JP4751347B2 - 組み換えタンパク質の製造のための微生物菌株 - Google Patents
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Classifications
-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description
1.可溶性タンパク質としての細胞内産生
2.封入小体("インクルージョンボディー")としての細胞内産生
3.ペリプラズム又は周囲の栄養培地中への分泌。
− BLR:Ray et al.2002、Novagen社から購入できる
− K802=CGSC*5610:Yang et al.,1998
− WCM105:EP0338410号B1に従って製造可能
− MM28=CGSC*#5892:Nagahari et al.1985
− RV308=ATCC**31608;EP0677109号B1
− RR1:ATCC**31434:Nagahari et al.,1985
− KG1005 ompT:Wadensten et al.,1991
*大腸菌ストックセンターCGSC(830 Kline Biology Tower,MCD Biology Department,266 Whitney Ave.,PO box 208103,Yale University,New Haven)から購入できる
**LGCプロモケム(Mercatorstr.51,46485 Wesel,Deutschland)から購入できる
分泌されるタンパク質は、宿主細胞から産生されかつ分泌される組み換えタンパク質である。有利には、タンパク質の分泌は、その遺伝子とシグナル配列との融合によって可能である。有利には、産生されるタンパク質は、工業的バッチで使用されるタンパク質又は医薬作用物質として使用されるタンパク質(生物製剤、生物薬剤)である。
− オリゴペプチド結合タンパク質OppA:Swiss Prot#P23843、61kDa、ペリプラズム中の主タンパク質の1つ、オリゴペプチド−パーミアーゼ(結合タンパク質依存性の輸送系)の構成要素、5アミノ酸までのペプチドを高い親和性で結合し、SecBによって結合されて、アミノグリコシド系抗生物質の吸収に関与するシャペロン機能をも有する
− ジペプチド結合タンパク質DppA:Swiss Prot#P23847、61kDa、ペプチド走化性やシャペロン類似機能(ロドバクターにおいて)に必要な輸送系のペリプラズム性のジペプチド結合タンパク質
− 外膜タンパク質Omp3a=OmpA:NCBI#NP_286832、37kDa、外膜中に局在する、コリシンK及びコリシンLの作用や接合の間の安定化のために必要、ファージ用の受容体、小さい溶質に低い透過性を有するポリン
− フラジェリンFliC:Swiss Prot#P04949、51kDa、鞭毛のサブユニット
− 推定されるヘミン結合タンパク質YddS:Swiss Prot#Q8XAU4、57kDa、推定されるジペプチド輸送タンパク質
− アルカリ性ホスファターゼPhoA:E.C.3.1.3.1、49kDa、オルトリン酸モノエステルの分解を触媒するペリプラズム性タンパク質
− リン酸結合タンパク質PhoS:37kDa、ペリプラズム性タンパク質;PTSリン酸−取り込み系の構成要素
アルカリ性ホスファターゼPhoA及びリン酸結合タンパク質PhoSは、両者とも大腸菌のリン酸供給に関与している。
− 該遺伝子に付属するプロモーターを好適な塩基置換によって弱める
− 発現に必要な転写アクチベーターを不活性化/改変する
− 翻訳シグナル(例えばリボソーム結合部位、開始コドン)を好適な塩基置換によって弱める
− 該遺伝子のmRNA安定化領域を除去する
− 特異的アンチセンスRNAをコードするDNA領域を過剰発現する
− 全遺伝子又は少なくとも一部を欠失する
− 該遺伝子を、例えば抗生物質耐性カセットの挿入によって破壊する
− 相応の遺伝子にヌクレオチド欠失又は挿入に基づきリーディングフレームの変動を導入する。
文献から公知の以下の一般的に入手可能であり、市販されている大腸菌−分泌菌株を、LB培地中で100mlのエルレンマイヤーフラスコにおいて30℃で48時間培養した:
− BLR:Ray et al.2002、Novagen社から購入できる
− K802=CGSC*5610:Yang et al.,1998
− WCM105:EP0338410号B1に従って製造可能
− MM28=CGSC*#5892:Nagahari et al.1985
− RV308=ATCC**31608;EP0677109号B1
− RR1:ATCC**31434:Nagahari et al.,1985
− KG1005 ompT:Wadensten et al.,1991
*大腸菌ストックセンターCGSC(830 Kline Biology Tower,MCD Biology Department,266 Whitney Ave.,PO box 208103,Yale University,New Haven)から購入できる
**LGCプロモケム(Mercatorstr.51,46485 Wesel,Deutschland)から購入できる。
− オリゴペプチド結合タンパク質OppA:Swiss Prot#P23845
− ジペプチド結合タンパク質DppA:Swiss Prot#P23847
− 外膜タンパク質Omp3a=OmpA:NCBI#NP_286832
− フラジェリンFliC:Swiss Prot#P04949
− 推定されるヘミン結合タンパク質YddS:Swiss Prot#Q8XAU4
− アルカリ性ホスファターゼPhoA:E.C.3.1.3.1 Swiss Prot#P00634
− リン酸結合タンパク質PhoS:Swiss Prot#P06128
実施例2:汚染している宿主タンパク質についての遺伝子の欠失
その都度の菌株における遺伝子の大きな内部領域の欠失を、DatsenkoとWanner(2000,PNAS,97(12)、第6640〜6645頁)によるλ−Redレコンビナーゼ系を用いて行った。このために、まず除去されるべき遺伝子領域をクロラムフェニコール耐性カセットと交換したが、それは引き続き酵母FLPレコンビナーゼとカセット側面の特定の"FRT"フランキングを使用することによって再び排除することができる。
PCR:
・ 鋳型:
鋳型として、pKD3(クロラムフェニコール耐性;大腸菌ストックセンターCGSCからCGSC#7631として得られる)を使用した。
フォワードオリゴプライマー:除去されるべき遺伝子の最初の36〜50塩基対の相同配列+20塩基対の相同プラスミド配列:
5′−36〜50塩基対の染色体−GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC−3′(配列番号1)
リバースオリゴプライマー:除去されるべき遺伝子の最初の36〜50塩基対の相同配列+20塩基対の相同プラスミド配列(反対鎖):
5′−36〜50塩基対の染色体−CATATGAATATCCTCCTTAG−3′(配列番号2)
・ ポリメラーゼ:
Pfu又はTaq
・ 生成物長:
pKD3:1.1kb
PCR産物の精製:
PCR産物を精製し(例えばQiaプレップ(Qiaprep)カラムを介して)、そしてDpnIで消化させ(付属のバッファー中37℃で2時間)、次いでもう一度精製して、30μlの蒸留水中に溶出させた(=PCR調製物)。
・ pKD46=λ Redレコンビナーゼ発現プラスミド(アラビノース誘導が可能)、これは大腸菌ストックセンターCGSCからCGSC#7739として得られる、Amp耐性、温度感受性の複製起点:全ての工程は最大30℃で
・ 該プラスミドの改変されるべき目的菌株での形質転換(発現/30℃でのインキュベーション)
・ 目的菌株とプラスミドからエレクトロポレーション用のコンピテント細胞を製造する
・ 細胞培養用の培地:SOB培地:
20g/lのトリプトン
5g/lの酵母エキス
0.5g/lのNaCl
2.5g/lのKCl
10mMのMgCl
+0.2%のアラビノース
+100mg/lのアンピシリン
・ エレクトロポレーション用コンピテント細胞の製造:
− 30℃で培養する
− OD600で0.6までで細胞を回収する
− 約100倍に濃縮し、そして氷冷グリセリン(10%)で3回洗浄する
組み換え:
・ 10μlのPCR調製物(約10〜100ngの精製されたPCR−DNA)を、エレクトロコンピテント細胞中に形質転換させる
・ 表現型発現:形質転換バッチを1mlのLB中に入れ、37℃で1時間インキュベートし、そしてLBcamプレート上で選別する。37℃でインキュベート
pKD46(CGSC#7739)のキュアリング:
・ こうして得られた耐性カセットを有するクローンを、2つのLBプレート上に塗抹し、並行して37℃と43℃で培養する
・ これらのプレートから、単一クローンをLBamp(100mg/lのアンピシリンを有するLB)とLB上に塗抹し、そして30℃でインキュベートする
・ そのうちの約8つのクローンをLBcam(30mg/lを有するLB)(37℃)上で浄化する
クローンのPCR制御:
・ 好適なオリゴプライマー(上記したこととDatsenkoとWanner,2000を参照)を用いて、耐性カセットが、染色体中の除去されるべき遺伝子の部位に実際にあるかどうかを試験する
染色体抗生物質耐性カセットの除去:
・ pCP20(大腸菌ストックセンターCGSCからCGSC#7629から得られる)="FLP"レコンビナーゼ発現プラスミド、Amp耐性、温度感受性の複製起点:全ての工程は最大30℃で
・ amp感受性のクローン(キュアリングによりcam耐性)を、pCP20で形質転換し、LBamp上で30℃において選別する
・ 8つの形質転換体を、LB上で浄化する、インキュベートは37℃
・ 個々のコロニーを、もう一度LB上に塗抹し、43℃でインキュベートする
・ そのうち約12つのクローンをcam感受性とamp感受性について試験する
・ amp/cam感受性クローンは、耐性カセットとpPC29を失っている
=>導入されたCamカセットを有さない欠失クローン
特に、個々の欠失突然変異体の構築のためには、以下のオリゴプライマーを使用して、以下のPCR産物が得られた:
OmpAの欠失
PCR用プライマー:
OmpA5:
プライマー:
OmpA3:GACAGCTATCGCGATTGCAG(配列番号5)
OmpA4:GCTGAGTTACAACGTCTTTG(配列番号6)
を用いた組み込み/欠失の調査
産物:野生型:1022塩基対;挿入突然変異体:1486塩基対;欠失突然変異:約430塩基対
記載されるようにして、以下の菌株を製造した:
− BLRΔompA
− K802ΔompA
− WCM105ΔompA
− MM28ΔompA
− RV308ΔompA
− RR1ΔompA
− KG1005ompTΔompA
OppAの欠失
PCR用プライマー:
OppA5:
プライマー:
OppA3:GCGGATCTTTGCCGGTATAG(配列番号9)
OppA4:GACCAACATCACCAAGAGAA(配列番号10)
を用いた組み込み/欠失の調査
産物:野生型:1587塩基対;挿入突然変異体:1270塩基対;欠失突然変異:約260塩基対
以下の菌株:
− BLRΔoppA
− K802ΔoppA
− WCM105ΔoppA
− MM28ΔoppA
− RV308ΔoppA
− RR1ΔoppA
− KG1005ompTΔoppA
が得られた
DppAの欠失
PCR用プライマー:
DppA1:
プライマー:
DppA3:GTCAGGGATGCTGAAGCTTG(配列番号13)
DppA4:TGTTTGCCTAATGGATCAAC(配列番号14)
を用いた組み込み/欠失の調査
産物:野生型:1587塩基対;挿入突然変異体:1193塩基対;欠失突然変異:約566塩基対
以下の菌株:
− BLRΔdppA
− K802ΔdppA
− WCM105ΔdppA
− MM28ΔdppA
− RV308ΔdppA
− RR1ΔdppA
− KG1005ompTΔdppA
が得られた
FliCの欠失
PCR用プライマー:
FliC1:
プライマー:
FliC3:TATCAACAAGAACCAGTCTGC(配列番号17)
FliC4:AGACAGAACCTGCTGCGGTA(配列番号18)
を用いた組み込み/欠失の調査
産物:野生型:1432塩基対;挿入突然変異体:1112塩基対;欠失突然変異:約110塩基対
以下の菌株:
− BLRΔfliC
− K802ΔfliC
− WCM105ΔfliC
− MM28ΔfliC
− RV308ΔfliC
− RR1ΔfliC
− KG1005ompTΔfliC
が得られた
YddSの欠失
PCR用プライマー:
YddS1:
プライマー:
YddS3:ATTGCTCGCGCTCGTCCTTG(配列番号21)
YddS4:CCTGTTCCAGCATGGGATTG(配列番号22)
を用いた組み込み/欠失の調査
産物:野生型:1432塩基対;挿入突然変異体:1156塩基対;欠失突然変異:約160塩基対
以下の菌株:
− BLRΔyddS
− K802ΔyddS
− WCM105ΔyddS
− MM28ΔyddS
− RV308ΔyddS
− RR1ΔyddS
− KG1005ompTΔyddS
が得られた
PhoA及びPhoSの欠失
同様に行った。
− BLRΔphoA
− K802ΔphoA
− WCM105ΔphoA
− MM28ΔphoA
− RV308ΔphoA
− RR1ΔphoA
− KG1005ompTΔphoA
− BLRΔphoS
− K802ΔphoS
− WCM105ΔphoS
− MM28ΔphoS
− RV308ΔphoS
− RR1ΔphoS
− KG1005ompTΔphoS
が得られた
実施例3:多重欠失突然変異体の作製
多重突然変異体の作製に際して、実施例2で作製された幾つかの菌株において、実施例2に記載される工程に従って段階的に、他の6つの同定された遺伝子をも欠失させた。
− K802ΔoppAΔfliC
− BLRΔphoAΔoppA
− BLRΔphoAΔoppAΔyddSΔphoAΔphoS
− BLRΔphoAΔyddS
− BLRΔphoAΔoppAΔyddSΔfliC
− WCM105ΔoppAΔompA
− WCM105ΔompAΔfliC
− WCM105ΔoppAΔphoA
− WCM105ΔoppAΔyddS
− WCM105ΔfliCΔyddS
− WCM105ΔoppAΔfliC
− WCM105ΔoppAΔfliCΔyddS
− WCM105ΔoppAΔfliCΔyddSΔphoA
が得られた。
種々の菌株の増殖を、30℃で、1%のグルコースを有するLB中で、600nmでのODを増殖24時間後と増殖48時間後とで測定することで調査した。
本発明による菌株の上清中の汚染しているタンパク質を分析するために、培養からアリコートを、SDS−PAGE及びクーマシー染色によって分析した。図2で選択された菌株について示されるように、欠失された遺伝子に相応するバックグラウンドタンパク質は、これらの菌株の場合にはもはや上清中に存在しない。汚染しているバックグラウンドバンドの全体は、それによって明らかに低減されている。
実施例2及び3に記載されるように作製した種々の菌株を、シクロデキストリン−グリコシル−トランスフェラーゼの産生のために使用した。そのために、これらの菌株を、プラスミドpCM301によって通常の方法(例えばCaCl2形質転換によって)形質転換した。このプラスミドは、クレブシエラ・オキシトカM5a1由来のシクロデキストリン−グリコシル−トランスフェラーゼの構造遺伝子を有しており、tac−プロモーターの制御下にあり、該プラスミドはEP0220714号に記載されている。
基質:試験バッファー(pH6.5)中10%のNoredux溶液
試験バッチ:1mlの基質溶液+1mlの遠心分離された培養上清(12000rpmで5分)+3mlのメタノール
反応温度:40℃
酵素試験:
・ 溶液の予熱(40℃で約5分)
・ 酵素溶液の基質溶液への添加;高速混合(渦流混合機(Whirl−Mixer))
・ 40℃で3分間のインキュベート
・ メタノールの添加による酵素反応の停止;高速混合(渦流混合機)
・ 氷上でのバッチの冷却(約5分)
・ 遠心分離(12000rpmで5分)と、澄明な上清のピペットによる分離
・ 産生されたCDのHPLCによる分析
酵素活性:A=G*V1*V2/(t*MG)(ユニット/ml)
A=活性
G=CDの含量(mg/l)=試験バッチ:単位面積×104/標準溶液(10mg/ml)/単位面積
V1=希釈係数/試験バッチ(−>5)
V2=希釈係数/酵素溶液
t=反応時間(分)(−>3)
MG=分子量(g/モル)(CD−>973)
1ユニット=1マイクロモルの産物/分
第2表は、選択された本発明による菌株のシクロデキストリン−グリコシル−トランスフェラーゼの比収率の増大を示している。
7.1 dsbGのクローニング
dsbG(Swiss Prot#P77202)の過剰生産のためのベクターを、以下のようにして構築した:
− W3110(ATCC#27325)由来の染色体DNAを鋳型として用い、そして以下のプライマー:
− 783塩基対のPCR産物をXbaIとEcoRIで制限する
− pASK−IBA3(IBA社、ゲッティンゲン在)をXbaIとEcoRIで制限する
− 両方のDNA断片をライゲーションする。
実施例2と実施例3に従って製造された菌株を、プラスミドpASK−dsbGで通常の方法(例えばCaCl2形質転換)に従って形質転換し、第3表に挙げられる本発明による菌株が得られた。
Claims (5)
- 組み換え異種タンパク質をコードする遺伝子と、OppA、YddS、FliCの群から選択される1つ以上のプロテアーゼではない宿主タンパク質をコードする突然変異された遺伝子とを有するエシェリキア・コリ種の菌株であって、その組み換え異種タンパク質を発酵中に発酵培地中に分泌し、かつ宿主タンパク質をコードする突然変異された遺伝子の突然変異が、その突然変異された遺伝子の基礎となる野生型遺伝子と比較して、宿主タンパク質の100%だけ低減された発現をもたらすことを特徴とするエシェリキア・コリ種の菌株。
- 請求項1記載のエシェリキア・コリ種の菌株であって、該菌株の出発菌株が、BLR、WCM105、MM28=N99=CGSC#5892、K802=CGSC#5610=WA802、RV308=ATCC31608の群から選択されることを特徴とするエシェリキア・コリ種の菌株。
- 請求項1又は2記載のエシェリキア・コリ種の菌株の製造方法において、組み換え異種タンパク質をコードする遺伝子で形質転換されたエシェリキア・コリ種の菌株の宿主細胞を発酵において使用して、組み換え異種タンパク質を製造するが、該宿主細胞は、組み換え異種タンパク質と他の宿主タンパク質とを発酵培地に分泌するため、組み換え異種タンパク質と他の宿主タンパク質を含有する粗生成物が得られるものであり、前記他の宿主タンパク質を特性決定し、そして前記宿主タンパク質をコードする遺伝子の発現を100%だけ低減させる製造方法。
- 発酵培地中で、組み換え異種タンパク質をコードする組み換え遺伝子を含むエシェリキア・コリ種の菌株によって組み換え異種タンパク質を発酵により製造する方法において、請求項1又は2記載のエシェリキア・コリ種の菌株を発酵培地中で培養し、そして該発酵培地を発酵後にエシェリキア・コリ種の菌株の細胞から分離することを特徴とする方法。
- 請求項4記載の方法において、発酵培地の分離後に、発酵培地から組み換え異種タンパク質を精製することを特徴とする方法。
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