DE3752008T2

DE3752008T2 - Hybride Plasminogenaktivatoren

Info

Publication number: DE3752008T2
Application number: DE3752008T
Authority: DE
Inventors: Sefik Prof Dr Alkan; Fredericus Alphonsu Asselbergs; Bhabatosh Dr Chaudhuri; Jutta Dr Heim; Bernd Dr Meyhack; Bhanu Dr Rajput; Oostrum Jan Dr Van
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1986-12-05
Filing date: 1987-12-03
Publication date: 1997-08-14
Anticipated expiration: 2007-12-04
Also published as: FI875324L; IE81116B1; GR3023047T3; NO177603C; FI100106B; EP0277313B1; HK1005037A1; DK638187D0; PT86276A; ATE148167T1; NO875069L; CA1341479C; JPS63160581A; AU8209187A; NZ222793A; IL84700A; FI875324A0; DE3752008D1; CY2156B1; JPH09117292A

Description

Die Erfindung betrifft hybride Plasminogenaktivatoren, DNAs, die solche hybride Plasminogenaktivatoren codieren, Hybridvektoren, die solche DNAs enthalten, mit solchen Hybridvektoren transformierte Wirte, Verfahren zur Herstellung solcher hybrider Plasminogenaktivatoren, DNAs, Hybridvektoren und Wirte, und pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche hybride Plasminogenaktivatoren enthalten.
Blutgerinnsel sind die Hauptursache für Morbidität und Mortalität von Menschen in der entwickelten Welt. Blutgerinnsel bestehen aus Fibrin, das aus einem löslichen Vorläufer-Fibrinogen durch die Wirkung des Enzyms Thrombin gebildet wird. Eine Anzahl von Enzymen und anderen Substanzen gewährleisten, daß sich Gerinnsel normalerweise nur und dort bilden, wo sie benötigt werden, um einen Blutverlust zu verhindern.
Säugerplasma enthält ein enzymatisches System, das fibrinolytische System, das Blutgerinnsel auflösen kann. Eine Komponente des fibrinolytischen Systems ist eine Gruppe von Enzymen mit der Bezeichnung Plasminogenaktivatoren, die Plasminogen (eine inaktive Proenzymform von Plasmin) in das proteolytische Enzym Plasmin umwandeln. Plasmin baut das Fibrinnetzwerk der Gerinnsel unter Bildung löslicher Produkte ab. In Fällen, in den die thrombolytische Kapazität des Körpers nicht ausreicht, um intravasculäre Thromben zu entfernen, beispielsweise bei Patienten, die an Thromboembolien oder postchirurgischen Komplikationen leiden, kann es unverzichtbar sein, exogen verabreichte Thrombolytika zu verwenden.
Zwei Typen von Plasminogenaktivatoren (nachstehend als "PAs" bezeichnet) können aus menschlichen Körperflüssigkeiten oder Zellen isoliert werden: Urokinase oder ein Plasminogenaktivator vom Urokinase-Typ (nachstehend als "u-PA" bezeichnet), eine Serinprotease, die beispielsweise in Urin und Nierenzellen vorkommt, und einen Plasminogenaktivator vom Gewebstyp (nachstehend als "t-PA" bezeichnet), der von den Endothelzellen gebildet wird und in einer Reihe von endokrinen Geweben vorkommt.
Sowohl t-PA als auch u-PA kommen in zwei molekularen Formen vor: eine einkettige Form (oft als "sc-t-PA" bzw. "sc- u-PA" bezeichnet) und eine zweikettige (tc) Form. Die einkettige oder Proenzymform wird in die zweikettige Form durch die Wirkung von proteolytischen Enzymen an gut definierten Positionen in der Polypeptidsequenz umgewandelt. Die so erhaltenen zwei Ketten des prozessierten PA-Proteins bleiben über Schwefel-Schwefel-Brücken miteinander verknüpft. Das carboxylterminale Fragment oder die B-Kette vermittelt die enzymatische Aktivität von PA, wohingegen die aminoterminale A-Kette Regulatoreinheiten, wie Fibrinbindungsstellen, enthält. Die spezifische Bindung eines inaktiven sc-PA an Komponenten des Blutgerinnsels, wie Fibrin, gefolgt von der Umwandlung in den aktiven tc-PA durch katalytischemengen von proteolytischen Enzymen, die an der Stelle vorhanden sind, führen zu einem effektiven ortsspezifischen Arzneimittel.
t-PA und u-PA werden von zwei verschiedenen Genen codiert, können immunologisch und enzymatisch unterschieden werden und besitzen ein unterschiedliches Antwortprofil gegenüber Inhibitoren, Stimulatoren und Aktivatoren. So wird nur t- PA durch den Protease-Inhibitor aus Erytrina latissima (DE-3) stark gehemmt. Die t-PA-Aktivität wird durch Fibrin und Fibrinfragmente stark stimuliert, wohingegen die u-PA- Aktivität gegenüber einer Stimulierung durch Fibrin und dessen Fragmente unempfindlich ist. Eine weitere Eigenschaft, die die zwei PA-Enzyme unterscheidet, ist, daß tc- t-PA eine hohe Affinität für Fibrin und Fibrinfragmente besitzt, wohingegen tc-u-PA keine nachweisliche Fibrin-affinität besitzt.
Unter Berücksichtigung der nicht zufriedenstellenden Serumstabilität von injizierten t-PAs, der niedrigen Affinität von tc-u-PA für Fibrin und der Tatsache, daß die Fibrinaffinität von sc-u-PA als indirekt gilt, d.h. daß sie einen zusätzlichen Blutfaktor benötigt (vgl. D. J. Binnema et al., 8th Int. congress of Fibrinolysis, Wien, 1986), besteht ein kontinuierlicher Bedarf nach verbesserten Plasminogenaktivatoren mit einer hohen Affinität für Fibrin, einer günstigeren Antwort auf Stimulatoren, einer verringerten Inaktivierung durch Inhibitoren und längeren effektiven Halbwertszeiten im Blutkreislauf.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, neue hybride Plasminogenaktivatoren bereitzustellen, die die nützlichen Eigenschaften von t-PA und u-PA beibehalten, während ihnen die unerwünschten Eigenschaften der Stammenzyme fehlen.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß zur Behandlung von Thrombose und anderen Zuständen, bei denen es wünschenswert ist, Fibrinolyse durch Plasminogenaktivierung zu erzeugen, einkettige hybride PA-Proteine überlegene biologische Eigenschaften, verglichen mit einkettigen t-PA und u-PA zeigen. Genauer, verglichen mit nativen PAs werden geringere Mengen der erfindungsgemäßen neuen PA-Moleküle benötigt, um in vivo Blutgerinnsel zu lysieren. Die erfindungsgemäßen einkettigen hybriden PA-Moleküle können in großen Mengen durch die rekombinante DNA-Technik produziert werden und werden nach Injektion in Patienten in ihre zweikettige Form nur unter dem Einfluß von Fibrin an der Stelle, an der das Blutgerinnsel zu lysieren ist, umgewandelt. Zweikettige hybride PA-Moleküle wurden in der Literatur beschrieben (Europäische Patentanmeldung Nr. 155 387; K. C. Robbins, 8th International congress of Fibrinolysis, Wien, 1986), aber die günstigeren einkettigen Formen von hybriden PA-Molekülen können auf der Proteinebene nicht produziert werden, wie in der zitierten Literatur beschrieben ist, sondern können nur in großen Mengen und in industriellem Maßstab durch die rekombinante DNA-Technik produziert werden.
Folglich liegt der vorliegenden Erfindung weiter die Aufgabe zugrunde, Mittel und Verfahren zur Produktion von einketten u-PA/t-PA-Hybridproteinen bereitzustellen. Solche Mittel umfassen DNAs, die die u-PA/t-PA-Hybridproteine codieren, Hybridvektoren, die die DNAs enthalten und mit den Hybridvektoren transformierte Wirte. Bereitgestellt werden auch Verfahren zur Produktion der einkettigen u- PA/t-PA-Hybridproteine, die DNAs, die Hybridvektoren und die Wirte. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein kosteneffizienteres Verfahren zur Produktion von zweikettigen hybriden PA-Molekülen, da die einkettigen Produkte der rekombinanten DNAs in vitro durch geeignete proteolytische Enzyme, wie Plasmin, gespalten werden können.
Die EP-A 0 231 883 beschreibt hybride Plasminogenaktivator-artige Polypeptide, bestehend aus einer t-PA-A-Teilkette und der u-PA-B-Kette, wobei die t-PA-A-Teilkette aus einem Fragment der t-PA-A-Kette besteht, die sich bis zu Aminosäure 219 (vom N-terminalen Serinrest) von t-PA erstreckt (relevant gemäß Artikel 54(3) EPC).
Die WO 87/04722 beschreibt thrombolytische Proteine mit einer t-PA-Typ-Aktivität, bei denen mindestens eine N-verknüpfte Glycosylierungs-Konsensusstelle modifiziert ist, was zu einer fehlenden Glycosylierung an der Konsensusstelle führt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft genauer einen einkettigen hybriden PA mit einer Aminosäuresequenz, bestehend aus mindestens zwei Subsequenzen, entsprechend in der Aminosäureidentität und der Anzahl den Subsequenzen von menschlichen t-PA und menschlichem u-PA.
Wie andere Serinproteasen, die an den fibrinolytischen und Gerinnungssystemen des Bluts beteiligt sind, besitzen u-PA und t-PA große nicht-katalytische Segmente, die in der A- Kette in Bindung an die katalytische Region (B-Kette) zusammengebaut werden. Die nicht-katalytische A-Kette von t- PA kann in einzelne Domänen unterteilt werden. Die "Finger"-Domäne, die "Wachstumsfaktor"-Domäne, und zwei "Kringle"-Strukturen, während die A-Kette von u-PA aus einer "Wachstumsfaktor"-Domäne und einer "Kringle"-Struktur besteht [vgl. die Literaturstelle : Patthy, Cell 41, 657- 663 (1985)]. Die katalytische Stelle der B-Ketten ist durch His-, Asp-, Ser-Reste an den Positionen 322, 371 und 478 (t-PA) bzw. 204, 255 und 356 (u-PA) gebildet und ist für die fibrinolytische Aktivität wesentlich.
Eine Proteindomäne ist eine strukturelle Einheit innerhalb der Gesamtstruktur des vollständigen Proteins. Beispielsweise sind in der t-PA-A-Kette vier Domänen (Finger-, Wachstumsfaktor- und zwei Kringle-Domänen) in Reihe angeordnet. Die Grenzen der Domänen werden am besten durch die Positionen der Exon-Intron-Verbindungen in der entsprechenden DNA-Sequenz (L. Patthy, a. a. O.) definiert. Jedoch wurde aus praktischen Gründen die minimale Größe jede Domäne durch die Aminosäuresequenz zwischen dem ersten und dem letzten cysteinrest innerhalb jeder Domäne, der wahrscheinlich an der S-S-Brückenbildung beteiligt ist, definiert. Aminosäuren vor und nach diesen cysteinresten aus benachbarten Domänen werden als verbindungssequenzen (J) definiert. Die Positionen der Exon-Intron-Verbindungen (siehe vorstehend) liegen innerhalb dieser J-Regionen.
So kann einkettiger t-PA durch die folgende Formel
T - F - J&sub1; - G - J&sub2; - K&sub1; - J&sub3; - K&sub2; - J&sub4; - TPAB
wiedergegeben werden, worin T den N-terminalen Teil, umfassend die Aminosäuren 1 bis 5, bedeutet, F die Finger- Domäne, umfassend die Aminosäure 6 bis 43, bedeutet, G die Wachstumsfaktor-Domäne, umfassend die Aminosäuren 51 bis 84, bedeutet, K&sub1; die Kringle-1-Struktur, umfassend die Aminosäure 92 bis 173, ist, K&sub2; die Kringle-2-Struktur, umfassend die Aminosäuren 180 bis 261, ist, TPAB die katalytische Serinprotease-Region, umfassend die Aminosäuren 307 bis 527, ist und J&sub1; (Aminosäuren 44 bis 50), J&sub2; (Aminosäuren 85 bis 91) J&sub3; (Aminosäuren 174 bis 179) und J&sub4; (Aminosäuren 262 bis 306) Verbindungssequenzen, die die Domänesegmente verknüpfen, sind.
Einkettiger u-PA kann durch die folgende Formel
T'- U - J&sub5; - K - J&sub6; - uPAB
wiedergegeben werden, worin T' den N-terminalen Teil, umfassend die Aminosäuren 1 bis 12, bedeutet, U die Wachstumsfaktor-Domäne, umfassend die Aminosäuren 13 bis 42, ist, K die Kringlestruktur, umfassend die Aminosäuren 50 bis 131, ist, uPAB die katalytische Serinprotease-Region, umfassend die Aminosäuren 189 bis 411, ist und J&sub5; (Aminosäuren 43 bis 49) und J&sub6; (Aminosäuren 132 bis 188) Verbindungssequenzen, die die Domänesegmente verknüpfen, sind.
Die verbindungssequenzen J&sub4; und J&sub6; umfassen jeweils die Aktivierungs-(Prozessierungs)stelle und, N-terminal davon, einen cysteinrest, der an einer Schwefel-Schwefel-Brücke zu der katalytischen (B-Kette) Region beteiligt ist.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß einkettige Hybrid-PAs, umfassend die katalytische Serinprotease-Region eines PA (uPAB) in Bindung an eine Aminosäuresequenz, die getrennte A-Ketten-Domänen des t-PA enthält, wertvolle pharmakologische Eigenschaften zeigen.
Folglich betrifft die Erfindung einen einkettigen hybriden PA, umfassend eine Aminosäuresequenz, die getrennte A-Ketten-Domänen des menschliches t-PAs in Bindung in Reihe an die katalytische Region von menschlichem u-PA (uPAB) um-
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen hybriden PAs die katalytische Region von menschlichem u-PA (uPAB).
Insbesondere betrifft die Erfindung einkettige PAs, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die getrennte A-Ketten-Domänen von menschlichem t-PA, insbesondere die Kringle-2-Domäne von menschlichem t-PA, und eine Aminosäuresequenz, die zwei oder drei Domänen von menschlichem t-PA enthält, wie die Finger-, Wachstumsfaktor- und Kringle-2-Domänen von menschlichem t-PA oder die Finger- und Kringle-2-Domänen von menschlichem t-PA, wobei die Aminosäuresequenz in Reihe an die katalytische Region von menschlichem u-PA gebunden ist.
Bevorzugt beginnt die hybride PA-Aminosäuresequenz mit der N-terminalen Sequenz von t-PA (T, Aminosäuren 1 bis 5) oder u-PA (T', Aminosäuren 1 bis 12) oder beginnt mit einer beliebigen Verbindungssequenz, die natürlicherweise N- terminal an die erste Domäne des hybriden PAs gebunden ist oder mit einem Fragment einer solchen Verbindungssequenz, wobei das Fragment bevorzugt die letzten fünf Aminosäurereste besitzt.
In den erfindungsgemäßen hybriden PAs sind die A-Ketten- Domänen über natürliche Verbindungssequenzen (z.B. J&sub1;, J&sub2;, J&sub3; und J&sub5;) fusionierte Verbindungssequenzen oder hybride Verbindungssequenzen oder Fragmente davon verbunden. So ist eine erste Domäne an eine zweite Domäne durch die natürlicherweise am C-Terminus der ersten Domäne vorkommende Verbindungssequenz, durch die natürlicherweise am N-Terminus der zweiten Domäne vorkommende Verbindungssequenz, durch eine fusionierte Verbindungssequenz, bestehend aus den Verbindungssequenzen oder Fragmenten davon verknüpft.
Die A-Ketten-Domäne der erfindungsgemäßen hybriden PAs sind an die B-Ketten-Serinprotease-Region (uPAB) durch eine Verbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der verbindungssequenz J&sub4;, die die A-Kette mit der B-Kette im menschlichen t-PA verknüpft, der Verbindungssequenz J&sub6;, die die A-Kette an die B-Kette im menschlichen u-PA verknüpft, und eine Hybridsequenz, bestehend aus Subsequenzen der genannten Verbindungssequenzen, geknüpft, wobei die Verbindungssequenz eine Prozessierungsstelle, die durch Plasmin gespalten werden kann, und N-terminal dazu einen cysteinrest, der an einer Schwefel- Schwefel-Brücke zu der katalytischen B-Region teilnehmen kann, umfaßt, wobei die Verbindungssequenz bevorzugt mindestens 40 bis 60 Aminosäurereste besitzt.
Bevorzugter befindet sich die Verbindung der Domänen in einer Position, die durch die Exon-Intron-Verbindungen auf der entsprechenden DNA definiert ist. Die Verbindung der A-Kette mit der B-Kette befindet sich am meisten bevorzugt an der Aktivierungsstelle.
Insbesondere betrifft die Erfindung einen einketten hybriden Plasminogenaktivator, umfassend eine A-Kette, die im wesentlichen aus den t-PA-Finger- und Kringle-2-Domänen besteht, oder eine A-Kette, die im wesentlichen aus den t- PA-Finger-, Wachstumsfaktor- und Kringle-2-Domänen besteht, wobei die A-Kette bevorzugt in Reihe an die katalytische Region (B-Kette) von u-PA gebunden ist, worin die A-Kette mit der B-Kette über eine Verbindungssequenz, umfassend eine Aktivierungsstelle und einen cysteinrest, der eine Schwefel-Schwefel-Brücke mit der B-Kette binden kann, geknüpft ist.
Insbesondere betrifft die Erfindung ebenso einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, umfassend eine A-Kette, die im wesentlichen aus der t-PA-Kringle-2-Domäne, gebunden an die katalytische Region (B-Kette) von u-PA an der Aktivierungsstelle, besteht.
Besonders bevorzugt ist ein einkettiger hybrider Plasminogenaktivator, umfassend eine A-Kette, die im wesentlichen aus der t-PA-Kringle-2-Domäne oder den t-PA-Finger- und - Kringle-2-Domänen besteht, in die Reihe an die katalytische Region (B-Kette) von u-PA gebunden sind, wobei die Verbindung zwischen der A-Ketten-Domäne/den A-Ketten-Domänen und der B-Kette sich an der Aktivierungsstelle befindet.
Bevorzugte erfindungsgemäße Hybrid-PAs sind
FK&sub2;UPAB (BC) =[tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411)],
FK&sub2;UPAB(BR) =[tPA(1-49)-tPA(176-262)-uPA(329-411)],
K&sub2;UPAB(BC) =[tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411)],
FGK&sub2;UPAB(BC) =[tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411)], und
FGK&sub2;UPAB(BR) =EtPA(1-86)-tPA(176-262)-uPA(132-411)],
worin UPAB die B-Kette von u-PA ist, K&sub2; die Kringle-2-Domäne von t-PA bezeichnet, F die Fingerdomäne von t-PA bezeichnet, G die Wachstumsfaktordomäne von t-PA bezeichnet, (BC) bezeichnet, daß die Verbindung zwischen der A-Ketten- Domäne/den A-Ketten-Domänen und der B-Kette sich an der Aktivierungsstelle befindet und (BR) anzeigt, daß die A- Ketten-Domäne/die A-Ketten-Domänen an die B-Kette über eine Verbindungssequenz, die natürlicherweise an die B- Kette gebunden ist, gebunden ist/gebunden sind, einschließlich der Aktivierungsstelle und N-terminal dazu des Cysteinrests, der an einer Schwefel-Schwefel-Brücke an die B-Kette beteiligt ist. Die Ziffern beziehen sich auf die Aminosäuresequenzen, die aus u-PA bzw. t-PA entnommen sind. Beispielsweise bezeichnet UK&sub2;UPAB(BR) =[uPA(1-44)- tPA(176-261)-uPA(134-411)] einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, bestehend aus den Aminosäuren 1-44 (Wachstumsfaktordomäne, U) von u-PA und den Aminosäuren 176-271(Kringle-2-Domäne, K&sub2;) von t-PA, gebunden in linearer Weise an die Aminosäuren 134-411 (B-Kette, UPAB) von u-PA.
Besonders bevorzugt sind die hybriden Plasminogenaktivatoren FGK&sub2;UPAB (BC) und insbesondere FK&sub2;UPAB(BC) und K&sub2;UPAB(BC).
Die erfindungsgemäßen hybriden PAs können durch die rekombinante DNA-Technik hergestellt werden, umfassend beispielsweise die Züchtung eines transformierten Wirts, der das hybride PA-Protein exprimiert unter Bedingungen, die die Expression davon erlauben und die Isolierung des hybriden PA-Proteins. Genauer werden die gewünschten Verbindungen hergestellt durch
a) Herstellen einer DNA, die ein hybrides PA-Protein codiert oder chemische Synthese einer solchen DNA,
b) Einschleusen der DNA in einen geeigneten Expressionsvektor,
c) Überführen des so erhaltenen Hybridvektors in einen Empfängerwirt,
d) Selektion des transformierten Wirts von nicht transformierten Wirten, z.B. durch Züchten unter Bedingungen, unter denen nur der transformierte Wirt überlebt,
e) Züchten des transformierten Wirts unter Bedingungen, die die Expression des hybriden PA-Proteins erlauben und
f) Isolieren des hybriden PA-Proteins.
Die an der Herstellung der hybriden PA-Proteine durch die rekombinante DNA-Technik beteiligten Stufen werden nachstehend ausführlichen diskutiert.

DNAs, die hvbride PA-Proteine codieren

Die Erfindung betrifft DNAs, die eine Sequenz besitzen, die einen hybriden PA codiert, der aus mindestens zwei Subsequenzen, entsprechend in der Aminosäureidentität und -anzahl Subsequenzen von menschlichem u-PA und menschlichem t-PA, zusammengesetzt ist. Insbesondere betrifft die Erfindung DNAs, die eine Sequenz besitzen, die jedes beliebige hybride PA-Protein, das vorstehend als bevorzugt genannt wurde, codiert.
Bevorzugt besitzen die erfindungsgemäßen DNAs flankierende Sequenzen an ihren Enden. Insbesondere umfassen diese flankierenden Sequenzen geeigneten Restriktionsspaltstellen, die die Integration der DNAs in geeignete Vektoren erlauben.
Ferner umfassen die erfindungsgemäßen DNAs die Signalsequenz von u-PA oder t-PA in Bindung an das erste Codon der reifen hybriden PA-Codierungssequenz. Bei Expression in Hefezellen können die erfindungsgemäßen DNAs alternativ eine Hefesignalsequenz, wie die Signalsequenz, die natürlicherweise an den verwendeten Hefepromotor gebunden ist, insbesondere die PHO5 oder Invertase-Signalsequenz umfassen.
Bevorzugt sind die Nukleotidsequenzen der DNA-Subsequenzen, den Nukleotidsequenzen, die in der u-PA-cDNA bzw. t- PA-cDNA aufgefunden werden, identisch. Jedoch können infolge der Degeneriertheit des genetischen Codes die Nukleotidsequenzen sich unterscheiden, vorausgesetzt, daß die so erhaltenen Aminosäure-Subsequenzen unverändert bleiben.
Die Nukleotidsequenzen von u-PA-cDNA und t-PA-cDNA sind bekannt [vgl. W. E. Holmes et al., Biotechnology 3, 923- 929 (1985); D. Pennica et al., Nature 301, 214-221 (1983)]. Ferner wurden die vollständigen Nukleotidsequenzen von genomischen u-PA- und t-PA-Genen einschließlich aller Introns und Exons ermittelt [vgl. A. Riccio et al., Nucl. Acids Res. 13, 2759-2771 (1985); S. J. Friezner-Degen et al., J. Biol. Chem. 261, 6972-6985 (1986)].
In Kenntnis der cDNA- und genomischen DNA-Sequenzen von u- PA und t-PA können die erfindungsgemäßen DNAs nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden. Die Verfahren zur Herstellung dieser DNAs umfassen die chemische Synthese der DNAs oder die Herstellung von Fragmenten, die Polynukleotid-Subsequenzen von u-PA-cDNA und t- PA-cDNA codieren und ihre Religierung in der bestimmten Reihenfolge, gegebenenfalls unter Einschluß einer oder mehrerer, wie beispielsweise zwei oder drei, Mutationsstufen.
Die chemische Synthese von DNA ist auf dem Fachgebiet gut bekannt und verwendet herkömmliche Techniken. Geeignete Techniken wurden von S. A. Narang [Tetrahedron 39, 3 (1983)] zusammengestellt. Insbesondere können die in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 146 785 beschriebenen Verfahren verwendet werden, und auf sie wird hiermit Bezug genommen.
Eine weitere Möglichkeit zur Synthese der erfindungsgemäßen DNAs besteht aus dem Herausschneiden geeigneter Restriktionsfragmente, die Polynukleotid-Subsequenzen von u- PA und t-PA codieren, aus u-PA-cDNA und t-PA-cDNA (oder genomische u-PA-DNA oder t-PA-DNA) und die Verwendung dieser Fragmente zur Herstellung des vollständigen hybriden PA-Strukturgens. Zwei Strategien können angewendet werden. Bei beiden Strategien muß aufgepaßt werden, daß die Fusion der Fragmente an Stellen zwischen den Domänen eintritt, um die zuletzt genannten intakt zu halten. Bei der ersten Strategie werden Restriktionsspaltstellen verwendet. Wenn eine geeignete Restriktionsspaltstelle an der vorbestimmten Verbindungsstelle/den vorbestimmten Verbindungsstellen sowohl in den u-PA- als auch den t-PA-DNAs verfügbar ist, werden die DNAs mit der entsprechenden Restriktionsendonuklease gespalten, und die Fragmente werden durch Ligierung von glatten Enden oder überstehenden Enden (abhängig von der gewählten Restriktionsendonuklease) verknüpft. Alternativ können nützliche Restriktionsspaltstellen, beispielsweise durch ortsspezifische Mutagenese [vgl. M. J. Zoller et al., Methods Enzymol. 100, 468 (1983)] eingeführt werden, wobei aufgepaßt werden muß, daß die mutierte DNA nicht zu einer veränderten Aminosäuresequenz wird. Besonders bevorzugte natürliche oder künstlich eingeführte Restriktionsspaltstellen sind solche, die die DNAs, die die A- und B-Ketten codieren, oder die DNAs, die getrennte Domänen, die in den A-Ketten enthalten sind, codieren, trennen. So können hybride DNAs produziert werden, die hybride PAs mit der gewünschten Verbindung zwischen den Domänen der A-Kette und der katalytischen Serinprotease-Region produziert werden. Die zweite Strategie geht auf die Hypothese zurück, daß die Grenzen der Domänen am besten durch die Position der Exon-Intron-Verbindung in den genomischen DNAs definiert werden [vgl. L. Patthy, Cell 41, 657-663 (1985)], d.h. Positionen in den cDNAs, an denen Introns gespleißt wurden. Da die Positionen selten mit den Restriktionsspaltstellen zusammenfallen, wird ein Schema angenommen, das für jede neue Konstruktion eingehalten werden kann: in einer ersten Stufe werden geeignete Restriktionsfragmente, die die spezifische Domäne/die spezifischen Domänen codieren, aber auch zusätzliche DNA-Sequenzen über den vorweggenommenen Fusionspunkt hinaus enthalten (bis zu mehreren hundert Basenpaaren) ligiert und in den Bakteriophagen m13 subcloniert. In einer zweiten Stufe werden die überschüssigen DNA-Sequenzen durch in-vitro-Mutagenese kreisförmig herausgeschnitten (Zoller et al., a. a. O.). Dieses Verfahren erlaubt präzise Fusionen im Leseraster an jeder vorbestimmten Nukleotidposition und ist daher bevorzugt.

Hybridvektoren, die hybride PA-DNA enthalten

Die Erfindung betrifft Hybridvektoren, umfassend eine DNA, die einen hybriden PA codiert, der aus mindestens zwei Subsequenzen entsprechend in Aminosäureidentität und -anzahl den Subsequenzen von menschlichem u-PA und menschlichem t-PA besteht und Verfahren zur Herstellung davon.
Der Vektor wird in Abhängigkeit von den für die Transformation in Betracht gezogenen Wirtszellen ausgewählt. Im Prinzip eignen sich alle Vektoren, die das erfindungsgemäße Polypeptidgen in dem gewählten Wirt replizieren und exprimieren. Beispiele für geeignete Wirte sind Eucaryonten, denen Restriktionsenzyme oder Modifikationsenzyme fehlen, oder die nur wenige davon besitzen, wie beispielsweise Hefen, z.B. Saccharomyces cerevisiae, z.B. S. cerevisiae GRF18 und ferner Säugerzellen, insbesondere etablierte menschliche oder tierische Zellinien, z.B. Myelomazellen, menschliche embryonale Lungenfibroblasten L-132, COS-Zellen, LTK-Zellen, menschliche maligne Melanom-Bowes- Zellen. HeLa-Zellen, mit dem SV-40-Virus transformierte Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze, COS-7 oder Chinahamster-Ovarienzellen ((CHO)-Zellen) und Varianten davon. Die vorstehenden Säugerzellen und Stämme von Saccharomyces cerevisiae, beispielsweise S. cerevisiae GRF18 sind als Wirtsmikroorganismus bevorzugt.

a. Vektoren zur Verwendung in Hefe

Vektoren, die sich für die Replikation und Expression in Hefe eignen, enthalten einen Hefe-Replikations-Origin und einen genetischen Selektionsmarker für Hefe. Hybridvektoren, die einen Hefe-Replikations-Origin enthalten, beispielsweise ein autonom replizierendes Segment (ars), werden extrachromosomal in der Hefezelle nach der Transformation beibehalten und autonom repliziert. Ferner können Hybridvektoren, die Sequenzen enthalten, die der Hefe-2µ- Plasmid-DNA homolog sind, verwendet werden. Solche Hybridvektoren werden durch Rekombination in die bereits in der Zelle existierenden 2µ-Plasmide integriert oder replizieren sich autonom. 2µ-Sequenzen eignen sich besonders für Plasmide mit einer hohen Transformationsfrequenz und erlauben hohe Kopienzahlen.
Geeignete Markergene für Hefe sind insbesondere diejenigen, die eine Antibiotikumresistenz dem Wirt verleihen, oder im Falle von auxotrophen Hefemutanten, Gene, die Wirtsläsionen komplementieren. Entsprechende Gene verleihen beispielsweise Resistenz gegenüber dem Antibiotikum G418 oder erzeugen Prototrophie in einer auxotrophen Hefemutante, beispielsweise das URA3-, LEU2-, HIS3- oder TRP1- Gen. Hefehybridvektoren enthalten ferner bevorzugt einen Replikations-Origin und ein Markergen für einen bakteriellen Wirt, insbesondere E. coli, so daß die Konstruktion und donierung der Hybridvektoren und ihrer Zwischenprodukte in einem bakteriellen Wirt stattfinden kann.
Sequenzen zur Kontrolle der Expression, die für die Expression in Hefe geeignet sind, sind beispielsweise diejenigen von gut exprimierten Hef egenen. So können die Promotoren des TRP1-Gens, des ADHI- oder ADHII-Gens, der Gene der sauren Phosphatase (PHO3 oder PHO5), des Isocytochromgens oder ein Promotor, der Glycolysegene, wie der Promotor der Enolase-, der Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase- (GAPDH), der 3-Phosphoglyceratkinase- (PGK), der Hexokinase-, der Pyruvatdecarboxylase-, der Phosphofructokinase-, der Glucose-6-phosphatisomerase-, der 3-Phosphoglyceratmutase- der Pyrovatkinase-, der Triosephosphatisomerase-, der Phosphoglucoseisomerase-, der Invertase- und Glucokinasegene, verwendet werden. Bevorzugte erfindungsgemäße Vektoren enthalten Promotoren mit Transskriptionskontrolle, z.B. die Promotoren der PHO5- und ADHII-Gene, die durch Variation der Wachstumsbedingungen an- oder abgeschaltet werden können. Beispielsweise kann der PHO5- Promotor alleine durch Erhöhen oder Senken der Konzentration an organischem Phosphat im Medium reprimiert oder dereprimiert werden.
Bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Hefehybridvektoren auch die 3'-flankierende Sequenz eines Hefegens, das die geeigneten Signale für die Transkriptionstermination und Polyadenylierung enthält. Geeignete 3'-flankierende Sequenzen sind beispielsweise diejenigen des Gens, die natürlicherweise mit dem verwendeten Promotor verknüpft sind, wie die 3'-flankierende Sequenz des Hefe-PHO5-Gens.

b. Vektoren zur Verwendung in Säugerzellen

Vektoren zur Replikation und Expression in Säugerzellen werden häufig mit DNA viralen Ursprungs versehen, z.B. aus dem Affenvirus 40 (SV40), Rous-Sarkom-Virus (RSV), Adenovirus 2, Rinder-Papillom-Virus (BPV), Papovavirus-BK-Mutant (BKV) oder murinem oder menschlichem Cytomegalie-Virus (MCMV bzw. HCMV).
Sequenzen zur Kontrolle der Expression, die zur Verwendung in Säugerzellen geeignet sind, umfassen u.a. die frühen und späten Promotoren von SV40, den hauptsächlichen späten Promotor des Adenovirus, den Promotor des murinen Metallothionein-Gens und die Enhancer-Promotor-Region des hauptsächlichen unmittelbaren frühen Gens des murinen oder menschlichen Cytomegalie-Virus, die Enhancer-Promotor-Region des menschlichen Immunglobulins, den menschlichen α- Globin-Promotor, gegebenenfalls in Kombination mit dem SV40-Enhancer und von den Hitzeschockgenen abgeleitete Promotoren.
Geeignete Markergene für Säugerzellen sind beispielsweise die neo- und ble-Gene von dem Transposon Tns, die Resistenz gegenüber dem Antibiotikum G418 bzw. Bleomycin-Typ- Antibiotika, verleihen, das E.-coli-Gen für Hygromycin-B- Resistenz, das Dihydrofolat-Reduktasegen (dhfr) aus Säugerzellen oder E. coli, das den phänotyp von DHFR&supmin;- in DHFR&spplus;-Zellen verändert und/oder Methotrexat-Resistenz verleiht, und das Thymidinkinasegen des Herpes-simplex-Virus, das die TK&supmin;-Zellen phänotypische zu TK&spplus;-Zellen macht.
Bevorzugt enthalten die Hybridvektoren für Säugerzellen die 3'-nicht-translatierte Region eines Säugergens, das Signale für die geeignete Transkriptionstermination und Polyadenylierung enthält, wie beispielsweise die 3'-flankierende Region des β-Globingens. Vorteilhafterweise umfassen die Regionen, die die Polypeptidcodierungsregion flankieren, ein oder mehrere native Intron(s) mit den geeigneten Spleißsignalen an ihren Enden. Solche Anfügungen gelten als notwendig, da cDNAs und prokaryotische DNAs, wie die vorstehend genannten Selektionsgene, im allgemeinen keine derartigen Transkriptions- und Prozessierungssignale besitzen.
Bevorzugt enthalten solche Vektoren einen Replikations- Origin und ein Antibiotikum-Resistenzgen zur Vermehrung in E. coli. Ein Säugerreplikations-Origin kann dadurch bereitgestellt werden, daß man entweder bei der Konstruktion des Vektors einen eukaryotischen Origin aufnimmt, beispielsweise abgeleitet von SV40 oder von einer anderen viralen Quelle, oder kann durch das Wirtszellchromosom nach Integration des Vektors in das Wirtzellchromosom bereitgestellt werden.
Die bevorzugten Hybridvektoren zur Verwendung in Säugerzellen umfassen die hybride PA-cDNA in funktioneller Verknüpfung an stromaufwärtige Stellen an das hauptsächliche unmittelbare frühe Gen des Enhancer-Promotors des murinen Cytomegalie-Virus oder auf stromabwärtiger Seite durch das 3'-Ende des Kaninchen-β-Globingens, das das zweite Intron mit dessen geeigneten Spleißsignalen und einer Polyadenylierungssequenz umfaßt. Ferner enthalten sie die Sequenzen, die das Neomycin-Resistenzgen aus dem Transposon Tn5 oder gegebenenfalls aus Tn9 codieren oder die Sequenzen, die Hygromycinphosphotransferase codieren, flankiert an ihrer stromaufwärtigen Stelle, aufeinanderfolgend durch den frühen Promotor aus dem SV40-Virus, der auch den SV40-Replikations-Origin und den natürlichen Promotor des Tn5-Neogens umfaßt, und an dessen stromabwärtige Seite von einem Segment des frühen SV40-Gens einschließlich der kleinen t-Antigen-Spleiß- und Polyadenylierungssignale. Die ganze Konstruktion wird in ein Fragment des E.-coli- Plasmids pBR322 doniert, das den Plasmid-Replikations- Origin des Ampicillin-Resistenzgens umfaßt, aber dem die sogenannten "Poison-Sequenzen" fehlen, die die SV40-gesteuerte DNA-Replikation in Säugerzellen hemmen. Gegebenenfalls wird ein Gen, das Dihydrofolatreduktase (DHFR) codiert, in den Vektor aufgenommen, bevorzugt wird das modulare DHFR-Gen, das von R. J. Kaufman et al. [Mol. Cell. Biol. 2, 1304-1319 (1982)] beschrieben ist, verwendet. Dieses modulare DHFR-Gen besteht in aufeinanderfolgender Reihenfolge aus dem hauptsächlichen späten Promotor des Adenovirus-Typ 2, einem Fragment eines Immunoglobulingens, dem codierenden Teil einer murinen DHFR-cDNA und der frühen SV40-Polyadenylierungsstelle.
Die neuen bevorzugten Hybridvektoren zur Verwendung in Säugerzellen stellen einen Fortschritt auf dem Fachgebiet dar. Sie sind, verglichen mit den bisher bekannten Vektoren, dahingehend überlegen, daß sie starke Expressionssignale für die donierte cDNA enthalten, die in dem unmittelbaren frühen Promotor/Enhancer des Mauscytomegalie- Virus und in den β-Globin-Spleiß-/Polyadenylierungssequenzen lokalisiert sind, in einer Umgebung, die eine Expression mit großer Höhe in einer extrem breiten Vielzahl von Vertebraten-Zelltypen erlaubt. Genauer, die Vektoren können verwendet werden (a), um cDNAs vorübergehend in normalen, d.h. nicht-SV40-transformierten Gewebskulturzellinien zu exprimieren, aber (b), noch besser, in höherer Kopienzahl in Primatenzellen, die das SV40-T-Antigen exprimieren, zu exprimieren, wodurch der Vektor sich über seinen SV40-Replikations-Origin replizieren kann, aber auch (c), um eine solche donierte cDNA stabil in normalen Gewebskulturzellinien zu exprimieren, in denen der Vektor sich in das Wirtszellchromosom integrieren kann und (d), noch besser, wegen der hohen Kopienzahl, wenn der Vektor in SV40-T-Antigen-produz ierende Primatenzellinien eingeschleust wird, worin der Vektor episomal replizieren kann.
Die Enhancer-Promotor-Region von MCMV umfaßt beispielsweise eine DNA, die bei den Nukleotiden -835 bis -443 beginnt und am Nukleotid +50 (gezählt von dem mRNA-Start) der 5'-Region des hauptsächlichen unmittelbaren frühen Gens von MCMV endet. Die bevorzugte Enhancer-Promotor-Region von MCMV umfaßt die Nukleotide -542 bis +50.
Die 3'-flankierende Region des Kaninchen-β-Globingens besteht aus der zweiten Hälfte des Kaninchen-β-Globingens [P. Dierks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1411- 1415 (1981); A. van Ooyen et al., Science 206, 337-344 (1979)] und beginnt am zweiten Exon, bevorzugt an der BamHI-Spaltstelle und umfaßt so das zweite Intron mit den Signalen zum Spleißen an dessen flankierenden Sequenzen und endet hinter den Polyadenylierungssignalen, bevorzugt der BglII-Stelle, die 1,2 kb hinter der vorstehenden BamHI-Spaltstelle lokalisiert ist.
Der SV40-Replikations-Origin ist beispielsweise in dem HindIII-SphI-Fragment der viralen DNA [Nukleotide 5171 bis 128, Origen = Position 1; Tooze J. (Hrsg.) DNA Tumor Viruses, Teil 2, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 1982] enthalten. Die bevorzugte Ausführungsform ist jedoch das HindIII-HpaII-Fragment (Nukleotide 5171 bis 346), das zusätzlich zu dem Replikations-Origin auch den viralen frühen Enhancer/Promotor enthält, der zur Förderung der Transkription des Selektionsgens des Vektors nützlich ist.
Das Neomycingen wird hinter einen Promotor, der in Gewebskulturzellen aktiv ist, bevorzugt den frühen SV40-Promotor, der auf dem vorstehend genannten HpaII-HindIII-Fragment lokalisiert ist, doniert. Die codierenden Sequenzen des Neomycingens sind beispielsweise auf einem BglII-SmaI- Fragment von Transposon Tn5 [E. Beck et al., Gene 19, 327 336 (1982); P Southern et al., J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341 (1982); F. Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150, 1-14 (1981)] enthalten. Es ist bevorzugt, das Neomycingen mit einem zweiten Promotor auszustatten, der auch die Transkription in E. coli erlaubt. Beispielsweise kann der natürliche Promotor des Tn5-Neomycingens, das bevorzugt auf einem HindIII-BglII-Fragment enthalten ist, hinter dem eukaryotische Promotor vor den neo-codierenden Sequenzen (Southern et al., a. a. O.) oder weiter stromaufwärts vor dem eukaryotischen Promotor (Colbere-Garapin et al., a. a. O.) angeordnet werden. Um in Gewebskulturzellen exprimiert zu werden, muß auf das bakterielle neogen ein Polyadenylierungssignal, bevorzugt ein Teil des SV40-T-Antigens, folgen, das auch Spleißsignale enthält. Die codierende Sequenz der Neomycinphosphotransferase, insbesondere des BglII-SmaI-Teils des vorstehend genannten Tn5-Fragments, kann auch durch die codierende Sequenz der Hygromycin-B-Phosphotransferase, bevorzugt in Form des BamHI-Fragments des Plasmids pLGBg [L. Gritz et al., Gene 25, 179-188 (1983)], ersetzt werden, das am einfachsten in pSVd [Luedin et al., EMBO-J. 6, 109-114 (1987)], ein Derivat von pSV2911neo, insertiert werden kann, worin ein BglII-Linker an der SmaI-Spaltstelle in den Vektor insertiert ist. Ein weiteres bevorzugtes Selektionsgen verwendet die codierende Sequenz für das Enzym Dihydrofolatreduktase, wie in pSV2dhfr (ATCC 37145), das nicht nur die Selektion von transformierten Zellinien, sondern auch die Amplifikation der plasmidassozuerten DNA-Sequenz häufig unter proportionaler Zunahme der Produktion der erfindungsgemäßen plasmidcodierten Proteine erlaubt.
Das von dem E. coli-Plasmid pBR322 abgeleitete Fragment umfaßt den pBR322-Replikations-Origin und das Ampicillin- Resistenzgen. Das Fragment wird bevorzugt aus einem pBR322-Derivat, wie PSV0d [P. Mellon et al, Cell 27, 279- 288 (1981)] genommen, aus dem die sogenannte Poison-Sequenz, die die SV40-T-Antigen-gesteuerte Replikation des Vektors hemmen würde, entfernt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Hybridvektoren, die zur Replikation und phänotypischen Selektion in einem eukaryotischen Wirtsstamm befähigt sind, umfassend einen Promotor und eine DNA, die einen hybriden PA codiert, wobei die DNA zusammen mit den Transkriptionsstart- und Terminationssignalen sowie den Translationsstart- und -stopsignalen in dem Hybridvektor unter der Kontrolle des Promotors so angeordnet ist, daß in einem transformierten Wirt sie unter Produktion des Proteins exprimiert wird.
Die erfindungsgemäßen Hybridvektoren werden nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt, beispielsweise durch Verknüpfen der DNA-segmente, die den Promotor, die den hybriden PA oder den mutierten hybriden PA codierende Region, die 3'-flankierende Sequenz und die Vektor-DNA enthalten.
Verschiedene Techniken können verwendet werden, um DNA- Segmente in vitro zu verknüpfen. Glatte Enden (Duplizes aus vollständig basengepaarter DNA), die von bestimmten Restriktionsendonukleasen erzeugt werden, können direkt mit T&sub4;-DNA-Ligase verknüpft werden. Üblicherweise werden die DNA-Segmente über ihre einzeistrangigen kohäsiven Enden verknüpft und durch DNA-Ligase, z.B. T&sub4;-DNA-Ligase, covalent geschlossen. Solche einzelsträngigen "kohäsiven Enden" können durch Spalten der DNA mit einer anderen Klasse von Endonukleasen, die überstehende Enden erzeugen, gebildet werden (die zwei Stränge der DNA-Duplex werden an unterschiedlichen Punkten in einer Entfernung von ein paar Nukleotiden gespalten). Einzelstränge können auch durch Addition von Nukleotiden an glatte Enden oder überstehende Enden unter Verwendung von terminaler Transferase ("homopolymere Schwanzbildung") oder einfach durch Zurückspalten eines Stranges eines glattendigen DNA-Segments mit einer geeigneten Exonuklease, wie λ-Exonuklease, gebildet werden. Eine weitere Variante zur Produktion überstehender Enden besteht in der Ligierung einer chemisch synthetisierten Linker-DNA an das glattendige DNA-Segment, die eine Erkennungsstelle für eine ein überstehendes Ende bildende Endonuklease besitzt, und Spalten der so erhaltenen DNA mit der jeweiligen Endonuklease. Die Komponenten der erfindungsgemäßen Hybridvektoren werden in einer vorbestimmten Reihenfolge miteinander verknüpft, um die geeignete Funktion zu gewährleisten.

Mit Hybridvektoren, die hybride PA-DNA enthalten, transformierte Wirte

Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft eukaryotische Wirtsorganismen, die mit Hybridvektoren transformiert sind, umfassend eine DNA, die einen hybriden PA codiert, bestehend aus mindestens zwei Subsequenzen, entsprechend in Aminosäureidentität und -anzahl den Subsequenzen von menschlichem u-PA und menschlichem t- PA und Mutanten des Wirts, und Verfahren zur Herstellung davon.
Beispiele für geeignete eukaryotische Wirte sind die vorstehend genannten, insbesondere die Stämme von Hefe- und Säugerzellen. Mutanten der transformierten Wirtsorganismen umfassen insbesondere Mutanten, die nur geringen Mengen an Proteasen, die den hybriden PA abbauen, besitzen, und die höhere Ausbeuten an hybridem PA ergeben.
Das Verfahren zur Herstellung der transformierten eukaryotischen Wirte umfaßt die Transformation oder Transfektion eines eukaryotischen Wirts mit einem Expressionsvektor, umfassend eine erfindungsgemäße DNA, die von einer Sequenz zur Expressionskontrolle reguliert wird.
Die Transformation der eukaryotischen Wirtszellen wird nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren durchgeführt. Beispielsweise kann die Transformation von Hefe mit den Hybridvektoren gemäß dem von Hinnen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1919 (1978)] beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Dieses Verfahren kann in drei Stufen aufgeteilt werden:
(1) Entfernung der Hefezellwand oder von Teilen davon.
(2) Behandlung der "nackten" Hefezellen (Sphäroblasten) mit der transformierenden DNA in Gegenwart von PEG (Polyethylenglykol) und Ca²+-Ionen.
(3) Regeneration der Zellwand und Selektion der transformierten Zellen in einer festen Agarschicht.
Bevorzugte Verfahren:
zu (1): Die Hefezellwand wird enzymatisch unter Verwendung verschiedener Glucosidasepräparate, wie Schneckendarmsaft (z.B. Glusulase oder Helicase ) oder Enzymgemischen, erhalten aus Mikroorganismen (z.B. Zymolyase ), in osmotisch stabilisierten Lösungen (z.B. 1 M Sorbit) entfernt.
zu (2): Die Hefesphäroblasten aggregieren in Gegenwart von PEG und lokale Fusionen der cytoplasmatischen Membranen werden induziert. Die Erzeugung von "fusionsartigen" Bedingungen ist kritisch und viele transformierte Hefezellen werden während des Transformationsverfahrens diploid oder sogar triploid. Verfahren, die die Selektion von fusionierten Sphäroblasten erlauben, können verwendet werden, um bzgl. Transformanten anzureichern, d.h. transformierte Zellen können leicht unter vorgewählten Fusionsprodukten abgesucht werden.
zu (3): Da Hefezellen ohne Zeliwand sich nicht teilen, muß die Zellwand regeneriert werden. Diese Regeneration wird zweckdienlicherweise durch Einbetten der Sphäroblasten in Agar durchgeführt. Beispielsweise wird geschmolzener Agar (etwa 50ºC) mit den Sphäroblasten vermischt. Nach Kühlen der Lösung auf Wachstumstemperaturen für die Hefe (etwa 30ºC) wird eine feste Schicht erhalten. Diese Agarschicht dient der Verhütung einer raschen Diffusion und eines Verlusts von wesentlichen Makromolekülen aus den Sphäroblasten und erleichert dadurch die Regeneration der Zellwand. Jedoch kann die Regeneration der Zellwand auch (obwohl mit einer geringeren Effizienz) durch Plattieren der Sphäroblasten auf die Oberfläche von vorgebildeten Agarschichten erhalten werden.
Bevorzugt wird der Regenerationsagar so hergestellt, daß die Regeneration und Selektion von transformierten Zellen gleichzeitig erlaubt wird. Da Hefegene, die Enzyme von biosynthetischen Stoffwechselwegen für Aminosäuren codieren, im allgemeinen als selektive Marker verwendet werden (siehe vorstehend), wird die Regeneration bevorzugt in Hefeminimalmediumagar durchgeführt. Wenn sehr hohe Regenerationseffizienzen benötigt werden, ist das folgende zweistufige Verfahren vorteilhaft: (1) Regeneration der Zellwand in einem reichen Komplexmedium und (2) Selektion der transformierten Zellen durch Replica-Plattierung der Zellschicht auf selektive Agarplatten.
Die Einschleusung von Hybridvektoren in Säugerzellen wird durch Transfektion in Gegenwart von Helferverbindungen durchgeführt, beispielsweise Diethylaminoethyldextran, Dimethylsulfoxid, Glycerin, Polyethylenglykol oder dergleichen, oder als Copräzipitate von Vektor-DNA und Calciumphosphat.
Weitere geeignete Verfahren umfassen die direkte Mikromjektion von Vektor-DNA in den Zellkern und Elektroporation, d.h. die Einschleusung von DNA durch einen kurzen elektrischen Puls, der die Permeabilität der Zellmembranen erhöht. Die anschließende Selektion von transfizierten Zellen kann unter Verwendung eines Selektionsmarkers durchgeführt werden, der entweder covalent in den Expressionsvektor integriert ist oder als getrennte Einheit zugesetzt wird. Die Selektionsmarker umfassen Gene, die Antibiotika-Resistenz verleihen, oder Gene, die eine Läsion der Wirtszelle komplementieren (siehe vorstehend).
Ein bevorzugtes Selektionssystem verwendet Zellen, denen Dihydrofolatreduktase (DHFR&supmin;) fehlt, z.B. CHO-Zellen, die absolut Thymidin, Glycin und Purine für ihr Wachstum benötigen, außer ein exogene DHFR-Gen wird zugeführt. Nach Einschleusung eines Vektors, der das hybride PA-Gen und zusätzlich ein DHFR-Gen enthält, in geeigneten DHFR&supmin;-Zellen, z.B. CHO-Zellen, werden transformierte Zellen durch Erhöhen der Konzentration des Antifolat-Arzneimittels Methotrexat im Medium selektioniert.
Besonders bevorzugt ist ein Selektionsverfahren, bei dem geeignete Säugerzellen, z.B. CHO-Zellen mit Copräzipitaten von Vektor-DNA, enthaltend das hybride PA-Gen und ein Gen, das Antibiotika-Resistenz codiert, z.B. Resistenz gegen G- 418, und Calciumphosphat behandelt. Die transformierten Zellen werden durch Züchten in Gegenwart des entsprechenden Antibiotikums, z.B. G418, und/oder durch Absuchen nach hybrider PA-Expression selektioniert.
Die erfindungsgemäßen transformierten Wirtsorganismen können bezüglich der Produktion von hybriden PAs oder mutierten hybriden PAs durch Mutation und Selektion unter Anwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren verbessert werden. Die Mutation kann beispielsweise durch UV-Bestrahlung oder geeignete chemische Mittel erzielt werden. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Proteasedefektmutanten, insbesondere Hefemutanten, um einen proteolytischen Abbau des produzierten hybriden PAs zu vermeiden.

Züchtung von transformierten Wirtszellen

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Produktion von einkettigen hybriden PAs mit einer Aminosäuresequenz, die aus mindestens zwei Subsequenzenen, die in Aminosäureidentität und -anzahl Subsequenzen menschlichem t-PA und menschlichem u-PA entsprechen, wobei man unter geeigneten Nährbedingungen einen transformierten eukaryotischen Wirt, der eine DNA-Sequenz, die den hybriden PA codiert, enthält, züchtet und den hybriden PA isoliert.
Die transformierten Wirtszellen werden nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren in einem Flüssigmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, gezüchtet.
Verschiedene Kohlenstoffquellen können zur Züchtung der erfindungsgemäßen transformierten Hefezellen verwendet werden. Beispiele für bevorzugte Kohlenstoffquellen sind assimilierbare Kohlenhydrate, wie Glucose, Maltose, Mannit oder Lactose, oder ein Acetat, die entweder als solches oder in geeigneten Gemischen verwendet werden können. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind Aminosäuren, wie Casaminosäuren, Peptide und Proteine und ihre Abbauprodukte, wie Trypton, Pepton oder Fleischextrakte, Hefeextrakte, Malzextrakt und auch Ammoniumsalze, beispielsweise Ammoniumchlorid, -sulfat oder -nitrat, die entweder als solche oder in geeigneten Gemischen verwendet werden können. Anorganische Salze, die auch verwendet werden können, sind beispielsweise Sulfate, Chloride, Phosphate und Carbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium.
Das Medium enthält weiterhin beispielsweise wachstumsfördernde Substanzen, wie Spurenelemente, beispielsweise Eisen, Zink, Mangan und dergleichen und bevorzugt Substanzen, die einen Selektionsdruck ausüben und das Wachstum von Zellen verhindern, die das Expressionsplasmid verloren haben. Wenn so beispielsweise ein Hefestamm, der beispielsweise bezüglich einer essentiellen Aminosäure auxotroph ist, als Wirtmikroorganismus verwendet wird, enthält das Plasmid bevorzugt ein Gen, das ein Enzym codiert, das den Defekt des Wirts komplementiert. Die Züchtung des Hefestamms wird in einem Minimalmedium, dem diese Aminosäure fehlt, durchgeführt.
Die Züchtung wird durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, durchgeführt. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert des Mediums und Fermentationszeit, werden so gewählt, daß der maximale Titer der erfindungsgemäßen PA-Proteine erhalten wird. So wird ein Hefestamm, bevorzugt unter aeroben Bedingungen in einer Submerskultur unter Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40ºC, bevorzugt etwa 30ºC, und einem pH-Wert von 5 bis 8, bevorzugt etwa pH 7 für etwa 4 bis 30 Stunden, bevorzugt, bis maximale Ausbeuten der erfindungsgemäßen Proteine erzielt sind, gezüchtet.
Säugerzellen werden unter Gewebskulturbedingungen unter Verwendung von im Handel erhältlichen Medien, die gegebenenfalls mit wachstumsfördernden Substanzen und/oder Säugerseren supplementiert sind, gezüchtet. Die Zellen werden entweder in Bindung an einen festen Träger, z.B. einen Mikroträger oder poröse Glasfasern oder freischwebend in geeigneten Kulturgefäßen gezüchtet. Das Kulturmedium wird so ausgewählt, daß ein Selektionsdruck ausgeübt wird und nur die Zellen überleben, die noch die Hybridvektor-DNA einschließlich des genetischen Markers enthalten. So wird beispielsweise ein Antibiotikum dem Medium zugesetzt, wenn der Hybridvektor das entsprechend Antibiotikum-Resistenzgen enthält.
Wenn die Zelldichte einen ausreichenden Wert erreicht hat, wird die Züchtung unterbrochen und das Protein wird isoliert. Bei Verwendung von Säugerzellen wird das hybride PA- oder mutierte hybride PA-Protein üblicherweise in das Medium ausgeschieden. Das Medium, das das Produkt enthält, wird von den Zellen abgetrennt, die mit frischem Medium versetzt werden können und für die kontinuierlichen Produktion verwendet werden können. Wenn Hefezellen verwendet werden, kann das Protein sich auch in den Zellen anhäufen, insbesondere im periplasmatischen Raum. Im zuletzt genannten Fall besteht die erste Stufe zur Gewinnung des PA-Proteins in der Freisetzung des Proteins aus dem Zellinneren. In den meisten Verfahren wird die Zellwand zuerst durch enzymatischen Abbau der Zellwand mit Glucosidasen entfernt (siehe vorstehend). Alternativ wird die Zellwand durch Behandlung mit chemischen Mitteln, z.B. Thiolreagentien oder EDTA, die zu Zellwandschäden führen, die die Freisetzung des produzierten hybriden PAs oder der Mutante davon erlauben, entfernt. Das so erhaltene Gemisch wird an hybridem PA oder an der Mutante davon durch herkömmliche Mittel angereichert, beispielsweise durch die Entfernung des Hauptteils des nicht-proteinartigen Materials durch Behandlung mit Polyethylenimin, Fällung der Proteine unter Verwendung von Ammoniumsulfat, Gelelektrophorese, Dialyse, Chromatographie, beispielsweise Ionenaustausch-Chromatographie, Größenauschluß-Chromatographie, HPLC oder Umkehrphasen-HPLC, Molekularsieb-Chromatographie auf einer geeigneten Sephadex -Säule oder dergleichen. Die abschließende Reinigung des vorgereinigten Produkts wird beispielsweise mittels Affinitäts-Chromatographie, beispielsweise Antikörper-Affinitäts-Chomatographie, insbesondere monodonale Antikörper-Affinitäts-Chomatographie unter Verwendung von monodonalen Anti-t-PA- oder Anti-u- PA-Antikörpern, die auf eine unlösliche Matrix nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren gebunden wurden, oder, im Falle von Hybrid-PAs, die die katalytische B-Kette von t-PA enthalten, der DE-3-Affinitäts-Chromatographie (DE-3 ist ein Protease-Inhibitor, der aus Erytrina latissima isoliert wurde) und dergleichen erzielt.
Hybridoma-Zellinien, die monodonale Antikörper produzieren, die gegen spezifische Domänen von t-PA oder u-PA gerichtet sind, und die monodonalen Antikörper sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Für die einfache Herstellung der einkettigen Form des hybriden PAs oder des mutierten hybriden PAs, der im wesentlichen frei von der zweikettigen Form ist, wird ein Protease-Inhibitor, wie Aprotinin (Trasylol ) oder der basische Pancreas-Trypsin-Inhibitor, vorteilhafterweise während des Reinigungsverfahrens, aufgenommen, um Spuren von Proteasen zu hemmen, die in dem Kulturmedium vorhanden sein können und die eine (Teil)umwandlung der einkettigen Form in die zweikettige Form verursachen können. Die Endreinigung wird durch Chromatographie auf einer Säule, die ein selektive Affinitätsreagens enthält, erzielt.

5. Pharmazeutische Präparate

Die neuen einkettigen hybriden PA-Proteine, die erfindungsgemäß erhältlich sind, zeigen wertvolle pharmakologische Eigenschaften. Sie können in Analogie zu bekannten Plasminogenaktivatoren beim Menschen zur Verhütung oder Behandlung von Thrombose oder anderen Zuständen verwendet werden, bei denen es erwünscht ist, eine lokale fibrinolytische oder proteolytische Aktivität über den Mechanismus der Plasminogenaktivierung zu produzieren, wie Arteriosklerose, Myocard- und Cerebruminfarkt, Venenthrormbose, Thromboembolie, postchirurgische Thrombose, Thrombophlebitis und diabetische Vasculopathien.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die erfindungsgemäßen neuen hybriden PA-Proteine die nützlichen Eigenschaften von natürlichem t-PA und u-PA vereinigen. So sind die neuen hybriden PA-Proteine fibrinolytisch aktiv. Die einzigartigen fibringesteuerten Eigenschaften, d.h. die Fähigkeit Plasminogen, bevorzugt in Gegenwart von Fibrin, zu aktivieren, werden beibehalten. Ferner besitzen die neuen Proteine eine verlängerte in-vivo-Stabilität, verglichen mit authentischem t-PA.
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge des aktiven Inhaltsstoffs (hybrider PA), zusammen mit organischen oder anorganischen festen oder flüssigen pharmazeutisch verträgliche Trägern, die für die parenterale, d.h. intramuskuläre, subkutane oder intraperitoneale Verabreichung geeignet sind, und die mit den aktiven Inhaltsstoffen nicht nachteilig wechselwirken, enthalten.
Es gibt geeignete Infusionslösungen, bevorzugt wäßrige Lösungen oder Suspensionen, wobei es möglich ist, diese vor Gebrauch herzustellen, beispielsweise aus lyophilisierten Präparaten, die den Wirkstoff alleine oder zusammen mit einem Träger, wie Mannit, Lactose, Glucose, Albumin und dergleichen, enthalten. Die pharmazeutischen Präparate werden sterilisiert und gegebenenfalls mit Hilfsmitteln vermischt, beispielsweise mit Konservierungsstoffen, Stabilisatoren, Emulgatoren, Lösungsvermittlern, Puffern und/oder Salzen zur Regulierung des osmotischen Drucks. Die Sterilisierung kann durch Sterilf iltration durch Filter mit einer kleinen Porengröße (Durchmesser 0,45 µm oder kleiner) erzielt werden, wonach die Zusammensetzung gegebenenfalls lyophilisiert werden kann. Antibiotika können auch zugesetzt werden, um die Beibehaltung der Sterilität zu unterstützen.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate werden in Dosiseinheitsformen abgegeben, beispielsweise als Ampullen, umfassend 1 bis 2000 mg eines pharmazeutischen verträglichen Trägers pro Dosiseinheit und etwa 1 bis 200 mg, bevorzugt etwa 5 bis 100 mg des Wirkstoff, pro Dosiseinheit.
In Abhängigkeit vom Typ der Erkrankung und des Alters und des Zustands des Patienten liegt die zu verabreichende Tagesdosis für die Behandlung eines Patienten mit einem Gewicht von etwa 70 kg im Bereich von 3 bis 100 mg, bevorzugt von 5 bis 50 mg, pro 24 Stunden. Im Falle eines Myocardinfarkts wird bevorzugt eine Dosis von etwa 30 bis 80 mg innerhalb von 60 bis 120 Minuten, bevorzugt in drei Aliquoten, innerhalb von etwa 90 Minuten, verabreicht. Die Gesamtmenge an hybridem PA kann auch als Bolusinjektion verabreicht werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Produktion einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß das erfindungsgemäße biologisch aktive Protein mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vermischt ist.
Die Verwendung der neuen Proteine zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung des menschlichen Körpers ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung betrifft insbesondere die DNAs, die Hybridvektoren, die transformierten Wirtsstämme, die hybriden PA-Proteine, die Hybridoma-Zellinien, die monodonalen Antikörper und die Verfahren zur Herstellung davon, wie in den Beispielen beschrieben.

Kurze Beschreibung der Figuren

Im folgenden experimentellen Teil werden verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren beschrieben. Darin erläutern die Figuren 1 und 3 die Nukleotidsequenzen und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von menschlicher t- PA-cDNA bzw. menschlicher u-PA-cDNA. Die ersten Aminosäuren der reifen Proteine sind unterstrichen;
sind die Figuren 2 und 4 Restriktionskarten von menschlicher t-PA-cDNA bzw. menschlicher u-PA-cDNA;
erläutert die Figur 5 schematisch die Technik, die zur Konstruktion des Plasmids pEco0,47ΔScaI verwendet wurde;
erläutert die Figur 6 die Konstruktion des Plasmids pH tPAΔ ScaI, das eine mutierte t-PA-cDNA enthält;
erläutert Figur 7 schematisch die Konstruktion des Plasmids pUNC tc, das eine cDNA-Insertion enthält, umfassend die A-Ketten-Domänen von u-PA und die B-Kette von t-PA;
zeigt Figur 8 schematisch die Konstruktion des Plasmids ptNC-UC, enthaltend eine cDNA-Insertion, umfassend die A- Ketten-Domänen von t-PA und die B-Kette von u-PA;
zeigt Figur 9 schematisch die Konstruktion des Plasmids pDO2;
erläutert Figur 10 die Konstruktion des Plasmids pDO10, das t-PA-cDNA in Kombination mit einem β-Globinfragment enthält;
erläutert Figur 11 schematisch die Konstruktion des Plasmids pCGA26, das die t-PA-cDNA unter Kontrolle des MCMV- IE-Promotors und ein β-Globinfragment enthält;
erläutert Figur 12 schematisch die Konstruktion des t-PA- Expressionsplasmids pCGA28 und des universellen Expressionsplasmids pCGA44, wobei beide Plasmide das Neomycin-Resistenzgen umfassen;
erläutert Figur 13 schematisch die Konstruktion des t-PA- Expressionsplasmids pCGA42 und des universellen Expressionsplasmids pCGA24d, wobei beide Plasmide das Hygromycin- Resistenzgen umfassen;
erläutert Figur 14 schematisch die Konstruktion des t-PA- Expressionsplasmids pCGA48, umfassend das Neomycin-Resistenzgen und das DHFR-Gen;
erläutert Figur 15 schematisch die Konstruktion des Expressionsplasmids pbrla, enthaltend die cDNA-Insertion des mutierten t-PA des Plasmids ph tPAΔScaI;
zeigt Figur 16 schematisch die Konstruktion des Expressionsplasmids pBR2a, enthaltend eine hybride PA-cDNA-Insertion, umfassend die A-Ketten-Domänen von u-PA und die B- Kette von t-PA;
zeigt Figur 17 schematisch die Konstruktion des u-PA-Expressionsplasmids pBR3a;
erläutert Figur 18 schematisch die Konstruktion des Expressionplasmids pBR4a, enthaltend eine cDNA-Insertion für den hybriden PA, umfassen die A-Ketten-Domänen von t-PA und die B-Kette von u-PA;
zeigt Figur 19 schematisch die Konstruktion des Hefeexpressionsvektors pJDB207/PHO5-I-TPA, enthaltend den PHO5- Promotor, die Invertase-Signalsequenz und die t-PA-cDNA;
erläutert Figur 20 schematisch die Konstruktion des Plasmids pCS16;
erläutert Figur 21 schematisch die Konstruktion des Plasmids pCS16/UPA, umfassend u-PA-cDNA;
zeigt Figur 22 schematisch die Konstruktion des Plasmids pJDB207/PHO5-I-UPA;
zeigen die Figuren 23 bis 26 schematisch die Techniken, die zur Umwandlung primärer hybrider PA-Konstrukte, einschließlich der A-Ketten-Domänen und der katalytisch B- Ketten-Region von u-PA oder t-PA, in die Endkonstruktionen verwendet werden, wobei die Verbindung der Domänen an der Aktivierungsstelle und/oder an den natürlichen Exon-Intron-Verbindungsstellen ist;
zeigt Figur 23 die Konstruktion eines Gens, das einen hybriden PA, umfassend die A-Ketten-Domänen von t-PA und die B-Kette von u-PA, codiert;
zeigt Figur 24 die Konstruktion eines Gens, das einen hybriden PA, umfassend die A-Ketten-Domänen von u-PA und die B-Kette von t-PA, codiert;
zeigt Figur 25 die Konstruktion eines Gens, das einen hybriden PA codiert, umfassend die u-PA-Wachstumsfaktor-Domäne, die Kringle-2-Domäne von t-PA und die B-Kette von t--
zeigt Figur 26 die Konstruktion eines Gens, das einen hybriden PA, umfassend die u-PA-Wachstumsfaktor-Domäne, die Kringle-2-Domäne von t-PA und die B-Kette von u-PA, codiert;
ist Figur 27 eine Zusammenstellung der hybriden PAs und der mutierten hybriden PAs, wie im Versuchsteil beispielhaft dargestellt.
Die in den beigefügten Figuren verwendeten Symbole besitzen die folgenden Bedeutungen:
AMP, AmpR Ampicillin-Resistenzgen (β-Lactamase)
TET, TetR Tetracyclin-Resistenzgen
NEO Tn5-Neomycinphosphotransferase
TN5PR Bakterieller Promotor des Transposons Tn5
HPH Hygromycinphosphotransferase
pBRori Replikations-Origin des Plasmids pBR322
POIS 'Poison-Sequenz', pBR322-Sequenz, die die SV40- Replikation hemmt
SV40ori Replikations-Origin von SV40, fällt mit den frühen und späten Promotoren zusammen
SV40enh,
SV40E 72-bp-Enhancer, Teil des frühen SV40-Promotors
HCMVE Enhancer des hauptsächlichen unmittelbaren frühen Gens des menschlichen Cytomegalie-Virus (HCMV)
MCMVP Promotor/mRNA-Startstelle des hauptsächlichen unmittelbaren frühen Gens Maus-Cytomegalie- Virus (MCMV)
RSV Rous-Sarkom-Virus-LTR (Promotor)
CAP Position 5' m7Gp 'cap' von eukaryotischer mRNA
polyA Polyadenylierungsstelle von mRNA
SPLD Spleißdonorstelle, 5'-Ende des Introns
SPLA Spleißakzeptorstelle, 3'-Ende des Introns
BAP Bakterielle alkalische Phosphatase
CIP Kälberdarmphosphatase
(Bamh1/ Bgl2) Sau3a-Spaltstelle als Ergebnis der Coligierung einer BamHI- und einer BglII-Spaltstelle
ScaI (del) mutierte ScaI-Spaltstelle
x < y Restriktionsenzymstelle x, lokalisiert im Uhrzeigersinn zu y
p Promotor
inv.SS Invertase-Signalsequenz
t Transkriptionsterminator
L Linker-DNA
DHFR Dihydrofolatreduktase mtPA Bowes-Melanom-t-PA

Versuchsteil

Beispiel 1: Einschleusung einer ScaI-Spaltstelle an der Verbindung zwischen den Kringlestrukturen und der Enzymdomäne in menschlicher t-PA-cDNA

Eine Variante der Konstruktion von chimären oder hybriden Molekülen, die Domänen sowohl von t-PA als auch von u-PA enthalten, besteht darin, daß man die gewünschten Restriktionsfragmente, die von den jeweiligen Clonen abgeleitet sind, hergestellt, sie in Lösung erneut zusammenbaut und dann die so erhaltenen Konstruktionen doniert. Nach der Clonierung wird die Struktur der chimären Moleküle durch Restriktionskartierung und DNA-Sequenzanalyse bestätigt.
Um die hybriden Moleküle zu erhalten, werden sowohl t-PA als auch u-PA-cDNAs an den Verbindungen zwischen den jeweiligen Kringlestrukturen und Enzymdomänen gespalten. Dies wird mit u-PA durch Durchführung einer Teilspaltung, mit der Restriktionsendonuclease MstI erzielt, die die nicht-katalytische Domäne von der Enzymdomäne und assoziierten Sequenzen vom 3'-Ende trennt. Eine nicht vergleichbar nützliche potentielle Spaltstelle ist in t-PA vorhanden und eine wird folglich, wie nachstehend beschrieben, eingeschleust.

A) Konstruktion des Plasmids pEco0,47ΔScaI (siehe Fig. 5)

In dieser Konstruktion wird die einzigartige ScaI-Spaltstelle (AGTACT) an der Nukleotidposition 940-945 der t-PA- cDNA zerstört (AGTACT T AGTA T) und eine weitere ScaI- Spaltstelle wird an den Nukleotidpositionen 963-968 (T AC T AC ) am 3'-Ende von Kringle2 eingeschleust (vgl. die Fig. 1 und 2). Durch diese Veränderung wird die Codierung keiner der Aminosäuren beeinflußt.
Alle Restriktionsspaltungen werden gemäß den Anweisungen des Herstellers (New England Biolabs, Bethesda Research Labs) durchgeführt und die so erhaltenen Spaltprodukte werden elektrophoretisch auf einem 3,5%igen Polyacrylamidgel analysiert. Das Gel wird mit Ethidiumbromid (1,0 µg/ml) angef ärbt und mit UV-Licht sichtbar gemacht. Die geeignete Bande wird herausgeschnitten und in 0,5 x TBE (1 x TBE = 90 mM Tris-Borat, pH 8,3, 2,5 mM EDTA) elektrisch eluiert. Das elektisch eluierte Material wird auf eine Elutip-d-Säule (Schleicher und Schuell) aufgebracht, die gebundene DNA wird mit einer hohen Salzkonzentration eluiert und durch Zugabe von Ethanol ausgefällt. Das Pellet wird mit Ethanol gewaschen, getrocknet und in Wasser aufgelöst.
Das Plasmid pW349F (Europäische Patentanmeldung Nr. 143 081), das menschliche t-PA-cDNA enthält (synthetisiert aus mRNA, die aus HeLaS3-Zellen isoliert und in die PstI- Spaltstelle des Plasmids pBR322 doniert wurde), wird mit EcoRI gespalten und das 470 Basenpaar-(bp)-Fragment (vgl. Fig. 2) wird isoliert. Die 150 bp EcoRI-, ScaI- und die 290 bp EcoRI-, HaeIII-Fragmente werden durch Spalten des 470 bp EcoRI-Fragments mit ScaI bzw. HaeIII erhalten. Die zwei Stränge des 470 bp EcoRI-Fragments werden durch Denaturieren der DNA in DMSO-Puffer (30% DMSO, 1 mM EDTA, 0,5% Xylolcyanol, 0,05% Bromphenolblau) und Durchführen einer Elektrophorese auf einem 5%igen Polyacrylamidgel in 0,5 x TBE bei 8 Volt pro Zentimeter [Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 1982] getrennt. Die getrennten Stränge werden durch Elektroelution mit anschließender Ethanolfällung wieder gewonnen. Ein 31-meres Desoxyoligonukleotid (das die 5 erwünschten Nukleotidveränderungen beherbergt, vgl. Fig. 5) wird synthetisiert, wobei das Phosphotriester-Verfahren verwendet wird. Fünfzig pmol des 31-meren werden mit ³²p am 5'-Ende in 20 µl Reaktion, enthaltend 1 x Kinasepuffer (10 x Kinasepuffer = 0,5 M Tris HCl, pH 7,5, 0,1 M MgCl&sub2;, 50 mM DTT, 1 mM Spermidin, 1 mm EDTA), 30 µCi [α³²] ATP (Amersham, 3000 Ci/mmol) und 10 Einheiten T&sub4;-Polynukleotidkinase (Bethesda Research Labs.) markiert. Der Reaktionsansatz wird 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert und anschließend werden 1 µl 10 mM ATP, 10 Einheiten T&sub4;-Kinase zugesetzt und es wird weitere 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wird durch zehnminütiges Erhitzen auf 68ºC beendet. Das markierte 31-mere, dessen Sequenz die des nicht-transkribierten Stranges ist, wird als Sonde in einer Dot-Blot-Analyse [durchgeführt gemäß Zoller and Smith, Nucl. Acids Res., 10, 6487-6500 (1982); ausgenommen, daß die Prähybridisierung und die Hybridisierung bei 50ºC und die Waschung bei 60ºC durchgeführt werden] verwendet, um zu bestimmen, welcher der zwei Stränge damit hybridisiert, d.h. den transkribierten Strang darstellt.
Die vier DNAs werden zusammen in einer 20-µl-Assoziierungsreaktion vermischt, die aus 0,3 pmol des transkribierten Stranges, 2 pmol jeweils des 150 bp EcoI-, ScaI- und 290 bp EcoRI-, HaeIII-Fragments, 25 pmol des phosphorylierten 31-meren und 1 x Assoziierungspuffer (5 x Assoziierungspuffer = 0,5 M NaCl, 32,5 mM Tris HCl, pH 7,5, 40 mM MgCl&sub2; und 5 mM β-Mercaptoethanol) besteht. Das Gemisch wird 3 Minuten lang bei 100ºC, 30 Minuten lang bei 30ºC, 30 Minuten lang bei 4ºC und dann 10 Minuten lang auf Eis inkubiert und anschließend mit 400 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase (New England Laboratories) versetzt, und der Reaktionsansatz wird über Nacht bei 12,5ºC inkubiert. Das assoziierte 470 bp-Fragment wird aus einem 3,5%igen Polyacrylamidgel, wie vorstehend beschrieben, isoliert und an Ecoi gespaltene und dephosphorylierte pBR322-DNA (New England Biolabs) in 50 mM Tris HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM Sperimidin, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin durch Inkubation bei 12ºC über Nacht ligiert. Das Ligierungsgemisch wird verwendet, um den kompetenten E. coli-Stamm HB101 (Maniatis et al., a. a. O.) zu transformieren. Ampicillin-resistente Kolonien werden auf L-Agar, der 50 µg/ml Ampicillin enthält, selektioniert und Kolonien, die das 470 bp-Fragment enthalten, werden durch Koloniehybridisierung unter Verwendung des 31 -meren als Sonde identifiziert [D. Woods, Focus 6, 1-3 (1984)]. Die Plasmid-DNA wird aus mehreren positiv hybridisierenden Kolonien in kleinem Umfang isoliert [Holmes et al., Analyt. Biochem. 114, 193-197 (1981)] und die Erzeugung von zwei neuen ScaI-Spaltstellen wird durch kombinierte EcoRI-, ScaI-Spaltung bestätigt. Um die Reinheit zu gewährleisten, wird Plasmid-DNA aus positiven Kolonien für die zweite Transformationsrunde von E. coli-HB101 verwendet. Die Plasmidherstellung in großem Umfang wird aus einer solchen in der zweiten Generation positiven Kolonie [Katz et al., J. Bacteriol. 114, 577-591 (1973); Biochemistry 16, 1677- 1683 (1977)] durchgeführt und die Zerstörung der ursprünglichen ScaI-Spaltstelle und die Erzeugung des neuen ScaI- Spaltstelle werden durch DNS-Sequenzanalyse unter Verwendung des Verfahrens von Maxam und Gilbert (Methods Enzym. 65, 499-560 (1980)] bestätigt. Dieses Plasmid wird als pEco0.47ΔScaI bezeichnet.

B) Rekonstruktion von menschlichem t-PA mit einer mutierten ScaI-Spaltstelle (vgl. Fig. 6)

Bei dieser Konstruktion wird das 450 bp-EcoI-Fragment, das auf dem menschlichem Wildtyp t-PA vorhanden ist, gegen das 470 bp-EcoI-Fragment, das die mutierte ScaI-Spaltstelle enthält, ausgetauscht. Das Plasmid PW349F, das menschliche t-PA-cDNA (siehe vorstehend) enthält, wird mit ClaI gespalten und die so erhaltenen klebrigen Enden werden durch Zugabe von 50 µm jeweils an dCTP, dGTP und 10 Einheiten DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment (Boehringer, Mannheim) glattendig gemacht. Der Reaktionsansatz wird bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert, anschließend mit Phenol und Ether extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das Pellet wird in Wasser aufgelöst, mit EcoRI und ScaI gespalten und 1,5 kb EcoRI-, ScaI- und 4,3 kb ClaI- (glattendig), EcoRI- Fragmente werden isoliert. Diese zwei Fragmente werden mit dem aus dem Plasmid pEco0,47ΔScaI nach EcoRI-Spaltung gewonnenen 470 bp-Fragment vermischt und, wie zuvor beschrieben, bei 12ºC über Nacht ligiert. Kompetente E. coli-HB101-Zellen werden mit dem Ligierungsgemisch transformiert und Tetracyclin-resistente Kolonien werden auf L- Agar, der 12,5 µg/ml Tetracyclin enthält, selektioniert. Kolonien, die das 470 bp lange mutierte Fragment enthalten, werden durch Koloniehybridisierung unter Verwendung des vorstehend beschriebenen 31-meren als Sonde identifiziert. DNA aus Minilysaten von mehreren der positiv hybridisierenden Kolonien wird hergestellt, und die genaue Natur der Konstruktion wird durch Durchführen geeigneter Restriktionsspaltungen bestätigt. Ein solches Plasmid mit den gewünschten Veränderungen wird als ph tPAΔScaI bezeichnet.

Beispiel 2: Konstruktion eines hybriden u-PA/t-PA-Moleküls; Plasmid pUNC tc (siehe Fig. 7)

Diese Konstruktion ist ein Hybrid zwischen den nicht-katalytischen Regionen von u-PA (enthaltend die 5'- nichtcodierende Region, Signal-, Wachstumsfaktor und Kringlesequenzen) und der katalytischen oder Enzymdomäne von menschlichem t-PA.
Urokinase-cDNA wird aus mRNA, die aus menschlichen Hep3- Zellen erhalten wurde [vgl. T. Maniatis et al., Molecular doning (1982), S. 188-246], hergestellt. Ein 1,3-kb-SmaI- BamHI-Fragment und 1-kb-BamHI-EcoRI-Fragment der u-PA-cDNA wird in die SmaI-, EcoRI-Spaltstellen von pUN121 [B. Nilsson et al. Nucl. Acids. Res. 11, 8019-8030 (1983)] cloniert, wodurch das Plasmid pcUK176 erhalten wird. Die Restriktionskarte der menschlichen u-PA-cDNA-Insertion ist in Fig. 4 gezeigt. Die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz der u-PA-Insertion sind in Fig. 3 angegeben.
Das Plasmid pcUK176 wird mit XmaI (vg. Fig. 4; XmaI ist ein Isoschizomeres von SmaI) und MstI gespalten, und das 521-bp-Fragment wird isoliert. Das Restriktionsenyzm MstI erkennt die DNA-Sequenz TGC GCA (die Pfeile zeigen die Spaltstelle an) und erzeugt nach Spaltung glatte Enden. Dieses Enzym spaltet daher u-PA-cDNA an den Nukleotiden 520-525, d.h. genau nach dem die Kringleregionen umfassenden letzten Cysteinrest (Aminosäure 131), [Holmes et al., Biotechnology 3, 923-929 (1985)] und trennt so glatt die codierenden Sequenzen für die nicht-katalytischen und katalytischen Regionen.
Das Plasmid ph PAΔScaI wird mit ScaI und HindIII (HindIII ist in dem Vektor enthalten) gespalten und das 1,8-kb- Fragment wird isoliert. Das Restriktionsenzym ScaI erkennt die DNA-Sequenz AGT ACT (die Pfeile zeigen die Spaltstelle an) und ergibt ebenfalls nach Spaltung glatte Enden. ScaI spaltet ph PAΔScaI-DNA nach dem Serinrest 262 [1 Aminosäure nach dem letzten Cystein von Kringle2; Pennica et al., Nature 301, 214-221 (1983)] und trennt daher die nicht-katalytischen und katalytischen Domänen.
Die zwei Fragmente werden vermischt und an die XmaI, HindIII gespaltene pUC18-Vektor-DNA ligiert. Nach Transformation von E. coli-HB101 werden Kolonien mit der korrekten Insertion durch Koloniehybridisierung identifiziert, wobei das 2,0-kb-BglII-Fragment von menschlichem t- PA (vgl. Fig. 2) als Sonde verwendet wird [die Sonde wird durch das Random-Priming-Verfahren markiert: Feinberg et al., Analyt. Biochem. 132, 6-13 (1983)]. Die DNA-Sequenz an der Verbindung der Ligierung der u-PA- und t-PA-Fragmente wird durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Ein korrekter Clon wird als pUNC tc bezeichnet.

Beispiel 3: Konstruktion eines hybriden t-PA/u-PA-Moleküls; Plasmid ptNC UC (vgl. Fig. 8)

Die Konstruktion ist genau die umgekehrte von pUNC tc dahingehend, daß die nicht-katalytische Region von ph tPA ScaI (enthaltend die 5'-nichtcodierende Region, Leader-, Finger-, Wachstumsfaktor- Kringle-1- und Kringle-2-Domänen) mit der katalytischen Domäne von menschlichem u-PA fusioniert wird. Das Plasmid ph tPAΔScaI wird mit SacI und ScaI (vgl. Fig. 8) gespalten und ein etwa 1,0 kb großes Fragment wird isoliert. Das Plasmid pcUK176 wird zuerst mit BamHI gespalten und dann mit MstI teilgespalten, und das etwa 800 bp große Fragment wird isoliert. Dann wird die BamHI-Spaltung mit EcoRI gespalten und das etwa 1,0 kb große Fragment wird isoliert. Diese drei Fragmente werden mit dem mit SacI-, EcoRI-gespaltenen PUC19-Vektor vermischt und ligiert. E. coli-HB101 wird mit dem Ligierungsgemisch transformiert und Kolonien mit der korrekten Insertion werden durch Koloniehybridisierung identifiziert, wobei die gleiche 2,0 kb große BglII-Sonde, wie vorstehend beschrieben, verwendet wird. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle der t-PA- und u-PA-DNA wird durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Ein korrekter don wird als ptNC UC bezeichnet.

Beispiel 4: Konstruktion eines Exidressionsvektors zur Verwendung in Säugerzellen

A) Umwandlung der HgiAI-Spaltstelle in der t-PA-cDNA in eine HindIII-Spaltstelle

Dies wird in fünf Stufen (Fig. 9) erzielt.
Das Plasmid pW349F (Europäische Patentanmeldung Nr. 143 081) wird mit dem Restriktionsenzym HgiAI durch Inkubation von 20 µg/ml DNA für 1 Stunde bei 37ºC mit 12 E/ml des Enzyms in den vom Hersteller (Bethesda Research Laboratories) empfohlenen Puffer, außer daß er mit 10 µg/ml Ethidiumbromid angereichert ist, um eine zweite Spaltung des Plasmids zu unterdrücken, gespalten. Die linearisierte Plasmid-DNA wird dann auf ein 0,8%iges Agarosegel in TBE- Puffer (TBE: 89 mM Tris-Borat pH 8,9, enthaltend 1 mM EDTA) aufgebracht, elektrophoretisch in gleichem Puffer eluiert, zweimal mit Phenol extrahiert, zweimal mit Chloroform extrahiert und schließlich mit Alkohl bei -20ºC nach Zugabe von 0,1 Vol. 3 M Natriumacetat pH 5,2 ausgefällt. Die pelletierte DNA wird in einer Konzentration von 0,2 mg/ml in TE (TE: 10 mM Tris-HCl pH 7,2 mit 0,1 mM EDTA) aufgelöst.
63 µl der linearisierten DNA werden dann 30 Minuten bei 37ºC mit 15 E T&sub4;-DNA-Polymerase in Ligasepuffer [33 mM Trisacetat (pH 7,9), 66 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 0,5 mM Dithiothreit und 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin] inkubiert und anschließend 10 Minuten auf 60ºC erhitzt, um das Enzym zu inaktivieren. Diese Inkubation dient dazu, die exonukleolytische Aktivität der T&sub4;-Polymerase zu verwenden, um die überstehenden 4 Nukleotide, die nach der Spaltung mit HgiAI erhalten wurden, zu entfernen, um glattendige DNA-Moleküle zu erhalten.
Um die HindIII-Linker (CAAGCTTG) an die glattendige DNA zu ligieren, werden 6 µl (300 ng) kinasierte Linker der vorstehenden Lösung mit 4 µl 10 mM ATP und 3 µl T&sub4;-DNA-Ligase (New England Biolabs, 400 u/µl ) zugesetzt, und anschließend wird 16 Stunden bei 16ºC inkubiert. Die Ligierung wird durch zehnminütiges Erhitzen des Gemisches auf 68ºC beendet, wonach die DNA mit HindIII und BglII gespalten wird, d.h. 15 µl (135 E) HindIII werden zu 1,5 µl 4M NaCl, 0,2 µl lM MgCl&sub2; und 11 µl 1 mg/ml Rinderserumalbumin gegeben, 1 Stunden lang bei 37ºC inkubiert und dann mit 40 E BglII versetzt und eine weitere Stunde bei 37ºC inkubiert. Das so erhaltene 177-Basenpaarfragment wird auf einem 6%igen Polyacrylamidgel, das in TBE laufengelassen wird, gereinigt, in TNE (TNE: 10 mM Tris-HCl pH 8,8, enthaltend 100 mM NaCl und 1 mM EDTA) eluiert, an DEAE-Cellulose (Whatman DE52) absorbiert, mit 1M NaCl in TNE eluiert, mit 4 Volumina Wasser verdünnt, nach Zusatz von 2,5 Volumina Ethanol bei -20ºC ausgefällt und schließlich in 17 µl TE (TE: 10 mM Tris-HCl pH 8,0, enthaltend 1 mM EDTA) aufgelöst.
Das Plasmid pRSVneo ist ein Derivat des Plasmids pSV2neo [P.J. Southern und P. Bergl J. Mol Appl. Genet. 1, 327-341 (1982)], worin das SV40-abgeleitete PvuII-HindIII-Fragment durch ein PvuII-HindIII-Fragment ersetzt wurde, das den LTR-Promotor aus dem Rous-Sarkom-Virus enthält, vergleichbar der Konstruktion von prsv2cat aus pSV2cat [C.M. Gorman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777-6781 (1982)]. 5 µg dieses Plasmids werden in einem Volumen von 50 µl mit 24 E BglII gemäß den Angaben des Herstellers gespalten. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37ºC werden 40 E HindIII zugesetzt und die Inkubation wird 1,5 Stunden fortgesetzt, wonach das große 5,4-kb-Fragment, wie vorstehend beschrieben, gereinigt wird.
17 µl des gereinigten 177-bp-Fragments werden 18 Stunden bei 16ºC an 2 µl (20 ng) des pRSVneo-Fragments unter Verwendung von 0,25 µl (100 E) T&sub4;-Ligase in einem Gesamtvolumen von 22 µl Ligasepuffer ligiert, wonach die Plasmid-DNA zur Transformation von E. coli gemäß D. Hanahan [J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983)] verwendet wird. Aus den so erhaltenen Ampicillin-resistenten Stämmen wird einer ausgewählt, der ein Plasmid mit der Bezeichnung ptPAL mit dem 177-bp-HindIII-BglII-Fragment enthält, wie durch Restriktionsanalyse nachgewiesen wird. 0,1 µg dieses Plasmids werden in 60 µl mit 16 E BglII, wie vom Hersteller empfohlen, 1,5 Stunden bei 37ºC gespalten. Diese Lösung wird mit 20 E alkalischer Kälberdarmphosphatase (Boehringer Mannheim) versetzt und dann weitere 30 Minuten lang inkubiert, wonach die DNA zweimal mit Phenol, zweimal mit Chloroform extrahiert wird und nach Zugabe von 0,1 Volumen 3,0 M Natriumacetat pH 5,2 und 0,6 Volumen Isopropanol, ausgefällt wird, in TE aufgelöst wird, weiter durch Agarosegelelektrophorese, wie vorstehend beschrieben, gereinigt wird, zweimal mit Phenol extrahiert wird, zweimal mit Chloroform extrahiert wird, bei -20ºC nach Zugabe von 2,5 Volumina Ethanol und 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5,2 ausgefällt wird und schließlich in 30 µl TE aufgelöst wird. Das 2,1-kb-t-PA-BglII-Fragment wird dann aus 5 µg pW349F in einem 25-µl-Reaktionsansatz unter Verwendung von 20 E BglII für 2 Stunden bei 37ºC herausgeschnitten, auf einem 0,8%igen Agarosegel gereinigt, elektrophoretisch, wie vorstehend beschrieben, eluiert, zweimal mit Phenol extrahiert, zweimal mit Chloroform extrahiert, bei -20ºC nach Zugabe von 2,5 Volumina Ethanol und 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5,2 ausgefällt und in einer Konzentration von 8 ng/µl in TE aufgelöst. 1 µl des t-PA-Fragments werden dann in einem 10-µl-Reaktionsansatz an 7,5 ng BglII gespaltene Vektor-DNA unter Verwendung von 100 ET&sub4;-Ligase (Biolabs) für 17 Stunden bei 16ºC ligiert und anschließend wird E. coli damit transformiert. Einer der so erhaltenen done mit der Bezeichnung pDO2 enthält das t-PA-BglII- Fragment so insertiert, daß das Plasmid ein kontinuierliches offenes Leseraster für menschlichen t-PA enthält.

B) Kombination der t-PA-cDNA mit dem β-Globin-Fragment

Das Plasmid pDO10 (Fig. 10) wird durch Koligieren von drei DNA-Fragmenten konstruiert: (i) ein 2,1-kb-Fragment, das mit einer HindIII-Spaltstelle beginnt und mit einer BglII- Spaltstelle endet, das die vollständige t-PA-codierende Sequenz enthält, wird aus einem Agarosegel isoliert, auf das 10 µg pDO2-DNA, die mit BglII teilgespalten und mit HindIII vollständig gespalten ist, geladen wurden. (ii) pUB ist ein Plasmid, das das Kaninchen-β-Globingen enthält [A. Van Ooyen et al., Science 206, 337 (1979)] subcloniert als eine BglII-Teilspaltung in die BamHI-Spaltstelle des Plasmids pUC9 [J. Vieira und J. Messing, Gene 19, 259-268 (1982); ibid. 19, 269-276 (1982)]. Aus diesem Plasmid wird ein 1,2-kb-BamHI-HindIII-Fragment, das das zweite Intron und die Polyadenylierungsstelle enthält, herausgeschnitten und durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. (iii) Der Vektor pD01 wird im Gegenuhrzeigersinn aus der HindIII- Spaltstelle (Fig. 10) des HindIII-AccI-Fragments von pBR322 aufgebaut, das den Replikations-Origin, ein 0,3-kb- Fragment, das den Enhancer des menschlichen Cytomegalivirus (HCMV) enthält, und mit einer synthetischen XbaI- Spaltstelle endet, worauf eine zweite Kopie dieses Enhancers in Bindung an den homologen Promotor folgt, der in einer synthetischen HindIII-Spaltstelle endet. Diese Vektor-DNA wird mit HindIII gespalten und das 6,3 kb große lineare Plasmid wird durch Agarosegelelektrophorese gereinigt.

C) Insertion der t-PA/Globinkombination in pSP62Pst33 (siehe Fig. 11)

pSP62Pst33 (Fig. 11) ist ein Plasmid, das ein 1,2-kb-PstI- Fragment der Maus-Cytomegalivirus-(MCMV)-DNA enthält, das den unmittelbaren frühen (IE) viralen Promotor, insertiert in die PstI-Spaltstelle des Plasmids pSP62 (Boehringer Mannheim), wie in der Figur angegeben, enthält. In die HindIII-Spaltstelle von pSP62Pst33 wird das HindIII-Fragment aus pDO10 insertiert. Ein Plasmid, pCGA26, wird selektioniert, worin die t-PA-codierende Sequenz so insertiert ist, daß sie in Orientierung im Leseraster von dem MCMV-IE-Promotor transkribiert werden kann.

D) Insertion der MCMV/t-PA/Globineinheit in pFASV2911neo (siehe Fig. 12)

Das Plasmid pSV2911neo [F. Asselbergs et al. J. Mol. Biol. 189, 401-411 (1986)] enthält das Neomycin(neo)phosphotransferasegen aus dem Transposon TN5 in einer SV40-Expressionskassette (Fig. 12). So verleiht es bei Einschleusen in Säugergewebskulturzellen Resistenz gegen Neomycin und Kanamycin. pSV2911neo-DNA wird zur Clonierung durch Spalten mit BamHI, Behandlung mit alkalischer Kälberdarmphosphatase, zwei Extraktionen mit Phenol, zwei Extraktionen mit Chloroform, Fällung mit Alkohol und schließlich Auflösen in TE, hergestellt. Das Plasmid pCGA26 wird mit dem Restriktionsenzym AccI gespalten, das die Sequenz GT/ACAC in der Position 345 in der MCMV-Enhancer/Promotor- Region [K. Doersch-Haessler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 8325-8329 (1985)] und die Sequenz GT/CGAC (kann auch mit Sall gespalten werden) hinter dem Globinteil spaltet. Die zwei überstehenden Basen nach der Spaltung werden mit E. coli (großes Fragment) DNA-Polymerase I aufgefüllt. Die nun glatten Enden werden an BamHI-Linker (CGGATCCG) ligiert und diese werden mit dem BamHI-Enzym gespalten. Das 3,8-kb-Fragment, das die MCMV/t- PA/Globineinheit nun mit BamHI-Enden trägt, wird über ein Agarosegel gereinigt und dann in die, wie vorstehend beschrieben, hergestellte pSV2911neo-DNA ligiert, um das Expressionsplasmid pCGA28 zu ergeben.

E) Von pCGA28 abgeleitete Expressionsvektoren

pCGA42 ist ein Derivat von pCGA28, worin die neocodierende Sequenz (zwischen der BglII-Spaltstelle und der SmaI- Spaltstelle) durch die codierende Sequenz eines Hygromycin-Resistenz Gens ersetzt ist. Dies wird (siehe Fig. 13) durch Spalten des Plasmids pSV2911neo an dessen einzigartiger SmaI-Spaltstelle, Ligieren eines BglII-Linker (CAGATCTG) an die DNA, gefolgt von einer Spaltung mit BglII durchgeführt. Das so erhaltene große DNA-Fragment, das aus dem Vektor minus der neocodierenden Sequenz besteht, wird auf einem Agarosegel gereinigt und an das kleine BamHI-Fragment aus dem Plasmid pLG89 [L. Gritz et al., Gene 25, 179-188 (1983)], das ebenfalls auf einem Agarosegel gereinigt worden war, ligiert, was zu den Plasmiden pCGA25c und pCGA25d führt, die das Hygromycinphosphotransferasegen in der Sense- bzw. Antisense-Orientierung enthalten. Bei Transfektion in CHO-DUKXB1-Zellen unter Standardbedingungen (siehe Beispiel 16), ergibt pCGA25c 60 Kolonien/µg DNA, die gegen 0,2 µg/ml Hygromycin-B resistent sind, einer Konzentration, die CHO-Zellen, die ein Plasmid, das keine Hygromycin-B-Resistenz codiert, enthalten, beispielsweise pCGA28, abtötet. In pCGA25c sind die Sequenzen, die Hygromycin-Resistenz codieren, so lokalisiert, daß sie in E. coli von dem Tn5-Promotor (der in dem Transposon Tn5 das Kanamycin-Resistenzgen transkribiert) transkribiert werden. So erreicht eine 2,5-ml-Kultur in Luria-Brühe (LB), die 40 mg/l Hygromycin-B enthält und mit 0,05 ml einer über Nacht, d.h. einer gesättigten E. coli-DH1-Bakterienkultur (gezüchtet unter 50 mg/l Ampicillin-Selektion) inokuliert worden war, nach 3 Stunden belüfteter Kultur bei 37ºC eine mindestens zehnfach höhere Bakteriendichte als wenn Bakterien in Plasmiden, die kein Hygromycingen enthalten, das in E. coli funktionell ist, wie pCGA25d, pCGA28 oder pAT153 [A.J. Twigg et al., Nature 283, 215-218 (1980)] getestet werden. Die Funktionalität des Hygromycin-B-Resistenzgens, sowohl in tierischen Gewebskulturzellen als auch in E. coli, erleichtert stark die Verwendung des Plasmids pCGA25c und seiner Derivate. Das Plasmid pCGA42 wird dann durch Insertieren des BamHI- Fragments aus pCGA28, das die MCMV/t-PA/Globinkassette enthält, in pCGA25c konstruiert. Dessen Verwendung dient der Überführung des t-PA-exprimierenden Gens in Zellen, die nicht zu einer Geneticin-Resistenz transformiert werden können oder die bereits Geneticin-resistent sind. Ebenso kann pCGA42 sein Hygromycingen in E. coli exprimieren, wodurch pCGA42, das E. coli-DHL enthält, zu Dichten wachsen kann, die mindestens zehnmal höher sind, als beispielsweise die von pCGA28-enthaltendem E. coli, bei Testung, wie vorstehend, beschrieben.
Das Plasmid pCGA28 enthält zwei SacI-Spaltstellen, wobei eine ursprünglich Teil eines Linkers genau hinter dem MCMV-Promotor ist, die andere sich in der t-PA-cDNA befindet. Die Sequenz zwischen den SacI-Spaltstellen wird deletiert, indem man zuerst mit dem Restriktionsenzym spaltet, das große Fragment über ein Agarosegel reinigt und diese lineare DNA unter Verwendung von T&sub4;-DNA-Ligase zirkularisiert, wobei das Plasmid pCGA44 gebildet wird (siehe Fig. 12). Jede cDNA, die in der richtigen Orientierung in die nun einzigartige SacI-Spaltstelle von pCGA44 doniert wird, ersetzt effektiv die t-PA-codierende Sequenz in pCGA44 und wird effizient exprimiert.
pCGA42d wird von pCGA42 durch Deletieren des 1,4 kb großen SacI-Fragments (siehe Fig. 13) abgeleitet. In die nun einzigartige SacI-Spaltstelle können andere cDNAs als die t- PA-cDNA, insertiert werden und in großen Mengen in Gewebskulturzellen exprimiert werden.

Beispiel 5: Insertion von u-PA, t-PA und hybriden PA-cDNAs in den Expressionsvektor pCGA28

A) Insertion von t-PA-cDNA (siehe Fig. 15)

Bei dieser Konstruktion wird das t-PA-cDNA-Fragment aus dem Plasmid ph tPAΔScaI in pCGA28 insertiert. Diese Konstruktion gilt als notwendig, um als Kontrolle für alle Veränderungen zu dienen, die unabsichtlich während der Neustrukturierung der ScaI-Spaltstelle eingetreten sein könnten. Das 1,4 kb große SacI-Fragment wird aus dem Plasmid ph PAΔScaI nach Spaltung mit SacI isoliert. Der Expressionsvektor pCGA28 wird mit SacIgespalten und das 8,2 kb große Vektorfragment wird isoliert und in einem 100-µl- Reaktionsgemisch aus 0,1 mM Tris pH 8,0, 0,1% SDS und 0,02 Einheiten bakterieller alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Nach dreißigminütiger Inkubation bei 60ºC wird der Reaktionsansatz mit Phenol und Ether zweimal extrahiert und dann mit Ethanol gefällt. Das Pellet wird in Wasser aufgelöst und ein Aliquot davon wird zur Ligierung an das 1,4-kb-SacI-Fragment aus ph tPAΔScaI verwendet. Das Ligierungsgemisch wird zur Transformation von E. coli- HB101 verwendet und Minilysat-DNA, hergestellt aus Ampicillin-resistenten Kolonien, wird mit dem geeigneten Restriktionsenzymen gespalten, um festzustellen, ob die SacI-Insertion in der gewünschten Orientierung vorliegt. Dieses Plasmid mit der gewünschten Orientierung wird als pBR1A bezeichnet. Das Plasmid mit dem SacI-Fragment in der entgegengesetzten Orientierung wird als pBR1B bezeichnet.

B) Insertion von hybrider UPAATPAB-cDNA (siehe Fig. 16)

Bei dieser Konstruktion wird das hybride UPAATPAB-cDNA- Fragment aus dem Plasmid pUNC.tc in den Expressionsvektor pCGA28 insertiert. pUNC.tc-DNA wird mit SmaI (siehe Fig. 7) gespalten, das 1,24-kb-Fragment wird isoliert und an mit SacI gespaltener dephosphorylierter 8,2-kb-pCGA28-Vektor-DNA ligiert. E. coli-Hb101-Zellen werden mit dem Ligierungsgemisch transformiert und Kolonien, die die SacI- Insertion in der gewünschten Orientierung enthalten, werden durch Durchführen von Restriktionsspaltungen an der Minilysat-DNA identifiziert. Das Plasmid mit der pUNC.tc- DNA-Insertion in der gewünschten Orientierung wird als pBR2A bezeichnet und das mit der entgegengesetzten Orientierung wird als pBR2B bezeichnet.

C) Insertion von u-PA-cDNA (siehe Fig. 17)

Bei dieser Konstruktion wird menschliche u-PA-DNA in den Expressionsvektor pCGA28 insertiert und zusammen mit pBR1 dient dieses Plasmid als Stammplasmid zur Kontrolle und bestätigt die Nützlichkeit von Vektoren vom pCGA28-Typ. Das Plasmid pcUK176 wird mit SmaI, Ahalil (vgl. Fig. 4) gespalten, das 2,25-kb-Fragment wird isoliert und an den phosphorylierten SacI-Linker, wie vorstehend beschrieben, ligiert. Nach der SacI-Spaltung wird das 2,25-kb-Fragment isoliert und an das SacI-gespaltene dephosphorylierte 8,2- kb-pCGA28-DNA-Fragment ligiert. E. coli-HB101 wird transformiert und Kolonien, die das gewünschte Plasmid beherbergen, werden durch Spalten der Minilysat-DNA mit Restriktionsenzymen identifiziert. Das Plasmid mit der menschlichen u-PA-DNA in der korrekten Orientierung wird als pBR23A bezeichnet und das mit der entgegengesetzten Orientierung als pBR3B bezeichnet.

D) Insertion von hybrider TPAAUPAB-cDNA (Fig. 18)

Hier wird die hybride TPAAUPAB-cDNA aus dem Plasmid ptNC.UC in den Expressionsvektor pCGA28 insertiert. Das 2,75-kb- SmaI- (in dem Vektor vorhanden), AhaIII-Fragment wird aus der ptNC.UC-DNA isoliert, an einen phosphorylierten SacI- Linker ligiert, das linkerligierte 2,75-kb-Fragment isoliert und an SacI gespaltene dephosphorylierte Vektor-DNA ligiert und die gewünschten Kolonien werden, wie vorstehend beschrieben, identifiziert. Das Plasmid mit der ptNC.UC-DNA-Insertion in der korrekten Orientierung wird als pBR4A bezeichnet.

Beispiel 6: Konstruktion eines Hefeexpressionsvektors, der den PHO5-Promotor, die Invertase-Signalsequenz und die t- PA-codierende Region enthält

A) Synthese von Oligodesoxyribonukleotiden für die Invertase-Signalsequenz

Vier Oligodesoxyribonukleotide: I-1, I-2, I-3, I-4 werden mit einem DNA-Synthesegerät (Modell 380B Applied Biosystems) synthetisiert. Nach Deblockieren werden die synthetischen Fragmente auf einem 12%igen Polyacrylamidgel, das 8 M Harnstoff enthält, gereinigt. Salzfreie reine Oligodesoxyribonukleotide werden unter Verwendung von Sep.Pak (Water Associates) erhalten. Diese Fragmente bilden eine Duplex, die die Invertase-Signalsequenz mit den häufig verwendeten Hefecodons codiert.

B) Subclonieren der Invertase-Signalsequenz in das Plasmid p31

a) Herstellen des Vektors:

1,5 µg p31R/SS-tPA 2 (Europäische Patentanmeldung Nr. 143 081) werden mit 10 E EcoRI (Boehringer) in 50 µl 10 mM Tris.Hcl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol für eine Stunde bei 37ºC gespalten. Nach Zugabe von 1 µl 2,5 M NaCl werden 10 E XhoI (Boehringer) zugesetit und es wird eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Der 4,2-kb-Vektor wird auf einem 0,8%igen präparativen Agarosegel isoliert. Die Gelscheibe wird in ein Micro-Colloidor-Röhrchen (Sartonus Gmbh) überführt, mit 200 µl TE bedeckt und elektrisch eluiert (Durchführen der Elektrophorese bei 90 mA für 50 Minuten). Die TE-Lösung wird gewonnen und in 2,5 Volumina absolutem Ethanol nach Zugabe von 0,1 Volumen 10 x TNE ausgefällt. Das DNA-Pellet wird mit kaltem 80%igern Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die DNA wird in 6 µl TE (40 pmol/µl) resuspendiert.

b) Assoziieren der Oligodesoxyribonukleotide (I-1, I-2, I- 3, I-4). Kinasierung und Ligierung mit dem Vektor

Eine Lösung, die 10 pmol jedes der vier Desoxyribonukleotide in 10 µl 0,5 M Tris.HCl pH 8 enthält, wird 5 Minuten lang bei 95ºC auf einem Wasserbad inkubiert. Das Wasserbad wird langsam auf 30ºC im Verlauf von 5 Stunden abgekühlt. Dieses assozuerte Gemisch wird mit 2 µl jeweils an 0,1 M MgCl&sub2;, 0,1 M NaCl, 30 mM DTT, 4 mM ATP und 8 E (1 µl) Polynukleotidkinase (Boehringer) versetzt. Die Kinasierungsreaktion wird eine Stunde lang bei 37ºC durchgeführt. Die assoziierten kinasierten Oligodesoxyribonukleotide und 60 pmol p31R/SS-TPAΔ2-gespaltener Vektor (1,5 µl) werden mit 400 E (1 µl) T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs) bei 14ºC 17 Stunden lang ligiert. Die Reaktion wird durch zehnminütige Inkubation bei 65ºC gestoppt. 10 µl dieses Ligierungsgemisches werden zur Transformation von E. coli-HB101-Ca&spplus;&spplus;-Zellen [M. Dagert und S.D. Ehrlich, Gene 56, 23-28 (1979)] verwendet. 20 ampR-Kolonien werden aufgenommen. Die DNA wird durch das rasche Isolierungsverfahren [D.S. Holmes und M. Quigley, Anal. Biochem. 114, 193-197 (1981)] hergestellt. Die DNA wird mit EcoRI und XhoI gespalten, radioaktiv am EcoRI-Ende markiert und auf einem 6%igen Polyacrylamidgel, das 8 M Harnstoff enthält, unter Verwendung von radioaktiv markierter HaeIII-gespaltener pBR322-DNA als Marker analysiert. Banden der korrekten Größe werden für die DNA, die aus all den 20 Clonen erhalten wurde, beobachtet. Ein Clon wird in 100 ml LB-Medium, das 100 µg/ml Ampicillin enthält, angezüchtet. Die Plasmid-DNA wird isoliert und als p31RIT-12 bezeichnet.

C) Konstruktion von pJDB207/PHO5-I-TPA (siehe Fig. 19)

a) Herstellen des Vektors:

Drei µg pJDB207/PHO5-TPA18 (Europäische Patentanmeldung Nr. 143 081) werden eine Stunde lang bei 37ºC mit 10 E BamHI in 50 µl 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol, inkubiert. Ein Aliquot wird auf einem 1%igen Agarosegel in TBE-Puffer überprüft, um die vollständige Spaltung zu bestätigen. Der Spaltansatz wird 10 Minuten lang bei 65ºC inkubiert. Dann werden 0,5 µl 5 M NaCl zugesetzt und anschließend 15 E XhoI (Boehringer) zugesetzt. Dieses Gemisch wird eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Der 6,8-kb-Vektor wird auf einem präparativen 0,8%igen Agarosegel isoliert. Die DNA wird durch Elektroelution extrahiert und nach Fällung in TE aufgelöst.

b) XhoI-Spaltung von p31/PHO5-TPA18:

Dreißig µg von p31/PHO5-TPA18 (Europäische Patentanmeldung Nr. 143 081) werden eine Stunde lang bei 37ºC mit 60 E XhoI (15 E/µl) in 200 µl 10 mM Tris.HCl pH 8, 6 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol, inkubiert, mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform extrahiert und in Ethanol ausgefällt.

c) Teilspaltung mit PstI des XhoI-gespaltenen p31(PHO5- TPA18

Die ausgefällte XhoI-gespaltene p31/PHO5-TPA18-DNA wird in 25 µl 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol, 2,5 mg Ethidiumbromid, resuspendiert, 35 Minuten lang bei 37ºC mit 22,5 E PstI inkubiert und mit einem gleichen Volumen an Phenol extrahiert und anschließend mit einem gleichen Volumen an Chloroform/Isoamylalkohol (50:1) extrahiert. Das 1,6-kb-Fragment wird auf einem präparativen l%igen Agarosegel isoliert. Die DNA wird durch Elektroelution extrahiert und ausgefällt [Insertion 1].

d) SalI-XhoI-Spaltung von p31RIT-12:

Dreißig µg p31RIT-12 werden bei 37ºC eine Stunde lang mit 60 E SalI (Boehringer 12 E/µl) und 60 E XhoI (15 E/µl) in 200 µl 10 mM Tris.HCl pH 8, 6 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol, inkubiert, mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform extrahiert und in Ethanol ausgefällt. Das 869-bp-Fragment wird auf einem 1,2%igen präparativen Agarosegel isoliert. Die DNA wird durch Elektroelution extrahiert, über DE-52 entsalzt und in Ethanol gefällt.

e) HgaI-Spaltung von SalI-XhoI-gespaltenem p31RIT-12

Das SalI-XhoI-gespaltene p31RIT-12 wird in 100 µl 6 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 1 mM Dithiothreit, 10 mg Rinderserumalbumin, resuspendiert und eine Stunde lang bei 37ºC mit 6 E HgaI (Biolabs, 0,5 E/µl) inkubiert. Das 600-bp-Fragment wird auf einem 1,2%igen Agarosegel isoliert. Die DNA wird durch Elektroelution extrahiert und in Ethanol gefällt.

f) Assoziieren der Linker-Oligonukleotide

90 pmol der zwei Oligodesoxyribonukleotide mit der Sequenz
werden in 10 µl 0,5 mM Tris.HCl pH 8 in einem silikonisierten Eppendorf-Röhrchen suspendiert. Die Lösung wird 5 Minuten lang bei 95ºC inkubiert und dann langsam über Nacht auf Raumtemperatur abgekühlt.

g) Kinasierung des Linkers

Die vorstehende Lösung wird mit 2 µl 0,1 M KCl, 2 µl 0,1 M MgCl&sub2;, 3 µl 30 mM DTT, 1 µl 200 mM ATP, 8 E Polynukleotid (8 E/µl) versetzt. Dieses Gemisch wird eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert.

h) Ligierung des HgaI-Fragments aus p31RIT-12 mit dem kinasierten Linker

Die kinasierte Linkerlösung wird in ein Röhrchen, das das trockene HgaI-Fragment enthält, gegeben und 400 E T&sub4;-DNA- Ligase werden dann zugesetzt. Die Lösung wird bei Raumtemperatur (21-22ºC) 90 Minuten lang inkubiert, auf 100 µl mit TE verdünnt und mit einem gleichen Volumen Phenol- Chloroform extrahiert. Das Fragment wird durch Zugabe von 0,6 Volumina Isopropanol und 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat bei Raumtemperatur zu der wäßrigen Lösung ausgefällt.

i) BamHI-PstI-Spaltung des vorstehenden Produkts

Die vorstehende trockene DNA wird mit 10 E BamHI und 10 E PstI in 20 µl 10 mM Tris.HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2;, 6 mM Mercaptoethanol eine Stunde lang bei 37ºC gespalten. Nach Verdünnen auf 100 µl wird die Lösung mit einem gleichen Volumen Phenol-Chloroform extrahiert und die wäßrige Schicht wird in Isopropanol ausgefällt [Insertion 2].

j) Ligierung der drei Fragmente

100 fmol pJDB207/PHO5-TPA18 BamHI-XhoI-gespaltenes Vektorfragment, 200 fmol jedes der anderen zwei Insertionsfragmente [1 und 2] werden in 10 µl 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 µg Gelatine mit 400 E T&sub4;-DNA-Ligase 16 Stunden lang bei 15ºC ligiert. Die Reaktion wird durch zehnminütige Inkubation bei 65ºC gestoppt. 5 µl dieses Ligierungsgemisches werden zur Transformation von E. coli-HB101-Ca&spplus;&spplus;-Zellen verwendet. 10 ampR-Kolonien werden aufgenommen und die DNA wird nach dem raschen Isolierungsverfahren präpariert. Bei Analyse mit EcoRI, PstI und BamHI-HindIII werden Fragmente mit korrekter Größe beobachtet. Ein Clon wird in 100 ml LB-Medium, das 100 µg/ml Ampicillin enthält, angezüchtet. Die Plasmid-DNA wird isoliert und wird als pJDB 207/PHO5-I-TPA bezeichnet.

Beispiel 7: Konstruktion des Plasmids pCS16/uPA, umfassend die u-PA-codierende Region

A) Konstruktion des Plasmids pCS16 (siehe Fig. 20)

Ein 1,5 kb großes PstI-BamHI-Fragment des Plasmids pUN121 [B. Nilsson et al., Nucl. Acids Res. 11, 8019-8030 (1983)], umfassend das cI-Gen des Lambda-Phagen und einen Teil des Tetracyclin-Resistenz Gens, wird in pUC18 [J. Norrander et al., Gene 26, 101-106 (1983)] doniert, das mit PstI und BamHI gespalten war. Der so erhaltene Clon wird mit PstI gespalten. Die 3'-überstehenden Enden werden in einer Reaktion mit T&sub4;-DNA-Polymerase entfernt und XhoI- Linker werden an die glatten Enden ligiert. Nach Spaltung mit XhoI wird das Molekül durch Ligierung rezirkularisiert. Ein Aliquot des Ligierungsgemisches wird zur Transformation von Ca&spplus;&spplus;-behandeltem E. coli-HB101-Zellen verwendet. Die DNA der einzelnen Ampicillin-resistenten transformierten Kolonien wird analysiert. Einer von mehreren korrekten donen wird ausgewählt und als pCS16 bezeichnet.

B) Konstruktion des Plasmids pCS16/uPA (siehe Fig. 21)

Die Urokinase-cDNA, die in Plasmid pcUK176 enthalten ist (siehe Beispiel 2), wird in das Plasmid pCS16 subcloniert. Die subclonierte cDNA erstreckt sich von der SmaI-Spaltstelle in der 5'-nicht-translatierten Region (Fig. 4) bis in der 3'-nicht-translatierten Region (Zählung gemäß Fig. 3)
15 µg des Plasmids pcUK176 werden mit PvuII gespalten. Das 379-bp-PvuII-Fragment wird aus anderen Fragmenten auf einem 1,5%igen Agarosegel in Tris-Borat-EDTA-Puffer pH 8,3 isoliert. Die DNA wird elektrisch eluiert, mit einer DE52- (Whatman)-Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt und in Ethanol gefällt. 1,2 µg einzelsträngige XhoI-Linker (5'- CCTCGAGG-3') werden an ihren 3'-Enden phosphoryliert, 10 Minuten lang auf 75ºC erhitzt, während des Abkühlens auf Raumtemperatur selbst assoziiert und bei -20ºC gelagert. 0,9 µg kinasierte doppeisträngige XhoI-Linker werden in einem 80fachen molaren Überschuß an die glatten Enden des 379-bp-PvuII-Fragments von pcUK176 (siehe vorstehend) in 20 µl 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP und 400 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs) bei 15ºC für 16 Stunden ligiert. Das Gemisch wird 10 Minuten lang auf 85ºC erhitzt. Überschüssige Linkermoleküle werden durch Fällen mit 0,54 Volumina Isopropanol in Gegenwart von 10 mM EDTA und 300 mM Natriumacetat pH 6,0 für 30 Minuten bei Raumtemperatur entfernt. Die DNA wird mit XhoI und BamHI gespalten. Ein 121-bp-BamHI-XhoI-Fragment wird auf einem 1,5%igen Agarosegel in Tris-Borat-EDTA-Puffer pH 8,3 isoliert. 6 µg des Plasmids pcUK176 werden mit SmaI und BamHI gespalten. Ein 1,3-kb-SmaI-BamHI-Fragment, umfassend den Hauptteil der u-PA-codierenden Sequenz, wird isoliert. 6 µg des Plasmids pCS16 werden mit SmaI und XhoI gespalten. Das 2,7-kb-Vektorfragment wird isoliert. Die DNA-Fragmente werden aus dem Gel elektrisch eluiert und mit Ethanol gefällt. 0,2 pmol des 1,3-kb-SmaI-BamHI-Fragments, 0,2 pmol des 121-bp-BamHI-XhoI-Fragments (beide Fragmente zusammen umfassen die volle u-PA-codierende Sequenz) und 0,1 pmol des 2,7-kb-Vektorfragments werden in 10 µl 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP und 400 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase bei 15ºC ligiert. Ein- und 3 µl-Aliquote des Ligierungsgemisches werden zu 100 µl Ca&spplus;&spplus;-behandeltem E. coli-HB101-Zellen gegeben. Die Transformation wird wie beschrieben [A. Hinnen et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)] durchgeführt. 12 Ampicillin-resistente Kolonien werden in LB-Medium, das 100 mg/l Ampicillin enthält, angezüchtet. Die DNA wird gemäß Holmes et al. [Anal. Biochern. 114, 193 (1981)] isoliert und durch EcoRI-, PvuII- und XhoI-Restriktionsspaltung isoliert. Ein Clon mit den erwarteten Restriktionsfragmenten wird als pCS16/UPA bezeichnet.

Beispiel 8: Konstruktion des Plasmids pJDB207/PHO5-I-UPA (Fig. 22)

pJDB207/PHO5-I-UPA enthält den PHO5-Promotor, die Invertase-Signalsequenz, die codierende Sequenz reifer Urokinase und den PHO5-Transkriptionsterminator in tandemartiger Anordnung, doniert in den pJDB207-Hefeexpressionsvektor.
20 µg des Plasmids pCS16/uPA werden vollständig mit 40 Einheiten EcoRI gespalten. Nach Phenolextraktion und Ethanolfällung wird die EcoRI-gespaltene DNA weiter durch TaqI bei 65ºC gespalten. Die so erhaltenen Fragmente werden auf einem präparativen 1,2%igen Agarosegel getrennt. Das 426- bp-TaqI-EcoRI-Fragment wird durch Elektroelution aus dem Gel und Ethanolfällung isoliert.
Ein Oligodesoxyribonukleotid-Linker der Formel
wird an die TaqI-Spaltstelle des DNA-Fragments ligiert. Der Linker stellt das 5'-Ende der codierenden Sequenz reifer u-PA (Nukleotide 130-154, Fig. 3) wieder her und ergibt die Fusion im Leseraster an die Invertase-Signalsequenz. Die 5'-CTCGA-Sequenz des Linker füllt das entsprechende 3'-zurückgespaltene Ende der Invertase-Signalsequenz, das durch HgaI-Spaltung erzeugt wurde, auf.
300 pmol jeweils der Oligodesoxyribonukleotide I und II werden phosphoryliert und assoziiert. 5,25 µg (600 pmol) phosphorylierte doppelsträngige Linker-DNA werden an 1,7 µg (5,6 pmol) des 462-bp-TaqI-EcoRI-Fragments (siehe vorstehend) in 175 µl 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 JUM MgCl&sub2;, 1 mM ATP, 5 mM DTT und 800 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase bei 15ºC für 16 Stunden ligiert. T&sub4;-DNA-Ligase wird 10 Minuten bei 85ºC inaktiviert. Der Überschuß der Linker wird durch Fällen in Gegenwart von 10 mM EDTA, 300 mM Natriumacetat pH 6,0 und 0,54 Volumina Isopropanol entfernt. Die DNA wird mit PstI gespalten. Ein einzigartiges 312-bp-Fragment wird isoliert, das den Linker in Bindung an DNA-Sequenzen, die u-PA codieren, bis zu Nukleotid 436 (PstI-Spaltstelle, siehe Fig. 3) enthält. Das DNA-Fragment wird durch Elektroelution und Fällung mit Ethanol gereinigt.
Das Plasmid pCS16/uPA wird mit XhoI und PstI gespalten. Ein 1007-bp-PstI-XhoI-Fragment wird isoliert und gereinigt. Dieses Fragment enthält den Hauptteil der codierenden Sequenz für die Urokinase.
Das Plasmid p31RIT-12 (siehe Beispiel 68) wird mit SalI und XhoI gespalten. Ein 882-bp-SalI-XhoI-Fragment wird aus dem Gel durch Elektroelution und Ethanolfällung isoliert. Das Fragment wird weiter mit BamHI und HgaI gespalten. Ein 591-bp-BamHI-HgaI-Fragment wird isoliert und enthält die PHO5-Promotorregion und die Invertase-Signalsequenz.
Das Plasmid pJDB207/PHO5-TPA18 (siehe Europäische Patentanmeldung Nr. 143 081) wird mit BamHI und XhoI gespalten. Das 6,8-kb-Vektorfragment wird auf einem präparativen 0,6%igen Agarosegel in Tris-Acetatpuffer pH 8,2 isoliert. Die DNA wird elektrisch eluiert und mit Ethanol gefällt.
Alle DNA-Fragmente werden in H&sub2;O in einer Konzentration von 0,1 pmol/µl resuspendiert. 0,2 pmol des 591-bp-BamHI- HgaI-Fragments, 0,2 pmol des 312-bp-HgaI-PstI-Fragments, 0,2 pmol des 1007-bp-PstI-XhoI-Fragments und 0,1 pmol des 6,8-kb-BamHI-XhoI-Vektorfragments werden 15 Stunden lang bei 15ºC in 10 µl 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 1 mM ATP und 400 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase ligiert. Ein µl des Ligierungsgemisches wird zur Transformation von E. coli-HB101-Ca&spplus;&spplus;-Zellen verwendet. 12 ampR-Kolonien werden aufgenommen und in LB-Medium, das 100 mg/l Ampicillin enthält, gezüchtet. Die DNA wird nach dem raschen Isolierungsverfahren [D.S. Holmes et al. Anal. Biochem. 114, 193 (1981)] präpariert. Nach Restriktionsspaltungen der Plasmid-DNA mit HindIII und EcoRI werden die erwarteten Restriktionsfragmente beobachtet. Die Plasmid-DNA eines einzelnen Clons wird ausgewählt und als pJDB207/PHO5-I-UPA bezeichnet.

Beispiel 9: Ein hybrider t-PA/u-PA-Plasminogenaktivator mit den t-PA-A-Ketten-Domänen und der u-PA-B-Kette (primäre DNA-Konstruktion

Eine weitere Variante zur Konstruktion einer Fusion im Leseraster der DNA-Sequenzen, die die A-Kette von t-PA und die B-Kette von u-PA in einer bestimmten Position codieren, besteht aus zwei Stufen. Zuerst werden geeignete Restriktionsfragmente mit den codierenden Sequenzen ligiert. Die DNA wird in E. coli präpariert und in M13 subcloniert, um einzelsträngige Matrizen zu erhalten. In einer zweiten Stufe werden überschüssige Nukleotidsequenzen durch in-vitro-Mutagenese entfernt. Die exakte Verbindung im Leseraster zwischen der t-PA-A-Kette und der u-PA-B-Kette befindet sich an der Aktivierungsstelle. Die mutierte DNA wird in einen geeigneten Expressionsvektor für Hefe und Säugerzellinien subcloniert.

a) Isolierung eines DNA-Fragments, das die t-PA-A-Kette codiert:

10 µg des Plasmids pJDB207/PHO5-I-TPA (siehe Beispiel 6) werden mit BamHI und PvuII gespalten. Das 1,7-kb-BamHI- PvuII-Fragment wird auf einem 0,8%igen Agarosegel in Tris- Borat-EDTA-Puffer pH 8,3 getrennt. Das DNA-Fragment enthält den PHO5-Promotor, die Invertase-Signalsequenz und die codierende Sequenz von reifer t-PA bis zu der PvuII- Restriktionsspaltstelle [vgl. Fig. 1; Nukleotidpositionen 1305-1310]. Die DNA wird elektrisch eluiert, mit Ethanol gefällt und in H&sub2;O in einer Konzentration von 0,1 pmol/µl resuspendiert.

b) Isolierung eines DNA-Fragments. das die u-PA-B-Kette codiert:

Das Plasmid pCS16/uPA (siehe Beispiel 78) wird mit BalI (vgl. die Fig. 3 und 4, Nukleotid-Positionen 573-578) und XhoI gespalten. Das 868-bp-BalI-XhoI-Fragment wird wie vorstehend isoliert und in H&sub2;O in einer Konzentration von 0,1 pmol/µl resuspendiert.

c) Ligierung der Fragmente an das Vektorfragment:

Das Plasmid pJDB207/PHO5-TPA18 (Europäische Patentanmeldung Nr. 143 081) wird mit BamHI und XhoI gespalten. Das 6,7-kb-Vektorfragment wird auf einem 0,8%igen Agarosegel in Tris-Acetatpuffer pH 8,2 isoliert. Die DNA wird elektrisch eluiert, mit Ethanol gefällt und in H&sub2;O in einer Konzentration von 0,1 pmol/µl resuspendiert.
0,2 pmol des 1,7-kb-BamHI-PvuII-Fragments, 0,2 pmol des 868-bp-BalI-XhoI-Fragments und 0,1 pmol des 6,7-kb-BamHI- XhoI-Vektorfragments werden in 10 µl 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP und 400 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs) bei 15ºC 16 Stunden lang ligiert. Ein- und 3-µl-Aliquote des Ligierungsgemisches werden zu 100 µl Ca&spplus;&spplus;-behandelten E. coli-HB101-Zellen gegeben. Die Transformation wird wie üblich durchgeführt.
Sechs transformierte Ampicillin-resistente Kolonien werden in LB-Medium, das 100 mg/l Ampicillin enthält, angezüchtet. Die Plasmid-DNA wird nach dem Verfahren von Holmes et al. [Analyt. Biochem. 114, 193 (1981)] hergestellt und durch Restriktionsspaltung mit BamHI und PstI gespalten. Ein Clon mit den erwarteten Restriktionsfragmenten wird als pJDB207/PHO5-I-TPAAUPAB bezeichnet.

Beispiel 10: Hybrider u-PA/t-PA-Plasminogenaktivator mit den u-PA-A-Ketten-Domänen und der t-PA-B-Kette (primäre DNA-Konstruktion

Die primäre hybride DNA-Konstruktion umfaßt die u-PA-Nukleotidsequenzen von der SmaI-Spaltstelle bis zu der EcoRI-Spaltstelle (siehe Fig. 4), geknüpft an die t-PA-Nukleotidsequenzen von der ScaI-Spaltstelle (Positionen 940- 945) bis zu der in Position 1800 über einen XhoI-Linker eingeführten XhoI-Spaltstelle. Die so erhaltene hybride DNA-Sequenz enthält zwei überschussige Nukleotide, die durch in-vitro-Mutagenese entfernt werden. Die exakte Verbindung im Leseraster zwischen der u-PA-A-Kette und der t- PA-B-Kette befindet sich an der Aktivierungsstelle.

a) Isolierung eines DNA-Fragments, das die u-PA-A-Kette codiert:

7 µg des Plasmids pCS16/UPA werden mit EcoRI gespalten. Die klebrigen Enden der so erhaltenen 3 Fragmente werden in glatte Enden durch eine Auffüllreaktion mit 7,5 Einheiten Klenow-DNA-Polymerase (BRL) in Anwesenheit von 60 mM Tris HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM dATP und 0,1 mM dTTP für 30 Minuten bei 25ºC umgewandelt. Die Reaktion wird durch die Zugabe von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 12,5 mM gestoppt. Die DNA wird weiter mit KpnI gespalten. Ein glattendiges 619-bp-KpnI-[EcoRI]-Fragment wird auf einem 1,5%igen Agarosegel in Tris-Borat-EDTA-Puffer pH 8,3 isoliert, elektrisch eluiert und mit Ethanol gefällt.

b) Isolierung eines DNA-Fragments, das die t-PA-B-Kette codiert:

6 µg des Plasmids pJDB207/PHO5-TPA18 werdem mit ScaI und XhoI gespalten. Ein 860-bp-Fragment wird auf einem 1,2%igen Agarosegel in Tris-Borat-EDTA-Puffer pH 8,3 isoliert, elektrisch eluiert und mit Ethanol gefällt.

c) Ligierung der DNA-Fragmente an einen von pUC18 abgeleiteten Vektor:

5 µg des Plasmids pCS16/UPA (siehe Beispiel 7) werden mit KpnI und XhoI gespalten. Das so erhaltene 2,7-kb-Fragment wird auf einem 0,8%igen Agarosegel in Tris-Borat-EDTA-Puffer pH 8,3 isoliert. Die DNA wird elektrisch eluiert und mit Ethanol gefällt. Alle DNA-Fragmente werden in einer Konzentration von 0,1 pmol/µl resuspendiert.
0,2 pmol des glattendigen 619-bp-Kpn-u-PA-Fragments, 0,2 pmol des 860-bp-ScaI-XhoI-t-PA-Fragments und 0,1 pmol des 2 17-kb-KpnI-XhoI-Vektorfragments werden, wie vorstehend beschrieben, ligiert (Beispiel 9). Ca&spplus;&spplus;-behandelte E. coli-HB101-Zellen werden transformiert. 12 transformierte Ampicillin-resistente Kolonien werden in LB-Medium, das mit Ampicillin supplementiert ist (100 mg/l), angezüchtet. Die DNA wird gemäß Holmes et al (a. a. O.) hergestellt und durch Restriktionsspaltung mit EcoRI und PstI analysiert. Ein einzelner Clon mit den erwarteten Restriktionsfragmenten wird als pCS16/UPAATPAB bezeichnet.

Beispiel 11: Hybrider u-PA/t-PA-Plasminogenaktivator mit der zweiten Kringle-Domäne und der katalvtischen B-Kette von t-PA (Primärkonstruktion)

Ein hybrides Plasminogenaktivatorgen, umfassend die DNA- Sequenz der "Wachstumsfaktorartigen" Urokinase-(U)-Domäne, die zweite Kringle-Domäne (K2) von t-PA und die katalytische B-Kette von t-PA, wird wie folgt konstruiert: zwei DNA-Restriktions fragmente, die die u-PA-Wachstumsfaktordomäne und die t-PA-K2-Kringle- bzw.-B-Kettendomäne codieren, werden ligiert und in das Plasmid pCS16 insertiert. Der so erhaltene don wird als pCS16/UK&sub2;TPAB bezeichnet. Ein Fragment, das die u-PA- und t-PA-codierenden Sequenzen enthält, wird in M13 subcloniert. Die in-vitro-Mutagenese wird an einem DNA-Einzelstrang durchgeführt, um überschüssigen DNA-Sequenzen an der Verbindung zwischen der u-PA- und der t-PA-Sequenz zu entfernen.
5 µg des Plasmids pCS16/UPA werden mit NcoI (Nukleotid-Positionen 326-331, siehe Fig. 4) gespalten. Die klebrigen Enden der Restriktionsfragmente werden in einer Reaktion mit 5 Einheiten Klenow-DNA-Polymerase I (BRL) in Gegenwart von 0,1 mM jeweils an dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 60 mM Tris HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2; in 50 µl 30 Minuten bei Raumtemperatur aufgefüllt. Die Reaktion wird durch Zugabe von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 12,5 mM gestoppt. Die DNA wird mit Ethanol gefällt und weiter mit XhoI gespalten. Das glattendige 3-kb-XhoI--Fragment wird auf einem 0,8%igen Agarosegel in Tris-Borat-EDTA pH 8,3 isoliert, elektrisch eluiert und mit Ethanol gefällt. Dieses Fragment enthält den pCS16-Vektor und die codierende Sequenz für die u-PA-Wachstumsfaktordomäne. 10 µg des Plasmids pJDB207/PHO5-TPA18 (Europäische Patentanmeldung Nr. 143 081) werden mit BstXI [Nukleotide-Positionen 577- 588] gespalten. Das lineare DNA-Fragment mit den 3'-überhängenden Enden wird mit 10 Einheiten T&sub4;-DNA-Polymerase (BRL) in 100 µl 33 mM Tris-Acetat pH 7,9, 66 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 0,5 mM DTT und 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin für 2,5 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Inkubation wird weitere 35 Minuten bei 37ºC in Gegenwart von 0,1 mM jeweils an dATP, dCTP, dTTP, dGTP in einem Gesamtvolumen von 200 µl fortgesetzt. Die DNA wird mit Ethanol gefällt und weiter mit XhoI gespalten. Das glattendige 1,2-kb-[BstXI]-XhoI-Fragment wird auf einem 0,8%igen Agarosegel getrennt, elektrisch eluiert und mit Ethanol gefällt. Diese Fragment enthält die codierende Sequenz für K2 und die B-Kette von t-PA.
0,2 pmol des 1,2-kb-t-PA-Fragments und 0,1 pmol des 3-kb- u-PA/Vektorfragments (siehe vorstehend) werden wie beschrieben ligiert. Aliquote des Ligierungsgemisches werden zur Transformation kompetenter E. coli-HB101-Zellen verwendet. Ampicillin-resistente Kolonien werden auf LB-Agarplatten, die 100 mg/l Ampicillin enthalten, selektioniert. DNA wird aus einzelnen Transformanten hergestellt und durch ScaI- und SmaI-Restriktionsspaltungen analysiert. Ein Clon, der die 0,5-kb-ScaI- und die 1,55-kb-SmaI-Verbindungsfragmente enthält, wird ausgewählt und als pCS16/UK&sub2;TPAB bezeichnet.

Beispiel 12: Hybrider t-PA/u-PA-Plasminogenaktivator mit der zweiten Kringle-Domäne von t-PA und der katalytischen B-Kette von u-PA (Primärkonstruktion)

Ein hybrides Plasminogenaktivatorgen, umfassend die DNA- Sequenz der "wachstumsfaktorartigen" Urokinase-(U)-Domäne, die zweite Kringle-Domäne (K2) von t-PA und die katalytische B-Kette von u-PA wird nach einem Verfahren, das dem in Beispiel 11 analog ist, konstruiert.

Konstruktion des Plasmids pCS16/UK&sub2;UPAB:

5 µg des Plasmids pCS16/UPA werden mit BglII und NcoI (Nukleotid-Positionen 391-396 bzw. 326-331, siehe Fig. 4) gespalten. Die klebrigen Enden der Restriktionsfragmente werden in einer Reaktion mit Klenow-DNA-Polymerase I (BRL) wie vorstehend beschrieben, aufgefüllt. Das 4,2-kb-DNA- Fragment mit den glatten Enden wird auf einem 0,8%igen Agarosegel in Tris-Acetat-Puffer pH 8,2 isoliert. Die DNA wird elektrisch eluiert und mit Ethanol gefällt. Das Fragment enthält die u-PA-G-Domäne und u-PA-B-Kette in Bindung an das Vektormolekül.
10 µg des Plasmids p31/PHO5-TPA18 (Europäische Patentanmeldung Nr. 143 081) werden mit AluI gespalten. Ein 447- bp-AluI-Fragment, das die vollständige K2-Domäne von t-PA enthält, wird auf einem 1,5%igen Agarosegel in Tris-Borat- EDTA-Puffer pH 8,3 isoliert. Das DNA-Fragment wird elektrisch eluiert und mit Ethanol gefällt.
0,2 pmol des 447 bp langen Fragments und 0,1 pmol des 4,2 kb langen Fragments werden ligiert. Aliquote des Ligierungsgemisches werden zur Transformation kompetenter E. coli-HB101-Zellen verwendet. Die transformierten Zellen werden auf LB-Agarplatten mit 100 mg/l Ampicillin selektioniert. Die DNA wird aus Ampicillin-resistenten Zellen hergestellt und durch EcoRI- und ScaI-Spaltungen analysiert. Ein einzelner Clon, der ein 551-bp-EcoRI-Fragment und ein 403-bp-ScaI-Fragment zeigt, besitzt das AluI-Fragment insertiert in korrekter Orientierung. Dieser Clon wird als pCS16/UK&sub2;UPA bezeichnet.

Beispiel 13: Clonierung der primären Hybrid-DNA-Konstruktionen in M13mp18

A) Clonierung eines pJDB207/PHO5-I-TPAAUPA-BamHI-Fragments in M13mp18

1,5 µg von pJDB207/PHO5-I-TPAAUPAB (vgl. Beispiel 9), erhalten aus einer raschen DNA-Präparation, wird mit 9 E BamHI (Boehringer) in 20 µl 10 mM Tris HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol bei 37ºC eine Stunden lang gespalten. Nach Zugabe von 1 µl Rnase (Serva, 1 mg/ml), 15minütiger Inkubation bei 37ºC und Behandlung mit Phenol, wird die 2,5-kb-Insertion auf einem 0,8%igen präparativen Agarosegel isoliert. Die DNA wird durch Elektroelution extrahiert und ausgefällt.
1 µg M13mp18 (RF) wird mit BamHI gespalten, mit alkalischer Kälberdarmphosphatase behandelt, und das 7,3-kb-Vektorfragment wird auf einem präparativen 0,7%igen Agarosegel isoliert. Die DNA wird elektrisch eluiert und ausgefällt.
100 pmol BamHI-gespaltener M13mp18-Vektor und 200 pmol der BamHI-TPAAUPAB-Insertion werden in 10 µl 50 mM Tris HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 µg Gelatine mit 400 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase 7 Stunden lang bei 15ºC ligiert Nach lominütiger Inkubation bei 65ºC werden 5 µl dieses Ligierungsgemisches zur Transformation von kompetenten E. coli-JM101-Zellen gemäß dem Handbuch "M13-Cloning and Sequencing Handbook", veröffentlicht von Amersham, verwendet. 36 farblose Plaques werden aufgenommen und einzelsträngige und replikative Formen (RF) der DNA werden hergestellt. Gemäß Analyse der RF-DNA zeigen alle Clone Insertionen in korrekter Größe nach Spaltung mit BamHI. Fragmente mit korrekter Größe nach der Spaltung mit EcoRI und PstI zeigen an, daß DNA-Insertionen in allen Clonen in der falschen Orientierung vorliegen (einzelsträngige Matrizen-DNA ist der nicht-codierende Strang). Einer diese done wird als mp18/BamHI(TPAAUPAB bezeichnet und wird für die Deletionsmutagenese verwendet.

B. Clonierung eines pCS16/UPAATPAB-KpnI-HindIII-Fragments in M13mp18

1,5 µg pCS16/UPAATPAB (vgl. Beispiel 10), erhalten aus einer raschen DNA-Präparation, wird mit 12 E KpnI in 20 µl 10 mm Tris HCl pH 7,5, 6 mm MgCl&sub2;, 6 mm Mercaptoethanol bei 37ºC für eine Stunde gespalten. Nach Zugabe von 1 µl 1 M NaCl wird die DNA mit 12 E HindIII bei 37ºC für eine Stunde gespalten. Ein 1,5-kb-Fragment wird auf einem 0,8%igen präparativen Agarosegel isoliert. Die DNA wird mit Elektroelution extrahiert und ausgefällt.
0,5 µg M13mp18 (RF) wird mit KpnI und HindIII gespalten. Das 7,3-kb-Vektorfragment wird auf einem präparativen 0,7%igen Agarosegel isoliert. Die DNA wird elektrisch eluiert und ausgefällt.
100 fmol KpnI-HindIII-gespaltener M13mp18-Vektor und 200 fmol der KpnI-HindIII-Insertion werden in 10 µl 50 mm Tris HCl pH 7,5, 10 mm MgCl&sub2;, 10 mm DTT, 2 mm ATP, 0,5 µg Gelatine mit 400 E T&sub4;-DNA-Ligase für 7 Stunden bei 15ºC ligiert. Die Reaktion wird durch 10minütige Inkubation bei 65ºC gestoppt. 5 µl dieses Ligierungsgemisches werden zur Transformation von kompetenten E. coli-JM101-Zellen verwendet. Zehn farblose Plaques werden aufgenommen und die einzelsträngige und replikative Form (RF) der DNA wird hergestellt. Nach Analyse der RF-DNA zeigen alle Clone Insertionen korrekter Größe und Fragmente korrekter Größe.
Einer dieser Clone wird als mp18/KpnI-HindIII/UPAATPAB bezeichnet und wird zur Deletionsmutagenese verwendet.

C. Clonierung eines pSC16/UK²TPAB-KpnI-HindIII-Fragments in M13mp18

1,5 µg pCS16/UK&sub2;TPAB (vgl. Beispiel 11), erhalten aus einer raschen DNA-Präparation, wird mit 12 E KpnI (Boehringer) in 20 µl 10 mM Tris HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM Mercaptoethanol bei 37ºC für eine Stunde gespalten. Nach Zugabe von 1 ml 1 M NaCl wird die DNA mit 12 E HindIII bei 37ºC für eine Stunde gespalten. Ein 1,5-kb- Fragment wird auf einem präparativen 0,8%igen Agarosegel isoliert. Die DNA wird durch Elektroelution extrahiert und ausgefällt.
0,5 µg M13mp18 (RF) wird mit KpnI und HindIII gespalten. Das 7,3-kb-Vektorfragment wird auf einem präparativen 0,7%igen Agarosegel isoliert. Die DNA wird elektrisch eluiert und ausgefällt.
100 fmol KpnI-HindIII-gespaltener M13mp18-Vektor und 200 fmol der KpnI-HindIII-Insertion werden in 10 µl 50 mM Tris HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 µg Gelatine mit 400 E T&sub4;-DNA-Ligase für 7 Stunden bei 15ºC ligiert. Die Reaktion wird durch 10minütige Inkubation bei 65ºC gestoppt. 5 µl dieses Ligierungsgemisches werden zur Transformation von kompetenten E. coli-JM101-Zellen verwendet. Sieben farblose Plaques werden aufgenommen und die einzelsträngige und replikative Form (RF) der DNA wird hergestellt. Nach Analyse der RF-DNA zeigen alle Clone Insertionen korrekter Größe und Fragmente korrekter Größe. Einer dieser done wird als mp18/KpnI-HindIII/UK&sub2;TPAB bezeichnet und wird zur Deletionsmutagenese verwendet.

D. Clonierung eines pSC16/UK²TPAB-KpnI-HindIII-Fragments in M13mp18

1,5 µg pCS16/UK&sub2;UPAB (vgl. Beispiel 12), erhalten aus einem raschen DNA-Präparat, wird mit 12 E KpnI in 20 µl 10 mM Tris HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM Mercaptoethanol bei 37ºC für eine Stunde gespalten. Nach Zugabe von 1 µl 1 M NaCl wird die DNA mit 12 E HindIII bei 37ºC für eine Stunde gespalten. Ein 1,7-kb-Fragment wird auf einem präparativen 0,8%igen Agarosegel isoliert. Die DNA wird durch Elektroelution extrahiert und ausgefällt.
0,5 µg M13mp18 (RF) wird mit KpnI und HindIII gespalten. Das 7,3-kb-Vektorfragment wird auf einem präparativen 0,7%igen Agarosegel isoliert. Die DNA wird elektrisch eluiert und ausgefällt.
100 fmol KpnI-HindIII-gespaltener M13mp18-Vektor und 200 fmol der KpnI-HindIII-Insertion werden in 10 µl 50 mM Tris HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 µg Gelatine mit 400 E T&sub4;-DNA-Ligase für 7 Stunden bei 15ºC ligiert. Die Reaktion wird durch lominütige Inkubation bei 65ºC gestoppt. 5 µl dieses Ligierungsgemisches werden zur Transformation von kompetenten E. coli-JM101-Zellen verwendet. Zehn farblose Plaques werden aufgenommen, und die einzelstrangige und replikative Form (RF) der DNA wird hergestellt. Nach Analyse der RF-DNA zeigen alle Clone Insertionen korrekter Größe und Fragmente korrekter Größe. Einer dieser Clone wird als mp18/KpnI-HindIII/UK&sub2;UPAB bezeichnet und wird zur Deletionsmutagenese verwendet.

Beispiel 14: Deletionsmutagenese der primären Hybrid-DNA- Konstruktionen

A) Allgemeines Protokoll für die Deletionsmutagenese

a) Phosphorylierung des Mutagenese-Primers:

Für die Mutagenese werden 200 pmol des Mutagenese-Primers in 20 µl 50 mM Tris HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 0,1 mM Spermidin, 0,1 mM EDTA, enthaltend 1 µl 10 mM ATP, unter Verwendung von 8 E T&sub4;-Polynukleotidkinase (Boehringer, 8 E/µl) phosphoryliert. Nach einstündiger Inkubation bei 37ºC wird die Reaktion durch 10minütiges Erhitzen auf 65ºC gestoppt.
Für das Hybridisierungs-Screening werden 20 pmol des Mutagenese-Primers wie vorstehend unter Verwendung von 30 µCi γ³²P-ATP (3000 Ci-mmol; Amersham International) als alleinige Quelle für ATP phosphoryliert. Der Primer wird mit 3,5 ml 6 x SSC verdünnt und direkt als Sonde verwendet.

b) Assoziierung des Mutagenese-Primers und des universellen Sequenzier-Primers an eine einzelsträngige Matrize

0,2 pmol der einzelsträngigen Matrize werden mit 20 pmol des phosphorylierten Oligodesoxyribonukleotid-Mutagenese- Primers (10 pmol/µl) und 10 pmol des universellen M13-Sequenzier-Primers in 10 µl 20 mM Tris HCl pH 7,51 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 1 mM DTT bei 95ºC für 5 Minuten inkubiert. Die Lösung wird langsam auf Raumtemperatur im Verlauf von 30 Minuten abkühlen gelassen.

c) Extensionsligierungsreaktion

Das vorstehend assozuerte Gemisch wird mit 10 µl EnzymdTNP-(dATP, dGTP, dTTP, dCTP)-Lösung, enthaltend 1 µl Puffer (0,2 M Tris.HCl pH 7,5, 0,1 M MgCl&sub2;, 0,1 M DTT], 4µl 2,5 mM dNTP-Gemisch, 1 µl 10 mM ATP, 0,5 µl T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs, 400 E/µl), 0,67 µl Klenow-DNA-Polymerase (BRL, 299 E/µl) versetzt. Das Gemisch wird eine Stunde lang bei 15ºC inkubiert und dann 16 Stunden bei 8 bis 9ºC inkubiert. Die Reaktion wird durch 10minütiges Inkubieren bei 65ºC gestoppt.

d) Transformation des Ligierungsgemisches

Das Ligierungsgemisch wird 1:20 und 1:200 mit TE verdünnt, 1 µl und 5 µl jeder der verdünnten Lösungen werden zur Transformation von 0,2 ml eines Reparatur-Minus-Stammes von kompetenten E. coli-BMH-71-18mutS-Zellen (BMH71-18 (Δ(lac-proAB), thi, supE, F'laciq, ZΔM15, proA&spplus;B&spplus;] verwendet. Die Konstruktion von E. coli-BMH71-18mutS (BMH71-18, muts-215-::Tnio) ist in Kramer et al. [Cell 38, 879-887 (1984)] beschrieben. Nach der Transformation wird ein Zellrasen durch den Reparatur-+-Stamm von E. coli-JM101 bereitgestellt, um die Exposition des Phagen gegenüber dem Mutatorphänotyp des Reparatur-Minus-Stammes zu minimieren (P. Carter, H. Bedouelle und G. Winter, Nucl. Acids Res. 13, 4431-4443 (1985)].

e) Screening der Phagen

100 Plaques aus der transfizierten DNA werden mit einem Zahnstocher auf YT-Platten übertragen und als Kolonien von infizierten Bakterien 15 bis 18 Stunden lang gezüchtet. Das Kolonie-Blotting wurde nach Grunstein und Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961-3965 (1985)] angepaßt. Ein Nitrocellulosefilter (Millipore S.A., Cat. Nr. HAWP 090, Porengröße 0,45 µm) wird 10 Minuten lang auf die Kolonieplatte bei Raumtemperatur gegeben. Die Filter werden mit 0,5 N NaOH denaturiert, mit 1 M Tris.HCl pH 7,5 neutralisiert und dann mit einer stark salzhaltigen Lösung (0,5 M Tris HCl pH 715 + 1,5 M NaCl) behandelt. Die Filter werden 30 Minuten lang bei 80ºC im Vakuum gebacken, in 100 ml 10 x Denhardt-Lösung (D.T. Denhardt, Biochem. Biophys. Res. Commun. 23, 641-646), 6 x SSC und 0,2% SDS in einem versiegelbaren Plastikbeutel 15 Minuten lang prähybridisiert.
Für das Hybridisierungs-Screening werden die prähybridisierten Filter in 50 ml 6 x SSC 1 Minute gewaschen und dann mit 3,5 ml Sonde, enthaltenden ³²P-markiertem Mutagenese-Primer, 30 Minuten lang hybridisiert. Die hybridisierten Filter werden dreimal in 100 ml 6X SSC bei Raumtemperatur für insgesamt 2 Minuten gewaschen und dann autoradiographiert. Eine gute Unterscheidung zwischen den Wildtyp-Phagen und den mutierten Phagen wird durch eine kurze Waschung (5 Minuten) bei 60ºC in 100 ml 0,1 x SSC + 0,1% SDS erhalten.

f) Bestätigung der Deletionsmutation an aus der Hybridisierung erhaltenen Dositiven Clonen

Die Phagen aus den positiven Clonen werden mit einem Zahnstocher in 1 ml 2 x YT überführt, 20 Minuten lang auf 70ºC erhitzt, um die Bakterien abzutöten und dann werden 100 µl dieser Phagensuspension in 1,5 ml einer frisch wachsenden E. coli-JM101-Kultur (OD&sub6;&sub0;&sub0; - 0,45) inokuliert. Die Kulturen werden 4 Stunden lang bei 37ºC heftig geschüttelt (300 Upm) Eine Phagenstammlösung und die replikative Form der DNA aus den positiven Clonen werden hergestellt [J. Messing, Methods in Enzymology 101, 21-78 (1983)]. DNA aus den Mutanten (nach Deletionsmutagenese) wird mit geeigneten Restriktionsenzymen analysiert und mit den Restriktionsfragmenten einer Wildtyp-DNA (vor der Deletionsmutagenese) verglichen. Nach der Bestätigung durch Restriktionsanalyse wird DNA aus einer korrekten Mutante Plaque-gereinigt. Die Mutationen werden weiter durch Restriktionsanalyse und Sequenzieren unter Verwendung des Kettenterminationsverfahrens bestätigt [F. Sanger, S. Niclen und A.R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)].

B) Deletionsmutagenese an mp18/BamHI/TPAAUPAB (siehe Fig. 23

Die Deletionsmutagenese wird, wie in dem allgemeinen Protokoll beschrieben, durchgeführt. Aus der Hybridisierung erhaltene positive Clone werden durch Restriktionsanalyse bestätigt. 333 bp werden durch Deletionsmutagenese aus dem BamHI-Fragment entfernt. Die Restriktionsanalyse mit BamHI bestätigt das 2150-bp-Fragment. Eine weitere Restriktionsanalyse mit EcoRI ergibt 660-, 416-, 287-, 230-bp-Fragmente auf den Mutanten anstelle der beim Wildtyp beobachteten 660-, 472, 416- und 287-Fragmente. Die Analyse mit PstI zeigt zwei Fragmente mit einer Größe von 611 und 414 bp für die Mutanten. Die Wildtyp-DNA zeigt drei Fragmente zu 622, 611 und 414 bps. Ein mutierter Clon mit der korrekten Struktur wird als mp18/BamHI/MOTPAAUPAB bezeichnet.
Die DNA-Sequenz an der Verbindung zwischen der t-PA-A- Kette und der u-PA-B-Kette wird durch das Kettenterminations-Sequenzierverfahren mit einem Sequenzier-Primer der Sequenz 5'CAGAGCCCCCCCGGTGC 3' bestätigt. Dieser Primer ist dem codierenden Strang vom u-PA (682-666) komplementär.

C) Deletionsmutagenese an mp18/KpnI-HindIII/UPAATPAB (siehe Fig. 24)

Die Deletionsmutagenese wird, wie in dem allgemeinen Protokoll beschrieben, durchgeführt. Aus der Hybridisierung erhaltene positive Clone werden durch Restriktionsanalyse mit PstI bestätigt. In den Mutanten wird eine 467-bp- Bande, verglichen mit dem Wildtyp beobachtet, der ein 544- bp-Fragment ergibt. Ein mutierter Clon mit der korrekten Struktur wird als mp18/KpnI-HindIII/MOUPAATPAB bezeichnet. Die Deletion wird durch das Kettenterminations-Sequenzierverfahren unter Verwendung eines Sequenzier-Primers der Sequenz 5' CAAAGATGGCAGCCTGC 3' bestätigt. Dieser Primer ist dem codierenden Strang von t-PA komplementär (1062- 1046).

D) Deletionsmutagenese an mp18/KpnI-HindIII/UK&sub2;TPAB (siehe Fig. 25)

Die Deletionsmutagenese wird, wie in dem allgemeinen Protokoll beschrieben, durchgeführt. Aus der Hybridisierung erhaltene positive Clone werden durch Restriktionsanalyse mit KpnI-HindIII, EcoRI und PstI bestätigt. Die erhaltenen Fragmente sind
Eine Insertion korrekter Größe und Fragmente korrekter Größe werden für die Mutanten beobachtet. Ein mutierter Clon mit der korrekten Struktur wird als mp18/KpnI- HindIII/MOUK&sub2;TPAB bezeichnet. Die Deletion wird durch das Kettenterminations-Sequenzierverfahren unter Verwendung eines Sequenzier-Primers der Sequenz 5' CCCAGTGCCTGGGCACTGGGGTTCTGTGCTGTG 3' bestätigt. Dieser Primer ist dem codierenden Strang von t-PA komplementär (853-821).

E) Deletionsmutagenese an mp18/KpnI-HindIII/UK²UPAB (siehe Fig. 26

Zwei getrennte Deletionsmutationen sind an die Konstruktion von UK&sub2;UPAB beteiligt:
Die erste Deletionsmutagenese wird, wie in dem allgemeinen Protokoll beschrieben, durchgeführt. Aus der Hybridisierung erhaltene positive Clone werden durch Restriktionsanalyse mit EcoRI bestätigt. In den Mutanten werden 549-, 416-, 351-bp-Banden beobachtet, verglichen mit dem Wildtyp, der 549- 452- und 416-bp-Fragmente ergibt. Ein mutierter Clon mit der korrekten Struktur wird als mp18/KpnI-HindIII-MOUK&sub2;UPAB-1 bezeichnet. Die Deletion wird durch das Kettenterminations-Sequenzierverfahren unter Verwendung eines Sequenzier-Primers der Sequenz 5' CCCAGTGCCTGGGCACTGGGGTTCTGTGCTGTG 3' bestätigt. Der Primer ist dem codierenden Strang von t-PA (853-821) komplementär.
In der zweiten Stufe der Deletionsmutagenese wird eine Deletion gleichzeitig mit der Einschleusung einer Punktmutation vorgenommen. Die Deletionsmutagenese wird, wie in dem allgemeinen Protokoll beschrieben, durchgeführt. Aus der Hybridisierung erhaltene positive Clone werden durch Restriktionsanalyse mit EcoRI bestätigt. In den Mutanten werden 416-, 351-, 259-bp-Banden beobachtet, verglichen mit dem Wildtyp, der 549-, 416- und 351-bp-Fragmente ergibt. Ein mutierter Clon mit der korrekten Struktur wird als mp18/KpnI-HindIII/MOUK&sub2;UPAB bezeichnet. Die Deletion wird durch das Kettenterminations-Sequenzierverfahren unter Verwendung eines Sequenzier-Primers der Sequenz 5' CAGAGCCCCCCCGGTGC 3' bestätigt. Der Primer ist dem codierenden Strang von u-PA (682-666) komplementär.

Beispiel 15: Clonierung der hybriden t-PA/u-PA-cDNA-Konstruktionen in dem Hefeexdressionsvektor pJDB207

A) Clonierung des TPAAUPAB-Hybridgens in pJDB207

RF-DNA wird für mp18/BamHI-MOTPAAUPAB durch das rasche DNA-Isolierungsverfahren [D.S. Holmes und M. Quingley, Anal. Biochem. 114, 192-197 (1981)] hergestellt.
RF-DNA ( 1,5 µg) wird mit 9 E BamHI in 20 µl 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol für eine Stunde bei 37ºC gespalten. Nach der Zugabe von 1 µl RNase (1 mg/ml) und 10minütiger Inkubation bei 37ºC wird die 2,1-kb-Insertion auf einem präparativen 0,7%igen Agarosegel isoliert. Die DNA-Insertion wird durch Elektroelution extrahiert und in Ethanol gefällt.
1,5 µg pJDB207/PHO5-I-TPAAUPAB wird mit BamHI gespalten, mit alkalischer Kälberdarmphosphatase behandelt und der 6,7-kb-Vektor wird isoliert. Nach der Elektroelution wird die Vektor-DNA ausgefällt.
100 fmol BamHI-gespaltener pJDB207/PHO5-I-TPAAUPAB-Vektor, 200 fmol TPAAUPAB-Insertion werden in 10 µl 50 mM Tris HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, mM ATP, 0,5 µg Gelatine mit 400 E T&sub4;-DNA-Ligase für 8 Stunden bei 15ºC ligiert. Die Reaktion wird durch 10minütige Inkubation bei 65ºC gestoppt. 5 µl dieses Ligierungsgemisches werden zur Transformation von E. coli-HB101-Ca²&spplus;-Zellen [M. Dagert und S.D. Ehrlich, Gene 6, 23-28 (1979)) verwendet. 12 ampR-Kolonien werden aufgenommen und die DNA wird durch das rasche Isolierungsverfahren hergestellt. Bei der Analyse der DNA zeigen 5 clone sowohl Insertionen der korrekten Größe als auch der korrekten Orientierung. Ein Clon wird in 100 ml LB-Medium, das 100 mg/ml Ampicillin enthält, angezüchtet. Die Plasmid-DNA wird isoliert und als pJDB207/PHO5-I- MOTPAAUPAB bezeichnet.

B) Clonierung der MOUPAATPAB-, MOUK&sub2;TPAB- und MOUK&sub2;UPAB- Geninsertionen in das Plasmid pCA16

RF-DNA wird für mp18/KpnI-HindIII/MOUPAATPAB, mp18/KpnI- HindIII/MOUK&sub2;TPAB, mp18/KpnI-HindIII/MOUK&sub2;UPAB durch das rasche DNA-Isolierungsverfahren hergestellt.
Die drei RF-DNAs ( 1,5 µg) werden jeweils mit 12 E KpnI und 12 E HindIII in 20 µl 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM Mercaptoethanol für eine Stunde bei 37ºC gespalten. 1 µl 1 M NaCl wird zugesetzt und die DNAs werden weiter mit 12 E HindIII gespalten. Nach Zugabe von 1 µl RNase (1 mg/ml) und 10minütiger Inkubation bei 37ºC, werden die 1,4-kb-Insertionen jeweils auf einem präparativen 0,8%igen Agarosegel isoliert. Die DNA-Insertionen werden durch Elektroelution extrahiert und in Ethanol gefällt.
Drei µg pCS16/uPA werden mit KpnI und HindIII gespalten und das 2,7-kb-Vektorfragment wird isoliert. Nach Elektroelution wird die Vektor-DNA in Ethanol gefällt.
100 fmol KpnI-HindIII-gespaltener pCS 16-Vektor, 200 fmol KpnI-HindIII-gespaltene Insertionsfragmente werden in 10 µl 50 mM Tris.HCl pH 7,51 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 µg Gelatine mit 400 E T&sub4;-DNA-Ligase 8 Stunden lang bei 15ºC ligiert. Die Reaktion wird durch 10minütige Inkubation bei 65ºC gestoppt, 5 µl dieses Ligierungsgemisches werden zur Transformation von E. coli-HB101-Ca²&spplus;- Zellen verwendet.
Sechs ampR-Kolonien werden aus jeder der drei Ligierungen aufgenommen. Die DNA wird durch das rasche Isolierungsverfahren hergestellt. Nach Analyse der DNA mit KpnI-HindIII werden Insertionsbanden der korrekten Größe beobachtet. Ein Clon aus jeder der drei Ligierungen wird in 100 ml LB- Medium, das 100 µg/ml Ampicillin enthält, angezüchtet. Die von mp18/KpnI-HindIII/MOUPAATPAB, mp18/KpnI- HindIII/MOUK&sub2;TPAB und mp18/KpnI-HindIII/MOUK&sub2;UPAB abgeleiteten Plasmid-DNAs werden isoliert und als pCS16/MOUPAATPAB, pCS16/MOUK&sub2;TPAB und pCS16/MOUK&sub2;UPAB bezeichnet.

C) Clonierung der MOUPAATPAB-, MOUK2TPAB und MOUK&sub2;UPAB- Geninsertionen in pCJDB207

Fünf µg pJDB207/PHO5-I-UPA werden mit 15 E ScaI und 15 E XhoI (Boehringer) in 50 µl 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol eine Stunde lang bei 37ºC gespalten. Nach Zugabe von 1 ml RNase (1 mg/ml) wird das 6,7-kb-Vektorfragment isoliert. Nach Elektroelution wird die Vektor-DNA ausgefällt.
Fünfzehn µg jeweils an pCS16/MOUPAATPAB, pCS16/MOUK&sub2;TPAB und pCS16/MOUK&sub2;UPAB werden eine Stunde lang bei 37ºC mit 30 E XhoI in 200 ml 10 mM Tris.HCl pH 8, 6 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol inkubiert, mit einem gleichen Volumen Phenol-Chloroform extrahiert und in Ethanol gefällt. Die ausgefällten XhoI-gespaltenen pCS16/MOUPATPAB-, pCS16/MOUK&sub2;TPAB- und pCS16/MOUK&sub2;UPAB- DNAs werden jeweils in 150 µl 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol, 1,5 µg Ethidiumbromid resuspendiert, 40 Minuten lang bei 37ºC mit 12 E ScaI (Teilspaltung) inkubiert und mit einem gleichen Volumen Phenol und dann mit einem gleichen Volumen Chloroform- Isoamylalkohol (50:1) extrahiert. Die 1,2-kb-Fragmente werden jeweils auf einem 1%igen präparativen Agarosegel isoliert. Die DNAs werden durch Elektroelution extrahiert und ausgefällt.
100 fmol ScaI-XhoI-gespaltener pJDB207/PHO5-I-UPA-Vektor und 200 fmol XhoI-ScaI gespaltene pCS16/MOUPATPAB-, pCS16/MOUK&sub2;TPAB- und pCS16/MOUK&sub2;UPAB-1,2-kb-Insertionen werden jeweils in 10 µl 50 mM Tris HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 µg Gelatine mit 400 E T&sub4;- DNA-Ligase 16 Stunden lang bei 15ºC ligiert. Die Reaktion wird durch 10minütige Inkubation bei 65ºC gestoppt. 5 µl dieses Ligierungsgemisches werden zur Transformation von E. coli-HB101-Ca²+-Zellen verwendet.
Sechs ampR-Kolonien werden aus jeder der drei Ligierungen aufgenommen. Die DNA wird durch das rasche Isolierungsverfahren hergestellt. Die Restriktionsanalyse der DNA zeigt Insertionsbanden der korrekten Größe. Ein Clon aus jeder der drei Ligierungen wird in 100 ml LB-Medium, das 100 µg/ml Ampicillin enthält, angezüchtet. Die von pCS16/MOUPAATPAB, pCS16/MOUK&sub2;TPAB, pCS16/MOUK&sub2;UPAB abgeleiteten Plasmid-DNAs werden als pJDB207/PHO5-I- MOUPAAtPAB, PJDB207/PHO5-I-MOUK&sub2;TPAB bzw. pJDB207/PHO5-I- MOUK&sub2;UPAB bezeichnet.

Beispiel 16: Transformation von Saccharomyces-cerevisiae- GRF18 und Herstellung der Hefezellextrakte

Die Plasmide pJDB207/PHO5-I-MOtPAAUPAB, pJDB207/PHO5-I- MOUPAAtPAB, pJDB207/PHO5-I-MOUK&sub2;tPA und pJDB207/PHO5-I- MOUK&sub2;UPAB werden jeweils in den Saccharomyces-cerevisiae- Stamm GRF18 unter Verwendung des von Hinnen et al. beschriebenen Transformationsprotokolls (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)] eingeschleust. Fünf µg jeder Plasmid-DNA werden zu 100 µl einer Sphäroblastensuspension gegeben und das Gemisch wird mit Polyethylenglykol behandelt. Die Sphäroblasten werden mit 10 ml Regenerationsagar vermischt und auf Hefeminimalmediumplatten ohne Leucin plattiert. Nach dreitägiger Inkubation bei 30ºC werden etwa 200 transformierte Zellen erhalten.
Eine Kolonie aus jeder der Hefetransformationen wird aufgenommen. Die verschiedenen Kolonien werden als
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-I-MOtPAAUPAB,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-I-MOUPAATPAB,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-I-MOUK&sub2;TPAB,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-I-MOUK&sub2;UPAB bezeichnet.
Hefezellen werden bei 30ºC in 20 ml HE-17-Medium (8,4 g Hefestickstoffbase (Difco), 10 g L-Asparagin (Sigma), 1 g L-Histidin (Sigma), 40 ml 50%ige pro 1 Liter Lösung) in einem 50-ml-Erlenmeyer-Kolben unter Schütteln für 24 Stunden bis zum Erreichen einer Zelldichte von 8 bis 10x10&sup7; Zellen/ml gezüchtet. Die Zellen werden zentrifugiert, in 10 ml 0,9% NaCl resuspendiert. Zwei ml der resuspendierten Zellen werden zur Inokulierung von 50 ml Minimalmedium mit niedrigem Pi-Gehalt (wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 143 081 beschrieben), dem 10 g/l L-Asparagin (Sigma) und 10 g/l L-Histidin (Sigma) zugesetzt worden war, im 250-ml-Erlenmeyer-Kolben verwendet. Die Inkubation wird bei 30ºC mit 250 UpM durchgeführt.
Zellen aus den 10 ml des Minimalmediums mit niedrigem Pi- Gehalt werden nach 48 Stunden durch 10minütige Zentrifugation bei 3000 UpM in Falcon-2070-Röhrchen gewonnen. Die Zellen werden einmal mit 10 ml Medium mit niedrigem Pi-Gehalt gewaschen und zentrifugiert. Das Zellpellet wird in Lysepuffer (66 mM Kaliumphosphat pH 7,4, 4 mM Zwittergent (Calbiochem.)] suspendiert. Die Zellsuspension wird mit 8 g Glaskügelchen (Durchmesser 0,5 bis 0,75 mm) und einem kleinen Glasstab versetzt und die Suspension wird auf einem Vortex-Mixer (Scientific Instruments Inc., USA) mit Höchstgeschwindigkeit für 4 x 2 Minuten mit zweiminütigen Intervallen auf Eis geschüttelt. Mehr als 90% der Zellen werden durch dieses Verfahren aufgebrochen. Die Zelltrümmer und die Glaskügelchen werden durch fünfminütige Zentrifugation bei 3000 UpM bei 4ºC sedimentiert. Der Überstand wird zur Bestimmung der PA-Aktivität und zur Reinigung und Isolierung von PA verwendet.

Beispiel 17: Insertion der hybriden PA-codierenden Sequenzen in einem Säugerzell-Expressionsvektor

A) Insertion einer perfekt hybriden UPAATPAB-codierenden Sequenz

RF-DNA von mp18/KpnI-HindIII/MOUPAATPAB wird an der SmaI- Spaltstelle, die genau stromaufwärts des Beginns der codierenden Sequenz lokalisiert ist, gespalten und an einen SacI-Linker (CGAGCTCG) ligiert. Anschließend wird das Plasmid mit SacI gespalten, das an der Position der ligierten Linker und an der natürlichen SacI-Spaltstelle in dem t-PA-abgeleiteten Teil der hybriden PA-codierenden Sequenz spaltet. Das kleinere der zwei so erhaltenen Fragmente wird über ein Agarosegel gereinigt und an SacI-gespaltenes pCGA44 (siehe Beispiel 4) ligiert, in E. coli-HB101 transformiert, und die DNA aus den in Frage kommenden Clonen wird mit EcoRI getestet. Ein Clon mit dem erwarteten Restriktionsmuster wird als pCGC1/UPAAtPAB bezeichnet.

B) Insertion der hybriden UK&sub2;TPAB-codierenden Sequenz

RF-DNA von mp18/KpnI-HindIII/MOUK&sub2;TPAB wird an der SmaI- Spaltstelle, die gerade stromaufwärts des Beginns der codierenden Sequenz lokalisiert ist, gespalten und wie vorstehend in SacI ligiert. Nach Spalten mit SacI wird das so erhaltene kleine Fragment in SacI-gespaltendes pCGA44, wie vorstehend beschrieben, cloniert und ein Clon mit dem erwarteten Restriktionsmuster wird als pCGC2/UK&sub2;TPAB bezeichnet.

C) Insertion einer hybriden UK&sub2;UPAB-codierenden Sequenz

RF-DNA aus mp18/KpnI-HindIII/MOUKKUPAB wird an der SmaI- Spaltstelle stromaufwärts der u-PA-codierenden Sequenz und an der XhoI-Spaltstelle stromabwärts der codierenden Sequenz (in der Vektor-DNA) gespalten. Das klebrige Ende des DNA-Fragments wird unter Verwendung von E. coli-DNA-Polymerase I (vgl. Beispiel 5D) aufgefüllt. SacI-Linker werden an die glatten Enden ligiert, die DNA wird mit SacI gespalten, das kleinere der zwei so erhaltenen Fragmente wird über ein Agarosegel gereinigt und in SacI-gespaltenes pCGA44 cloniert. Ein Clon mit dem erwarteten EcoRI-Restriktionsmuster wird als pCGC2/UK&sub2;UPAB bezeichnet.

D) Insertion einer perfekten TPAAUPAB-codierenden Sequenz

Stufe 1: RF-DNA von mp18/BamI/MOTPAAUPAB wird mit BamHI gespalten und das kleinere ( 2,1 kb) Fragment wird in den BamHI-gespaltenen pJDB207 /PHO5-I-TPAAUPAB-Vektor (vgl. Beispiel 9) cloniert. Die korrekte Orientierung wird durch Spalten mit HindIII gewählt und ein korrektes Plasmid wird als pJDB207/PHO5-I-MOtPAAUPAB bezeichnet.
Stufe 2: Ein 600 bp großes SacI-NarI-Fragment aus ptNC.UC (vgl. Beispiel 3) und ein 1350 bp großes NarI-XhoI-Fragment aus pJDB207/PHO5-I-TPAAUPAB wird isoliert und in den SacI-Xhoi-gespaltenen pCS16-Vektor (vgl. Beispiel 7) cloniert. Die 1,9 kb große Insertion wird durch Spaltung mit SacI-XhoI und EcoRI bestätigt. Ein korrektes Plasmid wird als pCS16/MOTPAAUPAB bezeichnet.
Stufe 3: Das Plasmid pCS16/MOTPAAUPAB wird an der XhoI- Spaltstelle, die stromaufwärts der u-PA-codierenden Sequenz lokalisiert ist, gespalten und die klebrigen Enden werden unter Verwendung von E. coli-DNA-Polymerase I aufgefüllt. SacI-Linker werden an die glatten Enden ligiert und die DNA wird mit SacI gespalten. Das kleinere der zwei Fragmente wird über ein Agarosegel gereinigt und in ein SacI-gespaltenes pBR4-Vektorfragment (vgl. Beispiel 5) cloniert. Insertionen der korrekten Orientierung und der korrekten Größe werden durch Spalten mit BamHI bzw. SacI bestätigt. Ein korrektes Plasmid wird als pCGC4a/TPAAUPAB bezeichnet.

Beispiel 18: Konstruktion weiterer hybrider PA-codierender Sequenzen und Insertion davon in einen Säugerzell-Expressionsvektor

A) Clonierung eines pCGC4a/TPAAUPAB in M13mp18

3 µg pCGC4a/TPAAUPAB (vgl. Beispiel 17) werden mit 12 E SacI (Boehringer) in 20 µl 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM Mercaptoethanol bei 37ºC eine Stunde lang gespalten. Ein 1,9 kb großes Fragment wird auf einem präparativen 0,7%igen Agarosegel isoliert. Die DNA wird durch Elektroelution extrahiert und ausgefällt.
0,5 µg M13mp18 (RF) wird mit SacI gespalten. Das 7,3-kb- Vektorfragment wird auf einem präparativen 0,7%igen Agarosegel isoliert. Die DNA wird elektrisch eluiert und ausgefällt.
100 fmol SacI-gespaltener M13mp18-Vektor und 200 fmol SacI-Insertion werden in 10 µl 50 mM Tris HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 µg Gelatine mit 400 T&sub4;- DNA-Ligase 7 Stunden lang bei 15ºC ligiert. Die Reaktion wird durch lominütige Inkubation bei 65ºC gestoppt. 5 µl dieses Ligierungsgemisches werden zur Transformation von kompetenten E. coli-JM101-Zellen verwendet. Sechs farblose Plaques werden aufgenommen und einzelsträngige und replikative Formen (RF) der DNA werden hergestellt. Entsprechend der Analyse der RF-DNA zeigen vier Clone Insertionen der korrekten Größe und die korrekte Orientierung. Einer dieser done wird als mp18/SacI/TPAAUPAB (BC) bezeichnet.

B) Clonierung eines pBR4a-SacI-Fragments in M13mp18

Ein pBR4a- (vgl. Beispiel 5) SacI-Fragment wird in M13mp18 cloniert. Einer der Clone, der eine Insertion der korrekten Größe und eine korrekte Orientierung hat, wird als mp18/SacI/TPAAUPAB (BR) bezeichnet.

C) Deletionsmutagenese an hybriden TPA-UPA-Konstruktionen

1) Konstruktion von K&sub2;UPAB (BC) [d.h. tPA(1-3)-tPA(176- 275)-UPA(159-411)]

Die Deletionsmutagenese wird, wie in dem allgemeinen Protokoll (vgl. Beispiel 14) beschrieben, an mp18/SacI/TPAAUPAB(BC) durchgeführt. Positive Clone, die aus der Hybridisierung erhalten wurden, werden durch Restriktionsanalyse mit SacI bestätigt. In den Mutanten wird eine 1380 bp große Bande beobachtet, verglichen mit dem Wildtyp, der ein 1900 bp großes Fragment ergibt. Die Mutanten werden weiter durch EcoRI-Spaltung bestätigt. Ein mutierter Clon mit der korrekten Struktur wird als mp18/SacI/K&sub2;UPAB(BC) bezeichnet. Die Deletion wird durch das Kettenterminations-Sequenzierverfahren unter Verwendung eines Sequenzier-Primers der Sequenz
5' CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGTG 3'
bestätigt. Dieser Primer ist dem codierenden Strang von t- PA(853-821) mit einer Fehlpaarung in Position 838 (t-PA) komplementär.

2) Konstruktion von FUPAB(BC) [d.h. tPA(1-49)-tPA(262- 275)-UPA(159-411)]

Die Deletionsmutagenese wird, wie in dem allgemeinen Protokoll (vgl. Beispiel 14) beschrieben, an mp18/SacI/TPAAUPAB(BC) durchgeführt. Positive Clone, die aus der Hybridisierung erhalten wurden, werden durch Restriktionsanalyse mit SacI bestätigt. In den Mutanten wird eine 1200 bp große Bande beobachtet, verglichen mit dem Wildtyp, der ein 1900 bp großes Fragment ergibt. Die Mutanten werden weiter durch EcoRI-Spaltung bestätigt. Ein mutierter don mit der korrekten Struktur wird als mp18/SacI/FUPAB(BC) bezeichnet. Die Deletion wird durch das Kettenterrninations-Sequenzierverfahren unter Verwendung eines Sequenzier-Primers der Sequenz
5' CAGAGCCCCCCCGGTGC 3'
bestätigt. Dieser Primer ist dem codierenden Strang von u-PA(666-682) komplementär.

3) Konstruktion von FK&sub2;UPAB(BC) [d.h. tPA(1-49)-tPA(176- 275)-uPA(159-411)]

Die Deletionsmutagenese wird, wie in dem allgemeinen Protokoll (vgl. Beispiel 14) beschrieben, an mp18/SacI/TPAAUPAB(BC) durchgeführt. Positive Clone, die aus der Hybridisierung erhalten wurden, werden durch Restriktionsanalyse mit SacI bestätigt. In den Mutanten wird eine 1470 bp große Bande beobachtet, verglichen mit dem Wildtyp, der ein 1900 bp großes Fragment ergibt. Die Mutanten werden weiter durch EcoRI-Spaltung bestätigt. Ein mutierter Clon mit der korrekten Struktur wird als mp18/SacI/KF&sub2;UPAB(BC) bezeichnet. Die Deletion wird durch das Kettenterminations-Sequenz ierverfahren unter Verwendung eines Sequenzier-Primers der Sequenz
5' CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGTG 3'
bestätigt. Dieser Primer ist dem codierenden Strang von t- PA(853-821) mit einer Fehlpaarung in Position 838 (t-PA) komplementär.

4) Konstruktion von FGK&sub2;UPAB(BC) [d.h. tPA(1-86)-tPA(176- 275)-UPA(159-411)]

Die Deletionsmutagenese wird, wie in dem allgemeinen Protokoll (vgl. Beispiel 14) beschrieben, an mp18/SacI/TPAAUPAB(BC) durchgeführt. Positive Clone, die aus der Hybridisierung erhalten wurden, werden durch Restriktionsanalyse mit SacI bestätigt. In den Mutanten wird eine 1580 bp große Bande beobachtet, verglichen mit dem Wildtyp, der ein 1900 bp großes Fragment ergibt. Die Mutanten werden weiter durch EcoRI-Spaltung bestätigt. Ein mutierter Clon mit der korrekten Struktur wird als mp18/SacI/FGK&sub2;UPAB(BC) bezeichnet. Die Deletion wird durch das Kettenterminations-Sequenzierverfahren unter Verwendung eines Sequenzier-Primers der Sequenz
5' CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGTG 3'
bestätigt. Dieser Primer ist dem codierenden Strang von t- PA(853-821) mit einer Fehlpaarung in Position 838 (t-PA) komplementär.
5) Ähnliche Deletionsmutagenese-Protokolle werden zur Erzeugung von
K&sub2;UPAB(BR) [tPA(1-3)-tPA(176-262)-UPA(132-411)],
FUPAB(BR) [tPA(1-49)-UPA(134-411)],
FK&sub2;UPAB(BR) [tPA(1-49)-tPA(176-262)-UPA(132-411)] und
FGK&sub2;UPAB(BR) [tPA(1-86)-tPA(176-262)-UPA(132-411)] verwendet.

D) Insertion von hybriden PA-codierenden Sequenzen in einen Säugerzell-Expressionsvektor

1. Insertion von FUPAB(BC), K&sub2;UPAB(BC), FK&sub2;UPAB(BC) und FGK&sub2;UPAB (BC)

RF-DNA aus mp18/SacI/UPAB(BC), mp18/SacI/FUPAB(BC), mp18/SacI/FK&sub2;UPAB(BC) und mp18/SacI/FGK&sub2;UPAB(BC) wird jeweils mit SacI gespalten. Das kleinere der zwei so erhaltenen Fragmente wird isoliert und an ein SacI-gespaltenes pBR4a- (vgl. Beispiel 5) -Vektorfragment ligiert, in E. coli-HB101 eingeschleust, und Insertionen der korrekten Orientierung und korrekten Größe werden durch Spaltung mit BamHI bzw. SacI bestätigt. Die so erhaltenen Plasmide werden als pCGC5/K&sub2;UPAB, pCGC6/FUPAB, pCGC7/FK&sub2;UPAB bzw. pCGC8/FGK&sub2;UPAB bezeichnet.
2. Auf ähnliche Weise werden K&sub2;UPAB(BR)-, FUPAB(BR)-, FK&sub2;UPAB(BR)- und FGK&sub2;UPAB(BR)-DNAs (siehe vorstehend) jeweils in pBR4a insertiert. Die so erhaltenen Plasmide werden pBR5, pBR6, pBR7 bzw. pBR8 bezeichnet.

Beispiel 19: Säugerzell-Exrressionsvektoren. umfassend das DHFR-Gen

Das Plasmid pSV2dhfr (ATCC 37145) ist ein Plasmid, das die Selektion von Transformanten von DHRF-haltigen Zellen durch Selektion des Antifolat-Arzneimittels Methotrexat oder die Selektion von DHFR&spplus; -Transformanten von DHFR&supmin;CHO- Zellen [DUKXBI-Zellen; G. Urlaub, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220 (1980)] erlaubt. In die einzelne BamHI- Spaltstelle dieses Plasmids kann das BamHI-Fragment von pCGA28, enthaltend das modulare t-PA-Gen, cloniert werden. Plasmide, die eine der beiden möglichen Orientierungen enthalten, werden als pCGA700a/tPA und pCGA700b/tPA bezeichnet. Beide können zur Expression von tPA in Gewebskulturzellen verwendet werden, aber bevorzugt ist pCGA700a/tPA, worin die Transkription des t-PA-Gens in der gleichen Richtung wie die des DHFR-Gens ist, da diese Orientierung häufig zu geringfügig höheren Expressionshöhen als Plasmide, die konvergent transkribiert werden, führt.
Auf analoge Weise können die modularen Gene, die hybride Plasminogenaktivatoren (siehe nachstehend) codieren, aus den Plasmiden pBR1a/tPA, pBR2a/UPABTBAB, pCGC1/UPABTBAB und pCGC2/UK&sub2;TBAB als BamHI-Fragmente mit dem DHFR-Gen von pCGA700a/tPA kombiniert werden, wodurch die Plasmide pCGA701a/tPA, pCGA702a/UPABTBAB, pCGA705a/UPABTBAB bzw. pCGA707a/UK&sub2;TBAB gebildet werden, worin das modulare Plasminogenaktivatorgen in gleicher Richtung wie das DHFR-Gen transkribiert wird und pCGA701b/tPA, pCGA702b/UPABTBAB, pCGA705b/UPABTBAB, pCGA707b/UK&sub2;TBA , worin die Gene in entgegengesetzten Richtungen transkribiert werden. Aufgrund der Anwesenheit einer BamHI-Sequenz in dem Teil, der die u-PA-B-Kette codiert, kann das modulare Plasminogenaktivatorgen nur durch eine Teilspaltung (2 der 3 BamHI- Spaltstellen) des neoR-Plasmids, gefolgt von einer Isolierung des geeigneten Fragments (vgl. Figuren) durch Agarosegelelektrophorese isoliert werden. So können aus pBR3a/uPA, pBR4a/TPAAUPAB, pBRS/K&sub2;UPAB, pBR6/FUPAB, pBR7/FK&sub2;UPAB, pBR8/FGK&sub2;UPAB, pCGC3/UK&sub2;UPAB, pCGC4a/TPAAUPAB, pCGCS/K&sub2;UPAB, pCGC6/FUPAB, pCGC7/FK&sub2;UPAB und pCGCb/FGK&sub2;UPAB pCGA703a/uPA, pCGA704a/TPAAUPAB, pCGA705a/K&sub2;UPAB, pCGA708a/FUPAB pCGA706a/FK&sub2;UPAB, pCGA707a/FGK&sub2;UPAB, pCGA709a/UK&sub2;UPAB, pCGA711a/TPAAUPAB, pCGA712a/K&sub2;UPAB, pCGA713a/FUPAB, pCGA714a/FK&sub2;UPAB bzw. pCGA715a/FGK&sub2;UPAB konstruiert werden, worin die Plasminogenaktivatorgene alle in der gleichen Richtung des DHFR- Gens transkribiert werden und weiter pCGA703b/uPA, pCGA704b/TPAAUPAB, pCGA708b/FUPAB, pCGA705b/K&sub2;UPAB, pCGA706b/FK&sub2;UPAB, pCGA707b/FGK&sub2;UPAB, pCGA709b/UK&sub2;UPAB, pCGA711b/TPAAUPAB, pCGA712b/K&sub2;UPAB, pCGA713b/FUPAB, pCGA714b/FK&sub2;UPAB und pCGA715b/FGK&sub2;UPAB konstruiert werden, worin beide Gene inkonvergent transkribiert werden.

Beispiel 20: Produktion von hybriden Plasminogenaktivatoren durch transformierte Säugerzellen

A) Erhalt und DNA-Transfektion von Gewebskulturzellen; allgemeines Verfahren

Die DNA-Konstruktionen werden in DUKXB1, einer Mutante der Chinahamster-Ovarien(CHO)zellen, denen das Enzym Dihydrofolatreduktase fehlt [G. Urlaub et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220 (1980)], exprimiert. Die DUKXB1- Zellen werden in α-MEM-Medium, das Nukleoside (GIBCO) enthält und mit 5% fetalem Kälberserum supplementiert ist, gezüchtet.
Die Zellen werden in einer Dichte von 10.000/cm in Multiplatten mit 6-Kavitäten (Durchmesser 3,4 cm) plattiert und mit 4 µg DNA transformiert. Die DNA wird in einer Konzentration von 50 µg/ml in 10 mM Tris.HCl pH 7,0, enthaltend 0,1 mM EDTA, aufgelöst, 5 Minuten lang auf Eis gekühlt, 0,25 Volumen 1 M CaCl&sub2; wird zugesetzt und es wird 10 Minuten auf Eis inkubiert. Das Gemisch wird dann mit einem gleichen Volumen 2 x HBS (50 mM Hepes, 280 mM NaCl, 0,75 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 0,75 mM NaH&sub2;PO&sub4;.pH 7,12) vermischt und weitere 10 Minuten auf Eis inkubiert. Schließlich wird dieses DNA- Ca-Phosphat-Copräzipität dem Kulturmediurn zugesetzt und die Zellen werden 16 bis 18 Stunden mit der DNA inkubiert, anschließend mit Glycerin geschockt, d.h. die Zellen werden mit TBS (80 g/l NaCl, 3,8 g/l KCl, 1 g/l Na&sub2;HPO&sub4;.2H&sub2;O, 0,114 g/l CaCl&sub2;.2H&sub2;O, 0,11 g/l MgCl&sub2;.6H&sub2;O, 25 mM Tris.HCl pH 7,5) gespült, 1 Minute lang mit 20% (Vol./Vol.) Glycerin in TBS inkubiert, erneut mit TBS gespült und 24 Stunden lang in einem Gewebskulturmedium gezüchtet. Die Zellen werden mit Trypsin behandelt und die Zellen werden in Petri-Schalen mit einem Durchmesser von 8 cm überführt. Am nächsten Tag wird das Anfangskulturmedium ohne selektives Agens durch ein Medium mit 1 mg/ml Geneticin ersetzt. Das Medium wird jeden dritten oder vierten Tag ersetzt. Die Kolonien können etwa am 14. Tag beobachtet werden. Zellen aus einzelnen Kolonien werden durch Abkratzen mit einer Pipettenspitze unter gleichzeitigem Ansaugen in die mit Trypsinlösung gefüllte Pipettenspitze isoliert und jeweils in eine Kavität einer Multiplatte mit 24 Kavitäten, die mit dem Geneticin-haltigen Medium gefüllt ist, überführt. Bei Konfluenz werden diese Kulturen in die Kavitäten einer Multiplatte mit 6 Kavitäten aufgeteilt und anschließend in Petri-Schalen mit 8 cm Durchmesser überführt.

B) Agaroseplatten-Assavs auf Plasminogenaktivatoren

Bei diesen empfindlichen Assays auf Plasminogenaktivatoren werden Agarosegele verwendet, denen Plasminogen (Stammlösung, hergestellt durch Auflösen von Plasminogen Sigma A-6877 in einer Konzentration von 1 mg/ml in 100 Volumina 50 mM Tris.HCl pH 8,0 und zweimal Dialysieren gegen diese Lösung) oder Casein (zugesetzt als Magermilch) oder Fibrin (zugesetzt als Fibrinogen plus Thrombin) zugegeben ist. Die den Plasminogenaktivator enthaltende Probe wird in Löcher, die in eine 4 mm dicke Agaroseschicht eingestanzt sind, gegeben und das Gel wird anschließend bei 37ºC inkubiert. Die enzymatische Aktivität wird dann dadurch detektiert, daß der Plasminogenaktivator radial aus der Probenkavität diffundiert, das Plasminogen in dem Gel in Plasmin umwandelt, das seinerseits das Casein oder Fibrin abbaut, wodurch ein klarer Schatten in dem opaken Gel um die Probenkavität gebildet wird. Der Radius des Schattens (gemessen vom Rand der Probenkavität) ist ein Maß für die Menge des aktivierten Plasminogens. Der Assay zeigt jedoch keine lineare Antwort auf die Menge des zugesetzten Plasminogenaktivators. Für den Assay auf niedrige Mengen Plasminogenaktivator kann die Inkubation mehrere Tage verlängert werden. Das Verfahren und die Kalibration des Casein-Assays wird wie in Tang et al. Eann. N.Y. Acad. Sci. 434, 536-540 (1984)] beschrieben, durchgeführt, ausgenommen, daß anstelle von 2% (Gew./Vol.) Carnation-Magermilchpulver 12,5% (Vol./Vol.) sterilisierte (UHT) Magermilch von Migros Corp. (Schweiz) verwendet wird. Wenn Fibrin [Granelli-Piperno und Reich, J. Exp. Med. 148, 223- 234 (1978)] als Substrat verwendet wird, werden 0,2 g Agarose in 15 ml 0,9% NaCl aufgelöst und auf 42ºC gekühlt. An diesem Punkt werden 5 ml 0,9%ige NaCl-Lösung, enthaltend 80 mg Rinderfibrinogen (Sigma F-8630), 0,1 ml Plasminogenlösung (siehe vorstehend) und 0,1 ml 100 mg/ml Natriumazid, bei 42ºC zugesetzt. Schließlich werden 0,2 ml Rinderthrombin (Sigma T-6634, aufgelöst in einer Konzentration von 16,6 NIH-Einheiten/ml in 0,9% NaCl) zugesetzt und das Gemisch wird rasch in eine Petri-Schale (Durchmesser 8 cm) gegossen und 1 Stunde lang auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Das so erhaltene Gel ist etwa 4 mm dick und kann mehrere Tage bei 4ºC gelagert werden oder sofort wie das vorstehende caseinhaltige Gel verwendet werden.

C. Produktion von hybriden PA-Proteinen in Hamsterzellen

CHO-DUKXBL-Zellen werden mit DNA der Plasmide pBR1A, pBR1B pBR2a, pBR2B, pBR3A, pBR3B, pBR4A, pBR5, pBR7, pBR8, pCGC1, pCGC2, pCGC3, pCGC4A, pCGC5, pCGC6, pCGC7 bzw. pCGC8, wie vorstehend beschrieben (Beispiel 20A) transformiert. Die Kolonien erscheinen etwa am Tag 10. Kolonien werden etwa am Tag 15, wie vorstehend beschrieben, aufgenommen und zwei Wochen später hat ihre Anzahl ausreichend zugenommen, um PA, wie vorstehend beschrieben, zu messen. Nicht transformierte Zellen und mit pBR1B, pBR2B, pBR3B, die das insertierte SacIFragment in der Antisense-Orientierung enthalten, transformierte Zellinien produzieren keine nachweisbaren PA-Mengen.

D. Enzymaktivität in durch transformierte CHO-Zellen konditionierten Medien

Ein konditioniertes Medium aus einem transformierten Plasmid und Kontroll-CHO-Zellen wird durch Züchten von 200.000 bis 500.000 Zellen/ml für 24 Stunden in Alpha-MEM ohne Nukleoside und 5% fetales Kälberserum hergestellt, und 0,03 ml werden auf Agaroseplatten, die Casein oder Fibrin enthalten, für die nachstehend angegebene Zeitspanne inkubiert. Auf der Fibrinplatte wird eine minimale Hintergrundaktivität, vermutlich eine Folge endogener Hamster-t- PA, in dem DUKXB1-konditionierten Medium nachgewiesen. Kein Schatten erscheint auf den Caseinplatten, wenn Proben des hybriden Proteins mit 3 µl Kaninchen-Anti-t-PA-Antikörper (erzeugt gegen gereinigten Bowes-Melanom-t-PA) oder Anti-Urokinase-Antikörper (erzeugt gegen Serono-Urokinase) vermischt werden. Ein Anti-t-PA-Antikörper hemmt das u-PA- Enzym nicht, ebenso hemmt ein Anti-Urokinase-Antikörper t- PA nicht in einem signifikanten Ausmaß. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1: Aktivität verschiedener Plasminogenaktivatoren

Tranformierendes Flasmid Durchmesser des Schattens

Beispiel 21: Herstellung von Hybridoma-Zellen und Isolierung monoclonaler Antikörder

a) Ouelle des Immunogens: Eine Probe halbgereinigtes natürliches menschliches Material (Melanom-t-PA) mit einer geschätzten Reinheit von > 90%.
b) Immunisierungsdrotokoll: Drei Gruppen von BALB/c-Mäusen (Tierfarm Sisseln, Schweiz) mit einem Alter von 10 bis 14 Wochen werden durch Injektion in die zwei hinteren Pfotenballen und subkutan von 100 µg Melanom-t-PA, emulgiert in komplettem Freund'schem Adjuvans (Difco), immunisiert. Anschließend erhält die erste Gruppe (Nr. 405) 10 µg t-PA in inkomplettern Adjuvans jede Woche sechs Wochen lang, während die zweite Gruppe (406) die gleiche Menge zweiwöchentlich erhält. Die dritte Gruppe (407) erhält zweimal 50 µg t-PA in dreiwöchigen Intervallen. Allen Tieren wird in Woche 4 und Woche 8 Blut abgenommen. Für die letzte Injektion werden 100 µg t-PA in PBS i.p. verabreicht und 4 Tage später werden die Milzzellen mit der SP2/o-Myeloma- Linie gemäß einem Standardverfahren fusioniert. Nur diejenigen Mäuse mit einem hohen Anti-t-PA-Antikörpertiter werden für die Fusion verwendet.
c. Zeilfusion: Alle Fusionsexperimente werden gemäß dem Verfahren von G. Köhler und C. Milstein [Nature 256, 495 (1975)] unter Verwendung der nicht-sekretierenden Sp 2/0- AG14-Myeloma-Linie [M. Shulman, C.D. Wilde und G. Köhler, Nature 276, 269 (1978)] durchgeführt. 10&sup8; Milzzellen werden mit 10&sup7; Myelomazellen in Anwesenheit von 1 ml 50%igem Polyethylenglykol (PET 1500, Serva) vermischt. Nach dem Waschen werden die Zellen in 48 ml Standard-Dulbecco's-Minimalnährmedium (Gibco Nr. 0422501) resuspendiert. 3 x 10&sup6; normale Maus-Peritonealexsudat-Zellen pro Fusion werden als Feeder-Zellen zugesetzt. Die Zellen werden in 48 x 1 ml Costar-Kavitäten verteilt und 3 Mal pro Woche mit Standard-HAT-Selektionsmedium für 3 bis 6 Wochen beschickt. Wenn das Wachstum der Hybridomazellen sichtbar wird, werden die Überstände sowohl durch Antigenbindungs- (ELISA) als auch Neutralisation-(Casein)-Assays (siehe nachstehend) abgesucht. Die Ergebnisse der 4 Fusionsexperimente sind wie folgt: Aus 192 beschickten Kavitäten werden 192 Hybridome erhalten. Von denen produzieren 24 den Anti-t- PA-Antikörper. Von 24 positiven Hybridomen werden 14 cloniert und von 574 erhaltenen Clonen wird gefunden, daß 31 den Anti-t-PA-mab stabil produzieren. Drei (die Clone 405B.33.3, 406A.23.7 und 407A.15.27) davon werden Mäusen injiziert und die Ascitesflüssigkeiten werden für weitere Untersuchungen gewonnen.

d) Isolierung und Reinigung des monoclonalen Antikörpers

BALB/c-Mäuse mit einem Alter von 8 bis 10 Wochen (Tierfarm Sisseln, Schweiz) werden intraperitoneal mit 0,3 ml Pristane (Aldrich) vorbehandelt. 2 bis 3 Wochen später werden 2 bis 5 x 10&sup6; clonierte Hybridomazellen 405B.33.3, 406A.23.7 und 407A.15.27 und 0,2 ml Fristane intraperitoneal inokuliert. Nach 8 bis 10 Tagen wird die Ascitesflüssigkeit gewonnen, bei 800 x g zentrifugiert und bei -20ºC gelagert.
Aufgetaute Ascitesflüssigkeit wird bei 50.000 x g 60 Minuten lang zentrifugiert. Eine Fettschicht, die auf der Oberfläche schwimmt, wird sorgfältig entfernt und die Proteinkonzentration wird auf eine Konzentration von 10 bis 12 mg/ml eingestellt.
Das Rohimmunglobulin wird durch tropfenweise Zugabe von 0,9 Volumenaquivalenten an gesättigtem Ammoniumsulfat bei 0ºC ausgefällt, dann in 20 mM Tris.HCl/50mM NaCl (pH 7,9) aufgelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Eine Immunglobulinfraktion wird durch DEAE-D52-Cellulose(Whatman)-Chromatographie unter Verwendung eines Puffergradientensystens aus 20 mM Tris HCl/25 bis 400 mM NaCl, pH 7,9, erhalten. Das Immunglobulin wird erneut mit Ammoniumsulfat ausgefällt und in PBS in einer Konzentration von 10 mg/ml aufgelöst.
Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS- PAGE) zeigt einen Reinheitsgrad von mehr als 95% für die monoclonalen Antikörper.

e) Bestimmung der Klasse und Subklasse der monodonalen Antikörder

Die Klasse und die Subklasse der von den clonierten Hybridomazellen produzierten monodonalen Antikörper werden mit der bekannten Immundiffusionstechnik von Ouchterlony (Agargel-Immundiffusionsverfahren) unter Verwendung von Klassen- und Subklassen-spezifischen Kaninchen-Antikörpern (Bionetics) bestimmt.
Die Subkiassen der mabs sind wie folgt:
405B.33.3: γ1k
406A.23.7: γ2bk
407A.15.27: γ2ak
f) Enzymimmuno-Assay (ELISA): Mikrotiterplatten werden mit 0,5 µg pro Kavität eines t-PA-Präparats (Reinheit )95%) in 100 µl PBS beschichtet. Die freie Bindungskapazität der Platte wird mit einem Puffer aus 0,2% Gelatine in FBS, enthaltend 0,2% NaN&sub3; (Gew./Vol), pH 7,4, gesättigt. 100- µl-Proben, die die monoclonalen Antikörper 4058.33.3, 406A.23.7 bzw. 407A.15.27 enthalten, werden 2 Stunden lang in den Kavitäten bei 37ºC inkubiert. Die Platten werden mit PBS, die 0,05% Tween 20 enthält, gewaschen, dann 2 Stunden lang bei 37ºC mit einem Phosphatase-konjugierten Kaninchen-Anti-Mausimmunglobulinpräparat inkubiert. Das gebundene Enzym wird durch Inkubieren (37ºC, 30 bis 60 Minuten) mit einer Lösung des Enzymsubstrats p-Nitrophenylphosphat (1 mg/ml in 10%igem Diethanolamin-Puffer, enthaltend 0,5 mM MgCl&sub2; und 0,02% (Gew./Vol.) NaN&sub3;, 9,8) und Messen der optischen Dichte bei 405 nm, entwickelt.
Der gleiche ELISA wird auch unter Verwendung von Urokinase durchgeführt. Keiner der mabs bindet an Urokinase. Alle mAbs sind t-PA-spezifisch.
g) Caseinlyse-Assay (Neutralisationstest): Um die Hemmwirkung der mAbs zu bestimmen, wird t-PA zuerst mit den mAbs 4058.33.3, 4068.23.7 bzw. 407A.15.27 vermischt und 30 bis 60 Minuten lang bei 4ºC inkubiert. Dann wird der übliche Casein/Plasminogenagar-Assay durchgeführt (siehe Beispiel 20B). Keiner der mAbs hemmt die t-PA-Aktivität, außer daß der mab 4058.33.3 eine Verzögerung (mehr als 6 Stunden) in der Caseinlyse verursacht.

Beispiel 2²: Reinigung des hybriden Plasminogenaktivators, allgemeines Verfahren

Extrakte aus transformierten Hefezellen werden, wie in Beispiel 16 beschrieben, hergestellt. Extrakte aus Plasmid-transformierten Säugerzellen, wie CHO-Zellen, werden wie folgt hergestellt:
Die Zellen werden zuerst bis zu einer 70 bis 80%igen Konfluenz gezüchtet. Dann wird die einzellige Schicht mit Medium, wie vorstehend beschrieben, aber ohne Serum, gespült, und anschließend werden die Zellen für eine weitere Zeitspanne von 5 bis 7 Tagen gezüchtet. Das Medium wird alle 24 Stunden abgeerntet, wobei gleichzeitig frisches Medium zu den Zellen gegeben wird. Das so erhaltene konditionierte Medium wird dann 30 Minuten lang bei 5000 x g zentrifugiert und durch ein 0,4-µm-Filter filtriert, um unerwünschte Zelltrümmer vor der Affinitätschromatographie zu entfernen. Als Affinitätsmatrix wird entweder der immobilisierte Protease-Inhibitor DE-3 aus Erythrina latissima oder die immobilisierten Antikörper gegen u-PA oder t-PA verwendet
Die Hybrid-PAs, die die katalytische B-Kette von t-PA enthalten, werden aus dem konditionierten Medium, das wie vorstehend beschrieben, hergestellt wurde, oder aus Hefezellextrakten unter Verwendung des zur Reinigung von t-PA aus Melanomzell-konditioniertem Medium ursprünglich entwickelten Protokolls gereinigt (vgl. C. Heussen et al. J. Biol. Chem 259, 11635-11638) (1984)].
Alle Hybrid-PAs werden unter Verwendung von polyclonalen Antikörpern, die in Kaninchen oder Ziegen gegen die Stammu-PA- oder -t-PA-Enzyme erzeugt worden waren, oder unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern (mit Mausursprung), die gegen die Stammenzyme erzeugt wurden, vorausgesetzt, diese erkennen einen auf dem in Frage kommenden Hybrid-PA vorhandenes Epitop (vgl. Beispiel 21), gereinigt. Der Antikörper der Wahl wird dann auf einer unlöslichen Matrix, wie Affigel oder Sepharose4B, immobilisiert. Das wie vorstehend beschrieben hergestellte konditionierte Medium oder der Hefezellextrakt wird dann auf eine Säule der Affinitätsmatrix aufgebracht, unerwünschte Proteine werden unter Verwendung eines geeigneten Puffers, beispielsweise Dulbecco's PBS (0,1 g/l CaCl&sub2;, 0,2 g/l KCl, 0,2 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,047 g/l MgCl&sub2;, 8,0 g/l NaCl, 1,15 g/l Na&sub2;HPO&sub4;; J. Exp. Med. 99, 167 (1954)] abgewaschen, und dann wird PA aus der Säule unter Verwendung des chaotropen Mittels Kaliumthiocyanat (vgl. M. Einarsson et al., Biochem. Biophys. Acta 830, 1-10 (1985)] oder eines Puffers mit niedrigem pH-Wert, wie 0,1 bis 0,2 M Glycin-HCl (pH 2,1), eluiert.
Nach der Reinigung unter Verwendung von monodonalen Antikörpern besitzen die Hybrid-PAs eine Reinheit von mehr als 90%.

Beispiel 23: Reinigung von UK&sub2;TPAB(BC)

a. Herstellung einer DE-3-Sepharose -Säule

Pro ml Bromcyan-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia) werden 5 mg gereinigter Inhibitor aus Erythrina latissima (F.J. Joubert et al. Hoppe-Seyler's Zeitschr. Phyiol. Chem. 302, 531 (1981)] gemäß den Angaben des Herstellers gekoppelt. Die Matrix wird mit 0,2 M Ammoniumaceatat-Puffer pH 7,0, der 0,2 M NaCl, 0,1% Synperonic und 0,02% Natriumazid enthält, equilibriert.

b. Chromatogradhische Reinigung von UK&sub2;TFAB auf DE-3 Sepharose 4B

Das konditionierte Medium (vgl. Beispiel 22) wird 0,1%ig bezüglich Synperonic gemacht und dann auf die DE-3 Sepharose aufgebracht. Nach sanftem einstündigem Rühren bei 4ºC wird die DE-3-Sepharose-4B in eine Säule gegossen und mit 0,2 M NaCl, 0,1% Synperonic gewaschen, bis die UV-Absorption bei 280 nm Grundlinienwerte erreicht, was das Fehlen von Proteinen im Eluat anzeigt. Das Waschen wird dann in 0,2 M Ammoniumaceatat-Puffer pH 7,0, der 0,2 M Ammoniumthiocyanat in 0,1% Synperonic enthält, fortgesetzt. Nachdem die UV-Absorption bei 280 nm das Fehlen von Protein in dem Eluat anzeigt, wird die Säule mit 0,2 M Ammoniumaceatat-Puffer pH 7,0, der 1,6 M Ammoniumthiocyanat und 0,1% SynperonicR enthält, eluiert. Fraktionen, die die höchsten amidolytischen Aktivitäten enthalten, wobei unter Verwendung des fluorimetrischen Assays mit Cbz-Gly- Gly-Arg-AMC als Substrat (M. Zimmermann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 750 (1978)] gemessen wird, werden vereinigt. Mindestens 80% der auf das DE-3-Sepharose-4B - Material aufgebrachten Aktivität werden in einem einzigen Peak wiedergewonnen.
Die vereinigten aktiven Fraktionen werden gegen 0,2 M Ammoniumacetat-Puffer pH 7,0, der 0,1% Synperonic enthält, dialysiert und auf eine Säule, die den monoclonalen Antikörper 407A.15.27 enthält, der gegen die erste Kringle-Domäne von t-PA gerichtet ist, und an Sepharose 4B , die mit 0,2 M Ammoniumacetat-Puffer pH 7,0, enthaltend 0,1% Synperonic , zur Entfernung von endogenern t-PA äquilibriert ist, gekoppelt ist, aufgebracht. Der die UK&sub2;TPAB(BC) enthaltende Effluent wird gewonnen.
Umkehrphasen-HPLC des gereinigten UK&sub2;TPAB(BC) auf einer Nucleosil -300-5-C18-Säule mit den Maßen 4 x 110 mm zeigt einen einzelnen Peak bei Elution mit einem linearen Gradienten über 30 Minuten, beginnend mit 70% der Lösung A, bestehend aus Wasser und 0,1% Trifluoressigsäure und 30% Lösung B, bestehend Acetonitril mit 0,08% Trifluoressigsäure, und endend bei 40% A und 60% B. Das gereinigte Protein zeigte nach N-terminaler Sequenzanalyse der ersten zehn Aminosäurereste die Sequenz SNELHQVPSN, die mit der aus der DNA-Sequenz, die das Molekül codiert, erwarteten Sequenz identisch ist.

Beispiel 24: Reinigung von FK&sub2;UPAB(BC) und K&sub2;TPAB(BC)

a) Herstellung von Antikörper-Affinitätssäulen

Kaninchen-Anti-uPA-Antikörper, die aus Kaninchen-Anti-uPA- Serum gereinigt wurden, die monoclonalen Antikörper 4058.33.3 und 406A.23.7, werden an Bromcyan-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia) gemäß den Angaben des Herstellers unter Verwendung von 6 mg Antikörper pro ml aktivierter Sepharose gekoppelt. Die Gelmatrix wird mit PBS, die 0,1% Synperonic und 0,1% Natriumazid enthält, äquilibriert.

b. Chromatogradhische Reinigung von FK&sub2;TPAB(BC) und K&sub2;UPAB auf Antikörper-Sepharose 48

Das konditionierte Medium (vgl. Beispiel 22) wird 0,1%ig bezüglich Synperonic gemacht und dann auf die Anti-uPA- Sepharose-4B oder auf die 4058.33.3- oder die 406A.23.7- Sepharose-4B aufgebracht. Die beiden zuletzt genannten Antikörper sind gegen die Kringle-Domäne von t-PA gereichtet. Nach sanftem zweistündigen Rühren bei 4ºC wird die Antikörper-Sepharose in eine Säule gegossen und mit PBS, die 1 M NaCl und 0,1% Synperonic enthält, gewaschen, bis die UV-Absorption bei 280 nm ein Fehlen von Protein im Eluat anzeigt. Die Säule wird dann mit 0,2 M Glycin-HCl- Puffer pH 2,5 eluiert. Die Fraktionen werden in Rhrchen, die eine neutralisierende Menge an 1 M Tris enthalten, gewonnen. Fraktionen, die die höchsten amidolytischen Aktivitäten enthalten, gemessen unter Verwendung des fluorimetrischen Assays mit Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC als Substrat [M. Zimmermann et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 750 (1978)] werden vereinigt.
Umkehrphasen-HPLC des gereinigten FK&sub2;UPAB(BC) und K&sub2;UPAB(BC) auf auf einer Nucleosil -300-5-C18-Säule mit den Maßen 4 x 110 mm zeigt einen einzelnen Peak jeweils bei Elution mit einem linearen Gradienten über 30 Minuten, beginnende mit 70% Lösung A, bestehend aus Wasser mit 0,1% Trifluoressigsäure und 30% Lösung B, bestehend aus Acetonitril mit 0,08% Trifluoressigsäure und endend bei 40% A und 60% B. Die N-terminale Sequenzanalyse der ersten fünf Reste der gereinigten Proteine führt zu der Sequenz SYQGN für K&sub2;UPAB(BC) und SYQVI für FK&sub2;UPAB(BC), die mit den Sequenzen, die mit den DNA-Sequenzen, die jedes Molekül codieren, identisch sind.

Beispiel 25: Aktivitäts-Assay von hybriden Plasminogenaktivatoren in Anwesenheit und Abwesenheit von Fibrinogenfragmenten

Der Doppelumsatz-Assay, wie beschrieben von Verheyen et al. [Thromb. Haemost. 48, 266 (1982)], basierend auf der Umwandlung von Plasminogen in Plamin durch den Plasminogenaktivator, gefolgt von der Reaktion von Plasmin mit dem chromogenen Plasminsubstrat H-D-Valyl-L-leucyl-L-lysin-p- Nitroaniliddihydrochlorid, wird verwendet. Der Assay wird in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen und mit einem Titertek -Mikrotiterplatten-Lesegerät durchgeführt. Die Kavitäten enthalten 120-X µl 0,1 mol/l Tris HCl-Puffer pH 7,5, enthaltend 0,1% Tween 80, 20 µl Glu-Plasminogen bei 1,3 µmol/l in dem vorstehend genannten Trispuffer, 100 µl Plasminsubstrat in einer Konzentration von 0,7 mmol/l in Trispuffer, X µl Probe in einer bekannten Konzentration (X entspricht 10, 20, 40 bzw. 60 µl) oder einem Urokinase- Standard mit einer bestimmten Aktivität, die als internationale Einheiten ausgedrückt ist, und 100 µl Stimulator (Fibrinogenfragmente) in einer Konzentration von 3 mg/ml in destilliertem Wasser oder 10 µl destilliertes Wasser, wenn die Versuche ohne Stimulator durchgeführt werden sollen. Die erhöhte Lichtabsorption, geteilt durch das Quadrat der Inkubationszeit, ist der Aktivität des Plasminogenaktivators in einer bekannten Konzentration an Aktivator proportional und wird in internationalen Einheiten ausgedrückt. Urokinase mit hohem Molekulargewicht mit einer definierten Aktivität, die als internationale Einheiten (American Diagnostics) ausgedrückt ist, wurde als Standard verwendet. Jeder Plasminogenaktivator wurde unter identischen Bedingungen in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von Fibrinogenfragmenten getestet. Unter diesen Bedingungen ist der erhaltene Aktivitätsunterschied ein Maß für die Stimulierung der Plasminogenaktivatoren durch die Fibrinogenfragmente. Die Tabelle 2 enthält die Ergebnisse der Analyse, die die fehlende Stimulierung für den Urokinase-Standard im Gegensatz zur Stimulierung, die durch die Fibrinogenfragmente auf die neuen Plasminogenaktivator-Moleküle, die die katalytische Domäne von Urokinase enthalten, ausgeübt wird. Unabhängig von der Abwesenheit einer oder mehrerer nicht-katalytischer Domänen F, G, K1 oder K2 des Gewebsplasminogenaktivators wird eine Stimulierung durch Fibrinogenfragmente für alle getesteten Hybridmoleküle beobachtet. Tabelle 2

Beispiel 26: Aktivität der mutierten Plasminogenaktivatoren bezüglich Gerinnsellyse

Die Aktivitäten bezüglich Gerinnsellyse werden unter Verwendung des von R.D. Philo und J.J. Gaffney [Thromb. Haemost. 45, 107-109 (1981)] beschriebenen Assays bestimmt. Eine logarithmische Auftragung der Lysezeit gegen die Konzentration des Plasminogenaktivators führt zu einer geraden Linie. Die spezifische Aktivität eines Plasminogenaktivators wird durch Vergleich mit den Kurven aus einem Standardpräparat eines Gewebsplasminogenaktivators oder Urokinase bestimmt.
Die Kurven aller gemessen Aktivatoren besitzen in etwa die gleiche Neigung, was eine direkte Beziehung zwischen der Zeit, die für die Gerinnsellyse benötigt wird, und ihrer spezifischen Aktivität erlaubt. Da die verschiedenen Plasminogenaktivatoren nicht die gleiche molekulare Masse besitzen, müssen die spezifischen Aktivitäten in einer molaren Konzentration anstelle der üblichen Gewichtskonzentration ausgedrückt werden, um aussagekräftige Kriterien für die Effizienz der unterschiedlichen Moleküle zu erhalten. Es wird gefunden, daß UK&sub2;TPAB(BC) mindestens so aktiv wie der Standard-t-PA ist, wohingegen FGK&sub2;UPAB(BC) und FK&sub2;UPAB(BC) Aktivitäten zeigen, die zu t-PA fast gleich sind, aber signifikant h:her als der u-PA-Standard sind. Es wird gefunden, daß K&sub2;UPAB(BC) eine fast identische Aktivität mit dem u-PA-Standard besitzt. Die Aktivitäten des Assays sind der Tabelle 3 zusammengefaßt. Tabelle 3
Gerinnsellyse-Einheiten sind in picomol t-PA ausgedrückt. wobei die molekulare Masse von t-PA basierend auf dessen Aminosäuresequenz und eine spezifische Aktivität von 400.000 Gerinnsellyse-Einheiten/mg angenommen werden.

Beispiel 27: Clearance der mutierten Plasminogenaktivatormoleküle aus dem Kreislauf von Kaninchen

1. Markierung

Alle mutierten Moleküle werden mit 125I unter Verwendung des Iodogen-Verfahrens radioaktiv markiert [P.J Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, 849-857 (1978)].
Um überschüssiges freies 1251 zu entfernen, werden die mutierten Moleküle entweder unter Verwendung des in Beispiel 23 beschriebenen Verfahrens (PAs mit der t-PA-B-Kette) oder des in Beispiel 24 beschriebenen Verfahrens (PAs mit der u-PA-B-Kette) affinitätsgereinigt.
Spezifische Radioaktivitäten von 2 bis 20 µCi/µg Protein werden üblicherweise erhalten. Die Homogenität der markierten Moleküle wird durch SDS-Elektrophorese, gefolgt von Röntgenautoradiographie, bewertet. In allen Fällen wandern die mutierten Moleküle unter nicht-reduzierenden Bedingungen als einzelne Banden mit Molekulargewichten, die den nicht-markierten Proteinen identisch sind.

2. Clearance-Studien

Die Experimente werden an weißen New-Zealand-Kaninchen mit einem Gewicht von 1,8 bis 2,4 kg durchgeführt. Die Tiere werden mit 1750 mg/kg Urethan (Merck, Darmstadt, Deutschland) subkutan anästhesiert. Die Tracheotomie wird durchgeführt und ein Plastikröhrchen wird in die externe Vena jugularis und die allgemeine Carotisarterie insertiert. 0,5 ml Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, die etwa 300 bis 500 ng des mutierten PAs enthält, wird in die Vena jugularis injiziert und aufeinanderfolgende Blutproben (jeweils 2 ml) werden aufeinanderfolgend über ein 60minütiges Intervall über die Carotisarterie entnommen.
Die Blutproben werden in Citrat gewonnen, dann sofort 15 Minuten lang bei 3000 UpM zentrifugiert und das Plasma wird dekantiert. Aliquote werden in 10%iger Trichloressigsäure ausgefällt und die Pellets werden in einem γ-Zähler ausgezählt.
Im Vergleich zu aus der Bowes-Melanom-Zellinie isoliertem t-PA zeigen die mutierten Moleküle die folgenden Halbwertszeiten im Kreislauf. Tabelle 4
Das Clearance-Muster von t-PA ist typischerweise biexponentiell mit einer sehr raschen α-Phase, gefolgt von einer langsamen β-Phaseneliminierung. Die Eliminierung von UK&sub2;TPAB(BC) und K&sub2;UPAB(BC) ist fast monophasisch, was nahelegt, daß die Verteilung in einen zweiten Reaktionsraum unterdrückt ist.

3. Organverteilung

Die Kaninchen werden wie vorstehend behandelt. 20 Minuten nach der Injektion der iodierten mutierten Moleküle werden die Kaninchen getötet, die Hauptorgane werden entnommen, ihr Gewicht bestimmt und ein Aliquot wird nach Homogenisierung in einem γ-Zähler ausgezählt. Tabelle 5
Die mutierten PAs zeigen einen größeren Anteil der radioaktiven Moleküle, die immer noch im Kreislauf verbleiben (siehe vorstehend), der mit einer stark verringerten Leber-Clearance übereinstimmt. Die verringerte Aufnahme durch die Leber ist daher die Erklärung für die verlängerte Halbwertszeit und das monophasische Eliminierungsmuster der mutierten Moleküle, insbesondere von UK&sub2;TPAB(BC) und K&sub2;UPAB(BC).
In den Beispielen 28 bis 34 werden die Plasmide pCGC5/K&sub2;UPAB, pCGC6/FUPAB, pCGC7 /FK&sub2;UPAB (BC) und pCGCB/FGK&sub2;UPAB (vgl. Beispiel 18) verwendet, um Hefeexpressionsplasmide zu konstruieren. Die Hefe-Invertase- Signalsequenz wird im Leseraster an unterschiedliche codie rende Sequenzen fusioniert. Diese werden unter der Kontrolle des induzierbaren PHO5-Promotors exprimiert. In einigen Konstruktionen sind die Glycosylierungsstellen mutiert.

Beispiel 28: Clonierung des Replikations-Origins des Phagen F1 in den Expressionsvektor pJDB207:

Die Plasmide der pEMBL-Familie [Dente al al., Nucl. Acids Res. 11, 1645-55 (1983)] enthalten eine Region des Genoms des Phagen F1, das alle cis-wirkenden Elemente für die DNA-Replikation und -Morphogenese liefert. Nur nach Superinfektion mit dem Phagen F1 (Helfer) wird eine große Menge einzelsträngiger Plasmid-DNA in das Medium ausgeschieden.
Das Plasmid pEMBL19(+) wird mit ScaI und EcoRI gespalten. Ein 2,2-kb-Fragment wird isoliert, das einen Teil des Ampicillin-Resistenzgens von pBR322 (ScaI-Spaltstelle), die intergene F1-Region und ein Teil des β-Galactosidasegens bis zu der Polylinkerregion (EcoRI-Spaltstelle) enthält.
Das Plasmid pJDB207 wird durch Spalten mit HpaI linearisiert. 10 µg des linearisierten Plasmids werden mit 7,5 Einheiten EcoRI in Gegenwart von 0,1 mg/ml Ethidiumbromid 40 Minuten lang bei 37ºC teilgespalten. Die Reaktion wird durch Zugabe von 10 mM EDTA gestoppt. Das 1,8-kb-EcoRI- HpaI-Fragment wird auf einem präparativen 0,8%igen Agarosegel isoliert.
3 µg HpaI-gespaltenes pJDB207 werden weiter mit ScaI gespalten. Das 4,8 kb große HpaI-ScaI-Fragment wird isoliert. Die DNA-Fragmente werden aus den Agarosegelbiöcken elektrisch eluiert, mit DE52-Chromatographie gereinigt und mit Ethanol gefällt.
0,2 pmol jedes der 2,2 kb großen ScaI-EcoRI-Fragmente und das 1,8 kb große EcoRI-HpaI-Fragment und 0,1 pmol des HpaI-ScaI-Vektorfragments werden ligiert. Das Ligierungsgemisch wird zur Transformation kompetenter E. coli-HB101- Ca²&spplus;-Zellen verwendet.
Die Plasmid-DNA von 12 Ampicillin-resistenten Kolonien wird durch doppelte Spaltung mit EcoRI/PstI analysiert. Die DNA eines einzelnen Clons mit den korrekten Restriktionsfragmenten wird gewählt und als pJDB207F1Lac bezeichnet.

Beispiel 29: Konstruktion des Plasmids pJDB207/PHO5-I- FK&sub2;UPAB:

Die codierende Sequenz von FK&sub2;UPAB, wie sie in dem Plasmid pCGC7/FK&sub2;UPAB vorhanden ist, wird zur Expression in Hefe durch Fusionen der Hefe-Invertase-Signalsequenz und Exprimieren des Gens unter der Kontrolle des PHO5-Promotors angepaßt.
Das Plasmid pCGC7/FK&sub2;UPAB (siehe Beispiel 18D) wird mit PstI und BamHI gespalten. Das 1147 bp große PstI-BamHI- Fragment enthält die FK&sub2;UPAB-codierende Sequenz von der PstI-Spaltstelle an der Nukleotid-Position 199 von t-PA (Fig. 1) bis zu der BamHI-Spaltstelle in Position 1322 von u-PA (Fig. 3).
Das Plasmid pJDB207/PH05-I-TPA (siehe Beispiel 6C) wird mit SalI und PstI gespalten. Das 891 bp große Fragment wird isoliert. Es enthält den PHO5-Promotor, die Invertase-Signalsequenz und 19 Basen von t-PA (PstI-Spaltstelle).
Das Plasmid pJDB207/PHO5-I-UPA (siehe Beispiel 8) wird mit SalI und BamHI gespalten. Das 6,6-kb-Vektorfragment enthält ein 3'-Teil des u-PA-Gens von der BamHI-Spaltstelle in der Nukleotid-Position 1323 (Fig. 3) bis zu der Position 1441 (die PvuII-Spaltstelle mit dem XhoI-Linker wird angefügt) und die PHO5-Transkriptions-Terminationssignale.
0,2 pmol jeweils an dem 891-bp-SalI-PstI-Fragment und dem 1147-bp-PstI-BamHI-Fragment und 0,1 pmol des 6,6-kb-SalI- BamHI-Vektorfragments werden ligiert und zur Transformation von E. coli-HB101-Ca²&spplus;-Zellen verwendet.
8 Ampicillin-resistente Kolonien werden in Ampicillin-haltigem LB-Medium (100 mg/l) gezüchtete. Die Plasmid-DNA wird isoliert und durch EcoRI- und HindIII-Restriktionsspaltung analysiert. Ein Plasmid mit den erwarteten Restriktionsfragmenten wird ausgewählt und als pJDB207/PHO5- I-FK&sub2;UPAB bezeichnet.
Die Plasmide pCGC6/FUPAB und pCGCB/FGK&sub2;UPAB können wie pCGC7/FK&sub2;UPAB verwendet werden. Die so erhaltenen Hefeexpressionsplasmide werden als pJDB207/PHO5-I-FIPAB bzw. pJDB207/PHO5-I-FGK&sub2;UPAB bezeichnet.
Nach der Extension und der Ligierungsreaktion werden kompetente E. coli-BMH71-Ca²&spplus;-Zellen transformiert. Die Plasmid-DNA Ampicillin-resistenter Transformanten wird hergestellt und auf die Anwesenheit beider Mutationen durch DNA-Sequenzierung mit den angegebenen Sequenzier-Primern analysiert.
Die Plasmid-DNA eines don mit beiden Mutationen wird als pJDB207F1Lac/PHO5-I-UK&sub2;TPAB-YZ bezeichnet. Y bezeichnet die Mutation der Glycosylierungsstelle in Asn184 und Z die Mutation in Asn448. Das nicht-glycosylierte hybride UK&sub2;TPAB-Protein besitzt zwei Aminosäureaustausche: Ser186 TAla in dem K&sub2;-Kringle von t-PA und Thr450 TAla in der t-PA-B-Kette.
Das Mutationsprotokoll kann auch auf die Matrizen von
pJDB207F1Lac/PHO5-I-UK&sub2;UPAB,
pJDB207F1Lac/PHO5-I-TPAAUPAB und
pJDB207F1Lac/PHO5-I-UPAATPAB (siehe Beispiel 31)
mit dem Mutageneseprimer W für die Mutation der Glycosylierungsstelle in der u-PA-B-Kette und/oder den Mutageneseprimern Y und Z und anderen, die in der Europäischen Fatentanmeldung Nr. 225 286 veröffentlicht sind, für die Mutation der Glycosylierungsstellen in t-PA angewendet werden.

Beispiel 35: Transformation von Saccharomyces cerevisiae GRF18 und Herstellen von Hefezellextrakten

Die Plasmide pJDB207/PHO5-I-FK&sub2;UPAB,
pJDB207F1Lac/PHO5-I-UK&sub2;TPAB,
pJDB207/PHO5-I-FUPAB,
pJDB207/PHO5-I-FGK&sub2;UPAB
werden in den Saccharomyces-cerevisiae-Stamm GRF18 transformiert. Die Transformation, das Zellwachstum und Herstellung der Zellextrakte sind in Beispiel 16 beschrieben.
Die so erhaltenen hybriden Plasminogenaktivatoren können analog, wie in den Beispielen 22 bis 24 beschrieben, gereinigt werden.

Beispiel 36: Herstellung von lyophilisierten hybriden Plasminogenaktivatoren

Die in jedem der Beispiele 22 bis 24 erhaltene Lösung wird wie folgt weiter gereinigt und lyophilisiert:
Die Lösung wird mit 10 Volumina 0,1 M Ammoniumacetat pH 5,0 (Gesamtvolumen 80 ml) verdünnt und auf eine Säule, die 5 ml CM-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) enthält, mit einer Fließgeschwindigkeit von 25 ml/h bei Raumtemperatur aufgebracht. (Die Säule wurde mit 1 M Ammoniumacetat vorequilibriert.) Das produktfreie Percolat wird verworfen. Die Säule wird 50 ml 0,1 M Ammoniumacetat pH 5,0 und mit 10 ml 0,1 Ammoniumacetat pH 7,0 gewaschen. Die Elution des adsorbierten hybriden PA wird mit 1 M Ammoniumacetat pH 8,6 bei Raumtemperatur (Fließgeschwindigkeit 5 ml/h) durchgeführt. Um Gasbildung in der Säule zu vermeiden, wird die Elution mit einem Überdruck von 1 bis 1,5 bar durchgeführt. Der Gehalt an hybridern PA im Eluat wird mit einem UV-Monitor (280 nm) gemessen. Eine Fraktion, die etwa 90% des eluierten hybriden PAs enthält, wird gewonnen und lyophilisiert. Die Reinheit des festen hybriden PA-Lyophilisats beträgt etwa oder mehr als 95% gemäß HPLC. Das Produkt ist frei von Detergentien.

Beispiel 37: Erstes pharmazeutisches Präparat für die parenterale Verabreichung

Eine Lösung, die reinen u-PA(1-44)-TPA(176-527), erhalten wie vorstehend beschrieben, enthält, wird gegen eine 0,3 molare Natriumchloridlösung, die 0,01% Tween 80 enthält, dialysiert und bei -80ºC gelagert. Vor der Verabreichung wird die Konzentration auf 75 µg/ml Gesamt-PA und 0,3 M NaCl eingestellt. Die Lösung wird durch Filtration durch ein 0,22 µm Membranfilter sterilisiert.
Anstelle des vorstehend genannten PAs ist es möglich, die gleiche Menge eines anderen PAs, der in den vorstehenden Beispielen beschrieben wurde, zu verwenden, wie beispielsweise uPA(1-158)-tPA(276-527),
uPA(1-131)-tPA(263-527), tPA(1-275)-uPA(159-411),
tPA(1-26Z)-uPA(132-411), uPA(1-44)-tPA(176-261)-uPA(134-411),
tPA(1-49)-tPA(262-275)-uPA(159-411), tPA(1-49)-uPA(134-411),
tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411),
tPA(1-49)-tPA(176-262)-uPA(132-411),
tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411),
tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411) oder
tPA(1-86)-tPA(176-262)-uPA(132-411).

Beispiel 38: Zweites pharmazeutisches Präparat für die parenterale Verabreichung (Dispersion zur Injektion)

169,3 mg Sojabohnenlecithin (Sojabohnen-Phosphatid NC 95, Hersteller: Nattermann, Köln, Deutschland; Reinheit 90 bis 96%, Zusammensetzung der Fettsäuren: Linolsäure 61-71%, Linolensäure 4-7%, Ölsäure 6-13%, Palmitinsäure 10-15%, Stearinsäure 1,5-3,5%) und 92,7 mg reines Natriumglycocholat werden in 752,5 ml sterilisiertem Wasser aufgelöst. Die Lösung wird mit 1 N NaOH auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt. 10 mg lyophilisierter uPA(1-44)-TPA(176-527) werden zugesetzt. Das Gemisch wird bis zum Erhalt einer klaren Lösung gerührt. Die Lösung wird durch Filtration durch ein 0,22 µm Membranfilter sterilisiert und in Ampullen gefüllt. Anstelle des vorstehend genannten PAs ist es auch möglich, die gleiche Menge eines anderen PAs, der in den vorstehenden Beispielen beschrieben wurde, zu verwenden, wie beispielsweise uPA( 1-158) -tPA(276-527),
uPA(1-131)-tPA(263-527), tPA(1-275)-uPA(159-411),
tPA(1-262)-uPA(132-411), uPA(1-44)-tPA(176-261)-uPA(134-411),
tPA(1-49)-tPA(262-275)-uPA(159-411), tPA(1-49)-uPA(134-411),
tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411),
tPA(1-49)-tPA(176-262)-uPA(132-411),
tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411),
tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411) oder
tPA(1-86)-tPA(176-262)-uPA(132-411).

Beispiel 39: Drittes pharmazeutisches Präparat für die parenterale Verabreichung (einschließlich Bolus-Injektion)

100 mg des hybriden Plasminogenaktivators oder des mutierten hybriden Plasminogenaktivators, wie einer der in Beispiel 37 und 38 genannten, wird in 1000 ml 50 mM Glutaminsäure/Natriumglutamat, enthaltend 0,7% NaCl, pH 4,5, aufgelöst. Die Lösung wird in Ampullen gefüllt und kann für die intravenöse (Bolus-)Infusion verwendet werden.

Hinterlegung von Mikroorganismen

Die folgenden Stämme wurden am 23. Oktober 1987 bei der "Deutschen Sammlung von Mikroorganismen" (DSM, Grisebachstr. 8, D-3000 Göttingen (Hinterlegungsnummern sind angegeben) hinterlegt:
Die folgenden Hybridoma-Zellinien wurden am 20. November 1987 bei der "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes", Institut Pasteur, Paris (CNCM) unter den angegebenen Hinterlegungsnummern hinterlegt.

Claims

1. Einkettiger hybrider Plasminogenaktivator, bestehend aus

a) der menschlichen t-PA-Kringle-2-Domäne, der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne und einer Verbindungssequenz, die die menschliche t-PA-Kringle-2-Domäne mit der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne verknüpft, wobei die Verbindungssequenz aus der Gruppe, bestehend aus der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichem t-PA verknüpft, der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichem u-PA verknüpft, und einer hybriden Verbindungssequenz, bestehend aus Subsequenzen der Verbindungssequenzen, ausgewählt ist, wobei die Verbindungssequenzen und die hybriden Verbindungssequenzen eine Prozessierungsstelle, die von Plasmin gespalten werden kann, und N-terminal dazu, einen Cysteinrest, der eine Schwefel-Schwefel-Brücke zu der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne bilden kann, umfassen;

und gegebenenfalls zusätzlich eine oder mehrere Sequenzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

(i) der Verbindungssequenz, die N-terminal die Kringle-2-Domäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon, wobei die Verbindungssequenz oder das Fragment davon in dem hybriden Plasminogenaktivator N-terminal zu der menschlichen t-PA-Kringle-2-Domäne positioniert ist; und

(ii) der T-Region von menschlichem t-PA oder einem N- terminalen Fragment davon, wobei die T-Region oder das Fragment davon am N-Terminus des hybriden Plasminogenaktivators positioniert ist;

b) der menschlichen t-PA-Fingerdomäne, der menschlichen t-PA-Kringle-2-Domäne, der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne und einer Verbindungssequenz, die die menschliche t-PA-Kringle-2-Domäne mit der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne verknüpft, wobei die Verbindungssequenz aus der Gruppe, bestehend aus der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichem t-PA verknüpft, der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B- Kette in menschlichem u-PA verknüpft und einer hybriden Verbindungssequenz, bestehend aus Subsequerizen der Verbindungssequenzen, ausgewählt ist, wobei die Verbindungssequenzen und die hybriden Verbindungssequenzen eine Prozessierungsstelle, die durch Plasmin gespalten werden kann, und N-terminal dazu, einen Cysteinrest, der eine Schwefel- Schwefel-Brücke an die menschliche katalytische u-PA-Domäne bilden kann, umfassen;

(i) der Verbindungssequenz, die C-terminal die Fingerdomäne in menschlichem t-PA flankiert, der Verbindungssequenz, die N-terminal die Kringle-2-Domäne von menschlichem t-PA flankiert, oder einer fusionierten Verbindungssequenz, bestehend aus beiden Verbindungssequenzen oder Fragmenten davon, wobei die Verbindungssequenz oder die fusionierte Verbindungssequenz zwischen der t-PA-Fingerdomäne und der t-PA-Kringle-2-Domäne in dem hybriden Plasminogenaktivator positioniert ist; und

(c) der menschlichen t-PA-Fingerdomäne, der menschlichen t-PA-Wachstumsfaktordomäne, der menschlichen t-PA- Kringle-2-Domäne, der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne und einer Verbindungssequenz, die die menschliche t- PA-Kringle-2-Domäne mit der menschlichen katalytischen u- PA-Domäne verknüpft, wobei die Verbindungssequenz aus der Gruppe, bestehend aus der Verbindungssequenz, die die A- Kette mit der B-Kette in menschlichem t-PA verknüpft, der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichem u-PA verknüpft, und einer hybriden Verbindungssequenz, bestehend aus Subsequenzen der Verbindungssequenzen, ausgewählt ist, wobei die Verbindungssequenzen und die hybriden Verbindungssequenzen eine Prozessierungsstelle, die durch Plasmin gespalten werden kann, und N- terminal dazu, einen Cysteinrest, der eine Schwefel-Schwefel-Brücke zu der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne bilden kann, umfassen;

(i) der Verbindungssequenz, die C-terminal die Fingerdomäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon, der Verbindungssequenz, die N-terminal die t-PA- Wachstumsfaktordomäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon oder einer fusionierten Verbindungs- Sequenz, bestehend aus beiden Verbindungssequenzen oder Fragmenten davon, wobei die Verbindungssequenzen oder fusionierten Verbindungssequenzen zwischen der Finger- und Wachstumsfaktordomane in dem hybriden Plasminogenaktivator positioniert sind;

(ii) der Verbindungssequenz, die C-terminal die Wachstumsfaktordomäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon, der Verbindungssequenz, die N-terminal die Kringle-2-Domäne in menschlichem t-PA flankiert, oder einem Fragment davon oder einer fusionierten Verbindungssequenz, bestehend aus beiden Verbindungssequenzen oder Fragmenten davon, wobei die Verbindungssequenzen oder fusionierten Verbindungssequenzen zwischen der Wachstumsfaktor- und Kringle-2-Domäne in dem hybriden Plasminogenaktivator positioniert sind; und

(iii) der T-Region von menschlichem t-PA oder einem N- terminalen Fragment davon, wobei die T-Region oder das Fragment davon am N-Terminus des hybriden Plasminogenaktivators positioniert ist.

2. Einkettiger hybrider Plasminogenaktivator nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus tPA(1- 3)-tPA(176-275)-uPA(159-411), tPA(1-49)-tPA(176-275)- uPA(159-411) und tPA(1-86)-tPA(176-275)-uFA(159-411)

3. Einkettiger hybrider Plasminogenaktivator nach Anspruch 1, der tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411) ist.

4. DNA-Sequenz, die einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, bestehend aus

a) der menschlichen t-PA-Kringle-2-Domäne, der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne und einer Verbindungssequenz, die die menschliche t-PA-Kringle-2-Domäne mit der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne verknüpft, wobei die Verbindungssequenz aus der Gruppe, bestehend aus der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichem t-PA verknüpft, der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichem u-PA verknüpft und einer hybriden Verbindungssequenz, bestehend aus Subsequenzen der Verbindungssequenzen, ausgewählt ist, wobei die Verbindungssequenzen und die hybriden Verbindungssequenzen eine Prozessierungsstelle, die von Plasmin gespalten werden kann, und N-terminal dazu, einen Cysteinrest, der eine Schwefel-Schwefel-Brücke zu der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne bilden kann, umfassen;

(i) der Verbindungssequenz, die N-terminal die Kringle- 2-Domäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon, wobei die Verbindungssequenz oder das Fragment davon in dem hybriden Plasminogenaktivator N-terminal zu der menschlichen t-PA-Kringle-2-Domäne positioniert ist; und

b) der menschlichen t-PA-Fingerdomäne, der menschlichen t-PA-Kringle-2-Domäne, der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne und einer Verbindungssequenz, die die menschliche t-PA-Kringle-2-Domäne mit der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne verknüpft, wobei die Verbindungssequenz aus der Gruppe, bestehend aus der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichem t-PA verknüpft, der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B- Kette in menschlichem u-PA verknüpft und einer hybriden Verbindungssequenz, bestehend aus Subsequenzen der Verbindungssequenzen, ausgewählt ist, wobei die Verbindungssequenzen und die hybriden Verbindungssequenzen eine Prozessierungsstelle, die durch Plasmin gespalten werden kann, und N-terminal dazu, einen Cysteinrest, der eine Schwefel- Schwefel-Brücke an die menschliche katalytische u-PA-Domäne bilden kann, umfassen;

(c) der menschlichen t-PA-Fingerdomäne, der menschlichen t-PA-Wachstumsfaktordomäne, der menschlichen t-PA- Kringle-2-Domäne, der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne und einer Verbindungssequenz, die die menschliche t- PA-Kringle-2-Domane mit der menschlichen katalytischen u- PA-Domäne verknüpft, wobei die Verbindungssequenz aus der Gruppe, bestehend aus der Verbindungssequenz, die die A- Kette mit der B-Kette in menschlichem t-PA verknüpft, der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichem u-PA verknüpft und einer hybriden Verbindungssequenz, bestehend aus Subsequenzen der Verbindungssequenzen, ausgewählt ist, wobei die Verbindungssequenzen und die hybriden Verbindungssequenzen eine Prozessierungsstelle, die durch Plasmin gespalten werden kann, und N- terminal dazu, einen Cysteinrest, der eine Schwefel-Schwefel-Brücke zu der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne bilden kann, umfassen;

(i) der Verbindungssequenz, die C-terminal die Fingerdomäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon, der Verbindungssequenz, die N-terminal die t-PA- Wachstumsfaktordomäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon oder einer fusionierter Verbindungssequenz, bestehend aus beiden Verbindungssequenzen oder Fragmenten davon, wobei die Verbindungssequenzen oder fusionierten Verbindungssequenzen zwischen der Finger- und Wachstumsfaktordomäne in dem hybriden Plasminogenaktivator positioniert sind;

(ii) der Verbindungssequenz, die C-terrninal die Wachstumsfaktordomäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon, der Verbindungssequenz, die N-terminal die Kringle-2-Domäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon, oder einer fusionierten Verbindungssequenz, bestehend aus beiden Verbindungssequenzen oder Fragmenten davon, wobei die Verbindungssequenzen oder fusionierten Verbindungssequenzen zwischen der Wachstumsfaktor- und Kringle-2-Domane in dem hybriden Plasminogenaktivator positioniert sind; und

(iii) der T-Region von menschlichem t-PA oder einem N- terminalen Fragment davon, wobei die T-Region oder das Fragment davon am N-Terminus des hybriden Plasminogenaktivators positioniert ist, codiert.

5. DNA-Sequenz nach Anspruch 4, die einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus tPA(1-3)-tPA(176-275)-UFA(159-411), tPA(1- 49Y-tPA(176-275)-uPA(159-411) und tPA(1-86)-tPA(176-275) uPA(159-411), codiert.

6. DNA-Sequenz nach Anspruch, die einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, der tPA(1-3)-tPA(176-275)- uPA(159-411) ist, codiert.

7. Hybridvektor zur Verwendung in einem eukaryotischen Wirt, umfassend eine DNA-Sequenz, die einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, bestehend aus

a) der menschlichen t-PA-Kringle-2-Domäne, der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne und einer Verbindungssequenz, die die menschliche t-PA-Kringle-2-Domäne mit der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne verknüpft, wobei die Verbindungssequenz aus der Gruppe, bestehend aus der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichem t-PA verknüpft, der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichem u-PA verknüpft und einer hybriden Verbindungssequenz, bestehend aus Subsequenzen der Verbindungssequenzen, ausgewählt ist, wobei die Verbindungssequenzen und die hybriden Verbindungssequenzen eine Frozessierungsstelle, die von Plasmin gespalten werden kann, und N-terminal dazu, einen Cysteinrest, der eine Schwefel-Schwefel-Brücke zu der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne bilden kann, umfassen;

(ii) der T.-Region von menschlichem t-PA oder einem N- terminalen Fragment davon, wobei die T-Region oder das Fragment davon am N-Terminus des hybriden Plasminogenaktivators positioniert ist;

(i) der Verbindungssequenz, die C-terminal die Fingerdomäne in menschlichem t-PA flankiert, der Verbindungssequenz, die N-terminal die Kringle-2-Domäne von menschlichem t-PA flankiert, oder einer fusionierten Verbindungs- Sequenz, bestehend aus beiden Verbindungssequenzen oder Fragmenten davon, wobei die Verbindungssequenz oder die fusionierte Verbindungssequenz zwischen der t-PA-Fingerdomäne und der t-PA-Kringle-2-Domäne in dem hybriden Flasminogenaktivator positioniert ist; und

(c) der menschlichen t-PA-Fingerdomäne, der menschlichen t-PA-Wachstumsfaktordomäne, der menschlichen t-PA- Kringle-2-Domäne, der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne und einer Verbindungssequenz, die die menschliche t- PA-Kringle-2-Domane mit der menschlichen katalytischen u- PA-Domäne verknüpft, wobei die Verbindungssequenz aus der Gruppe, bestehend aus der Verbindungssequenz, die die A- Kette mit der B-Kette in menschlichem t-PA verknüpft, der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichem u-PA verknüpft und einer hybriden Verbindungssequenz, bestehend aus Subsequenzen der Verbindungssequenzen, ausgewählt ist, wobei die Verbindungssequenzen und die hybriden Verbindungssequenzen eine Frozessierungsstelle, die durch Plasmin gespalten werden kann, und Nterminal dazu, einen Cysteinrest, der eine Schwefel-Schwefel-Brücke zu der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne bilden kann, umfassen;

(i) der Verbindungssequenz, die C-terminal die Fingerdomäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon, der Verbindungssequenz, die N-terminal die t-PA- Wachstumsfaktordomäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon oder einer fusionierten Verbindungssequenz, bestehend aus beiden Verbindungssequenzen oder Fragmenten davon, wobei die Verbindungssequenzen oder fusionierten Verbindungssequenzen zwischen der Finger- und Wachstumsfaktordomäne in dem hybriden Plasminogenaktivator positioniert sind;

(ii) der Verbindungssequenz, die C-terminal die Wachstumsfaktordomäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon, der Verbindungssequenz, die N-terminal die Kringle-2-Domäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon, oder einer fusionierten Verbindungssequenz, bestehend aus beiden Verbindungssequenzen oder Fragmenten davon, wobei die Verbindungssequenzen oder fusionierten Verbindungssequenzen zwischen der Wachstumsfaktor- und Kringle-2-Domane in dem hybriden Plasminogenaktivator positioniert sind; und

8. Hybridvektor nach Anspruch 7 zur Verwendung in einem eukaryotischen Wirt, umfassend eine DNA-Sequenz, die einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus tPA(1-3)-tPA(176-275)- uPA(159-411), tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411) und tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411), codiert.

9. Hybridvektor nach Anspruch 7 zur Verwendung in einem eukaryotischen Wirt, umfassend eine DNA-Sequenz, die einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, der tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411) ist, codiert.

10. Eukaryotische Wirtszelle, transformiert mit einem Hybridvektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, bestehend aus

(ii) der T-Region von menschlichem t-PA oder einem N- terminalen Fragment davon, wobei die T-Region oder das Fragment davon am N-Terminus des hybriden Plasminogenaktivaters positioniert ist;

b) der menschlichen t-PA-Fingerdomäne, der menschlichen t-PA-Kringle-2-Domäne, der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne und einer Verbindungssequenz, die die menschliche t-PA-Kringle-2-Domäne mit der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne verknüpft, wobei die Verbindungssequenz aus der Gruppe, bestehend aus der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichem t-PA verknüpft, der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B- Kette in menschlichem u-PA verknüpft und einer hybriden Verbindungssequenz, bestehend aus Subsequenzen der Verbindungssequenzen, ausgewählt ist, wobei die Verbindungssequenzen und die hybriden Verbindungssequenzen eine Frozessierungsstelle, die durch Plasmin gespalten werden kann, und N-terminal dazu, einen Cysteinrest, der eine Schwefel- Schwefel-Brücke an die menschliche katalytische u-PA-Domane bilden kann, umfassen;

(ii) der Verbindungssequenz, die C-terminal die Wachstumsfaktordomäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon, der Verbindungssequenz, die N-terminal die Kringle-2-Domäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon, oder einer fusionierten Verbindungssequenz, bestehend aus beiden Verbindungssequenzen oder Fragmenten davon, wobei die Verbindungssequenzen oder fusionierten Verbindungssequenzen zwischen der Wachstumsfaktor- und Kringle-2-Domäne in dem hybriden Plasminogenaktivator positioniert sind; und

11. Eukaryotische Wirtszelle nach Anspruch 10, transformiert mit einem Hybridvektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus tPA(1-3)- tPA(176-275)-UPA(159-411), tPA(1-49)-tPA(176-275)-UPA(159- 411) und tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411), codiert.

12. Eukaryotische Wirtszelle nach Anspruch 10, transformiert mit einem Hybridvektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, der tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411) ist, codiert.

13. Verfahren zur Produktion eines einkettigen hybriden Plasminogenaktivators, bestehend aus

(i) der Verbindungssequenz, die C-terminal die Fingerdomane in menschlichem t-PA flankiert, der Verbindungssequenz, die N-terminal die Kringle-2-Domäne von menschlichem t-PA flankiert, oder einer fusionierten Verbindungssequenz, bestehend aus beiden Verbindungssequenzen oder Fragmenten davon, wobei die Verbindungssequenz oder die fusionierte Verbindungssequenz zwischen der t-PA-Fingerdomäne und der t-PA-Kringle-2-Domäne in dem hybriden Plasminogenaktivator positioniert ist; und

(iii) der T-Region von menschlichem t-PA oder einem N- terminalen Fragment davon, wobei die T-Region oder das Fragment davon am N-Terminus des hybriden Plasminogenaktivators positioniert ist,

wobei man unter geeigneten Nährbedingungen einen transformierten eukaryotischen Wirt, der eine DNA-Sequenz, die den hybriden Plasminogenaktivator codiert, enthält, züchtet und den hybriden Plasminogenaktivator isoliert.

14. Verfahren nach Anspruch 13 zur Produktion eines einkettigen hybriden Plasminogenaktivators, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159- 411), tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411) und tPA(1-86)-t-PA(176-275)-uPA(159-411)

15. Verfahren nach Anspruch 13 zur Produktion eines einkettigen hybriden Plasminogenaktivators, der tPA (1-3)- tPA(176-275)-uPA(159-411) ist.

16. Verfahren zur Produktion einer DNA-Sequenz, die einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, bestehend aus

a) der menschlichen t-PA-Kringle-2-Domäne, der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne und einer Verbindungssequenz, die die menschliche t-PA-Kringle-2-Domäne mit der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne verknüpft, wobei die Verbindungssequenz aus der Gruppe, bestehend aus der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichemn t-PA verknüpft, der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichem u-PA verknüpft und einer hybriden Verbindungssequenz, bestehend aus Subsequenzen der Verbindungssequenzen, ausgewählt ist, wobei die Verbindungssequenzen und die hybriden Verbindungssequenzen eine Prozessierungsstelle, die von Plasmin gespalten werden kann, und N-terminal dazu, einen Cysteinrest, der eine Schwefel-Schwefel-Brücke zu der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne bilden kann, umfassen;

b) der menschlichen t-PA-Fingerdomäne, der menschlichen t-PA-Kringle-2-Domäne, der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne und einer Verbindungssequenz, die die menschliche t-PA-Kringle-2-Domäne mit der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne verknüpft, wobei die Verbindungssequenz aus der Gruppe, bestehend aus der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichem t-PA verknüpft, der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B- Kette in menschlichem u-PA verknüpft und einer hybriden Verbindungssequenz, bestehend aus Subsequenzen der Verbindungssequenzen, ausgewählt ist, wobei die Verbindungssequenzen und die hybriden Verbindungssequenzen eine Prozes sierungsstelle, die durch Plasmin gespalten werden kann, und N-terminal dazu, einen Cysteinrest, der eine Schwefel- Schwefel-Brücke an die menschliche katalytische u-PA-Domäne bilden kann, umfassen;

(i) der Verbindungssequenz, die C-terrninal die Fingerdomäne im menschlichen t-PA flankiert, der Verbindungssequenz, die N-terminal die Kringle-2-Domäne von menschlichem t-PA flankiert, oder einer fusionierten Verbindungssequenz, bestehend aus beiden Verbindungssequenzen oder Fragmenten davon, wobei die Verbindungssequenz oder die fusionierte Verbindungssequenz zwischen der t-PA-Fingerdomäne und der t-PA-Kringle-2-Domäne in dem hybriden Plasminogenaktivator positioniert ist; und

(ii) der T-Region von menschlichem t-PA oder einem Nterminalen Fragment davon, wobei die T-Region oder das Fragment davon am N-Terminus des hybriden Plasminogenaktivators positioniert ist;

(c) der menschlichen t-PA-Fingerdomäne, der menschlichen t-PA-Wachstumsfaktordomäne, der menschlichen t-PA- Kringle-2-Domäne, der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne und einer Verbindungssequenz, die die menschliche t- PA-Kringle-2-Domäne mit der menschlichen katalytischen u- PA-Domäne verknüpft, wobei die Verbindungssequenz aus der Gruppe, bestehend aus der Verbindungssequenz, die die A- Kette mit der B-Kette in menschlichen t-PA verknüpft, der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichem u-PA verknüpft und einer hybriden Verbindungssequenz, bestehend aus Subsequenzen der Verbindungssequenzen, ausgewählt ist, wobei die Verbindungssequenzen und die hybriden Verbindungssequenzen eine Prozessierungsstelle, die durch Plasmin gespalten werden kann, und N- terminal dazu, einen Cysteinrest, der eine Schwefel-Schwefel-Brücke zu der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne bilden kann, umfassen;

(i) der Verbindungssequenz, die C-terminal die Fingerdomane in menschlichen t-PA flankiert oder einem Fragment davon, der Verbindungssequenz, die N-terminal die t-PA- Wachstumsfaktordomäne in menschlichen t-PA flankiert oder einem Fragment davon oder einer fusionierten Verbindungssequenz, bestehend aus beiden Verbindungssequenzen oder Fragmenten davon, wobei die Verbindungssequenzen oder fusionierten Verbindungssequenzen zwischen der Finger- und Wachstumsfaktordomäne in dem hybriden Plasminogenaktivator positioniert sind;

(ii) der Verbindungssequenz, die C-terrninal die Wachstumsfaktordomäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon, der Verbindungssequenz, die N-terminal die Kringle-2-Domäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon, oder einer fusionierten Verbindungssequenz, bestehend aus beiden Verbindungssequenzen oder Fragmenten davon, wobei die Verbindungssequenzen oder fusionierten Verbindungssequenzen zwischen der Wachstumsfaktor- und Kringle-2-Domäne in dem hybriden Plasminogenaktivator positioniert sind; und

(iii) der T-Region von menschlichem t-PA oder einem N- terminalen Fragment davon, wobei die T-Region oder das Fragment davon am N-Terminus des hybriden Plasminogenaktivators positioniert ist, codiert,

wobei man die DNA chemisch synthetisiert oder Fragmente hergestellt, die Folynukleotid-Subsequenzen von u-PA- und t-PA-CDNA codieren, und sie in der vorbestimmten Reihen folge, gegebenenfalls unter Einschluß einer oder mehrerer Stufen, religiert.

17. Verfahren nach Anspruch 16 zur Produktion einer DNA-Sequenz, die einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus tPA(1- 3)-tPA(176-275)-uPA(159-411), tPA(1-49)-tPA(176-275)- uPA(159-411) und tPA(1-86)tPA176-275)-uPA(159-411), codiert.

18. Verfahren nach Anspruch 16 zur Produktion einer DNA-Sequenz, die einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, der tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411) ist, codiert.

19. Verfahren zur Produktion eines Hybridvektors zur Verwendung in einem eukaryotischen Wirt, umfassend eine DNA-Sequenz, die einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, bestehend aus

a) der menschlichen t-PA-Kringle-2-Domäne, der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne und einer Verbindungssequenz, die die menschliche t-PA-Kringle-2-Domäne mit der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne verknüpft, wobei die Verbindungssequenz aus der Gruppe, bestehend aus der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichen t-PA verknüpft, der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichen u-PA verknüpft und einer hybriden Verbindungssequenz, bestehend aus Subsequenzen der Verbindungssequenzen, ausgewählt ist, wobei die Verbindungssequenzen und die hybriden Verbindungssequenzen eine Prozessierungsstelle, die von Plasmin gespalten werden kann, und N-terminal dazu, einen Cysteinrest, der eine Schwefel-Schwefel-Brücke zu der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne bilden kann, umfassen; und gegebenenfalls zusätzlich eine oder mehrere Sequenzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

(i) der Verbindungssequenz, die N-terminal die Kringle- 2-Domäne in menschlichen t-PA flankiert oder einem Fragment davon, wobei die Verbindungssequenz oder das Fragment davon in dem hybriden Plasminogenaktivator N-terminal zu der menschlichen t-PA-Kringle-2-Domäne positioniert ist; und

(ii) der T-Region von menschlichen t-PA oder einem Nterminalen Fragment davon, wobei die T-Region oder das Fragment davon am N-Terminus des hybriden Plasminogenaktivators positioniert ist;

b) der menschlichen t-PA-Fingerdomäne, der menschlichen t-PA-Kringle-2-Domäne, der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne und einer Verbindungssequenz, die die menschliche t-PA-Kringle-2-Domäne mit der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne verknüpft, wobei die Verbindungssequenz aus der Gruppe, bestehend aus der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichem t-PA verknüpft, der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B- Kette in menschlichem uPA verknüpft und einer hybriden Verbindungssequenz, bestehend aus Subsequenzen der Verbindungssequenzen, ausgewählt ist, wobei die Verbindungssequenzen und die hybriden Verbindungssequenzen eine Prozessierungsstelle, die durch Plasmin gespalten werden kann, und N-terminal dazu, einen Cysteinrest, der eine Schwefel- Schwefel-Brücke an die menschliche katalytische u-PA-Domäne bilden kann, umfassen;

(i) der Verbindungssequenz, die C-terminal die Fingerdomäne in menschlichem t-PA flankiert, der Verbindungssequenz, die N-terminal die Kringle-2-Domäne von menschli chem t-PA flankiert, oder einer fusionierten Verbindungssequenz, bestehend aus beiden Verbindungssequenzen oder Fragmenten davon, wobei die Verbindungssequenz oder die fusionierte Verbindungssequenz zwischen der t-PA-Fingerdomäne und der t-PA-Kringle-2-Domäne in dem hybriden Plasminogenaktivator positioniert ist; und

(c) der menschlichen t-PA-Fingerdomäne, der menschlichen t-PA-Wachstumsfaktordomäne, der menschlichen t-PA- Kringle-2-Domäne, der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne und einer Verbindungssequenz, die die menschliche t- PA-Kringle-2-Domäne mit der menschlichen katalytischen u- PA-Domäne verknüpft, wobei die Verbindungssequenz aus der Gruppe, bestehend aus der Verbindungssequenz, die die A- Kette mit der B-Kette in menschlichem t-PA verknüpft, der Verbindungssequenz, die die A-Kette mit der B-Kette in menschlichem u-PA verknüpft und einer hybriden Verbindungssequenz, bestehend aus Subsequenzen der Verbindungssequenzen, ausgewählt ist, wobei die Verbindungssequenzen und die hybriden Verbindungssequenzen eine Frozessierungsstelle, die durch Plasmin gespalten werden kann, und Nterminal dazu, einen Cysteinrest, der eine Schwefel-Schwefel-Brücke zu der menschlichen katalytischen u-PA-Domäne bilden kann, umfassen;

(i) der Verb indungssequenz, die C-terminal die Fingerdomäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon, der Verbindungssequenz, die N-terminal die t-PA- Wachstumsfaktordomäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon oder einer fusionierten Verbindungssequenz, bestehend aus beiden Verbindungssequenzen oder Fragmenten davon, wobei die Verbindungssequenzen oder fusionierten Verbindungssequenzen zwischen der Finger- und Wachstumsfaktordomäne in dem hybriden Plasminogenaktivator positioniert sind;

(ii) der Verbindungssequenz, die C-terminal die Wachstumsfaktordomäne in menschlichen t-PA flankiert oder einem Fragment davon, der Verbindungssequenz, die N-terminal die Kringle-2-Domäne in menschlichem t-PA flankiert oder einem Fragment davon, oder einer fusionierten Verbindungssequenz, bestehend aus beiden Verbindungssequenzen oder Fragmenten davon, wobei die Verbindungssequenzen oder fusionierten Verbindungssequenzen zwischen der Wachstumsfaktor- und Kringle-2-Domäne in dem hybriden Plasminogenaktivator positioniert sind; und

wobei man die DNA-Segmente, die den eukaryotischen Promotor enthalten, die codierende Region für den hybriden Plasminogenaktivator, die 3'-flankierende Sequenz eines eukaryotischen Gens und die Vektor-DNA verknüpft.

20. Verfahren nach Anspruch 19 zur Produktion eines Hybridvektors zur Verwendung in einem eukaryotischen Wirt, umfassend eine DNA-Sequenz, die einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411), tPA(1-49)-tPA(176- 275)-uPA(-159-411) und tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159- 411), codiert.

21. Verfahren nach Anspruch 19 zur Produktion eines Hybridvektors zur Verwendung in einem eukaryotischen Wirt, umfassend eine DNA-sequenz, die einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, der tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159- 411) ist, codiert.

22. Verfahren zur Produktion einer transformierten eukaryotischen Zelle, die mit einem Hybridvektor, der eine DNA-sequenz umfaßt, die einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, bestehend aus

(i) der Verbindungssequenz, die C-terminal die Fingerdomäne in menschlichen t-PA flankiert, der Verbindungssequenz, die N-terminal die Kringle-2-Domäne von menschlichem t-PA flankiert, oder einer fusionierten Verbindungssequenz, bestehend aus beiden Verbindungssequenzen oder Fragmenten davon, wobei die Verbindungssequenz oder die fusionierte Verbindungssequenz zwischen der t-PA-Fingerdomäne und der t-PA-Kringle-2-Domäne in dem hybriden Plasminogenaktivator positioniert ist; und

(iii) der T-Region von menschlichem t-PA oder einem N- terminalen Fragment davon, wobei die T-Region oder das Fragment davon am N-Terminus des hybriden Plasminogenaktivators positioniert ist, codiert, transformiert ist,

wobei man eukaryotische Wirtszellen mit dem Hybridvektor transformiert.

23. Verfahren nach Anspruch 22 zur Produktion einer transformierten eukaryotischen Zelle, die mit einem Hybridvektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411), tPA(1- 49)-tPA(176-275)-uPA(159-411) und tPA(1-86)-tPA(176-275)- uPA(159-411), codiert, transformiert ist.

24. Verfahren nach Anspruch 22 zur Produktion einer transformierten eukaryotischen Zelle, die mit einem Hybridvektor transformiert ist, umfassend einen Hybridvektor zur Verwendung in einem eukaryotischen Wirt, umfassend eine DNA-Sequenz, die einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator, der tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411) ist, codiert.

25. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen einkettigen hybriden Plasminogenaktivator nach Anspruch 1 bis 3 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

26. Einkettiger hybrider Plasminogenaktivator nach Anspruch 1 bis 3 zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen prophylaktischen Behandlung des menschlichen Körpers.

27. Verwendung eines einkettigen hybriden Plasminogenaktivators nach Anspruch 1 bis 3 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.