DE69101634T2

DE69101634T2 - Rekombinant hergestellte blutfaktoren, verfahren zur exprimierung besagter blutfaktoren sowie in besagtem prozess verwendeter rekombinanter vaccina-virus.

Info

Publication number: DE69101634T2
Application number: DE69101634T
Authority: DE
Inventors: Walter Bodemer; Friedrich Dorner; Johann Eibl; Falko-Guenter Falkner; Ross Macgillivray; Friedrich Scheiflinger
Original assignee: Immuno AG
Current assignee: Oesterreichisches Institut fuer Haemoderivate
Priority date: 1990-01-26
Filing date: 1991-01-24
Publication date: 1994-08-18
Anticipated expiration: 2011-01-25
Also published as: CA2073859A1; JP2549224B2; FI923347A; ATE103982T1; HUT63459A; ES2052368T3; HU9202435D0; JPH05507401A; CS17291A2; EP0512011B1; DK0512011T3; NO922953D0; FI923347A0; DE69101634D1; WO1991011519A1; EP0512011A1; NO922953L; DE69101634T4

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinant hergestellte Blutfaktoren, insbesondere von Vitamin K abhängige Blutgerinnungsfaktoren, rekombinante Kuhpockenviren und ein Verfahren zur Expression der Blutfaktoren. Die Erfindung offenbart insbesondere die Herstellung von rekombinantem Prothrombin und Thrombin sowie von Zwischenstufen, die durch unterschiedliche Prozessierungsmechanismen auf dem Weg vom Prothrombin zu verschiedenen Varianten von Thrombin gebildet werden.
Es besteht ein Bedarf an hochgradig gereinigten Blutfaktoren, wie Faktor VIII, Faktor II, von Willebrand-Faktor und Plasminogen, die nicht durch infektiöses oder toxisches Material kontaminiert sind. Die Gentechnik eröffnet einen Weg zur Herstellung derartiger prophylaktisch oder therapeutisch wichtiger Proteine in vergleichsweise hohen Ausbeuten und in Abwesenheit von pathogenen Viren, wie HIV- oder Hepatitisviren. Eukaryontische Expressionssysteme bieten ferner den Vorteil, daß post- translationale Modifizierungen am Proteinanteil durchgeführt werden, so daß Glykoproteine erhalten werden, die in hohem Maße den Substanzen, die vom menschlichen Körper produziert werden, vergleichbar sind oder die dazu identisch sind.
Mehrere von Vitamin K abhängige menschliche Gerinnungsfaktoren sind in verschiedenen rekombinanten Systemen exprimiert worden. Über die Expression von menschlichem Gerinnungsfaktor IX ist berichtet worden, und zwar in Hepatomzellen und in Mäusefibroblastenzellen von H. de la Salle et al. in Nature, Bd. 316 (1985), S. 268-270 und D.S. Anson et al. in Nature, Bd. 315 (1985), S. 683-865, in Babyhamsternierenzellen von S. Busby et al. in Nature, Bd., 316 (1985), S. 271-273 und in chinesischen Hamstereierstockzellen (CHO-Zellen) von N.J. Jorgensen et al. in Cell, Bd. 48 (1987), S. 185-191. Aus diesen Untersuchungen ist bekannt, daß nur bestimmte Zelltypen, wie aus Leber oder Niere abgeleitete Zellinien, wirksame Carboxylierungssysteme besitzen. Ferner ist beobachtet worden, daß die Überexpression von Faktor IX in CHO-Zellen durch Genamplifikation üblicherweise zu überhöhten Spiegeln an Proteinantigen führt, daß jedoch die spezifische Aktivität drastisch abfällt und daß auch die Prozessierung des Präpro-Proteins zur reifen Form unzureichend ist (A. Balland et al., Eur. J. Biochem., Bd. 172 (1988), S. 565-572).
Ein weiterer von Vitamin K abhängiger Faktor, nämlich menschliches Protein C, ist in einem menschlichen 293-Embryonierenzellsystem exprimiert worden. In diesem System wurde eine hochgradige Expression von vollständig carboxyliertem Protein C erzielt (J.D. Walls et al., Gene, Bd. 81 (1989), S. 139-149). Die 293-Zellinie erscheint jedoch nicht geeignet zur Maßstabsvergrößerung und Fermentation.
Rekombinante Untersuchungen sind auch für Prothrombin durchgeführt worden. Bei dem von Vitamin K abhängigen Gerinnungsfaktor Prothrombin handelt es sich um ein Plasmaglykoprotein mit einem Molekulargewicht von 72 000. Dieses Protein, das in der Leber synthetisiert wird, ist an den letzten Stufen der Blutgerinnung beteiligt. Vor der Absonderung unterliegt es mehreren post-translationalen Modifizierungen, wie Glykosylierung, einer von Vitamin K abhängigen Carboxylierung der ersten 10 aminoterminalen Glutaminsäurereste und einer Abspaltung von Prä- und Pro- Peptiden. Die Klonierung des Gens für menschliches Prothrombin und seine komplementäre DNA (S.J.F. Degen et al., Biochemistry, Bd. 26 (1987), S. 6165-6177) hat die Möglichkeit zu Expressionsuntersuchungen in geeigneten Zellsystemen eröffnet. Im Hinblick auf die cDNA voller Länge für Prothrombin unter Einschluß der Signalpeptidregion und der Pro-Sequenz (die für Präpro-Prothrombin codiert) wird auf R.T.A. MacGillivray, D.M. Irwin, R.E. Guinto und J.C. Stone, "Recombinant genetic approaches to functional mapping of thrombin", Annals of the New York Academy of Sciences, Bd. 485 (1987), S. 73-79 verwiesen. Die Expression von aktivem menschlichem Prothrombin ist in Eierstockzellen vom chinesischen Hamster (CHO-Zellen) und in Babyhamsternierenzellen (BHK-Zellen) von M.J. Jorgensen et al., J. Biol. Chem., Bd. 262 (1987), S. 6729-6734 erzielt worden. Wenn die Expression von Prothrombin in CHO-Zellen durch Genamplifikation verstärkt wurde, dann wurden hohe Expressionsgrade erzielt, es war jedoch nur 60 % des Materials in ausreichender Weise carboxyliert. Die Expression von Prothrombin in BHK-Zellen führte zu aktivem Prothrombin, der Expressionsgrad war jedoch vergleichsweise gering.
Auf Kuhpockenviren basierende Vektorsysteme sind bekannt, z.B. aus M. Mackett et al. in D.M. Glover (Herausgeber): "DNA cloning: A practical approach", IRL Press, Oxford, S. 191-211 (1985). In EP-243 029 wird ein rekombinantes Kuhpockenvirus zur Expression des HIV-env-Proteins beschrieben.
Kuhpockenvirus hat seine eigenen transkriptionalen regulatorischen Sequenzen entwickelt, die von einer Virus-codierten RNA-Polymerase erkannt werden, die in das infektiöse Viruspartikel gepackt ist. Darüber hinaus weist Kuhpockenvirus ein großes Genom (185 Kilobasenpaare doppelsträngiger DNA) auf, das nicht nach in vitro-Klonierungstechniken gehandhabt werden kann. Die Insertion fremder DNA in das Kuhpockenvirusgenom kann daher nur in vivo unter Ausnutzung des Prinzips der allgemeinen homologen Rekombination erfolgen.
Kuhpockenvirus hat sich als geeignet für Genexpressionsuntersuchungen in Säugerzellen erwiesen. Vorteile umfassen das Aufrechterhalten der infektiösen Beschaffenheit, einen weiten Wirtsbereich, eine große DNA-Kapazität und die Synthese, die Faltung, die Prozessierung und den Transport der Proteine in korrekter Weise.
Rekombinante Kuhpockenviren erlauben daher ein rasches Absuchen auf Zellinien, die fähig sind, die korrekten post-translationalen Modifizierungen durchzuführen, und die - in Kombination mit einer geeigneten Wirtszelle - darüber hinaus das gewünschte Protein in wirksamer Weise absondern. Dies ist insbesondere wichtig, wenn die Expression von stark modifizierten sekretorischen Proteinen, wie den von Vitamin K abhängigen Gerinnungsfaktoren, in Betracht gezogen wird.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Expressionssystem für Blutfaktoren, insbesondere für von Vitamin K abhängige Blutgerinnungsfaktoren, wie Prothrombin und Thrombinvarianten, bereitzustellen, das gegenüber bisher bekannten Expressionssystemen verbessert ist, indem es eine hohe post-translationale Kapazität und aufgrund der stabilen viralen Rekombinanten sehr gut reproduzierbare Expressionsbedingungen bietet.
Eine weitere Aufgabe besteht darin, rekombinant hergestellte Blutgerinnungsfaktoren oder deren Derivate davon bereitzustellen, die ein hohes Verhältnis der biologisch aktiven Form zur antigenen Form aufweisen.
Die vorstehend genannte Aufgabe wird durch rekombinant hergestellte Blutgerinnungsfaktoren gelöst, die ein Verhältnis ihrer biologisch aktiven Form zur antigenen Form von mindestens 50 %, vorzugsweise im Bereich von 60 bis 90 % und insbesondere im Bereich von 70 bis 80 % aufweisen.
Unter diesen Blutfaktoren, die die gesamte Aminosäuresequenz des Proteins oder einen Teil davon sowie Derivate davon, die durch Ersatz, Deletion oder Insertion mindestens einer Aminosäure gebildet werden, umfassen, können Faktor V, Faktor VIII, Faktor XII, Faktor XIII, von Willebrand-Faktor, Plasminogen und von Vitamin K abhängige Blutfaktoren, wie Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C, Protein S und insbesondere Prothrombin sowie Varianten davon genannt werden.
Die Erfindung umfaßt auch Insertionsplasmide und rekombinante Kuhpockenviren, die für die Expression der gewünschten Glykoproteine erforderlich sind.
Es wird ferner vorgeschlagen, andere rekombinante Pockenviren, z.B. Geflügelpockenviren, zu verwenden.
Die Insertionsplasmide umfassen eine fremde cDNA-Sequenz, die für den gewünschten Blutfaktor codiert, und mindestens ein Replikon, mindestens einen Selektionsmarker, mehrfache Klonierungsstellen, mindestens einen Promotor und DNA-Sequenzen aus Kuhpockenvirus, die den Promotor und die fremde DNA-Sequenz flankieren.
Die Selektion von rekombinanten Viren oder Zellen, die diese Viren enthalten, wird durch die Verwendung eines Selektionsmarkers erleichtert. Die Expression dieses Markers findet vorzugsweise unter der Steuerung eines starken, kontinuierlich aktiven Promotors, z.B. P 7.5 aus Kuhpockenvirus, statt. Ein Beispiel für einen geeigneten Selektionsmarker ist das gpt-Gen, das für Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase codiert. Nur ein rekombinantes Virus, das das gpt-Gen trägt, wächst in Säugerzellkultur in Gegenwart von Mycophenolsäure (F.G. Falkner und B. Moss, J. Virol., Bd. 62 (1988), S. 1849-1854).
Während es von größter Wichtigkeit ist, daß das fremde Gen unter der Steuerung eines Pockenviruspromotors exprimiert wird, ist es gleichfalls wichtig, daß dieser Pockenviruspromotor, z.B. ein Kuhpockenviruspromotor, sich in unmittelbarer Nähe zu der fremden Gensequenz, die exprimiert werden soll, befindet. Es ist in zahlreichen Beispielen gezeigt worden, daß nicht-translatierte codierende Regionen, die sich zwischen dem Pockenviruspromotor und der fremden Gensequenz, die exprimiert werden soll, befinden, zu einer Verringerung des Expressionsgrads führen. Besondere Sorgfalt sollte daher angewandt werden, um sicherzustellen, daß das 3'-Ende des Promotors und die 5'-Sequenz des fremden Gens, die stromabwärts davon folgt, in einem geeigneten Leserahmen ausgerichtet sind, wobei unnötige Regionen mit nicht-translatierten Codons vermieden werden. Eine Möglichkeit, um dies zu erzielen, besteht in der Wahl einer geeigneten Restriktionsstelle und der Modifizierung des 5'- Endes der fremden Gensequenz (möglicherweise unter Einschluß einer Prä- oder Präpro-Sequenz) durch Addition oder Deletion von Codons in einer solchen Weise, daß eine identische Restriktionsstelle gebildet wird. Auf diese Weise erlauben überlappende Enden des 3'-Endes des Promotors und des 5'-Endes des fremden Gens die gewünschte Anordnung.
Die Wahl des geeigneten Promotors im Kuhpockenvirus-Expressionssystems ist von großer Bedeutung. Üblicherweise werden virale Promotoren für die Proteinexpression verwendet, die in der späten Phase aktiv sind oder die in der frühen und der späten Phase des Infektionszyklus aktiv sind.
Erfindungsgemäß wird der späte 11 K-Promotor aus Kuhpockenvirus verwendet. Dieser Promotor enthält ein funktionell wichtiges konserviertes Sequenzelement, das mit der transkriptionalen und der translationalen Initiationsstelle überlappt (vgl. B. Moss et al., Ann. Rev. Immunol., Bd. 5 (1987), S. 305-324). Um eine wirksame Expression zu erzielen, haben sich die Erfinder entschlossen, diese Region nicht zu ändern. Daher wurde die Prothrombin-cDNA im nachstehend vorgelegten Beispiel in die natürlich auftretende EcoRI-Stelle unmittelbar stromabwärts vom Initiationscodon des 11 K-Polypeptids kloniert, wie es in Fig. 3 gezeigt ist.
Wie ausführlicher im experimentellen Abschnitt beschrieben wird, wurde die exakte Fusion des Promotors mit der für Prothrombin codierenden Region durch Einführung einer neuen EcoRI-Stelle mittels gerichteter Oligonucleotidmutagenese stromabwärts vom Initiationscodon des Prothrombingens erreicht. Die gewählte Strategie führte zur Einführung von zwei zusätzlichen Aminosäuren (Asn und Ser) in das Signalpeptid (vgl. Fig. 3). Da sich die Signalpeptid-Spaltungsstelle etwa 40 Aminosäuren davon entfernt befindet, beeinträchtigt diese Mutation nicht das korrekte Prozessieren und die Absonderung der reifen Polypeptidkette.
Aufgrund der Tatsache, das Kuhpockenvirus-DNA im Cytoplasma transkribiert wird, wird kein Gebrauch vom Spleißapparat der Wirtszelle gemacht. Daher muß bei der Konstruktion eines rekombinanten Virus intronfreie DNA oder cDNA verwendet werden. Im Hinblick auf die wirksame Expression und Absonderung wird es bevorzugt, wenn diese DNA auch Signalsequenzen umfaßt.
Für einige Zwecke kann es günstig sein, in das rekombinante Virus nur eine Teilsequenz oder eine geänderte Sequenz der fremden DNA-Sequenz, die exprimiert werden soll, zu inserieren. Auf diese Weise werden Derivate oder Mutanten oder aktivierte Formen der Blutfaktoren erhalten.
Die Insertionsplasmide umfassen ferner flankierende DNA-Sequenzen des Kuhpockenvirus, die dem Thymidinkinasegen oder den Hämagglutininsequenzen oder einer beliebigen nicht-essentiellen Region in der Kuhpockenvirus-DNA entsprechen können.
Ein geeigneter Vektor mit offenem Leserahmen zur Insertion der fremden cDNA-Sequenz ist pTKgpt-oFls, der von F.G. Falkner und B. Moss in J. Virol., Bd. 62 (1988), S. 1849-1854 beschrieben wurde.
Mit Hilfe dieses Vektors mit offenem Leserahmen wurden die Insertionsplasmide, pTKgpt-PTHBa und pTKgpt-PTHBb (Fig. 1 und Fig. 2) hergestellt. In ähnlicher Weise, wie es für Prothrombin beschrieben wird, können beliebige andere gewünschte fremde Gene, die für einen Blutfaktor codieren, in das Plasmid pTKgpt-oFls in enger Nähe zum P11-Promotor inseriert werden.
Mit derartigen Insertionsplasmiden werden die rekombinanten Kuhpockenviren in vivo durch homologe Rekombination mit Wildtyp-Kuhpockenviren erhalten. Die rekombinanten Kuhpockenviren, die im experimentellen Abschnitt für die Expression von Prothrombin beschrieben werden, sind vPTHBa und vPTHBb (Fig. 1 und 2) sowie vPT6/2, vTKemc-PT2, vHA-PTa und vHA-PTb, die nachstehend beschrieben werden.
Mit diesen Saatviren wird anschließend eine Säugerzellkultur infiziert und auf die Expression des gewünschten Glykoproteins abgesucht.
Als Säugerwirtszellen werden Leber- und Nierenzellen bevorzugt, da sie die am besten geeignete post-translationale Modifizierung bieten. Es konnte gezeigt werden, daß die am meisten bevorzugten Wirtszellen Vero-, CV1- und BSC1-Nierenzellen sowie BHK-Zellen im Hinblick auf die Expressionsgrade und die post-translationale Modifizierung sind.
Andere geeignete Wirtszellen sind RK13-Zellen. Diese Zellen sondern das gewünschte Protein nicht in den Überstand ab, sie weisen jedoch die Fähigkeit auf, das Protein in sehr großen Mengen zu exprimieren. In diesem Fall müssen die Zellen zerstört werden, um das Protein zu gewinnen. In diesen Fällen kann es daher von Vorteil sein, das gewünschte Protein ohne eine Signalsequenz zu exprimieren.
Das Verfahren zur Herstellung der gewünschten rekombinanten Blutfaktoren wird vorzugsweise in Gegenwart von Vitamin K durchgeführt, um Proteine zu erhalten, die eine hohe biologische Aktivität aufweisen.
Eine weitere Verbesserung des Expressionssystems wird durch Beobachtung der Phase der Zelle erzielt, wenn die Infektion durchgeführt wird, erzielt. Es ist gezeigt worden, daß die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn die Zellen die Konfluenz vor der Infektion erreicht haben.
Im Hinblick auf die Menge an rekombinanten Kuhpockenviren, die zur Infektion der Wirtszellen erforderlich sind, konnte festgestellt werden, daß diese Menge vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 20 pfu und insbesondere im Bereich von 0,1 bis 1 pfu liegt. Höhere Mengen an rekombinanten Viren, die für die Infektion verwendet wurden, führten nicht zu erhöhten Expressionsgraden.
Die Expressionsgrade wurden weiter erhöht, indem Systeme mit hoher Dichte, wie Mikroträgerkulturen oder Hohlfasersysteme, eingesetzt wurden.
Auf diese Weise hergestelltes proteinartiges Material kann aus den Zellüberständen oder den Zellen nach beliebigen, dem Fachmann bekannten Techniken gewonnen und durch Anwendung üblicher Verfahren der Proteinchemie gereinigt werden.
Die rekombinanten Kuhpockenviren besitzen einen wesentlichen Vorteil gegenüber rekombinanten Systemen nach dem Stand der Technik, der darin besteht, daß sie ein rasches Absuchen von Zellinien auf die wirksame Absonderung und korrekte post-translationale Modifizierung erlauben. Auf diese Weise kann leicht festgestellt werden, welche Zellinien fähig sind, große Mengen an aktivem Protein abzusondern, während andere möglicherweise große Mengen in ihrem Cytoplasma anreichern, und welche Zellinien die aktivsten Proteine aufgrund ihrer korrekten post-translationalen Modifizierung ergeben. Es ist daher zweckmäßig, vor der Konstruktion einer transformierten Zellinie verschiedene Zelltypen auf die erforderlichen Funktionen durch Infektionsuntersuchungen mit rekombinanten Kuhpockenviren abzusuchen.
Mit dem rekombinant hergestellten menschlichen Prothrombin, das frei von im Blut enthaltenen Viren, wie HIV oder NANB-Hepatitisviren ist, ist es möglich, bestimmte Störungen des Gerinnungssystems, z.B. einen septischen Schock, mit menschlichem Thrombin, das aus dem Prothrombin hergestellt wird, zu behandeln. Ferner werden menschliches Thrombin und/oder ein synergistisches Gemisch aus menschlichem Thrombin- Thrombomodulin und Protein C als geeignete Arzneimittel für die gerinnungshemmende Therapie und bei septischem Schock betrachtet.
Eine weitere Anwendung ist die Verwendung von Thrombin, das aus menschlichem rekombinantem Prothrombin hergestellt wird, in einer Fibrinqabdichtung anstelle des gegenwärtig verwendeten Rinderthrombins. Diese Fibrinabdichtung wird in starkem Maße bei bestimmten Formen der Chirurgie verwendet. Der Ersatz von Rinderthrombin durch menschliches Thrombin kann das Risiko für bestimmte Virusinfektionen sowie allergischer Reaktionen verringern.
Die Erfindung wird weiter durch die Figuren 1 bis 7 erläutert.
Fig. 1 zeigt die Konstruktion des Kuhpocken-Insertionsvektors pTKgpt-PTHBa. Dieses Insertionsplasmid wurde bei einer in vivo-Rekombination zur Konstruktion des rekombinanten Virus vPTHBa verwendet. Die Bedeutung der Abkürzungen ist nachstehend angegeben:
PTHB = Prothrombinsequenzen; tetr = Tetracyclinresistenzgen; ssDNA = einzelsträngige DNA; tk = Thymidinkinasesequenzen aus Kuhpockenvirus; gpt = Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferasegen aus E. coli; P11 = Promotor des hauptsächlichen späten 11K-Polypeptids aus Kuhpockenvirus; P7.5 = Promotor des 7,5 kDa umfassenden Polypeptids aus Kuhpockenvirus; MCS = mehrfache Klonierungsstellen. Die Pfeile zeigen die Richtungen der Transkription an.
Fig. 2 zeigt die Konstruktion eines Kuhpockenvirus-Insertionsvektors pTKgpt-PTHBb. Dieses Insertionsplasmid wurde zur Konstruktion des rekombinanten Kuhpockenvirus vPTHBb verwendet. Die Abkürzungen sind vorstehend für Fig. 1 erläutert.
Fig. 3 zeigt die Fusion der für Prothrombin codierenden Region mit dem späten P11-Promotor aus Kuhpockenvirus (P11 WT). In den rekombinanten Kuhpockenviren vPTHBa und vPTHBb ist die codierende Region für menschliches Prothrombin exakt hinter dem translationalen Initiationscodon des 11 K-Polypeptids fusioniert. Aufgrund der Insertion einer neuen EcoRI-Restriktionsendonucleaseschnittstelle durch gerichtete Oligonucleotidmutagenese enthält das Prothrombinsignalpeptid zwei zusätzliche Aminosäure (Asn und Ser). Im rekombinanten vPTHBb wurde auch die Poly(A)-Tailing-Sequenz (60 in der cDNA und im rekombinanten vPTHBa vorhandene A-Reste) und eine Oligo(C)-Sequenz von 14 C-Resten durch Insertion einer zweiten EcoRI-Stelle und anschließendes Schneiden entfernt.
Fig. 4 zeigt das Konstruktionsschema der Kuhpockenvirus-Insertionsplasmide pHAgpt-oFa und pHAgpt-oFb. Ha = Hämagglutinin; weitere Abkürzungen können aus den vorstehenden Figuren abgeleitet werden. Für Restriktionsendonucleasen wurden übliche Abkürzungen verwendet. Für weitere Erklärungen vergleiche auch Beispiel III.
Fig. 5 zeigt das Konstruktionsschema für die Insertionsplasmide pHAgpt-PTa und pHAgpt-PTb.
Für die Abkürzungen vergleiche die vorstehenden Figuren.
Fig. 6 zeigt das Konstruktionsschema des Kuhpockenvirus-Insertionsplasmids pTKemc-PT2. Ampr = Ampicillinresistenzgen; emc = Leitsequenz der Encephalomyocarditisvirussequenz; T7P = T7-Polymerasesequenz.
Für weitere Abkürzungen vergleiche die vorstehenden Figuren und Beispiel IV.
Fig. 7 zeigt einen Vergleich der Expressionsgrade, die von verschiedenen viralen Rekombinanten bei der Expression von Prothrombin in Vero-Zellen induziert wurden. Für den Versuch wurden Wirtszellen mit 1 pfu pro Zelle der entsprechenden viralen Rekombinante (im Fall der auf T7 basierenden Vektoren mit 1 pfu jeweils des T7-Polymerase bereitstellenden Virus und des T7-Promotor-Zielgen-Virus) infiziert und in serumfreiem Medium in Gegenwart von Vitamin K&sub1; gezüchtet. Die Überstände wurden nach 72 Stunden gewonnen, und die biologischen Aktivitäten wurden bestimmt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
Nachstehend werden Versuche zur Herstellung von Kuhpockenvirus-Insertionsplasmiden und rekombinanten Viren, zur Expression des Blutgerinnungsfaktors Prothrombin sowie Versuche zur Optimierung dieser Expression beschrieben. Die nachstehenden Versuche dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel I:

Herstellung der rekombinanten Kuhpockenviren vPTHBa und vPTHBb und Expression von Prothrombin

1. Konstruktion von Kuhpockenvirus-Insertionsplasmiden

a) Konstruktion von pTKgpt-PTHBa

Das 1,6 kb umfassende PstI-Unterfragment der Prothrombin-cDNA (ausgeschnitten aus dem Plasmid pIIH13, wie von R.T.A. MacGillivray, D.M. Irwin, R.E. Guinto und J.C. Stone in "Recombinant genetic approaches to functional mapping of thrombin", Annals of the New York Academy of Sciences, Bd. 485 (1987), S. 73-79 beschrieben) wurde in den einzelsträngigen Phagen M13mp18 kloniert, und eine EcoRI-Stelle wurde durch gerichtete Oligonucleotidmutagenese unter Anwendung eines auf Phosphorothionat basierenden Mutageneseverfahrens (Amersham, Inc.) eingeführt. Das Oligonucleotid oPT1 (5'-TCG GAC GTG CGC GGA ATT CAT AGT GTG TCA-3') wurde für die Mutagenese verwendet (die EcoRI-Stelle ist unterstrichen). Das Oligonucleotid oPT2 (5'-CTG TGC ACA AGG CTA CAC-3') befindet sich etwa 60 bp stromabwärts und dient als Sequenzierprimer zur Kontrolle der Mutation. Das neue EcoRI-PstI-Fragment wurde anschließend in den Expressionsvektor pTKgpt-oFls mit offenem Leserahmen kloniert, der von F.G. Falkner und B. Moss in J. Virol., Bd. 62 (1988), S. 1849- 1854 beschrieben wurde. Um die für Prothrombin codierende Region zu vervollständigen, wurde ein 0,4 kb umfassendes PstI-Subfragment der Prothrombin-cDNA in die einzige PstI-Stelle des Zwischenstufenplasmids pTKgpt-PTHB1 inseriert, was zum Plasmid pTKgpt-PTHBa führte. Die Konstruktion dieses Insertionsplasmids ist schematisch in Fig. 1 dargestellt.

b) Konstruktion von pTKgpt-PTHBb

In diesem Fall wurde das 0,4 kb umfassende PstI-Subfragment der Prothrombin-cDNA (das aus pIIH13 ausgeschnitten wurde und die Signal- und Pro-Sequenzen umfaßt) in M13mp18 kloniert, und eine EcoRI-Stelle wurde durch gerichtete Oligonucleotidmutagenese 70 bp stromabwärts vom Stopcodon eingeführt. Das Oligonucleotid oPT3 (5'-GTT TCT AAA ACT AGA ATT CCC AAT AAA AGT-3') wurde für die Mutagenese verwendet, und das Oligonucleotid oPT5 (5'-AAT CTG GGC TCC TGG A-3'), das sich etwa 60 bp stromabwärts von der Mutation befindet, diente als Sequenzierprimer zur Kontrolle der Mutation. Das modifizierte 0,4 kb umfassende PstI-Fragment wurde in die einzige PstI-Stelle des Zwischenstufenplasmids pTKgpt-PTHB1 kloniert (vgl. Konstruktion von pTKgpt-PTHBa, die vorstehend beschrieben wurde). Das 2,0 kb umfassende EcoRI-Fragment, das Prothrombin-cDNA ohne die Poly(A)-Sequenz enthält, wurde in die einzige EcoRI-Stelle von pTKgpt-oFls kloniert, was zum Plasmid pTKgpt-PTHBb führte. Die Konstruktion dieses Plasmids ist schematisch in Fig. 2 gezeigt.
In beiden vorstehend beschriebenen Plasmiden ist die für Prothrombin codierende Region exakt hinter dem Initiationscodon für das 11 K-Polypeptid fusioniert. Das Schema, um diese exakte Fusion zu erhalten, ist in Fig. 3 dargestellt. Wie aus Fig. 3 abgeleitet werden kann, führte die gewählte Strategie zur Einführung einer neuen EcoRI-Stelle durch gerichtete Oligonucleotidmutagenese zur Einführung von zwei zusätzlichen Aminosäuren (Asn und Ser) in das Signalpeptid von Prothrombin. Da die Spaltungsstelle des Signalpeptids sich etwa 40 Aminosäuren entfernt befindet, war es nicht wahrscheinlich, daß diese Mutation das korrekte Prozessieren und die korrekte Absonderung der reifen Polypeptidkette beeinträchtigen würde.
Es kann ferner aus Fig. 3 abgeleitet werden, daß in pTKgpt-PTHBb zusätzlich die Poly(A)-Tailing-Sequenz der Prothrombin-cDNA und eine 14 bp umfassende G/C-Sequenz durch Einführen einer zweiten EcoRI Stelle am 3'-Ende des Prothrombingens und nachfolgendes Schneiden entfernt wurde, während in pTKgpt-PTHBa die Poly(A)-Tailing-Sequenz und die 14 bp umfassende G/C-Sequenz noch vorhanden sind.

2. Konstruktion der rekombinanten Kuhpockenviren vPTHBa und vPTHBb

Zur in vivo-Rekombination wurde das von M. Macket et al. in "The construction and characterization of vaccinia virus recombinants expressing foreign genes", D.M. Glover (Herausgeber), "DNA cloning: A practical approach", IRL Press, Oxford (1985), S. 191-211 beschriebene Verfahren mit den nachstehenden Modifizierungen durchgeführt.
5 x 10&sup6; CV1-Zellen (konfluente Monoschichten) wurden mit 0,2 pfu/Zelle Wildtyp-Kuhpockenvirus infiziert. 2 Stunden nach der Infektion wurde 1 ml Calcium-DNA-Niederschlag (bestehend aus 5 pg Plasmid-DNA von pTKgpt-PTHBa bzw. pTKgpt-PTHBb in Superhelixform, 1 pg Kuhpockenvirus- Wildtyp-DNA und 14 ug gescherter Heringsperma-DNA) zu den Zellen gegeben. Nach 15-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden 9 ml Medium (DMEM, 8 % FBS mit Antibiotika) zugegeben. Das Medium wurde nach 4 Stunden gewechselt, und die Inkubation wurde weitere 48 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden gewonnen und in 1 ml Medium resuspendiert, und eine virale rohe Stammlösung wurde hergestellt.

3. Selektion auf gpt&spplus;-Kuhpockenvirusrekombinanten

Für die Isolierung von gpt+-Mutanten wurde ein Plaque-Assay mit BSCI-Zellen wie folgt durchgeführt: konf Iuente BSCI-Zellen wurden in gpt-selektivem Medium (DMEM, 2,5 % FBS, Antibiotika, 25 ug/ml MPA, 250 g/ml Xanthin und 15 ug/ml Hypoxanthin) 14 bis 24 Stunden vorinkubiert.
Verdünnungen von 10&supmin;³, 10&supmin;&sup4; und 10&supmin;&sup5; der rohen viralen Stammlösung (0,5 ml resuspendierte Zellen wurden dreimal gefroren und aufgetaut, ein gleiches Volumen an 0,25 mg/ml Trypsin wurde zugegeben, das Gemisch wurde 30 Minuten bei &spplus;37ºC verdaut und 20 Sekunden mit Ultraschall behandelt) wurden verwendet, um die BSC1-Zellen zu infizieren. Nach 1,5- stündiger Inkubation bei &spplus;37ºC wurden die Zellen mit gpt-selektivem Medium mit einem Gehalt an 1 % niedrig schmelzender Agarose überschichtet. Nach 2-tägiger Inkubation wurden die Zellen mit Neutralrot angefärbt. Die Plaques waren nach Inkubation über Nacht leicht sichtbar. Die Plaquereinigungen wurden durchgeführt, wie es von F.G. Falkner et al. in J. Virol. Bd. 62 (1988), S. 1849-1854 beschrieben ist.

4. Absuchen auf Prothrombin exprimierende rekombinante Viren

a) Infektion von Zellen mit Saatviren

Affennierenzellen (CV1- und Vero-Zellen) wurden in DMEM, 10 % fötalem Kälberserum mit Antibiotika und Glutamin gezüchtet. Einen Tag, bevor die Zellen die Konfluenz erreichten, wurde Vitamin K&sub1; in einer Endkonzentration von 20 ug/ml zugegeben (Vitamin K&sub1; wurde von Sigma unter der Nr. V-3501 bezogen und bei &spplus;4ºC als eine Stammlösung mit 5 mg/ml in Ethanol gelagert). Wenn die Monoschichten Konfluenz erreichten, wurden sie zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einem Gehalt an Mg²&spplus; und Ca²&spplus; gewaschen, und anschließend wurden sie mit 0,1 bis 10 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) an gereinigtem Virus infiziert. Nach 1- stündiger Virusadsorption wurden serumfreies Medium (DMEM) und Vitamin K zugegeben.
Die Zellen wurden 2 Tage gezüchtet, und anschließend wurden die Zellen aus den zellulären Überständen gefällt und durch Western-Blot mit einer alkalischen Phosphatase, die an Antikörper gegen menschliches Prothrombin gekoppelt war, analysiert, wie es nachstehend beschrieben wird.

b) Acetonfällung von Zellkulturüberständen

Die Überstände wurden 10 Minuten bei 3000 g zur Entfernung von Zellbruchstücken zentrifugiert, mit 2 Volumenteilen Aceton gefällt und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 8000 g wurde das Pellet in 0,25 ml 0,01 n NaOH wieder aufgelöst, 3 Minuten auf 70ºC erwärmt und zentrifugiert, um nicht gelöstes Material zu entfernen. Der Überstand wurde mit 20 ul 1 m Tris/HCl bei einem pH-Wert von 7,0 neutralisiert und erneut mit 2 Volumenteilen Aceton gefällt. Das erhaltene Pellet wurde in 40 Pl SDS-Probenpuffer wieder aufgelöst. Üblicherweise wurden 10 ul auf das Gel aufgetragen.

c) Western-Blot-Analyse

Das Verfahren wurde im wesentlichen durchgeführt, wie es von H. Towbin et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 83 (1979), S. 6672-6676 beschrieben wurde, und zwar mit den folgenden Modifizierungen: die Proteine wurden auf einem 10 %-igem SDS-Polyacrylamidgel getrennt und auf eine Nitrocellulosemembran (Amersham Hybond C) 1 Stunde bei 200 mA in einer Transfer-Elektrophorese-Einheit der Serie Hoefer TE in einem Transferpuffer mit einem Gehalt an 12,5 millimolar Tris, 96 millimolar Glycin, pH-Wert: 8,3 und 10 % Methanol übertragen. Die Membran wurde 3 x 20 min im Western-Puffer (WB; phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 0,1 % Tween 20) getränkt und in 20 ml WB mit einem Gehalt an 10 % normalem Schafserum vorinkubiert. Nach 1 Stunde wurden 40 ul eines Schafantikörpers gegen menschliches Prothrombin, der mit alkalischer Phosphatase (Serotec AHP 06A) gekoppelt war, zugegeben (was zu einer Verdünnung des Antiserums im Verhältnis 1:500 führte), und die Inkubation wurde über Nacht fortgesetzt. Die Membran wurde 3 x 10 Minuten in WB, 1 x 3 Minuten in alkalischem Phosphatase-Puffer (AP-Puffer; 0,1 m Tris/HCl, pH-Wert: 9,5, 0,1 m NaCl, 5 millimolar MgCl&sub2;) gewaschen und anschließend in 10 ml AP-Puffer mit einem Gehalt an 66 ul Nitroblau-Tetrazolium (NBT; 50 ug/ml in 70 % Dimethylformamid) und 35 ul 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCiP; 50 ug/ml in Dimethylformamid) für 3 bis 10 Minuten entwickelt.
In allen Proben war eine neue Proteinbande leicht sichtbar, die gemeinsam mit der gereinigten Prothrombinkontrolle wanderte, während diese Bande bei nicht-infizierten oder bei mit Wildtypviren infizierten Zellen fehlte. Auf der Grundlage dieses Absuchens wurden positive Viren vPTHBa und vPTHBb in großem Maßstab gezüchtet und gereinigt.

d) Genomische Charakterisierung viraler Rekombinanten

Um das Vorhandensein und das Integrationsmuster des Prothrombingens im rekombinanten Virus zu überprüfen, wurde eine Restriktionsenzymspaltung mit einer anschließenden Southern-Blot-Analyse durchgeführt. DNA der gereinigten Rekombinanten vPTHBa und vPTHBb wurde mit den Restriktionsendonucleasen HindIII und EcoRI verdaut, einer Elektrophorese durch ein 1 %-iges Agarosegel unterworfen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen. Der Filter wurde zuerst mit einer Thymidinkinase-Sonde (tk-Sonde) und anschließend mit einer Prothrombingen-Sonde (PTHB-Sonde) hybridisiert.
In den mit HindIII verdauten Proben, die mit der tk-Sonde hybridisiert waren, war das HindIII-J-Fragment des Wildtypvirus, das das Thymidinkinasegen enthielt, als eine Bande bei etwa 5,0 kb sichtbar. Beide rekombinanten Viren enthielten die vorhergesagte Bande bei etwa 6,0 kb und eine kleinere von etwa 1,0 kb, die tk-Sequenzen enthielten. Mit der Prothrombin-Sonde war nur die Bande bei 6,0 kb sichtbar. Die erhaltenen Muster bestätigen die Integration der Prothrombin-cDNA in den viralen tk-Locus.
In den mit EcoRI verdauten Proben, die mit der tk-Sonde hybridisiert waren, war das Thymidinkinasegen des Wildtyp-Virus in zwei Fragmente von etwa 7,0 und 8,0 kb gespalten. In der vPTHBa-Probe erschienen aufgrund der Integration des Prothrombingens die beiden erwarteten größeren Fragmente von etwa 9,0 und 10,0 kb. In vPTHBb war eine zweite EcoRI-Stelle eingeführt worden, die zum Ausschneiden des Prothrombingens bei Verdau mit EcoRI führte. Das vPTHBb-Muster zeigte daher das 10,0 kb umfassende Fragment (das auch in der vPTHBa-Probe sichtbar war) und das 7,0 kb umfassende Fragment (das auch in der Wildtyp-DNA sichtbar war). Mit der Prothrombin-Sonde wurde im Fall von vPTHBa das erwartete 9,0 kb umfassende Fragment und im Fall von vPTHBb das 2,0 kb umfassende ausgeschnittene Prothrombingen nachgewiesen. Die Analyse bestätigte das erwartete Integrationsmuster für die beiden rekombinanten Viren.

5. Auswahl bevorzugter Zellinien, die Prothrombin absondern

Das Potential an Zellen für bestimmte Funktionen, z.B. Wachstum, Haftung auf Substraten, Absonderung und post-translationale Modifizierung, variiert von Zelltyp zu Zelltyp. Der folgende Versuch dient dazu, Zellinien abzusuchen und zu identifizieren, die im Bereich der Kuhpockenviruswirte liegen, geeignete Wachstumscharakteristika aufweisen und fähig sind, aktive, von Vitamin K abhängige Proteine abzusondern.
Die Prothrombinaktivität wurde in einem Gerinnungsassay unter Verwendung von Prothrombin-armem Plasma durchgeführt. Menschliches Prothrombin bekannter Konzentration (Immuno FII, IX, X-CPK-Standard) wurde zur Erstellung einer Eichkurve verwendet.
Für die in Tabelle 1 gezeigten Versuche wurden die Zellen mit vPTHBa infiziert. Die Überstände und die gesamten zellulären Proteine, die nach 48 Stunden gewonnen wurden, wurden durch SDS-Polyacrylamidgel- Elektrophorese analysiert und in Bezug auf bekannte Mengen an gereinigtem Prothrombin in einem mit Coomassie-Blau angefärbtem Gel quantitativ bestimmt.
Außer für Leberzellinien (Hep G2 und H4-11-E-C3) wurde auch für Nierenzellen (z.B. BHK und MDCK) und Eierstockzellen (CHO) gezeigt, daß sie aktive, gamma-carboxylierte Proteine bilden. Auf der Grundlage der bekannten Eigenschaften dieser Zellinien und der Anforderungen für die Expression von biologisch aktivem Prothrombin sind die in Tabelle 1 angegebenen Zellinien für Prothrombinexpressionsuntersuchungen ausgewählt worden. Tabelle 1 Auswahl einer Prothrombin absondernden Zellinie Zellinie Quelle 48 h Überstand intrazellulär Carboxylierung Niere Kaninchen Osteosarcom Mensch Hamster + = sichtbare Prothrombin-Bande (ca. 50 ng) ++ = gut sichtbar (ca. 500 bis 100 ng) +++ = starke Bande (> 200 ng) - = keine Prothrombin-Bande AGM = Afrikanischer grüner Affe n.b. = nicht bestimmt
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, daß die Zellinien BSC1, CV1 und Vero aus afrikanischen grünen Affen Prothrombin am besten absondern. Von der Kaninchennierenzellinie RK13 konnte gezeigt werden, daß sie große Mengen des Proteins intrazellulär anreichert. Absonderung und Anreicherung von Prothrombin wurden auch in den Nierenzellinien 293 und BHK-21 festgestellt, wenn sie mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten Virus infiziert wurden.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Kuhpockenviren erlauben ein rasches Absuchen von Zellinien auf die Expression von Blutfaktoren, insbesondere der von Vitamin K abhängigen Blutgerinnungsfaktoren. Die Wanderung im gleichen Größenbereich deutet darauf hin, daß rekombinantes Protein, das aus mit Kuhpockenvirus infizierten Zellen stammt, einen ähnlichen Glykosylierungsgrad wie das aus Blut stammende Protein aufweist.

6. Optimierung der Expression von biologisch aktivem Prothrombin

Da der vorstehende Versuch gezeigt hat, daß die Prothrombinspiegel in den Überständen von infizierten CV1- und Vero-Zellen wesentlich höher als bei den anderen untersuchten Zellinien waren und ein vorläufiger Gerinnungsassay zeigte, daß die Überstände biologisch hochgradig aktiv waren, wurden diese beiden Zellinien für weitere Versuche ausgewählt.
a) Beim ersten Versuch wurde die Abhängigkeit der Aktivität der Zellkulturüberstände von der Dosis der Infektion mit dem Prothrombin exprimierenden Virus bestimmt. Es konnte gezeigt werden, daß im Bereich zwischen 0,1 bis 20 Plaque-bildenden Einheiten pro Zelle an vPTHBa oder vPTHBb die Prothrombinspiegel in den Überständen nach 48 Stunden sich nicht wesentlich unterschieden. Es kann daraus abgeleitet werden, daß 0,1 bis 3 und vorzugsweise 0,1 bis 1 Plaque-bildende Einheiten pro Zelle ausreichen, um die maximale Menge an abgesondertem Faktor II sowohl in CV1- als auch in Vero-Zellen zu erzielen.
b) Der nachstehende Versuch betrifft die Anreicherung von abgesondertem Protein mit steigender Inkubationszeit. Zellkulturüberstände von infizierten CV1-Zellen wurden 12, 24, 48, 60, 72 und 96 Stunden nach der Infektion untersucht. Ein kontinuierlicher Anstieg an abgesondertem Prothrombin wurde innerhalb einer Zeitspanne von bis zu 72 Stunden beobachtet. Diese Tests wurden durch Gelelektrophorese und Western-Blot-Analyse durchgeführt. Es wurde in den Gelen beobachtet, daß über eine längere Zeit auch ein Anstieg bei anderen abgesonderten Proteinen auftritt. Es wurde gezeigt, daß das Maximum an abgesondertem Prothrombin zwischen 60 und 72 Stunden lag.

b) Zellzyklusabhängigkeit der Prothrombinexpression

Es zeigte sich, daß ein weiterer wichtiger Parameter für die wirksame Expression im erfindungsgemäßen System die Phase des Zellzyklus der infizierten Zellen war. Für diesen Versuch wurden CV1-Zellen in Gegenwart von Vitamin K&sub1; gezüchtet, bis sie gerade die Konfluenz erreichten, odersie wurden für einen, zwei oder drei weitere Tage vor der Infektion gezüchtet. Die Überstände wurden auf die Aktivität an Faktor II 48 und 72 Stunden nach der Infektion untersucht.
Es wurde festgestellt, daß mäßig hohe Aktivitätsspiegel erzielt wurden, wenn die Infektion unmittelbar durchgeführt wurde, nachdem die Zellen Konfluenz erreichten (1 Tag). Mit steigendem Alter der konfluenten Monoschicht wurde jedoch ein kontinuierlicher Anstieg an Prothrombin beobachtet. Das Maximum der Prothrombinaktivität wurde erzielt, nachdem die infizierten CV1-Zellen Konfluenz erreicht hatten. Es wurde in wiederholten Versuchen gezeigt, daß ein Festhalten der Zellen vor der Infektion in einer stationären Phase die besten Ergebnisse ergab. Die erhöhten Expressionsspiegel haben ihren Grund teilweise in einer Erhöhung der Zelldichte, aber eine erhöhte Zelldichte allein erklärt nicht völlig den gesamten Anstieg der Expression.

7. Berechnung der Expressionsgrade

Die Expressionsgrade, die in den vorstehend beschriebenen Versuchen in CV1- und BSC1-Zellen erhalten wurden, wurden bestimmt; es ergaben sich bis zu 8,0 ug/ml Prothrombin-Antigen.

8. Bestimmung der biologischen Aktivität

Es wurde festgestellt, daß die biologische Aktivität des rekombinanten Prothrombins im Bereich von 50 bis 70 Millieinheiten pro ml Kulturmedium lag, was also ein rekombinantes Prothrombin mit einem Verhältnis von biologisch aktiver Form zu antigener Form in Vero-Zellen von bis zu 70 % und in CV1-Zellen von bis zu 60 % ergab.

Beispiel II

Konstruktion des rekombinanten Kuhpockenvirus vPT6/2 und Expression von Prothrombin

Zur Konstruktion des rekombinanten Virus vPT6/2 wird das in Fig. 2 gezeigte Insertionsplasmid pTKgpt-PTHBb einer Rekombination mit dem Kuhpockenvirusstamm WR6/2 unterworfen (Moss et al.: "Deletion of a 9,000 bp segment of the vaccinia virus genome that encodes non-essential polypeptides"; J. Virol., Bd. 40 (1981), S. 387-395; dieser Kuhpockenvirusstamm ist öffentlich über NTIS erhältlich). Dieser Stamm ist stärker abgeschwächt (10&sup6;-fach im Mausmodell; Buller et al.: "Decreased virulence of recombinant vaccinia virus expression vectors is associated with a thymidine kinase negative phenotype", Nature, Bd. 317 (1985), S. 813- 815) im Vergleich zum üblicherweise verwendeten WR-Stamm, und er ist daher ein sichererer Vektor für die Produktion.
vPT6/2 wurde in ähnlicher Weise, wie es in Beispiel I beschrieben ist, für die Expression von Prothrombin verwendet. Die Ausbeuten an biologischer Aktivität von Prothrombin in Vero-Zellen können aus Fig. 7 abgeleitet werden. Für die weiteren Bedingungen vergleiche die Legende von Fig. 7.

Beispiel III

Plasmide zur Insertion von Prothrombin-cDNA in den Kuhpockenvirus- Hämagglutinin-Locus

Bei den Prothrombin exprimierenden Rekombinanten, die in den Beispielen I und II beschrieben wurden, war die Prothrombin-cDNA in den viralen Thymidinkinase-Locus integriert. Da die Inaktivierung des viralen tk-Gens das Virus abschwächt, kann man annehmen, daß diese Abschwächung auch zu einer Verringerung des Expressionsgrades für fremde Gene, die exprimiert werden sollen, führt.
Daher wurden zwei virale Rekombinanten rekonstruiert, bei denen das fremde Gen in den Hämagglutinin-Locus des Kuhpockenvirus integriert ist.

1. Konstruktion der Kuhpockenvirus-Insertionsplasmide pHAgpt-oFa und pHAgpt-oFb

Der Basisvektor pHA wurde das Ligieren des 1,6 kb umfassenden HincII-Fragments des Kuhpockenvirus-Hämagglutiningens (H. Shida: Nucleotide sequence of the vaccinia virus hemagglutinin gene; Virology, Bd. 150, S. 451-562) mit dem großen PvuII-Vektor-Fragment von pTZ19R (Pharmacia, Inc.) konstruiert. Die Quelle für das HA-Gen war das Plasmid pVY5 (erhalten von B. Moss). In die einzige NruI-Stelle von pHA wurde die 1,7 kb HpaI-DraI-Genkassette des Plasmids pTKgpt-OFls inseriert (F.G. Falkner, B. Moss: "Escherichia coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors"; J. Virol., Bd. 62 (1988), S. 1849-1854). Die Kassette besteht aus dem P11- Promotor unter Einschluß einer mehrfachen Klonierungsstelle und dem gpt- Gen unter der Steuerung des P7.5-Promotors des Kuhpockenvirus. Die beiden möglichen Orientierungen wurden als pHAgpt-oFa und pHAgpt-oFb bezeichnet. Diese Plasmide sind in Fig. 4 dargestellt.

2. Konstruktion der Kuhpockenvirus-Insertionsplasmide pHAgpt-PTa und pHAgpt-PTb

Das Plasmid pHAgpt-PTa wurde durch Insertion des 2,0 kb umfassenden EcoRI-Fragments von pTKgpt-PTHBb in das mit EcoRI linearisierte und mit Phosphatase behandelte Plasmid pHAgpt-oFa konstruiert.
Entsprechend wurde das Plasmid pHAgpt-PTb durch Insertion des 2,0 kb umfassenden EcoRI-Fragments in das mit EcoRI linearisierte Plasmid pHAgpt-OFb konstruiert.
Die vorstehenden Plasmide, die in Fig. 5 gezeigt sind, wurden verwendet, um durch in vivo-Rekombination mit Wildtyp-Kuhpockenvirus die rekombinanten Viren vHA-PTa und vHA-PTb zu erhalten.
Vero-Zellen wurden mit den vorstehend genannten rekombinanten Viren in entsprechender Weise infiziert, wie es in Beispiel II beschrieben ist. Der Expressionsgrad an Prothrombin im Vergleich zu anderen viralen Rekombinanten kann aus Fig. 7 abgeleitet werden.

Beispiel IV:

Konstruktion des rekombinanten Kuhpockenvirus vTKemc-PT2 und seine Verwendung zur Expression von Prothrombin

Um den Grad der Prothrombinexpression zu verbessern, wurde ein neues rekombinantes Kuhpockenvirus konstruiert, das auf einem sehr wirksamen Hybridkuhpockenvirus-Expressionssystem beruht. In diesem System exprimiert ein Virus die Bakteriophage T7-Polymerase, und ein zweites Virus exprimiert das Zielgen (Prothrombin) unter der Steuerung des T7- Promotors gefolgt von der Leitsequenz des Encephalomyocarditisvirus (EMC-Virus) (Elroy-Stein et al.: "Cap-independent translation of mRNA conferred by encephalomyocarditis virus 5' sequence improves the performance of the vaccinia virus/bacteriophage T7 hybrid expression system", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86 (1989), S. 6126-6130). Diese EMC- Leitsequenz verleiht den T7-Transkripten eine cap-unabhängige Translation und erhöht auf diese Weise den Translationswirkungsgrad.

1. Konstruktion des Kuhpockenvirus-Insertionsplasmids pTKemc-PT2

Das 2,0 kb umfassende EcoRI-Fragment des Plasmids pTKgpt-PTHBb (Fig. 2), das die Prothrombin-cDNA enthält, wurde in die einzige EcoRI- Stelle des Vektors pTM3 inseriert. In das erhaltene Plasmid pTKemc-PTx ist die Prothrombin-cDNA außerhalb des Rahmens hinter dem Initiationscodon, das durch den Vektor pTM3 bereitgestellt wird, inseriert. Um die codierende Region direkt mit dem Startcodon zu fusionieren, wurde eine gerichtete Oligonucleotidmutagenese mit der einzelsträngigen DNA von pTKemc-PTx und dem Oligonucleotid oPT9 (5'-AGC CTC GGA CGT GCG CCA TGG TAT TAT CGT-3') durchgeführt. Einzelsträngige DNA wurde aus pTKemc-PTx durch Transfektion des Plasmids in den E. coli Stamm NM 522 und Superinfektion mit dem Helferphagen M13 K07 erhalten. Im erhaltenen Plasmid pTKemc-PT2 wurde die korrekte Primärstruktur der Fusionsstelle im Bereich des Initiationscodons durch Sequenzieren mit dem Primer oPT2 (5'- CTG TGC ACA AGG CTA CAC-3') bestätigt.
Durch diese Maßnahme wird die Wildtypsequenz von Prothrombin im Plasmid pTKemc-PT2 wiederhergestellt.
Das rekombinante Virus vTKemc-PT2 wurde anschließend durch in vivo-Rekombinationstechniken erhalten, wie es in Beispiel I beschrieben ist, gefolgt von einer dominanten Selektion des rekombinanten Virus.

Claims

1. Insertionsplasmid, umfassend eine fremde cDNA-Sequenz, die für einen von Vitamin K abhängigen Blutfaktor oder ein funktionelles Äquivalent davon codiert, mindestens ein Replikon, mindestens einen Selektionsmarker, Klonierungsstellen und den P11-Promotor des Kuhpockenvirus, wobei der Promotor und die fremde cDNA von nicht-essentiellen DNA-Sequenzen des Kuhpockenvirus flankiert werden und das 3'-Ende des Promotors und das 5'-Ende der stromabwärts folgenden fremden DNA-Sequenz sich in unmittelbarer Nähe voneinander befinden, und zwar durch Insertion der fremden DNA-Sequenz in den korrekten offenen Leserahmen, indem eine Restriktionsstelle gebildet wird, die einer auf identische Weise erzeugten oder natürlich auftretenden Restriktionsstelle am 3'-Ende des P11-Promotors entspricht.

2. Plasmid nach Anspruch 1, wobei die flankierenden DNA-Sequenzen des Kuhpockenvirus dem Thymidinkinasegen entsprechen.

3. Plasmid nach Anspruch 1, wobei die flankierenden DNA-Sequenzen des Kuhpockenvirus dem Hämagglutiningen entsprechen.

4. Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die fremde cDNA für Prothrombin codiert.

5. Plasmid nach Anspruch 4, umfassend eine neue EcoRI-Restriktionsendonuclease-Schnittstelle, indem die Prothrombinsignalsequenz in einer solchen Weise geändert wird, daß sie für die korrekte Insertion die DNA-Sequenz umfaßt, die für die beiden zusätzlichen Aminosäuren Asn und Ser am 5'-Ende codiert.

6. Plasmid nach Anspruch 5, umfassend die folgende Promotor- Fremd-cDNA-Teilsequenz:

TATAA ATG AAT TCC GCGCAC--/ /--TAG-XXXTTC-60A-14C.

7. Plasmid nach Anspruch 5, umfassend die folgende Promotor- Fremd-cDNA-Teilsequenz:

TATAA ATG AAT TCC GCGCAC--/ /--TAG--GAATTC--.

8. Plasmid nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die fremde cDNA-Sequenz, die für einen von Vitamin K abhängigen Blutfaktor codiert, in die mehrfache Klonierungsstelle des Plasmids pTKgpt-oFls in unmittelbarer Nähe des Promotors kloniert ist.

9. Rekombinantes Kuhpockenvirus, erhältlich durch homologe in vivo-Rekombination des Wildtyp-Kuhpockenvirus mit einem Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 8.

10. Rekombinantes Kuhpockenvirus, erhältlich durch homologe in vivo-Rekombination des Kuhpockenvirusstamms WR6/2 mit den Plasmiden nach einem der Ansprüche 1 bis 8.

11. Vertebratenzellkultur zur Expression eines von Vitamin K abhängigen Blutfaktors, erhältlich durch Infektion einer Wirtszelle mit einem rekombinanten Kuhpockenvirus nach Anspruch 9 oder 10.

12. Zellkultur nach Anspruch 11, wobei es sich bei der Wirtszelle um eine Säugerleberzelle oder Säugernierenzelle handelt.

13. Zellkultur nach Anspruch 12, wobei es sich bei den Wirtszellen um Vero-, CV1-, BSC1-, BHK- oder RK13-Zellen handelt.

14. Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines von Vitamin K abhängigen Blutfaktors, umfassend die Infektion von Säugerwirtszellen mit einem rekombinanten Kuhpockenvirus nach einem der Ansprüche 9 und 10, das Züchten der Zellen, die Expression des von Vitamin K abhängigen Blutfaktors und die Gewinnung des Faktors.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei es sich bei den Wirtszellen um Vero-, CV1-, BSC1-, BHK- oder RK13-Zellen handelt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei RK13-Wirtszellen verwendet werden und den fremden Genen die Signalsequenz fehlt.

17. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Zellen vor der Infektion die Konfluenz erreicht haben.

18. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Züchten der Zellen und/oder die Expression des von Vitamin K abhängigen Blutfaktors in Gegenwart von Vitamin K durchgeführt werden.

19. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Züchten der infizierten Zellen in einem System mit hoher Dichte durchgeführt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Züchten der infizierten Zellen in einer Mikroträgerkultur oder einem Hohlfasersystem durchgeführt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 14, wobei Prothrombin hergestellt wird.

22. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Gewinnung des von Vitamin K abhängigen Blutfaktors 48 bis 96 Stunden und vorzugsweise 60 bis 72 Stunden nach der Infektion durchgeführt wird.