DE60033141T2

DE60033141T2 - Verfahren zum entfernen von den n-terminalen alaninresten mit aeromonas aminopeptidase

Info

Publication number: DE60033141T2
Application number: DE60033141T
Authority: DE
Inventors: S. Jacob Ballwin TOU; W. Douglas Ballwin TAYLOR
Original assignee: Pharmacia LLC
Current assignee: Pharmacia LLC
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-26
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2020-04-27
Also published as: WO2000066761A3; EP1173572B1; BR0010187A; KR20020011399A; CA2370113A1; ES2280211T3; ATE352622T1; AU768111B2; AU4641500A; JP2002542835A; EP1173572A2; CN1353755A; WO2000066761A2; AR025156A1; ZA200108915B; MXPA01011057A; DE60033141D1

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Entfernen N-terminaler Alaninreste von rekombinanten Proteinen unter Verwendung einer Aminopeptidase, die von dem marinen Bakterium Aeromonas proteolytica stammt. Demgemäß kann Aeromonas-Aminopeptidase (AAP; E.C. 3.4.11.10) verwendet werden, um N-terminale Alanylreste z.B. von Derivaten von humanem Somatotropin (hST, humanes Wachstumshormon oder hGH), Schweine-Somatotropin (pST) und Rinder-Somatotropin (bST) zu entfernen, um Proteine bereitzustellen, die ihre nativen Aminosäuresequenzen haben. Die Enzymreaktionen können in freier Lösung durchgeführt werden, oder die AAP kann für Reaktionen, die in vitro durchgeführt werden, auf einen festen Träger immobilisiert sein. Ein effizientes Verfahren zum Umwandeln von z.B. Ala-hGH zu hGH umfasst die Expression von Ala-hGH in E. coli, Gewinnen von Einschlusskörpern, Solubilisierung und Rückfaltung in Detergens, Detergensentfernung durch Ultrafiltration, selektive Präzipitation, enzymatische Spaltung, gefolgt von zwei Säulenchromatographiestufen.
Rekombinante Proteine, die native Proteine nachahmen oder die gleiche Struktur haben wie diese, sind für die Verwendung in therapeutischen Anwendungen, als Bestandteile in Impfstoffen und diagnostischen Testkits und als Reagenzien für Struktur/Funktionsstudien hochgradig erwünscht. Säuger-, Bakterien- und Insektenzellen werden allgemein verwendet, um rekombinante Proteine für derartige Anwendungen zu exprimieren. Bakterielle Expressionssysteme werden jedoch häufig eingesetzt, wenn große Proteinmengen für experimentelle oder klinische Studien bzw. Untersuchungen benötigt werden, und das Protein dazu fähig ist, zu seiner ordnungsgemäßen Konformation zurückgefaltet zu werden. Bakterielle Systeme bieten insbesondere signifikante Kostenvorteile gegenüber anderen Expressionsvektorsystemen, wenn eukaryotische post-translationale Modifikationen (z.B. Glycosylierung) im endgültigen Proteinprodukt nicht erforderlich oder erwünscht sind.
In Bakterien, wie z.B. E. coli, exprimierte rekombinante Proteine werden häufig in unlöslichen Einschlusskörperchen sequestriert. Aus Einschlusskörperchen geerntete heterologe Proteine behalten oft einen zusätzlichen Aminosäurerest, wie z.B. Methionin, an ihrem Amino-Terminus bei. Dieser Methioninrest (codiert durch das ATG-Startcodon) liegt jedoch häufig nicht an nativen oder rekombinanten Proteinen vor, die von eukaryotischen Wirtszellen geerntet werden. Die Amino-Termini von vielen Proteinen, die im Cytoplasma von E. coli produziert werden, werden jedoch durch Enzyme, wie z.B. Methioninaminopeptidase (Ben Bassat et al., J. Bacteriol. 169: 751-757, 1987), prozessiert, so dass das Methionin bei der Expression gewöhnlicherweise vom N-Terminus abgespalten wird.
Die Aminosäurezusammensetzung von Proteintermini wird auf viele unterschiedliche Weisen verzerrt (Berezovsky et al., Protein Engineering 12(1): 23-30, 1999). Eine systematische Untersuchung von N-Exopeptidaseaktivitäten führte zu der Entdeckung der "N-Terminus-" oder "N-Ende-Regel": das N-terminale (f)Met wird abgespalten, wenn die nächste Aminosäure Ala, Cys, Gly, Pro, Ser, Thr oder Val ist. Wenn die nächste Aminosäure Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Ile, Leu, Lys oder Met ist, verbleibt das initiale (f)Met als die erste Aminosäure des reifen Proteins. Die Hydratationsradien der Aminosäure-Seitenketten wurden als physikalische Grundlage für diese Beobachtungen vorgeschlagen (Bachmain et al., Science, 234: 179-186, 1986; Varshavsky, Cell, 69: 725-735, 1992). Die Halbwertszeit eines Proteins (von 3 Minuten bis 20 Stunden) wird durch die chemische Struktur der N-terminalen Aminosäure dramatisch beeinflusst (Stewart et al., J. Biol. Chem., 270: 25-28, 1995; Griegoryev et al., J. Biol., Chem., 271: 28521-28532, 1996). Ortsspezifische bzw. ortsgerichtete Mutagenese wurde nachfolgend eingesetzt, um die "N-Ende-Regel" durch Überwachung der Lebensdauer rekombinanter Proteine, die geänderte N-terminale Aminosäuresequenzen enthalten, zu bestätigen (Varshavsky, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 12142-12149, 1996). Eine statistische Untersuchung der Aminosäuresequenzen an den Aminotermini von Proteinen legte nahe, dass Met- und Ala-Reste an der ersten Position überrepräsentiert sind, während an den Positionen +2 und +5 Thr bevorzugt ist (Berezovsky et al., Protein Engineering 12(1): 23-30, 1999). C-terminale Abweichungen ("C terminal biases") zeigen jedoch eine Bevorzugung von geladenen Aminosäuren und Cys-Resten (Berezovsky et al., Protein Engineering, 12(1): 23-30, 1999).
Rekombinante Proteine, die das N-terminale Methionin beibehalten, haben in einigen Fällen biologische Merkmale, die sich von der nativen Species, der das N-terminale Methionin fehlt, unterscheiden. Humanes Wachstumshormon, das sein N-terminales Methionin beibehält (Met-hHG), kann z.B. im Vergleich zu hGH, das aus natürlichen Quellen gereinigt wurde, oder rekombinantem hGH, das auf eine solche Weise hergestellt wird, dass es die gleiche Primärsequenz wie natives hGH aufweist (ohne ein N-terminates Methionin), die Induktion unerwünschter Antikörper fördern. Kostengünstige Verfahren zum Erzeugen rekombinanter Proteine, die die Struktur von nativen Proteinen nachahmen, sind häufig für therapeutische Anwendungen hochgradig erwünscht (Sandman et al., Bio/Technology 13:504-6 (1995)).
Ein Verfahren zum Herstellen nativer Proteine in Bakterien ist es, das gewünschte Protein als Teil eines größeren Fusionsproteins zu exprimieren, das eine Erkennungsstelle für eine Endoprotease enthält, die spezifisch stromaufwärts von dem Beginn der nativen Aminosäuresequenzen spaltet. Die Erkennungs- und Spaltungsstellen können jene sein, die von nativen Signalpeptidasen, die das Signalpeptid des N-terminalen Endes eines Proteins, das für die Abgabe an eine Membran oder für die Sekretion aus der Zelle targetiert ist, spezifisch abspalten, erkannt werden. In anderen Fällen können Erkennungs- und Spaltungsstellen in dem für ein Fusionsprotein codierenden Gen konstruiert werden, so dass das rekombinante Protein gegenüber anderen nicht-nativen Endoproteasen in vitro oder in vivo empfindlich ist. Der Blutgerinnungsfaktor Xa, Collagenase und das Enzym Enterokinase können beispielsweise verwendet werden, um verschiedene Fusionstags aus einer Vielfalt an Proteinen freizusetzen. Wirtschaftliche Überlegungen schließen jedoch im Allgemeinen die Verwendung von Endoproteasen in großem Maßstab für die pharmazeutische Verwendung aus.
Ein weiteres Verfahren zum Herstellen nativer Proteine in Bakterien ist es, das Enzym Methioninaminopeptidase (MAP) zum Prozessieren des N-terminalen Methionins von E. colistammenden rekombinanten Proteinen zu verwenden. Met-hGH kann z.B. mit MAP behandelt werden, um hGH zu erzeugen. Die US-Patente 4,870,017 und 5,013,662 beschreiben die Klonierung, Expression und Verwendung von E. coli-Methioninaminopeptidase zum Entfernen von Met von einer Vielfalt an Peptiden und von Met-IL-2. Die Fähigkeit, Aminosäuren aus einer Vielfalt an Peptidsubstraten freizusetzen, wurde untersucht, wobei entdeckt wurde, dass MAP nur N-terminales Methionin an Peptiden abspaltet, die wenigstens drei Aminosäuren lang sind. Die Natur der Aminosäuren an der zweiten und dritten Position scheint ebenfalls bedeutsam zu sein. Methionin wurde beispielsweise freigesetzt aus Met-Ala-Met; Met-Gly-Met, Met-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu (SEQ ID NO: 1), und Met-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Gln-Cys (SEQ ID NO: 2), aber, unter anderem, nicht aus Met-Phe-Gly, Met-Leu-Phe, Met-Met-Met. Aus Leu-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu (SEQ ID NO: 3), Ala-Pro-Thr-Ser-Ser- Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu (SEQ ID NO: 4), oder Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Gln-Cys (SEQ ID NO: 5) wurden keine Aminosäuren freigesetzt.
WO 84/02351 offenbart ein Verfahren zur Herstellung reifer (nativer) Proteine, wie z.B. humanem Wachstumshormon oder humanem Proinsulin, aus Fusionsproteinen unter Verwendung von Leucinaminopeptidase. Ein Fusionsprotein mit der Aminosäuresequenz (Y_m ... Y₂Y₁)-(Pro)_p-(X₁X₂ ... X_n), in der (Y_m ... Y₂Y₁)-(Pro)_p die Prosequenz ist und der Rest das reife Protein darstellt, m eine ganze Zahl größer als 2 ist, Y eine willkürlich gewählte Aminosäure ist, p 0 ist, wenn X₁ oder X₂ Pro ist, und 1, wenn X₁ oder X₂ von Pro verschieden ist, X eine willkürlich gewählte Aminosäure ist und n eine ganze Zahl größer oder gleich 4 ist, wird durch stufenweise Spaltung mit Aminopeptidase, die die Aminosäuren Y_m ... Y₂ entfernt, wenn p = 1 oder X₁ Pro ist, oder die Gruppen Y_m ... Y₂-Y₁ entfernt, wenn X₂ Pro ist, umgewandelt. Dann werden die zwei Aminosäuren Y₁-Pro in ein oder zwei Stufen auf eine an sich bekannte Weise abgespalten, wenn p=1, und Y₁ wird gleichermaßen alleine abgespalten, wenn X₁=Pro.
Die Europäische Patentanmeldung EP 0 204 527 A1 offenbart ein Verfahren zur Entfernung des N-terminalen Methionins von Proteinen der Formel H-Met-X-Pro-Y-OH, um ein Protein bereitzustellen, das durch die Formel H-X-Pro-Y-OH wiedergegeben wird, wobei X eine andere Aminosäure als Prolin ist und Y eine Peptidkette ist. Aminopeptidase M wurde bevorzugt, aber Leucinaminopeptidase, Aminopeptidase PO oder Aminopeptidase P könnten ebenfalls verwendet werden. Das N-terminale Methionin wurde von Derivaten von humanem Interleukin-2 und humanem Wachstumshormon entfernt.
Aeromonas-Aminopeptidase (AAP), eine aus dem marinen Bakterium Aeromonas proteolytica isolierte Exopeptidase, kann auch verwendet werden, um die Freisetzung N-terminaler Aminosäuren aus Peptiden und Proteinen zu erleichtern (Wilkes et al., Eur. J. Biochem. 34(3), 459-66, 1973). Die günstigste Sequenz ist X-//-Y-, wobei Y ein hydrophober Rest ist, bevorzugt eine aromatische Aminosäure, wie z.B. Phenylalanin. Hydrolyseempfindliche Reste umfassen alle hydrophoben, aromatischen und basischen Aminosäuren, plus Prolin. Selbst bei hohen Enzymkonzentrationen wurden Aspartyl-, Glutamyl- und Cysteinsäurereste nicht aus dem Aminoterminus von jeglichem untersuchten Substrat entfernt. Jedoch wurden Asparagin, Glutamin und aminoethyliertes Cystein aus Oligopeptidsubstraten freigesetzt. Glycin war allgemein gegenüber Hydrolyse resistent, wurde aber, abhängig von den benachbarten Resten, langsam aus manchen Substraten freigesetzt. Die Aktivität von AAP gegenüber Peptidsubstraten kann auch durch Ändern der Metall-Gegenionen, wie z.B. Cu²⁺ und Ni²⁺ für das freie AAP-Enzym, verstärkt werden (Prescott et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 114(2): 646-652, 1983). AAP ist ein Metalloenzym von 29,5 kDa, das zwei Disulfidbindungen enthält.
Das Europäische Patent 0 191 827 B1 und das US-Patent 5,763,215 beschreiben die sequenzielle Entfernung von N-terminalen Aminosäuren von Analoga eukaryotischer Proteine, die in einem fremden Wirt gebildet werden, durch die Anwendung von Aeromonas-Aminopeptidase. Wenn 8 mg Methionyl-humanes Wachstumhormon (Met-hGH) (gelöst in 1 mL 10 mM Na-Boratpuffer, pH 9,5) mit Aeromonas-Aminopeptidase (gelöst zu 0,4725 ng/mL in Tris-Puffer, pH 9,5) in einem Verhältnis von 900 zu 19 gemischt und bei 37°C inkubiert wurde, war die Methioninabspaltung in 15 Minuten vollständig. Die Abspaltung der neuen N-terminalen Aminosäure Leucin war nach 22 h geringfügig. Das N-terminale Methionin von Met-pST, Met-Interferon, Met-IGF-1, Met-Interleukin-2 (Met-IL-2) und Met-Apolipoprotein E wurde durch AAP entfernt. Aus reifer Superoxiddismutase wurde ein N-terminales Alanin jedoch nicht entfernt.
Es können auch kompliziertere Verfahren verwendet werden, um rekombinante Proteine mit einem nativen Aminoterminus zu erzeugen. Zum Beispiel beschreibt das US-Patent 5,783,413 die gleichzeitige oder sequenzielle Verwendung von (a) einer oder mehreren Aminopeptidasen, (b) Glutamincyclotransferase und (c) Pyroglutaminaminopeptidase zum Behandeln aminoterminal verlängerter Proteine der Formel NH₂-A-Glutamin-Protein-COOH, um ein gewünschtes natives Protein zu erzeugen. Die erste(n) Aminopeptidase(n) (ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Dipeptidylaminopeptidase I, Aeromonas-Aminopeptidase, Aminopeptidase P und Prolinaminopeptidase) katalysiert/katalysieren die Entfernung von Resten, die aminoterminal zu Glutamin sind. Die Glutamincyclotransferase katalysiert die Umwandlung des Glutamins zu Pyroglutamin, und die Pyroglutaminaminopeptidase katalysiert die Entfernung von Pyroglutamin, um das gewünschte Proteinprodukt zu erzeugen.
Die US-Patente 5,565,330 und 5,573,923 offenbaren Verfahren zur Entfernung von Dipeptiden vom Aminoterminus von Vorläuferpolypeptiden, umfassend Behandlung des Vorläufers mit Dipeptidylaminopeptidase (dDAP) aus dem Schleimpilz Dictostelium descoideum, die eine Masse von näherungsweise von 225 kDa und ein pH-Optimum von näherungsweise 3,5 hat. Vorläufer von Humaninsulin, Analoga von Humaninsulin und humanes Wachstumshormon, die Dipeptid-Verlängerungen enthielten, wurden durch dDAP prozessiert, wenn dDAP in freier Lösung war und wenn es auf einer geeigneten festen Trägeroberfläche immobilisiert war.
Effizientere Strategien zum Prozessieren von Aminosäuren am Aminoterminus von rekombinanten Proteinen sind wünschenswert, um die Kosten der Erzeugung therapeutischer Proteine, die die Struktur nativer Proteine nachahmen, zu verringern. Verfahren, die die Expressionslevel erhöhen oder die Produktaufarbeitung ("downstream processing") rekombinanter Proteine erleichtern, werden auch die Auswahl und die Entwicklung kleiner chemischer Moleküle und anderer Protein-basierter Moleküle, die für klinische Versuche in großem Maßstab bestimmt sind, beschleunigen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Entfernen eines N-terminalen Alanylrests von einem rekombinanten Protein, ausgewählt aus der Gruppe N-terminaler Ala-Derivate von humanem Wachstumshormon, humanem Somatotropin, Schweine-Somatotropin, Rinder-Somatotropin und humanem Gewebefaktor-Inhibitor ("human tissue factor pathway inhibitor"), umfassend Inkontaktbringen des rekombinanten Proteins mit immobilisierter Aeromonas-Aminopeptidase, um den Alanylrest abzuspalten und Gewinnen des resultierenden rekombinanten Proteins.
Das rekombinante Protein ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus humanem Wachstumshormon (hGH), Rindersomatotropin (bST), Schweine-Somatotropin (pST) und humanem Gewebefaktor-Inhibitor (TFPI). Bevorzugt ist das rekombinante Protein hGH.
Das Verfahren zum Inkontaktbringen wird bevorzugt bei einem pH von näherungsweise pH 7 bis näherungsweise pH 11 durchgeführt. Stärker bevorzugt wird das Verfahren zum Inkontaktbringen bei einem pH von näherungsweise pH 8 bis näherungsweise pH 10 durchgeführt. Es ist am stärksten bevorzugt, dass das Verfahren zum Inkontaktbringen bei einem pH von näherungsweise pH 8,0 bis näherungsweise pH 9,5 durchgeführt wird.
Das Verfahren zum Inkontaktbringen wird bevorzugt in Gegenwart eines Puffers durchgeführt, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Borat, CHES, Natriumbicarbonat, Natriumphosphat und Tris-HCl. Stärker bevorzugt ist der Puffer Borat, Phosphat oder Tris-HCl.
Das Verfahren zum Inkontaktbringen kann bevorzugt in einer Weise durchgeführt werden, worin die Aminopeptidase immobilisiert ist. Die Aminopeptidase ist bevorzugt auf einem Chromatographieharz, einer Chromatographieoberfläche oder einem Chromatographiegel immobilisiert.
Das rekombinante Protein wird bevorzugt durch eine Säule passiert bzw. geführt, die die Aminopeptidase, immobilisiert auf einem Chromatographieharz, enthält.
Alternativ kann das Verfahren zum Inkontaktbringen durchgeführt werden, wobei die Aminopeptidase nicht immobilisiert ist (z.B. in freier Lösung).
Es ist auch denkbar, dass Aeromonas-Aminopeptidase das Prozessieren von Proteinen erlauben kann, die zwei oder mehr eng beabstandete Alanylreste in den N-terminalen Regionen von Polypeptiden enthalten. Die Aminopeptidase kann sequenziell bzw. schrittweise vom N-Terminus des Polypeptids voranschreiten oder möglicherweise weitere Alaninreste innerhalb einer kurzen Distanz exponierter N-terminaler Polypeptidreste erkennen. Die Aufklärung einer Consensus-Sequenz für die Alanyl-spezifischen Erkennungs- und Spaltungsstellen kann an einer Vielfalt an Protein- und Peptidsubstraten evaluiert werden.
Aeromonas-Aminopeptidase kann auch das Prozessieren von Nicht-Alanylresten von Proteinen unter den in dieser Anmeldung offenbarten Bedingungen erleichtern. Die Aufklärung einer Consensus-Sequenz für die Erkennung und Spaltung dieser Stellen kann an einer Vielfalt an Protein- und Peptidsubstraten evaluiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Entfernen Aminoterminaler Aminosäuren von einem Vorläuferpeptid der Formel X-Y-Pro-Z mit Aeromonas-Aminopeptidase, um ein Polypeptid der Formel Y-Pro-Z bereitzustellen, zu beschreiben, wobei X ein oder mehrere Aminosäuren außer Prolin ist, Y eine beliebige Aminosäure außer Prolin ist und Z eine oder mehrere Aminosäuren ist.
X ist bevorzugt Alanin.
Y ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Phenylalanin, Methionin, Threonin und Asparaginsäure. Stärker bevorzugt ist Y Phenylalanin.
Am stärksten bevorzugt ist X Alanin und Y Phenylalanin.
Das Vorläuferpolypeptid ist bevorzugt Ala-hGH.
Das Folgende ist eine Liste von Abkürzungen und den entsprechenden Bedeutungen, wie sie hierin austauschbar verwendet werden:

g: = Gramm
HPLC: = Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
kb: = Kilobase(n)
mb: = Megabase(n)
mg: = Milligramm
ml, mL: = Milliliter
RP-HPLC: = Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
ug, μg: = Mikrogramm
ul, uL, μl, μL: = Mikroliter

Das Folgende ist eine Liste von Definitionen verschiedener Begriffe und den entsprechenden Bedeutungen, wie sie hierin austauschbar verwendet werden:
Die Begriffe "aap" und "AAP" bedeuten Aeromonas-Aminopeptidase.
Die Begriffe "ap" und "AP" bedeuten Aminopeptidase.
Der Begriff "Aminosäure(n)" bedeutet alle natürlich vorkommenden L-Aminosäuren, einschließlich Norleucin, Norvalin, Homocystein und Ornithin.
Der Begriff "Fusionsmolekül" meint ein Protein-codierendes Molekül oder Fragment davon, das bei Expression ein Fusionsprotein erzeugt.
Der Begriff "Fusionsprotein" bedeutet ein Protein oder Fragment davon, das ein oder mehrere zusätzliche Peptidregionen umfasst, die nicht von diesem Protein stammen bzw. abgeleitet sind.
Der Begriff "Promotor" wird in einem weiten Sinn verwendet, um die Regulatorsequenz(en) zu bezeichnen, die die mRNA-Produktion kontrollieren.
Der Begriff "Proteinfragment" bedeutet ein Peptid- oder Polypeptidmolekül, dessen Aminosäuresequenz eine Teilmenge der Aminosäuresequenz dieses Proteins umfasst.
Der Begriff "Proteinmolekül/Peptidmolekül" bedeutet jedes beliebige Molekül, das fünf oder mehr Aminosäuren umfasst.
Der Begriff "rekombinant" bedeutet jedes beliebige Agens (z.B. DNA, Peptid, usw.), das, allerdings indirekt, eine humane Manipulation eines Nucleinsäuremoleküls ist oder daraus resultiert.
Der Begriff "spezifisch binden" bedeutet, dass die Bindung eines Antikörpers oder Peptids durch die Gegenwart nicht-verwandter Moleküle nicht kompetitiv inhibiert wird.
Der Begriff "im Wesentlichen gereinigt" bedeutet, dass ein oder mehrere Moleküle, die in einer natürlich vorkommenden Zubereitung, die das Zielmolekül enthält, entfernt oder in der Konzentration verringert worden sind.
1- Struktur von Ala-hGH und hGH
Humanes Wachstumshormon (rechts) ist ein Einzelketten-Polypeptid (22 kDa) mit vier Cysteinresten, die in zwei Disulfidbrücken beteiligt sind. Die korrekte N-terminale Sequenz kann durch die enzymatische Spaltung von Ala-hGH (links) mit Aeromonas-Aminopeptidase in vitro erzielt werden.
2 – Verfahren zur Herstellung von hGH aus Ala-hGH
Ein allgemeines Verfahren für die Reinigung von hGH aus Ala-hGH umfasst Reinigung von Ala-hGH aus bakteriellen Einschlusskörperchen, Rückfaltung von Ala-hGH in Detergens, Detergensentferung, Säurepräzipitation, Behandlung mit Aminopeptidase und Reinigung des nativen hGH durch Kationen- und Anionenaustauschsäulenchromatographie.
3 – Kinetiken der Entfernung von Ala von Ala-hGH durch AAP
Die Kinetiken der Entfernung von Ala von Ala-hGH durch AAP sind in 3 dargestellt. Ala-hGH lag bei 3 mg/ml vor, und AAP lag bei 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 und 4,0 Units/ml in dem Gesamtvolumen von 6 ml vor. Die Reaktionen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, und Proben wurden bis 25 Stunden genommen und die Produkte wurden durch ES/MS untersucht. Die meisten der Reaktionen bei den drei höchsten Konzentrationen an AAP waren bei 6 Stunden vollständig.
4 – Optionen des enzymatischen Spaltungsverfahrens – Säulenmodus
Ein schematischer Vergleich von Spaltungsverfahren mit stationärer Strömung und Strömungskontinuum ist illustriert.
5 – Chargenmodus-Spaltung von Ala-hGH
5 illustriert einen Zeitverlauf der verstärkten Spaltung von Ala-hGH durch Cu-AAP im Vergleich zu Zn-AAP im Chargenmodus.
6 – Rezirkulationsmodus-Spaltung von Ala-hGH
6 illustriert einen Zeitverlauf von Ala-hGH durch Cu-AAP im Vergleich zu Zn-AAP, ausgeführt im Säulenrezirkulationsmodus.
7 – Spaltungseffizienz, analysiert durch HPLC
7 illustriert HPLC-Profile von Ala-hGH vor Spaltung mit AAP, unvollständige Spaltung und nachdem die Spaltung abgeschlossen ist.
8 – Produktvergleich durch RP-HPLC
8 illustriert das HPLC-Profil von hGH, hergestellt durch Behandeln von Ala-hGH mit AAP und zwei handelsübliche Zubereitungen von hGH (Humatrope und Zomacton).
9 – Produkte von mit AAP behandeltem Ala-hGH, analysiert durch tryptisches Mapping bzw. tryptische Kartierung
9-12 illustrieren typische tryptische Map-Profile. 9 illustriert die Profilaufzeichnungen, die die Mobilitätsunterschiede des Ala-T1-Peptids im Vergleich zum T1-Peptid illustrieren.
10 – Quantitative Analyse von verbleibendem Ala-hGH in hGH durch tryptischen Verdau
10 zeigt eine vertikal aufgeweitete Profilaufzeichnung, die die Unterschiede der Peakflächen unter den Elutionspositionen für Ala-T1 und T1 illustriert.
11- Produktvergleich durch tryptische Kartierung
11 illustriert die tryptischen Maps bzw. Karten von hGH, das nach Behandlung von Ala-hGH mit AAP gereinigt wurde, im Vergleich zu tryptischen Karten von hGH aus kommerziellen Quellen (Humatrope und Zomacton).
12 – Verbleibende Konzentrationen von Ala-hGH im Endprodukt durch tryptische Kartierung
12 zeigt eine vertikal aufgeweitete Profilaufzeichnung, die das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Ala-T1 in einer rohen Zubereitung von hGH, der endgültigen Massenzubereitung von hGH und hGH aus zwei kommerziellen Quellen (Humatrope und Zomacton) illustriert.
13 – Spaltungseffizienz, analysiert durch ES/MS
13 illustriert ES/MS-Profile von Ala-hGH vor Spaltung mit AAP, unvollständige Spaltung und nachdem die Reaktion abgeschlossen ist. 8 illustriert das HPLC-Profil von hGH, das durch Behandeln von Ala-hGH mit AAP hergestellt wurde, und zwei kommerziellen Zubereitungen von hGH (Humatrope und Zomacton).
14 – Produktanalyse durch RP-HPLC, SE-HPLC und ES/MS
14 illustriert ein überlagertes ES/MS-Profil von Ala-hGH und hGH (unteres Feld) zusammen mit HPLC-Aufzeichnungen des an RP-HPLC- und SE-HPLC-Säulen aufgetrennten Endprodukts.
15 – Durch N-terminale Sequenzierung analysiertes Produkt
15 illustriert Aufzeichnungen der Produkte, die nach Zyklus 1 und Zyklus 2 aus einem automatisierten Proteinsequenzierungsgerät freigesetzt wurden. Phenylalanin (18,3 min) ist der einzige signifikante Rest, der nach einem Zyklus detektiert wurde (linkes Feld). Prolin (14,2 min) ist der einzige signifikante Rest, der in Zyklus 2 detektiert wurde. Die Menge an Alanin (*) ist in beiden Zyklen vernachlässigbar, was auf das Fehlen N-terminaler Alaninreste in dem gereinigten Endprodukt hinweist.
Die folgenden Beispiele werden die Erfindung detaillierter erläutern, obwohl verstanden wird, dass die Erfindung durch diese spezifischen Beispiele nicht beschränkt wird.
Allgemeine Verfahren
Allgemeine Verfahren zum Klonieren, Exprimieren und Charakterisieren von Proteinen werden in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 und den darin zitierten Literaturverweisen, hierin durch Literaturverweis aufgenommen; und in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, und darin zitierten Literaturverweisen, hierin durch Literaturverweis aufgenommen, gefunden. Allgemeine und spezifische Bedingungen und Verfahrensweisen für die Konstruktion, Manipulation und Isolation von Antikörpern sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (siehe z.B. Harlow und Lane, In Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1988)).
Reagenzien
Aeromonas-Aminopeptidase und alle Spezialchemikalien wurden, sofern nicht anders angegeben, von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) erhalten.
Humatrope wurde von Eli Lilly erhalten. Zomacton wurde von Gentechnisch erhalten.
Proteinreinigung
Die Proteinreinigung kann bewerkstelligt werden, indem beliebige einer Vielfalt von chromatographischen Verfahren angewendet werden, wie z.B. Ionenaustausch-, Gelfitration-, hydrophobe Chromatographie oder Umkehrphasen-HPLC. Diese und andere Proteinreinigungsverfahren sind im Detail beschrieben in Methods in Enzymology, Band 182, "Guide to Protein Purification", herausgegeben von Murray Deutscher, Academic Press, San Diego, Kalifornien, 1990. Gefaltete Proteine können auch unter Verwendung von Affinitätsreagenzien, wie z.B. monoklonalen Antikörpern, oder Rezeptor-Untereinheiten, die an eine geeignete Matrix gebunden sind, affinitätsgereinigt werden.
Gereinigte Proteine können mittels RP-HPLC, Elektrospray-Massenspektrometrie und SDS-PAGE analysiert werden. Proteinquantifizierung wird durch Aminosäurezusammensetzung, RP-HPLC und Bradford-Proteinbestimmungstechniken bewerkstelligt. Tryptisches Peptidmapping bzw. tryptische Peptidkartierung, durchgeführt in Verbindung mit Elektrospray-Massenspektrometrie, kann auch verwendet werden, um die Identität von Proteinen zu bestätigen.
Beispiel 1: Herstellung von Alanyl-humanem Wachstumshormon (Ala-hGH)
Ala-hGH (1) wurde in E. coli exprimiert, wobei das mini-Mu-basierte chromosomale Expressionssystem (Weinberg et al., Gene 126: 25-33, 1993, US-Patente 5,395,763 und 5,514,483; US-Patentanmeldung 09/044,369, eingereicht am 19. März 1998, hierin jeweils durch Literaturverweis spezifisch aufgenommen) verwendet wurde. Ala-hGH wurde in Konzentrationen von näherungsweise 1,5 bis näherungsweise 2,0 g/Liter exprimiert.
Ala-hGH wurde gereinigt, rückgefaltet und bis zu einer Reinheit von >90 %, basierend auf der Analyse von Ala-hGH (durch RP-HPLC) und Gesamtproteinkonzentration (durch Absorption bei A₂₈₀), prozessiert bzw. bearbeitet. Kurz gesagt, wurden Einschlusskörperchen isoliert und Ala-hGH wurde unter Anwendung von früher beschriebenen Verfahren (WO 98/29433) gereinigt und rückgefaltet. Die Rückfaltung wurde üblicherweise mit einer Ausbeute von >85 % bei pH 10 unter Verwendung von Acylglutamat als Detergens erreicht. Das Detergens wurde durch erschöpfende Ultrafiltration (10 TOVs) gegen pH 10-Wasser aus dem Rückfaltungsgemisch entfernt. Darauf folgte eine Säurepräzipitationsstufe, um die meisten der rekombinanten E. coli-Proteine zu entfernen. Die durchschnittliche Wiedergewinnung von Ala-hGH aus dieser Präzipitationsstufe war ~80-85 %. Dieses halbgereinigte Ala-hGH wurde gegen den Spaltungspuffer (10 mM Phosphat, pH 8,0) diafiltriert, bevor es mit dem Enzym, bevorzugt in einem immobilisierten Modus, behandelt wurde. Nach der enzymatischen Spaltungsstufe wurde hGH durch Ionenaustauschchromatographie zu einem Massenpulver ("bulk powder") gereinigt. Ein allgemeines Verfahrensschema ist in 2 illustriert.
Beispiel 2: In vitro-Prozessierung von Ala-humanem Wachstumshormon (Ala-hGH) mit Aeromonas-Aminopeptidase in freier Lösung (Referenzbeispiel)
Vor der Spaltungsstufe wurde Ala-hGH auf eine Konzentration von 3 mg pro ml in 10 mM Borat, pH 9,5, eingestellt. Dazu wurde Aeromonas-Aminopeptidase in 3 Units pro ml zugegeben und die Reaktion wurde für 24-36 Stunden bei Umgebungstemperatur oder bei einer kürzeren Zeit bei 37°C fortschreiten gelassen. Der Fortschritt der Spaltungsreaktion kann durch RP-HPLC oder durch Aminosäureanalyse der Freisetzung von Alanin aus Ala-hGH überwacht werden. Am Ende der Reaktion wurde die Lösung durch Zugeben von 2 % Essigsäure (1:1,5-Verdünnung G/G) gelöscht bzw. gequencht.
Die Kinetiken der Entfernung von Ala bzw. aus Ala-hGH durch AAP sind in 3 illustriert. Ala-hGH war mit 3 mg/ml vorhanden, und AAP war mit 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 und 4,0 Units/ml in einem Gesamtvolumen von 6 ml vorhanden. Die Reaktionen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, und Proben wurden bis zu 25 Stunden genommen und die Produkte durch ES/MS analysiert. Die meisten der Reaktionen bei den drei höchsten Konzentrationen an AAP waren bei 6 Stunden abgeschlossen.
Beispiel 3: In vitro-Prozessierung von Ala-humanem Wachstumshormon (Ala-hGH) unter Verwendung immobilisierter Aminopeptidase
Herstellung von immobilisierter Aminopeptidase
Aeromonas-Aminopeptidase (AAP) wurde über die Bromcyan-(CNBr)Chemie auf Harze, wie z.B. Sepharose 4B-Harz, gekuppelt. Handelsübliches CNBr-aktiviertes Sepharose 4B-Harz wurde ausgiebig mit kaltem Wasser gewaschen und dann in 0,1 M Natriumcarbonatpuffer, pH 8,5, oder 10 mM Phosphat, pH 8, suspendiert. AAP wurde zugegeben (100 Units pro Gramm Harz), und das Gemisch wurde bei 4°C über Nacht sanft gerührt. Nach Waschen mit Wasser wurde das Harz mit Ethanolamin (0,5-1 M) bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gecapped ("capped"). Das Harz wurde dann mit Wasser gewaschen und mit dem Enzymspaltungspuffer, z.B. 10 mM Phosphat, pH 8, äquilibriert. Die Aktivität dieses immobilisierten Enzyms wurde durch den von Sigma vorgeschlagenen Standardassay gemessen, wobei L-Leucin-p-nitroanilid als Substrat verwendet wurde. Die durchschnittliche Aktivität betrug typischerweise 10-20 Units pro ml Harzbett.
In vitro-Spaltung von Ala-humanem Wachstumshormon (hGH) Chargenmodus:
Immobilisierte Aminopeptidase wurde als 1:1-Gemisch in Borat- oder Phosphatpuffer suspendiert. Zu einem 7-ml-Röhrchen, das 5 ml Ala-hGH in Phosphat- oder Boratpuffer enthielt, wurde ein ml Harz zugegeben. Dies ergab ein Gesamtvolumen von 6 ml mit einer Proteinkonzentration von 3 mg/ml. Das Gemisch wurde 10-24 Stunden lang bei 20-40°C geschüttelt. Am Ende der Reaktion wurde das Harz abfiltriert, und die resultierende Lösung wurde durch RP-HPLC analysiert. Die verbleibende Lösung wurde unter Verwendung einer CentriCon-Mikrofiltrationsvorrichtung zentrifugiert. Das Filtrat wurde mit dem Aminosäureanalysator auf die Freisetzung von Alanin untersucht. Das Retentat wurde 4-5 mal mit 2 % Essigsäure ausgetauscht, bevor es für die Massenspektrometrieanalyse zu einem Pulver getrocknet wurde.
Tabelle 1 illustriert die Wirkung von Temperatur auf die Chargenmodus-Spaltung von Ala-hGH unter Verwendung immobilisierter AAP. Die Reaktion ist bei Umgebungstemperatur beschleunigt und nach von 54 Stunden im Wesentlichen abgeschlossen.
Tabelle 1: Wirkung der Temperatur auf Chargenmodus-Spaltung von Ala-hGH unter Verwendung immobilisierter AAP
Zirkulationsmodus:
Ala-hGH in 10 mM Borat, pH 9,5, oder 10 mM Phosphat, pH 8,0, wurde auf einer Sepharose-Säule, die zuvor mit Aeromonas-Aminopeptidase immobilisiert worden war, zirkuliert. Das Volumen des Reservoirs bzw. der Vorlage liegt, abhängig von der Konzentration des Proteins, zwischen 100 ml und 700 ml. Typischerweise ist Ala-hGH in 5-10 mg pro ml. Die Flussrate liegt zwischen 2-4 ml pro Minute. Dies wurde bei 20°C für näherungsweise 24 Stunden durchgeführt. Die Reaktion wurde durch RP-HPLC überwacht.
Die Spaltungseffizienz wurde durch Massenspektrometrie und N-terminale Sequenzierung bestätigt. Das fertig gestellte Produkt wurde dann durch Ionenaustauschchromatographie weiter gereinigt.
Tabelle 2 illustriert die Wirkung der Flussrate auf die Spaltung von Ala-hGH unter Verwendung immobilisierter AAP bei 28°C im Rezirkulationsmodus. Kürzere Verweilzeiten waren im Allgemeinen mit höheren Konzentrationen an ungespaltenem Substrat verbunden. Tabelle 2: Zirkulationsmodus-Spaltung von Ala-hGH bei 28°C

* Das Experiment wurde bei 28°C in einem Säulenvolumen von 51 ml unter Verwendung von 10 mM Phosphat, pH 8, als Puffer und unter Verwendung von Ala-hGH: 8 mg/ml (HPLC) durchgeführt.

Tabelle 3 illustriert die Wirkung der Flussrate auf die Spaltung von Ala-hGH unter Verwendung immobilisierter AAP bei 20°C im Rezirkulationsmodus. Kürzere Verweilzeiten korrelierten direkt mit höheren Konzentrationen an ungespaltenem Substrat. Tabelle 3: Zirkulationsmodus-Spaltung von Ala-hGH bei 20°C

Das Experiment wurde bei 20°C mit einem Säulenvolumen von 51 ml in 10 mM Phosphatpuffer, pH 8, unter Verwendung von Ala-hGH: 8 mg/ml (HPLC) durchgeführt.
* Näherungsweise 1 % sind das Cysteinaddukt, das mit dem nicht-gespaltenen Ala-T1-Peptid co-eluierte.

Durchflussmodus:
Ala-hGH (8 mg/ml Konzentration) in 10 mM Borat, pH 9,5, oder 10 mM Phosphat, pH 8,0, wurde in eine Sepharose-Säule (Säulenvolumen beträgt 50 ml) eingeführt, die zuvor mit Aeromonas-Aminopeptidase immobilisiert worden war. Der Fluss bzw. die Flussrate wurde auf 15 ml pro Stunde eingestellt, so dass die Verweilzeit um 3 Stunden lag. Die Spaltungseffizienz wurde durch RP-HPLC, tryptischen Verdau, Massenspektrometrie oder N-terminale Sequenzierung bestätigt. Der Eluent wurde gesammelt und für nachgelagerte chromatographische Reinigung bearbeitet.
Tabelle 4 illustriert die Wirkung der Flussrate auf die Spaltung von Ala-hGH unter Verwendung von immobilisierter AAP bei 28°C im Durchflussmodus. Der größte Teil des Ala-hGH wurde unter diesen Bedingungen von AAP prozessiert. Tabelle 4. Durchflussmodus-Spaltung bei 28°C

* Alle tryptischen Daten basieren auf der Kombination aus ungespaltenem Ala-hGH und einer Prozessverunreinigung. Der wahre Werte des ungespaltenen Ala-hGH wird auf näherungsweise 50 % der angegebenen Werte geschätzt.

Beispiel 4: Vergleich von Spaltungsprozessen bzw. -verfahren mit stationärer Strömung bzw. Strömungskontinuum
Säulenmodus-Spaltung kann bei einer viel niedrigeren Flussrate in einem Durchgang bzw. in einer Passage durchgeführt werden, solange die insgesamte Verweilzeit eingehalten wird. Lauf #1 war ein typischer Lauf im Rezirkulationsmodus. Lauf #2 wurde bei 1/10 der Flussrate von Lauf #1 betrieben. Jedoch wurde der Lauf #2 mit 175 min pro Durchgang durchgeführt, im Vergleich zu 18 min pro Durchgang für Lauf #1. Die ingesamte Verweilzeit für beide Läufe ist näherungsweise die gleiche, ~ 180 Minuten. Die zwei Modi sind in 4 illustriert.
Tabelle 5: Wirkung der Flussrate auf die Aktivität
Tabelle 6 illustriert die Wirkung der Anzahl an Durchgängen auf die Spaltung von Ala-hGH unter Verwendung immobilisierter AAP bei 28°C im Rezirkulationsmodus. Der Hauptteil des Ala-hGH wurde unter Bedingungen durch AAP prozessiert. Tabelle 6: Rezirkulation bei 28°C im Phosphatpuffer

* [Ala-hGH] = 9,2 mg/ml; Beladung 500 ml

Tabelle 7 illustriert die Wirkung von Temperatur und Verweilzeit auf die Spaltung von Ala-hGH. Ein Temperaturunterschied von 10 Grad scheint die Spaltungseffizienz zu beeinträchtigen. Eine längere Verweilzeit kann erforderlich sein, wenn eine höhere prozentuale Spaltung erforderlich ist. Tabelle 7: Wirkung von Temperatur und Verweilzeit auf das Spaltungsverfahren mit stationärer Strömung:

* Die Spaltungsprodukte wurden durch das Peptidkartierungsverfahren analysiert.

Beispiel 5: Verstärkung der Alanyl-prozessierenden Aktivität von AAP mit Kupfer
Die Effekte der Ersetzung des nativen katalytischen Zn²⁺-Cofaktors von AAP durch substituiertes Cu²⁺- oder Ni²⁺ wurden im immobilisierten System für die in vitro-Prozessierung von Ala-hGH untersucht. Dieses Cu-AAP kann entweder direkt aus der AAP-Reinigungsprozessstufe hergestellt werden oder kann durch Ersetzen des Zink-Gegenmetalls, das im handelüblichen Material vorliegt, in die Kupfer-Species umgewandelt werden. Diese Umwandlung kann entweder als das freie Enzym oder als die immobilisierte Form erfolgen.
Immobilisierte Cu-AAP aus Zn-AAP-Sepharose:
Cu-AAP wurde immobilisiert, wie es oben stehend beschrieben ist. Eine Harzaufschlämmung (Probe A, 20 ml mit 10 ml Harzbettvolumen) wurde in einen 250-ml-Sinterglastrichter gegeben und unter Anwendung von Vakuum bis zur beinahen Trocknung abgesaugt. Dazu wurde 20 ml 50 mM Tricin/50 mM KCl, pH 7,5 und 20 mM 1,10-Phenanthrolin gegeben, und es wurde für 20 Minuten gemischt. Die Lösung wurde entfernt und in frischen Puffer gegeben, der 1,10-Phenanthrolin enthielt, und für weitere 2 Stunden gemischt. Der Puffer wurde entfernt, und die Harzaufschlämmung wurde mit Wasser und HEPES-Puffer, pH 7,5, gewaschen. Das resultierende Harz wurde auf zwei Röhrchen aufgeteilt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 12 ml. Zu B wurde 0,2 mM CuCl₂ in 50 mM HEPES, pH 7,5, zugegeben, und zu C wurde 0,2 mM ZnCl₂ in 50 mM HEPES, pH 7,5, zugegeben. Beide Röhrchen wurden 3 Stunden lang sanft geschüttelt. Die Aufschlämmungen wurden ausgiebig mit Wasser gewaschen und im gewünschten Puffer, wie z.B. Borat, pH 9,5, gelagert.
Tabelle 8: Aktivität von Metall-modifizierter AAP gegen Leu-pNA
Die Rate bzw. Geschwindigkeit der Ala-hGH-Spaltung durch Cu-AAP und Zn-AAP wurde sowohl im Chargen- als auch im Rezirkulationssäulenmodus verglichen. Im Chargenspaltungsversuch wurden 0,5 ml einer 1:1-Aufschlämmung von jedem Harz (B oder C) zu 2,056 ml 10 mM Borat-Puffer, pH 9,5, zugegeben, und zwar vor der Zugabe von Ala-hGH bis zu einer Endkonzentration von 0,8 mg/ml. Die Reaktionen wurden durch Sammlung von Proben, die durch Quenchen und Abfiltrieren des immobilisierten Enzyms durch 0,45 μm-Filter gestoppt wurden, über 24 Stunden verfolgt. Das Filtrat wurde dann durch RP-HPLC analysiert, um den Anteil an Ala-hGH zu bestimmen, der gespalten worden war.
Im Rezirkulationssäulenspaltungsversuch wurden Säulen mit den Abmessungen 1 cm × 5 cm gegossen, die entweder das Cu-AAP-Harz (B) oder das Kontroll-AAP-Harz (B) enthielten. Diese Säulen wurden mit 10 mM Phosphat äquilibriert und 50 ml 4,75 mg/ml Ala-hGH wurde bei 2 CV pro Stunde durch jede der Säulen rezirkuliert. Aliquote wurden gesammelt und wie oben bei 3 h, 6 h, 18 h und 28 h für die Untersuchung gequencht.
5 illustriert einen Zeitverlauf der verstärkten Spaltung von Ala-hGH durch Cu-AAP im Vergleich zu Zn-AAP im Chargenmodus. 6 illustriert einen Zeitverlauf von Ala-hGH durch Cu-AAP im Vergleich zu Zn-AAP, durchgeführt im Säulenrezirkulationsmodus.
Unter allen untersuchten Reaktionsbedingungen war Cu²⁺-substituierte AAP gegenüber Ala-hGH die aktivste (5 und 6), selbst wenn die Cu-AAP bei der Hydrolyse des chromogenen Substrats Leu-p-Nitroanilid (pNA) weniger aktiv ist (Tabelle 8).
Beispiel 6: Detaillierte Strukturanalyse des durch Behandlung von Ala-hGH mit Aeromonas-Aminopeptidase erzeugten Produkts
Reinigung von Ala-hGH
Auflösung/Rückfaltung:
Die Einschlusskörperchen-(IB)Aufschlämmung wurde zu einer vorgemischten Lösung, die 34,5 g Natriumbicarbonat, 156 g Aminosäure-(z.B. Sarcosin- und/oder Glutaminsäure-)basiertes Detergens und 826 ml Wasser enthielt, zugegeben. Die aufgelöste IB-Lösung wurde 20 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten, und es wurde Cysteinlösung (100 mM, pH 10,0) zugegeben. Die Lösung wurde vor Abkühlung auf 4°C 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Das fertig gestellte Rückfaltungsgemisch wurde dann auf 4 Liter konzentriert, bevor es gegen pH 10-Wasser diafiltriert wurde.
Säurepräzipitation:
Die diafiltrierte Lösung wurde mit pH 10,0-Wasser auf eine Ala-hGH-Konzentration von ~ 2,5 mg/ml verdünnt. Eine 2%ige Essigsäurelösung wurde unter Verwendung einer Peristaltikpumpe zugegeben, bis der pH ~5,6 bei 4-6°C erreicht hatte. Die angesäuerte Lösung wurde für weitere 30 Minuten gerührt. Die Lösung wurde dann bei 6000 U/min 30 Minuten lang unter Verwendung einer Zentrifuge vom Typ Sorvall RC5C bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und dann gegen 10 mM Natriumphosphat, pH 8,0, diafiltriert. Die Proteinkonzentration wurde dann auf 8 mg/ml eingestellt.
Enzymatische Spaltung:
Aeromonas-Aminopeptidase wurde über die Bromcyan-Chemie (Hermanson, 1992) auf Harzen, wie z.B. Sepharose 4B-Harz, gekuppelt. Die Aktivität dieses immobilisierten Enzyms wurde durch den Standardassay, wie er von Sigma vorgeschlagen wird, unter Verwendung von L-Leucin-p-nitroanilid (Leu-pNA) als Substrat gemessen. Kalte Ala-hGH-Lösung (8 mg/ml) in 10 mM Phosphat, pH 8,0 wurde durch eine Säule mit immobilisiertem Enzym, die mit einem Wassermantel ausgestattet war und bei 25°C gehalten wurde, passiert bzw. geleitet. Die Flussrate wurde auf ~ 8 ml/h eingestellt, um eine hinreichende Kontaktzeit zwischen Ala-hGH und dem immobilisierten Enzym sicherzustellen. Dann wurde der Puffer des Spaltungspools ("cleavage pool") gegen drei 3 M Harnstoff, 0,05 M Essigsäure, pH 5,0 (Puffer A), ausgetauscht, bevor auf die Kationensäule geladen wurde.
Kationensäule:
Die Kationenladung wurde in eine mit CM Sepharose-Harz gepackte Amicon-Säule, 2,2 × 20 cm, eingebracht. Die gesamte Säulenbeladung war 2,0 g Ala-hGH. Nach der Beladung wurde die Säule mit 1 CV (Säulenvolumen) Puffer A gewaschen, dann mit einem Salzgradienten von 0-0,2 M NaCl über insgesamt 54 CVs eluiert. Die Flussrate war 4 CV/Stunde. Der Säuleneluent wurde in 0,2 CV-Fraktionen gesammelt, und der Eluent wurde bei 280 nm mit einem Detektor vom Typ Gilson Holochrome überwacht. Die Fraktionen wurden durch Kationenaustausch-HPLC analysiert, und Fraktionen mit >95 % Reinheit wurden vereinigt bzw. gepoolt.
Anionensäule:
Der Kationenpool wurde auf eine Amicon-Säule, 1,6 × 20 cm, die mit Pharmacia Q-Sepharose-Harz gepackt war, geladen. Nach der Beladung wurde die Säule mit einem CV-Puffer A gewaschen. Ein linearer Gradient von 0-0,15 M NaCl in 0,05 M Tris-Cl, pH 7,5, erfolgte über 40 CV. Der Säuleneluent wurde wie oben gesammelt. Die Fraktionen wurden durch Anionenaustausch-HPLC analysiert und Fraktionen mit > 98 % Reinheit wurden vereinigt.
Strukturanalyse der Spaltungsprodukte
Das zweckdienlichste Verfahren für die Analyse einer Spaltungsreaktion ist das RP-HPLC-Verfahren. Die einzige verlässliche quantitative Analyse ist jedoch das Peptidverdauverfahren. In dem Verfahren ist die Detektionsgrenze für Ala-T1 0,25 %.
Aminosäureanalyse:
Nach der Spaltungsreaktion wurde die Lösung zentrifugiert, wobei ein Centricon mit einer Membran mit einer Trenngrenze von 10 kDa Molekulargewicht verwendet wurde. Die Alaninkonzentration in dem Filtrat kann durch einen Aminosäureanalysator gemessen werden. Der Spaltungsgrad kann dann durch die aus der Reaktion freigesetzte Menge an Alanin berechnet werden. Zusätzlich sollte jedoch jede andere detektierte Aminosäure ein Hinweis auf unspezifische Spaltung sein.
RP-HPLC-Analyse:
Ein isokratisches Verfahren unter Verwendung von N-Propanol(NPA)/0,25 M Phosphat, pH 6,5, (26:74) als mobiler Phase wurde zum Analysieren von Ala-hGH und hGH an einer Säule vom Typ Vydac 114ATP54 verwendet. Die Trennung wurde bei 40°C durchgeführt. Dieses Verfahren wurde hauptsächlich zum Überwachen der Bildung von hGH über enzymatische Spaltung von Ala-hGH verwendet. Es diente auch als zweites Werkzeug beim Entscheiden, welche Fraktionen aus einer Kationenaustauschsäule zusammen waren.
Die 7 und 8 illustrieren typische HPLC-Profile. 7 illustriert HPLC-Profile von Ala-hGH vor der Spaltung mit AAP, unvollständige Spaltung und nachdem die Reaktion vollständig ist. 8 illustriert das HPLC-Profil von hGH, das durch Behandlung von Ala-hGH mit AAP hergestellt wurde, und von zwei handelsüblichen Zubereitungen von hGH (Humatrope und Zomacton).
Peptdd-Mapping unter Verwendung von Trypsin:
Eine Lösung von hGH wurde mit 0,5 N NaOH auf pH 7,5 eingestellt. Diese Lösung wurde mit Tris-Base (50 mM, pH 7,5) verdünnt, so dass die Endkonzentration 2 mg/ml war. Dann wurden 15 mL Trypsinlösung (1 mg/mL in 50 mM Tris-Base, pH 7,5) zugegeben. Die Probe wurde gemischt und 4 Stunden lang bei 37°C inkubiert, dann mit 50 mL HCl (0,5 M) gequencht. Ein Aliquot der verdauten Lösung wurde in die RP-HPLC injiziert, und die Peptide wurden durch einen Acetonitrilgradienten mit 0,1 % TFA aufgetrennt.
Dieses Verfahren stellt Information für die Bewertung der Primär- und Sekundärstrukturintegrität von hGH bereit. Am wichtigsten ist, dass dies das beste Verfahren zum Analysieren von Spuren-Konzentrationen an ungespaltenem Ala-hGH in der Spaltungsreaktion und im Endprodukt ist. Der einzige Unterschied zwischen dem tryptischen Verdauen von hGH und Ala-hGH ist das N-terminale Octapeptid, T1 vs. Ala-T1. Diese zwei Peptide werden unter Verwendung eines isokratischen RP-HPLC-Verfahrens Grundlinien-aufgelöst.
T1: FPTIPLSR (SEQ ID NO: 6)
Ala-T1: AFPTIPLSR (SEQ ID NO: 7)
Die 9-12 illustrieren typische tryptische Kartierungsprofile. 9 illustriert die Profile bzw. Profilaufzeichnungen, die die Mobilitätsunterschiede des Ala-T1-Peptids im Vergleich zum T1-Peptid illustrieren. 10 zeigt ein vertikal aufgeweitetes Profil, das die Unterschiede der Peakflächen unter den Elutionspositionen für Ala-T1 und T1 illustriert. 11 illustriert die tryptischen Karten bzw. Maps von hGH, das nach Behandlung von Ala-hGH mit AAP gereinigt wurde, im Vergleich zu tryptischen Karten von hGH aus kommerziellen Quellen (Humatrope und Zomacton). 12 zeigt ein vertikal aufgeweitetes Profil, das das Vorhandensein oder Fehlen von Ala-T1 in einer rohen Zubereitung von hGH, der endgültigen Massenzubereitung von hGH und hGH aus zwei kommerziellen Quellen (Humatrope und Zomacton) zeigt.
Elektrospray-Massenspektrometrie (ES/MS):
Die Messung basiert auf der Peakintensität für hGH (22,125) und Ala-hGH (22,195). Das Vorliegen anderer Peaks zeigt eine unspezifische enzymatische Spaltung an.
13 illustriert ES/MS-Profile von Ala-hGH vor der Spaltung mit AAP, unvollständige Spaltung und nachdem die Reaktion abgeschlossen ist. 8 illustriert die HPLC-Profile von hGH, das durch Behandeln von Ala-hGH mit AAP hergestellt wurde, und zwei kommerziellen Zubereitungen von hGH (Humatrope und Zomacton).
14 illustriert ein überlagertes ES/MS-Profil von Ala-hGH und hGH (unteres Feld) zusammen mit HPLC-Aufzeichnungen bzw. Profilen des Endprodukts, aufgelöst an RP-HPLC- und SE-HPLC-Säulen.
N-terminale Sequenzierung:
Die N-terminale Proteinsequenzierung wurde mittels Standardverfahren durchgeführt. Die relativen Mengen an Ala (vorhanden in Ala-hGH) und Phe (in hGH) als die N-terminale Aminosäure weisen auf den Spaltungsgrad hin. Durch N-terminale Sequenzanalyse kann auch eine interne Spaltung detektiert werden.
15 illustriert Aufzeichnungen der nach Zyklus 1 und Zyklus 2 aus einem automatisierten Proteinsequenzierungsgerät freigesetzten Produkte. Phenylalanin (18,3 min) ist der einzige signifikante Rest, der nach einem Zyklus detektiert wurde (linkes Feld). Prolin (14,2 min) ist der einzige signifikante Rest, der in Zyklus 2 detektiert wurde. Die Menge an Alanin (*) ist in beiden Zyklen vernachlässigbar, was auf ein Fehlen N-terminaler Alaninreste in den gereinigten Endprodukten hinweist.
Beispiel 7: In vitro-Prozessierung von Alanyl-Gewebefaktorinbibitor (Ala-TFPI) unter Verwendung von Aminopeptidase:
Ala-TFPI, isoliert aus E. coli ( US 5,212,091 ) kann unter Verwendung von AAP in Lösung zu TFPI prozessiert werden. Einwandfrei rückgefaltetes Ala-TFPI wird auf eine Konzentration von 0,5-3 mg pro ml in 10 mM Phosphat, pH 8,0, oder 10 mM Borat, pH 9,5, eingestellt. Dazu wird Aeromonas-Aminopeptidase zu einer Konzentration von 3 Units pro ml zugegeben und die Reaktion wird 24-36 Stunden lang bei Raumtemperatur und für eine kürze Zeit bei 37°C fortschreiten gelassen. Der Fortschritt der Spaltungsreaktion kann durch ein HPLC-Verfahren oder durch Aminosäureanalyse der Freisetzung von Alanin von bzw. aus Ala-TFPI überwacht werden. Am Ende der Reaktion wird die Lösung durch Zugeben von 2 % Essigsäure (Verdünnung 1:1,5 G/G) gequencht. Der Grad der Spaltung wird durch HPLC-Analyse der tryptischen Peptidfragmente und durch ES/MS des isolierten Produkts bestimmt.
Ala-TFPI kann auch unter Verwendung einer immobilisierten AAP, wie es oben beschrieben ist, zu TFPI prozessiert werden. Der Grad der Spaltung wird durch HPLC-Analyse der tryptischen Peptidfragmente und durch ES/MS des isolierten Produkts bestimmt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Entfernen eines N-terminalen Alanylrests von einem rekombinanten Protein, ausgewählt aus der Gruppe N-terminaler Ala-Derivate von humanem Wachstumshormon, humanem Somatotropin, Schweine-Somatotropin, Rinder-Somatotropin und humanem Gewebefaktor-Inhibitor („human tissue factor pathway inhibitor"), umfassend Inkontaktbringen des rekombinanten Proteins mit immobilisierter Aeromonas-Aminopeptidase um den Alanylrest abzuspalten und Gewinnen des resultierenden rekombinanten Proteins.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Alanylrest für das Protein nicht-nativ ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Inkontaktbringen bei einem pH von pH 7 bis pH 11 durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Aminopeptidase auf einem festen Träger immobilisiert ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Chromatographieharz, Chromatographieoberfläche und Chromatographiegel.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Protein, das mit der Aminopeptidase in Kontakt gebracht wird, rezirkuliert wird, so dass das Protein wenigstens ein weiteres Mal mit der Aminopeptidase in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Inkontaktbringen bei einer Temperatur von 20°C bis näherungsweise 40°C geschieht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei ein nativer katalytischer Zn2+-Cofaktor der Aminopeptidase durch ein Kation, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cu²⁺ und Ni²⁺, ersetzt wird.
Verfahren zum Entfernen aminoterminaler Alanylreste von einem Vorläuferprotein der Formel X-Y-Pro-Z mit Aeromonas-Aminopeptidase, um ein Protein der Formel Y-Pro-Z bereitzustellen, wobei X Alanyl ist, Y eine beliebige Aminosäure außer Prolin ist und Z eine oder mehrere Aminosäuren ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Phenylalanin, Methionin, Threonin und Asparaginsäure.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei Y Phenylalanin ist.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei das Vorläuferprotein ein N-terminales Ala-Derivat von humanem Wachstumshormon ist.