JP4546578B2 - プロテアーゼスクリーニング方法およびそれにより同定されるプロテアーゼ - Google Patents

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Description

関連出願
２００６年７月５日付、「プロテアーゼスクリーニング方法およびそれにより同定されるプロテアーゼ」と題する、Edwin Madisonによる米国仮特許出願第６０／８１８８０４号、および２００６年７月５日付、「修飾尿中−プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）プロテアーゼ」と題する、Edwin Madisonによる米国仮特許出願第６０／８１８９１０号に対して、優先権の利益を主張する。認められる場合、上記出願の内容については出典明示で援用する。
本願は、米国仮特許出願第６０／８１８８０４号および米国仮特許出願第６０／８１８８０４号に対し優先権を主張している、２００７年７月５日付、「プロテアーゼスクリーニング方法およびそれにより同定されるプロテアーゼ」と題する、Edwin Madisonによる米国特許出願第１１／８２５６２７号と関連している。
本願はまた、J Nguyen、C Thanos、S Waugh-Ruggles、およびC Craikによる「特異性が改変されたプロテアーゼの生成およびスクリーニング方法」と題する、２００３年１０月２日付の米国特許出願第１０／６７７９７７号、すなわち２００４年７月２９日付の米国特許出願公開第ＵＳ−２００４−０１４６９３８号、および２００４年４月１５日公開の対応する国際ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００４／０３１７３３号に関連しており、これらは２００２年１０月２日付の米国仮特許出願第６０／４１５３８８号に対して利益を主張するものである。
本願はまた、J Nguyen および S Waugh-Rugglesによる「野生型および突然変異体ＭＴＳＰ−１によるＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体の開裂」と題する、２００５年４月１２日付の米国特許出願第１１／１０４１１０号、すなわち２００６年１月５日付の米国特許出願公開第ＵＳ−２００６−０００２９１６号、および２００５年１１月２４日公開の対応する国際ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００５／１１０４５３号に関連しており、これらは２００４年４月１２日付の米国仮特許出願第６０／５６１７２０号に対して利益を主張するものである。
本願はまた、J Nguyen および S Waugh-Rugglesによる「野生型および突然変異体プロテアーゼによるＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体の開裂」と題する、２００５年４月１２日付の米国特許出願第１１／１０４１１１号、すなわち２００６年２月２日付の米国特許出願公開第ＵＳ−２００６−００２４２８９号、および２００５年１０月２７日公開の対応する国際ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００５／１００５５６号に関連しており、これらは２００４年４月１２日付の米国仮特許出願第６０／５６１６７１号に対して利益を主張するものである。
本願はまた、Edwin L. Madisonによる「補体活性化を阻害する修飾プロテアーゼ」と題する、２００５年１０月２１日付、米国仮特許出願第６０／７２９８１７号に関するものである。本願はまた、Edwin L. Madison、Jack Nguyen、Sandra Waugh Ruggles およびChristopher Thanosによる「補体活性化を阻害する修飾プロテアーゼ」と題する、２００６年１０月２０日付、米国特許出願第１１／５８４７７６号、および２００７年４月２６日公開の対応する国際ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００７／０４７９９５号に関連しており、これらは米国仮特許出願第６０／７２９８１７号に対して利益を主張するものである。
認められる場合、上記各関連出願の内容については出典明示で援用する。
コンパクトディスクで提供した配列リストについても出典明示で援用
配列リストのコンパクトディスク（ＣＤ−Ｒ）での電子バージョンについては、４コピー（ＣＯＰＹ１、ＣＯＰＹ２、ＣＯＰＹ３およびＣＲＦのラベル）で同時提出しており、その内容も出典明示で援用する。２００７年７月５日に作成した、前述の各コンパクトディスクでのコンピューター読み取り可能ファイルは、同一であり、１８０９キロバイトのサイズで、タイトルは４９０２ＳＥＱ.ＰＣ１.ｔｘｔである。
発明の分野
本発明は、基質特異性が改変されているか、または他の特性をもつ修飾プロテアーゼの同定方法に関するものである。上記方法では、候補および修飾プロテアーゼを、基質開裂時にそれらを捕える基質と接触させることにより、それらを選別する。
プロテアーゼは、タンパク質分解酵素である。プロテアーゼは、標的タンパク質と特異的に相互作用し、それを不活化または活性化し得るため、それらは治療薬として使用されている。天然に存するプロテアーゼは、生物治療薬としての適性である特異性、安定性および／または触媒活性を呈しないため、それらは最適な治療薬ではないことが多い（例えば、Fernandez-Gacio et al.（２００３）Trends in Biotech．２１：４０８−４１４参照）。中でも重要である治療薬の特性は、免疫原性の欠如または低い免疫原性；標的分子についての特異性および限られた副作用である。天然に存するプロテアーゼは、一般にこれらの特性の１つまたはそれ以上を欠いている。
特性が改善されたプロテアーゼを遺伝子工学で作り出す試みが為されてきた。これらの方法には、１）プロテアーゼの構造、触媒機構および分子モデリングに関する情報を必要とする合理的設計、および２）プロテアーゼについての多様な突然変異体レパートリーの生成、および所望の特徴を呈する突然変異体の選択を必然的に伴う過程である、定向進化がある（Bertschinger et al.（２００５）、Phage display in Biotech. and Drug Discovery（Sidhus編）、４６１−４９１頁）。前者の方法の場合、プロテアーゼの構造−機能関係に関する情報が欠如しているため、ほとんどのプロテアーゼに関して突然変異を合理的に設計する可能性は限られている。定向進化方法を採用しても、成果は限られている。
改善されたプロテアーゼ活性についてスクリーニングした場合、基質選択性が失われることが多く、逆もまた同様である。最適な治療用プロテアーゼは、標的基質についての高い特異性および高い触媒有効性を呈するべきである。最適化された特異性および最適化された活性を伴うプロテアーゼに関して利用可能な選択方法の有効性は限られているため、これらに代わるプロテアーゼ選択方法の開発が依然として要望されている。したがって、所望の基質特異性および活性をもつプロテアーゼまたは突然変異体プロテアーゼの選択方法を提供することも本発明の目的に含まれる。
望ましいかまたは予め定められた基質特異性および活性をもつプロテアーゼまたは突然変異体プロテアーゼまたはその触媒活性部分の選択または同定方法を提供する。特に、本発明は、一標的基質または複数の同基質について改変、改善または最適化または他の点が改変された基質特異性および／または活性を有するプロテアーゼを同定するプロテアーゼスクリーニング方法を提供する。例えば、本発明方法は、疾患または障害の原因に関与する標的基質について改変された基質特異性および活性を有するプロテアーゼのスクリーニングに使用され得る。標的基質について改変、典型的には増強された特異性および／または活性により、本発明方法で同定または選択されたプロテアーゼは、標的基質が関与する疾患または状態の処置における試薬または治療薬としての使用に関する候補である。本発明方法を実践する場合、一コレクションのプロテアーゼまたはその触媒活性部分を、プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させることにより、プロテアーゼトラップポリペプチドとコレクション中のプロテアーゼまたはその触媒活性部分との安定した複合体を形成させる。若干の例では、プロテアーゼトラップポリペプチドに修飾を加えることにより、標的基質、例えば疾患または障害に関与する標的基質についての予め定められた基質特異性および／または活性を有するプロテアーゼにより開裂させる。さらに本方法は、標的基質の開裂配列に関する基質特異性についての複合体のスクリーニングを含み得る。上記の例では、同定または選択されたプロテアーゼは、標的基質に対して改変された活性および／または特異性を有する。一例では、プロテアーゼトラップポリペプチドと選択されたプロテアーゼの共有結合により安定した複合体が形成される。選択されたプロテアーゼまたはその触媒活性部分は、本発明方法において複合体から同定または選択される。さらに本発明方法は、コレクション中の非複合体化プロテアーゼメンバーからの複合体化プロテアーゼの分離段階を含み得る。一例では、プロテアーゼトラップポリペプチドを検出または分離用に標識し、検出可能なプロテアーゼトラップポリペプチドおよびプロテアーゼまたはその触媒活性部分を含む複合体の捕捉により分離を実施する。懸濁液、溶液中、または固体支持体において捕捉を実施し得る。捕捉が固体支持体による場合、プロテアーゼトラップポリペプチドを固体支持体に結合させるが、この結合は、プロテアーゼトラップポリペプチドとプロテアーゼまたはその触媒活性部分のコレクションの接触前、接触中または接触後に実施され得る。固体支持体は、例えば９６ウェルプレートの一ウェルを含み得る。若干の例では、プロテアーゼトラップポリペプチドをビオチンで標識する。他の例では、プロテアーゼトラップポリペプチドをＨｉｓ標識で標識し得、金属キレート剤、例えば、限定するわけではないが、硫酸ニッケル（ＮｉＳＯ４）、塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）、硫酸銅（ＣｕＳＯ４）および塩化銅（ＺｎＣｌ２）での捕捉により分離を実施し得る。金属キレート剤は、固体支持体、例えばビーズ、例えばセファロースビーズまたは磁気ビーズにコンジュゲートされ得る。
さらに本発明方法は、分離された複合体においてプロテアーゼまたはその触媒活性部分を増幅する段階を含み得る。若干の例では、分離複合体におけるプロテアーゼまたはその触媒活性部分をファージ上で表示し、宿主細胞をファージで感染させることにより増幅を実施する。宿主細胞には、細菌、例えば大腸菌（E.coli）が含まれ得る。細菌細胞培地、細菌ペリプラズム、ファージ上清または精製タンパク質からの増幅したプロテアーゼは、標的基質に向かう特異性および／または活性についてスクリーニングされ得る。典型的には、標的基質は、疾患または障害の原因に関与するポリペプチドまたはポリペプチドにおける開裂配列である。
本発明では、プロテアーゼのコレクションを複数の異なるプロテアーゼトラップポリペプチドまたはその修飾形態と接触させる方法で、プロテアーゼトラップポリペプチドが、それぞれ同定可能な形で検出され得るように標識されているマルチプレックス方法を提供する。上記方法では、複数の安定した複合体が形成され得、複数のプロテアーゼが同定されるように少なくとも２種のプロテアーゼトラップポリペプチドが同定可能な形で標識されている。
本発明において、本方法はまた、プロテアーゼ選択を最適化するために連続ラウンドのスクリーニングを含み、その方法では、本発明スクリーニング方法の第１ラウンドでの同定または選択後にプロテアーゼを増幅することにより、プロテアーゼまたはその触媒活性部分の第２コレクションを生成する。第２コレクションのプロテアーゼを、プロテアーゼトラップポリペプチド、すなわち第１のと同一または異なるプロテアーゼトラップポリペプチドと接触させることにより、第２セットの安定複合体を生成する。第２セットの安定複合体におけるプロテアーゼが同定または選択される。
本発明方法において、プロテアーゼトラップポリペプチドは、セルピン、アルファマクログロブリンファミリーの一員、またはｐ３５ファミリーの一員である。本明細書記載の方法で使用している上記ポリペプチド分子は、プロテアーゼまたはその触媒活性部分とプロテアーゼトラップポリペプチドの共有結合により安定した複合体を形成する。
本発明方法の一態様では、プロテアーゼおよび／またはプロテアーゼのタンパク質分解活性部分の一コレクションをプロテアーゼトラップポリペプチドと接触させて、プロテアーゼトラップポリペプチドの開裂時にプロテアーゼトラップポリペプチドとプロテアーゼの安定した複合体を形成させることにより、所望の基質特異性を有するプロテアーゼが同定される。プロテアーゼトラップポリペプチド、またはその修飾形態は、所望の基質特異性を有するプロテアーゼにより開裂されることを目的として本方法で使用するために選択される。上記方法では、プロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分を同定することにより、所望の基質特異性を有するプロテアーゼについて選択する。
本発明方法で使用するプロテアーゼのコレクションは、プロテアーゼまたはその触媒活性部分のコレクションでありさえすればよく、少なくとも、約または５、１０、５０、１００、１０３、１０４、１０５、１０６と同等のメンバーそれ以上の異なるメンバーを含む。若干の態様では、プロテアーゼは、セリンおよび／またはシステインプロテアーゼである。本発明方法では、プロテアーゼまたはその触媒活性部分のコレクションをプロテアーゼトラップポリペプチドと接触させるために表示する。一例では、プロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分を、固体支持体、細胞表面、または微生物の表面上で表示させる。プロテアーゼは、酵母、細菌、ウイルス、ファージ、核酸、ｍＲＮＡ分子、またはリボソーム上で表示され得る。プロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分を微生物上で表示させる場合、微生物には、限定するわけではないが、大腸菌（E.coli）、サッカロマイシス・セレヴィシエ（S.cerevisiae）またはウイルス、例えばＭ１３、ｆｄ、またはＴ７ファージ、またはバキュロウイルスが含まれる。本発明方法では、プロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分はファージディスプレーライブラリー上で表示され、プロテアーゼコレクションはプロテアーゼファージディスプレーライブラリーである。実施態様によっては、プロテアーゼは、コレクションで、例えばディスプレーにより、完全長プロテアーゼのタンパク質加水分解活性部分として与えられる場合もある。若干の例では、プロテアーゼコレクションとプロテアーゼトラップポリペプチドの接触は均一混合物中で行われる。
本発明では、少なくとも２種の異なるプロテアーゼトラップポリペプチドを、コレクションと接触させ、ただしプロテアーゼトラップポリペプチドの１種のみを検出可能な形で標識しているプロテアーゼ選択方法を提供する。検出可能な形で標識されたプロテアーゼトラップポリペプチドは、検出可能なプロテアーゼトラップポリペプチドおよびプロテアーゼまたはその触媒活性部分を含む安定複合体の捕捉を可能にする。本方法の若干の例では、検出可能な形では標識されていない１種またはそれ以上の他のプロテアーゼトラップポリペプチドが、検出可能な形で標識されたプロテアーゼトラップポリペプチドと比べて反応物中に過剰に存在する。本方法において、標識は、それを検出させる標識であればよく、例えば蛍光標識またはエピトープ標識、例えばＨｉｓ標識である。他の例では、検出可能な標識はビオチンである。
本発明方法で選択を行うプロテアーゼのコレクションは、プロテアーゼのいかなるコレクションでもよい。若干の例では、プロテアーゼはセリンまたはシステインプロテアーゼである。プロテアーゼのコレクションは、セリンプロテアーゼのキモトリプシンおよびズブチリシンファミリーのメンバーまたはシステインプロテアーゼのパパインファミリーのカスパーゼからのメンバーであるコレクションを含む。プロテアーゼは表７に示したプロテアーゼまたはその触媒活性部分を全て包含する。若干の例では、プロテアーゼまたはその触媒活性部分は、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）プロテアーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）プロテアーゼまたはＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼのコレクションである。
一態様において、本発明方法で使用するプロテアーゼトラップポリペプチドは、セルピン、ｐ３５ファミリーメンバー、アルファ−マクログロブリンファミリーメンバー、またはその修飾形態である。本発明方法で使用するプロテアーゼトラップポリペプチドには、限定するわけではないが、プラスミノーゲン阻害剤−１（ＰＡＩ−１）、抗トロンビン（ＡＴ３）、またはアルファ２−マクログロブリン、またはその修飾形態がある。本発明方法で使用するプロテアーゼトラップポリペプチドの修飾形態には、アミノ酸置換、欠失、またはプロテアーゼトラップポリペプチドの反応部位での置換を含むものがある。若干の例では、修飾は、標的基質の開裂配列に対応する１つまたはそれ以上のアミノ酸置換である。標的基質は、疾患または障害の原因に関与するタンパク質であり得る。標的基質の例には、限定するわけではないが、ＶＥＧＦＲ、ｔ−ＰＡ開裂配列または補体タンパク質がある。例えば、標的基質には、限定するわけではないが、ＶＥＧＦＲ２または補体タンパク質Ｃ２がある。標的基質の開裂配列には、限定するわけではないが、配列番号３８９、４７９および４９８のいずれかに示したものが含まれる。若干の態様では、プロテアーゼトラップポリペプチドはセルピンであり、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、セルピンポリペプチドの反応部位ループで行われる。反応部位ループ（ＲＳＬ）における１つまたはそれ以上の置換には、Ｐ４−Ｐ２’位の１つまたはそれ以上におけるものがある。本発明方法で使用する上記セルピンの例は、配列番号４９７、４９９、６１０および６１１のいずれかに示されている。別の例では、プロテアーゼトラップポリペプチドは、アルファ２マクログロブリンであり、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換はポリペプチドのベイト領域にある。修飾プロテアーゼトラップポリペプチドに対して本発明方法で同定または選択されるプロテアーゼは、非標的基質と比較して標的基質に関して改変された基質特異性についてスクリーニングまたは選択され得る。上記の例では、非標的基質には、対応する鋳型プロテアーゼの基質が含まれる。典型的には、同定または選択されたプロテアーゼの基質特異性は、１.５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍またはそれより大きい倍率で増強される。
本発明方法は、反復的であるものを含み、所望の基質特異性を有するプロテアーゼについての同定および／または選択方法は、複数回反復または遂行される。上記方法では、複数の異なるプロテアーゼが、本方法の第一反復または第１ラウンドで同定され得る。他の例では、反復の第１ラウンドで選択される同定されたプロテアーゼに基づいた第１反復後に複数のプロテアーゼが生成および製造される。さらに、若干の例では、第１ラウンドまたは反復および／または連続ラウンドで同定される選択されたプロテアーゼのアミノ酸配列を比較することにより、ホットスポットを同定する。ホットスポットは、多ラウンドにおいて改変された座として認識される位置であり、本方法で使用する修飾プロテアーゼのコレクションから、例えば野生型または鋳型プロテアーゼと比較して、例えば少なくとも２、３、４、５またはそれ以上の同定されたプロテアーゼで見られる。
また、本発明方法は、一プロテアーゼまたは複数のプロテアーゼを同定した後、プロテアーゼの第２コレクションを調製し、その場合、同定されたプロテアーゼを鋳型として用いて、第２コレクションのメンバーが同定されたプロテアーゼの突然変異およびさらなる突然変異を有するポリペプチド（に基づくように）を含むようにプロテアーゼ配列またはその触媒活性部分にさらなる突然変異を導入するものとし、次いで最初の一プロテアーゼまたは複数のプロテアーゼの単離に使用したプロテアーゼトラップと同一または異なるプロテアーゼトラップポリペプチドと第２コレクションを接触させ、その場合、所望の基質特異性を有するプロテアーゼによって開裂されるようにプロテアーゼトラップに修飾を加えるものとし、次いで複合体におけるコレクションからプロテアーゼ（複数も可）またはプロテアーゼのタンパク質加水分解活性部分（複数も可）を同定するというさらなる段階を提供するものであり、その結果、同定されたプロテアーゼ（複数も可）は、最初に同定されたプロテアーゼよりも所望の基質に対して大きな活性または特異性を有することになる。第２コレクションは、同定された鋳型プロテアーゼ（複数も可）またはプロテアーゼのタンパク質加水分解活性部分のアミノ酸配列と異なりランダムまたはフォーカス突然変異を含み得る。フォーカス突然変異は、例えばホットスポット位置、セリンプロテアーゼ、例えばｕ−ＰＡにおける、キモトリプシンのナンバリングに基づいた例えば３０、７３、８９および１５５位を含む。
本方法を実践する際、安定した複合体を形成させる反応は、１つまたはそれ以上のパラメーターを制御することによりモジュレーションされ得る。上記パラメーターは、反応の速度または程度または反応の効率を改変するもの、例えば限定するわけではないが、反応時間、温度、ｐＨ、イオン強度、ライブラリー濃度およびプロテアーゼトラップポリペプチド濃度である。
反応は、プロテアーゼトラップポリペプチドとプロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分間の反応の競争物質の存在下で実施され、それによって同定されたプロテアーゼ（複数も可）またはタンパク質加水分解活性部分（複数も可）の選択性が高められ得る。競争物質には、例えば血清または血漿、例えばヒト血清またはヒト血漿、細胞または組織抽出物、生物学的流体、例えば尿または血液、プロテアーゼトラップの精製または部分精製野生型形態（または他の修飾形態）がある。上記競争物質の典型例は、プロテアーゼトラップポリペプチドの精製または部分精製野生型形態またはプロテアーゼトラップポリペプチドの１種またはそれ以上の特異的変異型である。
本発明は、少なくとも２つの開裂配列についての特異性／選択性および／または活性を有するプロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分を進化させるかまたは選択または同定する反復方法を提供する。これらの方法は、ａ）プロテアーゼおよび／またはプロテアーゼのタンパク質加水分解活性部分のコレクションを、第１プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させることにより、プロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分によるプロテアーゼトラップポリペプチドの開裂時、コレクションにおけるプロテアーゼまたはその触媒活性部分を伴うプロテアーゼトラップポリペプチドを含む安定した複合体を形成させ、ただし上記接触は競争物質の存在下で実施されるものとし、ｂ）第１プロテアーゼトラップポリペプチドとの複合体を形成するプロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分を同定または選択し、ｃ）第１プロテアーゼトラップポリペプチドとの複合体を形成するプロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分を、競争物質の存在下で第２プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させ、そしてｄ）第１プロテアーゼトラップポリペプチドとの複合体を形成するプロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分を同定または選択する段階を含む。２つの開裂配列は、一標的基質にあるか、または２つの異なる標的基質にあり得る。同定、選択または進化させたプロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分は、１つまたは２つの異なる標的基質における少なくとも２つの異なる開裂配列についての基質特異性および／または開裂活性を有する。第１および第２プロテアーゼトラップポリペプチドは同一または異なり得る。典型的には、本方法で使用する第１および第２プロテアーゼトラップポリペプチドは異なり、それぞれ異なる標的基質について予め定められた基質特異性を有するプロテアーゼによって開裂されるように修飾が加えられている。さらに本方法は、少なくとも２つの認識配列に対して所望の、または予め定められた基質特異性および開裂活性をもつプロテアーゼが単離されるまで、少なくともさらに１回反復段階ａ）およびｂ）またはａ）−ｄ）を含み得る。基質特異性および開裂活性は、典型的には鋳型プロテアーゼと比べて増強されている。
本方法で使用する競争物質は、プロテアーゼトラップポリペプチドが相互作用し得る何かを含み、典型的には標的プロテアーゼより安定性は低い。競争物質には、限定するわけではないが、血清、血漿、ヒト血清またはヒト血漿、細胞または組織抽出物、生物学的流体、例えば尿または血液、プロテアーゼトラップの精製または部分精製野生型形態、およびプロテアーゼトラップポリペプチドの１つまたはそれ以上の特異的変異型がある。
また、本発明は、ａ）プロテアーゼまたはそのタンパク質分解活性部分のコレクションを第１プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させることにより、プロテアーゼトラップポリペプチドの開裂時に、コレクションのプロテアーゼまたはその触媒活性部分とプロテアーゼトラップポリペプチドの共有結合複合体を形成させ、ｂ）非複合体形成プロテアーゼトラップポリペプチド（複数も可）から複合体形成プロテアーゼを分離し、ｃ）複合体形成プロテアーゼを単離または選択または同定し、ｄ）選択されたプロテアーゼに基づいてプロテアーゼまたはプロテアーゼのタンパク質分解活性部分の第２コレクションを形成し、さらにｅ）プロテアーゼまたはそのタンパク質加水分解活性部分の第２コレクションを、第１プロテアーゼトラップポリペプチドとは異なる第２プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させて複合体を形成させ、複合体を分離し、複合体形成プロテアーゼを単離、選択または同定することにより段階ａ）〜ｃ）を反復する段階を含むプロテアーゼ選択方法を提供する。第１および第２プロテアーゼトラップポリペプチドは、２つの異なる標的基質認識配列を含むように修飾され得、その結果、同定または選択されたプロテアーゼは、少なくとも２つの認識配列に対し特異性および高い開裂活性を有することになる。これらの方法は複数回反復され得る。これらの方法では、プロテアーゼまたはそのタンパク質分解活性部分のコレクションを、競争物質（上記参照）の存在下で第１および／または第２プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させ得る。
本明細書に記載しているプロテアーゼ選択方法のいずれかにおいて、コレクションは修飾プロテアーゼを含み得る。プロテアーゼに対する修飾は、ポリペプチドの標的領域にランダムまたは集中して配置され得る。
本発明はまた、プロテアーゼおよび／またはそのタンパク質分解活性部分のコレクションおよび少なくとも１つのプロテアーゼトラップポリペプチドを含む組合わせを提供する。成分は、別々に、または混合物として提供され得る。プロテアーゼトラップポリペプチドは、中でもセルピン、ｐ３５ファミリーメンバー、アルファ−マクログロブリンファミリーメンバー、それぞれの修飾形態およびその混合物を含む。
プロテアーゼおよび／またはその触媒活性部分のコレクションは、溶液または懸濁液中または固相中で提供されるか、または他の形、例えば固体支持体（マトリックス材料）またはディスプレーライブラリー、例えば、限定するわけではないが、ファージディスプレーライブラリーで表示され得、その場合、メンバーは少なくともプロテアーゼのタンパク質分解活性部分を表示する。
本願は、上記組合わせを含むキットを提供する。典型的には、キットは、パッケージされた成分を含み、所望により追加試薬および本方法の実施説明書を含んでいてもよい。
また本願は、キモトリプシンのナンバリングに基づいた３０、７３、８９および１５５から選択される１個またはそれ以上の残基を修飾することによる、セリンプロテアーゼ、例えばｕ−ＰＡの基質特異性の修飾方法を提供する。
また本願は、本発明方法により同定される修飾プロテアーゼを提供する。本発明で提供される修飾プロテアーゼは、同定された修飾により改変された基質特異性および／または活性を呈する。選択方法を用いて同定される本発明による修飾は、野生型プロテアーゼ、その対立遺伝子または種変異型で行われるものもあれば、プロテアーゼの他の変異型で行われるものもあり得る。さらに、本発明はまた、野生型プロテアーゼに対し８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を含む修飾プロテアーゼ、またはその対立遺伝子または種変異型を提供するが、ただし本方法で同定された修飾がそこに存在するものとする。
上記プロテアーゼには、修飾プロテアーゼ、例えばキモトリプシンファミリーにおける修飾セリンプロテアーゼ、例えばキモトリプシンのナンバリングに基づいた３０、７３、８９および１５５位から選択されるホットスポット位置に１つまたはそれ以上の突然変異を含むことによって、基質特異性が改変されている尿中プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）ポリペプチド、またはその触媒活性フラグメントがある。
本発明はまた、疾患または障害の原因に関与する標的基質に向けた高い特異性および／または活性を呈する本発明方法で同定される修飾プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）プロテアーゼを含む。上記標的基質には、限定するわけではないが、ＶＥＧＦＲまたは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）基質がある。したがって、本発明はまた、ｔ−ＰＡ基質を開裂する修飾セリンプロテアーゼまたはその触媒活性部分を提供する。特に、上記プロテアーゼには、ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、キモトリプシンのナンバリングに基づいた２１、２４、３０、３９、６１（Ａ）、８０、８２、８４、８９、９２、１５６、１５８、１５９および１８７位から選択される位置に１つまたはそれ以上の修飾を含む修飾尿中プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）ポリペプチドがある。また本発明は、Ｆ２１Ｖ、Ｉ２４Ｌ、Ｆ３０Ｖ、Ｆ３０Ｌ、Ｔ３９Ａ、Ｙ６１（Ａ）Ｈ、Ｅ８０Ｇ、Ｋ８２Ｅ、Ｅ８４Ｋ、Ｉ８９Ｖ、Ｋ９２Ｅ、Ｋ１５６Ｔ、Ｔ１５８Ａ、Ｖ１５９ＡおよびＫ１８７Ｅから選択される１つまたはそれ以上の突然変異を含む上記修飾ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分を提供する。また本発明は、ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Ｆ３０Ｖ／Ｙ６１（ａ）Ｈ; Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ; Ｆ３０Ｖ／Ｋ１５６Ｔ;Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｖ１５９Ａ;Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｔ３９Ａ／Ｖ１５９Ａ;Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｔ１５８Ａ／Ｖ１５９Ａ;Ｆ３０Ｖ／Ｙ６１（ａ）Ｈ／Ｋ９２Ｅ;Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｖ１５９Ａ／Ｅ８０Ｇ／Ｉ８９Ｖ／Ｋ１８７Ｅ;およびＦ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｖ１５９Ａ／Ｅ８０Ｇ／Ｅ８４Ｋ／Ｉ８９Ｖ＼Ｋ１８７Ｅから選択される２つまたはそれ以上の突然変異を含むこれらの修飾ｕ−ＰＡポリペプチドを提供する。
また本発明は、ＶＥＧＦＲ、特にＶＥＧＦＲ−２を開裂する修飾セリンプロテアーゼまたはその触媒活性部分を提供する。特に、ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、キモトリプシンのナンバリングに基づいた３８、７２、７３、７５、１３２、１３３、１３７、１３８、１５５、１６０および２１７位から選択される位置に１つまたはそれ以上の修飾を含むことにより、ＶＥＧＦＲ−２またはその配列に対する基質特異性が改変されている、修飾尿中プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）ポリペプチドおよびその触媒活性部分を提供する。また、Ｖ３８Ｄ、Ｒ７２Ｇ、Ｌ７３Ａ、Ｌ７３Ｐ、Ｓ７５Ｐ、Ｆ１３２Ｌ、Ｇ１３３Ｄ、Ｅ１３７Ｇ、Ｉ１３８Ｔ、Ｌ１５５Ｐ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｍ、Ｖ１６０ＡおよびＲ２１７Ｃから選択される１つまたはそれ以上の突然変異を含む上記ポリペプチドを提供する。さらにこれらのポリペプチドは、キモトリプシンのナンバリングに基づいた３０位および／または８９位での修飾、例えばＦ３０Ｉ、Ｆ３０Ｔ、Ｆ３０Ｌ、Ｆ３０Ｖ、Ｆ３０Ｇ、Ｆ３０ＭおよびＩ８９Ｖから選択される修飾を含み得る。また、Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ;Ｌ７３Ｐ;Ｒ２１７Ｃ;Ｌ１５５Ｐ;Ｓ７５Ｐ／Ｉ８９Ｖ／Ｉ１３８Ｔ;Ｅ１３７Ｇ;Ｒ７２Ｇ／Ｌ１５５Ｐ;Ｇ１３３Ｄ;Ｖ１６０Ａ;Ｖ３８Ｄ;Ｆ１３２Ｌ／Ｖ１６０Ａ; Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｔ;Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｌ;Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｖ;Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｇ;Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｌ１５５Ｖ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｍ;Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｌ１５５Ｍ;Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｌ／Ｌ１５５Ｍ;およびＬ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｇ／Ｌ１５５Ｍから選択される１つまたはそれ以上の突然変異、および場合によっては２つまたはそれ以上の突然変異を含むこれらのｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分を提供する。
また本発明は、ｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分が、Ｆ３０Ｉ、Ｆ３０Ｔ、Ｆ３０ＧおよびＦ３０Ｍから選択される１つまたはそれ以上の突然変異を含む修飾ｕ−ＰＡポリペプチドを提供する。
また本発明は、本発明方法により同定される修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを提供する。上記修飾ポリペプチドは、配列番号２５３に示したＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドにおいて、キモトリプシンのナンバリングに基づいたＤ２３Ｅ、Ｉ４１Ｆ、Ｉ４１Ｔ、Ｌ５２Ｍ、Ｙ６０（ｇ）ｓ、Ｔ５６Ｋ、Ｈ７１Ｒ、Ｆ９３Ｌ、Ｎ９５Ｋ、Ｆ９７Ｙ、Ｆ９7Ｌ、Ｔ９８Ｐ、Ｆ９９Ｌ、Ａ１２６Ｔ、Ｖ１２９Ｄ、Ｐ１３１Ｓ、Ｉ１３６Ｔ、Ｉ１３６Ｖ、Ｈ１４３Ｒ、Ｔ１４４Ｉ、Ｉ１５４Ｖ、Ｎ１６４Ｄ、Ｔ１６６Ａ、Ｌ１７１Ｆ、Ｐ１７３Ｓ、Ｆ１８４（ａ）Ｌ、Ｑ１９２Ｈ、Ｓ２０１Ｉ、Ｑ２０９Ｌ、Ｑ２２１（ａ）Ｌ、Ｒ２３０Ｗ、Ｆ２３４ＬおよびＶ２４４Ｇから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含む。若干の例では、修飾は、配列番号５０５に示したアミノ酸配列を有するＭＴ−ＳＰ１の触媒活性部分に存する。他の例では、修飾は、さらにキモトリプシンのナンバリングに基づく配列番号２５３に示したＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドにおけるＣ１２２Ｓの修飾に対応する修飾を含むＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド、例えば配列番号５０７または５１７に示したＭＴ−ＳＰ１に存する。特に、本明細書で示した修飾には、Ｉ４１Ｆ、Ｆ９７Ｙ、Ｌ１７１ＦおよびＶ２４４Ｇから選択されるものがある。さらに、本発明で提供する修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、配列２５３に示したＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドにおけるＱ１７５ＲまたはＤ２１７Ｖに対応する１つまたはそれ以上の修飾を含み得る。上記修飾には、Ｉ１３６Ｔ／Ｎ１６４Ｄ／Ｔ１６６Ａ／Ｆ１８４（Ａ）Ｌ／Ｄ２１７Ｖ;Ｉ４１Ｆ;Ｉ４１Ｆ／Ａ１２６Ｔ／Ｖ２４４Ｇ;Ｄ２３Ｅ／Ｉ４１Ｆ／Ｔ９８Ｐ／Ｔ１４４Ｉ;Ｉ４１Ｆ／Ｌ１７１Ｆ／Ｖ２４４Ｇ;Ｈ１４３Ｒ／Ｑ１７５Ｒ;Ｉ４１Ｆ／Ｌ１７１Ｆ;Ｒ２３０Ｗ;Ｉ４１Ｆ／Ｉ１５４Ｖ／Ｖ２４４Ｇ;Ｉ１４１Ｆ／Ｌ５２Ｍ／Ｖ１２９Ｄ／Ｑ２２１（Ａ）Ｌ;Ｆ９９Ｌ;Ｆ９７Ｙ／Ｉ１３６Ｖ／Ｑ１９２Ｈ／Ｓ２０１Ｉ; Ｈ７１Ｒ／Ｐ１３１Ｓ／Ｄ２１７Ｖ;Ｄ２１７Ｖ;Ｔ６５Ｋ／Ｆ９３Ｌ／Ｆ９７Ｙ／Ｄ２１７Ｖ;Ｉ４１Ｔ／Ｐ１７３Ｓ／Ｑ２０９Ｌ;Ｆ９７Ｌ／Ｆ２３４Ｌ;Ｑ１７５Ｒ;Ｎ９５ＫおよびＹ６０（Ｇ）Ｓから選択されるものがある。上記修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、いずれもＣ２補体タンパク質についての特異性またはＣ２補体タンパク質に対する活性の一方または両方を増強する修飾を呈する。
また本発明は、修飾セリンプロテアーゼを含む修飾プロテアーゼ、例えば修飾ｕ−ＰＡポリペプチドまたは修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、医薬上許容される賦形剤を含み、限定するわけではないが、全身、経口、経鼻、経肺、限局的または局所的投与を含む適切な投与経路に対して処方され得る。また、医薬組成物のいずれか、組成物投与装置および所望による投与説明書を含むキットを提供する。
本発明は、ｕ−ＰＡプロテアーゼおよびＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼおよびその触媒活性部分を含む修飾プロテアーゼをコード化する核酸分子を提供する。また、核酸分子を含むベクターおよび核酸分子またはベクターを含む細胞を提供する。
本発明は、ｔ−ＰＡの投与により処置される疾患または状態、例えば、限定するわけではないが、動脈血栓症、静脈血栓症および血栓塞栓症、虚血性卒中、後天的凝固疾患、汎発性血管内凝固症候群、細菌感染症および歯周炎、および神経学的状態から選択される疾患または状態を呈する対象の処置方法であって、修飾ｕ−ＰＡプロテアーゼまたはそのタンパク質分解活性部分またはそれらをコード化する核酸分子または細胞を含む医薬組成物を投与することによる方法を提供する。本方法は、核酸分子、細胞または医薬組成物を対象に投与することにより実践される。
また本発明は、ＶＥＧＦＲ、特にＶＥＧＦＲ−２が介在する疾患または状態を呈する対象の処置方法を提供する。上記疾患または状態には、限定するわけではないが、癌、脈管形成疾患、眼病、例えば黄斑変性、炎症性疾患および糖尿病、特にその合併症、例えば糖尿病性網膜症がある。本方法は、ＶＥＧＦＲ−２についての非修飾形態と比べて高められた基質特異性を呈する修飾ｕ−ＰＡプロテアーゼを含むかまたはコード化する核酸分子または細胞または組成物を投与することにより行われる。本方法は、所望により疾患または状態を処置するための別の薬剤の投与、例えば疾患が癌である場合抗腫瘍剤の投与を含んでいてもよい。
また本発明は、補体タンパク質、特にＣ２が介在する疾患または状態を呈する対象の処置方法を提供する。上記疾患および状態には、限定するわけではないが、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、喘息、炎症性腸疾患、免疫複合体（ＩＣ）性急性炎症性組織損傷、アルツハイマー病（ＡＤ）、虚血−再灌流損傷、およびギラン−バレー症候群がある。若干の例では、虚血−再灌流損傷は、例えば、限定するわけではないが、心筋梗塞（ＭＩ）、卒中、血管形成術、冠動脈バイパス移植、心肺バイパス（ＣＰＢ）および血液透析といった事象または処置により誘発される。本方法は、Ｃ２についての特に非修飾形態と比べて増強された基質特異性を呈する修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼを含むかまたはコード化する核酸分子または細胞または組成物を投与することにより実施される。場合によっては、疾患または状態が対象の処置により生じることもある。例えば、処置が補体介在虚血−再灌流損傷を誘発し得る。上記処置には、限定するわけではないが、血管形成術または冠動脈バイパス移植がある。上記の例では、修飾ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼを対象の処置前に投与する。修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、体液または組織試料をインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させることにより投与され得る。
本発明はまた、本発明方法で使用する修飾セルピンポリペプチドを提供する。上記修飾セルピンポリペプチドを、標的基質についての開裂配列を伴うＰ４−Ｐ２'位に対応する位置でのその反応性部位ループで修飾する。典型的には、標的基質は、疾患または障害の原因に関与している。上記標的基質には、限定するわけではないが、ＶＥＧＦＲ、補体タンパク質またはｔ−ＰＡ基質がある。例えば、標的基質は、ＶＥＧＦＲ２および補体タンパク質Ｃ２を含む。本発明で提供する修飾セルピンの例は、修飾プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）および抗トロンビン−３（ＡＴ３）である。典型的な修飾セルピンを、配列番号４９７、４９９、６１０および６１１のいずれかに示す。
図１は、セルピンによるプロテアーゼの阻害機構および安定した阻害複合体の生成を示す。接触後、セルピン（Ｉ）およびプロテアーゼ（Ｅ）は、まず非共有結合性ミカエリス様複合体（ＥＩ）を形成する。この後、容易に開裂できるＰ１−Ｐ１'結合が開裂され、セルピンの反応性部位ループ（ＲＳＬ）カルボニルでプロテアーゼの触媒性セリンによる求核的攻撃が行われ、共有結合性アシル−酵素中間体（ＥＩ＃）が形成される。動力学的に捕えられた共有結合性阻害生成物（ＥＩ＋）は、ＲＳＬ挿入、プロテアーゼ転位、プロテアーゼ活性部位の歪曲、および全体的プロテアーゼ構造の変形の結果である。小さな非阻害性経路は、通常の開裂産物、セルピン（Ｉ★）、および反応性プロテアーゼ（Ｅ）を放出する。
詳細な説明
概略
Ａ．定義
Ｂ．プロテアーゼのスクリーニング方法
Ｃ．プロテアーゼトラップポリペプチド
１．セルピン：構造、機能および発現
２．プロテアーゼ触媒作用、セルピンの阻害性機構、およびアシル酵素中間体の形成
ａ．具体例としてのセルピン
i.ＰＡＩ−１
ii.抗トロンビン（ＡＴ３）
３．他のプロテアーゼトラップポリペプチド
ａ．ｐ３５
ｂ．アルファマクログロブリン（ａＭ）
４．プロテアーゼトラップポリペプチド競争物質
５．変異型プロテアーゼトラップポリペプチド
Ｄ．プロテアーゼ
１．候補プロテアーゼ
ａ．プロテアーゼの分類
ｉ．セリンプロテアーゼ
（ａ）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）
（ｂ）組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）
（ｃ）ＭＴ−ＳＰ１
ii．システインプロテアーゼ
Ｅ．スクリーニング用の修飾プロテアーゼおよびコレクション
１．変異型プロテアーゼの生成
ａ．ランダム突然変異誘発
ｂ．フォーカス突然変異誘発
２．変異型プロテアーゼのキメラ形態
３．コンビナトリアルライブラリーおよび他のライブラリー
ａ．ファージディスプレーライブラリー
ｂ．細胞表面ディスプレーライブラリー
ｃ．他のディスプレーライブラリー
Ｆ．選択されたプロテアーゼの接触、単離および同定方法
１．反復スクリーニング
２．具体例としての選択されたプロテアーゼ
Ｇ．プロテアーゼ活性および特異性の評価方法
Ｈ．プロテアーゼトラップポリペプチド（すなわち、セルピン）またはその変異型またはプロテアーゼ／修飾プロテアーゼをコード化する核酸の製造方法
１．ベクターおよび細胞
２．発現
ａ．原核生物細胞
ｂ．酵母細胞
ｃ．昆虫細胞
ｄ．哺乳類細胞
ｅ．植物
３．精製技術
４．融合タンパク質
５．ヌクレオチド配列
Ｉ．選択されたプロテアーゼポリペプチドの製造、処方および投与
１．組成物および送達
２．選択されたプロテアーゼのインビボ発現および遺伝子治療
ａ．核酸の送達
ｉ．ベクター−エピソームおよび組込み
ii．人工染色体および他の非ウイルス性ベクター送達方法
iii．リポソームおよび他の封入形態および核酸を含む細胞の投与
ｂ．インビトロおよびエクスビボ送達
ｃ．全身的、限局的および局所的送達
２． 併用療法
３．製品およびキット
Ｊ．選択されたプロテアーゼポリペプチドによる具体的処置方法
１．ｔＰＡ標的を開裂する選択されたｕＰＡポリペプチドについての具体的処置方法
ａ．血栓性疾患および状態
ｉ．動脈血栓症
ii．静脈血栓症および血栓塞栓症
（ａ）虚血性卒中
iii．後天的凝固疾患
（ａ）汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）
（ｂ）細菌感染症および歯周炎
ｂ．他のｔＰＡ標的関連状態
ｃ．診断方法
２．ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ標的を開裂する選択されたプロテアーゼポリペプチドについての具体的処置方法
ａ．脈管形成、癌および他の細胞周期依存的疾患または状態
ｂ．ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを開裂する選択されたプロテアーゼによる併用療法
３．補体タンパク質標的を開裂する選択されたＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドについての具体的処置方法
ａ．免疫介在炎症性疾患
ｂ．神経変性疾患
ｃ．心臓血管疾患
Ｋ．実施例
Ａ．定義
特に断らなければ、本明細書で使用している技術的および科学的用語は、本発明（複数も可）が属する技術分野の者が一般的に理解しているものと同じ意味を有する。本開示全体を通して引用されている全ての特許、特許出願、公開出願および出版物、Genbank配列、データベース、ウェブサイトおよび他の公的材料については、特に断らなければ、出典明示で援用する。本明細書記載の語について複数の定義がある事象では、この項の記載を優先する。ＵＲＬまたは他の上記識別名またはアドレスについて言及する場合、上記識別名は変更され得、インターネット上の特定情報はすぐに移り変わり得るが、インターネットを検索することにより同等内容の情報を見出し得るものとする。それを参照すれば、上記情報の有効性および公衆への普及状態が判明する。
プ本明細書で使用している「プロテアーゼトラップ」または「プロテアーゼトラップポリペプチド」は、プロテアーゼにより開裂される基質であり、プロテアーゼは実際の遷移状態を経て酵素複合体を形成するため、開裂時、プロテアーゼと安定した複合体を形成することによりプロテアーゼを捕え、その結果、プロテアーゼの活性を阻害し、それを捕捉することになる。すなわち、プロテアーゼトラップは、プロテアーゼの阻害剤である。プロテアーゼトラップは、開裂時、安定した複合体が形成されるようにプロテアーゼにより開裂されるアミノ酸残基を含むポリペプチドまたは分子である。複合体は十分安定しているため、未反応トラップまたはプロテアーゼとの相互作用の安定性が劣るトラップから複合体が分離され得る。プロテアーゼトラップは、プロテアーゼにより開裂され、開裂時、プロテアーゼと複合体を形成することにより、未反応トラップから反応したプロテアーゼまたは複合体を分離させ得るものであれば合成、修飾または天然の分子を全て包含する。上記プロテアーゼトラップの具体例は、セルピン、修飾セルピン、セルピンと類似した機構を呈する分子、例えば、ｐ３５、およびプロテアーゼにより開裂され、安定した複合体としてプロテアーゼを捕える他の分子、例えば、アルファ２マクログロブリンである。また、プロテアーゼ（またはそのタンパク質分解活性部分）により開裂され、開裂時、プロテアーゼまたはそのタンパク質分解活性部分と安定した複合体を形成する合成ポリペプチドもプロテアーゼトラップとして包含される。
本明細書で使用しているセルピンは、プロテアーゼによる反応性部位の開裂後にプロテアーゼを阻害することにより、安定したアシル酵素中間体を形成させ、安定した共有結合複合体中にプロテアーゼを捕捉（トラップ）する構造上関連したタンパク質の一群をいう。安定した共有結合複合体を形成することによりセルピン分子がプロテアーゼを阻害する限り、セルピンは対立遺伝子および種変異型および他の変異型を含むものとする。セルピンは、反応性部位ループ（ＲＳＬ）の少なくとも十分な部分を最小限含むことにより、プロテアーゼ阻害およびプロテアーゼとの安定した共有結合複合体の形成を促す完全長セルピンポリペプチドのアミノ酸の先端切除型または連続フラグメントも包含する。典型的なセルピンは、表２に示されており、そして／または配列番号１〜３８のいずれか１つに示されたアミノ酸配列、対立遺伝子変異型、またはその先端切除型部分を有する。
本明細書で使用している「突然変異体」または「変異型」セルピンは、アミノ酸修飾、特にセルピンの反応性部位ループでの修飾を含むセルピンをいう。修飾は、Ｐｎ−Ｐ15−Ｐ14−Ｐ13...Ｐ4−Ｐ3−Ｐ2−Ｐ1−Ｐ1'−Ｐ2'−Ｐ3'...Ｐｎ'-位に対応する１個またはそれ以上のアミノ酸の置き換え、欠失または置換であり得る。典型的には、セルピンは、野生型セルピンと比べて反応性部位ループの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。ほぼ通常、置換は、Ｐ４−Ｐ２'位に対応する１個またはそれ以上のアミノ酸に存する。例えば、配列番号１１に示した典型的なＰＡＩ−１セルピンの場合、配列番号１１におけるアミノ酸３６６〜３７０位に対応するＰ４−Ｐ１'位（ＶＳＡＲＭ）が修飾され得る。実施例１は、ＲＰＶＲＭまたはＰＦＧＲＳへのＶＳＡＲＭアミノ酸残基の修飾について記載している。
本明細書で使用している「容易に開裂できる結合」とは、プロテアーゼにより開裂されるポリペプチドにおける結合をいい、基質の開裂配列におけるＰ１−Ｐ１'位の間で形成される結合により示される。
本明細書で使用している反応性部位とは、プロテアーゼにより開裂される標的基質の配列の部分をいう。典型的には、反応性部位は、容易に開裂できるＰ１−Ｐ１'結合配列を含む。
本明細書で使用している反応性部位ループ（ＲＳＬ；反応性中心ループとも呼ばれる、ＲＣＬ）は、プロテアーゼ認識部位としての役割を果たし、一般にはプロテアーゼ特異性の単独または主要決定基を含むセルピン分子におけるアミノ酸の配列（典型的には１７〜２２連続アミノ酸）をいう。ＲＳＬ配列の開裂およびその立体配座変化は、安定した共有結合複合体におけるセルピン分子によるプロテアーゼの捕捉に関与している。本発明の目的の場合、セルピンのＲＬＳループにおける１個またはそれ以上のアミノ酸は、目的標的タンパク質における開裂配列に対応するように修飾され得る。変異型ＲＳＬ配列を含む上記修飾セルピンまたはその一部分は、基質特異性が改変されたプロテアーゼに関する選択に使用され得る。
本明細書で使用している分配（すること）は、セルピンが、安定したセルピン−プロテアーゼ複合体対開裂セルピン間に分配される過程をいう。セルピンにおける分配の理由は、セルピン表面全体に及ぶ開裂された反応性部位ループの大きな転位から生じる、阻害性経路の性質に関係している。プロテアーゼが阻害位置をとる前に解離する（すなわち、酵素−セルピン複合体を脱アシル化する）時間を有する場合、分配が行われる。したがって、所与のセルピン−プロテアーゼ相互作用の結果は、阻害性（ｋ４）および基質（ｋ５）経路間の分配比に左右され（例えば図１に描かれている）、阻害の化学量論により表わされる（ＳＩ＝１＋ｋ５／ｋ４）。セルピン分子の大部分は複合体形成へ分配され、ｋ５／ｋ４は０に近づくため、良好な阻害剤は１の値を有する。しかしながら、ＲＳＬループが十分な速さでプロテアーゼ中に挿入されない場合、分配が起こり、反応は直接開裂産物に進む。
本明細書で使用している触媒効率またはｋｃａｔ／ｋｍは、当業者によく知られている通りプロテアーゼが基質を開裂する際の効率の尺度であり、定常条件下で測定される。
本明細書で使用している阻害の二次速度定数は、プロテアーゼと阻害剤の相互作用に関する速度定数をいう。一般的に、プロテアーゼと阻害剤、例えばプロテアーゼトラップ、例えばセルピンの相互作用は、各反応体、阻害剤およびプロテアーゼの濃度の積に比例する二次反応である。堅固な結合または不可逆的阻害剤またはプロテアーゼトラップによるプロテアーゼの阻害に関する二次速度定数は一定であり、酵素濃度と阻害剤濃度を掛けたとき、特定阻害剤による酵素不活化の速度が得られる。各プロテアーゼトラップおよび酵素対についての速度定数は、それらの相互作用を独特に反映する。二次反応として、二次速度定数の増加は、選択された修飾プロテアーゼと阻害剤間の相互作用が、非修飾プロテアーゼと阻害剤の相互作用と比べて速いことを意味する。すなわち、二次速度定数の変化は、反応の成分、プロテアーゼおよび／または阻害剤の間の相互作用の変化を反映している。プロテアーゼについてスクリーニングした場合、二次速度定数の増加は、プロテアーゼにおける選択された修飾が望ましいものであることを反映し得る。
本明細書で使用しているアシル酵素中間体は、セリンプロテアーゼの触媒中心（典型的には、キモトリプシンのナンバリングに基づいたＳｅｒ１９５）における基質および必須セリン間の触媒作用における第一段階中に形成される共有結合中間体をいう。この反応は以下の要領で進行する：セリン−ＯＨが基質のＰ１位のカルボニル炭素を攻撃し、ヒスチジンの窒素がセリンの−ＯＨからの水素を受け入れ、カルボニル酸素の二重結合から一電子対が酸素に移動する。この結果、負に荷電した四面体の中間体が生成される。基質のペプチド結合における窒素と炭素を結ぶ結合が破壊される。この結合を作る共有結合電子が移動してヒスチジンの水素を攻撃することにより、結合を破壊する。カルボニル酸素二重結合から先に移動した電子は、負の酸素から戻ることによって、再び結合を作り、共有結合アシル酵素中間体を形成する。アシル酵素中間体を（水で）加水分解することにより、脱アシル化が行われ、開裂した基質と遊離酵素が形成される。
本明細書で使用しているプロテアーゼのコレクションは、少なくとも１０種の異なるプロテアーゼおよび／またはそのタンパク質分解活性部分を含み、一般的には少なくとも５０、１００、５００、１０００、１０４、１０５またはそれ以上のメンバーを含むコレクションをいう。典型的には、コレクションにプロテアーゼ（またはそのタンパク質分解活性部分）を含ませて、基質特異性についてのスクリーニングにかける。上記コレクションには、天然プロテアーゼ（またはそのタンパク質分解活性部分）および／または修飾プロテアーゼ（またはそのタンパク質分解活性部分）が含まれる。修飾には、プロテアーゼの長さに沿ったランダム突然変異および／またはターゲッティングまたは選択された領域における修飾（すなわち、フォーカス突然変異）がある。修飾は、組合わせ的であり得、特定の座または全座またはそのサブセットでの全アミノ酸の置換による順列を全て含み得る。上記コレクションは、プロテアーゼドメインのみを含む、完全長またはそれより短いプロテアーゼを含み得る。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼなどのプロテアーゼを全て包含し得る。コレクションのサイズおよび特定のコレクションは、使用者が決定する。他の実施態様では、コレクションが僅か２つのプロテアーゼしか含まない場合もあり得る。
本明細書で使用している「コンビナトリアルコレクション」または「コンビナトリアルライブラリー」は、出発鋳型プロテアーゼポリペプチド配列の配列に関してその配列中に独特で多様なアミノ酸突然変異を有するプロテアーゼポリペプチドのコレクションをいう。コレクションに表れる突然変異は、ポリペプチドの配列全体に及び得るか、またはポリペプチド配列の特定の一領域または複数領域に存在し得る。突然変異はランダムに誘発され得るか、または構造または機能情報に基づいて経験的または合理的に設計されたターゲット突然変異であり得る。
本明細書で使用している「鋳型プロテアーゼ」は、その突然変異誘発に使用されるアミノ酸の配列を有するプロテアーゼをいう。鋳型プロテアーゼは、野生型プロテアーゼ、またはその触媒活性部分の配列であり得るか、または変異型プロテアーゼ、またはその触媒活性部分の配列であり得、さらなる突然変異が導入される。例えば、本発明選択方法で同定される突然変異体プロテアーゼは、さらなる突然変異導入用の出発鋳型として使用され、選択の後続ラウンドで使用され得る。
本明細書で使用しているランダム突然変異は、突然変異に関して重要視または偏向を伴わないポリペプチドの配列全体に及ぶ１つまたはそれ以上のアミノ酸変化の導入をいう。ランダム突然変異誘発は、例えばＵＶ照射、化学的方法およびＰＣＲ法（例、エラー-プローンＰＣＲ）を含む当業者に公知の様々な技術により促進され得る。
本明細書で使用しているフォーカス突然変異は、ポリペプチドの特定の一領域（または複数領域）または特定の一位置（または複数位置）における１つまたはそれ以上のアミノ酸変化をいう。例えば、プロテアーゼの特異性結合ポケットにおけるアミノ酸のターゲット突然変異が誘発され得る。フォーカス突然変異誘発は、例えば、当業界で公知の標準組換え技術を用いる位置指定突然変異導入または多位置指定突然変異導入により実施され得る。
本明細書で使用している、プロテアーゼトラップおよびプロテアーゼまたはそのタンパク質分解活性部分間の安定複合体は、プロテアーゼトラップとの複合体を形成しなかったプロテアーゼ（すなわち、非複合体形成プロテアーゼ）から分離されるほど十分に安定している複合体をいう。上記複合体は、共有結合、イオン性および疎水性相互作用を含む安定した相互作用を介して形成され得るが、反応条件下で十分に安定しているため、単離するため複合体を分離するのに十分な時間複合体の状態を維持している。典型的には、例えばセルピンおよび開裂プロテアーゼ間における上記相互作用は、共有結合である。
本明細書で使用している「ホットスポット」は、所望の新規基質配列に関して改善された活性および／または選択性を呈するプロテアーゼ選択から生じる多数の変異型において突然変異が導入される位置をいう。１つまたはそれ以上の「ホットスポット」は、プロテアーゼ選択中に同定され得る。このため、上記位置は、プロテアーゼに関する特異性および／または選択性決定因子であることによって基質特異性の一因となるもので、また、他例えばキモトリプシンのナンバリングに基づいた、プロテアーゼファミリー、例えばセリンプロテアーゼファミリーまたは特定のプロテアーゼファミリーの複数メンバーにおいて対応する遺伝子座全体に及ぶ広範な特異性および／または選択性決定因子として発現し得る。
本明細書で使用している基質特異性に関する所望の特異性は、予め定められたかまたは予め選択されたかまたは他の形でターゲッティングされる基質についての開裂特異性をいう。
本明細書で使用している「選択する」またはその文法的変形は、プロテアーゼトラップポリペプチドと複合体を形成しているプロテアーゼを選抜または選択することをいう。このため、本発明における目的の場合、「選択する」は、プロテアーゼトラップポリペプチドとの安定した複合体におけるその会合状態に基づいてプロテアーゼを抜き出すことである。一般的に、共有結合複合体の捕捉により選択は容易になり得、所望ならば、プロテアーゼを単離し得る。例えば、プロテアーゼトラップポリペプチドを、例えば予め定められたマーカー、標識または他の検出可能な部分で標識することにより、選択は容易となり、安定した複合体におけるその会合状態に基づいてプロテアーゼが同定され得る。
本明細書で使用している「同定する」およびその文法的変形は、安定した複合体におけるプロテアーゼを認識または識別することである。典型的には、本発明方法では、プロテアーゼは、プロテアーゼトラップポリペプチドとの安定した複合体におけるその会合状態により同定され、この同定は、例えば複合体で結合しているプロテアーゼの増幅（すなわち、適切な宿主細胞での増殖）、次いでＤＮＡ配列決定により達成され得る。
本明細書で使用している、検出または分離のための標識は、分子、例えばプロテアーゼトラップポリペプチドが、検出可能な標識、例えば発蛍光団を随伴しているか、または例えば精製または単離または分離を目的として標識または他の部分を随伴していることを意味する。「検出可能な形で標識された」は、分子、例えばプロテアーゼトラップポリペプチドが検出または分離するために標識されていることを指す。
本明細書で使用している、プロテアーゼまたはプロテアーゼのタンパク質分解活性部分の増幅とは、プロテアーゼまたはそのタンパク質分解活性部分の量が、例えば単離およびクローニングおよび発現を通して増大されていることを意味するか、または、プロテアーゼまたはタンパク質分解活性部分が微生物上で表示されている場合、微生物を適切な宿主中に導入し、表示されたプロテアーゼまたはタンパク質分解活性部分がさらに生産されるように生育または培養することを意味する。
本明細書で使用している、反応混合物に関して「均一な」という場合、これは反応体が混合物として、例えば溶液または懸濁液として液相にあることを意味する。
本明細書で使用している、プロテアーゼまたはプロテアーゼのタンパク質分解活性部分のコレクションが特定プロテアーゼ「に基づいている」という場合、これは上記コレクションが、例えばランダムまたは（位置）指定突然変異導入または合理的設計または他の修正スキームまたはプロトコルにより特定プロテアーゼから誘導されてコレクションを形成していることを意味する。
本明細書で使用している、ｔ−ＰＡに投与により処置される疾患または状態は、当業者がｔ−ＰＡを投与する疾患または状態をいう。上記状態には、限定されるわけではないが、フィブリン溶解性状態、例えば動脈血栓症、静脈血栓症および血栓塞栓症、虚血性卒中、後天的凝固疾患、汎発性血管内凝固症候群およびその前駆症状、例えば細菌またはウイルス感染症、歯周炎および神経学的状態がある。
本明細書で使用している、ＶＥＧＦＲ−２が介在する疾患または状態は、病理または病因が複雑である。上記状態には、限定されるわけではないが、炎症性および血管形成状態、例えば癌、糖尿病性網膜症および眼病、例えば黄斑変性がある。
本明細書で使用している、「プロテアーゼ」、「プロテイナーゼ」および「ペプチダーゼ」は互換的に使用され、共有ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素を包含する。これらの名称は、チモーゲン形態およびその活性化１本、２本および多鎖形態を包含する。明確にするため、プロテアーゼと言えば、これらの形態を全て包含するものとする。プロテアーゼは、それらの活性部位の触媒活性および標的基質のペプチド結合の開裂機構により、例えばセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルティックプロテアーゼ、トレオニンおよびメタロ−プロテアーゼを包含する。
本明細書で使用している、チモーゲンは、成熟開裂を含む、タンパク質加水分解開裂、例えば活性化開裂、および／または他のタンパク質（複数も可）および／または補因子（複数も可）との複合体形成により活性化されるプロテアーゼをいう。チモーゲンは、タンパク質分解酵素の不活性前駆体である。上記前駆体は一般に大きいが、活性形態より必ずしも大きいとは限らない。セリンプロテアーゼに関して述べると、チモーゲンは、触媒的および自触的開裂を含む特異的開裂により、または活性酵素を生成する活性化補因子の結合により活性酵素に変換される。すなわち、チモーゲンは、活性化因子の作用によりタンパク質分解酵素に変換される酵素的不活性タンパク質である。開裂は自触的に行われ得る。チモーゲンは、一般的に不活性であり、チモーゲンからのプロ領域の触媒的または自触的開裂により成熟活性ポリペプチドに変換され得る。
本明細書で使用している、「プロ領域」、「プロペプチド」または「プロ配列」は、開裂されることにより成熟タンパク質を生じる領域またはセグメントをいう。これは、触媒機構を遮断することによって触媒性中間体の形成を阻止することにより（すなわち、基質結合部位を化学立体的に閉塞させることにより）酵素活性を抑制するべく機能するセグメントを含み得る。プロ領域は、成熟生物学的活性ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列であり、僅か数個のアミノ酸であり得るか、またはマルチドメイン構造であり得る。
本明細書で使用している、活性化配列は、活性プロテアーゼを形成するための活性化開裂または成熟開裂に要求される部位であるチモーゲンにおけるアミノ酸配列をいう。活性化配列の開裂は、自触的または活性化パートナーにより触媒され得る。
活性化開裂は、活性に必要とされる立体配座変化が起こる成熟開裂の一タイプである。これは古典的活性化経路であり、例えば、セリンプロテアーゼについては、開裂により、触媒機構の保存領域、例えば触媒性残基と相互作用する新たなＮ−末端が生じ、それにより活性に必要とされる立体配座の変化が誘導される。活性化の結果、プロテアーゼの多鎖形態が生成され得る。場合によっては、プロテアーゼの１本鎖形態が１本鎖としてタンパク質分解活性を呈し得ることもある。
本明細書で使用している、ドメインは、分子の他の部分とは構造的および／または機能的に異なり、同定可能である分子、例えばタンパク質またはコード化する核酸の一部分をいう。
本明細書で使用している、プロテアーゼドメインは、プロテアーゼの触媒活性部分である。プロテアーゼのプロテアーゼドメインと言えば、これらのタンパク質のいずれかの１本、２本および多鎖形態を指すものとする。タンパク質のプロテアーゼドメインは、例えばその触媒中心などのタンパク質分解活性に必要とされるそのタンパク質の必須特性を全て含む。
本明細書で使用している、プロテアーゼの触媒活性部分またはタンパク質分解活性部分は、プロテアーゼドメイン、またはプロテアーゼ活性を保持しているそのフラグメントまたは一部分をいう。重要なことに、少なくともインビトロで、プロテアーゼの１本鎖形態およびその触媒性ドメインまたはタンパク質分解活性部分（典型的にはＣ−末端切頂部分）は、プロテアーゼ活性を呈する。
本明細書で使用している、「プロテアーゼドメインまたはプロテアーゼの触媒活性部分をコード化する核酸」は、連続配列としてのプロテアーゼの他の近接部分ではなく、上記１本鎖プロテアーゼドメインまたはその活性部分のみをコード化する核酸をいう。
本明細書で使用している、「ポリペプチドが本質的にプロテアーゼドメインから成る」という表現は、ポリペプチドのその部分のみがプロテアーゼドメインまたはその触媒活性部分であることを意味する。ポリペプチドは、所望により追加的なアミノ酸の非プロテアーゼ由来の配列を含んでいてもよく、またそれが一般的である。
本明細書で使用している、「Ｓ１〜Ｓ４」は、基質のＰ１〜Ｐ４残基についての結合部位を形成するアミノ酸残基をいう（例、Schecter および Berger（１９６７）Biochem Biophys Res Commun ２７：１５７−１６２参照）。Ｓ１〜Ｓ４はそれぞれ、非連続的であり得る１個、２個またはそれ以上の残基を含む。これらの部位には、容易に開裂できる結合と称される、Ｎ−末端認識部位からタンパク質分解部位まで連続番号を付けている。
本明細書で使用している、「Ｐ１〜Ｐ４」および「Ｐ１'〜Ｐ４'」は、Ｓ１〜Ｓ４残基およびＳ１'〜Ｓ４'残基とそれぞれ特異的に相互作用し、プロテアーゼにより開裂される基質ペプチドにおける残基をいう。Ｐ１〜Ｐ４は、開裂部位のＮ−末端側における残基位置をいう。Ｐ１'〜Ｐ４'は、開裂部位のＣ−末端側までの残基位置を指す。アミノ酸残基については、ポリペプチド基質のＮ末端からＣ末端まで標識付している（Ｐｉ、...、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１'、Ｐ２'、Ｐ３'、...、Ｐｊ）。それぞれの結合性サブサイトについても標識付している（Ｓｉ、...、Ｓ３、Ｓ２、Ｓ１、Ｓ１'、Ｓ２'、Ｓ３'、...、Ｓｊ）。開裂は、Ｐ１とＰ１'の間で触媒される。
本明細書で使用している、「結合ポケット」は、基質上の特異的な一アミノ酸または複数アミノ酸と相互作用する一残基または複数残基をいう。「特異性ポケット」は、他よりも多くのエネルギーを与える結合ポケットである（最も重要または優勢な結合ポケット）。典型的には、結合段階は、触媒過程の誘発に必要な遷移状態の形成に先行する。Ｓ１〜Ｓ４およびＳ１'〜Ｓ４'アミノ酸は、基質配列結合ポケットを構成し、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質基質のそれぞれのＰ１〜Ｐ４およびＰ１'〜Ｐ４'アミノ酸との相互作用による基質認識を容易にする。プロテアーゼが基質と相互作用するか否かは、Ｓ１〜Ｓ４およびＳ１'〜Ｓ４'位におけるアミノ酸の相関関係によって決まる。Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ１'、Ｓ２'、Ｓ３'およびＳ４'サブサイトのいずれか１つまたはそれ以上におけるアミノ酸が、基質におけるＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ１'、Ｐ２'、Ｐ３'およびＰ４'部位のアミノ酸のいずれか１つまたはそれ以上と相互作用するかまたはそれを認識する場合、プロテアーゼは基質を開裂し得る。結合ポケットは、ペプチド結合の触媒作用および基質の開裂が達成されるように標的アミノ酸をプロテアーゼと配置している。例えば、セリンプロテアーゼは、典型的には基質におけるＰ４−Ｐ２'部位を認識する。他のプロテアーゼは、Ｐ４−Ｐ２'の範囲を超えて広範に認識し得る。
本明細書で使用している、「広範な基質特異性の一因となる」アミノ酸とは、特異性ポケットに加えて開裂された活性部位における残基をいう。これらのアミノ酸は、プロテアーゼにおけるＳ１〜Ｓ４、Ｓ１'〜Ｓ４'残基を含む。
本明細書で使用している、相互作用の二次部位は、開裂された活性部位の外側である。これらは、基質認識および触媒作用の一助となり得る。これらのアミノ酸は、基質との第２および第３殻相互作用の一助となり得るアミノ酸を含む。例えば、Ｓ１〜Ｓ４の周囲のプロテアーゼの構造におけるループ。Ｓ１'〜Ｓ４'アミノ酸は、基質においてＰ１〜Ｐ４、Ｐ１'〜Ｐ４'アミノ酸を配置させることにより、プロテアーゼの活性部位に容易に開裂できる結合を形成させる上である一定の役割を演じる。
本明細書で使用している、プロテアーゼの活性部位は、基質の触媒作用が起こる基質結合部位をいう。活性部位の構造および化学的特性により、基質の認識および結合、それに続く基質における加水分解および容易に開裂できる結合の開裂が行われ得る。プロテアーゼの活性部位は、ペプチド開裂の触媒機構の一端を担うアミノ酸および基質配列認識の一端を担うアミノ酸、例えば広範な基質結合特異性の一助となるアミノ酸を含む。
本明細書で使用している、セリンまたはシステインプロテアーゼの「触媒性トライアッド」または「活性部位残基」とは、セリンまたはシステインプロテアーゼの活性部位にあり、ペプチド開裂の触媒機構の一端を担うアミノ酸、典型的には３個のアミノ酸の組合わせをいう。一般的に、触媒性トライアッドは、セリンプロテアーゼに見出され、活性求核基および酸／塩基触媒を提供する。セリンプロテアーゼの触媒性トライアッドは、キモトリプシンでは、Ａｓｐ１０２、Ｈｉｓ５７およびＳｅｒ１９５である、３個のアミノ酸を含む。これらの残基は、セリンプロテアーゼの触媒効率にとって決定的なものである。
本明細書で使用している、「基質認識部位」または「開裂配列」は、プロテアーゼにより開裂される、プロテアーゼの活性部位により認識される配列をいう。典型的には、例えば、セリンプロテアーゼの場合、開裂配列は、基質におけるＰ１〜Ｐ４およびＰ１'〜Ｐ４'アミノ酸により構成され、開裂はＰ１位の後で起こる。典型的には、セリンプロテアーゼに関する開裂配列は、多くのプロテアーゼの広範な基質特異性と適合するように６残基長であるが、プロテアーゼしだいで長い場合も短い場合もあり得る。例えば、自触作用に要求されるＭＴ−ＳＰ１の基質認識部位または開裂配列はＲＱＡＲＶＶであり、この場合、ＲはＰ４位にあり、ＱはＰ３位にあり、ＡはＰ２位にあり、ＲはＰ１位にある。ＭＴ−ＳＰ１における開裂は、Ｒ位の後で起こり、配列ＶＶＧＧが続く。
本明細書で使用している、標的基質とは、プロテアーゼによりその基質認識部位が特異的に開裂される基質をいう。標的基質は、最小限開裂配列を構成するアミノ酸を含む。所望により、標的基質は、開裂配列および他のアミノ酸を含むペプチドを含む。プロテアーゼにより認識される開裂配列を含むものであれば、完全長タンパク質、対立遺伝子、変異型、イソ型またはそのいずれかの一部分は、そのプロテアーゼについての標的基質である。さらに、標的基質は、プロテアーゼによる基質の開裂に影響を及ぼさない追加的部分を含むペプチドまたはタンパク質を含む。例えば、標的基質は、蛍光性部分に化学的に結合された４アミノ酸ペプチドまたは完全長タンパク質を含む。
本明細書で使用している、開裂とは、プロテアーゼによるペプチド結合の破壊をいう。プロテアーゼに関する開裂部位モチーフは、Ｎ−およびＣ−末端残基から容易に開裂できる結合までを含む（非プライムおよびプライム側は、それぞれ、...Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１'、Ｐ２'、Ｐ３'...として定義されるプロテアーゼに関する開裂部位を伴い、また開裂はＰ１とＰ１'残基の間で起こる）。典型的には、基質の開裂は、活性化開裂または阻害的開裂である。活性化開裂は、不活性形態から活性形態へのポリペプチドの開裂をいう。これは、例えば、チモーゲンの活性酵素への開裂、および／または前増殖因子から活性増殖因子への開裂を含む。例えば、ＭＴ−ＳＰ１は、ＲＱＡＲのＰ１〜Ｐ４配列で標的基質を開裂することにより自己賦活し得る。活性化開裂もまた、タンパク質が、それ自体活性を有する１つまたはそれ以上のタンパク質に開裂される開裂である。例えば、活性化開裂は、その終結が、炎症を刺激し、抗原食作用を促し、細胞を直接溶解する多くのエフェクター分子の形成をもたらすタンパク質分解的開裂事象の不可逆的カスケードである補体系で起こる。
本明細書で使用している、阻害的開裂は、機能的ではない１つまたはそれ以上の分解産物へのタンパク質の開裂である。阻害的開裂の結果、タンパク質の活性は減少または縮小する。典型的には、タンパク質の活性の縮小により、タンパク質が関与する経路または過程も縮小する。一例では、阻害的開裂である、１つまたはそれ以上の標的タンパク質、例えばＶＥＧＦＲの開裂により、標的基質の１つまたはそれ以上の機能または活性の縮小または阻害が同時に起こる。例えば、ＶＥＧＦＲの開裂の場合、阻害され得る活性には、限定されるわけではないが、リガンド結合、キナーゼ活性または脈管形成活性、例えばインビボまたはインビトロでの脈管形成活性がある。阻害性であるため、開裂は、タンパク質の天然形態と比べて少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９.９％またはそれを超える割合で活性を低下させる。開裂が阻害性であるために要求されるタンパク質の開裂パーセントは、タンパク質間で変動するが、タンパク質の活性について検定することにより測定され得る。
本明細書で使用している、プロテアーゼポリペプチドは、候補プロテアーゼ、または本明細書に記載しているその変異型プロテアーゼのいずれか１つに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
本明細書で使用している、「修飾プロテアーゼ」または「突然変異タンパク質プロテアーゼ」は、野生型または鋳型プロテアーゼと異なり一次配列に１つまたはそれ以上の修飾を有するプロテアーゼポリペプチド（タンパク質）をいう。１つまたはそれ以上の突然変異は、１つまたはそれ以上のアミノ酸置き換え（置換）、挿入、欠失およびそれらの組合わせであり得る。修飾プロテアーゼポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の修飾位置を有するものを包含する。修飾プロテアーゼは、完全長プロテアーゼであり得るか、または修飾プロテアーゼがタンパク質分解活性を示す限り、修飾完全長プロテアーゼのその触媒活性部分であり得る。一般的に、これらの突然変異は、１つまたはそれ以上の目的または予め定められた標的基質の開裂に関する野生型または鋳型プロテアーゼの特異性および活性を変化させる。プロテアーゼの基質特異性を改変する領域に修飾を含むことに加えて、修飾プロテアーゼはまた、プロテアーゼの基質特異性に必須のものではない領域に他の修飾を含むことを許容し得る。このため、修飾プロテアーゼは、典型的には、野生型またはスカホールドプロテアーゼのアミノ酸の対応する配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。修飾完全長プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼのその触媒活性部分は、融合自体がプロテアーゼの基質特異性を改変するものではない限り融合タンパク質であるプロテアーゼも包含し得る。
本明細書で使用している、キモトリプシンのナンバリングは、配列番号３９１の成熟キモトリプシンポリペプチドのアミノ酸のナンバリングをいう。プロテアーゼドメインを含む、キモトリプシンファミリー（すなわち、ｕ−ＰＡ、ｔ−ＰＡ、ＭＴ−ＳＰ１）のプロテアーゼのアラインメントは、キモトリプシンで形成され得る。上記の場合、キモトリプシンのアミノ酸に対応するプロテアーゼのアミノ酸には、キモトリプシンアミノ酸のナンバリングが付されている。対応する位置は、当業者が操作するアラインメントを用いるかまたは多くの利用可能なアラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ）を用いることによる、上記アラインメントにより決定され得る。対応する位置はまた、例えばタンパク質構造のコンピューターでシミュレーションしたアラインメントを用いることによる、構造アラインメントに基づき得る。ポリペプチドのアミノ酸が開示された配列におけるアミノ酸に対応するということは、標準アラインメントアルゴリズム、例えばＧＡＰアルゴリズムを用いて同一性または相同性が最大となるようにした（この場合保存されたアミノ酸を整列させる）開示された配列とのポリペプチドのアラインメントで同定されたアミノ酸であることを意味する。例えば、成熟キモトリプシンポリペプチドとｕ−ＰＡのアラインメントでは、配列番号１９１に示したｕ−ＰＡの前駆体配列におけるアミノ酸Ｃ１６８が、成熟キモトリプシンポリペプチドのアミノ酸Ｃ１と並ぶ。すなわち、ｕ−ＰＡにおけるアミノ酸Ｃ１６８は、キモトリプシンのナンバリングに基づくＣ１でもある。キモトリプシンのナンバリング標準を用いると、配列番号１９１に示した前駆体ｕ−ＰＡ配列におけるアミノ酸Ｌ２４４は、キモトリプシンのナンバリングに基づくＬ７３と同じであり、Ｉ２６０は、キモトリプシンのナンバリングに基づくＩ８９と同じである。別の例において、成熟キモトリプシンとＭＴ−ＳＰ１のセリンプロテアーゼドメイン（配列番号２５３のアミノ酸６１５〜８５５に対応）のアラインメントでは、ＭＴ−ＳＰ１における６１５位のＶにはＶ１６のキモトリプシンのナンバリングが与えられている。後続のアミノ酸もそれに準じてナンバリングされている。すなわち、完全長ＭＴ−ＳＰ１（配列番号２５３）のアミノ酸７０８位のＦは、キモトリプシンのナンバリングに基づくＦ９９に対応する。残基がプロテアーゼに存在するが、キモトリプシンには存在しない場合、アミノ酸残基には文字表示が付される。例えば、キモトリプシンのナンバリングに基づくアミノ酸６０を伴うループの一部であるが、キモトリプシンとは異なりＭＴ−ＳＰ１配列に挿入されているキモトリプシンにおける残基は、例えばＡｓｐ６０ｂまたはＡｒｇ６０ｃと称される。
本明細書で使用している、標的基質についての特異性とは、非標的基質とも称される別の基質と比べてプロテアーゼによる標的基質の開裂が優先されることをいう。特異性は、プロテアーゼの基質に対するその親和力および酵素の有効性の尺度である、二次速度定数または特異性定数（ｋｃａｔ／Ｋｍ）に反映されている。
本明細書で使用している、開裂に関する特異性定数は（ｋｃａｔ／Ｋｍ）であり、式中、Ｋｍはミカエリス−メントン定数（半Ｖｍａｘでの［Ｓ］）であり、Ｋｃａｔは、Ｖｍａｘ／［Ｅγ］であり、Ｅγは最終酵素濃度である。パラメーターｋｃａｔ、Ｋｍおよびｋｃａｔ／Ｋｍは、基質濃度の逆数対基質開裂速度の逆数をグラフ化し、ラインウェバー-バーク等式（１／速度＝（Ｋｍ／Ｖｍａｘ）（１／［Ｓ］）＋１／Ｖｍａｘ；式中、Ｖｍａｘ＝［Ｅγ］ｋｃａｔ）に当てはめることにより計算され得る。様々な濃度の基質の存在下で経時的に開裂の増加速度を測定する方法を用いることにより、特異性定数が計算され得る。例えば、プロテアーゼによる開裂時に放出される蛍光性部分に基質を結合させる。異なる酵素濃度で開裂速度を測定することにより、特定プロテアーゼについてｋｃａｔが測定され得る。特異性定数を用いることにより、当業界での標準的方法、例えばポジショナル・スキャン・コンビナトリアルライブラリー（ＰＳ−ＳＣＬ）を用いて、基質において同時に存するＰ１〜Ｐ４アミノ酸に関するプロテアーゼのＳ１〜Ｓ４ポケットの１つまたはそれ以上におけるアミノ酸の部位特異的優先性が測定され得る。さらに、特異性定数を用いることにより、別の基質に対する一標的基質についてのプロテアーゼの優先性も測定され得る。
本明細書で使用している、基質特異性比は、特異性定数の比であり、２種またはそれ以上のプロテアーゼまたは２種またはそれ以上の基質に対する一プロテアーゼの特異性を比較するのに使用され得る。例えば、複数基質について競う場合のプロテアーゼまたは一基質について複数プロテアーゼを競わせる場合の基質特異性は、ｋｃａｔ／Ｋｍを比較することにより比べられる。例えば、標的基質について２×１０６Ｍ−１／秒および非標的基質について２×１０４Ｍ−１／秒の特異性定数を有するプロテアーゼは、標的基質についての方の特異性が高い。上記による特異性定数を用いると、プロテアーゼは、標的プロテアーゼについて１００の基質特異性を有する。
本明細書で使用している、標的基質についての優先性は、基質特異性比として表わされ得る。優先性を反映する比の特定値は、基質と問題のプロテアーゼとの相関的な要素である。１より大きい基質特異性は、標的基質についての優先性を意味し、１未満の基質特異性は非標的基質についての優先性を意味する。一般的に、少なくともまたは約１の比は、プロテアーゼを候補治療薬とみなすのに十分な差異を反映している。
本明細書で使用している、改変された特異性とは、出発野生型または鋳型プロテアーゼと比べた場合の修飾または選択されたプロテアーゼの基質特異性の変化をいう。一般的には、特異性の変化は、鋳型プロテアーゼの野生型基質（本明細書では非標的基質と称す）と比べた場合の標的基質についての修飾プロテアーゼの優先性における変化を反映するものである。典型的には、本明細書記載の修飾プロテアーゼまたは選択されたプロテアーゼは、鋳型プロテアーゼの基質特異性と比べた場合の標的タンパク質の１つまたはそれ以上の予め定められたかまたは目的開裂配列についての基質特異性の増加を呈する。例えば、標的基質対非標的基質に関して１００の基質特異性比を有する修飾プロテアーゼまたは選択されたプロテアーゼは、１０の基質特異性をもつスカホールドプロテアーゼと比べて１０倍高い特異性を呈する。別の例では、０.１の基質特異性比と比べて１の同比を有する修飾プロテアーゼは、基質特異性の１０倍増加を呈する。鋳型プロテアーゼと比べて高い特異性を呈するために、修飾プロテアーゼは、予め定められた標的基質の１つまたはそれ以上について１.５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍またはそれより大きい基質特異性を有する。
本明細書で使用している、「選択性」は、競合基質の混合物間から一標的基質を選択および開裂するプロテアーゼの能力についていう場合、特異性と互換的に使用され得る。他の１つまたはそれ以上の標的基質と比べて高い、一標的基質についてのプロテアーゼの選択性は、例えばプロテアーゼによる標的基質開裂の特異性定数を比較することにより測定され得る。例えば、プロテアーゼが標的基質について２×１０６Ｍ−１／秒および他の１つまたはそれ以上の標的基質について２×１０４Ｍ−１／秒の開裂特異性定数を有する場合、プロテアーゼは、前者の標的基質について高い選択性を示す。
本明細書で使用している、活性とは、完全長（完全）タンパク質に随伴するポリペプチドまたはその一部分の機能的な一活性または複数活性をいう。機能的活性には、限定されるわけではないが、生物活性、触媒または酵素活性、抗原性（抗ポリペプチド抗体への結合またはそれへの結合についてポリペプチドと競合する能力）、免疫原性、マルチマー形成能、およびポリペプチドについての受容体またはリガンドへの特異結合能がある。
本明細書で使用している、触媒活性または開裂活性は、選択された基質のタンパク質分解を検出するインビトロタンパク質分解検定法で評価されるプロテアーゼの活性をいう。開裂活性は、プロテアーゼの触媒有効性を評価することにより測定され得る。
本明細書で使用している、標的基質に向かう活性とは、開裂活性および／または機能的活性、または標的基質に対するかまたはそれに向かうプロテアーゼの活性を反映する他の測定値をいう。開裂活性は、プロテアーゼの触媒有効性を評価することにより測定され得る。本発明の目的の場合、プロテアーゼが、プロテアーゼの存在しない場合と比べて、高い標的基質のタンパク質分解または開裂を呈するか、そして／または標的基質タンパク質の機能的活性をモジュレーションする（すなわち、活性化または阻害する）場合、活性は高められている。
本明細書で使用している、セリンプロテアーゼまたはセリンエンドペプチダーゼは、酵素の活性中心におけるセリン残基の存在を特徴とする、ペプチダーゼの１種をいう。セリンプロテアーゼは、血液凝固、炎症および原核生物および真核生物での消化酵素を含め、身体における広範囲の機能に関与している。「セリンプロテアーゼ」による開裂機構は、セリンによる標的ペプチド結合の求核攻撃に基づいている。システイン、トレオニンまたはアスパラギン酸に伴う水分子または金属もまた、この役割を演じ得る。セリン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸の並んだ側鎖は、ほとんどのセリンプロテアーゼに共通する触媒性トライアッドを形成する。セリンプロテアーゼの活性部位はクレフトの形状をしており、そこにポリペプチド基質が結合している。セリンプロテアーゼの例には、配列番号４３３に示した尿中プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）および配列番号２５３に示したＭＴ−ＳＰ１、およびその触媒活性部分、例えば配列番号５０５に示したＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメイン（Ｂ鎖とも呼ばれる）がある。
本明細書で使用している、ヒトタンパク質とは、その対立遺伝子変異型およびその同類変異型を全て含む、ヒトゲノムに存在する核酸分子、例えばＤＮＡによりコード化されるものである。修飾がヒトタンパク質の野生型または顕著な配列に基づくものであれば、タンパク質の変異型または修飾形もヒトタンパク質である。
本明細書で使用している、天然α−アミノ酸の残基とは、ヒトにおけるその同族体ｍＲＮＡコドンを伴う負荷ｔＲＮＡ分子の特異的認識によりタンパク質に組み込まれる、天然で見出される２０のα−アミノ酸の残基である。
本明細書で使用している、非天然アミノ酸とは、遺伝子によりコード化されていないアミノ酸をいう。
本明細書で使用している、核酸とは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびその混合物を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似体を包含する。核酸は、１本または２本鎖であり得る。所望により例えば検出可能な標識、例えば蛍光性または放射性標識で標識されていてもよいプローブまたはプライマーについていうとき、１本鎖分子が予測される。上記分子は、典型的にはそれらの標的が、ライブラリーのプローブ探索またはプライミングに際し統計的にユニークであるかまたは低コピー数（典型的には５未満、一般的には３未満）である長さを有する。一般的には、プローブまたはプライマーは、興味の対象である遺伝子と相補的であるかまたは同一である配列の少なくとも１４、１６または３０の連続ヌクレオチドを含む。プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００またはそれ以上の核酸長であり得る。
本明細書で使用している、ペプチドとは、２〜４０個のアミノ酸長であるポリペプチドをいう。
本明細書で使用している、本明細書記載のアミノ酸の様々な配列に現れるアミノ酸は、それらの公知３文字または１文字省略形（表１）に従って識別される。様々な核酸フラグメントに現れるヌクレオチドは、当業界で常用されている標準１文字名称で示される。
本明細書で使用している、「アミノ酸」とは、アミノ基およびカルボン酸基を含む有機化合物である。ポリペプチドは、２個またはそれ以上のアミノ酸を含む。本発明の目的の場合、アミノ酸は、２０の天然アミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体（すなわち、α炭素が側鎖を有するアミノ酸）を包含する。
本明細書で使用している、「アミノ酸残基」とは、そのペプチド結合にあるポリペプチドの化学的消化（加水分解）時に形成されるアミノ酸をいう。本明細書記載のアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体形態であると予測される。「Ｄ」異性体形態であり、そう称される残基は、所望の機能的特性がポリペプチドにより保持されておりさえすれば、いずれのＬ−アミノ酸残基とも置換され得る。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基をいう。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基をいう。J. Biol. Chem.、２４３：３５５２−３５５９（１９６９）記載の標準ポリペプチド命名法、および採択された３７Ｃ.Ｆ.Ｒ.§§１.８２１−１.８２２にしたがって、アミノ酸残基に関する省略形を表１に示す。
表１−対応表
Figure 0004546578
本明細書で式により表わされたアミノ酸残基配列は全て、アミノ末端からカルボキシル末端への慣用的方向で左から右への配向を有するものとする。さらに、「アミノ酸残基」の語は、対応表（表１）に列挙したアミノ酸および修飾および特異アミノ酸、例えば３７Ｃ.Ｆ.Ｒ.§§１.８２１−１.８２２で示されたもの（出典明示で援用する）を含むものとして広く定義される。さらに、アミノ酸残基配列の始まりおよび終りのダッシュは、１個またはそれ以上のアミノ酸残基のさらなる配列、アミノ末端基、例えばＮＨ２またはカルボキシル末端基、例えばＣＯＯＨへのペプチド結合を示すものとする。
本明細書で使用している、「天然アミノ酸」とは、ポリペプチドに現れる２０のＬ−アミノ酸をいう。
本明細書で使用している、「非天然アミノ酸」とは、天然アミノ酸と類似した構造を有するが、天然アミノ酸の構造および反応性を模倣するように構造的に修飾された有機化合物をいう。すなわち、非天然アミノ酸は、例えば２０天然アミノ酸の以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体を包含し、限定されるわけではないが、アミノ酸のＤ−アイソスターを含む。非天然アミノ酸の例は本明細書に記載されており、当業者には公知である。
本明細書で使用しているイソキネティック混合物は、アミノ酸のモル比が、それらの記録された反応速度に基づいて調節されたものである（例、Ostresh et al.（１９９４）Biopolymers ３４：１６８１参照）。
本明細書で使用しているＤＮＡ構築物とは、天然では見出されない形で組み合わされたかまたは並列されたＤＮＡのセグメントを含む１本または２本鎖、線状または環状ＤＮＡ分子である。ＤＮＡ構築物は、人為的操作の結果として存在し、遺伝子操作された分子のクローンおよび他のコピーを含む。
本明細書で使用しているＤＮＡセグメントは、特定の属性を有する大きなＤＮＡ分子の一部分である。例えば、特定ポリペプチドをコード化するＤＮＡセグメントは、５'から３'方向に読み取られたとき、特定ポリペプチドのアミノ酸の配列をコード化する長いＤＮＡ分子の一部分、例えばプラスミドまたはプラスミドフラグメントである。
本明細書で使用しているオーソログの語は、機能的対応物質である一つの種から得られるポリペプチドまたはタンパク質または異なる種からのポリペプチドまたはタンパク質を意味する。オーソログ間の配列差異は種形成の結果である。
本明細書で使用しているポリヌクレオチドの語は、５'から３'端へと読み取られたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の１本または２本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然供給源から単離されるか、インビトロで合成されるか、または天然および合成分子の組合わせから製造され得る。ポリヌクレオチド分子の長さは、本明細書ではヌクレオチド（略して「ｎｔ」）または塩基対（略して「ｂｐ」）により与えられている。ヌクレオチドの語は、前後関係が許す場合、１本および２本鎖分子に使用される。この語を２本鎖分子に適用するとき、それは長さ全体を示すのに用いられ、塩基対の語と同等内容であるものとする。２本鎖ポリヌクレオチドの２本鎖は、長さが僅かに異なり得、その端部が互い違いに切断され得ることは当業者であれば認めるところである。すなわち、２本鎖ポリヌクレオチド分子内のヌクレオチドが全て対合し得るわけではない。一般に、上記の不対端部が２０ヌクレオチド長を超えることはない。
本明細書で使用している、２タンパク質または核酸間の「類似性」とは、タンパク質のアミノ酸の配列または核酸のヌクレオチド配列間の関連性をいう。類似性は、残基の配列およびそこに含まれる残基の同一性および／または相同性の度合いに基づき得る。タンパク質または核酸間の類似性の度合いを評価方法は、当業者には公知である。例えば、配列類似性を評価する一方法では、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列を、配列間において最大レベルの同一性が得られるように並べる。「同一性」とは、アミノ酸またはヌクレオチド配列が不変である程度をいう。また、アミノ酸配列、およびある程度までのヌクレオチド配列のアラインメントには、アミノ酸（またはヌクレオチド）における同類差異および／または頻繁な置換が考慮され得る。同類差異は、関与残基の物理化学特性を保存しているものである。アラインメントは、グローバル（全残基を含め配列の全長にわたって比較した配列のアラインメント）またはローカル（最も類似した一領域または複数領域のみを含む配列の一部分のアラインメント）であり得る。
「同一性」それ自体は、当業界で認められた意味を有し、発表された技術を用いて計算され得る。（例、Computational Molecular Biology，Lesk,A.M.編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、ニューヨーク、１９８８；Biocomputing: Informatics and Genome Projects、Smith,D.W.編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、１９９３；Computer Analysis of Sequence Data、Part I、Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、ヒュマナ・プレス、ニュージャージー、１９９４；Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje,G.、アカデミック・プレス、１９８７；およびSequence Analysis Primer、Gribskov,M.およびDevereux,J.編、M ストックトン・プレス、ニューヨーク、１９９１参照）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の同一性を測定する若干の方法が存在し、「同一性」の語は当業者には熟知されている（Carillo,H. & Lipton,D.、SIAM J Applied Math ４８：１０７３（１９８８））。
本明細書で使用している相同的（核酸および／またはアミノ酸配列に関して）とは、２５％とほぼ同等またはそれを超える配列相同性、典型的には２５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％と同等またはそれを超える配列相同性を意味する。必要ならば、正確なパーセンテージが明記され得る。本発明での目的の場合、特に断らなければ、「相同性」および「同一性」の語は互換的に使用されることが多い。一般に、相同性または同一性パーセンテージを測定するためには、最高次のマッチが得られるように配列を整列させる（例、Computational Molecular Biology，Lesk,A.M.編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、ニューヨーク、１９８８；Biocomputing: Informatics and Genome Projects、Smith,D.W.編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、１９９３；Computer Analysis of Sequence Data、Part I、Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、ヒュマナ・プレス、ニュージャージー、１９９４；Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje,G.、アカデミック・プレス、１９８７；およびSequence Analysis Primer、Gribskov,M.およびDevereux,J.編、M ストックトン・プレス、ニューヨーク、１９９１；Carillo et al.（１９８８）SIAM J Applied Math ４８：１０７３参照）。配列相同性によって、保存アミノ酸の数は、標準アラインメントアルゴリズムプログラムにより測定され、各供給者により確立されたデフォルトギャップペナルティーにより使用され得る。実質的に相同的な核酸分子は、典型的には興味の対象である核酸の全長に沿って中程度のストリンジェンシーまたは高いストリンジェンシーでハイブリダイゼーションする。また、ハイブリダイゼーションしている核酸分子におけるコドンの代わりに変性コドンを含む核酸分子も考慮に入れられる。
２分子が、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の「同一性」または「相同性」を示すヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有するか否かは、公知コンピューターアルゴリズム、例えば、Pearson et al.（１９８８）Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８５：２４４４に示されたデフォルトパラメーターを用いる、「ＦＡＳＴＡ」プログラムなど（他のプログラムには、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J.,et al.、Nucleic Acids Research １２（Ｉ）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschul,S.F.,et al.、J Molec Biol ２１５：４０３（１９９０））がある；Guide to Huge Computers、Martin J. Bishop編、アカデミック・プレス、サンディエゴ、１９９４およびCarillo et al.（１９８８）SIAM J Applied Math ４８：１０７３）を用いて測定され得る。例えば、National Center for Biotechnology Information データベースのＢＬＡＳＴ機能は、同一性の測定に使用され得る。他の市販または公的に利用可能なプログラムには、DNAStar“MegAlign”プログラム（マディソン、ウィスコンシン）およびthe University of Wisconsin Genetics Computer Group（ＵＷＧ）“Gap”プログラム（マディソン、ウィスコンシン）がある。タンパク質および／または核酸分子の相同性または同一性パーセントは、例えば、ＧＡＰコンピュータープログラム（例、Needleman et al.（１９７０）J. Mol. Biol.４８：４４３、SmithおよびWatermanにより改訂（（１９８１）Adv. Appl. Math.２：４８２）を用いて配列情報を比較することにより測定され得る。簡単に述べると、ＧＡＰプログラムは、類似している並列された記号（すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を、２配列の短い方の記号の合計数で割ったものとして類似性を定義する。ＧＡＰプログラムに関するデフォルトパラメーターは以下のものを含み得る：（１）単項比較マトリックス（同一性については１および非同一性については０の値を含む）およびGribskov et al.（１９８６）Nucl.Acids Res.１４：６７４５の加重比較マトリックス、Schwartz および Dayhoff編、ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE、National Biomedical Research Foundation、３５３−３５８頁（１９７９）に記載；（２）各ギャップについて３.０のペナルティーおよび各ギャップにおける各記号について追加的０.１０ペナルティー、および（３）エンドギャップについてペナルティー無し。
したがって、本明細書で使用している「同一性」または「相同性」の語は、試験およびリファレンスポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較を表す。本明細書で使用している、少なくとも「〜と９０％同一である」の語は、ポリペプチドのリファレンス核酸またはアミノ酸配列に対する９０〜９９.９９の同一性パーセントをいう。９０％またはそれを超えるレベルでの同一性は、例証目的を想定すると、１００アミノ酸の試験およびリファレンスポリペプチド長が比較されているという事実を示すものである。試験ポリペプチドにおけるアミノ酸の１０％（すなわち、１００のうち１０）以下が、リファレンスポリペプチドのそれとは異なっている。同様の比較が試験およびリファレンスポリヌクレオチド間でも実施され得る。上記差異は、ポリペプチドの全長にわたってランダムに分散した点突然変異として表わされ得るか、またはそれらは、最大許容範囲、例えば１０／１００アミノ酸差異（約９０％同一性）以下の様々な長さの１つまたはそれ以上の場所でクラスターを形成し得る。差異は、核酸またはアミノ酸置換、挿入または欠失として定義される。約８５〜９０％を超える相同性または同一性レベルの場合、結果は当然プログラムおよびギャップパラメーターセットには左右されない。かかる高レベルの同一性は、ソフトウェアに頼らずとも手技によるアラインメントにより容易に評価され得ることが多い。
本明細書で使用している、並列（された）配列とは、相同性（類似性および／または同一性）を用いて、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列における対応位置を並列させていることをいう。典型的には、５０％またはそれを超える同一性での関連性を示す２つまたはそれ以上の配列を並列させる。配列の並列セットとは、対応位置で平行に整列させた２つまたはそれ以上の配列をいい、ゲノムＤＮＡ配列と並列させた、ＥＳＴおよび他のｃＤＮＡなどのＲＮＡから誘導される並列配列を含み得る。
本明細書で使用している、「プライマー」とは、適切な緩衝液中および適切な温度で適切な条件下（例、４つの異なるヌクレオシド三リン酸および重合剤、例えばＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素の存在下）において鋳型指定ＤＮＡ合成の開始点として作用し得る核酸分子である。ある種の核酸分子でも、「プローブ」および「プライマー」としての役割を果たし得るものとする。しかしながら、プライマーは、伸長のための３'ヒドロキシル基を有する。プライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ、ＲＮＡ ＰＣＲ、ＬＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、パンハンドルＰＣＲ、捕捉ＰＣＲ、発現ＰＣＲ、３'および５'ＲＡＣＥ、in situ ＰＣＲ、ライゲーション伝達ＰＣＲおよび他の増幅プロトコルを含む様々な方法で使用され得る。
本明細書で使用している、「プライマー対」とは、増幅（例、ＰＣＲによる）すべき配列の５'端とハイブリダイゼーションする５'（上流）プライマーおよび増幅すべき配列の３'端の相補部分とハイブリダイゼーションする３'（下流）プライマーを含むプライマーのセットをいう。
本明細書で使用している、「特異的にハイブリダイゼーションする」とは、標的核酸分子への核酸分子（例、オリゴヌクレオチド）の相補的塩基対合によるアニーリングをいう。当業者であれば、特定分子の長さおよび組成などの特異的ハイブリダイゼーションに影響を及ぼすインビトロおよびインビボパラメーターを熟知しているはずである。インビトロハイブリダイゼーションと特に関連しているパラメーターには、さらにアニーリングおよび洗浄温度、緩衝液組成および塩濃度がある。高ストリンジェンシーでの非特異的結合核酸分子を除去するための典型的洗浄条件は、０.１×ＳＳＰＥ、０.１％ＳＤＳ、６５℃であり、中程度のストリンジェンシーでは、０.２×ＳＳＰＥ、０.１％ＳＤＳ、５０℃である。同等内容のストリンジェンシー条件は当業界では公知である。当業者であれば、容易にこれらのパラメーターを調節することにより、特定適用に適切な標的核酸分子への核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを達成できるはずである。
本明細書で使用している、「生成物と実質的に同一である」とは、興味の対象である特性がほとんど変わっていないため、実質的に同一である生成物がもとの生成物の代わりに用いられ得る程度まで十分に類似していることをいう。
また、本明細書で使用している「実質的に同一である」または「類似した」の語は、当業者が理解している前後関係により変化するものとする。
本明細書で使用している、対立遺伝子変異型または対立遺伝子変異は、同一染色体遺伝子座を占める遺伝子の２つまたはそれ以上のオルターナティブ形態のいずれかをいう。対立遺伝子変異は、突然変異を通して自然発生し、母集団内に表現型多形をもたらし得る。遺伝子突然変異は、サイレント（コード化されたポリペプチドでの変化が無い）であり得るか、または改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化し得る。また、「対立遺伝子変異型」の語は、本明細書では遺伝子の対立遺伝子変異型によりコード化されるタンパク質を示すのに用いている。典型的には、遺伝子のリファレンス形態は、ある種の一母集団または単一リファレンスメンバーからのポリペプチドの野生型形態および／または優勢な形態をコード化する。一般に、種間における変異型を含む対立遺伝子変異型は、典型的には同一種からの野生型および／または優勢な形態と少なくとも８０％。９０％またはそれより大きいアミノ酸同一性を有する。同一性の程度は、遺伝子および比較が種間であるのか同一種内であるのかによって異なる。一般的に、同一種内対立遺伝子変異型は、ポリペプチドの野生型および／または優勢な形態との少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％またはそれを超える同一性、例えば野生型および／または優勢な形態との９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより大きい同一性を有する。本明細書において対立遺伝子変異型といえば、総じて同一種のメンバー間におけるタンパク質の変異をいう。
本明細書で使用している、「対立遺伝子」は、本明細書では「対立遺伝子変異型」と互換的に使用しており、遺伝子またはその一部分のオルターナティブ形態をいう。対立遺伝子は、同種染色体上の同じ遺伝子座または位置を占める。対象が２つの同一対立遺伝子を有するとき、対象はその遺伝子または対立遺伝子について同型接合であると言われる。対象が２つの異なる対立遺伝子を有するとき、対象は、その遺伝子について異型接合であると言われる。特異的遺伝子の対立遺伝子は、単一ヌクレオチドまたは幾つかのヌクレオチドが互いに異なり得、ヌクレオチドの置換、欠失および挿入を含み得る。（遺伝子の）対立遺伝子はまた、突然変異を含む遺伝子の一形態であり得る。
本明細書で使用している、種変異型とは、マウスおよびヒトなどの種々の哺乳類種を含む異なる種間でのポリペプチドにおける変異型をいう。
本明細書で使用しているスプライス変異型とは、複数タイプのｍＲＮＡをもたらすゲノムＤＮＡの一次転写物の差示的プロセッシングにより生成される変異型をいう。
本明細書で使用している修飾は、ポリペプチドのアミノ酸の配列または核酸分子におけるヌクレオチドの配列の修飾に関するものであり、アミノ酸およびヌクレオチドのそれぞれの欠失、挿入および置換を含む。ポリペプチドの修飾方法は、例えば組換えＤＮＡ方法を用いることによる、当業者には常用的なものである。
本明細書で使用しているペプチド模倣物は、特定ペプチドの生物活性形態の立体配座およびある種の立体化学的特徴を模倣する化合物である。一般に、ペプチド模倣物は、生物活性立体配座の喪失および結合破壊を招く可撓性などの化合物の望ましくない特性ではなく、ある種の望ましい特性を模倣するように設計されている。ペプチド模倣物は、望ましくない特性の一因となるある種の基または結合を生物学的等価体と置換することにより生物活性化合物から製造され得る。生物学的等価体は当業者には公知である。例えば、メチレンの生物学的等価体ＣＨ２Ｓは、エンケファリン類似体においてアミド置換基として使用されている（例、Spatola（１９８３）Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins、Weinstein編、７巻、Marcel Dekker（ニューヨーク）、２６７−３５７頁参照）。経口投与され得るモルヒネは、ペプチドエンドルフィンのペプチド模倣物である化合物である。本発明での目的の場合、環状ペプチドは、１つまたはそれ以上のペプチド結合が模倣物により置換されているポリペプチドであるため、ペプチド模倣物に含まれる。
本明細書で使用している、リファレンスポリペプチドで示された特定パーセンテージのアミノ酸を含むポリペプチドとは、そのパーセンテージがポリペプチドおよびリファレンスポリペプチド間で共有されている連続した同一アミノ酸の比率であることを意味する。例えば、１４７アミノ酸を列挙している配列番号ＸＸに示されたアミノ酸の配列を有するリファレンスポリペプチドに示されたアミノ酸の７０％を含むイソ型とは、リファレンスポリペプチドが、配列番号ＸＸのアミノ酸配列に示された少なくとも１０３の連続アミノ酸を含むことを意味する。
本明細書で使用しているプロモーターの語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始を誘導するＤＮＡ配列を含む遺伝子の一部分をいう。プロモーター配列は、必ずというわけではないが、普通遺伝子の５'非コーディング領域で見出される。
本明細書で使用している、単離または精製ポリペプチドまたはタンパク質またはその生物活性部分は、細胞物質またはタンパク質が由来する細胞または組織からの他の混入タンパク質を実質的に含まないか、または化学的前駆体または化学合成される他の化学物質を実質的に含まない。純度の評価に当業者が使用する標準分析方法、例えば薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定したところ容易に検出され得る不純物を含んでいないか、またはそれ以上精製しても酵素および生物活性などの物質の物理および化学特性が検出可能な形では改変されないと予測されるほど十分に純粋であると思われる場合、調製物は実質的に（不純物）不含有であると判断され得る。実質的化学的純粋化合物を製造するための化合物の精製方法は、当業者には公知である。しかしながら、実質的化学的純粋化合物は、立体異性体の混合物であり得る。そのような場合、さらに精製することにより、化合物の比活性が高められ得る。
「細胞物質を実質的に含まない」の語は、タンパク質が単離されるかまたは組換え技法により生産される細胞の細胞性成分から上記タンパク質が分離されているタンパク質調製物をいう。一実施態様において、「細胞物質を実質的に含まない」の語は、約３０％未満（乾燥重量にして）の非プロテアーゼタンパク質（本明細書では混入タンパク質とも称す）、一般的には約２０％未満の非プロテアーゼタンパク質または１０％の非プロテアーゼタンパク質または約５％未満の割合で非プロテアーゼタンパク質を有する調製物を包含する。プロテアーゼタンパク質またはその活性部分を遺伝子組み換え的に製造するとき、それは培養培地も実質的に含まない、すなわち、培養培地は、プロテアーゼタンパク質調製物の体積の約２０％またはそれ未満、１０％または５％を占める。
本明細書で使用している「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」の語は、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質からタンパク質が分離されているプロテアーゼタンパク質の調製物を包含する。この語は、約３０％（乾燥重量にして）未満、２０％、１０％、５％またはそれ未満の割合で化学的前駆体または非プロテアーゼ化学物質または成分を有するプロテアーゼタンパク質の調製物を包含する。
本明細書で使用している、例えば合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関する「合成（の）」とは、組換え技法および／または化学合成方法により製造される核酸分子またはポリペプチド分子の場合をいう。
本明細書で使用している、組換えＤＮＡ方法を用いることによる組換え技法による製造とは、クローン化ＤＮＡによりコード化されるタンパク質を発現させる公知分子生物学方法の使用を意味する。
本明細書で使用している、ベクター（またはプラスミド）は、異種核酸を細胞へ導入してそれを発現または複製させるのに使用される独立要素をいう。ベクターは、典型的にはエピソームのままであるが、ゲノム染色体への遺伝子またはその一部分の組み込みを行うように設計され得る。また、人工染色体、例えば酵母人工染色体および哺乳類人工染色体であるベクターも考えられる。上記ベクターの選択および使用は当業者には公知である。
本明細書で使用している、発現ベクターは、ＤＮＡフラグメントの発現を実行させ得るプロモーター領域などの調節配列と機能し得るように結合されているＤＮＡを発現させ得るベクターを包含する。上記の追加的セグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含み得、所望により１つまたはそれ以上の複製起点、１つまたはそれ以上の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含み得る。発現ベクターは、一般的にプラスミドまたはウイルス性ＤＮＡから誘導されるか、または両方の要素を含み得る。すなわち、発現ベクターとは、適切な宿主細胞への導入後、クローン化ＤＮＡの発現をもたらす組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物、例えばプラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターをいう。適切な発現ベクターは、当業者には公知であり、真核生物細胞および／または原核生物細胞で複製可能なものおよびエピソームのままのものまたは宿主細胞ゲノムへ組み込まれるものを包含する。
本明細書で使用しているベクターはまた、「ウイルスベクター」または「ウイルス性ベクター」を包含する。ウイルス性ベクターは、外生遺伝子に機能し得るように結合されることにより、細胞中へ遺伝子を（ベクターまたはシャトルとして）移入する遺伝子工学的ウイルスである。
本明細書で使用しているアデノウイルスは、ヒトにおいて結膜炎および上気道感染症を誘発するＤＮＡ含有ウイルスの一群のいずれかを指す。本明細書で使用している裸のＤＮＡとは、ワクチンおよび遺伝子治療に使用され得るヒストン不含有ＤＮＡをいう。裸のＤＮＡは、形質転換と呼ばれる遺伝子導入過程中に細胞から細胞へ通される遺伝物質である。形質転換では、精製または裸のＤＮＡが受容細胞に取り込まれ、受容細胞に新しい特性または表現型を与える。
本明細書で使用している、ＤＮＡセグメントについて「機能し得るようにまたは作動し得るように結合されている」とは、セグメントが意図された目的に調和して機能するように、例えばプロモーターで転写が開始し、コーディングセグメントからターミネーターへと進行するように、それらが配置されていることを意味する。
本明細書で使用している、タンパク質結合配列とは、総じて他のタンパク質またはペプチド配列、一群のタンパク質またはペプチド配列または特定タンパク質またはペプチド配列に特異的に結合し得るタンパク質またはペプチド配列をいう。
本明細書で使用している、エピトープ標識とは、後続のエピトープ標識タンパク質またはペプチドの生化学的および免疫学的分析をし易くするエピトープに対応するアミノ酸残基の短い伸長部をいう。エピトープ標識は、適切な発現ベクターにおいてエピトープ標識の配列をタンパク質コード化配列に付加することにより達成される。エピトープ標識タンパク質は、標識に対して産生した高特異的抗体を用いてアフィニティー精製され得る。
本明細書で使用している、金属結合配列とは、総じて金属イオン、一群の金属イオンまたは特定金属イオンに特異的に結合し得るタンパク質またはペプチド配列をいう。
本明細書で使用している、「評価する（こと）」とは、試料中に存在するプロテアーゼまたはそのドメインの活性に関する絶対値を得、活性のレベルを示す指数、割合、パーセンテージ、視覚的または他の値を得るという意味で定量的および定性的測定を包含するものとする。評価は直接的または間接的であり得、実際に検出される化学種は、勿論タンパク質分解産物そのものである必要はないが、例えばその誘導体またはさらに別の物質であり得る。例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルーでのタンパク質染色による、補体タンパク質の開裂産物の検出など。
本明細書で使用している、生物活性とは、化合物のインビボ活性または化合物、組成物または他の混合物のインビボ投与時に生じる生理学的応答をいう。すなわち、生物活性は、上記化合物、組成物および混合物の治療効果および医薬活性を包含する。生物活性は、上記活性を試験または使用するように設計されたインビトロ系で観察され得る。すなわち、本発明の目的の場合、プロテアーゼの生物活性は、ポリペプチドが加水分解される際のその触媒活性である。
本明細書で使用している、核酸の２配列に関する場合の「同等の」とは、問題の２配列がアミノ酸または同等内容のタンパク質の同一配列をコード化することをいう。２つのタンパク質またはペプチドに関して「同等の」を用いるとき、２つのタンパク質またはペプチドが、タンパク質またはペプチドの活性または機能を実質的に改変することのないアミノ酸置換のみを含む、実質的に同じアミノ酸配列を有することを意味する。「同等の」を特性に関して用いるとき、その特性は同程度まで存在する必要はないが（例、２つのペプチドは、同じタイプではあるが、異なる速度の酵素活性を呈し得る）、活性は通常実質的に同じである。２つのヌクレオチド配列に関して「相補的」という場合、ヌクレオチドの２配列が、典型的には対向するヌクレオチド間において２５％未満、１５％または５％の誤対合でハイブリダイゼーションし得ることを意味する。必要ならば、相補性のパーセンテージを特定する。典型的には、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションするように２分子を選択する。
本明細書で使用している、タンパク質の活性または遺伝子または核酸の発現をモジュレーションする作用物質とは、タンパク質の活性を減じるかまたは高めるかまたは他の形で改変するか、または何らかの方法で細胞における核酸の発現をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションまたは他の形で改変するものである。
本明細書で使用している医薬効果または治療効果とは、疾患または障害の処置またはその症状の改善を目的とした作用物質の投与時に観察される効果をいう。
本明細書で使用している「モジュレーションする」および「モジュレーション」または「改変する」とは、分子、例えばタンパク質の活性の変化をさす。活性の例には、限定されるわけではないが、シグナル変換などの生物活性がある。モジュレーションは、活性の増加（すなわち、アップレギュレーションまたはアゴニスト活性）、活性の減少（すなわち、ダウンレギュレーションまたは阻害）または活性の他の改変（例えば周期性、頻度、持続時間、速度論または他のパラメーターの変化）を含み得る。モジュレーションは状況に左右され得、典型的にはモジュレーションは、定められた状態、例えば野生型タンパク質、構成的状態のタンパク質または指定された細胞型または状態で発現されるタンパク質と比較される。
本明細書で使用している「阻害する」および「阻害」とは、阻害されていない活性に対する活性の低下をいう。
本明細書で使用している組成物とはあらゆる混合物をいう。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそれらの組合わせであり得る。
本明細書で使用している「組合わせ」とは、２つまたはそれ以上のアイテム間での配合をいう。組合わせは、２つまたはそれ以上の個別アイテム、例えば２組成物または２コレクションであり得、その混合物、例えば２つまたはそれ以上のアイテムの単一混合物、またはその変形であり得る。組合わせの成分は、一般的に機能的に結合または関連したものである。キットは、所望によりその組合わせまたは成分の使用説明書を含んでいてもよいパッケージされた組合わせである。
本明細書で使用している「疾患または障害」とは、限定されるわけではないが、感染、後天的状態、遺伝的状態を含む原因または状態から生じ、識別可能な症状を特徴とする、生物体における病理学的状態をいう。本発明において興味の対象である疾患または障害は、補体活性化が介在するものおよび補体活性化が病理または病因においてある一定の役割を演じているものを含む、補体活性化を伴うものである。疾患および障害はまた、免疫不全症などのタンパク質の欠如により誘発されるものも含むが、本発明において興味の対象であるのは、補体タンパク質の欠損故に補体活性化が起こらない障害である。
本明細書で使用している、疾患または状態を発現する対象を「処置する」とは、対象の症状が部分的または全体的に軽減されるか、または処置後に静態のままであることを意味する。このため、処置は、予防、治療および／または治癒を包含する。予防とは、潜在的な疾患の予防および／または症状の悪化または病気の進行の阻止をいう。処置はまた、修飾インターフェロンの医薬的使用およびそれで提供される組成物を包含する。
本明細書で使用している治療剤、治療プログラム、放射線防護薬、または化学療法は、ワクチンを含む慣用的薬剤および薬物療法を意味し、当業者には周知である。放射線治療剤は、当業界では周知である。
本明細書で使用している「処置」は、状態、障害または疾患または他の適応症の症状を改善させるかまたは他に有利な形で改変させる方法を意味する。
本明細書で使用している「治療効果」とは、疾患または状態の症状を改変する、典型的には改善または改良するかまたは疾患または状態を治癒させる、対象の処置から生じる効果を意味する。治療有効量とは、対象への投与後に治療効果をもたらす組成物、分子または化合物の量をいう。
本明細書で使用している「対象」の語は、哺乳類、例えばヒトを含む動物をいう。
本明細書で使用している患者とは、ヒト対象をいう。
本明細書で使用している、処置、例えば医薬組成物または他の治療薬の投与による特定疾患または障害の症状の改善とは、恒久的または一時的、永続的または一過性にせよ、組成物または治療薬の投与に起因するかまたは随伴し得る症状の低減化をいう。
本明細書で使用している、防止または予防とは、疾患または状態を発現する危険性を減らす方法をいう。
本明細書で使用している有効量は、疾患または状態の症状を予防、治癒、改善、阻止または部分的に止めるのに必要な治療剤の量である。
本明細書で使用している、プロテアーゼ、例えば修飾プロテアーゼの投与とは、プロテアーゼをその基質と接触させる方法をいう。投与は、インビボまたはエクスビボまたはインビトロで実施され得る。例えば、エクスビボ投与については、血液などの体液を対象から除去し、体外で修飾非補体プロテアーゼと接触させる。インビボ投与については、例えば限局的、局所的、全身的および／または他の導入経路により修飾プロテアーゼを体内へ導入し得る。インビトロ投与は、細胞培養方法などの方法を包含する。
本明細書で使用している、単位用量形態とは、当業界では公知のとおり、ヒトおよび動物対象に適切な物理的に分離された単位をいい、個々にパッケージされている。
本明細書で使用している、単用量処方物とは、直接投与用処方物をいう。
本明細書で使用している、「製品」は製造および販売される生成物である。本願全体で使用しているように、この語は、パッケージ製品に含まれた修飾プロテアーゼポリペプチドおよび核酸を包含するものとする。
本明細書で使用している、流体とは、流動し得る組成物をいう。すなわち、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームおよび他の上記組成物の形態である組成物を包含する。
本明細書で使用している、「キット」は、本明細書記載の修飾プロテアーゼポリペプチドまたは核酸分子、および限定されるわけではないが、投与、診断および生物活性または特性の評価を含む目的に適う別のアイテムの組合わせをいう。キットは、所望により使用説明書を含んでいてもよい。
本明細書で使用している細胞抽出物またはライゼートは、溶解または破壊された細胞から調製される調製物または画分をいう。
本明細書で使用している動物と言えば、限定されるわけではないが、ヒト、ゴリラおよびサルなどを含む霊長類、マウスおよびラットなどのげっ歯動物、ニワトリなどの家禽、ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジなどの反芻動物、ヒツジ様動物(ovine)、例えばブタおよび他の動物を含め、あらゆる動物を包含する。ヒト以外の動物については、考えられる動物としてヒトを除外する。本発明プロテアーゼは、供給源である動物、植物、原核生物および真菌に由来する。ほとんどのプロテアーゼは哺乳類を含む動物由来のものである。
本明細書で使用している対照とは、それが試験パラメーターで処理されていないことを除き、試験試料と実質的に同一である試料をいい、またはそれが血漿試料である場合には、興味の対象である状態に冒されていない正常ボランティアから採取され得る。対照はまた、内部対照でもあり得る。
本明細書原文で使用している英語の単数形態「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に断らなければ、複数の場合も含むものとする。すなわち、例えば、「細胞外ドメイン」を含む化合物という表現は、１つまたは複数の細胞外ドメインを含む複数化合物を包含する。
本明細書で使用している「範囲」および「量」は、特定の値または範囲に「約」を付けて表わされ得る。「約」という表現は、正確な量も含む。このため、「約５塩基」は、「約５塩基」および「５塩基」の両方を意味する。
本明細書で使用している「所望による」または「所望により」は、その後に記載している事象または環境が起こる場合も起こらない場合もあることを意味し、上記事象または環境が起こる場合およびそれが起こらない場合の両方を想定している。例えば、所望により置換されていてもよい基とは、その基が非置換であるか、または置換されていることを意味する。
本明細書で使用している保護基、アミノ酸および他の化合物に関する省略形は、特に断らなければ、それらの通常の使用法、公認の省略形またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature（（１９７２）Biochem.１１：１７２６参照）に準ずるものとする。
Ｂ．プロテアーゼのスクリーニング方法
本発明は、改変された特性、特に基質特異性および選択性をもつプロテアーゼのスクリーニング方法を提供する。上記方法はまた、実質的に不変であるかまたは治療用としての十分な活性を呈する上記の改変プロテアーゼを提供する。本発明方法は、プロテアーゼ修飾および修飾プロテアーゼの設計方法により使用され得る。上記方法には、ライブラリーの無作為作成方法、既存ライブラリーの使用、および定向進化方法がある。
改変された基質特異性／選択性を有するプロテアーゼを同定する様々な選択スキームが使用されているが、どれも制限を有する。本発明方法は上記制限を克服するものである。一般的に、選択スキームは、１）プロテアーゼ結合に関して選択するものまたは２）プロテアーゼ触媒に関して選択するものを含む。プロテアーゼ結合を利用する戦略の例には、例えば遷移状態類似体（ＴＳＡ）の使用および小分子自殺基質を用いるものがある。ＴＳＡは、プロテアーゼ：基質反応の遷移状態の電子的および構造的特徴を模倣する安定した化合物である。プロテアーゼと基質間の最強の相互作用は、典型的には反応の遷移状態で行われる。ＴＳＡは、高い結合親和力をもつプロテアーゼについて選択するモデル基質として使用される。ＴＳＡは、決して真の遷移状態の完璧な模倣物ではなく、それらの合成は難しい（Bertschinger et al.（２００５）、Phage display in Biotech. and Drug Discovery（Sidhu S.編）４６１−４９１頁）。上記戦略は、基質特異性が改変されたプロテアーゼ変異型を同定するが、プロテアーゼ触媒作用に関する必要条件は選択スキームの一部ではないため、上記プロテアーゼは一般に低い活性を呈する。
これに代わる別の戦略では、小分子自殺基質（機構に基づく阻害剤とも呼ばれる）を用いることにより、結合に基づいたプロテアーゼ選択を行う。上記自殺基質は、典型的には酵素の活性部位と共有結合する小分子阻害剤である。これらの自殺基質は、酵素求核基と反応して共有結合を形成する反応性求電子種を含む。プロテアーゼによる天然ペプチド結合の開裂は、この反応には要求されない。典型的には、上記阻害剤は、正確な酵素と結合し、通常の触媒段階を経たときのみ反応性求核基を生成する（例、Bertschinger et al.（２００５）、Phage display in Biotech. and Drug Discovery（Sidhu S.編）４６１−４９１頁参照）。多くの場合、基質阻害剤は、触媒に関与する最初の遷移状態の立体配座を模倣するが、触媒周期を完了させることはない。その結果、上記阻害剤の使用により、触媒作用の代わりに強い結合が有効に選択され、基質の解離が損なわれた不活性酵素が選択される（Droge et al.（２００６）ChemBioChem、７：１４９−１５７）。また、それらのサイズおよび基質開裂に関する必要条件の欠如故に、それらは天然タンパク質基質とプロテアーゼの相互作用を繰り返さない。
結合ではなく触媒作用について選択するプロテアーゼ選択戦略も試みられてきた（例、Heinis et al.（２００１）、Protein Engineering、１４：１０４３−１０５２）。触媒作用の検定における主たる制限の一つは、反応完了後すぐに反応産物が拡散するため、触媒活性酵素の単離が難しいことである。したがって、触媒作用について選択する戦略は、基質および酵素が極めて接近するようにそれらをファージに固定させることにかかっている。例えば、タンパク質カルモジュリンは、固定剤として使用されてきた（Demartis(１９９９)J Mol.Biol.、２８６：６１７−６３３）。反応基質は、カルモジュリン結合性ペプチド誘導体を用いてカルモジュリン標識ファージ酵素に非共有結合的に固定されている。触媒作用後、抗生成物アフィニティー試薬を用いて、反応生成物を表示するファージを非触媒活性ファージから単離する。しかしながら、基質はファージ粒子に結合されているため、触媒反応は妨害され得る。したがって、これらおよび他のプロテアーゼ選択方法には制限があるため、特異性が改変され、実質的には不変であるが治療適用にとって十分な活性をもつプロテアーゼは同定されない。本発明方法は、これらの制限に取り組むものである。
本発明は、基質特異性が改変、最適化または改善されたプロテアーゼおよび／またはプロテアーゼ変異型を同定するためのプロテアーゼ選択方法を提供する。上記プロテアーゼは、所望のタンパク質標的、例えば疾患または障害の病因に関与するタンパク質標的を開裂および不活化（または活性化）し得る治療用プロテアーゼとして最適化し、使用することを目的として同定される。本発明によるプロテアーゼのスクリーニング方法では、候補プロテアーゼを、プロテアーゼ酵素反応の安定した中間複合体として捕捉し、次いで同定する。安定した中間複合体は、典型的には共有結合複合体または非複合体形成分子からのその分離を可能にする他の複合体である。上記中間体には、例えば、選択されたかまたは予め定められた基質特異性を有するプロテアーゼの捕捉および最終的同定を可能にするアシル酵素中間体がある。プロテアーゼの捕捉（捕捉）は、プロテアーゼにより開裂され、開裂時に安定した複合体を形成するプロテアーゼトラップポリペプチドとプロテアーゼのコレクションを接触させることにより行われる。上記プロテアーゼトラップポリペプチドの例は、セルピン、アルファ２マクログロブリン、および他の上記分子である。プロテアーゼトラップポリペプチドは、天然のものであり得るか、そして／または特定標的基質を選択するように修飾され得る。
本方法を実施する際、プロテアーゼ、典型的には修飾または突然変異体プロテアーゼのコレクションおよび／または天然プロテアーゼのコレクションを、基質開裂後にプロテアーゼと反応して、捕捉された中間体を含む複合体を形成するプロテアーゼトラップポリペプチドと接触させる。これらの方法を用いることにより、所望の基質特異性／選択性を有するプロテアーゼを同定し得る。所望の基質特異性／選択性を有するプロテアーゼの同定を達成するため、プロテアーゼトラップポリペプチドにおける容易に開裂できる結合のアミノ酸配列、および／または反応部位の周辺配列、例えば反応性ループ配列または類似配列に修飾を加えることにより、所望の標的基質の基質開裂配列を模倣させ得る。
安定した複合体、典型的には共有結合複合体が形成する条件下でプロテアーゼトラップポリペプチドとプロテアーゼのコレクションを接触させることにより、スクリーニング反応を実施する。複合体は、他の安定性の低い複合体および未反応プロテアーゼトラップポリペプチドからそれらが分離され得るほどの十分な安定性を有している。
プロテアーゼトラップポリペプチドには、複合体を同定し易くするため、同定可能標識またはアフィニティー標識が付され得る。例えば、蛍光部分、アフィニティー標識または他の上記ラベル／標識剤などによるプロテアーゼトラップポリペプチドの標識により、プロテアーゼ−阻害剤複合体が単離され易くなり、選択されたプロテアーゼの同定も容易になる。選択されたプロテアーゼを活性について分析することにより、タンパク質分解有効性および基質特異性が評価され得る。また、同定または選択されたプロテアーゼは、例えば配列決定または質量分析法を含む他の同定プロトコルにより、または複合体中の選択されたプロテアーゼを同定するための他の標識方法により同定され得る。
本発明方法はまた所望による反復スクリーニング段階を含むため、本方法は、１回実施され得るか、所望の、または予め定められた特異性／選択性および／または開裂活性のプロテアーゼに集中して多ラウンドで実施され得る。例えば、プロテアーゼ選択は、選択されたプロテアーゼの無作為的または経験的または系統的修飾（標的領域で、および／または長さに沿って）、およびプロテアーゼコレクションを１つまたはそれ以上のプロテアーゼトラップポリペプチドと接触させる方法の反復（１、２、３、４回またはそれ以上のラウンドで）を含み得る。
本発明方法は、例えば２つまたはそれ以上の差示的標識または差次的に同定可能なプロテアーゼトラップポリペプチドを含ませることにより多重方式で実施され得る。
本発明方法では、少なくとも検出可能なパーセンテージ、典型的には少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の割合で、安定性の低い複合体または未反応プロテアーゼトラップポリペプチドから分離されるかまたは他の形で同定され得る安定した複合体を形成し得る限り、プロテアーゼトラップポリペプチドが複合体形成反応において１００％または非常に高い有効性を呈することは、必ずしも必要ではない。すなわち、プロテアーゼ触媒反応のプロテアーゼトラップポリペプチドによる１００未満の阻害、例えば１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上の阻害が見られる反応において分配が行われる場合に、プロテアーゼは選択され得る。本発明方法では、例えば反応時間、温度、ｐＨ、イオン強度および／またはライブラリーおよび基質濃度を制御することにより、選択のストリンジェンシーおよび他のパラメーターをモジュレーションすることができる。特異性の制約もまた、競合物質、例えば望ましくない基質開裂配列を含む特異的競合物質、または広範なクラスの競合物質、例えばヒト血漿を含ませることにより選択中にモジュレーションされ得る。
本発明方法はまた、プロテアーゼのコレクションを一プロテアーゼトラップポリペプチドまたは異なるプロテアーゼトラップポリペプチドの混合物と例えば多重方式により接触させることにより実施され得る。複数の異なるプロテアーゼトラップポリペプチドを使用する場合、各プロテアーゼトラップポリペプチドに対し個々にかつ明確に標識を付すことにより、それらは同定可能な形で検出され得る。上記方法により、単一反応でプロテアーゼのコレクションから多くのプロテアーゼが単離および同定され得る。
本発明方法では、プロテアーゼのコレクションを１度スクリーニングにかけるだけで、所望の、または予め定められた基質特異性を有するものが同定され得る。プロテアーゼのコレクションは、様々な野生型プロテアーゼ、修飾プロテアーゼ、それらの混合物およびそのタンパク質分解活性部分のコレクションを含むプロテアーゼのあらゆるコレクションを包含する。いずれのコレクションでも使用され得る。コレクションはまた、突然変異体プロテアーゼ、または突然変異を含むそのタンパク質分解活性部分のセットとして作成され得る。上記コレクションには、コレクション中のメンバーが様々な突然変異を含むコンビナトリアルコレクションがある。突然変異は、プロテアーゼ（またはその触媒活性部分）の長さに沿ってランダムに存在し得るか、または特定位置または領域、例えばプロテアーゼの特異性結合ポケットにターゲッティングされ得る。本発明方法では、以前には特異性決定因子として含まれていないとみなされていた非接触残基（すなわち、埋没残基）が同定または発見され得る。このため、本発明によるプロテアーゼ選択技法を用いることにより、全く新しい特異性および活性をもつプロテアーゼが作られ、既存の先行プロテアーゼの特異性または活性が最適化され得る。
Ｃ．プロテアーゼトラップポリペプチド
本発明方法で使用するプロテアーゼトラップポリペプチドは、プロテアーゼに関する基質としての役割を果たし、開裂時、安定したプロテアーゼ−基質中間複合体を形成させるポリペプチド、または反応性部位を含むポリペプチド部分である。一般的に、上記プロテアーゼトラップポリペプチドは、捕捉された基質−プロテアーゼ複合体を生成させるのにプロテアーゼによる容易に開裂できる結合（Ｐ１−Ｐ１'）の開裂を必要とするものである。安定した複合体は、典型的には例えば共有結合、イオン結合、疎水性結合、または他の堅固な結合による、プロテアーゼとプロテアーゼトラップポリペプチド間の堅固な相互作用を通じて形成される不可逆性複合体である。一般的に複合体自体は、何時間、何日間、何週間またはそれ以上の間安定しているため、複合体の単離は可能である。一例では、安定した中間複合体は、セリンまたはシステインプロテアーゼとプロテアーゼトラップポリペプチドとの反応時に形成されるアシル酵素中間体であり得る。ほぼ通常、プロテアーゼトラップポリペプチド開裂後、複合体における迅速な立体配座変化によりプロテアーゼはゆがめられ、アシル−酵素複合体の脱アシル化が阻止される。すなわち、プロテアーゼトラップポリペプチドによるプロテアーゼのふるい分けにより、同時にコレクション混合物から容易に単離される非常に堅固な（すなわち、共有結合）複合体を形成しながら触媒作用（すなわち、Ｐ１−Ｐ１'結合の開裂および酵素のアシル化）の律速段階について選択が可能となる。
典型的には、上記プロテアーゼトラップポリペプチドは、プロテアーゼにより認識される反応性部位配列を含む大きい（１００を超えるアミノ酸）、単一ドメインタンパク質である。一般的に、反応性部位開裂配列は、標的基質となるように可撓性で露出しており、長い大きな反応性ループの一部分である（Otlewski et al.（２００５）The EMBO J. ２４：１３０３−１３１０）。しかしながら、プロテアーゼトラップが、プロテアーゼにより開裂され得る反応性部位配列を含み、それによって基質開裂を模倣するものであれば、本発明方法で使用され得る。すなわち、プロテアーゼにより容易に開裂できる結合を含むことにより、長期間持続する安定した複合体中にプロテアーゼを捕捉する大型ポリペプチドまたは合成ポリペプチドは全て、本発明方法で使用され得る。上記プロテアーゼトラップポリペプチドの例は、本明細書記載のものなどのセルピンである。他のプロテアーゼトラップポリペプチド、例えば作用機構がセルピン分子の場合と類似しているものもまた、本発明方法で使用され得る。これらの例には、合成または組換え技法により製造されたセルピン様分子、またはセルピン分子の反応性部位ループの十分な部分を含むセルピン分子の連続フラグメントまたは配列を含むポリペプチドがある。さらに、阻害機構がセルピンの場合と類似している他のプロテアーゼ阻害剤も使用され得、例えばカスパーゼを阻害するバキュロウイルスｐ３５タンパク質がある（Xu et al.（２００１）Nature、４１０：４９４−４９７；Otlewski et al.（２００５）The EMBO J. ２４：１３０３−１３１０）。他のプロテアーゼトラップポリペプチドには、限定されるわけではないが、アルファ２マクログロブリンなど、容易に単離され得る安定した複合体にプロテアーゼを捕捉するものがある。
１．セルピン：構造、機能および発現
セルピン（セリンプロテアーゼ阻害剤）は、通常は約６０未満のアミノ酸である他のセリンプロテアーゼ阻害剤と比べて大きなタンパク質分子（約３３０〜５００アミノ酸）であるプロテアーゼ阻害剤である。セルピンファミリーは、プロテアーゼ阻害剤の中で最大であり、最も広く分布している。１５００を超えるセルピンファミリーメンバーが現在までに様々な異なる動物、ポックスウイルス、植物、細菌および古細菌から同定されており（Law et al.(２００６)Genome Biology、７：２１６）、３０を超える種々のヒトセルピンがこれまでに試験されている。大部分のヒトセルピンは、例えば炎症、補体、凝固およびフィブリン溶解カスケードを含む広範囲の調節的役割でそれらが機能している血液から見出されている。セルピンはまた、細胞内で機能することにより、例えば細胞傷害性プロテアーゼの不適切な放出の調節などの細胞防護的役割を演じる。ほとんどのセルピンはプロテアーゼ活性に対して阻害的役割を有するが、中には、限定されるわけではないが、ホルモン輸送、コルチコステロイド結合グロブリン、および血圧調節などの他の非阻害的役割も演じるセルピンもある（Silverman et al.（２００１）JBC、２７６：３３２９３−３３２９６）。非阻害的セルピンには、ステロイド結合グロブリンおよび卵アルブミンがある。典型的には、セルピンはセリンプロテアーゼの作用を阻害するが、パパイン様システインプロテアーゼまたはカスパーゼの阻害剤である幾つかのセルピンも同定されている（Whisstock et al.（２００５）FEBS Journal、２７２：４８６８−４８７３）。
セルピンファミリーメンバー間の配列同一性は弱いが、それらの構造は高度に保存されている。例えば、セルピンファミリーのメンバーは、セルピンアルファ１−抗トリプシンと約３０％のアミノ酸配列相同性を共有しており、保存三次構造を有する。構造的に、セルピンは、３枚のβシート（Ａ、ＢおよびＣ）および８〜９のα−へリックス（Ａ−Ｉ）により構成され、それらは上部β−バレルドメインおよび下部へリックスドメインに組織化されている。２つのドメインは、セルピンの主たる構造的特徴である５本鎖ＢシートＡにより架橋されている（Huntington et al.（２００３）、J.Thrombosis and Haemostasis、１：１５３５−１５４９）。セルピンは準安定性タンパク質であるため、それらは活性形態で部分的にのみ安定している。それらは、完全に安定した立体配座をとるのにプロテアーゼを必要とする。反応性部位ループ（ＲＳＬ）と呼ばれるループは、セルピン分子の改変された立体配座に関与している。ＲＳＬは、ＡおよびＣβシート間の領域で分子の上部から突出している約１７アミノ酸残基の露出した伸長部分である。ＲＳＬは、プロテアーゼ認識部位としての役割を果たし、一般にプロテアーゼ特異性の唯一の決定基を含む。セルピン構造の最も安定した形態は、ＲＳＬ開裂形態である。プロテアーゼ開裂後、ＲＳＬのアミノ末端部分は、βシートＡの中心に挿入され、６本鎖βシートの鎖４となる。この立体配座変化は、「緊張」から「弛緩」への（またはＳからＲへの）トランジションと呼ばれる。この形態変換は、５本鎖βシートＡから６本鎖抗平行形態への再組織化による分子の熱安定性の増加を特徴とする（Lawrence et al.（２０００）、J Biol. Chem.、２７５：５８３９−５８４４）。言い換えれば、セルピンの天然構造は、プロテアーゼ開裂後にさらに安定した構造へ変換されているだけである潜在的中間体と均等内容である（Law et al.(２００６)Genome Biology、７：２１６）。
典型的には、セルピンは、セリンプロテアーゼをターゲッティングするが、類似した機構を用いてシステインプロテアーゼを阻害するセルピンもある。ＲＳＬループは標的プロテアーゼに関する偽基質を提供するため、どのプロテアーゼが阻害についてターゲッティングされるかをそれが決定する。事実、特定セルピンの阻害特異性は、セルピンの中でも最も変化し易い領域であるＲＳＬ配列により伝達される（Travis et al.（１９９０）Biol.Chem.Hoppe Seyler、３７１：３−１１）。ＲＳＬは、プロテアーゼの基質認識配列を模倣することにより、...Ｐn-Ｐ3-Ｐ2-Ｐ1-Ｐ1'-Ｐ2'-Ｐ3'-Ｐn'...とナンバリングされる反応性部位を含み、そこでの反応性部位はＰ１およびＰ１'間の容易に開裂できる結合である。成熟α１−抗トリプシンの場合、Ｐ１−Ｐ１'結合での開裂はＭｅｔ３５８−Ｓｅｒ３５９結合（配列番号１に示したアミノ酸配列のアミノ酸Ｍｅｔ３８２およびＳｅｒ３８９に対応）で起こる。プロテアーゼ上の残基についての対応結合部位は、...Ｓn-Ｓ3-Ｓ2-Ｓ1-Ｓ1’, Ｓ2’, Ｓ3’, Ｓn’-...である。本発明方法では、下記で詳細に検討しているところによると、ＲＳＬ配列の修飾は、改変された基質特異性を呈するディスプレーライブラリーからプロテアーゼについて選択するように行われる。
２．プロテアーゼ触媒作用、セルピンの阻害機構およびアシル酵素中間体の形成
本発明プロテアーゼ選択方法は、基質特異性が改変されたプロテアーゼを同定するため、例えばセルピンにより例証しているように、ポリペプチドのプロテアーゼ捕捉能を利用する。プロテアーゼ触媒作用の機構は、タンパク質分解酵素：セリン、システイン、アスパルティック、トレオニンまたはメタロプロテアーゼのクラス間で微妙に異なる。例えば、セリンペプチダーゼは、活性中心に含まれるセリン残基を有し、アスパルティックは触媒中心に２個のアスパラギン酸を有し、システイン型ペプチダーゼはシステイン残基を有し、トレオニン型ペプチダーゼはトレオニン残基を有し、メタロ−ペプチダーゼは触媒機構で金属イオンを用いている。一般的に、共有結合中間体を形成するそれらのプロテアーゼファミリーは、本発明プロテアーゼ選択方法の標的である。例えば、これらはセリンおよびシステインプロテアーゼファミリーのメンバーを含む。一例として、セリンプロテアーゼの場合、触媒作用の第一段階は、プロテアーゼの触媒中心における基質およびセリン間でのアシル酵素中間体の形成である。この共有結合中間体の形成は、負に荷電した四面体遷移状態中間体を通して続行し、次いで基質のＰ１−Ｐ１'ペプチド結合が開裂される。第２段階または脱アシル化中、アシル酵素中間体は水分子により加水分解され、ペプチドを放出し、酵素のＳｅｒ−ヒドロキシルをもとに戻す。脱アシル化は、四面体遷移状態中間体の形成も伴い、アシル化の逆反応経路を通して続行される。脱アシル化の場合、水分子は、Ｓｅｒ残基に代わる攻撃性求核基である。セリンプロテアーゼの触媒中心におけるＨｉｓ残基は、一般的塩基を提供し、反応性ＳｅｒのＯＨ基を受け入れる。
セルピンは、上記のＳからＲへのトランジションを用いてセリンおよびシステイン標的プロテアーゼの両方の触媒反応を阻害する。それらの作用機構は、脱アシル化が進行する前にプロテアーゼの活性部位を破壊するため、アシル酵素中間体の形成後タンパク質分解を不可逆的に妨げることによりプロテアーゼ阻害剤間でも独特なものである（Otlewski et al.（２００５）The EMBO J. ２４：１３０３）。セルピンとプロテアーゼの反応の速度論モデルは、基質のタンパク質分解のそれと同一である（例、図１；Zhou et al.（２００１）J. Biol. Chem.、２７６：２７５４１−２７５４７参照）。標的プロテアーゼとの相互作用後、セルピンは、まず、容易に開裂できるＰ１−Ｐ１'結合の両端に隣接するＲＳＬにおける残基の相互作用を介して非共有結合的ミカエリス様複合体を形成する（Silverman et al.（２００１）、J. Biol. Chem.、２７６：３３２９３−３３２９６）。プロテアーゼの活性部位におけるセリン残基（セリンプロテアーゼの場合）はＰ１−Ｐ１'結合を攻撃し、ペプチド結合の開裂およびセリン残基とＰ１残基のバックボーンカルボニル間の共有結合的エステル結合の形成を促す。ＲＳＬが開裂された後、ＲＳＬはセルピン分子のβシートＡに挿入される。最初に挿入される残基はＰ１４（すなわち、成熟α１−抗トリプシンにおけるアミノ酸３４５、配列番号１に示したアミノ酸配列のアミノ酸位置Ｔ３６９に対応する）であり、次いでＲＳＬの可撓性ヒンジ領域（Ｐ１５〜Ｐ９）が続く（Buck et al.（２００５）Mol.Biol.Evol.、２２：１６２７−１６３４）。ＲＳＬの挿入により、それと共に共有結合したプロテアーゼが輸送されるため、歪んだ活性部位を特徴とするプロテアーゼの立体配座に変化がもたらされ（図１参照）、セルピンの「弛緩」状態へのトランジションが誘発される。プロテアーゼの立体配座の変化により、Ｐ１側鎖がＳ１ポケットから除去されるように活性部位の触媒性トライアッドが改変される。立体配座の転位の最終的結果として、アシル酵素中間体が捕捉される（Silverman et al.（２００１）、J. Biol. Chem.、２７６：３３２９３−３３２９６）。
アシル酵素の形成はセルピン相互作用にとって重要であるため、セルピンは、典型的には触媒作用でアシル酵素中間体を有するクラスのプロテアーゼに特異的である。これらのクラスのプロテアーゼの中で、優勢なのはプロテアーゼのキモトリプシンスーパーファミリー中およびズブチリシンスーパーファミリー中のものを含むセリンプロテアーゼファミリーのメンバーであり、これらについては下記で詳細に説明する。さらに、セルピンはまた、例えばセリンプロテアーゼのパパインファミリーおよびカスパーゼファミリー中のものを含むシステインプロテアーゼに対して反応性を示す。典型的には、セルピンは、メタロ−、トレオニンまたはアスパルティックファミリーのプロテアーゼを阻害しない。例えば、セルピンとメタロプロテアーゼの相互作用が、共有結合的に捕捉された中間体をもたらすことはなく、その代わりメタロプロテアーゼが、いかなる複合体も形成せずに阻害剤を開裂する（Li et al.（２００４）Cancer Res.６４：８６５７−８６６５）。
すなわち、ほとんどのセルピンは、キモトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼを阻害するが、システインプロテアーゼを阻害する交差クラス的阻害剤も実際に存在する。交差クラス的阻害剤には、両方ともカスパーゼ１を阻害するウイルス性セルピンＣｒｍＡおよびＰＩ９（ＳＥＲＰＩＮＢ９）およびカテプシンＬ、ＫおよびＳを含むパパイン様システインプロテアーゼを阻害するＳＣＣＡ１（ＳＥＲＰＩＮＢ３）がある。セリンプロテアーゼのセルピン介在による阻害機構は、システインプロテアーゼにも適合すると思われる。しかしながら、動力学的に捕捉された中間体が、セリンプロテアーゼの場合と同様オキシエステルではなくチオールエステルである点が異なる（Silverman et al.（２００１）、J. Biol. Chem.、２７６：３３２９３−３３２９６）。安定した共有結合チオールエステル型結合の存在は、ＳＣＣＡ１およびカテプシンＳ間におけるＳＤＳ-安定複合体の検出により裏付けられる（Silverman et al.（２００１）、J. Biol. Chem.、２７６：３３２９３−３３２９６；Schick et al.（１９９８）Biochemistry、３７：５２５８−５２６６）。
セルピン−プロテアーゼ対は、そのセルピン−プロテアーゼ対によっては何週間から何年間までの間非常に安定しているが、結局は解離が起こり、通常のタンパク質分解産物を生じる（すなわち、開裂されたセルピンおよび活性プロテアーゼ；例えば、Zhou et al.（２００１）J. Biol. Chem.、２７６：２７５４１−２７５４７参照）。さらに、ＲＳＬループがプロテアーゼ中に十分な速さでは挿入されない場合、反応は直接開裂産物まで進行する。この現象は分配と呼ばれ、例えば阻害された複合体の形成対非阻害的経路として図１に描かれているように安定した阻害性複合体の形成または基質へのセルピンのターンオーバーのいずれかに至り得る分岐経路の存在を反映する（Lawrence et al.（２０００）、J. Biol. Chem.、２７５：５８３９−５８４４）。セルピンの分配は、ＲＳＬループ、特にループ挿入を開始するＲＳＬのヒンジ領域（すなわち、Ｐ１４）における残基を変えるか、またはセルピンが最適な形で相互作用するプロテアーゼを改変することによりモジュレーションされ得る。例えば、セルピンプラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）の阻害活性は、プロテアーゼｕＰＡ、ｔＰＡおよびトロンビン間で異なり、標的としてはｕＰＡおよびｔＰＡが優先される。さらに、例えば、ヒンジ領域のＰ１４位でのＲＳＬループの変化により、標的とされるＰＡＩ−１の優先性が改変される。荷電アミノ酸（すなわち、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）への突然変異により、ｕＰＡ、ｔＰＡおよびトロンビンのそれぞれに対するＰＡＩ−１の阻害活性は低下する。中性アミノ酸（すなわち、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ）または側鎖を欠くＧｌｙへの突然変異により、ｕＰＡに対する場合と比べてｔＰＡおよびトロンビンに対するＰＡＩ−１の阻害活性は１０〜１００分の１に縮小する。さらに、疎水性アミノ酸への突然変異が、野生型ＰＡＩ−１の場合と比べてＰＡＩ−１の阻害活性を変えることはない（Lawrence et al.（２０００）、J. Biol. Chem.、２７５：５８３９−５８４４）。
プロテアーゼ触媒作用のセルピン介在による阻害の成功における重要因子はＲＳＬループの長さであり、セルピン本体とプロテアーゼ間にてこ入れすることにより、活性部位から触媒性セリンを除き、プロテアーゼを変形させ得る形で確実にセルピンおよびプロテアーゼが相互作用するためには正確な長さを有していなければならない（Zhou et al.（２００１）J. Biol. Chem.、２７６：２７５４１−２７５４７；Huntington et al.（２０００）Nature、４０７：９２３−９２６）。事実、プロテアーゼは、セルピン本体に対して押し込まれる。ほとんどのセルピンは１７残基長であるＲＳＬを有するが、１６残基のループをもつものもごく僅か同定されている（すなわち、α２−抗プラスミン、Ｃ１−阻害剤、およびＣｒｍＡ）。１８残基ループを有するα２−抗プラスミン変異型セルピンも出血疾患の患者から同定されているが、この変異型は機能的阻害性セルピンではない（Zhou et al.（２００１）J. Biol. Chem.、２７６：２７５４１−２７５４７）。すなわち、セルピン阻害機構は、ＲＳＬの延長ではなく、短縮を適応させ得る（Zhou et al.（２００１）J. Biol. Chem.、２７６：２７５４１−２７５４７）。セルピンファミリーメンバー間におけるループ長の保存に加えて、セルピンのＲＳＬはまた、一般に保存ヒンジ領域（Ｐ１５〜Ｐ９）組成を保持しており、典型的には荷電または巨大Ｐ残基を含まない。
ａ．具体例としてのセルピン類
本発明方法で使用するセルピンは、限定されるわけではないが、遺伝子組み換えにより製造されたポリペプチド、合成ポリペプチドおよび細胞、組織および血液から抽出されたセルピンを含め、いかなるセルピンポリペプチドでもよい。セルピンはまた、対立遺伝子変異型および限定されるわけではないが、ヒトおよびヒト以外の起源の動物、ポックスウイルス、植物、細菌および古細菌を含む異なる種からのポリペプチドも包含する。典型的には、セルピンの対立遺伝子または種変異型は、約または少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の割合で天然または野生型セルピンとは異なる。ヒトセルピンは、本明細書（例、下記表２）で示したセルピン、対立遺伝子変異型イソ型、核酸からの合成分子、ヒト組織、細胞または血液から単離したタンパク質、およびヒトセルピンポリペプチドの修飾形態を包含する。セルピンはまた、プロテアーゼとの相互作用および共有結合アシル酵素中間体の形成を伝達するのに十分なＲＳＬループ部分が存在する限りは切頂型ポリペプチドフラグメントも含む。
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典型的には、本発明方法で使用するセルピンは、セルピンおよびプロテアーゼ間に共有結合アシル酵素中間体を形成させ得る阻害性セルピンまたはそのフラグメントである。一般的に、上記セルピンを用いることにより、セルピンが通常ターゲッティングするプロテアーゼについて選択を行うが、その場合プロテアーゼのほぼ完全な阻害が起こり、阻害性複合体と開裂セルピン基質間での分配は最小限となる。表３は、セリンプロテアーゼおよびそれらの同族体セルピン阻害剤の例を示す。上記セルピン／プロテアーゼ対は、高い会合定数または二次速度定数を有し、非阻害性複合体への分配は低調または皆無であることが予測される。例えば、ｔ−ＰＡの主たる生理学的阻害剤は、約５０ｋＤの糖タンパク質、セルピンＰＡＩ−１である（Pannekoek et al.（１９８６）EMBO J.、５：２５３９−２５４４；Ginsberg et al.（１９８０）J. Clin. Invest.、７８：１６７３−１６８０；およびCarrell et al.、Proteinase Inhibitors、Barrett,A.J.et al.編、Elsevier、アムステルダム、４０３−４２０頁（１９８６））。また、会合定数が低く、分配が高調である場合でさえ、他のセルピン／プロテアーゼ対も本発明方法で使用され得る。例えば、他のセルピン、例えばＣ１エステラーゼ阻害剤およびアルファ−２−抗プラスミンとｔＰＡの会合定数は、ＰＡＩ−１の場合より一桁低いが（Ranby et al.（１９８２）Throm.Res.、２７：１７５−１８３；Hekman et al.（１９８８）Arch. Biochem. Biophys.、２６２：１９９−２１０）、それにも拘らず、これらのセルピンはｔＰＡを阻害しない（例、Lucore et al.（１９８８）Circ.７７：６６０−６６９参照）。
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すなわち、一般に本発明方法でプロテアーゼの選択に使用するセルピンは反応産物を生じ、その場合反応産物の８０％、９０％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は阻害性複合体の形成を占める。しかしながら、本方法で使用するセルピンが最適な形でプロテアーゼをターゲッティングしない場合など、セルピンとプロテアーゼ間で高い分配が起こる場合も本発明方法ではあり得る。すなわち、本発明方法では、セルピンを用いてプロテアーゼを選択するが、その場合、生じる反応物は約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％前後およびそれ以上の割合で安定した阻害性複合体に誘導され、残りの生成物は開裂されたセルピン基質である。分配が起こる場合にプロテアーゼ選択に向けて改変され得る因子には、例えば、高いセルピン濃度および長い反応時間がある。場合によっては、下記で検討している他の非阻害性セルピンまたはその突然変異体も、選択用の標的プロテアーゼがセルピン基質と相互作用することにより、捕捉され得る共有結合阻害性複合体を生じさせることができる限りは本発明方法で使用され得る。
ｉ．ＰＡＩ−１
プロテアーゼ選択方法で使用するセルピンの具体例は、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）またはその変異型である。ＰＡＩ−１は、プラスミノーゲンの活性化故にフィブリン溶解に関与するプロテアーゼである、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）およびウロキナーゼまたは尿中プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）の主要阻害剤である。ＰＡＩ−１は、ｔ−ＰＡおよびｕ−ＰＡについて約２×１０７Ｍ−１／秒の二次速度定数を有する。ＰＡＩ−１は、腫瘍浸潤、フィブリン溶解、細胞移動、組織リモデリング、組織退縮、排卵、炎症、栄養膜浸潤および悪性変換に関与する（Salonen et al.（１９８８）J Biol. Chem.、２６４：６３３９−６３４３）。ＰＡＩ−１は、主として内皮により産生されるが、例えば脂肪組織などの他の組織型により分泌されることもある。他の関連プラスミノーゲン活性化因子阻害剤には、ＰＡＩ−２およびＰＡＩ−３がある。例えば、ＰＡＩ−２もまた、ｕ−ＰＡおよびｔ−ＰＡの阻害剤であるが、胎盤により分泌され、典型的には妊娠中に大量に存在するのみである。
ＰＡＩ−１は、２３アミノ酸シグナル配列を含む、配列番号１１に示した前駆体配列を有する単鎖糖タンパク質であり、開裂されると、３７９アミノ酸成熟配列を生じる。他のセルピンと同様、ＰＡＩ−１は、Ａｒｇ３４６〜Ｍｅｔ３４７（すなわち、配列番号１１に示した前駆体配列のアミノ酸Ａｒｇ３６９およびＭｅｔ３７０に対応する）に位置するそのＰ１−Ｐ１'反応性部位がプロテアーゼにより開裂された後、潜在形態から活性形態へとトランジションし、その結果、安定した共有結合複合体の形成および結合プロテアーゼの不活化をもたらす。しかしながら、他のセルピンとは異なり、ＰＡＩ−１は、自然に潜在トランジションをとるため、不活性の安定性は高いが共有結合的に無傷の形態となり、そこでＲＳＬの残基Ｐ１５〜Ｐ４はβ−シートＡに挿入されてβ−シートの鎖４（すなわちｓ４Ａ）を形成し、残基Ｐ３〜Ｐ１０'は、分子の表面に伸長したループを形成する（De Taeye et al.（２００３）J Biol. Chem.、２７８：２３８９９−２３９０５）。すなわち、活性ＰＡＩ−１は、潜在的立体配座への自然発生的変換前には３７℃で比較的不安定であり、２.５時間の半減期しか呈しない。しかしながら、この潜在形態は、変性、例えばドデシル硫酸ナトリウム、塩化グアニジウムおよび尿素による変性（Declerek et al.（１９９２）J. Biol. Chem.、２６７：１１６９３−１１６９６）および加熱（Katagiri et al.（１９８８）Eur J. Biochem.、１７６：８１−８７）により再活性化され得る。ＰＡＩ−１の活性形態はまた、ビトロネクチンとの相互作用により安定化する。潜在的立体配座への変換を受け入れ得ないため、長時間にわたって高い温度およびｐＨでさらに安定している突然変異体ＰＡＩ−１が同定された（例、Berkenpas et al.（１９９５）The EMBO J.、１４：２９６９−２９７７）。
セリンプロテアーゼ（すなわち、ｔ−ＰＡまたはｕ−ＰＡ）および／または阻害性セルピン（すなわち、ＰＡＩ−１）に対し、例えば野生型プロテアーゼの活性が所望される治療適用で使用するために、阻害の二次速度定数をモジュレーションまたは改変することによりプロテアーゼがそれらの同族体セルピン阻害剤、またはその変異型による阻害に対して耐性となるように修飾を加えている（例、米国特許第５８６６４１３、５７２８５６４、５５５００４２、５４８６６０２、５３０４４８２号参照）
ii．抗トロンビン（ＡＴ３）
本発明方法で使用する別の典型的セルピンまたはその変異体は抗トロンビン（ＡＴ３）である。ＡＴ３はまた、セルピンファミリーの一員であり、例えば、限定されるわけではないが、因子Ｘ、因子IX、因子II（トロンビン）、因子ＶII、因子ＸＩおよび因子ＸIIなどの凝固系からのものを含む酵素の一員を不活化する。典型的には、抗トロンビンは、それが例えばトロンビンの機能を遮断することにより凝固を阻止または阻害する血液から主に見出される。ＡＴ３の活性は、１種またはそれ以上の補因子、典型的にはヘパリンの存在により高められる。ヘパリンと相互作用すると、ＡＴ３は、セルピン構造からのループ排除およびＰ１露出を伴う立体配座の転位を経て、露出プロテアーゼに接近し易い立体配座を有するＡＴ３構造となる。さらに、ヘパリンは、プロテアーゼと阻害剤の両方に結合することにより、阻害機構を加速させ得る（Law et al.（２００６）Genome Biology、７（２１６）：１−１１）。
ＡＴ３の遺伝子配列は、配列番号５に示した前駆体タンパク質をコード化する、７エキソンに及ぶＤＮＡをコードする。配列番号５に示した配列のアミノ酸１〜３２に対応するシグナル配列の開裂により、約５８０００ダルトンの分子量を有する４３２アミノ酸の成熟タンパク質が生じる。アミノ酸のうち６個はシステインであり、３つの分子内ジスルフィド結合の形成をもたらす。ＡＴ３のＲＳＬにおけるＰ４−Ｐ２'位は、配列番号５に示したアミノ酸配列におけるアミノ酸４２２〜４２７に対応するアミノ酸残基ＩＡＧＲＳＬ（配列番号４７８）を含み、反応性部位Ｐ１−Ｐ１'での開裂がアミノ酸Ａｒｇ４２５〜Ｓｅｒ４２６の間で起こる。
３．他のプロテアーゼトラップポリペプチド
セルピンと類似した阻害機構（例、安定した中間体を生成し、プロテアーゼ構造に立体配座の変化をもたらすプロテアーゼによる標的基質の開裂）を呈する追加的プロテアーゼトラップポリペプチドは当業界では公知であるか、または同定され得る。上記プロテアーゼトラップポリペプチドについても、本発明方法での使用が考えられる。上記プロテアーゼトラップポリペプチドの例はｐ３５である。さらに、他の分子でも、プロテアーゼにより開裂されて永続性のある安定した複合体中にプロテアーゼを捕捉するものであれば、本発明方法で使用され得る。
ａ．ｐ３５
例えば、広いスペクトルのカスパーゼ阻害剤である、バキュロウイルスｐ３５タンパク質（配列番号４７３）は、この方法でカスパーゼを阻害し得る（Xu et al.（２００１）Nature ４１０：４９４−４９７；Xu et al.（２００３）J. Biol. Chem.、２７８（７）：５４５５−５４６１）。カスパーゼによりｐ３５のＰ１−Ｐ１'結合が（カスパーゼ開裂部位ＤＱＭＤ８７で）開裂されると、ｐ３５ループのアミノセグメント（Ａｓｐ８７）とカスパーゼ触媒性トライアッドのシステイン残基（カスパーゼ−８におけるＣｙｓ３５０）間に共有結合チオエステル中間体が生成される。チオエステル結合が形成されると、プロテアーゼにおいて、開裂したループのアミノセグメントをカスパーゼ中へ埋没させ得る立体配座の変化が起こり、２位のＣｙｓ残基を含むｐ３５のＮ−末端はカスパーゼ活性部位へ挿入されるため、カスパーゼ−８におけるＨｉｓ３１７残基の溶媒接近可能性が遮断される。したがって、加水分解用の水分子に接近できないため、チオエステル結合の後続の加水分解が阻止される。
ｐ３５に加えて、類似したウイルス性カスパーゼ阻害剤には、限定されるわけではないが、ｐ４９（配列番号４９１）およびセルピンＣｒｍＡ牛痘遺伝子（配列番号４９２）が含まれる。ｐ４９阻害剤は、ｐ４９カスパーゼ認識配列ＴＶＴＤ９４の開裂時に、カスパーゼの活性部位との安定したチオエステル結合が形成されるという点でｐ３５の場合と類似したカスパーゼ阻害機構を呈する。
本発明方法を用いるスクリーニング用の標的基質は、ｐ３５、ｐ４９またはＣｒｍＡポリペプチドなどのウイルス性カスパーゼ阻害剤ポリペプチドを含み得る。本発明で提供するセルピンのＲＳＬループの修飾方法は、ウイルス性カスパーゼ阻害剤ポリペプチドの修飾にも容易に適合し得る。例えば、ｐ３５ＲＳＬにおける開裂に関する標的部位には、標的基質に関して改変された反応性または特異性を有するプロテアーゼを選択するように修飾が加えられ得る。野生型ｐ３５では、カスパーゼ認識はアミノ酸８４〜８７位（ＤＱＭＤ８７）で見出される。したがって、ウイルス性カスパーゼ阻害剤ポリペプチドへの修飾は、開裂配列および／または周囲のアミノ酸残基を改変する修飾を含み得る。例えば、上記修飾カスパーゼ阻害剤ポリペプチド、例えば、ｐ３５、ｐ４９またはＣｒｍＡポリペプチドは、所望の標的基質、例えば、疾患または障害の病因に関与する標的基質の開裂配列を模倣するように設計され得る。ウイルス性カスパーゼ阻害剤ポリペプチドのＲＳＬループ配列における修飾はいずれも本発明方法で行われ得る。
本発明方法で使用するｐ３５、ｐ４９またはＣｒｍＡポリペプチドなどのウイルス性カスパーゼ阻害剤ポリペプチドは、限定されるわけではないが、遺伝子組み換えによるポリペプチド、合成ポリペプチドおよびバキュロウイルス精製方法により製造されるｐ３５またはｐ４９ポリペプチドを含むいずれのウイルス性カスパーゼ阻害剤ポリペプチドでもよい。ウイルス性カスパーゼ阻害剤ポリペプチドはまた、ポリペプチドの対立遺伝子変異型、例えばｐ３５、ｐ４９またはＣｒｍＡポリペプチド変異型も包含する。
ｂ．アルファマクログロブリン（ａＭ）
プロテアーゼのアルファマクログロブリン（ａＭ）ファミリーは、典型的なプロテアーゼ阻害剤アルファ−２−マクログロブリン（ａ２Ｍ、配列番号４９０）などのプロテアーゼ阻害剤を含むため、本発明方法でのプロテアーゼトラップとしての使用が考えられる。ａＭ分子は、あらゆるクラスのプロテアーゼを阻害する。ａＭプロテアーゼトラップは、プロテアーゼによる阻害剤のベイト領域の開裂を含む類似した阻害機構を特徴とする。ベイト領域は、タンパク質分解的開裂を受けやすいセグメントであり、開裂されると、ａＭ分子における立体配座の変化を誘発することにより、プロテアーゼ周囲の構造を崩壊させる。配列番号４９０に示した典型的ａ２Ｍ配列の場合、ベイト領域はアミノ酸６９０〜７２８に相当する。生成するａＭ−プロテアーゼ安定複合体では、プロテアーゼの活性部位は立体的に保護されるため、通常のプロテアーゼ基質への接近は減少する。典型的には、捕捉されたプロテアーゼは、小ペプチド基質に対する活性を保持してはいるが、大型タンパク質基質または阻害剤とのその相互作用能力を喪失している。さらに、ａＭ分子は、チオールエステルとアミンとの反応により阻害受容力を不活化する反応性チオールエステルの存在を特徴とする。さらに、ベイト領域の開裂時に起こる立体配座の変化により、保存されたＣＯＯＨ−末端受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は露出する。ＲＢＤ配列の露出により、循環からａＭ−プロテアーゼ複合体が除去されやすくなる。
４．プロテアーゼトラップ競合物質
本発明方法では、標的基質について選択されたプロテアーゼの特異性および選択性制約をモジュレーションするのに競合物質を用い得る。例えばプロテアーゼと所望のプロテアーゼトラップポリペプチドの接触の前または後など、いずれの時点でも、競合物質をプロテアーゼまたはそのコレクションと接触させ得るか、または競合物質および所望のプロテアーゼトラップポリペプチドを同時にプロテアーゼと接触させ得る。競合物質は特異的競合物質または広範な競合物質であり得る。
予め定められた非標的基質を模倣することにより、予め定められた潜在的オフターゲット（的外れ的存在）として作用する特異的競合物質を設計する。典型的には、上記競合物質には標識しないため、形成する安定したプロテアーゼ複合体はそれについて選択されない。さらに、上記競合物質は、選択スキームで使用するように設計されたプロテアーゼトラップポリペプチドよりもかなり過剰に、典型的にはモル過剰で加えられるため、上記競合物質はコレクション中の望ましくないプロテアーゼを捕縛する。特異的競合の一例では、それぞれ異なる基質認識を模倣するように設計された２種の異なるプロテアーゼトラップポリペプチドを、プロテアーゼのコレクションと接触させるが、その際プロテアーゼトラップポリペプチドの一方のみを検出可能な形で標識する。例えば、競合物質は、その反応性部位が非標的基質の開裂配列を模倣するように設計されたポリペプチドプロテアーゼトラップを含み得る。すなわち、セルピンなどの競合物質は、そのＰ４−Ｐ１'ＲＳＬ残基が予め定められた非標的基質の開裂配列と置き換わるように設計され得る。本発明方法では、競合物質を、プロテアーゼトラップポリペプチド、例えば、そのＲＳＬ配列が、所望の、または予め定められた標的基質の開裂配列を模倣するＰ４−Ｐ１'位でのアミノ酸を含むように修飾されており、単離され得るように標識された別のセルピンポリペプチドと組み合わせて使用し得る。すなわち、両プロテアーゼトラップポリペプチドとも、標的または非標的開裂配列に対する選択性を呈するプロテアーゼについて選択するが、所望の標的基質特異性を呈し、検出可能な形で標識されている安定したプロテアーゼ複合体のみが反応から単離され得る。特異的競合物質の他の例には、例えば、反応性部位が本発明方法で修飾された天然プロテアーゼトラップポリペプチドがある。実施例６は、血漿精製ＡＴ３セルピンを、修飾セルピンＡＴ３ＳＬＧＲ−ＫＩに対する競合物質として用いる戦略を典型的に示している。
選択されたプロテアーゼの特異性および選択性を制約する広範な競合物質もまた本発明方法で使用し得る。広範な競合物質の例には、例えば、様々な天然プロテアーゼ阻害剤を含むヒト血漿またはヒト血清がある。別法として、Ｐ２、Ｐ３またはＰ４のどの位置も異なるように設定されたプロテアーゼトラップポリペプチドの広範な小分子ライブラリー、例えばＡｃｘｘｘ−チアフィンライブラリーも作成され得る。
５．変異型プロテアーゼトラップポリペプチド
本発明方法では、改変された開裂配列を有するように反応性部位が修飾されたプロテアーゼトラップポリペプチドも、所望の、または予め定められた標的基質を伴うプロテアーゼについて選択するのに使用し得る。すなわち、プロテアーゼトラップでは、標的基質について改変された反応性または特異性を有するプロテアーゼについて選択できるように、プロテアーゼの認識される開裂部位としての役割を果たすそれらの配列領域に修飾を加える。例えば、セルピンは、ＲＳＬループにおいて容易に開裂できる結合またはその付近に改変された開裂配列を有するように修飾され得る。別の例の場合、ａ２Ｍでは、改変された開裂配列を有するようにそのベイト領域が修飾され得る。上記修飾プロテアーゼトラップは、所望の標的基質、例えば疾患または障害の病因に関与する標的基質の開裂配列を模倣するように設計され得る。
本発明方法では、セルピン分子のＲＳＬループ配列に何らかの修飾が加えられ得る。具体例としての野生型セルピンのＲＳＬ配列のアラインメントを下記表４に示す。下表において、Ｐ１５〜Ｐ５'位を示す番号は、成熟α１−抗トリプシン分子（配列番号１に示したアミノ酸配列のアミノ酸３６７〜３８７に対応する）に関するものである。ＲＳＬループ配列の同一性は当業界では公知であり、そして／またはアラインメント、例えば下記表４に示したセルピンとのアラインメントにより測定され得る。
Figure 0004546578
すなわち、セルピンの反応性部位におけるアミノ酸のいずれか１つまたはそれ以上（すなわち、例えば上記表４に示したＰ１５〜Ｐ５'位に対応するアミノ酸のいずれか１つまたはそれ以上）に対応するセルピンのＲＳＬループ内のアミノ酸配列が修飾され得る。典型的には、ＲＳＬループ配列のヒンジ領域の一部であるアミノ酸は修飾されない（すなわち、Ｐ１５〜Ｐ９位に対応するアミノ酸）。一例では、容易に開裂できる結合の両端に隣接するアミノ酸に対応するＰ１および／またはＰ１'位における１つまたはそれ以上のアミノ酸が修飾される。別の例では、反応性部位Ｐ４〜Ｐ２'位に対応する１つまたはそれ以上のアミノ酸が修飾される。例えば、ＰＡＩ−１のＰ４〜Ｐ１'はＶＳＡＲＭ（配列番号３７８）であり、Ｒ（Ｐ１）とＭ（Ｐ１'）アミノ酸の間で開裂が起こる。ＶＳＡＲＭ配列のアミノ酸のいずれか１つまたはそれ以上を修飾することにより、改変された特異性をもつプロテアーゼについて選択できるようにＰＡＩ−１の開裂配列が修飾され得る。実施例１は、反応性部位ループにおけるＶＳＡＲＭ配列をＲＲＡＲＭ（配列番号３７９）に修飾するＰＡＩ−１の修飾を具体的に示している。別の例では、反応性部位ループのＶＳＡＲＭ配列を、既知の有効なペプチド基質ＰＦＧＲＳ（配列番号３８９）に修飾し得る。上記突然変異体ＰＡＩ−１の具体例を配列番号６１０および６１１に示す。
別の例では、抗トロンビンIII（ＡＴ３）のＲＳＬに修飾を加え得る。例えば、ＡＴ３のＰ４−Ｐ１'はＩＡＧＲＳＬ（配列番号４７８）であり、Ｒ（Ｐ１）とＳ（Ｐ１'）アミノ酸の間で開裂が起こる。ＩＡＧＲＳＬ配列のアミノ酸のいずれか１つまたはそれ以上を修飾することにより、改変された特異性をもつプロテアーゼについて選択できるようにＡＴ３の開裂配列が修飾され得る。実施例６および７は、反応性部位ループにおけるＩＡＧＲＳＬ配列をＲＲＶＲＫＥ（配列番号４９８）に修飾するＡＴ３の修飾を具体的に示している。別の例では、反応性部位ループのＩＡＧＲＳＬアミノ酸配列を、ＳＬＧＲＫＩ（配列番号４７９）に修飾し得る。アミノ酸配列ＳＫＧＲＳＬ（配列番号５０１）またはアミノ酸配列ＰＲＦＫＩＩ（配列番号５０３）によるＩＡＧＲＳＬアミノ酸配列の置換を含む他の修飾ＡＴ３ポリペプチドも調製した。上記突然変異体ＡＴ３分子の具体例を配列番号４９７、４９９、５００および５０２のいずれかに示す。
別法として、また必要ならば、いずれか１つまたはそれ以上のアミノ酸Ｐ４−Ｐ２'位における修飾は、同時に１つ、同時に２つ、同時に３つなどの形で行うことも可能であり、生成した修飾セルピンを選択の連続ラウンドで別々に試験することにより、修飾位置のそれぞれで基質特異性および／または選択性を呈するプロテアーゼについて最適化することができる。
ほとんどの場合、野生型セルピンまたは別のプロテアーゼトラップにおける類似配列の反応性部位ループにおいてアミノ酸残基を置換しているアミノ酸残基は、所望の標的基質における開裂配列に基づいて選択される。標的基質タンパク質は通常病理に関与しているものであり、所与の基質配列での標的タンパク質の開裂が、病状の処置としての役割を果たす（例、米国特許公開第ＵＳ２００４／０１４６９３８号、同第ＵＳ２００６／００２４２８９号、同第ＵＳ２００６／０００２９１６号、および仮特許出願第６０／７２９８１７号参照）。例えば、標的タンパク質は、慢性関節リウマチ（すなわち、ＴＮＦＲ）、敗血症（すなわち、プロテインC）、腫瘍形成性（すなわち、増殖因子受容体、例えばＶＥＧＦＲ）または炎症（すなわち補体タンパク質）に関与するものであり得る。標的基質はまたウイルス性タンパク質でもあり得るため、ウイルス性タンパク質が開裂すると、ウイルスは細胞に感染し得なくなる。下記表５は、具体的な標的基質を示す。
Figure 0004546578
標的タンパク質内の開裂部位は、公知であるかまたは容易に同定され得る。標的タンパク質内の開裂部位は、以下の基準により同定される：１）それらはタンパク質の露出表面に位置する、２）原子構造予測アルゴリズムでの測定によると、それらは二次構造を欠く（すなわち、ヘリックスのＰシートではない）領域に位置する（これらの領域は、タンパク質表面上のループまたは細胞表面受容体上のストークとなる傾向がある）、３）それらは、その既知機能に基づくと、タンパク質を不活化（または活性化）すると思われる部位に位置する。開裂配列は、プロテアーゼの長い基質特異性と適合するために例えば４残基長（すなわちＰ１〜Ｐ４位）であるが、それより長い場合も短い場合もあり得る。例えば、補体因子Ｃ２における開裂配列に関するＰ４−Ｐ１アミノ酸残基はＳＬＧＲ（配列番号４３１）であるが、ＳＬＧＲＫＩ（配列番号４７９）のＰ４−Ｐ２'配列としても表わされ得、その場合、Ｐ１およびＰ１'位間（すなわちＲ・Ｋ間）で開裂が起こる。このため、Ｐ４−Ｐ１を含む、残基Ｐ４−Ｐ２'のいずれか１つまたはそれ以上を含む、開裂配列内のいずれか１つまたはそれ以上の残基が、例えばセルピンのＲＳＬにおいて、プロテアーゼトラップポリペプチドに導入されることにより、突然変異体プロテアーゼトラップポリペプチドが生成され得る。
開裂配列は、当業界で公知の方法により標的基質において同定され得る（例、米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０１４６９３８号参照）。一例において、標的基質の開裂は、基質を開裂することが知られているプロテアーゼと標的基質をインキュベーションすることにより測定される。プロテアーゼとのインキュベーション後、標的タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、分解産物は、タンパク質染料、例えばクーマシーブリリアントブルーでの染色により同定され得る。タンパク質分解性フラグメントを配列決定することにより、開裂配列、例えば、６アミノ酸Ｐ４−Ｐ２'開裂配列、および特に４アミノ酸Ｐ４−Ｐ１開裂配列残基の同一性が測定され得る。表６は、典型的標的基質に関するＰ４−Ｐ１位に対応する開裂配列を示す。
Figure 0004546578
セルピンのＲＳＬ、または他のプロテアーゼトラップにおける類似配列の修飾は、標的基質の所望の、または予め定められた開裂配列に対して行われ得る。一例において、選択された開裂配列は、ｔ−ＰＡの特に有効な開裂配列であり得る。上記開裂配列は、例えば、ＰＦＧＲＳ（配列番号３８９、例えば、Ding et al.（１９９５）PNAS，９２：７６２７−７６３１）であり得る。すなわち、例えば、プロテアーゼについては、それが有する基質特異性に改変が加えられてｔ−ＰＡの基質特異性を複製するようにされたものが選択され得る。ｔ−ＰＡはフィブリン溶解疾患の処置に用いられることが多い治療薬であるため、上記の選択されたプロテアーゼは、ｔ−ＰＡ治療に伴うことが多い望ましくない副作用（すなわち、過度の出血）を最小限にしながら代替的ｔ−ＰＡ治療薬となるように最適化され得る。
別の例において、補体タンパク質に関する開裂配列は、本発明方法を用いることにより、プロテアーゼを選択するため予め定められたかまたは所望の開裂配列としてターゲッティングされ得る。いずれか１つまたはそれ以上の補体タンパク質に対する高い基質特異性を有するように選択されたプロテアーゼは、限定されるわけではないが、例えば慢性関節リウマチおよび狼瘡などの自己免疫疾患、心臓疾患、および他の炎症性疾患、例えば、敗血症および虚血−再灌流損傷などの炎症と関連した障害および疾患を処置するための治療薬候補となる（例えば、仮出願第６０／７２９８１７号参照）。実施例６〜実施例１５は、その天然Ｐ４−Ｐ２'残基ＩＡＧＲＳＬ（配列番号４７８）をＣ２補体タンパク質の開裂配列（すなわち、ＳＬＧＲＫＩ、配列番号４７９）により置換することにより修飾したＡＴ３セルピン分子に対するＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼの選択を具体的に示している。ＳＬＧＲＫＩ開裂配列、またはその中間体、例えば下記のものによるアミノ酸残基の修飾または置換は、所望通りの候補プロテアーゼが選択されるように、プロテアーゼトラップポリペプチド、例えばセルピンポリペプチドで行われ得る。
さらなる例において、開裂配列は、開裂配列についての特異性を有するプロテアーゼにより開裂されるとＶＥＧＦＲが不活化されるように、ＶＥＧＦＲ、例えばＶＥＧＦＲのストーク領域で選択され得る。ＶＥＧＦＲにおける開裂配列の例については、本明細書に記載しており、関連した米国特許出願公開第２００６００２４２８９号および同第２００６０００２９１６号に示されている。例えば、セルピンのＲＳＬまたは他のプロテアーゼトラップにおける類似配列、例えばアルファ−２マクログロブリンにおける「ベイト」領域は、ＶＥＧＦＲの開裂配列により置換されるアミノ酸Ｐ４−Ｐ２'位のいずれか１つまたはそれ以上を有するように修飾され得る。一例において、天然セルピンにおけるアミノ酸残基は、ＲＲＶＲ（配列番号４８９）開裂配列に対応するＰ４−Ｐ１位、または全Ｐ４−Ｐ２'配列ＲＲＶＲＫＥ（配列番号４９８）を含むように修飾され得る。上記の修飾セルピンに対して選択されたプロテアーゼは、ＶＥＧＦＲ介在疾患、例えば脈管形成疾患を処置するための候補となる。
本発明方法では、場合によっては、セルピンＲＳＬのＰ４−Ｐ２'位のいずれか１つまたはそれ以上、または他のプロテアーゼトラップにおける類似配列における修飾が、所望の、または予め定められた基質特異性をもつプロテアーゼの選択について最適化するように連続ラウンドで行われ得る。例えば、ｕ−ＰＡおよびｔ−ＰＡプロテアーゼは両方とも、Ｐ２位にある小アミノ酸およびＰ３およびＰ４位にある非常に異なるアミノ酸を好む。すなわち、最終標的開裂配列についての中間体である修飾セルピンが生成され得、その場合最初の中間体は、Ｐ３およびＰ４位で特異性を呈するプロテアーゼを選択するようにＰ３およびＰ４位のみの修飾により生成される。次いで、選択された一プロテアーゼまたは複数プロテアーゼは、さらにＰ２位を変えるように修飾された新たなセルピン分子に対する新たなコンビナトリアルライブラリーを作成するための鋳型として使用され得る。
すなわち、例えば、ＶＥＧＦＲ開裂配列ＲＲＶＲについての高い基質特異性を呈するｕ−ＰＡプロテアーゼまたはその変異型の選択では、選択の第一ラウンドは、中間体修飾プロテアーゼトラップポリペプチド、例えばセルピンに対して行われ得、その場合Ｐ３およびＰ４位のみがそれらの位置の天然配列と比べて変更されている。例えば、セルピンＰＡＩ−１のＲＳＬループにおける天然Ｐ４−Ｐ１'アミノ酸がＶＳＡＲＭである場合、修飾中間体ＰＡＩ−１は、Ｐ４およびＰ３ ＶＥＧＦＲ開裂配列のみの置換により生成され、Ｐ４−Ｐ１'位にＲＲＡＲＭ（配列番号３７９）を含む中間体セルピン分子を生じ得る。プロテアーゼ選択の後続ラウンドは、さらにＰ２位が修飾されたＰＡＩ−１セルピンに対して行われ得る。
セルピンを含むプロテアーゼトラップは、タンパク質修飾技術分野で知られている方法を用いて修飾され得る。上記方法には、単または多位置指定突然変異導入を含む位置指定突然変異導入がある。同様に、変異型プロテアーゼトラップポリペプチドを含むプロテアーゼトラップポリペプチドの発現および精製は、ポリペプチドの発現および精製に関する当業界での標準的方法を用いて遂行され得る。限定されるわけではないが、哺乳類細胞、細菌細胞または昆虫細胞を含む、任意の宿主系が発現に使用され得る。さらに、プロテアーゼトラップポリペプチドは、プロテアーゼトラップポリペプチドの同定および精製で助けとなる追加的配列を含むようにさらに修飾され得る。例えば、ポリペプチドのアフィニティー精製の助けとなるように、エピトープ標識、例えば限定されるわけではないが、Ｈｉｓ標識またはフラッグ標識が付加され得る。若干の例では、捕捉および／または精製の助けとなるようにプロテアーゼトラップポリペプチドを直接ビオチニル化する。プロテアーゼトラップポリペプチドをビオチニル化する具体的な方法については実施例１６に記載している。
例えばセルピン分子または他のプロテアーゼトラップの生物学的機能に関する検定法などの検定法は、当業界では公知であり、本発明方法における阻害剤としての修飾プロテアーゼトラップの活性を評価するのに使用され得る。上記検定法は、本発明方法での使用を目的として修飾されたプロテアーゼトラップポリペプチドにより異なる。ＰＡＩ−１に関する上記検定法の具体例には、例えば、標準トリプシンに対する活性部位滴定または標準トリプシンの滴定、例えば実施例１で具体的に示した方法がある。また、上記検定法の具体例は、当業界では公知のプロテアーゼ阻害検定法であり、その方法では、活性プロテアーゼによる蛍光基質の開裂をプロテアーゼトラップが阻害する能力を、プロテアーゼトラップ活性に関するリードアウトとして使用する。プロテアーゼ阻害検定法の具体例は、マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）阻害検定法である。上記検定法の一例では、プロテアーゼトラップはセルピンである。ある特定例では、セルピンはＡＴ３または本発明方法により製造された変異型ＡＴ３タンパク質であり、蛍光基質はＲＱＡＲ−ＡＣＣである。例えば実施例１４Ａで具体的に示した要領で、基質の開裂を測定する。トロンビン阻害検定法もまた、ＡＴ３または修飾ＡＴ３の活性評価に使用され得る。プロテアーゼトラップポリペプチドまたはその変異型が通常相互作用する同族体プロテアーゼにより異なる類似検定法も設計され得るかまたは当業者には公知である。さらに、修飾プロテアーゼトラップポリペプチドが、プロテアーゼトラップ活性または機能の通常検定法で野生型プロテアーゼトラップポリペプチドと比べて低い活性を有することは、予測され、またよくあることでもある。
Ｄ．プロテアーゼ類
本発明方法では、典型的には予め定められたか、または所望の基質について改変された基質特異性を呈する候補プロテアーゼを選択する。プロテアーゼ、突然変異体プロテアーゼまたはその触媒活性部分のコレクションを、プロテアーゼトラップポリペプチド、例えば、セルピンまたは修飾セルピンを含む本明細書記載のものと接触させることにより、改変された基質特異性を有するプロテアーゼを選択する。プロテアーゼコレクションは、固体支持体または均一混合物中、例えば溶液または懸濁液中で提供され得る。選択されたプロテアーゼは、プロテアーゼトラップポリペプチドとの安定複合体として単離され、同定され得る。選択されたプロテアーゼは、所望の、または予め定められた標的基質に対して高い触媒有効性および反応性を示すため、例えば標的基質が関与する疾患または障害における治療薬としての使用に関する候補である。
１．候補プロテアーゼ
本発明方法では、疾患または障害に関与する目的基質に関して改変および／または高い特異性を有するプロテアーゼについて選択する。一般的に、プロテアーゼは、他は無傷のままで残しながら標的基質を加水分解する高特異性タンパク質である。天然基質の開裂について、プロテアーゼは、基質開裂には有利であり、非基質開裂には不利となるような高度の選択性を呈する（Coombs et al.（１９９６）J. Biol. Chem.、２７１：４４６１−４４６７）。所望の標的基質について改変された特異性および選択性を呈するプロテアーゼについて選択することにより、選択的にタンパク質を活性化または不活化することにより疾患または障害を縮小、改善または阻止する治療薬としてのプロテアーゼの使用が可能となる。本発明によるプロテアーゼトラップ選択方法で使用する標的プロテアーゼは、プロテアーゼトラップが相互作用するペプチド結合加水分解能を有する公知クラスのプロテアーゼであり得る。典型的には、セルピンの場合、上記プロテアーゼは、一般的にはセルピンが相互作用して共有結合中間複合体を形成するセリンまたはシステインプロテアーゼである。セリンおよびシステインプロテアーゼの具体例は、下記表７に示したプロテアーゼである。典型的には、本発明方法では修飾プロテアーゼのライブラリーを用いることにより、標的プロテアーゼトラップまたはその変異型、例えばセルピンまたはその変異型について高い特異性または選択性を呈するプロテアーゼ変異型について選択する。
本発明選択方法で使用され、そして／または修飾されて使用され得るプロテアーゼの例を記載するが、そこには触媒活性部分を含むその切頂型ポリペプチドが含まれる。候補プロテアーゼの例を表７に列挙し、本項で説明する（例えば、www.merops.sanger.ac.uk参照）。例示的な各候補プロテアーゼについてのヌクレオチド配列およびコード化アミノ酸前駆体配列に関する配列表（配列番号）を表に示す。成熟タンパク質を生じるシグナルペプチドまたはプロペプチド配列に対応するコード化アミノ酸も表に示す。さらに、各プロテアーゼの例えば触媒性トライアッドを構成する活性部位残基であるところのプロテアーゼドメインを示すアミノ酸（すなわち、ペプチダーゼユニット）についても示す。相互作用は動的であるため、示されたアミノ酸位置は参照および例示のためのものである。示された位置は、２、３、４、５またはそれ以上のアミノ酸の遺伝子座の範囲を反映する。また、対立遺伝子変異型および種変異型間に変形も存在する。当業者であれば、視覚的比較または容易に利用できるアルゴリズムおよびソフトウェアを含む他の比較法により対応する配列を同定できるはずである。
選択用の候補プロテアーゼは、典型的には野生型または野生型候補プロテアーゼの修飾または変異型形態、またはその触媒活性部分、例えばいずれかのタンパク質の対立遺伝子変異型およびイソ型などである。候補プロテアーゼは、天然供給源からの単離、細胞、組織および生物体で製造された遺伝子組み換えタンパク質の単離を含む当業界で公知の方法、および遺伝子組換え方法およびインシリコ(in silico)段階を含む方法、合成方法および当業者に公知の方法により製造または単離され得る。選択用候補プロテアーゼの修飾は、例えば下記に示した方法などの当業者に公知の方法により行われ得る。
表７：例示的候補プロテアーゼ
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ａ．プロテアーゼの分類
プロテアーゼ（プロテイナーゼまたはペプチダーゼとも称す）は、標的タンパク質内におけるアミノ酸またはポリペプチド基質の配列を認識するタンパク質分解酵素である。アミノ酸の基質配列を認識すると、プロテアーゼは、標的タンパク質内のペプチド結合の加水分解または開裂を触媒する。標的タンパク質の上記加水分解は、標的配列の完全長配列状況内でのペプチド結合の場所によって異なるが、標的を不活化または場合によっては活性化し得る。
プロテアーゼは、それらがタンパク質を攻撃する過程に基づいて、エキソ−またはエンド−プロテアーゼに分類される。プロテイナーゼまたはエンドペプチダーゼは、タンパク質の内側を攻撃して大きなペプチドを生じさせる。ペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼは、タンパク質の端部またはフラグメントを攻撃して、小さなペプチドまたはアミノ酸を生じさせる。ペプチダーゼはそれらの作用パターンに基づいて分類される：アミノペプチダーゼはアミノ末端からアミノ酸を開裂する：カルボキシペプチダーゼは、カルボキシル末端からアミノ酸を開裂し、ジペプチジルペプチダーゼは２つのアミノ酸を開裂する；ジペプチダーゼは、ジペプチドを脱離し、トリペプチダーゼは、トリペプチドからアミノ酸を開裂する。ほとんどのプロテアーゼは、２１０００〜４５０００ダルトンと小さい。多くのプロテアーゼは、合成され、チモーゲンと呼ばれる不活性形態として分泌され、それに続いてタンパク質分解により活性化される。これにより酵素の活性部位の構造は変化する。
プロテアーゼは、幾つかの異なるタイプの触媒機構を用いる（Barret et al.（１９９４）Meth. Enzymol．２４４：１８−６１；Barret et al.（１９９４）Meth. Enzymol. ２４４：４６１−４８６；Barret et al.（１９９４）Meth. Enzymol. ２４８：１０５−１２０；Barret et al.（１９９４）Meth. Enzymol.２４８：１８３−２２８）。それらの触媒機構に基づくと、カルボキシペプチダーゼは、セリン−、メタロおよびシステイン−型カルボキシペプチダーゼに細別され、エンドペプチダーゼは、セリン−、システイン−、アスパルティック−、トレオニン−およびメタロエンドペプチダーゼに細別される。セリンペプチダーゼは、活性中心に含まれるセリン残基を有し、アスパルティックは触媒中心に２個のアスパラギン酸を有し、システイン型ペプチダーゼは、システイン残基を有し、トレオニン型ペプチダーゼは、トレオニン残基を有し、メタロペプチダーゼは、触媒機構で金属イオンを使用する。一般的に、プロテアーゼはそれらの触媒活性に基づいて分類され得るため、プロテアーゼのクラスはセリン、システイン、アスパルティック、トレオニンまたはメタロプロテアーゼを含み得る。プロテアーゼの触媒活性は、標的基質の開裂に必要とされる。このため、プロテアーゼの修飾によるプロテアーゼの触媒活性の改変は、特定基質を開裂するプロテアーゼの能力に影響を及ぼし（すなわち、特異性／選択性を修飾し）得る。
各プロテアーゼは、活性部位ポケットの内側をおおい、基質と直接接触する一連のアミノ酸を有する。ペプチダーゼの結晶学的構造は、活性部位が一般に隣接構造ドメイン間の分子の表面上の溝に位置していることを示しており、基質特異性は、容易に開裂できる結合の加水分解に関与する触媒部位の片側または両側にある溝に沿って配置された結合部位の特性により定められる。したがって、ペプチダーゼの特異性は、各サブサイトが単一アミノ酸残基の側鎖と適応する能力により説明される。触媒部位から基質のＮ−末端に向かってＳ１、Ｓ２...Ｓｎ、およびＣ−末端に向かってＳ１'、Ｓ２'...Ｓｎ'と部位には番号を付す。それらが適応する残基には、それぞれＰ１、Ｐ２...Ｐｎ、およびＰ１'、Ｐ２'...Ｐｎ'と番号を付す。標的タンパク質の開裂はＰ１とＰ１'の間で触媒され、そこではポリペプチド基質のＮ末端からＣ末端までのアミノ酸残基が（Ｐｉ、...、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１'、Ｐ２'、Ｐ３'、...、Ｐｊ）と標識されており、プロテアーゼにおけるそれらの対応する結合性認識ポケットが（Ｓｉ、...、Ｓ３、Ｓ２、Ｓ１、Ｓ１'、Ｓ２'、Ｓ３'、...、Ｓｊ）と標識されている（Schecter および Berger（１９６７）Biochem Biophys Res Commun ２７：１５７−１６２）。すなわち、Ｐ２はＳ２と、Ｐ１はＳ１と、Ｐ１'はＳ１'といった形で相互作用する。したがって、プロテアーゼの基質特異性は、活性部位におけるＳ１〜Ｓ４位から生じ、そこではプロテアーゼがペプチド基質配列のＰ１〜Ｐ４残基と接触している。中には、活性部位のＳ１〜Ｓ４ポケット間で相互作用が（あるとしても）ほとんど起こらない場合もあり、その結果、各ポケットは、他のポケットとは独立してペプチド基質配列における対応する残基を認識し、結合すると思われる。すなわち、特異性決定因子は、他のポケットの特異性に影響することなく一つのポケットで変えられ得る。ファミリーメンバーの多様な構造およびモデリングに基づき、広範な基質特異性および基質との他の二次相互作用の一因となる表面残基は、セリン、システイン、アスパルティック、メタロ−およびトレオニンファミリーのプロテアーゼを含む多くのプロテアーゼについて特定されている（例えば、Wang et al.（２００１）Biochemistry ４０（３４）：１００３８−４６；Hopfner et al.（１９９９）Structure Fold Des. ７（８）：９８９−９６；Friedrich et al.（２００２）J Biol Chem. ２７７（３）：２１６０−８；Waugh et al.（２０００）Nat Struct Biol. ７（９）：７６２−５；Cameron et al.（１９９３）J Biol Chem. ２６８：１１７１１；Cameron et al.（１９９４）J Biol Chem. ２６９：１１１７０参照）。
ｉ．セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼ（ＳＰ）は、分泌酵素および細胞質貯蔵オルガネラで封鎖された酵素を含み、血液凝固、創傷治癒、消化、免疫応答および腫瘍浸潤および転移を含め様々な生理学的役割を有する。例えば、キモトリプシン、トリプシンおよびエラスターゼは消化管で機能し、因子１０、因子１１、トロンビンおよびプラスミンは血餅形成および創傷治癒に関与し、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓおよびＣ３変換酵素は、補体活性化においてある一定の役割を演じる。
II型貫膜セリンプロテアーゼと命名された細胞表面タンパク質の１種は、細胞外ドメインを伴う膜固定タンパク質であるプロテアーゼである。細胞表面タンパク質として、それらは細胞内シグナル変換および細胞表面タンパク質分解事象の伝達においてある一定の役割を演じる。他のセリンプロテアーゼも膜結合し、類似した形で機能する。他は分泌される。多くのセリンプロテアーゼは、細胞表面受容体へ結合したときにそれらの活性を発揮するため、細胞表面で作用する。細胞表面タンパク質分解は、様々な細胞機能を伝達する生物活性タンパク質を生成する機構である。
分泌および貫膜セリンプロテアーゼを含むセリンプロテアーゼは、新生物の発生および発達を含む過程に必然的に伴う。これらのプロテアーゼの正確な役割についてあまり詳述されたことはないが、セリンプロテアーゼおよびその阻害剤は、癌細胞浸潤および転移拡散における分解作用、腫瘍進行に関与する腫瘍の新生血管形成を含む多くの細胞内および細胞外生理学的過程の制御に関与している。プロテアーゼは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解およびリモデリングに関与し、組織リモデリングの一因となるため、癌浸潤および転移には必要である。若干のプロテアーゼの活性および／または発現は、腫瘍進行および発達と相関関係をなすことが示された。
セリンプロテアーゼの２０を超えるファミリー（Ｓ１〜Ｓ２７で示す）が同定されており、これらは、構造類似性および他の機能的証拠に基づいて６クラン（ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＥ、ＳＦおよびＳＧ）にグループ分けされる（Rawlings ND et al.（１９９４）Meth. Enzymol.２４４：１９〜６１）。幾つかのセリンプロテアーゼの反応機構には類似性がある。キモトリプシン、ズブチリシンおよびカルボキシペプチダーゼＣクランは、セリン、アスパラギン酸およびヒスチジンの触媒性トライアッドを共通して有する：セリンは求核基として、アスパラギン酸は求電子剤として、ヒスチジンは塩基としてそれぞれ作用する。触媒性残基の幾何的配向は、タンパク質折りたたみが異なるにもかかわらずファミリー間で類似している。触媒性残基の直線配列は、一般的にクラン関係を反映している。例えば、キモトリプシンクラン（ＳＡ）における触媒性トライアッドはＨＤＳとして整列し、ズブチリシンクラン（ＳＢ）ではＤＨＳおよびカルボキシペプチダーゼクラン（ＳＣ）ではＳＤＨとして並んでいる。
キモトリプシンスーパーファミリーのセリンプロテアーゼの例には、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、キモトリプシン、プラスミン、エラスターゼ、ウロキナーゼ（または尿型プラスミノーゲン活性化因子、ｕ−ＰＡ）、アクロシン、活性化プロテインC、Ｃ１エラスターゼ、カテプシンG、キマーゼ、およびカリクレイン、トロンビンおよび因子ＶIIａ、ＩＸａ、Ｘａ、ＸＩａおよびＸIIａを含む血液凝固カスケードのプロテアーゼがある（Barret,A.J.、Proteinase Inhibitors、Barrett,A.J.,et al.編、Elsevier、アムステルダム、３〜２２頁（１９８６）；Strassburger,W.et al.（１９８３）FEBS Lett.、１５７：２１９−２２３；Dayhoff,M.O.、Atlas of Protein Sequence and Structure、第５巻、National Biomedical Research Foundation、シルバースプリング、メリーランド（１９７２）およびRosenberg,R.D. et al.（１９８６）Hosp. Prac.、２１：１３１−１３７）。
セリンプロテアーゼファミリーにおけるプロテアーゼの活性は、それらの活性部位を形成する一連のアミノ酸残基により左右される。残基の一つは常にセリンであるため、セリンプロテアーゼと命名されている。例えば、キモトリプシン、トリプシンおよびエラスターゼは、類似構造を共有し、それらの活性セリン残基は、３つ全部において同じ位置（Ｓｅｒ−１９５）にある。それらの類似性にもかかわらず、それらは異なる基質特異性を有する。それらはタンパク質消化中に異なるペプチド結合を開裂する。例えば、キモトリプシンは、カルボニル炭素が開裂されるペプチド結合の一部である残基上の芳香族側鎖を好む。トリプシンは、この位置にある正に荷電したＬｙｓまたはＡｒｇ残基を好む。セリンプロテアーゼは、それらの基質認識特性が著しく異なる：高特異性のものがあれば（すなわち、血液凝固および免疫補体系に関与するプロテアーゼ）、部分的にしか特異性を示さないものもあり（すなわち、哺乳類消化酵素トリプシンおよびキモトリプシン）、その他細菌性プロテアーゼであるズブチリシンなどは完全に非特異的である。これらの特異性の差異にもかかわらず、セリンプロテアーゼの触媒機構は十分に保存されている。
セリンプロテアーゼによる標的タンパク質の開裂機構は、セリンによるターゲッティングされたペプチド結合の求核的攻撃に基づいている。システイン、トレオニンまたはアスパラギン酸に会合した水分子または金属もこの役割を演じ得る。多くの場合、基の求核特性は、アスパラギン酸により「プロトンアクセプター状態」に保たれた、ヒスチジンの存在により改善される。セリン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸の並列側鎖は、ほとんどのセリンプロテアーゼに共通した触媒性トライアッドを構築する。例えば、キモトリプシンおよびキモトリプシンと同じファミリーのメンバーであるセリンプロテアーゼの活性部位残基は、Ａｓｐ１０２、Ｈｉｓ５７およびＳｅｒ１９５である。
キモトリプシンスーパーファミリーの全セリンプロテアーゼの触媒性ドメインは、配列相同性および構造相同性の両方を有する。配列相同性は、１）特徴的な活性部位残基（例、トリプシンの場合におけるＳｅｒ１９５、Ｈｉｓ５７およびＡｓｐ１０２）；２）オキシアニオンホール（例、トリプシンの場合におけるＧｌｙ１９３、Ａｓｐ１９４）および３）構造中のジスルフィド架橋を形成するシステイン残基の保存性を含む（Hartley,B.S.（１９７４）Symp. Soc. Gen. Microbiol.、２４：１５２−１８２）。構造相同性は、１）２つのグリークキー構造を特徴とする共通の折りたたみ（Richardson,J.（１９８１）Adv. Prot. Chem.、３４：１６７−３３９）、２）触媒性残基の共通の配列、および３）分子のコア内における構造の細部保存（Stroud,R.M.（１９７４）Sci. Am.、２３１：２４−８８）を含む。
セリンプロテアーゼのキモトリプシンファミリー全体を通じて、基質と酵素間のバックボーン相互作用は完全に保存されているが、側鎖相互作用はかなり変化している。活性部位のＳ１〜Ｓ４ポケットを含むアミノ酸の同一性は、その特定ポケットの基質特異性を決定する。一セリンプロテアーゼから同じ折りたたみの別のセリンプロテアーゼへとアミノ酸をグラフトすることにより、一方から他方への特異性の修飾が行われる。典型的には、Ｓ１〜Ｓ４ポケットを含むプロテアーゼのアミノ酸は、基質の４〜５オングストローム内に側鎖を有するものである。これらのアミノ酸は直接プロテアーゼ基質と接触するため、それらと基質との相互作用は、一般に「第一殻」相互作用と呼ばれる。しかしながら、最終的には第一殻アミノ酸を配置させる「第二殻」および「第三殻」相互作用もあり得る。第一殻および第二殻基質結合効果は、主としてベータ−バレルドメイン間のループにより決定される。これらのループはタンパク質のコア要素ではないため、新規基質特異性をもつループ変異型が進化過程中に分子レベルでの必要な代謝的または調節的ニッチを満たすように選択され得る間も折りたたみの完全性は維持される。セリンプロテアーゼの場合典型的には、一次配列における以下のアミノ酸が特異性の決定因子である：キモトリプシンのナンバリングに基づくと、１９５、１０２、５７（触媒性トライアッド）；１８９、１９０、１９１、１９２および２２６（Ｓ１）；５７、５８と６４の間のループ、および９９（Ｓ２）；１９２、２１７、２１８（Ｓ３）；Ｃｙｓ１６８とＣｙｓ１８０の間のループ、２１５、および９７〜１００（Ｓ４）；および４１および１５１（Ｓ２'）であり、Ｓ１位のアミノ酸はＰ１特異性に影響を及ぼし、Ｓ２位のアミノ酸はＰ２特異性に影響を及ぼし、Ｓ３位のアミノ酸はＰ３特異性に影響を及ぼし、Ｓ４位のアミノ酸はＰ４特異性に影響を及ぼす。セリンプロテアーゼにおける１８９位は、Ｓ１特異性を決定するポケットの底部に埋没された残基である。様々なセリンプロテアーゼに関する構造決定因子について、成熟キモトリプシンのナンバリングに基づいて番号付しながら表８に列挙しており、示されたプロテアーゼのそれぞれについてのプロテアーゼドメインをキモトリプシンのプロテアーゼドメインのものと並列させている。Ｃｙｓ１６８〜Ｃｙｓ１８２および６０のループの縦列の標題下部の番号は、２つのアミノ酸間のループおよび６０のループにおけるアミノ酸の数を示す。Ｃｙｓ１９１〜Ｃｙｓ２２０の縦欄標題の下の有／無という表示は、ジスルフィド結合がプロテアーゼに存在するか否かを示す。これらの領域は、キモトリプシン様セリンプロテアーゼのファミリー内において変わり得るものであり、本質的に構造決定因子を表す。Ｓ１〜Ｓ４ポケットにおけるアミノ酸のいずれか１つまたはそれ以上を改変するためのプロテアーゼの修飾は、標的基質に関するプロテアーゼの特異性または選択性に影響を及ぼす。
表８：様々なセリンプロテアーゼに関する構造決定因子
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（ａ）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ、尿中プラスミノーゲン活性化因子とも呼ばれる）は、本発明方法での選択用候補として使用される典型的プロテアーゼである。ｕ−ＰＡは、配列番号１９０に示されており、配列番号１９１に示した前駆体アミノ酸配列をコード化する。ｕ−ＰＡは、尿、血液、精液および多くの癌組織から見出される。それは、プラスミノーゲンからプラスミンへのその変換に関連付けられる様々な生物学的過程に関与しており、それ自体セリンプロテアーゼである。プラスミンは、例えば、細胞移動、およびフィブリン、フィブロネクチン、プロテオグリカンおよびラミニンを含む様々な分子のその開裂を通した組織破壊を含む様々な正常および病理学的過程においてある一定の役割を演じる。ｕ−ＰＡは、創傷治癒中の組織リモデリング、炎症性細胞移動、新生血管形成および腫瘍細胞浸潤にも関与している。ｕ−ＰＡはまた、限定されるわけではないが、肝細胞増殖因子／散乱因子（ＨＧＦ／ＳＦ）、膜１型マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＴ−ＳＰ１）の潜在形態などを含む他の基質を開裂および活性化する。
ｕ−ＰＡの成熟形態は４１１残基タンパク質（２０アミノ酸シグナルペプチドを含む前駆体形態である、配列番号１９１に示したアミノ酸配列におけるアミノ酸残基２１〜４３１に対応する）である。ｕ−ＰＡは３つのドメインを含む：セリンプロテアーゼドメイン、クリングルドメインおよび増殖因子ドメイン。ヒトｕ−ＰＡの成熟形態では、アミノ酸１〜１５８は、増殖因子ドメイン（アミノ酸１〜４９）、クリングルドメイン（アミノ酸５０〜１３１）およびドメイン間リンカー領域（アミノ酸１３２〜１５８）を含むＮ−末端Ａ鎖を表す。アミノ酸１５９〜４１１は、Ｃ−末端セリンプロテアーゼドメインまたはＢ鎖を表す。ｕ−ＰＡは、１本鎖チモーゲン分子として合成および分泌され、例えば、プラスミン、カリクレイン、カテプシンＢ、および神経増殖因子−ガンマを含む様々なプロテアーゼにより活性２本鎖ｕ−ＰＡに変換される。２本鎖形態への開裂は、成熟ｕ−ＰＡ配列における残基１５８と１５９の間で行われる（配列番号１９１におけるアミノ酸残基１７８および１７９に対応する）。生成した２本の鎖は、ジスルフィド結合によりまとめられて、ｕ−ＰＡの２本鎖形態を形成する。
ｕ−ＰＡは、高親和力細胞表面受容体、ｕＰＡＲへの結合により調節される。ｕＰＡＲへのｕ−ＰＡの結合は、プラスミノーゲン活性化速度を高め、細胞外マトリックス分解および細胞浸潤を促進する。ｕＰＡＲおよびｕ−ＰＡ間で形成されるバイナリー複合体は、膜会合プラスミノーゲンと相互作用することにより、プラスミノーゲン活性化についてのＫｍ（すなわち、基質に関するほぼ正確な親和力の速度論的速度定数）を低下させる高次活性化複合体を形成する（Bass et al.（２００２）Biochem. Soc. Trans.、３０：１８９−１９４）。さらに、ｕＰＡＲへのｕ−ＰＡの結合により、プロテアーゼは同族体阻害剤、すなわちＰＡＩ−１による阻害から防護される。これは、通常血漿に存在する１本鎖ｕ−ＰＡはＰＡＩ−１による阻害に感受性を示さないためで、血漿中の活性ｕ−ＰＡはＰＡＩ−１により阻害される。受容体結合している活性ｕ−ＰＡは、ＰＡＩ−１による阻害について十分に有効であるが、ＰＡＩ−１は、結合した活性分子に接近できない（Bass et al.（２００２）Biochem. Soc. Trans.、３０：１８９−１９４）。結果的に、ｕ−ＰＡは、主として細胞表面で機能し、その機能はプラスミン依存的細胞周囲タンパク質分解の活性化と相関関係を示す。
ｕ−ＰＡおよびｔ−ＰＡ（下記で検討）の広範な基質特異性は、両方ともプラスミノーゲンから活性プラスミンへの開裂に関与しているとう事実により類似している。ｕ−ＰＡおよびｔ−ＰＡは両方とも、Ｐ１ Ａｒｇ後の開裂について高い特異性を有し、それらはＰ２位での小アミノ酸への優先を同様に示す。Ｐ３およびＰ４の両位置は、ｕ−ＰＡおよびｔ−ＰＡの基質に関する特異性決定因子であり、Ｐ３位が特に顕著な役割を担う（Ke et al.（１９９７）J. Biol. Chem.、２７２：１６６０３−１６６０９）。Ｐ３位のアミノ酸が優先されているのは明確であり、２種のプロテアーゼ間における改変された基質の識別に関する主要決定因子である。ｔ−ＰＡは、Ｐ３位にある芳香族アミノ酸（ＰｈｅおよびＴｙｒ）を優先し、ｕ−ＰＡは、小極性アミノ酸（ＴｈｒおよびＳｅｒ）を優先する（例えば、Ke et al.（１９９７）J. Biol. Chem.、２７２：１６６０３−１６６０９；Harris et al.（２０００）PNAS、９７：７７５４−７７５９参照）。
（ｂ）組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）
また本発明方法でのプロテアーゼトラップに対する選択用の候補プロテアーゼは、代表的なセリンプロテアーゼ組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）およびその変異型を含む。ｔ−ＰＡは、プラスミノーゲンをプラスミンへ変換するセリンプロテアーゼであり、フィブリン溶解または血餅の形成に関与している。組換えｔ−ＰＡは、例えば卒中などの血餅を特徴とする疾患での治療薬として使用される。ｔ−ＰＡ遺伝子のオルターナティブスプライシングにより３つの転写物が生成される。優勢な転写物は配列番号１９２に示したもので、２０〜２３のアミノ酸シグナル配列および１２〜１５のアミノ酸プロ配列を含む配列番号１９３に示した前駆体タンパク質をコード化する。他の転写物は配列番号１９４および１９６に示されており、それぞれ配列番号１９５および１９７に示したアミノ酸配列を有する前駆体タンパク質をコード化する。ｔ−ＰＡの成熟配列はシグナル配列およびプロペプチド配列を欠いており、５２７アミノ酸である。
ｔ−ＰＡは血管内皮により分泌され、１本鎖形態として血液中で循環する。多くの他のセリンプロテアーゼとは異なり、ｔ−ＰＡの１本鎖または「プロ酵素」形態は、高い触媒有効性を有する。ｔ−ＰＡの活性はフィブリンの存在下で高められる。フィブリンが存在しない場合、１本鎖ｔ−ＰＡは、２本鎖ｔ−ＰＡと比べて約８％の活性しか示さないが、フィブリンの存在下ではｔ−ＰＡの１本および２本鎖形態は類似した活性を示す。（Strandberg et al.（１９９５）J. Biol. Chem.、２７０：２３４４４−２３４４９）。すなわち、１本鎖ｔ−ＰＡの活性化は、活性化開裂（すなわち、チモーゲン開裂）により２本鎖形態を生じさせるか、補因子フィブリンに結合することにより達成され得る。活性化開裂は、アミノ酸Ａｒｇ２７５〜Ｉｌｅ２７６位（配列番号１９３に示したアミノ酸配列におけるＡｒｇ３１０〜Ｉｌｅ３１１に対応する）にあるプラスミン、組織カリクレインおよび活性化因子Ｘによる開裂後に行われ、ｔ−ＰＡの活性２本鎖形態を生じさせる。２本鎖ポリペプチドは、鎖間ジスルフィド結合により連結されたＡおよびＢ鎖を含む。
成熟ｔ−ＰＡは、１６のジスルフィド架橋を含み、５つの異なるドメインに組織化される（Gething et al.（１９８８）、The EMBO J.、７：２７３１−２７４０）。成熟タンパク質の残基４〜５０は、フィンガードメインを形成し、残基５１〜８７はＥＧＦ様ドメインを形成し、残基８８〜１７５および１７６〜２６３は、３つのドメイン内ジスルフィド結合をそれぞれ含む２つのクリングルドメインを形成し、成熟分子の残基２７７〜５２７（配列番号１９３に示した前駆体配列のアミノ酸残基３１１〜５６２に対応する）はセリンプロテアーゼドメインを構成する。
細胞性受容体結合活性化因子として作用するｕ−ＰＡとは対照的に、ｔ−ＰＡは、フィブリン依存的循環活性化酵素として機能する。同様に、ｔ−ＰＡの１本および２本鎖形態は、両方ともそれらの同族体阻害剤、例えばＰＡＩ−１による阻害を受けやすいが、２本鎖ｔ−ＰＡは、１本鎖ｔ−ＰＡよりも約１.４倍速くＰＡＩ−１により阻害される（Tachias et al.（１９９７）J Biol. Chem.、２７２：１４５８０−５）。ｔ−ＰＡは、内皮細胞におけるその細胞性結合部位アネキシンIIに結合することにより阻害から防御され得る。すなわち、ｔ−ＰＡおよびｕ−ＰＡは両方ともプラスミノーゲンを開裂および活性化するが、血中におけるｔ−ＰＡの作用は、プラスミノーゲンの主たるフィブリン溶解活性化因子としてｔ−ＰＡを維持し、ｕ−ＰＡはプラスミノーゲンの主たる細胞活性化因子である。
（ｃ）ＭＴ−ＳＰ１
膜型セリンプロテアーゼＭＴ−ＳＰ１（マトリプターゼ、ＴＡＤＧ−１５とも呼ばれる、腫瘍形成性サプレッサー１４、ＳＴ１4）は、所望の、または予め定められた開裂配列に対して基質特異性が改変された変異型を選択するための本発明方法での選択を目的とする代表的プロテアーゼである。ＭＴ−ＳＰ１の配列は、配列番号２５２に示したものであり、配列番号２５３に示したアミノ酸配列を有する８５５アミノ酸ポリペプチドをコード化する。それは、Ｃ−末端セリンプロテイナーゼドメインをもつマルチドメインプロテイナーゼである（Friedrich et al.（２００２）J Biol. Chem.、２７７（３）：２１６０）。プロテアーゼの６８３アミノ酸変異型は単離されたが、このタンパク質は切頂型形態またはエクトドメイン形態であると思われる。
ＭＴ−ＳＰ１は、前立腺、胸部および結腸直腸癌において高度に発現されるかまたは活性を示し、また乳癌および前立腺癌の転移においてある一定の役割を演じ得る。ＭＴ−ＳＰ１はまた、ヒト消化管および前立腺における高度の活性および／または発現を伴い様々な上皮組織で発現される。ＭＴ−ＳＰ１の他の種類も公知である。例えば、ＭＴ−ＳＰ１のマウス相同体が同定されており、エピシンと呼ばれる。
ＭＴ−ＳＰ１は、配列番号２５３に示された配列におけるアミノ酸６１５〜８５４（または文献中の変形によっては６１５〜８５５）間に貫膜ドメイン、２つのＣＵＢドメイン、４つのＬＤＬＲ反復、およびセリンプロテアーゼドメイン（またはペプチダーゼＳ１ドメイン、Ｂ−鎖とも呼ばれる）を含む。プロテアーゼドメインのアミノ酸配列は配列番号５０５に示されており、配列番号５０４に示した核酸配列によりコード化される。ＭＴ−ＳＰ１は、チモーゲンとして合成され、開裂により二重鎖形態に活性化される。さらに、１本鎖タンパク質分解性ドメインのみが触媒活性および機能性を示す。
キモトリプシンのナンバリングに基づき、配列番号２５３または５０５に示したＭＴ−ＳＰ１の野生型配列に対応するＣ１２２Ｓの突然変異を有する、ＣＢ４６９と呼ばれるＭＴ−ＳＰ１変異型は、ファージミドベクターで改善されたディスプレーを呈する。上記の変異型ＭＴ−ＳＰ１は、配列番号５１５（完全長ＭＴ−ＳＰ１）または配列番号５０７（プロテアーゼドメイン）に示されており、下記の本発明方法で使用され得る。
ＭＴ−ＳＰ１は、キモトリプシンおよびトリプシンも包含するセリンプロテアーゼのペプチダーゼＳ１ファミリー（キモトリプシンファミリーとも称される）に属する。一般的に、キモトリプシンファミリーメンバーは、キモトリプシンと配列および構造相同性を共有する。ＭＴ−ＳＰ１については、成熟キモトリプシンのナンバリングにしたがって本明細書では番号付しており、そのプロテアーゼドメインをキモトリプシンのプロテアーゼドメインのそれと並列させ、その残基をそれに応じてナンバリングしている。キモトリプシンのナンバリングに基づくと、活性部位残基はＡｓｐ１０２、Ｈｉｓ５７およびＳｅｒ１９５（配列番号２５３のＡｓｐ７１１、Ｈｉｓ６５６およびＳｅｒ８０５に対応する）である。線状アミノ酸配列をキモトリプシンの同配列と並列させ、キモトリプシンのβシートにしたがってナンバリングし得る。挿入および欠失は、ベータシート間のループで行われるが、構造的ファミリー全体を通じて、コアシートは保存される。セリンプロテアーゼは、保存ベータシートの形で基質と相互作用する。６個以下の保存水素結合が、基質と酵素の間で行われ得る。キモトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼは全て、触媒活性に必要であるプロテアーゼドメインのそれらのＮ−末端に保存領域を有する（すなわち、IIＧＧ、ＶＶＧＧまたはＩＶＧＧ、この４つ組における最初のアミノ酸をキモトリプシンのナンバリングに従って番号付し、Ｉｌｅ１６の名称を与える。このナンバリングは前駆体配列の長さを反映するものではない）。
プロテアーゼドメインにおけるＭＴ−ＳＰ１の基質特異性は、ポジショナルスキャン合成コンビナトリアルライブラリーおよび基質ファージディスプレーを用いてマッピングされている（Takeuchi et al.（２０００）J Biol Chem ２７５：２６３３３）。ＭＴ−ＳＰ１により認識された基質における開裂残基は、Ｐ４にＡｒｇ／ＬｙｓおよびＰ３に塩基性残基またはＧｌｎ、Ｐ２に小残基、Ｐ１にＡｒｇまたはＬｙｓ、およびＰ１'にＡｌａを含む。有効な基質は、Ｐ４〜Ｐ１部位にそれぞれＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇを含む。一般に、ＭＴ−ＳＰ１についての基質特異性は一つの傾向を見せており、それによると、Ｐ３が塩基性である場合Ｐ４は非塩基性である傾向があり、Ｐ４が塩基性であるならＰ３は非塩基性である傾向を示す。例えば、プロテイナーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ−２）、１本鎖ｕＰＡ（ｓｃ−ｕＰＡ）、ＭＴ−ＳＰ１のプロ形態および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含むＭＴ−ＳＰ１に関する公知基質は、ＭＴ−ＳＰ１特異基質に関する開裂配列に適合する。
ＭＴ−ＳＰ１は、選択された合成基質をトリプシンと同じくらい有効に開裂するが、トリプシンよりも基質に関して制限された特異性を呈し得る。ＭＴ−ＳＰ１の触媒性ドメインは、（キモ）トリプシン様セリンプロテアーゼの全体的な構造的折りたたみを有するが、疎水性／酸性Ｓ２／Ｓ４サブサイトおよび露出した６０ループなど独特の特性を示す。同様に、ＭＴ−ＳＰ１は、接近し易いＬｙｓまたはＡｒｇ残基にあるペプチド基質を無差別に開裂することはないが、容易に開裂できるペプチド結合周囲のさらなる残基の認識を必要とする。広範な一次配列に関する必要条件は、ＭＴ−ＳＰ１のその基質に関する特異性を強調している。例えば、ＭＴ−ＳＰ１は、プロテイナーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ−２）（Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＡｒｇのＰ４〜Ｐ１標的配列を示す）を開裂するが、この酵素が、容易に開裂できる結合付近の広範なＭＴ−ＳＰ１特異性と適合する標的配列を示さないＰＡＲ−１、ＰＡＲ−３およびＰＡＲ−４などこの基質に密接に関連したタンパク質を活性化することはない（Friedrich et al.（２００２）J Biol Chem ２７７：２１６０参照）。
ＭＴ−ＳＰ１のプロテアーゼドメインは、プロ領域および触媒性ドメインにより構成される。このポリペプチドの触媒活性部分は、成熟タンパク質のアミノ酸残基６１１にある自動活性化部位の後から始まる（例えば、ＲＱＡＲにある配列番号２５３、次いで残基ＶＶＧＧ参照）。ＭＴ−ＳＰ１とトリプシンのＳ１ポケットは、ＬｙｓおよびＡｒｇ Ｐ１残基について良好な相補性をもつという点で類似していることから、トリプシンによる基質開裂におけるある程度の類似性も説明される。Ｐ１−Ｌｙｓ残基の適応は、側鎖が追加的水素結合アクセプターを提供することにより、埋没したα−アンモニウム基を安定化させるＳｅｒ１９０により伝達される（Friedrich et al.（２００２）J Biol Chem ２７７：２１６０参照）。Ｓ２ポケットは、Ｐ２アミノ酸の小〜中程度の大きさの疎水性側鎖と適応する形状をしており、一般的にＰ２位での広い範囲のアミノ酸を受け入れる。基質結合時、Ｐｈｅ９９ベンジル基の回転により証明されたところによると、Ｓ２サブサイトはそれほど堅固ではない。Ｐ３位（Ｇｌｎまたは塩基性残基の場合）および４位（ＡｒｇまたはＬｙｓ残基の場合）の基質アミノ酸は、酵素活性部位クレフトに近づくにつれて特異的塩基性ペプチド基質を有利に前配向させ得るＡｓｐ−２１７および／またはＡｓｐ−９６の酸性側鎖とのＳ３およびＳ４ポケットにおける静電気相互作用が介在すると思われる。Ｐ３残基の側鎖はまた、Ｇｌｎ１９２のカルボキサミド基と水素結合を形成し得るか、または別法として、Ｐ３側鎖は、Ｓ４サブサイト中へ伸長してＰｈｅ９７と水素結合を形成することにより、Ｇｌｙ２１６との主鎖間水素結合を弱体化させ得る。いずれの立体配座でも、塩基性Ｐ３側鎖は、ＭＴ−ＳＰ１ Ｓ４ポケットの負のポテンシャルと有利に相互作用することができる。同じＳ４部位からの相互電荷補償および排除は、良好なＭＴ−ＳＰ１基質においてＰ３およびＰ４にＡｒｇ／Ｌｙｓ残基が同時に存在する確率が低いことを説明している。一般的に、基質結合性に関する拡張した特異性の一因であるＭＴ−ＳＰ１のアミノ酸位置（キモトリプシンナンバリングに基づく）は以下のものを含む：１４６および１５１（Ｓ１'）；１８９、１９０、１９１、１９２、２１６、２２６（Ｓ１）；５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、９９（Ｓ２）；１９２、２１７、２１８、１４６（Ｓ３）；９６、９７、９８、９９、１００、１６８、１６９、１７０、１７０Ａ、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７８、１７９、１８０、２１５、２１７、２２４（Ｓ４）。
ii）システインプロテアーゼ
システインプロテアーゼは、システインスルフヒドリル基を含む触媒機構を有する。近接ヒスチジン残基によるシステインスルフヒドリルの脱プロトン化の後、ペプチドカルボニル炭素でシステインの求核攻撃が始まる。新たなカルボキシ末端をシステインチオールに結合するチオエーテルは、反応の中間体（セリンプロテアーゼのアシル−酵素中間体に匹敵する）である。システインプロテアーゼは、パパイン、カテプシン、カスパーゼおよびカルパインを含む。
パパイン様システインプロテアーゼは、パパインとの構造的類似性により関連したチオール依存的エンドペプチダーゼのファミリーである。それらは、ＲおよびＬ（右および左のこと）と標識されたドメインとの２ドメインタンパク質を形成し、両ドメインからのループは基質認識クレフトを形成する。それらは、アミノ酸Ｃｙｓ２５、Ｈｉｓ１５９およびＡｓｎ１７５により構成される触媒性トライアッドを有する。基質のベータ-シート立体配座に基づいた標的ペプチドを認識し、タンパク質分解するセリンプロテアーゼとは異なり、このファミリーのプロテアーゼは、基質認識について十分に特定されたポケットを有していない。主たる基質認識は、Ｐ２アミノ酸で行われる（セリンプロテアーゼにおけるＰ１残基とは異なる）。
若干のシステインプロテアーゼ（ヒトカテプシンＬ、Ｖ、Ｋ、Ｓ、Ｆ、Ｂ、パパインおよびクルザイン）の基質特異性は、完全多様性ポジショナルスキャン合成コンビナトリアルライブラリー（ＰＳ−ＳＣＬ）を用いて測定されている。完全ライブラリーはＰ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４テトラペプチド基質を含み、それらのうち一つの位置が固定されており、他の三つの位置は２０の可能なアミノ酸の等モル混合物によりランダムに存在し、〜１６００００のテトラペプチド配列という全体的多様性を与えている。
全般的に、Ｐ１特異性は、カテプシン間ではほぼ同一であり、ＡｒｇおよびＬｙｓは非常に有利であり、小脂肪族アミノ酸は許容される。選択性の多くはＰ２位置から見出され、ヒトカテプシンは疎水性アミノ酸について厳密に選択的である。興味深いことに、疎水性残基についてのＰ２特異性は、芳香族アミノ酸、例えばＰｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ（カテプシンＬ、Ｖ）および巨大脂肪族アミノ酸、例えばＶａｌまたはＬｅｕ（カテプシンＫ、Ｓ、Ｆ）間に分割される。Ｐ２位と比べると、Ｐ３位での選択性は、著しくストリンジェンシーが低い。しかしながら、プロテアーゼの幾つかは、プロリン（カテプシンＶ、Ｓおよびパパイン）、ロイシン（カテプシンＢ）、またはアルギニン（カテプシンＳ、クルザイン）に対して明確な好みを示す。あるアミノ酸が他よりも優先的に選択されることはないため、プロテアーゼはＰ４位で拡張した特異性を示す。
Ｓ２ポケットは、プロテアーゼ基質認識部位の中でも最も選択性が高く、十分に特性確認されている。それは、以下の空間的位置にあるアミノ酸により特定される（パパインのナンバリング）：６６、６７、６８、１３３、１５７、１６０および２０５。２０５位は、特異性を決定するポケットの底部に埋没した残基である、セリンプロテアーゼにおける１８９位と類似した役割を演じる。他の特異性決定因子には以下のアミノ酸がある（パパインによるナンバリング）：６１および６６（Ｓ３）；１９、２０および１５８（Ｓ１）。様々なシステインプロテアーゼについての構造決定因子を表９に列挙する。典型的には、例えばパパインプロテアーゼなどのシステインプロテアーゼの修飾による、拡張特異性結合性ポケットまたは他の二次相互作用部位におけるアミノ酸のいずれか１つまたはそれ以上の改変は、補体タンパク質標的基質を含む標的基質に関するプロテアーゼの特異性または選択性に影響を及ぼす。
表９：様々なシステインプロテアーゼに関する構造決定因子
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Ｅ．スクリーニングに関する修飾プロテアーゼおよびコレクション
プロテアーゼまたはその変異型は、本発明では所望の基質特異性、多くの場合改変、改善または最適化された基質特異性をもつプロテアーゼの同定に使用され得る。本発明方法で使用する修飾プロテアーゼは、当業界で公知の方法を用いてプロテアーゼの１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより生成され得る（米国特許出願公開第２００４／０１４６９３８号参照）。本発明で提供される修飾用プロテアーゼおよび方法は、例えば、完全長野生型プロテアーゼ、プロテアーゼの公知変異型形態、または触媒活性、例えば基質のタンパク質分解に十分なものであるプロテアーゼのフラグメントを含む。上記修飾プロテアーゼは標的プロテアーゼトラップ、例えばセルピンまたは修飾セルピンに対して個々にスクリーニングされ得るか、またはそれらは、例えば、プロテアーゼのディスプレーが、例えばファージディスプレー、細胞表面ディスプレー、ビーズディスプレー、リボソームディスプレーなどにより行われるコンビナトリアルライブラリーを含むディスプレー・ライブラリーを用いることにより、コレクションとしてスクリーニングされ得る。安定した共有結合阻害性複合体の形成に起因する、プロテアーゼトラップまたはその修飾形態についての特異性および／または選択性を呈するプロテアーゼの選択は、限定されるわけではないが、アフィニティー標識および／または精製、ＥＬＩＳＡ、色素原検定法、蛍光に基づく検定法（例、蛍光クエンチングまたはＦＲＥＴ）などを含む当業者に公知の検出スキームにより容易にされ得る。
１．変異型プロテアーゼの生成
プロテアーゼ配列に突然変異を導入する方法の例には、配列全体にランダム突然変異を誘発する方法またはプロテアーゼ配列の選択領域またはドメインのフォーカス突然変異を誘発する方法がある。一例では、プロテアーゼに導入される突然変異の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。好ましい実施態様では、突然変異（複数も可）は高い基質特異性をもたらす。プロテアーゼ変異型の活性が、野生型プロテアーゼの活性に対して少なくとも１０倍、１００倍または１０００倍の割合で高められる例もある。関連した態様では、活性の増加は基質特異性に存する。
ａ．ランダム突然変異誘発
ランダム突然変異誘発方法には、例えば大腸菌（E.coli）ＸＬ１レッドの使用、ＵＶ照射、例えば脱アミノ化、アルキル化または塩基類似体突然変異原による化学的修飾、またはＰＣＲ方法、例えばＤＮＡシャッフル、カセット突然変異導入、位置指定ランダム突然変異導入、またはエラー・プローンＰＣＲがある（例、米国特許出願第２００６−０１１５８７４号参照）。上記の例には、限定されるわけではないが、ヒドロキシルアミンによる化学的修飾（Ruan, H., et al.（１９９７）Gene １８８：３５〜３９）、ｄＮＴＰ類似体の使用（Zaccolo, M., et al.（１９９６）J. Mol. Biol. ２５５：５８９−６０３）、または市販のランダム突然変異導入キット、例えば GeneMorph PCRベースランダム突然変異導入キット（Stratagene）またはDiversify ランダム突然変異導入キット（Clontech）の使用がある。Diversify ランダム突然変異導入キットは、反応混合物中におけるマンガン（Ｍｎ２＋）およびｄＧＴＰの量を変えることにより所与のＤＮＡ配列に関する所望の突然変異率（２〜８突然変異／１０００塩基対）の選択を可能にする。最初にマンガンレベルを上昇させると突然変異率は増加し、高濃度のｄＧＴＰによりさらに突然変異率は増加する。高率の突然変異率でも、追加ラウンドのＰＣＲを実施することにより達成可能である。
ｂ．フォーカス突然変異誘発
フォーカス突然変異は、遺伝子配列の予め定められた領域、例えば触媒活性を伝達するプロテアーゼドメインの領域に１つまたはそれ以上の突然変異を誘発することにより達成され得る。一例では、標準的単一または多位置指定突然変異導入キット、例えば QuikChange（Stratagene）を用いることにより、プロテアーゼのいずれか１つまたはそれ以上のアミノ酸に対し突然変異を誘発する。別の例では、飽和突然変異誘発（Zheng et al.（２００４）Nucl. Acids. Res.、３２：１１５）、例えば活性部位残基の突然変異誘発によりプロテアーゼのいずれか１つまたはそれ以上のアミノ酸に対し突然変異を誘発する。この例では、プロテアーゼのＳ１〜Ｓ４ポケットを形成し（この場合、プロテアーゼは、ペプチド基質のＰ１〜Ｐ４残基と接触している）、そして／または特異性の重要な決定因子であることが示された残基は、あらゆる可能なアミノ酸へと単独または組合わせて突然変異誘発される。中には、活性部位のＳ１〜Ｓ４ポケット間には相互作用は（あったとしても）ほとんど存在しない場合もあり、その結果、各ポケットは、他のポケットとは独立してペプチド基質配列上の対応する残基を認識し、結合すると思われる。すなわち、一般的に特異性決定因子は、他のポケットの特異性に影響することなく一ポケットで変えられ得る。一実施態様では、ポケットの内側を覆う残基（複数も可）を２０の可能なアミノ酸のそれぞれに突然変異させる飽和突然変異誘発技術を使用する（例えば、Kunkle method, Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc.、Media Pa.参照）。上記技術では、選択されたアミノ酸（複数も可）をコード化する所望のコドン（複数も可）でのヌクレオチドのランダム化を含む変性突然変異原性オリゴヌクレオチドプライマーが合成され得る。ランダム化スキームの例には、ＮＮＳ−またはＮＮＫ−ランダム化があり、この場合Ｎは任意のヌクレオチドを表し、Ｓはグアニンまたはシトシンを表し、Ｋはグアニンまたはチミンを表すものとする。変性突然変異原性プライマーを、１本鎖ＤＮＡ鋳型にアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼを加えることにより、鋳型の相補鎖を合成する。ライゲーション後、増幅させるため二重鎖ＤＮＡ鋳型を大腸菌（E.coli）に形質転換する。
本明細書では、典型的プロテアーゼの拡張基質結合性ポケットを形成するアミノ酸について記載する。一般的に、プロテアーゼの基質特異性は、例えば、プロテアーゼおよび基質の複合体の３次元構造に基づいた分子モデリングにより判明している（例えば、Wang et al.（２００１）Biochemistry ４０（３４）：１００３８；Hopfner et al.、Structure Fold Des. １９９９、７（８）：９８９；Friedrich et al.（２００２）J Biol Chem ２７７（３）：２１６０；Waugh et al.（２０００）Nat Struct Biol. ７（９）：７６２参照）。例えば、ＭＴ−ＳＰ１のフォーカス突然変異は、195, 102, 157 (触媒性トライアッド); 189, 190, 191, 192, 216 および 226 (S1); 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 99 (S2); 146, 192, 217, 218 (S3); 96, 97, 98, 99, 100, 168, 169, 170, 170A, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 178, 179, 180, 215, 217, 224 (S4)を含む基質特異性の一因となるいずれか１つまたはそれ以上の残基（キモトリプシンナンバリングに基づく）で誘発され得る。別の例では、パパインファミリープロテアーゼにおけるアミノ酸残基の突然変異は、６６〜６８、１３３、１５７、１６０および／または２１５を含むＰ２特異性に影響を及ぼすいずれか１つまたはそれ以上の残基（標準パパインナンバリング）で誘発され得る。さらに、プロテアーゼ基質と直接接触しないが、接触残基（例えば上記で列挙したもの）の位置および／または立体配座に影響を及ぼす残基についても、突然変異を誘発することによりプロテアーゼスカホールドの特異性を改変させ得る。
別の例において、突然変異誘発用に集中させるアミノ酸は、基質特異性が類似した相同性プロテアーゼの配列比較により選択され得る。共通アミノ酸残基は、相同性タンパク質のアミノ配列のアラインメント、例えば基質結合に関与するプロテアーゼ領域のアラインメントにより同定され得る。典型的には、基質特異性が類似したプロテアーゼは、共通アミノ酸を共有しており、例えば基質結合性ポケットのアミノ酸は、比較したプロテアーゼ間において同一または類似したものであり得る。さらに、基質特異性が異なるプロテアーゼのアミノ酸配列を比較することにより、基質認識に関与し得るアミノ酸が同定され得る。これらの方法を、三次元モデリングなどの方法と組み合わせることにより、突然変異誘発についての標的残基が同定され得る。
さらなる例において、フォーカス突然変異誘発は、プロテアーゼスクリーニングの初回ラウンドにおいてホットスポットとして同定されるアミノ酸に制限され得る。例えば、ランダム突然変異誘発コンビナトリアル・ライブラリーからのプロテアーゼの選択後、典型的には幾つかの「ホットスポット」が観察され、これらはスクリーニング方法で何度も選択される。非常に多くの場合、ランダム突然変異誘発はポリペプチド配列を広い範囲で突然変異させるが、各部位にはごく僅かの突然変異しか導入されていないため、さらなる突然変異導入を目的としてホットスポット位置を特異的にターゲッティングするための第２戦略としてフォーカス突然変異誘発法を用いる。ホットスポット位置でのフォーカス突然変異誘発により、ポリペプチド配列のランダム突然変異誘発後に起こる浅い突然変異誘発とは対照的に、特定位置でのさらに多様で根深い突然変異誘発が可能となる。例えば、飽和突然変異誘発は、例えばこれらの位置にＮＮｔ／ｇまたはＮＮｔ／ｃを含むオリゴを用いることにより、「ホットスポット」の突然変異誘発に使用され得る。一例では、本発明方法を用いることにより、以下のホットスポットが、高い基質特異性の一因になるものとしてｕ−ＰＡから同定された：キモトリプシンナンバリングに基づく７３、８０、３０および１５５。これらの位置の突然変異は、例えば、これらの部位の１つまたはそれ以上での野生型または鋳型プロテアーゼ配列の飽和突然変異誘発を用いて達成され、後続のスクリーニングで使用するプロテアーゼ突然変異体のコレクションが作成され得る。
２．変異型プロテアーゼのキメラ形態
本発明による変異型プロテアーゼは、キメラまたは融合タンパク質を含み得る。一例では、プロテアーゼ融合タンパク質は、プロテアーゼタンパク質の少なくとも１つの触媒活性部分を含む。別の例では、プロテアーゼ融合タンパク質は、プロテアーゼの少なくとも２つまたはそれ以上の触媒活性部分を含む。融合タンパク質内では、非プロテアーゼポリペプチドがプロテアーゼポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合され得る。一具体例では、融合タンパク質は、非プロテアーゼポリペプチドからプロテアーゼを分離する、可撓性ペプチドリンカーまたはスペーサーを含み得る。別の具体例では、融合タンパク質は、標識または検出可能なポリペプチドを含み得る。典型的な標識および検出可能なポリペプチドは、当業界では公知であり、例えば、限定されるわけではないが、ヒスチジン標識、血球凝集素標識、ｍｙｓ標識または蛍光性タンパク質が含まれる。さらに別の具体例では、融合タンパク質は、プロテアーゼ配列がＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＮ−末端に融合されているＧＳＴ-プロテアーゼ融合タンパク質である。上記融合タンパク質は、組換えプロテアーゼポリペプチドの精製を容易にし得る。別の具体例では、融合タンパク質は、プロテアーゼ配列が免疫グロブリンＧからのＦｃドメインのＮ−末端に融合されているＦｃ融合体である。上記融合タンパク質は、インビボで良好な薬物動力学的特性を有し得る。別の具体例では、融合タンパク質は、そのＮ−末端に異種シグナル配列を含むプロテアーゼタンパク質である。ある種の宿主細胞（すなわち哺乳類宿主細胞）では、プロテアーゼの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を通じて高められ得る。
プロテアーゼキメラまたは融合タンパク質は、標準的組換えＤＮＡ技術により製造され得る。例えば、種々のポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、慣用的技術にしたがって、例えばライゲーションに適した平滑末端またはスタッガー末端の使用、適切な末端を形成させるための制限酵素消化、適切な場合の粘着末端の補充、アルカリ性ホスファターゼ処理による望ましくない連結の回避、および酵素ライゲーションを用いることにより、枠内でライゲーションさせる。別の具体例では、自動ＤＮＡ合成装置を含む慣用的技術により、融合遺伝子を合成し得る。別法として、２つの連続した遺伝子フラグメント間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを用い、後続的に上記フラグメントをアニーリングおよび再増幅してキメラ遺伝子配列を生成させることにより、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を実施し得る（例えば、Ausubel et al.（編）CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、John Wiley & Sons（１９９２）参照）。さらに、既に融合部分をコード化する多くの発現ベクターが市販されている（例、ＧＳＴポリペプチド）。プロテアーゼをコード化する核酸を上記の発現ベクターにクローン化することにより、融合部分をプロテアーゼタンパク質と枠内で結合させる。
３．コンビナトリアル・ライブラリーおよび他のライブラリー
スクリーニング検定法用の化合物の供給源は、限定されるわけではないが、コンビナトリアル・ライブラリーを含むライブラリーなどのコレクションであり得る。コンビナトリアル・ライブラリーの合成方法および上記コンビナトリアル・ライブラリーの特徴は、当業界では公知である（一般的には、Combinatorial Libraries: Synthesis, Screening and Application Potential（Cortese編）Walter de Gruyter, Inc.、１９９５；Tietze およびLieb、Curr. Opin. Chem. Biol.、２（３）：３６３−７１（１９９８）；Lam、Anticancer Drug Des.、１２（３）：１４５−６７（１９９７）；Blaney および Martin、Curr. Opin. Chem. Biol.、１（１）：５４−９（１９９７）；および Schultz および Schultz、Biotechnol. Prog.、１２（６）：７２９−４３（１９９６）参照）。
プロテアーゼまたは酵素ライブラリー、例えばポジショナルスキャン合成コンビナトリアル・ライブラリー（ＰＳＳＣＬ）を含む多様なライブラリーを作製する方法および戦略は、分子生物学的方法および／または同時化学合成方法を用いて開発されてきた（例えば、Georgiou, et al.（１９９７）Nat. Biotechnol. １５：２９−３４；Kim et al.（２０００）Appl Environ Microbiol. ６６：７８８ ７９３；MacBeath,G.P. et al.（１９９８）Science ２７９：１９５８−１９６１；Soumillion,P.L. et al.（１９９４）Appl. Biochem. Biotechnol. ４７：１７５−１８９、Wang,C.I. et al.（１９９６）Methods Enzymol. ２６７：５２−６８、米国特許第６８６７０１０号、同第６１６８９１９号、米国特許出願第２００６−００２４２８９号参照）。作製されたコンビナトリアル・ライブラリーは、選択された活性を呈する化合物を同定するためスクリーニングにかけられ得る非常に多数の化合物を潜在的に含んでいる。
一例では、プロテアーゼのコレクションまたはライブラリーの成分を、ポリペプチド部分を表示し得る、限定されるわけではないが、例えばファージ、ウイルスまたは細菌などの複製可能なベクターを含む遺伝子パッケージで表示させ得る。複数の表示されたポリペプチドは、プロテアーゼまたはその触媒活性部分などのポリペプチドを標的ポリペプチドと結合および／または相互作用させ得る方法で遺伝子パッケージにより表示される。遺伝子パッケージの具体例には、限定されるわけではないが、バクテリオファージ（例えば、Clackson et al.25a/（１９９１）Making Antibody Fragments Using Phage Display Libraries、Nature、３５２：６２４−６２８；Glaser et al.（１９９２）Antibody Engineering by Condon-Based Mutagenesis in a Filamentous Phage Vector System、J. immunol.、１４９：３９０３ ３９１３；Hoogenboom et al.（１９９１）Multi-Subunit Protein on the Surface of Filamentous Phage: Methodologies for Displaying Antibody(Fate)Heavy and 30 Light Chains、Nucleic Acids Res.、１９：４１３３−４１３７０参照）、バキュロウイルス（例えば、Boublik et al.（１９９５）Eukaryotic Virus Display: Engineering the Major Surface Glycoprotein of the Autographa California Nuclear Polyhedrosis Virus（ACNPV）for the Presentation of Foreign Proteins on the Virus Surface、Bio/Technology、１３：１０７９−１０８４参照）、細菌および例えばファージ表示プロテアーゼなどのタンパク質表示に適切な他のベクターがある。例えば、興味の対象であるバクテリオファージには、限定されるわけではないが、Ｔ４ファージ、Ｍ１３ファージおよびＨＩファージがある。所望により、遺伝子パッケージを例えば細菌性宿主で増幅させてもよい。これらの遺伝子パッケージのいずれか、および当業者に公知の他のものも、プロテアーゼまたはその触媒活性部分を表示させるのに本発明方法で使用される。
ａ．ファージディスプレーライブラリー
スクリーニングを目的とする、変異型プロテアーゼまたはその触媒活性部分のライブラリーは、限定されるわけではないが、Ｍ１３、ｆｄ、ｆ１、Ｔ７およびλファージなどのバクテリオファージ表面で発現され得る（例えば、Santini（１９９８）J. Mol. Biol. ２８２：１２５−１３５；Rosenberg et al.（１９９６）Innovations ６：１−６；Houshmand et al.（１９９９）Anal Biochem ２６８：３６３−３７０、Zanghi et al.（２００５）Nuc. Acid Res. ３３（１８）e１６０：１−８参照）。変異型プロテアーゼは、共有結合、非共有結合または非ペプチド結合でバクテリオファージコートタンパク質に融合され得る。（例えば、米国特許第５２２３４０９号、Crameri et al.（１９９３）Gene １３７：６９および国際公開第０１／０５９５０号参照）。変異型プロテアーゼをコード化する核酸を、コートタンパク質をコード化する核酸と融合させてプロテアーゼ−コートタンパク質融合タンパク質を生成させ得、そこで変異型タンパク質がバクテリオファージの表面から発現される。例えば、変異型プロテアーゼをコード化する核酸は、繊維相Ｍ１３ Gene III（ｇIIIｐ；配列番号５１２）のＣ−末端ドメインをコード化する核酸に融合され得る。若干の例では、ファージ上での改善されたディスプレーを呈する突然変異体プロテアーゼを鋳型として用いることにより、本明細書記載の突然変異体ファージディスプレーライブラリーを作製する。例えば、実施例８の記載によると、キモトリプシンのナンバリングに基づいた野生型ＭＴ−ＳＰ１の１２２位に対応する位置におけるセリンからシステインへの突然変異を有する突然変異体ＭＴ−ＳＰ１は、改善されたファージディスプレーを呈する。このため、上記突然変異体は、ライブラリーでの多様性をもたらす鋳型として使用され得る。
さらに、融合タンパク質に可撓性ペプチドリンカーまたはスペーサー、標識または検出可能なポリペプチド、プロテアーゼ部位または追加のアミノ酸修飾を含ませることにより、融合タンパク質の発現および／または有用性が改善され得る。例えば、プロテアーゼ部位の付加により、選択手順後に所望のバクテリオファージが有効に回収され得る。典型的な標識および検出可能なタンパク質は、当業界では公知であり、例えば、限定されるわけではないが、ヒスチジン標識、血球凝集素標識、ｍｙｃ標識または蛍光生タンパク質が含まれる。別の例では、プロテアーゼ−コートタンパク質融合体をコード化する核酸を、リーダー配列と融合させることにより、ポリペプチドの発現性が改善され得る。リーダー配列の例としては、限定されるわけではないが、ＳＴIIまたはＯｍｐＡがある。ファージディスプレーは、例えば、Ladner et al.、米国特許第５２２３４０９号；Rodi et al.（２００２）Curr. Opin. Chem. Biol. ６：９２−９６；Smith（１９８５）Science ２２８：１３１５−１３１７；国際公開第９２／１８６１０号；国際公開第９１／１７２７１号；国際公開第９２／２０７９１号；国際公開第９２／１５６７９号；国際公開第９３／０１２８８号；国際公開第９２／０１０４７号；国際公開第９２／０９６９０号；国際公開第９２／０２８０９号；de Haard et al.（１９９９）J. Biol. Chem. ２７４：１８２１８−３０；Hoogenboom et al.（１９９８）Immunotechnology ４：１−２０；Hoogenboom et al.（２０００）Immunol Today ２：３７１−８；Fuchs et al.（１９９１）Bio/Technology ９：１３７０−１３７２；Hay et al.（１９９２）Hum Antibod Hybridomas ３：８１−８５；Huse et al.（１９８９）Science ２４６：１２７５−１２８１；Griffiths et al.（１９９３）EMBO J １２：７２５−７３４；Hawkins et al.（１９９２）J Mol Biol. ２２６：８８９−８９６；Clackson et al.（１９９１）Nature ３５２：６２４−６２８；Gram et al.（１９９２）PNAS ８９：３５７６−３５８０；Garrard et al.（１９９１）Bio/Technology ９：１３７３−１３７７；Rebar et al.（１９９６）Methods Enzymol. ２６７：１２９−４９；Hoogenboom et al.（１９９１）Nuc Acid Res １９：４１３３−４１３７；および Barbas et al.（１９９１）PNAS ８８：７９７８−７９８２に記載されている。
ファージディスプレーに適切な核酸、例えばファージベクターは、当業界では公知である（例えば、Andris-Widhopf et al.（２０００）J Immunol Methods、２８：１５９−８１；Armstrong et al.（１９９６）Academic Press、Kay et al.編、３５−５３頁；Corey et al.（１９９３）Gene １２８（１）：１２９−３４；Cwirla et al.（１９９０）Proc Natl Acad Sci USA ８７（１６）：６３７８−８２；Fowlkes et al.（１９９２）Biotechniques １３（３）：４２２−８；Hoogenboom et al.（１９９１）Nuc Acid Res １９（１５）：４１３３−７；McCafferty et al.（１９９０）Nature ３４８（６３０１）：５５２−４；McConnell et al.（１９９４）Gene １５１（１−２）：１１５−８；ScottおよびSmith（１９９０）Science ２４９（４９６７）：３８６−９０参照）。
プロテアーゼ−コートタンパク質融合タンパク質、典型的には上記要領で生成されるプロテアーゼ変異型をコード化する核酸のライブラリーは、バクテリオファージのゲノムに組み込まれるか、または別法としてファージミドベクターに挿入され得る。ファージミド系では、ディスプレータンパク質をコード化する核酸は、典型的には６０００未満のヌクレオチド長のファージミドベクターで提供される。ファージミドベクターはファージ複製起点を含むため、プラスミドをもつ細菌細胞がヘルパーファージ、例えばＭ１３Ｋ０１またはＭ１３ＶＣＳにより感染したとき、プラスミドはバクテリオファージの粒子中へ組み込まれる。しかしながら、ファージミドは十分なファージ遺伝子のセットを欠いているため、感染後に安定したファージ粒子を生産できない。これらのファージ遺伝子は、ヘルパーファージにより提供され得る。典型的には、ヘルパーファージは、遺伝子IIIコートタンパク質およびファージ複製および組立に必要とされる他のファージ遺伝子の無傷のコピーを提供する。ヘルパーファージは欠陥複製起点を有するため、ヘルパーファージゲノムは、野生型起源を有するプラスミドと比べてあまり効果的にはファージ粒子中へ組み込まれない。例えば、米国特許第５８２１０４７号参照。ファージミドゲノムは、ライブラリーのメンバーが感染している細胞の選択を目的として選択可能なマーカー遺伝子、例えばAmp.sup.RまたはKan.sup.R（それぞれ、アンピシリンまたはカナマイシン耐性に関する）を含む。
ファージディスプレーの別の例では、発現時に感染性ファージ粒子を製造するのに十分な一連のファージ遺伝子、ファージパッケージングシグナルおよび自律複製配列をコード化する核酸をもつベクターが使用され得る。例えば、ベクターは、ディスプレータンパク質をコード化する配列を含むように修飾されたファージゲノムであり得る。さらにファージディスプレーベクターは、外来核酸配列が挿入され得る部位、例えば制限酵素消化部位を含む多クローニング部位を含み得る。例えばファージベクターにおいてディスプレータンパク質をコード化する外来核酸配列は、リボソーム結合部位、シグナル配列（例、Ｍ１３シグナル配列）および転写ターミネーター配列に結合され得る。
ベクターは、プロテアーゼおよびファージコートタンパク質の一部分を含み、調節可能なプロモーターに機能し得るように結合されたポリペプチドをコード化する配列を含むように標準クローング技術により構築され得る。若干の例では、ファージディスプレーベクターは、ファージコートタンパク質の同じ領域をコード化する２つの核酸配列を含む。例えば、ベクターは、ディスプレータンパク質をコード化する配列に機能し得るように結合させた位置に上記領域をコード化する一配列を、そしてコートタンパク質をコード化する機能的ファージ遺伝子（例、野生型ファージ遺伝子）の状況において上記領域をコード化するもう一つの配列を含む。野生型および融合コートタンパク質の両方の発現は、一ファージ粒子につき製造される融合タンパク質の量を減らすことにより成熟ファージの生産を助け得る。上記方法は、融合タンパク質に対するファージの耐容性が低い状況において特に有用である。
ファージディスプレー系は、典型的には繊維状ファージ、例えばＭ１３、ｆｄおよびｆ１を利用する。繊維状ファージを用いる若干の例では、ディスプレータンパク質を、ファージコートタンパク質アンカードメインに融合させる。融合タンパク質は、同じアンカードメインを有する別のポリペプチド、例えば野生型またはコートタンパク質の内生コピーと共発現され得る。タンパク質ディスプレーに使用され得るファージコートタンパク質は、（ｉ）繊維状ファージの小コートタンパク質、例えば遺伝子IIIタンパク質（ｇIIIｐ）および（ii）繊維状ファージの主コートタンパク質、例えば遺伝子ＶIIIタンパク質（ｇＶIIIｐ）を含む。遺伝子ＶＩタンパク質、遺伝子ＶIIタンパク質または遺伝子ＩＸタンパク質などの他のファージコートタンパク質への融合体も使用され得る（例、国際公開第００／７１６９４号参照）。
これらのタンパク質の一部分（例、ドメインまたはフラグメント）もまた使用され得る。有用な部分はファージ粒子へ安定して組み込まれるドメインを含むため、例えば、融合タンパク質は選択手順全体を通して粒子中に残存する。一例では、ｇIIIｐのアンカードメインを使用する（例えば、米国特許第５６５８７２７号および下記実施例参照）。別の例では、ｇＶIIIｐを使用する（例えば、米国特許第５２２３４０９号参照）が、これはディスプレータンパク質に融合させた成熟完全長ｇＶIIIｐであり得る。繊維状ファージディスプレー系は、典型的にはタンパク質融合体を用いることにより、異種アミノ酸配列をファージコートタンパク質またはアンカードメインに結合させる。例えば、ファージは、シグナル配列、異種アミノ酸配列およびアンカードメイン、例えばｇIIIｐアンカードメインをコード化する遺伝子を含み得る。
発現された融合タンパク質の価数は、ファージコートタンパク質の選択により制御され得る。例えば、ｇIIIｐタンパク質は、典型的には１ビリオンにつき３〜５コピーの割合でファージコートへ組み込まれる。すなわち、変異型プロテアーゼへのｇIIIｐの融合により、価数は低くなる。これに比べて、ｇＶIIIタンパク質は、典型的には１ビリオンにつき２７００コピーの割合でファージコートに組み込まれる（Marvin（１９９８）Curr. Opin. Struct. Biol. ８：１５０−１５８）。ｇＶIIIｐは価数が高いため、１０残基を超えるペプチドの場合、一般的にファージの耐容性は良くない。ファージミド系は、コートタンパク質の野生型コピーを提供して融合タンパク質の価数を減少させることにより、大型ペプチドに対するファージの耐容性を高めるのに使用され得る。さらに、大型ペプチドの発現用に最適化されたｇＶIIIｐの突然変異体も使用され得る。かかる一例として、改善された表面ディスプレー特性をもつｇＶIIIｐについての突然変異誘発スクリーンにおいて突然変異体ｇＶIIｐを得た（Sidhu et al.（２０００）J. Mol. Biol. ２９６：４８７−４９５）。
調節可能なプロモーターもディスプレータンパク質の価数の制御に使用され得る。調節された発現を利用することにより、ディスプレータンパク質の価数が低いファージが製造され得る。多くの調節可能な（例、誘導性および／または抑制性）プロモーター配列が知られている。上記配列は、使用者の介入により、例えば環境的パラメーター、例えば温度の操作により、または刺激性分子の添加またはリプレッサー分子の除去により活性が改変または調節され得る調節可能なプロモーターを含む。例えば、内在性化学的化合物を加えることにより、プロモーターによっては転写が調節される場合もあり得る。調節可能なプロモーターは、１つまたはそれ以上の転写アクチベーターまたはリプレッサータンパク質に関する結合部位を含み得る。転写因子結合部位を含む合成プロモーターが構築され得、これらも調節可能なプロモーターとして使用され得る。調節可能なプロモーターの具体例には、環境的パラメーター、例えば温度変化、ホルモン、金属、代謝物、抗生物質または化学的薬剤に応答するプロモーターがある。大腸菌（E.coli）での使用に適した調節可能なプロモーターには、lac、tac、trp、trcおよび tet オペレーター配列またはオペロンからの転写因子結合部位を含むプロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーター（ｐｈｏ）、アラビノースプロモーター、例えばaraＢＡＤプロモーター、ラムノースプロモーター、プロモーターそれ自体、またはその機能性フラグメントがある（例えば、Elvin et al.（１９９０）Gene ３７：１２３−１２６；TaborおよびRichardson（１９９８）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. １０７４−１０７８；Chang et al.（１９８６）Gene ４４：１２１−１２５；LutzおよびBujard、（１９９７）Nucl. Acids. Res. ２５：１２０３−１２１０；D.V.Goeddel et al.（１９７９）Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.、７６：１０６−１１０；J.D.Windass et al.（１９８２）Nucl. Acids. Res.、１０：６６３９−５７；R.Crowl et al.（１９８５）Gene、３８：３１−３８；Brosius（１９８４）Gene ２７：１６１−１７２；AmannaおよびBrosius（１９８５）Gene ４０：１８３−１９０；Guzman et al.（１９９２）J. Bacteriol.、１７４：７７１６−７７２８；Haldimann et al.（１９９８）J. Bacteriol.、１８０：１２７７−１２８６参照）。
例えば、ｌａｃプロモーターは、乳糖または構造上関連した分子、例えばイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）により誘導され得、グルコースにより抑制される。誘導性プロモーターには、抑制解除過程、例えばリプレッサー分子の不活化により誘導されるものもある。
調節可能なプロモーター配列はまた、間接的に調節され得る。間接的調節用に遺伝子工学的に製造され得るプロモーターの例には、ファージラムダＰＲ、ＰＬ、ファージＴ７、ＳＰ６およびＴ５プロモーターがある。例えば、調節配列は、発現が例えば環境的パラメーターにより調節される因子により抑制または活性化される。上記プロモーターの一例はＴ７プロモーターである。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現は、環境応答性プロモーター、例えばｌａｃプロモーターにより調節され得る。例えば、細胞は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをコード化する配列および環境的パラメーターにより調節される調節配列（例、ｌａｃプロモーター）を含む異種核酸を含み得る。またＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの活性は、ＲＮＡポリメラーゼの天然阻害剤、例えばＴ７リゾチームの存在により調節され得る。
別の立体配置では、環境的パラメーターにより調節されるように、ラムダＰＬに遺伝子操作を加え得る。例えば、細胞は、ラムダリプレッサーの温度感受性変異型をコード化する核酸配列を含み得る。細胞を非許容性温度に上昇させると、ＰＬプロモーターは抑制から解放される。
プロモーターまたは転写調節配列の調節特性は、リポータータンパク質（または検出可能なタンパク質）をコード化する配列にプロモーターまたは配列を機能し得るように結合することにより容易に試験され得る。このプロモーター-リポート融合配列を、細菌細胞、典型的にはプラスミドまたはベクターに導入し、リポータータンパク質の存在量を様々な環境条件下で評価する。有用なプロモーターまたは配列は、ある種の条件で選択的に活性化または抑制されるものである。
若干の実施態様では、非調節可能プロモーターも使用される。例えば、関連性のある条件下で適切な量の転写を誘導するプロモーターが選択され得る。非調節可能プロモーターの一例はｇIIIプロモーターである。
ｂ．細胞表面ディスプレーライブラリー
スクリーニング用の変異型プロテアーゼのライブラリーは、細胞、例えば原核生物または真核生物細胞の表面で発現され得る。細胞表面発現用の典型的細胞には、限定されるわけではないが、細菌、酵母、昆虫細胞、鳥類細胞、植物細胞、および哺乳類細胞がある（Chenおよび Georgiou(２０００)Biotechnol. Bioeng ７９：４９６−５０３）。一例では、発現用の細菌細胞は大腸菌（Echerichia coli）である。
変異型プロテアーゼは、細胞表面で発現されるタンパク質、例えば膜タンパク質または細胞表面性タンパク質との融合タンパク質として発現され得る。例えば、変異型プロテアーゼは、大腸菌（E.coli）外膜タンパク質（例、ＯｍｐＡ）、主要大腸菌（E.coli）リポタンパク質（Ｌｐｐ）および外膜タンパク質ＯｍｐＡの遺伝子工学的ハイブリッド分子または細胞表面性タンパク質（例、線毛および鞭毛サブユニット）との融合タンパク質として大腸菌（E.coli）で発現され得る。一般的に、細菌性外膜タンパク質を異種ペプチドまたはタンパク質のディスプレーに使用するとき、それは、担体タンパク質の許容部位への遺伝子挿入を通じて達成される。ペプチドまたはタンパク質は、タンパク質のＮ−またはＣ−末端での融合と比べて許容部位への挿入時により束縛されるため、異種ペプチドまたはタンパク質の発現は、挿入されたタンパク質ドメインの構造特性に左右される。融合タンパク質の修飾は、融合タンパク質の発現性を改善するように行われ得るもので、例えば可撓性ペプチドリンカーまたはスペーサー配列の挿入または細菌性タンパク質の修飾（例、アミノ酸配列における突然変異誘発、挿入または欠失）がある。酵素、例えばβ−ラクタマーゼ(lacatamase)およびセルロモナス・フィミ（Cellulomonas fimi）のＣｅｘエキソグルカナーゼは、大腸菌（E.coli）の表面でＬｐｐ−ＯｍｐＡ融合タンパク質として有効に発現されている（Francisco J.A.および Georgiou G. Ann N Y Acad Sci. ７４５：３７２−３８２（１９９４）およびGeorgiou G. et al. Protein Eng. ９：２３９−２４７（１９９６））。１５〜５１４アミノ酸の他のペプチドは、ＯｍｐＡの表面における第２、第３および第４外側ループでディスプレーされている（Samuelson et al.、J. Biotechnol. ９６：１２９−１５４（２００２））。すなわち、外膜タンパク質は、細菌の外部表面で異種遺伝子産物を担い、ディスプレーし得る。
別の例では、変異型プロテアーゼを、エヌ・ゴノロエ(N.gonorrhoeae)ＩｇＡ１プロテアーゼ、セラティア・マルセセンス(Serratia marcescens)セリンプロテアーゼ、シゲラ・フレキシネリ(Shigella flexneri)ＶｉｒＧタンパク質および大腸菌(E.coli)接着ＡＩＤＡ−Ｉなどのタンパク質のオートトランスポータードメインに融合させ得る（Klauser et al. EMBO J. 1991-1999 (1990); Shikata S, et al. J Biochem.114:723-731 (1993); Suzuki T et al. J Biol Chem. 270:30874-30880 (1995);および Maurer J et al. J Bacteriol. 179:794-804 (1997)）。他のオートトランスポータータンパク質には、グラム陰性菌（例、大腸菌（E. coli）、サルモネラ(Salmonella)血清型ティフィムリウム(Typhimurium)、およびシゲラ・フレキシネリ(S. flexneri)）に存在するものがある。β−ラクタマーゼなどの酵素は、この系を用いて大腸菌（E.coli）の表面で有効に発現されている(Lattemann CT et al. J Bacteriol. 182(13): 3726-3733 (２０００)）。
細菌に遺伝子組換えを加えることにより、膜融合タンパク質などの融合タンパク質を発現させることができる。変異型プロテアーゼをコード化する核酸は、細胞表面タンパク質、例えば、限定されるわけではないが、細菌性ＯｍｐＡタンパク質をコード化する核酸に融合され得る。変異型プロテアーゼをコード化する核酸は、膜タンパク質における許容性部位、例えば膜タンパク質の細胞外ループに挿入され得る。さらに、融合タンパク質をコード化する核酸は、標識または検出可能なタンパク質をコード化する核酸に融合され得る。上記の標識および検出可能なタンパク質は当業界では公知であり、例えば、限定されるわけではないが、ヒスチジン標識、血球凝集素標識、ｍｙｃ標識または蛍光性タンパク質がある。融合タンパク質をコード化する核酸は、細菌で発現させるためのプロモーターへ機能し得るように結合され得る。例えば、核酸は、融合タンパク質発現用プロモーターおよび所望による選択用、例えば抗生物質耐性に関する追加的遺伝子を運び得るベクターまたはプラスミドへ挿入され得る。例えば電気穿孔または化学的形質転換法により、細菌は上記プラスミドで形質転換され得る。上記技術は、当業者には公知である。
外膜または周辺腔におけるタンパク質は、通常未成熟タンパク質として細胞質で合成され、シグナル配列で開裂されることにより、成熟タンパク質を生じ、これが細胞質外へ輸送される。大腸菌（E.coli）に関する組換えタンパク質の分泌的生産に使用される典型的シグナル配列は公知である。興味の対象である遺伝子がシグナル配列と正確に融合されているとき、Ｍｅｔ伸長を伴わないＮ−末端アミノ酸配列は、シグナルペプチダーゼによる開裂後に生成され得る。すなわち、成熟タンパク質は、興味の対象であるタンパク質のアミノ酸配列を変えなくても製造され得る（Choiおよび Lee. Appl. Microbiol. Biotechnol. 64: 625-635 (2004)）。
他の細胞表面ディスプレー系は当業界では公知であり、限定されるわけではないが、氷核タンパク質（Inp）に基づく細菌表面ディスプレー系（Lebeault J M (1998) Nat Biotechnol. 16: 576 80）、酵母ディスプレー（例、酵母Ａｇａ２ｐ細胞壁タンパク質との融合体；米国特許第６４２３５３８号参照）、昆虫細胞ディスプレー（例、バキュロウイルスディスプレー；Ernst et al. (1998) Nucleic Acids Research, Vol 26, Issue 7 1718-1723参照）、哺乳類細胞ディスプレー系、および他の真核生物ディスプレー系（例えば、５７８９２０８号および国際公開第０３／０２９４５６号参照）がある。
ｃ．他のディスプレーライブラリー
また、変異型プロテアーゼのライブラリー、例えば、変形が本発明により設計されたものであるライブラリーをスクリーニングするための他のディスプレー方式を用いることも可能である。具体例としての他のディスプレー方式には、核酸−タンパク質融合、リボザイムディスプレー（例えば、Hanes および Pluckthun (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 13:4937-4942参照）、ビーズディスプレー（Lam, K. S. et al. Nature (1991) 354, 82-84; , K. S. et al. (1991) Nature, 354, 82-84; Houghten, R. A. et al. (1991) Nature, 354, 84-86; Furka, A. et al. (1991) Int. J. Peptide Protein Res. 37, 487-493; Lam, K. S., et al. (1997) Chem. Rev., 97, 411-448;米国特許出願公開第2004-0235054号）およびタンパク質アレイ（例えば、Cahill (2001) J. Immunol. Meth. 250:81-91、国際公開第01/40803号、国際公開第99/51773号、および米国特許出願2002-0192673-A1参照）がある。
他の特異的な場合では、代わりにプロテアーゼ、変異型プロテアーゼまたは触媒活性部分またはファージライブラリーまたは変異型プロテアーゼを発現する細胞を固体支持体に結合させるのが有利であり得る。例えば、若干の例では、変異型プロテアーゼを発現する細胞をビーズに自然吸着させ得、その結果、ビーズの集団は１ビーズにつき１細胞を含むことになる（Freeman et al. Biotechnol. Bioeng. (2004) 86:196-200）。ガラス支持体に固定した後、微細コロニーを成長させ、色素原または蛍光原基質によるスクリーニングにかけ得る。別の例では、変異型プロテアーゼまたはファージライブラリーまたは変異型プロテアーゼを発現する細胞を、タイタープレート中へ配列させ、固定化し得る。
Ｆ．選択されたプロテアーゼの接触、単離および同定方法
プロテアーゼまたはその触媒活性部分をディスプレーする複数のコレクションまたはライブラリーを選択および調製した後、ライブラリーを用いて、標的プロテアーゼトラップポリペプチドをプロテアーゼ成分と接触させる。例えばプロテアーゼトラップポリペプチド、例えば所望の開裂配列を有するようにそのＲＳＬループにおいて突然変異させたセルピンを含む標的基質を、基質特異性が改変されたプロテアーゼの選択用にディスプレーされたプロテアーゼライブラリーと接触させる。プロテアーゼおよびプロテアーゼトラップポリペプチドを、懸濁液、溶液中、または固体支持体を介して接触させ得る。これらの成分を十分な時間、温度または濃度で接触させることにより、相互作用、それに続いて開裂反応が起こり、選択されたプロテアーゼとプロテアーゼトラップポリペプチドの安定した中間複合体が形成され得る。反応を維持させるストリンジェンシーは、反応温度、プロテアーゼトラップポリペプチド阻害剤の濃度、競合物質（含まれる場合）の濃度、混合物中におけるプロテアーゼコレクションの濃度およびインキュベーションの時間の長さのうちの１つまたはそれ以上のパラメーターを変えることによりモジュレーションされ得る。
プロテアーゼトラップポリペプチドと共有結合複合体を形成する選択されたプロテアーゼを捕捉し、単離する。捕捉し易くするため、スクリーニングに用いるプロテアーゼトラップポリペプチドを溶液中、懸濁液中で供給するか、または検定方法に適切な場合固体支持体に結合させ得る。例えば、プロテアーゼトラップポリペプチドを、固体支持体、例えば１個またはそれ以上のビーズまたは粒子、ミクロスフィア、管またはプレートの表面、フィルター膜、および当業界で公知の他の固体支持体に結合させ得る。具体例としての固体支持体系には、限定されるわけではないが、マルチウェルプレートまたは膜を含む、例えばガラス、珪素、金属、ナイロン、セルロース、プラスチックまたは合成物で構築された平坦表面があり、またはシリカゲル、制御型多孔質ガラス、マグネチック（Dynabead）またはセルロースビーズなどのビーズ形態であり得る。上記方法は、懸濁液中またはカラム形態での使用にも適合化され得る。標的プロテアーゼトラップポリペプチドは、直接的または間接的に固体支持体、例えばポリアクリルアミドビーズに結合され得る。結合には共有結合または非共有結合的方法を使用し得る。標的化合物の共有結合的結合方法には、化学的架橋方法がある。反応性試薬は、標的分子上の官能基と支持体の間に共有結合を形成させ得る。化学反応し得る官能基の例には、アミノ、チオールおよびカルボキシル基がある。Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、Ｎ−ヒドロスクシンイミドおよびグルタルアルデヒドは、官能基と反応する試薬の例である。他の例では、標的基質は、例えば、限定されるわけではないが、免疫親和力またはリガンド−受容体相互作用（例、ビオチン−ストレプトアビジンまたはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−グルタチオン）などの方法により固体支持体に間接的に結合され得る。例えば、プロテアーゼトラップポリペプチドは、ＥＬＩＳＡプレートまたは他の類似したアドレス可能なアレイへコーティングされ得る。一例では、プレートのウェルは、プロテアーゼトラップポリペプチドは、と結合し、それを捕捉する親和性捕捉剤でコーティングされ得る。実施例９は、ビオチニル化抗Ｈｉｓ抗体でストレプトアビジン含有プレートをコーティングすることにより、Ｈｉｓ標識を含むプロテアーゼトラップポリペプチドの捕捉を容易にする方法を具体的に説明している。
固体支持体へのプロテアーゼトラップポリペプチドの結合は、それらが変異型プロテアーゼまたはファージライブラリーまたは変異型プロテアーゼを発現する細胞と接触する前、間または後に実施され得る。例えば、変異型プロテアーゼとのインキュベーション前に、標的基質を固体支持体、例えばクロマトグラフィーカラムに予め吸収させ得る。他の例では、標的基質を変異型プロテアーゼに結合させた後に固体支持体の結合を行う。
上記の例では、複合体を形成した基質−プロテアーゼ対を含む固体支持体を洗浄することにより、未結合プロテアーゼを除去し得る。複合体は、当業者に公知の方法により、例えば希酸で処理し、中和するか（Fu et al. (1997) J Biol. Chem. 272:25678-25684）またはトリエチルアミン（Chiswell et al. (1992) Trends Biotechnol. 10:80-84）で処理することにより固体支持体から回収され得る。この段階を最適化することにより、固体基質からのディスプレー供給源の再生可能で定量的な回収が確実に行われ得る。例えば、固体支持体に結合された標的基質へのディスプレー供給源の結合は、当業者に周知の方法を用いて、例えばファージに対する、例えばＭ１３ファージに対する抗体（例、New England Biolabs、マサチューセッツ）および標準ＥＬＩＳＡ（例えば、Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons（ニューヨーク）参照）を用いることにより独立的に監視され得る。
基質−プロテアーゼ複合体を捕捉および単離する別の方法は溶液によるものである。典型的には、上記方法では、プロテアーゼトラップポリペプチドまたはその変異型を、例えば、少量の適切な結合緩衝液（すなわち、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００マイクロリットルまたはそれ以上）中でプロテアーゼのコレクションと接触させるが、その液中では、各プロテアーゼトラップポリペプチドは、その同定および単離を目的とする予め定められたマーカー、標識または他の検出可能な部分と会合している。検出可能な部分は、基質−プロテアーゼ複合体の検出および単離を容易にするものであればいかなる部分でもよい。例えば、上記部分は、標識に特異的な抗体が存在するエピトープ標識であり得る（すなわち、ｍｙｃ−標識、Ｈｉｓ−標識など）。抗体を固体支持体、例えばビーズに結合させることにより、安定した複合体の捕捉が容易になり得る。他の類似した戦略も使用され得、例としては、標的基質をビオチンで標識し、磁気ビーズまたはマイクロタイタープレートなどの固体支持体に結合させたストレプトアビジンを用いて捕捉するか、またはポリヒスチジン（例、Ｈｉｓ６−標識）で標識し、限定されるわけではないが、硫酸ニッケル（ＮｉＳＯ4）、塩化コバルト（ＣｏＣｌ2）、硫酸銅（ＣｕＳＯ4）または塩化亜鉛（ＺｎＣｌ2）などの金属キレート剤を用いて捕捉する方法がある。捕捉剤は、大型ビーズ、例えばセファロースビーズにカップリングされ得、その結果結合ビーズの単離は遠心分離により容易に達成され得る。別法として、捕捉剤は、磁気カラムを用いて容易に単離され得る小型ビーズ、例えば磁気ビーズ（すなわち、Miltenyi Biotec）にカップリングされ得る。さらに、上記部分は蛍光性部分であり得る。例えば、ディスプレー系によっては、例えば、細胞表面ディスプレー系では、蛍光性標識により、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ;例えば、Levin et al. (2006) Molecular BioSystems, 2: 49-57参照）による選択された複合体の単離が容易になり得る。
場合によっては、１つまたはそれ以上の異なるプロテアーゼトラップポリペプチドを、プロテアーゼのコレクションと接触させることもあり、その場合、プロテアーゼトラップポリペプチドはそれぞれ異なる検出部分と会合しているため、１つまたはそれ以上のプロテアーゼトラップポリペプチド−プロテアーゼ複合体が個々に単離され得る。それぞれ異なる目的ＲＳＬ開裂配列をもつ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるプロテアーゼトラップポリペプチドを単一反応物中に含ませることができれば、同時に何百または何千のうちから１０の共有結合複合体を検出および単離することが可能となる。
プロテアーゼトラップポリペプチドとの共有結合複合体として捕捉されている、選択されたプロテアーゼは、プロテアーゼのコレクションからの非複合体形成プロテアーゼから分離され得る。次いで、選択されたプロテアーゼを増幅することにより、選択されたプロテアーゼは同定され易くなり得る。プロテアーゼトラップポリペプチドに対し複合体を形成していないプロテアーゼを除去した後、プロテアーゼがディスプレーされている物質の供給源（すなわち、ファージ、細胞、ビーズなど）を適切な宿主細胞で増幅および発現させる。例えば、プロテアーゼがファージでディスプレーされている場合、一般的にはプロテアーゼトラップポリペプチドとの複合体におけるプロテアーゼ−ファージを、宿主細胞とインキュベーションすることにより、ファージを吸着させ、次いで少量の栄養ブロスを加え、培養物を撹拌することにより、増殖性宿主でのファージプローブＤＮＡ複製が促進される。例によっては、ファージの存在下でこれを行うことにより、宿主細胞を確実にファージにより感染させる場合もある。このインキュベーション後、培地に抗生物質および／または誘導物質を補足する。ファージプロテアーゼゲノムはまた、ファージプロテアーゼＤＮＡを維持する細菌細胞の選択的増殖を可能にするために、抗生物質に対する耐性をコード化する遺伝子を含み得る。典型的には、選択されたプロテアーゼを含むファージ上清の供給源としてファージを増幅させる場合、ファージのレスキューがヘルパーファージの使用により要求される。例によっては、レスキュー段階を伴わずに選択されたプロテアーゼの存在について検定することが可能な場合もある。例えば、選択または同定されたプロテアーゼを含む捕捉された複合体と宿主細胞、例えば細菌のインキュベーションおよび選択物質の存在下における増殖後、ペリプラズムまたは細胞培養培地を、選択されたプロテアーゼの供給源として直接サンプリングすることにより、例えば、プロテアーゼ活性を測定することができる。上記手順は実施例１７に記載されている。
さらに、例えば細菌宿主におけるディスプレー供給源の増幅は、様々な方法で最適化され得る。例えば、マイクロウェルなどにおいて検定材料に加える細菌の量を、結合段階から回収されたファージ供給源よりかなり多くすることにより、ファージゲノムの定量的形質導入が確実に行われ得る。ファージが選択されたとき、所望により形質導入効率を測定してもよい。増幅段階は、ディスプレー供給源のゲノム、例えばファージゲノムを増幅させるため、関連したシグネチャーポリペプチドを過剰発現させ、例えばＤＮＡ配列決定によりその同定を行い得る。
ふるい分け方法を用いることにより、標的タンパク質、例えばプロテアーゼトラップポリペプチドまたはそのＲＳＬ変異型と相互作用するプロテアーゼまたはその触媒活性部分が迅速に選択される。例えば、ファージ-ディスプレーポリペプチド、例えばファージディスプレープロテアーゼのライブラリーを、表面結合または可溶性標的タンパク質とインキュベーションし、未結合ファージを洗い流し、特異的かつ共有結合的に結合したファージを溶離することにより、ふるい分けを行う。次いで、溶離されたファージを例えば宿主感染を介して増幅させ、さらにふるい分けおよび増幅の追加的周期にかけることにより、標的ポリペプチドに関して最高の親和力をもつものについてファージのプールを連続的に強化する。数ラウンドの後、個々のクローンが、例えばＤＮＡ配列決定により同定され、それらの活性が例えば下記Ｇ項に示した方法により測定され得る。
一旦選択されたプロテアーゼが同定されると、それをディスプレー供給源から精製し、活性について試験し得る。一般的に、上記方法は、生化学的および組換えＤＮＡ技術を含み、当業者には常用的なものである。一方法では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿を用いることにより、精製した選択されたファージ上清中に混入している可能性のあるプロテアーゼ活性が除去され得る。上記の例では、ヘルパーファージの存在下でのファージレスキュー後、選択されたプロテアーゼを含むファージ上清をＰＥＧの存在下で沈殿させ得る。当業者であれば、特定の沈殿適用に要求されるＰＥＧのパーセンテージを決定できるはずである。一般的に、プロテアーゼ上清の沈殿について、２０％ＰＥＧを使用する。
若干の例では、レスキューファージ上清または細菌細胞ペリプラズムまたは細胞培地（ファージレスキューを伴わない）からの上清を、本明細書記載の要領でプロテアーゼ活性について検定し得る。別法として、またはさらに、選択されたプロテアーゼは、上清または他の供給源から精製され得る。例えば、選択されたプロテアーゼドメインをコード化するＤＮＡをディスプレー供給源から単離することにより、選択されたタンパク質の精製を行い得る。例えば、上記で示した選択されたファージによる大腸菌（E.coli）宿主細胞の感染後、個々のクローンを採取し、当業者に公知の方法を用いてプラスミド精製用に成長させ、必要ならば大量に、例えばMidi Plasmid Purification Kit（Qiagen）を用いて製造し得る。精製したプラスミドをＤＮＡ配列決定に使用することにより、変異型プロテアーゼの配列を同定するか、またはこれを用いて発現用の細胞、例えば限定されるわけではないが、哺乳類発現系へトランスフェクションすることが可能である。必要ならば、１または２段階ＰＣＲを実施することにより、選択された配列を増幅させ得、これを選択された発現ベクターにサブクローニングし得る。ＰＣＲプライマーは、例えば制限酵素部位の付加を含ませることによりサブクローニングを容易にするように設計され得る。実施例４は、完全長ｕ−ＰＡ遺伝子の増幅および精製を実施するための２段階ＰＣＲ手順の具体例を説明しており、選択されたプロテアーゼファージはｕ−ＰＡ遺伝子のプロテアーゼドメインのみを含んでいた。例えば下記で詳述している発現に適切な細胞へのトランスフェクション後、プロテアーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分を含む条件培地を活性検定法で試験するか、またはさらなる精製に使用し得る。さらに、必要ならば、それに応じてプロテアーゼをプロセッシングし、例えば１本鎖形態の開裂により活性プロテアーゼから２本鎖形態を生成させ得る。上記操作は当業者には公知である。例えば、１本鎖ｕ−ＰＡは、本明細書に記載されているプラスミンの開裂に関し活性にされ得る。
１．反復スクリーニング
本発明方法では、反復スクリーニングを用いてプロテアーゼの修飾を最適化する。すなわち、反復スクリーニング方法では、様々なパラメーターのもと、例えば種々のプロテアーゼトラップポリペプチドまたは競合物質を用いることにより、複数回ふるい分け反応を実施することによりプロテアーゼを進化させ得る。上記の反復スクリーニング方法では、プロテアーゼコレクションは、スクリーニングの連続ラウンドにおいて一定に保たれ得る。別法として、上記ラウンドで同定された選択されたプロテアーゼのみを含ませ、そして／または初回ラウンドで同定された鋳型プロテアーゼと比べてさらなる突然変異が加えられている突然変異体プロテアーゼの新たなコレクションを作製することにより、新たなプロテアーゼコレクションを形成させ得る。
一例において、プロテアーゼライブラリーの初回スクリーニングでは、プロテアーゼの特異性を改変する１つまたはそれ以上の突然変異を含む変異型プロテアーゼを同定し得る。次いで、第２ラウンドライブラリー合成を実施し得、そこでは１つまたは複数の突然変異のアミノ酸位置は一定に保たれ、フォーカスまたはランダム突然変異がタンパク質または所望の領域または残基の残りで誘発され得る。追加ラウンドのスクリーニングの後、選択されたプロテアーゼは、ライブラリー合成およびスクリーニングのさらなるラウンドにかけられ得る。例えば、ライブラリー合成およびスクリーニングの２、３、４、５またはそれ以上のラウンドを実施し得る。若干の例では、改変された基質に対する変異型プロテアーゼの特異性を各選択ラウンドによりさらに最適化することもある。
反復スクリーニングの別の方法の場合、プロテアーゼコレクションの初回スクリーニングは、中間体プロテアーゼトラップポリペプチドに対するものであり、中間体基質に対するプロテアーゼの特異性を改変する１つまたはそれ以上の突然変異を含む変異型プロテアーゼが同定され得る。選択されたプロテアーゼ複合体を単離し、成長させ、適切な宿主細胞で増幅させ、さらに標的ポリペプチドの完全開裂配列を含むプロテアーゼトラップポリペプチドに対するスクリーニングの第２ラウンドでのプロテアーゼコレクションとして使用し得る。例えば、上記方法は、ＶＥＧＦＲ開裂配列についての基質特異性を有するプロテアーゼを選択するのに使用され得、その場合ふるい分けの１回またはそれ以上のラウンドはＲＲＡＲＭ中間体開裂配列に対するものであり、ふるい分けの後続ラウンドは、ＶＥＧＦＲ２開裂配列ＲＲＶＲを含むプロテアーゼトラップポリペプチドに対して実施される。
反復スクリーニングの追加的な例では、２種またはそれ以上の異なるポリペプチドについての異なる基質認識または開裂配列を含む２つまたはそれ以上のプロテアーゼトラップポリペプチドを、オルターナティブラウンドのふるい分け方法で使用する。上記方法は、２種の異なる基質に関して選択性を有するように最適化されたプロテアーゼを選択するのに有用である。選択された変異型は、典型的には狭い特異性を有するが、２つまたはそれ以上の基質認識配列に対する高い活性を有する。上記方法では、第１の予め定められた基質特異性をもつプロテアーゼを選択するように修飾された、第１プロテアーゼトラップポリペプチドに対するプロテアーゼコレクションの初回スクリーニングでは、プロテアーゼの特異性を改変する１つまたはそれ以上の突然変異を含む変異型プロテアーゼを同定し得る。選択されたプロテアーゼを単離し、成長させ、適切な宿主細胞で増幅させ、さらに第２の予め定められた基質特異性をもつプロテアーゼを選択するように修飾された第２プロテアーゼトラップポリペプチドに対するスクリーニングの第２ラウンドでのプロテアーゼコレクションとして使用し得る。本方法で使用する第１および第２プロテアーゼトラップポリペプチドは同一または異なり得るが、それぞれその反応性部位が、異なる標的基質の基質認識部位（すなわち、開裂配列）を模倣するように異なる形で修飾されている。例によっては、選択におけるストリンジェンシーが、競合物質、例えば、本明細書記載の厳密または広範な競合物質の存在下で高められることもある。
２．選択されるプロテアーゼの具体例
本発明は、改変および／または改善された基質特異性を有するものとして本発明方法で同定される変異型ｕ−ＰＡおよびＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを提供する。上記変異型ｕ−ＰＡおよびＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、標的タンパク質の選択されたか、または所望の開裂配列に関して高い特異性を有するものとして同定された。上記標的タンパク質の例には、限定されるわけではないが、ＶＥＧＦＲまたは補体タンパク質、例えば、補体タンパク質Ｃ２における開裂配列がある。修飾セルピンは、本発明の選択方法で変異型プロテアーゼを同定するのに使用され得る。上記の修飾セルピンの例は、上記で述べたところによると、標的タンパク質、例えば、ＶＥＧＦＲまたはＣ２に関する開裂配列を含むようにＲＳＬが修飾されたＰＡＩ−１またはＡＴ３である。上記の選択された修飾プロテアーゼは、選択された修飾を含まない鋳型または出発プロテアーゼと比べて標的タンパク質における開裂配列について改変された、典型的には改善された基質特異性を呈する。下記によると、特異性は典型的には高く、選択された標的基質対非標的基質に関する野生型または鋳型プロテアーゼの特異性と比較したとき、一般に少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００倍またはそれ以上である。
ａ．変異型ｕ−ＰＡポリペプチド
例えば、本発明で提供される変異型ｕ−ＰＡポリペプチドは、天然Ｐ４〜Ｐ１'反応性部位アミノ酸を所望の、または選択された標的タンパク質のアミノ酸と置換することによりそのＲＳＬ配列が修飾された突然変異体セルピンポリペプチドについて高い反応性を有するように選択された。一例では、修飾ＰＡＩ−１ポリペプチドの選択に対して変異型ｕ−ＰＡポリペプチドが同定された。本発明によるｕ−ＰＡ選択方法で使用する修飾ＰＡＩ−１ポリペプチド分子の例には、例えば、その天然Ｐ４〜Ｐ１'残基ＶＳＡＲＭ（配列番号３７８）が、中間体ＶＥＧＦＲ−２開裂配列ＲＲＡＲＭ（配列番号３７９）についてのアミノ酸残基（Ｐ４〜Ｐ１位における所望の開裂配列は、ＶＥＧＦＲ−２開裂配列ＲＲＶＲ（配列番号４８９）である）、または最適ｔ−ＰＡ開裂配列ＰＦＧＲＳ（配列番号３８９）についてのアミノ酸残基により修飾されたＰＡＩ−１がある。
本発明方法を用いることにより、以下の位置がｕ−ＰＡポリペプチドの基質特異性の一因になるものとして同定された：キモトリプシンのナンバリングに基づく２１、２４、３０、３８、３９、６１（Ａ）、７２、７３、７５、８０、８２、８４、８９、９２、１３２、１３３、１３７、１３８、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１８７および２１７。一アミノ酸置換または同複数置換は、以下の位置のいずれかに対応する１つまたはそれ以上の位置で行われ得る：キモトリプシンのナンバリングに基づいた、ｕ−ＰＡポリペプチド、例えば配列番号４３３に示したｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分のＦ２１、Ｉ２４、Ｆ３０、Ｖ３８、Ｔ３９、Ｙ６１（Ａ）、Ｒ７２、Ｌ７３、Ｓ７５、Ｅ８０、Ｋ８２、Ｅ８４、Ｉ８９、Ｋ９２、Ｆ１３２、Ｇ１３３、Ｅ１３７、Ｉ１３８、Ｌ１５５、Ｋ１５６、Ｔ１５８、Ｖ１５９、Ｖ１６０、Ｋ１８７およびＲ２１７。高い基質特異性を呈する本発明の修飾ｕ−ＰＡポリペプチドは、キモトリプシンのナンバリングに基づいた、ｕ−ＰＡポリペプチド、例えば配列番号４３３に示したｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分のＦ２１Ｖ、Ｉ２４Ｌ、Ｆ３０Ｉ、Ｆ３０Ｖ、Ｆ３０Ｌ、Ｆ３０Ｔ、Ｆ３０Ｇ、Ｆ３０Ｍ、Ｖ３８Ｄ、Ｔ３９Ａ、Ｙ６１（Ａ）Ｈ、Ｒ７２Ｇ、Ｌ７３Ａ、Ｌ７３Ｐ、Ｓ７５Ｐ、Ｅ８０Ｇ、Ｋ８２Ｅ、Ｅ８４Ｋ、Ｉ８９Ｖ、Ｋ９２Ｅ、Ｆ１３２Ｌ、Ｇ１３３Ｄ、Ｅ１３７Ｇ、Ｉ１３８Ｔ、Ｌ１５５Ｐ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｍ、Ｋ１５６Ｙ、Ｔ１５８Ａ、Ｖ１５９Ａ、Ｖ１６０Ａ、Ｋ１８７ＥおよびＲ２１７Ｃのいずれか１つまたはそれ以上の修飾に相当する１つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含み得る。
一例では、ＶＥＧＦＲ−２開裂配列についての高い基質特異性を有する本発明の修飾ｕ−ＰＡポリペプチドは、キモトリプシンのナンバリングに基づいた、Ｖ３８Ｄ、Ｆ３０Ｉ、Ｆ３０Ｔ、Ｆ３０Ｌ、Ｆ３０Ｖ、Ｆ３０Ｇ、Ｆ３０Ｍ、Ｒ７２Ｇ、Ｌ７３Ａ、Ｌ７３Ｐ、Ｓ７５Ｐ、Ｉ８９Ｖ、Ｆ１３２Ｌ、Ｇ１３３Ｄ、Ｅ１３７Ｇ、Ｉ１３８Ｔ、Ｌ１５５Ｐ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｍ、Ｖ１６０ＡおよびＲ２１７Ｃのいずれか１つまたはそれ以上の修飾に対応する１つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含む。上記ポリペプチドの具体例は、ｕ−ＰＡポリペプチド、例えば配列番号４３３に示したアミノ酸配列を有するｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分におけるＦ３０Ｉ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ；Ｌ７３Ｐ；Ｒ２１７Ｃ；Ｌ１５５Ｐ；Ｓ７５Ｐ／Ｉ８９Ｖ／Ｉ１３８Ｔ；Ｅ１３７Ｇ；Ｒ７２Ｇ／Ｌ１５５Ｐ；Ｇ１３３Ｄ；Ｖ１６０Ａ；Ｖ３８Ｄ；Ｆ１３２Ｌ／Ｖ１６０Ａ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｔ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｌ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｖ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｇ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｌ１５５Ｖ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｍ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｌ１５５Ｍ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｌ／Ｌ１５５ＭおよびＬ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｇ／Ｌ１５５Ｍのいずれかに対応する１つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含むｕ−ＰＡポリペプチドである。上記配列の例は、配列番号４３４〜４５９のいずれかに示したもの、または突然変異を含み、触媒活性を有する連続アミノ酸のそのフラグメントである。特に、以下のアミノ酸修飾を有する修飾ｕ−ＰＡポリペプチドが提供される：キモトリプシンのナンバリングに基づいた、Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ；Ｌ１５５Ｐ；Ｒ７２Ｇ／Ｌ１５５Ｐ；Ｆ１３２Ｌ／Ｖ１６０Ａ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｔ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｌ１５５Ｖ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｌ１５５Ｍ；およびＬ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｌ／Ｌ１５５Ｍ。
別の例では、ｔ−ＰＡにより認識される開裂配列についての高い特異性を有する本発明による修飾ｕ−ＰＡポリペプチドは、キモトリプシンのナンバリングに基づいた、Ｆ２１Ｖ、Ｉ２４Ｌ、Ｆ３０Ｖ、Ｆ３０Ｌ、Ｔ３９Ａ、Ｙ６１（Ａ）Ｈ、Ｅ８０Ｇ、Ｋ８２Ｅ、Ｅ８４Ｋ、Ｉ８９Ｖ、Ｋ９２Ｅ、Ｋ１５６Ｔ、Ｔ１５８Ａ、Ｖ１５９ＡおよびＫ１８７Ｅのいずれか１つまたはそれ以上の修飾に対応する１つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含む。上記ポリペプチドの例は、ｕ−ＰＡポリペプチド、例えば配列番号４３３に示したアミノ酸配列を有するｕ−ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分におけるＦ２１Ｖ；Ｉ２４Ｌ；Ｆ３０Ｖ；Ｆ３０Ｌ；Ｆ３０Ｖ／Ｙ６１（Ａ）Ｈ；Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ；Ｆ３０Ｖ／Ｋ１５６Ｔ；Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｖ１５９Ａ；Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｔ３９Ａ／Ｖ１５９Ａ；Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｔ１５８Ａ／Ｖ１５９Ａ；Ｆ３０Ｖ／Ｙ６１（Ａ）Ｈ／Ｋ９２Ｅ；Ｆ３０Ｖ／Ｋ８２E／Ｖ１５９Ａ／Ｅ８０Ｇ／Ｉ８９Ｖ／Ｋ１８７ＥおよびＦ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｖ１５９Ａ／Ｅ８０Ｇ／Ｅ８４Ｋ／Ｉ８９Ｖ／Ｋ１８７Ｅのいずれかに対応する１つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含むｕ−ＰＡポリペプチドである。上記配列の例は、配列番号４６０〜４７２のいずれかに示したもの、または突然変異を含み、触媒活性を有する連続アミノ酸のそのフラグメントである。
また、本発明は、キモトリプシンのナンバリングに基づき、本発明による変異型ｕ−ＰＡポリペプチドと異なり対応する突然変異を有するキモトリプシンファミリーの変異型プロテアーゼを提供する。例えば、キモトリプシンのナンバリングに基づくと、ｕ−ＰＡにおけるＦ３０位の修飾は、ｔ−ＰＡにおけるＱ３０位、トリプシンにおけるＱ３０位およびキモトリプシンにおけるＱ３０位の修飾に対応する（Bode et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 865-872）。当業者であれば、限定されるわけではないが、表７に示したプロテアーゼの修飾を含み、配列番号：４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９，１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４２、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２のいずれかに示したアミノ酸配列またはその触媒活性フラグメントを有する、他のキモトリプシンファミリーメンバーにおいて対応する突然変異を測定できるはずである。
ｂ．変異型ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド
別の例では、本発明による変異型ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドが、所望の、または選択された標的タンパク質のアミノ酸による天然Ｐ４〜Ｐ２'反応性部位アミノ酸の置換によりそのＲＳＬ配列が修飾された突然変異体セルピンポリペプチドについての高い反応性を有するものとして選択された。一例では、変異型ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドが、修飾ＡＴ３ポリペプチドの選択に対して同定された。本発明によるＭＴ−ＳＰ１選択方法で使用される修飾ＡＴ３ポリペプチド分子の例には、例えば、その天然Ｐ４〜Ｐ２'残基ＩＡＧＲＳＬ（配列番号４７８）が補体タンパク質Ｃ２開裂配列ＳＬＧＲＫＩ（配列番号４７９）についてのアミノ酸残基により修飾されたＡＴ３がある。
本発明方法を用いることにより、以下の位置が、ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドの基質特異性の一因となるものとして同定された：キモトリプシンのナンバリングに基づいた、２３、４１、５２、６０（ｇ）、６５、７１、９３、９５、９７、９８、９９、１２６、１２９、１３１、１３６、１４３、１４４、１５４、１６４、１６６、１７１、１７３、１７５、１８４（ａ）、１９２、２０１、２０９、２１７、２２１（ａ）、２３０、２３４および２４４。一アミノ酸置換または同複数置換は、キモトリプシンのナンバリングに基づいた、ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド、例えば配列番号２５３または５１５に示した完全長ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドまたは配列番号５０５または５０７に示したその触媒活性部分の以下の位置：Ｄ２３、Ｉ４１、Ｌ５２、Ｙ６０（ｇ）、Ｔ６５、Ｈ７１、Ｆ９３、Ｎ９５、Ｆ９７、Ｉ９８、Ｆ９９、Ａ１２６、Ｖ１２９、Ｐ１３１、Ｉ１３６、Ｈ１４３、Ｔ１４４、Ｉ１５４、Ｎ１６４、Ｔ１６６、Ｌ１７１、Ｐ１７３、Ｑ１７５、Ｆ１８４（ａ）、Ｑ１９２、Ｓ２０１、Ｑ２０９、Ｄ２１７、Ｑ２２１（ａ）、Ｒ２３０、Ｆ２３４およびＶ２４４のいずれかに対応するいずれか１つまたはそれ以上の位置で行われ得る。高い基質特異性を呈する本発明の修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、キモトリプシンのナンバリングに基づいた、ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド、例えば配列番号２５３または５１５に示した完全長ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドまたは配列番号５０５または５０７に示したその触媒活性部分のＤ２３Ｅ、Ｉ４１Ｆ、Ｉ４１Ｔ、Ｌ５２Ｍ、Ｙ６０（ｇ）ｓ、Ｔ６５Ｋ、Ｈ７１Ｒ、Ｆ９３Ｌ、Ｎ９５Ｋ、Ｆ９７Ｙ、Ｆ９７Ｌ、Ｔ９８Ｐ、Ｆ９９Ｌ、Ａ１２６Ｔ、Ｖ１２９Ｄ、Ｐ１３１Ｓ、Ｉ１３６Ｔ、Ｉ１３６Ｖ、Ｈ１４３Ｒ、Ｔ１４４Ｉ、Ｉ１５４Ｖ、Ｎ１６４Ｄ、Ｔ１６６Ａ、Ｌ１７１Ｆ、Ｐ１７３Ｓ、Ｑ１７５Ｒ、Ｆ１８４（ａ）Ｌ、Ｑ１９２Ｈ、Ｓ２０１Ｉ、Ｑ２０９Ｌ、 Ｄ２１７Ｖ、Ｑ２２１（ａ）Ｌ、Ｒ２３０Ｗ、Ｆ２３４ＬおよびＶ２４４Ｇのいずれか１つまたはそれ以上の修飾に対応する１つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含み得る。特に、修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、Ｉ４１Ｆ、Ｆ９７Ｙ、Ｌ１７１Ｆ、Ｑ１７５Ｒ、Ｄ２１７ＶおよびＶ２４４Ｇのいずれか１つまたはそれ以上の修飾、例えばＩ４１Ｆ、Ｆ９７Ｙ、Ｌ１７１ＦおよびＶ２４４Ｇのいずれか１つまたはそれ以上の修飾に対応する１つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含む。
典型的には、上記の修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ２についての高い基質特異性を呈する。上記ポリペプチドの例は、ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド、例えば、配列番号２５３に示したアミノ酸配列を有するＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドまたは配列番号５０５に示したその触媒活性部分におけるＩ１３６Ｔ／Ｎ１６４Ｄ／Ｔ１６６Ａ／Ｆ１８４（Ａ）Ｌ／Ｄ２１７Ｖ；Ｉ４１Ｆ；Ｉ４１Ｆ／Ａ１２６Ｔ／Ｖ２４４Ｇ;Ｄ２３Ｅ／Ｉ４１Ｆ／Ｔ９８Ｐ／Ｔ１４４Ｉ;Ｉ４１Ｆ／Ｌ１７１Ｆ／Ｖ２４４Ｇ;Ｈ１４３Ｒ／Ｑ１７５Ｒ;Ｉ４１Ｆ／Ｌ１７１Ｆ;Ｒ２３０Ｗ;Ｉ４１Ｆ／Ｉ１５４Ｖ／Ｖ２４４Ｇ;Ｉ１４１Ｆ／Ｌ５２Ｍ／Ｖ１２９Ｄ／Ｑ２２１（Ａ）Ｌ;Ｆ９９Ｌ;Ｆ９７Ｙ／Ｉ１３６Ｖ／Ｑ１９２Ｈ／Ｓ２０１Ｉ;Ｈ７１Ｒ／Ｐ１３１Ｓ／Ｄ２１７Ｖ;Ｄ２１７Ｖ;Ｔ６５Ｋ／Ｆ９３Ｌ／Ｆ９７Ｙ／Ｄ２１７Ｖ;Ｉ４１Ｔ／Ｐ１７３Ｓ／Ｑ２０９Ｌ;Ｆ９７Ｌ／Ｆ２３４Ｌ；Ｑ１７５Ｒ;Ｎ９５ＫおよびＹ６０（Ｇ）Ｓのいずれかに対応する１つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含むＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドである。上記配列の例は、配列番号５８９〜６０９のいずれかに示したもの、または例えば、配列番号５６８〜５８８のいずれかに示した、突然変異を含み、触媒活性を有する連続アミノ酸のそのフラグメントである。若干の例では、本発明による変異型ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、さらにＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド、例えば配列番号２５３に示したアミノ酸配列を有するＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドまたは配列番号５０５に示したその触媒活性フラグメントにおけるＣ１２２Ｓに対応する修飾を含む。上記変異型ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドの例は、配列番号５３７〜５５７のいずれか、または例えば配列番号５１６〜５３６のいずれかに示した突然変異を含み、触媒活性を有する連続アミノ酸のそのフラグメントに示されている。
特に、以下のアミノ酸修飾を有する修飾ｕ−ＰＡポリペプチドが提供される：キモトリプシンのナンバリングに基づいた，Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ；Ｌ１５５Ｐ；Ｒ７２Ｇ／Ｌ１５５Ｐ；Ｆ１３２Ｌ／Ｖ１６０Ａ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｔ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｌ１５５Ｖ；Ｌ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｌ１５５ＭおよびＬ７３Ａ／Ｉ８９Ｖ／Ｆ３０Ｌ／Ｌ１５５Ｍ。
Ｇ．プロテアーゼ活性および特異性の評価方法
本発明方法で選択されたプロテアーゼを試験することにより、選択後、プロテアーゼが触媒有効性を保持し、所望の基質特異性を呈するか否かを測定し得る。活性評価は、増幅したディスプレー供給源または精製タンパク質からの上清を用いて実施され得る。例えば、上記で検討したところによると、ヘルパーファージによるファージレスキューおよびファージ増幅後にファージ上清が検定され得る。別法として、プロテアーゼ活性は、感染した細菌の細胞培地またはペリプラズムから直接検定され得る。精製された選択されたプロテアーゼのプロテアーゼ活性についても測定し得る。
既知プロテアーゼ基質を用いて基質開裂について検定することにより、触媒有効性および／または基質特異性が評価され得る。例えば、プラスミノーゲンの開裂は、ｔ−ＰＡまたはｕ−ＰＡを本発明選択方法で使用する場合に評価され得る。別の例では、プロテアーゼにより認識されるペプチド基質が使用され得る。例えば、ＭＴ−ＳＰ１の自律活性化部位であるＲＱＡＲ（配列番号５１３）を用いることにより、選択されたＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼの活性を評価し得る。一実施態様では、ペプチド基質の蛍光性標識テトラペプチド、例えば、ＡＣＣ−またはＡＭＣ−テトラペプチドが使用され得る。さらに、プロテアーゼを選択する際の所望の標的基質の開裂配列に基づいて設計された蛍光性ペプチド基質を用いることにより、活性が評価され得る。
若干の例では、選択されたプロテアーゼが、選択方法で使用される変異型プロテアーゼトラップポリペプチドの存在または非存在下での既知ペプチド基質に対するその活性について評価され得る。典型的には、標的基質の所望の開裂配列を含むプロテアーゼトラップポリペプチドの存在下で阻害されるプロテアーゼについてさらに選択することにより、標的基質について改善された選択性を有する選択されたプロテアーゼを最適化するために上記活性評価を実施する。野生型または鋳型プロテアーゼに対し、そして／または選択方法で同定された他の全プロテアーゼにより阻害の比較を行い得る。
選択されたプロテアーゼの天然基質の開裂の速度論分析結果を、所望の標的基質の開裂分析結果と比較することにより、標的配列について選択されたプロテアーゼの特異性が評価され得る。さらに、阻害の二次速度定数（ｋｉ）を評価することにより、本選択方法で使用される基質、例えば、プロテアーゼトラップポリペプチドまたはその変異型についての選択されたプロテアーゼの有効性および反応性が監視され得る。実施例５は、本発明方法で同定された突然変異体ｕ−ＰＡポリペプチドの触媒有効性および反応性の評価に使用される様々な検定法について具体的に説明している。実施例１０および実施例１２は、選択されたＭＴ−ＳＰ１ファージ上清の触媒有効性の評価に使用される様々な検定法について具体的に説明している。実施例１４は、選択された精製変異型ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼの触媒有効性および反応性の評価に使用される様々な検定法について具体的に説明している。
一例では、選択されたプロテアーゼ、例えば、選択されたｕ−ＰＡまたはＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼは、突然変異プロテアーゼトラップポリペプチドの所望の特異性プロフィールと適合するように選択されたものであり、所望の開裂配列に対応する個々の蛍光性ペプチド基質を用いて評価され得る。例えば、標的基質の所望の開裂配列のいずれか１つまたはそれ以上を開裂し得る修飾プロテアーゼについての検定方法は、（ａ）プロテアーゼの作用時に蛍光性部分がペプチド基質配列から放出されることにより、蛍光部分を生じさせるように、ペプチド蛍光性試料（所望の標的配列を含む）をプロテアーゼと接触させ、そして（ｂ）試料に蛍光の検出可能な変化が起こっているか否かを観察することを含むもので、この検出可能な変化は、試料中における酵素活性プロテアーゼの存在の指標である。かかる一例では、プロテアーゼを選択する際の所望の開裂配列は、当業界で公知の方法により蛍光性ペプチドへ作製される。一実施態様では、個々のペプチド開裂配列は、蛍光性標識基質、例えば、ＡＣＣまたはＡＭＣ蛍光性脱離基に結合され得、蛍光性部分の放出がペプチド開裂配列についてのプロテアーゼの特異性の尺度として測定され得る。標的開裂配列の蛍光の増加率は、例えば蛍光分光光度計を用いることにより測定され得る。蛍光の増加率は、時間経過とともに測定され得る。ミカエリス−メントン反応速度定数は、標準速度論的方法により決定され得る。反応速度定数ｋｃａｔ、Ｋｍおよびｋｃａｔ／Ｋｍは、基質濃度の逆数対基質開裂速度の逆数をグラフ化し、ラインウィーバー-バーク等式（１／速度＝（Ｋｍ／Ｖｍａｘ)（１／［Ｓ］）＋１／Ｖｍａｘ;式中、Ｖｍａｘ＝［ＥＴ］ｋｃａｔ）に当てはめることにより計算され得る。二次速度定数または特異性定数（ｋｃａｔ／Ｋｍ）は、基質が特定プロテアーゼによりいかにうまく切断されたかの尺度である。例えば、ＡＣＣ−またはＡＭＣ−テトラペプチド、例えばＡｃ−ＲＲＡＲ−ＡＭＣ、Ａｃ−ＳＬＧＲ−ＡＭＣ、Ａｃ−ＳＬＧＲ−ＡＣＣ、Ａｃ−ＲＱＡＲ−ＡＣＣを製造し、本発明方法で選択されたプロテアーゼとインキュベーションすると、蛍光性部分の放出について検定することによりプロテアーゼの活性が評価され得る。テトラペプチドの選択は、検定される所望の開裂配列に左右され、経験的に決定され得る。
溶液中のプロテアーゼに関する検定法は、多量のプロテアーゼ貯蔵液を蛍光性プロテアーゼインジケーターペプチドに加え、それに続く蛍光の増加または吸収スペクトルにおける励起バンドの減少を測定するだけでよい。また、溶液および蛍光性インジケーターを合わせて、プロテアーゼの活性を最適化する「消化緩衝液」中で検定することも可能である。プロテアーゼ活性の検定に適切な緩衝液は、当業者には公知である。一般に、緩衝液は、特定プロテアーゼのｐＨ最適条件に対応するｐＨにより選択される。例えば、エラスターゼ活性の検定に特に適切な緩衝液は、ｐＨ８.９で５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡを含む。測定は、発蛍光団用の「励起」光源を提供し、それに続いて放出された特定波長の光線を測定する器具である、蛍光計で行うのが最も容易である。プロテアーゼを欠く対照インジケーター溶液との比較により、プロテアーゼ活性の尺度が得られる。既知活性のプロテアーゼ溶液により生じた蛍光の変化率が測定される、プロテアーゼ／インジケーターの組合わせに関する標準曲線を作成することにより、活性レベルは正確に定量化され得る。
蛍光性化合物の検出は、蛍光計を用いて達成され得るが、検出は、当業者に公知の様々な他の方法により達成され得る。すなわち、例えば、発蛍光団が可視波長で放出されるとき、検出は光源による励起に応じた蛍光を視覚的に調べるだけで可能である。検出はまた、ディジタル処理装置にインターフェースで連結されたビデオカメラを用いた画像分析システムまたは他の画像捕捉システムによるものであり得る。検出はまた、蛍光顕微鏡のもとでのフィルターを通した視覚化によるものであり得る。顕微鏡は、操作者により簡単に視覚化されるシグナルを提供し得る。別法として、シグナルは、写真フィルムまたはビデオ解析システムを用いて記録され得る。シグナルはまた、画像分析システムまたは光度計を用いて実時間で単純に定量され得る。
すなわち、例えば、試料のプロテアーゼ活性に関する基本的検定法では、試料を緩衝液（検定されている特定プロテアーゼに最適なｐＨで）に懸濁または溶解し、蛍光性プロテアーゼペプチドインジケーターを緩衝液に加え、例えばHarris et al.（１９９８）Ｊ Biol Chem ２７３：２７３６４に示された要領で分光蛍光計を用いることにより生じた蛍光の変化を監視する。分光蛍光計は、発蛍光団の励起波長で発蛍光団を励起するように設定されている。蛍光性プロテアーゼインジケーターは、プロテアーゼによるインジケーターの開裂に起因する、蛍光を変化させるプロテアーゼの基質配列である。
また、選択されたプロテアーゼを検定することにより、完全長タンパク質の状況に置かれたときにそれらが所望の配列を開裂することを確認し得る。一例では、精製標的タンパク質、すなわちＶＥＧＦＲ２または補体タンパク質Ｃ２を、選択されたプロテアーゼの存在下または非存在下でインキュベーションし、開裂事象をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでタンパク質に関するクーマシーブリリアントブルー染色および濃度計を用いた開裂産物の分析によりモニターし得る。プロテアーゼによる完全長タンパク質の開裂の特異性定数を、ゲル濃度計を用いて測定することにより、プロテアーゼの存在下でインキュベーションした完全長標的基質バンドの濃度計での経時変化を評価することができる。さらにまた、所望の標的タンパク質の活性の検定に関する当業界で公知の方法を用いて標的タンパク質の活性を検定することにより、その機能が開裂事象により破壊されたことが証明され得る。
実施態様では、選択されたプロテアーゼ、典型的には修飾プロテアーゼの特異性の比較を用いることにより、選択されたプロテアーゼが、野生型または鋳型プロテアーゼと比べて改変された、例えば高い特異性を呈するか否かを測定し得る。標的基質に関するプロテアーゼの特異性は、修飾プロテアーゼが、野生型または鋳型プロテアーゼと比べて所与の活性でいかに多くの本質的に異なる配列を開裂するかを観察することにより測定され得る。修飾プロテアーゼが野生型プロテアーゼよりも開裂する標的基質が少ない場合、修飾プロテアーゼは、それらの標的基質に関して野生型プロテアーゼよりも高い特異性を有することになる。標的基質に関するプロテアーゼの特異性は、非標的基質（すなわち、プロテアーゼの天然野生型基質配列）と比較した標的基質の開裂の特異性定数から測定され得る。標的基質対非標的基質についての修飾プロテアーゼの特異性定数の比率を出すことにより、プロテアーゼの開裂効率が決定され得る。修飾プロテアーゼおよび野生型または鋳型プロテアーゼ間の開裂効率の比較を用いることにより、標的基質に関する特異性の倍率変化が評価され得る。特異性は、標的基質対非標的基質についての野生型または鋳型プロテアーゼの特異性と比較したとき、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００倍またはそれ以上であり得る。
Ｈ．プロテアーゼトラップポリペプチド（すなわちセルピン）またはその変異型またはプロテアーゼ／修飾プロテアーゼをコード化する核酸の製造方法
プロテアーゼトラップポリペプチドまたはプロテアーゼポリペプチドまたはその触媒活性部分、例えば修飾ｕ−ＰＡポリペプチドまたは修飾ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを含む本明細書記載のポリペプチドは、タンパク質精製および組換えタンパク質発現に関する当業界で公知の方法により得られる。所望の遺伝子をコード化する核酸の同定に関する当業界で公知の任意の方法が使用され得る。当業界で利用可能な方法を用いることにより、例えば細胞または組織供給源から所望のプロテアーゼトラップポリペプチドまたはプロテアーゼタンパク質をコード化する完全長（すなわち、全コーディング領域を包含する）ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡクローンが得られる。修飾ポリペプチド、例えば変異型プロテアーゼトラップポリペプチドまたは選択された変異型プロテアーゼは、本明細書記載の要領で野生型ポリペプチドから例えば位置指定突然変異導入により遺伝子工学的に製造され得る。
核酸分子のクローニングおよび単離に関する当業界で公知の利用可能な方法を用いて、ポリペプチドをクローン化または単離し得る。上記方法には、核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体に基づくスクリーニングおよび活性に基づくスクリーニングを含む、核酸のＰＣＲ増幅およびライブラリーのスクリーニングがある。
核酸の増幅方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を用いることにより、所望のポリペプチドをコード化する核酸分子を単離し得る。核酸含有材料を、所望のポリペプチドコード化核酸分子が単離され得る出発材料として用い得る。例えば、ＤＮＡおよびｍＲＮＡ調製物、細胞抽出物、組織抽出物、流体試料（例、血液、血清、唾液）、健康および／または罹患対象からの試料が増幅方法で使用され得る。核酸ライブラリーもまた、出発材料の供給源として使用され得る。プライマーは、所望のポリペプチドを増幅するように設計され得る。例えば、プライマーは、所望のポリペプチドが生成される発現された配列に基づいて設計され得る。プライマーは、ポリペプチドアミノ酸配列の復帰翻訳に基づいて設計され得る。増幅により生成された核酸分子の配列決定を行い、所望のポリペプチドをコード化するのを確認し得る。
追加的ヌクレオチド配列が、ベクター、例えばタンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質コーディングＤＮＡ配列の増幅用に設計されたベクターへ合成遺伝子をクローニングするため制限エンドヌクレアーゼ部位を含むリンカー配列を含むポリペプチドコード化核酸分子に連結され得る。さらに、機能的ＤＮＡ成分を特定する追加的ヌクレオチド配列が、ポリペプチドコード化核酸分子に機能し得るように結合され得る。上記配列の例には、限定されるわけではないが、細胞内タンパク質発現を促すように設計されたプロモーター配列、およびタンパク質分泌を促すように設計された分泌配列がある。タンパク質結合領域を特定する塩基配列などの追加的ヌクレオチド残基配列も、プロテアーゼコード化核酸分子に結合され得る。上記領域には、限定されるわけではないが、特異的標的細胞へのプロテアーゼの取り込みを促すか、または合成遺伝子産物の薬物動態を他の形で改変するタンパク質を促すかまたはコード化する残基の配列がある。
さらに、例えばポリペプチドの検出またはアフィニティー精製を助ける標識または他の部分も付加され得る。例えば、エピトープ標識または他の検出可能なマーカーを特定する塩基の配列などの追加的ヌクレオチド残基配列も、プロテアーゼコード化核酸分子またはセルピンコード化核酸分子、またはその変異型に結合され得る。例えば上記配列および核酸配列はＨｉｓ標識（例、６ｘＨｉｓ、ＨＨＨＨＨ；配列番号４９６）またはフラッグ標識（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号４９５）をコード化する。
次いで、同定および単離された核酸は、適切なクローニングベクターに挿入され得る。当業界で公知の多数のベクター-宿主系が使用され得る。可能なベクターには、限定されるわけではないが、プラスミドまたは修飾ウイルスがあるが、ベクター系は使用される宿主細胞と適合するものでなくてはならない。上記ベクターには、限定されるわけではないが、ラムダ誘導体などのバクテリオファージ、またはプラスミド、例えばｐＣＭＶ４、ｐＢＲ３２２またはｐＵＣプラスミド誘導体または Bluescript ベクター（Stratagene、ラジョラ、カリフォルニア）がある。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的付着末端を有するクローニングベクターへＤＮＡフラグメントをライゲーションすることにより達成され得る。挿入は、ＴＯＰＯクローニングベクター（INVITROGEN、カールスバッド、カリフォルニア）を用いて実施され得る。ＤＮＡのフラグメント化に使用される相補的制限部位がクローニングベクターに存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端は酵素的に修飾され得る。別法として、ヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端にライゲーションすることにより、いかなる所望の部位でも作製され得る。これらのリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコード化する特異的化学合成オリゴヌクレオチドを含み得る。別の方法では、開裂されたベクターとタンパク質遺伝子をホモポリマー末端結合により修飾し得る。組換え分子は、例えば形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔およびソノポレーションにより宿主細胞へ導入され得、その結果遺伝子配列の多数のコピーが作成される。
実施態様では、単離されたタンパク質遺伝子、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ配列を組み込んだ組み換えＤＮＡ分子による宿主細胞の形質転換により、遺伝子の多数のコピーが作成され得る。すなわち、遺伝子は、形質転換体を成長させ、組換えＤＮＡ分子を形質転換体から単離し、必要時には単離された組換えＤＮＡから挿入遺伝子を回収することにより大量に得られる。
１．ベクターおよび細胞
所望のタンパク質、例えば本明細書記載のものの１つまたはそれ以上を組み換え発現させる場合、タンパク質をコード化するヌクレオチド配列の全部または一部分を含む核酸を、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コーディング配列の転写および翻訳に必要な成分を含むベクターに挿入し得る。必要な転写および翻訳シグナルはまた、プロテアーゼ遺伝子に関する天然プロモーターおよび／またはそれらのフランキング領域により供給され得る。
また、本発明は、プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼをコード化する核酸を含むベクターを提供する。本発明はまたベクターを含む細胞を提供する。細胞は、真核生物および原核生物細胞を含み、ベクターはそこでの使用に適切なものであればよい。
本発明は、ベクターを含む原核生物および真核生物細胞、例えば内皮細胞を提供する。上記細胞には、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞がある。細胞を用いて、コード化されたタンパク質を細胞により発現させる条件下で上記細胞を成長させ、発現されたタンパク質を回収することにより、そのタンパク質を製造する。本発明での目的の場合、例えば、プロテアーゼは培地中へ分泌され得る。
一実施態様において、本発明は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコード化、例えば本発明によるｕ−ＰＡ変異型ポリペプチドのいずれかをコード化し、プロテアーゼドメインの全部または一部分、またはその多数のコピーを含むヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。また、本発明は、プロテアーゼドメインおよび完全長およびそれ以下の長さのプロテアーゼタンパク質を含むプロテアーゼタンパク質の追加的ドメインをコード化するヌクレオチド配列およびその多数のコピーを含むベクターを提供する。ベクターは、細胞で修飾プロテアーゼタンパク質またはそのプロテアーゼドメインを発現させるため、またはプロテアーゼタンパク質が分泌タンパク質として発現されるように選択され得る。プロテアーゼドメインを発現させるとき、上記核酸を、分泌シグナルをコード化する核酸、例えば出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）交配因子シグナル配列またはその一部分、または天然シグナル配列に連結する。
タンパク質コーディング配列を発現させるのに様々な宿主−ベクター系が使用され得る。これらには、限定されるわけではないが、ウイルス（例、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよび他のウイルス）感染させた哺乳類細胞系、ウイルス（例、バキュロウイルス）感染させた昆虫細胞系、微生物、例えば酵母含有酵母ベクターまたはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換した細菌がある。ベクターの発現エレメントは、それらの強度および特異性が変化する。使用する宿主−ベクター系によって、若干の適切な転写および翻訳エレメントのいずれか１つが使用され得る。
ベクターへのＤＮＡフラグメントの挿入に関する当業者に公知の方法を用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コーディング配列を含むキメラ遺伝子を含む発現ベクターが構築され得る。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技術およびインビボ組換え体（遺伝子組み換え）を含み得る。タンパク質、またはそのドメイン、誘導体、フラグメントまたは相同体をコード化する核酸配列の発現は、遺伝子またはそのフラグメントが組み換えＤＮＡ分子（複数も可）により形質転換された宿主において発現されるように第２の核酸配列により調節され得る。例えば、タンパク質の発現は、当業界で公知のプロモーター／エンハンサーにより制御され得る。一実施態様では、プロモーターは、所望のタンパク質に関する遺伝子にとって自然のものではない。使用され得るプロモーターには、限定されるわけではないが、ＳＶ４０初期プロモーター（Bernoist および Chambon, Nature 290:304-310 (1981)）、ラウス肉腫ウイルスの３'長末端反復に含まれるプロモーター（Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980)）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)）、原核生物発現ベクター、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター（Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543）またはｔａｃプロモーター（DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)）、また“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”:Scientific American 242:79-94 (1980)も参照）、ノパリンシンテターゼプロモーター（Herrar-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984)）またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター（Garder et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)）を含む植物発現ベクター、および光合成酵素リブロースビスリン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984)）、酵母および他の真菌からのプロモーターエレメント、例えばＧａｌ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーター、および組織特異性を呈し、トランスジェニック動物で使用されている以下の動物転写制御領域：膵腺房細胞で活性を示すエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)）、膵臓ベータ細胞で活性を示すインスリン遺伝子制御領域（Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)）、リンパ様細胞で活性を示す免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)）、精巣、胸部、リンパ様およびマスト細胞で活性を示すマウス乳癌ウイルス制御領域（Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)）、肝臓で活性を示すアルブミン遺伝子制御領域（Pinckert et al., Genes and Devel. 1:268-276 (1987)）、肝臓で活性を示すアルファ−フェトタンパク質遺伝子制御領域（Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987)）、肝臓で活性を示すアルファ−１抗トリプシン遺伝子制御領域（Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987)）、脊髄細胞で活性を示すベータグロビン遺伝子制御領域（Mogram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)）、脳の稀突起膠細胞で活性を示すミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987)）、骨格筋で活性を示すミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Sani, Nature 314:283-286 (1985)）および視床下部の性腺刺激細胞で活性を示す性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986)）がある。
一実施態様では、所望のタンパク質、またはそのドメイン、フラグメント、誘導体または相同体をコード化する核酸に機能し得るように結合されたプロモーター、１つまたはそれ以上の複製起点、および所望による１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー（例、抗生物質耐性遺伝子）を含むベクターが使用される。例えば、プロテアーゼタンパク質のプロテアーゼドメインのベクターおよび発現系は、公知のPichiaベクター（例えば、カリフォルニア、サンディエゴのInvitrogen から入手可能）、特にコード化されたタンパク質を分泌させるように設計されたものを含む。大腸菌（E.coli）細胞の形質転換用の典型的プラスミドベクターには、例えば、ｐＱＥ発現ベクター（カリフォルニア、バレンシアの Qiagenから入手可能；また、この系について記載しているQiagenにより出版された文献参照）がある。ｐＱＥベクターは、大腸菌（E.coli）において組換えタンパク質の堅固に調節された高レベル発現を実現させるためのファージＴ５プロモーター（大腸菌（E.coli）ＲＮＡポリメラーゼにより認識される）および二重ｌａｃオペレーター抑制モジュール、有効な翻訳のための合成リボソーム結合部位（ＲＢＳII）、６ＸＨｉｓ標識コーディング配列、ｔ０およびＴ１転写ターミネーター、ＣｏｌＥ１複製起点、およびアンピシリン耐性を付与するためのベータ−ラクタマーゼ遺伝子を有する。ｐＱＥベクターでは、組換えタンパク質のＮ−またはＣ−末端に６ｘＨｉｓ標識を配置させ得る。上記プラスミドにはｐＱＥ３２、ｐＱＥ３０およびｐＱＥ３１があり、それらは３読み枠全部についての多クローニング部位を提供し、Ｎ−末端６ｘＨｉｓ標識タンパク質を発現させる。大腸菌（E.coli）細胞を形質転換するための他の典型的なプラスミドベクターには、例えば、ｐＥＴ発現ベクター（米国特許第４９５２４９６号参照；ウィスコンシン、マディソンのNOVAGENから入手可能；この系について記載しているNOVAGENにより出版された文献参照）がある。上記プラスミドには、Ｔ７ｌａｃプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導性大腸菌（E.coli）ｌａｃオペレーター、およびｌａｃリプレッサー遺伝子を含むｐＥＴ１１ａ、Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーターおよび大腸菌（E.coli）ｏｍｐＴ分泌シグナルを含むｐＥＴ１２ａ−ｃ、およびＨｉｓカラムでの精製で使用されるHis-Tag（登録商標）リーダー配列およびカラムでの精製後開裂され得るトロンビン開裂部位、Ｔ７−ｌａｃプロモーター領域およびＴ７ターミネーターを含むｐＥＴ１５ｂおよびｐＥＴ１９ｂ（ウィスコンシン、マディソンのNOVAGEN）がある。
２．発現
タンパク質、例えばプロテアーゼトラップポリペプチドまたはその変異型、または選択されたプロテアーゼまたはその触媒活性部分を含む本明細書に示したタンパク質などは、インビボおよびインビトロ方法を含む当業者に公知の方法により製造され得る。所望のタンパク質は、要求される量および形態のタンパク質、例えば投与および処置に必要とされるものを製造するのに適切な生物体で発現され得る。発現宿主には、原核生物および真核生物、例えば大腸菌（E.coli）、酵母、植物、昆虫細胞、ヒトセルラインおよびトランスジェニック動物を含む哺乳類細胞がある。発現宿主は、それらのタンパク質生産レベルおよび発現されたタンパク質に存在する翻訳後修飾のタイプが異なり得る。発現宿主の選択は、これらおよび他の因子、例えば調節性および安全性の考察、製造費用および精製の必要性および方法に基づいて行われ得る。
多くの発現ベクターが利用可能で当業者には公知であり、タンパク質の発現に使用され得る。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択に影響される。一般に、発現ベクターは、転写プロモーターおよび所望によるエンハンサー、翻訳シグナルおよび転写および翻訳終結シグナルを含み得る。安定した形質転換に使用される発現ベクターは、典型的には形質転換細胞を選択および維持し得る選択可能なマーカーを有する。場合によっては、複製起点がベクターのコピー数の増幅に使用され得る。
タンパク質、例えば本発明による変異型プロテアーゼまたはプロテアーゼトラップポリペプチドまたはその変異型はまた、タンパク質融合体として利用または発現され得る。例えば、プロテアーゼ融合体を生成することにより、プロテアーゼに追加的機能性を付加し得る。プロテアーゼ融合タンパク質の例は、限定されるわけではないが、シグナル配列、例えば局在化の標識、例えばｈｉｓ６標識またはｍｙｃ標識、または精製用標識、例えばＧＳＴ融合体、およびタンパク質分泌および／または膜会合を指令する配列の融合体を含む。
一実施態様では、プロテアーゼは、活性形態で発現され得る。別の実施態様では、プロテアーゼは、不活性チモーゲン形態で発現される。
ａ．原核生物細胞
原核生物、特に大腸菌（E.coli）は、大量のタンパク質を生産する系を提供する。大腸菌（E.coli）の形質転換は、当業者に公知の単純で迅速な技術である。大腸菌（E.coli）のための発現ベクターは、誘導性プロモーターを含み得、上記プロモーターは、高レベルのタンパク質発現を誘導し、宿主細胞に何らかの毒性を呈するタンパク質を発現させるのに有用である。誘導性プロモーターの例には、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーターおよび温度調節λＰＬプロモーターがある。
タンパク質、例えば本発明によるものは、大腸菌（E.coli）の細胞質環境で発現され得る。細胞質は還元的環境であるため、分子によっては、不溶性封入体の形成が誘発される場合もある。還元剤、例えばジチオトレイトールおよびβ−メルカプトエタノールおよび変性剤、例えばグアニジン−ＨＣｌおよび尿素は、タンパク質を再溶解させるのに使用され得る。これに代わる方法は、酸化環境およびシャペロン様およびジスルフィドイソメラーゼを提供し、可溶性タンパク質の産生を誘導し得る細菌の周辺腔におけるタンパク質の発現である。典型的には、リーダー配列を発現させるべきタンパク質に融合することにより、そのタンパク質をペリプラズムに指向させる。次いで、リーダー配列を、ペリプラズム内側のシグナルペプチダーゼにより除去する。ペリプラズム−ターゲッティングリーダー配列の例には、ペクチン酸リアーゼ遺伝子からのｐｅｌＢリーダーおよびアルカリ性ホスファターゼ遺伝子から誘導されるリーダーがある。場合によっては、ペリプラズム発現により、発現されたタンパク質が培養培地中へ漏出されることもある。タンパク質の分泌により、培養上清からの迅速かつ簡単な精製が可能となる。分泌されないタンパク質は、浸透溶解によりペリプラズムから得られる。細胞質発現と同様に、場合によってはタンパク質が不溶性になることもあり得るため、変性剤および還元剤を用いることにより、可溶化および再折りたたみを促進し得る。誘導および成長温度もまた、発現レベルおよび溶解度に影響を及ぼし得、典型的には２５℃〜３７℃の温度が使用される。典型的には、細菌は非グリコシル化タンパク質を生産する。すなわち、タンパク質が機能するのにグリコシル化を必要とする場合、宿主細胞からの精製後にグリコシル化がインビトロで付加され得る。
ｂ．酵母細胞
出芽酵母（Saccharomyces cerevisae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、クルイベロマイシス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母は、タンパク質、例えば本明細書記載のものの製造に使用され得る公知の酵母発現宿主である。酵母は、エピソーム複製ベクターまたは相同的組換えによる安定した染色体組込みにより形質転換され得る。典型的には、誘導性プロモーターを用いて遺伝子発現を調節する。上記プロモーターの例には、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ５およびメタロチオネインプロモーター、例えばＣＵＰ１、ＡＯＸ１または他のピキア（Pichia）または他の酵母プロモーターがある。発現ベクターは、形質転換されたＤＮＡを選択および維持するために選択可能なマーカー、例えばＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＵＲＡ３を含むことが多い。酵母で発現されたタンパク質は多くの場合可溶性である。シャペロン、例えばＢｉｐおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの共発現により、発現レベルおよび溶解度は改善され得る。さらに、酵母で発現されたタンパク質は、分泌シグナルペプチド融合体、例えば出芽酵母（Saccharomyces cerevisae）からの酵母交配型アルファ因子分泌シグナルおよび酵母細胞表面タンパク質、例えばＡｇａ２ｐ交配接着受容体またはアルクスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）グルコアミラーゼとの融合体を用いることにより分泌へ向けて指令され得る。例えばＫｅｘ−２プロテアーゼに関するプロテアーゼ開裂部位に遺伝子操作を加えることにより、分泌経路を出るとき発現されたポリペプチドから融合配列が除去され得る。酵母はまた、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフでグリコシル化され得る。
ｃ．昆虫細胞
特にバキュロウイルス発現系を用いる昆虫細胞は、ポリペプチド、例えば修飾プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼトラップポリペプチドの発現に有用である。昆虫細胞は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物により使用される翻訳後修飾の大部分を行い得る。バキュロウイルスは限定的な宿主範囲を有するため、真核生物発現の安全性は改善され、調節に関する懸念は減じられる。典型的な発現ベクターは、高レベル発現用プロモーター、例えばバキュロウイルスの多角体タンパク質プロモーターを使用する。常用されるバキュロウイルス系には、バキュロウイルス、例えばアウトグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）、およびボンビクス・モリ（bombyx mori）核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）および昆虫セルライン、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）から誘導されたＳｆ９、シューダレチア・ウニプンクタ（Pseudaletia unipuncta）（Ａ７Ｓ）およびダナウス・プレキシプス（Danaus plexippus）（ＤｐＮ１）がある。高レベル発現の場合、発現させる分子のヌクレオチド配列を、ウイルスの多角体開始コドンの下流に隣接して融合させる。哺乳類分泌シグナルを昆虫細胞で正確にプロセッシングして用いることにより、発現されたタンパク質は培養培地中へ分泌され得る。さらに、セルライン、シューダレチア・ウニプンクタ（Pseudaletia unipuncta）（Ａ７Ｓ）およびダナウス・プレキシプス（Danaus plexippus）（ＤｐＮ１）は、哺乳類細胞系と類似したグリコシル化パターンをもつタンパク質を生産する。
昆虫細胞における別の発現系は、安定して形質転換された細胞の使用である。シュニーダー（Schnieder）２（Ｓ２）およびＫｃ細胞（ドロソフィラ・メラノガスター、Drosophila melanogaster）およびＣ７細胞（エデス・アルボピクツス、Aedes albopictus）などのセルラインが、発現に使用され得る。ドロソフィラ（Drosophila）メタロチオネインプロモーターは、カドミウムまたは銅による重金属誘導の存在下で高レベルの発現を誘導するのに使用され得る。発現ベクターは、典型的には選択可能なマーカー、例えばネオマイシンおよびハイグロマイシンの使用により維持される。
ｄ．哺乳類細胞
哺乳類発現系は、修飾プロテアーゼまたはその触媒活性部分、またはプロテアーゼトラップポリペプチドまたはその変異型を含むタンパク質の発現に使用され得る。発現構築物は、アデノウイルスなどのウイルス感染により、またはリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランなどの直接ＤＮＡ導入、および物理的手段、例えば電気穿孔および顕微注入により哺乳類細胞へ導入され得る。哺乳類細胞用の発現ベクターは、典型的には、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（コザック共通配列）およびポリアデニル化エレメントを含む。上記ベクターは、高レベル発現用の転写プロモーター−エンハンサー、例えばＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長末端反復を含むことが多い。これらのプロモーター−エンハンサーは、多くの細胞型において活性を示す。組織および細胞型プロモーターおよびエンハンサー領域もまた発現に使用され得る。プロモーター／エンハンサー領域の例には、限定されるわけではないが、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳癌ウイルス、アルブミン、アルファフェトタンパク質、アルファＩ抗トリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２、および性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御域などの遺伝子からの領域がある。選択可能なマーカーは、発現構築物をもつ細胞を選択し、維持するのに使用され得る。選択可能なマーカー遺伝子の例には、限定されるわけではないが、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびチミジンキナーゼがある。ＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γなどの細胞表面シグナリング分子との融合により、細胞表面上で活性状態のタンパク質の発現が指令され得る。
マウス、ラット、ヒト、サル、ニワトリおよびハムスター細胞を含む哺乳類発現については、多くのセルラインが利用可能である。セルラインの例には、限定されるわけではないが、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌性）および他のセルライン、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマセルライン、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２Ｂ８およびＨＫＢ細胞がある。セルラインはまた血清不含有培地に適合させた形で利用され得、細胞培養培地からの分泌タンパク質の精製が容易になる。上記の一例は、血清不含有ＥＢＮＡ−１セルライン（Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42）である。
ｅ．植物
トランスジェニック植物細胞および植物は、タンパク質の発現、例えば本明細書記載のタンパク質の発現に使用され得る。発現構築物は、典型的には直接ＤＮＡ導入、例えばマイクロプロジェクタイル法およびプロトプラストへのＰＥＧを介した導入、およびアグロバクテリウムによる形質転換を用いて植物に導入される。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結エレメントおよび翻訳制御エレメントを含み得る。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常、アラビドプシス（Arabidopsis）およびタバコなどの双子葉植物宿主およびトウモロコシおよびイネなどの単子葉植物宿主に分けられる。発現に使用される植物プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボースビスリン酸カルボキシラーゼプロモーターおよびユビキチンおよびＵＢＱ３プロモーターがある。形質転換細胞の選択および維持を容易にするために、ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーぜなどの選択可能なマーカーを使用することが多い。形質転換植物細胞は、細胞、凝集体（カルス組織）として培養中で維持されるか、または総体植物に再生され得る。トランスジェニック植物細胞はまた、プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼを生産するように遺伝子操作が加えられた藻類を含み得る（例えば、Mayfield et al. (2003) PNAS 100:438-442参照）。植物は、哺乳類細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するため、このことはこれらの宿主で製造されるタンパク質の選択に影響を及ぼし得る。
３．精製技術
宿主細胞からのプロテアーゼポリペプチドまたは他のタンパク質を含むポリペプチドの精製方法は、選択された宿主細胞および発現系により異なる。分泌分子の場合、一般に細胞除去後にタンパク質を培養培地から精製する。細胞内発現の場合、細胞を溶解し、抽出物からタンパク質を精製し得る。トランスジェニック植物および動物などのトランスジェニック生物体を発現に使用するとき、組織または器官を出発材料として用いることにより、溶解細胞抽出物を製造し得る。さらに、トランスジェニック動物生産は、回収され得る乳または卵でのポリペプチドの生産を含み得、必要ならば、当業界での標準的方法を用いてタンパク質を抽出し、さらに精製し得る。
一例では、プロテアーゼは、発現および精製されて不活性形態（チモーゲン形態）をとり得るか、または別法として発現されたプロテアーゼは、自触により活性形態、例えば２本鎖形態に精製されて、プロ領域が除去され得る。典型的には、自己賦活は、例えば室温で２４〜７２時間インキュベーションすることにより、精製過程中に起こる。活性化の速度および程度は、タンパク質濃度および特異的修飾プロテアーゼにより異なり、例えば、高希釈試料は、室温で長期間インキュベーションする必要があり得る。活性化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（例、３キロダルトンのシフト）および酵素活性（蛍光性基質の開裂）によりモニターされ得る。典型的には、プロテアーゼを精製前に７５％を超える活性化に到達させる。
タンパク質、例えばプロテアーゼまたはプロテアーゼトラップポリペプチドは、当業界で公知の標準タンパク質精製技術、例えば、限定されるわけではないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿およびアニオン交換などのイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製され得る。また、調製物の有効性および純度を改良するのにアフィニティー精製技術も利用され得る。例えば、抗体、受容体およびプロテアーゼまたはプロテアーゼトラップポリペプチドと結合する他の分子がアフィニティー精製で使用され得る。また、発現構築物には、ｍｙｃエピトープ、ＧＳＴ融合体またはＨｉｓ６などのタンパク質にアフィニティー標識を付加する遺伝子操作が加えられ、ｍｙｃ抗体、グルタチオン樹脂およびＮｉ樹脂によりそれぞれアフィニティー精製され得る。純度は、ゲル電気泳動および染色および分光測光技術を含む当業界で公知の方法により評価され得る。
４．融合タンパク質
本発明はまた、本発明による変異型プロテアーゼおよび１つまたはそれ以上の他のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。本発明は、適切な経路による投与用に処方された上記融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。融合タンパク質は、プロテアーゼの精製を容易にし、プロテアーゼを標的細胞または組織に指向させることによりプロテアーゼの薬物動態特性を改変し、そして／またはプロテアーゼの発現または分泌を高めることを目的として修飾プロテアーゼおよび別のポリペプチド、例えば抗体またはそのフラグメント、成長因子、受容体、リガンドおよび他の上記作用物質を何らかの順序で結合することにより形成される。プロテアーゼ融合タンパク質内において、プロテアーゼポリペプチドは、プロテアーゼタンパク質の全部またはその触媒活性部分に相当し得る。若干の実施態様では、プロテアーゼまたはその触媒活性部分は修飾プロテアーゼである。本発明による融合タンパク質は、所望の標的基質の１つまたはそれ以上についてのそれらの特異性および／または選択性を実質的に全て保持している。一般的に、プロテアーゼ融合ポリペプチドは、非融合プロテアーゼと比べた場合少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％の基質特異性および／または選択性を保持しており、さらに非融合プロテアーゼと比べて９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより大きい基質特異性を保持している場合もある。
プロテアーゼポリペプチドおよび別のポリペプチドの結合は、直接的またはリンカーを介して間接的に行われ得る。一例では、結合は、例えばヘテロ二官能性剤を介した化学結合またはチオール結合または他の同様の結合によるものであり得る。プロテアーゼと別のポリペプチドとの融合は、プロテアーゼポリペプチドのＮ−またはＣ−末端に対して行われ得る。本発明プロテアーゼとの融合タンパク質で使用され得るポリペプチドの非限定的な例には、例えば、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）ポリペプチド、免疫グロブリンからのＦｃドメイン、または異種シグナル配列がある。融合タンパク質は、さらなる成分、例えば細胞によるタンパク質の取り込みを助ける大腸菌（E.coli）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を含み得る（例えば、国際ＰＣＴ出願第０１／３２７１１号参照）。
プロテアーゼ融合タンパク質は、標準的組換え技術により製造され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、慣用的技術にしたがって、例えば連結用に平滑末端またはスタッガー末端を用い、制限酵素消化により適切な末端を形成させ、適宜付着末端を補充し、アルカリ性ホスファターゼ処理により望ましくない結合を回避し、酵素的ライゲーションにより、枠内で連結させ得る。別の実施態様では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む慣用的技術により合成され得る。別法として、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子フラグメント間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを用いて実施され得、続いて上記フラグメントはアニーリングおよび再増幅されることによりキメラ遺伝子配列を生じさせ得る（例えば、Ausubel et al. (編) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, １９９２参照）。さらに、既に融合部分（例、ＧＳＴポリペプチド）をコード化している多くの発現ベクターが市販されている。プロテアーゼコード化核酸は、融合部分がプロテアーゼタンパク質と枠内で結合されるように上記発現ベクターにクローン化され得る。
５．ヌクレオチド配列
本発明は、修飾プロテアーゼをコード化する核酸分子を提供する。核酸分子は、コード化されたプロテアーゼまたはその触媒活性部分の対立遺伝子変異型またはスプライス変異型を含む。一実施態様では、本発明による核酸分子は、核酸コード化野生型プロテアーゼまたはその触媒活性部分と少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５または９９％の配列同一性を有するか、またはその完全長の少なくとも７０％に沿って中程度または高度ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションする。別の実施態様では、核酸分子は、プロテアーゼまたはその触媒活性部分のいずれか、例えば本明細書記載のものの変性コドン配列を有するものを含み得る。
本発明はまた、プロモーター、例えば哺乳類細胞での発現に関する誘導性プロモーターに機能し得るように結合された核酸分子、または核酸分子の触媒活性部分を含む融合タンパク質を提供する。上記プロモーターには、限定されるわけではないが、ＣＭＶおよびＳＶ４０プロモーター、アデノウイルスプロモーター、例えばＨＰＶ Ｅ７腫瘍性タンパク質に反応するＥ２遺伝子プロモーター、ＰＶプロモーター、例えばＰＶ Ｅ２タンパク質に反応するＰＢＶ ｐ８９プロモーター、およびＨＩＶまたはＰＶまたは発癌遺伝子により活性化される他のプロモーターがある。
本発明による修飾プロテアーゼはまた、遺伝子導入ベクターで細胞に送達され得る。導入ベクターはまた、プロテアーゼが投与される疾患または障害、例えば凝固疾患または癌を処置するための他の追加的治療剤（複数も可）をコード化し得る。プロテアーゼをコード化する導入ベクターは、対象に核酸を投与することにより全身的に使用され得る。例えば、導入ベクターは、ウイルス性ベクター、例えばアデノウイルスベクターであり得る。プロテアーゼをコード化するベクターはまた、幹細胞に組み込まれ、上記幹細胞は、例えば治療部位に幹細胞を移植または植え付けることにより対象に投与され得る。例えば、間葉幹細胞（ＭＳＣ）に対し、プロテアーゼを発現するように遺伝子操作を加え、上記ＭＳＣを腫瘍の治療部位に植え付け得る。
Ｉ．選択されたプロテアーゼポリペプチドの調製、処方および投与
１．組成物および送達
選択されたプロテアーゼ、例えば選択された突然変異体ｕ−ＰＡポリペプチドの組成物は、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内注射、皮下、硬膜外、経鼻、経口、直腸、局所、吸入、頬側（例、舌下）および経皮投与または任意の経路を含む当業者に公知の経路による投与用に処方され得る。選択されたプロテアーゼは、慣用的経路により、例えば注入またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜内層（例、口腔粘膜、直腸および腸粘膜等）からの吸収により投与され得、連続的、断続的または同一組成物中で他の生物活性剤と共に投与され得る。処置を施す位置によって、限局的、局所的または全身的投与であり得る。処置を必要とする領域への局所投与は、例えば、術中の局部注入、例えば術後の創傷用包帯と連係的させた局所適用、注射、カテーテル手段、坐薬、または移植体手段により行われ得るが、これらに限定されるわけではない。投与法はまた、放出制御型製剤およびポンプ手段などの放出制御装置を含む放出制御系を含み得る。所与の症例で最適な経路は、疾患の性質、疾患の進行状態、疾患の重症度、使用する特定組成物など様々な因子により異なる。
様々な送達系が知られており、選択されたプロテアーゼの投与に使用され得、例を挙げると、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルでの封入、化合物を発現し得る組換え細胞、受容体介在によるエンドサイトーシス、および選択されたプロテアーゼをコード化する核酸分子の送達、例えばレトロウイルス送達系があるが、これらに限定されるわけではない。
選択されたプロテアーゼを含む医薬組成物が製造され得る。一般的に、医薬上許容される組成物は、動物および人体での使用に関する公認の薬局方に準じて設けられた統制機関または他の機関による承認を考慮して製造される。医薬組成物は、イソ型を投与する際の希釈剤、補助薬、補形薬または賦形剤などの担体を含み得る。上記医薬用担体は、石油、動物性、植物性または合成起源のものを含む無菌の液体、例えば水および油類、例えば、落花生油、大豆油、鉱油およびゴマ油であり得る。医薬組成物を静脈内投与するとき、水は典型的な担体である。食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセリン溶液も、特に注射可能溶液のための液体担体として使用され得る。組成物は、有効成分と一緒に、希釈剤、例えば乳糖、ショ糖、リン酸二カルシウムまたはカルボキシメチルセルロース、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルク、および結合剤、例えば澱粉、天然ゴム、例えばアラビアゴム、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドンおよび当業者に公知の他の同様の結合剤を含み得る。適切な医薬用補形薬には、澱粉、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、稲、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレン、グリコール、水およびエタノールがある。所望ならば、組成物はまた、少量の湿潤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤、例えば、アセテート、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレエート、および他の同様の薬剤を含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル剤、散剤および持効性製剤の形態をとり得る。組成物は、慣用的結合剤および担体、例えばトリグリセリドを用いた坐薬として処方され得る。経口用処方物は、標準担体、例えば医薬グレートのマンニトール、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム、他の同様の薬剤を含み得る。適切な医薬用担体の例は、E. W. Martin による"Remington's Pharmaceutical Sciences" に記載されている。上記組成物は、患者に対し適正な投与を行う形態を提供するために、一般的には純粋形態で、適量の担体と一緒に治療有効量の化合物を含有する。処方物は、投与方式に適合するべきである。
処方物は、適量の化合物またはその医薬上許容される誘導体を含有する単位用量形態、例えば錠剤、カプセル剤、丸薬、散剤、顆粒剤、滅菌非経口用溶液または懸濁液、および経口用溶液または懸濁液、および油水エマルジョンでヒトおよび動物への投与用に提供される。医薬的治療活性化合物およびその誘導体は、典型的には単位用量形態または多用量形態で処方および投与される。各単位用量は、所望の治療効果をあげるのに十分な予め定められた量の治療活性化合物を、必要とされる医薬用担体、賦形剤または希釈剤と共に含む。単位用量形態の例には、アンプルおよび注射器および個別にパッケージされた錠剤またはカプセル剤がある。単位用量形態は、分割して、またはまとめて投与され得る。複数用量形態は、単一容器にパッケージされた複数の同一単位用量形態であり、分離した単位用量形態で投与される。複数用量形態の例には、バイアル、錠剤またはカプセル剤の瓶またはパイントまたはガロン単位の瓶がある。このため、複数用量形態は、パッケージ中では分離されていない単位用量の集合体である。
０.００５％〜１００％の範囲で有効成分を含有し、残りは非毒性担体から成る用量形態または組成物が製造され得る。経口投与の場合、医薬組成物は、例えば、医薬上許容される賦形剤、例えば結合剤（例、前ゼラチン化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例、乳糖、微晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例、ジャガイモ澱粉または澱粉グリコール酸ナトリウム）または湿潤剤（例、ラウリル硫酸ナトリウム）による慣用的手段により製造される錠剤またはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は、当業界で公知の方法によりコーティングされ得る。
医薬調製物はまた、液体形態、例えば溶液、シロップまたは懸濁液であり得るか、または使用前に水または他の適切な賦形剤により再構成される薬剤製品として提供され得る。上記液体調製物は、医薬上許容される添加剤、例えば懸濁剤（例、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）、乳化剤（例、レシチンまたはアカシア）、非水性賦形剤（例、扁桃油、油性エステルまたは精製植物油）、および保存剤（例、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を用いた慣用的手段により製造され得る。
直腸投与に適切な処方物は、単位用量坐薬として提供され得る。これらは、活性化合物を、１種またはそれ以上の慣用的担体、例えばココアバターと混合し、次いで得られた混合物を成型することにより製造され得る。
皮膚または眼への局所適用に適切な処方物には、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エーロゾルおよび油類がある。担体の例には、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、およびこれらの２つまたはそれ以上の組合わせがある。局所用処方物はまた、０.０５〜１５、２０、２５重量パーセントの割合で、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ／ヒドロキシアルキル、（メタ）アクリレートまたはポリ（メタ）アクリルアミドから選択される増粘剤を含み得る。局所用処方物は、点眼薬または結膜嚢への軟膏として適用されることが多い。それはまた、眼、顔面洞および外耳道の洗浄または潤滑に使用され得る。それはまた、前眼房および他の場所に注射され得る。液体状態の局所用処方物はまた、活性成分が放出されるストリップまたはコンタクトレンズ形態で親水性三次元ポリマーマトリックス中に存在し得る。
吸入による投与の場合、本発明で使用する化合物は、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスの使用により、加圧パックからのエーロゾル噴霧装置またはネブライザーの形態で送達され得る。加圧エーロゾルの場合、投薬単位はバルブ設けて定量を送達することにより測定され得る。吸入器または注入器で使用される例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物および適切な粉末基剤、例えば乳糖または澱粉の粉末混合物を含むものとして製剤化され得る。
頬側（舌下）投与に適切な処方物には、例えば、調味した基剤、通常ショ糖およびアカシアまたはトラガカントゴム中に活性化合物を含む舐剤およびゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアカシアなどの不活性基剤中に化合物を含むトローチ剤がある。
選択されたプロテアーゼの医薬組成物は、注射、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に処方され得る。注射用処方物は、保存剤を加えた、例えばアンプルまたは複数用量容器中での単位用量形態をとり得る。組成物は、油性または水性賦形剤中の懸濁液、溶液またはエマルジョンであり得、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの調剤成分を含み得る。別法として、有効成分は、使用前に適切な賦形剤、例えば無菌で発熱物質不含有の水または他の溶媒による再構成用の粉末形態であり得る。
本発明は経皮投与に適切な処方物を提供する。それらは、適切な形式、例えば長期間にわたって受容者の表皮と緊密接触した状態を保つのに適合化された個別パッチで提供され得る。上記パッチは、例えば、活性化合物に関して０.１〜０.２Ｍ濃度の所望により緩衝状態にされていてもよい水溶液中に活性化合物を含む。経皮投与に適切な処方物はまた、イオン導入法（例えば、Pharmaceutical Research 3(6), 318 (1986)参照）により送達され、典型的には活性化合物の所望により緩衝状態にされていてもよい水溶液の形態をとり得る。
医薬組成物はまた放出制御型製剤および／または送達装置により投与され得る（例えば、米国特許第３,５３６,８０９;３,５９８,１２３;３,６３０,２００;３,８４５,７７０；３,８４７,７７０;３,９１６,８９９;４,００８,７１９；４,６８７,６１０;４,７６９,０２７;５,０５９,５９５;５,０７３,５４３;５,１２０,５４８；５,３５４,５６６；５,５９１,７６７;５,６３９,４７６;５,６７４,５３３および５,７３３,５６６号参照）。
ある実施態様では、リポソームおよび／またはナノ粒子も選択されたプロテアーゼの投与に使用され得る。リポソームは、水性媒質に分散され、同時に多重ラメラ同心二分子層小胞（多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは、一般に２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶを超音波処理すると、コアに水溶液を含む２００〜５００オングストロームの範囲の直径を有する小さい単ラメラ小胞（ＳＵＶ）が形成される。
リン脂質は、水に分散されると、脂質対水のモル比によって、リポソーム以外の様々な構造を形成し得る。低比では、リポソームが形成される。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に左右される。リポソームは、イオン性および極性基質への低い透過性を示し得るが、高温ではそれらの透過性を著しく改変する相転移が起こる。相転移は、ゲル状態として知られる密に圧縮された規則正しい構造から、流動状態として知られる緩い圧縮状態で、規則正しさの劣る構造への変化を伴う。これは、特徴的な相転移温度で起こり、イオン、糖類および薬物への透過性を高めることになる。
リポソームは、種々の機構：マクロファージおよび好中球などの細網内皮細胞系の食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水的または静電的力または細胞表面成分との特異的相互作用による細胞表面への吸着；細胞質へのリポソーム成分の同時放出を伴う、原形質膜へのリポソームの脂質二分子層の挿入による原形質膜との融合；およびリポソーム内容物の会合を伴わない、細胞膜または細胞レベル下の膜へのリポソーム脂質の転移（またはその逆）により細胞と相互作用する。リポソームの処方を変えると、どの機構が機能的であるかも改変され得るが、同時に複数が機能することも可能である。ナノカプセルは、一般的に安定した再生可能な形で化合物を包括し得る。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を回避するためには、生体内で分解されるポリマーを用いて、このような超微細粒子（０.１μｍ前後の大きさ）を設計するべきである。本発明では、これらの必要条件を満たす生体分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子の使用を考えており、上記粒子は容易に製造され得る。
タンパク質分解および抗原性および免疫原性応答による免疫学的介入などの分解的過程への選択されたプロテアーゼの暴露を減らす投与方法が採用され得る。上記方法の例には、治療部位での局所投与がある。治療薬のペギル化は、タンパク質分解に対する抵抗を高め、血中半減期を延長し、抗原性および免疫原性を減らすことが報告されている。ペギル化方法の例は文献により公知である（例えば、Lu and Felix, Int. J. Peptide Protein Res., 43: 127-138, 1994; Lu および Felix, Peptide Res., 6: 142-6, 1993; Felix et al., Int. J. Peptide Res., 46 : 253-64, 1995; Benhar et al., J. Biol. Chem., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu et al., J Immunol., 154: 3088-95, 1995、参照; また、Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77 および Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S参照）。ペギル化はまた核酸分子のインビボ送達にも使用され得る。例えば、アデノウイルスのペギル化は、安定性および遺伝子導入を高め得る（例えば、Cheng et al. (2003) Pharm. Res. 20(9): 1444-51参照）。
望ましい血中レベルは、血漿レベルで確認されるとおり活性成分の連続注入により維持され得る。主治医は、毒性、または骨髄、肝臓または腎臓機能不全により、いつどのように治療を終結、中断または低用量に調節するべきかを承知しているものとする。逆に、主治医はまた、臨床応答が十分なものではない（毒性副作用を除外する）場合、いつどのように治療を高レベルに調節するかを承知しているはずである。
医薬組成物は、例えば、経口、経肺、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射）、吸入（微細粉末製剤による）、経皮、鼻、膣、直腸または舌下投与経路により投与され得、各投与経路に適切な用量形態で処方され得る（例えば、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９３／２５２２１号および同第ＷＯ９４／１７７８４号および欧州特許出願第６１３６８３号参照）。
選択されたプロテアーゼは、処置されている患者に対して望ましくない副作用をもたらすことなく治療上有効な効果を発揮するのに十分な量で医薬上許容される担体に含まれる。治療有効濃度は、本明細書記載の検定法など、公知インビトロおよびインビボ系で化合物を試験することにより経験的に決定され得る。
組成物中の選択されたプロテアーゼの濃度は、複合体の吸収、不活化および排出速度、複合体の物理化学特性、投薬スケジュール、および投与量並びに当業者に公知の他の因子により異なる。疾患または状態の処置、例えば癌または新脈管形成の処置に関する選択されたプロテアーゼの投与量は、標準的臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロ検定法および動物モデルの使用は、最適な投薬量範囲の確認の助けとなり得る。経験的に決定され得る正確な用量は、投与経路および疾患の重症度により異なり得る。
選択されたプロテアーゼは、一度に投与され得るか、または数回の小用量に分割され、時間間隔をおいて投与され得る。選択されたプロテアーゼは、処置の経過にともなって、例えば数時間、数日、数週間または数カ月にわたって１回または複数回の用量で投与され得る。場合によっては、連続投与が有用なこともある。正確な用量および処置の持続時間は、処置されている疾患の相関的要素であり、公知試験プロトコルを用いて経験的に、またはインビボまたはインビトロ試験データから補外することにより決定され得るものとする。濃度および投薬量値はまた緩和すべき状態の重症度により変動し得るものとする。さらに、特定対象についての、特定投薬プログラムは、個体の必要性および組成物投与の管理または監督者の専門的判断に応じて時間経過に伴って調節されるべきであり、本明細書で示した濃度範囲は典型例に過ぎず、それらを含む組成物および組合わせの範囲または使用を制限する意図はないものとする。組成物は、毎時、毎日、毎週、毎月、毎年または１回投与され得る。遺伝子治療のためのポリペプチドを含む組成物および核酸を含む組成物の投与方式には、限定されるわけではないが、病変部内、腹腔内、筋肉内および静脈内投与がある。また、注入、鞘内、皮下、リポソーム型、デポー型投与も含まれる。また、経鼻、経眼、経口、局所的、限局的および経耳送達も含まれる。投与量は経験的に決定され、適応症、投与方式および対象により異なり得る。具体的な用量は、対象の体重に基づいて０.１、１、１０、１００、２００ｍｇ／日／ｋｇおよびそれ以上である。
２．選択されたプロテアーゼのインビボ発現および遺伝子治療
選択されたプロテアーゼは、核酸分子の発現により細胞および組織へ送達され得る。選択されたプロテアーゼは、エクスビボ技術および直接インビボ発現を含め、選択されたプロテアーゼをコード化する核酸分子として投与され得る。
ａ．核酸の送達
核酸は、当業者に公知の方法で細胞および組織へ送達され得る。
ｉ．ベクター−エピソームおよび組み込み
コード化核酸分子の発現による選択されたプロテアーゼの投与方法には、組換えベクターの投与が含まれる。ベクターは、例えば複製起点の封入によりエピソームのままであるように設計され得るか、または細胞で染色体へ組み込まれるように設計され得る。組換えベクターは、ウイルス性ベクターおよび非ウイルス性ベクターを含み得る。非限定的なウイルス性ベクターには、例えばアデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよび当業者に公知の他のウイルス性ベクターがある。非限定的な非ウイルス性ベクターには、人工染色体またはリポソームまたは他の非ウイルス性ベクターがある。選択されたプロテアーゼはまた、ウイルス性および非ウイルス性ベクターを用いるエクスビボ遺伝子発現療法で使用され得る。例えば、細胞に対し、例えば選択されたプロテアーゼをコード化する核酸を、調節配列と機能し得るように結合させたゲノム位置に組み込むか、または上記核酸をゲノム位置において調節配列に機能し得るように結合させて配置することによる遺伝子操作を加えて選択されたプロテアーゼを発現させ得る。次いで上記細胞は、対象、例えば処置を必要とする患者に局所または全身に投与され得る。
選択されたプロテアーゼは、ウイルスにより発現され得、処置を必要とする対象に投与される。遺伝子治療に適切なウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよび上記の他のものがある。例えば、アデノウイルス発現技術は当業界ではよく知られており、アデノウイルス生産および投与方法も熟知されている。アデノウイルス血清型は例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド）から入手可能である。アデノウイルスは、エクスビボで使用され得、例えば処置を必要とする患者から細胞を単離し、選択されたプロテアーゼを発現するアデノウイルスベクターにより形質導入する。適切な培養期間後、形質導入された細胞を対象に局所または全身投与する。別法として、選択されたプロテアーゼを発現するアデノウイルス粒子を単離し、対象の疾患または状態を予防、処置または改善することを目的として治療有効量を送達するための医薬上許容される担体中で製剤化する。典型的には、アデノウイルス粒子は、対象体重１キログラム当たり１粒子〜１０１４粒子、一般的には対象体重１キログラム当たり１０６または１０８粒子〜１０１２粒子の用量範囲で送達される。状況によっては、細胞をターゲッティングする作用物質、例えば細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体または標的細胞上の受容体に関するリガンドと共に核酸供給源を提供することが望ましい場合もある。
ii．人工染色体および他の非ウイルス性ベクター送達方法
核酸分子は、人工染色体および他の非ウイルス性ベクターへ導入され得る。人工染色体（例えば、米国特許第６０７７６９７号およびＰＣＴ国際ＰＣＴ出願第ＷＯ０２／０９７０５９号参照）には、イソ型をコード化し、発現するように遺伝子操作が加えられ得る。
iii．リポソームおよび他の封入形態および核酸を含む細胞の投与
核酸は、リポソームなどの伝達体中に封入されるか、または細胞、例えば細菌細胞、特に弱毒化細菌に導入されかまたはウイルス性ベクターに導入され得る。例えば、リポソームを使用するとき、エンドサイトーシスに随伴して細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質がターゲッティングおよび／または取り込みの促進に使用され得、例えば特定細胞型に親和性を示すキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、循環中にインターナリゼーションが行われるタンパク質についての抗体、および細胞内限局化をターゲッティングし、細胞内半減期を高めるタンパク質がある。
ｂ．インビトロおよびエクスビボ送達
エクスビボおよびインビボ方法の場合、選択されたプロテアーゼをコード化する核酸分子は、適切なドナーまたは処置される対象からの細胞へ導入される。治療目的で核酸が導入され得る細胞には、例えば、処置される疾患または状態に適切な望ましい利用可能な細胞型が含まれ、限定されるわけではないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞、血液細胞、例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球、様々な幹または始原細胞、特に造血幹または始原細胞、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓および他の供給源から得られる幹細胞がある。
エクスビボ処置の場合、処置される対象と適合し得るドナーからの細胞、または処置される対象からの細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を対象に投与する。処置は、例えば患者の体内に移植される多孔質膜内での封入などによる直接投与を含む（例、米国特許第４８９２５３８および５２８３１８７号参照）。インビトロでの哺乳類細胞への核酸の導入に適切な技術には、リポソームおよびカチオン性脂質（例、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌ）の使用、電気穿孔、顕微注入、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストランおよびリン酸カルシウム沈殿法がある。ＤＮＡ送達方法は、選択されたプロテアーゼをインビボで発現させるに使用され得る。上記方法は、核酸のリポソーム送達および裸のＤＮＡ送達、例えば電気穿孔を用いる局所および全身的送達、超音波およびリン酸カルシウム送達法を含む。他の技術には、顕微注入、細胞融合、染色体融合遺伝子導入、微小核融合遺伝子導入およびスフェロプラスト融合がある。
選択されたプロテアーゼのインビボ発現は、追加分子の発現と連結され得る。例えば、選択されたプロテアーゼの発現は、例えば遺伝子操作されたウイルスにおける細胞傷害性生成物の発現または細胞傷害性ウイルスでの発現と連結され得る。上記ウイルスは、治療効果に関する標的である特定細胞型にターゲッティングされ得る。発現された、選択されたプロテアーゼを用いることにより、ウイルスの細胞傷害性を高めることができる。
選択されたプロテアーゼのインビボ発現では、選択されたプロテアーゼをコード化する核酸分子を特異的調節配列、例えば細胞特異的または組織特異的プロモーターと機能し得るように結合させ得る。選択されたプロテアーゼはまた、標的細胞型および／または組織で特異的に感染および／または複製するベクターから発現され得る。誘導性プロモーターを用いて、選択されたプロテアーゼの発現を選択的に調節することができる。
ｃ．全身的、限局的および局所的送達
裸の核酸として、またはベクター、人工染色体、リポソームおよび他の伝達体での核酸分子は、全身的投与、限局的、局所的および他の投与経路により対象に投与され得る。全身的よびインビボのとき、核酸分子または核酸分子を含む伝達体は、細胞にターゲッティングされ得る。
投与はまた、例えば細胞または組織を標的とするベクターまたは細胞の投与による直接的なものであり得る。例えば、腫瘍細胞および増殖性細胞は、選択されたプロテアーゼのインビボ発現に関してターゲッティングされる細胞であり得る。イソ型のインビボ発現に使用される細胞はまた、患者にとってオートロガスである細胞を含む。上記細胞は患者から取り出され、選択されたプロテアーゼを発現させる核酸が導入され、次いで、例えば注射または移植により患者に投与され得る。
２．併用療法
本明細書記載の選択されたプロテアーゼポリペプチド、および選択されたプロテアーゼポリペプチドをコード化する核酸分子のいずれかは、限定されるわけではないが、他の生物製剤、小分子化合物および手術を含む他の治療剤または処置と併用されるか、それらの前に、それらと断続的に、またはそれらに続いて投与され得る。他の薬剤および処置が利用可能である、上記で例示したもの全てを含むいずれの疾患または状態についても、上記疾患および状態に対して選択されたプロテアーゼポリペプチドは、それらと組み合わせて使用され得る。例えば、増殖性疾患、例えば癌の処置を目的とする本発明の選択されたプロテアーゼポリペプチドは、他の抗癌治療剤、例えば化学療法剤、放射性核種、放射線療法、サイトカイン類、成長因子、感光剤、毒素、代謝拮抗物質、シグナリングモジュレーター、抗癌性抗生物質、抗癌性抗体、新脈管形成阻害剤またはそれらの組合わせと併用されるか、それらの前に、それらと断続的に、またはそれらに続いて投与され得る。特異的な例では、血栓性疾患の処置を目的とする本発明の選択されたプロテアーゼポリペプチドは、他の抗凝血剤、例えば、限定されるわけではないが、血小板阻害剤、血管拡張剤、フィブリン溶解性(fibrolytic)活性化因子または他の抗凝血薬と併用されるか、それらの前に、それらと断続的に、またはそれらに続いて投与され得る。例示的な抗凝血薬には、ヘパリン、クマリン、ヒルジン、アスピリン、ナプロキセン、メクロフェナミン酸、イブプロフェン、インドメタシン、フェニルブタザール（phenylbutazare）、チクロピジン、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよび組織プラスミノーゲン活性化因子がある。
３．製品およびキット
選択されたプロテアーゼポリペプチドまたは選択されたプロテアーゼポリペプチドをコード化する核酸、またはその誘導体または生物活性部分の医薬化合物は、包装材料、疾患または障害の処置に有効な医薬組成物および選択されたプロテアーゼポリペプチドまたは核酸分子が疾患または障害の処置に使用されることを示すラベルを含む製品として包装され得る。
本明細書による製品は包装材料を含む。医薬製品を包装するのに使用される包装材料は、当業者には周知である。例えば、米国特許第５３２３９０７、５０５２５５８および５０３３２５２号参照、これらについては出典明示で援用する。医薬用包装材料の例には、限定されるわけではないが、ブリスターパック、瓶、チューブ、吸入器、ポンプ、袋、バイアル、容器、注射器、瓶および選択された処方物および意図された投与および処置方式に適切な包装材料がある。本発明による化合物および組成物の広範な一連の処方物は、標的が介在する疾患または障害についての様々な処置法であるものとしてみなされる。
選択されたプロテアーゼポリペプチドおよび核酸分子はまた、キットとして提供され得る。キットは、本明細書記載の医薬組成物および投与用のアイテムを含み得る。例えば、選択されたプロテアーゼは、投与装置、例えば、注射器、吸入器、服用カップ、スポイトまたはアプリケーターにより供給され得る。キットは、所望により、投薬量、服用法を含む使用説明書および投与方法に関する指示書を含んでいてもよい。キットはまた、本明細書記載の医薬組成物および診断用アイテムを含み得る。例えば、上記キットは、対象において選択されたプロテアーゼの濃度、量または活性を測定するアイテムを含み得る。
Ｊ．選択されたプロテアーゼポリペプチドによる典型的処置方法
特定標的を開裂する本発明による選択されたプロテアーゼポリペプチドおよび本発明による選択されたプロテアーゼをコード化する核酸は、標的配列を含むタンパク質に関連するか、または標的配列を開裂するプロテアーゼが使用される疾患または状態の処置に使用され得る。例えば、ｔＰＡ標的基質、例えばプラスミノーゲンを開裂するように遺伝子操作が加えられた、選択されたｕＰＡポリペプチドは、ｔＰＡ標的基質に関連するかまたはｔＰＡポリペプチドが使用される疾患または状態の処置に使用され得る。ｔＰＡ標的基質に関連した疾患の例には血栓性疾患があり、本発明による選択されたプロテアーゼによる処置により、プラスミノーゲンからその活性プロテアーゼ形態プラスミンへの開裂が促進され、血餅の溶解が誘導され得る。
選択されたプロテアーゼポリペプチドは、単独または他の薬剤と組み合わせた形で治療活性を呈する。本発明による選択されたプロテアーゼは、競合する結合タンパク質に対して改善された特性を呈するように設計されている。上記特性は、例えば、ポリペプチドの治療有効性を改善し得る。この項では、その典型的な使用および投与方法を説明する。ここに記載した治療法は典型例であって、選択されたプロテアーゼポリペプチドの適用を制限するものではない。
本発明による選択されたプロテアーゼポリペプチドは、標的配列を含むタンパク質と関連した様々な治療および診断方法で使用され得る。上記方法は、下記に記載および列挙した生理学的および医学的状態の処置方法を含むが、これらに限定されるわけではない。本発明による選択されたプロテアーゼポリペプチドは、競合する結合タンパク質または特定標的を開裂するプロテアーゼよりも改善されたインビボ活性および治療効果を呈し得、例えば低用量でも投与および処置において同じ効果、さらに持続性のある治療効果および他の改善をもたらし得る。選択されたプロテアーゼポリペプチドの使用による治療上の改善例には、限定されるわけではないが、標的組織浸透性（例、腫瘍浸透性）の改良、有効性の向上、投薬量の低減化、投与頻度の減少および／または低下、副作用の減少および治療効果の増強がある。特に、選択されたプロテアーゼは多数の標的基質を開裂および不活化し得るため、選択されたプロテアーゼにより実質的に治療範囲は拡大される。
特に、選択されたプロテアーゼポリペプチドは、特定標的を開裂するプロテアーゼが既に処置に使用されている治療方法での使用が意図されたものである。上記方法には、限定されるわけではないが、疾患および障害、例えば、限定されるわけではないが、凝血性障害、例えば血栓性障害および汎発性血管内凝固症候群、心臓血管疾患、神経学的障害、増殖性疾患、例えば癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染症、細菌感染症、呼吸器疾患、胃腸障害および代謝性疾患の処置方法がある。
選択されたプロテアーゼポリペプチドによる疾患および状態の処置は、限定されるわけではないが、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内注射、皮下、硬膜外、経鼻、経口、直腸、局所、吸入、頬側（例、舌下）および経皮投与を含む本明細書記載の適切な処方物を用いた適切な投与経路により実施され得る。必要ならば、特定の投薬量および持続期間および処置プロトコルは、経験的に決定されるかまたは補外され得る。例えば、類似配列を開裂する野生型プロテアーゼポリペプチドの典型的用量は、適切な投薬量を決定する際の出発点として使用され得る。例えば、組換えｔＰＡポリペプチドの用量は、ｔＰＡ標的を開裂する選択されたｕＰＡポリペプチドの用量を決定する際の指針として使用され得る。
投薬量レベルおよびプログラムは、既知の投薬量およびプログラムに基づいて決定され得、必要ならば、選択されたプロテアーゼポリペプチドの特性の変化に基づいて補外され、そして／または様々な因子に基づいて経験的に決定され得る。他の類似プロテアーゼとの比較における選択されたプロテアーゼポリペプチドの活性レベルおよび半減期などの因子は、上記決定を下すのに使用され得る。特定の投薬量およびプログラムが経験的に決定され得る。上記の他の因子には、個体の体重、全般的健康状態、年齢、使用される特異的化合物の活性、性別、食事療法、投与時間、排出速度、薬剤の組合わせ、疾患の重症度および経過、および疾患に対する患者の素因および主治医の判断がある。有効成分、選択されたプロテアーゼポリペプチドは、典型的には医薬上有効な担体と組み合わされる。担体材料との組み合わせにより、単一用量形態または複数用量形態を形成する有効成分の量は、処置される宿主および特定の投与方式により変化し得る。
疾患の処置または疾患の症状の改善に対する選択されたプロテアーゼポリペプチドの効果は、処置されている特定疾患について当業界で公知の診断試験を用いてモニターされ得る。患者の状態が改善されると、維持用量の化合物または組成物が投与され得、必要ならば、投薬量、投薬形態または投与頻度またはそれらの組合わせが修正され得る。場合によっては、病状の再発時または予定された投薬法に基づいて、対象が長期間体制で断続的処置を必要とすることもあり得る。他に、出血、外傷または外科的措置などの急性事象に応じて追加的投与が要求される場合もあり得る。
例によっては、プロテアーゼアゴニスト（すなわち、模倣物質）またはプロテアーゼアンタゴニストとして機能する選択されたプロテアーゼタンパク質の変異型を使用する場合もある。選択されたプロテアーゼポリペプチドの変異型は、突然変異誘発（例、プロテアーゼタンパク質の独立した点突然変異または先端切除）により生成され得る。選択されたプロテアーゼポリペプチドのアゴニストは、選択されたプロテアーゼポリペプチドの天然形態の生物活性と実質的に同じ活性かまたはそれらの一部分を保持し得る。選択されたプロテアーゼポリペプチドのアンタゴニストは、選択されたプロテアーゼポリペプチドの天然形態の活性の１つまたはそれ以上を、例えば選択されたプロテアーゼポリペプチドと同じ標的タンパク質を開裂することにより阻害し得る。すなわち、限定された機能をもつ変異型で処置することにより、特異的生物作用が誘発され得る。一実施態様では、選択されたプロテアーゼポリペプチドの天然形態の生物活性の一部を有する変異型で対象を処置すると、選択されたプロテアーゼポリペプチドの天然形態で処置した場合と比べて対象における副作用は少なくなる。
以下、選択されたプロテアーゼが単独の治療剤として、または他の薬剤と組合わせた形で使用され得る若干の典型的な疾患または状態を示す。プロテアーゼの選択に関する具体例としての標的は、説明を目的としているのであり、本発明方法で使用される可能な標的の範囲を限定するものではない。
１．ｔＰＡ標的を開裂する選択されたｕＰＡポリペプチドに関する典型的処置方法
ｔＰＡ標的を開裂する選択されたｕＰＡポリペプチドは、急性および慢性状態の両方を含む血栓性障害の改善に使用される治療適用法に有用である。急性状態には特に心臓発作および卒中があり、慢性状況には動脈および深静脈血栓症および再狭窄の状態がある。選択されたｕＰＡポリペプチドは、上記状態の症状を改善するための血栓崩壊性治療薬として使用され得る。治療用組成物は、ポリペプチド、ｃＤＮＡ分子を単独で、またはウイルス性ベクター送達系またはリポソーム送達系などで示された他のベクターに基づく遺伝子発現送達系の一部を含む。血栓崩壊性治療薬として使用される組成物は、一般に医薬上適切な賦形剤中における選択されたｕＰＡポリペプチドの生理学的有効量である。投与方式および処置される状態によって、血栓崩壊性治療薬は単一または複数投薬法で投与される。当業者であれば、投薬法の変化は処置される状態によって異なることは容易に理解できるはずである。
凝血に対し阻害または拮抗作用を示す本発明による選択されたｕＰＡポリペプチドは、虚血性障害、例えば末梢血管障害、肺塞栓、静脈血栓症、深静脈血栓症（ＤＶＴ）、表在性血栓静脈炎（ＳＶＴ）、動脈血栓症、心筋梗塞、一過性虚血発作、不安定狭心症、可逆性虚血性神経障害、付随性血栓崩壊活性、過度の血液凝固状態、再灌流損傷、鎌状赤血球貧血または卒中障害についての抗凝血処置方法で使用され得る。術中におけるＤＶＴまたはＳＶＴなどの過度の血液凝固の危険性が高い患者の場合、本発明によるプロテアーゼ不活性の選択されたｕＰＡポリペプチドが、限定されるわけではないが、心臓手術、血管形成術、肺手術、腹部手術、脊髄手術、脳手術、血管手術、または心臓、肺、膵臓または肝臓の移植を含む臓器移植手術などの手術中における過度の血液凝固を予防するために投与され得る。選択されたｕＰＡポリペプチドのみで処置を行う場合もある。また、選択されたｕＰＡポリペプチドを、処置される状態または疾患に必要であるならば追加的抗凝固因子と連係的に投与する場合もある。
ｔＰＡは、食品医薬品局（ＦＤＡ）により認可された、急性血栓塞栓性卒中に関する唯一の治療薬である。ｔＰＡおよびその変異型は、市販されており、様々な状態に関して人体への投与が認められている。例えば、アルテプラーゼ（Activase（登録商標）、カリフォルニア、サウス・サンフランシスコ、Genentech）は組換えヒトｔＰＡである。レテプラーゼ（Retavase（登録商標）、Rapilysin（登録商標）; Boehringer Mannheim、Roche Centoror）は、もとのタンパク質の５２７アミノ酸のうち３５５アミノ酸を含むように分子に遺伝子操作が加えられたヒトｔＰＡの組換え非グリコシル化形態である。テネクテプラーゼ（TNKase（登録商標）、Genentech）は、３個のアミノ酸置換を有する点が天然ヒトｔＰＡとは異なるヒトｔＰＡの５２７アミノ酸糖タンパク質誘導体である。これらの置換により、血漿クリアランスは減少し、フィブリン結合は増加し（それによりフィブリン特異性は増加する）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）への抵抗性は高まる。アニストレプラーゼ（Eminase（登録商標）、SmithKline Beecham）は、さらに別の市販されているヒトｔＰＡである。ｔＰＡ標的に対する特異性をもつ本発明による選択されたｕＰＡポリペプチドも同様に修飾され、ｔＰＡで処置可能な治療法に関して処方され得る。
ａ．血栓性疾患および状態
血栓性疾患は、凝固能亢進、または血液凝固に有利な血流遮断の調節不全を特徴とする。血栓性疾患および状態の例には、動脈血栓症、静脈血栓症、静脈血栓塞栓症、肺塞栓症、深静脈血栓症、卒中、虚血性卒中、心筋梗塞、不安定狭心症、心房細動、腎損傷、経皮的経管的冠動脈形成術、汎発性血管内凝固症候群、敗血症、人工臓器、シャントまたはプロテーゼ、および下記で検討している他の後天的血栓性疾患がある。血栓性疾患に関する典型的治療法は、凝血カスケードの阻止を含む抗凝血治療を必然的に伴う。
本発明による選択されたｕＰＡポリペプチドおよび本発明による選択されたｕＰＡポリペプチドをコード化する核酸は、血管内凝固を伴う状態の処置を含む、血栓性疾患および状態に関する抗凝血治療で使用され得る。血液凝固を阻害し得る本発明による選択されたｕＰＡポリペプチドは、例えば、血栓形成を制御、溶解または阻止するのに使用され得る。ある実施態様では、本発明による選択されたｕＰＡポリペプチドおよび選択されたｕＰＡポリペプチドをコード化する核酸は、動脈血栓性疾患の処置に使用され得る。別の実施態様では、本発明による選択されたｕＰＡポリペプチドおよび選択された修飾ｕＰＡポリペプチドをコード化する核酸は、深静脈血栓症などの静脈血栓障害の処置に使用され得る。ある実施態様では、本発明による選択されたｕＰＡポリペプチドおよび選択されたｕＰＡポリペプチドをコード化する核酸は、卒中などの虚血性障害の処置に使用され得る。選択されたｕＰＡポリペプチドの使用による治療上の改善例としては、例えば、投薬量の低下、投与頻度の減少および／または低下、副作用の減少および治療効果の向上があるが、これらに限定はされない。選択されたｕＰＡポリペプチドは、例えば、動物モデルの使用により治療有効性について試験され得る。例えば、虚血性卒中のマウスモデル、または血栓性疾患または状態に関する他の公知疾患モデルは、選択されたｕＰＡポリペプチドにより処置され得る（Dodds, Ann NY Acad Sci 516: 631-635 (1987)）。病状の進行および表現型をモニターすることにより、選択されたｕＰＡポリペプチドの効果が評価される。また選択されたｕＰＡポリペプチドを、動物モデルおよび臨床試験などにおける対象に投与することにより、プラセボ対照と比較したインビボ有効性が評価され得る。
ｉ．動脈血栓症
動脈血栓は、動脈血管壁の破裂の結果として形成される。多くの場合、この破裂はアテローム性動脈硬化症などの血管疾患を患う患者で起こる。動脈血栓は、通常妨害された血流領域およびアテローム性動脈硬化症のプラークに起因する破裂部位で形成され、この破裂によりトロンボゲン形成性内皮下層が血小板および凝血性タンパク質に暴露され、次いで凝血カスケードを活性化する。プラーク破裂はまた、プラークへの出血に起因する血管のさらなる狭窄をもたらし得る。非閉塞性血栓は血管壁に組み込まれ、アテローム性動脈硬化のプラーク成長を加速させ得る。動脈血栓の形成は、血流を閉塞させるかまたは遠位微細循環系への塞栓により虚血状態を誘発し得る。抗凝血薬および血小板機能および凝血カスケードを抑制する薬剤は、動脈血栓症の予防および処置に有効であり得る。上記種類の薬剤は、動脈血栓症の処置に有効である。動脈血栓症は、不安定狭心症および急性心筋梗塞状態に至り得る。凝血を阻害する本発明による選択されたｕＰＡポリペプチドは、不安定狭心症および急性心筋梗塞などの動脈血栓症および状態の処置および／または予防に使用され得る。
ii．静脈血栓症および血栓塞栓症
静脈血栓症は、特に静脈系を通る血流が低い場合における血液凝固対血餅溶解に関するシグナルの不均衡により血餅が静脈に形成されている状態である。血栓形成の結果としては、静脈および静脈弁の損傷があり得るが、血管壁は典型的には無傷のままである。血餅は、多くの場合塞栓を形成するかまたは破裂し、血流を通過し得、そこで臓器領域、例えば肺（肺塞栓症）、脳（虚血性脳卒中、一過性虚血性発作）、心臓（心臓発作／心筋梗塞、不安定狭心症）、皮膚（電撃性紫斑病）および副腎に留まり得る。血流妨害により死亡する場合もあり得る。静脈血栓塞栓症の再発傾向がある患者は、血栓形成傾向を有することを特徴としている。血栓塞栓性疾患発現に関する危険因子には、外傷、固定化、悪性疾患、心不全、肥満、高レベルのエストロゲン、下肢麻痺、心筋梗塞、拡張蛇行静脈、癌、脱水症、喫煙、経口避妊薬および妊娠がある。血栓形成傾向を有する家族の遺伝的研究は、ＦＶIII、ＦＩＸおよびＦＸＩを含む、遺伝的な高レベルの凝固因子を立証している（Lavigne et al. J. Thromb. Haemost. 1:2134-2130 (2003)）。
深静脈血栓症（ＤＶＴ）は、深下肢静脈における静脈血栓の形成をいう。ＤＶＴの一因となる３つの主因子は、静脈管壁の損傷、高い血液凝固傾向および血流鬱滞である。これらの因子は、まとめてウィルヒョウーの３要素と呼ばれる。静脈は、外傷または手術中、または病的状態、例えばバーガー病またはＤＩＣまたは別の血液凝固の結果として傷つき得る。ＤＶＴ発現の一因となる他の因子は、上記で検討した一般的な血栓塞栓性疾患の場合と類似している。ＤＶＴで形成される血餅は、微細な炎症しか誘発しないため、容易に血流中へ放出され得る。血栓は、多くの場合下肢筋肉の微細な収縮により破裂し得る。一旦血栓が塞栓になると、それは肺の血管内に留まり得るため、肺梗塞を誘発し得る。血流中の活性ＦＩＸレベルが高い患者は、深静脈血栓症を発症する危険性が高い（Weltermann et al. J. Thromb. Haemost. 1(1): 16-18 (2003)）。
血栓塞栓性疾患は遺伝性であり得、血液凝固因子の遺伝的異常により病気が誘発されるため、血流遮断での不均衡がもたらされる。幾つかの先天的欠損には、抗トロンビンIII、プロテインC、プロテインＳまたはプラスミノーゲンが含まれる。他の因子には、活性化プロテインCに対する抵抗（ＡＰＣ抵抗性または第Ｖ因子ライデン効果とも呼ばれ、第Ｖ因子における突然変異により、プロテインCによる分解に対して抵抗を示すものになる）、プロトロンビンの突然変異、異常フィブリノゲン血症(dysfibrinogemia)（突然変異によりフィブリン溶解に対する抵抗性が付与される）および高ホモシステイン血症がある。若年患者における血栓塞栓性疾患の発現は、上記の先天的欠損に起因することが多く、若年性栓友病と呼ばれる。
静脈血栓塞栓性疾患およびＤＶＴの処置は、典型的には抗凝血治療を含み、その場合経口用量のへパリンおよびワルファリンを投与する。通常、ヘパリンを患者に注入することにより急性事象を制御した後、長期間ワルファリンによる経口抗凝血治療を行うことにより、将来的な症状の発現を制御する。他の治療法には、直接的トロンビン阻害剤、血小板機能阻害剤、例えばアスピリンおよびデキストラン、および弾力性ストッキングおよび空気圧迫装置を含む静脈鬱血を打ち消す治療がある。凝血を阻止する本発明による選択されたｕＰＡポリペプチドは、血栓塞栓性疾患および／またはＤＶＴの抗凝血治療で使用され得る。若干の実施態様において、凝血を阻止する本発明による選択されたｕＰＡポリペプチドは、血栓塞栓性疾患および／またはＤＶＴに関する危険因子を呈する患者における血栓塞栓性疾患および／またはＤＶＴの予防的治療法で使用され得る。
（ａ）虚血性卒中
脳への血流が中断されたとき、虚血性卒中が起こり、脳の一領域への循環が突然失われるため、それに応じて神経学的機能も失われる。脳内出血を特徴とする出血性卒中とは対照的に、虚血性卒中は、通常血栓症または塞栓症により誘発される。虚血性卒中は、全卒中の約８０％を占める。上記で検討した血栓塞栓症発現に関する原因および危険因子に加えて、脳動脈切開の原因となる過程（例、外傷、胸部大動脈切開、動脈炎）が血栓性卒中を誘発し得る。他の原因としては、狭窄または閉塞した動脈に対し遠位での低灌流または２つの脳動脈テリトリー間の脆弱な分水界領域の低灌流がある。虚血性卒中の処置は、その状態を予防および処置するための抗凝血治療を含む。凝血を阻止する本発明による選択されたｕＰＡポリペプチドは、虚血性卒中の処置および／または予防またはその危険性の低減化に使用され得る。
iii．後天的凝固障害
後天的凝固障害は、ビタミンＫ欠損症、肝臓病、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）または循環抗凝固薬の発現などの状態または疾患の結果である。血液凝固の欠損は、上記状態または疾患により誘発される血液凝固因子の二次的欠乏の結果である。例えば、肝臓が病的状態であるとき、肝臓からの凝固因子の生成は損なわれることが多い。凝固因子の合成の減少に伴って、フィブリン溶解が増し、血小板減少症（血小板の欠乏）が増大する。また、肝臓による凝固因子の生産減少は、劇症肝炎または急性妊娠脂肪肝により誘発され得る。上記の状態は、利用可能な凝固因子を消費する血管内血液凝固を促進する。本発明による選択されたｕＰＡポリペプチドは、血液凝固因子の欠乏を緩和するために後天的凝固障害の処置で使用され得る。
（ａ）汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）
汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）は、広範囲に及び継続している凝固の活性化を特徴とする障害である。ＤＩＣでは、凝固のトロンビン活性化と血栓のプラスミン分解間の均衡が失われる。血管または微細血管フィブリン沈着は、結果的に様々な臓器への血液供給に障害を生じさせ得、それが臓器不全の一因となり得る。亜急性または慢性ＤＩＣでは、患者は凝固能亢進表現型を呈し、過度のトロンビン形成による血栓が生じ、静脈血栓症の症状および徴候が存在し得る。急性ＤＩＣとは対照的に、亜急性または慢性ＤＩＣは、ヘパリン、抗トロンビンIIIおよび活性化プロテインC処置を含む、高血栓症(hyperthrombosis)の緩和方法により処置される。本発明による選択されたｕＰＡポリペプチドおよび本発明による選択されたｕＰＡポリペプチドをコード化する核酸は、亜急性または慢性ＤＩＣに対する治療で使用され得る。一実施態様では、亜急性または慢性ＤＩＣについて、本発明によるポリペプチド、および選択されたｕＰＡポリペプチドをコード化する核酸は、他の抗凝固治療と組み合わせて使用され得る。選択されたｕＰＡポリペプチドは、例えば動物モデルを用いることにより、治療有効性に関して試験され得る。病状の進行および表現型をモニターすることにより、選択されたｕＰＡポリペプチドの効果を評価する。また、選択されたｕＰＡポリペプチドを、動物モデルおよび例えば臨床試験での対象に投与することにより、プラセボ対照と比較したインビボ有効性が評価され得る。
（ｂ）細菌感染症および歯周炎
細菌などの微生物による全身的感染症は、一般にＤＩＣに随伴する。凝固経路のアップレギュレーションは、炎症応答を誘発する微生物の細胞膜成分（リポ多糖類または内毒素）または細菌性内毒素（例、ブドウ球菌アルファ毒素）により部分的に伝達され、高レベルのサイトカインを誘導し得る。次いで、サイトカインは凝固の誘導に影響を及ぼし得る。
細菌性病原体、例えばポルフィルス・ギンギバリス（Porphyrus gingivalis）は、成人歯周病の病原体としてよく知られている。ポルフィルス・ギンギバリス（Porphyrus gingivalis）菌は、病原性因子として機能するアルギニン特異的システインプロテイナーゼを生じる（Grenier et al. J. Clin. Microbiol. 25:738-740 (1987), Smalley et al. Oral Microbiol. Immunol. 4:178-181 (1989), Marsh, et al. FEMS Microbiol. 59:181-185 (1989)およびPotempa et al. J. Biol. Chem. 273:21648-21657 (1998)）。ポルフィルス・ギンギバリス（Porphyrus gingivalis）からは、５０ｋＤａおよび９５ｋＤａのギンギパインＲ（それぞれＲｇｐＢおよびＨＲｇｐＡ）と称される２種のプロテイナーゼが生成された。プロテアーゼは、凝固因子をタンパク質分解的に開裂することにより活性化し得る。細菌感染中には、血流中へギンギパインＲが放出されることにより、凝固カスケードの活性化が制御不能になり、トロンビンの過剰生産をもたらすため、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）誘発の可能性が増大し得る。さらにトロンビン濃度の多大な増加は、歯周炎部位での破骨細胞による歯槽骨吸収の一因となり得る。
血液凝固を阻害する本発明による選択されたｕＰＡポリペプチド、および選択されたｕＰＡポリペプチドをコード化する核酸は、歯周炎の処置に使用され得る。選択されたｕＰＡポリペプチドは、歯周炎モデルにおける気道応答性に関する治療有効性について試験され得る。上記モデルとしては、動物、例えばヒト以外の霊長類、イヌ、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットが利用可能である（Weinberg および Bral, J. of Periodontology 26(6), 335-340）。また選択されたｕＰＡポリペプチドを、動物モデルおよび例えば臨床試験での対象に投与することにより、プラセボ対照と比較したインビボ有効性が評価され得る。
ｂ．他のｔＰＡ標的関連状態
本発明による選択されたｕＰＡポリペプチドはまた、ｔＰＡが関与する神経障害の処置にも使用され得る。ｔＰＡは、細胞外マトリックスタンパク質および他の基質に対する加水分解能を有することから組織モデリングおよび可塑性を含む生理学的過程を調節すると考えられている（Gravanis および Tsirska (2004) Glia 49:177-183）。卒中または負傷（例、事故または手術による）などの事象を経験した患者は、本発明による選択されたｕＰＡポリペプチドで処置され得る神経損傷を患っていることが多い。本発明による選択されたｕＰＡポリペプチドは、限定されるわけではないが、神経変性疾患、例えば多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、亜急性硬化性汎脳炎、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋ジストロフィー、および栄養失調または毒素（例、神経毒、乱用性医薬）により誘発される状態を含む様々な神経学的疾患および状態に罹患している対象の処置に有用であり得る。さらに、選択されたｕＰＡポリペプチドは、認知機能を向上させ、そして／または認知機能低下、例えば、「良性老人性健忘症」、「老年性記憶障害」、「老年性認知機能低下」など（Petersen et al., J Immunological Meth. 257:107-116 (2001)）およびアルツハイマー病を処置するのに有用であり得る。
選択されたｕＰＡポリペプチドは、神経系への損傷に関する様々な動物モデルのいずれかを用いて試験され得る。使用され得るモデルには、限定されるわけではないが、血栓塞栓性卒中（Krueger および Busch、Invest. Radiol. 37:600-8 (2002); Gupta および Briyal、Indian J Physiol. Pharmacol. 48:379-94 (2004)）に関するげっ歯動物、ウサギ、ネコ、イヌまたは霊長類モデル、脊椎損傷モデル（Webb et al., Vet. Rec. 155:225-30 (2004)）などがある。本方法および組成物はヒトでも試験され得る。標準化された試験および評点システムを含む様々な異なる方法が、動物およびヒトにおける運動、感覚、行動および／または認知機能の回復を評価するのに利用可能である。適切な方法であれば使用され得る。一例では、ヒトにおける感覚機能の回復を測定する主基準となった、アメリカ脊髄障害協会（ＡＳＩＡ）評点基準が使用され得る。例えば、様々な評点システムおよび方法の例についてはMartinez-Arizala, J Rehabil. Res. Dev. 40:35-9 (2003), Thomas および Noga、J Rehabil. Res. Dev. 40:25-33 (2003), Kesslak および Keirstead、J Spinal Cord Med. 26:323-8 (2003)参照。ヒトでの使用に好ましい用量範囲は、薬剤（複数も可）の効力および観察された毒性を考慮しながら組織培養系および動物モデルで薬剤（複数も可）を試験することにより確立され得る。
ｃ．診断方法
本発明による選択されたｕＰＡポリペプチドは、限定されるわけではないが、フィブリンおよび活性が改変されたフィブリン分解産物を検出する診断検定法を含む診断方法で使用され得る。したがって、これらの検定法は血栓状態で指示される。他の診断的適用法は、選択されたｕＰＡポリペプチドに対する抗体を含むキットを含み、これらは当業者には周知のものである。
２．ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ標的を開裂する選択されたプロテアーゼポリペプチドに関する典型的処置方法
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、特異的細胞表面受容体（ＶＥＧＦＲ）と結合し、それを通してシグナリングすることにより、新たな血管が既存の脈管構造から形成される過程である新血管形成を調節するサイトカインである。病的な新血管形成は、疾患に随伴した血管新生の増加を示し、固体腫瘍の増大（McMahon, (2000) Oncologist. 5 補遺１ 1:3-10）、黄斑変性および糖尿病などの事象を含む。癌の場合、固体腫瘍は、増殖および転移するため血液供給の絶えざる増加を必要とする。低酸素または発癌遺伝子突然変異により、腫瘍および周辺ストロマ細胞におけるＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ ｍＲＮＡのレベルが増加するため、既存の血管が伸長し、新たな脈管網が形成される。滲出型黄斑変性では、異常な血管増殖が黄斑下方に形成される。これらの血管から血液および流体が黄斑中へ漏れることにより光受容細胞が損なわれる。糖尿病では、眼への血液供給が欠如するため失明に至り得る。目の周囲における毛細血管の成長をＶＥＧＦが刺激することにより、正しく機能しない不規則な脈管となる。
ＶＥＧＦの３種のチロシンキナーゼファミリー受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ−１／Ｆｌｔ−１、ＶＥＧＦ−Ｒ−２／Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＶＥＧＦ−Ｒ−３／Ｆｌｔ−４）が同定されている。ＫＤＲ（マウス相同体はＦｌｋ−１）は、内皮細胞で排他的に発現される４００〜８００ｐＭのＫｄをもつＶＥＧＦの高親和力受容体（Waltenberger, (1994) J Biol Chem. 269(43):26988-95）である。ＶＥＧＦおよびＫＤＲの組合わせは、病的新脈管形成に必要とされる主要な内皮細胞特異的シグナリング経路として確認されている（Kim, (1993) Nature. 362 (6423):841-4; Millauer, (1994) Nature. 367 (6463):576-9; Yoshiji, (1999) Hepatology. 30(5): 1179-86）。リガンド結合時に受容体が二量体化すると、細胞質ドメインの自動リン酸化、および細胞質全域および核にシグナルを伝達する結合パートナーの漸増が誘発されることにより、細胞増殖プログラムが変更される。可溶性ＶＥＧＦ−Ｒ２による腫瘍の処置により、腫瘍の増殖は阻害され（Lin, (1998) Cell Growth Differ. 9(1):49-58）、リン酸化の化学的阻害により腫瘍細胞はアポトーシスに至り得る（Shaheen, (1999) Cancer Res. 59(21):5412-6）。
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびその受容体によるシグナリングは、病的新脈管形成および癌における腫瘍脈管構造の急速な発達に関与している。このシグナリング経路を遮断する薬剤は、腫瘍の血液供給の増大および維持を阻止し、腫瘍を系統的な死に至らしめる。転移性腸癌患者における抗ＶＥＧＦ抗体ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）の近年の成果は、ＶＥＧＦが癌の抗脈管形成療法における標的であることを証明した。これらの有望な結果にもかかわらず、腫瘍の進行は抗ＶＥＧＦ処置にもかかわらず依然として起こっている。ＶＥＧＦ機能に影響する抗体の機構および抗体がどのように腫瘍増大を妨げるのかは未知である。ノックダウン実験は、ＶＥＧＦ機能の遮断により新脈管形成が遮断されることを示している。すなわち、ＶＥＧＦＲ−２を通じた脈管形成シグナリングの阻害は、新規ターゲッティングを伴う遺伝子操作されたプロテアーゼの開発に理想的であるまだ十分には開発されていない治療領域を代表している。
ＶＥＧＦ受容体およびＦｌｋ−１／ＫＤＲを特異的にターゲッティングする治療は、単独および細胞傷害性治療(Klement, (2000) J Clin Invest. 105(8):R15-24）と組み合わせた形で、ヒトおよびマウス固体腫瘍の多数のマウスモデルにおいて病的な新脈管形成を阻害し、腫瘍の大きさの縮小を示した（Prewett, (1999) Cancer Res. 59(20):5209-18; Fong, (1999) Neoplasia 1(1):31-41. Erratum: (1999) Neoplasia 1(2):183)。小分子阻害剤および抗体による試験は、強力な抗新脈管形成標的であるとしてＶＥＧＦ受容体ファミリーを確認しているが、さらに有効な治療法が依然として要望されている。
ＶＥＧＦＲは、７つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインの細胞外領域、貫膜領域および２つの細胞質チロシンキナーゼドメインにより構成される。最初の３つのＩｇ様ドメインは、リガンド結合を調節することが示されており、ドメイン４〜７は正しい二量体化の阻害およびリガンドの非存在下でのシグナリングにおいてある一定の役割を有する。遺伝子操作されたプロテアーゼによる選択的タンパク質分解における標的として、それは以下の有望な標的としての特徴を有する：タンパク質分解に接近可能なアミノ酸の不安定領域；ヒト、ラットおよびマウス種間における高い配列同一性；開裂時のシグナリングのダウンレギュレーション；およびリガンドと非生産的に結合し得る可溶性受容体のタンパク質分解的生成。ＶＥＧＦ−Ｒ２の幾つかの領域は、Ｉｇ様ドメイン間における貫膜領域および未構築ループ前のストーク領域を含め特異的タンパク質分解に利用可能である。一例では、本発明によるセリン様プロテアーゼには、貫膜およびサイトカインまたは増殖因子結合ドメイン間の特異的標的受容体（例、ＶＥＧＦＲ）を開裂するように遺伝子操作が加えられ得る。それによりタンパク質受容体を細胞表面またはループ領域につなぐように機能するストーク領域は、ポリペプチド鎖における球状ドメインから分離される。
ａ．新脈管形成、癌および他の細胞周期依存的疾患または状態
本発明による典型的な選択されたプロテアーゼは、新脈管形成のモジュレーションに関与するＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを開裂する。細胞表面分子が腫瘍新脈管形成でシグナリングするＶＥＧＦＲである場合、開裂は癌の拡散を阻止する。例えば、ＶＥＧＦＲ分子から細胞表面ドメインが開裂されると、その細胞外シグナル、特に細胞増殖シグナルを伝達する能力は不活化され得る。腫瘍に養分を与える新脈管形成が無ければ、癌細胞は増殖し得ないことが多い。したがって、一実施態様において、本発明による選択されたプロテアーゼは癌治療に使用される。また、ＶＥＧＦＲの開裂は、黄斑変性、炎症および糖尿病などの他の病状における新脈管形成のモジュレーションに使用され得る。一実施態様では、細胞周期の進行に関与する標的ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲタンパク質を開裂することにより、細胞周期を前進させるタンパク質の能力が不活化される。細胞周期の進行が無ければ、癌細胞は増殖できない。したがって、本発明による選択されたプロテアーゼは、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを開裂することから、癌および他の細胞周期依存的病状の処置に使用される。
また本発明による選択されたプロテアーゼは、腫瘍形成性に関与する可溶性タンパク質を開裂し得る。ＶＥＧＦポリペプチドの開裂により、ＶＥＧＦ受容体によるシグナリングが阻止され、新脈管形成が減少するため、例えば癌、黄斑変性、炎症および糖尿病などの新脈管形成が一定の役割を演じる疾患が縮小される。さらに、ＶＥＧＦシグナリングは、ある種の細胞型における細胞周期のモジュレーションに関与する。したがって、本発明による選択されたプロテアーゼは、ＶＥＧＦを開裂することから、癌および他の細胞周期依存的病状の処置に有用である。
ｂ．ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを開裂する選択されたプロテアーゼによる併用療法
一実施態様において、癌などの病状の処置では、処置を必要とする対象に、例えば少なくとも１種の抗癌剤と組合わせて、特異的に開裂することにより、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ−２複合体のシグナリングを不活化するプロテアーゼの治療有効量を投与する。抗新脈管形成療法は、固体癌および血液悪性疾患の両方に対して有効であることが判明した（例えば、Ribatti et al. (2003) J Hematother Stem Cell Res. 12(1), 11-22参照）。したがって、抗新脈管形成治療としての本発明による組成物は、血液および固体組織悪性疾患の両方の処置を容易にし得る。本発明による組成物および処置方法は、単独または当業者に公知の他の適切な抗癌治療法と組合わせて使用され得る。例えば、本発明による選択されたプロテアーゼは、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）投与が治療上の恩恵をもたらす治療においてＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）と併用して、またはその代わりに投与され得る。
一実施態様では、抗癌剤は少なくとも１種の化学療法剤である。関連した実施態様では、プロテアーゼの投与を少なくとも１種の放射性療法と組み合わせる。併用療法を施行すると、脈管形成シグナルが弱められ、遊離ＶＥＧＦレベルを低下させる可溶性受容体のプールができる。一実施態様では、本発明による選択されたプロテアーゼは、６アミノ酸領域にわたる受容体の決定的領域、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲストークと適合するインビトロ特異性を有する。
本発明による選択されたプロテアーゼポリペプチドは、複数の治療剤を含む組成物中で投与され得る。治療剤は、同一または異なり得、例えば治療用放射性核種、薬物、ホルモン、ホルモン拮抗物質、受容体拮抗物質、別の作用物質により活性化された酵素またはプロ酵素、オートクリン、サイトカインまたは当業者に公知の適切な抗癌剤であり得る。一実施態様では、選択されたプロテアーゼポリペプチドと共投与される抗癌剤はＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）である。本発明方法で有用な他の治療剤には、毒素、抗ＤＮＡ、抗ＲＮＡ、放射性標識オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗タンパク質および抗クロマチン細胞傷害性または抗菌剤がある。他の治療剤も当業者には知られており、本発明方法による他の同様の治療剤の使用も具体的に考えられる。
抗腫瘍剤は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、ホルモン性剤、抗生物質、抗体、抗癌生物製剤、グリベック、コルチシン、ビンカアルカロイド、Ｌ−アスパラギナーゼ、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、ニトロソ尿素またはイミダゾールカルホキサミドなどの多数の化学療法剤の一つであり得る。適切な薬剤は、チューブリンの脱分極を促進するかまたは腫瘍細胞増殖を阻止する薬剤である。考えられる化学療法剤には、限定されるわけではないが、食品医薬品局および米国保健福祉省により編集された、Orange Book of Approved Drug Products With Therapeutic Equivalence Evaluations に列挙された抗癌剤がある。上記化学療法剤に加えて、本発明によるセリンプロテアーゼ様プロテアーゼも放射線治療処置と一緒に投与され得る。当業界で公知の追加的処置も包含される。
治療剤は化学療法剤であり得る。化学療法剤は当業界では公知であり、少なくともタキサン類、窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、ビンカアルカロイド、抗生物質、酵素、白金配位錯体、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤または拮抗物質が含まれる。さらに具体的には、化学療法剤は、ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲンまたはアンドロゲンの非限定的な群から選択される１種またはそれ以上の薬剤であり得る。さらに特定すれば、化学療法剤は、アザリビン、ブレオマイシン、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、ＣＰＴ−１１、シクロホスファミド、シタラビン、デカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エチニルエストラジオール、エトポシド、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、ゲムシタビン、ヒドロキシプロゲステロン、カプロエート、ヒドロキシ尿素、Ｌ−アスパラギナーゼ、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、酢酸メドロプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、フェニルブチレート、プレドニゾン、プロカルバジン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキサン、タキソール、テストステロンプロピオネート、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビンブラスチンまたはビンクリスチンであり得る。化学療法剤の組合わせの使用も包含される。化学療法剤の投与は、セリンプロテアーゼ様ムテインポリペプチドの投与の前、最中または後であり得る。
本発明による選択されたプロテアーゼポリペプチドと併用または共投与される他の適切な治療剤は、放射性同位元素、ホウ素アデンド(addend)、免疫モジュレーター、毒素、光活性剤または染料、癌化学療法剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗細菌剤、抗原生動物剤および化学増感剤から成る群から選択される（米国特許第４９２５６４８および４９３２４１２号参照）。適切な化学療法剤は、例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES、１９版. (Mack Publishing Co. 1995)および Goodman および Gilman、THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (Goodman et al.編 Macmillan Publishing Co., ニューヨーク、1980 および 2001年版)に記載されている。他の適切な化学療法剤は、例えば、実験用薬物は、当業者には公知である。さらに、適切な治療用放射性同位元素は、ａｘ−エミッター、β−エミッター、γ−エミッター、オージェ電子エミッター、α−粒子を放出する中性子捕捉剤および電子捕捉により崩壊する放射性同位元素から成る群から選択される。好ましくは、放射性同位元素は、２２５Ａｃ、１９８Ａｕ、３２Ｐ、１３１Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６７Ｃｕ、１７７Ｌｕ、２１３Ｂｉ、１０Ｂおよび２１１Ａｔから成る群から選択される。
複数の治療剤を本発明による選択されたプロテアーゼと組み合わせて使用する場合、それらは同じ種類またはタイプに属するものであり得るか、または異なる種類またはタイプのものであり得る。例えば、治療剤は、異なる放射性核種、または一薬物および一放射性核種を含み得る。
別の実施態様では、個々のエネルギー放出の結果として異なる距離にわたって有効である種々の同位体が、本発明プロテアーゼとの組み合わせにおける第１および第２治療剤として使用される。上記薬剤の使用により、腫瘍のさらに有効な処置が達成され得ることから、通常の臨床環境におけるように、大きさが異なる多数の腫瘍を呈する患者に対しても有用である。
極小腫瘍沈殿物および単細胞の処置に有用である利用可能な同位体は僅かしかない。これらの状況では、薬物または毒素が本発明によるプロテアーゼとの同時投与に関して有用な治療剤であり得る。したがって、若干の態様では、同位体は、薬物、毒素および中性子捕捉剤などの非同位体種と組み合わせて使用され、本発明によるプロテアーゼと同時投与される。細胞に対する細胞傷害作用を有する多くの薬物および毒素が知られており、本発明によるプロテアーゼと組み合わせて使用され得る。それらは、薬物および毒素の総目録、例えばMerck Index、Goodman および Gilmanなど、および上記で引用した参考文献に載せられている。
細胞内タンパク質合成を妨げる薬剤もまた、本発明治療方法においてプロテアーゼと併用され得る。上記薬剤は、当業者には公知であり、例としてはプロマイシン、シクロヘキシミドおよびリボヌクレアーゼがある。
本発明による治療方法は、癌治療に使用され得る。放射性同位元素、薬物および毒素を、癌細胞により、またはそれに付随して生じるマーカーと特異的に結合する抗体または抗体フラグメントにコンジュゲートし得ること、および上記抗体コンジュゲートを用いて、放射性同位元素、薬物または毒素を腫瘍部位にターゲッティングさせることにより、それらの治療効力を高め、副作用を最小限に抑え得ることはよく知られている。これらの薬剤および方法の例は、Wawrzynczak および Thorpe (Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer, L. M. Franks および N. M. Teich編、１８章、378-410頁、Oxford University Press.オックスフォード、1986)、Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer (C. W. Vogel編、 3-300, Oxford University Press、ニューヨーク、1987)、Dillman, R. O. (CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology 1:357, CRC Press, Inc., 1984)、Pastan et al. (Cell 47:641, 1986)、Vitetta et al. (Science 238:1098-1104, 1987)およびBrady et al. (Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phys. 13:1535-1544,1987)において検討されている。癌に関する免疫コンジュゲートの他の使用例および他の治療形態の例は、特に、米国特許第４３３１６４７、４３４８３７６、４３６１５４４、４４６８４５７、４４４４７４４、４４６０４５９、４４６０５６１、４６２４８４６、４８１８７０９、４０４６７２２、４６７１９５８、４０４６７８４、５３３２５６７、５４４３９５３、５５４１２９７、５６０１８２５、５６３５６０３、５６３７２８８、５６７７４２７、５６８６５７８、５６９８１７８、５７８９５５４、５９２２３０２、６１８７２８７および６３１９５００号に開示されている。
さらに、本発明による処置方法は、ある種の細胞傷害性薬剤の副作用を阻止、軽減または打ち消すために、本発明による選択されたプロテアーゼを他の化合物または技術と組み合わせて使用する方法を含む。上記の組合わせの例には、例えば米国特許第４６２４８４６号に記載されている、例えば迅速なクリアランスのための抗体とＩＬ−１の同時投与がある。上記投与は、抗癌剤と（例えば、細胞傷害性成分として放射性同位元素、薬物または毒素と）組み合わせたグランザイムＢムテインまたはＭＴ−ＳＰ１ムテインによる一次治療的処置施与の３〜７２時間後に実施され得る。この方法を用いることにより、循環からのコンジュゲート、薬物または毒素のクリアランスを向上させ、治療剤により誘発される骨髄性および他の造血性毒性を軽減または打ち消し得る。
別の例では、また上記のとおり、癌治療は、複数の殺腫瘍性剤、例えば薬物および放射性同位元素、または中性子活性化療法の場合には放射性同位元素およびボロン１０剤、または薬物および生物応答修飾因子、または融合分子コンジュゲートおよび生物応答修飾因子の組み合わせを含み得る。サイトカインは、その各成分の効力を最大限発揮させるように上記治療プログラムに組み込まれ得る。
同様に、βまたはα−エミッターである放射性同位元素とコンジュゲートしたある種の抗白血病および抗リンパ腫抗体は、これらの薬剤を腫瘍細胞に指向させているだけではないとき、骨髄性および他の造血性副作用を誘発し得る。特に腫瘍細胞が循環系および血液形成臓器にあるとき、これが観察される。少なくとも１種の造血性サイトカイン（例、成長因子、例えばコロニー刺激因子、例えばＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ）を同時および／または後続投与することが、抗癌効果を高めながら、造血系副作用を低減化または改善するのに好ましい。
様々な放射性核種治療方法が、例えばHarbert、"Nuclear Medicine Therapy"、ニューヨーク、Thieme Medical Publishers, 1087、１〜３４０頁に記載されているとおり、癌および他の病的状態の処置に使用され得ることは、当業界ではよく知られている。これらの手順で経験を積んだ臨床医であれば、容易に上記手順に本明細書記載のサイトカインアジュバント療法を適合させて、その造血系副作用を軽減することができるはずである。同様に、プロテアーゼムテインと同時投与される、細胞傷害性薬剤による治療は、例えば癌、感染性または自己免疫疾患の処置または臓器拒絶治療に使用され得る。上記処置には、同位体または放射性標識抗体による放射性同位体療法と類似した原則が適用される。すなわち、当業者であれば、サイトカイン使用形態を適合させて、一次抗癌治療の前、間および／または後にサイトカインを投与することにより骨髄抑制および他の造血系副作用を軽減できるはずである。
３．補体タンパク質標的を開裂する選択されたＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドについての典型的処置方法
本発明によるプロテアーゼポリペプチドおよび核酸分子は、補体経路の活性化が関与する状態、特に急性炎症状態を含む炎症状態、例えば敗血症ショックおよび慢性炎症状態、例えば慢性関節リウマチ（ＲＡ）の処置に使用され得る。急性および炎症性状態は、免疫介在性疾患、例えば自己免疫疾患または免疫複合体介在性炎症により誘発される組織損傷として発現され得る。補体介在性炎症状態はまた、炎症性成分を有する神経変性または心臓血管疾患として発現され得る。この項では、プロテアーゼの具体例としての使用、投与方法について記載する。これらの記載された治療法は、典型例であって、プロテアーゼの適用を制限するものではない。上記方法は、限定されるわけではないが、下記に記載および列挙した生理学的および医学的状態の処置方法を含む。上記方法には、限定されるわけではないが、敗血症、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、全身エリテマトーデス、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、喘息、炎症性腸疾患、呼吸窮迫症候群、免疫複合体（ＩＭ）介在性急性炎症性組織損傷、多臓器不全、アルツハイマー病（ＡＤ）、例えば心筋梗塞（ＭＩ）、卒中、心肺バイパス（ＣＰＢ）または冠動脈バイパス移植、血管形成術、または血液透析などの事象または処置により誘発される虚血−再灌流損傷またはギラン−バレー症候群の処置方法がある。
プロテアーゼによる疾患および状態の処置は、限定されるわけではないが、皮下注射、経口および経皮投与を含む本明細書記載の適切な処方物を用いた適切な投与経路により実施され得る。必要ならば、特定の投薬量および持続期間および処置プロトコルは、経験的に決定されるかまたは補外され得る。例えば、組換えおよび天然プロテアーゼポリペプチドの典型的用量は、適切な投薬量を決定するための出発点として使用され得る。野生型またはスカホールドプロテアーゼと比べて高い特異性および／または選択性を有する修飾プロテアーゼは、低い投薬量および／または頻度でも有効であり得る。用量レベルは、例えば個体の体重、全般的健康状態、年齢、使用する特定化合物の活性、性別、食事療法、投与時間、排出速度、薬剤の組み合わせ、疾患の重症度および経過、および疾患に対する患者の素因および主治医の判断などの様々な因子に基づいて決定され得る。担体材料と組合わせて単一用量形態を生成させ得る有効成分の量は、処置される宿主および特定投与方式により異なる。
患者の状態が改善すると、必要ならば、維持用量の化合物または組成物が投与され得、さらに投薬量、用量形態または投与頻度またはその組合わせも修正され得る。場合によっては、病状再発時に対象が長期体制での断続的処置を必要とすることもあり得る。
ａ．免疫介在性炎症性疾患
本明細書記載の方法で選択されるプロテアーゼおよび修飾プロテアーゼは、限定されるわけではないが、本発明による変異型ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼを含め、炎症性疾患の処置に使用され得る。プロテアーゼで処置され得る炎症性疾患には、急性および慢性炎症性疾患がある。炎症性疾患の例としては、中枢神経系疾患（ＣＮＳ）、自己免疫疾患、例えば喘息における気道過敏状態、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、および免疫複合体（ＩＣ）介在急性炎症性組織損傷がある。
実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症（ＭＳ）に関するモデルとしての役割を果たし得る（Piddlesden et al., (1994) J Immunol 152:5477）。ＥＡＥは、ミエリンおよびミエリン成分、例えばミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質およびミエリン稀突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）による免疫化により若干の遺伝的感受性種で誘発され得る。例えば、ＭＯＧ誘導ＥＡＥは、慢性的、再発性臨床病状経過、炎症の組織病理学的３要素、反応性神経膠症および大きな融合性脱髄プラークの形成を含むヒトＭＳの本質的特徴を再現する。プロテアーゼおよび修飾プロテアーゼは、ＥＡＥ動物モデルで評価され得る。プロテアーゼを例えば毎日腹腔内注射により投与し、症状の経過および進行を対照動物と比較しながらモニターする。また病気を増悪させ得る炎症性補体成分のレベルは、溶血検定法において血清補体活性を検定することにより、また補体成分、例えばＣ１、Ｃ３およびＣ９の沈着について検定することにより測定され得る。
補体活性化は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）などの疾患において炎症をモジュレーションする（Wang et al., (1995) PNAS 92:8955）。プロテアーゼおよび修飾プロテアーゼは、本発明による変異型ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼを含め、ＲＡの処置に使用され得る。例えば、プロテアーゼは、局所的または全身的に注射され得る。プロテアーゼは、毎日または毎週投与され得る。ペギル化プロテアーゼは、免疫原性を低下させるのに使用され得る。一例として、II型コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）は、炎症性滑膜炎、パンヌス形成および軟骨および骨の侵食を特徴とするＲＡと組織学的に類似している自己免疫炎症性関節疾患のモデルとしてマウスで誘発され得る。ＣＩＡを誘発するため、完全フロイントアジュバントの存在下におけるウシII型コラーゲン（Ｂ−ＣII）を、尾の付け根に皮内注射する。２１日後、同一プロトコルを用いてマウスを再免疫化する。ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを含むプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼの効果を調べるため、Ｂ−IIによる初回攻撃の３週間後、プロテアーゼまたは対照を３週間にわたって週に２回腹腔内投与する。初回免疫化の７週間後組織分析用にマウスを殺す。確立された疾患に対するプロテアーゼの治療効果を評価するため、プロテアーゼは、１本またはそれ以上の下肢における臨床的関節炎の開始後合計１０日間毎日投与され得る。最初に罹患した関節の腫脹の程度は、カリパスを用いて足の厚みを測定することによりモニターされ得る。両モデルにおいて、溶血検定法および補体活性化マーカー、例えばＣ５ａおよびＣ５ｂ−９の測定用にマウスから血清を採取し得る。別の例として、霊長類モデルがＲＡ処置に関して利用可能である。プロテアーゼポリペプチドで処置された対象および対照において柔らかい腫脹した関節の応答をモニターすることにより、プロテアーゼ処置が評価され得る。
プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼは、限定されるわけではないが、本発明による変異型ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを含め、免疫複合体（ＩＣ）介在性急性炎症性組織損傷の処置に使用され得る。ＩＣ介在性損傷は、組織におけるＩＣ沈着に対する局所炎症応答により誘発される。後続の炎症性応答は、浮腫、好中球増加、出血および最終的には組織壊死を特徴とする。ＩＣ介在性組織損傷は、インビボアルツス（ＲＰＡ）反応で試験され得る。簡単に述べると、アルツス反応では、過剰の抗体（例えばウサギＩｇＧ抗ニワトリ卵アルブミン）を、対応する抗原（すなわち、ニワトリ卵アルブミン）を予め静脈内注入しておいた動物、例えばラットまたはモルモットの皮膚に注射する（Szalai et al., (2000) J Immunol 164:463）。ＲＰＡ反応での開始直前、プロテアーゼまたはボーラス対照を、右大腿静脈への静脈内注射により対応する抗原と同時に投与する。別法として、プロテアーゼは、ＲＰＡ反応の最初の１時間、抗原注射の直後から始まり抗体の皮内注射の直前までに投与され得る。補体依存的ＩＣ介在性組織損傷の発生に対するプロテアーゼの効果は、採血して血清溶血活性を測定し、皮膚の感染領域を採取して病変の大きさを計量することにより、ＲＰＡ開始後の様々な時点で評価され得る。
治療用プロテアーゼ、例えば本発明による変異型ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを含む本明細書記載のものは、敗血症および致命的ショックを誘発し得る重症の敗血症の処置に使用され得る。補体介在性致命的ショックのモデルは、治療剤としてのプロテアーゼの効果を試験するのに使用され得る。かかる一例では、痕跡量のリポ多糖類（ＬＰＳ）でラットを感作し、次いで補体の膜阻害剤に対するモノクローナル抗体（抗Ｃｒｒｙ）を投与する（Mizuno M et al., (2002) Int Arch Allergy Immunol 127:55）。プロテアーゼまたは対照は、致命的ショックの開始経過中におけるいずれの時点でも、例えばＬＰＳ感作前、ＬＰＳ感作後または抗Ｃｒｒｙ投与後に投与され得、致命的ショックからのラットのレスキューが評価され得る。
ｂ．神経変性疾患
補体活性化は、アルツハイマー病（ＡＤ）の進行を増悪させ、ＡＤ脳の神経突起喪失の一因となる。本発明によるプロテアーゼおよび修飾プロテアーゼは、限定されるわけではないが、本発明による変異型ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを含め、ＡＤの処置に使用され得る。ＡＤの神経病理学的および行動的特徴をある程度模倣するマウスモデルが、プロテアーゼの治療効果を評価するのに使用され得る。トランスジェニックマウスモデルの例では、攻撃的プロモーターの制御下で、発病性突然変異をもつヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはプレセニリン１（ＰＳ１）タンパク質をマウスに導入する。これらのマウスには、ベータ−アミロイド斑および異栄養性神経突起の増加を含むＡＤの特徴が現れる。ＡＰＰおよびＰＳ１突然変異体タンパク質についての二重トランスジェニックマウスは、多数の原線維ベータ−アミロイド斑を発現し、活性化グリアおよび斑に随伴した補体因子を示す。プロテアーゼは、例えば毎日腹腔内または静脈内注射により投与され得、症状の経過および進行については対照動物と比較しながらモニターする。
ｃ．心臓血管疾患
本発明によるプロテアーゼおよび修飾プロテアーゼは、限定されるわけではないが、本発明による変異型ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを含め、心臓血管疾患の処置に使用され得る。プロテアーゼは、卒中、心筋梗塞、心肺バイパス、冠動脈バイパス移植、血管形成術または血液透析により誘発される虚血再灌流損傷を含む心臓血管疾患の処置で使用され得る。プロテアーゼはまた、組織損傷の一因となり得る心肺バイパスに伴う炎症性応答の処置に使用され得る。一般的に、プロテアーゼは、補体介在性虚血再灌流損傷を誘発する処置または事象の前、それと同時またはそれに後続して投与され得る。一例では、プロテアーゼは、例えば冠動脈バイパス移植・血管形成術などの補体介在性虚血損傷誘発事象による対象の処置の前に対象に投与され得る。
虚血再灌流損傷の処置に対するプロテアーゼの効果は、損傷の動物モデルで評価され得る。上記の一モデルでは、前部心膜に切り目を入れておいたウサギにおいて左前下行（ＬＡＤ）冠動脈のその起点から５〜８ｍｍ付近のところに３−０絹糸で縫合術を施し、血管が完全に閉塞されるように結紮糸を締めることにより心筋虚血を誘発する（Buerke et al., (2001) J Immunol 167:5375）。プロテアーゼ、例えば本発明による変異型ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチド、または食塩水などの対照賦形剤を、冠動脈閉塞の５５分後（すなわち再灌流の５分前）ボーラスとして増加用量で静脈内投与し得る。５分後（すなわち合計６０分の虚血後）ＬＡＤ結紮をほどき、虚血心筋を３時間再灌流させ得る。再灌流期間の最後に、ＬＡＤ周囲の結紮を締める。虚血損傷に対するプロテアーゼの効果は、心筋壊死、血漿クレアチンキナーゼレベルおよび好中球活性化のマーカー、例えばミエロペルオキシダーゼ活性およびスーパーオキシドラジカル放出に対する効果を評価することにより分析され得る。
６％ヒト血漿を含むクレブス−ヘンゼライト緩衝液での摘出マウス心臓の灌流後に持続される補体介在性心筋損傷の別のモデルでは、プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼによる処置は、組織損傷を心臓に制限するのに使用され得る。かかる一例では、心臓の灌流に使用する緩衝液に様々な用量のプロテアーゼ、例えば限定されるわけではないが、本発明によるＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドを含む変異型プロテアーゼが補われ得る。灌流された心臓は、ヒトＣ３およびＣ５ｂ−９の沈着、冠動脈灌流圧、最終拡張期圧および心拍数について検定され得る。
プロテアーゼおよび修飾プロテアーゼ、例えば本発明による変異型ＭＴ−ＳＰ１ポリペプチドは、心肺バイパス（ＣＰＢ）または冠動脈バイパス移植の前またはその後に、バイパス後に起こりがちであり、組織損傷の一因となり得る炎症性免疫応答を阻害する治療薬として使用され得る。体外バイパス回路における全血のインビトロ再循環を用いることにより、ＣＰＢが誘発する血小板および白血球の変化および補体活性化を刺激し得る（Rinder et al. (1995) J. Clin. Invest. 96:1564）。上記モデルでは、様々な用量のプロテアーゼまたは修飾プロテアーゼまたは対照緩衝液を、体外回路に血液を加える直前、健康なドナーからの血液およびブタヘパリンを既に含むトランスファーパックに加え得る。血液試料を、再循環の５、１５、３０、４５、６０、７５および９０分後に採取し、補体試験、例えば溶血検定法および／またはＣ５ａ、Ｃ３ａおよび／またはｓＣ５ｂ−９について測定する補体活性化検定法にかけ得る。体外回路への添加前に採取した処置前血液試料を対照として使用し得る。血液試料のフローサイトメトリーを実施することにより、血中で循環している白血球（すなわち、好中球）の集団における接着分子のレベル、例えばＣＤ１１ｂおよびＰ−セレクチンレベルが測定され得る。
Ｋ．実施例
以下の実施例は、説明を目的としているのに過ぎず、本発明の範囲を制限する意図はない。
実施例１
突然変異体ＰＡＩ−１阻害剤
Ａ．突然変異体ＰＡＩ−１阻害剤の発現および精製
ヒトＰＡＩ−１のｃＤＮＡ（配列番号３９６に示したＮ−末端Ｍｅｔを含む成熟ＰＡＩ−１をコード化する）をもつ組換えプラスミド、ｐＰＡＩＳＴ７ＨＳを鋳型として用いることにより、ＰＡＩ−１反応性中心ループのアミノ酸配列に修飾を導入した。プラスミドｐＰＡＩＳＴＨＳは、ヌクレオチド対１でのＨｉｎｄIII部位およびヌクレオチド対２１０６でのＳａｌＩ部位を欠くプラスミドｐＰＡＩＳＴ７の誘導体である。プラスミドｐＰＡＩＳＴ７は報告された要領で生成された（Franke et al. (1990) Biochimic et Biophysica Acta 1037: 16-23）。簡単に述べると、ＰＡＩ−１ ｃＤＮＡクローンｐＰＡＩ−１ １ＲＢを、制限エンドヌクレアーゼＡｐａＬＩおよびＰｆｌＭＩで開裂し、ＰＡＩ−１の残基１に関する２ｂｐのコドンおよび３７９残基タンパク質の残基２〜３７６に関する完全コーディング配列を含むＰＡＩ−１の１１２７ｂｐフラグメントを、ゲル電気泳動により精製した。合成リンカーを構築して、ＰＡＩ−１ ｃＤＮＡコーディング配列の両端を再構築し、成熟ＰＡＩ−１の第１残基をコード化するトリプレットの直前にＡＴＧタンパク質合成開始コドンを導入することにより、配列番号３９６に示したアミノ酸配列を有する成熟ＰＡＩ−１を生成した。さらに、ｃＤＮＡコーディング領域をプラスミドｐＢＲ３２２へ挿入し易くするため、ＰＡＩ−１ ｃＤＮＡフラグメントの５'および３'末端にそれぞれＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII制限エンドヌクレアーゼ部位を生じるようにリンカーを設計した。合成リンカーは次のとおりである：Ｎ−末端、５'ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＧ−３’（配列番号３９２）および５'−ＴＧＣＡＣＣＡＴＡＧ−３'（配列番号３９３）；Ｃ−末端、５'−ＡＴＧＧＡＡＣＣＣＴＧＡＡ−３'（配列番号３９４）および５'−ＡＧＣＴＴＣＡＧＧＧＴＴＣＣＡＴＣＡＣ−３'（配列番号３９５）。リンカーを使用前にポリヌクレオチドキナーゼで処理した。次いで、合成リンカー（５'末端にある１０ｂｐおよび３'末端にある１３ｂｐ）を、１１２７ｂｐのＡｐａＬＩ−ＰｆｌＭＩ ＤＮＡフラグメントでライゲーションし、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで消化し、１１４６ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントをゲル電気泳動により単離し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII開裂ｐＢＲ３２２（配列番号３７７）へクローン化した。
ｐＰＡＩＳＴ−７発現プラスミドの構築を開始するため、ｐＢＲ３２２ベクターにおけるサブクローンを、ＥｃｏＲＩで開裂し、細菌性アルカリ性ホスファターゼを用いて線状プラスミドを脱リン酸化した。ｔｒｐプロモーターおよびリボソーむ結合部位を含むｐＣ５Ａ−４８からの３６０ｂｐのＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントを用いて、標準ライゲーション後にｐＰＡＩＳＴ−７を作製した。
ｐＰＡＩＳＴ７ＨＳ原核生物発現ベクター（Shubeita et al. (1990) J Biol. Chem., 265: 18379-18385）を作製するため、ｐＰＡＩＳＴ７をＨｉｎｄIIIで部分消化してプラスミドを線状にし、大腸菌（E.coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で平滑末端にし、ライゲーションすることにより、上流ＨｉｎｄIII部位を排除した。ＨｉｎｄIIIとＳａｌＩ部位間のＰＡＩ−１コーディング配列のｐＰＡＩＳＴ７下流における配列の欠失およびＳａｌＩ部位の排除は、連続的部分ＳａｌＩ消化、完全ＨｉｎｄIII消化、大腸菌（E.coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片による平滑末端形成およびライゲーションにより達成された。
供給者により明記された条件にしたがって、Multi位置指定突然変異導入キット（Stratagene）を用いることにより、突然変異誘発反応を実施した。アミノ酸ＶＳＡＲＭ（配列番号３７８）に対応する反応性中心ループにおけるＰ４〜Ｐ１'位置で野生型ＰＡＩ−１におけるアミノ酸の突然変異を誘発した。Ｐ４からＰ１'位までのＰＡＩ−１反応性中心ループにおけるＲＲＡＲＭ（配列番号３７９）配列による野生型アミノ酸配列ＶＳＡＲＭの置換を含む突然変異体ＰＡＩ−１を作製した（ＰＡＩ−１／ＲＲＡＲ）。ＲＲＡＲＭ突然変異誘発性プライマーの配列は、５'−ＣＣＡＣＡＧＣＴＧＴＣＡＴＡＡＧＧＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＣＣＣＧＡＧＧＡＧＡＴＣ−３'（配列番号３８０）であった。Ｐ４からＰ１'位までのＰＡＩ−１反応性中心ループにおけるＰＦＧＲＳ（配列番号３８９）配列による野生型アミノ酸配列ＶＳＡＲＭの置換を含む第２の突然変異体ＰＡＩ−１を作製した（ＰＡＩ−１／６９）。ＰＦＧＲＳ突然変異誘発性プライマーの配列は、５'ＣＣＡＣＡＧＣＴＧＴＣＡＴＡＣＣＣＴＴＣＧＧＣＡＧＡＡＧＣＧＣＣＣＣＣＧＡＧＧＡＧＡＴＣ−３'（配列番号３９０）であった。突然変異誘発後、形質転換体から単離したＤＮＡを完全に配列決定することにより、目的とする突然変異が存在し、追加的突然変異が存在しないことを確認した。
ｐＰＡＩＳＴ７ＨＳベクターに存在するＮ−末端ポリヒスチジン残基を利用することにより、突然変異体ＰＡＩ−１／ＲＲＡＲおよびＰＡＩ−１／６９を融合タンパク質として発現させた。突然変異体ＰＡＩ−１（すなわち、ＰＡＩ−１／ＲＲＡＲおよびＰＡＩ−１／６９）の発現および精製は、Ke et al. (J Biol. Chem., 272: 16603-16609 (1997))記載の方法に基づくものであった。突然変異体ＰＡＩ−１をコード化するｐＰＡＩＳＴ７ＨＳベクターの０.１μｇＤＮＡを、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの存在下でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを合成する大腸菌（E.coli）株ＢＬ２１［ＤＥ３］ｐＬｙｓｓ (Novagen)へ形質転換することにより、ＰＡＩ−１の野生型および突然変異型の発現を達成した。細菌培養物を３７℃で激しく振とうしながら１.１〜１.３の吸光度Ａ５９５まで成長させ、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを最終濃度１ｍＭになるまで加えることにより、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの合成およびＰＡＩ−１タンパク質の生成を誘導した。培養物を３７℃でさらに１〜２時間成長させ、次いで２〜６時間３０℃にシフトした。細胞を４℃で２０分間８０００×ｇの遠心分離にかけることにより沈殿させ、冷出発緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、２００ｍＭのＮａＣｌおよび０.０１％トゥイーン２０、ｐＨ５.６）４０ｍｌに再懸濁した。細胞懸濁液をFrench プレスセル（Aminco）中で破砕し、細胞屑を３２０００×ｇで２５分間の超遠心分離により除去した。
ＰＡＩ−１／ＲＲＡＲまたはＰＡＩ−１／６９の可溶性形態を含む大腸菌（E.coli）のライゼートを、ＣＭ−５０セファデックス（Pharmacia、例えば、Sancho et al. (1994) Eur. J. Biochem. 224, 125-134参照）を充填したＸＫ−２６カラム（Pharmacia Biotech Inc）に注入することにより、可溶性、活性突然変異体ＰＡＩ−１の精製を実施した。カラムを５カラム容量の出発緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、２００ｍＭのＮａＣｌおよび０.０１％トゥイーン２０、ｐＨ５.６）で洗浄し、同緩衝液中ＮａＣｌの０.２〜１.８Ｍの直線勾配を用いてＰＡＩ−１タンパク質を溶離した。ピーク画分を集め、プールし、セントリプラス３０濃縮装置（Amicon）を用いて濃縮した。濃縮した画分を活性測定用に使用した。
Ｂ．ＰＡＩ−１活性測定
１．標準トリプシンに対する活性部位滴定
ＰＡＩ−１／ＲＲＡＲおよびＰＡＩ−１／６９の活性濃度を、Olson et al. (J. Biol. Chem., 270: 30007 (1995))により記載された要領で、標準トリプシンに対する活性部位滴定により測定した。簡単に述べると、濃縮した阻害剤（０.５〜６.０μＭ）を、１μＭのβ−トリプシン（Sigma）および１０μＭのｐ−アミノベンズアミジンプローブ（Sigma）の溶液に連続的に加えた。阻害剤の結合による酵素活性部位からの結合プローブの排除に伴う蛍光の減少から結合をモニターした。各濃縮阻害剤を添加後、１〜２分の平衡時間をおいた後、それぞれ３２５ｎｍおよび３４５ｎｍの励起および放出波長での蛍光の変化を評価し、結合および遊離プローブ蛍光間の差異を最大化した。トリプシン酵素の非存在下における阻害剤とプローブのみの対照滴定を実施することにより、バックグラウンド蛍光について補正した。阻害剤−酵素滴定結果を、一次回帰分析に適合させた。
２．標準化ｔ−ＰＡ調製物の滴定
また、突然変異体ＰＡＩ−１を、標準化ｔ−ＰＡ調製物に対して滴定することにより活性を評価した。ｔＰＡ（American Diagnostics, Inc、１００Ｕ／μｇ）および色素原性ｔＰＡ基質Ｈ−Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−パラ−ニトロアニリン基質（Ｓ−２２８８、Chromogenix）を用いる直接色素原検定法により、野生型ＰＡＩ−１または突然変異体ＰＡＩ−１の阻害活性を測定した。系列希釈したＰＡＩ−１（０.１〜４.０μｇ）を、室温で一定時間（典型的には２０〜６０分間）マイクロタイタープレートにおいてｔ−ＰＡとインキュベーションし、色素原基質Ｓ−２２８８を０.５ｍＭの最終濃度になるまで添加することにより、ｔＰＡの残留活性を測定した。増加濃度の阻害剤とのインキュベーション後のｔ−ＰＡの残留活性を、４０５ｎｍでの吸光度の測定により評価した。
実施例２
ｕ−ＰＡ変異型のファージディスプレーライブラリーの構築
Ａ．ファージミドへの野生型ｕ−ＰＡのクローニング
ファージでのｕ−ＰＡのプロテアーゼドメインの機能的ディスプレーを立証するため、プライマー４９６および４９７、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、および鋳型として完全長ｕ−ＰＡ遺伝子（配列番号４７４）のｃ−ＤＮＡを含むｐＣＭＶ４プラスミド（配列番号３７３）を用いて、高忠実度ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ増幅で使用したプライマーは次の通りであった：４９６、５'−ＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＴＴＴＣＡＧＴＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＧ−３'（配列番号３７４）、４９７、５'−ＴＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＧＣＣＡＴＴＣＴＣ−３'（配列番号３７５）。両プライマーとも、５'末端にＳｆｉＩ酵素についての制限部位（下線部分）をもつ。精製およびＳｆｉＩ消化後、ＰＣＲ産物をＳｆｉＩ消化ファージミドベクター、ｐＣｏｍｂ３Ｈ（配列番号３７６）（Andris-Widhopf et al. (2000) J Immunol Methods, 28: 159-81）にライゲーションした。野生型または突然変異体ｕ−ＰＡの１価ディスプレーにファージミドを使用した（下記参照）。この構築物は、ｆｄファージのｇIIIｐ遺伝子のＣ−末端領域をコード化する配列を含む。２つの異なる認識配列をもつベクターにおける２つのＳｆｉＩ制限部位の存在は、上述のプライマーを設計するのに利用された。プライマー４９６および４９７を用いて増幅したＰＣＲ産物により、ファージミドへのｕ−ＰＡプロテアーゼドメインｃＤＮＡ（配列番号４７５）の定方向性クローニングが可能となった（ライゲーション条件については下記参照）。最終構築物において、ｕ−ＰＡプロテアーゼドメインの配列を含むＰＣＲ産物を、ＯｍｐＡおよびｇIIIｐ配列の中間でクローン化することにより、野生型または突然変異体ｕ−ＰＡをＮ−末端融合体としてディスプレーした。
Ｂ．突然変異体ｕ−ＰＡの構築および突然変異体ｕ−ＰＡのファージディスプレーライブラリー
ｕ−ＰＡファージディスプレーライブラリーを構築するため、ＰＣＲ Diversify 突然変異誘発キット（Clontech）で供給される試薬を用いて１００μｌの反応混合物中で２５サイクル間、上記で示した通り、鋳型としてｕＰＡ遺伝子のｃＤＮＡを含むｐＣＭＶ４／ｕ−ＰＡプラスミドを用いることにより、エラー-プローンＰＣＲ増幅を実施した。適切なＰＣＲ条件にしたがって３種の異なるＰＣＲ反応を設定し、製造業者により記載されたとおりマンガン（ＭＮ２＋）またはｄＧＴＰの量を変えることにより上記のプライマー４９６および４９７を用いてｕＰＡ遺伝子（配列番号４７５）のプロテアーゼドメインのみを増幅させ、ｃＤＮＡへの突然変異率０.２、０.５または０.９％の組み込みを達成した。ＰＣＲ精製キット（Qiagen）、次いでＳｆｉＩ酵素消化を用いることにより、増幅したＰＣＲ産物（８０５ｂｐ、配列番号４７５）を精製した。各突然変異誘発反応からのＳｆｉＩ消化ＰＣＲ産物を用いて、３つの異なるライブラリーを作製した。
ライブラリーを構築するため、ｐＣｏｍｂ３Ｈベクター（配列番号３７６）をＳｆｉＩ酵素で消化し、この反応からの大きい方のＤＮＡフラグメントを、「ゲルスライスキット」（Qiagen）を用いてゲル精製した。３つの別々のライゲーション反応を実施することにより、０.２、０.５および０.９％突然変異率を含むＰＣＲ産物で３種のライブラリーを構築した。少なくとも１μｇのゲル精製ベクターを、ＳｆｉＩ消化ＰＣＲ産物（１：２比）と混合し、ライゲーション混合物を一晩１８℃でインキュベーションした。次に、ライゲーション混合物を、Qiagen ミニ溶離キット（Qiagen）を用いて精製し、最後にＤＮＡを６０μｌの Milli Q 精製水中へ溶離した。精製したＤＮＡを、４００μｌの大腸菌（E.coli）XL Blue1 エレクトロポレーション能力細胞（Stratagene）中へ遺伝子のパルサー（Bio Rad）を用いてエレクトロポレーションした。次いで、細胞を１０ｍｌのＳＯＣ培地（Invitrogen）へ移し、振とう器中３７℃で１時間インキュベーションした後、カルベニシリン（７５μｇ／ｍＬ）を補った大型ＬＢ寒天プレート（２４５ｍｍ×２４５ｍｍ）で平板培養した。３０℃でのプレートの一晩インキュベーション後、細胞スクレーパーを用いて形質転換体をこすり取り、得られた培養物を、３７℃で振とうしながら２時間カルベニシリン（７５μｇ／ｍｌ）を補った２Ｘ ＹＴ培地で培養した。培養物を、ライブラリー増幅のため５のＭＯＩ（感染多重度）でヘルパーファージ（ＶＣＳ Ｍ１３）により感染させた。３７℃で振とうしながら１時間培養後、培養物にカナマイシンを３μｇ／ｍＬの最終濃度になるまで補い、一晩３７℃で振とうしながら培養した。細胞を採取し、ＰＥＧ−ＮａＣｌ溶液を用いて上清に存在するファージ粒子を沈殿させた。同時に、各ライブラリーの多様性を計算するため、電気穿孔した細胞のアリコートを、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢ寒天プレートで平板培養し、一晩３７℃でインキュベーション後コロニーを計数した。同じ方法を用いることにより、ＰＡＩ−１／ＲＲＡＲ阻害剤に対して同定されたｕ−ＰＡ変異型のさらなる改良のため連続世代のｕ−ＰＡファージディスプレーライブラリーを作製した。以前のライブラリーから同定されたｕ−ＰＡ変異型のＤＮＡを、次世代ライブラリー構築用の鋳型として用いた。
ランダム突然変異誘発を用いて作製した野生型またはｕ−ＰＡファージライブラリーの触媒有効性を、間接的プラスミノーゲン活性化検定法を用いて分析した。簡単に述べると、合計１００μｌの容量中に、５μｌのｕ−ＰＡファージ（典型的には〜５×１０１２ｃｆｕ）、０.２μＭのＬｙｓ−プラスミノーゲン（American Diagnostic）および０.６２ｍＭの Spectrozyme ＰＬ（American Diagnostic）を存在させた。マイクロタイタープレートで検定を実施し、４０５ｎｍでの光学密度を、Molecular Devices Thermomax を用いて３０秒ごとに１時間読み取った。反応を３７℃で実施した。ｕ−ＰＡまたはｕ−ＰＡ変異型ファージの阻害についても評価した。簡単に述べると、ｕ−ＰＡファージ５μｌ（典型的には〜５×１０１２ｃｆｕ）を、ｗｔ−ＰＡＩ−１（０.１μＭ）または突然変異体ＰＡＩ−１／ＲＲＡＲ阻害剤（１.０μＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベーションし、次いで０.６２ｍＭのSpectrozyme ＰＬ、０.２μＭのＬｙｓ−プラスミノーゲン（American Diagnostics, Inc.）を加えた。検定結果を上記要領で読み取った。
実施例３
突然変異体阻害剤に対するｕ−ＰＡファージライブラリーからの変異体ｕ−ＰＡの選択
Ａ．ｕ−ＰＡファージ／突然変異体ＰＡＩ−１複合体の選択
突然変異体ＰＡＩ−１／ＲＲＡＲ阻害剤またはＰＡＩ−１／６９を、ふるい分け実験における「ベイト基質」として用いることにより、上記実施例２に記載した大きなコンビナトリアルｕ−ＰＡファージディスプレーライブラリーからの突然変異体基質配列に対して改善された反応性を示す改変されたｕ−ＰＡファージ（複数も可）を単離した。簡単に述べると、３つの全ｕ−ＰＡファージライブラリー（０.２、０.５および０.９％突然変異誘発頻度）からの同等呈示量のｕ−ＰＡファージを含む、５μｌ（〜２×１０１２〜１×１０１３）のｕ−ＰＡファージを、合計容量１００μｌ（すなわち、反応物は８０μｌのＨ２Ｏを含んだ）中で５μｌのベイト基質（０.１〜１.０μＭのＰＡＩ−１／ＲＲＡＲまたはＰＡＩ−１／６９）および１０μｌの１０×間接的緩衝液ｐＨ７.４（０.５Ｍのトリス、１.０ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０.１％トゥイーン 80）と混合した。反応物を室温で様々な時間インキュベーションした（典型的には１時間、しかしながら、インキュベーション時間を調節して溶液のストリンジェンシーを制御した）。
ＣｕＳＯ４活性化セファロースを用いて、ｕ−ＰＡファージ−ＰＡＩ−１阻害剤複合体を捕捉した。ＣｕＳＯ４（１００ｍＭ）で処理することにより、キレート化セファロース（２００μｌ；Pharmacia）の前活性化を達成した。ＣｕＳＯ４活性化セファロースを、室温で１時間ＰＢＳ緩衝液中の０.５％ＢＳＡにより遮断した。ＢＳＡ遮断セファロースビーズ１００μｌを、結合緩衝液（０.５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス、２０ｍＭのイミドゾール、ｐＨ７.４）８００μｌの存在下、上記ふるい分け混合反応物１００μｌに加えることにより、Ｈｉｓ標識ＰＡＩ−１阻害剤−ｕ−ＰＡファージ複合体を捕捉した。インキュベーションをさらに１時間室温で続行した。次に、ふるい分け混合物を２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、結合ｕ−ＰＡファージ−ＰＡＩ−１阻害剤複合体を含むセファロースビーズを、結合緩衝液１ｍｌで洗浄することにより、未結合ファージを除去した。洗浄段階を５〜１０回反復し、各洗浄後結合複合体を含むビーズを新しい管に移すことにより、非特異的ファージの潜在的「キャリーオーバー（持ち越し）」を回避した。
結合ｕ−ＰＡファージ−ＰＡＩ−１／ＲＲＡＲ複合体を、溶離緩衝液（０.５ＭのＥＤＴＡ）１００μｌで溶離した。溶離したファージの９５μｌアリコートを用いて、１ｍｌのXL-1 Blue 大腸菌（E.coli）細胞を感染させる（０.６ＯＤ）ことにより、ライブラリーのアウトプットを計算した（選択後に得られたファージの数を示す）。感染した細菌を、カルベニシリン（７５μｇ／ｍｌ）を含む大型プレート（２４５ｍｍ×２４５ｍｍ）で培養することにより、次のラウンドの選択用にライブラリーを作製した。最後に、残りのアウトプットライブラリー（すなわち、選択されたファージ）を用いて、次のラウンドの選択用に新しいライブラリーをスクリーニングおよび／または作製するため個々のファージクローンを調製した。選択で使用するベイト基質の濃度およびライブラリーとベイト基質のインキュベーション時間を、所望のストリンジェンシーレベルにしたがって調節した。例えば、条件は、１％未満、２％、５％、１０％または１０％を超える率でライブラリーのｕ−ＰＡ活性が、ベイト基質配列を含む「ベイトＰＡＩ−１」により阻害されるように選択され得る。典型的には、高い（例、０.５μＭ）濃度のベイトＰＡＩ−１を用いて選択の初回ラウンドを実施し、選択の後続ラウンドについては、ベイトセルピン濃度およびライブラリーとのインキュベーション時間を減らした。さらに、多重ストリンジェンシーを各選択ラウンドで並行して使用することもできる。アウトプット（例、一対＋／−ベイトセルピン選択におけるファージアウトプットのシグナル対ノイズ比（下記参照））の質、および機能性分析に基づいた結果の「ヒット」の質に基づいて、これらの選択の１つまたはそれ以上からのファージアウトプットが選択の次回ラウンド（複数も可）に向けて実施され得る。
並行して、ベイト基質を含まないｕ−ＰＡライブラリーからのファージの選択に関する上記条件を用いて対照実験を実施し、この対照実験からのファージを、ベイトセルピン基質の存在下におけるライブラリー選択のアウトプットと比較した。ベイト基質の存在下で選択されたライブラリーのアウトプットからのｃｆｕは、通常対照選択から得られたアウトプットより１０４〜１０５高い範囲であった。高いバックグラウンドが対照選択で観察された場合、インキュベーション時間を減らす、反応体（ライブラリー、ベイト基質またはビーズ）の濃度を増す、およびキレート化セファロースに結合した選択されたファージの洗浄回数および時間を増やす（１０倍またはそれ以上まで）などストリンジェンシーの高い条件を用いてふるい分けを反復した。
Ｂ．新しい基質配列に対して高い反応性および触媒有効性をもつｕ−ＰＡファージのスクリーニング
溶離ｕ−ＰＡファージのアリコート（５μｌ）を、感染させるためXL-1Blue 大腸菌（E.coli）細胞（１００μｌ）と混合し、３７℃で１時間インキュベーションした。次いで、感染した大腸菌（E.coli）細胞を、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢ寒天プレートで平板培養した。一晩３７℃でインキュベーション後、個々のコロニーをファージ調製用に採取した。カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびテトラサイクリン（１００μｇ／ｍｌ）を補った２×ＹＴ２ｍｌ中で細胞を増殖させ、報告された要領（Sambrook, J et al (1989) Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold spring Harbor laboratory）でファージ調製を実施した。同定されたファージを以下の検定法で試験することにより、活性を評価した。個々のファージ調製物を間接的プラスミノーゲン活性化検定法で使用することにより、活性ファージを同定し、活性ファージ調製物を阻害検定法に用いた。
１．間接的プラスミノーゲン活性化検定法
個々のファージ調製物を間接的プラスミノーゲン活性化検定法で使用することにより、活性ｕ−ＰＡファージを同定した。簡単に述べると、１００μｌの合計容量中に、５μｌのｕ−ＰＡファージ（典型的には〜５×１０１２ｃｆｕ）、０.２μＭのＬｙｓ−プラスミノーゲン（American Diagnostic）および０.６２ｍＭの Spectrozyme PL (American Diagnostica)を存在させた。検定法をマイクロタイタープレートで実施し、４０５ｎｍでの光学密度を、Molecular Devices Thermomax において３０秒ごとに１時間読み取った。反応を３７℃で実施した。
２．突然変異体ＰＡＩ−１／ＲＲＡＲによるｕ−ＰＡファージの阻害
間接的プラスミノーゲン活性検定法で活性として確認されたファージを、突然変異体ＰＡＩ−１／ＲＲＡＲによる阻害についてさらに試験した。簡単に述べると、阻害検定については、５μｌの活性ｕ−ＰＡファージ（典型的には〜５×１０１２ｃｆｕ）を、マイクロタイタープレートのデュプリケイトウェルに加え、次いで一定濃度の突然変異体ＰＡＩ−１（例、１.０μＭ）を一方のウェルに加え、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）をデュプリケイトの他方のウェルに加えた。混合した後、反応を一定時間（例、３０分）室温で続行させ、次いで０.６２ｍＭの Spectrozyme PL、０.２μＭのＬｙｓ−プラスミノーゲン（American Diagnostic,Inc.）を添加した。対照実験については、野生型ｕ−ＰＡファージを同一条件下で評価した。プレートを２時間分光光度計において４０５ｎｍで読み取った。野生型ｕ−ＰＡファージと比べてＰＡＩ−１／ＲＲＡＲまたはＰＡＩ−１６９に対して改善された感受性を呈する選択されたｕ−ＰＡファージを、さらなる分析用に選択し、ＤＮＡ配列決定にかけた。
３．ペプチド基質スクリーニング
さらに、改善された触媒有効性を呈するｕ−ＰＡファージの変異型を同定するため、個々のファージクローンを、Ａｃ−ＲＲＡＲ−ＡＭＣ基質に対するスクリーニングにかけた。検定法については、一定容量のファージ上清（例、３５μｌ）を、総容量１００μｌで１Ｘ間接検定緩衝液（５０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０.０１％トゥイーン 80）中において７５μＭのＡｃ−ＲＲＡＲ−ＡＭＣ基質と混合した。９６ウェルまたは３８４ウェルの黒色検定プレート（Corning）で検定を実施し、分光光度計（Molecular Devices）読取装置により２時間３８０〜４５０ｎｍで読み取った。
それらの改善を確認するため、阻害剤およびペプチド基質スクリーニング後に確認された陽性ｕ−ＰＡファージを、上記検定法を用いて再度スクリーニングにかけた。
Ｃ．選択されたｕ−ＰＡ突然変異体の同定および同定された突然変異体の最適化
陽性ファージクローンを、上記と同様、感染させるためXL-1Blue 大腸菌（E.coli）細胞と混合し、培養物を３７℃で振とうしながら一晩発育させた。プラスミド調製キット（Qiagen）を用いて、プラスミドＤＮＡを一晩培養物から精製した。ＤＮＡを次のプライマー：５３５−５'−ＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧ−３'（配列番号３８１）；５５４２−５'ＧＴＧＣＧＣＡＧＣＣＡＴＣＣＣＧＧ−３'（配列番号３８２）を用いるカスタムシーケンシングに送った。配列決定データの解析後に突然変異体ｕ−ＰＡ遺伝子で改変されたアミノ酸残基が同定された。
下表１０は、ＰＡＩ−１／ＲＲＡＲ突然変異体阻害剤に対するｕ−ＰＡファージライブラリーからの変異型ｕ−ＰＡの選択から同定されたｕ−ＰＡの変異型を示している。下表１０に示した突然変異は、キモトリプシンのナンバリングによるものである。カッコ内の数は、突然変異体がファージ選択方法で同定された回数を示す。活性検定法からの結果に基づいて、ｕ−ＰＡファージの最良の変異型を下線により強調している。示された突然変異を含む成熟ｕ−ＰＡプレプロタンパク質（配列番号４３３）のアミノ酸配列は、配列番号４３４〜４４５のいずれかに示されている。
表１０
Figure 0004546578
ＰＡＩ−１／６９阻害剤に対する選択後にＰＡＩ−１／６９阻害剤に対して高い感受性を呈する突然変異体ｕ−ＰＡ遺伝子において改変されたアミノ酸残基が、上記で示した配列決定データの解析後に同定された。第一世代プロテアーゼファージディスプレーライブラリー（Ｉ）から同定された突然変異体を下表１１に示す。ＰＣＲ Diversify 突然変異誘発キットおよびプライマー４９６および４９７を用いる上記実施例２Ｂで示した方法を用いることにより、後続世代のプロテアーゼファージディスプレーライブラリーを作製した。第２世代ファージディスプレーライブラリーについては、キモトリプシンのナンバリングに基づいたＦ３０Ｖに対応する突然変異を含むｕ−ＰＡ突然変異体ｕ−ＰＡ／Ｉｃを、突然変異誘発反応用の鋳型として使用した。第２世代プロテアーゼファージディスプレーライブラリー（II）から同定された突然変異体を、下表１１に示す。第３世代ファージディスプレーライブラリーについては、キモトリプシンのナンバリングに基づいたＦ３０Ｖ／Ｙ６１（Ａ）ＨまたはＦ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅにそれぞれ対応する突然変異を含むｕ−ＰＡ突然変異体ｕ−ＰＡ−IIｂまたはｕ−ＰＡ−IIｂ突然変異体を、突然変異誘発反応用の鋳型として使用した。第３世代プロテアーゼファージディスプレーライブラリー（III）から同定された突然変異体を、下表１１に示す。第４世代ファージディスプレーライブラリーについては、キモトリプシンのナンバリングに基づいたＦ３０Ｖ／Ｋ８２Ｅ／Ｖ１５９Ａに対応する突然変異を含むｕ−ＰＡ突然変異体ｕ−ＰＡ／IIIａを、突然変異誘発反応用の鋳型として使用した。第４世代プロテアーゼファージディスプレーライブラリー（ＩＶ）から同定された突然変異体を、下表１１に示す。カッコ内の数は、ｕ−ＰＡファージが同じ突然変異を有するものについて選択された回数を示す。下線は、突然変異体により獲得された新しい突然変異を示す。示された突然変異を含む成熟ｕ−ＰＡプレプロタンパク質（配列番号４３３）のアミノ酸配列は、配列番号４６０〜４７２のいずれかに示されている。
表１１
Figure 0004546578
１．ＰＡＩ−１／ＲＲＡＲ阻害剤に対するフォーカスファージディスプレーライブラリーにおけるアミノ酸残基３０および１５５の最適化および組換え
ＰＡＩ−１／ＲＲＡＲ阻害剤に対するｕ−ＰＡ変異型の感受性を増強するため、キモトリプシンのナンバリングに基づいたアミノ酸３０およびアミノ酸１５５（上記表１０に示された初回選択でホットスポットとして確認されている）を、次のプライマーをそれぞれ用いてランダム化および組換えについてターゲッティングした：ＴＣ３０−５'ＧＣＣＣＴＧＧＮＮＳＧＣＧＧＣＣＡＴＣ−３'（配列番号３８３）ＴＣ１５５−５'ＧＧＡＧＣＡＧＮＮＳＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧ−３'（配列番号３８４）
製造業者が記載した条件にしたがって、Quick Change 多位置指定突然変異導入キット（Stratagene）を用いることにより突然変異誘発を実施した。簡単に述べると、製造業者が記載した条件にしたがって、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs）を用いたプライマーのリン酸化の後、残基３０および１５５のランダム化について３種の異なる反応を実施した：１）個々に３０、２）個々に１５５、および同時に３０と１５５の両方。対応する野生型ｕ−ＰＡプロテアーゼドメイン配列と異なり残基Ｌ７３ＡおよびＩ８９Ｖに突然変異をもつＤＮＡ構築物、ｐＣｏｍｂ３Ｈ／ｕ−ＰＡ変異型（ｐＡＲＦ８１）を、３０位および１５５位のそれぞれのランダム化にプライマーＴＣ３０（配列番号３８３）およびＴＣ１５５（配列番号３８４）をそれぞれ用いる突然変異誘発反応において鋳型として用いた。別の反応では、これら２種のプライマーを用いることにより、ｐＡＲＦ８１変異型ＤＮＡで３０および１５５位を一緒にランダム化した。製造業者が明記した条件にしたがって、Multi 位置指定突然変異導入キット（Stratagene）を用いることにより突然変異誘発を実施した。突然変異導入後、反応産物をXL-1Blue 大腸菌（E.coli）細胞へライブラリー構築用に形質転換した（上記実施例２参照）。増幅したｕ−ＰＡファージライブラリーを、上記実施例３Ａおよび３Ｂに示した改良されたｕ−ＰＡ変異型の選択に使用した。
下表１２は、全変異型がキモトリプシンのナンバリングに基づいたアミノ酸残基Ｌ７３ＡおよびＩ８９Ｖにバックグラウンド突然変異を有するフォーカスｕ−ＰＡファージライブラリーからの変異型ｕ−ＰＡのＰＡＩ−１／ＲＲＡＲ突然変異体阻害剤に対する選択から同定されたｕ−ＰＡの変異型を示している。下表１２に示した突然変異は、キモトリプシンのナンバリングによるものである。カッコ内の数は、突然変異体がファージ選択方法で同定された回数を示す。活性検定法からの結果に基づいて、ｕ−ＰＡファージの最良の変異型を下線により強調している。示された突然変異を含む成熟ｕ−ＰＡプレプロタンパク質（配列番号４３３）のアミノ酸配列は、配列番号４４６〜４５９のいずれかに示されている。
表１２
Figure 0004546578
実施例４
ＣＯＳ細胞の一過性トランスフェクションによる修飾ｕ−ＰＡ酵素の発現
哺乳類発現系で変異型ｕ−ＰＡ酵素を発現させるため、ファージディスプレー結果から同定された陽性クローンを、選択されたｕ−ＰＡ変異型遺伝子をコード化するｃＤＮＡのＰＣＲ増幅用の鋳型（突然変異体ｕ−ＰＡプロテアーゼドメイン配列をもつｐＣｏｍｂ３Ｈ）として用いた。次のプライマーを用いて、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（Ho, S et al (1989) Gene 77, 51-59）を実施した。７１７−５'−ＴＴＴＣＡＧＴＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＧ−３'（配列番号３８５）；７１８、５'−ＣＡＧＡＧＴＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＡ−３'（配列番号３８６）；８５０、５'-ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＧＣＧＣ−３'（配列番号３８７）；８５１、５'-ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＣＡＧＡＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＡＴＴＣＴＣＴ−３'（配列番号３８８）。プライマー８５０および８５１は、それぞれＫｐｎＩおよびＸｂａＩ制限酵素（下線）についての配列をもつ。
２段階でＰＣＲを実施することにより、下記の要領で突然変異ｃＤＮＡ ｕ−ＰＡ遺伝子の完全長増幅を達成した。第１段階では、ＰＣＲを１００μｌ反応物中で実施し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー８５０、７１８および鋳型として完全長ｕＰＡ遺伝子を含むｐＣＭＶ４（配列番号４７４）を用いることにより５００ｂｐ産物（ｕ−ＰＡのＥＧＦおよびクリングルドメインに対応する）を増幅した。同様に、別のＰＣＲを実施し、プライマー８５１および７１７、および鋳型として適切な突然変異体ｕ−ＰＡ−ｐＣｏｍｂ３Ｈを用いることにより突然変異体ｕ−ＰＡプロテアーゼドメイン（８００ｂｐ、すなわち配列番号４７５で示した野生型配列と異なる突然変異体配列に対応する）を増幅した。これら２種のＰＣＲ産物をゲル精製し、ＰＣＲ増幅の次なるラウンドで使用した。第２段階では、ゲル精製したＰＣＲ産物（各５μｌ）を、プライマー８５０および８５１を含めた１００μｌ反応混合物中で鋳型として使用した。プライマー７１７および７１８は、第２段階ＰＣＲで完全長ｕ−ＰＡ ｃＤＮＡ（１.３ｋｂ）を増幅させ得るオーバーラップ相補的配列を有する。ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いてＰＣＲ産物を精製し、次いでＫｐｎＩおよびＸｂａＩ制限酵素により消化した。QIAquickカラム（Qiagen）を用いて精製後、完全長ｐ−ＵＡ遺伝子を、ＫｐｎＩおよびＸｂａＩで予め消化しておいたｐＣＭＶ４哺乳類発現ベクター（配列番号３７３）とライゲーションした。ライゲーション混合物を、大腸菌（E.coli）XL-1Blue 細胞へ電気穿孔し、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレートで平板培養した。３７℃でプレートを一晩インキュベーション後、個々のコロニーを採取し、プラスミド精製用に２ｍｌのＬＢ培地で培養した。次の配列決定用プライマーを用いた全ｕ−ＰＡ遺伝子の配列決定にこれらのプラスミドを使用した。ＵＰＡＦ１−５'ＡＴＧＡＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣ−３'（配列番号４７６）およびＵＰＡＦ２−５'ＧＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＧ−３'（配列番号４７７）。
正確な突然変異をもち、追加の突然変異（複数あり）は一切もたない突然変異体ｕ−ＰＡクローンを、Midi プラスミド調製キット（Qiagen）を用いて大量生産し、Bio-Rad Gene Pulserを用いるＣＯＳ−１細胞への電気穿孔に使用した。ｃＤＮＡ２０μｇ、担体ＤＮＡ１００μｇ、および約１０７のＣＯＳ−１細胞を、０.４ｃｍのキュベットに入れ、電気穿孔を３２０Ｖ、９６０マイクロファラッド、およびΩ＝∞で実施した（Tachias et al. (1995) J Biol. Chem., 270: 18319-18322）。電気穿孔後、トランスフェクションされた細胞を、１０％胎児ウシ血清および５ｍＭの酪酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ培地（Irvine Scientific）中３７℃で一晩インキュベーションした。次いで、細胞を血清不含有培地で洗浄し、ＤＭＥＭ中３７℃で４８時間インキュベーションした。血清不含有培地とインキュベーション後、条件培地を集め、さらなる特性確認に使用した。
実施例５
精製突然変異体ｕ−ＰＡの特性確認
Ａ．酵素濃度の測定
条件培地中の突然変異体ｕ−ＰＡ酵素の１本鎖形態を、プラスミン−セファロース（Calbiochem）で処理することにより対応する２本鎖酵素に変換した。これらの培地における活性ｕ−ＰＡの濃度を、上記実施例１記載の要領でトリプシン一次標準に対して予め滴定しておいた標準ＰＡＩ−１阻害剤調製物での活性部位滴定により測定した。実験マニュアル、Harlow et al (1998) Using Antibodies（Cold Spring Harbor Laboratory）のプロトコルにしたがって酵素結合イムノソルベント検定法により、全酵素濃度を測定した。これらの濃度比により、各培地で活性を示すｕ−ＰＡ変異型のフラクションを得た。
Ｂ．ｕ−ＰＡの直接的色素原検定法
ｕ−ＰＡ活性の直接検定法では、基質カルボベンズオキシ−Ｌ−γ−グルタミル（α−ｔ−ブトキシ）−グリシル−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド一酢酸塩（Ｃｂｏ−Ｌ−(γ)−Ｇｌｕ(α−ｔ−βｕＯ)−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ ＡｃＯＨ; Spectrozyme（登録商標）ｕＰＡ。American diagnostica）を利用した（Madison et al. (1995) J Biol. Chem., 270:7558-7562）。４０５ｎｍの吸光度で単位時間あたりに生じた遊離（ｐＮＡ）の吸光度の増加を測定することにより、酵素活性を測定した。６〜８ｎＭ間の酵素濃度を用いて、動的検定を経時的に実施した。Spectrozyme（登録商標）ｕＰＡの濃度を、２本鎖ｕ−ｐＡの検定では２５から１５０μＭに、またｕ−ＰＡのプロテアーゼドメインの検定では２５から２００μＭに変えた。反応を９６ウェルのマイクロタイタープレートで実施し、Spectromax M2 または M5 プレート読取装置(Molecular Devices)を用いて３０秒ごとに４０５ｎｍでの吸光度測定により、２時間までの間反応速度を評価した。基質濃度の逆数対ＯＤ４０５での吸光度の速度の逆数をグラフ化し、ラインウィーバー-バーク等式（１／速度＝（Ｋｍ／Ｖｍａｘ)（１／［Ｓ］）＋１／Ｖｍａｘ;式中、Ｖｍａｘ＝「Ｅ」*ｋａｃｔ）に当てはめることにより、反応速度定数ｋｃａｔ、Ｋｍおよびｋｃａｔ／Ｋｍ（特異性定数）を計算した。
下表１３は、ｕ−ＰＡ酵素活性の直接検定法でＰＡＩ−１／６９阻害剤に対して高い感受性を呈するものとして同定された、ｕ−ＰＡの突然変異体の動的検定の結果を示す。これらの結果は、Spectrozyme（登録商標）ｕＰＡ基質の開裂に関する特異性定数（ｋｃａｔ／Ｋｍ）の測定結果から測定されたところによると、同定された突然変異体ｕ−ＰＡのそれぞれが、野生型ｕ−ＰＡと比べて低い酵素活性を有することを示している。表において、試験した変異型は、ｕ−ＰＡファージディスプレーライブラリーの後続世代（第１〜第４）からの選択後における上記表１１に示されたものである。
Figure 0004546578
Ｃ．蛍光性基質を用いたｕ−ＰＡ変異型の動的検定
ＲＲＡＲ標的基質配列に対するｕ−ＰＡ変異型の活性を測定する直接的検定法を、Ａｃ−ＲＲＡＲ−ＡＭＣ基質を利用して実施した。７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）蛍光性ペプチド基質の使用は、プロテアーゼ特異性の常用的測定方法である（Zimmerman et al. (1977) Anal Biochem, 78:47-51; Harris et al. (2000) PNAS, 97:7754-7759）。アニリド結合の特異的開裂により、蛍光性ＡＭＣ脱離基が遊離することから、これは個々の基質に関する開裂速度を測定する有効な手段を提供する。基質を０.０５から１２.０ｍＭまで系列希釈し、Costarの９６ウェル黒色半面積検定プレートにおいてプロテアーゼ（９〜２５ｎＭ）の存在下でインキュベーションした。遊離ＡＭＣ脱離基からの蛍光を、ＡＭＣ標準に関して励起波長（３８０ｎｍ）および放出波長（４５０ｎｍ）で蛍光分光光度計（Molecular Devices Gemini XPS）により測定した。蛍光の増加速度を、３０秒間隔で読み取ることにより３０分にわたって測定した。基質濃度の逆数対基質開裂速度の逆数をグラフ化し、ラインウィーバー-バーク等式（１／速度＝（Ｋｍ／Ｖｍａｘ)（１／［Ｓ］）＋１／Ｖｍａｘ;式中、Ｖｍａｘ＝「Ｅ」*ｋａｃｔ）に当てはめることにより、反応速度定数ｋｃａｔ、Ｋｍおよびｋｃａｔ／Ｋｍ（特異性定数）を計算した。
下表１４は、Ａｃ−ＲＲＡＲ−ＡＭＣ基質に対するｕ−ＰＡ変異型ＡＲＦ２およびＡＲＦ３６の動的検定の結果を示す。これらの結果は、選択されたｕ−ＰＡプロテアーゼ変異型に関するＲＲＡＲ基質についての特異性定数が野生型ｕ−ＰＡと比べて約１０倍またはそれ以上の割合で高いことを示している。
Figure 0004546578
Ｄ．間接的色素原検定法を用いたプラスミノーゲン活性化の動的検定
間接的色素原検定法を実施することにより、精製タンパク質調製物として製造した野生型および突然変異体ｕ−ＰＡの活性を測定した（Madison et al. (1989) Nature, 339: 721-724; Madison et al. (1990) J Biol. Chem., 265: 21423-21426）。この検定法では、遊離ｐ−ニトロアニリンを、プラスミノーゲンに対するｕ−ＰＡの作用により産生したプラスミンの作用により色素原性基質 Spectrozyme PL（Ｈ−Ｄ−ノルロイシルヘキサヒドロチロシル−リシン−ｐ−ニトロアニリド二酢酸塩、American Diagnostics, Inc.）から放出させる。遊離ｐ−ニトロアニリンの放出を、ＯＤ４０５ｎｍでの分光光度計により測定した。
この検定法については、試験すべきｕＰＡ酵素０.２５〜１ｎｇ、０.６２ｍＭのSpectrozyme PL、０.２μＭのＬｙｓ−プラスミノーゲン（American Diagnostics, Inc.）を含む反応混合物１００μｌを、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、０.１ＭのＮａＣｌ、１.０ｍＭのＥＤＴＡおよび０.０１％（ｖ／ｖ）トゥイーン８０を含む緩衝液中で合わせた。反応物を３７℃で９６ウェルの平底マイクロタイタープレート（Costar,Inc.）中においてインキュベーションし、４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ４０５）を、Molecular Devices Thermomax において３０秒ごとに１時間読み取った。反応速度定数ｋｃａｔ、Ｋｍおよびｋｃａｔ／Ｋｍ（特異性定数）を先の記載（Madison, E. L (1989) Nature 339, 721-724）要領で計算した。
下表１５は、ｕ−ＰＡ酵素活性の間接的検定法において、ＰＡＩ−１／６９阻害剤に対して高い感受性を呈するものとして同定された、突然変異体ｕ−ＰＡの動的検定の結果を示す。結果は、Spectrozyme（登録商標）ＰＬ基質の開裂に関する開裂特異性定数（ｋｃａｔ／Ｋｍ）の間接的測定結果から測定されたところによると、同定された突然変異体ｕ−ＰＡがそれぞれ野生型ｕ−ＰＡと比べて低い酵素活性を有することを示している。表において、試験した変異型は、ｕ−ＰＡファージディスプレーライブラリーの後続世代（第１〜第４）からの選択後における上記表１１に示されたものである。
Figure 0004546578
Ｅ．野生型ＰＡＩ−１および突然変異体ＰＡＩ−１による突然変異体ｕ−ＰＡ酵素の阻害の動的検定
突然変異体および野生型ｕ−ＰＡ（陽性対照）の阻害に関する２次速度定数（ｋｉ）を、偽１次速度定数（ｋｉ＜２×１０６）または２次速度定数（ｋｉ＞２×１０６）条件を用いて測定した。各酵素については、残留酵素活性が初期活性の２０〜８０％の範囲で変化する幾つかのデータポイントが得られるように、酵素および阻害剤（突然変異体ＰＡＩ−１）の濃度を選択した。野生型および突然変異体ｕ−ＰＡと野生型および突然変異体ｕ−ＰＡの相互作用速度に関する動的検定を、０.１ｍＭのＥＤＴＡおよび０.１％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０を含む０.１Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.４）中２４℃で実施した。上記Ｄ項記載の間接的色素原検定法を用いて、時間の関数として存在する残留酵素活性を測定した。
ＰＡＩ−１による野生型および突然変異体ｕ−ＰＡに阻害に関する速度定数は、以前に記載された（例えば、Holmes et al. (1987) Biochemistry, 26: 5133-5140; Beatty et al. (1980) J. Biol. Chem., 255:3931-3934; Madison et al. (1990) PNAS, 87: 3530-3533; Madison et al. (1993) Methods Enzymol., 223:249-271参照）ｕ−ＰＡに対し過剰のＰＡＩ−１に関する偽１次速度定数条件下のものであった。簡単に述べると、精製野生型または突然変異体ｕ−ＰＡ（３〜５０ｆｍｏｌ）を、室温で０〜１２０分間野生型または突然変異体ＰＡＩ−１（３５〜１３３０ｆｍｏｌ）とインキュベーションした。インキュベーション後、混合物を希釈し、残留酵素活性を上記Ｄ項記載の標準色素原検定法で測定した。ｌｎ（残留活性／初期活性）対時間をプロットし、得られた直線の傾きを決定することにより、データを分析した。次いで、反応における阻害剤の濃度で傾きを割ることにより、偽１次速度定数を誘導した。
２次反応については、等モル濃度の野生型または突然変異体ｕ−ＰＡおよび野生型または突然変異体ＰＡＩ−１を、マイクロタイタープレートウェルで直接混合し、０〜３０分の時間範囲の様々な期間室温で前インキュベーションした。インキュベーション後、混合物を過剰の中和性抗ＰＡＩ抗体でクエンチングし、残留酵素活性を間接的色素原検定法で測定した。間接的色素原検定結果を、ＰＡＩ−１を含まないか、または前インキュベーションおよび反応混合物への抗ＰＡＩ−１抗体、プラスミノーゲンおよび Spectrozyme PLの添加後にＰＡＩ−１を加える対照反応と比較した。ｌｎ（残留活性／初期活性）対時間をプロットし、得られた直線の傾きを決定することにより、データを分析した。次いで、反応における阻害剤の濃度で傾きを割ることにより、２次速度定数を誘導した。
下表１６は、ＰＡＩ−１／ＲＲＡＲ阻害剤によるｕ−ＰＡ変異型の阻害に関する２次速度定数を示す。結果は、野生型ｕ−ＰＡと比べて阻害に関するｋｉ速度定数が高いと評価されている通り、変異型ＡＲＦ２およびＡＲＦ３６が、ＰＡＩ−１／ＲＲＡＲ阻害剤基質に関する特異性について約２０倍の改善を呈することを示す。
Figure 0004546578
下表１７および１８は、ＰＡＩ−１／６９阻害剤に対して選択された野生型ｕ−ＰＡまたはｕ−ＰＡ変異型による野生型（表１７）または突然変異体ＰＡＩ−１／６９阻害剤（表１８）に関する阻害の２次速度定数の結果である。表１７および１８のそれぞれに示した変異体ｕ−ＰＡは、上記表１１で示されているｕ−ＰＡファージライブラリー選択の１（Ｉ）〜４（ＩＶ）連続ラウンドから同定されたものである。表１７における結果は、突然変異体ｕ−ＰＡの中には（すなわち、ｕ−ＰＡ／IIIａ、ｕ−ＰＡ／IIIｂおよびｕ−ＰＡ／ＩＶａ）、野生型ｕ−ＰＡと比べて阻害に関する２次速度定数が微増しているものがあり、突然変異体ｕ−ＰＡ／Ｉｃ、ｕ−ＰＡ／IIｂおよびｕ−ＰＡ／ＩＶｂは、野生型ｕ−ＰＡと比べて阻害に関する２次速度定数が低いことを示している。表１８における結果は、阻害に関する２次速度定数が、突然変異体ＰＡＩ−１／６９阻害剤による阻害について選択されたｕ−ＰＡ変異型のそれぞれについて劇的に増加していることを示す。これらの結果は、選択された変異型のそれぞれが、ＰＡＩ−１／６９阻害剤基質に関する特異性に関して１３倍を超える改善を呈しており、変異型ｕ−ＰＡ／IIIｂ、ｕ−ＰＡ／ＩＶａおよびｕ−ＰＡ／ＩＶｂが、それぞれ特異性に関して４０倍近く、またはそれを超える改善を呈することを示す。
Figure 0004546578
Figure 0004546578
実施例６
突然変異体ＡＴ３阻害剤に対するＭＴ−ＳＰ１ファージライブラリーからの変異型ＭＴ−ＳＰ１の選択
アミノ酸残基ＩＡＧＲＳＬ（配列番号４７８）に対応する野生型ＡＴ３の反応性部位ループ（ＲＳＬ）残基Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１'−Ｐ２'にヘキサペプチド配列を含む突然変異体抗トロンビンIII（ＡＴ３）阻害剤（配列番号５）に対し、これらの残基において、補体Ｃ２開裂配列のアミノ酸残基に対応するＳＬＧＲＫＩ（配列番号４７９）への置換を含むように突然変異を導入した。突然変異体ＡＴ３ＳＬＧＲ−Ｋ１をプロテアーゼ選択実験における「ベイト基質」として用いることにより、大きなコンビナトリアルＭＴ−ＳＰ１ファージディスプレーライブラリーから突然変異体基質配列に対する反応性が改善されたファージを単離した。簡単に述べると、第１世代選択分析については、酵素活性を有する低突然変異頻度（すなわち、０.２〜０.５％の突然変異誘発頻度）ライブラリーである１：１００ＳＭ１（〜３Ｘ１０１３）ＭＴ−ＳＰ１ファージライブラリー５μｌを、同等呈示量で高い突然変異誘発頻度（すなわち、０.９％）を含む１：１００ＳＭ２（〜３Ｘ１０１２）ＭＴ−ＳＰ１ファージライブラリー５μｌと合わせた。ファージライブラリーを、５０μｌの総容量（すなわち、２０μｌのＨ２Ｏを含む）で５μｌ（１８μＭ）の野生型血漿精製ＡＴ３および５μｌの１０ＸＭＴＳＰ活性緩衝液（０.５ＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８、０.３ＭのＮａＣｌ、０.１％トゥイーン３０）の存在下、５μｌのヘパリン（５ｎｇ／μｌ、ブタ腸粘膜のストックから）、５μｌのベイトＡＴ３ＳＬＧＲ−Ｋ１基質（０（すなわち、５μｌのＨ２Ｏ）〜０.０１８μＭ、０.１８μＭ、１.８μＭまたは１８μＭの濃度範囲）と混合した。反応物を３７℃で４.５時間インキュベーションした。
ＣｕＳＯ４活性化セファロースを用いて、ＭＴＳＰ−１ファージ−ＡＴ３阻害剤複合体を捕捉した。キレート化セファロース（Pharmacia）２００μｌを、ＣｕＳＯ４（１００ｍＭ）により前活性化した。ＣｕＳＯ４活性化セファロース（１００μｌ）を、室温で１時間ＰＢＳ緩衝液中０.５％のＢＳＡ２ｍｌにより遮断した。ビーズを６５００ｒｐｍで６０秒間の遠心分離による沈降により遮断溶液から採取し、次いで４５０μｌの結合緩衝液（０.５ＭのＮａＣｌ、１００ＭのトリスｐＨ８、１０ｍＭのイミダゾール、０.１％のトゥイーン２０）に再懸濁した。上記ふるい分け反応混合物５０μｌを、ＣｕＳＯ４活性化セファロースビーズに加えることにより、Ｈｉｓ標識ＡＴ３阻害剤−ＭＴＳＰ１ファージ複合体を捕捉した。インキュベーションを室温でさらに１時間続行した。次に、ふるい分け混合物を２０００ｒｐｍで１分間の遠心分離にかけ、結合ＡＴ３ファージ−ＭＴＳＰ−１阻害剤複合体を含むセファロースビーズを、結合緩衝液５００μｌで洗浄することにより未結合ファージを除去した。洗浄工程を５回反復し、結合複合体を含むビーズを各洗浄後に新しい管へ移すことにより、非特異性ファージの潜在的「キャリーオーバー」を回避した。
結合ＭＴ−ＳＰ１ファージ−ＡＴ３ＳＬＧＲ−Ｋ１複合体を、溶離緩衝液（０.５ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８.０）１００μｌに溶離した。溶離したファージの５０μｌアリコートを用いて、３７℃で２０分間活発に増殖しているＴＧ１大腸菌（E.coli）細胞（Ａ６００＝０.５；０.５ＯＤ＝〜１.５Ｘ１０８コロニー／ｍｌ）３ｍｌを感染させた。感染細菌を、カルベニシリン（７５μｇ／ｍｌ）を含む大型プレート（２４５ｍｍＸ２４５ｍｍ）で平板培養し、３０℃で一晩インキュベーションした。翌朝、プレートを採取した。各プレートにおけるコロニーを計数し、ＡＴ３ＳＬＧＲ−Ｋ１阻害剤を含まないバックグラウンドプレートと比較した。コロニー計数の結果を表１９に示す。
Figure 0004546578
プレートを２時間冷室に置いて寒天を固まらせた後、ＡＴ３ＳＬＧＲ−Ｋ１含有プレートからのコロニーを、カルベニシリン（〜１００μｇ／ｍｌ）を補った２５ｍｌの２ＹＴ中へかき出した。２ＹＴ細菌含有培地２０ｍｌを、カルベニシリン含有２ＹＴ５００ｍｌに加え、Ａ６００を測定したところ０.１３であった。細菌をＯＤ＝〜０.５まで増殖させ、次いで〜１Ｘ１０１０〜２.６Ｘ１０１３ｃｆｕ／ｍｌのヘルパーファージ（ＶＳ Ｍ１３）をライブラリー増幅用に加えた（〜１５０μｌ〜２００μｌで）。３７℃で振とうしながら１時間増殖後、培養物にカナマイシンを加えて最終濃度３μｇ／ｍＬとし、一晩３０℃で振とうしながら増殖させた。細胞を採取し、ＰＥＧ−ＮａＣｌ溶液を用いて上清に存在するファージ粒子を沈殿させた。ＭＴ−ＳＰ１ファージ選択の第２世代の分析については、ベイトＡＴ３ＳＬＧＲ−Ｋ１基質に対する反応が、選択のストリンジェンシーを高めるのに４.５時間ではなく２７分だけであること以外、条件は第１世代と類似していた。
上記の結合ＭＴ−ＳＰ１ファージ−ＡＴ３ＳＬＧＲ−Ｋ１複合体の溶離後、溶離したファージの５０μｌアリコートを用いて、３７℃で２０分間活発に増殖しているＴＧ１大腸菌（E.coli）細胞（Ａ６００＝０.５；０.５ＯＤ＝〜１.５Ｘ１０８コロニー／ｍｌ）３ｍｌを感染させた。感染細菌を、カルベニシリン（７５μｇ／ｍｌ）を含む大型プレート（２４５ｍｍＸ２４５ｍｍ）で平板培養し、３０℃で一晩インキュベーションした。翌朝、プレートを採取した。各プレートにおけるコロニーを計数し、ＡＴ３ＳＬＧＲ−Ｋ１阻害剤を含まないバックグラウンドプレートと比較した。コロニー計数の結果を表２０に示す。
Figure 0004546578
さらなる特性検定用にコロニーを採取した。カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を補った２ｘＹＴ２ｍｌ中で細胞を培養し、報告された要領（Sambrook, J et al (1989) Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold spring Harbor laboratory）でファージ調製を実施した。選択されたファージを、Ａｃ−ＳＬＧＲ−ＡＣＣ基質に対する酵素活性について試験した。さらに、選択されたファージを、野生型ＡＴ３または血漿により不活化に対する抵抗性について選択した。
実施例７
突然変異体ＡＴ３阻害剤の発現および精製
Ａ．変異体ＡＴ３の生成
鋳型としてヒト抗トロンビンIII（ＡＴ３）遺伝子（配列番号６１２；Origene Technologiesから購入、カタログ＃ＴＣ１１０８３１）のコーディング領域を用いてＡＴ３反応性中心ループ（ＲＣＬ）のアミノ酸配列に修飾を加えることにより、プロテアーゼトラップ「ベイト基質」として使用する突然変異体ＡＴ３タンパク質を作製した。ＡＴ３ ｃＤＮＡを、配列番号６２６に示した核酸配列：
Figure 0004546578
 （スタッファー配列（太字で示す）、ＢＡＭＨ１部位（イタリック体で示す）、およびＡＴ３遺伝子とハイブリダイゼーションする部分（平文字で示す）を含む）を有するフォワードプライマー、および配列番号６２８に示した核酸配列：ＧＴＡＧＣＣＡＡＣＣＣＴＴＧＴＧＴＴＡＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＴＡＡＧＡＡＴＴＣを有するリバースプライマーを用いるＰＣＲにより増幅した。増幅後、ｃＤＮＡを、制限部位ＢａｍおよびＥｃｏＲＩを用いてｐＡｃＧＰ６７ｂバキュロウイルストランスファーベクター（BD Biosciences 配列番号４９４）へサブクローニングした。このサブクローニング段階中にＣ−末端６ｘＨｉｓ標識（配列番号４９６）またはＣ−末端ＦＬＡＧ標識（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号４９５）を付加することにより、ＡＴ３突然変異体は後でアフィニティー精製により単離され得る。４アミノ酸ＧＧＧＳリンカー（配列番号６２０）を用いて６ｘＨｉｓ標識と融合したＡＴ３を含む、クローン化ＡＴ３融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号６１３および６１４に示す。
様々な特異性をもつ標的プロテアーゼを単離するための突然変異体ＡＴ３ベイト基質を製造するため、製造業者が明記した条件にしたがってQuikchange（登録商標）位置指定突然変異導入キット（Stratagene）を用いて突然変異誘発反応を実施することにより、野生型ＡＴ３反応性中心ループ（ＲＣＬ）配列ＩＡＧＲＳＬ（配列番号４７８）の代わりに標的開裂配列のアミノ酸残基を導入した（配列番号に示した前駆体ＡＴ３ポリペプチド配列のアミノ酸残基４２２〜４２７、および配列番号４９３に示した成熟ＡＴ３ポリペプチド配列のアミノ酸残基３９０〜３９５）。
野生型ＩＡＧＲＳＬアミノ酸配列のアミノ酸残基を、ターゲッティングされたＶＥＧＦＲ２開裂配列からのアミノ酸残基ＲＲＶＲＫＥ（配列番号４９８）で置換することにより、上記の一突然変異体、ＡＴ３（ＡＴ３／ＲＲＶＲ−ＫＥ）（配列番号４９７）を作製した。野生型ＩＡＧＲＳＬアミノ酸配列を、ターゲッティングされた補体Ｃ２タンパク質開裂配列からのアミノ酸残基ＳＬＧＲＫＩ（配列番号４７９）で置換することにより、別の突然変異体、ＡＴ３（ＡＴ３／ＳＬＧＲ−ＫＩ）（配列番号４９９）を作製した。
Quikchange（登録商標）ＰＣＲについては、野生型ＡＴ３ ＲＣＬプライマーは、配列番号６３０に示された次の核酸配列を有していた：ＧＣＴＧＣＡＡＧＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＴＧＡＴＴＧＣＴＧＧＣＣＧＴＴＣＧＣＴＡＡＡＣＣＣＣＡＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＴＴＴＣ。補体Ｃ２標的配列プライマーは、配列番号６３２に示された次の核酸配列を有していた：ＧＣＴＧＣＡＡＧＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＴＴＡＧＧＣＣＧＴＡＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＣＡＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＴＴＴＣ。ＶＥＧＦＲ２標的配列プライマーは、配列番号６３４に示された次の核酸配列を有していた：ＧＣＴＧＣＡＡＧＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＴＧＣＧＣＣＧＴＧＴＧＣＧＣＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＣＡＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＴＴＴＣ。
野生型ＡＴ３ ｃＤＮＡを含むベクターおよび突然変異体ＡＴ３ ｃＤＮＡを含むベクターを、それぞれ形質転換し、XL-1-Blue 超形質転換能生細胞（Stratagene）で増幅した。Qiagen Plasmid Maxiキット（Quiagen）を用いて、供給者が明記した条件にしたがってプラスミドＤＮＡを細胞から精製した。
Ｂ．ＡＴ３ 突然変異体の発現
Ｓｆ９昆虫細胞を用いて、上記のＡＴ３含有ｐＡｃＧＰ６７ｂトランスファーベクターを用いることにより、Ｈｉｓ標識およびＦＬＡＧ標識野生型および突然変異体ＡＴ３タンパク質の両方を発現および精製した。Ｓｆ９細胞を、ＳＦ９００II血清不含有培地（Invitrogen）での成長に適合させ、３５ｍｍの皿で培養飽和密度の８５〜９０％まで培養した。供給者が明記した条件およびプロトコルにしたがって、FlashBac（登録商標）バキュロウイルス発現系（Oxford Expression Technologies）を用いることにより、細胞をトランスフェクションした。ＡＴ３トランスファーベクター５００ｎｇおよびFlashBac（登録商標）組換えベクター５００ｎｇを、抗生物質を含まないＳＦ９００II血清不含有培地１ｍｌ中で２０分間 Cellfectin（登録商標）トランスフェクション試薬（Invitrogen）５μｌとプレインキュベーションし、次いで細胞に滴下適用した。トランスフェクションの５時間後、細胞を遠心分離にかけ、抗生物質（抗生物質／抗真菌溶液；Cellgro）を含むＳＦ９００II血清不含有培地２ｍＬに再懸濁し、２８℃で４日間インキュベーションした。プラーク検定法で測定されたように、ウイルスをＳｆ９細胞において１×１０６ｐｆｕ／ｍＬの最大力価まで拡大させた。次いで、High Five（登録商標）（BTI-TN5B1-4）昆虫セルライン（Invitrogen）およびExcell（登録商標）４０５血清不含有培地（JRH Biosciences）を用いることにより、組換えＡＴ３を発現させた。細胞を、０.１〜１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させ、オービタルシェーカープラットフォームにおいて１２５ＲＰＭで振とうしながら、４〜５日間１Ｌエルレンマイヤーフラスコにおいて３００ｍＬ培養量で培養した。
Ｃ．野生型および突然変異体ＡＴ３タンパク質のアフィニティー精製
Ｈｉｓ標識ＡＴ３タンパク質のアフィニティー精製については、実施例７Ｂからの培養物の上清を、遠心分離にかけ、０.４５μＭフィルターでの濾過により澄明にし、５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７.５、３００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液中へ透析した。BioLogic Duoflow（登録商標）クロマトグラフィー装置（Bio-Rad）および１０ｍＬのTALON（登録商標）コバルト金属アフィニティー樹脂（Clontech）を用いるカラムクロマトグラフィーによりタンパク質を精製した。樹脂結合Ｈｉｓ標識タンパク質を、５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７.５、３００ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６.５、３００ｍＭのＮａＣｌ、１５０ｍＭのイミダゾールの一次勾配で溶離した。タンパク質含有画分を合わせ、ＡＴ３貯蔵緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６.５、３００ｍＭのＮａＣｌ、５％グリセリン）中へ透析した。精製ＡＴ３調製物が活性タンパク質を含むことを立証するため、本明細書の下記実施例１４に記載のＭＴ−ＳＰ１阻害（活性部位滴定）検定法を実施することにより、透析されたＡＴ３がＭＴ−ＳＰ１の基質開裂能を阻害する能力を測定した。このＭＴ−ＳＰ１阻害検定法からの反応混合物を、SpectraMax（登録商標）Ｍ５（SpectraMax（登録商標）Ｍ５マイクロプレートリーダー、Molecular Devices）（Molecular Devices, Inc）での０.４ｍＭのＡｃ−ＲＱＡＲ−ＡＣＣ（アセチル−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＡＣＣ）基質（カスタム合成）の開裂について速度論的に評価した。この基質の名称における「ＡＣＣ」は、７−アミノ−４−カルバモイルメチルクマリン脱離基を指す。ＡＣＣ脱離基は、励起（Ｅｘ）＝３８０、放出（Ｅｍ）＝４５０およびカットオフ（ｃ／ｏ）＝４３５の波長で検出された。精製Ｈｉｓ標識ＡＴ３タンパク質の全収量は、約１〜３ｍｇ／Ｌであった。
ＦＬＡＧ標識ＡＴ３タンパク質のアフィニティー精製については、培養物からの上清を上記と同様遠心分離および濾過により澄明化した。澄明化した上清をトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）ｐＨ７.４中へ透析し、総容量３００ｍＬで新しい１Ｌエルレンマイヤーフラスコに加えた。予め平衡にした抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲル（Sigma）２ｍＬを加え、全容量を、４℃で３時間、１２５ＲＰＭでのオービタルシェーカープラットフォームでインキュベーションした。樹脂結合ＦＬＡＧ標識ＡＴ３タンパク質を、フリットの２０ｍＬクロマトグラフィーカラム（Bio-Rad）を用いて重力により集めた。樹脂を１度目はＴＢＳ５ｍＬ、ＴＢＳＴ（０.１％トゥイーン２０を含むＴＢＳ）で１回、そして２度目はＴＢＳ５ｍＬで洗浄した。次いで、０.２ｍｇ／ｍＬのＦＬＡＧペプチド（Sigma）を含むＴＢＳ１０ｍＬ加えることにより、ＡＴ３タンパク質を溶離した。溶離液を濃縮し、ＡＴ３貯蔵緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６.５、３００ｍＭのＮａＣｌ、５％グリセリン）中へ透析し、上記および下記実施例１４Ａ記載のマトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）阻害（活性部位滴定）検定法を用いて活性を上記要領で検定した。精製ＦＬＡＧ標識ＡＴ３タンパク質の全収量は、約０.５〜１ｍｇ／Ｌであった。
これらの精製ＦＬＡＧ−およびＨｉｓ−標識ＡＴ３タンパク質を、例えば、以下の実施例に記載した方法において、特定標的部位配列を認識するプロテアーゼを同定するためのプロテアーゼトラップとして用いた。
実施例８
プロテアーゼ変異型のファージディスプレーライブラリーの構築
Ａ．ｐＭａｌ−Ｃ２ファージミドディスプレーベクターへの野生型およびＣ１２２Ｓ ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメイン（Ｂ鎖）のクローニング
配列番号２５３に示した完全長ＭＴ−ＳＰ１タンパク質のアミノ酸６１５〜８５４を含む、成熟ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメイン（ＭＴ−ＳＰ１ Ｂ鎖）（配列番号５０５）をコード化するｃＤＮＡ（配列番号５０４）を、制限部位ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄIIIを用いて、分泌を促すＳＴIIリーダー配列（ＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＣＧＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＡＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧＴＴＴＴＴＴＣＴＡＴＴＧＣＴＡＣＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＣＡ（配列番号６３６）、および繊維状ファージＭ１３ GeneIII（配列番号６１６）のＣ−末端ドメインをコード化する核酸を含む、ｐＭａｌ−Ｃ２ベクター（配列番号６１５）（New England Biolabs）へクローン化した。ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメインｃＤＮＡを、リーダー配列とGeneIIIドメインの間に挿入した結果、最終構築物は、ＭＴ−ＳＰ１ Ｎ−末端GeneIII融合タンパク質をコード化する配列番号５１０に示した核酸の配列を含んでいた。この融合タンパク質のコード化されたアミノ酸配列（配列番号５０６）は下記のとおりであり、ＳＴIIリーダー配列（配列番号５１１）は平文字、成熟ＭＴ−ＳＰ１ドメインは太字、Ｃ−末端GeneIII（配列番号５１２）ドメインはイタリック体で示す。＊は、タンパク質をコード化する核酸配列における停止コドンの存在を示す。
配列番号５０６：
Figure 0004546578
野生型ＭＴ−ＳＰ１ Ｂ鎖融合タンパク質に加えて、ＭＴ−ＳＰ１ Ｂ鎖変異型（ＣＢ４６９）−GeneIII融合タンパク質を上記方法により作製した。上記配列でイタリック体で示され、配列番号５０５に示されている、野生型ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメイン配列の１２２位（キモトリプシンのナンバリングに基づく）のシステインをセリンと置換することにより、配列番号５０７に示したＣＢ４６９変異型アミノ酸配列を作製した。上記要領で、このＣＢ４６９配列をｐＭａｌ−Ｃ２ベクターにクローン化した。改善されたディスプレーにするため、この変異型ＭＴ−ＳＰ１融合タンパク質をコード化する核酸を含むファージミドベクターを用いることにより、下記実施例８Ｂ記載のＭＴ−ＳＰ１突然変異体ファージディスプレーライブラリーを作製した。
Ｂ．突然変異体ファージディスプレーライブラリーの作製を目的とするプロテアーゼドメインの突然変異誘発
突然変異したプロテアーゼドメインを含むファージディスプレーライブラリーの作製については、以下に具体例を示している当業界で公知（Matsumura et al., Methods Mol Biol. 2002;182:259-67; Cirino et al., Methods Mol Biol. 2003;231:3-9）の標準的エラー-プローンＰＣＲ突然変異誘発プロトコルを用いて行った。
１．Ｂ鎖ＭＴ−ＳＰ１融合タンパク質の突然変異誘発
突然変異体ＭＴ−ＳＰ１含有融合タンパク質の構築については、Diversify（登録商標）ＰＣＲランダム突然変異誘発キット（BD Biosciences, Clonetech）を用い、供給者が示した条件に従ったエラー-プローンＰＣＲにより、ＭＴ−ＳＰ１ ＣＢ４６９ ｃＤＮＡをｐＭａｌ−Ｃ２ベクターから増幅し、１キロ塩基あたり５つの突然変異を得た。配列番号５０８に示した核酸配列：
Figure 0004546578
 を有する、このＰＣＲで使用されるＭＴ−ＳＰ１フォワードプライマーは、ＳＴIIリーダー配列内で（イタリック体で示した残基と）ハイブリダイゼーションするように設計されており、Ｎｄｅ制限部位配列（太字で示した）を含んでいた。配列番号５０９に示した核酸配列：
Figure 0004546578
 を有するＭＴ−ＳＰ１リバースプライマーは、ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメインをコード化する配列の３'部分内で（イタリック体で示した残基と）ハイブリダイゼーションするように設計されており、ＳａｃＩ制限部位配列（太字で示す）を含んでいた。
２．突然変異誘発産物の精製
Ｔａｑポリメラーゼは、ＤＮＡと堅固に結合するため、Qiagen ＰＣＲ精製キットを用いても完全には除去されず、その存在はＰＣＲ産物の下流制限消化を妨げ得る（Crowe et al., Nucleic Acids Res. １９９１年１月１１日; 19(1): 184; Wybranietz et al., Biotechniques (1998) 24, 578-580）。すなわち、実施例８Ｂ（１）からの増幅された野生型および突然変異体ＰＣＲ産物からＴａｑポリメラーゼを除去するため、それらの精製前に、以下のものを反応に加えた：５ｍＭのＥＤＴＡ、０.５％ＳＤＳ、５０ｎｇ／μｌのプロテイナーゼＫ。Ｔａｑポリメラーゼを排除するため、混合物を６５℃で１５分間インキュベーションした。
確実に（下記選択方法を妨害する可能性がある）野生型鋳型が残存しないようにするため、ＰＣＲ産物を精製することにより鋳型ＤＮＡを除去した。ＰＣＲ産物からベクターを分離するため、試料を、ＰＣＲ産物またはラダーと共移動することのない１０ＸオレンジＧゲルローディングバファー（New England Biolabs）の存在下で１％アガロースゲルにローディングした。外科用メスを用いてＰＣＲ産物をゲルから削り取った。供給者が明記した条件に従ってQIAquick（登録商標）ゲル抽出キットプロトコル（Qiagen）またはZymoclean（登録商標）ゲル抽出キット（Zymoclean CA、カタログ＃Ｄ４００１）を用いて、削り取ったＰＣＲ産物を精製した。
Qiagenゲル抽出キットについては、削り取ったゲル断片をＱＧ緩衝液中で可溶化し、それぞれ約５〜１０μｇの結合受容量を有し、２ｍＬより多い量を保持することのない、Qiagen ＱＧカラムにゆっくりと通した。十分な数のカラムを用いることにより、完全容量の出発材料を適応させた。カラムをコレクターチューブ中１４０００ｒｐｍでの遠心分離にかけることにより、残留バファーＱＧを全て除去した。０.７ｍＬのバファーＰＥを各カラムに添加し、試料を２〜５分間インキュベーションした。次いで、カラムを２回、それぞれさらに１分間１３０００ｒｐｍでの遠心分離にかけることにより、残留ＰＥ緩衝液を全て除去した。試料を新しい１.５ｍＬ微細遠心分離管に移し、５０μＬのＨ２０を加え、２分間インキュベーションした。結合ＤＮＡを７０００ｒｐｍでの遠心分離により溶離した。典型的収率は、試料の出発量の３０％〜６０％であった。
Zymoclean（登録商標）ゲル抽出キットについては、出発材料の量によって、１本またはそれ以上のZymoclean（登録商標）ゲル抽出キットカラム（それぞれ５μｇの最大結合受容量を有する）、またはZymoclean（登録商標）DNA Clean & Concentrator（登録商標）キットからの１本またはそれ以上のカラム（それぞれ２５μｇの受容量を有する）を使用した。このキットを用いて、削り取ったＤＮＡ断片を１.５ｍｌ微細遠心分離管に移し、次いでゲルから削り取ったアガロースの各量に３容量のADB Buffer（登録商標）を加えた。ゲル薄片が完全溶解するまで、試料を３７〜５５℃で５〜１０分間インキュベーションした。溶解したアガロース溶液を、コレクションチューブにおけるZymo-Spin I（登録商標）カラムに移し、少なくとも１００００ｒｐｍで３０〜６０秒間遠心分離にかけた。カラムから流れ出た溶液を廃棄した。２００μＬの洗浄緩衝液をカラムに加え、３０秒間少なくとも１００００ｒｐｍでの遠心分離にかけた。流れ出た溶液を廃棄し、洗浄工程を繰り返した。みず５０μＬをカラムマトリックスに直接加えた。最小限の溶離量は、Zymoclean（登録商標）ゲル抽出カラムの場合１０μＬであり、DNA Clean & Concentrator（登録商標）カラムの場合３５ｍＬであった。カラムを１.５ｍｌ管中に入れ、３０〜６０秒間少なくとも１００００ｒｐｍでの遠心分離にかけることにより、ＤＮＡを溶離した。
これら２方法の一法を用いた溶離の後、試料をプールし、蛍光分光光度計を用いて、７０μＬのＵＶキュベット中２６０ｎｍで試料の吸光度を測定することにより、ＤＮＡ濃度を評価した。次の等式：１Ａ２６０＝５０ｎｇ／μｌ ｄｓＤＮＡにしたがってＤＮＡ濃度を計算した。
Ｃ．ｐＭａｌ−Ｃ２ファージミドベクターを用いたプロテアーゼ突然変異体ファージライブラリーの構築
突然変異体プロテアーゼドメインを発現するファージディスプレーライブラリーの構築については、消化されたＰＣＲ産物、例えば上記実施例８ＡおよびＢ記載のプロテアーゼＰＣＲ突然変異誘発および精製から得られたものを、上記ｐＭａｌ−Ｃ２ファージミドベクターにライゲーションした。この過程の場合、Ｎｄｅ１およびＳａｃ１を用いてベクターを消化し、生成物をゲル精製し、ライゲーション反応（下記）で精製制限消化ＰＣＲ産物と合わせた。Ｎｄｅ１／Ｓａｃ１消化ゲル精製ｐＳＴII−ｇ３ ｐＭａｌ−Ｃ２ファージミドの分子量（ＭＷ）は５８３５塩基対（ｂｐ）である。Ｎｄｅ１／Ｓａｃ１消化ＭＴ−ＳＰ１ ＰＣＲ産物のＭＷは８０６ｂｐである。典型的には、２ｍＬのライゲーション反応の場合、７.５８μｇの切断ベクターは約１ｎＭのベクターであり、３.１４μｇの切断ＭＴ−ＳＰ１生成物は約３ｎＭの挿入産物であった。
ＭＴ−ＳＰ１生成物のライゲーションについては、消化精製生成物４０μｌ（３ｎＭ、３.１４μｇ）を、消化精製ベクター４０μｌ（１ｎＭ、７.５８μｇ）、１５１０μｌのＨ２Ｏ、４００μｌの５ＸＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Gibco）および１０μｌ（１０単位）のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）と混合した。ライゲーション反応を、２ｍＬ容量で、１６℃で一晩または室温で４時間実施した。ライゲーション後、ライゲーション反応混合物を６５℃で１５分間インキュベーションすることによりＤＮＡリガーゼを加熱不活化し、４ｍＬのZymoResearch ＤＮＡ結合緩衝液を加えた。次いで、この試料を、２５μｇのZymoResearch カラムへ一度に８００μｌ加えた。カラムを６００μｌのZymoResearch 洗浄緩衝液で２回洗浄し、予め４２℃に温めておいた５０μＬの水で溶離した。蛍光分光光度計を用いて２６０ｎｍで希釈溶離試料（７０μｌのＨ２Ｏ中３μｌの溶離液）の吸光度を測定することにより、ＤＮＡ回収パーセントを評価した。例えば、上記の３ｍＬライゲーションについては、Ａ２６０が０.１２＝１４０ｎｇ／μｌに対応する場合、総収量は約７μｇ（ライゲーションからのＤＮＡの約７０％収率である）であると測定された。
ライゲーション産物を、電気穿孔により約５００ｎｇ／μｌと適応し得るＸＬ−１blue細胞への電気穿孔にかけた。２００μｌのXL-1 Blue細胞（Stratagene）に対し１４０ｎｇ／μｌライゲーション産物７.５μｌを加えた。細胞を０.２ｃｍギャップキュベットに加え、次の条件：電圧（Ｖ）＝２５００、電気容量＝２５（ｕＦ）、抵抗＝２００オームを用いてジーン・パルサー（Bio-Rad, CA）での電気穿孔にかけた。電気穿孔の直後、１ｍＬのＳＯＣ培地（Invitrogen）をキュベットに加えた。次いで、細胞を２５ｍＬのＳＯＣ培地に移し、３７℃で２０分間インキュベーションした。このインキュベーション後、５つの小アリコート（１００マイクロリットル）の系列１００倍細胞希釈液を調製し、小さな２ＹＴカルベニシリン寒天プレートで平板培養し、コロニーの数（電気穿孔により作製されたライブラリーからのクローンの数を表す）を数えるため３７℃で一晩インキュベーションした。一方法では、残存する大量の細胞を遠心分離にかけて細胞を沈降させ、次いで１２ｍＬのＳＯＣ緩衝液に再懸濁し、カルベニシリン（７５μｇ／ｍｌ）を補った大型寒天プレート（２４５ｍｍ×２４５ｍｍ）で培養し、３０℃で一晩増殖させた。別法として、ライブラリーからファージストックを調製するため、１×１０１０ＣＦＵ／ｍＬのＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージと共にカルベニシリン（７５μｇ／ｍｌ）を補った５００ｍＬの２ＹＴ培地に細胞を直接加え、３７℃で一晩増殖させた。
実施例９
突然変異体ＡＴ３プロテアーゼトラップを用いるプロテアーゼドメインファージライブラリーからの変異型プロテアーゼドメインの選択
Ａ．ＭＴ−ＳＰ１ファージ／突然変異体ＡＴ３複合体の選択およびＥＬＩＳＡに基づくリードアウト検定法
この実施例では、上記実施例７に記載の補体Ｃ２標的開裂配列ＳＬＧＲＫＩを含む突然変異体ＡＴ３阻害剤を、標的開裂配列に対する反応性が改善された突然変異体ＭＴ−ＳＰ１担持ファージを単離し、かつその存在についてのリードアウトを提供するように設計されたふるい分け実験において「ベイト基質」として用いた。以下の手順を用いて上記実施例８Ａ、８Ｂおよび８Ｃ記載の要領で製造した大型コンビナトリアルＭＴ−ＳＰ１ファージディスプレーライブラリーからファージを単離した。
１．突然変異体ＭＴ−ＳＰ１担持ファージとのＡＴ３変異型の相互作用およびそれによる開裂
まず、ファージライブラリーからのファージ結合ＭＴ−ＳＰ１突然変異体を、次の要領で標的開裂部位を有する突然変異体ＡＴ３を用いて選択した。各開裂反応については、３７℃で６０分間、９６ウェルのポリスチレンプレート（Nunc Maxysorp）のデュプリケイトウェルにおいて以下の反応成分を７０μｌ容量でインキュベーションすることにより実施した：３.１４Ｅ１２ＣＦＵ／ｍｌでのＭＴ−ＳＰ１ライブラリーファージ３５μｌ、７μＬの１０ＸＭＴ−ＳＰ１活性緩衝液（０.５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.４、１ＭのＮａＣｌ、１％トゥイーン２０）、７μＬの１０μＭ低分子量へパリン（BD Biosciences）、１４μＬのＨ２Ｏ、および７μＬのＨｉｓ標識突然変異体ＡＴ３−ＳＬＧＲＫＩ。次の異なるＡＴ３−ＳＬＧＲＫＩ濃度で、個々の開裂反応を実施した：１００ｎＭ、３３ｎＭ、１１ｎＭ、３.３ｎＭ、１.１ｎＭおよび０.３３Ｍ。１００ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリド（Pefabloc, Roche Diagnostics）２μＬを加えることにより、各反応を終結させた。次いで、０.５５％ＢＳＡ、０.２７５％トゥイーン２０溶液４０μＬを加え、上下にピペット操作しながら十分に混合した。
２．抗Ｈｉｓ抗体を用いたＭＴ−ＳＰ１ファージ−ＡＴ３複合体の捕捉
一方、別の９６ウェルポリスチレンプレート（Nunc Maxysorp）のウェルを、０.２Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９、Pierce）中の５ｎｇ／μｌ ストレプトアビジン（Pierce）１００μＬにより室温で振とうしながら１時間コーティングした。次いで、ウェルを２５０μＬのＰＢＳＴで３回洗浄し、室温２時間ＰＢＳ中の０.２％ＢＳＡ２００μＬにより遮断し、室温で１時間５ｎｇ／μｌのビオチニル化抗６ＨＩＳ抗体１００μｌとインキュベーションすることにより、Ｈｉｓ標識ＡＴ３突然変異体を捕捉し、ＰＢＳＴで十分に洗浄した。次いで、実施例９Ａ（１）におけるＡＴ３開裂反応からの各突然変異体ＭＴ−ＳＰ１ファージ試料を、コーティングした９６ウェルプレートにデュプリケイトで加え、室温で１時間インキュベーションした。次いで、プレートを２５０μＬのＰＢＳＴで１４回洗浄した。
３．ＭＴ−ＳＰ１ファージ−ＡＴ３複合体を選択するためのＥＬＩＳＡに基づくリードアウト
洗浄後、マイクロタイタープレートにおける２列の第１列を用いて、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫検定法）に基づく検定法を実施することにより、ファージ捕捉についてのリードアウトを得た。この列の各ウェルに、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３ファージ抗体（GE Healthcare）の１：５０００希釈物１００μＬを加え、１時間結合させた。次いで、この列におけるウェルを、Skanwasherプレート洗浄機（Molecular Devices）を用いて８回洗浄し、次いでＴＭＢ／ペルオキシド基質溶液（Pierce）１００μＬを加え、室温で５分間インキュベーションした。この反応を２ＭのＨ２ＳＯ４ １００μｌでクエンチングし、４５０ｎＭでの吸光度についてSpectraMax（登録商標）プレート読取装置（Molecular Devices）で検定した。このリードアウトを、ファージ−ＡＴ３複合体の存在に関するサロゲートとして使用した。この検定法では、吸光度の濃度依存的増加が観察された（実施例９Ａ（１）での開裂反応で使用したＡＴ３−ＳＬＧＲＫＩベイトの濃度増加に基づく）。さらに、本明細書に記載した連続ラウンドのふるい分けを用いてこの方法を実施するとき、各ラウンドの後に吸光度の増加が観察されたことから、このふるい分け方法はファージプールを標的開裂部位親和力について有効に濃厚化し得ることがわかった。これらのデータは、この方法を用いることにより、ファージライブラリーから、特定標的配列に親和力を有する突然変異体プロテアーゼドメイン融合タンパク質を選択することができることを示唆している。ＥＬＩＳＡ検定法は、下記実施例９Ａ（４）記載のアフィニティーに基づく捕捉および後続の溶離に用いたのと同じ９６ウェルプレートを用いることによる、この選択および濃厚化についてのリードアウトを得る方法を提供した。
４．選択されたＭＴ−ＳＰ１ファージの溶離
次いで、実施例９Ａ（２）からのマイクロタイタープレートのデュプリケイトの２列の第２列を用いることにより、後続の精製およびスクリーニングに使用するための特異結合ファージを溶離した。この列の各ウェルに、１００ｍＭのＨＣＬ１００μＬを加え、５分間インキュベーションすることにより、特異結合ファージを溶離した。得られたファージ溶出液を、感染前に酸で中和するため３３μＬの１ＭトリスｐＨ８を含む別々のウェルに加えた。次いで、中和したファージ混合物１３３μＬを、０.５のＯＤ６００で増殖しているＸＬ−１ Blue細胞１ｍｌに加え、次いで３７℃で２０分間インキュベーションし、カルベニシリンを補った２ｘＹＴ寒天プレート（２４５ｍｍ×２４５ｍｍ）で平板培養した。これらの細胞を、下記実施例に記載した後続のスクリーニング、配列決定および精製方法で使用した。
また、この選択およびＥＬＩＳＡに基づく検定方法を、例えば上記実施例２および３に記載したものなどのｕＰＡライブラリーからのｕＰＡ突然変異体を選択および評価するのに使用した。
Ｂ．選択されたプロテアーゼドメイン担持ファージの精製
この実施例では、ベイト阻害剤を用いて選択されたファージ上清の単離方法について記載する。上記実施例９Ａで回収されたものなどの選択されたファージの力価（ｃｆｕ／ｍＬ）を測定した。ファージストックをＰＢＳで希釈し、０.５のＯＤ６００または約２.１×１０８細胞／ｍＬで増殖している大腸菌（E.coli）ＸＬ−１ Blue 細胞の感染に使用した。所望の感染力範囲は、１プレート当たり１０００〜２０００コロニーであった。感染した細胞を、２４５ｍｍ×２４５ｍｍ平方のポリスチレンBioAssay（Corning）皿において１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補った２ＹＴ寒天上で平板培養し、１６〜２０時間またはコロニーサイズが直径ほぼ２ｍｍになるまで増殖させた。自動コロニーピッカーを用いることにより、個々のコロニーを採取し、それぞれ１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび１２μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを補った２ＹＴ培地１５０〜１７０μＬを含む、９６ウェルポリプロピレンプレートのウェルに分配した。鋳型ファージ（突然変異誘発用の鋳型として使用されたプロテアーゼドメインを有するファージ）または不活性プロテアーゼ変異型を含む融合タンパク質を含むファージで感染させた細胞を対照ウェルに接種した。接種したプレートを空気透過性膜で密閉し、HiGro（GeneMachines）インキュベーター中に入れ、３７℃で１４〜２０時間、４００ｒｐｍで振とうした。
インキュベーション後、対数期細胞を得るため、各ウェルからの１００μＬを用いて、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび１２μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを補った２ＹＴ培地１ｍＬを含む深型ウェル９６ウェルプレートのウェルに接種した。次いで、深型ウェルプレートを、空気透過性膜で密閉し、細胞密度が０.４〜０.６間のＯＤ６００に達するまで酸素曝気して３７℃、４００ｒｐｍで振とうしながら、HiGro（登録商標）インキュベーター中に置いた。典型的インキュベーション期間は、４〜５時間の間であった。インキュベーション後、ヘルパーファージストック１００μＬを各ウェルに加え、プレートを密閉し、３７℃で５〜１０分間、４００ｒｐｍで再び振とうした。５〜１０分間振とうした後、プレートを３７℃で３０〜４５分間、振とうせずに静止状態でインキュベーションした。次いで、振とうを３７℃で１５〜３０分間、４００ｒｐｍで再開した。振とう後、１００μＬのカナマイシン溶液（４００μｇ／ｍＬ）を各ウェルに加えることにより、各ウェルにおいて３３.３μｇ／ｍＬの最終濃度とした。プレートを再密閉し、３７℃で１２〜１６時間、４００ｒｐｍで振とうした。次いで、細胞を沈降させるため、プレートを、４℃で２０分間、３５００〜４５００ｒｐｍでの遠心分離にかけた。遠心分離後、単離されたファージを含む上清を、そのまま下記実施例記載のスクリーニングに使用するか、またはまず４℃で貯蔵した。
Ｃ．プロテアーゼドメインファージ上清のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿
この実施例では、ポリエチレングリコール沈殿を用いることによる、選択された精製ファージ上清に混入する可能性のあるバックグラウンドプロテアーゼ活性（下記の特性確認検定法の中にはこれに感受性を示すものもある）の除去方法を記載する。この方法では、一晩（１２〜１６時間）ＭＴ−ＳＰ１担持ファージ上清（例えば実施例９Ａで選択および溶離されたもの）をヘルパーファージでレスキュー後、試料を４℃で２０分間、３５００〜４５００ｒｐｍでの遠心分離にかけ、１０００μＬの上清を各ウェルから除去し、別の９６ウェル深型ウェルプレートのウェルに移した。
沈殿させるため、２.５ＭのＮａＣｌ中２０％ＰＥＧ（体積にして）を含む溶液２５０μＬを各ウェルに加えた。プレートを密閉し、激しく反転させながら混合し、次いで氷水浴中に置き、１〜２時間放置した。次いで、プレートを、４５００ｒｐｍで６０分間または３５００ｒｐｍで９０分間の遠心分離にかけた。各ウェルからの上清溶液を傾瀉し、プレートを軽くたたいて乾かし、２０〜３０分間水切りした。生じた沈殿物を、もとのファージ上清体積（２００μＬ）の２０％に等しい最終体積でＰＢＳを用いて再懸濁することにより、５倍濃縮液を得た。この物質については、そのまま下記検定法で使用するか、または試験準備するまで４℃で貯蔵した。
実施例１０
標的基質配列に対する高い反応性および触媒有効性を有するプロテアーゼドメイン担持ファージのスクリーニング
例えば実施例９Ｂおよび９Ｃ記載のものなどの個々のファージ調製物を様々な検定法で用いることにより、それらの特異性および／または活性を測定した。
Ａ．ベイトタンパク質による蛍光性ペプチド加水分解の阻害をモニターすることによるプロテアーゼドメイン変異型を発現するファージの分析
突然変異体プロテアーゼ担持ファージクローンを評価する一方法として、選択された変異体プロテアーゼドメインの活性を阻害する阻害剤（ベイトセルピン）の能力を、ファージミドライブラリー構築で最初に使用した鋳型プロテアーゼドメイン（すなわち、「親」プロテアーゼ）の活性を阻害するその能力と比較する生化学的阻害検定法が実施され得る。この方法によると、例えば上記実施例９で回収されたものなどの突然変異体プロテアーゼ担持ファージが、標的基質配列を含む蛍光性基質を開裂する能力を、所定濃度のベイト阻害剤の存在下または非存在下で評価し、同ベイト阻害剤の存在下で同配列を開裂する鋳型プロテアーゼドメインの能力と比較した。蛍光性ペプチド基質の使用は、プロテアーゼ特異性測定に関する常用方法である（Zimmerman et al. (1977) Anal Biochem, 78:47-51; Harris et al. (2000) PNAS, 97:7754-7759）。
ＭＴ−ＳＰ１ Ｂ鎖鋳型（実施例８Ｂ（１）での突然変異誘発に使用）の阻害と比較したＭＴ−ＳＰ１ Ｂ鎖突然変異体の阻害の分析については、変異型ＡＴ３（所望の標的配列を伴う）が阻害剤として使用され得、Ａｃ−ＲＱＡＲ−ＡＣＣが基質として使用され得る。この基質では、アニリド結合の特異的開裂により、蛍光性ＡＣＣ脱離基が遊離することから、個々の基質に関する開裂速度の有効な測定手段が提供される。
上記検定法の一例では、例えば上記実施例３で回収されたものなどのｕＰＡプロテアーゼ担持ファージが蛍光性基質Ａｃ−ＡＧＲ−ＡＭＣ（配列番号６１７）を開裂する能力を、所定濃度のＰＡＩベイトの存在下および非存在下で評価した。上記のとおり、かかる７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）蛍光性ペプチド基質の使用は、プロテアーゼ特異性測定に関する常用方法である。この例では、３５μＬのファージ上清（例えば、実施例３（Ａ）記載の要領で得られたもの）を、３８４ウェルのポリプロピレンプレート（CoStar、＃３６５８）における指定検定ウェルおよび指定対照ウェルの両方に移した。選択に使用したものと同じＰＡＩベイトを含む２ｘ間接検定緩衝液３５μＬを検定ウェルに加えた。ベイトの濃度は選択に使用した濃度と同じであった。２ｘ間接検定緩衝液（阻害剤含まず）３５μＬｗ、対応する対照ウェルに加えた。プレートを３７℃で６０分間インキュベーションした。ファージを阻害剤または対照緩衝液と混合した後、間接検定緩衝液中で６０μＭの最終検定濃度に希釈した、ＡＧＲ−ＡＭＣ蛍光性ペプチド基質１０μＬをウェルに加えた。１時間動的読取モードを用いて、３８０ｎｍでの励起、４６０ｎｍでの放出によりMolecular Devices SpectraMax（登録商標）プレート読取装置を用いて、蛍光を測定した。鋳型プロテアーゼに関して高い標的基質阻害を示すクローンをさらに分析した。
Ｂ．蛍光性ペプチド基質を用いた変異体プロテアーゼ活性の分析
ＭＴ−ＳＰ１突然変異体の活性および特異性を直接評価するため、蛍光性ペプチド基質Ａｃ−ＲＱＡＲ−ＡＣＣ（野生型ＭＴ−ＳＰ１により認識される天然自触開裂配列を有する）およびＣ２標的部位開裂配列を有するＡｃ−ＳＬＧＲ−ＡＣＣ（アセチル−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＣＣ）を用いて検定法を実施した。上記で示したとおり、これらの基質の名称におけるＡＣＣは、蛍光性脱離基である７−アミノ−４−カルバモイルメチルクマリンを表す。また、上記で示したとおり、蛍光性ペプチド基質の使用は、プロテアーゼ特異性測定に関する常用方法である（Zimmerman et al. (1977) Anal Biochem, 78:47-51; Harris et al. (2000) PNAS, 97:7754-7759）。この例では、アニリド結合の特異的開裂により、蛍光性ＡＣＣ脱離基が遊離することから、個々の基質に関する開裂速度の有効な測定手段が提供される。この方法では、３５μＬの２ｘ間接検定緩衝液を全試験ウェルに加えた。３５μＬのファージ上清（実施例９Ｂ記載の要領で単離）または再懸濁ＰＥＧ沈殿ファージ（実施例９Ｃ記載の要領で単離）を、各指定ウェルに加えた。ファージを加えた後、プレートを１分間２０００ｒｐｍで遠心分離することにより、気泡を除去した。ペプチド基質（Ａｃ−ＳＬＧＲ−ＡＣＣ（最終検定濃度＝１２５μＭ））およびＡｃ−ＲＱＡＲ−ＡＣＣ（最終検定濃度＝６０μＭ）のそれぞれ１０μＬを、１Ｘ間接検定緩衝液で希釈し、次いで適切なウェルに個々に加えた。基質開裂の指標である相対蛍光単位／秒（ＲＦＵ／秒）として測定した加水分解速度（ＲＯＨ）を、動的読取モードを用いて、SpectraMax（登録商標）Ｍ５マイクロプレート読取装置（Molecular Devices）を用いることにより経時的にモニターした。
実施例１１
ＭＴ−ＳＰ１突然変異体の調製、選択、評価および同定
Ａ．ファージミドライブラリーからのＢ鎖ＭＴ−ＳＰ１突然変異体の蛍光検定法
この実施例では、実施例８記載の要領で製造されたライブラリーを用いて製造されたＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメイン担持ファージの活性および特異性を分析するのに実施された蛍光検定法について記載する。鋳型としてキモトリプシンのナンバリングに基づき１２２位にあるシステインの代わりにセリンを有するＭＴ−ＳＰ１の天然Ｂ鎖（配列番号５０７）を用いることにより、ＭＴ−ＳＰ１ライブラリーを上記実施例８記載の要領で製造した。供給者が勧めるｐＭａｌ−Ｃ２ベクターおよびエラー-プローンＰＣＲ条件を用いて、ライブラリーを上記要領で調製することにより、約０.５％突然変異誘発率を達成した。この突然変異誘発反応からの収量は、４×１０９組換え体であった。
（実施例７の記載と同様、天然ＲＣＬの代わりに）標的基質配列を含む変異型ＡＴ３との相互作用およびその開裂の速度に基づいたファージの選択を、ポリプロピレン９６ウェルフォーマットを用いて、実施例９Ａ記載の要領で実施した。この選択については、１ｘ１０１２組換えファージを、３０分間ＳＬＧＲＫＩ ＲＣＬ配列を有する３.３ｎＭの変異型ＡＴ３と混合した。洗浄後、ファージを上記実施例９Ａ記載の要領で溶離し、実施例９Ｂ記載の要領でＸＬ−１ Blue細胞を感染させるのに使用した。
本明細書記載の本発明方法を用いて、連続ラウンドの選択を実施することにより、標的基質配列との迅速な相互作用およびその開裂について増強した。例えば、第１ラウンドで選択されたクローンを、実施例９Ａ（３）の記載と同様１時間３.３、１.１および０.３３ｎＭのＡＴ３を用いて、本明細書記載の要領で選択の第２ラウンドにかけた。
第１ラウンドの選択後、選択されたクローンからのＰＥＧ沈殿を用いて実施例９Ｃと同様にファージ上清を調製した。蛍光性基質としてＡｃ−ＳＬＧＲ−ＡＣＣ（Ｃ２標的開裂部位配列を含む）およびＡｃ−ＲＱＡＲ−ＡＣＣ（天然ＭＴ−ＳＰ１に関する天然開裂配列を含む）を用いることにより、上記実施例１０（Ｂ）の方法を用いて、ファージクローンをスクリーニングした。各クローンについて、Ａｃ−ＳＬＧＲ−ＡＣＣ検定法から測定された蛍光速度（ＲＯＦ）を、天然基質配列に対する各突然変異ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメインの活性を、標的基質配列に対するその活性と比較する手段としてＡｃ−ＲＱＡＲ−ＡＣＣ検定法から測定されたＲＯＦと比較した。また、突然変異体ＭＴ−ＳＰ１検定法におけるＲＯＦを、鋳型（Ｃ１２２Ｓ）ＭＴ−ＳＰ１検定法におけるＲＯＦと比較した。個々のクローンにより得られた結果を下表２１に示しており、その表ではクローン番号を列挙し、ＲＦＵ／秒（１秒あたりの相対蛍光単位）として蛍光速度を列挙している。
表２１：ＡＴ３−ＳＬＧＲＫＩの開裂速度について選択された突然変異体ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメイン担持ファージのスクリーニング
Figure 0004546578
Ｂ．ＤＮＡ配列決定による選択されたＭＴ−ＳＰ１突然変異体ファージの同定
この実施例では、先行実施例記載の要領で製造され、例えば上記実施例１０Ｂ記載の検定法などの蛍光性検定法からの結果に基づいて選択された陽性ファージクローンの同定に使用した方法について記載している。この方法については、個々のクローンを、感染させるためＸＬ−１ Blue 大腸菌（E.coli）細胞と混合し、培養物を３７℃で振とうしながら一晩培養した。プラスミド調製キット（Qiagen）を用いて、プラスミドＤＮＡを一晩培養物から精製し、ＤＮＡを突然変異体同定のための配列決定に送った。
この方法の一例では、上記実施例１１Ａからの選択されたＢ鎖 ＭＴ−ＳＰ１突然変異体のアミノ酸配列を、上記で概説した段階を用いて同定した。これらのクローンの同定に使用した配列決定プライマーは、配列番号６１８：５'ＧＧＴＧＴＴＴＴＣＡＣＧＡＧＣＡＣＴＴＣ３'に示されている。配列決定データの解析により得られた結果を下表２２に示す。この表は、複数の分離体で突然変異していることが見出された残基をもつ突然変異体のみを列挙している。表２２は、配列決定データの解析により測定された、野生型ＭＴ−ＳＰ１ Ｂ鎖配列（配列番号５０５）と比較した各クローンに関するアミノ酸突然変異／位置を列挙している。アミノ酸ナンバリングは、キモトリプシンのナンバリングに準拠している。また配列番号は、示されたアミノ酸突然変異を含むＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメイン（Ｂ鎖）をコード化するアミノ酸残基の配列および同じ突然変異を有する完全長ＭＴ−ＳＰ１タンパク質をコード化するアミノ酸残基の配列の両方について列挙されている。
表２２：選択されたＭＴ−ＳＰ１ 突然変異体
Figure 0004546578
実施例１２
選択されたファージ結合ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼの大量生産および特性確認
Ａ．ＭＴ−ＳＰ１ファージの大規模製造
この実施例では、選択されたプロテアーゼドメインの分析およびそれに続く下流方法、例えばＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼ全体でのインビトロ翻訳における使用を目的とする、選択されたＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメイン担持ファージの大量生産について記載する。この実施例については、上記実施例１１と同様に選択された単ファージ担持コロニーを、一晩小型滅菌 Corning Orange Capped エルレンマイヤーフラスコにおいて、最終濃度５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび最終濃度１２μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを補った２ＹＴ培地中で一晩培養した。グリセリン貯蔵液を調製するため、６０％グリセリン８５μＬを、各培養物５００μｌに加え、次いで−８０℃で貯蔵した。各培養物の残存量を、カルベニシリンおよびテトラサイクリンを補った２ＹＴ培地５００ｍｌを含む２Ｌの広口バッフル付きフラスコに加えた。別法として、この段階を５０ｍＬ容量で５００ｍＬフラスコ中において実施した。０.５のＯＤ６００に達するまで培養物を増殖させた。
Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを培養物に加えることにより、１Ｅ１０ＣＦＵ／ｍｌを得、培養物を３７℃で１時間インキュベーションした。カナマイシンを加えて最終濃度３０μｇ／ｍＬとした。培養物をヘルパーファージと３７℃で一晩インキュベーションすることによりレスキューした。一晩培養後、試料を１５分間６０００ｒｐｍでの遠心分離にかけた。５体積の培養物に対し１体積のＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ＰＥＧ ８Ｋ／１.５Ｍ ＮａＣｌ）溶液を加えた。次いで、試料を４℃で２０分間撹拌した。試料を２０分間１００００ｒｐｍでの遠心分離にかけ、上清を除去した。１００００ｒｐｍでの２度目の遠心分離工程後、ペレットを５ｍＬ（最初の体積が５００ｍＬの場合）または１ｍＬ（最初の体積が５０ｍＬの場合）のＰＢＳに再懸濁した。再懸濁されずに沈殿している細胞を、２分間１４０００ｒｐｍでの短い遠心分離により除去した。再懸濁された細胞を含む上清に、グリセリンを１０体積％の割合で加えた。細胞を−８０℃で冷凍した。
Ｂ．ＡＣＣおよびＱＦ基質を用いる調製されたファージの検定法
この実施例では、実施例１２Ａで調製されたファージの活性および特異性を評価するのに使用される蛍光検定法について記載する。実施例１２Ａ記載の要領で５０ｍＬ容量の培養物を用いて調製した、ＰＥＧ−沈殿突然変異体ＭＴ−ＳＰ１担持ファージクローンを、１Ｅ１３粒子／ｍｌに正規化した。次いで、ＡＣＣ蛍光原性およびＱＦ（Quenched Fluorescence）基質を用いることにより、次の要領でファージを酵素検定した。５μＬのファージ（１Ｅ１３粒子／ｍｌで）を、５μＬの１０Ｘ ＭＴ−ＳＰ１検定緩衝液、３５μＬのＨ２Ｏおよび５μＬの基質と一緒に５０μＬの総容量で黒色 Costar ポリプロピレンハーフウェルマイクロタイタープレート（Corning）の各ウェルに加えた。個々のウェルで使用した基質は、Ａｃ−ＳＬＧＲ−ＡＣＣ（１２０μＭ最終濃度）、Ａｃ−ＲＱＡＲ−ＡＣＣ（６０μＭ最終濃度）、または次の消光蛍光基質：ＳＬＧＲ−ＫＩおよびＲＱＡＲ−ＳＡ（両方をも０.６２５μＭ最終濃度で使用）であった。Ａｃ−ＳＬＧＲ−ＡＣＣ基質は、標的（補体Ｃ２）開裂配列の突然変異体ＭＴ−ＳＰ１クローンによる開裂の評価に使用され、Ａｃ−ＲＱＡＲ−ＡＣＣ基質は、ＭＴ−ＳＰ１に関する天然標的開裂配列の開裂の評価に使用された。同様に、ＳＬＧＲ−ＫＩ基質は、標的（補体Ｃ２）開裂配列の開裂の評価に使用され、ＲＱＡＲ−ＳＡ基質は、ＭＴ−ＳＰ１に関する天然標的開裂配列の開裂の評価に使用された。これら２つの開裂速度比は、ターゲッティングされた新たな開裂配列についての選択されたプロテアーゼの特異性の一つの定量的尺度であった。選択された変異型および対応する本来のスカホード（すなわち、親）プロテアーゼに関するこれらの比率を比較すると、選択されたプロテアーゼが、ターゲッティングされた新たな開裂配列に対し高い選択性を呈するか否かが示された。ＡＣＣリードアウトについては、SpectraMax（登録商標）プレート読取装置を３８０ｎＭでの励起に設定し、４３５ｎＭカットオフで、４６０ｎＭでの放出を検出するようにした。ＱＦリードアウトについては、SpectraMax（登録商標）プレート読取装置を４９０ｎＭでの励起に設定し、５１５ｎＭのカットオフで、５２０ｎＭでの放出を検出するようにした。この検定法の結果を下表２３に示す。上記と同様、配列番号は、上記実施例１１Ｂ記載の要領で、配列決定により測定された、示されたアミノ酸突然変異を含むＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメイン（Ｂ鎖）をコード化するアミノ酸残基の配列および同じ突然変異を有する完全長ＭＴ−ＳＰ１タンパク質をコード化するアミノ酸残基の配列の両方について列挙されている。ＲＦＵ（相対蛍光単位）番号は、各基質について３７℃での６０分反応で観察された加水分解速度に対応している。
表２３：選択されたＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメイン担持ファージクローンの動的検定法
Figure 0004546578
 ＊ＲＦＵ／秒＝相対蛍光単位／秒（加水分解速度）
実施例１３
インビトロ翻訳を用いた選択されたＭＴ−ＳＰ１突然変異体タンパク質の発現
この実施例では、遺伝子III融合タンパク質の一部ではない、上記実施例で選択およびスクリーニングされたＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメインの発現について記載する。
Ａ．修飾ＩＶＥＸベクターへのＭＴ−ＳＰ１配列のサブクローニング
遺伝子III融合タンパク質としては合成されていない、上記実施例記載のとおりファージで選択されたＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメインを発現させるため、Ｎ−末端活性化配列およびＣ−末端６ｘＨｉｓ標識を含むＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメインについてのコーディング領域を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いてｐＩＶＥＸ.２.３ｄ ＲＴＳインビトロ翻訳ベクター（Roches、配列番号５５９）にクローン化した。ＲＱＡＲ開裂部位に先行するｐＩＶＥＸ.２.３ｄＭＴ−ＳＰ１の完全Ｎ−末端アミノ酸配列は、配列番号５５８：ＭＥＫＴＲＨＨＨＨＨＨＳＧＳＤＣＧＬＲＳＦＴＲＱＡＲで示される。上記要領でファージミドライブラリーを用いて選択され、実施例１０Ｂおよび１１Ａ記載の要領で蛍光スクリーニング方法を用いて検定され、実施例１１Ｂ記載の要領で配列決定された、ＭＴ−ＳＰ１ Ｂ鎖タンパク質をコード化する残基を、内部ＳｐｈＩおよびＢｓｒＧＩ制限部位を用いてｐＩＶＥＸ.２.３ｄＭＴ−ＳＰ１ベクターにサブクローニングした。これらの内部部位の外側であるＭＴ−ＳＰ１配列に突然変異を有するファージミドのセレクタント(selectant)を、ＰＣＲ突然変異誘発によりこの方法で使用するために作製した。
Ｂ．インビトロ翻訳によるＭＴ−ＳＰ１の発現
インビトロ翻訳キット、ＲＴＳ １００大腸菌（E.coli）ジスルフィドキット（Roche Applied Science）を用いたＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメインの発現を、次の最適化による供給者が明記した条件にしたがって実施した。５０μｌの反応液の成分については、５μｌの１ＭヘペスｐＨ８緩衝液、２.５μｌの１２ｎＭのトゥイーン−２０、２.５μｌのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）および６μｌのシャペロンＲＴＳ GroE サプリメント（Roche Applied Science）を加えて１２μｌのアミノ酸混合物、１０μｌの反応混合物、１２μｌのライゼートを含むように修正した。また、１ｍＬのフィード混合物についても、１６８μｌのアミノ酸混合物、２４μｌのメチオニン、６０８μｌのフィード混合物、１００μｌの１ＭヘペスｐＨ８、５０μｌの１２ｎＭのトゥイーン−２０および５０μｌの水を含むように修正を加えた。インビトロ翻訳（ＩＶＴ）反応物を、３０℃で１８時間、プレートシェーカーでインキュベーションした。
Ｃ．Ｈｉｓ標識ＭＴ−ＳＰ１の精製
インビトロ翻訳（ＩＶＴ）反応後、不溶性タンパク質を遠心分離により澄明化し、新しい管に移した。澄明上清（約４５μｌの容量）を、５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７.５、３００ｍＭのＮａＣｌ中で１ｍＬの最終容量にした。溶液を、２ｍＬフリット付きクロマトグラフィーカラム（Clontech）において予め平衡させておいたTALON（登録商標）樹脂３００μｌに適用し、重力により流出させた。５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７、３００ｍＭのＮａＣｌおよび７.５ｍＭのイミダゾールを含む溶液３ｍＬによりカラムを洗浄し、５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６.５、３００ｍＭのＮａＣｌおよび７５ｍＭのイミダゾールを含む溶液６００μｌで溶離した。溶出液を、０.１％トゥイーン−２０含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳＴ）中に透析し、２０μＬに濃縮した。典型的には、精製プロテアーゼの収率は約７０％であった。
実施例１４
突然変異ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメインの特性検定
この実施例では、上記実施例１３の要領で調製した突然変異（体）ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメインの特性検定について記載する。
Ａ．ＩＶＴ反応の活性部位滴定
プロテアーゼ活性を評価するため、報告された要領（Takeuchi et al, (1999) PNAS 96,11054-11061）で、インビトロ翻訳突然変異体ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメインの活性部位滴定を、ＭＴ−ＳＰ１阻害剤Ｍ８４Ｒエコチンにより澄明上清において実施した。この検定法については、ＩＶＴタンパク質を、１Ｘ ＭＴ−ＳＰ１活性緩衝液中で１：１００００の最終濃度に希釈し、３０℃で１時間１：２.５系列希釈での１５ｎＭエコチンとインキュベーションした。反応を、SpectraMax（登録商標）Ｍ５マイクロプレート読取装置（Molecular Devices, Inc）における０.４ｍＭのＡｃ−ＲＱＡＲ−ＡＣＣ基質の開裂について動的に検定した。ＡＣＣ脱離基が、励起（Ｅｘ）＝３８０、放出（Ｅｍ）＝４５０およびカットオフ（ｃ／ｏ）＝４３５の波長で検出された。２０％〜８０％非阻害活性間の活性分率を示す検定点を、活性対エコチン濃度のグラフでプロットし、点をつないで線をプロットした。その線のｘ切片を用いて、ＩＶＴプロテアーゼの活性濃度を確立した。曲線の線部分はＩＶＴプロテアーゼの活性濃度を示すものとして反応をグラフ化した。すなわち、活性部位滴定法を用いて活性部位濃度（下表２４に幾つかの突然変異体について示す；「活性部位濃度」）を測定した。
Ｂ．ＡＣＣおよびＱＦ基質によるＩＶＴ ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメイン突然変異体の検定法
幾つかのＩＶＴ産生ＭＴ−ＳＰ１ファージセレクタントを、消光蛍光（ＱＦ）動的酵素検定法により天然ＲＱＡＲ ＭＴ−ＳＰ１開裂部位よりも突然変異体ＲＣＬ開裂部位についての方が高い特異性について評価した。上記実施例１３Ｃ記載の要領で澄明化されたＩＶＴ上清を、１Ｘ ＭＴ−ＳＰ１活性緩衝液中で１：１００００に希釈し、天然ＲＱＡＲ−ＳＬ ＱＦ基質または突然変異体ＲＣＬ Ｃ２開裂基質ＳＬＧＲ−ＫＩのいずれか６.２５μＭとインキュベーションした。Ｅｘ＝４９０、Ｅｍ＝５２０およびｃ／ｏ＝５１５の波長で SpectraMax（登録商標）Ｍ５マイクロプレート読取装置（Molecular Devices）を用いて開裂を評価した。天然配列の場合に対するＲＣＬ標的配列についてのＩＶＴ産生プロテアーゼの相対特異性を、ＳＬＧＲ−ＫＩおよびＲＱＡＲ−ＳＬについてのＲＦＵ／秒（１秒あたりの相対蛍光単位）の比率を用いて計算した。結果を下表２４に示す。配列番号と表示された列では、示されたアミノ酸突然変異を含むプロテアーゼドメインのアミノ酸配列を示す配列番号を最初に列挙し、示されたアミノ酸突然変異を含む完全長ＭＴ−ＳＰ１をコード化するアミノ酸残基の配列を示す配列番号を（）内に示している。ＲＦＵ数は、各基質に関して測定された相対蛍光単位（加水分解速度）を示す。
表２４：突然変異体ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメインの動的検定法
Figure 0004546578
実施例１５
精製タンパク質としての選択されたＭＴ−ＳＰ１突然変異体タンパク質の発現
Ａ．ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメインのｐＱＥベクターへの導入
先行実施例で検定されたＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメイン担持ファージクローンのサブセットを、野生型ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメインの発現用に予め修飾しておいたｐＱＥ３０発現ベクターへのＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメイン配列の導入用に選択した。InFusion DryDown ＰＣＲクローニングキット（Clonetech）を用いることにより、供給者が明記し、Benoit et al. (2006), Protein Expression & Purification ４５：６６−７１に記載された条件下で選択されたクローンをｐＱＥ３０−ＭＴ−ＳＰ１（配列番号６２４）へ導入した。この過程については、ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメインをコード化するファージクローンＤＮＡの一部分を、それぞれ非アニーリング５'テイルをもつ、ｐＱＥ−Insert-Ｆ２フォワードプライマー：
Figure 0004546578
 およびｐＱＥ−Insert−Ｒ３リバースプライマー：
Figure 0004546578
 によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ＭＴ−ＳＰ１のプロテアーゼドメインを伴わないプラスミドｐＱＥ３０−ＭＴ−ＳＰ１を、フォワードプライマー：ｐＱＥ−Linear−Ｆ２：
Figure 0004546578
 およびリバースプライマー：ｐＱＥ−Linear−Ｒ１：
Figure 0004546578
 によるＰＣＲを用いて線状化し、次いでドナーおよびアクセプターの両ＰＣＲ産物をＤｐｎＩ酵素で処理した。上記で示したそれぞれの線状化プライマー配列については、１８ヌクレオチド長相同性領域、非アニーリング５'プライマーテイルを太字で示している。次いで、アクセプターおよびドナーの両ＤＮＡを混合し、供給者が明記した条件を用いて１０μＬ容量で InFusion 反応を行った。２μＬの反応混合物を、５０μＬの大腸菌（E.coli）ＴＯＰ１０Ｆ'形質転換能生細胞（Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア）へ形質転換した。１００ｐｐｍのカルベニシリンを補ったＬＢ寒天プレートでコロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを選択されたクローンから単離し、フォワードプライマー：ＭＴ−ＳＰ１−５Ｆ：ＧＧＡＧＡＡＡＣＣＧＧＣＡＧＡＧＴＡＣ（配列番号５６４）およびリバースプライマー：ＭＴ−ＳＰ１−５Ｒ：ＧＧＴＴＣＴＣＧＣＡＧＧＴＧＧＴＣＴＧ（配列番号５６５）を用いて配列決定することにより、正確な導入であることを証明した。これらのプライマーは完全にアニーリングしている。
Ｂ．突然変異ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメインの発現、再生および精製
上記実施例１５Ｂ記載のｐＱＥ３０ベクター（Qiagen）におけるＭＴ−ＳＰ１変異型のプロテアーゼドメインをコード化するプラスミドを、ＢＬ２1-Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）大腸菌（E.coli）細胞（Stratagene）へ形質転換した。１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補った１ｍＬのＬＢを含む小出発培養物をコロニーから接種し、３７℃で８〜１０時間インキュベーションした。この培養物１００μＬを用いて、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補った２ｘＹＴ培地５０ｍＬに接種し、一晩培養した。５０ｍＬ円錐管（Corning）において、細胞を遠心分離により採取し、次いで溶解した。供給者が明記した条件を用いてBugBuster（登録商標）試薬（Novagen）により封入体（ＩＢ）を単離した。１００ｍＭのトリスｐＨ８、６ＭのＧｄｍＨＣＬおよび２０ｍＭのＤＴＴを含む変性溶液１ｍＬにより、ＩＢペレットを可溶化した。不溶性物質があれば、微細遠心管（２００００×ｇ、１０分間）での遠心分離により全て除去した後、５０ｍＬ円錐管（Corning）中に１.５Ｍのアルギニン、１００ｍＭのトリスｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの還元グルタチオンおよび５０μＭの酸化グルタチオンを含む４０ｍＬの再生溶液中へ上清を希釈した。管を４℃で３〜４日間 Nutator プラットフォーム（Fisher Scientific）上に水平に置いた。次いで、まだ活性化されていない、再生されたＭＴ−ＳＰ１変異型を、室温で３〜４日間２５ｍＭのトリスｐＨ８、２５ｍＭのＮａＣｌに対し十分に透析した。透析中にアルギニンを除去した後、ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメイン変異型は活性化することができた。
次いで、活性化ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメイン変異型の粗調製物を、１ラウンドにつき７つまでの変異型の処理を可能にする自動モードで稼働するＡＫＴＡシステムに結合した５ｍＬのHiTrap（登録商標）Ｑ ＨＰカラム（GE Healthcare）でのクロマトグラフィーにかけた。泳動緩衝液は２５ｍＭのビス−トリスｐＨ６.５であり、精製ＭＴ−ＳＰ１を３５０ｍＭのＮａＣｌへの５０ｍＬ勾配内で溶離した。活性画分をプールし、次いで緩衝液をＰＢＳ＋２０ｍＭベンズアミジンに交換し、ＭＷＣＯが１０ｋＤａである Amicon-Ultra１５装置（Millipore）を用いて０.５〜１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。最後に、アリコートを液体窒素中で急速冷凍し、−８０℃で貯蔵した。
実施例１６
ビオチニル化突然変異体ＰＡＩ阻害剤ベイトの調製
この実施例では、ｕＰＡライブラリーからの変異型ｕＰＡプロテアーゼの選択に使用される、ストレプトアビジンでコーティングした表面を捕捉のためビオチンにより標識した突然変異体ＰＡＩ阻害剤タンパク質を発現および精製するのに使用した方法について記載する。これらの突然変異体ＰＡＩ阻害剤はまた、ＭＴ−ＳＰ１変異型およびＰＡＩで使用するＲＣＬ配列に左右される、ＭＴ−ＳＰ１ライブラリーからの変異型ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼの選択にも有用である。
Ａ．６ｘＨｉｓ−ＰＡＩ−１のＮ−末端ビオチニル化
６ｘＨｉｓ−ＰＡＩ−１またはその反応性中心ループ変異型のビオチニル化については、本明細書実施例１記載の要領で、野生型Ｈｉｓ標識ＰＡＩ−１（配列番号６２５）およびＨｉｓ標識ＰＡＩ−１変異型を、Rosetta−２（ＤＥ３）ｐＬｙｓ宿主株（Novagen）へ形質転換した。発現は、次の修飾を加えながら、本質的には報告された要領（Blouse, G. E., Perron, M. J., Thompson, J. H., Day, D. E., Link, C. A., および Shore, J. D. (2002) Biochemistry 41(40), 11997-12009）で実施された。３時間３０℃で、０.２％グルコース、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（Ｃｍ）を補った２ＸＹＴ培地中において誘導を実施した。次いで、６ｘＨis−ＰＡＩ−１の活性画分を、報告された要領（Blouse, G. E., Perron, M. J., Kvassman, J. O., Yunus, S., Thompson, J. H., Betts, R. L., Lutter, L. C.,および Shore, J. D. (2003) Biochemistry 42(42), 12260-12272; Kvassman, J.-O.,および Shore, J. D. (1995) Fibrinolysis 9, 215-221）で細胞ライゼートから精製した。
ジスルフィド開裂性試薬ＥＺ-Link ＮＨＳ−ＳＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（PIERCE、ロックフォード、イリノイ、＃２１４４２）を用いて、６ｘＨｉｓ−ＰＡＩ−１変異型をＮ−末端のところで優先的にビオチニル化した。氷上４℃で４時間、５０ｍＭのＮａＰｉ／３００ｍＭのＮａＣｌ／１ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液中ｐＨ６.２で実施した。ＤＭＳＯに溶かした５倍モル過剰のビオチニル化試薬を加えることにより、反応を開始させた。反応物中のＤＭＳＯの最終濃度を１％未満に維持した。０.５Ｍのトリス／１.０のＮａＣｌ／１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７.４を加えて２０ｍＭの最終トリス濃度にすることにより、ビオチニル化反応をクエンチングした。過剰のビオチニル化試薬を、５０ｍＭのＮａＰｉ／３００ｍＭのＮａＣｌ／１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６.２を含む貯蔵緩衝液に対する十分な透析により除去した。生成した溶液におけるＰＡＩ−１の濃度を、０.９３ｍＬｍｇ１−ｃｍ−１の吸光係数を用いて確認した（Kvassman, J.-O.,および Shore, J. D. (1995) Fibrinolysis 9, 215-221参照）。供給者が明記した条件にしたがって、ＥＺ−Quant ＨＡＢＡ／アビジンキット（PIERCE、ロックフォード、イリノイ、＃２８００５）を用いてビオチニル化の範囲を測定したところ、典型的にはＰＡＩ−１変異型１モルあたり１.０〜１.２モルのビオチンであった。
Ｂ．ＰＡＩのインビボビオチニル化：ＢＲＳ−ＴＥＶ−ＯｐｔｉＰＡＩ−１ｓｔａｂのインビボビオチニル化：
この実施例では、ＰＡＩのインビボビオチニル化に使用した方法について記載する。この実施例では、ベイト分子をコード化する遺伝子に適切な認識配列を組み込むことにより、ベイトのビオチン標識を、精製ベイトによりインビトロで実施するのではなく成長中の細胞で達成することができた。Ｎ１５０Ｈ、Ｋ１５４Ｔ、Ｑ３１９ＬおよびＭ３５４Ｉ突然変異を有する、安定したＰＡＩ−１タンパク質（ＰＡＩ−１ｓｔａｂ、配列番号５６７に示したアミノ酸残基配列を有する）をコード化する遺伝子について（Berkenpas, M. B., Lawrence, D. A.,および Ginsburg, D. (1995) EMBO J. 14(13), 2969-2977）、大腸菌（E.coli）コドンを最適化する形で、次の領域を次の順序で含むように設計した：１）開始コドン、２）ビオチン認識配列（ＢＲＳ）、３）タバコエッチウイルスプロテアーゼ配列（ＴＥＶ）４）ＰＡＩコーディング配列、５）停止コドン。この合成ＰＡＩ−１ｓｔａｂ遺伝子を、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄIII制限酵素を用いて市販の発現ベクターｐＥＴ２１−ａ（マディソン、ウィスコンシン）（配列番号５６６）へクローン化することにより、Ｔ７発現系を用いて最適化ＰＡＩ−１（ＯｐｔｉＰＡＩ−１；配列番号６２１に示したアミノ酸配列によりコード化される；この場合、アミノ酸残基３〜１７位および２０〜２６位はそれぞれＢＲＳおよびＴＥＶ部位に対応する）で発現されるプラスミドｐＣＡＴ０００２（配列番号６１９）を得た。次いで、プラスミドｐＣＡＴ０００２を、大腸菌（E.coli）ビオチンリガーゼ、ＢｉｒＡを過剰発現するプラスミドｐＢｉｒＡ（Asai et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:20079-20078に記載）をもつ大腸菌（E.coli）ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）形質転換能細胞（Stratagene、サンディエゴ、カリフォルニア）へ共形質転換した。１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（Ｃｍ）を補ったルリア−ベルターニ（ＬＢ）寒天プレートで形質転換体を選択した。
ＢＲＳ−ＴＥＶ−ＯｐｔｉＰＡＩ−１ｓｔａｂ（配列番号６２１）およびその反応性中心ループの発現を、次の修正を加えながらも本質的には報告された要領（Blouse, G. E., Perron, M. J., Thompson, J. H., Day, D. E., Link, C. A.,および Shore, J. D. (2002) Biochemistry 41(40), 11997-12009）で実施した。３時間３０℃で、０.２％グルコース、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（Ｃｍ）を補った２ＸＹＴ培地中において、０.１ｍＭのＩＰＴＧおよび０.１ｍＭのＤ−ビオチンを加えることにより誘導を開始させた。それに続いて、ＢＲＳ−ＴＥＶ−ＯｐｔｉＰＡＩ−１ｓｔａｂの活性画分を、報告された要領（Blouse, G. E., Perron, M. J., Kvassman, J. O., Yunus, S., Thompson, J. H., Betts, R. L., Lutter, L. C.,および Shore, J. D. (2003) Biochemistry 42(42), 12260-12272;および Kvassman, J.-O.,および Shore, J. D. (1995) Fibrinolysis 9, 215-221参照）で、または供給者が明記した条件にしたがって単量体アビジン（PIERCE、ロックフォード、イリノイ、＃２０２２７）でのクロマトグラフィーによる選択により、次の修正を加えながら細胞ライゼートから精製した。結合緩衝液は、５０ｍＭのトリス／１００ｍＭのＮａＣｌ／１ｍＭのＥＤＴＡ／０.０１％トゥイーン−８０を含み、ｐＨは７.４であった。使用した競合的溶離緩衝液は、この結合緩衝液に加えて２ｍＭのＤ−ビオチンを含んでいた。競合的溶離段階からのビオチンを、５０ｍＭのＮａＰｉ／３００ｍＭのＮａＣｌ／１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６.２を含む貯蔵緩衝液に対する十分な透析により除去した。ＰＡＩ−１濃度を、報告された要領で０.９３ｍＬｍｇ１−ｃｍ−１の吸光係数を用いて確認した（Kvassman, J.-O.,および Shore, J. D. (1995) Fibrinolysis 9, 215-221）。
Ｃ．Ｖ１Ｃ ＯｐｔｉＰＡＩ−１ｓｔａｂのインビトロビオチニル化
この実施例は、ＰＡＩ変異型のＮ−末端ビオチニル化方法を示す。この実施例に記載した方法を実施して、ＰＡＩベイト分子をコード化する遺伝子に適切な反応基を組み込むことにより、タンパク質の精製後にビオチンによるベイトの標識が達成され得、ベイトが位置特異的に標識され得る。この実施例において、天然ＰＡＩはシステイン残基を含まないため、ＰＡＩ遺伝子をコード化するＤＮＡにシステインコドンを付加することにより、Ｃｙｓ含有ＰＡＩを作製し、次いでこれをＣｙｓ反応性ビオチニル化試薬と反応させ得た。
上記プラスミドｐＣＡＴ０００２におけるＯｐｔｉＰＡＩ−１のＮ−末端ＢＲＳ−ＴＥＶ配列を、供給者の仕様書に従って、QuikChange-ＸＬ 突然変異導入キット（Stratagene、サンディエゴ、カリフォルニア）を用いてＶ１Ｃ突然変異を同時導入することにより欠失させ、Ｖ１Ｃ ＯｐｔｉＰＡＩ−１ｓｔａｂタンパク質（配列番号６２２）を発現するプラスミドｐＣＡＴ００５１（配列番号６２３）を得た。プラスミドｐＣＡＴ００５１を大腸菌（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ形質転換能細胞（Stratagene、サンディエゴ、カリフォルニア）へ形質転換した。１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（Ｃｍ）を補ったルリア−ベルターニ（ＬＢ）寒天プレートで形質転換体を選択した。
Ｖ１Ｃ−ＯｐｔｉＰＡＩ−１ｓｔａｂタンパク質およびその反応性中心ループの発現を、次の修正を加えながらも本質的には報告された要領（Blouse, G. E., Perron, M. J., Thompson, J. H., Day, D. E., Link, C. A.,および Shore, J. D. (2002) Biochemistry 41(40), 11997-12009）で実施した。３時間３０℃で、０.２％グルコース、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補った２ＸＹＴ培地中において、０.１ｍＭのＩＰＴＧを加えることにより誘導を開始させた。Ｖ１Ｃ ＯｐｔｉＰＡＩ−１ｓｔａｂまたはその変異型の活性画分を、報告された要領（Blouse, G. E., Perron, M. J., Kvassman, J. O., Yunus, S., Thompson, J. H., Betts, R. L., Lutter, L. C.,および Shore, J. D. (2003) Biochemistry 42(42), 12260-12272;および Kvassman, J.-O.,および Shore, J. D. (1995) Fibrinolysis 9, 215-221）で細胞ライゼートから精製した。
チオール反応性および可逆性ビオチニル化試薬、ＥＺ−Link ビオチン−ＨＰＤＰ（Ｎ−（６−（ビオチンアミド）ヘキシル）−３'−（２'−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド）（PIERCE、ロックフォード、イリノイ、＃２１３４１）を用いることにより、Ｖ１Ｃ ＯｐｔｉＰＡＩ−１タンパク質および変異型を、遺伝子操作を加えたＮ−末端システイン残基のところでビオチニル化した。供給者の仕様書に従って次の要領で若干の修正を加えながらビオチンのコンジュゲーションを達成した。ビオチン−ＨＰＤＰの保存溶液を、無水ＤＭＦ（９.３ｍＭ）中５ｍｇ／ｍＬで調製した。Ｖ１Ｃ−ＯｐｔｉＰＡＩ−１ｓｔａｂをＧ−２５ゲル濾過カラムで迅速に脱塩し、５０ｍＭのＮａＰｉ／１５０ｍＭのＮａＣｌ／１ｍＭのＥＤＴＡ／０.０１％トゥイーン−８０、ｐＨ７.４を含むコンジュゲーション緩衝液中へ溶離した。１０倍モル過剰のビオチン−ＨＰＤＰ保存液を加えることにより、ビオチニル化反応を開始させた。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の最終濃度を２〜３％未満に維持した。
反応を２５℃で４時間実施し、３４３ｎｍでのピリジン−２−チオン脱離基の放出を用いて反応の進行を追跡した。過剰のビオチニル化試薬を、５０ｍＭのＮａＰｉ／３００ｍＭのＮａＣｌ／１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６.２を含む貯蔵緩衝液に対する十分な透析により除去した。ＰＡＩ−１濃度を、報告された要領で０.９３ｍＬｍｇ１−ｃｍ−１の吸光係数を用いて確認した（Kvassman, J.-O.,および Shore, J. D. (1995) Fibrinolysis 9, 215-221）。ＥＺ−Quant ＨＡＢＡ／アビジンキットおよびピリジン−２−チオンの放出（PIERCE、ロックフォード、イリノイ、＃２８００５）を用いたところ、ビオチニル化の範囲は、典型的にはＰＡＩ−１変異型１モルあたり１.０〜１.２モルであった。
実施例１７
大腸菌（E.coli）培養物上清およびペリプラズム抽出物からのＭＴ−ＳＰ１変異型のスクリーニング
この実施例では、大腸菌（E.coli）周辺腔からのタンパク質または大腸菌（E.coli）細胞培養培地からのタンパク質を検定することによりファージでのＭＴ−ＳＰ１変異型の活性をスクリーニングするための別法として使用される２方法について記載する。
両方法について、１ｍＬ培養物を次の要領で調製した。１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび１２μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを補った２ＹＴ培地１ｍＬを、９６ウェル深型ウェルプレートの各ウェルに分配し、９６ウェルマスタープレートからの上記実施例１４記載の要領で一晩ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼドメイン担持ファージで感染させておいたＸＬ−１ Blue 細胞１０μＬを接種した。深型ウェルプレートを空気透過性膜で密閉し、細胞密度が０.４〜０.６ＯＤ６００に達するまで（通常４〜５時間の振とう）、酸素曝気しながら３７℃、４００ｒｐｍで振とうするHiGro シェーカーインキュベーター中に置いた。その時点で、ＩＰＴＧを加えて０.５ｍＭの最終濃度とし、振とうしながら一晩増殖を続行させた。翌日、プレートを２０分間３６００ｒｐｍでの遠心分離にかけて細胞を沈降させた。
Ａ．ペリプラズム調製物からのＭＴ−ＳＰ１変異型のスクリーニング
この実施例での方法を用いることにより、大腸菌（E.coli）周辺腔中へ輸送しておいた、完全長ＭＴ−ＳＰ１−遺伝子III融合タンパク質、および融合タンパク質の酵素活性開裂産物を検定した。３６００ｒｐｍで遠心分離後、培養上清を廃棄し、細胞ペレットを用いることにより、次の条件のいずれかを用いてペリプラズムタンパク質を放出させた：条件１：細胞ペレットを１５０μＬの冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、懸濁液を９６ウェルＰＣＲプレートに移し、次いで１段階冷凍解凍処理（−８０℃で２０分／室温水浴で１０分）を行った：または条件２：細胞ペレットを１５０μＬの３％BugBuster タンパク質抽出試薬（Novagen）に再懸濁し、懸濁液を９６ウェルＰＣＲプレートに移し、懸濁液を室温で３０分間インキュベーションした。次に、細胞懸濁液を４℃で２０分間、３６００ｒｐｍでの遠心分離にかけ、ペレットを乱すことなく、ペリプラズムタンパク質を含む上清を注意深く除去した。さらに、ペリプラズム抽出物を用いることにより、実施例１０Ｂ項記載の要領で適切な基質を用いてＭＴ−ＳＰ１変異型の酵素活性を測定した。
Ｂ．上清調製物からのＭＴ−ＳＰ１変異型のスクリーニング
この実施例での方法を用いることにより、ペリプラズムから細菌細胞培養培地へ拡散させておいた、完全長ＭＴ−ＳＰ１−遺伝子III融合タンパク質、および融合タンパク質の酵素活性フラグメントを検定した。この実施例では、１ｍＬ培養物中で遠心分離後、培養上清１０μＬを除去し、さらに２５μＬの検定緩衝液を反応に加えること以外は、実施例１０、Ｂ項記載のプロテアーゼ検定法を用いて検定した。
当業者であれば、修正については容易に想到できるはずであるため、本発明は、添付の請求の範囲でのみ制限されるものとする。

Claims (53)

  1. タンパク質標的基質における開裂配列を開裂するプロテアーゼまたはその触媒活性部分を同定または選択する方法であって、
    ａ）複数の異なる突然変異体プロテアーゼおよび／またはプロテアーゼの触媒活性部分のコレクションを修飾プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させ、
    （ただし、ここで
    該修飾プロテアーゼトラップポリペプチドが、修飾セルピン、修飾されたアルファ−マクログロブリンファミリーの構成員または修飾されたｐ３５ファミリーの構成員であり、
    該プロテアーゼのコレクションが、鋳型プロテアーゼまたはその触媒活性部分の一次配列にアミノ酸修飾を含むプロテアーゼまたはその触媒活性部分を含み、
    該一次配列のアミノ酸修飾が、アミノ酸の挿入、欠失または置換であり、
    該プロテアーゼトラップポリペプチドは、開裂配列を含む反応性部位を含み、それによりプロテアーゼトラップポリペプチドは、タンパク質標的基質の開裂配列を含むように、プロテアーゼトラップポリペプチドのＰ４〜Ｐ２'位における１種またはそれ以上のアミノ酸置換により反応性部位で修飾され、
    該接触は、コレクション中のプロテアーゼまたはその触媒活性部分によりプロテアーゼトラップポリペプチドの反応性部位に含まれる開裂配列中のアミノ酸を開裂させることにより、プロテアーゼまたはその触媒活性部分と共有結合しているプロテアーゼトラップポリペプチドを含む安定した複合体を形成させる条件下で実施され、
    該コレクション中のプロテアーゼまたはその触媒活性部分によるプロテアーゼトラップポリペプチドの反応性部位に含まれる開裂配列中のアミノ酸の開裂時に、プロテアーゼトラップポリペプチドは、プロテアーゼまたはその触媒活性部分と共有結合を形成することによりプロテアーゼまたはその触媒活性部分をプロテアーゼトラップポリペプチドと共に含む安定した複合体を形成するものとする。）、
    ｂ）該コレクションの非複合体形成構成員から複合体形成プロテアーゼを分離し、次いで
    ｃ）該複合体におけるプロテアーゼまたはその触媒活性部分を同定または選択する、すなわちプロテアーゼトラップポリペプチドにおける開裂配列を開裂するプロテアーゼまたはその触媒活性部分を同定または選択することにより、タンパク質標的基質を開裂するプロテアーゼまたはその触媒活性部分を同定または選択する
    ことを含む方法。
  2. プロテアーゼトラップポリペプチドが、修飾セルピンである、請求項１記載の方法。
  3. プロテアーゼまたはその触媒活性部分のコレクションが、非修飾プロテアーゼとは異なり、標的基質に対して改変された活性および／または特異性を有するように修飾されている、請求項１記載の方法。
  4. プロテアーゼトラップポリペプチドを検出または分離用に標識し、またプロテアーゼまたはその触媒活性部分と共に検出可能なプロテアーゼトラップポリペプチドを含む複合体の捕獲により分離を行う、
    請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 捕獲が、懸濁液、溶液または固体支持体において行われる、請求項４記載の方法。
  6. プロテアーゼトラップポリペプチドをビオチンで標識する、請求項４記載の方法。
  7. さらに分離された複合体におけるプロテアーゼまたはその触媒活性部分を増幅することを含み、増幅が、宿主細胞におけるプロテアーゼまたはその触媒活性部分をコード化する核酸の増殖および発現を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 複数の異なるプロテアーゼトラップポリペプチドをコレクションと接触させ、
    少なくとも２つのプロテアーゼトラップポリペプチドが同定可能な形で検出され得ることにより、複合体における複数のプロテアーゼまたはその触媒活性部分が同定される、多重方式で実施される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 複合体におけるプロテアーゼまたはその触媒活性部分がディスプレーされ、同定または選択後にそれらを増幅させることにより、プロテアーゼおよび／またはその触媒活性部分の第２コレクションを作製し得る、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. さらに、第２コレクションを第２プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させることにより、安定した複合体の第２セットを製造することを含み、ここで、第２プロテアーゼトラップポリペプチドが、第２コレクションからのプロテアーゼまたはその触媒活性部分と共有結合を形成し、プロテアーゼまたはその触媒活性部分を第２プロテアーゼトラップポリペプチドと共に含む複合体を形成する、請求項９記載の方法。
  11. 第２プロテアーゼトラップポリペプチドが、第１プロテアーゼトラップポリペプチドと同一または異なる、請求項１０記載の方法。
  12. さらに、安定した複合体の第２セットにおいてプロテアーゼを同定または選択することを含む、請求項１０記載の方法。
  13. プロテアーゼまたはその触媒活性部分のコレクションが、少なくとも５、１０、５０、１００、５００、１０３、１０４、１０５、１０６またはそれ以上の異なる構成員を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 鋳型プロテアーゼまたはその触媒活性部分がセリンおよび／またはシステインプロテアーゼである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、固体支持体、細胞表面または微生物表面でディスプレーされる、請求項１４記載の方法。
  16. プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、酵母、細菌、ウイルス、ファージ、核酸、ｍＲＮＡ分子の表面またはリボソームでディスプレーされる、請求項１５記載の方法。
  17. プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、ファージディスプレーライブラリーでディスプレーされる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. プロテアーゼがプロテアーゼの触媒活性部分として提供される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 少なくとも２つの異なるプロテアーゼトラップポリペプチドをコレクションと接触させ、さらに
    プロテアーゼトラップポリペプチドの少なくとも一方を検出可能な形で標識することにより、検出可能なプロテアーゼトラップポリペプチドおよびプロテアーゼまたはその触媒活性部分を含む安定した複合体の捕獲が行われ、
    他方または他の複数プロテアーゼトラップポリペプチドがそれぞれ検出可能な形で標識されたプロテアーゼトラップポリペプチドと比べて過剰に存在している、
    請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 検出可能な標識がビオチンである、請求項１９記載の方法。
  21. 鋳型プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、キモトリプシン、ズブチリシン、カスパーゼおよびパパインファミリーのプロテアーゼから選択される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 鋳型プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼまたはその触媒活性部分であり、グランザイムＢ、テスチシン、トリプターゼベータ１、カリクレインｈｋ５、コリン、カリクレイン１２、ＤＥＳＣ１オリテサーゼ、トリプターゼガンマ１、カリクレインｈＫ１4，ヒアルロナン結合セリンプロテアーゼ、トリプターゼ、カリクレインｈＫ１５、トリプシン、好中球エラスターゼ、マンナン結合レクチン関連セリンプロテアーゼ−３、カテプシンＧ、ミエロブラスチン、グランザイムＡ、グランザイムＭ、キマーゼ、グランザイムＫ、グランザイムＨ、キモトリプシンＢ、膵臓エラスターゼ、膵臓エンドペプチダーゼＥ、膵臓エラスターゼII、エンテロペプチダーゼ、キモトリプシンＣ、プロスタシン、カリクレイン１、カリクレインｈＫ２、カリクレイン３、ヒトカリクレイン８、メソトリプシン、因子ＸII、血漿カリクレインＫＬＫ３、因子ＸＩ、因子ＩＸ、因子ＶII、因子Ｘａ、トロンビン、プロテインＣ、アクロシン、ヘプシン、肝細胞増殖因子活性化因子（ｕＰＡ）、尿中プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、プラスミン、ニューロシン、ニューロトリプシン、ニューロプシン、カリクレインｈＫ１０、エピセリアシン、プロスターゼ、キモパシン、カリクレイン１１、ＭＴ−ＳＰ１、スピネシン、カテプシンＬ、カテプシンＶ、カテプシンＫ、カテプシンＳ、カテプシンＦ、カテプシンＢ、パパイン、クルザイン、ズブチリシン、テルミターゼ、Ｃ５ａペプチダーゼ、フェルビドリシン、ラクトセピン、フリン、ケキシン、カスパーゼ−１、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、カスパーゼ−６、カスパーゼ−２、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１、カスパーゼ−１２、カスパーゼ−１、カスパーゼ−１３およびカスパーゼ−１４から選択される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 鋳型プロテアーゼまたはその触媒活性部分が、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）およびＭＴ−ＳＰ１から選択される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. プロテアーゼトラップポリペプチドが、標的基質についての予め定められた基質特異性および／または活性を有するプロテアーゼにより開裂されるように修飾されている、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 修飾プロテアーゼトラップポリペプチドが、修飾セルピンである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 修飾セルピンが、修飾プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）または修飾抗トロンビンIII（ＡＴ３）から選択される、請求項２５記載の方法。
  27. 修飾プロテアーゼトラップポリペプチドが、修飾アルファ２−マクログロブリンである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  28. 標的基質が疾患または障害の病因に関与するものである、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 標的基質が、ＩＬ−５、ＩＬ−５受容体、ＩＬ−１、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−４、ＩＬ−４受容体、ＴＮＦ、ＴＮＦ受容体、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ｇｐ１２０、ｇｐ１４１、ＣＤ４、ＲＳＶ融合タンパク質、血球凝集素、Ｂ７、ＣＤ２８、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４０、ＩＬ−２、ＩＬ−２受容体、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ、ＨＥＲ２、ＣＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ３、Ｓｒｃ、Ａｋｔ、Ｂｃｌ−２、ＢＣＲ−Ａｂ１、ＧＳＫ−３、Ｃｄｋ−２、Ｃｄｋ−４、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２および補体タンパク質から選択される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 標的基質が、ＶＥＧＦＲ、補体タンパク質、または組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）の基質である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. ＶＥＧＦＲがＶＥＧＦＲ２である、請求項３０記載の方法。
  32. 補体タンパク質がＣ２である、請求項３０記載の方法。
  33. プロテアーゼトラップポリペプチドが、配列番号４０６〜４３２および４８０〜４８９のいずれかに示されたアミノ酸の配列を有する開裂配列に対応する１つまたはそれ以上のアミノ酸置換により反応性部位で修飾される、請求項１記載の方法。
  34. プロテアーゼトラップポリペプチドが、配列番号３８９、４７９および４９８のいずれかに示されたアミノ酸の配列を有する開裂配列に対応する１つまたはそれ以上のアミノ酸置換により反応性部位で修飾される、請求項１記載の方法。
  35. 修飾プロテアーゼトラップポリペプチドが修飾セルピンであり、反応性部位における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換が、セルピンポリペプチドの反応性部位ループに存在する、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 修飾セルピンが、配列番号４９７、４９９、６１０および６１１のいずれかに示されたアミノ酸の配列を有する、請求項３５記載の方法。
  37. 修飾プロテアーゼトラップポリペプチドが修飾アルファ２マクログロブリンであり、反応性部位における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換がポリペプチドのベイト領域に存在する、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  38. プロテアーゼの同定方法が複数回実施され、その過程が反復的である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. プロテアーゼが、対応する鋳型プロテアーゼの非標的基質の場合と比べて標的基質における開裂配列についての高い基質特異性および／または活性を呈するまで、本方法を実施する、請求項３８記載の方法。
  40. 複数の異なるプロテアーゼが少なくとも本方法の初回反復で同定される、請求項３８記載の方法。
  41. さらに、同定されたプロテアーゼのアミノ酸配列を比較することにより、ホットスポットを同定することを含み、
    ホットスポットが、鋳型プロテアーゼと比較して同定されたプロテアーゼの少なくとも２、３、４、５またはそれ以上に存する修飾された遺伝子座である、
    請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. さらに、
    第１の一プロテアーゼまたは複数プロテアーゼを同定後、プロテアーゼの第２コレクションを製造するが、ただし、同定された第１プロテアーゼを鋳型として用いて、プロテアーゼ配列またはその触媒活性部分にさらなる突然変異を導入することにより、第２コレクションの構成員が、同定された第１プロテアーゼの突然変異および追加的突然変異を有するポリペプチドを含んでいるものとし、
    次いで、第２コレクションを、第１の一プロテアーゼまたは複数プロテアーゼを単離するのに使用した第１プロテアーゼトラップポリペプチドと同一または異なる第２プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させるが、ただし、第１および第２プロテアーゼトラップポリペプチドは、所望の標的基質特異性を有するプロテアーゼにより開裂されるように修飾されているものとし、
    複合体におけるコレクションから第２プロテアーゼ（複数も可）またはプロテアーゼの触媒活性部分（複数も可）を同定するが、ただし、同定された第２プロテアーゼ（複数も可）は、同定された第１プロテアーゼよりも標的基質に対する高い活性または特異性を有するものとする、
    請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. さらに、プロテアーゼトラップポリペプチドとプロテアーゼまたはその触媒活性部分の間の反応に競合物質を加えることにより、同定されたプロテアーゼ（複数も可）またはその触媒活性部分（複数も可）の選択性を高めることを含む方法である、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. さらに、
    ａ）第１開裂配列を含む第１プロテアーゼトラップポリペプチドと安定した複合体を形成する第１の一プロテアーゼまたは複数プロテアーゼまたはその触媒活性部分を同定後、同定されたプロテアーゼまたはその触媒活性部分を、第２開裂配列を含む第２プロテアーゼトラップポリペプチドと接触させ、ただし接触については競合物質の存在下で実施するものとし、
    ｂ）第２プロテアーゼトラップポリペプチドと複合体を形成するプロテアーゼまたはその触媒活性部分を同定または選択する
    ことを含み、
    同定、進化または選択されたプロテアーゼまたはその触媒活性部分が、少なくとも２つの開裂配列についての基質特異性および／または開裂活性を有するものである、
    請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  45. 少なくとも２つの開裂配列が一標的基質に存する、請求項４４記載の方法。
  46. 少なくとも２つの開裂配列が２つの異なる標的基質に存する、請求項４４記載の方法。
  47. 第１および第２プロテアーゼトラップポリペプチドが異なり、それぞれ、異なる標的基質についての所望の基質特異性を有するプロテアーゼにより開裂されるように反応性部位で修飾されている、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. さらに、少なくとも２つの開裂配列に対し所望の、または予め定められた基質特異性および開裂活性をもつ同定または選択されたプロテアーゼが単離されるまで、段階ａ）およびｂ）を少なくとも再度反復することを含む、請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. さらに、標的基質の開裂配列に対する基質特異性について同定されたプロテアーゼをスクリーニングすることを含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. ａ）突然変異体プロテアーゼおよび／またはその触媒活性部分のコレクション
    （ここで、コレクションが、複数の異なるプロテアーゼおよび／またはプロテアーゼの触媒活性部分を含み、そしてプロテアーゼのコレクションが、鋳型プロテアーゼまたはその触媒活性部分の一次配列にアミノ酸の挿入、欠失または置換であるアミノ酸修飾を含むプロテアーゼまたはその触媒活性部分を含む）；および
    ｂ）セルピン、アルファマクログロブリンファミリーの構成員、またはｐ３５ファミリーの構成員である少なくとも１つの修飾プロテアーゼトラップポリペプチド
    （ここで、プロテアーゼトラップポリペプチドは、タンパク質標的基質の開裂配列を含むように、プロテアーゼトラップポリペプチドのＰ４〜Ｐ２'位における１種またはそれ以上のアミノ酸置換により反応性部位で修飾される）
    を含む組み合わせ。
  51. プロテアーゼおよび／またはその触媒活性部分のコレクションがディスプレーライブラリーで呈示される、請求項５０記載の組み合わせ。
  52. ディスプレーライブラリーがファージディスプレーライブラリーであり、構成員が少なくともプロテアーゼの触媒活性部分をディスプレーする、請求項５１記載の組み合わせ。
  53. 各成分が別々にパッケージされている、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の組み合わせを含むキット。
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