PL206286B1 - Komórka Gram-ujemnej bakterii, sposób wytwarzania heterologicznego peptydu, sposób zapobiegania odcinaniu N-końcowego aminokwasu, sposób odcinania N-końcowego aminokwasu i sposób wytwarzania skróconego polipeptydu - Google Patents

Description

Opis wynalazku

1. Dziedzina wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest komórka Gram-ujemnej bakterii, sposób wytwarzania heterologicznego peptydu, sposób zapobiegania odcinaniu N-końcowego aminokwasu, sposób odcinania N-końcowego aminokwasu i sposób wytwarzania skróconego polipeptydu. W szczególności w wynalazku opisuje się bakteryjne aminopeptydazy. U podłoża wynalazku było stwierdzenie, że usunięcie lub nadekspresję ważnego enzymu z bakterii poprawia odzyskiwanie nie przeciętych lub też przeciętych (skróconych) wytworzonych w bakterii polipeptydów, takich jak zrekombinowane polipeptydy.

2. Stan techniki

Niektóre białka, wytwarzane w bakteriach Gram-ujemnych i archebakteriach takiej jak E. coli, mają odcinane N-końcowe aminokwasy na skutek obecności w tych komórkach aminopeptydaz. W efekcie, zanieczyszczenie ściśle związane z polipeptydem typu dzikiego jest wprowadzane do hodowli komórkowej albo jednocześnie z lizą albo po lizie komórki jako część procesu oczyszczania produktu. Zanieczyszczenie to musi być usunięte z polipeptydu typu dzikiego jeśli mają być przygotowane białka użyteczne terapeutycznie. Przykładem jest ludzki hormon wzrostu (hGH), który posiada swoją N-końcową resztę fenyloalaninową odciętą gdy jest wytworzany w E. coli. Ta postać wariantu hGH (des-phe hGH), wytworzona przy lizie komórki w postaci mieszaniny z hGH z nie odciętym końcem (naturalny hGH) jest trudna do usunięcia z tej mieszaniny. Takie usuwanie wymaga poddania mieszaniny chromatografii oddziaływań hydrofobowych. Byłoby pożądanym uniknięcie tego, dodatkowego etapu oczyszczania.

Ponadto, jest pożądane w niektórych przypadkach otrzymanie polipeptydów z odciętymi N-końcowymi resztami aminokwasowymi i powielenie ilości takich polipeptydów względem jego odpowiednika sekwencji naturalnej celem uzyskania czystego, przeciętego materiału.

Szereg znanych aminopeptydaz E. coli posiada szerokie spektrum specyficzności i może ciąć różne reszty przy aminokwasowych N-końcach, np. pepA, pepB i pepN (Escherichia coli i Salmonella,

Frederick C. Neidhardt (wyd.), ASM, Press, rozdział 62 z Charles Miller - Protein Degradation and Proteolytic Modyfication str. 938-954 (1996); Gonzales i Robert Baudouy, FEMS Microbiology Reviews. 18 (4) : 319-44 (1996). Gen yfck kodujący b2324 znaleziony w szczepie K12 E. coli został wymieniony jako „przypuszczalna peptydaza” w efekcie projektu sekwencjonowania genomu E. coli (Blattner i wsp., Science, 277: 1453-62 (1997)) w bazie danych GenBank (nr dostępu AE000321), lecz nie dostarczono dalszych informacji o aktywności tego enzymu. Homolog w szczepie E. coli 0157 : H7 jest identyczny z genem yfcK ze szczepu K12. Istnieje potrzeba zidentyfikowania bakteryjnych aminopeptydaz, którymi można manipulować dla uzyskania bardziej czystych, nie przeciętych lub przeciętych polipeptydaz.

3. Streszczenie wynalazku

Enzym b2324 kodowany przez yfcK zidentyfikowany został jako aminopeptydaza tj. enzym odpowiedzialny za odcinanie N-końca polipeptydów.

W jednej postaci, geny kodujące aminopeptydazy homologiczne z tym enzymem, włączając aminopeptydazę b2324 kodowaną przez gen yfcK są eliminowane ze szczepów bakterii Gram-ujemnych przez genetyczne uszkadzanie chromosomu, tak że przyczepione zanieczyszczenia nie są dłużej wytwarzane w znaczącym stopniu. Tym samym zostaje wyeliminowany dodatkowy etap oczyszczania w celu usunięcia przyczepionych zanieczyszceń. Stwierdzono, w przypadku co najmniej jednego otrzymanego szczepu, wytwarzanie polipeptydu bez przyłączeń w ilościach równych ze szczepami rodzicielskimi.

Przedmiotem wynalazku jest zatem komórka Gram-ujemnej bakterii, w której chromosomalny gen jest inaktywowany lub uszkodzony, przy czym gen ten ma co najmniej 80% identyczności sekwencji z (a) cząsteczką DNA kodującą naturalną sekwencję aminopeptydazy b2324 o sekwencji aminokwasowej od 1 do 688 z SEQ ID NO:2 lub (b) komplement cząsteczki DNA z (a) i kodujący aminopeptydazę.

Przedmiotem wynalazku jest również komórka Gram-ujemnej bakterii, w której chromosomalny gen jest inaktywowany lub uszkodzony, przy czym gen ten ma co najmniej 80% identyczności z sekwencją naturalną genu yfcK posiadającego sekwencję nukleotydową od 1 do 2067 z SEQ ID NO:1 i kodujący aminopeptydazę.

Komórką według wynalazku korzystnie może być Salmonella lub Enterobacteriaceae, bardziej korzystnie może być E. coli, ewentualnie z niedoborem co najmniej jednego genu kodującego proteazę.

Również korzystnie może to być komórka z niedoborem naturalnej sekwencji genu yfcK.

PL 206 286 B1

W innym korzystnym rozwiązaniu komórka według wynalazku zawiera kwas nukleinowy kodujący polipeptyd heterologiczny dla komórki. Bardziej korzystnie polipeptydem ty jest polipeptyd ssaczy. Może to być również jeszcze bardziej korzystnie polipeptyd ludzki. Najkorzystniej peptyd ten jest ludzkim hormonem wzrostu.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania heterologicznego peptydu obejmujący hodowanie komórki zdefiniowanej według wynalazku i następnie odzyskiwanie polipeptydu z komórki.

Sposób korzystnie realizuje się przez hodowlę, którą prowadzi się w fermentorze a polipeptyd jest odzyskiwany z peryplazmy lub pożywki hodowlanej komórki. Odzyskiwanie prowadzi się natomiast przez rozbicie komórek do postaci lizatu a niezmieniony polipeptyd oczyszcza się z lizatu.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku lizat inkubuje się przed etapem oczyszczenia.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób zapobiegania N-końcowemu odcinaniu aminokwasu od polipeptydu, polegający na tym, że hoduje się komórkę zdefiniowaną wyżej, przy czym komórka ta zawiera kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, w warunkach takich, że kwas nukleinowy ulega ekspresji. Korzystnie polipeptyd odzyskuje się z komórki.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób odcinania N-końcowego aminokwasu od peptydu wyizolowanego z komórki, polegający na tym, że kontaktuje się polipeptyd z aminopeptydazą kodowaną przez kwas nukleinowy o co najmniej 80% identyczności sekwencji z (a) cząsteczką DNA kodującą naturalną sekwencję aminopeptydazy b2324 o sekwencji reszt aminokwasowych od 1 do 688 z SEQ ID NO:2 lub (b) komplementu czą steczki DNA z (a).

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest również sposób odcinania N-końcowego aminokwasu z polipeptydu wyizolowanego z komórki, polegają cy na tym, ż e kontaktuje się polipeptyd z aminopeptydazą o mniej niż 80% identyczności sekwencji z naturalną sekwencję aminopeptydazy b2324 o sekwencji aminokwasowej od 1 do 688 z SEQ ID NO:2. W sposobie tym, korzystną realizacją jest gdy polipeptyd jest inkubowany z aminopeptydazą.

Bardziej korzystnie polipeptyd jest kontaktowany z naturalną sekwencją aminopeptydazy b2324.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania skróconego polipeptydu, polegający na tym, że hoduje się komórki bakterii Gram-ujemnych niosących kwas nukleinowy o przynajmniej 80% identyczności sekwencji z (a) cząsteczką DNA kodującą naturalną sekwencję aminopeptydazy b2324 o sekwencji aminokwasowej od 1 do 688 z SEQ ID NO:2 lub (b) komplement czą steczki DNA z (a) i kodujący aminopeptydazę, które to komórki zawierają kwas nukleinowy kodujący odpowiadający nie skrócony polipeptyd posiadający dodany na jego N-końcu aminokwas, przy czym hodowlę prowadzi się w warunkach takich, aby kwas nukleinowy kodujący aminopeptydazę b2324 uległ nadekspresji, aby zaszła ekspresja kwasu nukleinowego kodującego nie skrócony polipeptyd i jeśli nie skrócony polipeptyd i aminopeptydaza nie kontaktują się po ekspresji, to kontaktuje się ten nie skrócony polipeptyd z aminopeptydazą wytwarzając skrócony polipeptyd.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania skróconego polipeptydu, polegający na tym, że hoduje się komórki bakterii Gram-ujemnych niosących kwas nukleinowy o co najmniej 80% identyczności z naturalną sekwencją genu yfck posiadającego sekwencje nukleotydów od 1 do 2067 w SEQ ID NO:1 i kodującego aminopeptydazę , które to komórki zawierają kwas nukleinowy kodujący odpowiadający nie skrócony polipeptyd posiadający dodany na jego N-końcu aminokwas, przy czym hodowlę prowadzi się w warunkach takich, aby zaszła nadekspresja kwasu nukleinowego kodującego aminopeptydazę b2324 i aby zaszła ekspresja kwasu nukleinowego kodującego nie skrócony polipeptyd i jeśli ten nie skrócony polipeptyd i aminopeptydaza nie kontaktują się po ekspresji, kontaktuje się ten nie skrócony polipeptyd z aminopeptydazą wytwarzając skrócony polipeptyd.

W korzystnej odmianie tego sposobu hoduje się komórki E. coli niosące naturalną sekwencję genu yfcK i nie skrócony polipeptyd następnie kontaktuje się z naturalną sekwencją aminopeptydazy b2324. Korzystnie w sposobie tym polipeptyd jest heterologiczny dla komórek, a bardziej korzystnie polipeptyd ten jest polipeptydem ssaczym.

W sposób wedł ug wynalazku, korzystnie komórki są z niedoborem co najmniej jednego genu kodującego proteazę.

Kontaktowanie w sposobie według wynalazku prowadzi się przez inkubację.

W innym korzystnej realizacji tego sposobu wedł ug wynalazku kwas nukleinowy kodujący aminopeptydazę jest naturalnym dla komórek bakterii i jest on wprowadzony do komórek bakterii.

Sposób według wynalazku realizuje się tak, że hodowlę prowadzi się w fermentorze a nie skrócony polipeptyd odzyskuje się z komórek przed kontaktowaniem z aminopeptydazą. Odzyskiwanie polipeptydu korzystnie prowadzi się z periplazmy lub pożywki hodowlanej komórki.

PL 206 286 B1

Odzyskiwanie można również korzystnie prowadzić przez rozbicie komórki do postaci lizatu a skrócony peptyd jest oczyszczany z lizatu. Bardziej korzystnie lizat inkubuje się przed etapem oczyszczenia. Najbardziej korzystnie lizat inkubuje się przez co najmniej 1 godz. w 20-40°C.

W powyż szych sposobach dla wytwarzania skróconego polipeptydu, korzystne aspekty obejmują te, w których komórka jest z niedoborem przynajmniej jednego genu kodującego proteaze i/lub warunki hodowli są takie, że gen yfcK (naturalna sekwencja i homologi) jest nadeksprymowane i/lub kontaktowanie przez inkubację. Gen yfcK (naturalna sekwencja i homologi) może być naturalny dla komórek bakterii lub wprowadzony do komórek bakterii. Hodowlę korzystnie prowadzić można w fermentorze. Nie skrócony polipeptyd jest korzystnie odzyskany z komórek przed kontaktowaniem ich z aminopeptydazą, gdzie odzyskanie może być z peryplazmy lub pożywki hodowlanej komórek lub przez rozbicie komórek do postaci lizatu, z którego korzystnie oczyszczony jest polipeptyd. Lizat może również być inkubowany przed etapem czyszczenia. Korzystnie lizat jest inkubowany przez przynajmniej 1 godz., korzystniej około 2-50 godz. w około 20-40°C, korzystniej w około 30-40°C.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia wykres wyprowadzenia komórki E. coli 61G3, szczepu gospodarza z delecja yfcK (kodujący b2324).

Figura 2 przedstawia diagram procentowej powierzchni (chromatografia cieczowa/spektroskopia masowa; LC/MS) ekstrakcji rhGH ze szczepu kontrolnego 16C9 inkubowanego w temperaturze pokojowej przez 0, 15, 24 i 48 godzin z naturalnym hGH, des-fenyloalanina hGH i des-fenyloalaninaprolina hGH, gdzie ilości pokazano różnymi cieniami.

Figura 3 przedstawia diagram procentowej powierzchni (LC/MS) dla rhGH szczepu 61G3 posiadającego usunięty gen, inkubowanych w temperaturze pokojowej przez 0, 15, 24 i 48 godzin z naturalnym hGH, des-fenyloalanina hGH i des-fenyloalanina-prolina hGH, gdzie ilości pokazano różnymi cieniami.

Figura 4 przedstawia diagram procentowej powierzchni (chromatografia cieczowa/spektroskopia mas; LC/MS) dla rhGH ekstrakcji rhGH ze szczepu kontrolnego 16C9 inkubowanego w 37°C przez 0, 15, 24 i 48 godzin z naturalnym hGH, des-fenyloalanina hGH i des-fenyloalanina-prolina hGH, gdzie ilości pokazano różnymi cieniami.

Figura 5 przedstawia diagram procentowej powierzchni (LC/MS) dla rhGH szczepu 61G3 posiadającego usunięty gen, inkubowanych w 37°C przez 0, 15, 24 i 48 godzin z naturalnym hGH, des-fenyloalanina hGH i des-fenyloalanina-prolina hGH, gdzie ilości pokazano różnymi cieniami.

Definicje

W użytym tu znaczeniu wyrażenie „komórka”, „linia komórkowa”, „szczep” i „hodowla komórkowa” są użyte tu wymiennie i każde takie określenie obejmuje potomstwo. Co za tym idzie, słowa „transformanty” i „stransformowane komórki” obejmują omawianą komórkę i hodowle z nich otrzymane bez względu na liczbę przeszczepień. Jest również zrozumiałe, że całe potomstwo może nie być dokładnie identyczne pod względem zawartości DNA z uwagi na zamierzone lub nie zamierzone mutacje. Uwzględniono zmutowane potomstwo posiadające tą samą funkcję lub aktywność biologiczną jaką wykryto w oryginalnych, stransformowanych komórkach. Odmienne określenia będą jasno wynikały z kontekstu.

„Bakteria” dla celów niniejszego opisu oznacza bakterię Gram-ujemną. Korzystnym typem bakterii jest Enterobacteriaceae. Przykłady bakterii należących do Enterobacteriaceae obejmują Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia i Shigella. Inne rodzaje użytecznych bakterii obejmują Azotobacter, Pseudomonas, Rhizobia, Vitreoscilla i Paracoccus. Dogodnie gospodarze E. coli obejmują E. coli W3110, (ATCC 27,325), E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B i E. coli X1776 (ATCC 31,537). Przykłady te są raczej ilustrujące niż ograniczające i preferowany jest W1310. Mogą być również zastosowane zmutowane komórki którejkolwiek z wyżej wspomnianych bakterii. Jest oczywiście niezbędnym wyselekcjonowanie odpowiedniej bakterii biorąc pod uwagę zdolność do replikacji replikonu w komórce bakterii. Gdy dla zapewnienia replikacji użyto dobrze znanych plazmidów takich jak pBR322, pBR325, pACYC177 lub pKN410, jako gospodarze przykładowo mogą być dogodnie użyte, gatunki E. coli, takie jak Serratia lub Salmonella.

„Chromosomowy gen yfcK” określa gen kodujący białko b2324 opisane jako „hipotetyczna peptydaza” w projekcie sekwencjonowania genomu E. coli (Blattner i wsp., powyżej) w bazie danych GenBank (numer dostępu AE000321). Białko ma numer dostępu Dayhoff B65005 i numer dostępu Swiss

PL 206 286 B1

Prot P77182 i gen jest umiejscowiony na chromosomie E. coli w 52.59 i jego lokalizacja podana w parach zasad równa się lewy koniec: 2439784 bp, prawy koniec: 2441790 bp. Sekwencja tego genu jest następująca:

TTGCGCAGCCTTACACACATCGCTAAGATCGAGCCACCGCCTGTAAGACGAGTAACTTAC

GTGAAACACTACTCCATACAACCTGCCAACCTCGAATTTAATGCTGAGGGTACACCTGTT

TCCCGAGATTTTGACGATGTCTATTTTTCCAACGATAACGGGCTGGAAGAGACGCGTTAT

GTTTTTCTGGGAGGCAACCAATTAGAGGTACGCTTTCCTGAGCATCCACATCCTCTGTTT

GTGGTAGCAGAGAGCGGCTTCGGCACCGGATTAAACTTCCTGACGCTATGGCAGGCATTT

GATCAGTTTCGCGAAGCGCATCCGCAAGCGCAATTACAACGCTTACATTTCATTAGTTTT

GAGAAATTTCCCCTCACCCGTGCGGATTTAGCCTTAGCGCATCAACACTGGCCGGAACTG

GCTCCGTGGGCAGAACAACTTCAGGCGCAGTGGCCAATGCCCTTGCCCGGTTGCCATCGT

TTATTGCTCGATGAAGGCCGCGTGACGCTGGATTTATGGTTTGGCGATATTAACGAACTG

ACCAGCCAACTGGACGATTCGCTAAATCAAAAAGTAGATGCCTGGTTTCTGGACGGCTTT

GCGCCAGCGAAAAACCCGGATATGTGGACGCAAAATCTGTTTAACGCCATGGCAAGGTTG

GCGCGTCCGGGCGGCACGCTGGCGACATTTACGTCTGCCGGTTTTGTCCGCCGCGGTTTG

CAGGACGCCGGATTCACGATGCAAAAACGTAAGGGCTTTGGGCGCAAACGGGAAATGCTT

TGCGGGGTGATGGAACAGACATTACCGCTCCCCTGCTCCGCGCCGTGGTTTAACCGCACG

GGCAGCAGCAAACGGGAAGCGGCGATTATCGGCGGTGGTATTGCCAGCGCGTTGTTGTCG

CTGGCGCTATTACGGCGCGGCTGGCAGGTAACGCTTTATTGCGCGGATGAGGCCCCCGCA

CTGGGTGCTTCCGGCAATCGCCAGGGGGCGCTGTATCCGTTATTAAGCAAACACGATGAG

GCGCTAAACCGCTTTTTCTCTAATGCGTTTACTTTTGCTCGTCGGTTTTACGACCAATTA

CCCGTTAAATTTGATCATGACTGGTGCGGCGTCACGCAGTTAGGCTGGGATGAGAAAAGC

CAGCATAAAATCGCACAGATGTTGTCAATGGATTTACCCGCAGAACTGGCTGTAGCCGTT

GAGGCAAATGCGGTTGAACAAATTACGGGCGTTGCGACAAATTGCAGCGGCATTACTTAT

CCGCAAGGTGGTTGGCTGTGCCCAGCAGAACTGACCCGTAATGTGCTGGAACTGGCGCAA

CAGCAGGGTTTGCAGATTTATTATCAATATCAGTTACAGATTTATCCCGTAAGGATGAC

TGTTGGTTGTTGAATTTTGCAGGAGATCAGCAAGCAACACACAGCGTAGTGGTACTGGCG

AACGGGCATCAAATCAGCCGATTCAGCCAAACGTCGACTCTCCCGGTGTATTCGGTTGCC

GGGCAGGTCAGCCATATTCCGACAACGCCGGAATTGGCAGAGCTGAAGCAGGTGCTGTGC

TATGACGGTTATCTCACGCCACAAAATCCGGCGAATCAACATCATTGTATTGGTGCCAGT

TATCATCGCGGCAGCGAAGATACGGCGTACAGTGAGGACGATCAGCAGCAGAATCGCCAGCG

GTTGATTGATTGTTTCCCGCAGGCACAGTGGGCAAAAGAGGTTGATGTCAGTGATAAAGAGG

CGCGCTGCGGTGTGCGTTGTGCCACCCGCGATCATCTGCCAATGGTAGGCAATGTTCCCGAT

TATGAGGCAACACTCGTGGAATATGCGTCGTTGGCGGAGCAGAAAGATGAGGCGGTAAGCGC

GCCGGTTTTTGACGATCTCTTTATGTTTGCGGCTTTAGGTTCTCGCGGTTTG

TGTTCTGCCCCGCTGTGTGCCGAGATTCTGGCGGCGCAGATGAGCGACGAACCGATTCCG ATGGATGCCAGTACGCTGGCGGCGTTAAACCCGAATCGGTTATGGGTGCGGAAATTGTTG AAGGGTAAAGCGGTTAAGGCGGGGTAA (SEQ ID NO:1);

i biał ko kodowane przez nią ma sekwencję nastę pując ą :

MRSLTHIAKIEPPPVRRVTYVKHYSIQPANLEFNAEGTPVSRDFDDVYFSNDNGLEETRYVF

LGGNQLEVRFPEHPHPLFVVAESGFGTGLNFLTLWQAFDQFREAHPQAQLQRLHFISFEKFP

LTRADLALAHQHWPELAPWAEQLQAQWPMPLPGCHRLLLDEGRVTLDLWFGDINELTSQLDD

SLNQKVDAWFLDGFAPAKNPDMWTQNLFNAMARLARPGGTLATFTSAGFVRRGLQDAGFTMQ

KRKGFGRKREMLCGVMEQTLPLPCSAPWFNRTGSSKREAAIIGGGIASALLSLALLRRGWQV

TLYCADEAPALGASGNRQGALYPLLSKHDEALNRFFSNAFTFARRFYDQLPVKFDHDWCGVT

QLGWDEKSQHKIAQMLSMDLPAELAVAVEANAVEQITGVATNCSGITYPQGGWLCPAELTRN

VLELAQQQGLQIYYQYQLQNLSRKDDCWLLNFAGDQQATHSVVVLANGHQISRFSQTSTLPV

YSVAGQVSHIPTTPELAELKQVLCYDGYLTPQNPANQHHCIGASYHRGSEDTAYSEDDQQQN

RQRLIDCFPQAQWAKEVDVSDKEARCGVRCATRDHLPMVGNVPDYEATLVEYASLAEQKDEA

VSAPVFDDLFMFAALGSRGLCSAPLCAEILAAQMSDEPIPMDASTLAALNPNRLWVRKLLKG

KAVKAG (SEQ ID NO:2). „Niedobór” pod względem genu lub kwasu nukleinowego oznacza, że komórka posiada usunięty lub inaktywowany lub nieczynny wspomniany gen tak, że nie wytwarza on białka, które ten gen koduje. Przykładowo, komórki z niedoborem chromosomowego genu yfcK kodującego b2324 nie wytwarzają produktu genu w hodowli. Podobnie, komórka z niedoborem genu kodującego proteazę, gdy jest hodowana nie wytwarza szczególnej proteazy.

PL 206 286 B1

W uż ytym tu znaczeniu „polipeptyd” odnosi się ogólnie do peptydów i biał ek z jakichkolwiek komórek, który posiada więcej niż 10 aminokwasów. Polipeptydy „heterologiczny” są polipeptydami obcymi dla wykorzystywanej komórki gospodarza, takimi jak ludzkie białko wytwarzane w E. coli. O ile heterologiczny polipeptyd może być prokariotycznym lub eukariotycznym polipeptydem to korzystnie jest on eukariotycznym, korzystniej ssaczym, najkorzystniej ludzkim polipeptydem.

Przykłady ssaczych polipeptydów obejmują cząsteczki takie jak np. renina, hormon wzrostu, włącznie z ludzkim hormonem wzrostu, bydlęcy hormon wzrostu; czynnik uwalniający hormon wzrostu; hormon przytarczyczki; hormon stymulujący tarczycę; lipoproteiny; 1-antytrypsyna; łańcuch A insuliny; łańcuch B insuliny; proinsulina; trombopoetyna; hormon pobudzający wzrost pęcherzyków jajnikowych; kalcytonina; hormon luteinizujacy; glukagon; czynniki krzepnięcia, takie jak czynnik VIIIC, czynnik IX, czynnik tkankowy i czynnik von Willebrada; czynniki przeciw krzepnięciu takie jak białko C; czynnik przedsionkowy; czynnik zwilżający płuc; aktywator plazminogenu, taki jak urokinaza lub ludzki mocznik lub tkankowy typ aktywatora plazminogenu (t. PA); bombezyna; trombina; chemopoetyczny czynnik wzrostowy; czynnik α i β martwicy nowotworu; enkefalina; albumina surowicy taka jak ludzka albumina surowicy; substancja hamująca mullerynę; łańcuch A relaksyny; łańcuch B relaksyny; prorelaksyna; peptyd towarzyszący mysiej gonadotropinie; białko bakteryjne, takie jak beta-laktamaza; Dnaza; inhibina; aktywina; czynnik wzrostowy śródbłonka naczyń (VEGF); receptory hormonów lub czynników wzrostowych; integryna; białko A lub D; czynniki reumatoidalne; czynniki neurotropowe takie jak pochodzący z mózgu czynnik neurotropowy (BDNF), neurotropina-3, -4, -5 lub -6 (NT-3, NT-4, NT-5 lub NT-6) lub czynnik wzrostowy nerwu tak jak NGF; kardiotrofiny (czynnik hipertrofowy serca) takie jak kardiotrofina-1 (CT-1); płytkowy czynnik wzrostowy (PDGF); czynnik wzrostowy fibroblastu taki jak aFGF i bFGF; czynnik wzrostowy nabłonka (EGF); transformujący czynnik wzrostowy (TGF) taki jak

TGF-α i TGF-β, włącznie z TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 lub TGF-5; czynnik wzrostowy -1 i -2 typu insuliny (IGF-1 i IGF-2); des(1-3)-IGF-1 (mózgowy IGF-1), białka wiążące czynnik wzrostowy typu insuliny; białka CD takie jak CD-3, CD-4, CD-8 i CD-19; erytropoetyna; czynniki indukcyjne kości; immunotoksyny; białko morfogeniczne kości (BNP); interferon taki jak interferon-α, -β i -γ i albumina surowicy taka jak ludzka albumina surowicy (HSA) lub bydlęca albumina surowicy (BSA); czynniki pobudzające wzrost kolonii (CSF) np. M-CSF, GM-CSF i G-CSF; interleukiny (IL), IL-1 do IL-10; przeciwciało anty-HRE-2; dysmutaza nadtlenkowa; receptory komórki T; powierzchniowe białka błonowe; czynnik przyspieszający rozkład; antygen wirusowy taki jak przykładowo część otoczki AIDS; białka transportu; receptory udomowienia; adresyny; białka regulatorowe; przeciwciała i fragmenty któregokolwiek z wyżej wymienionych polipeptydów. Pewien korzystny zestaw interesujących polipeptydów jest taki, które zawierają N-końcową fenyloalaninę, taki jak hGH. Inny, korzystny zestaw interesujących polipeptydów to taki, który jest wytworzony w peryplazmie lub pożywce z hodowli komórkowej bakterii, tak jak hGH.

Wyrażenie „sekwencje kontrolne” określają sekwencje DNA niezbędne dla ekspresji funkcjonalnie przyłączonej sekwencji kodującej w szczególnym organizmie gospodarza. Sekwencje kodujące, które są użyteczne dla bakterii obejmują promotor, warunkowo sekwencję operatora i miejsce wiązania rybosomu.

Kwas nukleinowy jest „przyłączony funkcjonalnie” gdy jest umieszczony w funkcjonalnej zależności z inną sekwencją kwasu nukleinowego. Przykładowo, DNA dla presekwencji lub lidera sekrecyjnego jest przyłączony funkcjonalnie do DNA dla polipeptydu, jeśli jest on wyrażony jako prebiałko uczestniczące w sekrecji polipeptydu; promotor jest przyłączony funkcjonalnie do sekwencji kodującej jeśli wpływa na transkrypcję sekwencji; lub miejsce wiązania rybosomu jest przyłączone funkcjonalnie do sekwencji kodującej jeśli jest ono umiejscowione tak, że zapewnia translację. Ogólnie, „przyłączony funkcjonalnie” oznacza, że sekwencje DNA są połączone w sposób ciągły, a w przypadku lidera sekrecyjnego w sposób ciągły i w fazie odczytu. Przyłączenie jest osiągnięte przykładowo przez ligację w dogodnych miejscach restrykcyjnych. Jeśli takie miejsca nie istnieją, użyte są syntetyczne adaptory lub linkery oligonukleotydowe zgodnie z dogodną praktyką.

Termin „nadekspresja” w odniesieniu do genu lub kwasu nukleinowego określa syntezę specyficznych białek w ilościach większych niż zazwyczaj wytworzane przez komórkę, gdy nie ma sztucznej indukcji takiej syntezy, jak np. zapośrednictwem promotora.

Termin „odzyskanie” polipeptydu ogólnie oznacza uzyskanie polipeptydu wolnego od komórek, w których został wytworzony.

Terminy „polipeptyd aminopeptydazy b2324”, „białko aminopeptydazy b2324” i „aminopeptydaza b2324”, gdy są tu użyte obejmują aminopeptydazę b2324 o natywnej sekwencji i homologi aminopeptydazy b2324 (które są tu dalej zdefiniowane). Zależnie od kontekstu polipeptydy aminopeptydazy

PL 206 286 B1 b2324 mogą być wyizolowane z różnych źródeł, jak na przykład z komórek bakterii lub przygotowane przez rekombinowanie i/lub sposobami syntezy.

„Aminopeptydaza b2324 o natywnej sekwencji” obejmuje polipeptyd posiadający taką samą sekwencję aminokwasową jak aminopeptydaza b2324 pochodząca z środowiska naturalnego. Taka aminopeptydaza b2324 o natywnej sekwencji może być wyizolowana z środowiska naturalnego lub może być wytworzona przez rekombinowanie i/lub syntetycznie. Termin „aminopeptydaza b2324 o natywnej sekwencji” obejmuje naturalnie występujące, skrócone lub sekrecyjne postaci (np. sekwencję domeny zewnątrzkomórkowej), naturalnie występujące postaci wariantów (np. formy powstałe przez alternatywne składanie) i naturalnie występujące warianty alleliczne aminopeptydazy b2324. W jednym wykonaniu wynalazku aminopeptydaza b2324 o natywnej sekwencji jest dojrzałą lub o natywnej sekwencji pełnej długości aminopeptydazą b2324 obejmującą aminokwasy 1 do 688 z SEQ ID NO:2.

„Homolog aminopeptydazy 2324” oznacza aminopeptydazę o około 80% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową reszt 1 do 688 z polipeptydu aminopeptydazy b2324 o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:2. Takie homologi aminopeptydazy b2324 obejmują przykładowo polipeptydy aminopeptydazy b2324, gdzie dodany lub usunięty jest jeden lub więcej aminokwasów na N- lub C-końcach, jak również w obrębie jednej lub większej liczbie wewnętrznych domen z sekwencji SEQ ID NO:2. Korzystnie, homolog aminopeptydazy 2324 będzie miał przynajmniej około 85% identyczności sekwencji aminokwasowej, korzystnie przynajmniej około 90% identyczności sekwencji aminokwasowej i jeszcze korzystniej przynajmniej około 95% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową złożoną z reszt 1 do 688 z SEQ ID NO:2. Homologi nie obejmują sekwencji natywnej.

Gen yfcK oznacza gen posiadający przynajmniej 80% identyczności sekwencji z (a) cząsteczką DNA kodującą aminopeptydazę b2324 o sekwencji natywnej mającej sekwencję aminokwasową od 1 do 688 z SEQ ID NO:2 lub (b) cząsteczką DNA komplementarną do (a) i kodującą aminopeptydazę, i oznacza również gen o przynajmniej 80% identyczności sekwencji z chromosomowym genem yfcK o pełnej sekwencji reszt kwasu nukleinowego z SEQ ID NO:1 i kodującego aminopeptydazę. Takie geny yfcK obejmują, przykładowo, chromosomowy gen yfcK, gdzie dodana lub usunięta jest jedna lub więcej reszt kwasu nukleinowego na końcu 5' lub 3', jak również w obrębie wewnętrznej części sekwencji SEQ ID NO:1. Korzystnie, gen yfcK będzie posiadał przynajmniej 85% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego, korzystniej przynajmniej około 90% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego i jeszcze korzystniej przynajmniej około 95% identyczności sekwencji kwasu nukleinowego z sekwencją kwasu nukleinowego zł o ż onej z nukleotydów 1 do 2067 z SEQ ID NO:1. Termin ten obejmuje gen yfcK o natywnej sekwencji (tj. chromosomowy gen yfcK).

„Procent (%) identyczności sekwencji aminokwasowej” w odniesieniu do sekwencji aminopeptydazy b2324, które tu określono, jest zdefiniowany jako procent reszt aminokwasowych w kandydującej sekwencji, które są identyczne z resztami aminokwasowymi w sekwencji aminopeptydazy b2324, po przyrównaniu z sekwencjami i wprowadzeniu luk, jeśli jest to niezbędne, dla uzyskania maksymalnego procentu identyczności sekwencji i bez rozważania jakichkolwiek konserwatywnych podstawień jako części identyczności sekwencji. Procent wartości identyczności tu użyty można uzyskać przy zastosowaniu WU-BLAST-2, który otrzymano z (Altschul i wsp., Methods in Enzymology, 26:460-480 (1996); http(blast.wustl/edu/blast/README.html). WU-BLAST-2 używa szeregu parametrów badania, większość z nich jest wartościami domyślnymi. Dostosowywane parametry są ustawione przy poniższych wartościach: zasięg zakładki:1, część zachodząca=0,125, długość słowa (T)=11. Parametry HSP S i HSP S2 są wartościami dynamicznymi i są ustalane przez sam program zależnie od składu konkretnej sekwencji i składu konkretnej bazy danych, która jest przeszukiwana przy zastosowaniu sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania. Jednakże, wartości mogą być dostosowane dla zwiększenia czułości. Wartość % identyczności sekwencji aminokwasowej jest określana przez liczbę dopasowanych, identycznych reszt podzielona przez całkowitą liczbę reszt „dłuższej” sekwencji w przyrównanym obszarze. „Dłuższa” sekwencja jest tą, która posiada najczęściej występujące reszty w przyrównanym obszarze (ignorowane są luki wprowadzone przez WU-Blast-2 dla maksymalizacji oceny przyrównania).

Termin „wartości dodatnie” w kontekście porównania sekwencji przeprowadzonego jak opisano powyżej, obejmuje reszty w porównanych sekwencjach, które nie są identyczne, lecz mają podobne właściwości (np. będąc wynikiem konserwatywnych podstawień). Procent wartości dodatnich jest określany przez frakcję reszt uznanych za wartości dodatnie w macierzy BLOSUM 62 podzielonych przez całkowitą liczbę reszt w dłuższej sekwencji, jak zdefiniowano powyżej.

PL 206 286 B1

W podobny sposób „procent (%) identyczności sekwencji kwasu nukleinowego” w odniesieniu do sekwencji, która koduje peptydy aminopeptydazy b2324, które tu zidentyfikowano, określono jako procent resztami nukleotydowymi w kandydującej sekwencji identycznych z nukleotydami sekwencji kodującej aminopeptydazę b2324. Wartości identyczności, których tu użyto można uzyskać przy zastosowaniu przez moduł BLASTN z WU-BLAST-2 z ustawionymi parametrami domyślnymi, z zasięgiem zakładki i frakcją zakładki ustawionymi odpowiednio jako 1 i 0,125.

„Wyizolowane” użyty dla opisu różnych ujawnionych tu polipeptydów, oznacza polipeptyd, który zidentyfikowano i rozdzielono i/lub odzyskano ze składnika jego naturalnego środowiska. Zanieczyszczające składniki tego naturalnego środowiska są materiałami, które typowo będą zaburzały diagnostyczne lub terapeutyczne zastosowania polipeptydu i mogą obejmować enzymy, hormony oraz różne rozpuszczalne substancje białkowe lub niebiałkowe. W korzystnych wykonaniach, polipeptyd będzie oczyszczony (1) w stopniu dostatecznym dla uzyskania przynajmniej 15 reszt N-końcowych przy zastosowaniu sekwenatora z nasadką wirówkową, lub (2) do homogenności przez SDS-PAGE w nieredukujących lub redukujących warunkach przy zastosowaniu barwienia błękitem Coomasie lub korzystnie barwienia srebrem. Wyizolowany polipeptyd obejmuje polipeptyd wewnątrz zrekombinowanej komórki, ponieważ nie będzie występował przynajmniej jeden składnik naturalnego środowiska aminopeptydazy b2324. Jednakże zazwyczaj wyizolowany polipeptyd będzie wytworzony przez przynajmniej jeden etap oczyszczania.

„Wyizolowana” cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd aminopeptydazy b2324 jest cząsteczką kwasu nukleinowego, która jest zidentyfikowana i oddzielona od przynajmniej jednej zanieczyszczającej cząsteczki kwasu nukleinowego, z którą jest zazwyczaj związana w naturalnym źródle kwasu nukleinowego kodującego aminopeptydazę b2324. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca aminopeptydazę b2324 jest inna niż postać lub układ, w którym jest znajdowana w naturze. Co za tym idzie, wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego są odróżnialne od cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej aminopeptydazę b2324, jaka występuje w naturalnych komórkach. Jednakże, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd aminopeptydazy b2324 obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą aminopeptydazę b2324 zawartą w komórkach, które zazwyczaj wyrażają aminopeptydazę b2324, gdzie przykładowo, cząsteczka kwasu nukleinowego jest umiejscowiona na chromosomie inaczej niż w komórkach naturalnych.

Sposoby wykonania wynalazku

W pewnym aspekcie, wynalazek dotyczy określonego szczepu komórki bakteryjnego gospodarza, który nie ma aminopeptydazy (tj. enzymu, który odcina reszty aminokwasowe umiejscowione na N-końcu polipeptydów, tak jak ten, który tnie pomiędzy N-końcową fenyloalaniną i kolejnym sąsiadującym z nią aminokwasem), co za tym idzie pozwala na lepsze oczyszczanie polipeptydu.

Dokładniej, niniejszy wynalazek dostarcza w tym aspekcie komórek bakterii gram ujemnych z niedoborem chromosomowego genu (którego to genu nie brakuje w wersji typu dzikiego takich komórek) posiadającego przynajmniej 80% identyczności sekwencji z (a) cząsteczką DNA kodującą aminopeptydazę b2324 o naturalnej sekwencji mającej sekwencję aminokwasową złożoną z reszt od 1 do 688 z SEQ ID NO:2 lub (b) cząsteczką komplementarn ą DNA do (a) i kodującą aminopeptydazę. Tak więc, taki gen wykazuje przynajmniej 80% identyczności sekwencji z sekwencją genu yfcK. Korzystnie, gen ten wykazuje przynajmniej 85% identyczności sekwencji, korzystniej przynajmniej około 90% identyczności sekwencji, jeszcze korzystniej przynajmniej około 95% identyczności sekwencji i najkorzystniej 100% identyczności sekwencji z sekwencją genu yfcK (który koduje aminopeptydazę b2324 o sekwencji naturalnej). W innym aspekcie komórki bakterii gram ujemnych są pozbawione chromosomowego genu (którego to genu nie brakuje w wersji dzikiej takich komórek) kodującego aminopeptydazę o przynajmniej 80% identycznoś ci sekwencji z aminopeptydazą b2324 o naturalnej sekwencją maj ą cej sekwencję aminokwasową złożoną z reszt od 1 do 688 z SEQ ID NO:2. Korzystnie, aminopeptydaza ma przynajmniej około 85%, korzystniej przynajmniej około 90%, a jeszcze korzystniej przynajmniej około 95% identyczności sekwencji. Obejmuje to komórki z niedoborem chromosomowego genu yfc K o sekwencji natywnej.

W trzecim aspekcie, komórki bakterii gram ujemnych nie posiadają chromosomowego genu (którego to genu nie brakuje w wersji typu dzikiego takich komórek), który to gen zawiera (a) DNA kodujący polipeptyd dający przynajmniej 80% wartości dodatnich, gdy porówna się go z sekwencją aminokwasową aminopeptydazy b2324 o naturalnej sekwencji rozciągającej się od 1 do 688 SEQ ID NO:2, lub (b) DNA komplementarny do (a), gdzie ten polipeptyd jest aminopeptydazą. Obejmuje to komórki dające 100% wartości dodatnich, przy porównaniu z natywną sekwencją aminopeptydazy b2324.

PL 206 286 B1

Komórki według wynalazku są bakteriami gram ujemnymi, przykładowo bakteriami o zsekwencjonowanych genomach, takimi jak Salmonella, Yersinia, Haemophilus, Caulobacter, Agrobacterium, Vibrio itd.), gdzie przewidywana jest obecność homologa yfcK. Korzystniej, komórką jest Salmonella lub Enterobacetriaceae, jeszcze korzystniej E. coli, najkorzystniej W3110.

Komórka jest ponadto warunkowo pozbawiona jednego lub więcej innych chromosomowych genów występujących w wersjach typu dzikiego takich komórek, takich jak geny, które kodują bakteryjne proteazy. Szczepy E. coli z niedoborem proteaz lub genów kontrolujących regulacę proteaz są znane (Beckwith i Strauch, WO 88/05821 opublikowany 11 sierpnia 1988; Chaudhury i Smith, J. Bacteriol., 160:788-791 (1984); Elish i wsp., J. Gen. Microbiol., 134:1355-1364 (1988); Baneyx i Georgiou, „Expression of proteolyticaly sensitive peptides in Escherichia coli”, w: Stability of Protein Pharmaceuticals, torn 3: Chemical and Physical Pathways of Protein Degradation, Ahern i Manning, wyd. (Plenum Press, Nowy Jork, 1992), str. 69-108).

Niektóre z tych szczepów z niedoborem proteazy użyto w próbach wydajnego wytwarzania peptydów wrażliwych na proteolizę, w szczególności tych o potencjalnym znaczeniu medycznym lub komercyjnym. Patent US nr 5,508,192 (dla Georgiou i wsp.) opisuje konstrukcję wielu gospodarzy bakteryjnych z niedoborem proteazy i/lub białka szoku cieplnego. Tacy gospodarze obejmują bakterie z brakiem jednej, dwóch, trzech lub czterech proteaz i bakterię z pojedynczą proteazą, która posiada również mutację w genie rpoH. Przykłady ujawnionych genów proteaz obejmują szczep degP ompT ptr3, pre (tsp) i degP rpoH dla opisano wytwarzanie wysokich mian zrekombinowanych białek w E. coli. Park i wsp., Biotechnol. Prog., 15:164-167 (1999) donoszą również, że szczep (HM114) z niedoborem dwóch proteaz otoczki komórki (degP prc) rośnie nieznacznie szybciej i wytwarza więcej białka fuzyjnego niż inne szczepy z niedoborem większej liczby proteaz. Komórki tutaj opisane mogą mieć niedobór którejkolwiek lub większej liczby takich proteaz, z preferencją takich proteaz, które są kodowane przez chromosomowy ptr3 kodujący Proteazę III, chromosomowy ompT kodujący proteazę OmpT i/lub chromosomalny degP kodujący proteazę DegP. Szczepy mogą również być pozbawione tonA (fhuA), phoA i/lub deoC. Korzystnie, komórka nie ma degP i/lub fhuA. Najkorzystniej, komórka ma genotyp

W3110 AfhuA A(arg-F-lac) 169 phoAΔE15 deoC2 degP::kanR ilvG2096 ΔyfcK.

W innym wykonaniu komórka zawiera kwas nukleinowy kodujący polipeptyd heterologiczny dla komórki. Kwas nukleinowy może być wprowadzony do komórki jakimkolwiek sposobem, lecz korzystnie do transformacji używa się kwas nukleinowym albo przez zastosowanie zrekombinowanego wektora ekspresyjnego albo przez rekombinację homologiczną, najkorzystniej z zastosowaniem wektora.

Przykładami odpowiednich heterologicznych polipeptydów są te, zdefiniowane powyżej i obejmujące białka i polipeptydy zaczynające się od metioniny i posiadające fenyloalaninę jako drugi aminokwas, jak również białka rozpoczynające się od fenyloalaniny (tj. te, które w dojrzałej postaci rozpoczynają się od fenyloalaniny lub są dalej poddane proteolitycznej obróbce dla usunięcia początkowej metioniny i te, które są preprobiałkami z odciętym peptydem sygnałowym tak aby zostawić Phe jako N-koniec dojrzałego białka, tak jak ma to miejsce w przypadku ludzkiego hormonu wzrostu). A zatem, jakikolwiek polipeptyd heterologiczny dla komórki bakterii, w której został otrzymany, w którym aminowy koniec dojrzałego lub końcowego produktu to Phe jest uwzględniony tu dla tych celów.

Przykłady ludzkich polipeptydów spełniających to wymaganie lokalizacji fenyloalaniny obejmują prekursor łańcucha alfa-2 kolagenu, prekursor łańcucha delta powierzchniowej glikoproteiny cd3 komórki T, prekursor insuliny, prekursor integryny alfa-3, prekursor integryny alfa-5, prekursor integryny alfa-6, prekursor integryny alfa-7, prekursor integryny alfa-e, prekursor integryny alfa-n, prekursor integryny alfa-v, prekursor integryny alfa-x, prekursor acetylotransferazy fosfatydylocholina-sterol, prekursor antygenu 3 związango z funkcją limfocytów, prekursor jelitowej kolagenazy, prekursor kolagenazy z limfocytów obojętnochłonnych, prekursor motyliny, prekursor neurofiliny-1, prekursor acetylohydrolazy czynnika aktywującego płytki, prekursor sialoproteiny ii z kości, prekursor wariantu hormonu wzrostu (Seeburg, DNA 1:239-249 (1982)), prekursor somatotropiny, prekursor małej indukowalnej cytokiny a13, prekursor małej indukowalnej cytokiny a27, prekursor małej indukowalnej cytokiny b11, prekursor przedstawiciela 8 nadrodziny receptora czynnika martwicy nowotworów, prekursor łańcucha beta tyrotropiny, prekursor czynnika wzrostowego c śródbłonka naczyń, preproinsulina (BE885196-A), wariant HGH-V ludzkiego hormonu wzrostu (EP89666-A), ludzka proinsulina (US4431740), peptyd sygnałowy AP i ludzki hormon wzrostu (hGH) kodowany przez pAP-1 (EP177343-A), prekursor ludzkiego hormonu wzrostu (hGF) (EP245138-A), ludzki BMP (EP409472-A) ludzkie białko LFA-3 (CD58) (DE4008354-A), receptor typu II ludzkiej interleukiny-1 (EP460846-A), analog nr 6 aprotyniny o zredukowanej nefrotoksyczności (WO9206111-A), analog nr 7 aprotyniny o zredukowanej nefrotoksyczności

PL 206 286 B1 (WO9206111-A), analog nr 8 aprotyniny o zredukowanej nefrotoksyczności (WO9206111-A), analog nr 10 aprotyniny o zredukowanej nefrotoksyczności (WO9206111-A), analog nr 9 aprotyniny o zredukowanej nefrotoksyczności (WO9206111-A), analog nr 11 aprotyniny o zredukowanej nefrotoksyczności (WO9206111-A), analog nr 12 aprotyniny o zredukowanej nefrotoksyczności (WO9206111-A), analog nr 13 aprotyniny o zredukowanej nefrotoksyczności (WO9206111-A), analog nr 14 aprotyniny o zredukowanej nefrotoksyczności (WO9206111-A), podjednostka alfa 6A integryny (WO9219647-A), podjednostka alfa 6B integryny (WO9219647-A), ludzkie białko LFA-3 (EP517174-A), ludzka plazmatyczna karboksypeptydaza B (US5206161-A), IL-1R pochodzenia limfoblastoidalnego (WO9319777-A), ludzkie LFA-3 (JP06157334-A), ludzki receptor indukowany przez aktywację limfocytu (ILA) (CA2108401-A), receptor białka komórki endotelium (WO9605303-A1), ludzka acetylotransferaza lecytyna-cholesterol (LCAT) (WO9717434-A2), ludzki rozpuszczalny antygen CD30 (DE9219038-U1), ludzki mały czynnik wzrostowy typu CCN (WO9639486-A1), ludzka plazmatyczna karboksypeptydaza B (US5593674-A), ludzki hormon wzrostu (WO9820035-A1), analog insuliny kodowany przez fragment plazmidu pKFN-864 (EP861851-A1), polipeptyd CXC chemokiny „IBICK” naczelnych (WO9832858-A2), ludzki mały czynnik wzrostowy typu CCN (US5780263-A), sekwencja aminokwasowa ludzkiej plazmatycznej hialuronidazy (hpHAza) (WO9816655-A1), ludzkie białko IL-1R typu II (US5767064-A), białko klonu CC365_40 od Homo sapiens (WO9807859-A2), ludzki hormon wzrostu (US5955346-A), ludzki rozpuszczalny receptor hormonu wzrostu (US5955346-A), ludzkie białko antygenu CD30 (WO9940187-A1), ludzka neuropilina-1 (WO9929858-A1), ludzki polipeptyd pochodzący z tkanki mózgowej (klon OMB096) (WO9933873-A1), ludzkie białko Toll PRO285 (WO9920756-A2), sekwencja aminokwasowa ludzkiego wydzielanego peptydu (WO9911293-A1), sekwencja aminokwasowa ludzkiego wydzielanego peptydu (WO9911293-A1), sekwencja aminokwasowa ludzkiego wydzielanego peptydu (WO9911293-A1), sekwencja aminokwasowa ludzkiego wydzielanego peptydu (WO9911293-A1), sekwencja aminokwasowa ludzkiego wydzielanego peptydu (WO9907891-A1), sekwencja aminokwasowa ludzkiego wydzielanego białka (WO9907891-A1), sekwencja aminokwasowa ludzkiego wydzielanego białka (WO9907891-A1), ludzka plazmatyczna karboksypeptydaza B (PCPB) thr147 (WO9855645-A1), białko ludzkiej chemokiny MIG-beta (EP887409-A1), sekwencja aminokwasowa ludzkiego wydzielanego białka (WO200052151-A2), ludzka fuzja białkowa hGH/EGF kodowana przez plazmid pWRG1630 (US6090790-A), ludzkie wydzielane białko kodowane przez klon cDNA 3470865 (WO200037634-A2), ludzkie białko FDF03DeltaTM pochodzące z monocytu (WO200040721-A1), ludzkie białko FDF03-S1 pochodzące z monocytu (WO200040721-A1), ludzkie białko FDF03-M14 pochodzące z monocytów (WO200040721-A1), ludzkie białko FDF03-S2 pochodzące z monocytów (WO200040721-A1), ludzkie wydzielane biało nr 2 (EP1033401-A2), ludzki pre-pro czynnik wzrostu C śródbłonka naczyń (WO200021560-A1), ludzkie błonowe białko transportujące, MTRP-15 (WO200026245-A2), białko ludzkiego czynnika wzrostowego śródbłonka naczyń (VEGF)-C (WO200024412-A2), ludzkie TANGO 191 (WO200018800-A1), receptor-HKAEF92 interferonu (WO9962934-A1), ludzka podjednostka alfa-10 integryny (WO9951639-A1), wariant składania ludzkiej podjednostki alfa-10 integryny (WO9951639-A1), homolog ludzkiej reduktazy delta 1-pirrolino-5-karboksylazy (P5CRH) (US6268192-B1), ludzkie białko typu czynnika wzrostu/różnicowania 6 AMF10 (WO200174897-A2), białko ludzkiego transportera i kanału jonowego-6 (TRICH-6) (WO200162923-A2), białko ludzkiego transportera i kanału jonowego-7 (TRICH-7) (WO200162923-A2), ludzkie białko metaloproteinazy-1 substancji międzykomórkowej (WO200166766-A2), ludzkie białko metaloproteinazy-8 substancji międzykomórkowej (MMP-8) (WO200166766-A2), ludzkie białko metaloproteinazy-18P substancji międzykomórkowej (MMP-18P) (WO200166766-A2), ludzkie białko receptora 6 związanego z białkiem G (GPCR6) (WO200181378-A2), ludzkie białko Zlec1 (WO200166749-A2), ludzkie białko substancji międzykomórkowej typu mataloproteazy (MMP) (WO200157255-A1), ludzkie wydzielane białko HFXDI56 kodowane przez gen 15 (WO200154708-A1), ludzkie wydzielane białko HTEGF16 kodowane przez gen 9, (WO200154708-A1), ludzkie wydzielane białko (SECP) nr 4 (WO200151636-A2), ludzkie wydzielane białko HUSIB13 kodowane przez gen 20 (WO200151504-A1), ludzkie wydzielane białko HISAQ04 kodowane przez gen 28 (WO200151504-A1), ludzkie wydzielane białko HCNAH57 kodowane przez gen 35 (WO200151504-A1), ludzkie wydzielane białko HBMCF37 kodowane przez gen 17 (WO200151504-A1), ludzkie białko kodowane przez gen-6 (TSG-6) pobudzane czynnikiem martwicy nowotworów (TNF) (US6210905-B1), FCTR10 (WO200146231-A2), ludzkie wydzielane białko HFKHW50 kodowane przez gen 18 (WO200136440-A1), ludzkie wydzielane białko kodowane przez gen 18 HFKHW50 (WO200136440-A1), ludzkie wydzielane białko HE8FC45 kodowane przez gen 13 (WO200077022-A1), ludzkie wydzielane białko HTLIF12 kodowane przez gen 32 (WO200077022-A1), ludzkie wydzielane białko HCRPV17 koPL 206 286 B1 dowane przez gen 4 (WO200134643-A1), ludzkie wydzielane białko HE8OK73 kodowane przez gen 23 (WO200134643-A1), ludzkie wydzielane białko HCRPV17 kodowane przez gen 4 (WO200134643-A1), ludzkie wydzielane białko HMSFK67 kodowane przez gen 22 (WO200132676-A1), ludzkie wydzielane białko HMSFK67 kodowane przez gen 22 (WO200132676-A1), ludzkie wydzielane białko HMSFK67 kodowane przez gen 22 (WO200132676-A1), ludzkie wydzielane białko HCRNF14 kodowane przez gen 19 (WO200134800-A1), ludzkie wydzielane białko HNEEB45 kodowane przez gen 6 (WO200132687-A1), ludzkie wydzielane białko HNEEB45 kodowane przez gen 6 (WO200132687-A1), ludzkie wydzielane białko HHPDV90 kodowane przez gen 9 (WO200132675-A1), ludzkie wydzielane białko B7-H6 kodowane przez gen 1 (WO200134768-A2), ludzkie wydzielane białko HDPMS12 kodowane przez gen 3 (WO200134768-A2), ludzkie wydzielane białko HRABS65 kodowane przez gen 13 klon (WO200134768-A2), ludzkie wydzielane białko HDPAP35 kodowane przez gen 1 (WO200134768-A2), ludzkie wydzielane białko HDPMS12 kodowane przez gen 3 (WO200134768-A2), ludzkie wydzielane białko HACCL63 kodowane przez gen 17 (WO200134769-A2), ludzkie wydzielane białko HACCL63 kodowane przez gen 17 (WO200134769-A2), ludzkie wydzielane białko HHEPJ23 kodowane przez gen 10 (WO200134629-A1), ludzkie wydzielane białko HHEPJ23 kodowane przez gen 10 (WO200134629-A1), ludzkie wydzielane białko HE9QN39 kodowane przez gen 5 (WO200134626-A1), ludzkie wydzielane białko HCRNO87 kodowane przez gen 14 (SEQ 104) (WO200134626-A1), ludzkie wydzielane białko HE9QN39 kodowane przez gen 5 (WO200134626-A1), ludzkie wydzielane białko HCRNO87 kodowane przez gen 14 (SEQ 145) (WO200134626-A1), ludzkie wydzielane białko HSODE04 kodowane przez gen 4 (WO200134623-A1), ludzkie wydzielane białko kodowane przez gen 6 HMZMF54 (WO200134623-A1), ludzkie wydzielane białko HPJAP43 kodowane przez gen 18 (WO200134623-A1), ludzkie wydzielane białko HNTSL47 kodowane przez gen 27 (WO200134623-A1), ludzkie wydzielane białko HSODE04 kodowane przez gen 4 (WO200134623-A1), ludzkie wydzielane białko HMZMF54 kodowane przez gen 6 (WO200134623-A1), ludzkie wydzielane białko HPJAP43 kodowane przez gen 18 (WO200134623-A1), ludzkie wydzielane białko HNTSL47 kodowane przez gen 27 (WO200134623-A1), ludzkie wydzielane białko HLJEA01 kodowane przez gen 21 (WO200134767-A2), ludzkie wydzielane białko HTJNX29 kodowane przez gen 25 (SEQ 115) (WO200134627-A1), ludzkie wydzielane białko HTJNX29 kodowane przez gen 25 (SEQ 165) (WO200134627-A1), ludzka sekwencja aminokwasowa TANGO 509 (WO200121631-A2), ludzkie białko TANGO 210 (WO200118016-A1), ludzkie białko 12 związane z rakiem (WO200118014-A1), ludzkie białko 18 związane z rakiem (WO200118014-A1), ludzkie wydzielone białko B7-4 (B7-4S) (WO200114557-A1), ludzkie błonowe białko B7-4 (B7-4M) (WO200114557-A1), ludzkie wydzielone białko B7-4 (B7-4S) (WO200114556-A1), ludzkie błonowe białko B7-4 (B7-4M) (WO200114556-A1), wariant ludzkiej interleukiny DNAX 80 (WO200109176-A2), ludzka acylotransferaza lecytyna-cholesterol (LCAT) (WO200105943-A2 sekwencja aminokwasowa ludzkiego polipeptydu PR01419 (WO200077037-A2), sekwencja aminokwasowa ludzkiego łańcucha alfa11 integryny (WO200075187-A1), ludzkie A259 (WO200073339-A1), ludzki peptyd pochodzący ze szpiku kostnego (WO200166558-A1), ludzkie antygenowe białko target-169 związane z guzem (TAT169) (WO200216602-A2), ludzkie wydzielane białko HKZAO35ID kodowane przez gen 3 (WO200218411-A1), ludzkie wydzielane białko HKZAO35 kodowane przez gen 3 (WO200218411-A1), ludzkie wydzielane białko HLYCK27 kodowane przez gen 11 (WO200218435-A1), ludzkie białko INTG-1 (WO200212339-A2), ludzkie wydzielane białko HFPHA80 kodowane przez gen 15, SEQ 70 (WO200216390-A1), ludzkie wydzielane białko HFPHA80 kodowane przez gen 15, SEQ 94 (WO200216390-A1), ludzkie wydzielane białko HDQFU73 kodowane przez gen 2, SEQ 69 (WO200-224719-A1), ludzkie wydzielane białko HDPTC31 kodowane przez gen 8, SEQ 75 (WO200224719-A1), ludzkie wydzielane białko HDQFU73 kodowane przez gen 2, SEQ 90 (WO200224719-A1), ludzkie wydzielane białko HDPRJ60 kodowane przez gen 6, SEQ 95 (WO200224719-A1), ludzkie wydzielane białko HDPTC31 kodowane przez gen 8, SEQ 99 (WO200224719-A1), ludzkie wydzielane białko HDPTC31 kodowane przez gen 8, SEQ 100 (WO200224719-A1), ludzki analog proinsuliny (WO200-204481-A2), antygenowe docelowe białko związane z nowotworem, TAT136 (WO200216429-A2), antygenowy docelowy polipeptyd związany z nowotworem (TAT) 136 (WO200216581-A2), sekwencja ludzkiego białka CD30 (WO200211767-A2), sekwencja białka ludzkiej interleukiny 1R2 (IL-1R2) (WO200211767-A2), ludzkie białko receptora-7 związanego z białkiem G (GPCR-7) (WO200206342-A2), ludzki receptor związany z białkiem G (GPCR6a) (WO200208289-A2), ludzki receptor związany z biał kiem G (GPCR6b) (WO200208289-A2), ludzki receptor typu II dla interleukiny-1 (WO200187328-A2), ludzki polipeptyd A259 (WO200181414-A2), ludzka cząsteczka adhezyjna dla komórek naczyń, VCAM1 (US6307025-B1), ludzka cząsteczka adhezyjna dla komórek naczyń, VCAM1b (US6307025-B1),

PL 206 286 B1 ludzkie transportery i kanały jonowe (TRICH)-6 (WO200177174-A2) i ludzka cząsteczka-8 modyfikująca i utrzymująca białko (PMMM-8) (WO200202603-A2).

W dalszym aspekcie, wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania heterologicznego polipeptydu obejmującego (a) hodowanie komórek niosących kwas nukleinowy kodujący heterologiczny polipeptyd i (b) odzyskiwanie polipeptydu z komórek. Odzyskiwanie moż e być z cytoplazmy, peryplazmy lub pożywki hodowlanej komórek, choć korzystnie polipeptyd jest odzyskiwany z peryplazmy lub pożywki hodowlanej. Korzystnie hodowla ma miejsce w fermentorze. Użyte parametry hodowli i wytwarzanie polipeptydu jest prowadzone w dogodny sposób, tak jak opisane poniżej procedury. Gdy pożądany polipeptyd jest wytworzony w cytoplazmie, nie jest konieczna inkubacja komórek przed lub po lizie, choć może ona zwiększyć wydajność tworzenia przyciętego materiału. Gdy pożądany polipeptyd jest wydzielony do peryplazmy lub pożywki hodowlanej, wtedy etap inkubacji jest preferowany i zalecany jako trwający przynajmniej około 0,5 godziny. Korzystny sposób odzyskiwania polipeptydów wytworzonych w peryplazmie jest związany z rozbiciem lub zmiażdżeniem komórek przykładowo przy pomocy homogenizatorów, prasy Frencha do komórek oraz mikrofluidyzerów dla dużych objętości i sonikatorów dla małych objętości. Lizat tworzy sie z rozbitych komórek, z którego może być oczyszczony niezmieniony polipeptyd. Korzystnie, lizat taki jest inkubowany przed etapem oczyszczania. Inkubacja ta może być przeprowadzona w jakiejkolwiek dogodnej temperaturze, lecz korzystnie w temperaturze pokojowej lub niższej przez przynajmniej około 1 godzinę, korzystniej przez około 2-50 godzin. Polipeptyd i typ komórki są korzystnie jak podano powyżej.

Ponadto, wynalazek dostarcza sposobu zapobiegania N-końcowemu odcięciu reszty aminokwasowej z polipeptydu, obejmującego hodowanie komórki, gdzie komórka zawiera kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, w warunkach takich, że kwas nukleinowy ulega ekspresji. Takie warunki hodowli są tradycyjne i dobrze znane biegłym w tej dziedzinie. Korzystnie, polipeptyd jest odzyskany z komórki. Korzystny polipeptyd i typ komórki są opisane powyżej.

Alternatywnie, odwrotne postępowanie stosuje się, gdy przecięty polipeptyd jest odczyszczony od nieprzeciętego polipeptydu, który jest zanieczyszczeniem. W tym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu odcięcia N-końcowego aminokwasu z polipeptydu obejmującego doprowadzenie do kontaktu polipeptydu z białkiem aminopeptydazy b2324, jak to opisano powyżej, korzystnie gdy kontaktowanie to jest prowadzone przez inkubowanie z białkiem aminopeptydazy b2324. Ponadto, sposób wytwarzania przeciętego polipeptydu wymaga hodowania komórek bakterii niosących gen yfcK (gdzie gen jest endogenny lub heterologiczny dla komórek) i zawierających kwas nukleinowy kodujący odpowiedni, nieprzecięty polipeptyd, który ma dodany aminokwas na swoim N-końcu, gdzie hodowanie jest w warunkach takich jak dla ekspresji lub nadekspresji genu yfcK i dla ekspresji kwasu nukleinowego kodującego nieprzecięty polipeptyd i jeśli nie przecięty polipeptyd i białko aminopeptydazy b2324 nie mają kontaktu po ekspresji, doprowadzenie do kontaktu nie przeciętego polipeptydu z białkiem aminopeptydazy b2324 tak, że wytworzony jest przecięty polipeptyd.

Korzystnie, polipeptyd jest heterologiczny dla komórek, a i korzystniej jest jednym z polipeptydów z podanych wyżej kategorii. Korzystnie, typ komórki jest wybrany z tych, podanych powyżej, z wyjątkiem takich bez delecji genu yfcK. Gen yfcK może być wprowadzony przy pomocy wektora lub może być endogennym dla komórki gospodarza i korzystnie ulega nadekspresji względem ekspresji kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd tak, że jest to korzystne dla enzymatycznej reakcji cięcia.

W kolejnym, korzystnym aspekcie nieprzecięty polipeptyd jest odzyskiwany z komórek przed kontaktem z białkiem aminopeptydazy b2324. Podczas odzyskiwania, korzystnie komórki są rozbijane (przy zastosowaniu podanych wyżej sposobów) i następnie zlizowane. Po lizie, nie przecięty polipeptyd jest korzystnie inkubowany z białkiem aminopeptydazy b2324 tak, że usunięty jest koniec aminowy i przecię ty polipeptyd jest oczyszczony z inkubowanego lizatu. Korzystnie, lizat jest inkubowany przez przynajmniej około 1 godz. w około 20-40°C, korzystniej przez około 2-50 godzin, w około 30-40°C.

I. Wytwarzanie i odzyskanie nieprzeciętego polipeptydu.

A. Wbudowanie kwasu nukleinowego do ulegającego replikacji wektora.

Kwasem nukleinowym kodującym polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania jest dogodnie cDNA lub genomowy DNA z jakiegokolwiek źródła przy założeniu, że koduje polipeptyd(y) będący przedmiotem zainteresowania.

Heterologiczny kwas nukleinowy (np. cDNA lub genomowy DNA) jest odpowiednio wbudowany do ulegającego replikacji wektora dla ekspresji w bakterii, pod kontrolą odpowiedniego promotora. Dla tych celów dostępnych jest wiele wektorów i selekcja odpowiedniego wektora będzie zależała głównie od wielkości kwasu nukleinowego, który będzie wbudowany do wektora i określonej komórki gospodaPL 206 286 B1 rza, która będzie stransformowana wektorem. Każdy wektor zawiera różne składniki, zależnie od konkretnej komórki gospodarza, z którą jest zgodny. Zależnie od konkretnego typu gospodarza składniki wektora ogólnie obejmują, lecz będąc ograniczone do jednej lub więcej poniższych: sekwencji sygnałowej, miejsca inicjacji replikacji, jednego lub większej liczby genów markerowych, promotora i sekwencji terminatora transkrypcji.

Ogólnie, wektory plazmidowe zawierające replikon i sekwencje kontrolujące pochodzące od gatunków zgodnych z komórkami gospodarza są stosowane w połączeniu z gospodarzami E. coli. Wektor zazwyczaj niesie miejsce replikacji, jak również sekwencje markerowe zdolne do zapewnienia stransformowanym komórkom fenotypu podlegającego selekcji. Przykładowo, E. coli jest typowo transformowana przy pomocy pBR322, plazmidu pochodzącego z gatunków E. coli (patrz np. Bolivar i wsp., Gene, 2:95 (1977)). Plazmid pBR322 zawiera geny oporno ś ci na ampicylinę i tetracyklinę i co za tym idzie zapewnia łatwy sposób identyfikacji stransformowanych komórek. Plazmid pBR322 lub inny plazmid bakteryjny lub fag ogólnie zawiera również lub jest zmodyfikowany tak aby zawierał promotory, które mogą być użyte przez gospodarza E. coli dla ekspresji genów markerów selekcyjnych.

(i) Składnik-sekwencja sygnałowa

DNA kodujący polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania może być wyrażony nie tylko bezpośrednio, lecz również jako fuzja z innym polipeptydem, korzystnie sekwencją sygnałową lub innym polipeptydem posiadającym miejsce cięcia na N-końcu dojrzałego polipeptydu. Ogólnie, sekwencja sygnałowa może być składnikiem wektora lub może być częścią DNA dla polipeptydu, który jest wbudowany do wektora. Wybrana heterologiczna sekwencja sygnałowa powinna być taką, która jest rozpoznawana i ulega obróbce (tj. jest cięta przez sygnałową peptydazę) przez komórki gospodarza.

Dla komórek gospodarza, które nie rozpoznają i nie prowadzą obróbki sekwencji sygnałowej natywnego lub eukariotycznego polipeptydu, sekwencja sygnałowa jest podstawiona przez odpowiednią prokariotyczną sekwencję sygnałową wybraną przykładowo z grupy obejmującej lidery alkalicznej fosfatazy, penicylinazy, lpp lub termostabilnej enterotoksyny 2.

(ii) Składnik - miejsce inicjacji replikacji

Wektory ekspresyjne zawierają sekwencję kwasu nukleinowego umożliwiającą wektorowi replikację w jednym lub większej liczbie komórek gospodarza. Sekwencje takie są dobrze znane dla różnych bakterii. Miejsce inicjacji replikacji z plazmidu pBR322 jest odpowiednie dla bakterii Gram-ujemnych, takich jak E. coli.

(iii) Składnik - gen selekcyjny

Wektory ekspresyjne ogólnie zawierają gen selekcyjny, określany również jako marker selekcyjny. Gen ten koduje białko niezbędne dla przeżycia lub wzrostu stransformowanych komórek gospodarza rosnących w pożywce selekcyjnej. Komórki gospodarza nie stransformowane wektorem zawierającym gen selekyjny nie przeżyją w pożywce hodowlanej. Ten marker selekcyjny jest oddzielony od markerów genetycznych tak jak wykorzystywany i zdefiniowany przez niniejszy wynalazek. Typowe geny selekcyjne kodują białka, które (a) nadają oporność na antybiotyki lub inne toksyny, np. ampicylina, neomycyna, metotreksat lub tetracyklina, (b) komplementują wymagania auksotroficzne inne niż te, wywołane obecnością znacznika(ów) genetycznych lub (c) dostarczają krytycznych substancji odżywczych niedostępnych w pożywce pełnej, np. kodujący racemazę D-alaniny z Bacilli.

Przykładowy schemat selekcji wykorzystuje lek dla zahamowania wzrostu komórki gospodarza. W tym wypadku komórki, które są pomyś lnie stransformowane kwasem nukleinowym b ę d ą cym przedmiotem zainteresowania wytwarzają polipeptyd nadający oporność na lek i tym samym umożliwiają przeżycie w warunkach selekcyjnych. Przykłady takiej, dominującej selekcji wykorzystują leki, neomycynę (Southern i wsp., J. Molec. Appl. Genet., 1: 327 (1982)), kwas mykofenolowy (Mulligan i wsp., Science 209:1422 (1980)) lub higromycynę (Sugden i wsp., Mol. Cell. Biol., 5:410-413 (1985)). Trzy podane wyżej przykłady wykorzystują geny bakteryjne pod kontrolą eukariotyczną zapewniające oporność na odpowiedni lek, odpowiednio, G418 lub neomycynę (genetycyna), xgpt (kwas mykofenolowy) lub higromycynę.

(iv) Składnik - promotor

Wektor ekspresyjny dla wytwarzania polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania zawiera odpowiedni promotor, który jest rozpoznany przez organizm gospodarza i jest połączony funkcjonalnie z kwasem nukleinowym kodującym będący przedmiotem zainteresowania polipeptyd. Promotory dogodne do użycia z prokariotycznymi gospodarzami obejmują systemy promotora beta-laktamazy i laktozy (Chang i wsp., Nature 275: 615 (1978); Goeddel i wsp., Nature, 281: 544 (1979)), system promotora arabinozy (Guzman i wsp., J. Bacteriol., 174:7716-7728 (1992)), system promotora

PL 206 286 B1 alkalicznej fosfatazy i tryptofanu (trp) (Goeddel, Nucleic Acid Res. 8:4057 (1980) i EP 36,776) oraz hybrydowe promotory takie jak promotor tac (deBoer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)). Jednakże odpowiednie są inne promotory bakteryjne. Ich sekwencje nukleotydowe zostały opublikowane co umożliwia biegłemu pracownikowi funkcjonalne włączenie ich do DNA kodującego interesujący polipeptyd (Siebenlist i wsp., Cell, 20:269 (1980)) przy pomocy łączników lub adaptorów dla zapewnienia wymaganych miejsc restrykcyjnych.

Promotory dla zastosowania w systemach bakteryjnych ogólnie zawierają również sekwencję Shine-Dalgarno (S.D.) połączoną funkcjonalnie z DNA kodującym polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania. Promotor może być pobrany z bakteryjnego źródła DNA przez trawienie enzymem restrykcyjnym i wbudowany do wektora zawierającego pożądany DNA.

(v) Konstrukcja i analiza wektorów

Konstrukcja dogodnych wektorów zawierających jeden lub więcej wyżej wyszczególnionych składników wykorzystuje standardowe techniki ligacji. Wyizolowane plazmidy lub fragmenty DNA są przecinane, dobudowuje im się końce i ponownie są łączone (ligowane) w postaci pożądanej dla wytworzenia wymaganych plazmidów.

Dla analizy dla potwierdzenia poprawności sekwencji w skonstruowanych plazmidach mieszaniny ligacyjne są użyte dla transformacji szczepu 294 E. coli K12 (ATCC 31,446) lub innych szczepów i pomyślnie uzyskane transformanty są selekcjonowane, tam gdzie jest to odpowiednie, pod kątem na oporności na ampicylinę lub tetracyklinę. Plazmidy z transformantów są przygotowane, analizowane przez trawienie endonukleazą restrykcyjną i/lub sekwencjonowane metodą według Sangera i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977) lub Messing i wsp., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981) albo metodą według Maxama i wsp., Methods in Enzymology, 65:499 (1980).

B. Selekcja i transformacja komórek gospodarza

Jak określono powyżej wiele typów komórek bakterii Gram-ujemnych może być użytych dla celów uzyskania braku genu yfcK, i te, które wspomniano powyżej, są ich przykładami. Szczep E. coli W3110 jest korzystnym szczepem rodzicielskim, ponieważ jest powszechnie stosowanym szczepem gospodarza dla fermentacji produktów zrekombinowanego DNA. Korzystnie, komórki gospodarza powinny wydzielać minimalne ilości enzymów proteolitycznych. Przykładowo, szczep W3110 może być zmodyfikowany dla uzyskania mutacji genetycznej w genach kodujących białka, a przykłady takich gospodarzy E. coli, wraz z ich genotypami, zamieszczono w tabeli poniżej.

Szczep	Genotyp
1	2
W3110	K-12 F lambda IN(rrnD-rrnE)l
1A2	W3110 \fhuA lub W3110 tonAΔ
7C1	W3110 \fhuA \(argF-lac)169 phoAΔE15
9E4	W3110\ fhuA ptr3
16C9	W3110 \fhuA \(arg-F-lac)169 phoAΔE15 deoC2
23E3	W3110 ΔfhuA Δ(arg-F-lac)169 phoAΔE15 deoC2 degP::kanR
27A7	W3110 \fhuA ptr3 phi\E15 \(argF-lac)169
27C6	W3110ΔfhuA ptr3 phoA\E15 Δ(argF-lac)169)ompT
27C7	W3110 \fhuA ptr3 phoA\E15 Δ(argF-lac)169 ΔompT degP41 ΔpstI-kanR)
33B6	W3110 \fhuA \(arg-F-lac)169 phoA\E15 deoC2 degP::kanR ilvG2096
33D3	W3110 \fhuA ptr3 laclq lacL8 \ompT degP41 \pstI-kanR)
36F8	W3110 \fhuA phoA\E15 \(argF-lac)169 ptr3 degP41 \pstI-kanR) ilvG2096R
37D6	W3110 tonAA ptr3 phoA\E15 \(argF-lac)169 ompT\ degP41kanr rbs7\ ilvG
40B4	Szczep 37D6 z delecją degP bez oporności na kanamycynę

PL 206 286 B1

c.d. tabeli

40G3	W3110tonA\ phoA\E15 Δ(argF-lac)169 deoC \ompT degP41 (\Pstl-kanr) ilvG2096R phn(EcoB)
43D3	W3110 \fhuA ptr3 phoA\E15 \(argF-lac)169 \ompT degP41 \Pstl-kanr) ilvG2096R
43E7	W3110 \fhuA \(argF-lac)169 \ompT ptr3 phoA\E15 degP41 \Pstl-kans) ilvG2096R
44D6	W3110 \fhuA ptr3 \(argF-lac)169 degP41 \pstl-kans) \ompT ilvG2096R
45F8	W3110 \fhuA ptr3 \(argF-lac)169 degP41 \pstl-kans) \ompT phoS* (T10Y) ilvG2096R
45F9	W3110 \fhuA ptr3 \(argF-lac)169 degP41 \pstl- kans) \ompT ilvG2096R phoS* (T10Y) \cyo::kanR

Również użyteczne są szczepy pośrednie dla otrzymania szczepu 36F8, tj. 27B4 (patent US nr 5,304,472) i 35E7 (spontaniczna kolonia odporna na temperaturę będąca izolatem rosnącym lepiej niż 27B4). Kolejnym, użytecznym szczepem jest szczep E. coli posiadający zmutowaną peryplazmatyczną proteazę ujawniony w patencie US nr 4,946,783 nadanym 7 sierpnia 1990.

Zmutowana komórka według niniejszego wynalazku może być wytworzona przez wbudowanie genu yfcK do chromosomu, do komórki rodzicielskiej lub przy pomocy innych technik obejmujących te podane w przykładach poniżej.

Kwas nukleinowy kodujący polipeptyd jest wbudowany do komórek gospodarza. Kwas nukleinowy jest wprowadzony do odpowiedniej komórki gospodarza przy zastosowaniu jakiegokolwiek użytecznego sposobu obejmującego transformację wektorem kodującym polipeptyd. Transformacja oznacza wprowadzenie DNA do organizmu tak, że DNA ulega replikacji, zarówno jako element pozachromosomowy lub przez włączenie do chromosomu. Zależnie od użytej komórki gospodarza, transformacja jest dokonana przy pomocy typowych sposobów odpowiednich dla takich komórek. Działanie wapniem w którym wykorzystuje się chlorek wapnia jak to opisano w rozdziale 1.82 Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nowy Jork: Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989), jest ogólnie stosowane w przypadku komórek prokariotycznych lub innych komórek posiadających istotne bariery ściany komórkowej. Inny sposób transformacji wykorzystuje glikol polietylenowy/DMSO, jak to opisano w Chung i Miller, Nucleic Acids Res., 16:3580 (1988). Jeszcze innym sposobem jest użycie techniki nazwanej elektroporacją.

Przykładowa transformacji przez wbudowanie genu kodującego polipeptyd do genomu gospodarza E. coli wymaga wbudowania do wektora dla transformacji sekwencji DNA, która jest komplementarna do sekwencji znalezionej w genomowym DNA E. coli. Transformacja E. coli wektorem prowadzi do rekombinacji homologicznej z genomem i wbudowania genu kodującego polipeptyd. Korzystnie, kwas nukleinowy jest wbudowany przez przeniesienie komórek gospodarza z wyżej opisanymi wektorami ekspresyjnym i hodowanie w zwykłej pożywce odżywczej zmodyfikowanej w sposób odpowiedni dla indukcji różnych promotorów.

C. Hodowanie komórek gospodarza

Komórki gospodarza użyte dla wytworzenia polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania, według niniejszego wynalazku są hodowane w odpowiedniej pożywce jak to ogólnie opisano np. w Sambrook i wsp., jak wyżej.

Dla wydzielania wyeksprymowanego lub nadeksprymowanego produktu genu, komórka gospodarza jest hodowana w warunkach dogodnych dla wydzielania produktu genu. Takie warunki obejmują np. temperaturę, substancje odżywcze i warunki zagęszczenia komórek umożliwiające wydzielanie przez komórkę. Ponadto, takie warunki są tymi, w których komórka może realizować podstawowe funkcje komórkowe transkrypcję, translację i przenoszenie białek z jednego przedziału komórkowego do drugiego, co jest znane fachowcom w tej dziedzinie.

Gdy użyty jest promotor alkalicznej fosfatazy, komórki E. coli użyte dla wytworzenie polipeptydu według niniejszego wynalazku hoduje się w odpowiedniej pożywce, w której promotor alkalicznej fosfatazy może być częściowo lub całkowicie zaindukowany jak to opisano ogólnie np. w Sambrook i wsp., jak wyżej. Hodowanie nie powinno nigdy mieć miejsca przy braku nieorganicznego fosforu lub w warunkach głodu fosforanowego. Po pierwsze, pożywka zawiera nieorganiczny fosforan w ilości powyżej poziomu indukcji syntezy białka i dostatecznej dla wzrostu bakterii. Wraz ze wzrostem komórek i wykorzystaniem poziom fosforanu w pożywce ulega obniżeniu, co w konsekwencji powoduje indukcję syntezy polipeptydu.

PL 206 286 B1

Jakiekolwiek inne niezbędne składniki pożywki, włącznie ze źródłami węgla, azotu i nieorganicznego fosforanu mogą również być uwzględnione w odpowiednich stężeniach, wprowadzone same lub jako mieszanina z innymi składnikami pożywki, takimi jak złożone źródło azotu. Pożywka może mieć jakiekolwiek pH w zakresie 5-9, głównie w zależności od organizmu gospodarza.

Jeśli promotor jest promotorem indukowalnym, dla zajścia indukcji, typowo komórki są hoduje się aż do osiągnięcia określonej gęstości optycznej np. A550 wynoszącego około 200, wykorzystując proces z wysoką gęstością komórek, przy której zachodzi zapoczątkowanie indukcji (np. przez dodanie induktora, przez usunięcie składnika pożywki, itp.), w celu indukcji ekspresji kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania.

D. Wykrywanie ekspresji

Ekspresja kwasu nukleinowego może być zmierzona bezpośrednio w próbce, przykładowo przy pomocy klasycznej techniki Southerna, techniki northern dla ilościowego oznaczenia transkrypcji mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), techniki kroplowej (ang. dot blot) (analiza DNA) lub hybrydyzacji in situ, przy pomocy odpowiedniej wyznakowanej sondy, opierając się na sekwencjach polipeptydu. Różne znaczniki mogą być użyte, najczęściej radioizotopy, szczególnie ³²P. Jednakże, mogą również być użyte inne techniki, tak jak zastosowanie zmodyfikowanych biotyną nukleotydów dla wprowadzenia do polinukleotydu. Następnie biotyna służy jako miejsce dla wiązania awidyny lub przeciwciał, które mogą być wyznakowane bardzo różnymi znacznikami takimi jak radionuklidy, fluoresceiny, enzymy i tym podobne. Alternatywnie, dla wykrycia białka można zastosować oznaczenia lub żele.

Procedury dla obserwowania, czy produkt genu ulegającego ekspresji lub nadekspesji jest wydzielony są łatwo dostępne dla biegłego praktyka. Gdy pożywka hodowlana jest oddzielona od komórek gospodarza, przykładowo przez wirowanie lub filtrowanie, produkt genu może być następnie wykryty w pożywce wolnej od komórek dzięki znanym właściwościom charakterystycznym dla produktu genu. Takie właściwości mogą obejmować wyróżnialne właściwości immunologiczne, enzymatyczne lub fizyczne produktu genu.

Przykładowo, jeśli produkt genu ulegającego nadekspresji ma unikalną aktywność enzymatyczną przeprowadzone może być oznaczenie tej aktywności na pożywce hodowlanej wykorzystywanej przez komórki gospodarza. Ponadto, gdy dostępne są przeciwciała reaktywne wobec danego produktu genu, przeciwciała takie mogą być użyte dla wykrycia produktu genu, przy pomocy jakiegokolwiek znanego oznaczenia immunologicznego (np. jak w Harlowe i wsp., Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nowy Jork, 1988).

Wydzielony produkt genu może również być wykryty przy pomocy testów wyróżniających polipeptydy na podstawie charakterystycznych właściwości fizycznych, takich jak masa cząsteczkowa. Aby wykryć właściwości fizyczne produktu genu, wszystkie nowo zsyntetyzowane przez komórkę gospodarza polipeptydy mogą być wyznakowane, np. radioizotopem. Powszechnie stosowany radioizotop, który może być użyty dla wyznakowania polipeptydów zsyntetyzowanych w komórce gospodarza obejmuje tryt (³H), węgiel-14 (¹⁴C), siarkę-35 (³⁵S) i tym podobne. Przykładowo, komórka gospodarza może być hodowana na podłożu z ³⁵S-metioniną lub ³⁵S-cysteiną i znaczące ilości znacznika ³⁵S będą preferencyjnie wbudowane do nowo syntetyzowanych polipeptydów, obejmując ulegające nadekspresji heterologiczne polipeptydy. Następnie usunięta jest pożywka hodowlana zawierająca ³⁵S i komórki są płukane i umieszczane w świeżej nie radioaktywnej pożywce hodowlanej. Po przetrzymaniu komórek w świeżej pożywce, przez czas i w warunkach wystarczających dla umożliwienia wydzielania wyznakowanych ³⁵S, wyrażonych heterologicznych polipeptydów, pożywka hodowlana jest zebrana i oddzielona od komórek gospodarza. Następnie może być oznaczona masa cząsteczkowa wydzielonych, wyznakowanych polipeptydów w pożywce hodowlanej, przy pomocy znanych sposobów jak np. elektroforeza w żelu poliakrylamidowym. Takie procedury i/lub inne procedury dla wykrycia wydzielonych produktów genu są dostarczone w Goeddel, D.V. (wyd.) 1990, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, tom 185 (Academic Press) oraz Sambrook i wsp., jak wyżej.

E. Odzyskiwanie/oczyszczanie

Po wytworzeniu, polipeptyd może być odzyskany z komórek w jakikolwiek odpowiedni sposób zależny, przykładowo od tego, z jakiej części komórki jest odzyskiwany. Polipeptyd może być odzyskany z cytoplazmy, peryplazmy lub pożywki hodowlanej. Polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania jest korzystnie odzyskiwany z pożywki hodowlanej jako wydzielony polipeptyd. Polipeptyd ten odczyszcza się od zrekombinowanych białek komórkowych lub polipeptydów dla uzyskania preparatów, które są zasadniczo homogenne, np. pod względem polipeptydu będącego przedmiotem zaintePL 206 286 B1 resowania. Jako pierwszy etap, pożywka hodowlana lub lizat jest odwirowywany dla usunięcia fragmentów komórki. Błony i rozpuszczalne frakcje białkowe mogą być następnie rozdzielone, jeśli to konieczne. Polipeptyd może być następnie oczyszczony z rozpuszczalnej frakcji białkowej i z frakcji błonowej lizatu komórkowego, zależnie od tego czy polipeptyd jest związany z błoną, jest rozpuszczalny lub występuje w postaci zagregowanej. Następnie polipeptyd jest rozpuszczany i poddawany refałdowaniu, jeśli to niezbędne, i jest oczyszczany od zanieczyszczających rozpuszczalnych białek i polipeptydów. Jakikolwiek typowy etap usuwania zanieczyszczeń przeciętego polipeptydu z mieszaniny jest wyeliminowany ze schematu oczyszczania, ponieważ aminopeptydaza nie jest już dłużej obecna. W korzystnej postaci, zagregowany polipeptyd jest izolowany, po czym następuje etap rozpuszczania i refałdowania jak to opisano w patencie US nr 5,288,931.

W szczególnie korzystnym wykonaniu odzyskiwanie następuje z peryplazmy przez rozbicie komórek (przy pomocy technik jakie podano powyżej) dla utworzenia lizatu, a następnie przez oczyszczenie nienaruszonego, nieprzeciętego polipeptydu z lizatu. Korzystnie, lizat jest inkubowany przed oczyszczaniem. Korzystniej, lizat jest inkubowany przez przynajmniej 1 godziny, w około 20-25°C, jeszcze korzystniej przez około 2-50 godzin w temperaturze pokojowej, jeszcze korzystniej przez około 5-45 godzin w temperaturze pokojowej i najkorzystniej przez około 20-30 godzin w temperaturze pokojowej.

Następujące procedury są przykładowo odpowiednimi procedurami oczyszczania: frakcjonowanie na kolumnach powinowactwa immunologicznego lub jonowymiennej; wytrącenie etanolem; HPLC z odwróconymi fazami; chromatografia na żywicy krzemionkowej lub kationowymiennej, takiej jak DEAE; chromatoogniskowanie; SDS-PAGE; wytrącanie siarczanem amonu i sączenie molekularne przy pomocy, przykładowo, kolumn SEPHADEX G-75™.

II. Wytwarzanie i odzyskiwanie przeciętego polipeptydu

W tym, alternatywnym procesie, doprowadza się do kontaktowania polipeptydu bezpośrednio z polipeptydem aminopeptydazy b2324 tak, że jest przycięty. Może być to osiągnięte szeregiem sposobów obejmujących inkubację w około 20-40°C, korzystnie w około 30-40°C przez czas w zakresie do około 50 godzin, korzystnie przynajmniej około 1 godzinę do 45 godzin. W korzystnym aspekcie tego sposobu doprowadzanie do kontaktu, wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania przeciętego polipeptydu, obejmującego hodowanie komórek bakterii niosących gen yfcK i zawierających kwas nukleinowy kodujący odpowiedni nieprzecięty polipeptyd posiadający dodane aminokwasy na swoim N-końcu. Hodowanie jest w warunkach takich, że ekspresji lub nadekspresji ulega gen yfcK i ekspresji ulega kwas nukleinowy kodujący nie przecięty polipeptyd i jeśli nieprzecięty polipeptyd i białko aminopeptydazy B2324 nie mają kontaktu po ekspresji, doprowadzenie do kontaktu nieprzeciętego polipeptydu z białkiem aminopeptydazy b2324 dla wytworzenia przeciętego polipeptydu. Korzystnie, doprowadzenie do kontaktu jest poprzez inkubowanie w warunkach podanych powyżej, a hodowanie ma miejsce w fermentorze.

W korzystnym aspekcie polipeptyd jest heterologiczny dla komórek, korzystniej jest polipeptydem eukariotycznym a jeszcze korzystniej polipeptydem ssaczym, szczególnie ludzkim. Korzystną komórką jest komórka Salmonella lub Enterobacteriaceae, jeszcze korzystniej komórka E. coli, a szczególnie W3110. Również preferowana jest komórka z brakiem przynajmniej jednego genu kodującego proteazę, taka jak degP lub fhuA lub obie.

W korzystnym aspekcie warunki hodowli są takie, że gen yfcK ulega nadekspresji. Gen yfcK może być naturalnym dla komórek bakterii lub do nich wprowadzonym, np. przez transformację wektorem niosącym taki gen.

W kolejnym, korzystnym aspekcie nieprzecięty polipeptyd jest odzyskiwany z komórek przed doprowadzeniem do kontaktu z białkiem aminopeptydazy b2324 i nieprzecięty polipeptyd jest odzyskiwany z peryplazmy lub pożywki z hodowli komórkowej. W jednym z wykonań, odzyskanie odbywa się poprzez rozbicie komórek (jak opisano powyżej) do postaci lizatu, dodawana jest aminopeptydaza i następnie przecięty polipeptyd jest oczyszczony z lizatu. Korzystnie, w tym przypadku lizat jest inkubowany z aminopeptydazą przed etapem oczyszczania. Korzystniej, lizat jest inkubowany przez przynajmniej około 1 godzinę w około 20-40°C, jeszcze korzystniej przez około 2-50 godzin w około 30-40°C, jeszcze korzystniej przez około 5-45 godzin w około 30-40°C i najkorzystniej przez około 20-30 godzin w około 35-38°C przed etapem oczyszczenia.

Gdy przecięte polipeptydy są przygotowane przez rekombinowanie, rodzicielskie szczepy, warunki hodowli, wykrycie ekspresji, odzyskanie/oczyszczanie i podstawowe techniki są jak ogólnie podano powyżej. Jednakże, dla nadekspresji w szczepie, który będzie hodowany, typowo gen yfcK, zarówno

PL 206 286 B1 endogenny (w chromosomie) jak i egzogenny dla komórki gospodarza jest połączony funkcjonalnie z indukowanym promotorem tak, ż e gen moż e ulec nadekspresji, gdy promotor jest zaindukowany. Hodowanie korzystnie ma miejsce w warunkach, w których ekspresja genu yfcK jest zaindukowana przed indukcją ekspresji kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd. Odpowiednie techniki dla nadekspresji użytecznych tu genów obejmują te, opisane przez Joly i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2773-2777 (1998); patent US nr 5,789,199 i 6,639,635; Knappik i wsp., Bio/Technology, 11(1):77-83 (1993) i Wulfing i Pluckthun, Journal of Molecular Biology, 242 (5) : 655-69 (1994).

Wynalazek został zilustrowany poniższymi przykładami.

P r z y k ł a d 1

Materiały i metody

Sekwencje DNA namnażano poprzez rekcję PCR powyżej i poniżej genu yfcK kodującego b2324, zidentyfikowanego przez projekt sekwencjonowania genomu (zestawienie według GenBank Blattner i wsp., jak wyżej). Następnie te połączone sekwencje) wrekombinowano do chromosomu szczepu W3110 przez transdukcję P1 i przeszukanie przy pomocy PCR pod kątem delecji (Metcalf i wsp., Gene, 138 : 1-7 (1994)) dla wytworzenia szczepu 61G3 o genotypie W3110ΔfhuA A(arg-F-lac)169 phoAAE15 deoC2 degP::kanR ilvG2096 AyfcK.

Dokładniej, szczep ten skonstruowano w szeregu etapach, przy pomocy technik obejmujących transdukcję fagiem P1kc, pochodzącym od P1 (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) i genetyki transpozonowej (Kleckner i wsp., J. Mol. Biol., 116:125-159 (1977)). Wyjściowo użytym gospodarzem była E. coli K-12 W3110, która jest szczepem K-12, który jest Flambda^- (Bachmann, Bact. Rev., 36:525-557 (1972); Bachmann, „Derivations and Genotypes of Some Mutants Derivatives of Escherichia coli K-12” str. 1190-1219 w F.C. Neidhardt i wsp., wyd. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, torn 2, American Society for Microbiology, Waszyngton D.C., 1987). Wprowadzenie mutacji tonA (fhuA) do genomu opisano szczegółowo w patencie US nr 5,304,472 nadanym 19 kwietnia 1994. Insercja Tn10 w gen ilv została wprowadzona przez transdukcję P1. Auksotrof izoleucyna/walina został transdukowany do prototrofa przy pomocy faga P1 rosnącego na szczepie niosącym mutację ilvG2096^R (Lawther i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:922-925 (1981)) co naprawiło mutację typu zmiany ramki odczytu, która powodowała, że szczep E. coli K-12 typu dzikiego był wrażliwy na walinę. Mutacja degP41 kan^r jest opisana w patencie US nr 5,304,472. Locus ilvG2096^R może być potwierdzony przez odporność gospodarza 33B6 na walinę w stężeniu 40 μg/ml (0,3 ) mM). Dwie mutacje delecyjne phoAAE15 i A(argF-lac)169 są opisane w patencie US nr 5,304,472. Mutacja deoC2 jest opisana w Mark i wsp., Mol. Gen. Genet., 155:145-152 (1977). Całkowite wyprowadzenie szczepu 61G3 przedstawiono na fig. 1.

Szczep ten następnie stransformowano plazmidem ekspresyjnym oznaczonym hGH4R, który wyraża i wydziela hGH (z N-końcową fenyloalaniną), zarówno w wytrząsanej kolbie jak i 10-1 fermentacjach. Konstrukcja phGH4R jest podana szczegółowo w Chang i wsp., Gene, 55:189-196 (1987). Ta transformacja doprowadziła do powstania szczepu JJGH1. Komórki hodowano jak opisano w Andersen i wsp., Biotechnology and Bioengineering, 75(2), 212-218 (2001). Nieoczyszczony lizat przygotowano przez rozbijanie ultradźwiękami komórek po wytworzeniu hGH i lizat inkubowano w 37°C przez 0 do 24 godzin w 37°C i w temperaturze pokojowej przez 0 do 42 godzin. Użycie wyższej temperatury poprawiło zdolność wykrycia des-phe i des-phe-pro hGH przy zastosowaniu sposobu oznaczenia, lecz nie było korzystne dla oczyszczania hGH. Normalnie, oczyszczanie hGH jest przeprowadzone w chłodzie dla zmniejszenia ilości przyciętych postaci.

To samo doświadczenie przeprowadzono przy pomocy szczepu rodzicielskiego jako kontroli (16C9 o genotypie W3110 AfhuA A(argF-lac)169 phoAAE15 deoC2) stransformowanego phGH4R. Szczep ten jest użyteczny dla tych celów bowiem mutacje degP i ilvG w szczepie 60G3 nie mają wpływu na aktywność aminopeptydazy.

Kontrola i próbki doświadczalne były następnie odwirowane dla usunięcia cząstek i rozpuszczone fazy zbadano przez LC-MS (chromatografia cieczowa, analiza przez spektrometrię mas). Śledzono masy dla niezmienionej postaci des-phe i des-phe-pro hGH.

Wyniki

Figury 2 i 4 pokazują, odpowiednio wyniki dla inkubacji w temperaturze pokojowej i 37°C dla szczepu kontrolnego (16C9/phGH4R) a fig. 3 i 5 pokazują, odpowiednio wyniki dla inkubacji w temperaturze pokojowej i 37°C dla JJGH1, który posiada nokaut aminopeptydazy. Aktualną numerację dla czterech figur przedstawiono poniżej w tabeli 1 (poniżej Temp=37°C i Temp=RT). Można dostrzec, że

PL 206 286 B1 zasadniczo nie ma zanieczyszczeń z przyciętą fenyloalaniną po 15 godzinach inkubacji w 37°C i nawet bez inkubacji następuje obniżenie ilości zanieczyszczeń. Można również dostrzec, że nawet w przypadku inkubacji w temperaturze pokojowej ilość zmutowanego polipeptydu pozbawionego N-końcowej fenyloalaniny jest zmniejszona w linii komórek JJGH1 w porównaniu z kontrolą we wszystkich czasach inkubacji. Oczyszczenie niezmienionego polipeptydu można łatwo przeprowadzić tradycyjnie lub znanymi sposobami chromatograficznymi.

T a b e l a 1

Temp = 37°C
	Powierzchnia	Powierzchnia %
Próbka	Czas	des-phe	Natywne	des-phe-pro	des-phe	Natywne	des-phe-pro
Kontrola	0	16159.80	4486460.00	19642.70	0.36	99.21	0.43
JJGHl	0	11927.90	3376380.00	7637.14	0.35	99.42	0.22
Kontrola	15	14372.30	1097210.00	976760.00	46.77	52.53	0.69
JJGHl	15	27163.70	2674010.00	16357.80	1.00	98.40	0.60
Kontrola	24	1058950.00	839418.00	17580.50	55.27	43.81	0.92
JJGH1	24	29409.90	2306690.00	11999.30	1.25	98.23	0.51
Temp = RT
		Powierzchnia	Powierzchnia %
Próbka	Czas	des-phe	Natywne	des-phe-pro	des-phe	Natywne	des-phe-pro
Kontrola	0	16159.80	4486460.00	19642.70	0.36	99.21	0.43
JJGHl	0	11927.90	3376380.00	7637.14	0.35	99.42	0.22
Kontrola	15	46158.20	364234.00	7950.57	1.24	98.53	0.21
JJGHl	15	183740.00	19431400.00	39130.00	0.94	99.06	0.20
Kontrola	24	100774.00	4561070.00	19501.10	2.15	97.43	0.42
JJGHl	24	160737.00	19711600.00	98221.60	0.80	98.70	0.49
Kontrola	42	122177.00	3933770.00	19246.40	3.00	96.53	0.47
JJGHl	42	213143.00	18242500.00	91090.90	1.15	98.36	0.49

Wyniki pokazują, że szczep ΔyfcK może być użyty dla zapobiegania N-końcowemu cięciu polipeptydów.

Claims (34)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Komórka Gram-ujemnej bakterii, w której chromosomalny gen jest inaktywowany lub uszkodzony, przy czym gen ten ma co najmniej 80% identyczności sekwencji z (a) cząsteczką DNA kodującą naturalną sekwencję aminopeptydazy b2324 o sekwencji aminokwasowej od 1 do 688 z SEQ ID NO:2 lub (b) komplement cząsteczki DNA z (a) i kodujący aminopeptydazę.
2. 2. Komórka Gram-ujemnej bakterii, w której chromosomalny gen jest inaktywowany lub uszkodzony, przy czym gen ten ma co najmniej 80% identyczności z sekwencją naturalną genu yfcK posiadającego sekwencję nukleotydową od 1 do 2067 z SEQ ID NO:1 i kodujący aminopeptydazę.
3. 3. Komórka według zastrz. 1 lub 2, którą jest Salmonella lub Enterobacteriaceae.
4. 4. Komórka według zastrz. 3, którą jest E. coli.
5. 5. Komórka według zastrz. 4, z niedoborem co najmniej jednego genu kodującego proteazę.
6. 6. Komórka według zastrz. 4, z niedoborem naturalnej sekwencji genu yfcK.
7. 7. Komórka według zastrz. od 1 do 6, zawierająca kwas nukleinowy kodujący polipeptyd heterologiczny dla komórki.

   PL 206 286 B1
8. 8. Komórka wed ług zastrz. 7, znamienna tym, ż e polipeptyd jest polipeptydem ssaczym.
9. 9. Komórka wed ług zastrz. 8, znamienna tym, ż e polipeptyd jest polipeptydem ludzkim.
10. 10. Komórka według zastrz. 9, znamienna tym, że polipeptyd jest ludzkim hormonem wzrostu.
11. 11. Sposób wytwarzania heterologicznego peptydu obejmujący (a) hodowanie komórki zdefiniowanej w zastrz. 7-10 i (b) odzyskiwanie polipeptydu z komórki.
12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w fermentorze a polipeptyd jest odzyskiwany z peryplazmy lub pożywki hodowlanej komórki.
13. 13. Sposób według zastrz. 11 lub 12, znamienny tym, że odzyskiwanie prowadzi się przez rozbicie komórek do postaci lizatu i niezmieniony polipeptyd oczyszcza się z lizatu.
14. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że lizat inkubuje się przed etapem oczyszczenia.
15. 15. Sposób zapobiegania N-końcowemu odcinaniu aminokwasu od polipeptydu, znamienny tym, że hoduje się komórkę zdefiniowaną w zastrz. od 1 do 10, przy czym komórka zawiera kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, w warunkach takich, że kwas nukleinowy ulega ekspresji.
16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że polipeptyd odzyskuje się z komórki.
17. 17. Sposób odcinania N-końcowego aminokwasu od peptydu wyizolowanego z komórki, znamienny tym, że kontaktuje się polipeptyd z aminopeptydazą kodowaną przez kwas nukleinowy o co najmniej 80% identyczności sekwencji z (a) cząsteczką DNA kodującą naturalną sekwencję aminopeptydazy b2324 o sekwencji reszt aminokwasowych od 1 do 688 z SEQ ID NO:2 lub (b) komplementu cząsteczki DNA z (a).
18. 18. Sposób odcinania N-końcowego aminokwasu z polipeptydu wyizolowanego z komórki, znamienny tym, że kontaktuje się polipeptyd z aminopeptydazą o mniej niż 80% identyczności sekwencji z naturalną sekwencję aminopeptydazy b2324 o sekwencji aminokwasowej od 1 do 688 z SEQ ID NO:2.
19. 19. Sposób według zastrz. 17 lub 18, znamienny tym, że polipeptyd jest inkubowany z aminopeptydazą.
20. 20. Sposób według zastrz. od 17 do 19, znamienny tym, że polipeptyd jest kontaktowany z naturalną sekwencją aminopeptydazy b2324.
21. 21. Sposób wytwarzania skróconego polipeptydu, znamienny tym, że hoduje się komórki bakterii Gram-ujemnych niosących kwas nukleinowy o przynajmniej 80% identyczności sekwencji z (a) cząsteczką DNA kodującą naturalną sekwencję aminopeptydazy b2324 o sekwencji aminokwasowej od 1 do 688 z SEQ ID NO: 2 lub (b) komplement cząsteczki DNA z (a) i kodujący aminopeptydazę, które to komórki zawierają kwas nukleinowy kodujący odpowiadający nie skrócony polipeptyd posiadający dodany na jego N-końcu aminokwas, przy czym hodowlę prowadzi się w warunkach takich, aby kwas nukleinowy kodujący aminopeptydazę b2324 uległ nadekspresji, aby zaszła ekspresja kwasu nukleinowego kodującego nie skrócony polipeptyd i jeśli nie skrócony polipeptyd i aminopeptydaza nie kontaktują się po ekspresji, to kontaktuje się ten nie skrócony polipeptyd z aminopeptydazą wytwarzając skrócony polipeptyd.
22. 22. Sposób wytwarzania skróconego polipeptydu, znamienny tym, że hoduje się komórki bakterii Gram-ujemnych niosących kwas nukleinowy o co najmniej 80% identyczności z naturalną sekwencją genu yfck posiadającego sekwencje nukleotydów od 1 do 2067 w SEQ ID NO:1 i kodującego aminopeptydazę, które to komórki zawierają kwas nukleinowy kodujący odpowiadający nie skrócony polipeptyd posiadający dodany na jego N-końcu aminokwas, przy czym hodowlę prowadzi się w warunkach takich, aby zaszła nadekspresja kwasu nukleinowego kodującego aminopeptydazę b2324 i aby zaszł a ekspresja kwasu nukleinowego kodują cego nie skrócony polipeptyd i jeś li ten nie skrócony polipeptyd i aminopeptydaza nie kontaktują się po ekspresji, kontaktuje się ten nie skrócony polipeptyd z aminopeptydazą wytwarzając skrócony polipeptyd.
23. 23. Sposób według zastrz. 21 lub 22, znamienny tym, że hoduje się komórki E. coli niosące naturalną sekwencję genu yfcK i nie skrócony polipeptyd następnie kontaktuje się z naturalną sekwencją aminopeptydazy b2324.
24. 24. Sposób według zastrz. 21 do 23, znamienny tym, że polipeptyd jest heterologiczny dla komórek.
25. 25. Sposób według zastrz. 21 do 23, znamienny tym, że polipeptyd jest polipeptydem ssaczym.
26. 26. Sposób według zastrz. 21 lub 22, znamienny tym, że komórki są z niedoborem co najmniej jednego genu kodującego proteazę.
27. 27. Sposób według zastrz. 21 lub 22, znamienny tym, że kontaktowanie prowadzi się przez inkubację.

    PL 206 286 B1
28. 28. Sposób według zastrz. 21 lub 22, znamienny tym, że kwas nukleinowy kodujący aminopeptydazę jest naturalnym dla komórek bakterii.
29. 29. Sposób według zastrz. 21 lub 22, znamienny tym, że kwas nukleinowy kodujący aminopeptydazę jest wprowadzony do komórek bakterii.
30. 30. Sposób według zastrz. 21 lub 22, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w fermentorze i nie skrócony polipeptyd odzyskuje się z komórek przed kontaktowaniem z aminopeptydazą .
31. 31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że polipeptyd odzyskuje się z periplazmy lub pożywki hodowlanej komórki.
32. 32. Sposób według zastrz. 30 lub 31, znamienny tym, że odzyskiwanie prowadzi się przez rozbicie komórki do postaci lizatu i skrócony peptyd jest oczyszczany z lizatu.
33. 33. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że lizat inkubuje się przed etapem oczyszczenia.
34. 34. Sposób według zastrz. 32 do 33, znamienny tym, że lizat inkubuje się przez co najmniej

    1 godz. w 20-40°C.