidad se cree preferiblemente que la afinidad de unión a la membrana de fosfolípidos potenciada da lugar a una concentración local mayor de las variantes de polipéptido activadas en franca proximidad a los otros factores de coagulación, de forma particular FX. Por tanto, la tasa de activación de FX o FXa será mayor, simplemente debido a la mayor relación molar de la variante de FVII activada respecto a FX. La mayor tasa de activación de FX da lugar entonces a una mayor cantidad de trombina activa, y por tanto a una tasa mayor de reticulación de fibrina.
En consecuencia se contempla que el tratamiento médico con una variante de polipéptido de acuerdo con la invención puede proporcionar ventajas frente al compuesto de rhFVIIa actualmente disponible (NovoSeven®), tal como una dosis menor, mayor eficacia y/o acción más rápida.
Además se cree que las variantes independientes del factor de tejido, es decir, variantes que presentan una actividad reducida cuando se unen al factor de tejido en comparación con factor VIIa humano de tipo salvaje, pueden ofrecer ciertas ventajas de seguridad en términos de riesgo reducido de formación de coágulos sanguíneos no deseados (por ejemplo, trombosis o tromboembolismo), de forma particular cuando se usa para el tratamiento de eventos hemorrágicos no controlados agudos tales como trauma.
Por tanto, en una realización muy preferida de la invención, la variante de polipéptido, en su forma activada y cuando se compara con una molécula de referencia, tal como rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa, presenta una mayor actividad de activación de FX, de forma particular cuando se ensaya en un ensayo independiente del factor de tejido, tal como el "ensayo de activación del factor X independiente de TF" descrito en la presente invención. De forma más particular, se prefiere que la relación entre la actividad de activación de FX de la variante de polipéptido, en su forma activada, y la actividad de activación de FX de una molécula de referencia sea al menos 1,25 cuando se ensaya en el "ensayo de activación del factor X independiente de TF" descrito en la presente invención. Más preferiblemente, esta relación es al menos 1,5, tal como al menos 1,75, por ejemplo al menos 2, incluso más preferiblemente al menos 3, tal como al menos 4, lo más preferiblemente al menos 5.
Cuando la molécula de referencia es rhFVIIa, la relación entre la actividad de activación de FX de la variante de polipéptido, en su forma activada, y la actividad de activación de rhFVIIa es preferiblemente al menos aproximadamente 5, de forma típica al menos aproximadamente 10, cuando se ensaya en el "ensayo de activación de factor X independiente de TF" descrito en la presente invención, tal como al menos aproximadamente 15 ó 20.
En otra realización muy preferida de la invención, las variantes de la invención poseen una mayor actividad de coagulación (es decir, un tiempo de coagulación reducido) en comparación con rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa. En una realización preferida de la invención la relación entre el tiempo para conseguir la formación de coágulo para la variante (t_{variante}) y el tiempo para alcanzar la formación de coágulo para rhFVIIa (t_{wt}) o [P10Q+K32E]rhFVIIa (t_{P10Q+K32E}) es como máximo 0,9 cuando se ensaya en el "ensayo de sangre completa" descrito en el presente documento. Más preferiblemente esta relación es como máximo de 0,75, tal como 0,7, incluso más preferiblemente la relación es como máximo 0,6 y lo más preferiblemente la relación es como máximo 0,5.
Se puede alcanzar una o varias de las propiedades anteriormente citadas con las modificaciones descritas en la presente invención.
Variantes de la invención que comprenden un residuo de aminoácido hidrófobo en la posición 34
Como se indicó anteriormente, la presente invención se refiere en un aspecto a una variante de polipéptido de FVII o FVIIa que presenta una secuencia de aminoácidos que difiere en 1 a 15 residuos de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos de hFVII o hVIIa (Nº ID SEC: 1), en la que se ha introducido un residuo de aminoácido hidrófobo por sustitución en la posición 34.
El residuo de aminoácido hidrófobo que se va a introducir en la posición 34 se puede seleccionar del grupo constituido por I, L, M, V, F, Y y W, preferiblemente I, L y V, de forma particular L.
En una realización preferida, la variante comprende adicionalmente una sustitución de aminoácido en la posición 10, de forma particular P10Q, y/o una sustitución de aminoácido en la posición 32, de forma particular K32E. En una realización particularmente preferida de la invención, la variante comprende sustituciones en las dos posiciones 10 y 32, tal como P10Q+K32E.
De acuerdo con lo anterior, en una realización interesante de la invención, la variante comprende las sustituciones P10Q+K32E+A34L.
En una realización particularmente interesante de la invención, la variante comprende además una inserción de al menos un residuo de aminoácido (de forma típica uno) entre la posición 3 y 4. Se prefiere que el residuo de aminoácido insertado sea un residuo de aminoácido hidrófobo. Lo más preferiblemente la inserción es A3AY. De acuerdo con lo anterior en una realización particularmente interesante de la invención la variante comprende las modificaciones A3AY+P10Q+K32E+A34L.
Además de cualquiera de las modificaciones anteriormente citadas, la variante puede comprender una sustitución adicional en la posición 33. Preferiblemente se introduce un residuo de aminoácido hidrófobo por sustitución en la posición 33, de forma particular D33F.
El dominio de Gla puede contener también modificaciones en otras posiciones, de forma particular en posiciones 8, 11 y 28, tales como R28F o R28E. Por otro lado se debería entender que el dominio de Gla no debería modificarse en una extensión tal que se alteren las propiedades de unión de la membrana. De acuerdo con esto se prefiere que no tengan lugar modificaciones en los residuos que se lleguen a carboxilar en y, es decir, se prefiere que no tengan lugar modificaciones en los residuos 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35. De forma similar, en general no se prefiere que se introduzcan restos no polipeptídicos, tales como restos de azúcar y/o grupos PEG, en el dominio de Gla. En consecuencia se prefiere que no tengan lugar modificaciones en el dominio de Gla que generen un sitio de N-glicosilación in vivo.
Finalmente se entenderá que las modificaciones en el dominio de Gla descritas en esta sección pueden combinarse de forma ventajosa con una o varias modificaciones en posiciones localizadas fuera del dominio de Gla (véanse las secciones tituladas "Modificaciones fuera del dominio de Gla" y "Otras modificaciones fuera del dominio de Gla" a continuación).
Variantes de la invención que comprenden una sustitución de aminoácido en la posición 36
Como se indicó anteriormente, la invención se refiere a una variante de polipéptido de FVII o FVIIa que presenta una secuencia de aminoácidos que difiere en 1 a 15 residuos de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos de hFVII o hFVIIa (Nº ID SEC: 1), en la que se ha introducido un residuo de aminoácido cargado negativamente por sustitución en la posición 36.
Preferiblemente la parte superior del residuo de aminoácido introducido por sustitución en la posición 36 es un residuo de aminoácido cargado negativamente, por ejemplo, R36E o R36D, de forma particular R36E.
En una realización preferida la variante comprende además una sustitución de aminoácido en la posición 10, de forma particular P10Q y/o una sustitución de aminoácido en la posición 32, de forma particular K32E. En una realización particularmente preferida de la invención la variante comprende sustituciones en las dos posiciones 10 y 32, tal como P10Q+K32E.
La variante de la invención puede comprender adicionalmente una sustitución en la posición 38. Se prefiere introducir un residuo de aminoácido cargado negativamente por sustitución en la posición 38, por ejemplo, K38E o K38D, de forma particular K38E.
De acuerdo con lo anterior, son variantes de interés aquellas que comprenden las siguientes sustituciones P10Q+K32E+R36E o P10Q+K32E+R36E+K38E.
En una realización particularmente interesante la variante comprende además una sustitución de aminoácido en la posición 34 (es decir, la variante resultante comprende sustituciones en los siguientes residuos 10+32+34+36 o 10+32+34+36+38). Preferiblemente se introduce un residuo de aminoácido cargado negativamente por sustitución en la posición 34, por ejemplo A34E o A34D.
Ejemplos específicos de variantes preferidas son aquellos que comprenden las siguientes sustituciones P10Q+K32E+A34E+R36E o P10Q+K32E+A34D+R36E+K38E.
En una realización de interés de la invención, la variante comprende además una inserción de al menos un residuo de aminoácido (de forma típica uno) entre la posición 3 y 4. Se prefiere que el residuo de aminoácido insertado sea un residuo de aminoácido hidrófobo. Lo más preferiblemente la inserción es A3AY.
Además de cualquiera de las modificaciones anteriormente citadas, la variante puede comprender una sustitución adicional en la posición 33. Preferiblemente se introduce un residuo de aminoácido hidrófobo por sustitución en la posición 33, de forma particular D33F.
El dominio de Gla puede contener también modificaciones en otras posiciones, de forma particular en posiciones 8, 11 y 28, tales como R28F o R28E. Por otro lado se debería entender que el dominio de Gla no debería modificarse en una extensión tal que se alteren las propiedades de unión de la membrana. De acuerdo con esto se prefiere que no tengan lugar modificaciones en los residuos que se lleguen a carboxilar en y, es decir, se prefiere que no tengan lugar modificaciones en los residuos 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35. De forma similar, en general no se prefiere que se introduzcan restos no polipeptídicos, tales como restos de azúcar y/o grupos PEG, en el dominio de Gla. En consecuencia se prefiere que no tengan lugar modificaciones en el dominio de Gla que generen un sitio de N-glicosilación in vivo.
Finalmente se entenderá que las modificaciones en el dominio de Gla descritas en esta sección pueden combinarse de forma ventajosa con una o varias modificaciones en posiciones localizadas fuera del dominio de Gla (véanse las secciones tituladas "Modificaciones fuera del dominio de Gla" y "Otras modificaciones fuera del dominio de Gla" a continuación).
Variantes de la invención que comprenden sustituciones de aminoácido en posiciones 74, 77 o 116
Como se indicó anteriormente, la presente invención se refiere en un tercer aspecto a una variante de polipéptido de FVII o FVIIa que presenta una secuencia de aminoácidos que comprende de 3 a 15 modificaciones de aminoácidos respecto a hFVII o hFVIIa (Nº ID SEC: 1), en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende una sustitución de aminoácido en posición 10, 32 y al menos una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada del grupo constituido por posición 74, 77 y 116.
En una realización preferida la sustitución de aminoácido en posición 10 es P10Q y la sustitución de aminoácido en posición 32 es K32E.
Se prefiere además que la sustitución en posición 74, 77 ó 116 se seleccione del grupo constituido por P74S, E77A y E116D.
En una realización de interés la variante comprende además una sustitución de aminoácido en la posición 34. Preferiblemente se introduce un residuo de aminoácido cargado negativamente por sustitución en la posición 34, por ejemplo, A34E o A34D, de forma particular A34E.
En otra realización de interés de la invención la variante comprende además una inserción de al menos un residuo de aminoácido (de forma típica uno) entre la posición 3 y 4. Se prefiere que el residuo de aminoácido insertado sea un residuo de aminoácido hidrófobo. Lo más preferiblemente la inserción es A3AY.
Por tanto, ejemplos específicos de variantes de interés incluyen variantes que comprenden las siguientes modificaciones A3AY+P10Q+K32E+E116D, A3AY+P10Q+K32E+E77A y P10Q+K32E+A34E+P74S.
Además de cualquiera de las modificaciones anteriormente citadas, la variante puede comprender una sustitución adicional en la posición 33. Preferiblemente se introduce un residuo de aminoácido hidrófobo por sustitución en la posición 33, de forma particular D33F.
El dominio de Gla puede contener también modificaciones en otras posiciones, de forma particular en posiciones 8, 11 y 28, tales como R28F o R28E. Como se explicó anteriormente, el dominio de Gla no debería modificarse en una extensión tal que se alteren las propiedades de unión de la membrana, es decir, se prefiere que no tengan lugar modificaciones en los residuos 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35, y se prefiere que no se genere un sitio de N-glicosilación in vivo en el dominio de Gla.
Finalmente se entenderá que las modificaciones en el dominio de Gla descritas en esta sección pueden combinarse de forma ventajosa con una o varias modificaciones en posiciones localizadas fuera del dominio de Gla (véanse las secciones tituladas "Modificaciones fuera del dominio de Gla" y "Otras modificaciones fuera del dominio de Gla" a continuación).
Modificaciones fuera del dominio de Gla
Se describió una vida media de rhFVIIa en circulación de 2,3 horas en "Summary Basis for Approval for NovoSeven®", número de referencia de FDA 96-0597. Son necesarias dosis relativamente altas y administración frecuente para conseguir y mantener el efecto terapéutico o profiláctico deseado. En consecuencia es difícil de obtener regulación de dosis adecuada y la necesidad de administración por vía intravenosa frecuente impone restricciones en el ritmo de vida del paciente.
Una molécula con una vida media en circulación prolongada y/o mayor biodisponibilidad (tal como una mayor área bajo la curva en comparación con rhFVIIa cuando se administra por vía intravenosa) reduciría el número de administraciones necesarias. Dada la necesidad actual de inyecciones frecuentes y el potencial de obtención de niveles de FVIIa terapéuticamente más óptimos con efecto terapéutico mejorado concomitante, hay una necesidad clara de moléculas de tipo FVII o FVIIa.
De acuerdo con lo anterior, un objeto adicional de la presente invención es proporcionar moléculas de FVII o FVII mejoradas (variantes de FVII o FVIIa) con una mejor biodisponibilidad (tal como un mayor área bajo la curva en comparación con una molécula de referencia, tal como rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa, cuando se administra por vía intravenosa) y que sean capaces de activar el factor X en factor Xa (sin unirse al factor de tejido) más eficientemente que una molécula de referencia, tal como rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa (con lo que se es capaz de tratar hemorragias incontroladas, tales como un trauma, o afecciones crónicas tales como hemofilia más eficientemente).
Por tanto, son variantes de interés de la invención aquellas que, en sus formas activadas y en comparación con una molécula de referencia, tal como rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa, generan un mayor área bajo la curva cuando se administran por vía intravenosa (AUC_{iv}). Esto puede determinarse de forma conveniente por administración por vía intravenosa en ratas. De forma más particular, son variantes de interés de la presente invención aquellas donde la relación entre el AUC_{iv} de dicha variante, en su forma activada, y el AUC_{iv} de una molécula de referencia, tal como rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa, es al menos 1,25, tal como al menos 1,5, por ejemplo al menos 1,75, más preferiblemente al menos 2, tal como al menos 3, incluso más preferiblemente al menos 4, tal como al menos 5, de forma particular cuando se administra (por vía intravenosa) a ratas.
Este efecto se corresponderá frecuentemente con una mayor vida media in vivo funcional y/o una mayor vida media en suero en comparación con una molécula de referencia, tal como rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa. De acuerdo con lo anterior, en otra realización de interés de la invención, la relación entre la vida media in vivo funcional o la vida media en suero para la variante, en su forma activada, y la vida media in vivo funcional o la vida media en suero para una molécula de referencia, tal como rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa, es al menos 1,25. Más preferiblemente la relación entre la vida media relevante para la variante, en su forma activada, y la vida media relevante para la molécula de referencia, tal como rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa, es al menos 1,5, tal como al menos 1,75, por ejemplo al menos 2, incluso más preferiblemente al menos 3, tal como al menos 4, por ejemplo al menos 5.
Un modo de aumentar la vida media en circulación de una proteína es asegurar que el aclaramiento renal de la proteína se reduzca. Esto se puede conseguir conjugando la proteína con un resto químico que sea capaz de conferir aclaramiento renal reducido a la proteína, por ejemplo, polietilenglicol (PEG).
Además, la unión de un resto químico con la proteína o sustitución de aminoácidos expuestos a proteólisis puede bloquear de forma efectiva un enzima proteolítico del contacto que de otro modo conduce a degradación proteolítica de la proteína.
Como se indicó anteriormente, la inestabilidad debida a la degradación proteolítica es un problema conocido en el actual tratamiento con rhFVIIa. La degradación proteolítica es por tanto un obstáculo principal para la obtención de una preparación en solución en oposición a un producto liofilizado. La ventaja de obtener una preparación soluble estable descansa en la manipulación más sencilla para el paciente, y, en el caso de emergencias, acción más rápida, que potencialmente puede llegar a salvar la vida. Se han descrito intentos de impedir la degradación proteolítica con mutagénesis dirigida al sitio en sitios proteolíticos principales en el documento WO 88/10295.
El documento WO 01/58935 describe un número de modificaciones adecuadas que conduce a un aumento en AUC_{iv}, vida media in vivo funcional y/o vida media en suero. Las variantes descritas en el documento WO 01/58935 son el resultado de una estrategia generalmente nueva para el desarrollo de moléculas de FVII o FVIIa mejoradas, que se pueden usar para el polipéptido de FVII o FVIIa padre de la presente invención.
De forma más específica eliminando y/o introduciendo un residuo de aminoácido que comprende un grupo de unión por un resto no polipéptido en el polipéptido de FVII o FVIIa padre es posible adaptar de forma específica el polipéptido de modo que se vuelva la molécula más susceptible de conjugarse con un resto no polipéptido de elección, optimizando el modelo de conjugación (por ejemplo, asegurar una distribución y número de restos no polipeptídicos en la superficie de la variante de polipéptido de FVII o FVIIa óptimos y asegurar que sólo los grupos de unión que se pretende conjugar estén presentes en la molécula) y con ello obtener una nueva molécula conjugada que tenga actividad amidolítica y además una o más propiedades mejoradas en comparación con rhFVIIa.
En realizaciones de interés de la presente invención se altera más de un residuo de aminoácido localizado fuera del dominio de Gla, por ejemplo, la alteración abarca eliminación así como también introducción de residuos de aminoácido que comprenden un grupo de unión para el resto no polipéptido de elección. Además de la eliminación y/o introducción de los residuos de aminoácido la variante de polipéptido puede comprender otras sustituciones que no están relacionadas con la introducción y/o eliminación de residuos de aminoácido que comprenden un grupo de unión para el resto no polipéptido.
También, la variante de polipéptido se puede unir a un inhibidor de serinproteinasa para inhibir el sitio catalítico de la variante de polipéptido. De forma alternativa se pueden mutar uno o más de los residuos de aminoácido presentes en el sitio catalítico (S344, D242 y H193) con el fin de volver inactiva la variante resultante. Un ejemplo de tal mutación es S344A.
El residuo de aminoácido que comprende un grupo de unión para un resto no polipéptido, si se elimina o si se introduce, se selecciona en base a la naturaleza del resto no polipéptido de elección y, en muchos casos, en base al procedimiento en el que se va a alcanzar la conjugación entre la variante de polipéptido y el resto no polipéptido. Por ejemplo, cuando el resto no polipéptido es una molécula de polímero tal como un polietilenglicol o molécula derivada de poli(óxido de alquileno), se pueden seleccionar residuos de aminoácido que comprenden un grupo de unión del grupo constituido por lisina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, histidina y tirosina, preferiblemente lisina, cisteína, ácido aspártico y ácido glutámico, más preferiblemente lisina y cisteína, de forma particular cisteína.
Siempre que se tenga que introducir o eliminar del polipéptido padre un grupo de unión para un resto no polipéptido, la posición del residuo de aminoácido que se tiene que modificar se localiza preferiblemente en la superficie del polipéptido de FVIIa o FVIIa padre, y más preferiblemente está ocupada por un residuo de aminoácido que presenta al menos 25% de su cadena lateral expuesta a la superficie (como se define en el ejemplo 1 en la presente invención), preferiblemente al menos 50% de su cadena lateral expuesta a la superficie (como se define en el ejemplo 1 de la presente invención). Tales posiciones se han identificado en base a un análisis de una estructura en 3D de la molécula de hFVII o hFVIIa como se describe en el documento WO 01/58935.
Además la posición que se va a modificar se selecciona preferiblemente de una parte de la molécula de FVII o FVIIa que se localiza fuera del sitio de unión del factor de tejido, y/o fuera de la región del sitio activa, y/o fuera del reborde de la hendidura de unión del sitio activo. Estos sitios/regiones se identifican en el ejemplo 1 de la presente invención y en el documento WO 01/58935.
En caso de eliminación de un grupo de unión, el residuo de aminoácido relevante que comprende tal grupo y ocupa una posición como se definió anteriormente se sustituye preferiblemente con un residuo de aminoácido diferente que no comprende un grupo de unión para el resto no polipéptido en cuestión. Normalmente, el residuo de aminoácido que se va a eliminar es uno para el que la conjugación es desventajosa, por ejemplo, un residuo de aminoácido localizado en o cerca de un sitio funcional del polipéptido (debido a que la conjugación en tal sitio puede dar lugar a inactivación o actividad reducida del conjugado resultante motivado, por ejemplo, por reconocimiento del receptor alterada). En el presente contexto el término "sitio funcional" se pretende que indique uno o más residuos de aminoácido que sea/sean esencial(es) para o estén involucrados de otra forma en la función o desarrollo de FVII o FVIIa. Tales residuos aminoácidos son una parte del sitio funcional. El sitio funcional se puede determina mediante procedimientos conocidos en la técnica y se identifica preferiblemente por análisis de una estructura del complejo de factor de tejido FVIIa (véase Banner y col., Nature 1996; 380:41-46).
En caso de introducción de un grupo de unión se introduce un residuo de aminoácido que comprende tal grupo en la posición pertinente, preferiblemente con sustitución del residuo de aminoácido que ocupa tal posición.
El número exacto de grupos de unión presentes y disponibles para conjugación en el polipéptido de FVII o FVIIa depende del efecto deseado que se va a alcanzar con la conjugación. El efecto que se va a obtener es, por ejemplo, función de la naturaleza y grado de conjugación (por ejemplo, la identidad del resto no polipéptido, el número de restos no polipéptidos deseables o posibles de conjugar con la variante de polipéptido, cuando estos se deban conjugar o cuando la conjugación se deba evitar, etc.).
El número total de residuos de aminoácido que se va a modificar fuera del dominio de Gla en el polipéptido de FVII o FVIIa padre (en comparación con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Nº ID SEC: 1) no excederá de forma típica de 10. Preferiblemente la variante de FVII o FVIIa comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en 1 a 10 residuos de aminoácidos de los residuos de aminoácido 46 a 406 mostrados en Nº ID SEC: 1, de forma típica en 1 a 8 o en 2 a 8 residuos de aminoácido, por ejemplo, en 1 a 5 o en 2 a 5 residuos de aminoácido, tal como en 1 a 4 o en 1 a 3 residuos de aminoácido, por ejemplo 1, 2 ó 3 residuos de aminoácido de residuos de aminoácido 46 a 406 mostrados en Nº ID SEC: 1.
De forma análoga la variante de polipéptido de la invención puede contener de 1 a 10 restos no polipéptidos (adicionales), de forma típica de 1 a 8 ó de 2 a 8 restos no polipéptidos (adicionales), preferiblemente de 1 a 5 ó de 2 a 5 restos no polipéptidos (adicionales), tal como 1 a 4 ó 1 a 3 restos no polipéptidos (adicionales), por ejemplo, 1, 2 ó 3 restos no polipéptidos (adicionales). Se entenderá que tales restos no polipéptidos adicionales están unidos covalentemente a un grupo de unión localizado fuera del dominio de Gla.
Variantes de polipéptido de la invención donde el resto no polipéptido es un resto de azúcar
En una realización preferida de la invención se ha introducido y/o eliminado, preferiblemente introducido, un grupo de unión para un resto de azúcar, tal como un sitio de glicosilación, en particular un sitio de glicosilación in vivo, tal como un sitio de N-glicosilación in vivo, en una posición localizada fuera del dominio de Gla.
Cuando se usa en el presente contexto, el término "sitio de glicosilación de origen natural" cubre los sitios de glicosilación en las posiciones N145, N322, S52 y S60. El término "sitio de O-glicosilación in vivo de origen natural" incluye las posiciones S52 y S60, mientras que el término "sitio de N-glicosilación in vivo de origen natural" incluye posiciones N145 y N322.
Por tanto, en una realización muy interesante de la invención, el resto no polipéptido es un resto de azúcar y el grupo de unión introducido es un sitio de glicosilación, preferiblemente un sitio de glicosilación in vivo, tal como un sitio de O-glicosilación in vivo o un sitio de N-glicosilación in vivo, de forma particular un sitio de N-glicosilación in vivo. De forma típica se han introducido de 1 a 10 sitios de glicosilación, de forma particular sitios de N-glicosilación in vivo, preferiblemente de 1 a 8, de 1 a 6, de 1 a 4 ó de 1 a 3 sitios de glicosilación, de forma particular sitios de N-glicosilación in vivo, en una o más posiciones localizadas fuera del dominio de Gla. Por ejemplo se pueden haber introducido 1, 2 ó 3 sitios de glicosilación, de forma particular sitios de N-glicosilación in vivo, fuera del dominio de Gla, preferiblemente por sustitución.
Se entenderá que con el fin de preparar una variante de polipéptido en la que la variante de polipéptido comprende uno o más sitios de glicosilación, la variante de polipéptido debe expresarse en una célula huésped capaz de unir restos de azúcar (oligosacáridos) en el(los) sitio(s) de glicosilación o de forma alternativa sometida a glicosilación in vitro. Se dan ejemplos de células huésped de glicosilación en la sección posterior titulada "Acoplamiento a un resto de azúcar".
Ejemplos de posiciones en las que los sitios de glicosilación, de forma particular sitios de N-glicosilación in vivo, se puede introducir incluyen residuos de aminoácidos que presentan al menos 25% de su cadena lateral expuesta a la superficie (como se define en el ejemplo 1 de la presente invención), tal como al menos el 50% de la cadena lateral expuesta a la superficie. La posición se selecciona preferiblemente de una parte de la molécula que esté localizada fuera del sitio de unión del factor de tejido y/o la región de sitio activo y/o fuera del reborde de la hendidura del sitio activo, como se define en el ejemplo 1 de la presente invención. Se debería entender que cuando se usa el término "al menos 25% (o al menos el 50%) de su cadena lateral expuesta a la superficie" en relación con introducción de un sitio de N-glicosilación in vivo, este término se refiere a la accesibilidad de la superficie de la cadena lateral de aminoácido en la posición donde el resto de azúcar está realmente unido. En muchos casos será necesario introducir un residuo de serina o un residuo de treonina en la posición +2 respecto al residuo de asparagina al que el resto de azúcar está realmente unido, y se permite que estas posiciones donde se introducen los residuos de serina o treonina estén ocultas, es decir, tengan menos del 25% de sus cadenas laterales expuestas en la superficie.
Ejemplos específicos y preferidos de tales sustituciones que generan un sitio de N-glicosilación in vivo incluyen una sustitución seleccionada del grupo constituido por A51N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, I205S, I205T, V253N, T267N, T267N+S269T, S314N+K316S, S314N+K316T, R315N+V317S, R315N+V317T, K316N+G318S, K316N+G318T, G318N, D334N y combinaciones de los mismos. Más preferiblemente el sitio de N-glicosilación in vivo es introducido con una sustitución seleccionada del grupo constituido por A51N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, I205T, V253N, T267N+S269T, S314N+K316T, R315N+V317T, K316N+G318T, G318N, D334N y combinaciones de los mismos. Incluso más preferiblemente el sitio de N-glicosilación in vivo es introducido con una sustitución seleccionada del grupo constituido por T106N, A175T, I205T, V253N, T267N+S269T y combinaciones de los mismos, de forma particular uno, dos o tres de T106N, I205T y V253N.
En una realización sólo un sitio de N-glicosilación in vivo se ha introducido mediante sustitución. En otra realización se han introducido dos o más (tal como dos) sitios de N-glicosilación in vivo mediante sustitución. Ejemplos de sustituciones preferidas que generan dos sitios de N-glicosilación in vivo incluyen sustituciones seleccionadas del grupo constituido por A51N+G58N, A51N+T106N, A51N+K109N, A51N+G124N, A51N+K143N+N145T, A51N+A175T, A51N+I205T, A51N+V253N, A51N+T267N+S269T, A51N+S314N+K316T, A51N+R315N+V317T, A51N+K316N+G318T, A51N+G318N, A51N+D334N, G58N+T106N, G58N+K109N, G58N+G124N, G58N+K143N+N145T, G58N+A175T-, G58N+I205T, G58N+V253N, G58N+T267N+S269T, G58N+S314N+K316T, G58N+R315N+V317T, G58N+K316N+G318T, G58N+G318N, G58N+D334N, T106N+K109N, T106N+G124N, T106N+K143N+N145T, T106N+A175T, T106N+I205T, T106N+V253N, T106N+T267N+S269T, T106N+S314N+K316T, T106N+R315N+V317T, T106N+K316N+G318T, T106N+G318N, T106N+D334N, K109N+G124N, K109N+K143N+N145T, K109N+A175T, K109N+I205T, K109N+V253N, K109N+T267N+S269T, K109N+S314N+K316T, K109N+R315N+V317T, K109N+K316N+G318T, K109N+G318N, K109N+D334N, G124N+K143N+N145T, G124N+A175T, G124N+I205T, G124N+V253N, G124N+T267N+S269T, G124N+S314N+K316T, G124N+R315N+V317T, G124N+K316N+G318T, G124N+G318N, G124N+D334N, K143N+N145T+A175T, K143N+N145T+I205T, K143N+N145T+V253N, <BR> <BR> K143N+N145T+T267N+S269T, K143N+N145T+S314N+K316T,<BR> K143N+N145T+R315N+V317T, K143N+N145T+K316N+G318T, K143N+N145T+G318N, K143N+N145T+D334N, A175T+I205T, A175T+V253N, A175T+T267N+S269T, <BR> <BR> A175T+S314N+K316T, A175T+R315N+V317T, A175T+K316N+G318T, A175T+G318N, A175T+D334N, I205T+V253N, I205T+T267N+S269T, I205T+S314N+K316T, I205T+R315N+V317T, I205T+K316N+G318T, I205T+G318N, I205T+D334N, V253N+T267N+S269T, V253N+S314N+K316T, V253N+R315N+V317T, V253N+K316N+G318T, V253N+G318N, V253N+D334N, T267N+S269T+S314N+K316T, T267N+S269T+R315N+V317T, T267N+S269T+K316N+G318T, T267N+S269T+G318N, T267N+S269T+D334N, S314N+K316T+R315N+V317T, S314N+K316T+G318N, S314N+K316T+D334N, R315N+V317T+K316N+G318T, R315N+V317T+G318N, R315N+V317T+D334N y G318N+D334N. Más preferiblemente las sustituciones se seleccionan del grupo constituido por T106N+A175T, T106N+I205T, T106N+V253N, T106N+T267N+S269T, A175T+I205T, A175T+V253N, A175T+T267N+S269T, I205T+V253N, I205T+T267N+S269T y V253N+T267N+S269T, incluso más preferiblemente del grupo constituido por T106N+I205T, T106N+V253N y I205T+V253N.
En una realización adicional se han introducido tres o más (tal como tres) sitios de N-glicosilación in vivo mediante sustitución. Ejemplos de sustituciones preferidas que generan tres sitios de N-glicosilación in vivo incluyen sustituciones seleccionadas del grupo constituido por I205T+ V253N+T267N+S269T y T106N+I205T+V253N.
Como se describió anteriormente se prefiere que el sitio de N-glicosilación in vivo se introduzca en una posición que no forme parte del sitio de unión del factor de tejido, la región del sitio activo o el reborde de la hendidura de unión del sitio de activo como se define en la presente invención.
Se entenderá que cualquiera de las modificaciones citadas en las secciones anteriores se pueden combinar entre ellas, además de combinarse con las sustituciones anteriormente descritas en posición 34 y/o 36, de forma particular A34E/L y/o R36E, y preferiblemente en combinación con las sustituciones anteriormente descritas en posición 10 y/o 32, de forma particular P1OQ y/o K32E. Entre las modificaciones anteriormente identificadas para introducción de un sitio de N-glicosilación in vivo, modificaciones preferidas incluyen uno, dos o tres de T106N, I205T y V253N, de forma particular dos de estas modificaciones, es decir T106N+I205T, T106N+V253N o I205T+V253N.
Por tanto en una realización preferida de la invención la variante de FVII o FVIIa comprende las modificaciones P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+I205T.
En una realización preferida adicional la variante FVII o FVIIa comprende las modificaciones P10Q+K32E+
A34E+R36E+T106N+V253N.
En una realización preferida adicional la variante FVII o FVIIa comprende las modificaciones P10Q+K32E+
A34E+R36E+I205T+V253N.
En una realización preferida adicional la variante FVII o FVIIa comprende las modificaciones P10Q+K32E+
A34L+T106N+I205T.
En una realización preferida adicional la variante FVII o FVIIa comprende las modificaciones P10Q+K32E+
A34L+T106N+V253N.
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En una realización preferida adicional la variante FVII o FVIIa comprende las modificaciones P10Q+K32E+
A34L+I205T+V253N.
En una realización preferida adicional la variante FVII o FVIIa comprende las modificaciones P10Q+K32E+
A34L+R36E+T106N+I205T.
En una realización preferida adicional la variante FVII o FVIIa comprende las modificaciones P10Q+K32E+
A34L+R36E+T106N+V253N.
En una realización preferida adicional la variante FVII o FVIIa comprende las modificaciones P10Q+K32E+
A34L+R36E+I205T+V253N.
Como también se explica anteriormente, una cualquiera o más de tres modificaciones se pueden combinar además con inserción de al menos un residuo de aminoácido, de forma típica un residuo de aminoácido único, entre la posición 3 y 4, donde el residuo insertado es preferiblemente un residuo de aminoácido hidrófobo. Lo más preferiblemente la inserción es A3AY. Por tanto, en realizaciones adicionales preferidas de la invención la variante de FVII o FVIIa comprende modificaciones seleccionadas de:
A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+I205T;
A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+V253N;
A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36E+I205T+V253N;
A3AY+P10Q+K32E+A34L+T106N+I205T;
A3AY+P10Q+K32E+A34L+T106N+V253N;
A3AY+P10Q+K32E+A34L+I205T+V253N;
A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+I205T;
A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+V253N;
A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36E+I205T+V253N.
Otras modificaciones fuera del domino de Gla
En una realización adicional de la presente invención, la variante de FVII o FVIIa puede, además de las modificaciones descritas en las secciones anteriores, contener también mutaciones que ya se sabe que aumentan la actividad intrínseca del polipéptido, por ejemplo, las descritas en el documento WO 02/22776.
Por ejemplo, la variante puede comprenden al menos una modificación en una posición seleccionada del grupo constituido por 157, 158, 296, 298, 305, 334, 336, 337 y 374. Ejemplos de sustituciones preferidas incluyen sustituciones seleccionadas del grupo constituido por V158D, E296D, M298Q, L305V y K337A. Más preferiblemente dichas sustituciones se seleccionan del grupo constituido por V158D+E296D+M298Q+L305V+K337A, V158D+E296D+M298Q+K337A, V158D+E296D+M298Q+L305V, V158D+E296D+M298Q, M298Q, L305V+
K337A, L305V y K337A.
En una realización adicional de la presente invención, la variante de FVII o FVIIa puede, además de las modificaciones descritas en las secciones anteriores, contener también otras mutaciones, tales como la sustitución K341Q descrita por Neuenschwander y col, Biochemistly, 1995; 34: 8701-8707. Otras posibles sustituciones adicionales incluyen D196K, D196N, G237L, G237GAA y combinaciones de los mismos.
Se encuentra información detallada adicional de la conjugación de variantes de FVII y FVIIa con restos no polipéptidos en los documentos WO 01/58935 y WO 03/093465, a los cuales se hace referencia y se incorporan a la presente invención como referencia.
Procedimientos de preparación de una variante conjugada de la invención
En general se puede producir una variante conjugada de acuerdo con la invención cultivando una célula huésped apropiada en conducciones conductoras para la expresión de el polipéptido variante, y recuperación del polipéptido variante, en la que a) el polipéptido variante comprende al menos un sitio de N-glicosilación u O-glicosilación y la célula huésped es una célula huésped eucariótica capaz de glicosilación in vivo, y/o b) el polipéptido variante se somete a conjugación con un resto no polipéptido in vitro.
Conjugación con una molécula de polímero
La molécula de polímero que se va a acoplar con el polipéptido variante puede ser cualquier molécula de polímero adecuada, tal como un homopolímero o heteropolímero natural o sintético, de forma típica con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 300 a 100.000 Da, tal como aproximadamente 500 a 20.000 Da, más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 500 a 15.000 Da, incluso más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 2 a 12 kDa, tal como en el intervalo de aproximadamente 3 a 10 kDa. Cuando el término "aproximadamente" se usa en la presente invención en relación con un cierto peso molecular, la palabra "aproximadamente" indica un peso molecular medio aproximado y refleja el hecho de que será normalmente una cierta distribución de peso molecular en una preparación de polímero dada.
Ejemplos de homopolímeros incluyen un poliol (es decir, poli-OH), una poliamina (es decir, poli-NH_{2}) y un ácido policarboxílico (es decir, poli-COOH). Un heteropolímero es un polímero que comprende diferentes grupos de acoplamiento, tal como un grupo hidroxilo y un grupo amina.
Ejemplos de moléculas de polímero adecuadas incluyen moléculas de polímero seleccionadas del grupo constituido por poli(óxido de alquileno) (PAO), incluyendo polialquilenglicol (PAG), tal como polietilenglicol (PEG) y polipropilenglicol (PPG), PEG ramificados, poli(alcohol vinílico) (PVA), policarboxilato, poli(vinilpirrolidona), polietileno-co-anhídrido de ácido maleico, poliestireno-co-anhídrido de ácido maleico, dextrán, incluyendo carboximetil-dextrán, o cualquier otro biopolímero adecuado para reducir inmunogenicidad y/o aumentar la vida media in vivo funcional y/o vida media en suero. Otro ejemplo de una molécula de polímero es albúmina humana u otra proteína abundante en plasma. Por lo general los polímeros derivados de polialquilenglicol son biocompatibles, no tóxicos, no antigénicos, no inmunogénicos, solubles en agua y son fácilmente excretados de organismos vivos.
PEG es la molécula de polímero preferida debido a que tiene sólo pocos grupos reactivos capaces de reticularse en comparación con, por ejemplo, polisacáridos tales como dextrán. De forma particular es de interés PEG monofuncional, por ejemplo, metoxipolietilenglicol (mPEG), debido a que su química de acoplamiento es relativamente simple (sólo un grupo reactivo se encuentra disponible para conjugación con grupos de unión en el polipéptido). En consecuencia cuando se elimina el riesgo de reticulación las variantes conjugadas resultantes son más homogéneas y la reacción de las moléculas de polímero con el polipéptido variante es más fácil de controlar.
Para efectuar la unión covalente de la(s) molécula(s) de polímero(s) con el polipéptido variante, los grupos terminales hidroxilo de la molécula de polímero se deben proporcionar en forma activada, es decir, con grupos funcionales reactivos (ejemplos de estos incluyen grupos amino primarios, hidrazida (HZ), tiol, succinato (SUC), succinimidilosuccinato (SS), succinimidilsuccinamida (SSA), succinimidilpropionato (SPA), succinimidilbutirato (SBA), succinimidilcarboximetilato (SCM), benzotriazolcarbonato (BTC), N-hidroxisuccinimida (NHS), aldehído, nitrofenilcarbonato (NPC), y tresilato (TRES)). Se encuentran comercialmente disponibles moléculas de polímero activadas adecuadas, por ejemplo, de Nektar Therapeutics, Huntsville, AL, EEUU, o de PolyMASC Pharmaceuticals plc, Reino Unido.
Se describen ejemplos específicos de moléculas de polímero lineales o ramificadas activadas para uso en la presente invención en el catálogo 2003 de Nektar Molecule Engineering (Nektar Therapeutics), incorporado a la presente invención como referencia.
Ejemplos específicos de polímeros de PEG activados incluyen los siguientes PEG lineales: NHS-PEG (por ejemplo SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, y SCM-PEG), y NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG, y MAL-PEG, y PEG ramificados tales como PEG2-NHS y los descritos en los documentos US 5.932.462 y US 5.643.575, ambos se incorporan a esta referencia como referencia. Se enumeran publicaciones adicionales que describen moléculas de polímero útiles, químicas de PEGilación y procedimientos de conjugación en los documentos WO 01/58935 y WO 03/093465.
Ejemplos específicos de polímeros de PEG activados particularmente preferidos para acoplamiento de residuos de cisteína, incluyen los siguientes PEG lineales: vinilsulfona-PEG (VS-PEG), preferiblemente vinilsulfona-mPEG (VS-mPEG); maleimida-PEG (MAL-PEG), preferiblemente maleimida-mPEG (MAL-mPEG) y ortopiridil-disulfuro-PEG (OPSS-PEG), preferiblemente ortopiridil-disulfuro-mPEG (OPSS-mPEG). Típicamente, tales polímeros de PEG o mPEG tendrán un tamaño de aproximadamente 5 kDa, aproximadamente 10 kD, aproximadamente 12 kDa o aproximadamente 20 kDa.
El especialista en la técnica estará seguro de que el procedimiento de activación y/o química de conjugación que se va a usar depende de (de los) grupo(s) de unión del polipéptido variante (se dan ejemplos más adelante), así como también de los grupos funcionales del polímero (que son, por ejemplo, amina, hidroxilo, carboxilo, aldehído, sulfidrilo, succinimidilo, maleimida, vinilsulfona o haloacetato). La PEGilación puede estar dirigida a la conjugación de todos los grupos de unión disponibles en el polipéptido variante (es decir, tales grupos de unión que están expuestos en la superficie del polipéptido) o se puede dirigir hacia uno o más grupos de unión específicos, por ejemplo, el grupo amino N-terminal como se describe en el documento US 5.985.265 o a residuos de cisteína. Además la conjugación se puede conseguir en una etapa o en etapas (por ejemplo, como se describe en el documento WO 99/55377).
Para PEGilación en residuos de cisteína (véase anteriormente) la variante de FVII o FVIIa se trata normalmente con un agente reductor, tal como ditiotreitol (DDT) antes de la PEGilación. El agente reductor se elimina subsiguientemente mediante cualquier procedimiento convencional, tal como por desalación. La conjugación de PEG con un residuo de cisteína tiene lugar de forma típica en un tampón adecuado a pH 6 a 9 a temperaturas que varían de 4ºC a 25ºC durante periodos de hasta 16 horas.
Se entenderá que la PEGilación se plantea de modo que produzca la molécula óptima respecto al número de moléculas de PEG unidas, el tamaño y forma de tales moléculas (por ejemplo, si estas son lineales o ramificadas), y el (los) sitio(s) de unión en el polipéptido variante. El peso molecular del polímero que se va a usar puede seleccionarse, por ejemplo, en base al efecto deseado a conseguir.
En relación con la conjugación con sólo un grupo de unión único en la proteína (por ejemplo, el grupo amino N-terminal), puede ser ventajoso que la molécula de polímero, que puede ser lineal o ramificada, presente un peso molecular alto, preferiblemente aproximadamente de 10 a 25 kDa, tal como aproximadamente de 15 a 25 kDa, por ejemplo, aproximadamente 20 kDa.
Normalmente la conjugación del polímero se lleva a cabo en condiciones que hacen reaccionar con las moléculas de polímero cuantos grupos de unión al polímero disponibles como sea posible. Esto se consigue con un exceso molar adecuado del polímero respecto al polipéptido. De forma típica, las relaciones molares de moléculas de polímero activadas respecto a polipéptidos son de hasta aproximadamente 1000 a 1, tal como hasta aproximadamente 200 a 1, o de hasta aproximadamente 100 a 1. No obstante, en algunos casos la relación puede ser un poco menor, de hasta aproximadamente 50-1,10-1, 5-1, 2-1 ó 1-1 con el fin de obtener reacción óptima.
También se contempla de acuerdo con la invención acoplar las moléculas de polímero con el polipéptido mediante un conector. Son bien conocidos conectores adecuados por el especialista en la técnica; véase también el documento WO 01/58935.
Subsiguientemente a la conjugación se bloquean moléculas de polímero activadas residuales de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante adición de amina primaria a la mezcla de reacción, y las moléculas de polímero inactivadas resultantes se eliminan mediante un procedimiento adecuado.
Se entenderá que en función de las circunstancias, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante, la naturaleza del compuesto de PEG activado que se usa y las condiciones de PEGilación específicas, incluyendo la relación molar de PEG a polipéptido, se pueden obtener grados variables de PEGilación, obteniéndose en general un grado mayor de PEGilación con una relación mayor de PEG a variante polipéptido. Los polipéptidos variante PEGilados resultantes de cualquier procedimiento de PEGilación dado comprenderá, normalmente, una distribución estocástica de variantes de polipéptido conjugadas que presentan grados ligeramente diferentes de PEGilación.
Acoplamiento con un resto de azúcar
Con el fin de conseguir la glicosilación in vivo de una molécula de FVII que comprende uno o más sitios de glicosilación se debe insertar la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido variante en un huésped de expresión eucariótico glicosilante. La célula huésped de expresión se puede seleccionar de células de hongos (hongos filamentosos o levadura), de insecto o animales o de células de plantas transgénicas. En una realización la célula de huésped es una célula de mamífero, tal como una célula de CHO, BHK o HEK, por ejemplo, HEK 293, célula, o una célula de insecto, tal como una célula SF9, o una célula de levadura, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris, o cualquiera de las células huésped citadas en adelante.
Se puede usar también acoplamiento in vitro covalente de restos de azúcar (tal como dextrán) con residuos de aminoácido del polipéptido variante, por ejemplo, como se describe por ejemplo en el documento WO 87/05330 y en Aplin y col., CRC Crit Rev. Biochem, páginas 259-306, 1981. Véase también el documento WO 03/093465 para más información sobre glicosilación in vitro de variantes de FVII o FVIIa.
Unión de inhibidor de serinproteasa
La unión de un inhibidor de serinproteasa se puede realizar de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 96/12800.
Procedimientos de preparación de una variante de polipéptido de la invención
La variante de polipéptido de la presente invención, de forma opcional en forma glicosilada, se puede producir por cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Tales procedimientos incluyen la construcción de una secuencia de nucleótidos que codifica la variante de polipéptido y que expresa la secuencia de un huésped transformado o transfectado adecuado. Preferiblemente la célula huésped es una célula huésped gamma-carboxilante tal como una célula de mamífero. Sin embargo las variantes de polipéptido de la invención se pueden producir, si bien menos eficientemente, por síntesis química o una combinación de síntesis química o una combinación de síntesis química y tecnología de ADN recombinante.
Se puede construir una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención mediante aislamiento o síntesis de una secuencia de nucleótidos que codifica el FVII padre, tal como hFVII con la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº: 1 y luego cambiar la secuencia de nucleótidos de modo que se efectúe la introducción (es decir, inserción o sustitución) o eliminación (es decir, deleción o sustitución) del (de los) residuo(s) de aminoácido relevante(s).
La secuencia de nucleótidos es modificada convenientemente por mutagénesis dirigida al sitio de acuerdo con procedimientos convencionales. De forma alternativa, la secuencia de nucleótidos se prepara mediante síntesis química, por ejemplo, usando un sintetizador de oligonucleótidos, en el que se diseñan oligonucleótidos basados en la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado, y preferiblemente se selecciona aquellos codones que son favorecidos en la célula huésped en la que se producirá el polipéptido recombinante. Por ejemplo se pueden sintetizar varios oligonucleótidos de pequeño tamaño que codifica porciones del polipéptido deseado y ensamblarse mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa), ligadura o reacción en cadena por ligadura (LCR) (Barany, Proc Natl Acad Sci EEUU 88: 189-193, 1991). Los oligonucleótidos individuales contienen típicamente protuberancias en 5' o 3' para ensamblaje complementario.
Una vez ensamblado (por síntesis, mutagénesis dirigida al sitio u otro procedimiento), la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido se inserta en un vector recombinante y se une operativamente a secuencias de control necesarias para expresión del FVII en la célula huésped transformada deseada.
Los especialistas en la técnica serán capaces de seleccionar vectores adecuados, secuencias de control de la expresión y huéspedes para expresión del polipéptido. El vector recombinante puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector, que existe como una entidad extracromosomal, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. De forma alternativa el vector es tal que cuando se introduce en una célula huésped se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el (los) cromosoma(s) en el (los) que se ha integrado.
El vector es preferiblemente un vector de expresión, en el que la secuencia de nucleótidos que codifican la variante de polipéptido de la invención se une de forma operativa a segmentos adicionales requeridos para transcripción de la secuencia de nucleótidos. El vector se deriva de forma típica del plásmido o ADN viral. Se encuentran comercialmente disponibles un número de vectores de expresión adecuados para expresión en las células huésped citadas en la presente invención o se describen en la bibliografía. Se puede encontrar información detallada sobre vectores adecuados para expresión de FVII en el documento WO 01/58935, incorporado a la presente invención como referencia.
El término "secuencias de control" se define en la presente invención incluyendo todos los componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión de la variante de polipéptido de la invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña respecto a la secuencia del ácido nucleico que codifica la variante de polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, pero sin limitarse a estas, una secuencia líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, potenciador o secuencia de activación aguas arriba, secuencia de péptido de señal, y terminador de transcripción. Como mínimo las secuencias de control incluyen un promotor.
Se pueden usar una amplia variedad de secuencias de control de expresión en la presente invención, por ejemplo, cualquiera de las secuencias de control descritas en el documento WO 01/58935, incorporado como referencia.
La secuencia de nucleótidos de la invención que codifica una variante de polipéptido, ya sea preparada por mutagénesis dirigida al sitio, síntesis, PCR u otros procedimientos, puede incluir opcionalmente una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de señal. El péptido de señal está presente cuando la variante de polipéptido se va a secretar de las células en las que se expresa. Tal péptido de señal, en caso de estar presente, debería ser uno reconocido por la célula seleccionada para expresión de la variante del polipéptido. El péptido de señal puede ser homólogo (es decir, asociado normalmente con hFVII) o heterólogo (es decir, se origina de otra fuente distinta de hFVII) respecto al polipéptido o puede ser homóloga o heteróloga respecto a la célula huésped, es decir, un péptido de señal expresado normalmente en la célula huésped o uno que normalmente no se expresa en la célula huésped. Para información adicional sobre péptidos de señal adecuados véase el documento WO 01/58935.
Se puede usar cualquier huésped adecuado para producir la variante de polipéptido, incluyendo bacterias (si bien no particularmente preferidas), hongos (incluyendo levaduras), planta, insecto, mamífero, u otras células o líneas celulares animales apropiadas, así como también animales transgénicos o plantas. Se prefieren células de mamíferos. Ejemplos de células huésped bacterianas incluyen bacterias gram-positivas tales como cepas de Bacillus, por ejemplo, B. brevis o B. subtilis, Pseudomonas o Streptomyces, o bacterias gram-negativas, tales como cepas de E. coli. Ejemplos de células huésped de hongos filamentosas adecuadas incluyen cepas de Aspergillus, por ejemplo, A. oryzae, A. niger, o A. nidulans, Fusarium o Trichoderma. Ejemplos de células huésped de levadura adecuadas incluyen cepas de Saccharomyces, por ejemplo S. cerevisiae, Schizosaccharomyces, Klyveromyces, Pichia, tales como P. pastoris o P. methanolica, Hansenula, tal como H. Polymorpha o Yarrowia. Ejemplos de células huésped de insectos adecuadas incluyen una línea celular de Lepidoptora, tal como Spodoptera frugiperda (Sf9 o Sf21) o células de Trichoplusioa ni (High Five) (documento US 5.077.214). Ejemplos de células huésped de mamífero adecuadas incluyen líneas celulares de ovario del hámster chino (CHO), (por ejemplo, CHO-K1; ATCC CCL-61), líneas celulares de mono verde (COS) (por ejemplo, COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); células de ratón (por ejemplo, NS/O), líneas celulares de riñón de cría de hámster (BHK) (por ejemplo, ATCC CRL-1632 o ATCC CCL-10), y células humanas (por ejemplo, HEK 293 (ATCC CRL-1573)). Se conocen en la técnica líneas celulares adecuadas adicionales de acceso público tales como American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. También se pueden modificar células de mamífero, tales como una célula CHO, para expresar sialiltransferasa, por ejemplo, 1,6-sialiltransferasa, por ejemplo, como se describe en el documento US 5.047.335, con el fin de proporcionar mejor glicosilación de la variante de polipéptido.
Con el fin de aumentar la secreción puede ser de interés particular producir la variante de polipéptido de la invención junto con una endoproteasa, de forma particular un PACE (enzima de transformación de aminoácido básico emparejado) (por ejemplo, como se describe en el documento US 5.986.079), tal como una endoproteasa Kex2 (por ejemplo, como se describe en el documento WO 00/28065).
Se encuentran procedimientos para la introducción de ADN exógeno en los tipos de células anteriores, así como también otra información relativa a expresión, producción y purificación de variantes de FVII, en el documento WO 01/58935, incorporado a la presente invención como referencia.
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Composición farmacéutica de la invención y su uso
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición, de forma particular a una composición farmacéutica, que comprende una variante de polipéptido de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Se puede usar como un medicamento la variante de polipéptido o la composición farmacéutica de acuerdo con la invención.
Debido a las propiedades mejoradas citadas anteriormente, las variantes de polipéptido de la invención, o la composición farmacéutica de la invención, son particularmente útiles para el tratamiento de eventos hemorrágicos incontrolables en pacientes con trauma, pacientes trombocitopénicos, pacientes en tratamiento anticoagulante, y pacientes de cirrosis con hemorragia varicela, u otras hemorragias gastrointestinales superiores, en pacientes que sufren transplantes de hígado ortopédico o rechazo de hígado (permitiendo cirugía sin transfusión), o en pacientes con hemofilia.
Se define trauma como un daño al tejido vivo provocado por un agente extrínseco. Se trata de la cuarta causa de muerte en los Estados Unidos y supone una gran carga financiera sobre la economía.
El trauma se clasifica bien como interno o penetrante. El trauma interno da lugar a una compresión interna, daño de órgano y hemorragia interna mientras que el trauma penetrante (como la consecuencia de un agente que penetra en el cuerpo y destruye el tejido, vasos y órganos) da lugar a hemorragia externa.
El trauma puede ser provocado por numerosos eventos, por ejemplo, accidentes de tráfico, heridas de armas de fuego, caídas, accidentes con máquinas y heridas de arma blanca.
La cirrosis de hígado puede ser provocada por lesión directa de hígado, incluyendo alcoholismo crónico, hepatitis viral crónica (tipos B, C, y D), y hepatitis autoinmune así como también por lesión indirecta mediante lesión del conducto biliar, incluyendo cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria y atresia biliar. Causas menos comunes de cirrosis incluyen lesión directa del hígado por enfermedad sin herida tal como fibrosis cística, deficiencia de alfa-1-antitripsina, hemocromatosis, enfermedad de Wilson, galactosemia, y enfermedad por depósito de glucógeno.
El transplante es la intervención clave para el tratamiento de pacientes cirróticos en fase tardía.
Por tanto, en un aspecto adicional la presente invención se refiere a una variante de polipéptido de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o trastornos en los que es deseable la formación de coágulos. La presente invención también se refiere de la variantes de la invención para uso en un procedimiento para el tratamiento de un mamífero que presenta una enfermedad o trastorno en el que se desea la formación de coágulos, que comprende la administración a un mamífero en necesidad del mismo de una cantidad efectiva de la variante de polipéptido o la composición farmacéutica de la invención.
Ejemplos de enfermedades/trastornos en los que es deseable la mayor formación de coágulos incluyen, pero sin limitarse a estos, hemorragias, incluyendo hemorragias cerebrales, así como también pacientes con hemorragias no controladas graves, tales como trauma. Ejemplos adicionales incluyen pacientes que sufren de transplantes vivos, pacientes que sufren rechazo y pacientes con hemorragia variceal. Otra enfermedad/trastorno ampliamente presente en el que se contempla que los polipéptidos de la invención serán útiles para mayor formación de coágulos es hemofilia, por ejemplo, enfermedad de Willebrand, hemofilia A, hemofilia B o hemofilia C.
Las variantes de polipéptido de la invención se administran a pacientes en una dosis terapéuticamente efectiva, normalmente una dosis aproximadamente paralela a la usada en terapia con rFVII tal como NovoSeven®, o en menor dosificación. Por "dosis terapéuticamente efectiva" en la presente invención se entiende una dosis que es suficiente para producir los efectos deseados en relación con la afección para la que se administra. La dosis exacta dependerá de las circunstancias y será determinada por un especialista en la técnica usando técnicas conocidas. Normalmente la dosis debería ser capaz de prevenir o reducir la gravedad o amplitud de la afección o trastorno en tratamiento. Será evidente para los especialistas en la técnica que una cantidad efectiva de una variante de polipéptido o composición de la invención depende, entre otros, de la enfermedad, la dosis, el programa de administración, si la variante de polipéptido o composición se administra sólo o junto con otros agentes terapéuticos, la vida media en plasma de las composiciones, y la salud general del paciente.
La variante de polipéptido de la invención se administra preferiblemente en una composición que incluye un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. "Farmacéuticamente aceptable" significa un vehículo o excipiente que no provoca efecto indeseable adverso alguno en pacientes a los que se administra. Tales vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables así como también procedimientos de formulación farmacéutica adecuados son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer y L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3ª edición, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]).
La variante de polipéptido de la invención se puede usar "como tal" y/o en una forma de sal de la misma. Sales adecuadas incluyen, pero sin limitarse a estas, sales con metales alcalinos o metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, calcio y magnesio, así como también, por ejemplo, sales de cinc. Estas sales o complejos pueden estar presentes como una estructura cristalina y/o amorfa.
La composición farmacéutica de la invención se puede administrar sola o junto con otros agentes terapéuticos. Estos agentes se pueden incorporar como parte de la misma composición farmacéutica o se puede administrar por separado de la variante de polipéptido de la invención, bien de forma concurrente o de acuerdo con otro calendario de tratamiento. Además la variante de polipéptido o composición farmacéutica de la invención se puede usar como un adyuvante en otras terapias.
Un "paciente" para los fines de la presente invención incluye tanto humanos como otros mamíferos. Por tanto las variantes de la invención son aplicables tanto a terapia humana como a aplicaciones veterinarias, de forma particular a terapia humana.
La composición farmacéutica que comprende la variante de polipéptido de la invención se puede formular en una variedad de formas, por ejemplo, como un líquido, gel o como un sólido liofilizado o comprimido. La forma preferida dependerá de la indicación particular que se trata y será evidente para un especialista en la técnica.
De forma particular la composición farmacéutica que comprende la variante de polipéptido de la invención se puede formular en forma liofilizada o soluble estable. La variante de polipéptido se puede liofilizar con una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. La variante de polipéptido puede estar en una forma soluble estable con la eliminación o protección de sitios de degradación proteolítica como se describe en la presente invención. La ventaja de obtener una preparación soluble estable se basa en manipulación más fácil para el paciente y, en el caso de emergencias, acción más rápida, que puede llegar potencialmente a salvar la vida. La forma preferida dependerá de la indicación particular que se trate y será evidente para un especialista en la técnica.
La administración de las formulaciones de la presente invención se puede llevar a cabo en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a estas, por vía oral, subcutánea, intravenosa, intracerebral, intranasal, transdérmica, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal, intraocular, o de cualquier otra forma aceptable. Las formulaciones se pueden administrar de forma continua por infusión, si bien es aceptable la inyección de bolo, usando técnicas bien conocidas en la técnica, tales como bombas o implante. En algunos ejemplos las formulaciones se pueden administrar directamente como una solución o pulverización.
Parentales
Un ejemplo preferido de una composición farmacéutica es una solución, de forma particular una solución acuosa, diseñada para administración por vía parenteral. Si bien en muchos casos se proporcionan las formulaciones de la solución farmacéutica en forma líquida, apropiada para uso inmediato, tales formulaciones para vía parenteral se pueden proporcionar también en forma congelada o liofilizada. En el primer caso, la composición se debe descongelar antes del uso. En el segundo caso se usa frecuentemente para mejorar la estabilidad del compuesto activo contenido en la composición bajo una amplia variedad de afecciones por depósito, ya que se reconoce por los especialistas en la técnica que las preparaciones liofilizadas son por lo general más estables que sus contrapartidas líquidas. Tales preparaciones liofilizadas son reconstituidas antes del uso con la adición de uno o más diluyentes farmacéuticamente aceptables adecuadas tales como agua estéril para inyección o solución salina fisiológica estéril.
En el caso de preparaciones para vía parenteral, estas se preparan para almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mediante mezcla, según sea apropiado, la variante de polipéptido que presenta el grado deseado de pureza con uno o más vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables usados de forma típica en la técnica (todos ellos se denominan "excipientes"), por ejemplo, agentes tamponantes, agentes estabilizantes, conservantes, isotonificantes, tensioactivos no iónicos o detergentes, antioxidantes, y/o otros aditivos misceláneos tales como complementos o cargas, agentes quelantes, antioxidantes y codisolventes.
Se encuentra información detallada sobre formulaciones para vía parenteral adecuadas para administración de variantes de FVII, así como también preparaciones de liberación sostenida, en los documentos WO 01/58935 y WO 03/093465, incorporados como referencia a la presente invención.
La invención se describe adicionalmente con los siguientes ejemplos no limitantes.
Materiales y procedimientos Región de sitio activo
La región de sitio activo se define como cualquier residuo que presenta al menos un átomo dentro de 10 \ring{A} de cualquier átomo en la triada catalítica (residuos H193, D242, S344).
Medida de la sensibilidad reducida a degradación proteolítica
La degradación proteolítica se puede medir usando el ensayo descrito en el documento US 5.580.560, ejemplo 5, donde la proteólisis es autoproteólisis.
Además se puede ensayar la proteólisis reducida en un modelo in vivo usando muestras radiomarcadas y comparando proteólisis de rhFVIIa y la variante de polipéptido de la invención mediante muestras de sangre resistentes y sometiendo estas a SDS-PAGE y autorradiografía.
Independientemente del ensayo usado para la determinación de la degradación proteolítica, "degradación proteolítica reducida" se pretende que signifique una reducción medible en escisión en comparación con la obtenida con rhFVIIa medido por barrido en gel de geles SDS-PAGE tintados con Coomassie, HPLC o medido por actividad catalítica conservada en comparación con tipo salvaje usando el ensayo de actividad independiente del factor de tejido descrito a continuación.
Determinación del peso molecular de variantes de polipéptido
El peso molecular de las variantes de polipéptido se determina bien por SDS-PAGE, filtración en gel, Western Blots, espectrometría de masas por desorción láser asistida por matriz o centrifugación en equilibrio, por ejemplo, SDS-PAGE de acuerdo con Laemmli, U. K., Nature Volumen 227 (1970), páginas 680-85.
Determinación de la afinidad de unión de la membrana fosfolípida
Se puede determinar la afinidad de unión de la membrana fosfolípida como se describe en Nelsestuen y col., Biochemistry, 1977; 30; 10819-10824 o como se describe en el ejemplo 1 en el documento US 6.017.882.
Ensayo de activación de factor X independiente de TF
Este ensayo se ha descrito con detalle en la página 39826 en Nelsestuen y col., J Biol Chem, 2001; 276: 39825-39831.
Brevemente, la molécula que se va a ensayar (bien hFVIIa; rhFVIIa o la variante de polipéptido de la invención en su forma activada) se mezcla con una fuente de fosfolípidos (preferiblemente fosfatidilcolina y fosfatidilserina en una relación de 8:2) y factor X re-lipidado en tampón Tris que contienen BSA. Después de un tiempo de incubación especificado la reacción se detiene mediante adición de EDTA en exceso. La concentración del factor Xa se mide luego partiendo del cambio de absorbancia a 405 nm tras adición de un sustrato cromogénico (S-2222, Chromogenix). Después de la corrección de fondo se determina la actividad independiente del factor de tejido de rhFVIIa (a_{wt}) como el cambio de absorbancia tras 10 minutos y se determina también la actividad independiente del factor de tejido de la variante de polipéptido de la invención (a_{variante}) como el cambio de absorbancia tras 10 minutos. La relación entre la actividad de la variante de polipéptido, en su forma actividad, y la actividad de rhFVIIa se define como a_{variante}/a_{wt}.
Ensayo de coagulación
Se midieron la actividad de coagulación del FVIIa y variantes del mismo en ensayos de una fase y se registraron los tiempos de coagulación en un coagulómetro Thrombotrack IV (Medinor). El plasma humano sin factor VII (American Diagnostica) se reconstituyó y equilibró a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos. Se transfirieron luego 50 microlitros de plasma a las copas del coagulómetro.
Se diluyeron FVIIa y variantes del mismo en tampón de glioxalina (barbiturato 5,7 mM, citrato de sodio 4,3 mM, NaCl 117 mM, 1 mg/ml de BSA, pH 7,35). Se añadieron las muestras a la copa en 50 \mul y se incubaron a 37ºC durante 2 minutos.
Se reconstituyó tromboplastina (Medinor) con agua y se añadió CaCl_{2} a una concentración final de 4,5 mM. Se inició la reacción añadiendo 100 \mul de tromboplastina.
Para medir la actividad de coagulación en ausencia de TF se usó el mismo ensayo sin adición de tromboplastina. Se analizaron los datos usando el software PRISM.
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Ensayo de sangre completa
Se midieron la actividad de coagulación de FVIIa y variantes del mismo en ensayos de una etapa y se registraron los tiempos de coagulación en un coagulómetro Thrombotrack IV (Medinor). Se diluyeron 100 \mul de FVIIa o variantes del mismo en un tampón que contiene glicilglicina 10 mM, NaCl 50 mM, CaCl_{2} 37,5 mM, pH 7,35 y se transfirió a la copa de reacción. Se inició la reacción de coagulación mediante adición de 50 \mul de sangre que contiene 10% de citrato trisódico 0,13 M como anticoagulante. Se analizó los datos usando Excel o software PRISM.
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Ensayo amidolítico
Se puede medir la capacidad de las variantes para escindir sustratos peptídicos de pequeño tamaño usando el sustrato cromogénico S-2288 (D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilida). Se diluye FVIIa hasta aproximadamente 10-90 nM en tampón de ensayo (Na-Hepes 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 5 mM, BSA al 0,1%, 1 U/ml de heparina). Además se diluye TF soluble (TFs) hasta 50-450 nM en tampón de ensayo. Se mezcla 120 \mul de tampón de ensayo con 20 \mul de muestra de FVIIa y 20 \mul de TFs. Después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente con agitación cuidadosa, seguido de 10 minutos de incubación a 37ºC se inicia la reacción mediante adición del sustrato S-2288 hasta 1 mM y se determina la absorción a 405 nm en distintos puntos de tiempo.
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Ensayo ELISA
Se determinan concentraciones de FVII/FVIIa (o variante) mediante ELISA. Se cubren pocillos de una placa de microtítulos con un anticuerpo dirigido contra el dominio de proteasa usando una solución de 2 \mug/ml en PBS (100 \mul por pocillo). Tras recubrimiento durante la noche a temperatura ambiente se lavan los pocillos 4 veces con tampón de THT (NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,2 0,05% de Tween-20). Subsiguientemente se añade 200 \mul de caseína al 1% (diluido en solución madre del 2,5% usando NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,2) por pocillo para bloqueo. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente se vacían los pocillos y se añade 100 \mul de muestra (opcionalmente diluidos en tampón de dilución (THT + caseína al 0,1%)). Después de otra incubación de 1 hora a temperatura ambiente, se lavan los pocillos 4 veces con tampón de THT, y se añade 100 \mul de un anticuerpo marcado con biotina dirigido contra el dominio tipo EGF (1 \mug/ml). Después de otra hora de incubación a temperatura ambiente, seguido de 4 lavados más con tampón de THF, se añade 100 \mul de peroxidada de rábano estreptavidina-caballo (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca, diluido a 1/10000). Después de otra hora de incubación a temperatura ambiente, seguido de 4 lavados más con tampón de THF, se añade 100 \mul de TMB (3,3', 5,5'-tetrametilbencidina, Kem-en-Tech A/S, Dinamarca). Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente en la oscuridad, se añade 100 \mul de H_{2}SO_{4} 1 M y se determina la DO_{450nm}. Se prepara una curva estándar usando rhFVIIa (NovoSeven®).
De forma alternativa se puede cuantificar FVII/FVIIa o variantes con el dominio de Gla más que con el dominio de la proteasa. En esta configuración de ELISA se cubren los pocillos durante la noche con un anticuerpo dirigido contra el dominio tipo EGF y para detección, se usa un anticuerpo de dominio de anti-Gla monoclonal marcado con biotina dependiente de calcio (2 \mug/ml, 100 \mul por pocillo). En esta configuración se añade CaCl_{2} 5 mM a los tampones de THT y dilución.
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Ensayo de trombograma
El efecto de variantes de hFVIIa, rhFVIIa o FVIIa sobre la generación de trombina en plasma humano se ensaya en una versión modificada del ensayo descrito en la página 589 de Hemker y col. (2000) Thromb Haemost 83:589-91. Brevemente, se mezcla la molécula que se va a ensayar (bien hFVIIa, rhFVIIa o una variante) con plasma pobre en plaquetas sin FVII (PPP) que contiene bien factor de tejido recombinante re-lipidado (tal como Innovin de Dade Behring) o bien fosfolípido (fosfatidilcolina y fosfatidilserina en una relación de 8:2, o fosfatidilcolina, fosfatidilserina y fosfatidiletanol en una relación de 4:2:4).
La reacción se inicia con adición de un sustrato de trombina fluoregénico y cloruro de calcio. Se mide la fluorescencia de forma continua y se determina la actividad amidolítica de trombina calculando la pendiente de la curva de fluorescencia (el aumento en fluorescencia durante el tiempo). De este modo se obtiene el tiempo hasta actividad amidolítica de trombina máxima (T_{max}), y se pueden calcular la tasa de generación de trombina (aumento máximo en actividad de trombina) y el trabajo de trombina total (área bajo la curva (AUC)).
Se descongela el plasma sin FVII citrado congelado en presencia de inhibidor de tripsina de maíz (100 \mug/ml de suero) para inhibir la ruta de contacto de coagulación. Se añade a cada pocillo de una placa de microtítulo de 96 pocillos 80 \mul de plasma y 20 \mul de tampón que contiene rhFVII o variante que se va a ensayar en concentraciones finales entre 0,1 y 100 nM. Se añade factor de tejido humano recombinante (rTF) a 5 \mul de tampón de ensayo hasta una concentración final de 1 pM. El tampón de ensayo consiste en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM y 60 mg/ml de BSA en agua destilada. Se inicia la reacción añadiendo 20 \mul de solución de sustrato que contiene cloruro de calcio 0,1 M. Se pre-calientan la placa de ensayo y reactivos hasta 37ºC y la reacción tiene lugar a esta temperatura. El fluorímetro usado es un fluorómetro BMG con un filtro de excitación a 390 nm y un filtro de emisión de a 460 nm. Se mide la fluorescencia en cada pocillo de placas de fondo claro de 96 pocillos a intervalos de 20 a 40 segundos durante 30 a 180 minutos. Se analizan los datos usando el software PRISM.
Ensayo de resonancia de plasmón en superficie de unión del factor de tejido (ensayo Biacore)
Se usó el análisis por resonancia de plasmón de superficie para determinar la unión relativa del factor VIIa de tipo salvaje y variantes del mismo para factor de tejido soluble. Se acopló el factor de tejido soluble recombinante que contiene el dominio extracelular con 270 unidades de respuesta en un Biacore CM5 chip usando acoplamiento NHS/EDC. Se acopló el factor de tejido soluble a un pH de 4,5 para permitir la interacción con la superficie de la placa.
En este ensayo la unión al factor de tejido de la proteína factor VII se comparó a una concentración única de FVIIa o variante permitiendo una comparación relativa de las variantes de tipo salvaje. Esta concentración se determinó por medio de una curva estándar de FVIIa de tipo salvaje que se hizo fluir sobre la placa a concentraciones entre 75 y 0 \mug/ml. Se eliminó el FVIIa por adición de EDTA 10 mM. Se determinó de esta forma que una concentración de 15 \mug/ml dio unión en el intervalo lineal. Se hicieron fluir variantes de FVIIa sobre la placa a 15 \mug/ml determinando la resistencia de unión relativa de FVIIa o variantes al factor de tejido.
Ejemplos Ejemplo 1
Se usa para este ejemplo la estructura de rayos X de hFVIIa en el complejo con factor de tejido soluble según Banner y col., J' Mol Biol, 1996; 285:2089. Para más información sobre los cálculos en este ejemplo véase el documento WO 01/58935.
Exposición de superficie
La realización de cálculos de ASA fraccional dio lugar a los siguientes residuos que se determina tienen más de 25% de su cadena lateral expuesta a la superficie: A1, N2, A3, F4, L5, E6, E7, L8, R9, P10, S12, L13, E14, E16, K18, E19, E20, Q21, S23, F24, E25, E26, R28, E29, F31, K32, D33, A34, E35, R36, K38, L39, W41, I42, S43, S45, G47, D48, Q49, A51, S52,. S53, Q56, G58, S60, K62, D63, Q64, L65, Q66, S67, I69, F71, L73, P74, A75, E77, G78, R79, E82, T83, H84, K85, D86, D87, Q88, L89, I90, V92, N93, E94, G97, E99, S103, D104, H105, T106, G107, T108, K109, S111, R113, E116, G117, S119, L120, L121, A122, D123, G124, V125, S126, T128, P129, T130, V131, E132, I140, L141, E142, K143, R144, N145, A146, S147, K148, P149, Q150, G151, R152, G155, K157, V158, P160, K161, E163, L171, N173, G174, A175, N184, T185, 1186, H193, K197, K199, N200, R202, N203, I205, S214, E215, H216, D217, G218, D219, S222, R224, S232, T233, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H249, Q250, P251, V253, T255, D256, E265, R266, T267, E270, R271, F275, V276, R277, F278, L280, L287, L288, D289, R290, G291, A292, T293, L295, E296, N301, M306, T307, Q308, D309, L311, Q312, Q313, R315, K316, V317, G318, D319, S320, P321, N322, T324, E325, Y326, Y332, S333, D334, S336, K337, K341, G342, H351, R353, G354, Q366, G367, T370, V371, G372, R379, E385, Q388, K389, R392, S393, E394, P395, R396, P397, G398, V399, L400, L401, R402, P404 y P406 (A1-S45 se localizan en el dominio de Gla, las posiciones restantes se localizan fuera del dominio de Gla).
Se determinó que los siguientes residuos presentan más de 50% de su cadena lateral expuesta a la superficie: A1, A3, F4, L5, E6, E7, L8, R9, P10, E14, E16, K18, E19, E20, Q21, S23, E25, E26, E29, K32, A34, E35, R36, K38, L39, I42, S43, G47, D48, A51, S52, S53, Q56, G58, S60, K62, L65, Q66, S67, I69, F71, L73, P74, A75, E77, G78, R79, E82, H84, K85, D86, D87, Q88, L89, I90, V92, N93, E94, G97, T106, G107, T108, K109, S111, E116, S119, L121, A122, D123, G124, V131, E132, L141, E142, K143, R144, N145, A146, S147, K148, P149, Q150, G151, R152, G155, K157, P160, N173, G174, A175, K197, K199, N200, R202, S214, E215, H216, G218, R224, V235, P236, G237, T238, H249, Q250, V253, D256, T267, F275, R277, F278, L288, D289, R290, G291, A292, T293, L295, N301, M306, Q308, D309, L311, Q312, Q313, R315, K316, G318, D319, N322, E325, D334, K341, G354, G367, V371, E385, K389, R392, E394, R396, P397, G398, R402, P404 y P406 (A1-S43 se localizan en el dominio de Gla, las posiciones restantes se localizan fuera del dominio de Gla).
Sitio de unión del factor de tejido
Se determinó usando cálculos ASA que los siguientes residuos en hFVII cambian su ASA en el complejo. Se definieron estos residuos como constituyentes del sitio de unión del receptor: L13, K18, F31, E35, R36, L39, F40, I42, S43, S60, K62, D63, Q64, L65, I69, C70, F71, C72, L73, P74, F76, E77, G78, R79, E82, K85, Q88, I90, V92, N93, E94, R271, A274, F275, V276, R277, F278, R304, L305, M306, T307, Q308, D309, Q312, Q313, E325 y R379.
Región del sitio activo
La región del sitio activo se define como cualquier residuo que presenta al menos un átomo a una distancia de 10 \ring{A} de cualquier átomos en la triada catalítica (residuos H193, D242, S344) : I153, Q167, V168, L169, L170, L171, Q176, L177, C178, G179, G180, T181, V188, V189, S190, A191, A192, H193, C194, F195, D196, K197, I198, W201, V228, I229, I230, P231, S232, T233, Y234, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H241, D242, I243, A244, L245, L246, V281, S282, G283, W284, G285, Q286, T293, T324, E325, Y326, M327, F328, D338, S339, C340, K341, G342, D343, S344, G345, G346, P347, H348, L358, T359, G360, I361, V362, S363, W364, G365, C368, V376, Y377, T378, R379, V380, Q382, Y383, W386, L387, L400 y F405.
El reborde de la hendidura de unión del sitio activo
Se definió el reborde de la región de hendidura del sitio de unión activo por inspección visual de la estructura IFAK.pbd de FVIIa como: N173, A175, K199, N200, N203, D289, R290, G291, A292, P321 y T370.
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Ejemplo 2 Diseño de un casete de expresión para expresión de rhFVII en células de mamífero
Se diseñó el casete de expresión para expresión de rhFVII y se clonó como se describe en el ejemplo 2 del documento WO 01/58935.
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Ejemplo 3 Construcción de casete de expresión que codifica las variantes de la invención
Se usó PCR de la extensión de la protuberancia de la secuencia (SOE) para generar construcciones que presentan marcos de lectura abiertos de FVII variante con codones sustituidos usando procedimientos convencionales.
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Ejemplo 4 Expresión de variantes de polipéptido en células K1 de CHO
La línea celular K1 de CHO (ATCC # CCL-61) se siembra al 50% de confluencia en matraces T-25 usando MEMa, FCS al 10% (Gibco/BRL nº de cat. 10091), P/S y 5 \mug/ml de feniloquinona y se permite que crezca hasta confluencia. Se transfecta la capa monocelular confluente con 5 \mug del plásmido relevante descrito anteriormente usando el agente de transfección Lipofectamina 2000 (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Veinticuatro horas tras la transfección se extrae una muestra y se cuantifica usando, por ejemplo, un ELISA que reconoce el dominio de EGF1 de hFVII. En este momento se puede aplicar selección relevante (por ejemplo, higromicina B) a las células con el fin de generar un grupo de transfectantes estables. Cuando se usan células K1 de CHO y el gen de resistencia a higromicina B como marcador seleccionable en el plásmido, esto se consigue normalmente en una semana.
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Ejemplo 5 Generación de células K1 de CHO que expresan de forma estable variantes de polipéptido
Se descongela un vial de grupo transfectante de K1 de CHO y se siembran las células en un matraz para tejido de 175 cm^{2} que contiene 25 ml de MEM\alpha, FCS al 10%, filoquinona (5 \mug/ml), 100 U/l de penicilina, 100 \mug/l de estreptomicina y se cultivaron durante 24 horas. Se cosecharon las células, se diluyeron y se dispusieron en placas de microtítulos de 96 pocillos con una densidad celular de ½ a 1% de células/pocillo. Después de una semana de crecimiento se encuentran presentes colonias de 20 a 100 células en los pocillos y se marcan aquellos pocillos que contienen sólo una colonia. Después de dos semanas más se sustituye el medio en todos los pocillos que contienen sólo una colonia con 200 \mul de medio fresco. Después de 24 horas se extrae una muestra del medio y se analiza, por ejemplo, mediante ELISA. Se seleccionan clones de alta producción y se usan para producción a gran escala de FVII o variantes.
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Ejemplo 6 Purificación de variantes de polipéptido y activación subsiguiente
Se purificaron variantes de FVII y FVII como sigue: el procedimiento se lleva a cabo a 4ºC. Se somete a ultrafiltración el medio de cultivo cosechado de la producción a gran escala usando un sistema Millipore TFF con membranas Pellicon de corte a 30 kDa. Tras la concentración del medio se añade citrato hasta 5 mM y se ajusta el pH hasta 8,6. En caso necesario, se reduce la conductividad hasta por debajo de 10 mS/cm. Subsiguientemente se aplica la muestra a una columna FF de Q-sepharose, equilibrada con NaCl 50 mM, Tris 10 mM pH 8,6. Después de lavar la columna con NaCl 100 mM, Tris 10 mM pH 8,6, seguido de NaCl 150, Tris 10 mM pH 8,6, se eluye FVII usando Tris 10 mM, NaCl 25 mM, CaCl_{2} 35 mM, pH 8,6.
Para la segunda etapa cromatográfica se prepara una columna de afinidad mediante acoplamiento de un anticuerpo del dominio de antiGla dependiente de calcio monoclonal con Sepharose FF activada con CNBr. Aproximadamente se acopla 5,5 mg de anticuerpo por ml de resina. La columna se equilibra con Tris 10 mM, NaCl 100 mM, CaCl_{2} 35 mM, pH 7,5. Se añade NaCl a la muestra hasta una concentración de NaCl 100 mM y se ajusta el pH a 7,4-7,6. Tras la aplicación O/N de la muestra se lava la columna con NaCl 100 mM, CaCl_{2} 35 mM, Tris 10 mM pH 7,5, y se eluye la proteína FVII con NaCl 100, citrato 50 mM, Tris 75 mM pH 7,5.
Para la tercera etapa cromatográfica se reduce la conductividad de la muestra hasta por debajo de 10 mS/cm, en caso de necesidad, y se ajusta el pH a 8,6. Se aplica luego la muestra a una columna de Q-sepharose (equilibrada con NaCl 50 mM, Tris 10 mM pH 8,6) a una densidad en torno a 3-5 mg de proteína por ml de gel obteniendo activación eficiente. Tras la aplicación se lava la columna con NaCl 50 mM, Tris 10 mM pH 8,6 durante aproximadamente 4 horas con un flujo de 3 a 4 volúmenes de columna (vc) por hora. Se eluye la proteína de FVII usando un gradiente de 0-100% de NaCl 500 mM, Tris 10 mM pH 8,6 sobre 40 vc. Se reúnen fracciones que contienen FVII.
Para la etapa cromatográfica final se reduce la conductividad hasta por debajo de 10 mS/cm. Subsiguientemente se aplica la muestra a una columna de Q-sepharose (equilibrada con NaCl 140 mM, glicilglicina 10 mM pH 8,6) a una concentración de 3-5 mg de proteína por ml de gel. Se lava luego la columna con NaCl 140 mM, glicilglicina 10 mM pH 8,6 y se eluye FVII con NaCl 140 mM, CaCl_{2} 15 mM, glicilglicina 10 mM pH 8,6. Se diluye el eluido hasta CaCl2 10 mM y se ajusta el pH a 6,8-7,2. Finalmente se añade Tween-80 hasta 0,01% y se ajusta el pH a 5,5 para almacenamiento a -80ºC.
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Ejemplo 7 Resultados experimentales-actividad de activación de FX
Sometiendo las variantes de la invención al "ensayo de activación del factor X independiente de TF", se obtuvieron los siguientes resultados (los resultados se expresan como un porcentaje de la actividad de la variante P10Q+K32E como una referencia):
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TABLA 1
5 
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Como se evidencia de los resultados anteriores, las variantes de la invención mostraron una mejora sustancial en actividad de activación de FX en comparación con rhFVIIa y también en comparación con [P10Q+K32E]rhFVIIa.
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Ejemplo 8 Resultados experimentales-actividad de coagulación en el "ensayo de sangre completa"
Sometiendo las variantes de la invención al "ensayo de sangre completa" se reveló que estas mostraban una actividad de coagulación significativamente mayor (es decir, tiempo de coagulación reducido) en comparación con rhFVIIa así como también [P10Q+K32E]rhFVIIa. Se muestran los resultados experimentales en la figura 1 y tabla 2 siguiente.
TABLA 2
6 
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Ejemplo 9 Resultados experimentales-actividad de coagulación en el "ensayo de coagulación"
Cuando se ensayó en un ensayo de coagulación dependiente de TF (el "ensayo de coagulación" descrito anteriormente en la sección de Materiales y Procedimientos) se hizo evidente que las variantes de la invención que presentan la sustitución de R36E tienen una actividad de coagulación significativamente reducida cuando se compara con rhFVII o con otras variantes de la invención. Véase la tabla 3 siguiente. No obstante, como se ilustra en el ejemplo 7 anterior, las variantes que presentan la sustitución R36E presentan una actividad de activación de factor X en el "ensayo de activación de factor X independiente de TF".
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TABLA 3
7 
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Ejemplo 10 Resultados experimentales-generación de trombina en el ensayo del trombograma
Usando tanto trombogramas dependientes de fosfolípidos (PL) y dependientes del factor de tejido (TF) (véase la descripción del ensayo de trombograma anterior) se determinó la tasa máxima de generación de trombina para variantes de FVIIa a diferentes concentraciones de proteínas de variante. Representando gráficamente las tasas de generación de trombina máximas (expresadas como FU (unidades de fluorescencia) por segundo^{2}) como una función de la concentración de variante en pM, se obtuvieron los resultados mostrados en la figura 2 (tasa de generación de trombina dependiente del factor de tejido máxima) y figura 3 (tasa de generación de trombina dependiente de fosfolípido máxima).
A partir de estos resultados es evidente que la variante de FVIIa P10Q K32E A34E R36E presenta una capacidad de generación de trombina diferenciada en función de si la reacción es dependiente de PL o dependiente de TF. La máxima tasa de generación de trombina dependiente de TF de esta variante se reduce aproximadamente 10 veces (línea de puntos en la figura 2) cuando se compara con las variantes de FVIIa P10Q K32E o A3AY P10Q K32E A34L. También, el tiempo de retardo, tiempo hasta pico, altura de pico y (en una extensión menor) el AUC se reducen para P10Q K32E A34E R36E en comparación con otras variantes (resultados no mostrados). Por el contrario a la actividad dependiente de TF, la actividad dependiente de PL de la variante P10Q K32E A34E R36E es equivalente a la de las otras variantes ensayadas en este ejemplo (véase la figura 3), es decir, esta variante presenta actividad dependiente de PL total incluso a pesar de que la actividad dependiente de TF se reduce sustancialmente.
En el mismo experimento la variante P10Q K32E A34E R36E se comparó directamente con la variante P10Q K32E A34E P74S, que presenta una tasa de generación de trombina dependiente de TF alta como se muestra en la figura 2. Las diferencias en unión al TF entre estas dos variantes (es decir, la unión al TF reducida de la variante P10Q K32E A34E R36E) se cree que es directamente atribuible a la presencia de la sustitución R36E, posiblemente en sinergia con la sustitución A34E.
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Ejemplo 11 Resultados experimentales-unión de FVIIa al factor de tejido en el ensayo Biacore
Sometiendo variantes de la invención a ensayo por resonancia de plasmón de superficie en un sistema Biacore usando una placa de TF como se describe en la sección Materiales y Procedimientos, se obtuvieron los siguientes resultados:
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TABLA 4
8 
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En coherencia con los datos de tasa de generación de trombina dependiente de TF del ensayo del trombograma (ejemplo 10), los resultados de la tabla 4 indican que la sustitución R36E confiere menos unión al factor de tejido.
En el mismo ensayo Biacore se ensayaron también las variantes de FVIIa que presentan las mismas modificaciones que las variantes enumeradas en la tabla 4 junto con dos modificaciones adicionales que introducen dos sitios de glicosilación (T106N y bien V253N o bien I205T) en cuanto a unión con el factor de tejido. Los resultados se muestran en la tabla 5 siguiente.
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TABLA 5
9 
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Estos resultados son coherentes con los de la tabla 4 y muestran que comparados con las mismas variantes (o de tipo salvaje) en la tabla 4 sin los sitios de glicosilación adicionales, la presencia de dos nuevos sitios de glicosilación en las variantes de la tabla 5 proporciona una reducción (adicional) de la unión al factor de tejido. Como fue el caso de las variantes de la tabla 4, la presencia de la sustitución R36E en una variante de glicosilación también da lugar a un nivel de unión al factor de tejido que es sustancialmente menor que la unión al factor de tejido de las otras variantes de glicosilación que no presentan esta sustitución.
<110> Maxygen ApS
\hskip1.1cmMaxygen Holdings Ltd.
\hskip1.1cmHaaning, Jesper Mortensen
\hskip1.1cmAndersen, Kim Vilbour
\hskip1.1cmBornas, Claus
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Variantes del dominio de Gla de FVII o FVIIa
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<130> 0274wo310
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<150> US 60/479.780
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<151> 2003-06-19
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DK PA 2004 00930
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2004-06-15
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<160> 1
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<170> PatentIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 406
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 1
11
12

Claims (45)

1. Una variante de polipéptido de factor VII (FVII) o factor VIIa (FVIIa) que presenta una secuencia de aminoácidos que difiere en 1 a 15 residuos de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos del factor VII humano (hFVII) o factor VIIa humano (hFVIIa) mostrada en la secuencia ID SEC Nº: 01, en la que se ha introducido un residuo de aminoácido cargado negativamente mediante sustitución en la posición 36, en la que dicha variante de polipéptido en su forma activada presenta una mayor actividad de activación de FX en comparación con el factor VIIa humano recombinante.
2. La variante de la reivindicación 1, en la que dicha sustitución es R36D.
3. La variante de la reivindicación 1, en la que dicha sustitución es R36E.
4. La variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además una sustitución de aminoácido en la posición 34.
5. La variante de la reivindicación 4, en la que se ha introducido un residuo de aminoácido cargado negativamente mediante sustitución en la posición 34.
6. La variante de la reivindicación 5, que comprende las sustituciones A34E+R36E.
7. La variante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además una sustitución de aminoácido en posición 10 y/o 32.
8. La variante de la reivindicación 7, que comprende la sustitución K32E.
9. La variante de la reivindicación 7, que comprende la sustitución P10Q.
10. La variante de la reivindicación 7, que comprende las sustituciones P10Q+K32E.
11. La variante de la reivindicación 10, que comprende las sustituciones P10Q+K32E+A34E+R36E.
12. La variante de la reivindicación 10, que comprende las sustituciones P10Q+K32E+A34L+R36E.
13. La variante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que al menos un residuo de aminoácido que comprende un grupo de unión para un resto no polipeptídico se ha introducido en una posición localizada fuera del dominio de Gla.
14. La variante de la reivindicación 13, en la que dicho grupo de unión es un sitio de N-glicosilación introducido por sustitución.
15. La variante de la reivindicación 14, en la que dicho sitio de N-glicosilación es introducido con una sustitución seleccionada del grupo constituido por A51N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, I205S, I205T, V253N, T267N, T267N+S269T, S314N+K316S, S314N+K316T, R315N+V317S, R315N+V317T, K316N+G318S, K316N+G318T, G318N, D334N y combinaciones de los mismos.
16. La variante de la reivindicación 15, que comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo constituido por T106N, I205T y V253N.
17. La variante de la reivindicación 16, que comprende dos sitios de N-glicosilación in vivo introducidos con sustituciones seleccionadas del grupo constituido por T106N+I205T, T106N+V253N e I205T+V253N.
18. La variante de la reivindicación 17, que comprende las sustituciones P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+
I205T.
19. La variante de la reivindicación 17, que comprende las sustituciones P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+
V253N.
20. La variante de la reivindicación 17, que comprende las sustituciones P10Q+K32E+A34E+R36E+I205T+
V253N.
21. La variante de la reivindicación 17, que comprende las sustituciones P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+
I205T.
22. La variante de la reivindicación 17, que comprende las sustituciones P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+
V253N.
23. La variante de la reivindicación 17, que comprende las sustituciones P10Q+K32E+A34L+R36E+I205T+
V253N.
24. La variante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además una inserción de al menos un residuo de aminoácido entre la posición 3 y 4.
25. La variante de la reivindicación 24, que comprende una inserción de un residuo de aminoácido entre la posición 3 y 4.
26. La variante de la reivindicación 25, en la que se inserta un residuo de aminoácido hidrófobo entre la posición 3 y 4.
27. La variante de la reivindicación 26, en la que dicha inserción es A3AY.
28. La variante de la reivindicación 27, que comprende la inserción A3AY y las sustituciones P10Q+
K32E+A34E+R36E.
29. La variante de la reivindicación 27, que comprende la inserción A3AY y las sustituciones P10Q+
K32E+A34L+R36E.
30. La variante de la reivindicación 27, que comprende la inserción A3AY y las sustituciones P10Q+
K32E+A34E+R36E+T106N+I205T.
31. La variante de la reivindicación 27, que comprende la inserción A3AY y las sustituciones P10Q+
K32E+A34E+R36E+T106N+V253N.
32. La variante de la reivindicación 27, que comprende la inserción A3AY y las sustituciones P10Q+
K32E+A34E+R36E+I205T+V253N.
33. La variante de la reivindicación 27, que comprende la inserción A3AY y las sustituciones P10Q+
K32E+A34L+R36E+T106N+I205T.
34. La variante de la reivindicación 27, que comprende la inserción A3AY y las sustituciones P10Q+
K32E+A34E+R36E+T106N+V253N.
35. La variante de la reivindicación 27, que comprende la inserción A3AY y las sustituciones P10Q+
K32E+A34E+R36E+I105T+V253N.
36. La variante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha variante está en su forma activada.
37. Una secuencia de nucleótidos que codifica una variante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36.
38. Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 37.
39. Una célula huésped que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 37 o el vector de expresión de la reivindicación 38.
40. Una composición que comprende una variante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36 y al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
41. Una variante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, o una composición como se define en la reivindicación 40, para uso como un medicamento.
42. Uso de una variante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno en el que se desea la formación de coágulos.
43. Uso de acuerdo con la reivindicación 42, en el que dicha enfermedad o trastorno se selecciona del grupo constituido por hemorragias, incluyendo hemorragias cerebrales, hemorragias no controladas graves, tales como trauma, hemorragias en pacientes que sufren transplantes o rechazo, hemorragia variceal y hemofilia.
44. Una variante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36 para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno en el que la formación de coágulos es deseable.
45. Una variante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36 para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo constituido por hemorragias, incluyendo hemorragias cerebrales, hemorragias no controladas graves, tales como trauma, hemorragias en pacientes que sufren transplantes o rechazo, hemorragia variceal y hemofilia.
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