JP2549224B2 - 組換えにより産生される血液因子及びその血液因子の発現方法並びにその方法に使用されるワクシニアウイルス組換え体 - Google Patents
組換えにより産生される血液因子及びその血液因子の発現方法並びにその方法に使用されるワクシニアウイルス組換え体Info
- Publication number
- JP2549224B2 JP2549224B2 JP3503086A JP50308691A JP2549224B2 JP 2549224 B2 JP2549224 B2 JP 2549224B2 JP 3503086 A JP3503086 A JP 3503086A JP 50308691 A JP50308691 A JP 50308691A JP 2549224 B2 JP2549224 B2 JP 2549224B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vaccinia virus
- plasmid
- prothrombin
- cell
- vitamin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/647—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、組換えにより産生される血液因子、特にビ
タミンＫ依存性血液凝固因子、ワクシニアウイルス組換
え体、及び上記の血液因子の発現方法に関する。本発明
は特に、組換えプロトロンビン及びトロンビン、並びに
プロトロンビンからトロンビンの種々の変種までの経路
上の異なったプロセッシング機構により生成される中間
生成物の調製を開示する。
タミンＫ依存性血液凝固因子、ワクシニアウイルス組換
え体、及び上記の血液因子の発現方法に関する。本発明
は特に、組換えプロトロンビン及びトロンビン、並びに
プロトロンビンからトロンビンの種々の変種までの経路
上の異なったプロセッシング機構により生成される中間
生成物の調製を開示する。
いかなる感染性又は毒性物質によっても汚染されてい
ないVIII因子、II因子、フォン・ビルブラント因子、及
びプラスミノーゲンのような高度に精製された血液因子
が求められる。遺伝子工学は、このような予防的又は治
療的に有意のタンパク質を、比較的高い収量で並びにHI
V及び肝炎ウイルスのような病原性ウイルスの非存在下
で産生する方法を提供する。真核発現系は、ヒトの身体
で産生される物質に非常に類似した又は同一の糖タンパ
ク質が得られるように、タンパク質部分での翻訳後修飾
を実行するというさらなる利点を提供する。
ないVIII因子、II因子、フォン・ビルブラント因子、及
びプラスミノーゲンのような高度に精製された血液因子
が求められる。遺伝子工学は、このような予防的又は治
療的に有意のタンパク質を、比較的高い収量で並びにHI
V及び肝炎ウイルスのような病原性ウイルスの非存在下
で産生する方法を提供する。真核発現系は、ヒトの身体
で産生される物質に非常に類似した又は同一の糖タンパ
ク質が得られるように、タンパク質部分での翻訳後修飾
を実行するというさらなる利点を提供する。
いくつかのビタミンＫ依存性ヒト血液凝固因子が、種
々の組換え体系で発現されている。ヒト血液凝固因子IX
の発現は、Nature 316,268-270（1985）の中でH.de la
salle等、及びNature 315,683-865（1985）の中でD.S.A
nson等が肝癌細胞及びマウス繊維芽細胞において、Natu
re 316,271-273（1985）の中でBusby等が乳仔ハムスタ
ー腎細胞において、並びにCell 48,185-191（1987）の
中でN.J.Jorgensen等がチャイニーズハムスター卵巣（C
HO）細胞において報告している。これらの研究から、肝
臓及び腎臓由来細胞株のようなある種の細胞型のみが有
効なカルボキシル化系を有することが公知である。さら
に、遺伝子増幅によるCHO細胞におけるIX因子の過剰発
現は通常タンパク質抗原レベルの上昇を引き起こすが、
しかしながらその特異的活性が急激に低下し、プレプロ
タンパク質から成熟形態へのプロセッシングが不十分と
なることが観察されている（A.Balland et al.,Eur.J.B
iochem.172,565-572［1988］）。
々の組換え体系で発現されている。ヒト血液凝固因子IX
の発現は、Nature 316,268-270（1985）の中でH.de la
salle等、及びNature 315,683-865（1985）の中でD.S.A
nson等が肝癌細胞及びマウス繊維芽細胞において、Natu
re 316,271-273（1985）の中でBusby等が乳仔ハムスタ
ー腎細胞において、並びにCell 48,185-191（1987）の
中でN.J.Jorgensen等がチャイニーズハムスター卵巣（C
HO）細胞において報告している。これらの研究から、肝
臓及び腎臓由来細胞株のようなある種の細胞型のみが有
効なカルボキシル化系を有することが公知である。さら
に、遺伝子増幅によるCHO細胞におけるIX因子の過剰発
現は通常タンパク質抗原レベルの上昇を引き起こすが、
しかしながらその特異的活性が急激に低下し、プレプロ
タンパク質から成熟形態へのプロセッシングが不十分と
なることが観察されている（A.Balland et al.,Eur.J.B
iochem.172,565-572［1988］）。
別のビタミンＫ依存性因子であるヒトプロテインＣ
は、ヒト293胎児腎細胞系で発現された。この系におい
て、完全カルボキシル化プロテインＣの高レベルの発現
が達成された（J.D.Walls et al.,Gene 81,139-149［19
89］）。しかしながら、293細胞株がスケールアップ及
び発酵に適しているとは思えない。
は、ヒト293胎児腎細胞系で発現された。この系におい
て、完全カルボキシル化プロテインＣの高レベルの発現
が達成された（J.D.Walls et al.,Gene 81,139-149［19
89］）。しかしながら、293細胞株がスケールアップ及
び発酵に適しているとは思えない。
組換え体研究は、プロトロンビンを用いても実施され
ている。ビタミンＫ依存性血液凝固因子であるプロトロ
ンビンは、分子量72,000の血漿糖タンパク質である。肝
臓で合成されるこのタンパク質は、血液凝固の最終段階
に関与する。分泌前に、それは、例えばグリコシル化、
最初の10個のアミノ末端グルタミン酸残基のビタミンＫ
依存性カルボキシル化、並びにプレー及びプロペプチド
の切断といったようないくつかの翻訳後修飾を受ける。
ヒトプロトロンビンの遺伝子及びその相補的DNAのクロ
ーニング（S.J.F.Degen et al.,Biochemistry 26,6165-
6177［1987］）は、適切な細胞系における発現研究の可
能性を切り開いた。シグナルペプチド領域及びプロ配列
（プレプロ−プロトロンビンをコードする）を含むプロ
トロンビンの全長cDNAに関しては、MacGillivray,R.T.
A.,Irwin,D.M.Guinto,R.E.and Stone,J.C.1987,「トロ
ンビンの機能的マッピングへの組換え遺伝学的アプロー
チ」、Annals of the New York Academy of Sciences 4
85,73-79で言及されている。活性のあるヒトプロトロン
ビンの発現は、M.J.Jorgensen et al.（J.Biol.Chem.26
2,6729-6734（1987））により、チャイニーズハムスタ
ー卵巣（CHO）細胞、及び乳仔ハムスター腎臓（BHK）細
胞で達成された。遺伝子増幅によりCHO細胞におけるプ
ロトロンビンの発現を増強すると、高度の発現レベルが
得られたが、しかしながら物質の60％が十分にカルボキ
シル化されたに過ぎなかった。BHK細胞におけるプロト
ロンビンの発現は活性のあるプロトロンビンを産生した
が、しかしながら発現レベルは比較的低かった。
ている。ビタミンＫ依存性血液凝固因子であるプロトロ
ンビンは、分子量72,000の血漿糖タンパク質である。肝
臓で合成されるこのタンパク質は、血液凝固の最終段階
に関与する。分泌前に、それは、例えばグリコシル化、
最初の10個のアミノ末端グルタミン酸残基のビタミンＫ
依存性カルボキシル化、並びにプレー及びプロペプチド
の切断といったようないくつかの翻訳後修飾を受ける。
ヒトプロトロンビンの遺伝子及びその相補的DNAのクロ
ーニング（S.J.F.Degen et al.,Biochemistry 26,6165-
6177［1987］）は、適切な細胞系における発現研究の可
能性を切り開いた。シグナルペプチド領域及びプロ配列
（プレプロ−プロトロンビンをコードする）を含むプロ
トロンビンの全長cDNAに関しては、MacGillivray,R.T.
A.,Irwin,D.M.Guinto,R.E.and Stone,J.C.1987,「トロ
ンビンの機能的マッピングへの組換え遺伝学的アプロー
チ」、Annals of the New York Academy of Sciences 4
85,73-79で言及されている。活性のあるヒトプロトロン
ビンの発現は、M.J.Jorgensen et al.（J.Biol.Chem.26
2,6729-6734（1987））により、チャイニーズハムスタ
ー卵巣（CHO）細胞、及び乳仔ハムスター腎臓（BHK）細
胞で達成された。遺伝子増幅によりCHO細胞におけるプ
ロトロンビンの発現を増強すると、高度の発現レベルが
得られたが、しかしながら物質の60％が十分にカルボキ
シル化されたに過ぎなかった。BHK細胞におけるプロト
ロンビンの発現は活性のあるプロトロンビンを産生した
が、しかしながら発現レベルは比較的低かった。
ワクシニアウイルスベースのベクター系は、例えばD.
M.Glover編の「DNAクローニング：実際的アプローチ」I
RL Press,Oxford,p.191-221（1985）におけるM.Mackett
et al.から公知である。欧州特許第243,029号では、組
換え体ワクシニアウイルスがHIV envタンパク質の発現
に関して記載されている。
M.Glover編の「DNAクローニング：実際的アプローチ」I
RL Press,Oxford,p.191-221（1985）におけるM.Mackett
et al.から公知である。欧州特許第243,029号では、組
換え体ワクシニアウイルスがHIV envタンパク質の発現
に関して記載されている。
ワクシニアウイルスは、感染性ウイルス粒子中にパッ
ケージされた、ウイルスにコードされたRNAポリメラー
ゼによって認識される、それ自身の転写調節配列を進化
させた。さらに、ワクシニアウイルスは大型ゲノム（18
5キロ塩基対の二重鎖DNA）を有するが、これはin vitro
クローニング技術で取り扱うことができない。したがっ
て、ワクシニアウイルスゲノムへの外来DNAの挿入は、
一般的相同組換えの原理を利用することによりin vivo
でのみ達成し得る。
ケージされた、ウイルスにコードされたRNAポリメラー
ゼによって認識される、それ自身の転写調節配列を進化
させた。さらに、ワクシニアウイルスは大型ゲノム（18
5キロ塩基対の二重鎖DNA）を有するが、これはin vitro
クローニング技術で取り扱うことができない。したがっ
て、ワクシニアウイルスゲノムへの外来DNAの挿入は、
一般的相同組換えの原理を利用することによりin vivo
でのみ達成し得る。
ワクシニアウイルスは、哺乳類細胞における遺伝子発
現研究のための有用な手段であることが立証されてい
る。利点としては、感染性の保持、広範的な宿主範囲、
大DNA容量、並びにタンパク質の正確な合成、折りたた
み、プロセッシング、及び運搬が含まれる。
現研究のための有用な手段であることが立証されてい
る。利点としては、感染性の保持、広範的な宿主範囲、
大DNA容量、並びにタンパク質の正確な合成、折りたた
み、プロセッシング、及び運搬が含まれる。
したがって、組換え体ワクシニアウイルスは、正確な
翻訳後修飾を実施し得る、そしてさらに（適切な宿主細
胞と合同して）所望のタンパク質を有効に分泌中の細胞
株をスクリーニングするための迅速な手段を提供する。
これは、ビタミンＫ依存性血液凝固因子のような大規模
に修飾される分泌タンパク質の発現が考えられる場合
に、特に重要である。
翻訳後修飾を実施し得る、そしてさらに（適切な宿主細
胞と合同して）所望のタンパク質を有効に分泌中の細胞
株をスクリーニングするための迅速な手段を提供する。
これは、ビタミンＫ依存性血液凝固因子のような大規模
に修飾される分泌タンパク質の発現が考えられる場合
に、特に重要である。
本発明の目的は、血液因子、特にビタミンＫ依存性血
液凝固因子、例えばプロトロンビン及びトロンビン変異
体のための発現系、そして高い翻訳後能力及び安定なウ
イルス組換え体による非常に再現性の高い発現条件を提
供することにおいて、今までのところ公知の発現系より
も改良されている発現系を提供することである。
液凝固因子、例えばプロトロンビン及びトロンビン変異
体のための発現系、そして高い翻訳後能力及び安定なウ
イルス組換え体による非常に再現性の高い発現条件を提
供することにおいて、今までのところ公知の発現系より
も改良されている発現系を提供することである。
さらに本発明の目的は、生物学的活性形態の対抗原形
態に対する比率が高い組換えによって調製された血液因
子又はその誘導体を提供することである。
態に対する比率が高い組換えによって調製された血液因
子又はその誘導体を提供することである。
上記の目的は、その生物学的活性形態の対抗原形態に
対する比率が少なくとも50％、好ましくは60〜90％の範
囲、最も好ましくは70〜80％の範囲である組換えによっ
て産生された血液因子により解決される。
対する比率が少なくとも50％、好ましくは60〜90％の範
囲、最も好ましくは70〜80％の範囲である組換えによっ
て産生された血液因子により解決される。
タンパク質の全部又は一部アミノ酸配列、並びに少な
くとも一つのアミノ酸の置換、欠失又は挿入によるその
誘導体を包含し得るこれらの血液因子の中から、Ｖ因
子、VIII因子、XII因子、XIII因子、フォン・ビルブラ
ント因子、プラスミノーゲン、及びビタミンＫ依存性血
液因子、例えばVII因子、IX因子、Ｘ因子、プロテイン
Ｃ、プロテインＳ、及び特にプロトロンビン、並びにそ
の変異体が挙げられる。
くとも一つのアミノ酸の置換、欠失又は挿入によるその
誘導体を包含し得るこれらの血液因子の中から、Ｖ因
子、VIII因子、XII因子、XIII因子、フォン・ビルブラ
ント因子、プラスミノーゲン、及びビタミンＫ依存性血
液因子、例えばVII因子、IX因子、Ｘ因子、プロテイン
Ｃ、プロテインＳ、及び特にプロトロンビン、並びにそ
の変異体が挙げられる。
本発明はさらに、所望の糖タンパク質の発現に必要な
挿入プラスミド及びワクシニアウイルス組換え体を包含
する。
挿入プラスミド及びワクシニアウイルス組換え体を包含
する。
さらに、他の組換え体ポックスウイルス、例えばニワ
トリポックスウイルスの使用が示唆される。
トリポックスウイルスの使用が示唆される。
挿入プラスミドは、所望の血液因子及び少なくとも一
つのレプリコンをコードする外来cDNA配列、少なくとも
一つの選択マーカー、多重クローニング部位、少なくと
も一つのプロモーター、並びにプロモーター及び外来DN
A配列と隣接するワクシニアウイルスからのDNA配列を包
含する。
つのレプリコンをコードする外来cDNA配列、少なくとも
一つの選択マーカー、多重クローニング部位、少なくと
も一つのプロモーター、並びにプロモーター及び外来DN
A配列と隣接するワクシニアウイルスからのDNA配列を包
含する。
ウイルス組換え体又はそれを含有する細胞の選択は、
選択マーカーの使用により促進される。このマーカーの
発現は、強力な、連続的に活性のあるプロモーター、例
えばワクシニアウイルスからのP7.5の制御下にあるのが
好ましい。好適な選択マーカーの一例としては、キサン
チングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコー
ドするgpt遺伝子がある。gpt遺伝子を保有する組換え体
ウイルスのみが、ミコフェノール酸の存在下で哺乳類細
胞培養中で増殖する（F.G.Falkner and B.Moss,J.Viro
l.62,1849-1854［1988］）。
選択マーカーの使用により促進される。このマーカーの
発現は、強力な、連続的に活性のあるプロモーター、例
えばワクシニアウイルスからのP7.5の制御下にあるのが
好ましい。好適な選択マーカーの一例としては、キサン
チングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコー
ドするgpt遺伝子がある。gpt遺伝子を保有する組換え体
ウイルスのみが、ミコフェノール酸の存在下で哺乳類細
胞培養中で増殖する（F.G.Falkner and B.Moss,J.Viro
l.62,1849-1854［1988］）。
発現される外来遺伝子がポックスウイルスプロモータ
ーの制御下にあることが最も重要なことである一方、こ
のポックスウイルスプロモーター、例えばワクシニアプ
ロモーターが発現される外来遺伝子配列に極めて接近し
ていることも等しく重要である。ポックスウイルスプロ
モーターと発現される外来遺伝子配列との間に位置する
非翻訳コード領域が発現レベルの低減を引き起こすこと
は、多数の例で示されている。したがって、プロモータ
ーの３′−末端とその下流に続く５′外来遺伝子配列
は、適正なリーディンクフレームに整列され、それによ
って非翻訳コドンの不必要な領域をなくすということ
に、特に注意すべきである。これを達成するための一つ
の可能性は、適切な制御部位を選択し、同一の制限部位
が形成されるような方法でコドンを付加又は欠失するこ
とにより、外来遺伝子配列（おそらくあらゆるプレー又
はプレプロー配列を含む）の５′−末端を修飾すること
である。この方法において、プロモーター３′−末端と
外来遺伝子の５′−末端の重複する末端は、所望の組立
てを可能にする。
ーの制御下にあることが最も重要なことである一方、こ
のポックスウイルスプロモーター、例えばワクシニアプ
ロモーターが発現される外来遺伝子配列に極めて接近し
ていることも等しく重要である。ポックスウイルスプロ
モーターと発現される外来遺伝子配列との間に位置する
非翻訳コード領域が発現レベルの低減を引き起こすこと
は、多数の例で示されている。したがって、プロモータ
ーの３′−末端とその下流に続く５′外来遺伝子配列
は、適正なリーディンクフレームに整列され、それによ
って非翻訳コドンの不必要な領域をなくすということ
に、特に注意すべきである。これを達成するための一つ
の可能性は、適切な制御部位を選択し、同一の制限部位
が形成されるような方法でコドンを付加又は欠失するこ
とにより、外来遺伝子配列（おそらくあらゆるプレー又
はプレプロー配列を含む）の５′−末端を修飾すること
である。この方法において、プロモーター３′−末端と
外来遺伝子の５′−末端の重複する末端は、所望の組立
てを可能にする。
ワクシニアウイルス発現系におけるプロモーターの選
択は、非常に重要である。通常、感染周期の後期に活性
な、又は初期及び後期に活性なウイルスプロモーター
が、タンパク質発現のために用いられる。合成後期プロ
モーター、又は合成初期及び後期プロモーターを用いて
もよい。
択は、非常に重要である。通常、感染周期の後期に活性
な、又は初期及び後期に活性なウイルスプロモーター
が、タンパク質発現のために用いられる。合成後期プロ
モーター、又は合成初期及び後期プロモーターを用いて
もよい。
ワクシニアウイルスの特に好ましいプロモーターは、
後期11Kプロモーターである。このプロモーターは、転
写及び翻訳の開始部位と重複する機能的に重要な保存配
列要素を含有する（B.Moss et al.,Ann.Rev.Immunol.5,
305-324［1987］参照）。有効な発現を得るために、本
発明者は、この領域を変えないことを選択した。したが
って、下記の実施例においては、プロトロンビンcDNA
は、図３に示すように、11Kポリペプチドの開始コドン
のすぐ下流の天然EcoRI部位中にクローニングした。
後期11Kプロモーターである。このプロモーターは、転
写及び翻訳の開始部位と重複する機能的に重要な保存配
列要素を含有する（B.Moss et al.,Ann.Rev.Immunol.5,
305-324［1987］参照）。有効な発現を得るために、本
発明者は、この領域を変えないことを選択した。したが
って、下記の実施例においては、プロトロンビンcDNA
は、図３に示すように、11Kポリペプチドの開始コドン
のすぐ下流の天然EcoRI部位中にクローニングした。
実験の項でさらに詳しく記載するように、プロモータ
ーとプロトロンビンコード領域との的確な融合は、プロ
トロンビン遺伝子の開始コドン下流のオリゴヌクレオチ
ド指定突然変異誘発による新規のEcoRI部位の導入によ
って得られた。選択されたストラテジーは、２つの付加
的アミノ酸（Asn及びSer）のシグナルペプチドへの導入
をもたらした（図３参照）。シグナルペプチド切断部位
は約40アミノ酸離れて位置するため、この突然変異は成
熟ポリペプチド鎖の正確なプロセッシング及び分泌を妨
害しない。
ーとプロトロンビンコード領域との的確な融合は、プロ
トロンビン遺伝子の開始コドン下流のオリゴヌクレオチ
ド指定突然変異誘発による新規のEcoRI部位の導入によ
って得られた。選択されたストラテジーは、２つの付加
的アミノ酸（Asn及びSer）のシグナルペプチドへの導入
をもたらした（図３参照）。シグナルペプチド切断部位
は約40アミノ酸離れて位置するため、この突然変異は成
熟ポリペプチド鎖の正確なプロセッシング及び分泌を妨
害しない。
ワクシニアウイルスDNAは細胞質中で転写されるとい
う事実のために、宿主細胞のスプライシング装置は使用
されない。したがって、ウイルス組換え体を構築する場
合には、イントロン無含有のDNA又はcDNAを用いなけれ
ばならない。有効な発現及び分泌のためには、このDNA
がシグナル配列も包含することが好ましい。
う事実のために、宿主細胞のスプライシング装置は使用
されない。したがって、ウイルス組換え体を構築する場
合には、イントロン無含有のDNA又はcDNAを用いなけれ
ばならない。有効な発現及び分泌のためには、このDNA
がシグナル配列も包含することが好ましい。
いくつかの目的のためには、発現される外来DNA配列
の部分配列又は修正配列のみを組換え体ウイルス中に挿
入するのが望ましい。この方法においては、血液因子の
誘導体又は突然変異体又は活性化形態が得られる。
の部分配列又は修正配列のみを組換え体ウイルス中に挿
入するのが望ましい。この方法においては、血液因子の
誘導体又は突然変異体又は活性化形態が得られる。
挿入プラスミドはさらに、ワクシニアウイルスのフラ
ンキングDNA配列を包含するが、これはチミジンキナー
ゼ遺伝子、又は赤血球凝集素配列に、あるいはワクシニ
アウイルスDNAのあらゆる非必須領域に相当し得る。
ンキングDNA配列を包含するが、これはチミジンキナー
ゼ遺伝子、又は赤血球凝集素配列に、あるいはワクシニ
アウイルスDNAのあらゆる非必須領域に相当し得る。
外来cDNA配列の挿入に適したオープンリーディングフ
レームベクターは、F.G.Falkner及びB.Moss（J.Virol.1
988,62,1849-1854）が記載したようなpTKgpt−oFlsであ
る。
レームベクターは、F.G.Falkner及びB.Moss（J.Virol.1
988,62,1849-1854）が記載したようなpTKgpt−oFlsであ
る。
このオープンリーディングフレームベクターを用い
て、挿入プラスミドpTKgpt−PTHBa及びpTKgpt−PTHBbを
調製した（図１及び図２）。プロトロンビンに関して記
載されたものと同様の方法で、血液因子をコードするあ
らゆる他の望ましい外来遺伝子を、P11プロモーターに
極めて近接するプラスミドpTKgpt−oFls中に挿入し得
る。
て、挿入プラスミドpTKgpt−PTHBa及びpTKgpt−PTHBbを
調製した（図１及び図２）。プロトロンビンに関して記
載されたものと同様の方法で、血液因子をコードするあ
らゆる他の望ましい外来遺伝子を、P11プロモーターに
極めて近接するプラスミドpTKgpt−oFls中に挿入し得
る。
このような挿入プラスミドを用いて、野生型ワクシニ
アウイルスとのin vivo相同組換えによって、ワクシニ
アウイルス組換え体が得られる。プロトロンビンの発現
に関して実験の項に記載されるワクシニアウイルス組換
え体は、vPTHBa及びvPTHBb（図１及び２）、並びに下記
のvPT6/2、vTKemc−PT2、vHA−PTa、及びvHA−PTbであ
る。
アウイルスとのin vivo相同組換えによって、ワクシニ
アウイルス組換え体が得られる。プロトロンビンの発現
に関して実験の項に記載されるワクシニアウイルス組換
え体は、vPTHBa及びvPTHBb（図１及び２）、並びに下記
のvPT6/2、vTKemc−PT2、vHA−PTa、及びvHA−PTbであ
る。
これらの種子ウイルスを用いて、次に哺乳類細胞培養
を感染させて、所望の糖タンパク質の発現に関してスク
リーニングする。
を感染させて、所望の糖タンパク質の発現に関してスク
リーニングする。
哺乳類宿主細胞としては、最も十分な翻訳後修飾を提
供するので、肝臓及び腎臓細胞が好ましい。宿主細胞と
して最も好ましいのは、発現レベル及び翻訳後修飾の点
からみて、Vero、CV1、BSC1腎細胞、並びにBHK細胞であ
ることが示された。
供するので、肝臓及び腎臓細胞が好ましい。宿主細胞と
して最も好ましいのは、発現レベル及び翻訳後修飾の点
からみて、Vero、CV1、BSC1腎細胞、並びにBHK細胞であ
ることが示された。
その他の有用な宿主細胞は、RK13細胞である。これら
の細胞は上澄中に所望のタンパク質を分泌しないが、し
かしそれらは莫大な量でタンパク質を発現する能力を有
する。この場合、タンパク質を回収するためには、細胞
を破壊しなければならない。したがって、この場合に
は、いかなるシグナル配列も持たない所望のタンパク質
を発現するのが有益であろう。
の細胞は上澄中に所望のタンパク質を分泌しないが、し
かしそれらは莫大な量でタンパク質を発現する能力を有
する。この場合、タンパク質を回収するためには、細胞
を破壊しなければならない。したがって、この場合に
は、いかなるシグナル配列も持たない所望のタンパク質
を発現するのが有益であろう。
所望の組換え体血液因子の産生方法は、高い生物学的
活性を有するタンパク質を得るために、好ましくはビタ
ミンＫの存在下で実施する。
活性を有するタンパク質を得るために、好ましくはビタ
ミンＫの存在下で実施する。
本発現系のさらなる改良は、感染を実施する場合に細
胞の相を観察することにより達成される。細胞が感染前
に集密状態に達している場合に、最高の結果が得られる
ことが立証された。
胞の相を観察することにより達成される。細胞が感染前
に集密状態に達している場合に、最高の結果が得られる
ことが立証された。
宿主細胞の感染に必要なワクシニアウイルス組換え体
の量に関しては、それが好ましくは0.1〜20pfuの範囲、
最も好ましくは0.1〜1pfuの範囲にあると確定された。
感染にこれより多量のウイルス組換え体を用いても、発
現レベルがさらに上昇するわけではなかった。
の量に関しては、それが好ましくは0.1〜20pfuの範囲、
最も好ましくは0.1〜1pfuの範囲にあると確定された。
感染にこれより多量のウイルス組換え体を用いても、発
現レベルがさらに上昇するわけではなかった。
微粒子担体培養、又はホローファイバー系のような高
密度系を用いることによって、発現レベルはさらに増大
された。
密度系を用いることによって、発現レベルはさらに増大
された。
このようにして産生されるタンパク質含有物質は、当
業界で公知のあらゆる好適な方法により、細胞上澄から
又は細胞から収穫され、タンパク質化学の一般的方法を
用いて精製される。
業界で公知のあらゆる好適な方法により、細胞上澄から
又は細胞から収穫され、タンパク質化学の一般的方法を
用いて精製される。
ワクシニアウイルス組換え体は、効率的な分泌及び正
確な翻訳後修飾に関しての細胞株の迅速なスクリーニン
グを可能にするという点で、従来技術の組換え体系より
も有意の利点を有する。この方法では、どの細胞株が大
量の活性タンパク質を分泌可能であるか、（一方、他の
株はその細胞質中に大量に蓄積する）、そしてどの細胞
株がその正確な翻訳後修飾によって最も活性なタンパク
質を産生するか、を容易に確立することができる。した
がって、形質転換細胞株を構築する前に、ワクシニアウ
イルス組換え体を用いた感染試験により、必要な機能に
関して異なる細胞型をスクリーニングすることが有用で
ある。
確な翻訳後修飾に関しての細胞株の迅速なスクリーニン
グを可能にするという点で、従来技術の組換え体系より
も有意の利点を有する。この方法では、どの細胞株が大
量の活性タンパク質を分泌可能であるか、（一方、他の
株はその細胞質中に大量に蓄積する）、そしてどの細胞
株がその正確な翻訳後修飾によって最も活性なタンパク
質を産生するか、を容易に確立することができる。した
がって、形質転換細胞株を構築する前に、ワクシニアウ
イルス組換え体を用いた感染試験により、必要な機能に
関して異なる細胞型をスクリーニングすることが有用で
ある。
血液媒介性のウイルス、例えば、HIV又はNANB肝炎ウ
イルスのようなウイルスを含まない、組換えにより産生
されたヒトプロトロンビンを用いて、プロトロンビンか
ら調製されるヒトトロンビンによる血液凝固系における
ある種の疾患、例えば敗血症性ショックを治療すること
ができる。ヒトトロンビン、及び／又はヒトトロンビン
−トロンボモジュリンとプロテインＣの相乗混合物はさ
らに、抗凝結物質療法及び敗血症性ショックの有用な薬
剤であると考えられる。
イルスのようなウイルスを含まない、組換えにより産生
されたヒトプロトロンビンを用いて、プロトロンビンか
ら調製されるヒトトロンビンによる血液凝固系における
ある種の疾患、例えば敗血症性ショックを治療すること
ができる。ヒトトロンビン、及び／又はヒトトロンビン
−トロンボモジュリンとプロテインＣの相乗混合物はさ
らに、抗凝結物質療法及び敗血症性ショックの有用な薬
剤であると考えられる。
さらなる適用は、一般に用いられるウシトロンビンの
代わりとしての、ヒト組換えプロトロンビンから産生さ
れるトロンビンのフィブリンシーラント中での使用であ
る。このフィブリンシーラントは、ある種の形態の手術
に広く用いられる。ウシトロンビンをヒトトロンビンに
置換すると、ある種のウイルス感染並びにアレルギー反
応の危険を減らすことができる。
代わりとしての、ヒト組換えプロトロンビンから産生さ
れるトロンビンのフィブリンシーラント中での使用であ
る。このフィブリンシーラントは、ある種の形態の手術
に広く用いられる。ウシトロンビンをヒトトロンビンに
置換すると、ある種のウイルス感染並びにアレルギー反
応の危険を減らすことができる。
図１〜７により、本発明をさらに説明する。
図１は、ワクシニアウイルス挿入ベクターpTKgpt−PT
HBaの構築を示す。この挿入プラスミドは、組換え体ウ
イルスvPTHBaを構築するためにin vivo組換えに用い
た。略語の意味を以下に示す： PTHB＝プロトロンビン配列;tetr＝テトラサイクリン
耐性遺伝子;ssDNA＝一本鎖DNA;tk＝ワクシニアウイルス
チミジンキナーゼ配列;gpt＝E.coliキサンチングアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子;P 11＝ワク
シニアウイルス主要後期11Kポリペプチドのプロモータ
ー;P7.5＝ワクシニアウイルス7.5kDaポリペプチドのプ
ロモーター;MCS＝多重クローニング部位。矢印は転写の
方向を示す。
HBaの構築を示す。この挿入プラスミドは、組換え体ウ
イルスvPTHBaを構築するためにin vivo組換えに用い
た。略語の意味を以下に示す： PTHB＝プロトロンビン配列;tetr＝テトラサイクリン
耐性遺伝子;ssDNA＝一本鎖DNA;tk＝ワクシニアウイルス
チミジンキナーゼ配列;gpt＝E.coliキサンチングアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子;P 11＝ワク
シニアウイルス主要後期11Kポリペプチドのプロモータ
ー;P7.5＝ワクシニアウイルス7.5kDaポリペプチドのプ
ロモーター;MCS＝多重クローニング部位。矢印は転写の
方向を示す。
図２は、ワクシニアウイルス挿入ベクターpTKgpt−PT
HBbの構築を示す。この挿入プラスミドは、ワクシニア
ウイルス組換え体vPTHBbを構築するために用いた。略語
は、図１で上記に説明したとおりである。
HBbの構築を示す。この挿入プラスミドは、ワクシニア
ウイルス組換え体vPTHBbを構築するために用いた。略語
は、図１で上記に説明したとおりである。
図３は、プロトロンビンコード領域とワクシニアウイ
ルス後期P11プロモーター（P11 WT）との融合を示す。
ワクシニアウイルス組換え体vPTHBa及びvPTHBbにおい
て、ヒトプロトロンビンのコード領域を、11Kポリペプ
チドの翻訳開始コドンの真後ろに融合する。オリゴヌク
レオチド指定突然変異誘発による新規のEcoRI制限エン
ドヌクレアーゼ切断部位の挿入のために、プロトロンビ
ンシグナルペプチドは２つの付加的アミノ酸（Asn及びS
er）を含有する。組換え体vPTHBbにおいてはさらに、ポ
リ（Ａ）尾部（cDNA及び組換え体vPTHBa中に存在する60
A残基）、及び14C残基のオリゴ（Ｃ）ストレッチを、第
二のEcoRI部位の挿入とその後の切断により除去した。
ルス後期P11プロモーター（P11 WT）との融合を示す。
ワクシニアウイルス組換え体vPTHBa及びvPTHBbにおい
て、ヒトプロトロンビンのコード領域を、11Kポリペプ
チドの翻訳開始コドンの真後ろに融合する。オリゴヌク
レオチド指定突然変異誘発による新規のEcoRI制限エン
ドヌクレアーゼ切断部位の挿入のために、プロトロンビ
ンシグナルペプチドは２つの付加的アミノ酸（Asn及びS
er）を含有する。組換え体vPTHBbにおいてはさらに、ポ
リ（Ａ）尾部（cDNA及び組換え体vPTHBa中に存在する60
A残基）、及び14C残基のオリゴ（Ｃ）ストレッチを、第
二のEcoRI部位の挿入とその後の切断により除去した。
図４は、ワクシニアウイルス挿入プラスミドpHAgpt−
oFa及びpHAgpt−oFbの構築模式図を示す。HA＝赤血球凝
集素；他の略語は前記の図から得られる。制限エンドヌ
クレアーゼに関しては、共通の略語を用いた。その他の
説明は、実施例IIIをも参照されたい。
oFa及びpHAgpt−oFbの構築模式図を示す。HA＝赤血球凝
集素；他の略語は前記の図から得られる。制限エンドヌ
クレアーゼに関しては、共通の略語を用いた。その他の
説明は、実施例IIIをも参照されたい。
図５は、挿入プラスミドpHAgpt−PTa及びpHAgpt−PTb
の構築模式図を示す。略語に関しては、前記の図を参照
されたい。
の構築模式図を示す。略語に関しては、前記の図を参照
されたい。
図６は、ワクシニアウイルス挿入プラスミドpTKemc−
PT2の構築模式図を示す。Ampr＝アンピシリン耐性遺伝
子;emc＝脳心筋炎ウイルス配列のリーダー配列;T7P＝T7
ポリメラーゼ配列。
PT2の構築模式図を示す。Ampr＝アンピシリン耐性遺伝
子;emc＝脳心筋炎ウイルス配列のリーダー配列;T7P＝T7
ポリメラーゼ配列。
その他の略語は、前記の図及び実施例IVを参照された
い。
い。
図７は、Vero細胞においてプロトロンビンを発現する
異なるウイルス組換え体により誘導される発現レベルの
比較を示す。本実験のために、宿種細胞をそれぞれのウ
イルス組換え体を用いて１細胞当たり1 pfuで感染させ
（T7ベースベクターの場合は、T7ポリメラーゼ提供ウイ
ルス及びT7プロモーター標的遺伝子ウイルスを各々1 pf
u用いた）、ビタミンＫ1の存在下で血清無含有培地中で
増殖させた。72時間後に上澄を収穫し、実施例１に記載
されているようにして、生物学的活性を測定した。
異なるウイルス組換え体により誘導される発現レベルの
比較を示す。本実験のために、宿種細胞をそれぞれのウ
イルス組換え体を用いて１細胞当たり1 pfuで感染させ
（T7ベースベクターの場合は、T7ポリメラーゼ提供ウイ
ルス及びT7プロモーター標的遺伝子ウイルスを各々1 pf
u用いた）、ビタミンＫ1の存在下で血清無含有培地中で
増殖させた。72時間後に上澄を収穫し、実施例１に記載
されているようにして、生物学的活性を測定した。
以下では、ワクシニアウイルス挿入プラスミド、ウイ
ルス組換え体の調製、血液凝固因子プロトロンビンの発
現のための実験、並びにこの発現の最適化のための実験
を記載する。以下の実験は、本発明をさらに説明するの
に役立つが、本発明を限定するものではない。
ルス組換え体の調製、血液凝固因子プロトロンビンの発
現のための実験、並びにこの発現の最適化のための実験
を記載する。以下の実験は、本発明をさらに説明するの
に役立つが、本発明を限定するものではない。
実施例I: VV組換え体vPTHBa及びvPTHBbの調製並びにプロトロン
ビンの発現 1.ワクシニアウイルス挿入プラスミドの構築 ａ）pTKgpt−PTHBaの構築 プロトロンビンcDNAの1.6kb Pstサブ断片（R.T.A.Mac
Gillivray,D.M.Irwin,R.E.Guinto and J.C.Stoneが「ト
ロンビンの機能的マッピングへの組換え遺伝学的アプロ
ーチ」、Annals of New York Academy of Sciences 48
5,73-79（1987）に記載したように、プラスミドpIIH13
から切り出した）を、一本鎖ファージM13mp18中にクロ
ーニングし、ホスホチオネートベースの突然変異誘発手
法（Amersham,Inc.）を用いたオリゴヌクレオチド指定
突然変異誘発により、EcoRI部位を導入した。オリゴヌ
クレオチドoPT1（５′−TCG GAC GTG CGC GGA ATT CAT
AGT GTG TCA−３′）を突然変異誘発のために用いた（E
coRI部位に下線を施す）。オリゴヌクレオチドoPT2
（５′−CTG TGC ACA AGG CTA CAC−３′）は約60bp下
流に位置し、突然変異を制御するためのシークエンス決
定用プライマーとして役立つ。次に、新規のEcoRI−Pst
I断片をオープンリーディングフレーム発現ベクターpT
Kgpt−oFls中にクローニングしたが、これはF.G.Falkne
r及びB.MossがJ.Virol.62,1849-1854（1988）に記載し
ている。プロトロンビンコード領域を完全なものにする
ために、プロトロンビンcDNAの0.4kbPst Iサブ断片を中
間体プラスミドpTKgpt−PTHB1の単一Pst I部位中にクロ
ーニングし、プラスミドpTKgpt−PTHBaを生じた。この
挿入プラスミドの構築を、図１に模式的に示す。
ビンの発現 1.ワクシニアウイルス挿入プラスミドの構築 ａ）pTKgpt−PTHBaの構築 プロトロンビンcDNAの1.6kb Pstサブ断片（R.T.A.Mac
Gillivray,D.M.Irwin,R.E.Guinto and J.C.Stoneが「ト
ロンビンの機能的マッピングへの組換え遺伝学的アプロ
ーチ」、Annals of New York Academy of Sciences 48
5,73-79（1987）に記載したように、プラスミドpIIH13
から切り出した）を、一本鎖ファージM13mp18中にクロ
ーニングし、ホスホチオネートベースの突然変異誘発手
法（Amersham,Inc.）を用いたオリゴヌクレオチド指定
突然変異誘発により、EcoRI部位を導入した。オリゴヌ
クレオチドoPT1（５′−TCG GAC GTG CGC GGA ATT CAT
AGT GTG TCA−３′）を突然変異誘発のために用いた（E
coRI部位に下線を施す）。オリゴヌクレオチドoPT2
（５′−CTG TGC ACA AGG CTA CAC−３′）は約60bp下
流に位置し、突然変異を制御するためのシークエンス決
定用プライマーとして役立つ。次に、新規のEcoRI−Pst
I断片をオープンリーディングフレーム発現ベクターpT
Kgpt−oFls中にクローニングしたが、これはF.G.Falkne
r及びB.MossがJ.Virol.62,1849-1854（1988）に記載し
ている。プロトロンビンコード領域を完全なものにする
ために、プロトロンビンcDNAの0.4kbPst Iサブ断片を中
間体プラスミドpTKgpt−PTHB1の単一Pst I部位中にクロ
ーニングし、プラスミドpTKgpt−PTHBaを生じた。この
挿入プラスミドの構築を、図１に模式的に示す。
ｂ）pTKgpt−PTHBbの構築 この場合は、プロトロンビンcDNAの0.4kb Pst Iサブ
断片（pIIH13から切り出され、シグナル配列及びプロ配
列を包含する）を、M13mp18中にクローニングし、オリ
ゴヌクレオチド指定突然変異誘発により、停止コドンの
70bp下流にEcoRI部位を導入した。オリゴヌクレオチドo
PT3（５′−GTT TCT AAA ACT AGA ATT CCC AAT AAA AGT
−３′）を突然変異誘発のために用いた。オリゴヌクレ
オチドoPT5（５′−ATT CTG GGC TCC TGG A−３′）は
突然変異の約60dp下流に位置し、突然変異を制御するた
めのシークエンス決定用プライマーとして役立った。修
飾された0.4kbPst I断片を中間体プラスミドpTKgpt−PT
HB1の単一Pst I部位中にクローニングした（上記のpTKg
pt−PTHBaの構築を参照）。ポリ（Ａ）配列を伴わない
プロトロンビンcDNAを含有する2.0kbのEcoRI断片をpTKg
pt−oFlsの単一EcoRI部位中にクローニングして、プラ
スミドpTKgpt−PTHBbを生じた。この挿入プラスミドの
構築を、図２に模式的に示す。
断片（pIIH13から切り出され、シグナル配列及びプロ配
列を包含する）を、M13mp18中にクローニングし、オリ
ゴヌクレオチド指定突然変異誘発により、停止コドンの
70bp下流にEcoRI部位を導入した。オリゴヌクレオチドo
PT3（５′−GTT TCT AAA ACT AGA ATT CCC AAT AAA AGT
−３′）を突然変異誘発のために用いた。オリゴヌクレ
オチドoPT5（５′−ATT CTG GGC TCC TGG A−３′）は
突然変異の約60dp下流に位置し、突然変異を制御するた
めのシークエンス決定用プライマーとして役立った。修
飾された0.4kbPst I断片を中間体プラスミドpTKgpt−PT
HB1の単一Pst I部位中にクローニングした（上記のpTKg
pt−PTHBaの構築を参照）。ポリ（Ａ）配列を伴わない
プロトロンビンcDNAを含有する2.0kbのEcoRI断片をpTKg
pt−oFlsの単一EcoRI部位中にクローニングして、プラ
スミドpTKgpt−PTHBbを生じた。この挿入プラスミドの
構築を、図２に模式的に示す。
上記のプラスミドの両方において、プロトロンビンコ
ード領域を11Kポリペプチドの開始コドンの後ろに正確
に融合する。この正確な融合を得るための模式図を、図
３に示す。図３から推測されるように、オリゴヌクレオ
チド指定突然変異誘発による新規のEcoRI部位の導入の
ために選択されたストラテジーは、プロトロンビンのシ
グナルペプチド中への２つの付加的アミノ酸（Asn及びS
er）の組込みをもたらした。シグナルペプチド切断部位
は約40アミノ酸離れて位置するため、この突然変異は正
確なプロセッシング及び成熟ポリペプチド鎖の分泌を妨
害しないと思われる。
ード領域を11Kポリペプチドの開始コドンの後ろに正確
に融合する。この正確な融合を得るための模式図を、図
３に示す。図３から推測されるように、オリゴヌクレオ
チド指定突然変異誘発による新規のEcoRI部位の導入の
ために選択されたストラテジーは、プロトロンビンのシ
グナルペプチド中への２つの付加的アミノ酸（Asn及びS
er）の組込みをもたらした。シグナルペプチド切断部位
は約40アミノ酸離れて位置するため、この突然変異は正
確なプロセッシング及び成熟ポリペプチド鎖の分泌を妨
害しないと思われる。
pTKgpt−PTHBbにおいては、さらに、プロトロンビンc
DNAのポリ（Ａ）尾部、及び14 bp G/C配列を、プロトロ
ンビン遺伝子の３′末端に第二のEcoRI部位を導入し、
その後切断することにより除去したが、一方、pTKgpt−
PTHBaにおいては、ポリ（Ａ）尾部及び14 bp G/C配列は
依然として存在することが、図３から推測される。
DNAのポリ（Ａ）尾部、及び14 bp G/C配列を、プロトロ
ンビン遺伝子の３′末端に第二のEcoRI部位を導入し、
その後切断することにより除去したが、一方、pTKgpt−
PTHBaにおいては、ポリ（Ａ）尾部及び14 bp G/C配列は
依然として存在することが、図３から推測される。
2.ワクシニアウイルス組換え体vPTHBa及びvPTHBbの構築 In vivo組換えのために、M.Macket et al.が「外来遺
伝子を発現するワクシニアウイルス組換え体の構築と特
徴づけ」,D.M.Glover編「DNAクローニング：実際的アプ
ローチ」、IRL Press,Oxford（1985）,p.191-211に記載
した手法を、以下の修正を加えて実施した： 5x106CV1細胞（集密的単層）を0.2pfu/細胞のワクシ
ニア野生型ウイルスで感染させた。感染２時間後に、1m
lのカルシウムDNA沈殿物（５μｇのpTKgpt−PTHBa又はp
TKgpt−PTHBbの超らせんプラスミドDNA、１μｇのワク
シニアウイルス野生型DNA、及び14μｇの剪断ニシン精
子DNAから成る）を細胞に付加した。室温で15分間イン
キュベートした後、9mlの培地（DMEM、８％FBS及び抗生
物質入り）を加えた。４時間後に培地を変え、インキュ
ベーションをさらに48時間継続した。細胞を収穫し、1m
l培地中に再懸濁し、ウイルス粗製ストックを調製し
た。
伝子を発現するワクシニアウイルス組換え体の構築と特
徴づけ」,D.M.Glover編「DNAクローニング：実際的アプ
ローチ」、IRL Press,Oxford（1985）,p.191-211に記載
した手法を、以下の修正を加えて実施した： 5x106CV1細胞（集密的単層）を0.2pfu/細胞のワクシ
ニア野生型ウイルスで感染させた。感染２時間後に、1m
lのカルシウムDNA沈殿物（５μｇのpTKgpt−PTHBa又はp
TKgpt−PTHBbの超らせんプラスミドDNA、１μｇのワク
シニアウイルス野生型DNA、及び14μｇの剪断ニシン精
子DNAから成る）を細胞に付加した。室温で15分間イン
キュベートした後、9mlの培地（DMEM、８％FBS及び抗生
物質入り）を加えた。４時間後に培地を変え、インキュ
ベーションをさらに48時間継続した。細胞を収穫し、1m
l培地中に再懸濁し、ウイルス粗製ストックを調製し
た。
3.gpt+ワクシニアウイルス組換え体の選択 gpt+突然変異体の単離のために、BSC1細胞上でのプラ
ーク検定を以下のように実施した：集密状態のBSC1細胞
をgpt選択培地（DMEM、2.5％ FBS、抗生物質、25μg/ml
のMPA、250μg/mlのキサンチン、及び15μg/mlのヒポキ
サンチン）中で14〜24時間、プレイキュベートした。ウ
イルス粗製ストック（0.5mlの再懸濁細胞を３回凍結、
解氷し、等容量の0.25mg/mlのトリプシンを添加した。
混合液を＋37℃で30分消化し、20秒間音波破砕した）の
10-3、10-4、及び10-5希釈液を用いて、BSC1細胞を感染
させた。＋37℃で1.5時間インキュベーション後、細胞
に、１％の低融点アガロースを含有するgpt選択培地を
重層した。２日間インキュベーション後、細胞をニュー
トラルレッドで染色した。一夜インキュベーション後、
プラークが見え易くなった。F.G.Falkner et alがJ.Vir
ol.62,1849-1854,1988に記載しているようにプラーク精
製を実施した。
ーク検定を以下のように実施した：集密状態のBSC1細胞
をgpt選択培地（DMEM、2.5％ FBS、抗生物質、25μg/ml
のMPA、250μg/mlのキサンチン、及び15μg/mlのヒポキ
サンチン）中で14〜24時間、プレイキュベートした。ウ
イルス粗製ストック（0.5mlの再懸濁細胞を３回凍結、
解氷し、等容量の0.25mg/mlのトリプシンを添加した。
混合液を＋37℃で30分消化し、20秒間音波破砕した）の
10-3、10-4、及び10-5希釈液を用いて、BSC1細胞を感染
させた。＋37℃で1.5時間インキュベーション後、細胞
に、１％の低融点アガロースを含有するgpt選択培地を
重層した。２日間インキュベーション後、細胞をニュー
トラルレッドで染色した。一夜インキュベーション後、
プラークが見え易くなった。F.G.Falkner et alがJ.Vir
ol.62,1849-1854,1988に記載しているようにプラーク精
製を実施した。
4.プロトロンビン発現組換え体ウイルスのスクリーニン
グ ａ）種子ウイルスによる細胞の感染 サル腎細胞（CV1及びVero細胞）を抗生物質及びグル
タミンを加えたDMEM,10％ウシ胎仔血清中で増殖させ
た。集密状態に達する１日前に、ビタミンＫ1を20μg/m
lの最終濃度で添加した（ビタミンＫ1はシグマから購入
した＃V-3501で、エタノール中に溶解した5mg/mlストッ
ク溶液として＋４℃で貯蔵した）。単層が集密状態に達
したら、それらをMg2+及びCa2+を含有するリン酸緩衝生
理食塩水中で２回洗浄し、その後、0.1〜10プラーク形
成単位（pfu）の精製ウイルスで感染させた。１時間の
ウイルス吸着後、血清無含有培地（DMEM）及びビタミン
Ｋを添加した。
グ ａ）種子ウイルスによる細胞の感染 サル腎細胞（CV1及びVero細胞）を抗生物質及びグル
タミンを加えたDMEM,10％ウシ胎仔血清中で増殖させ
た。集密状態に達する１日前に、ビタミンＫ1を20μg/m
lの最終濃度で添加した（ビタミンＫ1はシグマから購入
した＃V-3501で、エタノール中に溶解した5mg/mlストッ
ク溶液として＋４℃で貯蔵した）。単層が集密状態に達
したら、それらをMg2+及びCa2+を含有するリン酸緩衝生
理食塩水中で２回洗浄し、その後、0.1〜10プラーク形
成単位（pfu）の精製ウイルスで感染させた。１時間の
ウイルス吸着後、血清無含有培地（DMEM）及びビタミン
Ｋを添加した。
細胞を２日間増殖させ、その後、下記のように、アル
カリホスファターゼを結合した細胞上澄のタンパク質を
沈殿させて、ヒトプロトロンビンに対する抗体を用いて
ウエスターンブロッティングにより分析した： ｂ）細胞培養上澄のアセトン沈殿 上澄を3000gで10分間遠心分離して細胞砕片を除去
し、２容量のアセトンで沈殿させて、氷上で30分インキ
ュベートした。8000gで10分間遠心分離後、ペレットを
0.25mlの0.01N NaOH中に再溶解し、70℃で３分間加熱し
て、遠心分離し、未溶解物質を除去した。上澄を20μｌ
の1Mトリス／塩酸,pH7.0で中和し、２容量のアセトンで
再び沈殿させた。その結果生じたペレットを40μｌのSD
S試料緩衝液中に溶解した。通常、10μｌをゲル上に載
せた。
カリホスファターゼを結合した細胞上澄のタンパク質を
沈殿させて、ヒトプロトロンビンに対する抗体を用いて
ウエスターンブロッティングにより分析した： ｂ）細胞培養上澄のアセトン沈殿 上澄を3000gで10分間遠心分離して細胞砕片を除去
し、２容量のアセトンで沈殿させて、氷上で30分インキ
ュベートした。8000gで10分間遠心分離後、ペレットを
0.25mlの0.01N NaOH中に再溶解し、70℃で３分間加熱し
て、遠心分離し、未溶解物質を除去した。上澄を20μｌ
の1Mトリス／塩酸,pH7.0で中和し、２容量のアセトンで
再び沈殿させた。その結果生じたペレットを40μｌのSD
S試料緩衝液中に溶解した。通常、10μｌをゲル上に載
せた。
ｃ）ウエスターンブロット分析 手法は、本質的にはH.Towbin et al.がProc.Natl.Aca
d.Sci.USA83,6672-6676（1979）に記載した通りに実施
し、以下の修正を加えた：タンパク質を10％SDS−ポリ
アクリルアミドゲル上で分離し、12.5mMトリス、96mMグ
リシンpH8.3、及び10％メタノールを含有するトランス
ファー緩衝液中でHoefer TEシリーズTransphor電気泳動
ユニットで200mAで１時間、ニトロセルロース膜（Amer
sham Hybond C）上にブロットした。膜をウエスターン
緩衝液（WB,リン酸緩衝生理食塩水,0.1％トゥイーン（T
ween）20）中に20分間３回浸漬し、10％正常ヒツジ血清
を含有するWB20ml中でプレインキュベートした。１時間
後、40μｌのアルカリホスファターゼと結合したヒツジ
抗ヒトプロトロンビン抗体（Serotec AHP 06A）を添加
（その結果抗血清の1:500希釈液を生じる）し、インキ
ュベーションを一夜継続した。膜をWB中で10分間、３
回、アルカリホスファターゼ（AP）緩衝液（0.1Mトリス
/CH1 pH9.5、0.1M NaCl、5mM MgCl2）中で３分間、１
回、洗浄し、その後66μｌニトロブルーテトラゾリウム
（NBT;70％ジメチルホルムアミド中に50μg/ml）及び33
μl5−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェー
ト（BCiP;ジメチルホルムアミド中に50μg/ml）を含有
する10mlのAP緩衝液中で３〜10分間、発色させた。
d.Sci.USA83,6672-6676（1979）に記載した通りに実施
し、以下の修正を加えた：タンパク質を10％SDS−ポリ
アクリルアミドゲル上で分離し、12.5mMトリス、96mMグ
リシンpH8.3、及び10％メタノールを含有するトランス
ファー緩衝液中でHoefer TEシリーズTransphor電気泳動
ユニットで200mAで１時間、ニトロセルロース膜（Amer
sham Hybond C）上にブロットした。膜をウエスターン
緩衝液（WB,リン酸緩衝生理食塩水,0.1％トゥイーン（T
ween）20）中に20分間３回浸漬し、10％正常ヒツジ血清
を含有するWB20ml中でプレインキュベートした。１時間
後、40μｌのアルカリホスファターゼと結合したヒツジ
抗ヒトプロトロンビン抗体（Serotec AHP 06A）を添加
（その結果抗血清の1:500希釈液を生じる）し、インキ
ュベーションを一夜継続した。膜をWB中で10分間、３
回、アルカリホスファターゼ（AP）緩衝液（0.1Mトリス
/CH1 pH9.5、0.1M NaCl、5mM MgCl2）中で３分間、１
回、洗浄し、その後66μｌニトロブルーテトラゾリウム
（NBT;70％ジメチルホルムアミド中に50μg/ml）及び33
μl5−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェー
ト（BCiP;ジメチルホルムアミド中に50μg/ml）を含有
する10mlのAP緩衝液中で３〜10分間、発色させた。
全試料において、精製プロトロンビン対照と共移動す
る新規のタンパク質バンドが容易に観察されたが、この
バンドは非感染又は野生型感染細胞には存在しなかっ
た。このスクリーニング工程に基いて、陽性ウイルスvP
THBa及びvPTHBbを大量に増殖させて、精製した。
る新規のタンパク質バンドが容易に観察されたが、この
バンドは非感染又は野生型感染細胞には存在しなかっ
た。このスクリーニング工程に基いて、陽性ウイルスvP
THBa及びvPTHBbを大量に増殖させて、精製した。
ｄ）ウイルス組換え体のゲノム特性 組換え体ウイルスにおけるプロトロンビン遺伝子の存
在及び組込みパターンを調べるために、制限酵素切断、
及びその後サザーンブロット分析を実施した。精製組換
え体vPTHBa及びvPTHBbのDNAを制限エンドヌクレアーゼH
ind III及びEcoRIで消化し、１％アガロースゲル中を電
気泳動し、ニトロセルロースフィルター上にブロットし
た。フィルターを先ずチミジンキナーゼプローブ（tk−
プローブ）で、その後プロトロンビン遺伝子プローブ
（PTHB−プローブ）でハイブリダイズした： tk−プローブでハイブリダイズしたHind III消化試料
においては、チミジンキナーゼ遺伝子を含有する野生型
ウイルスHind III J断片は、約5.0kbのバンドとして見
えた。両組換え体ウイルスは約6.0kbの予測されたバン
ドと、tk配列を含有する約1.0kbの小型化したバンドを
含有した。プロトロンビンプローブを用いた場合、6.0k
bのバンドのみが観察された。得られたパターンは、プ
ロトロンビンcDNAのウイルスtk−遺伝子座への組み込み
を確証する。
在及び組込みパターンを調べるために、制限酵素切断、
及びその後サザーンブロット分析を実施した。精製組換
え体vPTHBa及びvPTHBbのDNAを制限エンドヌクレアーゼH
ind III及びEcoRIで消化し、１％アガロースゲル中を電
気泳動し、ニトロセルロースフィルター上にブロットし
た。フィルターを先ずチミジンキナーゼプローブ（tk−
プローブ）で、その後プロトロンビン遺伝子プローブ
（PTHB−プローブ）でハイブリダイズした： tk−プローブでハイブリダイズしたHind III消化試料
においては、チミジンキナーゼ遺伝子を含有する野生型
ウイルスHind III J断片は、約5.0kbのバンドとして見
えた。両組換え体ウイルスは約6.0kbの予測されたバン
ドと、tk配列を含有する約1.0kbの小型化したバンドを
含有した。プロトロンビンプローブを用いた場合、6.0k
bのバンドのみが観察された。得られたパターンは、プ
ロトロンビンcDNAのウイルスtk−遺伝子座への組み込み
を確証する。
tk−プローブでハイブリダイズしたEcoRI消化試料に
おいては、野生型ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子は
約7.0及び8.0kbの２つの断片に分割された。vPTHBa試料
では、プロトロンビン遺伝子の組み込みのために、約9.
0及び10.0kbの２つの予測された大型化した断片が現れ
た。vPTHBbでは、第二のEcoRI部位が導入され、これはE
coRI消化時にプロトロンビン遺伝子の切り出しを生じ
る。したがって、vPTHBbパターンは、10.0kb断片（vPTH
Ba試料にも認められる）及び7.0kb断片（野生型DNAにも
認められる）を示した。プロトロンビンプローブを用い
た場合、vPTHBaでは予期された9.0kb断片が、vPTHBbで
は、2.0kbの切り出されたプロトロンビン遺伝子が検出
された。分析により、２つの組換え体ウイルスの予期さ
れた組み込みパターンが確証された。
おいては、野生型ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子は
約7.0及び8.0kbの２つの断片に分割された。vPTHBa試料
では、プロトロンビン遺伝子の組み込みのために、約9.
0及び10.0kbの２つの予測された大型化した断片が現れ
た。vPTHBbでは、第二のEcoRI部位が導入され、これはE
coRI消化時にプロトロンビン遺伝子の切り出しを生じ
る。したがって、vPTHBbパターンは、10.0kb断片（vPTH
Ba試料にも認められる）及び7.0kb断片（野生型DNAにも
認められる）を示した。プロトロンビンプローブを用い
た場合、vPTHBaでは予期された9.0kb断片が、vPTHBbで
は、2.0kbの切り出されたプロトロンビン遺伝子が検出
された。分析により、２つの組換え体ウイルスの予期さ
れた組み込みパターンが確証された。
5.プロトロンビンを分泌する好ましい細胞株の選択 例えば増殖、基材への付着、分泌及び翻訳後修飾とい
ったようなある種の機能に関する細胞のポテンシャル
は、細胞の種類によって変化する。以下の実験は、ワク
シニアウイルス宿主範囲内にあって、許容可能な増殖特
性を有し、活性のあるビタミンＫ依存性タンパク質を分
泌可能な細胞株をスクリーニングし、同定するのに役立
つ。
ったようなある種の機能に関する細胞のポテンシャル
は、細胞の種類によって変化する。以下の実験は、ワク
シニアウイルス宿主範囲内にあって、許容可能な増殖特
性を有し、活性のあるビタミンＫ依存性タンパク質を分
泌可能な細胞株をスクリーニングし、同定するのに役立
つ。
プロトロンビン欠損血漿を用いて、凝固検定でプロト
ロンビン活性を測定した。既知の濃度（免疫FII、IX、X
-CPK標準）のヒトプロトロンビンを用いて、標準曲線を
作成した。
ロンビン活性を測定した。既知の濃度（免疫FII、IX、X
-CPK標準）のヒトプロトロンビンを用いて、標準曲線を
作成した。
表１に示した実験に関しては、細胞をvPTHBaで感染さ
せた。48時間後に収穫した上澄及び総細胞タンパク質
を、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析
し、クマシーブルー染色したゲル中で既知量の精製プロ
トロンビンに対して定量した。
せた。48時間後に収穫した上澄及び総細胞タンパク質
を、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析
し、クマシーブルー染色したゲル中で既知量の精製プロ
トロンビンに対して定量した。
肝細胞株（Hep G2及びH4-11-E-C3）の他に、腎細胞
（例えば、BHK及びMDCK）及び卵巣細胞（CHO）も、活性
のあるガンマカルボキシル化タンパク質を産生すること
が示された。これらの細胞株の公知の特性、及び生物学
的に活性のあるプロトロンビンの発現のための要求に基
いて、表１に列挙した細胞株を、プロトロンビン発現試
験用に選択した。
（例えば、BHK及びMDCK）及び卵巣細胞（CHO）も、活性
のあるガンマカルボキシル化タンパク質を産生すること
が示された。これらの細胞株の公知の特性、及び生物学
的に活性のあるプロトロンビンの発現のための要求に基
いて、表１に列挙した細胞株を、プロトロンビン発現試
験用に選択した。
表１から、アフリカミドリザル腎細胞株BSC1、CV1、
及びVero細胞が最も十分にプロトロンビンを分泌するこ
とが分かる。ウサギ腎細胞株RK13に関しては、それが大
量のタンパク質を細胞内に蓄積することが示された。プ
ロトロンビンの分泌及び蓄積は、本発明の組換え体ウイ
ルスで感染させた場合、腎細胞株293及びBHK-21にも見
出された。
及びVero細胞が最も十分にプロトロンビンを分泌するこ
とが分かる。ウサギ腎細胞株RK13に関しては、それが大
量のタンパク質を細胞内に蓄積することが示された。プ
ロトロンビンの分泌及び蓄積は、本発明の組換え体ウイ
ルスで感染させた場合、腎細胞株293及びBHK-21にも見
出された。
本発明のワクシニアウイルス組換え体は、血液因子、
特にビタミンＫ依存性血液凝固因子の発現に関する、細
胞株の迅速なスクリーニングを可能にする。同一サイズ
範囲における移動は、ワクシニアウイルス感染細胞に由
来する組換えプロトロンビンが血液由来タンパク質と同
程度のグリコシル化を示すことを示唆する。
特にビタミンＫ依存性血液凝固因子の発現に関する、細
胞株の迅速なスクリーニングを可能にする。同一サイズ
範囲における移動は、ワクシニアウイルス感染細胞に由
来する組換えプロトロンビンが血液由来タンパク質と同
程度のグリコシル化を示すことを示唆する。
6.生物学的に活性のあるプロトロンビンの発現の最適化 上記の実験が、感染CV1及びVero細胞の上澄中のプロ
トロンビンレベルが、試験した他の細胞株よりも有意に
高いことを示し、予備血液凝固検定は上澄が生物学的に
非常に活性であることを示したために、これら２つの細
胞株を以下の実験用に選択した。
トロンビンレベルが、試験した他の細胞株よりも有意に
高いことを示し、予備血液凝固検定は上澄が生物学的に
非常に活性であることを示したために、これら２つの細
胞株を以下の実験用に選択した。
ａ）第一の実験において、プロトロンビン発現ウイルス
による感染の用量への細胞培養上澄の活性の依存性を測
定した。細胞当り0.1〜20プラーク形成単位の範囲のvPT
HBa又はvPTHBaでは、48時間上澄におけるプロトロンビ
ンレベルは、有意に相異しなかった。したがって、細胞
当たり0.1〜３、好ましくは0.1〜１プラーク形成単位
が、CV1及びVero細胞の両方において、最大量の分泌さ
れたII因子を得るのに十分であることが推測される。
による感染の用量への細胞培養上澄の活性の依存性を測
定した。細胞当り0.1〜20プラーク形成単位の範囲のvPT
HBa又はvPTHBaでは、48時間上澄におけるプロトロンビ
ンレベルは、有意に相異しなかった。したがって、細胞
当たり0.1〜３、好ましくは0.1〜１プラーク形成単位
が、CV1及びVero細胞の両方において、最大量の分泌さ
れたII因子を得るのに十分であることが推測される。
ｂ）以下の実験は、インキュベーション時間の増加に伴
う分泌タンパク質の蓄積に関する。感染CV1細胞の細胞
培養上澄を、感染後12、24、48、60、72及び96時間目に
調べた。分泌されたプロトロンビンの連続的増加が、72
時間までの範囲の時間に亘って観察された。これらの試
験を、ゲル電気泳動及びウエスターンブロット分析と共
に行なった。長時間に亘って、他の分泌タンパク質の増
加も認められることが観察された。分泌されたプロトロ
ンビンの最大は、60〜72時間であることが示された。
う分泌タンパク質の蓄積に関する。感染CV1細胞の細胞
培養上澄を、感染後12、24、48、60、72及び96時間目に
調べた。分泌されたプロトロンビンの連続的増加が、72
時間までの範囲の時間に亘って観察された。これらの試
験を、ゲル電気泳動及びウエスターンブロット分析と共
に行なった。長時間に亘って、他の分泌タンパク質の増
加も認められることが観察された。分泌されたプロトロ
ンビンの最大は、60〜72時間であることが示された。
ｃ）プロトロンビン発現の細胞周期依存性 本発明の系における有効な発現のための別の不可欠の
パラメーターは、感染細胞の細胞周期の相であることが
判明した。この実験のためには、感染前にCV1細胞を、
ビタミンＫ1の存在下でそれらがちょうど集密状態に達
するまで、又はさらに１、２もしくは３日間増殖させ
た。感染後48及び72時間目にII因子活性に関して、上澄
を調べた。
パラメーターは、感染細胞の細胞周期の相であることが
判明した。この実験のためには、感染前にCV1細胞を、
ビタミンＫ1の存在下でそれらがちょうど集密状態に達
するまで、又はさらに１、２もしくは３日間増殖させ
た。感染後48及び72時間目にII因子活性に関して、上澄
を調べた。
細胞が集密状態に達した直後（１日）に感染を実施し
た場合、中等度の活性レベルが得られることが観察され
た。しかしながら、集密的単層の加齢に伴って、プロト
ロンビンの連続的増大が観察された。プロトロンビン活
性の最大は、集密状態に達したCV1細胞を感染後に得ら
れた。感染前の細胞を静止期に止めると最高の結果が得
られることが、反復実験で示された。発現レベルの増大
は、一部は細胞密度の増加に依っているが、しかし密度
の増大のみでは全体的発現増大を説明するのに十分でな
い。
た場合、中等度の活性レベルが得られることが観察され
た。しかしながら、集密的単層の加齢に伴って、プロト
ロンビンの連続的増大が観察された。プロトロンビン活
性の最大は、集密状態に達したCV1細胞を感染後に得ら
れた。感染前の細胞を静止期に止めると最高の結果が得
られることが、反復実験で示された。発現レベルの増大
は、一部は細胞密度の増加に依っているが、しかし密度
の増大のみでは全体的発現増大を説明するのに十分でな
い。
7.発現レベルの算出 CV1及びBSC1細胞において上記の実験で得られたよう
な発現レベルは、8.0μg/mlまでのプロトロンビン抗原
を産生したと決定した。
な発現レベルは、8.0μg/mlまでのプロトロンビン抗原
を産生したと決定した。
8.生物学的活性の測定 組換えプロトロンビンの生物学的活性が培地1ml当た
り50〜70ミリユニットであることを決定し、したがっ
て、生物学的活性形態の抗原形態に対する比率がVero細
胞では70％まで、CV1細胞では60％までである組換えプ
ロトロンビンを産生した。
り50〜70ミリユニットであることを決定し、したがっ
て、生物学的活性形態の抗原形態に対する比率がVero細
胞では70％まで、CV1細胞では60％までである組換えプ
ロトロンビンを産生した。
実施例II: ワクシニアウイルス組換え体vPT6/2の構築及びプロトロ
ンビンの発現 組換え体ウイルスvPT6/2を構築するために、図２に示
すような挿入プラスミドpTKgpt−PTHBbをワクシニアウ
イルスWR6/2株で組換えた（Moss et al.:「非必須ポリ
ペプチドをコードするワクシニアウイルスゲノムの9,00
0bp断片の欠失」;J.Virol.40,1981,387-395;この株は、
NTISを介して公的に入手可能である）。この株は、通常
用いられるWR株と比較してさらに弱毒化されており（マ
ウスモデルでは106倍;Buller et al.:「組換えワクシニ
アウイルス発現ベクターの減少された悪性度はチミジン
キナーゼ陰性の表現型と関連している」;Nature 317,19
85,813-815）、産生するにはより安全なベクターであ
る。
ンビンの発現 組換え体ウイルスvPT6/2を構築するために、図２に示
すような挿入プラスミドpTKgpt−PTHBbをワクシニアウ
イルスWR6/2株で組換えた（Moss et al.:「非必須ポリ
ペプチドをコードするワクシニアウイルスゲノムの9,00
0bp断片の欠失」;J.Virol.40,1981,387-395;この株は、
NTISを介して公的に入手可能である）。この株は、通常
用いられるWR株と比較してさらに弱毒化されており（マ
ウスモデルでは106倍;Buller et al.:「組換えワクシニ
アウイルス発現ベクターの減少された悪性度はチミジン
キナーゼ陰性の表現型と関連している」;Nature 317,19
85,813-815）、産生するにはより安全なベクターであ
る。
プロトロンビンの発現のために、実施例Ｉに記載され
たと同様の方法で、vPT6/2を用いた。Vero細胞における
プロトロンビンの生物学的活性の生成力は、図７から得
られる。その他の条件に関しては、図７の凡例を参照さ
れたい。
たと同様の方法で、vPT6/2を用いた。Vero細胞における
プロトロンビンの生物学的活性の生成力は、図７から得
られる。その他の条件に関しては、図７の凡例を参照さ
れたい。
実施例III: プロトロンビンcDNAのワクシニアウイルス赤血球凝集素
遺伝子座への挿入のためのプラスミド 実施例Ｉ及びIIに記載されているようなプロトロンビ
ン発現組換え体において、プロトロンビンcDNAをウイル
スチミジンキナーゼ遺伝子座に組み込んだ。ウイルスtk
遺伝子の不活性化はウイルスを弱毒するため、この弱毒
化はさらに発現される外来遺伝子の発現レベルの低減を
引き起こすと考えられる。
遺伝子座への挿入のためのプラスミド 実施例Ｉ及びIIに記載されているようなプロトロンビ
ン発現組換え体において、プロトロンビンcDNAをウイル
スチミジンキナーゼ遺伝子座に組み込んだ。ウイルスtk
遺伝子の不活性化はウイルスを弱毒するため、この弱毒
化はさらに発現される外来遺伝子の発現レベルの低減を
引き起こすと考えられる。
したがって、ワクシニアウイルスの赤血球凝集素遺伝
子座に組み込まれた外来遺伝子を有する２つのウイルス
組換え体を構築した。
子座に組み込まれた外来遺伝子を有する２つのウイルス
組換え体を構築した。
1.ワクシニアウイルス挿入プラスミドpHAgpt−oFa及びp
HAgpt−oFbの構築 ワクシニア赤血球凝集素遺伝子の1.6kb HincII断片
（Shida H.:「ワクシニアウイルス赤血球凝集素の塩基
配列」;Virology 150,451-562）をpTZ19R（Pharmacia,I
nc.）の大型Pvu IIベクター断片と連結することによ
り、基本ベクターpHAを構築した。HA遺伝子の供給源
は、プラスミドpVY5（B.Mossから入手）であった。pHA
の単一NruI部位に、プラスミドpTKgpt−oFlsの1.7kb Hp
aI−DraI遺伝子カセットを挿入した（Falkner,F.G.,Mos
s B.:「大腸菌gpt遺伝子はワクチニアウイルスオープン
リーディングフレーム発現ベクターのための優性選択マ
ーカーを提供する」;J.Virol.1988;62:1849-1854）。カ
セットは、多重クローニング部位を含むP11プロモータ
ー、及びワクシニアウイルスP7.5プロモーターによって
駆動されるgpt遺伝子から成る。２つの考え得る配向
は、pHAgpt−oFa及びpHAgpt−oFbを示した。これらのプ
ラスミドを、図４に示す。
HAgpt−oFbの構築 ワクシニア赤血球凝集素遺伝子の1.6kb HincII断片
（Shida H.:「ワクシニアウイルス赤血球凝集素の塩基
配列」;Virology 150,451-562）をpTZ19R（Pharmacia,I
nc.）の大型Pvu IIベクター断片と連結することによ
り、基本ベクターpHAを構築した。HA遺伝子の供給源
は、プラスミドpVY5（B.Mossから入手）であった。pHA
の単一NruI部位に、プラスミドpTKgpt−oFlsの1.7kb Hp
aI−DraI遺伝子カセットを挿入した（Falkner,F.G.,Mos
s B.:「大腸菌gpt遺伝子はワクチニアウイルスオープン
リーディングフレーム発現ベクターのための優性選択マ
ーカーを提供する」;J.Virol.1988;62:1849-1854）。カ
セットは、多重クローニング部位を含むP11プロモータ
ー、及びワクシニアウイルスP7.5プロモーターによって
駆動されるgpt遺伝子から成る。２つの考え得る配向
は、pHAgpt−oFa及びpHAgpt−oFbを示した。これらのプ
ラスミドを、図４に示す。
2.ワクシニアウイルス挿入プラスミドpHAgpt−PTa及びp
HAgpt−PTbの構築 pTKgpt−PTHBbの2.0kb EcoRI断片をEcoRIで線状化
し、ホスファターゼ処理したプラスミドpHAgpt−oFa中
に挿入することにより、プラスミドpHAgpt−PTaを構築
した。
HAgpt−PTbの構築 pTKgpt−PTHBbの2.0kb EcoRI断片をEcoRIで線状化
し、ホスファターゼ処理したプラスミドpHAgpt−oFa中
に挿入することにより、プラスミドpHAgpt−PTaを構築
した。
同様に、上記の2.0kb EcoRI断片を、EcoRIで線状化し
たプラスミドpHAgpt−oFb中に挿入することにより、プ
ラスミドpHAgpt−PTbを構築した。
たプラスミドpHAgpt−oFb中に挿入することにより、プ
ラスミドpHAgpt−PTbを構築した。
図５に示す上記のプラスミドを用いて、ワクシニア野
生型ウイルスによるin vivo組換えによって組換え体ウ
イルスvHA−PTa及びvHA−PTbを生成した。
生型ウイルスによるin vivo組換えによって組換え体ウ
イルスvHA−PTa及びvHA−PTbを生成した。
Vero細胞を、実施例IIに記載されているのと同様の方
法で、上記の組換え体ウイルスに感染させた。他のウイ
ルス組換え体と比較した場合のプロトロンビンの発現レ
ベルは、図７から推測される。
法で、上記の組換え体ウイルスに感染させた。他のウイ
ルス組換え体と比較した場合のプロトロンビンの発現レ
ベルは、図７から推測される。
実施例IV: ワクシニアウイルス組換え体vTKemc−PT2の構築及びプ
ロトロンビン発現のためのその使用 プロトロンビン発現のレベルを改良するために、非常
に有効なハイブリッドワクシニアウイルス発現系に基い
た、新規のワクシニアウイルス組換え体を構築した。こ
の系では、あるウイルスはバクテリオファージT7ポリメ
ラーゼを発現し、第二のウイルスは脳心筋炎（EMC）ウ
イルスのリーダー配列を後ろに持っているT7プロモータ
ーの制御下で、標的遺伝子（プロトロンビン）を発現す
る（Elroy-Stein et al.:「脳心筋炎ウイルス５′配列
によって付与されるmRNAのキャップ非依存性翻訳はワク
シニアウイルス／バクテリオファージT7ハイブリッド発
現系の功績を改良する」Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,1
989;86,6126-6130）。このEMCリーダーは、T7転写物に
キャップ非依存性翻訳を付与し、したがって翻訳効率を
増大する。
ロトロンビン発現のためのその使用 プロトロンビン発現のレベルを改良するために、非常
に有効なハイブリッドワクシニアウイルス発現系に基い
た、新規のワクシニアウイルス組換え体を構築した。こ
の系では、あるウイルスはバクテリオファージT7ポリメ
ラーゼを発現し、第二のウイルスは脳心筋炎（EMC）ウ
イルスのリーダー配列を後ろに持っているT7プロモータ
ーの制御下で、標的遺伝子（プロトロンビン）を発現す
る（Elroy-Stein et al.:「脳心筋炎ウイルス５′配列
によって付与されるmRNAのキャップ非依存性翻訳はワク
シニアウイルス／バクテリオファージT7ハイブリッド発
現系の功績を改良する」Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,1
989;86,6126-6130）。このEMCリーダーは、T7転写物に
キャップ非依存性翻訳を付与し、したがって翻訳効率を
増大する。
1.ワクシニアウイルス挿入プラスミドpTKemc−PT2の構
築 プロトロンビンcDNAを含有するプラスミドpTKgpt−PT
HBbの2.0kb EcoRI断片（図２）を、ベクターpTM3の単一
EcoRI部位に挿入した。その結果生じたプラスミドpTKem
c−PTxに、プロトロンビンcDNAを、ベクターpTM3によっ
て提供される開始コドンの後ろにフレームをずらして挿
入する。コード領域を開始コドンと正確に融合するため
にpTKemc−PTx一本鎖DNA及びオリゴヌクレオチドoPT9
（５′−AGC CTC GGA CGT GCG CCA TGG TAT TAT CGT−
３′）を用いて、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発
を実施した。プラスミドをE.coli NM522株中にトランス
フェクトし、ヘルパーファージM13 K07で重感染するこ
とにより、pTKemc−PTxから一本鎖DNAを得た。その結果
生じたプラスミドpTKemc−PT2において、開始コドン周
囲の融合部位の正確な一次構造を、プライマーoPT2
（５′−CTG TGC ACA AGG CTA CAC−２′）を用いたシ
ーケンス決定により確証した。
築 プロトロンビンcDNAを含有するプラスミドpTKgpt−PT
HBbの2.0kb EcoRI断片（図２）を、ベクターpTM3の単一
EcoRI部位に挿入した。その結果生じたプラスミドpTKem
c−PTxに、プロトロンビンcDNAを、ベクターpTM3によっ
て提供される開始コドンの後ろにフレームをずらして挿
入する。コード領域を開始コドンと正確に融合するため
にpTKemc−PTx一本鎖DNA及びオリゴヌクレオチドoPT9
（５′−AGC CTC GGA CGT GCG CCA TGG TAT TAT CGT−
３′）を用いて、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発
を実施した。プラスミドをE.coli NM522株中にトランス
フェクトし、ヘルパーファージM13 K07で重感染するこ
とにより、pTKemc−PTxから一本鎖DNAを得た。その結果
生じたプラスミドpTKemc−PT2において、開始コドン周
囲の融合部位の正確な一次構造を、プライマーoPT2
（５′−CTG TGC ACA AGG CTA CAC−２′）を用いたシ
ーケンス決定により確証した。
この方法により、プロトロンビンの野生型配列をプラ
スミドpTKemc−PT2中に回復する。
スミドpTKemc−PT2中に回復する。
次に、実施例Ｉに記載されているようなin vivo組換
え法、及びその後の組換え体ウイルスの優性選択によっ
て、組換えウイルスvTKemc−PT2を得た。
え法、及びその後の組換え体ウイルスの優性選択によっ
て、組換えウイルスvTKemc−PT2を得た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ボデメル，ヴァルテル オーストリア国、ア―1228 ウィーン、 ヘーゼガッセ 32／31 (72)発明者 シャイフリンガー，フリードリッヒ オーストリア国、ア―2304 オルト／ド ナウ、ライフェイゼンシュトラーセ 15 (72)発明者 エイブル，ヨハン オーストリア国、ア―1180 ウィーン、 グスタブ ツェルマークガッセ ２ (72)発明者 ドルネル，フリードリッヒ オーストリア国、ア―1230 ウィーン、 ペテルリニガッセ 17 (56)参考文献 特開 平２−131593（ＪＰ，Ａ) 飯野徹雄他２名編「組換えＤＮＡ実験 技術」（昭和59年６月10日）学会出版セ ンターＰ．129
Claims (27)
- 【請求項１】ビタミンＫ依存性血液因子又はその機能的
等価物をコードする外来cDNA配列、少なくとも一つのレ
プリコン、少なくとも一つの選択マーカー、クローニン
グ部位、及びワクシニアウイルスP11プロモーターを包
含する挿入プラスミドであって、上記プロモーター及び
上記外来cDNAがワクシニアウイルスの非必須DNA配列に
隣接し、そしてプロモーターの３′末端及び下流に続く
外来DNA配列の５′末端が、P11プロモーターの３′末端
の同一に工学的処理された又は天然の制限部位に対応す
る制限部位が形成されるように一つ又はそれ以上のヌク
レオチドにより外来DNA配列を延長又は短縮することに
よって互いに極めて接近して存在するプラスミド。 - 【請求項２】ワクシニアウイルスのフランキングDNA配
列がチミジンキナーゼ遺伝子に対応する請求項１記載の
プラスミド。 - 【請求項３】ワクシニアウイルスのフランキングDNA配
列が赤血球凝集素遺伝子に対応する請求項１記載のプラ
スミド。 - 【請求項４】５′末端の２つの付加的アミノ酸Asn及びS
erをコードするDNA配列を適正な挿入のためにプロトロ
ンビンシグナル配列が包含するように修正することによ
る新規のEcoRI制限エンドヌクレアーゼ切断部位を包含
する請求項１記載のプラスミド。 - 【請求項５】下記の部分プロモーター−外来cDNA配列： TATAA ATG AAT TCC GCGCAC−−／ ／−−TAG−XXXTTC
−60A−14C を包含する請求項４記載のプラスミド。 - 【請求項６】下記の部分プロモーター−外来cDNA配列： TATAA ATG AAT TCC GCGCAC−−／ ／−−TAG−−GAATT
C−− を包含する請求項４記載のプラスミド。 - 【請求項７】ビタミンＫ依存性血液因子をコードする外
来cDNA配列が、プロモーターに極めて接近してプラスミ
ドpTKgpt−oFlsの多重クローニング部位中にクローニン
グされた請求項４記載のプラスミド。 - 【請求項８】図１に示すようなプラスミドpTKgpt−PTHB
a。 - 【請求項９】図２に示すようなプラスミドpTKgpt−PTHB
b。 - 【請求項１０】図５に示すようなプラスミドpHAgpt−PT
a及びpHAgpt−PTb。 - 【請求項１１】図６に示すようなプラスミドpTKemc−PT
2。 - 【請求項１２】請求項１〜11記載のプラスミドによる野
生型ワクシニアウイルスのin vivo相同組換えによって
得られる組換え体ワクシニアウイルス。 - 【請求項１３】請求項８及び９記載のプラスミドによる
野生型ワクシニアウイルスのin vivo相同組換えによっ
て得られる組換え体ワクシニアウイルスvPTHBa及びvPTH
Bb。 - 【請求項１４】請求項１〜11記載のプラスミドによるワ
クシニアウイルスWR6/2株のin vivo相同組換えによって
得られる組換え体ワクシニアウイルス。 - 【請求項１５】請求項11記載のプラスミドによる野生型
ワクシニアウイルスのin vivo相同組換えによって得ら
れる組換え体ワクシニアウイルスvTKemc−PT2。 - 【請求項１６】請求項12〜15記載の組換え体ワクシニア
ウイルスによる宿主細胞の感染によって得られるビタミ
ンＫ依存性血液因子の発現のための脊椎動物細胞培養。 - 【請求項１７】宿主細胞が哺乳類肝臓又は腎臓細胞であ
る請求項16記載の細胞培養。 - 【請求項１８】宿主細胞がVero、CV1、BSC1、BHK、又は
RK17細胞である請求項17記載の細胞培養。 - 【請求項１９】請求項12〜15記載の組換え体ワクシニア
ウイルスによる哺乳類宿主細胞の感染、上記細胞の培
養、上記ビタミンＫ依存性血液因子の発現、及びその回
収を包含する、組換えによるビタミンＫ依存性血液因子
の製造方法。 - 【請求項２０】上記宿主細胞がVero、CV1、BSC1、BHK、
又はRK13細胞である請求項19記載の方法。 - 【請求項２１】宿主細胞RK13を用い、外来遺伝子がシグ
ナル配列を欠く請求項20記載の方法。 - 【請求項２２】感染前に細胞が集密状態（confluency）
に達している請求項19記載の方法。 - 【請求項２３】細胞の培養及び／又は上記ビタミンＫ依
存性血液因子の発現がビタミンＫの存在下で実施される
請求項19記載の方法。 - 【請求項２４】上記感染細胞の培養が高密度系で実施さ
れる請求項19記載の方法。 - 【請求項２５】上記感染細胞の培養が微粒子担体培養又
はホローファイバー系で実施される請求項19記載の方
法。 - 【請求項２６】プロトロンビンを調製する請求項19記載
の方法。 - 【請求項２７】上記ビタミンＫ依存性血液因子の回収が
感染後48〜96時間、好ましくは60〜72時間で実施される
請求項19記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP90101623 | 1990-01-26 | ||
| AT90101623.8 | 1990-01-26 | ||
| EP90101623.8 | 1990-01-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05507401A JPH05507401A (ja) | 1993-10-28 |
| JP2549224B2 true JP2549224B2 (ja) | 1996-10-30 |
Family
ID=8203546
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3503086A Expired - Lifetime JP2549224B2 (ja) | 1990-01-26 | 1991-01-24 | 組換えにより産生される血液因子及びその血液因子の発現方法並びにその方法に使用されるワクシニアウイルス組換え体 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0512011B1 (ja) |
| JP (1) | JP2549224B2 (ja) |
| AT (1) | ATE103982T1 (ja) |
| CA (1) | CA2073859A1 (ja) |
| CS (1) | CS17291A2 (ja) |
| DE (2) | DE69101634D1 (ja) |
| DK (1) | DK0512011T3 (ja) |
| ES (1) | ES2052368T3 (ja) |
| FI (1) | FI923347A (ja) |
| HU (1) | HUT63459A (ja) |
| NO (1) | NO922953L (ja) |
| WO (1) | WO1991011519A1 (ja) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0561034B1 (en) * | 1991-08-26 | 1999-06-09 | IMMUNO Aktiengesellschaft | Direct molecular cloning of a modified chordopox virus genome |
| EP0624199B1 (en) * | 1991-12-31 | 1999-05-06 | Zymogenetics, Inc. | Methods for producing thrombin |
| US5527692A (en) * | 1991-12-31 | 1996-06-18 | Zymogenetics, Inc. | Methods for producing thrombin |
| US7060484B1 (en) | 1993-11-12 | 2006-06-13 | Gilead Sciences, Inc. | Polypeptides and coagulation therapy |
| EP0728210B1 (en) * | 1993-11-12 | 2005-04-13 | Gilead Sciences, Inc. | Thrombin mutants |
| DE4430204A1 (de) * | 1994-08-26 | 1996-02-29 | Behringwerke Ag | Arzneimittel, welches als Gegenmittel für Blut-Antikoagulanzien geeignet ist und seine Verwendung |
| AT403167B (de) * | 1994-11-14 | 1997-11-25 | Immuno Ag | Selektion und expression von fremdproteinen mittels eines selektions-amplifikations-systems |
| AT404357B (de) * | 1995-06-13 | 1998-11-25 | Immuno Ag | Prothrombin-derivate |
| EP0796623B1 (de) * | 1996-03-20 | 2005-05-25 | Baxter Aktiengesellschaft | Pharmazeutisches Präparat zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen |
| US6747003B1 (en) | 1997-10-23 | 2004-06-08 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| US7247708B2 (en) | 1997-10-23 | 2007-07-24 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| CN100488562C (zh) | 2000-02-11 | 2009-05-20 | 拜耳医药保健有限公司 | 凝血因子VⅡ或VⅡa样分子 |
| EP1136553A1 (en) * | 2000-03-22 | 2001-09-26 | Octagene GmbH | Production of recombinant blood clotting factors in human cell lines |
| HU228091B1 (en) * | 2000-03-22 | 2012-10-29 | Octapharma Biopharmaceuticals Gmbh | Production of recombinant blood clotting factors in human cell lines |
| US7812132B2 (en) | 2000-04-28 | 2010-10-12 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| US7220837B1 (en) | 2000-04-28 | 2007-05-22 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| US20030211094A1 (en) | 2001-06-26 | 2003-11-13 | Nelsestuen Gary L. | High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides |
| US7700733B2 (en) | 2002-04-30 | 2010-04-20 | Bayer Healthcare Llc | Factor VII or VIIa polypeptide variants |
| US7771996B2 (en) | 2003-03-20 | 2010-08-10 | Bayer Healthcare Llc | FVII or FVIIa variants |
| BRPI0411650A (pt) | 2003-06-19 | 2006-08-08 | Maxygen Holdings Ltd | variante polipeptìdica do fator vii (fvii) ou do fator viia (fviia), sequencia de nucleotìdeos , vetor de expressão, célula hospedeira, composição, uso de uma variante, e, método para tratar de um mamìfero tendo uma doença ou um distúrbio em que a formação de coágulo seja desejável |
| JP6245299B2 (ja) * | 2016-04-27 | 2017-12-13 | バクスアルタ ゲーエムベーハー | 組換え安定細胞クローン、その産生およびその使用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8508845D0 (en) * | 1985-04-04 | 1985-05-09 | Hoffmann La Roche | Vaccinia dna |
| AU8339187A (en) * | 1986-11-17 | 1988-06-16 | New England Medical Center Hospitals, Inc., The | Enhancing gamma-carboxylation of recombinant vitamin k-dependent proteins |
| EP0380508A4 (en) * | 1987-05-18 | 1991-04-03 | Integrated Genetics, Inc. | Improved protein c molecules and method for making and activating same |
| FR2619314B1 (fr) * | 1987-08-11 | 1990-06-15 | Transgene Sa | Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant |
| DE3813093A1 (de) * | 1988-04-19 | 1989-11-09 | Immuno Ag | Rekombinantes plasmid, verfahren zum herstellen eines rekombinanten avipoxvirus, rekombinantes avipoxvirus und dessen verwendung |
| FR2638643B1 (fr) * | 1988-11-09 | 1991-04-12 | Transgene Sa | Sequence d'adn codant pour le facteur ix humain ou une proteine analogue, vecteur d'expression, cellules transformees, procede de preparation du facteur ix et produits obtenus correspondants |
-
1991
- 1991-01-24 WO PCT/EP1991/000139 patent/WO1991011519A1/en active IP Right Grant
- 1991-01-24 DK DK91903050.2T patent/DK0512011T3/da active
- 1991-01-24 HU HU922435A patent/HUT63459A/hu unknown
- 1991-01-24 DE DE91903050A patent/DE69101634D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-24 JP JP3503086A patent/JP2549224B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-24 CA CA002073859A patent/CA2073859A1/en not_active Abandoned
- 1991-01-24 DE DE69101634T patent/DE69101634T4/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-24 EP EP91903050A patent/EP0512011B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-24 AT AT91903050T patent/ATE103982T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-01-24 ES ES91903050T patent/ES2052368T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-25 CS CS91172A patent/CS17291A2/cs unknown
-
1992
- 1992-07-23 FI FI923347A patent/FI923347A/fi not_active Application Discontinuation
- 1992-07-24 NO NO92922953A patent/NO922953L/no unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 飯野徹雄他２名編「組換えＤＮＡ実験技術」（昭和５９年６月１０日）学会出版センターＰ．１２９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0512011T3 (da) | 1994-05-09 |
| WO1991011519A1 (en) | 1991-08-08 |
| DE69101634T4 (de) | 1994-12-01 |
| NO922953L (no) | 1992-09-04 |
| DE69101634D1 (de) | 1994-05-11 |
| HU9202435D0 (en) | 1992-10-28 |
| EP0512011B1 (en) | 1994-04-06 |
| JPH05507401A (ja) | 1993-10-28 |
| CS17291A2 (en) | 1991-09-15 |
| ATE103982T1 (de) | 1994-04-15 |
| HUT63459A (en) | 1993-08-30 |
| ES2052368T3 (es) | 1994-07-01 |
| FI923347A0 (fi) | 1992-07-23 |
| FI923347A (fi) | 1992-07-23 |
| NO922953D0 (no) | 1992-07-24 |
| DE69101634T2 (de) | 1994-08-18 |
| CA2073859A1 (en) | 1991-07-27 |
| EP0512011A1 (en) | 1992-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2549224B2 (ja) | 組換えにより産生される血液因子及びその血液因子の発現方法並びにその方法に使用されるワクシニアウイルス組換え体 | |
| EP0561034B1 (en) | Direct molecular cloning of a modified chordopox virus genome | |
| EP0255231B1 (en) | Human erythropoietin gene: high level expression in stably transfected mammalian cells | |
| AU747847B2 (en) | A simplified system for generating recombinant adenoviruses | |
| CA2071875C (en) | Recombinant human factor viii derivative | |
| AU698976B2 (en) | Alphavirus expression vector | |
| JP2003530064A (ja) | 遺伝子治療用のコートタンパク質改変バキュロウイルス−ベクター | |
| AU656311B2 (en) | Protein complexes having factor VIII:C activity and production thereof | |
| CA2162770A1 (en) | Expression plasmid, a fusion protein, a transfected eukaryotic cell line, a method of producing foreign proteins, a foreign protein preparation as well as a pharmaceutical composition | |
| JPH10507061A (ja) | アデノウイルス中にパッケージされたプラスミドｄｎａを用いる遺伝子送達ベクターおよびパッケージング細胞株 | |
| US5445953A (en) | Direct molecular cloning of a modified poxvirus genome | |
| JPH0365191A (ja) | スフェロイジン単離ｄｎａおよび組み換え昆虫ポックスウィルス発現ベクター | |
| Mathur et al. | Expression of L protein of vesicular stomatitis virus Indiana serotype from recombinant baculovirus in insect cells: requirement of a host factor (s) for its biological activity in vitro | |
| JP2693361B2 (ja) | 組織プラスミノーゲン活性化因子の生産方法 | |
| Falkner et al. | High level expression of active human prothrombin in a vaccina virus expression system | |
| EP0351586A1 (en) | Plasmids containing a chicken beta-actin promoter and a human factor VIII:C gene, transformants and processes for preparing human factor VIII:C | |
| CA2616698C (en) | Direct molecular cloning of a modified eukaryotic cytoplasmic dna virus genome | |
| KR19990072793A (ko) | Ｄｎａ서열의유전자수송을위한아데노바이러스전달벡터 | |
| CA2515166C (en) | Direct molecular cloning of a modified eukaryotic cytoplasmic dna virus genome | |
| AU600944B2 (en) | Human protein s, a plasma protein regulator of hemostasis | |
| CA2558864C (en) | Direct molecular cloning of a modified eukaryotic cytoplasmic dna virus genome | |
| EP0478333A1 (en) | Gene selective expression with vectors containing protector and suppressor viral sequences | |
| NO845186L (no) | Vektorsystem for innfoering av heterolog dna i eykaryotiske celler. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |