DE19943177C2 - Verfahren zur Herstellung von aktiven Serienproteasen und inaktiven Varianten - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von aktiven Serienproteasen und inaktiven VariantenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven Serinproteasen
und isolierter Serinprotease-Domänen sowie enzymatisch inaktiver Varianten dieser
Serinproteasen/Serinprotease-Domänen in prokaryotischen Wirten.
Nachfolgend werden Dokumente aus dem Stand der Technik zitiert, deren Offenbarungs
gehalt hiermit durch Bezugnahme in dieser Anmeldung enthalten ist.
Proteasen sind spezielle Proteine mit peptidolytischen und esterolytischen Eigenschaften
und können in katalytischer Weise andere Substanzen und Proteine (Substrate)
irreversibel verändern und umwandeln. Entsprechend der funktionell relevanten
Molekülreste des katalytisch aktiven Zentrums werden diese Proteasen in vier
verschiedene Hauptklassen eingeteilt: Serin-abhängige Proteasen, Cysteinproteasen,
Aspartasen und Metalloproteasen. Proteasen vom Serin-Typus fallen in zwei große
Familien, in die Familie der eigentlichen Serinproteasen und in die Subtilisin-Familie. Zu
den bekanntesten Vertretern der Serinproteasen zählen die Verdauungsenzyme des
Gastrointestinaltraktes, das Trypsin, Chymotrypsin und die Pankreas-Elastase, die
bakteriziden und Matrix-abbauenden Enzyme der neutrophilen Granulozyten,
Leukozyten-Elastase und Cathepsin G, die Kallikreine der Speicheldrüsen und die
Serinproteasen des Gerinnungs- und Immunabwehrsystems. Serinproteasen in
sekretorischen Granula von Mastzellen, Lymphozyten, Phagozyten oder natürlichen
Killerzellen und die Serinproteasen des Komplementsystems spielen eine wichtige Rolle
bei der Immunabwehr von Viren, Parasiten, Bakterien und Tumorzellen und bei
Autoimmunprozessen. Serinproteasen sind auf unterschiedliche Substrate spezialisiert
und können nach Asparaginsäure-Resten (Granzym B, Induktion der DNA-
Fragmentierung in lysierten Zielzellen), Arginin- und Lysin-Resten (Trypsin, Granzym A
und Granzym K), Methionin-Resten (Granzym M, "Met-ase") oder nach hydrophoben
Aminosäuren (Elastase, Proteinase 3, Pankreas-Elastase, Chymotrypsin) eine
Peptidbindung hydrolysieren. Eine Reihe von Lymphozyten-spezifischen Serinproteasen
(Granzyme genannt) werden bei der Zielzell-Lyse sezerniert und sind direkt und indirekt
nach Aufnahme in das Zytosol der Zielzelle am Vorgang der Zielzell-Zerstörung durch
aktivierte Killerzellen beteiligt. Bei Cathepsin G, Proteinase-3 und der Leukozyten-
Elastase handelt es sich um Serinproteasen aus neutrophilen Granulozyten, die u. a.
Elastin und andere Matrixkomponenten abbauen und als wichtige Pathogenitätsfaktoren
bei verschiedenen chronischen Entzündungskrankheiten und Autoimmunreaktionen
betrachtet werden. Die Proteinase-3 wurde ferner als das krankheitsspezifische
Autoantigen der Wegenerschen Granulomatose identifiziert und könnte in Zukunft zur
Behandlung von Patienten mit dieser Erkrankung eingesetzt werden.
Obwohl seit langem bekannt ist, daß Serinproteasen eine wesentliche Rolle in biologischen
Prozessen wie der Immunabwehr spielen und daher medizinisch von größter Bedeutung
sind, sind nur wenige Verfahren beschrieben worden, die gezielt eingesetzt werden
könnten, um derartige Serinproteasen in technischem Maßstab herzustellen.
So beschrieben Smyth et al. (1995) J. Immunol. 154: 6299-6305, und Kummer et al.
(1996) J. Biol. Chem. 271: 9281-9286, zwar die Expression von rekombinanten Proteasen,
jedoch wurden hier eukaryotische Expressionssysteme verwendet, in denen diese
Serinproteasen nur in geringen Mengen herstellbar sind. Die Effizienz einer
biosynthetischen Herstellung in Eukaryoten ist unbefriedigend, ebenso die zu
beobachtenden Kontaminierungen durch nicht-funktionelle Nebenprodukte und Zell-
Bestandteile. Hinzu kommt ein aufwendiges Reinigungsprotokoll zur Abtrennung
homologer zellulärer Proteine, das in der Regel mit weiteren Verlusten des zu reinigenden
Proteins einhergeht.
Weitere Expressionsversuche wurden auch in einem Hefesystem (Pham et al. (1998) J.
Biol. Chem. 273: 1629-1633) oder Baculosystem (Xia et al. (1998) Biochem. Biophys.
Res. Com. 243: 384-389) beschrieben. Beide Systeme eignen sich ebenfalls nur bedingt zur
Darstellung von homogen reinen Serinproteasen, da eine Kontamination mit
unerwünschten eukaryotischen Proteasen ebenfalls nicht ausgeschlossen werden kann.
Desweiteren wurde die Erfahrung gemacht, daß gewisse Serinproteasen bereits während
der Biosynthese in Wirtszellen (Säuger- oder Insektenzell-Linien) aktivierbar sind und
somit die Wirtszellen schädigen können.
Babé (Babé et al. (1998) Biotechnol. Appl. Biochem. 27: 117-124) beschreibt eine
Expressionsmethode einer Serinprotease in einem prokaryotischen System mit Sekretion
ins extrazelluläre Medium. Jedoch wurde von diesen Autoren keine Rückfaltung des
exprimierten Proteins und Prozessierung mit Cathepsin C vorgenommen. Ferner war nur
eine geringe Ausbeute von 200 µg/l und eine geringe Lagerstabilität der gewonnenen
Serinprotease beobachtet worden.
Beresford (Beresford et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 9285-9290) hingegen
zeigte die prokaryotische Herstellung von rekombinantem Granzym A in E. coli, das in
vitro durch Spaltung an einer rekombinant eingeführten Enterokinasestelle gewonnen wird.
Jedoch muß hierzu die natürliche Signalpeptidsequenz mit einer bakteriellen pelB-
Signalsequenz rekombinant ersetzt werden, damit ein inaktives Proenzym in das
bakterielle Periplasma exportiert werden kann. Wie in Xia et al. (loc. cit.) erwähnt, konnte
jedoch mit dieser Methode eine ähnliche Protease, Granzym B, nicht hergestellt werden.
In Lu et al.: Protein Expression and Purification 8 (1996), Seiten 215 bis 226 wird die Herstellung von aktiven, rekombinanten humanen Kallikrein (Serinprotease)
durch Expression desselben mit einer Helfersequenz Met-Ala-Pro-Pro-Ile-Gln-Ser-Arg am
N-Terminus in den prokaryotischen Wirt E. coli, anschließender Renaturierung des rekombi
nanten Enzyms und Aktivierung desselben durch protolytische Abspaltung der Propeptid-
Sequenz mittels der Endopeptidase Thermolysin beschrieben.
Höpfner (Höpfner et al. (1997) EMBO J. 16: 6626-6635) stellt die Expression einer
aktiven Serinprotease in E. coli vor, jedoch muß in diesem Verfahren eine Aktivierung
durch Russel's Viper Venom vorgenommen werden. Das in diesem Gift enthaltene sehr
sequenzspezifische Enzym (eine endoproteolytisch aktive Serinprotease) ist jedoch nicht
allgemein erhältlich. Außerdem ist die Signalsequenz, die von der Protease erkannt wird,
wesentlich länger und anders als die natürlich vorkommenden Propeptide, wodurch die
Effektivität der Renaturierung beeinträchtigt werden könnte.
In US-Patent 5679552 wird die Generierung von biologisch aktiven Proteinen beschrieben,
deren korrekter N-Terminus durch limitierte Proteolyse einer N-terminalen Helfersequenz
mittels Cathepsin C erreicht wird. Die exakte Prozessierung der geradzahligen
Aminosäurehelfersequenz mit Hilfe von Cathepsin C wird dadurch erreicht, daß sog.
Cathepsin C-Stopsequenzen in den Aminoterminus des herzustellenden Proteins
artifiziell eingefügt wurden. Die Methode ist jedoch auf solche Proteine beschränkt, die
bestimmte Sequenzeigenschaften am reifen N-Terminus aufweisen, d. h. auf Proteine mit
Lysin oder Arginin an erster Position, bzw. auf Proteine mit Prolin an zweiter oder dritter
Position innerhalb der Sequenz des herzustellenden Proteins. Serinproteasen mit der N-
terminalen Konsensus-Sequenz Ile-(Ile/Val)-Gly-Gly können mit dem in US 5679552
beschriebenen Verfahren nicht hergestellt werden. Die hochkonservierte N-terminale
Sequenz von funktionell aktiven Serinproteasen entspricht keiner der bisher bekannten
Cathepsin C-Stopsequenzen.
In EP-A1 0397420 ist die enzymatische Konvertierung von rekombinanten Proteinen mit
Helfersequenzen mittels Cathepsin C unter Verwendung einer neuartigen N-terminalen
Stopsequenz (Met-Tyr und Met-Arg) geschützt. Das in dieser Patentschrift erstmalig
beschriebene N-terminale Ende (Met-Tyr bzw. Met-Arg) des herzustellenden
rekombinanten Proteins kann durch Exopeptidasen wie dem Cathepsin C nicht
abgespalten werden. Die im Patent EP 0397420 dargestellten Stopsequenzen sind
ebenfalls für die Prozessierung und Darstellung eines funktionellen N-Terminus bei
katalytisch aktiven Serinproteasen ungeeignet.
US Patent 4,861,868 beschreibt die Generierung von Proteinen mit Alanin am N-
Terminus nach Abspaltung eines oder mehrerer Methionine durch eine
Monoaminoexopeptidase aus E. coli, der Methionin-Aminopeptidase. Zur Darstellung
einer aktiven Serinprotease ist jedoch ein N-terminales Alanin ungeeignet, da der
hochkonservierte N-Terminus Ile-(Ile/Val)-Gly-Gly für die Erlangung der aktiven
Konformation unerläßlich ist.
In der Patentschrift US 5,013,662 wird die Herstellung von N-terminal Methionin-freien
Proteinen in E. coli beschrieben. Das durch das Startkodon bedingte N-terminale
Methionin wird durch Methionin-Aminopeptidase in vitro oder in vivo abgespalten. Die
N-Termini von Serinproteasen (ILe-(Ile/Val)-Gly-Gly) können auch nach diesem Verfahren
nicht hergestellt werden, da die Methionin-Aminopeptidase Methionin nur vor kleinen
Aminosäuren (Gly, Val, Ser, Ala) abspaltet, nicht jedoch vor großen, aliphatischen
Aminosäuren wie dem absolut notwendigen Isoleucin.
E. Wilharm und D. Jenne publizierten (in Immunobiology, Vol. 197, 28th Annual Meeting 1997, S. 415), daß
ein Tripeptides Met-Gly-Glu für die Herstellung von katalytisch aktiven
Serinproteasen verwendet werden könnte. N-terminales Methionin wird vor Glycin in
endogen exprimierten E. coli-Proteinen quantitativ entfernt. Das dann verbleibende
Dipeptid, das Bestandteil der natürlichen Granzym B-Sequenz ist, sollte durch Cathepsin
C abgespalten werden. Dieser Verfahrensweg hat sich jedoch nicht bewährt. Bei
Überexpression in E. coli werden auch unter besten Kulturbedingungen nur etwa 60% bis
70% aller Methionine entfernt. Auch die Konvertierung der Methionin-freien Proform
durch Cathepsin C verläuft nicht vollständig. Die erhaltenen Produkte wurden durch
Ansequenzierung analysiert und u. a. als Met-Gly-Glu-GzmK, Gly-Glu-GzmK und
(komplett prozessierten reifen) GzmK-Molekülen identifiziert. Hierbei zeigte sich eine
nicht tolerierbare Produktheterogenität, die vielen Anwendungen entgegensteht.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, ein Verfahren bereitzustellen, das zur
Herstellung von biologisch aktiven Serinproteasen oder Serinprotease-Domänen und
katalytisch inaktiven, aber korrekt gefalteten Varianten oder sequenzmodifizierten Varianten gleicher biologischer Funktionalität in prokaryotischen Wirten
verwendet werden kann. Das Verfahren wurde
speziell für einfache Serinproteasen, die nur
aus einer einzigen Domäne, der katalytischen, bestehen und allein dadurch eine spezifische
peptidolytische oder esterolytische Funktion mit natürlicher oder artifizieller Spezifität
(Designer-Aktivitäten) ausüben. Diese einfachen Serinproteasen sind in der Natur
weitverbreitet und besitzen äußert unterschiedliche Aufgaben im Bereich der zellulären
und humoralen Immunabwehr (Mastzell-, Granulozyten- und Lymphozyten-Proteasen,
Komplement-Faktor D), der gastroenteralen Verdauung (Trypsine, Chymotrypsin und
Elastasen), der exokrinen und endokrinen Organe (Kallikreine), für die normale
Physiologie der Haut und des Nervensystems (Neuropsin, Kallikrein-Homologe). Das
Verfahren eignet sich zur Herstellung solcher Serinproteasen und davon abgeleiteter
Serinproteasen mit artifizieller Substratspezifität im industriellen Maßstab. Die Produkte
können somit in unbegrenzten Mengen kostengünstig als Forschungsreagenzien,
Therapeutika und für Inhibitorentwicklung und Erprobung dieser Inhibitoren in vivo
bereitgestellt werden. Erfindungsgemäß wesentlich ist hierbei, daß im Gegensatz zum
Stand der Technik im hier dargestellten Verfahren für die Terminierung von
Exopeptidasereaktionen keine spezifischen, linearen Stopsequenzen am N-Terminus der
herzustellenden Proteine erforderlich ist und daß eine präzise Abspaltung einer N-
terminalen Helfersequenz trotz Fehlen einer bekannten Stopsequenz für Exopeptidasen
selektiv und vollständig erfolgt.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen
gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Bei Versuchen zur Funktion und Spezifität des Cathepsin C wurde beobachtet, daß der
natürlicherweise vorhandene stark konservierte N-Terminus von Serinproteasen und
Serinprotease-Domänen gegenüber einem exopeptidolytischen Abbau z. B. durch
Cathepsin C in vitro resistent ist und sich somit als neue Stopsequenz für die
Prozessierung von Zymogenen in aktive Serinproteasen mit Hilfe von Cathepsin C oder
ähnlichen Exopeptidasen nutzen läßt, wenn ein homogenes Ausgangsprodukt vorliegt
und dieses Ausgangsprodukt eine Dipeptid-Helfersequenz vor dem Beginn des reifen
Enzyms trägt.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von biologisch
aktiven Serinproteasen, isolierter Serinprotease-Domänen und deren Aminosäure-
Varianten in einem prokaryotischen Wirt, das durch folgende Schritte charakterisiert ist:
- a) N-terminale Addition einer Helfersequenz wobei die
Helfersequenz ein Dipeptid mit der Dipeptidsequenz Met-Y ist und Y eine beliebige
Aminosäure, ausgenommen Prolin ist, oder die Helfersequenz ein Dipeptid mit der
Dipeptidsequenz Met-Y ist und Y eine beliebige Aminosäure, ausgenommen Prolin
ist und C-terminal nachfolgend mindestens ein weiteres Exopeptidase spaltbares
Dipeptid oder Vielfaches solcher Dipeptide in unterschiedlicher Kombination
aufweist,
Expression dieser artifiziellen Nukleotidsequenz mit den Eigenschaften, sich ähnlich wie die entsprechenden natürlichen Serinproteasen aufzufalten und eine stabile dreidimensionale Struktur auszubilden, gegebenenfalls als Einschlußkörperchen; - b) Renaturierung der exprimierten Proteine; und
- c) Aktivierung der Serinprotease(n), einer Serinproteasen-Domänen oder deren Aminosäure-Varianten durch Abspaltung der Helfersequenz durch eine Exopeptidase.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Serinproteasen all jene
Proteine verstanden, die eine strukturelle Ähnlichkeit zu Trypsin und Chymotrypsin
aufweisen. Dazu gehören beispielsweise die Serinproteasen des Gerinnungs- und
Komplementsystems, der Immunabwehrzellen, des Gastrointestinaltraktes und der
exokrinen Drüsen. Mit dem Begriff Serinprotease-Domäne bezeichnet man unabhängig
faltbare Teile von komplex aufgebauten Proteine mit struktureller, dreidimensionaler
Ähnlichkeit zu Serinproteasen.
Serinproteasen besitzen überwiegend
peptidolytische und esterolytsche Eigenschaften, bisweilen aber auch andere
Funktionen. So bestehen die Serinproteasen des Gerinnungs- und Komplementsystems
aus unterschiedlichen kovalent verbundenen Protein-Dömanen und einer carboxy
terminal lokalisierten Serinprotease-Domäne mit katalytischen Eigenschaften.
Wesentlich für die Aktivierung und thermodynamisch stabile Faltung von
Serinproteasen ist ein korrekt prozessierter N-Terminus, der im allgemeinen mit einem
Isoleucin oder Valin beginnt.
Prokaryotische Wirte, die im Sinne der Erfindung genutzt werden können, sind dem
Fachmann bekannt und umfassen, inter alia, Organismen wie Escherichia-, Bacillus-,
Erwinia- und Serratia-Spezies, insbesondere E. coli, Bacillus subtilis, Erwinia
chrysanthemi, Erwinia carotovora oder Serratia marcescens. Vorzugsweise können
hierbei eingesetzt werden: E. coli, Bacillus subtilis.
Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken ist es möglich (siehe z. B. Sambrook
et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor,
NY oder Band 1 und 2 von Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular
biology, Current Protocols) das biotechnologische Verfahren der Erfindung zur
Gewinnung und Aktivierung korrekt gefalteter und funktionell aktiver Serinproteasen
durchzuführen. Die erfindungsgemäße Addition einer Helfersequenz am Amino-
Terminus von Serinproteasen oder Serinprotease-Domänen wird mit Hilfe von
Klonierungstechniken und gentechnische Manipulationen in prokaryotischen Zellen
durchgeführt, wobei DNA-Moleküle oder Teile dieser Moleküle in Plasmide
eingebracht und gegebenenfalls durch gezielte Mutagenese und Rekombination von
DNA-Segmenten an die erforderliche Sequenz adaptiert werden. So können mit Hilfe
von Standardverfahren, wie die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und Ligations
reaktionen, Vektorenkonstrukte hergestellt werden, die zur Expression von
Serinproteasen mit N-terminalen Helfersequenzen führen. Diese Standardverfahren
(z. B. in Sambrook et al., loc. cit.; Mullis et al. (1994), The Polymerase Chain Reaction,
Birkhäuser, Boston, beschrieben) erlauben nicht nur die Klonierung und Expression von
heterologen Proteinen auf cDNA-Ebene, sondern auch den gezielten Austausch von
Basen und die Addition von natürlichen oder synthetischen Sequenzen. Auf diese
Weise kann mit Hilfe bekannter molekularbiologischer Methoden das hier vorgestellte
Verfahren auch dazu genutzt werden, um Sequenzmodifizierte Serinproteasen mit
neuen Eigenschaften in prokaryotischen Wirten herzustellen.
Für die Verknüpfung von DNA-Fragmenten können Adaptoren oder Linker an die zu
klonierenden Fragmente angefügt werden. Ferner können zweckdienliche
Restriktionsschnittstellen eingefügt oder überflüssige, z. B. nichtkodierende DNA oder
unerwünschte Restriktionsschnittstellen entfernt werden. Werden Insertionen,
Deletionen oder Substitutionen gewünscht, so kommen die Techniken der in vitro-
Mutagenese, der Reparatur mit Hilfe modifizierter Primer, der PCR, des
Restriktionsverdaus und der Ligation zum Einsatz. Die Degeneration des genetischen
Codes bietet dem Fachmann u. a. die Möglichkeit, die Nukleotidsequenz der DNA-
Sequenz an die Kodon-Präferenz des jeweiligen prokaryotischen Wirts anzupassen. Als
analytische Methoden zur Beurteilung der Arbeitsergebnisse sind Restriktionsverdaue,
Sequenzierungen und weitere biochemisch-molekularbiologische Tests erforderlich.
Die gewünschte, zu exprimierende Sequenz kann synthetisch hergestellt oder natürlich
gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-
Bestandteilen enthalten. Im allgemeinen werden synthetische DNA-Sequenzen mit
Kodons erzeugt, die von Prokaryoten bevorzugt werden. Diese von Prokaryoten
bevorzugten Kodons können publizierten Tabellen (http://pegasus.uthct.edu)
entnommen werden und finden sich in stark exprimierten endogenen Proteinen am
häufigsten. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-
Subfragmente einzeln manipuliert und kombiniert werden, um eine DNA-Sequenz zu
erhalten, die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist und in der korrekten
Richtung translatiert wird. Auch hierbei können zwecks vereinfachter Verknüpfung von
DNA-Fragmenten Adaptoren oder Linker eingesetzt werden.
Um eine N-terminale Addition von Helfersequenzen an Serinproteasen zu erreichen,
werden, wie oben erwähnt, molekularbiologische DNA-Vektoren mit besonderen
Kontrollbereichen eingesetzt, die die Transkription der Expressionskassette in
prokaryotischen Zellen steuern. Diese Kontrollbereiche umfassen in der Regel den
Promoter und spezielle regulatorische Elemente. Diese regulatorischen Elemente, wie
z. B. der tac-lac, T7 oder trp Promotor, sind dem Fachmann vertraut und geläufig:.
Entsprechende prokaryotische Expressionsvektoren können von verschiedenen Firmen
bezogen werden: pET24c und andere pET-Vektoren von Novagen, lambda gt11 und
pGBT9 von Clontech, pGX von Qiagen.
Unter "Expression der Serinprotease(n)" im Sinne der Erfindung versteht der Fachmann
die Expression eines heterologen Fusionsproteins im prokaryotischen Wirt. Das
Verfahren zur Herstellung von Serinproteasen und/oder ihrer Fragmente beinhaltet die
Expression einer Proform im Zytosol des prokaryotischen Wirts, gegebenenfalls und
vorzugsweise als Einschlußkörperchen ("IB, "inclusion bodies"). Dabei hängt die
Einschlußkörperchenbildung in erster Linie von der Expressionsrate ab, wobei eine
eindeutige Korrelation mit Größe, Hydrophobizität und anderen Eigenschaften des zu
exprimierenden Proteins nicht zu erkennen ist (Lilie, H. et al. (1998), Current Opinion
in Biotechnology 9: 497-501). Bei niedrigen Expressionstemperaturen sowie bei kleinen,
hydrophilen Proteinen ist aber durchaus mit der Löslichkeit des rekombinanten Proteins
zu rechnen (z. B. Alkalische Phosphatase (Derman et al. (1993) Science 262, 1744-
1747; Proba et al. (1995) Gene 159, 203-207). Bei rekombinanten Proteinen, deren
dreidimensionale Faltung nicht entscheidend durch die Ausbildung von Disulfidbrücken
stablisiert wird (vielfach bei zytoplasmatischen Proteinen vorzufinden), kann auch im
prokaryotischen Zytoplasma eine natürliche Konformation erreicht werden. In E. coli
mit Thioredoxinreduktasedefizienz (z. B. Novagen AD494 DE 3) ist das Cytoplasma
weniger reduzierend und erlaubt in einigen Fällen auch eine Ausbildung von
Disulfidbrücken (Derman et al.; loc. cit.).
Neben der Expression der heterologen Fusionsproteine der Serinproteasen und/oder
ihrer Fragmente als Einschlußkörperchen umfaßt daher die Erfindung auch ein
Verfahren, bei dem die Expression als lösliche rekombinante Protein/Peptide
durchgeführt wird. Unter "Renaturierung der exprimierten Fusionsproteine" im Sinne
der Erfindung wird die Solubilisierung von Proteinaggregaten und Auffaltung in
naturgleiche dreidimensionale Strukturen verstanden, die in physiologischen
Pufferlösungen stabil sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt ferner eine Aktivierung der herzustellenden
Serinproteasen oder ihrer Serinprotease-Domänen durch Abspaltung einer geeigneten
Helfersequenz durch eine Exopeptidase. Dabei wird bei Exopeptidasen zwischen
Dipeptidylexopeptidasen und Monoaminoexopeptidasen unterschieden, die bei jedem
Prozessierungsschritt zwei bzw. eine Aminosäure abspalten. Insbesondere bevorzugt
werden Dipeptidylexopeptidasen, wie unten genauer ausgeführt. Als Beispiele können
gelten: Cathepsin C, Cathepsin W, Cathepsin B oder Diaminopeptidase IV, Cathepsin
C-ähnliche Funktionshomologe in anderen Spezies wie z. B in Dictyolstelium
discoideum und C. elegans. Kennzeichnend für die zu prozessierenden Exopeptidase-
Substrate ist hierbei, daß sie die bekannten Exopeptidase-Stopsequenzen weder im
Bereich der Helfersequenz noch im amino-terminalen Bereich des gewünschten
Produktes tragen. Eine sequenzielle Konvertierung durch eine zweckmäßige
Kombination unterschiedlicher Exopeptidasen könnte durchgeführt werden, bei der z. B.
im ersten Schritt Methionin über eine spezifische Methioninaminoexopeptidase
abgespalten und in weiteren Schritten Dipeptid(e) entfernt werden.
Es kann also auch eine Sequenz aus mehreren Met-Resten vor das
abzuspaltende Helfer-Dipeptid angefügt werden. D. h. es können Sequenzen der Form
(Met)n-Glu, wie z. B. Met-Met-Gly (wobei n eine natürliche Zahl bis 40 bedeuten
kann) verwendet werden. Diese Methionine können während oder nach der Expression,
d. h. in vitro, durch Methioninaminopeptidase(n) abgespalten werden. Erfindungsgemäß
ist jedoch darauf zu achten, daß es nach der Abspaltung des Methionins/der Methionine
zu einer Helfersequenz kommt, die eine gerade Anzahl von Aminosäuren ohne Stop-
Aminosäuren aufweist. Käme es zu einer ungeraden Anzahl an Aminosäuren nach der
Abspaltung des Startmethionins/der Methionine, wäre durch Einsatz von
Dipeptidylaminoexopeptidasen eine Generierung eines exakten N-Terminus der
herzustellenden Serinprotease(n) und/oder ihrer Fragmente nicht mehr gewährleistet.
Es ist daher erfindungsgemäß sinnvoll, eine Methioninaminopeptidase mit einer
Diaminoexpeptidase zu kombinieren, wenn zusätzlich eingefügte Methionine vor der
Dipeptidhelfersequenz entfernt werden müssen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
wird im Schritt (a) vor der Sequenz des gewünschten Serinprotease-Produktes ein
Dipeptid der Form Met-Y, beispielsweise Met-Glu, addiert, das im Schritt (c)
unter Verwendung von bspw. Cathepsin C abgespalten wird.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
beginnt das N-terminal hinzugefügte Dipeptid mit einem Methionin. Da die Translation
in Prokaryoten mit einem Formyl-Methionin-Rest beginnt, das im Zytosol der
Bakterien in manchen Fällen durch die endogene E. coli Formylase in Verbindung mit
der E. coli Methionin-Aminopeptidase entfernt wird, ist es notwendig, ein geeignetes,
universell einsetzbares Propeptid zu identifizieren, das einerseits während der
Biosynthese in E. coli nicht verändert wird, andererseits aber nach Rückfaltung des
Vorläuferproduktes in einfacher und effizienter Weise selektiv enzymatisch abgespalten
werden kann, ohne das rekombinante Protein anzugreifen. Somit sind die
addierten Methionin-haltigen Dipeptide (Met-Y)
einerseits resistent gegenüber posttranslationeller Prozessierung in E. coli, andererseits
aber ein gutes Substrat für nur in Eukaryoten bisher nachgewiesenen
Dipeptidylaminoexopeptidasen.
In einer Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens werden
Dipeptide oder eine Kombination von mehreren unterschiedlichen Dipeptiden aus
einem Pool geeigneter Dipeptide ohne natürliche Stopsequenzen zusätzlich C-terminal nach dem Dipeptid Met-Y vor den N-
Terminus der zu exprimierenden Serinprotease vorgeschaltet. Diese Peptidhelfer
sequenzen umfassen jede Aminosäure-Kombination, jedoch kann Prolin, Lysin oder
Arginin nicht an erster Stelle und Prolin nicht an zweiter Stelle dieses Dipeptides
stehen.
Für das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders die
Dipeptidhelfersequenz Met-Glu, wobei dieser Dipeptidhelfersequenz einzelne oder
mehrere Methionine vorangestellt werden können. Prolin muß an der zweiten Stelle
des Dipeptids vermieden werden, da eine Abspaltung des Dipeptids durch einzelne
Exopeptidasen, wie Cathepsin C, verhindert wird. Es ist zu erwähnen daß weiterhin
Tyrosin oder Arginin an der zweiten Stelle nach einem Methionin vermieden werden
soll, wenn als Exopeptidase im erfindungsgemäßen Verfahren Cathepsin C eingesetzt
werden soll.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Dipeptid Met-Glu als
Helfersequenz und das Konvertierungsenzym Cathepsin C angewendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren, bei dem in den bevorzugten
Ausführungsformen die Exopeptidase eine Monoaminoexopeptidase und/oder eine
Dipeptidylexopeptidase ist. Unter Monoaminoexopeptidase ist, inter alia, die oben erwähnte
Methioninaminoexopeptidase aus E. coli (Ben-Bassat et al. (1987) J. Bacteriol. 169: 751-757)
zu verstehen. In der besonders bevorzugten Ausführungsform ist die
Dipeptidylexopeptidase Cathepsin C oder ein Cathepsin C-Homolog (RCP, beschrieben
in US 5,637,462).
Die Erfindung umfaßt auch jene Serinproteasen und deren Fragmente, die aufgrund von
Aminosäuresubstitutionen und/oder Aminosäureinsertionen als katalytisch inaktive
Serinprotease-Varianten in der Natur vorkommen und andere, nicht katalytische
Aufgaben erfüllen.
Die Erfindung umfaßt auch durch Mutagenese entstandene Serinproteasen ohne
katalytische Aktivität.
In einer bevorzugen Ausführungsform umfaßt die Erfindung ein Verfahren, bei dem die
Serinprotease Leukozyten-Elastase, Proteinase-3, Komplementfaktor D, Azurozidin,
Mastzell-Chymase, Pankreas-Trypsin, Pankreas-Chymotrypsin, Mastzell-Tryptase,
glanduläres Kallikrein, Cathepsin G, ein Granzym, eine katalytische Domäne von
Komplementproteasen oder von Gerinnungsproteasen ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren
zur Herstellung eines Granzyms, wobei das Granzym Granzym A, B, K, H, M oder L
ist. Dabei umfaßt Granzym L die hier in SEQ ID Nr. 1 (Abb. 5) dargestellte Nukleotidsequenz.
Diese und andere Ausführungsformen sind dem Fachmann durch die Beschreibung und
die Beispiele der vorliegenden Erfindung offenbart. Weiterführende Literatur kann zu
einer der oben angeführten Methoden, Produkte und therapeutischen Anwendungen
dieser Produkte, die mit Hilfe der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, aus
öffentlichen Bibliotheken unter Zuhilfenahme elektronischer Suchmaschinen
aufgefunden werkten. Zu diesem Zweck bieten sich unter anderem öffentliche
Datenbanken an wie die "Medline", die über Internet zur Verfügung stehen, z. B. unter
der Adresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Weitere Datenbanken
und Adressen sind dem Fachmann geläufig und können aus dem Internet entnommen
werden, z. B. unter der Adresse http:/ / www.lycos.com. Eine Übersicht über Quellen
und Informationen zu Patenten bzw. Patentanmeldungen in der Biotechnologie ist in
Berks, TIBTECH 12: 352-364 (1994) gegeben.
Die Durchführbarkeit der erfindungsgemäßen Verfahren wird durch die nachstehenden
Versuche belegt.
Konstruktion der Expressionskassetten unter
Der Vektor pET24c (Novagen) wurde für die Klonierung von humanem Granzym K
mit den Restriktionsendonukleasen NdeI und EcoRI geschnitten. Die für humanes
Granzym K kodierende Sequenz wurde mittels zweistufiger PCR von humaner
Knochenmark-cDNA amplifiziert. In der ersten PCR-Runde wurde mit einem Paar
korrekt hybridisierender Oligonukleotide (sogenannte äußere Oligos, siehe P1 und P2
im Sequenzprotokoll) die humane Granzym K-cDNA zwischen der Mitte des ersten
und dem Ende das fünften Exons von humaner Knochenmark-cDNA amplifiziert
(PCR-Bedingungen: Matrizen-DNA: 1 µl einer mit reverser Transkriptase in cDNA
umgeschriebenen mRNA (2 µg), Nukleotide: jeweils 0.2 mM; Oligos: jeweils 1 µM;
Enzym 0.5 µl/50 µl-Ansatz [2.5 Einheiten/µl] native Pfu-Polymerase (Stratagene);
Puffer: Stratagene; Programm: nicht-zyklische Denaturierung: 5 Minuten bei 95°C,
zyklische Schritte: 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 56°C, 1 Minute bei 72°C, 35
Zyklen, nicht-zyklische Elongation: 5 Minuten bei 72°C). Das erhaltene PCR-Produkt
diente als Matrizensequenz in der zweiten PCR-Runde, in der mittels eines zweiten
Oligonukleotidpaares (innere Oligos, siehe P3 und P4 im Sequenzprotokoll) das Insert
für die Klonierung in den pET24c Vektor amplifiziert wurde (PCR-Bedingungen:
Matrizen-DNA: 5 ng; Oligos: jeweils 1 µM; Nukleotide: jeweils 0.2 mM; Enzym: 0.5 µl/50 µl
Ansatz [2.5 Einheiten/µl] native Pfu-Polymerase (Stratagene); Puffer:
10-facher Pfu-Polymerase Reaktionspuffer
100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 200 mM Tris-Cl (pH 8,75)
20 mM MgSO4, 1% Triton® X-100, 1000 µg/ml BSA; Programm: nicht-zyklische Denaturierung: 5 Minuten bei 95°C, zyklische
Schritte: 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 58°C, 1 Minute bei 72°C, 24 Zyklen,
nicht-zyklische Elongation: 5 Minuten bei 72°C). In die Oligos wurden dazu die NdeI
und EcoRI Schnittstellen eingeführt. Das so erhaltene Amplifikat wurde aus dem Gel
gereinigt (Qiaquick-Protokoll von Qiagen) mit den Restriktionsendonukleasen NdeI
und EcoRI geschnitten und in den Vektor ligiert (Ligationsbedingungen: Enzym: 1.5 µl/20 µl
Ansatz [1 Einheit/µl] T4-Ligase (Boehringer Mannheim); Vektor: 50 ng/20 µl
Ansatz; Insert: 50 ng/20 µl Ansatz; Puffer: Ligationspuffer, 10-fach konzentriert
660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2, 10 mM Dithioerythrit
10 mM ATP, pH 7,5 (gemessen bei 20°C); Inkubation: 16
Stunden bei 15°C), so daß 8 Basen in 3' Richtung von der Ribosomenbindungsstelle
die Translation des Transkripts mit dem Methionin des NdeI-Palindroms beginnt. Die
N-terminale Sequenz setzt sich für beide Granzyme zusammen aus dem
Pro(Di)peptid Met-Glu und der sich daran anschließenden konservierten Sequenz der
reifen Granzyme Ile-Ile-Gly-Gly. Am 3'-Ende bricht die Translation mit dem
natürlichen Stopcodon ab.
Die Amplifizierung von Granzym K der Maus erfolgte unter Verwendung des
identischen Oligonukleotids im N-terminalen Bereich (P5 bzw. P3) und P6 als
Rückwärts-Primer. Von Milz-cDNA der Maus ausgehend wurde in 35 Zyklen unter
Einsatz von 5 ng DNA das Granzym K-Fragment der Maus für die
Expressionskassette amplifiziert, aus dem Gel gereinigt (Qiaquick-Protokoll von
Qiagen) mit der Restriktionsendonuklease NdeI geschnitten und das 3'-Ende kinasiert.
Für diese PCR wurden jeweils 0.2 mM der vier Nukleotide, 1 µM von jedem Oligo
und 0.5 µl/50 µl-Ansatz [2.5 Einheiten/µl] nativer Pfu-Polymerase (Stratagene) im
Puffersystem von Stratagene und folgendes Thermocycler-Programm eingesetzt: nicht-
zyklische Denaturierung: 5 Minuten bei 95°C, zyklische Arbeitschritte: 1 Minute bei
95°C, 1 Minute 51°C, 1 Minute 72°C, 35 Zyklen, nicht-zyklische Elongation: 5
Minuten bei 72°C, Für die Klonierung in pET24c wurde der Vektor durch Verdau mit
HindIII geöffnet, der Überhang aufgefüllt, so daß ein glattes Ende entstand, und der
linearisierte Vektor anschließend mit dem Restriktionsenzym NdeI geschnitten. Das
Insert wurde wie oben beschrieben in den so vorbereiteten Vektor ligiert.
Die resultierenden Klone wurden auf Kanamycin [30 µg/ml] selektioniert und über
Restriktionsanalyse (Doppelverdau) mit Hilfe von NdeI und XhoI (New England
Biolabs) und Sequenzierung verifiziert.
Der Vektor pET24c-His-Strep-tag (modifizierter Novagenvektor) wurde für die
Klonierung von humanem Granzym M mit den Restriktionsendonukleasen NdeI und
PstI geschnitten. Die für humanes Granzym M kodierende Sequenz wurde mittels
zweistufiger PCR von humaner Knochenmark-cDNA amplifiziert. In der ersten PCR-
Runde wurde mit einem Paar korrekt hybridisierender Oligonukleotide (sogenannte
äußere Oligos, siehe P7 und P8 im Sequenzprotokoll) die humane Granzym M-cDNA
zwischen der Mitte des ersten und dem Ende das fünften Exons von humaner
Knochenmark-cDNA amplifiziert (PCR-Bedingungen: Matrizen-DNA: 1 µl einer mit
reverser Transkriptase in cDNA umgeschriebenen mRNA (2 µg); Nukleotide: jeweils
0.2 mM; Oligos: jeweils 1 µM; Enzym 0.5 µl/50 µl-Ansatz [2.5 Einheiten/µl] native
Pfu-Polymerase (Stratagene); Puffer: Stratagene; Programm: nicht-zyklische
Denaturierung: 5 Minuten 95°C, zyklisch: 1 Minute 95°C, 1 Minute 56°C, 1 Minute
72°C, 24 Zyklen, nicht-zyklische Elongation: 5 Minuten 72°C). Das erhaltene PCR-
Produkt diente als Matrizen-DNA in der zweiten PCR-Runde, in der mittels eines
zweiten Oligonukleotidpaares (innere Oligos, siehe P9 und P10 im Sequenzprotokoll)
das Insert für die Klonierung in den pET24c-His-Strep-tag Vektor amplifiziert wurde
(PCR-Bedingungen: Matrizen-DNA: 5 ng; Oligos: jeweils 1 µM; Nukleotide: jeweils
0.2 mM; Enzym: 0.5 µl/50 µl Ansatz [2.5 Einheiten/µl] native Pfu-Polymerase
(Stratagene); Puffer: Stratagene; Programm: nicht-zyklische Denaturierung: 5 Minuten
95°C, zyklisch: 1 Minute 95°C, 1 Minute 58°C, 1 Minute 72°C, 24 Zyklen, nicht-
zyklische Elongation: 5 Minuten 72°C). In die Oligos wurden dazu die NdeI und NsiI
Schnittstellen eingeführt. Im Oligo P9 wurde zusätzlich die für die ersten zehn
Aminosäuren kodierende Sequenz hinsichtlich der Kodonfrequenz in E. coli optimiert
(Abb. 3). Der Einfluß dieser Kodonoptimierung auf die Expressionsstärke
veranschaulicht Abb. 2b. Das so erhaltene Amplifikat wurde aus dem Gel gereinigt
(Qiaquick-Protokoll von Qiagen) und in den Vektor ligiert (Ligationsbedingungen:
siehe Beispiel 1a). Als N-terminale Helfersequenz wurde auch für Granzym K der
Maus das Pro(Di)peptid Met-Glu benutzt und daran der cDNA-Leserahmen des
reifen murinen Granzym K angefügt. Am 3'-Ende brach die Translation mit dem
natürlichen Stopcodon ab.
Die resultierenden Klone wurden auf Kanamycin [30 µg/ml] selektioniert und durch
Restriktionsanalyse (Doppelverdau) mit NdeI und EcoRI (New England Biolabs) und
DNA-Sequenzierung bestätigt.
Die gemäß Beispiel 1a und 1b konstruierten Plasmide wurden in den
Expressionsstamm E. coli B834 DE3 (Novagen) transformiert und die Expression
zunächst im kleinen Maßstab getestet. 10 ml Kulturen wurden mit LB-Kanamycin
(Konzentration siehe Beispiel 1) bis zu einer OD600 von 0.5 angezogen, die
Expression mit 1 mM IPTG induziert und 3 Stunden bei 37°C bis zu einer OD600
von 1.5 inkubiert. IPTG aktiviert den lacUV-Promotor, der im B834 DE3-Stamm die
chromosomal kodierte T7-Polymerase kontrolliert, die ihrerseits die Transkription
des klonierten Granzym-Gens unter T7lac-Promotor Kontrolle aufnimmt.
Von 50 µl (= 0.075 OD) der induzierten Kultur und einer nicht-induzierten Kontrolle
wurde ein Gesamtzell-Lysat hergestellt und mittels SDS-PAGE analysiert.
Von gut exprimierenden Klonen (deutliche Bande bei 25 kD im Coomassie-gefärbten
SDS-Gel; Abb. 2a und b) wurde die Kultur im größeren Maßstab wiederholt und aus
dem Gesamtzell-Lysat eine IB-Präparation durchgeführt.
Zur Präparation von Einschlußkörpern ("inclusion bodies") wurden folgende Puffer
eingesetzt:
- a) Lysepuffer
50 mM Tris
10 µg/ml DNase
2 mM MgCl2
0.25 mg/ml Lysozyme
pH 7.2 - b) Waschpuffer I
50 mM Tris
60 mM EDTA
1.5 M NaCl
6% Triton-X-100
pH 7.2 - c) Waschpuffer II
50 mM Tris
60 mM EDTA
pH 7.2
Die Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet und das Pellet einmal mit PBS pH
7.4 gewaschen, bevor der Aufschluß in Lysepuffer bei Raumtemperatur erfolgte. Die
bakteriellen Membranen wurden entweder durch zwei French-Press-Zyklen (1000-
1200 psi) oder drei Sonifizierungszyklen (jeweils 15 Minuten 320 W) aufgebrochen,
das Lysat mit einem Drittel des Volumens Waschpuffer I versetzt und 1 Stunde bei
Raumtemperatur im Überkopfschüttler inkubiert. Die Suspension wurde 20 Minuten
bei 17200 g bei 4°C zentrifugiert, das Pellet in Waschpuffer I resuspendiert, 1 Stunde
bei Raumtemperatur im Schüttler inkubiert und erneut zentrifugiert. Dieser Vorgang
wurde zweimal mit Waschpuffer I und dreimal mit Waschpuffer II wiederholt. Nach
der letzten Zentrifugation wurde ein kleines Aliquot der IB-Präparation mittels SDS-
PAGE auf Reinheit analysiert, der Rest wurde solubilisiert. Hierzu wurden folgende
Puffer verwendet:
- a) Solubilisierungspuffer
6 M Guanidiniumchlorid
100 mM Tris
20 mM EDTA
15 mM GSH
150 mM GSSG
pH 8.0 - b) Dialysepuffer
6 M Guanidiniumchlorid
pH 5.0
~2 g IB (Frischgewicht) wurden in 20 ml Solubilisierungspuffer im Potter
resuspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur im Schüttler inkubiert. Unlösliche
Bestandteile wurden abzentrifugiert und diese Proteinlösung anschließend gegen
jeweils 20 Volumen Dialysepuffer 24 Stunden bei 4°C mit drei Pufferwechseln nach
jeweils 8 Stunden dialysiert.
Zur Renaturierung wurden folgende Puffer verwendet:
- a) Renaturierungspuffer
50 mM Tris
0.5 M Arginin
20 mM CaCl2
1 mM EDTA
0.1 M NaCl
0.5 mM Cystein
pH 8.5 - b) Dialysepuffer
PBS
pH 7.0
Die Renaturierung erfolgte in drei Pulsen mit Zeitintervallen von jeweils 8 Stunden.
Die Renaturierungsansätze von humanem Granzym K wurden bei Raumtemperatur,
die von Granzym K der Maus und humanem Granzym M bei 4°C inkubiert. Die
Proteinlösung (~10 mg/ml) aus Beispiel 2 wurde jeweils 1 : 100 (Vol/Vol) im
Renaturierungspuffer unter Rühren verdünnt und bis zum nächsten Puls ohne
Agitation inkubiert. Nach der dritten Zugabe der Proteinlösung wurde der
Rückfaltungsansatz noch weitere zwei Tage bei Raumtemperatur bzw. 4°C ohne
Agitation inkubiert. Nach der Renaturierung wurde das Reaktionsvolumen filtriert
(über Celluloseacetat), auf ca. 50 ml konzentriert und bis zur Entfernung von Arginin
bei 4°C dialysiert (Kontrolle über Leitfähigkeitsmessung). Auftretendes Präzipitat
wurde durch Zentrifugation und anschließende Filtration entfernt. Das lösliche
gefaltete Zymogen war enzymatisch inaktiv (Abb. 4) und wurde mittels
Kationenaustauschchromatographie von kontaminierenden E. coli Proteinen gereinigt
und dabei konzentriert. Es wurde dazu ein NaCl-Gradient von der physiologischen
NaCl-Konzentration in PBS (137 mM) bis 2 M gefahren.
Zunächst wurden die Aktivierungsbedingungen von bovinem Cathepsin C, der zu
verwendenden Exopeptidase, optimiert:
Cathepsin C wurde in Gegenwart einer Thiolkomponente und Halidionen durch Reduktion aktiviert, z. B. durch 10 mM Mercaptoethanolamin-HCl. Da es durch die Präsenz eines Reduktionsmittels im Konvertierungsansatz jedoch zu Reduktion der Disulfidbrücken des gefalteten Granzyms kommen kann, wurden die Aktivierungs- und Konvertierungsbedingungen zunächst hinsichtlich Thiolkonzentration, Zeitdauer der Aktivierung und der anschließenden Dialyse sowie des pH-Werts optimiert. Als optimale Parameter wurden 2 mM Mercaptoethanolamin zur Aktivierung bei pH 5.0 über 20 Minuten eingesetzt und anschließend für 20 Minuten gegen PBS, 75 mM NaAcetat bei pH 5.5 dialysiert.
Cathepsin C wurde in Gegenwart einer Thiolkomponente und Halidionen durch Reduktion aktiviert, z. B. durch 10 mM Mercaptoethanolamin-HCl. Da es durch die Präsenz eines Reduktionsmittels im Konvertierungsansatz jedoch zu Reduktion der Disulfidbrücken des gefalteten Granzyms kommen kann, wurden die Aktivierungs- und Konvertierungsbedingungen zunächst hinsichtlich Thiolkonzentration, Zeitdauer der Aktivierung und der anschließenden Dialyse sowie des pH-Werts optimiert. Als optimale Parameter wurden 2 mM Mercaptoethanolamin zur Aktivierung bei pH 5.0 über 20 Minuten eingesetzt und anschließend für 20 Minuten gegen PBS, 75 mM NaAcetat bei pH 5.5 dialysiert.
Die FPLC Peakfraktion wurde gegen PBS pH 6.0 dialysiert und auf ca. 1 ml (~20 mg
Protein/ml) konzentriert. 3 Einheiten Cathepsin C pro Milliliter [Stock: 5 U/ml in
H2O] wurden zunächst für 20 Minuten bei 37°C in 5 mM 2-Mercaptoethanolamin,
PBS pH 5.0 aktiviert und anschließend 20 Minuten bei Raumtemperatur gegen PBS,
75 mM NaAcetat, pH 5.5 zur Entfernung von 2-Mercaptoethanolamin dialysiert. Das
aktive Cathepsin C wurde 1 : 1 (Vol/Vol) mit dem Zymogen versetzt und 6 Stunden bei
Raumtemperatur inkubiert, evtl. auftretende Präzipitationen durch Zentrifugation
abgetrennt und die filtrierte Probe erneut einer Kationenaustauschchromatographie
unterworfen (siehe Beispiel 3) zur Abtrennung von Cathepsin C.
In Aktivitätsassays wurde die enzymatische Aktivität der prozessierten Granzyme
gegenüber den synthetischen Substraten Benzyloxycarbonyl-L-Lysin-Thiobenzylester
(Z-Lys-SBzl) für Granzym K und t-Butyloxycarbonyl-Ala-Ala-Met-Thiobenzylester
(Boc-Ala-Ala-Met-SBzl) für Granzym M demonstriert (Abb. 4). Diese
Aktivitätstests wurden in Vertiefungen einer 96-Napf-Schale mit jeweils 150 µl
Probenvolumen durchgeführt. Die Thiobenzylestersubstrate und Ellman's Reagenz
wurden auf Endkonzentrationen von 0.3 mM in Testpuffer (150 mM Tris, 50 mM
NaCl, 0.01% Triton X-100, pH 7.6) verdünnt. Die verschiedenen
Granzympräperationen wurden ebenfalls in Testpuffer auf 3-15 nM verdünnt. Der
mit dem Umsatz der Substrate einhergehende Farbumschlag wurde bei 405 nm und
Raumtemperatur über 5 Minuten im ELISA-Reader gemessen. Zur Berechnung der
Umsatzrate wurde die Differenz der Absorptionen zu Beginn und nach 5 Minuten
gebildet und auf die Zeit bezogen.
Die Ausmaß der Konvertierung in das gewünschte Endprodukt wurde durch
aminoterminale Proteinsequenzierung (Edmann-Abbau) überprüft und belief sich auf
über 90%. Ähnliche Forschungsarbeiten wurden auch mit Fusionproteinen unter
Zuhilfenahme anderer Helfersequenzen (z. B. Met-Gly-Glu-GzmK) durchgeführt.
Diese Versuche zeigten, daß verschiedene unerwünschte Nebenprodukte (Met-Gly-
Glu-GzmK, Gly-Glu-GzmK, Glu-GzmK) neben der eigentlichen Zielsubstanz
(GzmK) in beträchtlichen Mengen vorlagen und eine biochemische Separierung dieser
Nebenprodukte nicht erreichbar war.
solubilisiertes Protein aus IB: 50-75 mg/l
gefaltetes Zymogen: 10-15 mg/l (20%)
aktives Granzym 6-8 mg/l (10-12%)
gefaltetes Zymogen: 10-15 mg/l (20%)
aktives Granzym 6-8 mg/l (10-12%)
Prozentangaben beziehen sich auf die theoretische maximale Ausbeute von quantitativ
renaturiertem Protein (= 100%)
Abb. 1: Beschreibung der verwendeten Primer
Abb. 2a: Analyse der Expression, Reinigung und Renaturierung von humanem
Granzym K. Coomassie-gefärbtes 12% SDS-Gel mit Lysat nicht induzierter Kultur
(Spur 1), Lysat IPTG-induzierter Kultur (Spur 2), Präparation der Einschlußkörper
aus dem induzierten Lysat (Spur 3), renaturiertes Zymogen nach
Ionenaustauschchromatographie (Spur 4) und natives humanes Granzym K nach
Aktivierung mit Cathepsin C und Ionenaustauschchromatographie (Spur 5).
Abb. 2b: Analyse der Expression von humanem Granzym M (hGzmM) unter
Verwendung verschiedener Expressionskonstrukte. 12% SDS-PAGE mit
anschließender Coomassie-Färbung von hGzmM mit natürlichem C-Terminus
(Bezeichnung hGzmM/WT) und (His)8-Strep-tag-C-Terminus (Bezeichnung
hGzmM/HST), sowie von hGzmK als Expressionskontrolle. Die
Aufschlußverfahren sind: 1: nicht-induzierte Kultur, Aufschluß in 2.5% SDS, 5% b-
Mercaptoethanol; 2: induzierte Kultur, Aufschluß wie in 1; 3: induzierte Kultur,
Aufschluß in 5% SDS, 200 mM DTT, 5% b-Mercaptoethanol; 4: induzierte Kultur
mit idealisierten Kodons, Aufschluß wie in 1.
Abb. 3: N-terminaler Sequenzvergleich zwischen humanem Granzym K
(hGzmK) und humanem Granzym M (hGzmM) auf Aminosäureebene (A) und
Nukleotidebene (B). Die Kodonfrequenzen in E. coli (Ausubel et al., 1999) sind in %
angegeben, seltene Kodons sind unterstrichen. Der für die N-terminale Optimierung
der Expressionskonstrukte entworfene Oligo ist in (C) dargestellt, die veränderten
Positionen sind unterstrichen.
Abb. 4a: Substratspezifität von humanem Granzym K (hGzmK). Es wurden
jeweils 0.1 mM der Thiobenzylestersubstrate und jeweils 3 nM der Proform
(schwarz), der konvertierten Form (schraffiert) und der konvertierten S195A-Mutante
(grau) eingesetzt. Die Substratumsetzung wurde bei 405 nm und Raumtemperatur über
5 Minuten gemessen.
Abb. 4b: Substratspezifität von Granzym K der Maus (mgzmK). Es wurden
jeweils 0.1 mM der Thiobenzylestersubstrate und jeweils 5 nM der Proform
(schwarz) und der konvertierten Form (schraffiert) eingesetzt. Die Substratumsetzung
wurde bei 405 nm und Raumtemperatur über 5 Minuten gemessen.
Abb. 4c: Substratspezifität von humanem Granzym M (hGzmM). Es wurden
jeweils 0.1 mM der Thiobenzylestersubstrate und jeweils 15 nM der Proform
(schwarz), der konvertierten Form (schraffiert) und der konvertierten S195A-Mutante
(grau) eingesetzt. Die Substratumsetzung wurde bei 405 nm und Raumtemperatur über
5 Minuten gemessen.
Abb. 5: cDNA-Sequenz von Granzym L
Abb. 6: Aminosäure-Sequenz von Granzym L
Claims (7)
1. Verfahren zur Herstellung (I) einer Serinprotease,
(II) einer katalytischen Domäne einer Serinprotease,
(III) einer enzymatisch inaktiven Variante von (I) oder (II) oder
(IV) einer sequenzmodifizierten Variante von (I) oder (II)
gleicher biologischer Funktionalität
in einem prokaryotischen Wirt, dadurch gekennzeichnet, dass
(II) einer katalytischen Domäne einer Serinprotease,
(III) einer enzymatisch inaktiven Variante von (I) oder (II) oder
(IV) einer sequenzmodifizierten Variante von (I) oder (II)
gleicher biologischer Funktionalität
in einem prokaryotischen Wirt, dadurch gekennzeichnet, dass
- a) die Serinprotease (I), die katalytische Serinprotease-Domäne (II), die enzymatisch inaktive Variante (III) oder die sequenzmodifizierte Variante (IV) mit einer Helfersequenz am N-Terminus als rekombinantes Protein exprimiert wird, wobei
- - die Helfersequenz ein Dipeptid mit der Dipeptidsequenz Met-Y ist und Y eine beliebige Aminosäure, ausgenommen Prolin, ist
- - oder die Helfersequenz ein Dipeptid mit der Dipeptidsequenz Met-Y ist und Y eine beliebige Aminosäure, ausgenommen Prolin, ist und C-terminal nachfolgend mindestens ein weiteres Exopeptidase spaltbares Dipeptid oder Vielfaches solcher Dipeptide in unterschiedlicher Kombination aufweist,
- a) das rekombinante Protein gemäß (a) renaturiert wird und
- b) die Helfersequenz des gemäß (b) erhaltenen Proteins durch eine oder mehrere Exopeptidase(n) abgespalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
eine oder mehr Dipeptidy
lexopeptidasen in Verfahrenschritt (c) verwendet wird/werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Dipeptidylexopepti
dase Cathepsin C ist.
4. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Serinprotease Leu
kozyten-Elastase, Proteinase-3, Komplementfaktor D, Azurozidin, Mastzell-
Chymase, Mastzell-Tryptase, ein Gewebe-Kallikrein, Cathepsin G oder ein Gran
zym ist.
5. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Granzym Granzym
A, B, K, M oder L ist.
6. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Granzym L die in
Abb. 5 dargestellte Nukleotidsequenz bzw. die in Abb. 6 dargestellte Aminosäure
sequenz umfasst.
7. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekenn
zeichnet, dass die Helfersequenz N-terminal von dem Dipeptid Met-Y
eine oder mehrere Aminosäure(n) Methionin aufweist.
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