DE3537176A1 - Expression eines plasminogenaktivators in hefe - Google Patents

Expression eines plasminogenaktivators in hefe

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Description

  • EXPRESSION EINES PLASMINOGENAKTIVATORS IN HEFE
  • Die Erfindung betrifft Herfahren zur Expression des Plasminogenaktivators in Hefe, dafür geeignete 1)NS-Vektoren und auf diese Weise expressierte Proteinprodukte.
  • Die Blockierung des Blutstroms im Gefäßsystem durch Bildung von Blutpfropfen ist eine der häufigsten Krankheits-und Todesursachen. Am folgenschwersten ist dabei die Unterbrechung der Blutzufuhr zum Herzen (Herzattacke), zum Gehirn (Gehirnschlag) und zur Lunge (Lungenembolie). Zur Bekämpfung dieser Probleme wird eine Gruppe von biologischen Verbindungen, den sogenannten Plasminogenaktivatoren, eingesetzt, welche die Blutpfropfen abbauen, was als fibrinolytisches System bekannt ist. ber verschiedene Mechanismen erzeugen die Flasminogenaktivatoren das aktive Enzym Plasmin, das seinerseits das Fibrinnetzwerk eines Blutpfropfens unter Bildung löslicher Produkte abbaut. Die beiden im Handel erhältlichen für die Thrombolysetherapia in Frage kommenden Arzneimittel, die als Plasminogenaktivatoren wirken, sind Streptokinase, ein 3akterienprotein, und Urokinase, eine aus menschlichem Urin isolierte Serinprotease. Beide Arzneimittel haben jedoch einen erheblichen Nachteil - sie wirken nicht spezifisch auf Blutpfropfen. eben fibrin bauen sie nämlich auch noch Blutproteine, wie Fibrinogen, arothrombin, Faktor V und Faktor VIII ab, was zu inneren Blutungen als Nebenwirkung der Behandlung führen kann. Die Verabreichung von Streptokinase und Urokinase erfolgt daher gewöhnlich durch unmittelbare Einführung in den Pfropfen über einen Katheter. Da dieses Verfahren kompliziert ist, wird es nur selten angewandt.
  • Andererseits sind die Plasminogenaktivatoren aus normalen und Tumorweweben extrahiert worden und werden gegenwärtig je nach der Quelle, aus der sie stammen, eingeteilt in Plasminogenaktivatoren vom Urokinasetyp (uPA) und Plasminogenaktivatoren vom Gewebetyp (tPA). Letztere scheinen im Vergleich zu den ersteren eine höhere Affinität zu Fibrin aufzuweisen. Es ist daher wünschenswert, zur Verbesserung der Versorgung mit einer Vielzahl von tPA diese durch gentechnische Methoden herzustellen.
  • Pennica et al. (Nature, 301: 214-221, 1983) haben die DNS-Kodierungssequenz einer in E. coli geklonten tPA-cDNS unter Verwendung von mRNS aus Melanomzellen (nach Bowes) beschrieben. Wallen et al. (Eur. J. Biochem., 132: 681-686, 1983) haben zwei Varianten der einkettigen Form von Plasminogenaktivatoren aus einer menschlichen Melanomzellinie (nach Bowes) gereinigt und gekennzeichnet. Die partielle Aminosäuresequenz-Analyse der beiden Varianten hat ergeben, daß diese sich darin unterscheiden, daß eine davon am N-Terminus zusätzlich drei Aminosäurereste aufweist. Diese zusätzliche Tripeptidsequenz, Gly-Ala-Arg, wurde, wie sich herausstellte, vom Molekül durch Plasmin abgespalten, wodurch die kürzere Variante entstand, die eine aminoendständige Aminosäuresequenz aufweist, die derjenigen entspricht, die von der von Pennica et al. beschriebenen Nucleotidsequenz abgeleitet wurde.
  • Obwohl bisher in Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) eine Anzahl heterologer Proteinprodukte expressiert worden ist, kann nicht vorhergesagt werden, ob auch ähnliche Ergebnisse für andere Proteine erzielt werden können. Die Expression heterologer Gene in transformierten Zellen beruht auf einer Anzahl von Wechselwirkungen zwischen der Wirtszelle und den Fremdgenen, assoziierten Requlationsgenen und den Genprodukten. Derartige Wechselwirkungen werden teilweise druch die Wirtsspezies definiert. Genspezifische Wechselwirkungen umfassen das Codon-usage-bias, die Erkennung von Promotor- und Terminatorsignalen sowie die Stabi- lität und die Kopienzahl der extrachromosomalen Elemente (z.B. von Plasmiden), welche die Fremdgene tragen. Proteinspezifische Wechselwirkungen umfassen enzymatische Modifikationen der Proteinprodukte, wie Verarbeitung der Precursorformen, Glykosylierung, Entstehung der Disulfidbindung usw. Außerdem können die einzelnen Arten von Wirtsorganismen sich noch in ihrer Fähigkeit, heterologe Genprodukte zu sezernieren, voneinander unterscheiden.
  • Je nach dem konkreten in Frage kommenden Wirt-Produkt-System sind derartige spezifische Modifikationen wünschenswert oder unerwünscht. Die einzelnen Arten können sich hinsichtlich ihrer Toleranz gegenüber der Anwesenheit von Fremdproteinen oder den für die Erzeugung oder Isolierung eines konkreten Proteins erforderlichen Kulturbedingungen im großtechnischen Umfange voneinander unterscheiden. Native Genprodukte können in manchen Fällen das gewünschte Produkt verunreinigen, was die Reinigung verteuert und/ oder schwierig macht.
  • Es wurde daher nach einem Verfahren zur Erzeugung von Plasminogenaktivatoren im eukariotischen Organismus Saccharomyces cerevisiae und in anderen Hefen zur Ermittlung der genannten Wechselwirkungen und zu ihrer Nutzung für die groß technische Produktion von Plasminogenaktivatoren gesucht. Im allgemeinen können diese Wirt-Produkt-Wechselwirkungen nicht a priori vorhergesagt werden und erfordern intensive Forschungsarbeit im Labor bzw. eine Produktion in großtechnischem Umfange.
  • Eine Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung von tPA in Hefe.
  • imine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von DNz-Vektoren, die für die expression von tPA in Hefe geeignet sind.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung eines proteins mit der Aktivität von menschliche tPA in Hefe.
  • Inhalt der Figuren: Figur 1 zeit die Herstellung des Plasmids pUCW.
  • Figur 2 zeigt die Herstellung des Plasmids pUCH.
  • Figur 3 zeigt die für die in pUCH geklonte tPA-cDNS ermittelte Nukleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz. Abweichungen von den veröffentlichten Sequenzdaten (Pennica et al. und Wellen et al.) sind mit * gekennzeichnet. Angegeben sind die in den Sequenzierungsverfahren verwendeten Oligonukleotidaequenzen.
  • Figur 4 zeigt die Konstruktion des Plasmids pDR403.
  • Figur 5 zeigt die Konstruktion des Plasmids pM210.
  • Figur 6 zeit die Konstruktion des Plasmids pDR505.
  • Figur 7 zeigt die Konstruktion des Plasmids pDR606.
  • Figur 8 zeigt die Konstruktion des Plasmids pDR1005.
  • Figur 9 zeigt die Konstruktion der Plasmide pDR1207 und pDR1208.
  • Figur 1G zeigt die Konstruktion des Plasmids pDR1107.
  • Figur 11 zeigt einen Teil der Plasmide pIC7 und PIC19H.
  • Figur 12a und 12b zeigen die Konstruktion des Plasmids pDR1496.
  • Figur 13 zeigt die Herstellung des Plasmids pTE26.
  • Figur 14 zeigt die Herstellung des Plasmids p47.
  • Figur 15 zeigt die Mehrfachklonierungsabschnitt-Sequenzen der Plasmide pUC12 und pUC13.-Figur 16 zeigt die Herstellung des Plasmids p254.
  • Figur 17 zeigt die Herstellung des Plasmids p201.
  • Figur 18 zeigt die Herstellung des Plasmids p213.
  • Figur 19 zeigt die Herstellung des Plasmids p279.
  • Figur 2G zeigt die Konstruktion des Plasmids pDR1294 figur 21 zeit die Konstruktion von Expressionsvektoren, die die Leadersequenz SUC2 aufweisen.
  • Figur 22 zeigt die Konstruktion des Plasmids pZV24.
  • Figur 23 zeit die Konstruktion des Expressionsvektors pJH39.
  • Figur 24 zeigt die Konstruktion des Rekombinantenphagen mp19-Je23.
  • Figur 25 zeigt die Konstruktion des Expressionsvektors pJH52.
  • Figur 26 zeigt die Konstruktion des Expressionsvektors pJH49.
  • Die erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung eines Plasminogenativators in Hefe, dadurch gekennzeichnet, daß man eine kultur von Hefe züchtet, die durch einen Vektor transformiert wurde, der ein Segment enthält, das für einen Hefegenpromotor und ein Strukturgen für tPA kodiert, wobei die Expression des Plasminogenktivators unter ontrolle des promotors erfolgt. Beschrieben werden außerdem die für die rlerstellung derartiger Vektoren geeigneten DNS- Gebilde.
  • Die Ausdrücke "Vektor", "Plasmid" und "DNS-Gebilde" sind untereinander austauschbar. Alle diese Ausdrücke bezeichnen ein DN-Eolekül, das vom Menschen so modifiziert wur- de, daß es DNS-3egmente enthält, die in einer Weise miteinander kombiniert und aneinander angrenzend angeordnet wurden, wie sie sonst in der Natur nicht vorkommen, oder einen hlon eines solchen Moleküls. Gewöhnlich enthalten derartige Vektoren genetische Information, die bei der Transformierung in einen Wirtsorganismus, wobei wenigstens ein Gen im Wirtsorganismus zum Ausdruck kommen soll, ihre eigene Replikation gewährleistet, sowie andere genetische elemente, die für die expression des interessierenden Gens erforderlich sind, wie Promotoren, Transkriptionsinitiationssites und raskriptionsterminatoren. Die Vektoren können außerdem noch Sequenzen zur Steuerung der expression des (der) auszudrückenden Gens (Gene) enthalten.
  • Der Ausdruck "Expression" wird in der Anmeldung im üblichen Sinne verwendet und bedeutet die Bedingung, bei der ein durch ein Gen im Wirtsorganismus kodiertes Proteins produkt vom Organismus synthetisiert wird. Die Anwesenheit eines konkreten Gens mit sämtlichen erforderlichen Steuerungabereichen im Wirtsorganismus bedeutet nicht a priori, da das Gen ur,Dedingt zum Ausdruck kommt. Bs kann eine Reihe von Gründen vorliegen, von denen viele noch nicht vollständig geklärt sind, die dafür verantwortlich sind, daß ein Gen in einem transformierten Organismus nicht zum Ausdruck kommt. Außerdem kann selbst dann, wenn ein gewisser Expressionsgrad vorliegt, noch nicht mit Sicherheit das Ausmaß der expression vorhergesagt werden.
  • So kann es zwar in manchen Fällen zu einer Expression kommen, diese kann jedoch so gering sein, daß das Proteinprodukt nicht in einer ausreichenden Menge produziert wird.
  • Der Ausdruck "Leadersequenz" bezieht sich auf den Teil eines Gens, der das Signaipeptid oder ein Pre-Propeptid kodiert. Ein Signalpeptid dirigiert ein frisch synthetisiertes Protein auf einen zellulären Sekretionsweg und wird gewöhnlich vom Proteinrest während dieses Prozesses abgespalten. Ein Pre-Propeptid wird im allgemeinen zu einem späteren Zeitpunkt des Sekretionsprozesses entfernt.
  • Der Ausaruck "Leadersequenz" kann sich in der Anmeldung auch auf Teile einer natürlich vorkommenden Leadersequenz beziehen.
  • Für die Expression heterologer rroteine in Hefe ist es wunschenswert, daß die Expression unter der Kontrolle eines der hefe eigenen Promotors erfolgt. Ein bevorzugter Promotor ist die Promotorregion des Gens der Hefe-Triosephosphatisomerase (TPI) (Alber und Kawasaki, J. Molec.
  • Appl. Genet. 1: 419-434, 1982). hin Vorteil der Verwendung des Hefe-TPI-Promotors ist der, daS ein hohes Trenskriptionsniveau erzielt werden kann,sodaß ein erheblicher Anteil des von den Hefezellen produzierten Gesamtproteins für die Erzeugung des gewünschten Proteins verwendet werden karn.
  • Es können aber auch andere Promotorsequenzen für die Steuerung der Froduktion von tPA in einer transformierten Kultur von S. cerevisiae durch Kodifizierung der erfindungsgemäßen Vektoren zum Einbau dieser Promotoren verwendet werden. Derartige für erfindungsgemäße Zwecke in Frage kommende Promotoren sind solche von Genen von S. cerevisiae, welche für Alkohol-Dehydroaenase-I (Ammerer, Meth. in Enzymology 101: 192-201, 1983), Alkohol-Dehydrogenase-II (Williamson et al., Nature 283: 214-216, 198C), Pyruvatkinase, Phosphoglukoseisomerase, Phosphoglyceratmutase, Hexokinase-1, Hexokinase-2, Glukokinase, Phospho- fruktokinase, Aldolase usw. oder Teile davon kodieren.
  • Die erfindungsgemäßen DNS-Gebilde enthalten ferner vorzugsweise eine Transkriptionsterminatorsequenz im 3'-Bereich ces tPA-Strukturgens. Ein derartiger bevorzugter Terminator ist der des TPI-Gens von S. cerevisiae.
  • Für die Steuerung der Expression und Sekretion des tPA aus der Wirtszelle in Frage kommende Vektoren enthalten zusätzlich auch noch Gensequenzen, welche für die sekretorischen Signale kodieren, wie z.B. den Pre-Probereich des durch das Gen MBS1 kodierten α-Faktors des i:atingpheromons der hefe (Kurjan und Herskowitz, Cell 3G: 933-943, 1982) oder die Signalpeptidregionen der Hefegene PHOS, SUC2 und BAR1, sowie die Pre-Pro-Region des tPA-Gens selbst.
  • Die erfindungsgemäß beschriebenen, in 5. cerevisiae transformierten Vektoren steuern die erzeugung eines iroteins mit der Aktivität des menschlichen Gewebeplasminogenaktivators.
  • Die erfindungsgemäß hergestellten proteine können die Sequenz einer der beiden vorherrschender Formen von natürlich vorkommendem tPA aufweisen oder die Aminosäuresequenz kann so abgeändert sein, da.Q sie ein protein ergibt, das die biologische Aktivität des tPA beibehält, j jedoch auch noch andere wünschenswerte Eigenschaften aufweist. So z.B. können die Glykosylierungsabschnitte durch abschnittspezifische Mutagenese zur Verminderung der Glykosylierung des in der Hefe erzeugten tPA-Polypeptids modifiziert werden.
  • Eine derartige Modifikation kann zu einer verbesserten mxpression und/oder zu erhöhter spezifischer Aktivität führen. Außerdem können auch noch z.B. aufgrund von genetischem Polymorphismus natürlich vorkommende Varianten vor- liegen.
  • Mit den erfindungsgemäßen Vektoren transformierte Hefe zellen können unter Standardkulturbedingungen gezüchtet werden. Ein bevorzugtes Kulturmedium ist mit Glukose bei einer Konzentration von 2 - 6 % supplementiertes -leu-Medium.
  • Besonders bevorzugt enthalt dieses Medium außerdem noch zur Einstellung des pH auf 5,¢ - 6,0 während der Züchtung einen Puffer. Besonders bevorzugte Puffer sind dabei 0,1 M Kaliumhydrogenphthalat (pH 5,5) und 0,1 M Natriumsukzinat (pH 5,5).
  • Der erfindungsgemäß hergestellte tPA kann verschieden stark glykosiliert werden oder kann unglykosiliert bleiben. Da die Anwesenheit von Kohlenhydrat die fibrinolytische Aktivität stört,kann es sich in manchen Fällen als wünschenswert erweisen, es in vitro zu entfernen. reine bevorzugte Methode zur Entfernung von Kohlenhydraten ist die Behandlung mit Endoglykosidase £rfindungs0em2 wurden die üblichen biochemischen Techniken angewandt. Die verwendeten Restriktionsendonukleasen stammten von Bethesda Research Laboratories, New England BioLabs, und Boehringer Mannheim Biochemicals und wurden entsprechend den Herstellervorschriften verwendet, im allgemeinen unter Zusatz von Pankreas-RNase (10 µg/ml). Die T4-DNS-ligase stammte von Bethesda Research Laboratories und Boehringer Mannheim und wurde entsprechend den Herstellervorschriften verwendet. Die M13- und pUC-Wirtsstämme und -vektoren (mit Ausnahme von pUC18 und pUC19) stammen von Bethesda Research Laboratories. Die M13-Klonung erfolgte, wie von Messing beschrieben (Neth. in Enzymology 101: 2ö-7, , 1983). Die DNS-Polymerase-I (Kle- now-Fragment) wurde wie von Maniatis et al. beschrieben verwendet (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Die E. coli-Kulturen wurden nach der Methode von Bolivar et al. transformiert (gene 2: 95-113, 1977). Die S. cerevisiae-Kulturen wurden nach Beggs' Methode (Nature 275: 104-108, 1978) in ihrer nach MacKay modifizierten Form (Meth. in Enzymology, 101: 325, 1983) transform.iert.
  • Beispiel 1 Konstruktion eines volle Länge aufweisenden Plasminogenaktivator-cDNS-Klons A. Konstruktion des Plasmids pUCH.
  • Aus der Melanomzellinie (Bowes) wurde eine cDNS-Bibliothek (library) hergestellt (Rijken und Collen, J. Biol. Chem.
  • 256: 7035-7041, 1981), und zwar durch Annealing C-endständiger cDNS mit G-endständigem pBR322 nach der von Michelson et al. beschriebenen Methode (Proc. Natl. Acad.
  • Sci. USA 80: 472-476, 1983). Die Bibliothek wurde dann mit Oligonukleotidproben, deren Sequenzen ausgehend von den Serinproteasen eigenen AS-Sequenzen bzw. von den von Pennica et. al. (ibid.) definierten Nukleotidsequenzen des tPA-Gens definiert waren, analysiert. Die Synthese der Proben erfolgte nach der Phosphit-Triestermethode (Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Letters 22: 1859-1862, 1981, sowie Matteucci und Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103: 3183, 1981) unter Verwendung eines festen Trägermaterials, wie von Matteucci und Caruthers beschrieben (Tetrahedron Letters 21: 719-722, 1980). Für das Screening dieser cDNS-Bibliothek auf das Vorhandensein von tPA-Sequenzen wurden vier Oligonukleotidproben verwendet, und zwar die 5'-Probe 3'TAGTGAACCATTCT51 (Sinnstrang Nucleotide 191-204), die Mittelprobe 3,CTAGGACTATCCGT5, (Antisense, Nucleotide 810-823), die 3'-Probe 3 CTACTGTGAATGCT5 (Antisense, Nucleotide 1282-.
  • 1295) und die Standardserinproteaseprobe TACGACACACGACC (Antisense, Nucleotide 1552-1565). Die drei erhaltenen partiellen tPA-Klone waren Klon Nr. 27 mit der tPA-Sequenz von Nucleotid 145-303, Klon Nr. 20, Nucleotid 749-1079 und Klon Nr. 48, Nucleotid 1156-1685. Nicktranslatierte tPA-DNS-Sequenzen dieser Klone wurden, wie nachfolgend beschrieben, zur Analyse der cDNS-Bibliotheken verwendet, um zwei Klone zu erhalten, die zusammen die vollständige Kodierungssequenz eines ausgereiften tPA ergeben.
  • Gemäß Figur 1 wurde das pUCF, das die tPA-5'-Sequenz enthält und sich von Pos. 188, Abschnitt Bgl II bis Pos. 802, Abschnitt Eco RI erstreckt, von einer Bibliothek erhalten, die durch zweifache spezifische Primerstreckung (Lawn et al., Nuc. Acids Res. 9: 6103 - 6114, 1981), Endonukleasespaltung und Anlagerung an mit Bam HI und Eco RI gespaltenes pUC13 (Vieira und Messing, Gene 19: 259-268, 1982 und Messing, Meth. in Enzymology 101: 20-77, 1983) erhalten wurde. Der Primer des ersten Strangs war 3,CTAGGACTATCCGT51, der zur Sequenz von 810-823 genau bis zum 3'-Ende des Eco RI-Abschnitts bei 802 komplementär ist.
  • Als Primer für den zweiten Strang wurde das Oligonucleotid 5' 3' AGGAAATCCATGCC verwendet, was genau der Sequenz 155-168 bis zum 5'-Ende des B91II-Abschnitts bei 188 entspricht (s. Pennica et al., ibid.). Die cDNS-Bibliothek wurde unter Verwendung eines durch Nicktranslation erhaltenen Einschubs von Klon Nr. 27 analysiert. Wie Figur 1 zeigt, wurde das Plasmid pUCF mittels Hind III und Eco RI zerschnitten und das den Plasminogenaktivator enthaltende Fragment gereinigt.
  • Wie aus Figur 1 weiter hervorgeht, wurde das die 3'-Sequenz von tPA enthaltende pUCT dadurch erhalten, daß man eine cDNS-Bibliothek nach der von Michelson et al. beschriebenen Methode aufbaut mit der Ausnahme, daß nach der Synthese der Doppelstrang-DNS diese einer Spaltung durch Bgl II und Eco RI unterzogen und danach in pUC13 geklont wurde, das durch Bam HI und Eco RI aufgespalten worden war. Dieser Klon wurde dadurch erhalten, daß man die cDNS-Bibliothek einem Screening unter Verwendung nicktranslatierter Einschübe der Klone 20 und 48 unter zog. Ein durch partielle Eco RI-Spaltung abgespaltenes Stück des pUCT wurde zur Aufspaltung des Plasmids im oberen Eco RI-Abschnitt der Kodierungssequenz verwendet. Durch nachfolgende Spaltung mit Xba-I wurde ein Eco RI-Xba I-3'-Plasminogenaktivatorfragment erhalten, das gereinigt wurde.
  • Die beiden Fragmente 5'-tPA/Hind III-Eco RI und 3'-tPA/ Eco RI-Xba wurden, wie in Figur 1 gezeigt, an mit Hind III-Xba I-gespaltenem pUC13 angelagert und bildeten so das Plasmid pUCW.
  • Um die nichtkodierende 3'-Region des tPA vom Plasmid pUCW zu entfernen, wurde es mittels Xho II aufgespalten, das den Bam HI/Bgl II-Abschnitt bei 188 und den Xho II-Abschnitt bei 1806 erkennt. Dieses tPA-Xho-II-Fragment wurde in den Bam HI-Abschnitt von pUC13 geklont. Dann wurde ein Gebilde, in welchem das 3'-Ende des tPA in der Nähe des Xba-I-Abschnitts von pUC13 ausgerichtet war, isoliert hig. 2). Dieses Gebilde wird als pUCH bezeichnet.
  • B. Sequenzierung der cDNS Zum Nachweis der Klonung der gewünschten Sequenz wurde die cDNS sequenziert. Die dabei verwendete Sequenzierungsmethode ist in Tabelle 1 angegeben. Die Sequenzierungs- primer wurden mit Ausnahme des im Handel erhältlichen Universalsequenzierungsprimers M13 der Fa. Bethesda Research Laboratories manuell nach der Phosphit-Triestermethode (Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Letters 22: 1859 -1862, 1981; und Matteucci und Caruthers, J. Am. Chem.
  • Soc. 103: 3183, 1981) unter Verwendung eines Polymer trägers (Matteucci und Caruthers, Tetrahedron Letters 21: ?1o - 722, 1980) oder mit Hilfe eines Applied Biosystems model 38G-A DNS-synthesizer synthetisiert. Das Xho II-Xho II-tPA-Fragment aus pUCW wurde in den Bam HI-Abschnitt von M13mpll (Messing, Meth. in Enzymology 101: 20-77, 1983) in beiden Ausrichtungen eingebaut. Fragmente dieses einschubs wurden einer Subklonung in M13-Vektoren, wie in Tabelle 1 angegeben, unterworfen. Die Sequenzierung wurde gemä Messing (ibid.) durchgeführt. Die erhaltene Sequenz ist in Fig. 3 dargestellt.
  • Die Ergebnisse zeigen, daß sich die geklonte Sequenz von der bekannten (Pennica et al., ibid.) an vier Punkten unterscheidet (Tabelle 25. Die Unterschiede können auf verschiedene Weise entstanden sein, einschließlich der Mutation in der als Quelle für die Klonung der cDNS verwendeten Zellinie oder auf Grund von durch die Reverse-Transkriptase bei der Erzeugung der cDNS zustande gekommene Kopierfehler.
  • Beispiel 2 Elonung und Sequenzierung der tiA-cDRa des menschlichen Genoms Zur Ermittlung der korrekten Sequenz des menschlichen tPA-Gens wurde aus einer aus normalem Lebergewebe stammender DNS-Bibliothek ein genomischer tPA-Klon erhalten.Die Bibliothek wurde durch Einbau von DNS-7ragmenten der fe- talen menschlichen Leber in den Bakteriophagen Lambda aufgebaut (Lawn et al., Cell 15: 1157-1174, 1978).
  • Die DNS-Bibliothek wurde zur Infektion des E. coli-Stammes LE392 (ATCC33572) (Maniatis et al., ibid., 5. 504) verwendet. Eine über Nacht gehaltene Zellkultur in L-Nährlösung mit 0,2 % Maltose, 10 mM MgSO4 und 5C µg/ml Thymidin wurde in IG mM MgSO4 auf die Hälfte eingeengt. 75C µl des Konzentrats wurden dann auf Elatten (22 cm x 22 cm) ausgebracht, zusammen mit 1 pl der thagenbibliothek (200.000 Phagen/µl) auf L-Agarnährlösung mit einer oberen Weichagarschicht von NZY-Amin. Nach dem Bebrüten über nacht bei 37°C erhielt man ca. 1G5 Kolonien pro platte. Diese wurden dann auf Nitrozellulose transferiert, wonach die Lifts 1C Minuten lang mit 0,1 M NaOH und 1,5 X NaCl behandelt, dann in 0,2 M Tris (pH 7,5) und 1,5 M NaCl neutralisiert, an der Luft getrocknet und schließlich zwei Stunden bei 80°C C getrocknet wurden. Die Vorhybridisierung und die eigentliche Hybridisierung (mit einer der vollen Länge nach der Nicktranslation unterzogenen tPA-cDNS-Probe) wurde in einem SET-Puffer mit 175,2 g NaCL, 72,7 g Tris, 14,8 g EDTA, pH 8,0, mit HCl, per Liter, bei 65°C durchgeführt. Die Filter wurden in 2 x SSC, 0,1 % SDS gewaschen, getrocknet und autoradiografiert. Es konnten 13 vorläufige positive Klone identifiziert werden, von denen nach zwei durchgängen von Plaque-Reinigung (wie oben analysiert) neun positive Klone identifiziert wurden.
  • Die neun positiven Genomklone wurden auf Platten mit E.
  • coli LE392 ausgebracht und über Nacht gezüchtet, wonach Lysate bereitet wurden. Die Phagen wurden mit CsCl-Gradienten gereinigt und durch Hybridisierung mit den Oligonukleotidproben ZC94 (5'TAGGATCCATGGATGCAATGAAGAGAGGGC3'), ZC96 (5'CTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCC3'), ZC98 (5'TGCCCGATTCAGAACGAGGAGCCAGATCTC3'), ZC88, ZC89, ZC91 und ZC46 kartiert (s.
  • Fig. 3). Die proben ZC94, ZC96 und ZC98 hybridisieren dabei'ausgehend von der bekannten Sequenz (Pennica et al., ibid.) mit der für das Signalpeptid kodierenden Region, während die übrigen Proben mit der für dasreife Peptid kodierenden Region hybridisieren. Die neun positiven Isolate verteilten sich auf drei unterschiedliche Klassen, die zusammen d cie gesamte, für den tPA kodierende Region abdeckten.
  • Die Einschubgröße wurde durch Restriktion mit Eco RI ermittelt.
  • Für ,Dede Klasse wurde der Klon mit dem größten Einschub einer Restriktion mit Eco RI, Bgl II und Eco RI + Bgl II unterworfen und die Restriktionsfragmente wurden an Southernblots (Southern, J. Mol. Biol. 98: 503-517, 1975) unter Verwendung repräsentativer Cligonucleotidproben getestet. Klon Nr. 9 enthielt die gesamte Kodierungssequenz für den reifen tPA, jedoch nicht die für das Signalpeptid kodierende Region). Die Eco RI- und Bgl II-Eco RI-Fragmente des einschubs aus Klon Nr. 9 wurden in die M13- und pUC13-Vektoren zur Sequenzierung und weiteren Analyse eingebaut. Die Fragmente wurden nach der Dideoxy-Methode sequenziert CSanger et al., J. Mol. Biol.
  • 143: 161, 1983 und Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • USA 74: 5463, 1977), um auf diese Weise die korrekten nucleotide in den Positionen 4Q4, 605, 1069 und 1725 zu ermitteln. Die Sequenzierung eines 7 kb Eco RI-Fragments unter Verwendung des Primer ZC89 ergab, daß das Nucleotid in Pos. 605 im Genomklon in Übereinstimmung mit der bekannten Sequenz Guanin ist. Die Sequenzierung eines 2,8 kb Eco RI-Fragments unter Verwendung des Primers ZC148 ergab, daß das korrekte Nucleotid in Pos. 1069 in Übereinstimmung mit der cDNS-Sequenz von Pennica et al. (ibid.) Thymin ist. Die von Wallen et al. (ibid.) beschriebene partielle Aminosäuresequenz liefert einen weiteren Beweis dafür, daß das Nucleotid in dieser Position Thymin ist. In Position 1725 zeigte die cDNS-Sequenz, im Gegensatz zu dem von Pennica et al. (ibid.) gefundenen Adenin'Cytosin. Diese Abweichung hat keinen Sinflus auf die AS-Sequenz des Proteinproduktes. Das korrekte Nucleotid in Pos. 404 wurde ausgehend von den bekannten Daten als Thymin angenommen.
  • Die cDNS-Sequenz kann zur übereinstimmung mit der Genomsequenz durch in vitro-abschnittspezifische Mutagenese (Zoller et al., Manual for Advanced Techniques in Folecular Gloning Course, Cold Spring Rarbor Laboratory, 1983) modifiziert werden. Es können Sequenzen erzeugt werden, bei denen die Abänderungen alleine vorliegen oder in verschiedenen Kombinationen. Die abgeänderten 3equenzen können dann in die Expressionsvektoren, wie unten beschrieben, eingebaut werden.
  • Beispiel 3 Herstellung des Plasmids pTm26 Der für die Expression von tPA in Hefe verwendete TPI-Promotor wurde aus dem Plasmid pTE26 erhalten.
  • Das Plasmid YRp7' (Stinchcomb, D.T., et al., Nature 282, 39 -43, 1979) enthält die beim Eco RI-Abschnitt von pBR322 eineingeschobenen Hefe-TRP1- und ARS1-Sequenzen und weist zwei Eco RI-Abschnitte auf. Einer dieser Abschnitte wurde durch teilweise Restriktion mit Eco RI-Endonuklease der Dele- tion unterworfen, wodurch im Durchschnitt lediglich einer der beiden Abschnitte pro Molekül abgespalten wurde Die auf diese weise erhaltenen unpaarigen Enden der linearen Moleküle wurden durch die durch DNS-Polymerase 1 (Klenow-Fragment) katalysierte Heaktion gefüllt, wonach die dabei erhaltenen stumpfen Enden zur Wiederherstellung eines geschlossenen ringförmigen DNS-Moleküls in einer durch DRS-Ligase katalysierten Reaktion wieder miteinander verbunden wurden. Das auf diese Weise erhaltene Plasmid, das den an den ARS1-Bereich angrenzenden Eco RI-Abschnitt beibehalten hat, wird als pFRT bezeichnet.
  • Der Hefe-TFI-1-romotor wurde aus dem Plasmid pTPIO10 (Alber und Kawasaki, ibid.) erhalten. Entsprechend Fig.
  • 13 wurde das plasmid einer teilweisen Spaltung durch Bgl II unterzogen, wonach der Bereich zwischen den Bgl II-Abschnitten an den nahegelegenen Positionen 3000 und 10600 gereinigt und wieder angelagert wurde. Dieses Konstruktionsgebilde, bekannt als pTBR, wurde mit Kp I geschnitten und mit Bal 31 gespalten, wonach die Enden mit DNS-Polymerase I (Klenow-Fragment) abgestumpft wurden. In Pos.
  • +6 des TPI-Strukturgens wurde ein synthetischer Hind III-Linker (GCAAGCTTGC) zugesetzt. Das Molekül wurde dann zur Erzeugung von pTH30 erneut angelagert. Dieses Konstruktionsgebilde wurde dann mit Hind III zerschnitten, mit Bal 71 und DNS-Polymerase I (Klenow-Fragment) wie oben behandelt und bei Position -1G wurde ein synthetischer co RI-Linker (GGAATTCC) zugefügt. Der TPI-Iromotor (900 bp) wurde unter Verwendung von Bgl II entfernt und in das mittels Eco HI/Bgl II aufgespaltene Plasmid pFRT eingefügt. Als Ergebnis erhält man das Plasmid pTE26.
  • Beispiel 4 Herstellung der Plasmide p213 und p279 Das Plasmid p279 war Donator für den TPI-Promotor, die MFocl-Leadersequenz und den TPI-Terminator.
  • Gemäß Fig. 14 wird durch G-Teilung von mit Pst I auf gespaltenem pBR327 und Einschub von DNS mit endständigem C, erhalten durch Reversetranskription der RNS der menschlichen Pankreas ein Klon der menschlichen Pre-Proinsulin-cDNS (preBCA), p27, hergestellt. Das Plzid pBR327 wurde von Soberon et al., Gene 9: 287-305 (1980) und die DNS-Sequenz von menschlichem Pre-Proinsulin wurde von Bell et al., Nature 232:525-527 (1979) beschrieben. Die vollständige translatierte Sequenz wurde als Nco I-Hga I-Fragment herausgeschnitten. die abstehenden Enden wurden mit DNS-Polymerase I (Klenow Fragment) abgestumpft, wobei gleichzeitig synthetische Eco RI-(GGAATTCC) und Xba I (CTCTAGAG) - Linker angefügt wurden. Das Fragment wurde einer Subklonung in den Vektor pUC13 (aufgebaut wie für pUC8 und pUC9 von Vieira und Messing in Gene 19: 259-268, 1982, beschrieben, jedoch mit der in Fig. 15 dargestellten Polylinkersequenz) unterzogen, der mit Eco RI und Xba I geschnitten wurde.
  • Da die Zugabe eines Eco RI-Linkers am 5'-Ende den Nco I-Abschnitt (CCATGG) am Initiationskodon wiederherstellt, wurden die Plasmide auf die Anwesenheit von einen 340 bp-Einschub flankierende Eco RI-, Nco I- und Xba I-Abschnitte hin analysiert. Es wurde ein Plasmid (p47), das diese Eigenschaften aufwies, identifiziert.
  • Entsprechend Fig. 16 wurde ein BCA-Fragment durch Primer-Reparationssynthese des Plasmids p47 (Lawn et al., Nuc.
  • Acids Res. 9: 6103-6114, 1981) mit stumpfem 5'Ende erzeugt.
  • Nachfolgende Auf spaltungen mit Xba I ergaben ein 270- bp-Fragment, das in pUC12 (aufgebaut, wie für pUC8 und pUC9 von Vieira und Messing, ibid., beschrieben, jedoch mit der in Fig. 15 dargestellten Polylinkersequenz) eingefügt wurde. Der Vektor wurde durch Restriktion mit Hind III, Abstumpfen der Enden mit DNS-Polymerase I (Klenow-Fragment), Restriktion mit Xba I und Gelreinigung bereitet. Das erhaltene Vektorfragment, das ein stumpfes und ein klebriges Xba I-Ende aufweist, wurde mit dem oben angeführten, von p47 abgeleiteten Fragment verbunden.
  • Die Plasmide wurden zuerst auf die Rückgewinnung des Hind III-Abschnitts und dann durch Sequenzierung über die Verbindungsnaht unter Verwendung von M13 als Sequenzierungsprimer analysiert. Das Plasmid p254 hatte die richtige Sequenz.
  • Das für den $-Faktor (MF 1) kodierende Gen war bereits früher geklont und durch KurJan et al., Cell 3O, 933 -943 (1982) gekennzeichnet und später bestätigt worden (Singh A. et al., Nucleic Acids Research 11: 4049 - 4063, 1983). Aus einer Hefegenombibliothek von partiellen Sau3A-Fragmenten, die in den Bam HI-Abschnitt von YEpl3 geklont worden waren (Nasmyth und Tatchell, Cell 19: 753-764 198C), wurde ein Plasmid isoliert, das den α-Faktor in einem mat-α2-Mutantenstamn zum Ausdruck brachte. Der Klon enthielt einen sich mit dem ursprünglich gekennzeichneten MFα1-Gen überlappenden Einschub. Entsprechend Fig. 17 wurde dieses Plasmid (pZA2) mit Eco RI zerschnitten, wonach das 17GC bp-Fragment mit dem MFα1-Gen isoliert wurde. Dieses rament wurde mit Hinf I-Endonuklease weiter aufgespalten und mit DNS-Polymerase I (Klenow-Fragment) abgestumpft. Danach wurden die inden mit Eco RI-Linkers (GGAATTCC) verbunden. Nach erneutem Zerschneiden mit Eco RI undoal I wurde das gereinigte Fragment, das den hauptanteil oder die Gesamtmenge an transkribierten Regionen des MFα1-Gens enthielt, mit dem TFi-Promoter im Plssmid pTE26 verbunden. Im erhaltenen Plasmid p2C1 hat das MW1-Gen seine vermutete Regulationsregion (gesteuert durch den mating type locus)eingebüßt und ist jetzt der konstitutiven Expression durch den TPI-Promotor unterworfen.
  • Das Hefe-TPI-Terminator-Fragment wurde aus dem Plasmid pFG1 erhalten (Alber und Kawasaki, ibid.). Es umfaßt die Region vom vorletzten AS-Kodon des TPI-Gens bis zum Eco RI-Abschnitt ca. 700 bp abwärts. Entsprechend Fig. 18 wurde ein Bam HI-Abschnitt anstelle des einzigen Eco RI-Abschnitts von pFGl durch ein erstes Zerschneiden des Plasmids mit Eco RI, Abstumpfen der Enden mit DNS-Polymerase I (Klenow-Fragment), Anfügen synthetischer Bam HI-Linker (CGGATCCA) und erneute Verbindung zur Erzeugung des Plasmids p136 eingesetzt. Der TPI-Terminator wurde von p135 als ein Xba I-mam HI-Fragment entfernt. Dieses wurde mit dem mit Xba I-Bam EI aufgespaltenen YEp13 verbunden (Broach et al., Gene 8: 121 - 133, 1979), um zum Plasmid p213 zu gelangen.
  • Gemäß Fig. 19 wurde das rind III-Xba I-Fragment aus p254 herausgeschnitten und mit dem Bgl II-Hind III-Fragment von p2G1, das die Fusion des TPI-Promotors mit dem Pro-α-Faktor enthielt, verbunden. Diese wurden wiederum mit dem Plasmid p213 verbunden, das an den Xba I- und Bgl II-Abschnitten geschnitten worden war. Das erhaltene Plasmid ist p279.
  • Beispiel 5 Montage des Plasnids pDR403 Das Plasmid pDR403 (Fig. 4) umfaßt die vollständige Kodierungssequenz von tPA (mit den obenerwähnten Basen- substitutionen) einschließlich der 5'-Endsequenz der längeren von Wallen et al. (ibid.) beschriebenen Variante zusammen mit dem TFI-Fromotor und -terminator und der Pre-Pro-Sequenz aus dem MFα1-Gen von S. cerevisiae. Dieses Plasmid ist eine nützliche Intermediärform bei der Montage einer Reihe von Hefe-Expressionsverktoren, die auf dieser Expressionseinheit beruhen. Da pDR4C3 keinen Xeplikationsursprung, der in Hefe wirksam ist, aufweist, jedoch den Replikationsursprung aus dem Eakterienplasmid pBR322 enthält, wird es in einem geeigneten Stamm von E. coli aufrecht erhalter. Es wurde durch Werbindung der tPA-Kodierungssequenz aus pUCH zusannnen mit einem Oligonucleotidlinker mit eine Teil des Plasmids pM210 aufgebaut.
  • Das Plasmid pM210 umfaßt den Hefe-TPI-Promotor-und -terminator, die MFα1-Pre-Prosequenz und die Sequenz des menschlichen Proinsulins (BCA) (Bell et al., Nature 232: 525-527, 1979). Seine Montage erfolgte wie unten beschrieben und in Fig. 5 dargestellt, wobei als Ausangsmaterial die in Beispiel 3 und 4 beschriebenen Vektoren pTE 26, p279 und p213 verwendet wurden.
  • Gemäß Fig. 5 wurde der Vektor pTE26 it Dgl II und Eco RI aufgespalten und das 900 bp-TPI-Promotorfragment gereinigt. Das Plasmid p279 wurde mit Eco RI und Xba 1 aufgespalten und das die MFα1- und BCA-Sequenzen umfassende 800 bp-Fragment wurde in analoger Weise gereinigt. Das Plasmid p213 wurde mit Hind III zerschnitten, die kohäsiven Enden unter Verwendung von DNS-Polymerase I (Klenow-Fragment) abgestumpft, wonach das Fadenmolkül wieder zu einem Ring unter Verwendung der T4-DK-Ligase geschlossen wurde. Auf diese weise ersielt man das Plasmid p27C. Ein Fragment von ca. 5 kb mit dem TPI-Terminator, 2µ, und den Ampicillinresistenz (ampr)-Sequenzen wurde aus einem mit Xba I-Bgl II abgespaltenen Stück von p270 gereinigt. Die drei Fragmente (TPI-Promotor, MFα1/BCA und TPI/2µ/ampr) wurden dann mit Hilfe von T4-DNS-Ligase miteinander verbunden, wodurch man das Plasmid pM210 erhielt.
  • Gemäß Fig. 4 wurde zum Aufbau von pDR403 das Plasmid pUCH zwecks Vervollständigung mit Xba I aufgespalten und mit Xho II partiell abgespalten. Das Xho II-Xba I-tPA-Fragment wurde einer Gelreinigung unterzogen und mit Hilfe eines Oligonucleotidlinkers an pM210, von dem zuvor mittels Hind III und Xba I die BCA-Sequenz abgespalten wurde,angelagert. Der Linker 5' AGCTGGCGCCA3' 3' CCGCGGTCTAG5' liefert ein zum kohäsiven Ende von Hind III des pM210-Fragments komplementäres 5'-Ende sowie ein zum kohCsiven Ende von Xho II des tPA-Fragments komplementäres 31-Ende.
  • Er vervollständigt die Kodierungssequenz für die längere tPA-Variante (Wallen et al., ibid.) dadurch, daß er die Kodone für die Aminosäuren Gly-Ala-Arg liefert. Die Fusion dieser Sequenz mit der Pre-1 ro-MF'\-Sequenz schließt die tPA-Kodierungssequenz an die Kodierungssequenz für den fEr eine potentielle Peptidsynthese zur Verfügung stehenden Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-Abschnitts des α-Faktors an. Die Abspaltung eines Pre-Pro-α-Faktor-tPA-Precursorproteins nach Lys-Arg ergibt einen tPA-Precursor mit vier zusätzlichen Aminosäuren am Aminoende. Die Synthese kann auch nach einem oder nach beiden Ala ninresten auftreten, wobei ein tPA-Polypeptid mit 0, 1 oder 2 Glu-Ala-Paaren am Amino-Terminus gebildet wird.
  • Eine nachfolgende Sequenzanalyse zeigte, daß die oben beschriebene Linkersequenz in mehrfach verknüpften Kopien vorhanden war. Fremde Linkersequenzen wurden danach bei der Konstruktion von Hefeexpressionsvektoren, wie unten beschrieben, entfernt.
  • Beispiel 6 Montage des plasmids pDR505 Durch Transfer der Expressionseinheit des Promotors, der Leadersequenz, der Kodierungssequenz und des Terminstors von pDR403 in den Hefevektor YEp13 (Broach et al., Gene 8: 121 - 133, 1979) wurde ein vorläufiger Heffexprssionsvektor gebildet.
  • Die Entfernung der Expressionseinbeit aus pDR403 erfolgte durch vollständige Bam hI- und partielle Bol II-Spaltung.
  • Das erhaltene Fragment wurde einer Gelreinigung unterzogen und dann in den Bam HI-Abschnitt von YEpl3 geklont. Die auf diese weise erhaltenen Plasmide wurden auf die Orientierung ihres Einschubs hin untersucht. Ein Plasmid, das die in Fig. 6 dargestellte Orientierung aufweist, erhielt die Bezeichnung pDR505.
  • Der Stamm E8-11C von S. cerevisiae (MATα leu 2-3,112, pep4-3; ein haploides Segregans der Kreuzung E2-7B /ATCC 20689/ x GK100 /ATCC 20669) wurde mit pDR505 transnormiert und in einem leucinfreien synthetischen Medium bei 30°C gezüchtet. Den Transformantenkulturen wurden in verschiedenen Abständen, beginnend mit 9,5 Stunden (frühe log-Phase) bis zu 48 Stunden, Proben entnommen. (Die Zellen traten nach 17 bis 19 Stunden in eine frühe stationäre Phase). Der Zellniederschlag wurde extrahiert bzw. der Kulturüberstand wurde durch Amicon-Ultrafiltrierung für die Western-blet-Analyse auf ein hundertstel eingeengt (Tsowbin et al., iroc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350, 1979, und Burnette, Analytical Biochem. 112: 195 - 2G3, 19819. In den stellt kugelextrakten bzw. in den ersten Überstandsproben konnte kein tPA-Polypeptid festgestellt werden. Es konnte aber in der nach einem Zeitraum von 24 bis 48 Stunden (etwas mehr als 24 Stunden) entnommenen Proben durch Westernblot-Analyse nachgewiesen werden. Die verschiedenen Banden die bei ca. 63000 Dalton verliefen, deuteten möglicherweise auf unterschiedliche Polypeptidsynthese oder -glykosilierung hin. ebenso wurden Überstandskonzentrate der nach 24 Stunden entnommenen Proben von pDR505 und YEp13-Kontrollkulturen nach der ELISA-Methode untersucht (s.
  • Beispiel 13). Bezogen auf den natürlichen Melanom-tPA-Standard enthielten die pDR505-Proben mindestens 1 ng tPA je ml nicht eingeengten Überstand. Im Hinblick darauf, daß die genaue Bestimmung von natürliche tPA durch Lomponenten des Hefeüberstands inhibiert wird, könnten die Werte der tatsächlich vorhandenen t1-A-Mene auch höher sein.
  • m die bei der montage von pDR403 zuefgte fremden I-nkersequenzen zu entfernen, wurde die -xFressionseinheit, d.h. der 3'-Bereich des TPI-Promotors, die MFα1-Sequenz und die tPA-Kodierungssequenz von pDR505 in Form des Sph I-Xba I-Fragments entfernt wd in das mit Sph I und Xba I aufgesaltene pUC19 eingefügt (Norrander et al., Gene 26: 101 - 106, 1983). Die überschüssigen Linker wurden dann durch Schneiden mit Bgl II entfernt und das Plasmid mittels T4-DNS-Ligase zum Ring geschlossen. DU erhaltene Konstruktion ist als pDR1206 bekannt.
  • Beispiel 7 Montage eines Plasmids für die intercelluläre Expression von tPA Es wurde ein Plasmid zur Steuerung der intercellulären Expression von tPA in 5. cerevisiae montiert. Dieses als pDR1005 bekannte Plasmid umfaßt den S. cerevisiae-TPI- Promotor und -Terminator, die Kodierungssequenz für Met-Gly-Ala-Arg-Ser-tPA und einen Teil des Vektors YEpI3.
  • Seine Montage ist in Fig. 7 und 8 dargestellt.
  • Gemäß Fig. 7 wurde zum Aufbau von pDR1005 das Plasinid pDR403 mit Bgl II und Xba I gespalten und das tPA-Fragment (ca. 1,6 kb) durch Elektrophorese auf einem 0,7 % Agarosegel gereinigt. Die 3ande wurde vom Gel abgeschnitten und in einem TE-Fuffer (10 mM Tris, pH 7,4, und 5 mM EDTA) 6 - 8 Stunden inkubiert, wonach die DNß mit 2 Vol.
  • Ethanol ausgefällt wurde. Das 5'-Ende der Kodierungssequenz wurde mit dem Gligonucleotidlinker 5' CATGGGCGCCA 3' 3' CCGCGGTCTAG 5' wiederhergestellt. Das tPA-Fragment und der Linker wurden an den Vektor pMT204 angelagert, der zuvor mit Neo I und Xba I geschnitten worden war. Der Vektor pMT204 wurde durch Anlagerung unter Verwendung von T4-DNS-Ligase, des Sph I-Eco RI-Schizosaccharomyces pombe-ADR-Promotor-Fragments von Plasmid pADHpol (Russell und Hall, J. Biol.
  • Chem. z58: 143 - 149, 1983), des großen Fragments (umfassend die Ampicillinresistenz, LEU2, und partielle 2 Sequenzen) des mit SpH I und Xba I hergestellten Doppelt schnitts von YEp13 sowie des Eco RI-Xba I-Pre-Proinsulinfragments von Plasmid p153 hergestellt. Das co I-Xba I-Fragment von pMT204 umfaßt somit den S. pombe-ADH-Promotor und die YEp13-Sequenzen (s. Fig. 7). Die erhaltene Konstruktion ist bekannt als pDR606 und in Figur 7 dargestellt.
  • Um die tPA-Kodierungssequenz mit dem TFI-Promotor und -terminator in einem für die Verwendung in 5. cerevisiae brauchbaren Expressionsvektor zu kombinieren, wurdengemäß Fig. 8 die Plasmide pDR606 und p153 mit Nco I und Xba I gesalten und die erhaltenen Schnitte auf C,7 %-igen Agarcsegel der Elektrophorese unterzogen. Vom pDR606-Schnitt wurde das 1,6 kb-tPA-Fragment gereinigt. Vom p153-Schnitt wurde das größere Nco I-Xba Fragment mit der YEp13- und TSI-Promotor-Sequenzen und das Xba I-Xba I-Fragment mit dem TPI-Terminator gereinigt. Die drei Fragmente wurden dann unter Verwendung von T4-DNS-Ligase untereinander verbunden. Die erhaltene Hybrid-3 wurde für die Transformation des E. coli-Stamms LM1035 (ein hochtransformierendes Derivat des HB101-Stamms /ATOC 33694/) verwendet. Die Transformation erfolgte nach der von Maniatis et al. beschriebenen Galciumchloridmethode (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Zwölf transformierte Kolonien wurden dann auf das Vorhandensein des gewünschten Plasmidgebildes hin geprüft. Hierbei ging man von der Anwesenheit eines Bam EI-Abschnitts aus, der ca. 700 bp vom 3'-Ende des oberen Xba I-Abschnitts im Terminator bzw. ca. 1000 bp vom 5'-Ende des unteren Xba I-Abschnitts entfernt angeordnet ist. Eine zweifache enzymatische Restriktion unter Verwendung von Bam EI ermöglicht daher, die Anwesenheit und Orientierung eines TPI-Terminator-Fragments festzustellen. Bei einem korrekten Konstruktionsgebilde ergibt ein I-co I + Bam HI-Schnitt ein Fragment von 2300 bp, bei einer nicht korrekten jedoch ein Fragment von 26CG bp. Bei einem Bam EI + Eco RI-Schnitt ergibt sich ein 1300 bp-Fragment bei korrecter Orientierung bzw. ein 1600 bp-Fragment bei inkorrekter Orientierung.
  • Die Kolonien enthielten YEp13, den TrI-iromotor und tPA-Sequenzen, jedoch nicht den TPI-Terminator. Ein von einer derartigen Kolonie abgeleitetes Plasmid wurde mit pDR1001 bezeichnet. Dieses wurde dann mit Xba I linear ausgerichtet. Die TPI-Terminator-Sequenz wurde von p153 mit Eilfe von Xba I abgespalten, wonach das Fragment der Gelreinigung unterzogen und dann mit der linearen pDR1001 verbunden wurde. Die angebundene DNS wurde dann zur Transformierung von . coli LN1035 verwendet. Eine Kolonie wurde gefunden, die ein Plasmid mit dem gewünschten Xba 1-Fragment enthielt. Dieses Plasmid wurde gereinigt und als pDR1CG5 bezeichnet (Fig. 8).
  • Das Plasmid pDRIGG5 wurde, wie oben ausgeführt, zur Überprüfung der Orientierung des TPI-Terminators anal-siert. Die zweifache enzymatische Restriktion von pDR1005 ergab die Schnitte co RI + Bam EI und Nco I + Bam HI mit einem 1300 bp- bzw. 2300 bp-Fragment, wodurch nachgewiesen waren konnte, daß das gewünschte Plasmid aufgebaut worden war.
  • Der Stamm E2-7B von s. cerevisiae (MATa leu 2 his 4 pep4; ATCC 20689) wurde mit Hilfe der Plasmide pDR606 und pDR1005 sowie des Vektors YEp13 transformiert. Die Zellen wurden in einem synthetischen leucinfreien Medium gezüchtet, wobei während der gesamten Züchtungsdauer für jeden der Transformanten Proben entnommen wurden. Diese wurden dann extrahiert und auf Western-Dlcts analysiert. Bei den pDR6O6-Extrakten lieR sich mit Hilfe von Anti-tPA-Antikörpern kein Protein nachweisen. Die Proben aus pDR1005-Extrakten zeigten nachweisbares zytoplasmatisches tPA-Polypeptid, das in einer späten log-Phase sein Maximum erreichte (zwischen 5 x 1C7 und 1 x 108 Zellen/ml). In den Extrakten aus pDR1005 war das tPA-Molekül auf grund der Western-blots, die zwei Banden von N = 27-28.000 Daltons zeigten, offensichtlich gespalten.
  • Beispiel 8 Konstruktion von pDR1207 und pDR12G8 Das plasmid pDR505 stellt eine Verschmelzung der MFα1-teadersequenz mit der tPA-Kodierungssequenz dar, die aufgebaut wurde, um ein primäres Translationsprodukt mit der AS-Sequenz Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-Gly-ALa-Arg-Ser-tPA zu erzeugen. Die in vivo-Spaltung eines derartigen Precursors hinter dem Lys-Arg-Faar durch eine dem Kathepsin B ähnliche Protease ergibt ein tPA-Nolekül mit vier zusätzlichen Aminosäuren am Aminoterminus. Die weitere stufenweise Behandlung mit dem Gen-Frodukt von S. cerevisiae STE13 sollte zur Spaltung der nachfolgenden Glu-Ala-Paare fiihren und auf diese Weise ein Produktgemisch ergeben. Die Anwesenheit von Mehrfachkopien der Linkersequenz in pDR5G5 führt jedoch zu einem primuren uranslationsprodukt, das die Sequenz Gly-Ala-Arg-Ser-Gly-Ala-Arg-Ser-tPA enthält.
  • Zur Erzeugung sezernierter tPAs mit den Aminotermini entsprechend den beiden Molekülformen nach Walien et al., ibid. wurde der MFα1-tPA-Nahtbereich zur Deletion der Glu-Ala-Glu-Ala-Sequenzen und Verschmelzung des Lys-Arg von MFα1 unmittelbar mit dem Aminoeterminus (entweder Gly oder Ser) des tPA weiter modifiziert.
  • Entsprechend Fig. 9 wurde das Plasmid pDR505 mit Sph I und Xba 1 gespalten und das 2,2 kb-FraOment mit den MFα1- und tPA-Sequenzen einer Reinigung unterzogen.
  • Dieses Fragment wurde dann an M13mp19, das zuvor mit Sh I und Xba I linear ausgerichtet worden war, angelagert. Das erhaltene Hybridmolkül, bekannt als mp19- ZV52, wurde für die Transfektion von . coli K12 (JM103) verwendet und die einsträngige Form des Phagen wurde gereinigt (Messing, Meth. in Enzymology 1W1: 2C - 77, 1983). Diese einsträngige DNS wurde dann mit einem der beiden Oligonucleotidprimer (ZC126:/3'/AACCTATTTTCTCCTCGGTCTAGA/5'/oder ZC127:/3'/AACCTATTTTCTAGAATCCTTCAC/5'/) und dem M13-Universalsequenzierungsprimer hybridisiert.
  • Die erhaltenen Heteroduplexe wurden mit DNS-Polymerase I (Klenow-Fragment) und T4-DNS-Ligase unter Reaktionsbedingungen inkubiert, wie sie von Zoller et al. (ibid.) für die oligonucleotidgesteuerte abschnittspezifische Mutagenese (Zwei-Primer-Methode) beschrieben wurden.
  • Die zweisträngigen Produkte wurden für die Transfektion -on E. coli K12 (JM103) verwendet und die erhaltenen Flaques durch Hybridisierung mit den entsprechend marvierten Oligonucleotidprimern analysiert. Die positiven Klone wurden von Plaques gereinigt und sequenziert (Messing, ibid.), um so das Vorhandensein einer korrekten Verbindung zu priifen. ei beiden Phagen wurde die replikative DNS-Form gereinigt, mit Sp I und Xba I gespalten und dann das 2,2 kb-Sph I-Xba Fragment gereinigt. Danach wurden die tPA-Fragmente unter Verwendung von T4-DNS-Ligase in das Flasmid pUC19 eingefügt (Korrander et al. Gene 26: 101 - 106, 1983), das zuvor durch Aufspaltung mit Sph I und Xba I linear ausgerichtet worden war. Das bei Verwendung des ZC126-Oligonucleotids erhaltene onstruktionsgebilde ist bekannt als pDR1207, das bei Verwendung des ZC127-Cligonucleotids erhaltene als pDR1208 (Fig. 9). Die nachfolgende Sequenzierung des MFα1-tPA-Verbindungsbereichs ergab, daß durch die Schleifenbildung die Fremdkopien des in pDR505 anwesenden Linkers entfernt worden waren.
  • einer Deletion unterlagen auch die Kodons für Glu-Ala-Glu-Ala (in pDR1207 und pDR1208) und für Gly-Ala-Arg am Aminoterminus von tPA (nur bei pDR1208).
  • Da pUC19 ein bakterielles Plasmid darstellt, treten pDR1207 und pDR1208 in S. cerevisiae funktionell nicht in Erscheinung. Um Eefeplasmide mit der modifizierten MFα1-tPa-Verschmelzung zu erzeugen, werden die Plasmid de pDR1207 und pDR1208 zuerst mit Sph I und Xba I aufgespalten Das das 3'-Ende des TPI-Promotors, den MFα1-Lader und die tPA-Kodierungssequenz enthaltende Fragmeint wird einer Gelreinigung unterzogen und dann an das in Beispiel 9 beschriebene pDR1107 angelagert, welces dann mit Sph I und Xba I geschnitten wird und so as Derivate von pDR12C7 bzw. pDR1208 die Plasmide pDR1307 bzw. pDR1308 ergibt. Diese Zwischenprodukte werden dann für die Konstruktion von Hefeexpressionsvektoren verwendet.
  • Beispiel 9 Konstruktion von pDR11G7 Das Plasmid pDR1107 (Fig. 10) umfaßt den 5'-Teil des TPI-Promotors, den TPI-Terminator und einen Teil des Plasmids pUC18 (Norrander et al., ibid.). Es ist dies somit ein Bakterienplasmid und kann in einem geeigneten Stamm von E. coli, wie JM83, repliziert werden (Nessing, Recombinant DNA Technical Bulletin, NIH Puoication No. 79 - 9, 2, No. 2, 43 - 48, 1979).
  • Entsprechend Fig. 10 wurde das 800 bp-TPI-Terminatorfragment aus einem Xba I + Bam I-Schnitt von pDR403 gereinigt. Dieses Fragment wurde dann unter Verwendung vom T4-DNS-Ligase'mit pUC18 verbunden, das zuvor mit XDa I und Bam EI linear ausgerichtet worden war. Dieses Gebilde wurde dann für die Transformation von E.
  • coli K12 (JM83) verwendet. Die Plasmide wurden aus den erhaltenen weißen Kolonien isoliert und auf die Anwesenheit des 800 bp-Xba I-Bam HI-Einschubs analysiert. Ein Plasmid mit diesem Einschub wurde ausgewählt und als pDR1100 bezeichnet.
  • Der TPI-Promotor wurde von pDR403 als 900 bp-Bgl II-Eco RI-Bragment gereinigt. Dieses Fragment wurde mit den Plasmid p.I07 (aufgebaut durch Restriktion von pUC8 mit Hind III und Eco RI und Einschub der Polylinkersequenz gemäß Fig. 11) verbunden, das zuvor mit Bgl II und co RI geschnitten worden war. Das Konstruktionsgebilde wurde dann für die Transformation von £. coli K12 (JM83) verwendet. Die Plasmide wurden aus den erhaltenen weißen Kolonien isoliert. Ein Plasmid mit dem 900 bp-3gl II-co RI-inschub wurde als pDR1101 bezeichnet.
  • Zur Aufbau des Plasmids pDR11G7 wurde ein Teil des TPI-Promotors aus pDR1101 mit pDR1100 auf folgende Weise verbunden. Das plasmid pDR1101 wurde mit Sph I und Kind III aufgespalten, wonach ein 700 bp-Partial-TPI-Promotorfragment gereinigt wurde. Das Plasmid pDR1100 wurde mit Sph I und Hind III zerschnitten, wonach das Promotorfragment aus pDR1101 unter Verwendung von T4-DRS-Ligase mit dem linear ausgerichteten plasmid verbunden wurde. Das Verbindungsgemisch wurde zur Transformation von E. coli K12 (JN83) verwendet.
  • Die aus den wei3en Kolonien isolierten Plasmide wurden auf die Anwesenheit eines Hind IlT-Bam HI-Einschubs (ca. 1,6 kb) analysiert. Ein derartiges Flasmid wurde mit pDR1107 bezeichnet.
  • Eeispiel IG Abschnittspezifische Änderungen in der tPA-Kodierungssequenz Die Mutationen in der tPA-cDNS-Sequenz wurden durch in vitro-Mutagenese korrigiert, wobei man im wesentlichen der Zwei-lrimer-V;ethode von Zoller et al.
  • (ibid.) gefolgt ist. Aus mp19-ZV52 wurde eine Matrise aus einem einzelnen (positiven) DNS-Strang bereitet.
  • Danach wurden zwei Oligonucleotidprimer mit der Natrize verbunden. Der erste Primer war komplementör zu dem den mutagenen Abschnitt umgebenden Bereich mit Ausnahme eier einzigen Baseninkongruenz. Der zweite irrimer war komplementär zu einer 40 Basenpaare vom 5'-Ende des mutagenen Abschnitts entfernten Sequenz. Die Reaktion zur Anlagerung der Primer an die Matrize wurde in der Regel 10 Minuten bei 55°C durchgeführt, worauf 5 Minuten lang auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. Danach wurde DNS-Polymerase I (Klenow-Fragment) und T4-DNS-Ligase zugeft und die Primer 4 - 8 Stunden lang bei 14°C gehalten. Das Gemisch wurde dann zur Trasnfektion von coli JM83 verwendet, wonach die Zellen plattiert und über Nacht gezüchtet wurden. Zur Identifizierung der positiven Plaques wurde die aus auf Nitrozellulosefilter, wie oben beschrieben (Zoller et al., ibid.), transferiert, wonach die Filter einer einstündigen Prähybridisierung bei 37°C und dann der Hybridisierung bei 37°C, ebenfalls für die Dauer von 1 stunde, mit ae geeigneten 32 P-markierten mutagenen rrimer unterzogen wurden. Danach wurde nacheinander bei Raumtemperatur, 5CCC und gegebenenfalls bei 60°C gewaschen, wobei zwichen den einzelnen Waschvorgängen autoradiografiert wurde. Die durch Hybridisierung bei der (aen) höheren -lemperatur(en) als positiv identifizierten Plaques wurden ausgewählt, wonach daraus DNS hergestellt wurde. Die Anwesenheit der gewünschten Sequenz wurde durch Sequenzierung nach der Dideoxymethode überprüft.
  • Fr die Korrektur der Mutation bei Pos. 605 wurde als erster (mutagener) Primer der 21-mer 5' GTTGTGGTTCCCC-AGGCCCAG3' und als zweiter (Sequenzierungs-) Primer der 17-mer 5' CTTAAAGACGTAGCACC3' verwendet. Der positive Strang von mp19-ZV52 wurde als Patrize verwendet.
  • Für die Korrektur der Mutation bei Pos. 404 wurden zwei Wege eingeschlagen. Der erste bestand darin, daß man als Matrize den positiven Strang eines Phagenklons mit korrigierter Mutation bei los . 605 verwendete und der zweite, da man als Matrize den positiven Strang enes nicht korrigierten mp19-ZV52 verwendete. In beiden Fällen war der 18-mer 5' CTGGCACACGAAATCTGA 3' der mutagene und der 18-mer 5' GGCCCTGGTATCTATTTC3' der Sequenzierungsprimer.
  • Die Mutation bei Pos. 1069 wurde dadurch korrigiert, aa man als Patrize den positiven Strang mit der in Pos. 605 korrigierten Mutation verwendete. Mutagener Primer war der 20-mer 5' CTTCCTTCGGCAAAGATGGCA3' und Sequenzierungsprimer war 5' GCCCCCGCACAGGAACCG3'.
  • Beispiel 11 Konstruktion von Expressionsvektoren mit Korrekturen in der tPA-Kodierungssequenz trA-KOdierungssequenzen mit einer oder mehreren korrigierten Basen werden in verschiedene Hefeexpressionsvektoren auf folgende Weise eingefügt. Die Replikationsformen von M13-Klonen, die die verschiedenen Korrekturen enthielten, wurden mit den entsprechenden Er,-zymen aufgespalten und die tPA-Fragmente wurden gereinigt. Diese Fragmente wurden in die Bakterienvektoren pDR1206, pSR12C7 und pDR12C8 eingefügt, die zuvor mit Bgl II und Xba I aufgespalten worden waren, um die mutanten tPA-Sequenzen zu entfernen.
  • Das Plasmid pDR1216 mit der korrigierten Mutation in Hos. 605 wurde aus pDR12G6 durch Substitution mit einem die Korrektur der mutanten Sequenz enthalte; Bgl II-Xba I-Fragment aufgebaut. Die Plasmide pDR1217 und pDR-1218 wurden in gleicher Weise aus den Flasmiden pDR1207 bzw. pDR1208 aufgebaut.
  • Die Plasmide pDR1226, pDR1227 und pDR1228 wurden aus pDR1206, pDR1207 bzw. pDR1208 durch Substitution mit einem die Korrektur für die mutante Sequenz in Pos. 404 enthaltenden Bgl II-Xba I-Fragment aufgebaut.
  • Die Plasmide pDR1246, pDr1247 und pDr1248 wurden aus pDR1206, pDR1207 bzw. pDR1208 durch Einfügung eines Bgl II-Xba I-Bragments, das sowohl die Korrektur in Pos. 605 als auch die Korrektur in los. 404 enthielt, in das linear ausgerichtete Plasmid aufgebaut.
  • Die Plasmide pDR1256, pDR1257 und pDR1258 wurden aus pDR1206, pDR1207 bzw. pDR1208 durch Einfügung eines Bgl II-Xba I-Fragments, das sowohl die Korrektur in Pos. 6G5 als auch die Korrektur in Pos. 1069 enthielt, in das linear ausgerichtete Plasmid aufgebaut.
  • Die Plasmide pDR1276, pDR1277 und pDR1278 wurden aus pDr1206, pDR1207 bzw. pDR1208 durch Einfügung eines Nar I-Xba 1-Fragments, das sowohl in Pos. 605 als auch in os. 1G69 korrigiert war, und eines Bgl II-Nar I- Fragments des in Pos. 404 eine Korrektur enthaltenden Klons in das linear ausgerichtete Plasmid aufgebaut.
  • Diese drei Plasmide kodieren, wie angenommen wird, für einen tPA, der die AS-Sequenzen aufweist, wie von Pennica et al. (ibid.) und Wallen et al. (ibid.) beschrieben.
  • Die tPA-cDNS-Sequenz von pDR1276 wurde in M13mp18 und M13mp19 als Sph I-Xba 1Fragment subgeklont, um die beiden Stränge zu sequenzieren. Die Sequenzierung nach der Dideoxymethode ergab, daß die cDNS vier neue Basensubstitutionen an den Nucleotiden 870, 873, 876 und 879 enthielt und eine Zweibasendeletion in den Positionen 723-724. Die Basensubstitutionen in den Positionen 404, 605 und 1069 erwiesen sich als korrigiert.
  • Die Sequenzierung mehrerer Subklone von Zwischenprodukten Deim Aufbau der Expressionsvektoren zeigte, welche Sequenzen als Quellen für DTS-Fragmente für den Aufbau der richtigen tPA-Sequenz in Frage kommen.
  • Das M13T21, welches das Xho II-Xho II-tPA-iragment des Plasmids puCW umfaßt, wobei dieses Fragment in den Bam HI-Abschnitt von M13mpll eingefügt war, enthielt in den Pos. 723-724 und 870-879 keine Fehler, wies jedoch in den Pos. 4C4, 6G5 und 1069 Basensubstitutionen auf. Das Flasmid pDR1276 enthielt die korrigierten Substitutionen in den Pos. 404, 605 und 1069.
  • Entsprechend Fig. 12 wurde ein die richtige Sequenz aufweisender Hefeeeeressionsvektor wie folgt aufgebaut.
  • Die replikative Form von M13T21 wurde mit Xho II und Sca I aufgespalten, wonach das 5'-tPA-Fragment gereinigt wurde. Das Plasmid pDR1276 wurde mit Sca I und Xba I aufgespalten, wonach das 3'-tPA-Fragment gereinigt wurde. Außerdem wurde das Plasmid pDR1276 auch noch mit Bgl II und Xba I aufgespalten, wonach das die pUC18-Sequenzen aufweisende Fragment gereinigt wurde. Die drei Fragmente wurden dann miteinander verbunden, um das Plasmid pDR1286 zu erzeugen, das lediglich die ursprünglichen Mutationen in den Pos. 404 und 605 enthält. pDR1286 wurde dann vollständig mit Xba I und partiell mit Taq I aufgespalten, um auf diese Weise ein 1145-Basenpaar-tPA-Fragment zu erhalten, das mit einem 446 Basenpaar-Bgl-II-Taq I-Fragment aus pDR1276 und einem Bgl II-Xba I-Vektor-Fragment aus pDR1276 verbunden wurde, um auf diese Weise das Plasmid pDR1296 zu ergeben. Dieses Plasmid umfaßt somit den 3'-Bereich des TPI-Promotors, die MFα1-Sequenz und die tFA-Kodierungssequenz, wobei sämtliche Fehler korrigiert sind.
  • Um den 5'-Bereich des TPI-Promotors und -terminators in der Expressionseinheit des pDR1296 wiederherzustellen, wurde der Vektor mit Sph I und Xba I aufgespalten und das aus TPI-Promotor, MFα1- und tPA-Sequenzen bestehende Fragment gereinigt. Dieses Fragment wurde dann in pDR11C7 eingefügt, das zuvor mit Sph I und Xba I aufgespalten worten war. Das erhaltene Plasmid wurde mit pDR1396 bezeichnet.
  • Der endgültige Hefeexpressionsvektor wurde dann durch Spaltung von pDR1396 mit Bam EI und Hind III und Reinigung des die Expressionseinheit des TPI-Fromotors, MFα1, tPA und TPI-Terminator umfassenden Fragments aufgebaut. Dieses Fragment wurde dann in YEp13 eingeführt, das zuvor mit Bam HI und Hind III aufgespalten worden war. Das erhaltene Plasmid ist als pDR1496 bekannt. Die Sequenzierung der in M13mp18 und mp19 subgeklonten Sph I-Xba I-pDR1496-tPA-Sequenz bestatigte, daß sämtliche Mutationen korrigiert worden waren.
  • Das Plasmid pDR1497 wurde aufgebaut, um für den sezernierten tPA mit dem Aminoterminus Gly-Ala-Arg-Serzu kodieren. Die Kodierungssequenz für tPA wurde an die MFI-Sequenz bei den Rodonen für den Bys-Arg-Synthese-Abschnitt angelagert.
  • ü pDR1497 aufzubauen, wurde pDR1217 mit Bgl II und Xba I geschnitten und das Vektorfragment wurde einer Gelreinigung unterzogen. Die tPA-Kodierungssequenz wurde von pDR1296 entfernt, wonach die beiden Fragment te miteinander verbunden wurden. Das erhaltene Gebilde (pDR1297) wurde für die Transformation von E. coli LM1035 verwendet.
  • Um nachzuweisen, daß die richtige Sequenz hergestellt wurde, wurde eine von einem Transformanten isolierte Plasmid-DNS mit Sph I und Xba I geschnitten und das den tPA-Kodierungsbereich umfassende Fragment gereinigt. Dieses Fragment wurde an die Replikationsform von M13mp19, die mit Sph I und Xba I geschnitten worden war, angelagert. Die Sequenzanalyse ergab, daß die Sequenz der-Faktor-tPA-Verbindung und die tPA-Kodierungssequenz wie erwünscht waren.
  • Der endgültige Hefeexpressionsvektor pDR1497 wurde dann wie folgt aufgebaut. Das Sph I-Xba Fragment von pDR1297, das den 3'-Bereich des TPI-Promotors, die MFα1-Sequenz und die tPA-Kodierungssequenz umfaßte, wurde in pDR1107 eingefügt, das mit Sph I und Xba I aufgespalten worden war. Dieses Gebilde, bekannt als pDR1397, wurde dann mit Eind III und Bam EI aufgespalten, wonach das die Expressionseinheit aufweisende Fragment einer Gelreinigung unterzogen wurde. Dieses Fragment wurde dann in YEp13 eingefügt, das mit Hind III und Bam HI zuvor geschnitten worden war. Das erhaltene Gebilde ist pDR1497.
  • Das Plasmid pDR1498 umfaßt die korrigierte tPA-Kodierungssequenz für die kurzere Form des Moleküls (ertPA), verschmolzen mit den Kodonen für das Lys-Arg-Spaltungssignal desα-Faktors. Es wurde analog zu pDR1497 aufgebaut, wobei als Quelle für das Ausgangsvektorfragment pDR1208 verwendet wurde.
  • Das Plasmid pDR1499 umfaßt die Kodierungssequenz fr Met-Gly-Ala-Arg-Ser-tPA, die unmittelbar mit dem TPI-romotor zur Kodierung für die intrazelluläre rroduktion von tPA verbunden ist. Es wurde wie folgt aufgebaut. Das Plasmid pDR1005 wurde mit Sph I und Xba I geschnitten, wonach das den 3'-Teil des TiI-Promotors und die tPA-Kodierungssequenz enthaltende Fragment einer Gelreinigung unterzogen wurde. Dieses Fragment wurde dann mit pUC19 verbunden, das zuvor mit Sph I und Xba I linear ausgerichtet worden war. Das erhaltene Plasmid, bekannt als pDR1209, wurde dann mit Bgl II un Xba I geschnitten, wonach das Vektorfragment gereinigt wurde. Die die korrigierte Base in ros. 6G5 aufweisende tPA-Kodierungssequenz wurde dann von der Replikationsform des geeigneten, in Beispiel 10 beschriebenen M13-Klons gereinigt. Dieses Bgl II - Xba I-Fragment wurde dann mit dem Vektorfragment von pDR1209 zur Erzeugung von pDR1219 verbunden. Das Plasmid pDR1499 wurde dann analog zu pDR1497 und pDR1498 unter Verwendung von pDR1219 als Quelle für das Ausgangsvektorfragment aufgebaut.
  • für die Expression in Hefe werden die obengenannten Plasmide für die Transformation eines geeigneten Hefewirtsstamms verwendet und die Transformanten, wie in Beispiel 12 beschrieben, gezüchtet. Ein bevorzugter Hefewirtsstamm ist E8-11c.
  • Nachstehende Tabelle zeigt die vorhergesagte Sequenz eines durch die oben beschriebenen Expressionsvektoren kodierten primären Translationsprodukts.
  • Vektor pDR1496 MFα-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-Gly-Ala-Arg-Ser-tPA pDR1497 MFα1-Lys-Arg-Gly-Ala-Arg-Ser-tPA pDRI 498 M -Lys-Arg-Se r-tPA pDR1499 Met-Gly-Ala-Arg-Ser-tPA ESeiskiel 12 Expression von tPA in S. cerevisiae Zur Transformation des E8-11c-Stammes von S.cerevisiae wurde der Expressionsvektor pDR1496 mit dem TPI-Promotor, der MFα1-Leadersequenz, der Gly-Ala-Arg-Ser-tPA Kodierungssequenz und dem TPI-Terminator in YEp13 verwendet. Die Zellen wurden dann bis zur Ausbildung einer stationären Ehase gezüchtet und zur Beimpfung von frischem leufreiem Medium verwendet. Die Kultur wurde dann bei 30°C unter Rühren mit 250UpM inkubiert. Als Iontrolle wurde eine ähnliche, mit YEpI3 transformierte Kultur von E8-11c bereitet.
  • Ic, 20, 22 und 24 Stunden nach der Beimpfung wurden aliquote Anteile von jeweils 100 ml entnommen. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgeerntet, wonach die gewaschenen pelletierten Zellen mit Glaskügelchen in mit Phosphat abgepufferter physiologischer Kochsalzlösung zerkleinert und auf die tPA-biologische Aktivität nach der Fibrinolysemethode getestet wurden. Diese beruht auf der Methode von Binder et al. (J. Biol.
  • Chem. 254: 1998, 1979). 10 ml einer Rinderfibrinogenlösung (3,0 mg/ml in 0,036 M Natriumacetat, pH 8,4, 0,036 M Natriumveronal, 0,145 M NaCl, 10-4 4 M CaCl2, 0,02 % NaN3) wurden 10 ml einer 1,5%-igen Lösung von niederschmelzender Agarose im selben Puffer bei 40°C zugesetzt. DieseLösung wurde ihrerseits mit 1C1 Plasminogen und 10 tul Rinderthrombin versetzt (500 U/ml).
  • Dieses Gemisch wurde dann auf ein Gelbond-Agaroseträgerplättchen (Fa. Marine Colloids) gegossen, wonach man das Ganze abkühlen ließ. Dann wurden in die Agarose Vertiefungen geschnitten, in die 10 /ul der zu testenden Probe und 1G /ul der 0,1 %-iges Rinderserumalbumin enthaltenden phosphatgepufferten Kochsalzlösung gegeben wurden. Die Ergebnisse wurden dann mit einer mit gereinigtem tPA erhaltenen Standardkurve verglichen. Die Entwicklung eines transparenten Hofs um die Vertiefungen zeigt die Anwesenheit von biologisch aktivem tlasminogenaktivator an. Die Testergebnisse für eine repräsentative Serie von Experimenten sind in Tabelle A zusammengefaßt.
  • Mit pDR14961 pDR1497, pDR1498 und pDR1499 transformierte E8-IIc-Stämme von S. cerevisiae wurden unter der Nr. 20728, 20729, 20730 bzw. 2G731 bei der American Type Kultur Collection hinterlegt.
  • Tabelle A Plasmid Zeitdauer Aktivität¹ (µg/l) YEp13 18 Std. -20 Std.
  • 22 Std.
  • 24 Std.
  • pDR1496 18 Std. 13,2 20 Std. 27,0 22 22 Std. 18,0 24 Std. 17,2 1Die Proteinkonzentrationen sind je ml Kultur angegeben; Analog hergestellte Kulturen von mit pDR1496 transformierten E8-11c wurden nach der ELISA-Methode (Beispiel 13) untersucht. Die Ergebnisse sind nachstehend sumrarisch angegeben.
  • ELISA+ Gesamtprotein Zeitdauer µg/l mg/l 18 Std. 52,8 166,0 2C std. 104,0 264,C 22 Std. 120,0 280,0 24 Std. 80,0 296,4 +Die Proteinkonzentrationen sind je 1 Kultur angegeben.
  • bin mit pDR1498 transformierter E8-11c-Stamm von 5. cerevisiae wurd in leufreiem mit 2 % Glukose + 0,1 x Kaliumhydrogenphtalat,pH 5,5 versetztem Medium gezüchtet. Die ungereinigten Extrakte der stationären Kulturen wurden nach der ELISA- und der Pibrinolysemethode untersucht.
  • Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengefaßt.
  • tPA, /ug/l Spez.
  • Stamm Medium ELISA Fibrinolyse Aktivität E8-11c/pDR1498 ungepuffert 88,0 7,7 C,088 E8-11c/pDR1498 gefpuffert 76,0 14,4 0,19 Rohe Extrakte von E8-11c/pDR1493 in PBS wurden mit 60 %-iger gesättigter (NH4)2SO4-Lössung ausgefällt, erneut in PBS suspendiert und gegen PBS dialysiert. Die Endproteinkonzentration betrug 100 mg/ml. 50 µl dialysierter Extrakt wurden mit PBS bzw. Endoglykosidase H (C,1 /ug) versetzt, wonach die proben vor dem Test auf fibrinolytische Aktivität 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Die unten zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß durch die in vitro-Behandlung mit Endoglykosidase H die biclogische Aktivität von durch Hefe erzeugtem tPA sich um ca. das zwei- bis sechsfache erhöht hat.
  • Proteinkonzentration Fibrinolytische Aktivität, ng/ml in der Probe (mg/5C µl) - nndo H + Endo H 5,0 170 380 1,C 25 110 C,25 7 30 0,05 1,7 11 Beispiel 13 Enzymgekoppelter Immunosorbenstest (ELISA) auf tPA Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (Immulon 2, Fa.
  • Dynatech) wurden mit affinitätsgereinigtem Kannichen-Anti-tPA-Antikörper beschichtet, woför man 200 µl einer Antikörperverdünnung (1:400) in 0,1 M Na2CO3 bei einem pH von 9,6 verwendete. Die Platten wurden über Nacht bei 400 stehen gelassen, wonach man eine dreifache Wäsche mit Puffer B (0,05 % Tween 20, 0,05 % NaN3 in phosphatgepufferter Salzlösung) durchführte. Danach wurden in jede Vertiefung 200 µl Puffer A (0,05 % Tween 20, 0,05 % NaN3, 1 % BSA in phosphatgepufferter Salzlösung gegeben), wonach die Flatten 2 Stunden bei 350 zur Reduzierung der nicht spezifischen Bindung inkubiert wurden. Danach wurden die Platten drei Mal mit Puffer B gewaschen.
  • Die Testproben wurden durch Verdünnen des Testmaterials in Puffer A bereitet. In jede Vertiefung wurden 200 Probe gegeben. Die Platten wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden abgesaugt und 3 al rit Puffer 3 und einmal mit Aqua dest. gewaschen. In jede Vertiefung wurden 200 /ul einer Lösung von affinitätsgereinigte: Kaninchen-Anti-tPA-Antikörper, gekoppelt mit alkalischer Phosphatase in Puffer A (gewöhnlich eine Verdünnung des konjugierten Antikörpers von 1:800) gegeben, wonach die Platten 3C Minuten dabei Raumtemperatur inkubiert wurden. Danach wurde die Antikörperlösung entfernt und die Platten mit Puffer B und Aqua dest. gewaschen.
  • Dann wurden 200 µl Enzymsubstrat (60 mg para-Nitrophenylphosphatreagens /Sigma/ in 50 ml einer Lösung von 96 1/1 Diethanolamin, 56 mg/l MgOl2, pH ,8) zugesetzt, wonach die Platten 30 Minuten bei 3?oO inkubiert wurden.
  • Die rlatten wurden dann mit hilfe eines Detektors ("Multiskan", Fa. Titertek) gelesen. Die Ergebnisse wurden mit der mit nativem tPA bei 5-10G ng/ml in Puffer A erhaltenen Standardkurve verglichen.
  • Beispiel 14 Abschnittspezifische Mutagenese des Plasminogenaktivators Der Gewebeplasminogenaktivator enthält vier potentielle Glykosylierungsabschnitte (AS-Sequenz Asn-X-(Ser)). Gemäß Pohl et al. (Biochemistry 23: 3701-3707, 1984) werden drei dieser Abschnitte (Asn-117, -184 und -448) in aus Melanomzellen nach Bowes erhaltenem tPA glykosyliert. Der vierte Abschnitt (Asn-218) ist in Bowes tPA nicht glykosyliert.
  • er in Hefe erzeugte Plasminogenaktivator erweist sich auf Grund der Western blot-Analyse als stark glykosyliert.
  • Dieser Umstand kann die Eignung des Produktes für die Behandlung des Menschen beeinträchtigen, da dieser es als Fremdprotein erkennen könnte. n's wird daher eine Methode zur Erzeugung modifizierter Formen von tPA in transformierter Hefe bereitgestellt, wobei die modifizierten Proteine verglichen mit dem nicht modifizierten in Hefe erzeugten tPA verminderte Glykosylierung aufweisen, die biologische Aktivität dabei jedoch erhalten bleibt. Die modifizierten Plasminogenaktivatoren weisen außerdem ein vernindertes Potential an antigenen Sigenschaften im Hinblick auf den Menschen auf. Durch Umwandlung der Asn-Reste an den Glykosylierungsabschnitten in andere Aminosäurereste kann die Glykosylierung blockiert werden. Besonders bevorzugt ist dabei die Umwandlung der Asn-Reste in Gln-Reste. Außerdem können zur Blockierung der Glykosylierung von in Hefe erzeugtem Protein auch noch andere Abänderungen in der Sequenz durchgeführt werden. So z,B. kann ein Prolinrest in der zweiten Stellung der Sequenz Asn-X-(SerThr) die Glykosylierung in Hefe verhindern (Marshall, Biochem, oc. Symp. 40: 17-26, 1974). In dieser position können auch noch; eitere Substitutionen durchgeführt werden.
  • Auch kann die dritte Aminosäure des Glykosylierungsabschnitts abgeändert werden.
  • Abänderungen in der den tPA kodierenden DNS-Sequenz können nach der Methode dei abschnitts pezifischen Mutagenese im wesentlichen nach Zoller und S lith, Manual for Advanced Techniques in Molecular Clonin Course, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983, durchgeführt werden. Zur Modifizierung eines oder mehrerer Glykosyl ierungsabschnitte können die ADänderungen in den Nucleotiden einzeln oder in ombination miteinander erfolgen. Außerdem können mutierte Sequenzen durch Restriktion von Vektoren mit Restriktionsendonuklease unter Durchführung von Mutationen und Verbindung der so erhaltenen Fragmente zu den gewünschten Produkten kombiniert werden. Auch können in einer einzigen Mutagenesestufe mehrere Abänderungen durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden zusätzliche Nucleotidsubstitutionen durchgeführt, welche die natürlich vorkommenden Kodone an den Glykosylierungsabschnitten in die bevorzugten Hefekodone umwandeln.
  • B. Versuchsteil Die geklonte tPA-cDNS wurde in zwei Fragmente subgeklont, um eine abschnittspezifische Mutagenese vorzubereiten.
  • Um den 5'-Bereich der tPA-Sequenz zu erhalten, wurde ca.
  • 1 µg des Plasmids pDR1296 zwei Stunden bei 37°C mit einer einheit von Bgl II in einem Bgl II-uffer (3RL) abgespalten. danach wurde eine einheit von Eco RI zugefügt und nach einer zusätzlichen Inkubationszeit von 1G und 20 Minuten wurden aliquote Mengen entfernt. Die DNS-Fragmente wurden auf einem 1 %-igen Agarosegel isoliert und das 1086 bp-Bgl II-partiell-Eco RI-Fragment wurde durch eine NA-45 DEAE-Membrane (Fa. Schleicher & Schuell) gemäß Herstellervorschrift elektroeluiert. Die 3'-Kodierungssequenz wurde durch Aufspaltung von pDR1296 mit Xba I und Eco RI in 0,05 M Tris, ph 7,4, 6 mM MgCl2 und 0,05 M NaOl erhalten. Die Fragmente wurde auf einem 1 -igen Agarosegel isoliert und das 532 bp-Eco RI-Xba I-Fragment wurde wie oben eluiert. Die Fragmente wurden mit CHCl3 extrahiert und mit Phenol und EtOH ausgefallt. Das gereinigt Bgl II-Eco RI-Fragment wurde dann an das mit Bam 1 + Eco RI gespaltene M13mp8 (Replikationsform oder RF) dadurch angelagert, daß die beiden Fragmente 5 Stunden bei Raumtemperatur mit T4DNS-Ligase inkubiert wurden. Das co RI-Xba Fragment wurde in gleicher Weise an das von Eco RI + Xba I aufgespaltene M13 mp 19 (Replikationsform) angelagert.
  • Die rekombinierten Phagenklone wurden für die Transfektion des kompetenten i;. coli Ji; 101 verwendet. Die Phagen-DNS wurde von Plaques gereinigt und nach der Dideoxymethode unter Verwendung des Primer ZC87 sequenziert, um die Anwesenheit der richtigen cDNS-sequenz festzustellen.
  • Die abschnitt spezifische Mutagenese wurde an einsträngigen M13-Matrizen durchgeführt, wobei als mutagene Primer ZC294, ZC295 und Z0297 (s. Tabelle 3) verwendet wurden, um Änderungen bei Asn-117, -184 bzw. -448 zu erzeugen, Die Timer sollten die Änderung potentieller Glykosylierungsabschnitte durch Änderung der Asn-Kodons in Gln-Kodons sowie durch Änderung anderer Kodons von Glykosylierungsabschnittenin solche, die von Hefe bevorzugt werden, bewirken. Die Primer wurden mit der Sequenz der Matrizen verglichen, um Bereich mit sekundärer Homologie zu vermeiden, welche zu unerwünschten Mutationen führen könnten.
  • Die Glykosylierungsabschnitte bei Asn-117 und -184 wurden dadurch verändert, da: man als Matrize die M13mp8-Rekombinante mit dem Bgl II-co RI-minschub verwendete. Der Abschnitt bei Asn-448 wurde durch Verwendung der M13mp19-Rekombinante, die den Eco RI-Xba I-Einschub enthält, als Matrize verändert. Bei allen Mutagenesereaktionen wurde als Sekundärprimer der Universal-M13-Primer ZC87 verwendet.
  • 2G pmol des phosphorylierten mutagenen Primers und 20 pmol des Sekundärprimers wurden mit 1 pmol der einsträngigen Matrize in 10 µl von 20 mM Tris, pH 7,5 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl und 1 mM DTT vereinigt und 10 Minuten bei 65°C und dann 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann auf Eis ausgebracht. Zu der auf diese Weise gewonnenen DNS wurden 10 µl 20 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, enthaltend 1 mM dNTPs, 2,5 einheiten Klenow-Polymerase und 3,5 Einheter DNS-Ligase zugefügt und das Gemisch 3 Stunden bei 15°C inkabiert. Die DNS wurden dann für die Transfektion in kompetentes E. coli JM101 verwendet, wonach die Zellen auf YT-Agar plattiert und bei 37 0C inkubiert wurden. Die Plaques wurden dann bei einer Temperatur des mutagenen Primers von -40C eine Stunde in einer 6X SSC, 10X-Denhardtschen Lösung vorhybridisiert und dann bei -4°C in derselben Lösung mit dem 32p-markierten mutagenen Primer hybridisiert.
  • Die Filter wurden über Nacht der Röntgenstrahlung ausgesetzt. Dann wurde noch ein zusätzlicher Waschvorgang bei einer um 5°C höheren Temperatur als für die Identifizierung von Plaquemutanten erforderlich durchgeführt. Die nachstehenden Phageklonmutanten wurden identifiziert: Nr. 2: M13mp8 mit dem bei Asn-117 eine Mutation enthaltenden Bgl II-Teil-Eco RI-Fragment; Nr. 10: M13mp8 mit dem bei Asn-184 eine Mutation enthaltenden Bgl II-Teil-Eco RI-Fragment; Nr. 24: M13mp19 mit der bei Asn-448 eine Mutation enthaltenden Eco RI-Xba I-Fragment.
  • Danach wurden tPA-Mutanten kodierende DNS mit ein-, zwei-oder dreifachen Mutationen durch Substitution der tsA-Kodierungssequenzen in pDR1298 aufgebaut. Es wurden folgende Plasmide aufgebaut: (1) pDR1601 mit einer Mutation bei Asn-117; (2) pD216C2 mit einer Nutation bei Asn-184; (3) p3216G3 mit einer Mutation bei Asn-448; (4) pDR1604 mit Mutationen bei Asn-117 und -448; (5) pDR 1605 mit Mutationen bei Asn-184 und -448; (6) pDR1606 mit drei Mutationen.
  • Das Plasmid pDR16C1 wurde dadurch aufgebaut, daß man das Hind III-Teil-Eco RI-Fragment, das die Asn-117-Mutation des Klons Nr. 2 (RF) enthält, einer ersten Reinigung unterzog und es dann in mit Hind III + co R.I restringiertes pUC12 einschob. Das erhaltene plasmid wurde dann der Restriktion mit Xho II und dann teilweise mit co RI unterzogen, wonach das die.tPA-Sequenz enthaltende 1086-bp-Fragment gereinigt wurde. Dieses Fragment wurde dann in einer Dreifachbindung mit einem 532 bp-Eco RI-Xba I-Fragment aus pDR1296 (mit der 3'-tPA-Sequenz) und dem groben Xba I-Bgl II-Fragment aus pDR1298 (mit pUC18, TPI-Promotor und MEα1-Sequenzen) verbunden, wodurch das Plasmid pDR16C1 erzeugt wurde.
  • Das Plasmid pDR1602 wurde auf ähnliche Weise unter Verwendung des Klons Nr. 10 (RF) als Quelle der Mutante 5'-tPA-Fragments (Hind III-Teil-£co RI) erzeugt.
  • Das Plasmid pDR1603 wurde durch Reinigung des 3'-mutanten tPA-Fragments (Eco RI-Xba I aus Klon Ior. 24 /RF/) und Verbinaung desselben in einer dreiteiligen Verbindung mit dem Xba I-Bgl II-Fragment aus pDR1298 und dem Bgl II-Teil-Eco-RI-5'-tPA-Fragment aus pDR1296 aufgebaut.
  • Das Plasmid pDR1604 wurde, wie für pDR1601 beschrieben, aufgebaut, wobei das Eco RI-Xba I-Fragment aus Klon Nr. 24 (RF) anstelle des entsprechenden Fragments aus pDR1290 verwendet wurde.
  • Das Plasmid pDR1605 wurde, wie für pDR1602 beschrieben, hergestellt, wobei anstelle des entsbrechenden Fragments aus pDR1296 das Eco RI-Xba I-Fragment aus Klon Nr. 24 (RF) verwendet wurde.
  • Das Plasmid pDR1606 wurde durch Verbindung des Xba I-Bgl II-Fragments aus pDR1298 mit einem Bgl II-Taq I-Fragment (mit der Mutation bei Asp-117) aus pDR1601 und einem Teil-Taq I-Xba I-Fragment (mit Mutationen bei Asn-184 und -448) aus pDR1605 hergestellt.
  • Alle Plasmide der pDR1600-Reihe wurden mit Sph I und Xba I aufgespalten, die tPA-Sequenzen wurden gereinigt und nach M13mp8 zwecks Sequenzüberprüfung geklont.
  • Plasmide mit den gewscten sequenzen wurden ausgewählt, um für den Aufbau von Hefeexpressionsvektoren verwendet zu werden. Die Plasmide pDR1701-1706 wurden aus pDR1601-1606 dadurch gewonnen, daß die Plasmide der pDR1600-Reihe mit Sp I und Xba I aufgespalten wurden, wonach die tA-Fragmente gereinigt und mit dem Sph I + Xba I-restringierten pDR1107 verbunden wurden. Die Ilasmide der pDR1700-Reihe wurden dann mit Bam EI und Hind III aufgespalten, wonach.
  • die tPA-Expressionseinheiten in das Bam HI + Hind III-restringierte YEp13 eingefügt wurden, wodurch die Plasmide pDR1801-1806 entstanden.
  • Die Plasmide pDR1801, pDR1802, pDR1803 und pDR1804 wurden für die Transformation des Starnmes E8-11c von S. cerevisiae verwendet. Die transformierten Zellen wurden in einem leufreien Medium, das 2 % Glukose enthielt, bei 30°C in einen Schüttelkolben unter Rühren mit 250 UpM gezüchtet.
  • Während der gesanten Züchtungsdauer wurden in Abständen Proben entnommen und diese nach dem ELISA-Verfahren auf tPA-Polypeptid und nach dem Fibrinolyseverfahren auf ihre biologische Aktivität hin untersucht. Die erhaltenen Daten wurden mit den Standarddaten eines gereinigten tPA vergleichen. Die nachstehend angeführten Untersuchungsergebnisse zeigen, daß jede der drei Einzelabschnittmutationen (pDR1801, 1802 und 183) eine gesteigerte biologische Aktivität bewirkt.
  • tPA, Plasmid Zeitdauer (Std.) ELI»A Fibrinolyse pDR1498 28 64 64 pDR1801 30 80 408 pDR1802 30 40,6 404 pDR1803 30 64,8 720 pDR1604 26 88 132 Beisiel 15 Verwendung von pHC5-Signalpeptid zur tPA-Sekretion as lefegen P£L5 (Arima et al., Nuc. Acids Res. 11: 1657-1672, 1983) kodiert die sezernierte Proteinsäurephosphatase. Zur expression in Hefe wurde ein synthetisches, das PHO5-Signalpeptid kodierendes DNS-Fragment mit der tPA-Kodierungssequeny verbunden.
  • Zum uibau einer Signalpeptidkodierungssequenz wurden die Oligenucleotide ZC231 232, 233 und 234 (s. Tabelle 3) synthetisiert und phosphoryliert. Danach wurden sie paarweise (Z0231 + ZC232 und Z0233 + ZC234) verscholzen und bildeten auf diese Weise Fragmente mit einsträngigen 5'-Termini. Die fragmente wurden in äquimolaren Mengen mit pUC13, das zuvor mit Eco RI und Bam HI geschnitten worden war, verbunden. Das erhaltene Gemisch wurde für die Transformation von . coli JM83 verwendet. Die hellblauen rlaques wurden ausgewählt und durch DNS-Sequenzierung analysiert. Ein Plasmid, das den richtigen Einschub aufwies, wurde ausÕewGnlt unc mit pMPH05 bezeichnet.
  • Die PH05-Sequenz wurde dann an den TPI-Promotor und die tPA-Kodierungssewquenz wie folgt angelagert (Fig. 2C). Das Plasmid pDR1296 wurde mit Eind III und Bgl II aufgespalten.
  • Das den TPI-Promotor und die MEα1-Sequenzen enthaltende Fragment wurde gereinigt und in pIC7 geklont, das zuvor mit ind III und Bgl aufgespalten worden war. Dieser Klon wurde sodann mit b-'.co RI und Bgl II restringiert, wonach die MFα1-Preprosequenz entfernt wurde. Das Plasmid pMPH05 wurde mit Eco RI und Xho II aufgespalten, wonach die PHC-5-Signalsequenz gereinigt wurde. Diese wurde dann an das pDR1296-Fragment angelagert. Das erhaltene Plasmin (mit der Bezeichnung pMTPIPH(5) wurde dann mit Sph I und Bgl II gespalten, Das den TPI-Promotor und die PHC5-Sequenz enthaltende Fragment wurde ereinigt und in einer dreiteiligen Verbindung mit tPA-cDNS (Bgl II-Xba I-Fragment) aus Plasmid pDR1296) und pUC18, , des zuvor mit S.h I und Xba I aufgespalten worden war, verbunden. Das erhaltene Plasmid wurde mit pDR1294 bezeichnet (Fig. 20).
  • Um einem Hefeexpressionsvektor aufzubauen, der die TPI-Promotor-PHO5-tPA-Expressionseinheit enthält, wurde das Plasmid pDR1294 mit Sph I und Xba I aufgespalten. Danach wurde das TPI-PHO5-tPA-Fragment gereinigt und in das pDR1107 eingefügt, wodurch das Plasmid pDR1394 entstand.
  • Die Expressionseinheit wurde dann durch Restriktion mit Bam 'sI und Rind III von pDR1394 abgetrennt und einer Gelreinigung unterzogen. Dieses Fragment wurde dann, wie in Beispiel 11 beschrieben, in YEp13 eingefügt, wodurch das Plasmid pDR1494 entstand.
  • Der Stamm E8-11c von S. cerevisiae wurde mit pDR1494 transformiert. Die Zellen wurden in einem leufreien Medium gezüchtet, das 6%-ige Glukose und 0,1 M Kaliumhydroxyphtalat enthielt (pn 5,5), bis sich eine stationäre Phase herausbildete. Der tPA wurde nach dem ELISA- und nach dem Fibrinolyseverfahren getestet. Die Expressionsmenge betrug 52,8 µg/l bzw. 14.4 µg/l.
  • Das pDR1494 wurde durch abschnitt-spezifische Mutagenese zur Deletion der Kodone für Gly-Ala-Arg am 5'-Ende der tPA-Sequenz modifiziert. Das pDR1394 wurde mit Sph I und XDa I der Restriktion unterworfen, wonach das-1,9 kb-TPI-PHC5-tPA-Fragment in M13mp18 subgeklont wurde. Es wurde eine Einstrang-DNS hergestellt und mit dem Oligonucleotid 20403 (5' GCC AAT TCT TAC CAA 3') verschmolzen. Der zweite Strang wurde entrollt und das Gemisch zur Transfektion von E. coli Jl'1C7 verwendet.
  • Die Plaques wurden durch Hybridisierung mit markiertem Cligonucleotid ZC403 analysiert. Aus den positiven Klonen wurde DNS hergestellt und zum Nachweis der Anwesenheit der gewünschten 5'-tPA-Sequenz sequenziert. Das difizier te tPA-Fragment wurde vom M13-Vektor durch Restriktion der replikativen DNS-Form mit Eind III + Bam I entfernt.
  • Das die tPA-Expressionseinheit enthaltende Fragment wurde zur Herstellung des Plasmide pZV84 in YEp13 eingefügt.
  • S. cerevisiae E8-11c wurde mit pZV84 transformiert, wonach die Zellen in eine. leufreien Medium, das 6 ;e Glukose und 0,1 N Kaliumhydrogenphtalat, pH 5,5, enthielt, 28 Stunden bei 30°C gezüchtet. Die Expressionsmenge wurde nach dem ELISA- und Fibrinolyseverfahren untersucht und betrug 96 uG/l bzw. . 64 jug, 1.
  • Beispiel 16 Verwendung des SUC2-Signalpeptids für die Expression von tPA Das Hefe-SUC2-Gen kodiert zwei Formen der Invertase, von denen die eine ein glykosyliertes, sezerniertes Protein aufweist, da als ein Signalpeptid enthaltender Frecursor synthetisiert wird. 7ur Verwendung des SUC2-Signalpeptids zur Sezernierung von tPA wurde ein Teil der SUC2-Kodierungsequenz mit der tPA-Kodierngssequenz zur Erzielung einer Genverschmelzung verbunden. Unter Verwendung synthetischer Oligonucleotide wurde die dazwischenliegende DNS einer Deletion unterzogen, ut den ersten Kodon der tPA-Sequenz unmittelbar anschließend an die oacne für den SUC2-Signalpeptid-Spaltungsabschnitt anzuordnen.
  • Das SUC2-Gen wurde aus dem Plasmid pRB58 (Carlson und Botstein, Cell 28: 145-154, 1982) in sorm eines Eco RI-Fragments gewonnen. Dieses Fragment wurde unter Verwendung von DNS-Polymerase I (Klenow-Fragment) abgestumpft, mit Bam I-Linker verbunden und mit Bam HI und partiell mit Nco I geschnitten. Das erhaltene Fragment, welches den SUC2-Promotor und den 5'-Kodierungsbereich enthielt, wurde mit einem Nco I-Xba I-tPA-Fragment aus pDR1299 in pUC12 verbunden, welches zuvor mit Bam EI und Xba I aufgespalten worden war. Das erhaltene Plasmid, das mit pHK1002 (Fig. 21) bezeichnet wurde, wurde mit ari HI und Xba 1 gespalten, wonach das SUC2-tPA-Fragment gereinigt wurde. Dieses Fra rent wurde sodann mit dem Xba I-arn HI-TPI-Terminator-Fragment aus pDR1100 in YEp13 verbunden und dann mit Pam HI linear ausgerichtet. Das so erhaltene Gemisch wurde für die Transformation von . coli RNI verwendet. Die Plasmide aus den Ampr Tets-Transformanten wurden analysiert, um die Anwesenheit und Orientierung der 3,1 kb-3a; HI-Bam HI-Expressionseinheit festzustellen. in mit pHK1102 bezeichnetes Plasmid wurde entnommen und mit Bam HI und Xba I gespalten, worauf das SUC2-tPA-Fragment gereinigt wurde.
  • Dieses Fragment wurde sodann in M13mp18 (RS) eingesetzt, um eine Matrize für eine in vitro-Schleifenbildung für die rzeugung exakter SUC2-Signalpeptid-tPA-Verschmel zungen zu erhalten Die Matrize wurde sequenziert, um aer gesamten SUC2-Kodierungsbereich und die SUC2-tPA-Verbindung auf ihre Richtigkeit hin zu überprüfen.
  • Um die fremde Kodierungssequenz zwischen der SUC2-und der tPA-Sequenz zu entfernen und eine exakte Verschmelzung bei Gly-tPA und Ser-tPA zu erreichen, wurden an der M13 in vitro-Schleifenbildungen ausgeführt. Für die Steuerung dieser Schleifenbildungen wurden die Oligonucleotide Z0238 und ZC239 (Tabelle 3) verwendet. Die SUC2-tPA-Fragmente wurden von der M13-RF-DNS in Form von Bam HI-Xba I-Fragmenten isoliert und mit dem TPI-Terminator (Xba I-Bam HI-Fragment aus pDR1100) in YEp13 verbunden, das zuvor mit am HI geschnitten worden war. Die Plasmide pHK1202 und pHK1205 enthielten die SUC2-Gly-tPA-Einheit als Einschub mit entgegengesetzter Orientierung am BamHI-Absohnitt. Die Plasmide pHK1302 und pHK1305 enthielten die SUC2-Ser-tPA-Einheit ebenfalls als Einschub mit entgegengesetzter Orientierung.
  • Danach. wurde der SUC2-Promotor in den angeführten Konstruktionsgebilden durch den TPI-Promotor substituiert. Die die Verschmelzungen enthaltenden Plasmide wurden mit Hind III und Xba I aufgespalten, wonach die SUC2-tPA-Fragmente gereinigt und mit einem Nco I-Hind III-Adapter (Sequenz: und dem Nco I-Xba I-Vektor-Fragment aus pDR1399, das die TPI-Promotor- und -terminatorsequenzen enthielt, verbunden.
  • ble erhaltenen Zwischenprodukte wurden mit Sph I und Xba I aufgespalten, wonach die TPI- romotor-tPA-Fragmente in M13mp18 subgeklont und zum Nachweis der Kahtsequenzen sequenziert wurde. Die Expressionseinheiten aus den Zwischenprodukten wurden durch Restriktion mit Bam HI und partielle Restriktion mit Bgl II entfernt und in YEp13 subgeklont. Die erhaltenen Hefevektoren wurden als pHK1212 (mit der Expressionseinheit für Gly-Ala-Arg-Ser-tPA) und als pHK1312 (mit der Expressionseinheit für Ser-tPA) bezeichnet.
  • Da der TPI-Promotor durch Zugabe eines co RI-Abschnitts zur Erleichterung des Aufbaus modifiziert worden war, enthält er eine Sequenz, die sicn von der natürlichen TPI-Promotorsequenz und von einer im allgemeinen in starken Hefepromotoren anzutreffenden Oonsensussequenz erheblich unterscheidet. Die Promotorsequenz aus pHK1312 wurde daher in vitro unter Verwendung der Oligonucleotide ZC375 und ZC376 (Tabelle 3) zu natürlichen und Consensussequenzen mutagenisiert. Die Mutationen wurden durch Sequenzierung überprüft und die modifizierten Promotorsequenzen wurden mit dem Rest der Expressionseinheit in YEp13 verbunden.
  • Die erhaltenen, mit pHK1322 und pHK1332 bezeichneten Plasmide umfassen die natärliche TPI- und Consensuspromotorsequenzen.
  • Die Plasmide pHK1212, pHK1312, pHK1322 und pHK1332 wurden in m. cerevisiae E8-11c transformiert. Die Zellen wurden in leufreiem i"'ediur, das 2 2 % Glukose enthielt, gezüchtet.
  • Die erhaltenen Expressionsmengen wurden mit Hilfe des ELISA- und Fibrinolyseverfahrens an ungereinigten Zellextrakten bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengefaßt.
  • tPA, µg/l Plasmid Zeitdauer ELISA Fibrinolyse pHK1212 20 Std. 18,4 0 pHK1312 22 " 32 54 pHK1322 22 " 38 4C pHK1322 22 " 32,6 38 Beispiel 17 Verwendung einer endogenen tPA-Preprosequenz eifer tPA wird hergestellt aus einem primären Translationsprodukt, das ein Leaderpeptid umfaßt, das vom Molekül im Laufe seiner Sekretion aus der Zelle, in der es synthetisiert wurde, entfernt wird. Es wurde ein Hefeexpressionsvektor aufgebaut, der die tPA-Signalsequenz und die Kodierungssequenz für das reife Protein umfaßte.
  • Spaltungsabschnitte für Bam EI und co I sind unmittelbar am 5'-Ende des ersten Kodons (ATG) der Signelsequenz vorhanden, und ein Bgl II (Bau 3A, Xho II)-Abschnitt befindet sich a 5'-Ende- Die natürlich auftretende Leadersequenz hat in; mittleren Bereich keinen passenden Restrikionsabschnitt; allerdings kann die Sequenz GGAGGA (die für die Aminosäuren -20 und -19, Gly-Ala kodiert) zu GGCGCC abgeändert werden und liefert damit Hae III-und Nar I-Abschnitte, ohne die AS-Sequenz zu verändern.
  • Unter Verwendung eines Applied Biosystems Model 38C-A-DNS-Synthesizer wurden nachfolgende Oligonucleotide synthetisiert: ZC131: 5' GGA TCC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG3' ZC132: 5' TGG CGC CAC ACA GCA GCA CAC AGC AGAG3' ZC133: 5' GGC GOC GTC TTC GTT TCG CCC AGC CAG GAA ATC CATG 3' ZC134: 5' AGA TCT GGC TCG TCT TCT GAA TCG GGC ATG GAT TTC CT3' Die OligomerenZC131 und ZC132 ergaben nach Anlagerung eine Überlapung von 12 Basenpaaren (Sektion 1).
  • Die Oligomeren ZC133 und ZC134 ergaben nach Anslagerung eine Überlappung von 12 Basenpaaren (Sektion 2).
  • Die Oligomeren wurden in Iol I-Puffer (BRL) gemischt, 5 Minuten auf 85°C erwärmt und dann langsam während vier stunden zur Durchfährung der Anlagerung auf Raumtemperatur abgekühlt. Danach wurden 10 Einheiten DNS-Polymerase I zugesetzt, wonach die Reaktion zwei Stunden lang bei Raumtemperatur fortgesetzt wurde. Die Gemische wurden der Elektrophorese an einem Sequenzierungsgel aus 8 %-igem Polyscrylamid und Harnstoff bei 1000 V während 2 1/2 Stunden unterworfen, um eine Größenfraktionierung der Reaktionsprodukte zu erzielen. Die Fragmente mit der richtigen Größe, d.h. diejenigen, bei denen die Polymerasereartion zum Abschluß gekommen ist,; wurden vom Gel abgeschnitten und extrahiert.
  • Nach der Anlagerung wurde die Sektion 1 mit Bam 1 und ar I geschnitten und im Bam HI + Nar I-Schnitt aus pUC8 geklont (s. Vieira und Messing, Gene 19: 259 -268, 1982 und Messing, Methous in Enzymology 101: 20 -1983). Die Sektion 2 wurde einer neuerlichen Anlagerung unterzogen, danach mit ar I und 3g1 II geschnitten und in Bam HI + Nar I-Schnitt aus pUCS geklont.
  • Kolonien davon wurde durch entsprechend markierte Oligo nucleotide analysiert. Plasmide, die sich durch Koloniehybridisierung als positiv erwiesen, wurden sequenziert, um zu überprüfen, daß die richtige Sequenz geklont worden war.
  • Die Sektion 1 wurde dann aus einem Bar EI + Nar I-Zweifachschnitt eInes entsprechenden pUC-Klons und Sektion 2 aus einem Nar I + Xho II-Schnitt durch ReiniourJ erhalten.
  • Beide Fragmente wurden am Nar I-Abschnitt angelagert und in Bam HI-Schnitt aus pUC8 geklont.
  • Die Preprosequenz wurde aus dem pUC-Vektor in Form eines Nco I-Sau 3A-Fragments gewonnen und an das Bgl II-Xba I-tPA-cDNS-Fragment aus pDR1296 und das Sph I-Nco I-TPI-Promotor-Fragment aus pDR1296 angelagert. Das so erhaltene Fragment wurde in pUC18 eingefügt, das zuvor mit Sph I und Xba I aufgespalten worden war. Das erhaltene Konstruktionsgebilde wurde mit pDR1295 bezeichnet.
  • Danach wurde der Hefeexpressionsvektor pDR1495 aus pDR1295, wie in Beispiel 15 für pDR1494 beschrieben, aufgebaut.
  • Diese Flasmid wurde dann in den stamm ES-11c von S. cerevisiae transformiert, wonach die Zellen in eine leufreien Nedium, das 2 Jlukose enthielt, gezüchtet wurden.
  • Nach 16 Stunden wurden Zellextrakte nach dem ELISA- und nach dem Fibrinolyseverfahren auf tPA hin untersucht. Die Expressionsmengen betrugen 4,0 µg/l bzw. 5,2 µg/l.
  • Beispiel 18 Expressionsvektoren mit BAR1-tPA-Verschmelzungen Die tPA-Kodierungssequnezen wurden mit Teilen des Gens von . cerevisiae BAR1 verbunden. Die Konstrultionsgebilde kodieren die primären Translationsprodukte, welche ein Signalpeptid aufweisen, das sie auf einen Sekretionsweg dirigiert, welcher eine entsprechende Ilerausbildung der Disulfidbindung erleichtert.
  • Das Hefegen BARI kodiert ein sezerniertes Polypeptid, bekannt als Barrier. Dieses tolypeptid, von dem angenommen wird, da es glykosiert ist, bewirkt eine Reifung der Zellen vom Typ a und somit eine Überwindung der durch den α-Faktor hervorgerufenen Gl-Bemmung. Es stellte sich heraus, ca die Sequenz der ersten 2C - 24 Aminosäuren des primären Translationsprodukts von BAR1 den Sequenzen von bekannten Signalpeptiden von Hefe und Säugetieren entspricht. In primären Translationnsprodukt sind mehrere Abschnitte für eine potentielle Spaltung vorhanden.
  • S wurden nun DNS-Gebilde entworfen, um Verschmelzungen der tPA-Kodierungssequenz mit der Arg-Arg-zequenz im Bereich der Aminosäuren 177 und 178 von BAR1 (ein potentieller Abschnitt für die Eiqeißsynthese) soqie im Bereich eines gesigneten Bgl II-Abschnitts (Aminosäure 114 von BAR1) zu erzielen.
  • Das BAR1-Gen wurde aus einem Plasmidpool isoliert, der das gesamte, im Vektor YEp13 geklonte Hefegenom umfaßte (Nasmyth und Tatchell, Oell 19: 753 - 764, 1980). Der Plasmidpool wurde für die Transformation des Stamms XP635- 100 von . cerevisiae (MATa leu2-3 leu2-012 bar-1 ga12; ATCC Mr. 20679) verwendet und die erhaltenen Transformaneten nach ihrer Leucinprototrophie ausgewählt und dann auf die Fähigkeit zur Barrier-Aktivität-Sekretion untersucht (durch Aufhebung der α-Faktor-Hemmung). Es wurde gefunden, daß zwei Koloniendiese Eigenschaften besitzen. Diese Plasmide wurden isoliert und mit pBAR2 und pBAR3 bezeichnet.
  • Aus diesen beiden Transformanten isoliertes Plasmid-DNS wurde für die Transformation des Sta:nms RR1 von E. coli verwendet (ATCC Nr. 31343). Die Transformanten wurden nach ihrer Amicillinresistenz ausgewählt. Die Plasmide pBAR2 und pBAR3 wurden dann durch Reinigung aus den L.
  • coli-Transformanten gewonnen und durch Endonkleasere-Restriktion sowie durch Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidgel identifiziert. Das Plasmid pBAR2 enthielt einen Einschub von ca. 9,2 kb. Der durch das Plasmid pBAR2 transformierte Stamm RI von b.coli wurde unter der Nummer 39410 bei ATCC hinterlegt. Die Subklonung zeigte, daß der pBAR-Plasmideinschub einen Teil des pBAR2-Einschubs umfaßte, im Vektor jedoch in entgegengesetzter Richtung ausgerichtet war. Eine weitere Subklonung und Untersuchung auf Barriersekretion ergab, daß die funktionelle BAR1-Gensequenz in einem Bereich von ca. 2,75 kb lokalisiert ist.
  • Diese Fragment umfaßt die Kodierungssequenz, die nichttranslatierten transkribierten Sequenzen, den Promotor, die Regulatorregionen, den Transkriptionsterminator und die flankierenden chromosomalen Sequenzen.
  • Das Plasmid pBAR2 wurde mit Restruktionsendonkleasen Hind III und Xho I der Xestriktlon unterworfen, wonach ein Fragment von ca. 3 kb durch Elektrophorase durch ein Agarosegel gereinigt wurde. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pUGI3 eingeschoben, das mit Kind III und al I zuvor aufgespalten worden war. Das erhaltene rekombinante Plasmid (pZV9) kann zur Transformation von E. coli verwendet werden, weist jedoch den erfroderlichen Replikationsursprung und den für einen Hefevektor selektierbaren Varker nicht auf.
  • Zur Verwendung von BAR1-Sequenzen für die Expression des tPA wurde ein Teil des BAR1-tens zuerst mit dem Hefe-ADH1-Promotor verbunden (Fig. 22). Das Plasmid pAAH5 (Ammerer, Meth. in Enzymology 101: 192 - 201, 1983) wurde mit Hind III und Bam EI der restriktion unterworfen. Das #1,4 kb-ADH1-Fragment wurde isoliert und zusammen mit dem Eco RI - Hind III-Polyklinker aus pUC12 in das mit Eco RI und Bam EI aufgespaltene pBR322 unter Bildung des Plasmids pAM5 eingeschoben. Das Plasmid pAM5 wurde mit Sph I und Xba I aufgespalten, wonach ein #450 bp-ADH-Promotor-Fragmeint isoliert wurde. Das Plasmid pZV9 wurde mit Xba I geschnitten, wonach das #2kb#BAR1-Fragment gereinigt wurde.
  • Die beiden Fragmente wurde dann mit YEp13 verbunden, das durch Restriktion mit Sph I und Xba I zuvor linear ausgerichtet worden war. In Plasmid mit den Fragmenten in der richtigen Ausrichtung für die Expression der 3ARI-Sequenz aus dem ADH1-Promotor wurde als pZV24 bezeichnet (Fig. 22).
  • Aufgebaut wurde dann ein Plasmid, das die BAR1-Sequenz enthielt, verbunden mit der Ser-tlA-Kodierungssequenz im Abschnitt Bgl II von BAR1 (Fig. 23). Danach wurden pDR1107 und DR1296 in E. coli G-48 (dam) transformiert.
  • Danach wurden die Plasmide hergestellt und mit Xba I und Bam HI in einem Xba I-Puffer der Restrition unterworfen.
  • Das 600 bp-TPI-Terminator-Fragment aus pDR1107 und das 4,3kb-tia + Vektor-Fragment von pDR1296 wurden der Gelreinigung unterzogen. Diese beiden Fragmente wurden über Nacht bei Raumtemperatur miteinander verbunden und zur Transformation von E.coli RR1 verwendet. Aus Transformanten wurde Plasmid-DNS bereitet. Die DNS wurde mit Xba I und am EI in einem Xba I-Puffer zur Ermittlung positiver Klone zerschnitten. Ein solcher Klon wurde als pJH33 bezeichnet.
  • Das plasmid pJH33 wurde mit Bgl II und Sph 1 in einem Unipuffer zerschnitten. Das 5,1 kbg-tPA-Terminator-und Vektorfragment wurde einer Gelreinigung unterzogen.
  • pZV24 wurde mit Sph I und Bgl II in einem Unipuffer (0,05 M Tris, pH 7,4, 0,006 M MgCl2 und C,G5 M NaOl) zerschnitten und das erhaltene 800 bp-ADH1-Promotor-BAR1-Fragment einer Gelreinigung unterzogen. Das 5,1 kb-Bgl II-Sph I-Fragment wurde über Nacht bei Raumtemperatur mit dem 800-bp-ADH1 -Promotor-BAR1-Fragment aus pZV24 verbunden. Das so erhaltene Gemisch wurde in E. coli RR1 transformiert. Die Plasmid-DNS wurde dann durch Restriktion mit Sph I + Bgl II und Sph I + Bam HI analysiert. Ein positives Plasmid wurde ausgewählt und mit pJH35 bezeichnet.
  • Danach wurde das Hefeplasmid pJH39 aufgebaut, das in (Pos.
  • 1025 (Aminosäure 114) von BAR1 die mit der BAR1-Sequenz verbundene tPA-Kodierungssequenz enthält. Diese Verbindung führt zu einem primären Translationsprodukt, das aus einem Teil des Barrier-Polypetids gebunden an Ser-tPA besteht, wobei eine Regeneration des Arg-1 AS-5'-Endes am Ser von tPA erfolgt. Um pJE39 aufzubauen, wurde pJH33 und YEp13 mit Sph I und Bam HI in einem Unipuffer aufgespalten. Das YEp13 Fragment und der 3 kb-Einschub von pJH35 (bestehend aus ADH1-Promotor, BAR1-tPA-Verbindung und THI-Terminator) wurden einer Gelreinigung unterzogen und die Anlagerung über Nacht durchgeführt. Das so erhaltene Plasmid wurde mit pJH39 bezeichnet (Fig. 23).
  • Danach wurde ein zweiter Expressionsvektor aufgebaut, der die an die Gly-Ala-Arg-Ser-tPA-Kodierungssequenz im Bereich des potentiellen Eiweißsyntheseabschnitts Arg-Arg von BARI gebundene BAR1-Sequenz enthält (s. Fig. 24 und 25).
  • pDR1219 wurde mit cc I aufgespalten und die Fragmentenden mit DNS-Polymerase I (Klenow.Fragment) und dNTPs abgestumpft.
  • Danach wurde das Fragment mit Kinase Sal I heiß behandelten Linkern verbunden. Das Verbindungagemisch wurde dann über Nacht inkubiert, wobei es mit Sal I und Xba I in einem Xba I-Puffer aufgespalten wurde. Das 1,6 kb-Fragment wurde unter Verwendung einer NA45-Membrane einer Gelreinigung unterzogen. pUC13 wurde mit Sal I und Xba I in Xba I-Puffer geschnitten und unter Verwendung einer NA45-Membrane einer Gelreinigung unterzogen. Das 2,7 kb-pUC13-Fragment und das 1,6 kb-tPA-Fragment wurden bei Raumtemperatur über Nacht miteinander verbunden und in E. coli JM83 transformiert. Dann wurden auf die Transformanten 2 ml schnelle Plasmidpräparate gegeben. Diese wurden zur Identifizierung positiver Klone mit Xba I und Sal I in Xba I-Puffer zerschnitten. Es wurde ein positives Plasmid ausgewählt und mit pJH6 bezeichnet.
  • Danach wurden die BAR1 und tih Sequenzen miteinander verbunden. Das pZV9 wurde mit Hind III und Sal I in Hind III-Puffer aufgespalten, wonach das 1,75 kb-BAR1-Fragment unter Verwendung einer NA45-Membrane der Gelreinigung unterzogen wurde.
  • Das pJH6 wurde mit Hind III und Sal I in einem Unipuffer (0,05 M Tris, pH 7,4, 0,006 M MgCl2, 0,05 M NaCl) aufgespalten, wonach das linear ausgerischtete 4,3 kg-Plasmid unter Verwendung einer NA45-Membrane der Gelreinigung unterzogen wurde. Das 1,75 kb-BAR1-Fragment und das 4,3 kb-tPA + pUC13-Fragment wurden über Nacht bei Raumtemperatur miteinander verbunden und in . coli JM83 transformiert.
  • s wurde Plasmid-DNS hergestellt und mit Bgl II in einem nituffer zur Identifizierung positiver Klone aufgespalten.
  • in solcher Klon wurde ausgewählt und als pJH18 bezeichnet.
  • Das aus pJH18 durch Restriktion mit Bgl II befreite 400 bp-Fragment wurde unter Verwendung einer NA45-Membrane gelgereinigt. Das pICl9H wurde mit BglII in einem Unipuffer aufgespalten, mit dem 400 bp-BAR1-tPA-Fragment über Nacht bei Raumtempüeratur verbunden und in E. coli J83 transformiert. kuf die Transformanten wurden 2 ml Plasmidpräparate gegeben. Die DNS wurde mit Hind III und Bam EI in einem t;nipuffer und mit Bam EI + Sal I in einer. Gnipuffer aurgespalten, um die positiven Klone zu identifizieren una die Orientierung der Einschübe zu ermitteln.
  • Ein positiver Klon wurde ausgewählt und als pJH20 bezeichnet.
  • Danach wurden die BAR1- und Gly-Ala-Arg-Ser-tPA-equenzen genau miteinander verbunden. Das pJH20 wurde mit Hind III und Bam HI in einem Unipuffer aufgespalten, wonach das 400 bp-BAR1-tPA-Fragment unter Verwendung einer NA45-Membrane der Gelreinigung unterzogen wurde. Das M13mp18 wurde mit Rind III und Bam EI in einem Unipuffer aufgespalten und unter Verwendung einer NA45-Nembrane der Gelreinigung unterzogen.Dieses Vektorfragment und das 400 bp.BAR1-tPA-Fragment wurden über acht bei Raumtemperatur miteinander verbunden. Das Verbindungsgemisch wurde in S. coli JM101 transformiert.
  • Die Replikative Form der DNS wurde von Plaques hergestellt und mit Bgl II in einem Unipuffer zur Identifizierung positiver Klone aufgespalten. Ein solcher Klon wurde ausgewählt und mit mp19-JH23 bezeichnet (Fig. 24). Matrizen-DNS wurde aus mp19-JH23 hergestellt und sequenziert. Danach wurde mp19-JE23 einer Mutagenese durch Schleifenbildung unter Verwendung der Oligonucleotide ZC354 und ZC87 (Tabelle 3) als Primer unterzogen. Danach wurden RF-Präparate von möglichen positiven Plaques hergestellt. Diese wurden mit Bgl II aufgespalten, um positive Klone zu iaentifizieren. Potentielle positive Klone wurden sequenziert und ein Klon mit der gewünschten BAR1-tPA-Verbindungssequenz wurde mit mp19-JH42 bezeichnet.
  • Entsprechend Fig. 25 wurde eine BAR1-tPA-Verbindung in ein pUC-Plasmid eingeschoben, um die nachfolgenden Manipulationen zu erleichtern. Der Phage mp19-JH42 und das Plasmid pIGI9H- (mit der in den Eco RI-Abschnitt von SUC9 eingeschobenen Polylinkersequenz von Fig. 11) wurden mit Bgl II aufgespalten , wonach das Plasmid linear ausgereichtet wurde und zusammen mit einem ca. 200 bp.BAR1-tPA-Franent der Gelreinigung unterzogen wurde. Das linear ausgerichtete Plasmid wurde dann mit Kalbsdamphosphatase behandelt, um eine Regelegation zu verhindern, und mit aem £ARI-tPA-Fusionsfragment verbunden. Das so erhaltene rlasrid wurde mit pJR4£ bezeichnet. Danach wurde ein H-efe- vektor aufgebaut, der die Verbindung von BAR1 am Arg-Argodon mit der Gly-Ala-Arg-Ser-fPA-Sequenz enthielt. Es wurde folgendermaßen hergestellt. Das Plasmid pjH46 wurde mit Bgl II in einer Unipuffer aufgespalten, wonach das BARl-tPA-Fusionsfragment mit ca. 200 bp einer Gelreinigung unterzogen wurde. Das Plasmid pJR35 wurde unter Verwendung von Bgl II linear ausgerichtet, dann einer Gelreinigung unterzogen und zuletzt mit Kalbsdarmphosphatase behandelt.
  • Die beiden Fragmente wurden dann über Nacht miteinander verbunden und Klone davon durch Spaltung mit Restriktionsendonuklease untersucht. Ein Plasmid, das das gewünschte Muster zeigte, wurde mit pJH51 bezeichnet. Die Plasmide pJH51 und YEp13 wurden mit Sph I und Bam nI in einem Unipuffer aufgespalten. Das YEp13-Vektorfragment und das 3,1 kb-ADH1-BAR1-tPA-TPI-Terminator-Fragment wurden einer Gelreinigung unterzogen und über Nacht miteinander verbunden, wodurch der Expressionsvektor pJH52 gebildet wurde (Fig.
  • 25).
  • Danach wurde ein dritter BARl-tFA-Expressionsvektor aufgebaut (Fig. 26). Er kodiert die am potentiellen Eiweißsyntheseabschnitt Arg-Arg mit der Ser-Form von tPA verbundene BAR1-Sequenz.
  • Das Plasmid pJH6 wurde mit Xba 1 und Bgl II in einem Unipuffer aufgesplaten und das #2,7 kb-Vektor-sowie das tPA-Fragment wurden der Gelrelnigung unterzogen. Die pDR1296-DNS wurde aus einem E. coli g-48 (dam)-Transformanten hergestellt und mit Xba I und 3g1 II in einem Xba Puffer aufgespalten. Das 1,6 kb-tPA-Fragment wurde unter Verwendung eines NA45-Papiers der Gelreinigung unterzoge. Der 2.7 kb-Vektor und das tPA-Fragment wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit dem 1,6 kb-tPA-Fragment verbunden und in E. coli RR1 transformiert. Das so erhaltene fllasrid wurde mit pJH32 bezeichnet.
  • mp19-JH23 und pJH32 wurden mit Bam EI und Sal I in einem Unipuffer aufgespalten. Das 6,5 kb-BARI-tPA-mpl9-Fragment von mp19-JH23 und das 1,6 kb-tPA-Frgament von pJH32 wurden einer Gelreinigung unterzogen. Beide Fragmente wurden über Nacht bei Raumtemperatur miteinander verbunden. Das Verbindungsgemisch wurde in E. coli JM101 tranformiert.
  • Die replikative Form der DNS wurde hergestellt und mit Sal 1 und Bam EI in einem Unipuffer aufgespalten, um positive Klone zu identifizieren. Einer davon wurde ausgewählt und mit mpl 9-JH38 bezeichnet. Dieser Klon wurde sequenziert, um ihn noch eingehender zu identifizieren. Um die gewünschte Verbindung zwischen den RAR1- und tPA-Sequenzen herzustellen, wurde mp19-JH38 einer Loop-out-Mutagnese unterzogen, wobei das Oligonucleotide ZC365 als mutagener Primer und das Cligonucleatid ZC151 (Tab. 3) als Sekundärprimer verwendet wurden. Von potentiellen positiven Klonen wurde RF-DNS hergestellt. Die DNS wurde durch Spaltung mit Nar I sowie mit Xba I + Bgl II in einem Hind III-Suffer untersucht. Sin positiver Klon wurde mit mp19-JH43 bezeichnet.
  • Matrizen-DNS wurde aus mp19-JH43 hergestellt und der Loopout wurde durch Sequenzierung bestätigt. Der Phage mp19-JH43 und das Plasmid pUC13 wurden mit Xba I und Kind III in einem Unipuffer aufgespalten. Das plasmid und das 1,8 kb-Fusionsfragment wurden, wie oben beschrieben, gereinigt und miteinander unter Bildung des Plasmids pJH47 verbunden.
  • in Hefelplasmid, das BAR1 gebunden an die Ser-tPA-Kodierungssequenz bei Kodon Arg-Arg (Pos. 122) von BAR1 enthält, wurde mit pJH49 bezeichnet. Es wurde folgendermaßen hergestellt. Das 1,8 kb-BAR1-tPA-Fusions-Fragment wurde aus eine mit Xba I und Bgl II aufgesplatenen pJH47 durch Gel-Elektrophorese unter Verwendung eines NA45-Papiers gereinigt hergestellt. Das 800 bp-SphI-Bgl II-ADH1-Promotor-BAR1-Fragment wurde auf gleiche Weise aus pZV24 isoT liert. Diese Fragmente wurden in einer dreiteiligen Verbindung an das Vektor-TPI-Terminator-Frgament angelagert, das durch eine zweifache Aufspaltung von pJH35 mittels Sph I und Xba I gewonnen worden war. Das erhaltene Plasinid wurde mit pJH48 bezeichnet. Dieses wurde dann mit Sph I und Bam EI in einem Unipuffer geschnitten. Das 3,4 kb-ADH2-Promotor-BAR1-tPA-TPI-Terminator-Fragment wurde einer Gelreinigung unterzogen und an YEp13 angelagert, das zuvor mit Sph I und Bam EI aufgespalten worden war. Der so erhaltene Expressionsvektor ist pJH49 (Fig. 26).
  • Die nefeexpressionsvektoren pJH39, pJE49 und pJH52 wurden für die Transformation des Staus E8-11c von S. cerevisiae verwendet. Die Zeilen wurden in einem leufreien Medium, das 6 % Glukose und 0,1 M Kaliumhydrogenphthalat, pr 5,5, enthielt , gezüchtet. Unger inigte Extrakte wurden nach dem ELISA- bzw. nach dem Fibrinolyserverfahren untersucht. Dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten: tPA (µg/l) Stamm Zeitdauer ELISA Fibrinolyse E8-11c/pJH39 26 Std. 20,8 22,4 E8-11c/pJH39 26 Std. 4,9 9,4 E8-11c/pJH39 26 Std. 4,0 11,0 Tabelle 1 Sequenz- Sequenzierte Restriktionsbezeichnung Region fragment Primer4 GA20 190-259 Xho II-Xho II1 M13 Z29 211-378 Xho II-Xho II1 1 TCTTACCAAGTG 288 362-527 Xho II-Xho II1 TGCAGCGAGCCAAGG 289 518-687 Xho II-Xho II1 ACGTGGAGCACAGCG Z90 658-859 Xho II-Xho II1 CGAGACTCAAAGCCC TG48-6 823-990 Eco RI-Eco RI² M13 291 1136-1289 Xho II-Xho II1 CCCTCCTGCTCCACC GS48-7REV 1202-1018 Eco RI-Eco RI² M13 292 1136-1289 Xho Il-Xho II1 GGGGGCATACTCATC RI-HINDIII 1279-1489 Eco RI-Hind III3 M13 293 1479-1648 Xho Il-Xho II1 TATTCGGAGCGGCTG 1805-1630 Xho II-Xho II1 M13 1 Die Sequenz stammt von einem Konstruktionsgebilde, das durch Einschub der tPa-Kodierungssequenz eines mit Xho II aufgespaltenen pUCW in M13mp11 erhalten wurde.
  • 2Das interne tPA-Eco RI-Fragment wurde in mit Eco RI-aufgesplatenem M13mp11 subgeklont.
  • 3Das Eco RI-Hind III-Fragment wurde in mit Eco RI und Hind III aufgeslatenem N13mp11 subgeklont.
  • 4Die Primer werden 5' --- 3' geschrieben. M13 bedeutet den Universalsequenzierungsprimer M13 von Bethesia Research Laboratories.
  • Tabelle 2 Veröffentl. Aminosäure-Nucleotid Sequenz1 cDNS änderung 404 T C Val-Ala 605 G b Gly-Glu 1069 T C Phe-Leu 1725 A C 1 Pennica et al, Nature 301: 214-221, 1983.
  • Tabelle 3 Oligonucleotide Sequenz ZC87 5'TCCCAGTCACGACGT3' ZC151 5'TTG CTG GTA TAT C TAC TG3' 5' ZC231 5,GCC GCT TCT TTG GCC AAT GCC GGC GCT 3' ZC232 5'GAT CTA GCG CCG GCA TTG GCC AAA GAA G3' ZC233 5,AAT TCA CAA TGT TTA AAT CTG TTG TTT ATT CAA TTT TG3 ZC234 5' CGG CCA AAA TTG AAT AAA CAA CAG ATT TAA ACA TTG TG3' ZC238 5,TCT GGC TCC TGC AGA TAT ZC239 5,TTG GTA AGA TGC AGA TAT3, ZC294 5,ACC AAC TGG CAA TCT TCT GCG TTG GCC3 ZC295 5' TGC TAC TTT GGT CAA GGG TCA GCC3, ZC297 5' CAA CAT TTA TTG CAA AGA ACA GTC3' ZC354 5' ATC TGG CGC CTC TTC TAG3' 5' ZC365 5,CAC TTG GTA GGA TCT TCT TGG GAA CCC AAT TCC3' ZC375 5,TTG CAA ARG CAT TTT TAG TTT ATG TAT GTG3' ZC376 5' CAA AAG CAT TGT GTT TTT TGT AG3'

Claims (21)

  1. EXPRESSION EINES PLASMINOGENAKTIVATORS IN HEFE Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung eines Gewebeplasminogenaktivators in Hefe, dadurch g e k e n n z e i c h n e t daß man eine durch ein DNS-Gebilde transformierte Hefekultur züchtet, wobei das Gebilde einen Hefegenpromotor und eine DNS-Sequenz enthält, die den Gewebeplasminogenaktivator kodiert und die Expression der Plasminogenaktivator-DNS-Sequenz unter Kontrolle des Promotors erfolgt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß der Promotor ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus dem Triosephosphat-Isomerase-Promotor und dem Alkohol-Dehydrogenase-I-Promotor.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß das genannte Gebilde ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Plasmiden pDR505, pDRlOO5, pDR1496, pDR1497, pDR1498 und pDR1499.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß das Gebilde ferner eine zwischen dem Promotor und der DNS-Sequenz angeordnete Leadersequenz aufweist.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß die Leadersequenz abgeleitet ist von einem Hefegen, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Genen MF 1, PHO5, SUC2 und BAR1.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß die Leadersequenz abgeleitet ist von der Pre-Pro-Region des tPA-Gens des Menschen.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß die Kultur in einem bei einem pH zwischen 5,0 und 6,0 gehaltenen Medium gezüchtet wird.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß das Medium einen Puffer enthält, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 0,1 M Kaliumhydrogenphthalat, pH 5,5, und 0,1 M Natriumsukzinat, pH 5,5.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß außerdem noch der Gewebeplasminogenaktivator von der Kultur isoliert wird und der isolierte Gewebeplasminogenaktivator zur Entfernung der Kohlenhydrate entsprechend behandelt wird.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man die Behandlung durch Inkubieren des isolierten Gewebeplasminogenaktivators in Gegenwart von Endoglykosidase H durchführt.
  11. 11. Polypeptid mit der Aktivität eines Gewebeplasminogenaktivators und der modifizierten Aminosäuresequenz des Gebildes, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß es in einer Position, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Aminosäurepositionen 117, 184, 218 und 448, einen Glu- taminrest aufweist.
  12. 12. DNS-Gebilde, dadurch g e k e n n z e i c h n e t daß es einen Hefegenpromotor und ein Gen für den Gewebeplasminogenaktivator enthält, das so angeordnet ist, daß es der Steuerung durch den Promotor in der Hefe unterliegt.
  13. 13. DNS-Gebilde nach Anspruch 12, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus dem Triosephosphat-Isomerase-Promotor und dem Alkohol-Dehydrogenase-I-Promotor.
  14. 14. DNS-Gebilde nach Anspruch 12, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß es die DNS-Sequenz eines Plasmids, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Plasmiden pDR505, pDR1005, pDR1496, pDR1497, pDR1498 und pDR1499, aufweist.
  15. 15. DNS-Gebilde nach Anspruch 12, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß es ferner zwischen dem Promotor und dem Gen eine Leadersequenz aufweist.
  16. 16. DNS-Gebilde nach Anspruch 15, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß die Leadersequenz abgeleitet ist von einem Hefegen, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Genen MFs 1, PHOS, SUC2 und BAR1.
  17. 17. DNS-Gebilde nach Anspruch 15, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß die Leadersequenz abgeleitet ist von der Pre-Pro-Region des tPA-Gens des Menschen.
  18. 18. DNS-Gebilde nach Anspruch 12, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß das Gewebeplasminogenaktivatorgen eine mutagenisierte, den Glykosylierungabschnitt kodierende Sequenz enthält.
  19. 19. DNS-Gebilde nach Anspruch 18, dadurch g e k e n n - z e i c h n e t , daß die Kodierungssequenz Gln-x-(Ser) (Thr) ist und der Gln-Codon im Plasminogenaktivatorgen in einer Position angeordnet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Codonen 117, 184, 218 und 448.
  20. 20. Hefetransformantenstamm, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß dieser ein DNS-Gebilde nach Anspruch 12 enthält.
  21. 21. Transformant nach Anspruch 20, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß er Saccaromyces cerevisiae aufweist.
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