ES2329880T3

ES2329880T3 - Aminopeptidasa b2324.

Info

Publication number: ES2329880T3
Application number: ES02761635T
Authority: ES
Inventors: John C. Joly
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2001-09-13
Filing date: 2002-09-12
Publication date: 2009-12-02
Anticipated expiration: 2022-09-12
Also published as: US6921659B2; HU0600310D0; CA2460309C; DK1432793T3; HU225243B1; PT1432793E; KR100956907B1; IL160658A; US20030124664A1; KR20090018142A; US7229787B2; US7632658B2; CN100552023C; KR100954641B1; HUP0401869A3; US20080160572A1; EP1432793B1; JP2005502359A; NZ544964A; CN1555412A

Abstract

Célula bacteriana gram-negativa en la que un gen cromosómico está inactivado o incapacitado, cuyo gen tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con (a) una molécula de ADN que codifica una aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de 1 a 688 de SEC ID NO:2 o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a), y que codifica una aminopeptidasa.

Description

Aminopeptidasa b2324.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se refiere al descubrimiento de nuevas aminopeptidasas bacterianas. Más particularmente, la presente invención está dirigida a una importante actividad enzimática la eliminación o sobreexpresión de la cual por las bacterias mejora la recuperación respectiva de polipéptidos no separados o separados producidos en las bacterias, tales como polipéptidos recombinantes.

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2. Descripción de la técnica relacionada

Algunas proteínas tienen su residuo de aminoácido N-terminal separado cuando se producen en bacterias gram negativas y archaebacterias, tales como E. coli debido a la presencia de aminopeptidasas en las células. Como resultado, se introduce una impureza estrechamente relacionada con el polipéptido de tipo salvaje en el cultivo celular de manera simultánea o después de la posterior lisis celular como parte del proceso de purificación del producto. Esta impureza debe eliminarse del polipéptido de tipo salvaje si se van a preparar proteínas terapéuticamente útiles. Un ejemplo es la hormona del crecimiento humano (hGH) que tiene su residuo fenilalanina N-terminal separado cuando se produce en E. coli. Esta forma variante de hGH (hGH des-phe), producida tras la lisis celular para formar una mezcla con la hGH separada (hGH nativa), es difícil de eliminar de la mezcla. Dicha eliminación requiere someter la mezcla a una cromatografía de interacción hidrofóbica. Sería deseable evitar esta etapa de purificación
adicional.

Adicionalmente, se desea en algunos casos obtener polipéptidos con el residuo de aminoácido N-terminal separado para amplificar las cantidades de dichos polipéptidos en relación con la secuencia nativa equivalente para obtener un material separado más puro.

US 4865974 describe una Met-aminopeptidasa y su uso para separar proteínas en sistemas de expresión bacterianos.

Varias de las aminopeptidasas de E. coli conocidas tienen una amplia especificidad y pueden dividir un conjunto de residuos en el extremo N-terminal, por ejemplo, pepA, pepB, y pepN (Escherichia coli and Salmonella, Frederick C. Neidhardt (Ed), ASM Press. Chapter 62 por Charles Miller-Protein Degradation and Proteolytic Modification, pp 938-954 (1996): Gonzales and Robert-Baudouy, FEMS Microbiology Reviews. 18 (4):319-44 (1996). El gen yfcK que codifica b2324 hallado en la cepa K 12 de E. coli se indicó como "peptidasa hipotética" por el proyecto de secuenciación del genoma de E. coli (Blauner et al., Science, 277: 1453-62 (1997)) en base de datos GenBank (número de acceso AE000321), pero no se proporciona más información sobre su actividad enzimática. El homólogo en la cepa de E. coli O157:H7 es idéntico al gen yfcK en la cepa K12. Existe una necesidad en la técnica de identificar aminopeptidasas bacterianas que se puedan manipular para obtener polipéptidos no separados o separados más
puros.

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Descripción resumida de la invención

La enzima b2324 codificada por yfcK se ha identificado ahora como una aminopeptidasa, es decir, una enzima responsable de la separación de los extremos N-terminales de los polipéptidos. Tras su identificación, la presente invención es tal como se reivindica.

En una realización, los genes que codifican homólogos de aminopeptidasas a esta enzima, incluyendo el gen yfcK que codifica la aminopeptidasa b2324, se eliminan de las cepas bacterianas gram negativas, como mediante la destrucción genética del cromosoma, de manera que la impureza separada no se produce más en ningún grado significativo. La etapa de purificación adicional para eliminar la impureza separada es así eliminada. Se ha observado por lo menos una cepa resultante para producir un polipéptido no separado en cantidades iguales a las cepas
parentales.

Específicamente, se proporciona una célula bacteriana gram negativa en que un gen cromosómico tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con (a) un gen inactivado o incapacitado, el cual tiene una molécula de ADN que codifica la aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 1 a 688 de la SEC ID No. 2, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a), y que codifica una aminopeptidasa. El equivalente natural de dichas células contiene el gen cromosómico, pero las células de esta invención representan una manipulación a la célula de tipo natural, generalmente a través medios genéticos, pero mediante cualquier medio disponibles, para eliminar o incapacitar dicho gen, de manera que no codifique una aminopeptidasa.

Aún alternativamente, la presente invención proporciona una célula bacteriana gram-negativa en la que un gen cromosómico está inactivado o incapacitado, el cual tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con el gen yfcK de secuencia nativa que tiene la secuencia de nucleótidos de 1 a 2067 de SEC ID NO:1 y que codifica una aminopeptidasa.

En otra realización, se proporciona una célula E. coli que es deficiente en el gen yfcK cromosómico de secuencia nativa.

Preferiblemente, dichas células indicadas anteriormente son deficientes en por lo menos un gen que codifica una proteasa, por ejemplo, degP o fhuA. Adicionalmente, dichas células pueden comprender un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo a la célula, preferiblemente eucariota, más preferiblemente mamífera, y lo más preferible humana, tal como la hormona del crecimiento humano.

En otra realización, la presente invención proporciona un método para producir un polipéptido heterólogo que comprende (a) cultivar las células indicadas anteriormente y (b) recuperar el polipéptido de las células. Preferiblemente el cultivo tiene lugar en un fermentador. En otra realización preferida, el polipéptido se recupera del periplasma o del medio de cultivo de la célula. En una realización preferida adicional, la recuperación es mediante la destrucción celular para formar un lisado, y preferiblemente se purifica el polipéptido intacto del lisado. Más preferido es cuando el lisado se incuba antes de la etapa de purificación.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de prevención de la separación del N-terminal de un residuo de aminoácido de un polipéptido que comprende cultivar las células descritas anteriormente, donde las células comprenden un ácido nucleico que codifica el polipéptido, bajo condiciones en las que se expresa el ácido nucleico. Preferiblemente, se recupera el polipéptido de las células. Además, preferiblemente, el polipéptido es heterólogo a las células, más preferiblemente eucariotas, más preferiblemente mamíferas y lo más preferible humanas. La célula es preferiblemente una célula de E. coli.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para dividir un aminoácido N-terminal de un polipéptido aislado de una célula que comprende poner en contacto el polipéptido con una aminopeptidasa codificada por un ácido nucleico que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con (a) una molécula de ADN que codifica una aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de 1 a 688 de la SEC ID No. 2, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a). Preferiblemente, el polipéptido se incuba con la aminopeptidasa.

Alternativamente, se proporciona un método para separar un aminoácido N-terminal de un polipéptido aislado de una célula que comprende poner en contacto el polipéptido con una aminopeptidasa que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con la aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de 1 a 688 de la SEC Id No. 2.

En un aspecto específico, se proporciona un método para separar una aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprender poner en contacto el polipéptido con la aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa.

En otra realización, un método de producción de un polipéptido separado comprende cultivar células bacterianas gram-negativas que albergan un ácido nucleico que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con (a) una molécula de ADN que codifica una aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de 1 a 688 de la SEC Id No. 2, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) y que codifica una aminopeptidasa, cuyas células comprenden ácido nucleico que codifica el correspondiente polipéptido no separado que tiene un aminoácido añadido en su extremo N-terminal, donde el cultivo se realiza bajo condiciones para sobreexpresar el ácido nucleico que codifica la aminopeptidasa b2324 y para expresar el ácido nucleico que codifica el polipéptido no separado, y si los polipéptidos no divididos y aminopeptidasa no están en contacto después de la expresión, poner en contacto el polipéptido no separado con la aminopeptidasa para producir el polipéptido separado. En un aspecto preferido, el polipéptido es heterólogo a las células, más preferiblemente eucariotas, incluso más preferiblemente mamíferas y lo más preferible humanas.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de producción de un polipéptido separado que comprende cultivar células bacterianas gram-negativas que albergan un ácido nucleico que tiene por lo menos un 805 de identidad en la secuencia con el gen yfcK de secuencia nativa que tiene la secuencia de nucleótidos de 1 a 2067 de la SEC ID No. 1 y que codifica una aminopeptidasa, cuyas células comprenden ácido nucleico que codifica el correspondiente polipéptido no separado que tiene un aminoácido añadido en su extremo N-terminal, donde el cultivo es bajo condiciones para expresar el ácido nucleico que codifica la aminopeptidasa b2324 y para expresar el ácido nucleico que codifica el polipéptido separado, y si el polipéptido no separado y la aminopeptidasa no están en contacto después de la expresión, poner en contacto el polipéptido no separado con la aminopeptidasa para producir el polipéptido separado.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de producción de un polipéptido separado que comprende cultivar células de E. coli que albergan el gen yfcK de secuencia nativa y que comprende ácido nucleico que codifica el correspondiente polipéptido no separado que tiene un aminoácido añadido en su extremo N-terminal, donde el cultivo es bajo condiciones para expresar o sobreexpresar el gen yfcK y para expresar el ácido nucleico que codifica el polipéptido no separado, y si el polipéptido no separado y la aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa codificada por el gen yfcK no están contacto después de la expresión, poner en contacto el polipéptido separado con la aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa para producir el polipéptido separado.

En los métodos anteriores para producir un polipéptido separado, los aspectos preferidos incluyen aquellos en los que la célula es deficiente en por lo menos un gen que codifica una proteasa, y/o las condiciones de cultivo son tales que el gen yfcK (secuencia nativa y homólogas) se sobreexpresa y/o el contacto es mediante incubación. El gen yfcK (secuencia nativa y homólogas) puede ser nativo a las células bacterianas o se pueden introducir en las células bacterianas. El cultivo tiene lugar preferiblemente en un fermentador. El polipéptido no separado se recupera preferiblemente de las células antes del contacto con la aminopeptidasa, donde la recuperación puede ser del periplasma o del medio de cultivo de las células o mediante la destrucción celular para formar un lisado del cual se purifica el polipéptido separado. Además, el lisado se puede incubar antes de la etapa de purificación.

Preferiblemente, el lisado se incuba durante por lo menos aproximadamente 1 hora, más preferiblemente aproximadamente 2-50 horas, a aproximadamente 20-40ºC, más preferiblemente a aproximadamente 30-40ºC.

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Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa un diagrama de la derivación de la célula de E. coli G1G3, una cepa huésped con yfcK eliminado (que codifica b2324).

La figura 2 muestra un gráfico de barras del área porcentual (cromatografía líquida/espectroscopía de masas, LC/MS) de la cepa de control 16C9 por extracción de rhGH incubada a temperatura ambiente durante 0, 15, 24 y 42 horas, con las cantidades de hGH nativa, hGH desfenilalanina y hGH des-fenilalanina-prolina mostradas con diferentes sombreado.

La figura 3 muestra un gráfico de barras del área porcentual (LC/MS) de la cepa G1G3 de rhGH en que se ha eliminado el gen incubada a temperatura ambiente durante 0, 15, 24, y 42 horas, con cantidades de hGH nativa, hGH des-fenilalanina y hGH des-fenilalanina-prolina con diferente sombreado.

La figura 4 muestra un gráfico de barras del área porcentual (cromatografía líquida/espectroscopía de masas; LC/MS) de la cepa de control 16C9 por extracción de rhGH incubada a 37ºC durante 0, 15, y 24 horas, con cantidades de hGH nativa, hGH des-fenilalanina y hGH des-fenilalanina-prolina con diferente sombreado.

La figura 5 muestra un gráfico de barras del área porcentual (LC/MS) de la cepa G1G3 de rhGH en que se ha eliminado el gen incubada a 37ºC durante 0, 15, y 24 horas, con cantidades de hGH nativa, hGH des-fenilalanina y hGH des-fenilalanina-prolina con diferente sombreado.

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Descripción detallada de las realizaciones preferidas Definiciones

Tal como se utiliza aquí, las expresiones "célula", "línea celular", "cepa" y "cultivo celular" se utilizan indistintamente y todas estas designaciones incluyen la progenie. De este modo, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y cultivos derivados de las mismas sin considerar el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie no puede ser exactamente idéntica en el contenido de ADN debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que se criba en la célula originalmente transformada. Cuando se pretenda indicar designaciones diferentes, quedará claro a partir del texto.

Las "bacterias" para los objetivos de la presente invención son bacterias gram-negativas. Un tipo preferido de bacterias es Enterobacteriacene. Ejemplos de bacterias que pertenecen a Enterobacteriaceae se incluyen Escherichia, Enterobacter, Envinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, y Shigella. Otros tipos de bacterias adecuadas incluyen Azotobacter, Pseudomonas, Rhizobia, Vitreoscilia, y Paracoccus. Huéspedes de E. coli adecuados incluyen E. coli W3110 (ATCC 27.325), E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B, y E. coli X 1776 (ATCC 31.537). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes, y se prefiere W3110. También se pueden utilizar células mutantes de cualquiera de las bacterias mencionadas anteriormente. Es necesario, naturalmente, seleccionar las bacterias apropiadas teniendo en consideración la replicabilidad del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, las especies de E. coli, Serratia o Salmonella se pueden utilizar de forma adecuada como el huésped cuando se utilizan plásmidos bien conocidos, tales como pBR322, pBR325, pACYC177, o pKN410 para suministrar el
replicón.

El "gen yfcK cromosómico" se refiere al gen que codifica la proteína b2324 indicada como "peptidasa hipotética" por el proyecto de secuenciación del genoma de E. coli (Blattner et al., supra) en la base de datos de GenBank (número de acceso AE000321). La proteína tiene un número de acceso Dayhoff B65005 y el número de acceso de SwissProt P77182, y el gen se localiza en el cromosoma de E. coli en 52.59', y su localización de pares de bases= extremo izquierdo: 2439784 bp Extremo derecho: 2441790 bp. Su secuencia génica es:

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1

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y la proteína codifica por la misma tiene la secuencia:

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"Deficiente" en un gen o ácido nucleico significa que la célula tiene el gen en cuestión inactivado o incapacitado, de manera que no produce la proteína que codifica. Por ejemplo, las células deficientes en el gen yfcK cromosómico que codifica b2324 no producen el producto de ese gen cuando se cultivan. De manera similar, una célula deficiente en un gen que codifica una proteasa no produce esa proteasa concreta cuando se cultiva.

Tal como se utiliza en la presente invención, "polipéptido" se refiere en general a péptidos y proteínas de cualquier origen celular que tiene más de aproximadamente diez aminoácidos. Polipéptidos "heterólogos" son aquellos polipéptidos extraños a la célula huésped que se utilizan, tales como proteína humana producida por E. coli. Aunque el polipéptido heterólogo puede ser procariota o eucariota, preferiblemente es eucariota, más preferiblemente mamífera, lo más preferible humana.

Ejemplos de de polipéptidos de mamíferos se incluyen moléculas, tales como, por ejemplo, renina, una hormona del crecimiento, incluyendo la hormona del crecimiento humano; hormona de crecimiento bovino; factor de liberación de hormona de crecimiento; hormona de paratiroides; hormona estimulante de la tiroides; lipoproteínas; 1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; trombopoietina; hormona estimulante de folículos; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación tales como Factor VIIIC, factor IX, factor tisular, y factor de von Willebrands; factores anticoagulantes, tales como Proteína C; factor naturiético atrial; tensoactivo de pulmón; un activador de plasminógeno, tal como uroquinasa o orina humana o activador de plasminógeno del tipo tejido (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; factor alfa y beta de necrosis tumoral; encefalinasa; una albúmina del suero, tal como albúmina de suero humano; sustancia inhibidora mulleriana; cadena a de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; DNasa; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrópico, tal como factor neurotrópico derivado de cerebro (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso, tal como NGF; cardiotrofinas (factor de hipertrofia cardíaca), tal como cardiotrofina-1 (CT-1); factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos, tales como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF), tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF- 1, TGF- 2, TGF- 3, TGF- 4, o TGF- 5; factor de crecimiento de tipo insulina I y II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I de cerebro), proteínas de unión al factor de crecimiento de tipo insulina; proteínas CD, tales como CD-3, CD-4, CD-8, y CD-19; critropoictina; factores osteoinductivos; inmunotoxinas; un proteína morfogenética (BMP); un interferón, tal como interferón-alfa, -beta, y -gamma; albúmina de suero, tal como albúmina de suero humana (HSA) o albúmina de suero bovino (BSA); factores estimulantes de factores (CSFs), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF, y G-CSF; interleuquinas (ILs), por ejemplo, IL-1 a IL-10; anticuerpo anti-HER-2; superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de la membrana de superficie; factor acelerante de descomposición; antígeno viral, tal como, por ejemplo, una parte de la envoltura del SIDA; proteínas de transporte; receptores "homing"; adresinas, proteínas reguladoras; anticuerpos; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos indicados anteriormente. Un grupo preferido de polipéptidos de interés son aquellos que tienen una fenilalanina N-terminal, tal como hGH. Otro grupo preferido de polipéptidos de interés son aquellos producidos en el periplasma o el medio de cultivo celular de las bacterias, tal como hGH.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para bacterias incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribo-
soma.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está situado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o secuencia líder secretora está unido operativamente a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está situado para facilitar la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen están contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora, contiguas y en fase de lectura. La unión se realiza, por ejemplo, mediante la unión en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan según la práctica convencional.

El término "sobreexpresión" con respecto a un gen o ácido nucleico se refiere a la síntesis de proteínas específicas en mayores cantidades que son producidas normalmente por la célula cuando no hay una inducción artificial de dicha síntesis, como, por ejemplo, mediante un promotor.

El término "recuperación" de de un polipéptido significa en general obtener el polipéptido libre de las células en las que se produjo.

Los términos "polipéptido aminopeptidasa b2324", "proteína aminopeptidasa b2324" y "aminopeptidasa b2324" cuando se utilizan aquí comprenden la aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa y homólogos de aminopeptidasa b2324 (que se definen posteriormente en la presente. Dependiendo del contexto, los polipéptidos aminopeptidasa b2324 se pueden aislar de una serie de fuentes, tales como de células bacterianas o se pueden preparar mediante métodos recombinantes y/o sintéticos.

Una "aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos como la aminopeptidasa b2324 derivada de la naturaleza. Dicha aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa se puede aislar de la naturaleza o se puede produce mediante medios recombinantes y/o sintéticos. El término "aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa" comprende específicamente formas truncadas o secretadas naturales (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular), formas de variantes naturales (por ejemplo, formas de corte y empalme alternativo) y variantes alélicas naturales de la aminopeptidasa b2324. En una realización de la invención, la aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa es una aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa madura o de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 688 de la SEC ID NO:2.

"Homólogo de aminopeptidasa b2324" significa una aminopeptidasa que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de residuos 1 a 688 del polipéptido aminopeptidasa b2324 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2. Dichos homólogos de aminopeptidasa b2324 incluyen, por ejemplo, polipéptidos aminopeptidasa b2324 en los que se añaden, o eliminan, en el extremo N o c terminal, uno o más residuos de aminoácidos, así como en uno o más dominio internos, de la secuencia de SEC ID No. 2. Preferiblemente, un homólogo de aminopeptidasa 2324 tendrá por lo menos aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos, e incluso más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de residuos 1 a 688 de la SEC ID NO:2. Los homólogos no comprenden la secuencia nativa.

Un gen yfcK indica un gen que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con (a) una molécula de ADN que codifica una aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de 1 a 688 de SEC ID NO:2, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a), y que codifica una aminopeptidasa, y también indica un gen que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con el gen yfcK cromosómico que tiene la secuencia completa de residuos de ácidos nucleicos de SEC ID NO:1 y que codifica una aminopeptidasa. Dichos genes yfcK incluyen, por ejemplo, el gen yfcK cromosómico donde se añaden, o eliminan, uno o más residuos de ácidos nucleicos en el extremo 5' o 3', así como en una parte interna, de la secuencia de SEC Id No. 1. Preferiblemente, un gen yfcK tendrá por lo menos aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, e incluso más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, son la secuencia de ácidos nucleicos de los nucleótidos 1 a 2067 de SEC ID NO:1. Este término incluye el gen yfcK de secuencia nativa (es decir, el gen yfcK cromosómico).

El "porcentaje (%) de identidad en la secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias de aminopeptidasa b2324 identificadas en la presente invención se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos en la secuencia de aminopeptidasa b2324, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad en la secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad en la secuencia. Los valores del % de identidad utilizados en la presente invención se pueden generar mediante WU-BLAST-2 que se obtuvo a partir de (Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html). WU-BLAST-2 utiliza varios parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales se fijan en los valores por defecto. Los parámetros ajustables se fijan con los siguientes valores: "overlap span" = 1, "overlap fraction" = 0,125, "word threshold" (T) = 11. Los parámetros HSP S y HSP S2 con valores dinámicos y son fijados por el propio programa dependiendo de la composición de la secuencia concreta y la composición de la base de datos concreta contra la cual se busca la secuencia de interés; sin embargo, los valores se pueden ajustar para aumentar la sensibilidad. Un valor del % de identidad en la secuencia de aminoácidos se determina mediante el número de residuos idénticos en el emparejamiento dividido por el número total de residuos de la secuencia "más larga" en la región alineada. La secuencia "más larga" es aquella que tiene los residuos más reales en la región alineada (se ignoran los espacios introducidos por WU-Blast-2 para maximizar la puntuación del alineamiento).

El término "porcentaje (%) de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a la secuencia codificante de los polipéptidos aminopeptidasa b2324 identificados en la presente invención se define como el porcentaje de residuos de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de nucleótidos en la secuencia codificante de la aminopeptidasa b2324. Los valores de identidad utilizados en la presente invención se pueden generar mediante el módulo BLASTN de WU-BLAST-2 fijado a los parámetros por defecto, con "overlap span" y "overlap fraction" fijados a 1 y 0,125, respectivamente.

"Aislado", cuando se utiliza describe los diversos polipéptidos descritos en la presente invención, significa el polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que interferirían normalmente con usos diagnósticos o terapéuticos para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta la homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ en las células recombinantes, ya que por lo menos un componente del medio natural de la aminopeptidasa b2324 no estará presente. Normalmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de
purificación.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" que codifica un polipéptido aminopeptidasa b2324 es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está normalmente asociada en el medio natural del ácido nucleico que codifica la aminopeptidasa b2324. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la aminopeptidasa b2324 es diferente de la que está en la forma o tal como se establece en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aisladas se diferencian por tanto de la molécula de ácido nucleico que codifica la aminopeptidasa b2324 tal como se existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido aminopeptidasa b2324 incluye las moléculas de ácido nucleico que codifican la aminopeptidasa b2324 contenidas en células que normalmente expresan la aminopeptidasa b2324 donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.

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Modos para llevar a cabo la invención

En un aspecto, la presente invención se refiere a ciertas cepas de células huésped bacterianas que carecen de una aminopeptidasa (es decir, una enzima que separa el residuo de aminoácido situado en el extremo N-terminal de los polipéptidos, tal como uno que separa entre una fenilalanina N-terminal y otro aminoácido adyacente al mismo), permitiendo así una mejor purificación del polipéptido.

Específicamente, la presente invención proporciona, en este aspecto, células bacterianas gram-negativas deficientes en un gen cromosómico (cuyo gen no es deficiente en una versión de tipo salvaje de dichas células) que tienen por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con (a) una molécula de ADN que codifica la aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa que tiene los residuos de la secuencia de aminoácidos de 1 a 688 de la SEC ID No. 2, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a), y que codifica una aminopeptidasa. Es decir, dicho gen comparte por lo menos un 80% de identidad en la secuencia del gen yfcK. Preferiblemente, este gen comparte por lo menos aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia, y lo más preferible un 100% de identidad en la secuencia con la secuencia del gen yfcK (que codifica la aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa).

En otro aspecto, las células bacterianas gram-negativas son deficientes en un gen cromosómico (cuyo gen no es deficiente en una versión de tipo salvaje de dichas células) que codifica una aminopeptidasa que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con la aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de 1 a 688 de SEC ID NO: 2. Preferiblemente, la aminopeptidasa tiene por lo menos aproximadamente un 85%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia. Esto incluye células deficientes en el gen yfcK cromosómico de secuencia nativa.

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En un tercer aspecto, las células bacterianas gram-negativas son deficientes en un gen cromosómico ((cuyo gen no es deficiente en una versión de tipo salvaje de dichas células), cuyo gen comprende (a) ADN que codifica un polipéptido que consigue por lo menos un 80% de positivos cuando se compara con la secuencia de residuos de aminoácidos de la aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa que comprende de 1 a 688 de la SEC Id No. 2, o (b) el complemento del ADB de (a), siendo dicho polipéptido una aminopeptidasa. Esto incluye células que tienen un 100% de positivos cuando se comparan con la secuencia nativa de la aminopeptidasa b2324.

Las células que son objeto de este aspecto de la presente invención son bacterias gram-negativas, por ejemplo, las bacterias con genomas secuenciados, tales como Salmonella, Yersinia, Haemophilus, Caulobacter, Agrobacterium, Vibrio etc.), donde se prevé un homólogo de yfcK. Más preferiblemente, la célula es Salmonella o Enterobacteriaceae, aún más preferiblemente E. coli, lo más preferible W3110.

La célula es opcionalmente además deficiente en uno o más de otros genes cromosómicos presentes en las versiones de tipo natural de dichas células, tales como aquellos genes que codifican proteasas bacterianas. Se conocen cepas de E. coli deficientes en proteasas o genes que controlan la regulación de proteasas (Beckwith y Strauch, WO 88/05821 publicada el 11 de agosto de 1988; Chaudhury y Smith, J. Bacteriol., 160: 788-791 (1984); Elish et al., J. Gen. Microbiol., 134: 1355-1364 (1988); Bancyx y Georgiou, "Expression of proteolytically sensitive polypeptides in Escherichia coli", en: Stability of Protein Pharmaceuticals, Vol. 3: Chemical and Physical Pathways of Protein Degradation, Ahern and Manning, eds. (Plenum Press, New York, 1992), pág. 69-108).

Se han utilizado algunas cepas deficientes en proteasas en los intentos para producir de manera eficaz péptidos proteolíticamente sensibles, particularmente aquellos de potencial médico o intereses comerciales. La patente de Estados Unidos No. 5.508.192 (de Georgiou et al.) describe la construcción de muchos huéspedes bacterianos deficientes de proteasas y/o deficientes de proteínas de choque térmico. Dichos huéspedes incluyen bacterias deficientes de proteasas individuales, dobles, triples o cuádruples y bacterias de proteasas individuales que también transportan una mutación en el gen rpoH. Entre los ejemplos de los genes de proteasas descritos se incluyen degP ompT ptr3, prc (tsp), y una cepa degP rpoH que se ha descrito que produce amplios títulos de proteínas recombinantes en E. coli. Park et al., Biotechnol. Prog., 15: 164-167 (1999) también describieron que una cepa (HM 114) deficiente en dos proteasas de la envoltura celular celulares (degP prc) creció un poco más rápidamente y produjo más proteínas de fusión que las otras cepas deficientes en más proteasas. Las células de la presente invención pueden ser deficientes en alguna o más de dichas proteasas, siendo las preferidas de dichas proteasas ptr3 cromosómico que codifica Proteasa III, ompT cromosómico que codifica la proteasa OmpT, y/o degP cromosómico que codifica la proteasa DegP. Las cepas también pueden ser deficientes en tonA (fhuA), phoA, y/o deoC. Preferiblemente, la célula es deficiente en degP y/o fhuA. Lo más preferible, la célula tiene el genotipo W3110 \DeltafhuA \Delta(arg-F -lac)1 69 phoA\DeltaE15 deoC2 degP::kanR ilvG2096 \DeltayfcK.

En otra realización, la célula comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo a la célula. El ácido nucleico se puede introducir en la célula mediante cualquier medio, pero se utiliza preferiblemente para transformar el ácido nucleico, como mediante el uso de un vector de expresión recombinante o mediante recombinación homóloga, lo más preferible mediante un vector.

Ejemplos de polipéptidos heterólogos adecuados son aquellos definidos anteriormente e incluyen proteínas y polipéptidos que empiezan con un residuo de metionina y tienen fenilalanina como segundo residuo, así como proteínas (es decir, aquellas que en la forma madura empiezan con una fenilalanina o se procesan posteriormente proteolíticamente para eliminar la metionina inicial y aquellas que son preproteínas donde se ha separado el péptido señal para dejar la Phe como el extremo N-terminal de la proteína madura, tal como la hormona de crecimiento humana). Por tanto, para este objetivo se incluye en la presente cualquier polipéptido heterólogo a la célula bacteriana en la que se produce, donde el extremo amino del producto maduro o final es Phe.

Los ejemplos de polipéptidos humanos que cumplen con este requisito de la situación de la fenilalanina incluyen el precursor de la cadena alfa 2 de colágeno, el precursor de la cadena delta de la glicoproteína cd3 de la superficie de células T, precursor de insulina, precursor de integrina alfa-3, precursor de integrina alfa-5, precursor de integrina alfa-6, precursor de integrina alfa-7, precursor de integrina alfa-e, precursor de integrina alfa-m, precursor de integrina alfa-v, precursor de integrina alfa-x, precursor de la fosfatidilcolin-esterol aciltransferasa, precursor del antígeno 3 asociado con la función de los linfocitos, precursor de colagenasa intersticial, precursor de colagenasa de neutrófilo, precursor de motilina, precursor de neuropilina-1, precursor de acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas, precursor de la sialoproteína ii ósea, precursor de la hormona de crecimiento, (Seeburg, DNA 1: 239-249 (1982)), precursor de la somatotropina, precursor de la citoquina a13 inducible pequeña, precursor de la citoquina a27 inducible pequeña, precursor de la citoquina b11 inducible pequeña, precursor del miembro 8 de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, precursor de la cadena beta de tiotropina, precursor del factor c de crecimiento endotelial vascular, preproinsulina (BE885196-A), variante de la hormona de crecimiento humano HGH-V (EP89666-A), proinsulina humana (US4431740), péptido señal AP y hormona de crecimiento humano (hGH) codificado por pAP-1 (EP177343-A), precursor de la hormona de crecimiento humano (hGF) (EP245138-A), BMP humana (EP409472-A), proteína humana LFA-3 (CD58) (DE4008354-A), receptor de la interleuquina-1 de tipo II humana (EP460846-A), análogo de aprotinina #6 con nefrotoxicidad reducida (WO9206111-A), análogo de aprotinina #7 con nefrotoxicidad reducida (WO9206111-A), análogo de aprotinina #8 con nefrotoxicidad reducida (WO9206111-A), análogo de aprotinina #10 con nefrotoxicidad reducida (WO9206111-A), análogo de aprotinina #9 con nefrotoxicidad reducida (WO9206111-A), análogo de aprotinina #11 con nefrotoxicidad reducida (WO9206111-A), análogo de aprotinina #12 con nefrotoxicidad reducida (WO9206111-A), análogo de aprotinina #13 con nefrotoxicidad reducida (WO9206111-A), análogo de aprotinina #14 con nefrotoxicidad reducida (WO9206111-A), subunidad de integrina alfa 6A (WO9219647-A), subunidad de integrina alfa 6B (WO9219647-A), proteína LFA-3 humana (EP517174-A), carboxipeptidasa B de plasma humano (US5206161-A), IL-1R derivado de linfoblastoide (WO9319777-A), LFA-3 humano (JP06157334-A), receptor humano inducido por la activación de linfocitos (ILA) (CA2108401-A), receptor de proteína de células endoteliales (WO9605303-A1), aciltransferasa de lecitina-colesterol humana (LCAT) (WO9717434-A2), antígeno CD30 soluble humano (DE9219038-U1), factor de crecimiento de tipo CCN pequeño humano (WO9639486-1), carboxipeptidasa B de plasma humano (US5593674-A), hormona de crecimiento humano (WO9820035-1), análogo de insulina codificado por un fragmento del plásmido pKFN-864 (EP861851-A1), polipéptido "IBICK" de quimioquina CXC de primate (WO9832858-A2), factor de crecimiento de tipo CCN pequeño humano (US5780263-A), secuencia de aminoácidos de hialuronidasa de plasma humano (hpHAsa) (WO9816655-A1), proteína IL-1R de tipo II humana (US5767064-A), homo sapiens proteína del clon CC365_40 de homo sapiens (W09807859-A2), hormona de crecimiento humano (US5955346-A), receptor de la hormona de crecimiento soluble humana (US5955346-A), proteína del antígeno CD30 humano (WO9940187-A1), neuropilina-1 humana (WO9929858-A1), polipéptido derivado de tejido de cerebro humano (clon OMB096) (WO9933873-A1), proteína Toll humana PRO285 (W09920756-A2), secuencia de aminoácidos de un péptido secretado humano (WO9911293-A1), secuencia de aminoácidos de un péptido secretado humano (WO9911293-A1), secuencia de aminoácidos de un péptido secretado humano (WO9911293-A1), secuencia de aminoácidos de un péptido secretado humano (WO9911293-A1), secuencia de aminoácidos de una proteína secretada humana (WO9907891-A1), secuencia de aminoácidos de una proteína secretada humana (WO9907891-A1), secuencia de aminoácidos de una proteína secretada humana (WO9907891-A1), thr147 de carboxipeptidasa B de plasma humano (PCPB) (WO9855645-A1), proteína MIG-beta de quimioquina humana (EP887409-A1), secuencia de aminoácidos de una proteína secretora humana (WO200052151-A2), proteína de fusión hGH/EGF humana codificada por el plásmido pWRG1630 (US6090790-A), proteína secretada humana codificada por el clon de ADNc 3470865 (W0200037634-A2), proteína FDF03DeltaTM derivada de monocito humano (WO200040721-A1), proteína FDF03-S1 derivada de monocito humano (WO200040721-A1), proteína FDF03-M14 derivada de monocito humano (WO200040721-A1), proteína FDF03-S2 derivada de monocito humano (WO200040721-A1), proteína secretada humana #2 (EP1033401-A2), prepro-factor C de crecimiento vascular endotelial humana (WO200021560-A1), proteína de transporte de membrana humana, MTRP-15 (W0200026245-A2), proteína C del factor de crecimiento endotelial vascular humana (VEGF) (WO200024412-A2), TANGO 191 humana (WO200018800-A1), Receptor-HKAEF92 de interferón (WO9962934-A1), subunidad alfa-10 de integrina humana (WO9951639-A1), variante por empalme de la subunidad alfa-10 de integrina humana (WO9951639-A1), homólogo de delta 1-pirrolin-5-carboxilato reductasa humana (P5CRH) (US6268192-B1), proteína del tipo factor 6 de diferenciación/crecimiento humana AMF10 (WO200174897-A2), proteína transportadora y del canal iónico 6 humana (TRICH-6) (W0200162923-A2), proteína transportadora y del canal iónico 7 humana (TRICH-7) (WO200162923-A2), proteína metaloproteinasa-1 de matriz humana (MMP-1) (WO200166766-A2), proteína metaloproteinasa-8 de matriz humana (MMP-8) (W0200166766-A2), proteína metaloproteinasa-18P de matriz humana (MMP-18P) (W0200166766-A2), proteína del receptor 6 acoplado con la proteína G humana (GPCR6) (W0200181378-A2), proteína Zlec1 humana (WO200166749-A2), proteína del tipo de metaloproteasa (MMP) de matriz humana (WO200157255-A1), proteína secretada HFXDI56 humana codificada por el gen 15 (WO200154708-A1), proteína secretada HTEGF16 humana codificada por el gen 9 (WO200154708-A1), proteína secretada humana (SECP) #4 (WO200151636-A2), proteína secretada HUSIB13 humana codificada por el gen 20 (WO200151504-A1), proteína secretada HISAQ04 humana codificada por el gen 28 (WO200151504-A1), proteína secretada HCNAH57 humana codificada por el gen 35 (WO200151504-A1), proteína secretada HBMCF37 humana codificada por el gen 17 (WO200151504-A1), proteína humana del gen 6 estimulado (TSG-6) por el factor de necrosis tumoral (TNF) (US6210905-B1), FCTR10 (WO200146231-A2), proteína secretada HFKHW50 humana codificada por el gen 18 (WO200136440-A1), proteína secretada HFKHW50 humana codificada por el gen 18 (WO200136440-A1), proteína secretada HE8FC45 humana codificada por el gen 13 (W0200077022-A1), proteína secretada HTLIF12 humana codificada por el gen 32 (WO200077022-A1), proteína secretada HCRPV17 humana codificada por el gen 4 (WO200134643-A1), proteína secretada HE8OK73 humana codificada por el gen 23 (WO200134643-A1), proteína secretada HCRPV17 humana codificada por el gen 4 (WO200134643-A1), proteína secretada HMSFK67 humana codificada por el gen 22 (WO200132676-A1), proteína secretada HMSFK67 humana codificada por el gen 22 (WO200132676-A1), proteína secretada HMSFK67 humana codificada por el gen 22 (WO200132676-A1), proteína secretada HCRNF14 humana codificada por el gen 19 (WO200134800-A1), proteína secretada HNEEB45 humana codificada por el gen 6 (WO200132687-A1), proteína secretada HNEEB45 humana codificada por el gen 6 (WO200132687-A1), proteína secretada HHPDV90 humana codificada por el gen 9 (WO200132675-A1), proteína secretada B7-H6 humana codificada por el gen 1 (WO200134768-A2), proteína secretada HDPMS12 humana codificada por el gen 3 (WO200134768-A2), proteína secretada HRABS65 humana codificada por el gen 13 (WO200134768-A2), proteína secretada HDPAP35 humana codificada por el gen 1 (W0200134768-A2), proteína secretada HDPMS12 humana codificada por el gen 3 (WO200134768-A2), proteína secretada HACCL63 humana codificada por el gen 17 (WO200134769-A2), proteína secretada HACCL63 humana codificada por el gen 17 (WO200134769-A2), proteína secretada HHEPJ23 humana codificada por el gen 10 (WO200134629-A1), proteína secretada HHEPJ23 humana codificada por el gen 10 (WO200134629-A1), proteína secretada HE9QN39 humana codificada por el gen 5 (WO200134626-A1), proteína secretada HCRNO87 humana codificada por el gen 14 (SEC 104)(WO200134626-A1), proteína secretada HE9QN39 humana codificada por el gen 5 (WO200134626-A1), proteína secretada HCRNO87 humana codificada por el gen 14 (SEC 145) (WO200134626-A1), proteína secretada HSODE04 humana codificada por el gen 4 (WO200134623-A1), proteína secretada HMZMF54 humana codificada por el gen 6 (WO200134623-A1), proteína secretada HPJAP43 humana codificada por el gen 18 (WO200134623-A1), proteína secretada HNTSL47 humana codificada por el gen 27 (WO200134623-A1), proteína secretada HSODE04 humana codificada por el gen 4 (WO200134623-A1), proteína secretada HMZMF54 humana codificada por el gen 6 (WO200134623-A1), proteína secretada HPJAP43 humana codificada por el gen 18 (WO200134623-A1), proteína secretada HNTSL47 humana codificada por el gen 27 (WO200134623-A1), proteína secretada HLJEA01 humana codificada por el gen 21 (WO200134767-A2), proteína secretada HTJNX29 humana codificada por el gen 25 (SEC 115) (WO200134627-A1), proteína secretada HTJNX29 humana codificada por el gen 25 (SEC 165) (WO200134627-A1), secuencia de aminoácidos de TANGO 509 humana (WO200121631-A2), proteína de TANGO 210 humana (WO200118016-A1), proteína 12 humana relacionada con el cáncer (WO200118014-A1), proteína 18 humana relacionada con el cáncer (WO200118014-A1), proteína B7-4 secretada (B7-4S) humana (WO200114557-A1), proteína de membrana B7-4 (B7-4M) humana (WO200114557-A1), proteína B7-4 secretada (B7-4S) humana (WO200114556-A1), proteína de membrana B7-4 (B7-4M) humana (WO200114556-A1), variante de interleuquina DNAX 80 humana (WO200109176-A2), aciltransferasa de lecitina-colesterol humana (LCAT) (WO200105943-A2), secuencia de aminoácidos del polipéptido humano PRO1419 (WO200077037-A2), secuencia de aminoácidos de una cadena de integrina alfa 1 humana (WO200075187-A1), A259 humana (WO200073339-A1), péptido derivado de la médula ósea humana (WO200166558-A1), proteína humana de la diana antigénica 169 asociada a tumor (TAT169) (WO200216602-A2), proteína secretada HKZA0351D humana codificada por el gen 3 (WO200218411-A1), proteína secretada HKZA035 humana codificada por el gen 3 (WO200218411-A1), proteína secretada HLYCK27 humana codificada por el gen 11 (WO200218435-A1), proteína INTG-1 humana (WO200212339-A2), proteína secretada HFPHA80 humana codificada por el gen 15, SEC 70 (WO200216390-A1), proteína secretada HFPHA80 humana codificada por el gen 15 SEC 94 (WO200216390-A1), proteína secretada HDQFU73 humana codificada por el gen 2, SEC 69 (WO200224719-A1), proteína secretada HDPTC31 humana codificada por el gen 8, SEC 75 (WO200224719-A1), proteína secretada HDQFU73 humana codificada por el gen 2, SEC 90 (WO200224719-A1), proteína secretada HDPRJ60 humana codificada por el gen 6, SEC 95 (WO200224719-A1), proteína secretada HDPTC31 humana codificada por el gen 8, SEC 99 (WO200224719-A1), proteína secretada HDPTC31 humana codificada por el gen 8, SEC 100 (WO200224719-A1), análogo de proinsulina humana (WO200204481-A2), proteína de diana antigénica asociada a tumor, TAT136 (WO200216429-A2), polipéptido de la diana antigénica asociado a tumor (TAT) 136 (WO200216581-A2), secuencia de proteína CD30 humana (WO200211767-A2), secuencia de la proteína interleuquina 1R2 humana (IL-1R2) (W0200211767-A2), proteína del receptor 7 de la proteína G humana (GPCR-7) (WO200206342-A2), receptor acoplado a la proteína G humana (GPCR6a) (W0200208289-A2), receptor acoplado a la proteína G humana (GPCR6b) (WO200208289-A2), receptor de la interleuquina-1 de tipo II humano (WO200187328-A2), polipéptidos A259 humana (WO200181414-A2), molécula de adhesión a células vasculares humanas, VCAM (US6307025-B1), molécula de adhesión a células vasculares humanas, VCAM1b (US6307025-B1), transportadores humanos y de canales iónicos (TRICH)-6 (WO200177174-A2), y la molécula 8 de modificación y mantenimiento de proteína humana (PMMM-8) (WO200202603-A2).

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para producir un polipéptido heterólogo que comprende (a) cultivar la célula que alberga el ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogos, y (b) recuperar el polipéptido de la célula. La recuperación puede ser del citoplasma, periplasma o medio de cultivo de la célula, aunque preferiblemente el polipéptido se recupera del periplasma o medio de cultivo de la célula. Preferiblemente, el cultivo tiene lugar en un fermentador. Los parámetros de cultivo se utilizan u la producción del polipéptido se realiza de una manera convencional, tal como los procedimientos descritos a continuación.

Cuando se produce el polipéptido deseado en el citoplasma, la incubación antes o después de la lisis de las células no es necesaria, aunque puede aumentar la eficacia de la formación del material separado. Cuando el polipéptido deseado se secreta en el periplasma o el medio de cultivo celular, entonces se prefiere una etapa de incubación y se recomienda durante por lo menos aproximadamente 0,5 horas. El método preferido para recuperar periplásmicamente los polipéptidos producidos es destruir o romper las células, utilizando, por ejemplo, homogenizadores, celdas de presión francesa, y microfluidizadores para volúmenes más amplios y sonicadores para volúmenes más pequeños. Se forma un lisado a partir de las células destruidas a partir del cual se puede purificar el polipéptido intacto. Preferiblemente, dicho lisado se incuba antes de la etapa de purificación. Esta incubación se puede realizar a cualquier temperatura adecuada, pero preferiblemente es a temperatura ambiente o inferior durante por lo menos aproximadamente 1 hora, más preferiblemente durante aproximadamente 2-50 horas. El polipéptido y tipo de células son preferiblemente tal como se ha establecido anteriormente.

Adicionalmente, la presente invención proporciona un método de prevención de la separación del extremo N-terminal de un residuo de aminoácido de un polipéptido que comprende el cultivo de la célula, donde la célula comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido, en condiciones en las que se expresa el ácido nucleico. Dichas condiciones de cultivo son convencionales y son conocidas por los expertos en la materia. Preferiblemente, el polipéptido se recupera de la célula. El polipéptido preferido y el tipo de célula se describen anterior-
mente.

Alternativamente, se aplica la situación inversa cuando el polipéptido separado se purifica del polipéptido no separado que es la impureza. En este aspecto, la presente invención proporciona un método para separar un aminoácido N-terminal de un polipéptido que comprende poner en contacto el polipéptido con la proteína aminopeptidasa b2324 tal como se ha descrito anteriormente, preferiblemente donde el contacto es mediante la incubación con la proteína aminopeptidasa b2324. Un método adicional para producir un polipéptido separado implica cultivar células de bacterias que albergan un gen yfcK (tanto si el gen es endógeno o heterólogo a las células) y que comprende ácido nucleico que codifica el correspondiente polipéptido no separado que tiene un aminoácido añadido en su extremo N-terminal, donde el cultivo se realiza bajo condiciones para expresar o sobreexpresar el gen yfcK y para expresar el ácido nucleico que codifica el polipéptido no separado, y si el polipéptido no separado y la proteína aminopeptidasa b2324 no están en contacto después de la expresión, poner en contacto el polipéptido no separado con la proteína aminopeptidasa b2324 para producir la proteína separada.

Preferiblemente, el polipéptido es heterólogo a las células, y más preferiblemente, es uno de los polipéptidos en las categorías indicadas anteriormente. Preferiblemente, el tipo de célula se selecciona de las establecidas anteriormente, excepto sin el gen yfcK eliminado. El gen yfcK se puede introducir como un vector o puede ser endógeno a la célula huésped, y preferiblemente se sobreexpresa en relación a la expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido para favorecer la reacción de separación enzimática.

En otro aspecto preferido, el polipéptido no separado se recupera de las células antes del contacto con la proteína aminopeptidasa b2324. En la recuperación, preferiblemente, las células se destruyen (utilizando las técnicas indicadas anteriormente) y, a continuación, se lisan. Después del lisado, el polipéptido no separado se incuba preferiblemente con la proteína aminopeptidasa b2324 para separar el extremo amino, y el polipéptido separado se purifica del lisado incubado. Preferiblemente, el lisado se incuba durante por lo menos aproximadamente 1 hora a aproximadamente 20-40ºC, más preferiblemente durante aproximadamente 2-50 horas a aproximadamente 30-
40ºC.

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I. Producción y recuperación de polipéptido no separado A. Inserción de ácido nucleico en un vector replicable

El ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés es de forma adecuada ADNc o ADN genómico de cualquier origen, siempre que codifique el polipéptido o polipéptidos de interés.

El ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, ADNc o AND genómico) se inserta de manera adecuada en un vector replicable para la expresión en la bacteria bajo el control de un promotor adecuado. Existen muchos vectores para este objetivo y la selección del vector adecuado dependerá principalmente del tamaño del ácido nucleico a insertar en el vector y de la célula huésped particular a transformar con el vector. Cada vector contiene componentes que dependen de la célula huésped particular con la que es compatible. Dependiendo del tipo particular de huésped, los componentes del vector incluyen en general, pero no se limitan, a uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un promotor, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

En general, se utilizan vectores plasmídicos que contienen replicón y secuencias de control que derivan de la especie compatible con la célula huésped se utilizan en relación con los huéspedes de E. coli. El vector transporta normalmente un sitio de replicación, así como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma habitualmente utilizando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli (véase, por ejemplo, Bolivar et al., Gene, 2: 95 (1977)). pBR322 contiene genes para la resistencia a ampicillina y tetraciclina y, de este modo, proporciona un medio sencillo para identificar células transformadas. El plásmido pBR322, u otros plásmidos o fagos bacterianos, en general también contienen, o se modifican para contener, promotores que se pueden utilizar por el huésped de E. coli para la expresión de los genes marcadores seleccionables.

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(i) Componente secuencia señal

El ADN que codifica el polipéptido de interés de la presente invención se puede expresar no sólo directamente, sino también como una fusión con otro polipéptido, preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de separación específico en el extremo N terminal del polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector o puede ser una parte del ADN para el polipéptido que se inserta en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada debe ser aquella que es reconocida y procesada (es decir, separada por una señal peptidasa) por la célula huésped.

Para células huésped bacterianas que no reconocen y procesan la secuencia señal del polipéptido nativo o eucariota, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota adecuada, por ejemplo, del grupo que consiste en la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o secuencias líderes de enterotoxina II estables térmicamente.

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(ii) Origen del componente de replicación

Los vectores de expresión contienen una secuencia de ácido nucleicos que permite que el vector se replique en una o más de las células huésped seleccionadas. Dichas secuencias son conocidas para un grupo de bacterias. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias gram-negativas, tales como E. coli.

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(iii) Componente del gen de selección

Los vectores de expresión en general contienen un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Este gen codifica un aproteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de células huésped transformadas desarrolladas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Este marcador seleccionable se separa de los marcadores genéticos tal como se utiliza y define por la presente invención. Los genes de selección habituales codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias autotróficas diferentes de las causadas por la presencia del marcador o marcadores genéticos, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. En este caso, aquellas células que se transforman de manera satisfactoria con el ácido nucleico de interés producen un polipéptido que confiere resistencia a fármacos y, de este modo, sobreviven a la pauta de selección. Ejemplos de dicha selección dominante utilizan los fármacos neomicina (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet., 1: 327 (1982)), ácido micofenólico (Mulligan et al., Science, 209: 1422 (1980)), o higromicina (Sugdcn et al., Mol. Cell. Biol., 5: 410-413 (1985)). Los tres ejemplos indicados anteriormente utilizan genes bacterianos bajo el control eucariota para conferir resistencia al fármaco apropiado G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico), o higromicina, respectivamente.

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(iv) Componente promotor

El vector de expresión para producir el polipéptido de interés contiene un promotor adecuado que es reconocido por el organismo huésped y está unido operativamente al ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen sistemas de promotores de beta-lactamasa y lactosa (Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)), el sistema de promotores de arabinosa (Guzman et al., J. Bacteriol., 174: 7716-7728 (1992)), fosfatasa alcalina, un sistema de promotores de triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980) y EP 36,776) y promotores híbridos, tales como el promotor tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)). Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Se han publicado sus secuencias de nucleótidos, permitiendo así que un técnico en la materia las una operativamente a ADN que codifica el polipéptido de interés (Siebenlist et al., Cell, 20: 269 (1980)) utilizando enlazadores o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción
requerido.

Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contienen de manera general una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el polipéptido de interés. El promotor se puede extraer del ADN de origen bacteriano mediante la digestión con enzimas de restricción y se inserta en el vector que contiene el ADN deseado.

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(v) Construcción y análisis de vectores

La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes indicados anteriormente utiliza técnicas de unión estándar. Los plásmidos o fragmentos de ADN aislados se dividen, se adaptan y se vuelven a unir en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

Para el análisis para confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, se utilizan mezclas de unión para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC 31.446) u otras cepas, y se seleccionan transformantes satisfactorios mediante la resistencia a ampicilina o tetraciclina cuando sea apropiado. Se preparan los plásmidos a partir de transformantes, se analizan mediante la digestión con endonucleasa de restricción y/o se secuencian mediante el método de Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977) o Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981), o mediante el método de Maxam et al., Methods in Enzymology, 65: 499 (1980).

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B. Selección y transformación de células huésped

Tal como se ha definido anteriormente, se pueden utilizar muchos tipos de células bacterianas gram-negativas con el objetivo de tener un gen yfcK deficiente y las mencionadas anteriormente son ejemplos de las mismas. La cepa W3110 de E. coli es una cepa parental preferida, ya que es una cepa huésped común para fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 se puede modificar para realizar una mutación genética en los genes que codifican proteínas, incluyendo ejemplos de dichos huéspedes de E. coli, junto con sus genotipos, en la siguiente
tabla:

3

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También son adecuados los intermedios en la producción de la cepa 36F8, es decir, 27B4 (Patente de Estados Unidos No. 5.304.472) y 35E7 (un aislado de colonias espontáneas resistentes a la temperatura que crecen mejor que 27B4). Una cepa adecuada adicional es la cepa de E. coli que tiene la proteasa o proteasas periplásmicas mutantes descritas en la Patente de Estados Unidos No. 4.946.783 concedida el 7 de agosto de 1990.

La célula mutante de la presente invención se puede producir mediante la integración cromosómica del gen yfcK en la célula parental o mediante otras técnicas, incluyendo aquellas indicadas en los Ejemplos siguientes.

El ácido nucleico que codifica el polipéptido se inserta en las células huésped. El ácido nucleico se introduce en la célula bacteriana adecuada utilizando cualquier método adecuado, incluyendo la transformación por un vector que codifica el polipéptido. Transformación significa introducir el ADN en un organismo, de manera que el AD es replicable, ya sea como elemento extracromosómico o mediante un integrante cromosómico. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para dichas células. El tratamiento con calcio que utiliza cloruro de calcio, tal como se ha descrito en la sección 1.82 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), se utiliza generalmente para células procariotas u otras células que contienen barreras de pared celular sustanciales. Otro método para la transformación utiliza polietilenglicol/DMSO, tal como se describe en Chung and Miller, Nucleic Acids Res., 16: 3580 (1988). Otro método es el uso de la técnica denominada electroporación.

Un ejemplo de transformación mediante la inserción del gen que codifica el polipéptido en el genoma huésped de E. coli implica incluir en el vector para la transformación una secuencia de ADN que es complementaria a una secuencia hallada en el ADN genómico de E. coli. La transfección de E. coli con este vector da lugar a la recombinación homóloga con el genoma y la inserción del gen que codifica el polipéptido. Preferiblemente, el ácido nucleico se inserta mediante la transformación de las células huésped con los vectores de expresión descritos anteriormente y el cultivo en medios de nutrientes convencionales modificados según sea conveniente para inducir los diversos
promotores.

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C. Cultivo de células huésped

Las células bacterianas utilizadas para producir el polipéptido de interés de la presente invención se cultivan en medios adecuados tal como se ha descrito de forma general, por ejemplo, en Sambrook et al., supra.

Para la secreción de un producto génico expresado o sobreexpresado, la célula huésped se cultiva en condiciones suficientes para la secreción del producto génico. Dichas condiciones incluyen, por ejemplo, las condiciones de temperatura, el nutriente, y la densidad celular que permiten la secreción por la célula. Además, dichas condiciones son aquellas bajo las cuales la célula puede realizar las funciones celulares básicas de transcripción, traducción y paso de proteínas de un compartimento celular a otros, tal como son conocidas por los expertos en la
materia.

Cuando se utiliza el promotor de fosfatasa alcalina, las células de E. coli utilizadas para producir el polipéptido de interés de la presente invención se cultivan en un medio adecuado en el que el promotor de fosfatasa alcalina puede ser parcial o completamente inducido tal como se ha descrito de forma general, por ejemplo, en Sambrook et al., supra. El cultivo no necesita nunca tener lugar en ausencia de fosfato inorgánico o a niveles de privación de fosfato. En primer lugar, el medio contiene fosfato inorgánico en una cantidad por encima del nivel de inducción de la síntesis de proteínas y suficiente para el crecimiento de la bacteria. A medida que las células crecen y utilizan fosfato, disminuyen el nivel de fosfato en el medio, causando así la inducción de la síntesis del poli-
péptido.

Cualquier otro ingrediente necesario para el medio, además de fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato inorgánico, también se puede incluir en concentraciones apropiadas introducidos solos o como una mezcla con otro ingrediente o medio, tal como una fuente compleja de nitrógeno. El pH del medio puede ser cualquier pH de aproximadamente 5-9, dependiendo principalmente del organismo huésped.

Si el promotor es un promotor inducible, para que tenga lugar la inducción, habitualmente las células se cultivan hasta conseguir una cierta densidad óptica, por ejemplo, una A_{550} de aproximadamente 200 utilizando un proceso de densidad celular elevada, en cuyo punto se inicia la inducción (por ejemplo, mediante la adición de un inductor, mediante el agotamiento de un componente del medio, etc.) para inducir la expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés.

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D. Detección de la expresión

La expresión del ácido nucleico se puede medir directamente en una muestra, por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia northern para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)), transferencia de puntos ("dot") (análisis de ADN), o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada de manera apropiada, en base a las secuencias del polipéptido. Se pueden utilizar varios marcadores, más habitualmente radioisótopos, particularmente ^{32}P. Sin embargo, también se pueden utilizar otras técnicas, tales como utilizando nucleótidos modificados por biotina para la introducción en un polinucleótido. La biotina sirve entonces como sitio para la unión a avidina o anticuerpos, que pueden estar marcados con una amplia variedad de marcadores, tales como radionucleidos, sustancias fluorescentes, enzimas, o similares. Alternativamente, se pueden utilizar ensayos o geles para la detección de proteína.

Los procedimientos para observar si se secreta un producto génico expresado o sobreexpresado están fácilmente disponibles para el técnico en la materia. Una vez se separa el medio de cultivo de las células huésped, por ejemplo, mediante centrifugación o filtración, el producto génico se puede entonces detectar en el medio de cultivo sin células aprovechando las propiedades conocidas características del producto génico. Dichas propiedades pueden incluir las distintas propiedades inmunológicas, enzimáticas o físicas del producto génico.

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Por ejemplo, si un producto génico sobreexpresado tiene una única actividad enzimática, se puede realizar un ensayo para esa actividad en el medio de cultivo utilizado por las células huésped. Además, cuando hay disponibles anticuerpos reactivos contra un producto génico determinado, se pueden utilizar dichos anticuerpos para detectar el producto génico en cualquier ensayo inmunológico (por ejemplo, como en Harlowe et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1988).

El producto génico secretado también se puede detectar utilizando pruebas que distinguen los polipéptidos en base a propiedades físicas características, tales como el peso molecular. Para detectar las propiedades físicas del producto génico, se pueden marcar todos los polipéptidos recién sintetizados por la célula huésped, por ejemplo, con un radioisótopo. Los radioisótopos habituales que se pueden utilizar para marcar polipéptidos sintetizados en una célula huésped incluyen tritio (^{3}H), carbono-14 (^{14}C), azufre 35 (^{35}S) y similares. Por ejemplo, la célula huésped se puede desarrollar en un medio con ^{35}S-metionina o ^{35}S-cisteína y se incorporará una cantidad significativa del marcador ^{35}S en cualquiera de los polipéptidos recién sintetizados, incluyendo el polipéptido heterólogo expresado. A continuación, se extrae el medio de cultivo que contiene ^{35}S y las células se lavan y se colocan en un medio de cultivo nuevo no radioactivo. Después de mantener las células en el medio nuevo durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la secreción del polipéptido heterólogo expresado radiomarcado con ^{3}S, el medio de cultivo se recoge y se separa de las células huésped. El peso molecular del polipéptido marcado secretado en el medio de cultivo se puede determinar a continuación mediante procedimientos conocidos, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida. Dichos procedimientos y/o otros procedimientos para la detección de productos génicos secretados se proporcionan en Goeddel, D.V. (ed.) 1990, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, Vol. 185 (Academic Press), and Sambrook et al., supra.

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E. Recuperación/Purificación

Después de producir el polipéptido, se puede recuperar de la célula mediante cualquier medio apropiado que depende, por ejemplo, de qué parte de la célula se recupera. El polipéptido se puede recuperar del citoplasma, periplasma o medio de cultivo celular. El polipéptido de interés se recupera preferiblemente del periplasma o medio de cultivo como polipéptido secretado. El polipéptido de interés se purifica a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes para obtener preparaciones que son sustancialmente homogéneas en cuanto al polipéptido de interés. Como primera etapa, el medio de cultivo o lisado se centrifuga para eliminar la debris celular particulada. Si es necesario, a continuación, la membrana y la fracción de proteínas solubles se pueden separar. A continuación, el polipéptido se puede purificar a partir de la fracción de proteínas solubles y a partir de la fracción de membranas del lisado de cultivo, dependiendo de si el polipéptido está unido a la membrana, si es soluble o si está presente en forma agregada. A continuación, el polipéptido se solubiliza y se repliega, si es necesario, y se purifica de proteínas y polipéptidos solubles contaminantes. Cualquier etapa típica para eliminar la impureza de polipéptido separado se elimina del esquema de purificación, ya que la aminopeptidasa ya no está presente. En una realización preferida, el polipéptido agregado se aísla, seguido de una etapa simultánea de solubilización y repliegue, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5.288.931.

En una realización particularmente preferida, la recuperación es partir del periplasma mediante la destrucción celular (mediante técnicas tal como se ha indicado anteriormente) para formar un lisado, seguido por la purificación de un polipéptido intacto no separado del lisado. Preferiblemente, el lisado se incuba antes de la purificación. Más preferiblemente, el lisado se incuba durante por lo menos aproximadamente 1 hora a aproximadamente 20-25ºC, aún más preferiblemente durante aproximadamente 2-50 horas a aproximadamente temperatura ambiente, aún más preferiblemente aproximadamente 5-45 horas a aproximadamente temperatura ambiente, y lo más preferible durante aproximadamente 20-30 horas a aproximadamente temperatura ambiente.

Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento sobre columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE; cromatofocalización ("chromatofocusing"); SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; y filtración en gel utilizando, por ejemplo, columnas SEPHADEX G-75^{TM}.

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II. Producción y Recuperación del Polipéptido Separado

En este proceso alternativo, el polipéptido se pone en contacto con el polipéptido aminopeptidasa b2323 directamente de manera que se separa. Esto puede llevarse a cabo a través de distintos medios, incluyendo la incubación con los mismos a aproximadamente 20-40ºC, preferiblemente approximadamente 30-40ºC, durante un tiempo que puede variar hasta aproximadamente 50 horas, preferiblemente por lo menos aproximadamente de 1 hora a 45 horas. En un aspecto preferido de este procedimiento de contacto, la invención proporciona un método de producción de un polipéptido separado que comprende cultivar células bacterianas que albergan un gen yfck y que comprenden ácido nucleico que codifica el correspondiente polipéptido no separado que tiene un amminoácido añadido en su extremo N-terminal. El cultivo está bajo condiciones para expresar o sobreexpresar el gen yfck y para expresar el ácido nucleico que codifica el polipéptido no separado, y si el polipéptido no separado y la proteína aminopeptidasa b2324 no están en contacto después de la expresión, poner en contacto el polipéptido no separado con la proteína aminopeptidasa b2324 para producir el polipéptido separado. Preferiblemente el contacto es por incubación bajo las condiciones indicadas anteriormente o más adelante y el cultivo tiene lugar en un fermentador.

En un aspecto preferido, el polipéptido es heterólogo a las células, más preferiblemente un polipéptido eucariota, y aún más preferiblemente un polipéptido de mamífero, especialmente humano. La célula preferida es una célula de Salmonella o Enterobacteriaceae, aún más preferiblemente una célula de E. coli, y lo más especial W3110. También es preferente una célula que es deficiente en por lo menos un gen que codifica una proteasa, tal como degP o fhuA o ambos.

En un aspecto preferido, las condiciones de cultivo son tales que el gen yfck se sobreexpresa. El gen yfck puede ser nativo para las células de bacterias o introducirse en éstas, tal como mediante transformación con un vector que alberga dicho gen.

En otro aspecto preferido, el polipéptido no separado se recupera de las células antes del contacto con la proteína aminopeptidasa b2324, y el polipéptido no separado se recupera del periplasma o medio de cultivo de la célula. En una realización, la recuperación es mediante la destrucción celular (tal como se ha descrito anteriormente) para formar un lisado, se añade la aminopeptidasa, y a continuación, el polipéptido separado se purifica a partir del lisado. Preferiblemente, en este caso, el lisado se incuba con la aminopeptidasa antes de la etapa de purificación. Más preferiblemente, el lisado se incuba durante por lo menos aproximadamente 1 hora a aproximadamente 20-40ºC, aún más preferiblemente durante aproximadamente 2-50 horas a aproximadamente 30-40ºC, aún más preferiblemente aproximadamente 5-45 horas a aproximadamente 30-40ºC, y lo más preferible durante aproximadamente 20-30 horas a aproximadamente 35-38ºC antes de la etapa de purificación.

Cuando se preparan recombinantemente polipéptidos separados, las cepas parentales, las condiciones de cultivo, la detección de la expresión, la recuperación/purificación, y las técnicas básicas son generalmente tal como se ha indicado anteriormente. Sin embargo, para la sobreexpresión en la cepa a cultivar, habitualmente el gen yfcK, tanto si es endógeno (en el cromosoma) como exógeno a la célula huésped, está unido operativamente a un promotor inducible, de manera que el gen se puede expresar cuando se induce el promotor. El cultivo preferiblemente tiene lugar bajo condiciones a través de las cuales la expresión del gen yfcK es inducida antes de la inducción de la expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido. Las técnicas adecuadas para la sobreexpresión de genes útiles en la presente invención incluyen aquellas descritas por Joly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2773-2777 (1998); US Pat. Nos. 5.789.199 y and 5.639.635; Knappik et al., Bio/Technology, 11(1):77-83 (1993); and Wulfing and Pluckthun, Journal of Molecular Biology, 242(5):655-69 (1994).

La presente invención se entenderá completamente haciendo referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, no deberían interpretarse como limitantes del alcance de la presente invención.

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Ejemplo I

Materiales y procedimientos

Se amplificaron por PCR secuencias de ADN en dirección 5' y 3' del gen yfcK que codifica b2324 identificado mediante el proyecto de secuenciación genómica (el listado de GenBank resultante de Blattner et al., supra). A continuación, se recombinaron estas secuencias fusionadas en el cromosoma de una cepa W3110 mediante la transducción con PI y se cribó por PCR para las deleciones (Metcalf et al., Gene, 138: 1-7 (1994)) para producir la cepa 61G3, que tiene el genotipo W3110 \DeltafhuA \Delta(arg-F-lac) 169 phoA\DeltaE15 deoC2 degP::kanR ilvG2096\DeltayfcK.

Específicamente, se construyó esta cepa en diversas etapas utilizando técnicas que implican la transducción con fago Plkc, derivado de PI (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) y genéticas de transposón (Kleckner et al., J. Mol. Biol., 116: 125-159 (1977)). El huésped de inicio utilizado fue W3110 de E. coli K-12, que es una cepa K-12 que es F- lambda- (Bachmann, Bact. Rey., 36: 525-557 (1972); Bachmann, "Derivations and Genotypes of Some Mutant Derivatives of Escherichia coli K-12", pág. 1190-1219, en F. C. Neidhardt et al., ed., Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, vol. 2, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1987). Se describe con detalle la introducción de la mutación tonA (fhuA) en el genoma en la Patente de Estados Unidos nº 5.304.472 concedida el 19 de abril, 1994. Se introdujo la inserción de Tn10 en el gen ilv mediante la transducción P1. Se transdujo la auxotrofia de isoleucina/valina en prototrofia utilizando el fago PI desarrollado en una cepa que llevaba la mutación ilvG2096^{R} (Lawther et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 922-925 (1981)), que repara un desplazamiento del marco que provoca que el E. coli K-12 de tipo salvaje sea sensible a la valina. Se describe la mutación degP41 kan^{r} en la Patente de Estados Unidos nº 5.304.472. Los locus de ilvG2096^{R} pueden confirmarse mediante la resistencia del huésped 33B6 a 40 \mug/ml de valina (0,3 mM). Se describen dos mutaciones por deleción, phoA\DeltaE15 y \Delta(argF-lac)169, en la Patente de Estados Unidos nº 5.304.472. Se describe una mutación deoC2 en Mark et al., Mol. Gen. Genet. 155: 145-152 (1977). En la Figura 1 se muestra la derivación completa de la cepa
61G3.

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A continuación, se transformó esta cepa con un plásmido de expresión designado como hGH4R que expresa y secreta la hGH (con la fenilalanina N-terminal) tanto en un frasco de agitación como en fermentaciones de 10 L. Se detalla la construcción de phGH4R en Chang et al., Gene, 55: 189-196 (1987). Esta transformación dio lugar a la cepa JJGH1. Se cultivaron estas células tal y como se describe en Andersen et al., Biotechnology and Bioengineering, 75(2), 212-218 (2001). Se realizó un lisado crudo mediante la sonicación de las células después de producirse la hGH y se incubó el lisado a 37ºC durante de 0 a 24 horas y a temperatura ambiente durant 0 a 42 horas. El uso de la temperatura más alta fue para incrementar la capacidad de detectar hGH de des-phe y desphe-pro mediante el procedimiento de ensayo, pero no se prefiere para la purificación de la hGH. Normalmente se realiza la purificación de la hGH en frío para reducir la totalidad de estas formas separadas.

Se realizó el mismo experimento utilizando como control una cepa parental (16C9 con genotipo W3110 \DeltafhuA \Delta (arg-F-lac)169 phoA\DeltaE15 deoC2) transformado con phGH4R. Esta cepa es apropiada para este objetivo, ya que las mutaciones degP y ilvG en la cepa 61G3 no tienen efecto en la actividad aminopeptidasa.

A continuación, se centrifugaron las muestras de control y experimentales para eliminar las partículas y se analizaron las fases solubles mediante LC-MS (cromatografía líquida, análisis de espectrometría de masas). Se monitorizaron las masas para las formas intactas, des-phe, y des-phe-pro.

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Resultados

Las Figuras 2 y 4 muestran respectivamente los resultados a temperatura ambiente y en incubaciones de 37ºC con la cepa de control (16C9/phGH4R), y las Figuras 3 y 5 muestran respectivamente los resultados a temperatura ambiente y en incubaciones de 37ºC con JJGH1, que tiene la aminopeptidasa eliminada. Las cantidades reales de las cuatro figuras se muestran en la Tabla 1 más adelante. (bajo Temp=37ºC y Temp=RT). Puede observarse que prácticamente no hay impurezas separadas de fenilalanina tras 15 horas de incubación a 37ºC, e incluso sin incubación hay una disminución de la cantidad de impurezas. También puede observarse que incluso en la incubación a temperatura ambiente, se reduce la cantidad del polipéptido mutante sin fenilalanina N-terminal con la línea celular JJGH1 I en comparación con el control en todos los momentos de la incubación. Puede llevarse a cabo fácilmente la purificación del polipéptido intacto mediante medios de cromatografía convencionales o conocidos.

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TABLA 1

4

5

Los resultados muestran que puede utilizarse una cepa \DeltayfcK para evitar la separación de N-terminal de polipéptidos.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 4865974 A [0004]

\bullet WO 8805821 A [0045]

\bullet US 5508192 A, Georgiou [0046]

\bullet BE 885196 A [0049]

\bullet EP 89666 A [0049]

\bullet US 4431740 A [0049]

\bullet EP 177343 A [0049]

\bullet EP 245138 A [0049]

\bullet EP 409472 A [0049]

\bullet DE 4008354 A [0049]

\bullet EP 460846 A [0049]

\bullet WO 9206111 A [0049] [0049] [0049] [0049] [0049] [0049] [0049] [0049] [0049]

\bullet WO 9219647 A [0049] [0049]

\bullet EP 517174 A [0049]

\bullet US 5206161 A [0049]

\bullet WO 9319777 A [0049]

\bullet JP 06157334 A [0049]

\bullet CA 2108401 A [0049]

\bullet WO 9605303 A1 [0049]

\bullet WO 9717434 A2 [0049]

\bullet DE 9219038 U1 [0049]

\bullet WO 9639486 A1 [0049]

\bullet US 5593674 A [0049]

\bullet WO 9820035 A1 [0049]

\bullet EP 861851 A1 [0049]

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\bullet WO 200114557 A1 [0049] [0049]

\bullet WO 200114556 A1 [0049] [0049]

\bullet WO 200109176 A2 [0049]

\bullet WO 200105943 A2 [0049]

\bullet WO 200077037 A2 [0049]

\bullet WO 200075187 A1 [0049]

\bullet WO 200073339 A1 [0049]

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\bullet WO 200218435 A1 [0049]

\bullet WO 200212339 A2 [0049]

\bullet WO 200216390 A1 [0049] [0049]

\bullet WO 200224719 A1 [0049] [0049] [0049] [0049] [0049] [0049]

\bullet WO 200204481 A2 [0049]

\bullet WO 200216429 A2 [0049]

\bullet WO 200216581 A2 [0049]

\bullet WO 200211767 A2 [0049] [0049]

\bullet WO 200206342 A2 [0049]

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Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

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Claims

1. Célula bacteriana gram-negativa en la que un gen cromosómico está inactivado o incapacitado, cuyo gen tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con (a) una molécula de ADN que codifica una aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de 1 a 688 de SEC ID NO:2 o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a), y que codifica una aminopeptidasa.

2. Célula bacteriana gram-negativa en la que un gen cromosómico está inactivado o incapacitado, cuyo gen tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con el gen yfcK de secuencia nativa que tiene la secuencia de nucleótidos de 1 a 2067 de SEC ID NO:1 y que codifica una aminopeptidasa.

3. Célula según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que es Salmonella o Enterobacteriaceae.

4. Célula según la reivindicación 3 que es E. coli.

5. Célula según la reivindicación 4 que es deficiente en por lo menos un gen que codifica una proteasa.

6. Célula según la reivindicación 4 que es deficiente en el gen yfcK de secuencia nativa.

7. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo a la célula.

8. Célula según la reivindicación 7 en la que el polipéptido es un polipéptido de mamífero.

9. Célula según la reivindicación 8 en la que el polipéptido es un polipéptido humano.

10. Célula según la reivindicación 9 en la que el polipéptido es la hormona de crecimiento humano.

11. Método para producir un polipéptido heterólogo, que comprende (a) cultivar la célula según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 y (b) recuperar el polipéptido de la célula.

12. Método según la reivindicación 11, en el que el cultivo tiene lugar en un fermentador y en el que el polipéptido se recupera del periplasma o del medio de cultivo de la célula.

13. Método según la reivindicación 11 ó 12 en el que la recuperación es mediante destrucción celular para formar un lisado y en el que el polipéptido intacto se purifica del lisado.

14. Método según la reivindicación 13 en el que el lisado se incuba antes de la etapa de purificación.

15. Método para evitar la separación del extremo N-terminal de un residuo de aminoácido de un polipéptido, que comprende el cultivo de la célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la célula comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido bajo condiciones en las que se expresa el ácido nucleico.

16. Método según la reivindicación 15 en el que el polipéptido se recupera de la célula.

17. Método para separar un aminoácido N-terminal de un polipéptido aislado de una célula, que comprende poner en contacto el polipéptido con una aminopeptidasa codificada por un ácido nucleico que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con (a) una molécula de ADN que codifica una aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de 1 a 688 de SEC ID No. 2, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).

18. Método para separar un aminoácido N-terminal de un polipéptido aislado de una célula, que comprende poner en contacto el polipéptido con una aminopeptidasa tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con una aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de 1 a 688 de SEC ID No. 2.

19. Método según la reivindicación 17 ó 18 en el que el polipéptido se incuba con la aminopeptidasa.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 en el que el polipéptido se pone en contacto con la aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa.

21. Método de producción de un polipéptido separado, que comprende cultivar células bacterianas gram-negativas que albergan un ácido nucleico que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con (a) una molécula de ADN que codifica una aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de 1 a 688 de SEC ID NO:2, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) y que codifica una aminopeptidasa, cuyas células comprenden ácido nucleico que codifica el correspondiente polipéptido no separado que tiene un aminoácido añadido en su extremo N-terminal, en el que el cultivo es bajo condiciones para sobreexpresar el ácido nucleico que codifica la aminopeptidasa b2324 y para expresar el ácido nucleico que codifica el polipéptido no separado, y si el polipéptido no separado y la aminopeptidasa no están en contacto después de la expresión, poner en contacto el polipéptido no separado con la aminopeptidasa para producir el polipéptido separado.

22. Método de producción de un polipéptido separado, que comprende cultivar células bacterianas gram-negativas que albergan un ácido nucleico que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con el gen yfcK de secuencia nativa que tiene la secuencia de nucleótidos de 1 a 2067 de SEC ID NO:1 y que codifica una aminopeptidasa, cuyas células comprenden ácido nucleico que codifica el correspondiente polipéptido no separado que tiene un aminoácido añadido en su extremo N-terminal, en el que el cultivo es bajo condiciones para sobreexpresar el ácido nucleico que codifica la aminopeptidasa b2324 y para expresar el ácido nucleico que codifica el polipéptido no separado, y si el polipéptido no separado y la aminopeptidasa no están en contacto después de la expresión, poner en contacto el polipéptido no separado con la aminopeptidasa para producir el polipéptido separado.

23. Método según la reivindicación 21 ó 22 en el que se cultivan células de E. coli que albergan el gen yfcK de secuencia nativa y el polipéptido no separado se pone en contacto con la aminopeptidasa b2324 de secuencia nativa.

24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23 en el que el polipéptido es heterólogo a las células.

25. Método según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23 en el que el polipéptido es un polipéptido de mamífero.

26. Método según la reivindicación 21 ó 22 en el que las células son deficientes en por lo menos un gen que codifica una proteasa.

27. Método según la reivindicación 21 ó 22 en el que el contacto es mediante incubación.

28. Método según la reivindicación 21 ó 22 en el que el ácido nucleico que codifica la aminopeptidasa es nativo a las células bacterianas.

29. Método según la reivindicación 21 ó 22 en el que el ácido nucleico que codifica la aminopeptidasa se introduce en las células bacterianas.

30. Método según la reivindicación 21 ó 22 en el que el cultivo tiene lugar en un fermentador y en el que el polipéptido no separado se recupera de las células antes del contacto con la aminopeptidasa.

31. Método según la reivindicación 30 en el que el polipéptido se recupera del periplasma o medio de cultivo de la célula.

32. Método según la reivindicación 30 ó 31 en el que la recuperación es mediante destrucción celular para formar un lisado y en el que el polipéptido separado se purifica a partir del lisado.

33. Método según la reivindicación 32 en el que el lisado se incuba antes de la etapa de purificación.

34. Método según la reivindicación 32 ó 33 en el que el lisado se incuba durante por lo menos 1 hora a aproximadamente 20-40ºC.