HU225243B1 - Gram-negative bacterium cell containing a gene coding an aminopeptidase - Google Patents

Gram-negative bacterium cell containing a gene coding an aminopeptidase Download PDF

Info

Publication number
HU225243B1
HU225243B1 HU0401869A HUP0401869A HU225243B1 HU 225243 B1 HU225243 B1 HU 225243B1 HU 0401869 A HU0401869 A HU 0401869A HU P0401869 A HUP0401869 A HU P0401869A HU 225243 B1 HU225243 B1 HU 225243B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
polypeptide
cell
gene
human
aminopeptidase
Prior art date
Application number
HU0401869A
Other languages
English (en)
Inventor
John C Joly
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of HUP0401869A2 publication Critical patent/HUP0401869A2/hu
Publication of HUP0401869A3 publication Critical patent/HUP0401869A3/hu
Publication of HU225243B1 publication Critical patent/HU225243B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

A találmány tárgya Gram-negatív baktériumsejt, amely egy kromoszomális gén vonatkozásában hiányos. A gén szekvenciája legalább 80%-ban azonos egy natív szekvenciájú b2324-aminopeptidázt kódoló DNSmolekulával, amely aminopeptidáz a 2. azonosító számú szekvencia 1-688. aminosavait tartalmazza, és aminopeptidázt kódol.
HU 225 243 Β1
A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 5 lap ábra)
HU 225 243 Β1
A találmány bakteriális aminopeptidázokra vonatkozik. Közelebbről, a találmány tárgyát olyan fontos enzimaktivitás képezi, amelynek eltávolítása vagy túlzott mértékű expresszáltatása javítja a baktériumokban termelődő hasítatlan, illetve hasított polipeptidek (például rekombináns polipeptidek) kitermelését. Ezen túlmenően a találmány tárgyát Gram-negatív baktériumsejtek képezik, amelyek aminopeptidázt kódoló kromoszomális génjük vonatkozásában hiányosak.
Bizonyos proteinek N-terminális aminosava Gram-negatív baktériumokban és archaebaktériumokban (például E. co/;-ban) termelődve, a sejtekben lévő aminopeptidázok jelenléte miatt - lehasításra kerül, miáltal a sejttenyészetben (a tenyésztéssel egyidejűleg vagy a tisztítási folyamat részeként alkalmazott sejtfeltárási lépésben) a vad típusú polipeptidhez nagyon hasonló szennyeződés jelenik meg. Gyógyászati célra alkalmazható proteinek termelése esetén ezt a szennyeződést el kell különíteni a vad típusú polipeptidtől. Példaként említhető a humán növekedési hormon (hGH), amelynek N-terminális fenil-alaninja - E. co//'-sejtekben termeltetve - lehasításra kerül. A hGH ezen változata (dez-phe-hGH) a sejtek feltárása során az ép hGH-val (natív hGH) elegyet alkot, és nehéz attól elválasztani. Az elválasztáshoz az elegyet hidrofób kölcsönhatási kromatográfiának kell alávetni. A termelékenység javítása szempontjából előnyös lenne ezt a plusz tisztítási lépést elhagyni.
Ezen túlmenően bizonyos esetekben olyan polipeptidek előállítására van szükség, amelyekből az N-terminális aminosav le van hasítva, továbbá tisztább hasított változat kinyerése érdekében kívánatos lehet az ilyen polipeptidek mennyiségének natív szekvenciájú polipeptid mennyiségéhez viszonyított arányának növelésére is.
Az ismert E. coli aminopeptidázok közül több széles specifitású, melyek a polipeptidek N-terminálisán többféle aminosav hasítására képesek [például pepA, pepB és pepN („Escherichia coli and Salmonella”, szerk.: Frederick C. Neidhardt, ASM Press, 62. fejezet. Charles Miller: „Protein Degradation and Proteolytic Modification”, 938-954. old. (1996); Gonzales and Robert-Baudouy, FEMS Microbiology Reviews 18(4), 319-44 (1996)]. Az E. coli K-21-törzsben kimutatott, b2324-aminopeptidázt kódoló yfcK-gént az E. coli genom szekvenálási projektben „feltételezett peptidázként” azonosították [lásd Blattner és munkatársai: Science 277, 1453 (1997), GenBank nyilvántartási szám: AE000321], enzimaktivitásáról azonban nem írtak le további információkat. A 0157:H7 E. coli-törzsben található homológ azonos a Κ-12-törzs yfcK-génjével. Mindazonáltal szükség van olyan bakteriális aminopeptidázokra, amelyek nagyobb tisztaságú hasított polipeptidek kinyerése céljából manipulálhatók.
Találmányunk kidolgozása során az yfcK-gén által módolt b2324-enzimet aminopeptidázként, azaz a polipeptidek N-terminális aminosavainak lehasításáért felelős enzimként azonosítottuk, s ez a felismerés szolgál a találmány szerinti megoldás alapjául.
A találmány értelmében a b2324-enzimmel homológ aminopeptidázokat kódoló géneket (ideértve a b2324-aminopeptidázt kódoló yfcK-gént) eltávolítjuk a Gram-negatív baktériumtörzsekből (például kromoszómájuk génsebészeti módszerekkel történő szétbontásával), miáltal a hasított szennyezés nem termelődik jelentős mennyiségben, következésképpen az N-terminálison hasított polipeptidszennyezés eltávolításának további tisztítási lépései elhagyhatók. Az így létrehozott törzsek közül legalább egy olyat azonosítottunk, amely a nem hasított polipeptidet ugyanolyan mennyiségben termeli, mint a kiindulási törzsek.
Közelebbről, feltárunk egy Gram-negatív baktériumsejtet, amely egy kromoszomális génje vonatkozásában hiányos, mely gén legalább 80%-ban azonos egy natív szekvenciájú b2324-aminopeptidázt kódoló DNS-molekulával, mely aminopeptidáz a 2. azonosító számú szekvencia 1-688. aminosavait tartalmazza, és aminopeptidázt kódol. Az ilyen sejtek természetben előforduló megfelelői tartalmazzák a kromoszomális gént, miközben a találmány szerinti sejtek a vad típusú sejt - általában genetikai manipulációval vagy egyéb, tetszőleges módszerek alkalmazásával manipulált módosított változatai, amelyekben a módosítás eredményeként eliminált vagy működésképtelenné tett gén nem kódol aminopeptidázt.
A találmány értelmében továbbá olyan Gram-negatív baktériumsejtet tárunk fel, amely egy kromoszomális gén vonatkozásában hiányos, mely gén a 2. azonosító számú szekvencia 1-688. aminosavait tartalmazó aminosavszekvenciával összehasonlítva legalább 80% pozitív aminosavat tartalmazó polipeptidet kódoló DNS-t foglal magában, ahol a polipeptid aminopeptidáz.
Szintén a találmány értelmében olyan Gram-negatív baktériumsejtet tárunk fel, amely egy kromoszomális gén vonatkozásában hiányos, mely gén szekvenciája legalább 80%-ban azonos a natív yfcK-gén szekvenciájával, amely az 1. azonosító számú szekvencia 1-2067. nukleotidjaiból áll, és aminopeptidázt kódol.
A találmány egy következő megvalósítási módjának megfelelően E. coli-sejtet tárunk fel, amely a kromoszomális, natív szekvenciájú yfcK-gén vonatkozásában hiányos.
A felsorolt sejtek előnyösen legalább egy, proteázt kódoló génre (például degP vagy fhuA) nézve hiányosak. Ezen túlmenően az ilyen sejtek a sejt szempontjából heterológ polipeptidet, előnyösen eukarióta, még előnyösebben emlőseredetű, legelőnyösebben humán polipeptidet, például humán növekedési hormont kódoló nukleinsavat tartalmazhatnak.
A találmány egy következő megvalósítási módjának megfelelően eljárást tárunk fel heterológ polipeptid előállítására, melynek során (a) találmány szerinti sejteket tenyésztünk; és (b) a sejtekből kinyerjük a polipeptidet. A tenyésztést előnyösen fermentorban végezzük. Egy másik előnyös megvalósítási módban a polipeptidet a sejt periplazmájából vagy tenyésztő tápközegéből nyerjük ki. Egy további előnyös megvalósítási mód szerint a polipeptid kinyerése céljából a sejtet feltárjuk, s az így kapott lizátumból előnyösen intakt polipeptidet tisztítunk. Egy még előnyösebb megvalósítási módban a lizátumot a tisztítási lépés előtt inkubálásnak vetjük alá.
HU 225 243 Β1
A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük.
Az 1. ábrán a b2324-aminopeptidázt kódoló yfcKgénre nézve deléciós E. coli 61G3 gazdatörzs származási diagramját mutatjuk be.
A 2. ábrán a szobahőmérsékleten 0, 15, 24 és 42 óra hosszat inkubált rhGH-extrakciós kontrolltörzs (16C9) folyadékkromatográfiás/tömegspektroszkópiás (LC/MS) analízisével kapott százalékos területeredmények oszlopgrafikonját mutatjuk be. Az oszlopok eltérő satírozással jelölt szakaszai a natív hGH, az N-terminális fenil-alanin nélküli hGH (des-phe), illetve az N-terminális fenil-alanin és prolin nélküli hGH (desphe-pro) mennyiségét reprezentálják.
A 3. ábrán a szobahőmérsékleten 0, 15, 24 és 42 óra hosszat inkubált rhGH-törzs (61G3) folyadékkromatográfiás/tömegspektroszkópiás (LC/MS) analízisével kapott százalékos területeredmények oszlopgrafikonját mutatjuk be. Az oszlopok eltérő satírozással jelölt szakaszai a natív hGH, az N-terminális fenil-alanin nélküli hGH (des-phe), illetve az N-terminális fenil-alanin és prolin nélküli hGH (des-phe-pro) mennyiségét reprezentálják.
A 4. ábrán a 37 °C-on 0, 15 és 24 óra hosszat inkubált rhGH-extrakciós kontrolitörzs (16C9) folyadékkromatográfiás/tömegspektroszkópiás (LC/MS) analízisével kapott százalékos területeredmények oszlopgrafikonját mutatjuk be. Az oszlopok eltérő satírozással jelölt szakaszai a natív hGH, az N-terminális fenil-alanin nélküli hGH (des-phe), illetve az N-terminális fenil-alanin és prolin nélküli hGH (des-phe-pro) mennyiségét reprezentálják.
Az 5. ábrán a 37 °C-on 0, 15 és 24 óra hosszat inkubált rhGH-törzs (61G3) folyadékkromatográfiás/tömegspektroszkópiás (LC/MS) analízisével kapott százalékos területeredmények oszlopgrafikonját mutatjuk be. Az oszlopok eltérő satírozással jelölt szakaszai a natív hGH, az N-terminális fenil-alanin nélküli hGH (des-phe), illetve az N-terminális fenilalanin és prolin nélküli hGH (des-phepro) mennyiségét reprezentálják.
Definíciók
A leírásban a „sejt”, „sejtvonal”, „törzs” és „sejttenyészet kifejezéseket egymás szinonimáiként alkalmazzuk, és valamennyi ilyen megjelölés magában foglalja az utódokat. Ilyenformán a „transzformáns” és „transzformált sejt” kifejezések jelentése kiterjed az elsődleges, eredeti sejtre és a belőle származó tenyészetekre (függetlenül az átoltások számától). Az utódsejtek DNS-tartalmukban nem pontosan egyformák, ami a szándékos vagy véletlenszerű mutációk következménye. A funkciójuk és biológiai aktivitásuk tekintetében az eredetileg transzformált sejttel azonos mutáns utódok szintén e kifejezés jelentéskörébe tartoznak. Eltérő meghatározások esetén az adott kifejezés jelentése a szövegösszefüggésből lesz érthető.
A leírásban a „baktériumok” kifejezésen Gram-negatív baktériumokat értünk, melyek egyik előnyös típusa az Enterobacteriaceae család. Az e családba tartozó baktériumok példáiként említhetők az Escheríchia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia és Shigella fajok. A találmány céljaira alkalmas baktériumok további típusai közé tartoznak az Azotobacter, Pseudomonas, Rhizobia, Vitreoscilla és Paracoccus fajok. A találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezésére alkalmas E. coli gazdatörzsek példái, többek között, a következők: E. coli W3110 (ATCC 27325), E. coli 294 (ATCC 31446), E. coli B és E. coli X1776 (ATCC 31537), melyek közül a W3110-törzset alkalmazhatjuk előnyösen. A felsorolt baktériumok bármelyikének mutánsai is alkalmazhatók. A találmány céljaira megfelelő baktérium kiválasztása során természetesen figyelembe kell venni, hogy a replikon az adott baktériumsejtekben replikációra képes-e. Például ha a replikont olyan jól ismert plazmidok „szállítják, mint a pBR322, pBR325, pACYC177 vagy pKN410, gazdasejtként, alkalmas módon, E. coli-, Serratia- vagy Salmonella-sejtek használhatók fel.
A „kromoszomális yfcK-gén” kifejezésen az E. coligenom-szekvenálási projektben „feltételezett peptidázként” azonosított b2324-proteint kódoló gént (Blattner és munkatársai, lásd fentebb; GenBank nyilvántartási száma: AE000321) értjük. A b2324-protein Dayhoff nyilvántartási száma: B65005; SwissProt nyilvántartási száma: P77182; és a gén az E. coli 52.59’ kromoszómapozícióján helyezkedik el (bázispár-pozíciók: bal oldali végződés: 2439784. bázispár; jobb oldali végződés: 2441790. bázispár). Az yfcK-gén nukleotidszekvenciája a következő:
TTGCGCAGCCTTACACACATCGCTAAGATCGAGC
CACCGCCTGTAAGACGAGTAACTTAC
GTGAAACACTACTCCATACAACCTGCCAACCTCGAATTTAATGCTGAGGGTACACCTGTT
TCCCGAGATTTTGACGATGTCTATTTTTCCAACGATAACGGGCTGGAAGAGACGCGTTAT
GTTTTTCTGGGAGGCAACCAATTAGAGGTACGCTTTCCTGAGCATCCACATCCTCTGTTT
GTGGTAGCAGAGAGCGGCTTCGGCACCGGATTAAACTTCCTGACGCTATGGCAGGCATTT
GATCAGTTTCGCGAAGCGCATCCGCAAGCGCAATTACAACGCTTACATTTCATTAGTTTT
GAGAAATTTCCCCTCACCCGTGCGGATTTAGCCTTAGCGCATCAACACTGGCCGGAACTG
GCTCCGTGGGCAGAACAACTTCAGGCGCAGTGGCCAATGCCCTTGCCCGGTTGCCATCGT
TTATTGCTCGATGAAGGCCGCGTGACGCTGGATTTATGGTTTGGCGATATTAACGAACTG
HU 225 243 Β1
ACCAGCCAACTGGACGATTCGCTAAATCAAAAAGTAGATGCCTGGTTTCTGGACGGCTTT GCGCCAGCGAAAAACCCGGATATGTGGACGCAAAATCTGTTTAACGCCATGGCAAGGTTG GCGCGTCCGGGCGGCACGCTGGCGACATTTACGTCTGCCGGTTTTGTCCGCCGCGGTTTG CAGGACGCCGGATTCACGATGCAAAAACGTAAGGGCTTTGGGCGCAAACGGGAAATGCTT TGCGGGGTGATGGAACAGACATTACCGCTCCCCTGCTCCGCGCCGTGGTTTAACCGCACG GGCAGCAGCAAACGGGAAGCGGCGATTATCGGCGGTGGTATTGCCAGCGCGTTGTTGTCG CTGGCGCTATTACGGCGCGGCTGGCAGGTAACGCTTTATTGCGCGGATGAGGCCCCCGCA CTGGGTGCTTCCGGCAATCGCCAGGGGGCGCTGTATCCGTTATTAAGCAAACACGATGAG GCGCTAAACCGCTTTTTCTCTAATGCGTTTACTTTTGCTCGTCGGTTTTACGACCAATTA CCCGTTAAATTTGATCATGACTGGTGCGGCGTCACGCAGTTAGGCTGGGATGAGAAAAGC CAGCATAAAATCGCACAGATGTTGTCAATGGATTTACCCGCAGAACTGGCTGTAGCCGTT GAGGCAAATGCGGTTGAACAAATTACGGGCGTTGCGACAAATTGCAGCGGCATTACTTAT CCGCAAGGTGGTTGGCTGTGCCCAGCAGAACTGACCCGTAATGTGCTGGAACTGGCGCAA CAGCAGGGTTTGCAGATTTATTATCAATATCAGTT ACAGAATTTATCCCGTAAGGATGAC TGTTGGTTGTTGAATTTTGCAGGAGATCAGCAAGCAACACACAGCGTAGTGGTACTGGCG AACGGGCATCAAATCAGCCGATTCAGCCAAACGTCGACTCTCCCGGTGTATTCGGTTGCC GGGCAGGTCAGCCATATTCCGACAACGCCGGAATTGGCAGAGCTGAAGCAGGTGCTGTGC TATGACGGTTATCTCACGCCACAAAATCCGGCGAATCAACATCATTGTATTGGTGCCAGT TATCATCGCGGCAGCGAAGATACGGCGTACAGTG AGGACGATCAGCAGCAGAATCGCCAGC GGTTGATTGATTGTTTCCCGCAGGCACAGTGGGC AAAAGAGGTTGATGTCAGTGATAAAGA GGCGCGCTGCGGTGTGCGTTGTGCCACCCGCGATCATCTGCCAATGGTAGGCAATGTTCCC GATTATGAGGCAACACTCGTGGAATATGCGTCGTT GGCGGAGCAGAAAGATGAGGCGGTAA GCGCGCCGGTTTTTGACGATCTCTTTATGTTTGCGGCTTTAGGTTCTCGCGGTTTG TGTTCTGCCCCGCTGTGTGCCGAGATTCTGGCGGCGCAGATGAGCGACGAACCGATTCCG ATGGATGCCAGTACGCTGGCGGCGTTAAACCCGAATCGGTTATGGGTGCGGAAATTGTTG AAGGGTAAAGCGGTTAAGGCGGGGTAA (1. azonosító számú szekvencia); és a fenti nukleotidszekvencia által kódolt protein aminosavszekvenciája az alábbi; MRSLTHIAKIEPPPVRRVTYVKHYSIQPANLEFNAEGTPVSRDFDDVYFSNDNGLEETRYV F LG G N Q L E VRFP Ε Η P Η P L FV VAES G FGTGLNFLTLWQAFDQFREAHPQAQLQRLHFISFEK FPLTRADLALAHQHWPELAPWAEQLQAQWPMPLPGCHRLLLDEGRVTLDLWFGDINELTSQ
LDDSLNQKVDAWFLDGFAPAKNPDMWTQNLFNAMARLARPGGTLATFTSAGFVRRGLQDAG FTMQKRKGFGRKREMLCGVMEQTLPLPCSAPWFNRTGSSKREAAIIGGGIASALLSLALLR RGWQVTLYCADEAPALGASGNRQGALYPLLSKHDEALNRFFSNAFTFARRFYDQLPVKFDH DWCGVTQLGWDEKSQHKIAQMLSMDLPAELAVAVEANAVEQITGVATNCSGITYPQGGWLC PAELTRNVLELAQQQGLQIYYQYQLQNLSRKDDCWLLNFAGDQQATHSWVLANGHQISRF SQTSTLPVYSVAGQVSHIPTTPELAELKQVLCYDGYL TPQNPANQHHCIGASYHRGSEDTA YSEDDQQQNRQRLIDCFPQAQWAKEVDVSDKEARCGVRCATRDHLPMVGNVPDYEATLVEY ASLAEQKDEAVSAPVFDDLFMFAALGSRGLCSAPLC AEILAAQMSDEPIPMDASTLAALNP NRLWVRKLLKGKAVKAG (2. azonosító számú szekvencia).
Az adott gén vagy nukleinsav vonatkozásában „hiányos kifejezésen azt értjük, hogy a sejtben a kérdéses gén deletálva, inaktiválva vagy más módon működésképtelenné van téve, miáltal az általa kódolt protein nem termelődik. Például a b2324-aminopeptidázt kódoló yfcK-gén vonatkozásában hiányos sejtek sejttenyésztés során nem képesek termelni az yfcK-gén termékét. Hasonlóan, egy proteázt kódoló gén vonatkozásában deficiens sejt sejttenyésztés során nem termeli a szóban forgó proteázt.
A „polipeptid kifejezésen általában tetszőleges sejtből származó, körülbelül tíz aminosavnál hosszabb peptideket és proteineket értünk. A „heterológ” polipeptidek az alkalmazott gazdasejt szempontjából idegen polipeptidek (például E. co/í-ban termeltetett humán protein). A heterológ polipeptid lehet prokarióta vagy eukarióta eredetű, azonban előnyösen eukarióta, még előnyösebben emlőseredetű, legelőnyösebben humán polipeptid.
Az emlőseredetű polipeptidek jellemző példái közé tartoznak a következők: renin, növekedési hormon, mint például a humán növekedési hormon; szarvasmarha-eredetű növekedési hormon; növekedési hormont felszabadító faktor; mellékpajzsmirigy-hormon; pajzsmirigy-stimuláló hormon; lipoproteinek; lipoproteinek; 1-antitripszin; inzulin A-lánc; inzulin B-lánc; proinzulin; trombopoietin; follikuluszstimuláló hormon; kalcitonin; luteinizáló hormon; glukagon; véralvadási faktorok, például VIIIC faktor, IX. faktor, szöveti faktor és von Willebrand-faktor; véralvadást gátló faktorok, például protein-C; atrialis natriureticus faktor; tüdő szörfaktáns; plazminogén aktivátor, például urokináz vagy humán vizelet vagy szövet típusú plazminogén aktivátor (t-pA); bombezin; trombin; vérképzési növekedési faktor; tumornekrózis-faktor-a és -β; enkephalináz; szérumalbumin, például humán szérumaibumin; müllerianosist gátló szubsztancia; relaxin A-lánc; relaxin B-lánc; prorelaxin; egéreredetü gonadotropinasszociált peptid; mikrobiális protein, például β-laktamáz; DNáz; inhibin; aktivin; vascularis endothelialis növekedési faktor (VEGF); hormonok és növekedési faktorok receptorai; integrin; protein-A vagy -D; reumatoid faktorok;
HU 225 243 Β1 neurotroph faktor, például agyi eredetű neurotroph faktor (BDNF), neurotrophin-3, -4, -5 vagy -6 (NT-3, NT^4, NT-5 vagy NT-6) vagy idegsejt növekedési faktorok (NGF); cardiotrophinok (szív hipertrófia faktor), például cardiotrophin-1 (CT-1); vérlemezke-eredetű növekedési faktor (PDGF); fibroblaszteredetű növekedési faktor, például aFGF és bFGF; epidermális növekedési faktor (EGF); transzformáló növekedési faktorok (TGF-ek), például TGF-α és TGF-β, ideértve a TGF-1-et, TGF-2-t, TGF-3-at, TGF-4-et és TGF-5-öt; inzulinszerű növekedési faktor-l és -II (IGF-I és IGF—II); dez(1-3)-IGF-l (agyi IGF—I), inzulinszerű növekedési faktor kötő proteinek; CD-proteinek, például CD-3, CD—4, CD-8 és CD19; eritropoietin (EPO); oszteoinduktív faktorok; immunotoxinok; csont morfogenetikus protein (BMP); interferon, például interferon-α, -β és -γ; szérumalbumin, például humán szérumalbumin (HSA) vagy szarvasmarha-szérumalbumin (BSA); kolonizációt stimuláló faktorok (CSF-ek), például M-CSF, GM-CSF és G-CSF; interleukinek (IL-ek), például IL-1 - IL-10; anti HER-2 antitest; Apo2-ligandum; szuperoxid dizmutáz; T-sejt-receptorok; felületi membránproteinek; lebomlást gyorsító faktor; virális antigének, például HIV-vírus burokproteinjének részlete; transzportproteinek; „homing’-receptorok; adresszinek; szabályozóproteinek; antitestek; valamint a felsorolt polipeptidek fragmensei. A találmány céljaira előnyös polipeptidek közé tartoznak az N-terminális fenil-alanin tartalmazók, mint például a hGH. További előnyös polipeptidek azok, amelyek baktériumok periplazmájában vagy sejttenyésztő tápközegében termeltethetők.
A „szabályozószekvencia” kifejezésen olyan DNS-szekvenciát értünk, amely a hozzá működőképesen kapcsolt kódolószekvencia adott gazdaszervezetben történő expresszáltatásához szükséges. A bakteriális gazdasejtek számára megfelelő szabályozószekvencia például a promoter, adott esetben az operátorszekvencia, valamint a riboszómakötő hely.
Egy nukleinsav akkor van „működőképesen kapcsolva”, ha egy másik nukleinsavszekvenciával funkcionális kapcsolatban van. Például egy preszekvencia vagy szekréciós vezetőszekvencia DNS-e akkor van működőképesen egy polipeptidet kódoló DNS-hez kapcsolva, ha olyan preproteinként expresszálódik, amely részt vesz a polipeptid szekréciójában. Egy promoter akkor van működőképesen egy kódolószekvenciához kapcsolva, ha hatást gyakorol a szekvencia transzkripciójára. Egy riboszómakötő hely akkor van működőképesen egy kódolószekvenciához kapcsolva, ha elősegíti a transzlációt. A „működőképesen kapcsolt” kifejezés általában azt jelenti, hogy az összekapcsolt DNS-szekvenciák egymással határosak, illetve - szekréciós vezetőszekvencia esetében - egymással határosak, és azonos leolvasási fázisban vannak. Az összekapcsolás szokványos restrikciós helyeknél ligálással valósulhat meg. Ha ilyen helyek nem léteznek, az általános gyakorlatnak megfelelően szintetikus oligonukleotidadapterek vagy kapcsolószekvenciák alkalmazhatók.
A gének vagy nukleinsavak vonatkozásában a „túlzott mértékű expresszió” kifejezésen specifikus proteinek olyan mennyiségben történő szintézisét értjük, amely nagyobb, mint a sejt által a szintézis mesterséges indukciója nélkül termelt proteinmennyiség, például promoter alkalmazásával.
Egy polipeptid „kinyerése kifejezésen általában a polipeptidnek a polipeptidet termelő sejtektől elválasztott formában történő előállítását értjük.
Ahogy a találmány leírásában használjuk, a „b2324aminopeptidáz-polipeptid”, „b2324-aminopeptidáz-protein” vagy „b2324-aminopeptidáz” kifejezésen natív szekvenciájú b2324-aminopeptidázt és b2324-aminopeptidáz-homológokat értünk. A b2324-aminopeptidáz polipeptidek, a szövegösszefüggéstől függően, különböző forrásokból (például baktériumsejtekből) izolálhatok, illetve rekombináns és/vagy szintézises módszerekkel állíthatók elő.
A „natív szekvenciájú b2324-aminopeptidáz” kifejezésen olyan polipeptidet értünk, amely a természetben előforduló b2324-aminopeptidázéval azonos aminosavszekvenciát tartalmaz. A natív szekvenciájú b2324aminopeptidáz természetes forrásból izolálható, vagy rekombináns és/vagy szintézises módszerekkel állítható elő. A „natív szekvenciájú b2324-aminopeptidáz” kifejezés jelentése kiterjed a b2324-aminopeptidáz természetben előforduló, lerövidített vagy szekretált alakjaira (például extracelluláris dómén szekvencia), természetben előforduló változataira (például alternatív „splicing” eredményeként létrejött alakok) és természetben előforduló allélváltozataira. A találmány egyik megvalósítási módja értelmében a natív szekvenciájú b2324-aminopeptidáz olyan érett vagy teljes hosszúságú, natív szekvenciájú b2324-aminopeptidáz, amely a
2. azonosító számú szekvencia 1-688. aminosavait tartalmazza.
A „b2324-aminopeptidáz-homológ” kifejezés olyan aminopeptidázra vonatkozik, amelynek aminosavszekvenciája legalább 80%-ban azonos a 2. azonosító számú szekvenciát tartalmazó b2324-aminopeptidáz 1-688. aminosavaiból álló szekvenciával. A b2324aminopeptidáz-homológok közé tartoznak például azok a b2324-aminopeptidáz-polipeptidek, amelyek a 2. azonosító számú aminosavszekvencia N- vagy C-terminális végén (vagy egy vagy több belső doménben) egy vagy több hozzáadott aminosavat tartalmaznak, vagy egy vagy több aminosavuk deletálva van. A b2324-aminopeptidáz-homológ előnyösen legalább 85%-ban, előnyösebben legalább kb. 90%-ban, még előnyösebben legalább kb. 95%-ban azonos a 2. azonosító számú szekvencia 1-688. aminosavaiból álló szekvenciával. A homológok nem tartalmaznak natív szekvenciát.
Az „yfcK-gén” kifejezés olyan génre vonatkozik, amely legalább 80%-os szekvenciaazonosságot mutat a 2. azonosító számú szekvencia 1-688. aminosavaiból álló, natív szekvenciájú b2324-aminopeptidázt kódoló DNS-molekula szekvenciájával, és aminopeptidázt kódol. Az yfcK-gének közé tartoznak azok a gének is, amelyek legalább 80%-ban azonosak az 1. azonosító számú szekvencia egészét tartalmazó kromoszomális yfcK-génnel, és aminopeptidázt kódolnak. Az
HU 225 243 Β1 ilyen yfcK-gének közé tartozik például az a kromoszomális yfcK-gén, amely az 1. azonosító számú szekvencia 5'- vagy 3'-végén (vagy egy belső szakaszában) egy vagy több hozzáadott nukleotidot tartalmaznak (vagy egy vagy több nukleotid deletálva van). Az yfcK-gén előnyösen legalább kb. 85%-os, előnyösebben legalább kb. 90%-os, még előnyösebben legalább kb. 95%-os szekvenciaazonosságot mutat az 1. azonosító számú szekvencia 1-2067. nukleotidjaiból álló nukleotidszekvenciával. Az „yfcK-gén” kifejezés magában foglalja a natív szekvenciájú yfcK-gént (azaz a kromoszomális yfcK-gént) is.
A találmány leírásában a b2324-aminopeptidáz szekvenciáinak vonatkozásában megadott „százalékos aminosavszekvencia-azonosság” úgy definiálható, mint egy kiszemelt szekvencia azon aminosavainak százalékos aránya, amelyek azonosak a b2324-aminopeptidáz aminosavaival [a két szekvencia megfelelő egymás alá rendezése („alignment”) és szükség esetén - a maximális százalékos azonosság biztosítása érdekében hézagok beiktatása után], és figyelmen kívül hagyva az esetleges konzervatív szubsztitúciókat. Az általunk megadott százalékos szekvenciaazonossági értékek a WU-BLAST-2 program alkalmazásával generálhatók [Altschul és munkatársai: Methods in Enzymology 266, 460 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html], A WU-BLAST-2 program több keresőparaméter felhasználásával működik, melyek legtöbbje alapértelmezett beállítású. A változtatható paraméterek a következő értékekre vannak beállítva: átfedési távolság=1; átfedés! hányad=0,125; szóküszöb (T)=11. A HSP S és HSP S2 paraméterek dinamikus értékek, melyeket a program maga állapít meg (az adott szekvencia összetételétől és azon adatbázis összetételétől függően, amellyel szemben a kérdéses szekvencia összehasonlítási analízisét végezzük, azonban ezek az értékek az érzékenység növelése irányában is beállíthatók). A százalékos aminosavszekvencia-azonossági értéket úgy határozzuk meg, hogy a megegyező aminosavak számát elosztjuk az egymás alá rendezett régióban lévő „hosszabb” szekvencia aminosavainak számával. Azt tekintjük „hosszabb” szekvenciának, amely az egymás alá rendezett régióban a leginkább valóságos aminosavakat tartalmazza (a WU-Blast-2 programmal beiktatott hézagokat figyelmen kívül hagyva).
A fentiek szerint végzett szekvencia-összehasonlítások vonatkozásában a „pozitív aminosav kifejezés az összehasonlított szekvenciák azon aminosavaira vonatkozik, amelyek nem azonosak, mégis hasonló tulajdonságúak (például konzervatív szubsztitúciók eredményeként). A pozitív aminosavak százalékos arányát a BLOSUM 62 mátrixban pozitív értékkel pontozott aminosavaknak a hosszabb szekvenciában lévő aminosavak összes számához viszonyított aránya határozza meg.
Hasonló módon, a b2324-aminopeptidáz-polipeptidek kódolószekvenciáját illetően, a „százalékos nukleinsavszekvencia-azonosság” úgy definiálható, mint egy kiszemelt szekvencia azon nukleotidjainak százalékos aránya, amelyek azonosak a b2324-aminopeptidáz kódolószekvenciájában lévő nukleotidokkal. Ezek az azonossági értékek a WU-BLAST-2 - alapértelmezett paraméterekre beállított - BLASTN-moduljával számíthatók ki (átfedési távolság=1; átfedési hányadé,125).
A találmány szerinti polipeptidekkel összefüggésben alkalmazott „izolált” kifejezés olyan polipeptidre vonatkozik, amely egy - természetes környezetében megtalálható - komponenstől el van választva és/vagy különítve. A természetes környezetben megtalálható szennyező komponensek olyan anyagok, amelyek a polipeptid diagnosztikai vagy gyógyászati felhasználását akadályoznák; az ilyen komponensek közé tartoznak az enzimek, hormonok és egy - proteinszerű vagy nem proteinszerű - oldott anyagok. A találmány előnyös megvalósítási módjai értelmében a polipeptid tisztításának mértéke a következő: (1) forgócsészés („spinning cup”) szekvenátor alkalmazásával legalább 15 aminosavas N-terminális vagy belső aminosavszekvencia kinyeréséhez szükséges tisztaság; vagy (2) redukáló vagy nem redukáló feltételekkel (Coomassie-kék vagy előnyösen ezüstfestés alkalmazásával) végzett SDS-PAGE-analízissel homogenitásnak megfelelő tisztaság. Az izolált polipeptid kifejezés jelentése kiterjed a rekombináns sejtekben in situ megtalálható polipeptidekre, mivel az ilyen sejtekben a b2324-aminopeptidáz természetes környezetének legalább egy komponense hiányzik. Mindazonáltal az izolált polipeptideket általában legalább egy tisztítási lépést követően kapjuk.
A b2324-aminopeptidáz-polipeptidet kódoló „izolált” nukleinsavmolekula kifejezés a b2324-aminopeptidázt kódoló nukleinsav természetes forrására általánosan jellemző legalább egy szennyező nukleinsavmolekulától elválasztott és azonosított nukleinsavmolekulára vonatkozik. Egy b2324-aminopeptidázt kódoló, izolált nukleinsavmolekula nem azonos a természetben megtalálható alakjával, így az izolált nukleinsavak megkülönböztethetők a természetes sejtekben létező, b2324-aminopeptidázt kódoló nukleinsavmolekuláktól. Mindazonáltal a b2324-aminopeptidáz-polipeptideket kódoló, izolált nukleinsavak közé tartoznak azok a b2324-aminopeptidázt kódoló nukleinsavmolekulák is, amelyek a b2324-aminopeptidázt normális esetben expresszáló sejtekben vannak jelen, azonban a természetes sejtekre jellemzőtől eltérő kromoszomális pozícióban helyezkednek el.
A találmány kiviteli alakjai
A találmány egyik szempontjának megfelelően olyan bakteriális gazdasejttörzseket tárunk fel, amelyekből hiányzik egy aminopeptidáz (amely a polipeptidek N-terminális végén elhelyezkedő aminosav lehasításáért felelős enzim, például egy N-terminális fenil-alanin és a vele szomszédos aminosav közötti kötést hasító enzim), ami a polipeptid hatékonyabb tisztítását teszi lehetővé.
Közelebbről, Gram-negatív baktériumsejteket tárunk fel, amelyek egy kromoszomális gén vonatkozásában hiányosak (mely gén az ilyen sejtek vad típusú
HU 225 243 Β1 változataiban nem hiányos), mely gén legalább 80%ban azonos egy natív szekvenciájú b2324-aminopeptidázt kódoló DNS-molekulával, mely aminopeptidáz a
2. azonosító számú szekvencia 1-688. aminosavait tartalmazza, és aminopeptidázt kódol. Ilyenformán az ilyen gén szekvenciája legalább 80%-ban azonos a natív szekvenciájú b2324-aminopeptidázt kódoló yfcK-gén szekvenciájával. Ez a szekvenciaazonosság előnyösen legalább kb. 85%-os, előnyösebben legalább kb. 90%-os, még előnyösebben legalább kb. 95%-os, legelőnyösebben 100%-os.
A találmány egy további kiviteli alakja értelmében olyan Gram-negatív baktériumsejteket tárunk fel, amelyek egy kromoszomális gén vonatkozásában hiányosak (mely gén az ilyen sejtek vad típusú változataiban nem hiányos), mely gén olyan aminopeptidázt kódol, amely a 2. azonosító számú szekvencia 1-688. aminosavaiból álló, natív szekvenciájú b2324-aminopeptidázzal legalább 80%-os szekvenciaazonosságot mutat, amely előnyösen legalább kb. 85%-os, előnyösebben legalább kb. 90%-os, még előnyösebben legalább kb. 95%-os. A szóban forgó sejtek közé tartoznak a natív szekvenciájú, kromoszomális yfcK-gén vonatkozásában deficiens sejtek.
A találmány egy harmadik szempontjának megfelelően Gram-negatív baktériumsejteket tárunk fel, amelyek egy kromoszomális gén vonatkozásában hiányosak (mely gén az ilyen sejtek vad típusú változataiban nem hiányos), mely gén a 2. azonosító számú szekvencia 1-688. aminosavait tartalmazó, natív szekvenciájú b2324-aminopeptidáz aminosavszekvenciájával összehasonlítva legalább 80% pozitív aminosavat tartalmazó polipeptidet (aminopeptidázt) kódoló DNS-t foglal magában. A szóban forgó sejtek közé tartoznak azok a sejtek, amelyek olyan gén vonatkozásában hiányosak, mely gén a natív szekvenciájú b2324-aminopeptidáz aminosavszekvenciájával összehasonlítva 100% pozitív aminosavat tartalmazó polipeptidet (aminopeptidázt) kódoló DNS-t tartalmaz.
A találmány szerinti megoldás e szempontja szerinti sejtek Gram-negatív baktériumok (például Salmonella, Yersinia, Haemophilus, Caulobacter, Agrobacterium, Vibrio, stb.), melyek genomja szekvenálással fel van térképezve, és amelyekben megjósolható egy yfcK-homológ jelenléte. Még előnyösebben, a szóban forgó sejt Salmonella nemzetségbe vagy Enterobacteriaceae családba tartozó sejt, még előnyösebben E. co//-sejt, legelőnyösebben E. coli W3110-törzsbe tartozó sejt.
A találmány szerinti sejt adott esetben a sejt vad típusaiban jelen lévő egy vagy több egyéb kromoszomális gén (például bakteriális proteázokat kódoló gének) vonatkozásában is hiányos lehet. Jól ismertek a proteázokban, illetve a proteázokat szabályozó génekben hiányos E. coli-törzsek [lásd például a WO 88/05821 számú nemzetközi közzétételi iratot (1988. 08. 11.); Chaudhury és Smith: J. Bacteriol. 160, 788-791 (1984); Elish és munkatársai: J. Gén. Microbiol. 134, 1355-1364 (1988); Baneyx és Georgiou: „Expression of proteolytically sensitive polypeptides in Escherichia coli In: „Stability of Protein Pharmaceuticals”, 3. kötet, szerk.: Ahern és Manning, 69-108. old., Plenum Press, New York, (1992)].
Az ilyen proteázhiányos törzsek némelyikét proteolízisre érzékeny (és elsősorban gyógyászati és kereskedelmi szempontból fontos) peptidek hatékony előállítási módszereinek kidolgozása során alkalmazták. Az 5 508 192 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban több proteázhiányos és/vagy hősokkprotein-hiányos bakteriális gazdasejt létrehozását tárták fel. Az ilyen gazdasejtek közé egyszeresen, kétszeresen, háromszorosan, illetve négyszeresen proteázhiányos baktériumok és az egy proteázt tartalmazó baktériumok tartoznak, amelyek az rpoH-génben is hordoznak mutációt. A feltárt proteázgének példái közé tartoznak a következők: depP ompT ptr3, prc (tsp) és egy degP rpoH törzs, amelyről leírták, hogy E. co//-sejtekben a rekombináns proteinek nagyobb mennyiségű termelődését teszi lehetővé. Park és munkatársai [Biotechnoi. Prog. 15, 164 (1999)] leírták, hogy a két sejtburokproteáz génje (degP prc) vonatkozásában hiányos HM114-törzs valamivel gyorsabban szaporodott és több fúziós proteint termelt, mint az egyéb - több proteáz tekintetében hiányos - törzsek. A találmány szerinti sejtek az említett proteázgének közül egy vagy több vonatkozásában lehetnek hiányosak, mely proteázgének közül a következők előnyösek: a proteáz-lll-at kódoló kromoszomális ptr3-gén, OmpT-proteázt kódoló kromoszomális ompT-gén és/vagy DegP-proteázt kódoló degP-gén. A törzsek a tonA- (fhuA-), phoA- és/vagy deoC-génekre nézve is hiányosak lehetnek. A találmány szerinti sejt a degPés/vagy az fhuA-génre nézve hiányos, még előnyösebben genotípusa a következő: W3110 &fhuA&(argFlac)169 phoAAE15 deoC2 degP::kanR ilvG2096 AyfcK.
A találmány egy következő kiviteli alakja a találmány szerinti sejt számára heterológ polipeptidet kódoló nukleinsavat tartalmaz. Az ilyen nukleinsav bármely alkalmas módszerrel bejuttatható a sejtbe, előnyösen - rekombináns expressziós vektor vagy homológ rekombináció alkalmazásával végzett - transzformációval, legelőnyösebben vektorral végzett transzformációval.
A találmány céljaira alkalmas heterológ polipeptidek közé tartoznak a fentebb megadottak, valamint azon proteinek és polipeptidek, amelyek első aminosavként metionint, második aminosavként pedig fenil-alanint tartalmaznak, továbbá azok, amelyek első aminosavként fenil-alanint tartalmaznak (vagyis azok, amelyek érett alakjukban kezdőaminosavként fenil-alanint tartalmaznak; amelyekről a kezdő metionin proteolitikus érési folyamat eredményeként lehasításra került; és olyan pre-pro-proteinek, amelyekről a szignálpeptid lehasítása következtében az érett protein N-terminálisán fenil-alanin van jelen, mint például a humán növekedési hormon esetében). Ennek megfelelően heterológ polipeptidként bármely olyan polipeptid alkalmazható, amely heterológ a termeltetésére alkalmazott baktériumsejt számára, ha az érett alak vagy végtermék N-terminálisán fenil-alanin található.
A fenil-alanin elhelyezkedésével szemben támasztott követelménynek megfelelő humán polipeptidek pél7
HU 225 243 Β1 dái a következők: kollagén alfa-2-lánc prekurzor, T-sejt-felületi glikoprotein cd3-delta-lánc prekurzor, inzulinprekurzor, integrin alfa-3 prekurzor, integrin alfa-5 prekurzor, integrin alfa-6 prekurzor, integrin alfa-7 prekurzor, integrin alfa-e prekurzor, integrin alfa-m prekurzor, integrin alfa-v prekurzor, integrin alfa-x prekurzor, foszfatidil-kolin-szterol acil-transzferáz-prekurzor, limfocitafunkcióval asszociált antigén-3 prekurzora, interstitialis kollagenáz prekurzora, neutrophil kollagenáz prekurzora, motilinprekurzor, neuropilin-1-prekurzor, vérlemezke-aktiváló faktor acetil-hidroláz-prekurzor, csontszialoprotein-ll prekurzor, növekedési hormon változat prekurzor [Seeburg: DNA 1, 239-249 (1982)], szomatotropinprekurzor, kisméretű, indukálható a13-citokin-prekurzor, kisméretű, indukálható a27-citokin-prekurzor, kisméretű, indukálható b11-citokin-prekurzor, tumornekrózisfaktor-receptor főcsalád 8. tagjának prekurzora, thyrotropin béta-láncának prekurzora, vascularis endothelialis növekedési faktor-c prekurzora, pre-pro-inzulin (lásd BE 885196-A), HGH-V humán növekedési hormon változat (lásd EP 89666-A), humán proinzulin (lásd 4 431 740 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás), AP-szignálpeptid és humán növekedési hormon (hGH), melyet a ρΑΡ-1-gén kódol (lásd EP 177343-A), humán növekedési hormon (hGF) prekurzora (lásd EP245138-A), humán BMP (lásd EP409472-A), humán LFA-3 (CD58) protein (lásd DE 4008354-A), humán II. típusú interleukin—1 -receptor (lásd EP 460846-A), csökkentett nephrotoxicitású aprotininanalóg-6 (lásd WO 92/06111—A), csökkentett nephrotoxicitású aprotininanalóg-7 (lásd WO 92/06111-A), csökkentett nephrotoxicitású aprotininanalóg-8 (lásd WO 92/06111-A), csökkentett nephrotoxicitású aprotininanalóg-1 0 (lásd WO 92/06111-A), csökkentett nephrotoxicitású aprotininanalóg-9 (WO 92/06111—A), csökkent nephrotoxicitású aprotininanalóg-11 (WO 92/06111—A), csökkentett nephrotoxicitású aprotininanalóg-12 (WO 92/06111-A), csökkentett nephrotoxicitású aprotininanalóg-13 (WO 92/06111—A), csökkentett nephrotoxicitású aprotininanalóg-14 (WO 92/06111—A), alfa-6A integrinalegység (WO 92/19647-A), alfa-6B integrinalegység (WO 92/19647-A), humán LFA-3-protein (EP 517174—A), humán plazma karboxi-peptidáz-B (US 5206161-A), limfoblasztoid eredetű IL-1R (WO 93/19777—A), humán LFA-3 (JP06157334-A), limfocitaaktiválással indukált humán receptor (ILA; CA2108401-A), endothelsejt-protein-receptor (WO 96/05303-A1), humán lecitin-koleszterin acil-transzferáz (LCAT; WO 97/17434-A2), humán oldható CD30-antigén (DE 9219038-U1), humán kisméretű CCN-szerű növekedési faktor (WO 96/39486-A1), humán plazma karboxi-peptidáz-B (US 5593674-A), humán növekedési hormon (WO 98/20035-A1), pKFN-864-plazmidfragmens által kódolt inzulinanalóg (EP861851-A1), főemlős-eredetű CXC-kemokin „IBICK” polipeptid (WO 98/32858-A2), humán kisméretű CCN-szerű növekedési faktor (US5780263-A), humán plazma hialuronidáz (hpHAse) aminosavszekvenciája (WO9816655-A1), humán II. típusú IL-1R-protein (US5767064-A), Homo sapiens CC365 40 klón protein (WO 98/07859-A2), humán növekedési hormon (US5955346-A), humán oldható növekedési hormon receptor (US5955346-A), humán CD30-antigén-protein (WO 99/40187-A1), humán neuropilin-1 (WO 99/29858-A1), humán agyszövet-eredetű polipeptid (OMB096-klón; WO 99/33873-A1), humán PRO285 Toll-protein (WO 99/20756-A2), humán szekretált peptid aminosavszekvenciája (WO 99/11293—A1), humán szekretált protein aminosavszekvenciája (WO 99/07891—A1), humán plazma karboxi-peptidáz-B (PCPB) thr147 (WO 98/55645-A1), humán MIG-béta kemokin-protein (EP887409-A1), humán szekréciós protein aminosavszekvenciája (WO 2000/52151-A2), pWRG1630-plazmid által kódolt humán hGH/EGF fúziós protein (US6090790-A), 3470865-ös cDNS-klón által kódolt humán szekretált protein (WO 2000/37634-A2), humán monocitaeredetű FDF03Delta™-protein (WO 2000/40721-A1), humán monocitaeredetű FDF03-S1-protein (WO 2000/40721-A1), humán monocitaeredetű FDF03M14-protein (WO 2000/40721-A1), monocitaeredetű FDF03-S2-protein (WO 2000/40721-A1), humán szekretált protein-2 (EP1033401-A2), humán vascularis endothelialis növekedési faktor-C pre-pro-alakja (WO 2000/21560-A1), humán membrántranszport-protein (MTRP-15; WO 2000/26245-A2), humán vascularis endothelialis növekedési faktor (VEGF)-C protein (WO 2000/24412-A2), humán TANGO-191 (WO 2000/18800-A1), HKAEF92 interferonreceptor (WO 99/62934-A1), humán alfa-10 integrinalegység (WO 99/51639-A1), humán alfa-10 integrinalegység „splice változata (WO 99/51639-A1), humán delta-1-pirrolin-5-karboxilát reduktáz homológ (P5CRH; US6268192-B1), humán növekedési/differenciálódási faktor-6-szerű protein (AMF10; WO 01/74897-A2), humán transzporter és ioncsatorna-6 (TRICH-6)-protein (WO 01/62923-A2), humán transzporter és ioncsatorna-7 (TRICH7)-protein (WO 01/62923-A2), humán mátrix metalloproteináz-1 (MMP-1 )-protein (WO 01/66766-A2), humán mátrix metalloproteináz-8 (MMP-8)-protein (WO 01/66766-A2), humán mátrix metalloproteináz-18P (MMP-18P)-protein (WO 01/66766-A2), humán G-proteinhez kapcsolt receptor-6 (GPCR6)-protein (WO 01/81378-A2), humán Zlec1-protein (WO 01/66749-A2), humán mátrix metalloproteináz (MMP)-szerű protein (WO 01/57255—A1), humán 15. gén által kódolt szekretált HFXDI56-protein (WO 01/54708-A1), humán 9. gén által kódolt szekretált HTEGF16-protein (WO 01/54708-A1), humán szekretált protein-4 (SECP) (WO 01/51636-A2), humán 20. gén által kódolt szekretált HUSIB13-protein (WO 01/51504-A1), humán 28. gén által kódolt szekretált HlSAQ04-protein (WO 01/51504-A1), humán 35. gén által kódolt szekretált HCNAH57-protein (WO 01/51504-A1), humán 17. gén által kódolt szekretált HBMCF37-protein (WO 01/51504—A1), humán tumornekrózis-faktor (TNF) által stimulált gén-6 (TSG-6)-protein (US6210905-B1), FCTR10 (WO200146231-A2), humán 18. gén által kódolt szekretált HFKHW50-protein (W0200136440-A1), humán 13. gén által kódolt szekretált HE8FC45-protein (WO 00/77022-A1), humán 32. gén által kódolt szekre8
HU 225 243 Β1 tált HTLIF12-protein (WO 00/77022-A1), humán 4. gén által kódolt szekretált HCRPV17-protein (WO 01/34643-A1), humán 23. gén által kódolt szekretált HE80K73-protein (WO 01/34643-A1), humán 4. gén által kódolt szekretált HCRPV17-protein (WO 01/34643-A1), humán 22. gén által kódolt szekretált HMSFK67-protein (WO 01/32676-A1), humán 22. gén által kódolt szekretált HMSFK67-protein (WO 01/32676-A1), humán 19. gén által kódolt szekretált HCRNF14-protein (WO 01/34800-A1), humán 6. gén által kódolt szekretált HNEEB45-protein (WO 01/32687-A1), humán 9. gén által kódolt szekretált HHPDV90-protein (WO 01/32675-A1), humán 1. gén által kódolt szekretált B7-H6-protein (WO 01/34768-A2), humán 3. gén által kódolt szekretált HDPMS12-protein (WO 01/34768-A2), humán 13. gén által kódolt szekretált HRABS65-protein (WO 01/34768-A2), humán 1. gén által kódolt szekretált HDPAP35-protein (WO 01/34768-A2), humán 3. gén által kódolt szekretált HDPMS12-protein (WO 01/34768-A2), humán 17. gén által kódolt szekretált HACCL63-protein (WO 01/34769-A2), humán 10. gén által kódolt szekretált HHEPJ23-protein (WO 01/34629-A1), humán 5. gén által kódolt szekretált HE9QN39-protein (WO 01/34626-A1), humán 14. gén által kódolt szekretált HCRN087-protein; 104. azonosító számú szekvencia (WO 01/34626-A1), humán 5. gén által kódolt szekretált HE9QN39-protein (WO 01/34626-A1), humán 14. gén által kódolt szekretált HCRN087-protein (145. azonosító számú szekvencia) (WO 01/34626-A1), humán 4. gén által kódolt szekretált HSODE04-protein (WO 01/34623-A1), humán 6. gén által kódolt szekretált HMZMF54-protein (WO 01/34623-A1), humán 18. gén által kódolt szekretált HPJAP43-protein (WO 01/34623-A1), humán 27. gén által kódolt szekretált HNTSL47-protein (WO 01/34623-A1), humán 27. gén által kódolt szekretált HNTSL47-protein (WO 01/34623-A1), humán 21. gén által kódolt szekretált HLJEA01-protein (WO 01/34767-A2), humán 25. gén által kódolt szekretált HTJNX29-protein (115. azonosító számú szekvencia) (WO 01/34627-A1), humán 25. gén által kódolt szekretált HTJNX29-protein (165. azonosító számú szekvencia) (WO 01/34627-A1), humán TANGO-509 aminosavszekvencia (WO 01/21631—A2), humán TANGO-210-protein (WO 01/18016-A1), humán rákkal összefüggő protein-12 (WO 01/18014—A1), humán rákkal összefüggő protein-18 (WO 01/18014—A1), humán B7-4 szekretált (B7-4S)-protein (WO 01/14557—A1), humán B7-4 membránkötött (B7-4M)-protein (WO 01/14557—A1), humán B7-4 szekretált (B7-4S)-protein (WO 01/14556—A1), humán B7-4 membránkötött (B7-4M)-protein (WO 01/14556-A1), humán DNAX 80 interleukin-változat (WO 01/09176-A2), humán lecitin-koleszterin aciltranszferáz (LCAT; WO 01/05943-A2), humán PR01419-polipeptid aminosavszekvenciája (WO 00/77037-A2), humán alfa-11 integrinlánc aminosavszekvenciája (WO 00/75187-A1), humán A259 (WO 00/73339-A1), humán csontvelő-eredetű peptid (WO 01/66558-A1), humán tumorasszociált antigénhatású
169 (TAT169)-célprotein (WO 02/16602-A2), humán 3. gén által kódolt szekretált HKZA035ID-protein (WO 02/18411-A1), humán 3. gén által kódolt szekretált HKZA035-protein (WO 02/18411-A1), humán 11. gén által kódolt szekretált HLYCK27-protein (WO 02/18435-A1), humán INTG-1-protein (WO 02/12339-A2), humán 15. gén által kódolt szekretált HFPHA80-protein (70. azonosító számú szekvencia) (WO 02/16390-A1), humán 15. gén által kódolt szekretált HFPHA80-protein (94. azonosító számú szekvencia) (WO 02/16390-A1), humán 2. gén által kódolt szekretált HDQFU73-protein (69. azonosító számú szekvencia) (WO 02/24719-A1), humán 8. gén által kódolt szekretált HDPTC31-protein, 75. azonosító számú szekvencia (WO 02/24719-A1), humán gene 2. gén által kódolt szekretált HDQFU73-protein, 90. azonosító számú szekvencia (WO 02/24719-A1), humán 6. gén által kódolt szekretált HDPRJ60-protein, 95. azonosító számú szekvencia (WO 02/24719-A1), humán 8. gén által kódolt szekretált HDPTC31-protein, 99. azonosító számú szekvencia (WO 02/24719-A1), humán 8. gén által kódolt szekretált HDPTC31-protein, 100. azonosító számú szekvencia (WO 02/24719-A1), humán proinzulin-analóg (WO 02/04481-A2), tumorasszociált antigénhatású TAT136-célprotein (WO 02/16429-A2), tumorasszociált antigénhatású célpolipeptid (TAT-136; WO 02/16581-A2), humán CD30-protein (WO 02/11767-A2), humán 1 R2-interleukin (IL-1R2)-protein (WO 02/11767-A2), humán G-proteinnel kapcsolt receptor-7 (GPCR-7)-protein (WO 02/06342-A2), humán G-proteinnel kapcsolt receptor-6a (GPCR6a; WO 02/08289-A2), humán G-proteinnel kapcsolt receptor-eb (GPCR6b; WO 02/08289-A2), humán II. típusú interleukin-1-receptor (WO 01/87328-A2), humán A259-polipeptid (WO 01/81414-A2), humán érfali sejtadhéziós molekula-1 (VCAM1; US6307025-B1), humán érfali sejtadhéziós molekula-1 b (VCAMIb; US6307025-B1), humán transzporterek és ioncsatornák (TRICH)-6 (WO 01/77174-A2), és humán proteinmódosítási és fenntartási molekula-8 (PMMM-8; WO 02/02603-A2).
A találmány szerinti heterológ polipeptidet úgy állítjuk elő, hogy (a) heterológ polipeptidet kódoló nukleinsavat tartalmazó sejteket tenyésztünk; és (b) a sejtekből kinyerjük a polipeptidet. A polipeptidet a sejt citoplazmájából, periplazmájából vagy tenyésztő tápközegéből nyerhetjük ki, előnyösen a periplazmából vagy a tápközegből. A tenyésztést előnyösen fermentorban végezzük. A sejttenyésztést és a polipeptid termeltetését jól ismert módon, szokványos paraméterek alkalmazásával végezzük (lásd például az alábbiakban leírt eljárásokat).
Ha az előállítani kívánt polipeptid a sejt citoplazmájában termelődik, a sejtek feltárása előtti vagy utáni inkubálásra nincs szükség, bár növelheti a hasított polipeptid képződésének hatékonyságát. Ha a kívánt polipeptid a periplazmába vagy a tenyésztő tápközegbe választódik ki, legalább kb. 1/2 órás inkubálást ajánlatos végezni. A periplazmába kiválasztódott polipeptidek kinyerésének előnyös módszere szerint a sejteket
HU 225 243 Β1
- például nagyobb mennyiség esetén homogenizátorban, „French présben vagy mikrofluidizálóberendezésben, míg kisebb mennyiség esetén ultrahangos kezeléssel - feltárjuk, majd lizátumot készítünk, amelyből ép polipeptid tisztítható. A lizátumot a tisztítási lépés előtt inkubálásnak vetjük alá. Az inkubálást alkalmas hőmérsékleten, előnyösen szobahőmérsékleten vagy még alacsonyabb hőmérsékleten, legalább kb. egy óra hosszat, előnyösebben kb. 2-50 órán át végezzük. Az eljárás szempontjából előnyös polipeptideket és sejttípusokat fentebb ismertettük.
A polipeptid N-terminális aminosava lehasításának megakadályozására úgy járunk el, hogy a polipeptidet kódoló nukleinsavat tartalmazó sejtet a nukleinsav expresszióját elősegítő feltételek mellett tenyésztjük. Az ilyen tenyésztési feltételek szakember számára jól ismertek. Előnyösen a polipeptidet a folyamat végén kinyerjük a sejtből.
Fordított esetben a hasított polipeptidet kell megtisztítani a nem hasított (szennyezésként jelen lévő) polipeptidtől. Ennek megfelelően a polipeptidet b2324-aminopeptidáz-proteinnel érintkeztetjük, előnyösen oly módon, hogy a polipeptidet a b2324-aminopeptidáz-proteinnel együtt inkubáljuk. A hasított polipeptid előállításának egy másik eljárása során - az alkalmazott sejtekre nézve endogén vagy heterológ yfcK-gént hordozó baktériumsejteket tenyésztünk, mely baktériumsejtek megfelelő, nem hasított (N-terminálisán hozzáadott aminosavat tartalmazó) polipeptidet kódoló nukleinsavat tartalmaznak, és a tenyésztést olyan feltételek mellett végezzük, amelyek elősegítik az yfcK-gén expresszióját vagy túlzott mértékű expresszióját, valamint a nem hasított polipeptidet kódoló nukleinsav expresszióját, és ha a nem hasított polipeptid és a b2324-aminopeptidáz-protein az expresszáltatás után nem érintkezik egymással, a nem hasított polipeptidet érintkeztetjük a b2324-aminopeptidáz-proteinnel, előállítva ezáltal a hasított polipeptidet.
Előnyösen olyan polipeptidet hasítunk, amely a sejtek szempontjából heterológ, még előnyösebben, amely a fentebb felsorolt kategóriák valamelyikébe tartozik. Az eljárásban előnyösen a fentebb megadott sejttípusok valamelyikét alkalmazzuk. Az yfcK-gének vektor alkalmazásával juttathatók be a gazdasejtbe, illetve a sejt számára endogének lehetnek. A gazdasejtekben az yfcK-gén - a polipeptidet kódoló nukleinsavhoz viszonyítva - előnyösen túlzott mértékben expresszálódik, ami kedvez az enzimatikus hasítási reakciónak.
A nem hasított polipeptidet a b2324-aminopeptidáz-proteinnel történő érintkezés előtt kinyerjük a sejtekből, melynek során a sejteket (fentebb említett technikák alkalmazásával) feltárjuk, majd emésztjük. Az emésztés után a nem hasított polipeptidet előnyösen b2324-aminopeptidáz-proteinnel inkubáljuk, lehasítva ezáltal az N-terminális aminosavat, és a hasított polipeptidet az inkubált lizátumból tisztítjuk. A lizátumot kb. 20-40 °C-on legalább kb. egy órán át, még előnyösebben kb. 30-40 °C-on kb. 2-50 órán át inkubáljuk.
/. Nem hasított polipeptid termeltetése és kinyerése
A) Nukleinsav inszertálása replikációra képes vektorba
A polipeptidet kódoló nukleinsavként, alkalmas módon, tetszőleges forrásból származó cDNS vagy genomi DNS alkalmazható, feltéve, hogy kódolja a kívánt polipeptide(ke)t.
A heterológ nukleinsavat (például cDNS-t vagy genomi DNS-t) baktériumsejtekben történő expresszáltatása céljából (megfelelő promoter szabályozása alatt) replikációra képes vektorba inszertáljuk. Erre a célra számos vektor alkalmas; a megfelelő vektor kiválasztása elsősorban az inszertálni kívánt nukleinsav méretétől és a vektorral transzformálni kívánt gazdasejttől függ. A vektorok, a konkrét gazdasejttől függően (amellyel kompatíbilisak), különböző komponenseket tartalmaznak. A vektorok, többek között, a következő komponenseket tartalmazhatják: szignálszekvencia, replikációs kezdőhely, egy vagy több markergén, promoter és transzkripciós terminációs szekvencia.
A replikont és - a gazdasejttel kompatibilis fajból származó - szabályozószekvenciákat tartalmazó plazmidvektorokat általában E. coli gazdasejtekben alkalmazzuk. A vektor rendszerint tartalmaz egy replikációs helyet, valamint markerszekvenciákat, amelyek lehetővé teszik a transzformált sejtek fenotípuson alapuló szelektálását. Például E. coli-sejtek transzformálására általában pBR322-plazmidot alkalmaznak, amely egy E. co//-törzsből származik [lásd például Bolivár és munkatársai: Gene 2, 95 (1977)]. A pBR322-plazmid ampicillin- és tetraciklinrezisztencia-gént tartalmaz, ezáltal egyszerű módját biztosítja a transzformált sejtek azonosításának. A pBR322-plazmid (más bakteriális plazmidokhoz vagy fágokhoz hasonlóan) általában olyan promotereket tartalmaz, amelyek E. coli gazdasejtekben alkalmasak a szelektálható markergének expressziójának szabályozására.
(i) Szignálszekvencia-komponens
A kívánt polipeptidet kódoló DNS nemcsak közvetlenül expresszáltatható, de más polipeptiddel (előnyösen szignálszekvenciával vagy egyéb, az érett polipeptid N-terminálisán specifikus hasítási helyet tartalmazó polipeptiddel) képzett fúziós polipeptid létrehozására is felhasználható. A szignálszekvencia általában a vektor komponense, de lehet a polipeptidet kódoló - vektorba inszertált - DNS része is. Heterológ szignálszekvenciaként előnyösen olyan szekvenciát alkalmazunk, amelyet a gazdasejt képes felismerni és feldolgozni (azaz szignálpeptidázzal lehasítani).
Bakteriális gazdasejtek esetében, amelyek nem ismerik fel a természetes vagy eukarióta polipeptid szignálszekvenciáját, azt megfelelő prokarióta szignálszekvenciával helyettesítjük. Az alkalmas prokarióta szignálszekvenciák közé tartozik az alkalikus foszfatáz, penicillináz, Ipp vagy a hőstabil enterotoxin-ll vezetőszekvenciája.
(ii) Replikációs kezdőhely komponens
Az expressziós vektorok tartalmaznak olyan nukleinsavszekvenciát, amely lehetővé teszi a vektor egy
HU 225 243 Β1 vagy több kiválasztott gazdasejtben történő replikációját. Az ilyen szekvenciák különféle baktériumok esetében jól ismertek. A pBR322-plazmid replikációs kezdőhelye a legtöbb Gram-negatív baktériumban (így E. co//'-ban is) alkalmazható.
(iii) Szelekciós gén komponens
Az expressziós vektorok általában tartalmaznak szelekciós gént (más néven szelektálható markert) is. A szelekciós gén olyan proteint kódol, amely nélkülözhetetlen a szelektív tápközegen tenyésztett, transzformáit gazdasejtek életben maradásához vagy szaporodásához. A szelekciós gént tartalmazó vektorral transzformált gazdasejtek az ilyen tápközegben nem maradnak életképesek. Az ilyen szelektálható marker nem azonos a találmány értelmében alkalmazott genetikai markerekkel. A jellemző szelekciós gének olyan proteineket kódolnak, amelyek (a) antibiotikumokkal vagy egyéb toxinokkal (például ampicillin, neomicin, methotrexát vagy tetraciklin) szembeni rezisztenciát biztosítanak; (b) auxotróf deficienciákat egészítenek ki [kivéve azokat, amelyeket a genetikai marker(ek) jelenléte okoz]; vagy (c) komplex tápközegben nem található, kulcsfontosságú tápanyagokat biztosítanak (például Bacillus-ok esetében a D-alanin racemáz).
A szelekciós rendszerek egyik példája a gazdasejt szaporodását gátló hatóanyag alkalmazásán alapul. A heterológ génnel sikeresen transzformált sejtek olyan proteint termelnek, amely drogrezisztenciát biztosít, s ezáltal ezek a sejtek a szelekciót követően életben maradnak. Az ilyen domináns szelekció példáiként a neomicin [Southern és munkatársai: J. Molec. Appl. Génét. 1, 327 (1982)], a mikofenolsav [Mulligan és munkatársai: Science 209, 1422 (1980)] és a higromicin alkalmazása [Sugden és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 5, 410 (1985)] említhető. E három esetben eukariótaszabályozás alatt bakteriális géneket alkalmaznak, melyek G418-cal vagy neomicinnel (geneticin), xgpt-vel (mikofenolsav), illetve higromicinnel szembeni rezisztenciát közvetítenek.
(iv) Promoterkomponens
A kívánt poiipeptid termeltetésére alkalmas expressziós vektor megfelelő promotert is tartalmaz, amelyet a gazdaorganizmus felismer, és amely a kérdéses polipeptidet kódoló nukleinsavhoz működőképesen kapcsolódik. A prokarióta gazdasejtekben alkalmazható promoterek közé tartoznak a β-laktamáz és laktóz promoterrendszerek [Chang és munkatársai: Natúré 275, 615 (1978); Goeddel és munkatársai: Natúré 281, 544 (1979)]; az arabinóz promoterrendszer [Guzman és munkatársai: J. Bacteriol. 174, 7716 (1992)]; alkalikus foszfatáz, triptofán (trp) promoterrendszer [Goeddel: Nucleic Acids Rés. 8, 4057 (1980) és EP 36 776 számú európai szabadalmi leírás], valamint hibrid promoterek, mint például a tac-promoter [deBoer és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21 (1983)], azonban egyéb ismert bakteriális promoterek is alkalmazhatók. Az ilyen promoterek nukleotidszekvenciája jól ismert, így szakember számára nem okoz gondot ezek kívánt polipeptidet kódoló DNS-hez történő ligálása [Siebenlist és munkatársai:
Cell 20, 269 (1980)], melynek során - a szükséges restrikciós felismerési helyek biztosítása érdekében megfelelő kapcsolószekvenciák vagy adapterszekvenciák alkalmazhatók.
A bakteriális rendszerekben alkalmazható promoterek rendszerint - az adott polipeptidet kódoló DNS-hez működőképesen kapcsolva - Shine-Dalgarno (S. D.)-szekvenciát is tartalmaznak. A promoter restrikciós enzimes emésztéssel hasítható ki a bakteriális forrás DNS-ből, majd a kívánt DNS-t tartalmazó vektorba inszertálható.
(v) Vektorok előállítása és analízise
A fentebb felsorolt komponensekből egyet vagy többet tartalmazó vektorok előállítása során standard ligálási technikákat alkalmazunk. Az izolált plazmidokat vagy DNS-fragmenseket hasítjuk, megfelelő méretűre alakítjuk, majd kívánt formában ismét egymáshoz ligáivá a tervezett plazmidokat hozzuk létre.
Az így előállított plazmidok megfelelő szekvenciájának ellenőrzése céljából a ligálási eleggyel E. coli K-12 294-es törzset (ATCC 31446) vagy más törzseket transzformálunk, és a sikeres transzformánsokat, alkalmas módon, ampicillin- vagy tetraciklinrezisztencia alapján szelektáljuk. A transzformánsokból plazmidokat állítunk elő, azokat restrikciós endonukleázos emésztéssel analizáljuk, és/vagy Sanger és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)] vagy Messing és munkatársai [Nucleic Acids Rés. 9, 309 (1981)] vagy Maxam és munkatársai [Methods in Enzymology 65, 499 (1980)] eljárásával szekvenáljuk.
B) Gazdasejtek szelektálása és transzformálása
Ahogy fentebb említettük, az yfcK-gén vonatkozásában hiányos sejtként számos Gram-negatív baktériumsejt alkalmazható (példákat lásd fentebb). Kiindulási gazdatörzsként előnyösen alkalmazható az E. coli W3110-törzs, mivel széles körben alkalmazzák rekombináns DNS-termékek fermentációs gazdatörzseként. A találmány előnyös megvalósítási módjai értelmében a gazdasejt minimális mennyiségben választhat ki proteolitikus enzimeket. Például a W3110-törzs úgy módosítható, hogy proteineket kódoló génjeiben mutáció következzen be. A gazdatörzsekként alkalmazható E. coli-törzsek példáit (genotípusuk feltüntetésével) az alábbi táblázatban soroljuk fel.
Törzs Genotípus
W3110 K-12 F- lambda- IN (rrnD-rrnE)l
1A2 W3110 ÁfhuA vagy W3110 tonAó.
7C1 W3110 ÁfhuA i\(arg-F-lac)169 phoAÁE15
9E4 W3110 ÁfhuA ptr3
16C9 W3110 ÁfhuA A(arg-F-lac)169 phoAÁE15deoC2
23E3 W3110 ÁfhuA Á(arg-F-lac)169 phoA ÁE15 deoC2 degP::kanR
27A7 W3110 ÁfhuA ptr3 phoAΔΕ15 Á(argF-lac)169
HU 225 243 Β1
Táblázat (folytatás)
Törzs Genotípus
27C6 W311OAff7uA ptr3 phoAAl5 A(argF-lac)169 AompT
27C7 W3110 AfhuA ptr3 phoA AE15 A(argF-lac)169 AompT degP41 (&pstl-kanR)
33B6 W3110Aff)uA i\(arg-F-lac)169 phoAA15 deoC2 degP::kanR ilvG2096
33D3 W3110 AfhuA ptr3 laclq lacL8 AompT degP41 (Apstl-kanR)
36F8 W3110 AfhuA phoAA15 A(argF-lac)169 ptr3 degP41 (Apstl-kanR) ilvG2096R
37D6 W3110 tonAA ptr3 phoAA15 A(argF-lac)169 ompTA degP41kanr rbs7A ilvG
40B4 Nem kanamicinrezisztens degP deléciós mutációt hordozó 37D6-törzs
40G3 W3110 tonAA phoAAE15 A(argF-lac)169 deoC AompT degP41 (APstl-kanr) ilvG2096R phn(EcoB)
43D3 W3110 AfhuA ptr3 phoA- AE15 A(argF-lac)169 AompT degP41 (APst1-kanR) ilvG2096R
43E7 W3110 AfhuA A(argF-lac)169 AompT ptr3 phoAAE15 degP41 (APst1-kans) ilvG2096R
44D6 W3110 Δ/buA ptr3 A(argF-lac)169 degP41 (Apst1-kans) AompT /7vG2096R
45F8 W3110 AfhuA ptr3 A(argF-lac)169 degP41 (Apst1-kans) AompTphoS* (T10Y) ilvG2096R
45F9 W3110 AfhuA ptr3 A(argF-lac)169 degP41 (Apst1-kans) AompT ilvG2096R phoS* (T10Y) Acyo::kanR
Szintén alkalmasak a 36F8-törzs létrehozásának köztes termékei, vagyis a 27B4 (lásd az 5 304 472 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást) és a 35E7 (amely egy spontán hőmérséklet-rezisztens kolóniaizolátum, mely a 27B4-törzsnél jobb növekedésű). Egy további alkalmas törzs a mutáns periplazmikus proteáz(oka)t tartalmazó E. coli-törzs, melyet a 4 946 783 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban tártak fel.
A találmány szerinti mutáns sejt az yfcK-gén szülői sejtbe történő kromoszomális integrálásával vagy más technikák alkalmazásával hozhatók létre (ideértve a példákban leírt módszereket).
A polipeptidet kódoló nukleinsavat a gazdasejtekbe inszertáljuk. A nukleinsavat bármely alkalmas módszerrel (például kívánt polipeptidet kódoló expressziós vektorral történő transzformációval) bejuttathatjuk a megfelelő baktériumsejtbe. A transzformáció során a DNS-t egy organizmusba juttatjuk be oly módon, hogy a DNS - extrakromoszomális elemként vagy a gazdasejt kromoszómájába integrálódva - replikádéra képes legyen. A transzformációt - az alkalmazott gazdasejttől függően - standardtechnikák alkalmazásával hajtjuk végre. Prokarióta sejtek és más, jelentős sejtfalgátakat tartalmazó sejtek esetében általában a kalcium-kloridos kezelés alkalmazható [lásd Sambrook és munkatársai „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” című művének (New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 1.82 szakaszát]. Egy másik technika a polietilénglikol/DMSO alkalmazásával végzett transzformáció [lásd Chung és Miller: Nucleic Acids Rés. 16, 3580 (1988)]. Egy további eljárás az elektroporáció néven ismert technika.
A polipeptidet kódoló gén E. coli gazdasejtgenomba történő inszertálásával végrehajtott transzformáció egyik példája szerint a transzformálásra alkalmazandó vektorba E. coli genomi DNS-ében található szekvenciával komplementer DNS-szekvenciát foglalunk, és az E. coli-sejtek e vektorral történő transzfektálása a genommal homológ rekombinációt és a polipeptidet kódoló gén inszercióját eredményezi. A nukleinsavat előnyösen oly módon inszertáljuk az E. coli genomjába, hogy a gazdasejteket a fentebb leírt expressziós vektorokkal transzformáljuk, majd hagyományos - a különböző promoterek indukálásához megfelelően módosított - tápközegben tenyésztjük.
C) A gazdasejtek tenyésztése
A kívánt polipeptid termeltetésére kiválasztott prokarióta sejteket megfelelő tápközegben, lényegében Sambrook és munkatársai (lásd fentebb) leírása szerint tenyésztjük.
Egy expresszált vagy túlzott mértékben expresszált géntermék szekréciójának előidézése céljából a gazdasejtet a géntermék szekréciójához alkalmas feltételek mellett tenyésztjük. Az ilyen tenyésztési feltételek közé tartozik például a sejt szekrécióját elősegítő hőmérséklet, tápanyagellátás és sejtsűrűség. Idesorolhatók továbbá azok a feltételek, amelyek mellett a sejt képes az olyan alapvető celluláris funkciók végrehajtására, mint a transzkripció, transzláció és a proteinek egyik celluláris kompartmentből másikba történő szállítása.
Alkalikus foszfatáz promoter alkalmazása esetén a találmány szerinti polipeptid termeltetésére kiválasztott E. co//-sejteket megfelelő tápközegben tenyésztjük, amely biztosítja az alkalikus foszfatáz promoter részleges vagy teljes indukcióját (lásd például Sambrook és munkatársai fentebb idézett művét). A tenyésztést soha nem szervetlen foszfát hiányában vagy foszfáthiányos feltételek mellett végezzük. A tápközeg kezdetben olyan mennyiségben tartalmaz szervetlen foszfátot, amely a baktérium szaporodásához elégséges, a proteinszintézis indukálásához szükséges koncentrációnál azonban nagyobb. Ahogy a sejtek szaporodnak és felhasználják a foszfátot, a tápközegben csökkenni kezd a foszfátkoncentráció, ami a polipeptid szintézisének indukcióját eredményezi.
A szén-, nitrogén- és szervetlen foszfátforrás mellett az egyéb szükséges tápközeg-összetevők megfe12
HU 225 243 Β1 lelő koncentrációkban - önmagukban vagy egyéb összetevőkkel vagy tápközeggel alkotott elegyként (például komplex nitrogénforrásként) - a tápközeghez adhatók. A tápközeg pH-ja, elsősorban az alkalmazott gazdaszervezettől függően, 5 és 9 közötti érték lehet.
Indukálható promoter alkalmazása esetén a sejteket, az indukció bekövetkezése érdekében, rendszerint egy adott optikaidenzitás-érték (például nagy sejtsűrűségű fermentáció esetén kb. 200-as A550-érték) eléréséig tenyésztjük, amely pontnál az indukciót beindítjuk (például indukálószer hozzáadásával, a tápközeg egy komponense koncentrációjának lecsökkentésével stb.), miáltal a kérdéses polipeptidet kódoló gén expresszióját indukáljuk.
D) Az expresszió detektálása
Egy mintában a génexpressziót közvetlenül, például hagyományos Southern-blot-analízissel, az mRNS transzkripciójának mennyiségi meghatározását lehetővé tevő Northern-blot-analízissel [lásd Thomas: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201 (1980)], „dot-blot” analízissel (DNS-analízis) vagy - a polipeptid szekvenciáján alapuló, megfelelő módon jelölt próba alkalmazásával végzett - in situ hibridizációval mérhetjük. A próbák jelölésére különböző jelölők alkalmazhatók, leggyakrabban radioaktív izotópok, elsősorban 32P-izotóp. Mindazonáltal egyéb technikák is alkalmasak lehetnek; például a polinukleotidba biotinnal módosított nukleotidok építhetők be, ahol is a biotin az avidin vagy antitestek (melyek különféle jelölőkkel, például radionuklidokkal, fluoreszcens jelölőkkel, enzimekkel és hasonlókkal jelölhetők) kötőhelyeként szolgál. Más módon, a protein kimutatására megfelelő vizsgálati eljárások vagy gélek alkalmazhatók.
Az expresszált vagy túlzott mértékben expresszált géntermék szekréciójának megállapítására alkalmas eljárások szakember számára jól ismertek. Miután a tenyésztő tápközeget - például centrifugálással vagy szűréssel - elválasztottuk a gazdasejtektől, a génterméket (annak ismert, jellemző tulajdonságainak kihasználásával) a sejtmentes tápközegben vagy a sejttenyészetben detektáljuk. Az ilyen tulajdonságok közé tartoznak az immunológiai, enzimatikus vagy fizikai sajátságok.
Például ha egy túlzott mértékben expresszálódó géntermék egyedi enzimaktivitás kifejtésére képes, a gazdasejtek tenyésztő tápközegében vagy a kivont sejtüledékben ilyen aktivitás meghatározására alkalmas tesztet végezhetünk. Ezen túlmenően, ha egy adott géntermék ellen reaktív antitestek állnak rendelkezésre, azok felhasználhatók a géntermék bármely ismert immunológiai teszttel történő kimutatására [lásd például Harlowe és munkatársai: „Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1988)].
Ha a géntermék szekretálódik, olyan tesztek alkalmazásával is kimutatható, amelyek a polipeptideket jellemző fizikai tulajdonságaik (például molekulatömegük) alapján különböztetik meg. A géntermék fizikai sajátságainak detektálása céljából a gazdasejt által újonnan termelt valamennyi polipeptidet megjelöljük (például radioaktív izotóppal). A gazdasejtben termelődött polipeptidek jelölésére alkalmas radioaktív izotópok jellemző példái közé tartozik a trícium (3H), a 14C, 35S stb. Például a gazdasejteket 35S-metionint vagy 35S-ciszteint tartalmazó tápközegben tenyészthetjük, és a 35S-izotóp jelentős mennyiségben elsősorban az újonnan szintetizált polipeptidekbe (köztük a túlzott mértékben termelődő heterológ polipeptidbe) épül be. Ezt követően a 35S-izotópot tartalmazó tenyésztő tápközeget eltávolítjuk, a sejteket leöblítjük, majd friss, nem radioaktív tenyésztő tápközegbe helyezzük át. A sejteket a 35S-izotóppal jelölt heterológ polipeptid szekréciójához elegendő ideig és megfelelő feltételek mellett a friss tápközegben tartjuk, majd a tenyésztő tápközeget összegyűjtjük és elkülönítjük a gazdasejtektől. A tenyésztő tápközegben vagy a sejtüledékben lévő szekretált, jelölt polipeptid molekulatömegét ismert módszerekkel (például poliakrilamid-gélelektroforézissel) határozhatjuk meg. Az ilyen módszerek és/vagy a szekretált géntermék kimutatására alkalmas egyéb eljárások leírását illetően lásd „Gene Expression Technology”, Methods in Enzymology 185. szám, szerk.: Goeddel, D. V., Academic Press (1990); valamint Sambrook és munkatársai fentebb idézett művét.
E) Polipeptidek kinyerése/tisztitása
A polipeptidet, termelődése után, bármely alkalmas módszerrel kinyerhetjük a sejtből. A konkrét módszert például attól függően választjuk ki, hogy a polipeptidet a sejt mely részéből kell kinyerni. A polipeptid kinyerése történhet a sejt citoplazmájából, periplazmájából vagy tenyésztő tápközegéből. A polipeptidet előnyösen a periplazmából vagy a tenyésztő tápközegből - szekretált polipeptid formájában - nyerjük ki. A termelődött polipeptidet rekombináns sejtproteinekből vagy polipeptidekből tisztítjuk, miáltal olyan készítményeket kapunk, amelyek a kérdéses polipeptid vonatkozásában lényegében homológok. Első lépésként a tenyésztő tápközeget vagy lizátumot a szemcsés sejttörmelék eltávolítása céljából lecentrifugáljuk, majd - ha szükséges - a membránfrakciót és az oldható proteinek frakcióját elválasztjuk. A polipeptidet az oldható proteinek frakciójából és a lizátum membránfrakciójából tisztíthatjuk, attól függően, hogy a szóban forgó polipeptid membránkötött, oldható vagy aggregált alakban van jelen. Ezt követően a polipeptidet szolubilizáljuk, és - ha szükséges - visszaalakítjuk harmadlagos szerkezetét („refolding”), majd megtisztítjuk a szennyezésként jelen lévő oldható proteinektől és polipeptidektől. A tisztítási folyamatból kihagyhatok a hasított polipeptid szennyezések elegyből történő eltávolításának jellemző lépései, mivel a sejtekben aminopeptidáz nincs jelen. Az egyik előnyös megvalósítási mód szerint aggregált polipeptidet izolálunk, majd egyidejűleg szolubilizálási és „refolding” lépést hajtunk végre (lásd az 5 288 931 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást).
Különösen előnyösen a polipeptid kinyerését úgy hajtjuk végre, hogy a sejtet (a fentebb említett technikák alkalmazásával) feltárjuk, majd az ép, nem hasított
HU 225 243 Β1 polipeptidet a kapott lizátumból tisztítjuk, melyet előzetesen inkubálásnak vetünk alá. Az inkubálást előnyösen kb. 20-25 °C-on legalább kb. egy óra hosszat, előnyösebben szobahőmérsékleten kb. 2-50 óra hosszat, még előnyösebben szobahőmérsékleten kb. 2-50 óra hosszat, legelőnyösebben szobahőmérsékleten kb. 20-30 órán át folytatjuk.
A polipeptidek tisztítására alkalmas tisztítási eljárások jellemző példái a következők: immunaffinitási vagy ioncserélő oszlopon végzett frakcionálás; etanolos precipitáció; reverz fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC); szilikagél- vagy ioncserélő kromatográfia (például DEAE-gyanta alkalmazásával); kromatofokuszálás; SDS-PAGE; ammónium-szulfátos precipitáció; és gélfiltráció, például Sephadex G-75™ oszlopok alkalmazásával.
II. A hasított polipeptid előállítása és kinyerése
Ezen alternatív eljárás során a polipeptidet - N-terminális aminosavának lehasítása céljából - közvetlenül b2324-aminopeptidáz-polipeptiddel érintkeztetjük, amit többféle módon hajthatunk végre. Például a hasítani kívánt polipeptidet kb. 20-40 °C-on, előnyösen 30-40 °C-on, kb. 50 óráig terjedő időtartamban (előnyösen 1-45 óra hosszat) inkubáljuk a b2324-aminopeptidázzal. E megoldás egy előnyös megvalósítási módja értelmében eljárást tárunk fel hasított polipeptid előállítására, melynek során yfcK-gént hordozó baktériumsejteket tenyésztünk, mely baktériumsejtek megfelelő, nem hasított (N-terminálisán hozzáadott aminosavat tartalmazó) polipeptidet kódoló nukleinsavat tartalmaznak, és a tenyésztést olyan feltételek mellett végezzük, amelyek elősegítik az yfcK-gén expresszióját vagy túlzott mértékű expresszióját, valamint a nem hasított polipeptidet kódoló nukleinsav expresszióját. Ha a nem hasított polipeptid és a b2324-aminopeptidáz-protein az expresszáltatás után nem érintkezik egymással, a nem hasított polipeptidet érintkeztetjük a b2324-aminopeptidáz-proteinnel, előállítva ezáltal a hasított polipeptidet. A polipeptid és az aminopeptidáz érintkeztetését előnyösen a leírásban ismertetett feltételek mellett végezzük, és a tenyésztést fermentorban hajtjuk végre.
Célszerűen a polipeptid az alkalmazott sejtekre nézve heterológ, előnyösen eukarióta, még előnyösebben emlőseredetű (elsősorban humán) polipeptid. Az eljárás során gazdasejtként előnyösen Salmonella nemzetségbe vagy Enterobacteriaceae családba tartozó sejteket, még előnyösebben E. co//-sejteket, legelőnyösebben E. coli W3110-törzset alkalmazunk. Előnyös továbbá, ha a sejt legalább egy proteázt kódoló génjére (például degP és/vagy fhuA) nézve hiányos.
A tenyésztést olyan feltételek mellett is végezhetjük, amelyek az yfcK-gén túlzott mértékű expresszióját teszik lehetővé. Az yfcK-gén a baktériumsejtekre nézve natív vagy - ilyen gént hordozó vektorral végzett transzformáció eredményeként - a sejtbe bejuttatott gén lehet.
Úgy is eljárhatunk, hogy a nem hasított polipeptidet a b2324-aminopeptidáz-proteinnel történő érintkezés előtt kinyerjük a sejtekből, és a nem hasított polipeptidet a sejt periplazmájából vagy tenyésztő tápközegéből vonjuk ki. Az egyik megvalósítási módban a sejteket (fentebb említett technikák alkalmazásával) feltárva sejtlizátumot hozunk létre, amelyhez hozzáadjuk az aminopeptidázt, majd a hasított polipeptidet a lizátumból tisztítjuk. Ebben az esetben a lizátumot előnyösen a tisztítási lépés előtt inkubáljuk az aminopeptidázzal. További lehetőség az, hogy a lizátumot - a tisztítási lépés előtt - kb. 20-40 °C-on legalább kb. egy órán át, még előnyösebben kb. 30-40 °C-on kb. 2-50 órán át inkubáljuk, még előnyösebben kb. 30-40 °C-on kb. 5-45 óra hosszat, legelőnyösebben kb. 35-38 °C-on kb. 20-30 óra hosszat inkubáljuk.
Amennyiben a hasított polipeptideket rekombináns módszerekkel állítjuk elő, a kiindulási törzsek, tenyésztési feltételek, az expresszió detektálása, a polipeptid kinyerése/tisztítása és az alapvető technikák megegyeznek a fentebb leírtakkal. Mindazonáltal ha a tenyésztett törzsben az yfcK-gén túlzott mértékű expresszáltatása kívánatos - függetlenül attól, hogy e gén a gazdasejtre nézve endogén (a kromoszómában) vagy exogén -, az yfcK-gént működőképesen indukálható promoterhez kapcsoljuk, és a promoter indukálását követően bekövetkezhet a gén túlzott mértékű expressziója. A tenyésztést előnyösen olyan feltételek mellett végezzük, melyek lehetővé teszik, hogy az yfcK-gén expressziójának indukciója a polipeptidet kódoló nukleinsav expressziójának indukálása előtt következzen be. A gének túlzott mértékű expresszáltatására alkalmas technikák leírását illetően lásd Joly és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2773 (1998); 5 789 199 és 5 639 635 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Knappik és munkatársai: Bio/Technology 77(1), 77 (1993); Wulfing és Pluckthun: Journal of Molecular Biology 242(5), 655 (1994).
A találmány szerinti megoldást a továbbiakban az alábbi példán keresztül szemléltetjük, amely semmilyen szempontból nem korlátozza a találmány igényelt oltalmi körét. A leírásban említett valamennyi irodalmi és szabadalmi hivatkozás teljes terjedelmében a kitanítás részének tekintendő.
1. példa
Anyagok és módszerek
A b2324-aminopeptidázt kódoló - E. co//-genomszekvenálási projektben azonosított - yfcK-gén [lásd Blattner és munkatársai: Science 277, 1453 (1997); GenBank nyilvántartási szám: AE000321] 5’- és 3’-oldali DNS-szekvenciáit polimeráz-láncreakcióval amplifikáltuk, majd e fuzionált szekvenciákat P1-transzdukcióval egy W3110-törzs kromoszómájába inszertáltuk, és polimeráz-láncreakcióval deléciókra szkríneltük [Metcalf és munkatársai: Gene és munkatársai: 138, 1 (1994)], létrehozva ezáltal a 61 G3-törzset, amelynek genotípusa a következő: W3110 AfhuA A(arg-F-lac)169 phoAAE15 deoC2 degP::kanR ilvG2096 AyfcK.
Ezt a törzset több lépésben, P1-fágból származó P1kc-fág alkalmazásával végzett transzdukcióval [J. Miller: „Experiments in Molecular Genetics”, Cold
HU 225 243 Β1
Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)] és transzpozongenetikai módszerekkel [Klecknerés munkatársai: J. Mól. Bioi., 116:125-159 (1977)] hoztuk létre. Kiindulási gazdatörzsként az E. coli K-12 W3110-törzset alkalmaztuk, amely egy „F- lamb- 5 da-” törzs [Bachmann: Bact. Rév. 36, 525-557 (1972); Bachmann: „Derivations and Genotypes of Somé Mutant Derivatives of Escherichia coli K-12”, 1190-1219. old., in: „Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology”, szerk.: F. C. Neidhardt 10 és munkatársai 2. kötet, American Society fór Microbiology, Washington, D. C. (1987)]. A tonA (YhuA)-mutáció genomba történő bejuttatásának részletes leírását illetően lásd az 5 304 472 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást. Az ilv-génbe Tn10-inszerciót 15 P1-transzdukcióval juttattunk be. Az izoleucin/valin auxotrófiát - ilvG2096R-mutációt hordozó törzsön szaporított P1-fág alkalmazásával - prototrófiává transzdukáltuk [Lawther és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 78, 922 (1981)], amely kijavítja a vad típusú E. co- 20 Ii Κ-12-törzset valinra érzékennyé tevő fáziseltolódást.
A degP4fkanr-mutáció leírását illetően lásd az 5 304 472 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást. Az ilvG2096Rlokusz a 33B6-törzs 40 pg/mL (0,3 mM) valinnal szembeni rezisztenciája alapján iga- 25 zolható. A phoAAE15 és &(arg-F-lac)169 deléciós mutációt szintén az 5 304 472 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban tárták fel. A deoC2-mutációt illetően lásd Mark és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 155,
145 (1977). A 61G3-törzs teljes származási diagramját 30 az 1. ábrán mutatjuk be.
Ezt a törzset a phGH4R expressziós plazmiddal transzformáltuk. Ez a plazmid rázólombikos tenyészetben, illetve tízliteres fermentorban végzett tenyésztéssel az (N-terminális fenil-alanint tartalmazó) hHG ex- 35 presszióját és szekrécióját eredményezi. A phGH4Rplazmid előállításának részletes leírását lásd Chang és munkatársai: Gene 55, 189 (1987). A 61G3-törzs phGH4R-plazmiddal végzett transzformálása eredményeként a JJGH1-törzset hoztuk létre. A hGH termelő- 40 dése után a sejtek ultrahangos kezelésével nyers lizátumot hoztunk létre, melyet 37 °C-on 0-24 óra hosszat, szobahőmérsékleten pedig 0—42 óra hosszat inkubáltunk. A magasabb hőmérséklet alkalmazásának célja a dez-phe-hGH és dez-phe-pro-hGH kimutathatóságának javítása volt, a hGH tisztítása szempontjából azonban nem előnyös. Normális esetben a hGH tisztítását — a hasított alakok mennyiségének csökkentése érdekében - hidegben végezzük.
Ugyanezt a kísérletet egy kontroll kiindulási törzs (16C9; genotípusa: W3110 AfhuA &(arg-Flac)169 phoAAE15 deoC2) alkalmazásával is megismételtük, melyet szintén phGH4R-plazmiddal transzformáltunk. Ez a törzs alkalmas erre a célra, mivel a 61G3-törzsben a degP- és ilvG-mutáció nem befolyásolja az aminopeptidáz-aktivitást.
A kontroll- és kísérleti mintákat a szemcsés anyagok eltávolítása céljából lecentrifugáltuk, és az oldható fázisokat folyadékkromatográfia és tömegspektrometriás analízis kombinációjának (LC-MS) alkalmazásával, a hGH teljes hosszúságú, dez-phe- és pez-phepro-alakja mennyiségének mérésével vizsgáltuk.
Eredmények
A kontrolitörzs (16C9/phGH4R) szobahőmérsékleten és 37 °C-on végzett inkubálásával kapott eredményeket a 2., illetve 4. ábrán, míg az (aminopeptidáz vonatkozásában hiányos) JJGH1-törzs szobahőmérsékleten és 37 °C-on végzett inkubálásával kapott eredményeket a 3., illetve 5. ábrán mutatjuk be. E négy ábra számszerű adatait az alábbi, 1. táblázatban foglaljuk össze. Látható, hogy a 37 °C-on végzett 15 órás inkubálást követően gyakorlatilag nem mutatható ki fenil-alanin nélküli hGH-szennyeződés, sőt, inkubálás hiányában a szennyeződések mennyisége még kisebb. Jól látható továbbá, hogy a JJGH1-sejtvonalban az N-terminális fenil-alanin nélküli mutáns polipeptid mennyisége - a kontrollsejtvonalhoz viszonyítva - még a szobahőmérsékleten végzett inkubálást követően is csökkent (valamennyi inkubálási időtartam esetében). A teljes polipeptid tisztítása szokványos, jól ismert kromatográfiás eljárásokkal egyszerűen elvégezhető.
1. táblázat
T=37°C
Minta Idő Terület Terület %
dez-phe Natív dez-phe-pro dez-phe Natív dez-phe-pro
Kontroll 0 16 159,80 4 486 460,00 19 642,70 0,36 99,21 0,43
JJGH1 0 11 927,90 3 376 380,00 7 637,14 0,35 99,42 0,22
Kontroll 15 14 372,30 1 097 210,00 976 760,00 46,77 52,53 0,69
JJGH1 15 27 163,70 2 674 010,00 16 357,80 1,00 98,40 0,60
Kontroll 24 1 058 950,00 839 418,00 17 580,50 55,27 43,81 0,92
JJGH1 24 29 409,90 2 306 690,00 11 999,30 1,25 98,23 0,51
HU 225 243 Β1
1. táblázat (folytatás)
T=RT*
Minta Idő Terület Terület %
dez-phe Natív dez-phe-pro dez-phe Natív dez-phe-pro
Kontroll 0 16 159,80 4 486 460,00 19 642,70 0,36 99,21 0,43
JJGH1 0 11 927,90 3 376 380,00 7 637,14 0,35 99,42 0,22
Kontroll 15 46 158,20 364 234,00 7 950,57 1,24 98,53 0,21
JJGH1 15 183 740,00 19 431 400,00 39 130,00 0,94 99,06 0,20
Kontroll 24 100 774,00 4 561 070,00 19501,10 2,15 97,43 0,42
JJGH1 24 160 737,00 19 711 600,00 98 221,60 0,80 98,70 0,49
Kontroll 42 122 177,00 3 933 770,00 19 246,40 3,00 96,53 0,47
JJGH1 42 213 143,00 18 242 500,00 91 090,90 1,15 98,36 0,49
* Szobahőmérséklet
A fenti eredmények azt mutatják, hogy a AyfcKtörzs felhasználható a polipeptidek N-terminális hasításának megakadályozására.

Claims (17)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Gram-negatív baktériumsejt, amely egy kromoszomális gén vonatkozásában hiányos, mely gén szekvenciája legalább 80%-ban azonos egy natív szekvenciájú b2324-aminopeptidázt kódoló DNS-molekulával, amely aminopeptidáz a 2. azonosító számú szekvencia 1-688. aminosavait tartalmazza, és aminopeptidázt kódol.
  2. 2. Gram-negatív baktériumsejt, amely egy kromoszomális gén vonatkozásában hiányos, mely gén a 2. azonosító számú szekvencia 1-688. aminosavait tartalmazó aminosavszekvenciával összehasonlítva legalább 80% pozitív aminosavat tartalmazó polipeptidet kódoló DNS-t foglal magában, ahol a polipeptid aminopeptidáz.
  3. 3. Gram-negatív baktériumsejt, amely egy kromoszomális gén vonatkozásában hiányos, mely gén szekvenciája legalább 80%-ban azonos a natív yfcK-gén szekvenciájával, amely az 1. azonosító számú szekvencia 1-2067. nukleotidjaiból áll, és aminopeptidázt kódol.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti sejt, amely Salmonella nemzetségbe vagy Enterobacteriaceae családba tartozó baktériumsejt.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti sejt, amely E. co//'-sejt.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti sejt, amely legalább egy, proteázt kódoló gén vonatkozásában hiányos.
  7. 7. Az 5. igénypont szerinti sejt, amely a natív szekvenciájú yfcK-gén vonatkozásában hiányos.
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti sejt, amely számára heterológ polipeptidet kódoló nukleinsavat tartalmaz.
    25
  9. 9. A 8. igénypont szerinti sejt, amely emlőseredetű polipeptidet kódoló nukleinsavat tartalmaz.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti sejt, amely humán polipeptidet kódoló nukleinsavat tartalmaz.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti sejt, amely humán nö30 vekedési hormont kódoló nukleinsavat tartalmaz.
  12. 12. Eljárás heterológ polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) 8-11. igénypontok bármelyike szerinti sejtet tenyésztünk; és
    35 (b) a sejtből kinyerjük a polipeptidet.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést fermentorban végezzük, és a polipeptidet a sejt periplazmájából vagy tenyésztő tápközegéből nyerjük ki.
    40
  14. 14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid kinyerése céljából a sejtek feltárásával sejtlizátumot hozunk létre, és a teljes polipeptidet a sejtlizátumból nyerjük ki.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez45 ve, hogy a sejtlizátumot a tisztítási lépés előtt inkubáljuk.
  16. 16. Eljárás egy polipeptid N-terminális aminosava lehasításának megakadályozására, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet kódoló nukleinsavat tartalmazó,
    50 8-11. igénypontok szerinti sejtet olyan feltételek mellett tenyésztjük, melyek lehetővé teszik a nukleinsav expresszióját.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet kinyerjük a sejtből.
    HU 225 243 Β1
    Int. Cl.: C12N 9/52
    1A1 W3110 u
    1A2 W3110Á^
    U
    7C1 W3110 AfhuA A(arg-F-lac)169phoAAE15 u
    16C9 W3110 AfhuA A(arg-F-lac)169phoAAE15 deoC2 u
    23E3 W3110 AfhuA A(arg-F-lac)169phoA\E15 deoC2 degP::kanR u
    33B6 W3110 AfhuA A(arg-F-lac)169phoAAE15 deoC2 degP::kanR ilvG2096 u
    61G3 W3110 AfliuA A(arg-F-lac)169phoAAE15 deoC2 degP::kanR ilvG2096 AyfcK
    1. ábra
HU0401869A 2001-09-13 2002-09-12 Gram-negative bacterium cell containing a gene coding an aminopeptidase HU225243B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32235001P 2001-09-13 2001-09-13
PCT/US2002/029015 WO2003023030A2 (en) 2001-09-13 2002-09-12 Aminopeptidase

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0401869A2 HUP0401869A2 (hu) 2004-12-28
HUP0401869A3 HUP0401869A3 (en) 2005-06-28
HU225243B1 true HU225243B1 (en) 2006-08-28

Family

ID=23254494

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0600309A HU225430B1 (en) 2001-09-13 2002-09-12 Method for preparation of cleaved polipeptides
HU0600310A HU225346B1 (en) 2001-09-13 2002-09-12 Method for cleaving polipeptides
HU0401869A HU225243B1 (en) 2001-09-13 2002-09-12 Gram-negative bacterium cell containing a gene coding an aminopeptidase

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0600309A HU225430B1 (en) 2001-09-13 2002-09-12 Method for preparation of cleaved polipeptides
HU0600310A HU225346B1 (en) 2001-09-13 2002-09-12 Method for cleaving polipeptides

Country Status (22)

Country Link
US (3) US6921659B2 (hu)
EP (1) EP1432793B1 (hu)
JP (2) JP4831932B2 (hu)
KR (2) KR100954641B1 (hu)
CN (1) CN100552023C (hu)
AT (1) ATE440134T1 (hu)
AU (1) AU2002326884B2 (hu)
BR (1) BR0212886A (hu)
CA (1) CA2460309C (hu)
CY (1) CY1109903T1 (hu)
DE (1) DE60233417D1 (hu)
DK (1) DK1432793T3 (hu)
ES (1) ES2329880T3 (hu)
HK (1) HK1062695A1 (hu)
HU (3) HU225430B1 (hu)
IL (2) IL160658A0 (hu)
MX (1) MXPA04002326A (hu)
NZ (2) NZ531516A (hu)
PL (1) PL206286B1 (hu)
PT (1) PT1432793E (hu)
WO (1) WO2003023030A2 (hu)
ZA (1) ZA200401752B (hu)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4831932B2 (ja) 2001-09-13 2011-12-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド アミノペプチダーゼ
CA2946323A1 (en) 2004-03-11 2005-09-22 Genentech, Inc. Process for producing polypeptides
EP2376619A4 (en) 2008-12-15 2012-07-04 Greenlight Biosciences Inc METHODS FOR CONTROLLING FLOWS IN METABOLIC PATHWAYS
EP2379728A4 (en) * 2008-12-22 2016-04-13 Greenlight Biosciences Inc COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING A COMPOUND
JP2013526277A (ja) 2010-05-07 2013-06-24 グリーンライト バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド 酵素リロケーションにより代謝経路のフラックスを制御する方法
EP2611922A1 (en) 2010-08-31 2013-07-10 Greenlight Biosciences, Inc. Methods for control of flux in metabolic pathways through protease manipulation
CN104093848A (zh) 2011-09-09 2014-10-08 绿光生物科学公司 碳青霉烯(carbapenem)的无细胞制备
EP3460069B1 (en) 2013-08-05 2021-10-20 Greenlight Biosciences, Inc. Therapeutically active compounds and their methods of use
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
EP3277808A4 (en) 2015-03-30 2019-05-22 Greenlight Biosciences, Inc. ACELLULAR PRODUCTION OF RIBONUCLEIC ACID
MY195729A (en) 2016-04-06 2023-02-07 Greenlight Biosciences Inc Cell-Free Production of Ribonucleic Acid
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CN106967658B (zh) * 2017-02-23 2020-09-15 郑州大学 一种提高Fab抗体表达量的方法
MX2020003841A (es) 2017-10-11 2020-11-06 Greenlight Biosciences Inc Métodos y composiciones para la producción de nucleósido trifosfatos y ácidos ribonucleicos.
US11471497B1 (en) 2019-03-13 2022-10-18 David Gordon Bermudes Copper chelation therapeutics
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE81673T1 (de) 1984-08-16 1992-11-15 Bio Technology General Corp Verfahren zur beseitigung von nendaminos|ureresten aus eukaryotpolypeptidanlagen und so erzeugte polypeptide.
WO1986007380A1 (en) * 1985-06-04 1986-12-18 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for preparing polypeptide
US4865974A (en) 1985-09-20 1989-09-12 Cetus Corporation Bacterial methionine N-terminal peptidase
JPH01502320A (ja) 1987-01-30 1989-08-17 プレジデント　アンド　フェロウズ　オブ　ハーバード　カレッジ 大腸菌のペリプラズムプロテアーゼ変異体
US4946783A (en) 1987-01-30 1990-08-07 President And Fellows Of Harvard College Periplasmic protease mutants of Escherichia coli
JPH01181796A (ja) * 1988-01-14 1989-07-19 Ajinomoto Co Inc 組換えｄｎａ法を用いたポリペプチドの製造法
JP2844870B2 (ja) * 1989-07-21 1999-01-13 味の素株式会社 組み替えｄｎａ法によるポリペプチドの製造法
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
US5304472A (en) 1992-11-20 1994-04-19 Genentech, Inc. Method of controlling polypeptide production in bacterial cells
US5573923A (en) * 1993-12-22 1996-11-12 Eli Lilly And Company Method for removing N-terminal dipeptides from precursor polypeptides with immobilized dipeptidylaminopeptidase from dictyostelium discoideum
US6127144A (en) * 1993-12-23 2000-10-03 Cangene Corporation Method for expression of proteins in bacterial host cells
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
KR100369839B1 (ko) 1997-02-28 2003-06-12 주식회사 엘지생명과학 바실러스리케니포미스균주에서유래한아미노펩티다제,그의제조방법및이를이용한천연형단백질의제조방법
CN1329665A (zh) * 1998-12-07 2002-01-02 诺维信公司 具有n末端延伸的葡糖淀粉酶
ES2280211T3 (es) 1999-04-30 2007-09-16 Pharmacia Corporation Metodo para eliminar residuos de alanina, situados en extremos terminales de n, a partir de polipeptidos, con una aminopeptidasa procedente de aeromonas.
KR100400638B1 (ko) 2000-12-06 2003-10-08 주식회사 엘지생명과학 재조합 인간 성장호르몬 유사체의 분리방법
JP4831932B2 (ja) 2001-09-13 2011-12-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド アミノペプチダーゼ

Also Published As

Publication number Publication date
HU225430B1 (en) 2006-11-28
KR100956907B1 (ko) 2010-05-11
US20080160572A1 (en) 2008-07-03
ZA200401752B (en) 2005-05-25
NZ531516A (en) 2006-03-31
HU0600309D0 (en) 2006-06-28
CA2460309C (en) 2012-07-10
EP1432793A2 (en) 2004-06-30
EP1432793B1 (en) 2009-08-19
US20060019341A1 (en) 2006-01-26
KR100954641B1 (ko) 2010-04-27
HUP0401869A2 (hu) 2004-12-28
PL206286B1 (pl) 2010-07-30
BR0212886A (pt) 2004-10-13
DK1432793T3 (da) 2009-12-07
US7632658B2 (en) 2009-12-15
HUP0401869A3 (en) 2005-06-28
JP2005502359A (ja) 2005-01-27
HK1062695A1 (en) 2004-11-19
CN100552023C (zh) 2009-10-21
CN1555412A (zh) 2004-12-15
PT1432793E (pt) 2009-11-24
JP2011177189A (ja) 2011-09-15
HU0600310D0 (en) 2006-06-28
KR20090018142A (ko) 2009-02-19
WO2003023030A3 (en) 2003-07-10
PL368463A1 (en) 2005-04-04
ATE440134T1 (de) 2009-09-15
DE60233417D1 (en) 2009-10-01
ES2329880T3 (es) 2009-12-02
US7229787B2 (en) 2007-06-12
IL160658A (en) 2009-05-04
CY1109903T1 (el) 2014-09-10
HU225346B1 (en) 2006-10-28
US6921659B2 (en) 2005-07-26
EP1432793A4 (en) 2006-05-24
CA2460309A1 (en) 2003-03-20
IL160658A0 (en) 2004-08-31
AU2002326884B2 (en) 2007-10-18
JP4831932B2 (ja) 2011-12-07
WO2003023030A2 (en) 2003-03-20
JP5372061B2 (ja) 2013-12-18
KR20040041611A (ko) 2004-05-17
MXPA04002326A (es) 2004-06-29
NZ544964A (en) 2007-08-31
US20030124664A1 (en) 2003-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7632658B2 (en) Method of using aminopeptidase to produce cleaved polypeptides
EP0786009B1 (en) Process for bacterial production of heterologous polypeptides with disulphide bonds
US5789199A (en) Process for bacterial production of polypeptides
JP4056880B2 (ja) 細菌性宿主株
Henderson et al. Artifactual processing of penicillin-binding proteins 7 and 1b by the OmpT protease of Escherichia coli
US20080254511A1 (en) Process for the fermentative production of proteins
AU2002326884A1 (en) Aminopeptidase
US20080076158A1 (en) Process for the fermentative production of proteins
JP4751347B2 (ja) 組み換えタンパク質の製造のための微生物菌株
JP7242829B2 (ja) 新規細菌ｌｐｐ突然変異体及び組換えタンパク質の分泌産生のためのその使用