CN117651776A - 使用了大肠杆菌的质粒dna的制造方法 - Google Patents

使用了大肠杆菌的质粒dna的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在使用大肠杆菌制造质粒DNA时，从大肠杆菌的菌体中高效地回收质粒DNA，本发明提供一种质粒DNA的制造方法，其包含下述(a)～(c)的工序：(a)制备在涉及外膜的特性维持的基因区域中具有突变，并且保持目标质粒的大肠杆菌的工序；(b)培养(a)的大肠杆菌的工序；(c)从培养后的菌体中回收目标质粒的工序。

Description

使用了大肠杆菌的质粒DNA的制造方法
技术领域
本发明涉及一种使用了大肠杆菌的质粒DNA的制造方法。
背景技术
质粒DNA作为基因治疗和DNA疫苗的主药被利用，除此之外在用于基因治疗的病毒载体、病毒疫苗、mRNA生产的原材料等广泛的用途中发挥重要作用。
作为质粒DNA的制造方法，已知一种将作为目标的质粒担载到大肠杆菌宿主菌株中而得到的转化体进行培养，从培养后的大肠杆菌株中提取质粒D NA的发酵法。在非专利文献1中，作为大肠杆菌质粒DNA的提取方法而公开了碱裂解法。具体而言，碱裂解法为通过碱使大肠杆菌的膜结构崩坏(裂解)，在菌体外提取细胞质中的质粒DNA的方法。提取到的质粒DNA，通常，通过膜处理、色谱处理等进行高纯度化。该碱裂解法作为质粒DNA的提取方法是特别广泛使用的。然而，已知该方法中菌体与碱裂解液的混和比例在适当范围之外时，裂解变得不充分且其回收率降低(非专利文献2)。因此，例如，为了以工业生产规模来处理大量的菌体，除了正确的混和比例的控制之外，还需要大量的试剂。
在专利文献1中记载了如下方法：不使用酶、有机溶剂和突变原试剂而从细胞中溶出质粒DNA，通过分级PEG沉淀和层析来纯化，大量生产医药试剂等级的质粒DNA。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表平9-509313号公报
非专利文献
非专利文献1：H.C.Birnnoim and J.Doly,Nucleic Acids Res.Vol.7,No.6,pp.1513-1523(1979)
非专利文献2：QIAGEN Plasmid Purification Protocol and Troubleshoot ing06/2005
发明内容
发明所解决的技术问题
如上所述，以往的使用了大肠杆菌的质粒DNA的制造中，特别是以工业生产规模的制造中，在从菌体中的提取工序(例如利用碱裂解法的碱-SDS处理)中的菌体裂解的效率未必高，成为质粒DNA的回收率降低的要因之一。在专利文献1中，公开了大量生产医药试剂等级的质粒DNA的方法，而为了使平均量的碱性溶液的细胞裂解的效率提高的方法没有特别地被揭示。
本发明是一种使用了大肠杆菌的质粒DNA的制造方法，其提供一种可以从菌体中将作为目标的质粒DNA效率良好地回收的质粒DNA的制造方法。
解决问题的技术手段
本发明人进行了深入研究，其结果发现了可通过使用具有涉及外膜的特性维持的基因的修饰的大肠杆菌株，而改善提取效率、即从菌体中的质粒DNA的回收率变高和/或质粒生成量本身增加，从而提高DNA的回收量，由此完成了本发明。
(1)一种质粒DNA的制造方法，其包含下述(a)～(c)的工序：
(a)制备在涉及外膜的特性维持的基因区域中具有突变，并且保持目标质粒的大肠杆菌的工序；
(b)培养(a)的大肠杆菌的工序；
(c)从培养后的菌体中回收目标质粒的工序。
(2)根据(1)所述的方法，其中，
涉及外膜的特性维持的基因区域是涉及外膜的物理性和/或机械性特性维持的基因区域。
(3)根据(2)所述的方法，其中，
涉及外膜的物理性和/或机械性特性维持的基因区域是直接涉及外膜的物理性和/或机械性特性维持的基因区域。
(4)根据(3)所述的方法，其中，
直接涉及外膜的物理性和/或机械性特性维持的基因区域是选自编码pal、lpp、ompA、ybiS、ycfS、erfK、tolA、tolB、nlpI、bamD、bamA、lolA、lolB、lolC、lolD、lolE、lptE、lptD、lptA、lptB、lptF、lptG、slyB、mrcA、mrcB、lpoA、lpoB、tolQ和tolR的结构蛋白质的序列、以及编码它们的信号肽的碱基序列、启动子序列和SD序列中的至少一种。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的方法，其中，
所述大肠杆菌在选自Pal、Lpp、OmpA、YbiS、YcfS、ErfK、TolA、Tol B、NlpI、BamD、BamA、LolA、LolB、LolC、LolD、LolE、LptE、LptD、LptA、LptB、LptF、LptG、SlyB、MrcA、MrcB、LpoA、LpoB、TolQ和Tol R、以及它们的信号肽中的至少一种肽的氨基酸序列中具有突变。
(6)根据(5)所述的方法，其中，
所述大肠杆菌在选自Pal、Lpp、OmpA、YbiS、YcfS、ErfK和它们的信号肽中的至少一种肽的氨基酸序列中具有突变。
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的方法，其中，
所述突变为完全缺失。
(8)根据(1)～(6)中任一项所述的方法，其中，
所述突变为部分突变。
(9)根据(8)所述的方法，其中，
所述突变为信号肽的部分突变。
(10)根据(8)所述的方法，其中，
所述突变为结构蛋白质的部分突变。
(11)根据(10)所述的方法，其中，
所述结构蛋白质为以下的(A)～(E)中的任一种具有部分突变的结构蛋白质：
(A)结构蛋白质与外膜、肽聚糖层、内膜中的任一种相结合或接触，在其结合或接触的部分和/或其附近的氨基酸残基中具有置换或缺失的结构蛋白质；
(B)结构蛋白质具有使其他蛋白质与肽聚糖层相结合的酶活性，在其活性部位和/或其附近的氨基酸残基中具有置换或缺失的结构蛋白质；
(C)结构蛋白质是参与形成肽聚糖层的酶，在其活性部位和/或其附近的氨基酸残基中具有置换或缺失的结构蛋白质；
(D)结构蛋白质是参与存在于周质组分中的脂蛋白的外膜转运的蛋白质，在与脂蛋白的结合部位和/或其附近的氨基酸残基中具有置换或缺失的结构蛋白质；
(E)结构蛋白质是参与脂多糖的外膜转运的蛋白质，在与脂蛋白的结合部位和/或其附近的氨基酸残基中具有置换或缺失的结构蛋白质。
(12)根据(11)所述的方法，其中，
所述结构蛋白质为所述(A)的结构蛋白质，并且为选自Pal、Lpp、OmpA中的至少一种。
(13)根据(12)所述的方法，其中，
所述结构蛋白质为Pal，并且在其N末端侧的区域中具有所述突变。
(14)根据(12)所述的方法，其中，
所述结构蛋白质为Lpp，并且在其C末端侧的区域中具有所述突变。
(15)根据(12)所述的方法，其中，
所述结构蛋白质为OmpA，并且在其C末端侧的区域中具有所述突变。
(16)根据(11)所述的方法，其中，
所述结构蛋白质为所述(B)的结构蛋白质，并且为选自YbiS、YcfS、Erf K中的至少一种。
(17)根据(1)～(16)中任一项所述的方法，其中，
所述大肠杆菌来源于B株或来源于K12株。
(18)一种制备用于制造质粒DNA的大肠杆菌的方法，其包含下述(i)和(ii)的工序：
(i)在涉及大肠杆菌的外膜的特性维持的基因区域中添加突变的工序；
(ii)制备具有通过(i)得到的突变，并且保持目标质粒的大肠杆菌的工序。
(19)一种用于质粒DNA的制造的大肠杆菌，其在涉及外膜的特性维持的基因区域中具有突变，并且保持目标质粒。
本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本专利申请编号2021-117545号的公开内容。
发明的效果
根据本发明，可以提供一种使用了大肠杆菌的质粒DNA的制造方法，其是可以将质粒DNA从菌体中效率良好地回收的质粒DNA的制造方法。
具体实施方式
1.质粒DNA的制造方法
本发明的质粒DNA的制造方法包含下述(a)～(c)的工序：
(a)制备在涉及外膜的特性维持的基因区域中具有突变，并且保持目标质粒的大肠杆菌的工序；
(b)培养(a)的大肠杆菌的工序；
(c)从培养后的菌体中回收目标质粒的工序。
本发明的方法是一种可以通过具备所述特征，而从大肠杆菌的菌体中效率良好地回收目标质粒DNA的方法。
在医药试剂制造等中，追求工业上廉价地进行大量的制造。在质粒DNA的生产中也同样的，为了使其生产效率提高，已经开发了高生产能力宿主、高生产能力培养生产方法、高收率纯化方法。本发明的质粒DNA的制造方法(以下也称为“本发明的方法”)是使生成质粒DNA的宿主大肠杆菌的外膜的物理性和/或机械性特性改变而使质粒提取效率提高或使平均每菌体的质粒生成量增加的方法，可以通过由于设施的平均单元面积的质粒制造效率的提高和/或缓冲液使用量的削减而提高生产能力，降低提取工序所花费的成本。具体而言，可以实现伴随处理体积降低的原材料的削减、基于提取时间缩短的人员开支的降低等。
1-1大肠杆菌株
用于本发明的大肠杆菌是基因修饰株，作为其基础的大肠杆菌株没有特别限定，可以使用任何已知的大肠杆菌株。特别地可以适宜使用B株或者由B株派生出的菌株、K12株或者由K12株派生出的菌株。或者可以使用作为B株与K12株的混合株的HB101株。作为由B株派生出的菌株，例如，已知BL21株、REL606株。此外，作为由K12株派生出的菌株，已知W3110株、DH10B株、BW25113株、DH5α株、MG1655株、JM109株、RV308株等。
1-2外膜特性维持相关基因
用于本发明的大肠杆菌株是在1个以上的涉及外膜的特性维持的基因区域(下文中也称为“外膜特性维持相关基因”)中具有突变的基因突变株。
已知大肠杆菌的形态通过由外膜、肽聚糖(PG)层、内膜构成的膜结构而受到影响，该大肠杆菌的形态反映在外膜特性上。外膜的主要成分为磷脂、脂多糖(LPS)，PG层的主要成分为由多糖和肽构成的高分子化合物，内膜的主要成分为磷脂，由外膜蛋白质、内膜蛋白质、连接外膜和PG层的蛋白质、连接所述蛋白质间的蛋白质、连接PG层与内膜的蛋白质、连接外膜-PG层-内膜的蛋白质等构成。在本说明书中，“外膜的特性”是指外膜的物理性和/或机械性特性，通过存在于从外膜到内膜中的各种蛋白质和PG层而维持，通过存在于从外膜到内膜中的各种蛋白质的功能而直接或间接地维持。
在本说明书中所谓“外膜的物理性特性，”是指通过外膜而形成的大肠杆菌的形态、尺寸、膜的整合性、膜的流动性、透过性等，所谓“外膜的机械性特性，”是指外膜的机械性强度和大肠杆菌表面的状态，例如，硬度、表面结构。这些特性与大肠杆菌的生长增殖、分裂、菌体的形态维持、对外部因素、例如温度、渗透压、物质等的感受性和响应性等有关系。
就直接涉及外膜的物理性和/或机械性特性维持，且存在于内膜或周质空间的蛋白质而言，除了与外膜、PG层和/或内膜相结合、接触、贯穿和/或与这些蛋白质相互作用而与外膜的特性维持相关的蛋白质以外，还包含将这些蛋白质结合至PG层的酶、参与PG层的形成的酶。
Pal是丰富地存在于革兰氏阴性菌的外膜-内膜间的周质中的脂蛋白，通过N末端侧锚定于外膜上，C末端侧区域与PG层相互作用，有助于外膜的特性维持。
Lpp是最丰富地存在于革兰氏阴性菌的外膜-内膜间的周质空间中的脂蛋白，以N末端侧锚定于外膜上，C末端侧的赖氨酸与PG层形成共价键。Lp p通过外膜与PG的连接及其空间距离的维持而有助于外膜的特性维持。
OmpA是丰富地存在于革兰氏阴性菌的外膜-内膜间的周质中的外膜蛋白质之一，在外膜的特性维持中起着重要的作用。OmpA与PG层特异性地相互作用，特别地，R256和D241的残基与PG直接相互作用。
Lpp与PG层的结合通过LD-转肽酶(Ldt)进行催化，其中包含ErfK(LdtA)、YbiS(LdtB)和YcfS(LdtC)。Ldt催化Lpp与PG的共价键结，由此将PG与外膜交联，有助于外膜结构维持。
除此之外，NlpI、BamD、BamA、LolA、LolB、LptE、LptD、LptA、L poA、LpoB、SlyB插入到外膜、插入到内膜或存在于外膜-内膜之间，且涉及外膜的物理性和/或机械性特性维持。
Tol蛋白质存在TolA、TolB、TolQ、TolR，与Pal构成Tol-Pal系统，起桥接内膜、外膜和PG的作用，有助于外膜的特性维持。
Lol机制与Lpp、Pal等外膜蛋白质插入到外膜相关，由LolA/B/C/D/E构成。
Lpt机制对从内膜到外膜外层的LPS的转运方面较重要，涉及外膜的物理性和/或机械性特性维持。该Lpt机制由LptA/B/C/D/E/F/G构成。
Bam机制与OmpA等外膜蛋白质插入到外膜相关，作为与该机制有关的蛋白质，可举出BamA/B/C/D/E，形成了复合体。
MrcA、MrcB、LpoA、LpoB参与PG层的形成，涉及外膜的物理性和/或机械性特性维持。
本发明人深入研究的结果发现：在所述的涉及外膜的物理性和/或机械性特性维持的各功能蛋白质的基因区域中的突变在质粒DNA的制造中，通过大致分为提取效率的提高和/或质粒生成量本身的增加的机理，使其制造效率提高。例如，下文中列举按机理参与的基因区域，但未必表示基因产物的上述功能的分类仅参与一个机理，并且不限于在下文中举例的基因区域的突变。
(机理1)提取效率的提高和质粒的生成量提高：pal、lpp、ompA、ybiS、ycfS、erfK、tolB、nlpI、bamD、bamA、lolA、lolB、lolC、lolD、lolE、lptE、lptD、lptB、lptF和lptG。
(机理2)质粒生成量的提高：skyB、tolA和tolR。
用于本发明的方法的大肠杆菌基因突变株可以在2个以上的涉及外膜的物理性和/或机械性特性维持的基因区域中具有突变。该情况下，涉及所述的两个机理的基因区域组中，也可以在属于一个组的2个以上的基因区域中具有突变，也可以在包含各个组的1个以上的基因区域的2个以上的基因区域中具有突变。作为在2个以上的基因区域中具有突变的大肠杆菌基因突变株的实例，例如，可举出在ompA+Lpp、ompA+ybiS+ycsF+erfK、ybiS+ycsF+er fK、ompA+ybiS、ompA+ycsF、ompA+erfK、ompA+ybiS+ycsF、ompA+ybiS+erfK、ompA+ycsF+erfK、pal+ompA、pal+lpp、pal+ybis+ycsF+erfK、pal+ybi S、pal+ycsF、pal+erfK、pal+ybiS+ycsF、pal+ybiS+erfK、pal+ycsF+erfK等基因区域中具有突变的大肠杆菌基因突变株。
另一方面，就间接性地涉及外膜的物理性和/或机械性特性维持的蛋白质而言，包含(1)在控制外膜蛋白质的维持的周质空间中存在的分子伴侣蛋白质(SurA(例如GenBank:CAD6022301.1)、FkpA(例如GenBank:CAD6001217.1)、Spy(例如GenBank:CAD6012704.1)、Skp(例如GenBank:CAD6017209.1)、D egP(例如GenBank:CAD6021993.1)、UgpB(例如GenBank:CAD5993943.1)、OsmY(例如GenBank:EGT67405.1)等)、(2)控制外膜蛋白质的维持的催化蛋白质(DsbA(例如NCBI Reference:NP_418297.1)、DsbC(例如NCBI Referenc e:NP_417369.1)、DsbD(例如NCBI Reference:NP_418559.1)等)、(3)涉及PG层的形成、分解的酶、(4)涉及细胞外的应激反应的蛋白质(Rcs(例如GenBank:PSY27771.1)、Cpx(例如NCBIReference:NP_312809.1)、SigmaE(例如GenBank:BAE76749.1)等)。
在本说明书中，所谓“外膜特性维持相关基因”，更具体而言，是指涉及大肠杆菌的外膜的物理性和/或机械性特性维持的基因和基因区域。进一步地具体而言，所谓“外膜特性维持基因”，”是指参与涉及大肠杆菌的外膜的物理性和/或机械性特性维持的蛋白质的表达的、大肠杆菌的基因，即大肠杆菌具有的核酸(DNA或RNA，优选为DNA)。外膜特性维持相关基因不论直接或间接，是涉及外膜的特性维持的基因区域即可，没有特别限定，优选直接涉及的基因区域。外膜特性维持相关基因，例如，优选为选自pal、lpp、ompA、ybiS、ycfS、erfK、tolA、tolB、nlpI、bamD、bamA、lolA、lolB、lolC、lolD、lolE、lptE、lptD、lptA、lptB、lptF、lptG、slyB、mrcA、mrcB、lpoA、lpoB、tolQ和tolR中的至少一种基因区域。特别地，优选为pal、lpp、ompA、ybiS、ycfS或erfK的基因区域，但不限于此。更具体而言，优选为具有与由SEQ ID NO.1～30、54～59和62～83中的任一者表示的碱基序列具有60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上或100％的序列相同性的碱基序列的基因区域。
外膜特性维持相关基因中包含控制所述基因表达的SmallRNA和Non-Coding RNA。通过这些突变，可以减弱所述外膜特性维持相关基因的表达。
在本说明书中，碱基序列的“序列相同性”可以使用本领域技术人员广泛知晓的方法、序列解析软件等来获得。例如，可举出BLAST算法的blastn程序、FASTA算法的fasta程序。在本发明中，一些评价对象碱基序列的、与碱基序列X的所谓“序列相同性，”是指使碱基序列X与评价对象碱基序列对齐(alignment)，根据需要导入间隙，在使得两者的碱基一致程度变得最高时的、在包含间隙部分的碱基序列中在相同部位出现相同的碱基的频率用％表示的值。
在本说明书中，所谓“信号肽，”是指存在于目标蛋白质的N末端侧的15～30个氨基酸左右的肽序列，指示该蛋白质的转运和定位的肽。信号肽，通常，在转运和定位之后，通过信号肽酶来切断。在本说明书中，所谓“结构蛋白质，”是指信号肽切断后的蛋白质，即，该蛋白质的主体部分的结构。
在所述的外膜特性维持相关基因中，pal是为了表达外膜脂蛋白Pal的基因。编码大肠杆菌的Pal的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.1表示。编码pal的信号肽的碱基序列(信号碱基序列)由SEQ ID NO.2表示。
lpp是为了表达主要外膜脂蛋白Lpp的基因。编码大肠杆菌的Lpp的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.3表示。编码Lpp的信号肽的碱基序列由SEQ ID NO.4表示。
ompA是为了表达外膜蛋白质OmpA的基因。编码大肠杆菌的OmpA的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.5表示。编码OmpA的信号肽的碱基序列由SEQ ID NO.6表示。
ybiS是为了表达周质蛋白质YbiS的基因。YbiS已知是将PG与Lpp相结合而成的转肽酶。编码大肠杆菌的YbiS的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.54表示。编码YbiS的信号肽的碱基序列由SEQ ID NO.55表示。
ycfS是为了表达作为YbiS的同源物的YcfS的基因。编码大肠杆菌的Y cfS的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.56表示。编码YcfS的信号肽的碱基序列由SEQ IDNO.57表示。
erfK是为了表达作为YbiS的同源物的ErfK的基因。编码大肠杆菌的Er fK的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.58表示。编码ErfK的信号肽的碱基序列由SEQ IDNO.59表示。
tolA是为了表达作为构建Tol/Pal系统的蛋白质之一的TolA的基因。所谓Tol/Pal系统，是指存在于革兰氏阴性菌的、由多个蛋白质构成的复合体，已经报告其参与细胞分裂中的外膜内陷、膜的结构维持。编码大肠杆菌的To lA的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.7表示。
tolB是为了表达作为构建Tol/Pal系统的蛋白质之一的TolB的基因。编码大肠杆菌的TolB的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.8表示。编码TolB的信号肽的碱基序列由SEQ ID NO.9表示。
mepS是为了表达作为肽聚糖DD-内肽酶/肽聚糖LD-肽酶的MepS的基因。编码大肠杆菌的MepS的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.10表示。编码MepS的信号肽的碱基序列由SEQ ID NO.11表示。
nlpI是为了表达脂蛋白NlpI的基因。编码大肠杆菌的NlpI的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.12表示。编码NlpI的信号肽的碱基序列由SEQ ID NO.13表示。
bamD是为了表达外膜蛋白质BamD的基因。编码大肠杆菌中的BamD的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.15表示。编码BamD的信号肽的碱基序列由SEQ ID NO.16表示。
dppA是为了表达作为二肽结合蛋白质(dipeptide binding protein)的DppA的基因。编码大肠杆菌的DppA的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.19表示。编码DppA的信号肽的碱基序列由SEQ ID NO.20表示。
ecnB是为了表达toxin脂蛋白EcnB的基因。编码大肠杆菌的EcnB的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.21表示。编码EcnB的信号肽的碱基序列由SEQ ID NO.22表示。
mrcA是为了表达作为肽聚糖糖基转移酶/肽聚糖DD-转肽酶的MrcA的基因。编码大肠杆菌的MrcA的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.23表示。
mrcB是为了表达作为肽聚糖糖基转移酶/肽聚糖DD-转肽酶的MrcB的基因。编码大肠杆菌的MrcB的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.24表示。
oppA是为了表达周质寡肽结合蛋白质OppA的基因。编码大肠杆菌的OppA的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.25表示。编码OppA的信号肽的碱基序列由SEQ IDNO.26表示。
slyB是为了表达作为肽基-脯氨酰顺反异构酶(peptidyl-prolyl cis-transisomerase)的SlyB的基因。编码大肠杆菌的SlyB的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQID NO.27表示。编码slyB的信号肽的碱基序列由SEQ ID NO.28表示。
tolQ是为了表达作为构建Tol/Pal系统的蛋白质之一的TolQ的基因。编码大肠杆菌的TolQ的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.29表示。
tolR是为了表达作为构建Tol/Pal系统的蛋白质之一的TolR的基因。编码大肠杆菌的TolR的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.30表示。
bamA是为了表达外膜蛋白质BamA的基因。编码大肠杆菌的BamA的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.62表示。编码bamA的信号肽的碱基序列由SEQ ID NO.63表示。
lolA是为了表达参与脂蛋白的从内膜向外膜的转运的蛋白质LolA的基因。编码大肠杆菌的LolA的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.64表示。编码LolA的信号肽的碱基序列由SEQ ID NO.65表示。
lolB是为了表达参与脂蛋白的转运的外膜蛋白质LolB的基因。编码大肠杆菌的LolB的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.66表示。编码lolB的信号肽的碱基序列由SEQ ID NO.67表示。
lolC是为了表达参与脂蛋白的转运的内膜蛋白质LolC的基因。编码大肠杆菌的LolC的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.68表示。
lolD是为了表达参与脂蛋白的转运的ATP结合性蛋白质LolD的基因。编码大肠杆菌的LolD的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.69表示。
lolE是为了表达参与脂蛋白的转运的内膜蛋白质LolE的基因。编码大肠杆菌的LolE的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.70表示。
lptE是为了表达参与LPS的转运的脂蛋白LptE的基因。编码大肠杆菌的LptE的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.71表示。编码lptE的信号肽的碱基序列由SEQID NO.72表示。
lptD是为了表达参与LPS的转运的外膜蛋白质LptD的基因。编码大肠杆菌的LptD的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.73表示。编码lptD的信号肽的碱基序列由SEQ ID NO.74表示。
lptA是为了表达参与LPS的转运的蛋白质LptA的基因。编码大肠杆菌的LptA的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.75表示。编码lpt A的信号肽的碱基序列由SEQID NO.76表示。
lptB是为了表达参与LPS的转运的ATP结合性蛋白质LptB的基因。编码大肠杆菌的LptB的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.77表示。
lptF是为了表达参与LPS的转运的蛋白质LptF的基因。编码大肠杆菌的LptF的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.78表示。
lptG是为了表达参与LPS的转运的蛋白质LptG的基因。编码大肠杆菌的LptG的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.79表示。
lpoA是为了表达参与PG的合成的外膜蛋白质LpoA的基因。编码大肠杆菌的LpoA的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.80表示。编码lpoA的信号肽的碱基序列由SEQ ID NO.81表示。
lpoB是为了表达参与PG的合成的外膜蛋白质LpoB的基因。编码大肠杆菌的LpoB的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.82表示。编码lpoB的信号肽的碱基序列由SEQ ID NO.83表示。
可以使用具有所述的外膜特性维持相关基因、以及在arcA和/或cyoA的基因区域中具有突变的大肠杆菌。arcA是为了表达ArcA(Aerobic respiration control)的基因。编码大肠杆菌的ArcA的结构基因的碱基序列的一个实例由S EQ ID NO.14表示。cyoA是为了表达作为构成呼吸系统的膜蛋白质的CyoA的基因。编码大肠杆菌的CyoA的结构基因的碱基序列的一个实例由SEQ ID NO.17表示。编码CyoA的信号肽的碱基序列由SEQ ID NO.18表示。
1-3在外膜特性维持相关基因中具有突变的大肠杆菌株
在本说明书中，所谓基因的“突变”，是指对于在天然中存在的基因(也称为“野生型”)，添加了碱基序列的变更的状态。此处所谓的突变如果对于原本的基因的碱基序列添加了任何的变更，则没有特别限制，可以是完全缺失也可以是部分突变。此处所谓的“部分突变，”是指该基因区域的完全缺失以外的突变，具体而言，是指插入、置换、部分缺失。在本发明中，突变优选为部分突变，特别优选为部分缺失或置换。通过使基因突变为部分缺失或置换，可以与野生株相比使膜结构的稳定性减弱，并且维持大肠杆菌的增殖能力，因此可以将大肠杆菌在发酵罐(jar fermenter)等中进行大量培养。
本发明的方法中使用的大肠杆菌基因突变株具有使1个以上的外膜特性维持相关基因的表达变化的基因突变。此处所谓“使1个以上的外膜特性维持相关基因的表达变化的基因突变，”意指所述基因编码的蛋白质的活性与亲代菌株相比显著变化的基因突变。特别地，优选为使所述基因编码的蛋白质的功能、活性与亲代菌株相比减弱的基因突变，此处包含功能、活性完全消失的基因突变。所谓蛋白质的活性减弱的状态，是指作为目标基因的转录产物的mRNA、作为翻译产物的蛋白质的表达量降低的状态，或者作为所述目标基因的转录产物的mRNA、作为翻译产物的蛋白质是作为mRNA或蛋白质不能正常地发挥功能的状态。
在本说明书中，所谓基因的“缺失，”意指缺失或损伤，优选为缺失。作为所述部分突变可举出缺失、插入、置换等，优选为部分缺失或部分置换。所谓“部分缺失，”意指使基因或蛋白质部分地缺失。此外，所谓“部分置换，”意指基因的碱基序列或蛋白质的氨基酸序列的一部分置换成其他序列，即意指置换一个以上的氨基酸，包含基于通过置换单一的碱基而产生的错义突变的氨基酸置换。下文中，对于成为突变的目标的“1个以上的膜形成相关基因”，也简称为“目标基因。”目标基因也可以是一个外膜特性维持相关基因，也可以是2个以上的外膜特性维持相关基因。此外，可以在一个外膜特性维持相关基因的多个位置上存在突变。
作为所述部分缺失或置换，在使所述目标基因编码的蛋白质的氨基酸序列的编码区域的一部分缺失或置换的情况下，可以使N末端区域、内部区域、C末端区域等任一区域缺失。此外，在使基因缺失的情况下，其缺失区域的前后的序列也包含阅读框不一致。在缺失或置换中，适宜地，对于所述目标基因编码的蛋白质的至少一部分，例如，可以使包含1个氨基酸以上、整体的10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或95％以上的氨基酸数量的区域缺失或置换。或者可以使所述区域的100％缺失(完全缺失)。此外，例如，可以是在基因组DNA中所述目标基因中至少从起始密码子到终止密码子的区域缺失了的大肠杆菌基因突变株。
在本发明中，作为所述部分缺失或者置换，在所述目标基因编码的蛋白质的氨基酸序列的编码区域之内，与外膜、PG层、内膜的结合、接触区域和/或各蛋白质彼此的结合、接触区域和/或酶活性中心、催化剂区域和/或其附近的氨基酸残基的突变是有效的。
在本发明中，大肠杆菌的突变可以在结构蛋白质的编码区域中存在，或可以在表达调节序列中存在。在结构蛋白质的编码区域中有突变的情况下，由此，特别是在结构蛋白质中有部分突变的情况下，该结构蛋白质优选为以下的(A)～(E)中的任一种具有部分突变的结构蛋白质。
(A)结构蛋白质与外膜、肽聚糖层、内膜中的任一种相结合或接触，在其结合或接触的部分和/或其附近的氨基酸残基中具有置换或缺失的结构蛋白质；
(B)结构蛋白质具有使其他蛋白质与肽聚糖层相结合的酶活性，在其活性部位和/或其附近的氨基酸残基中具有置换或缺失的结构蛋白质；
(C)结构蛋白质是参与形成肽聚糖层的酶，在其活性部位和/或其附近的氨基酸残基中具有置换或缺失的结构蛋白质；
(D)结构蛋白质是参与存在于周质组分中的脂蛋白的外膜转运的蛋白质，在与脂蛋白的结合部位和/或其附近的氨基酸残基中具有置换或缺失的结构蛋白质；
(E)结构蛋白质是参与脂多糖的外膜转运的蛋白质，在与脂蛋白的结合部位和/或其附近的氨基酸残基中具有置换或缺失的结构蛋白质。
具有部分突变的结构蛋白质在(A)的结构蛋白质的情况下，优选为选自Pal、Lpp、Omp中的至少一种。在Pal的情况下，该突变优选在包含信号肽的N末端侧的区域中。在Lpp的情况下，该突变优选在C末端侧的区域中。在OmpA的情况下，该突变优选在C末端侧的区域中。
具有部分突变的结构蛋白质在(B)的结构蛋白质的情况下，优选为选自YbiS、YcfS、ErfK中的至少一种。
在本说明书中“表达调节序列”，若是可以参与编码区域的表达的碱基序列则没有特别限定，可以作为编码信号肽的碱基序列、启动子序列和/或Shine-Dalgarno(SD)序列(例如5’-AGGAGGA-3’)。本发明的大肠杆菌基因突变株包含具有编码信号肽的碱基序列、启动子序列和/或SD序列的完全缺失或部分突变的突变株。
作为在大肠杆菌株的基因组DNA中的所述目标基因的突变的其他实例，可举出在基因组DNA上的所述基因的氨基酸序列编码区域中导入错义突变、导入终止密码子(无义突变)、或者导入添加或缺失1～2个碱基的移码突变等。
作为在大肠杆菌株的基因组DNA中的所述目标基因的突变的其他实例，可以通过在基因组DNA上的所述基因的表达调节序列或氨基酸序列编码区域中置换或插入其他基因序列来达成。插入部位可以是所述基因的任一区域。此外，插入部位的前后的序列包含阅读框不一致。其他基因序列没有特别限定，例如，可举出标记基因。作为标记基因，可举出针对卡那霉素、氨苄青霉素、四环素、氯霉素等药物的抗药性标记、针对亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、色氨酸、尿嘧啶等营养成分的营养缺陷型标记。
所述大肠杆菌基因突变株，例如，可以通过突变处理、基因重组技术、使用了RNAi的基因表达抑制处理、基因编辑等来达成。
作为突变处理，可举出利用紫外线照射、或N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)等通常用于突变处理的突变剂的处理。
作为基因重组技术，可以利用已知的技术，例如：在FEMS Microbiolog y Letters165(1998)335-340,JOURNAL OF BACTERIOLOGY,Dec.1995,p7171-7177,Curr Genet 1986；10(8):573-578,WO 98/14600中记载的技术、C RISPR-Cas9等基因编辑、合成生物学等。
就制备具有突变的大肠杆菌外膜特性维持相关基因而言，可以适宜使用任意的向大肠杆菌株的基因组中整合的方法。就制备具有突变的大肠杆菌外膜特性维持相关基因的方法而言，可举出本领域技术人员已知的方法，例如，将适当的寡核苷酸作为引物的重叠PCR法、全合成法。就将制备的具有部分突变的大肠杆菌外膜特性维持相关基因整合到宿主细胞的方法而言，可以适宜使用已知的方法、可举出Red-recombinase系统(DatsenkoK.A.，and Wann er B.L.著(2000年),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97(12),6640-6645)、通过宿主细胞的同源重组机制整合的方法(Link A.J.等著(1997年)，J.Bacteriol.，179,6228-6237)等，特别地，优选为不将大肠杆菌基因组以外的外来基因整合到基因组上的Link等中记载的方法。
此时，就制备具有突变的外膜特性维持相关基因的重组载体的方法而言，可举出连接法、In-Fusion(Clontec公司)、PCR法、全合成法等，但特别地不限于此。此外，为了将重组载体导入到宿主细胞，例如，在使用大肠杆菌作为宿主的情况下，可以通过氯化钙法、电穿孔法等方法，但特别地不限于此。
就大肠杆菌株的基因组DNA中的目标基因的突变而言，可以通过将大肠杆菌株的基因组DNA中的所述基因置换为缺失型基因或标记基因来实现。此处所谓缺失型基因，是指以使得所述目标基因的一部分或全部缺失、或者使得一部分置换并且不产生正常地发挥功能的蛋白质的方式进行了修饰的不活泼基因。作为缺失型基因的实例，例如，可举出包含不具有所述目标基因的功能的任意的序列的线状DNA中，在该任意的序列的两端具备基因组DNA上的置换目标部位(即所述目标基因的一部分或全部)的上游和下游的序列的线状DNA、或者将基因组DNA上的所述置换目标部位的上游和下游的序列直接连接的线状DNA。作为标记基因的实例，例如，可举出包含标记基因的序列的线状DNA中，在所述标记基因的序列的两端具备基因组DNA上的置换目标部位(即所述目标基因的一部分或全部)的上游和下游的序列的线状D NA。通过所述线状DNA转化大肠杆菌株，在宿主菌株的基因组DNA的置换目标部位的上游和下游分别发生同源重组，可以通过1个步骤来将置换目标部位置换为所述线状DNA的序列。可以通过该置换而在大肠杆菌株的基因组DNA中使所述目标基因缺失。
标记基因在所述的置换之后根据需要可以除去。该目的是使得可以高效地除去标记基因，优选在标记基因的两端添加用于同源重组的序列或翻转酶识别对象(flippaserecognition target)(FRT)序列。
大肠杆菌基因突变株是在pal基因中具有突变的菌株的情况下，包含使大肠杆菌基因组上的编码Pal(具有由SEQ ID NO.31表示的氨基酸序列)的基因(SEQ ID NO.1)发生了突变的大肠杆菌、使表达调节序列发生了突变的大肠杆菌、例如使编码Pal的信号肽(SEQID NO.32)的基因(SEQ ID NO.2)发生了突变的大肠杆菌。在使信号肽突变的情况下，包含其他信号肽的置换以及具有突变的其他信号肽的置换。例如可举出将信号肽的疏水性区域中的疏水性氨基酸置换为亲水性氨基酸的突变，优选为将第14位的亮氨酸置换为天冬酰胺的突变。
Pal的突变也可以是完全缺失也可以是部分突变。在信号碱基序列以外的部分突变的情况下，优选为部分缺失，但没有特别限定。就包含编码具有部分缺失的Pal的基因的大肠杆菌而言，包含使大肠杆菌基因组上的编码Pal(具有由SEQ ID NO.31表示的氨基酸序列)的基因(SEQ ID NO.1)部分性地发生了缺失的大肠杆菌、以及在编码Pal的信号肽(SEQID NO.32)的基因(SEQ ID NO.2)中具有部分缺失的大肠杆菌。在Pal上实施部分缺失的位置，可以设为例如，Cascales E.and Lloubes R著,(2004年),Mol Microbiol.,51(3),873-885中记载的位置。
Pal部分突变株可以通过在编码Pal的基因缺失的Pal缺失株中导入具有编码具有部分突变的Pal的基因的基因，并使具有部分突变的Pal表达来制备，而在本发明中，优选使用Pal(SEQ ID NO.30)部分突变了的大肠杆菌，更优选所述部分突变为部分缺失。
作为在Pal中具有突变的大肠杆菌株，优选为Pal与外膜、PG层和/或其他外膜特性维持相关蛋白质相结合、接触的部分和/或其附近的氨基酸残基的置换或缺失，但没有特别限定。例如，可举出在基因组上具有编码从3位的氨基酸到17位的氨基酸缺失的Pal(SEQ IDNO.33)的基因(SEQ ID NO.34)的大肠杆菌株、在基因组上具有编码从19位的氨基酸到43位的氨基酸缺失的Pal(SEQ ID NO.35)的基因(SEQ ID NO.36)的大肠杆菌株、在基因组上具有编码从44位的氨基酸到62位的氨基酸缺失的Pal(SEQ ID NO.37)的基因(SEQ ID NO.38)的大肠杆菌株、在基因组上具有编码从62位的氨基酸到93位的氨基酸缺失的Pal(SEQ IDNO.39)的基因(SEQ ID NO.40)的大肠杆菌株、在基因组上具有编码从94位的氨基酸到121位的氨基酸缺失的Pal(SEQ ID NO.41)的基因(SEQ ID NO.42)的大肠杆菌株、在基因组上具有编码从123位的氨基酸到152位的氨基酸缺失的Pal(SEQ ID NO.43)的基因(SEQ IDNO.44)、在基因组上具有编码从126位的氨基酸到129位的氨基酸缺失的Pal(SEQ IDNO.45)的基因(SEQ ID NO.46)的大肠杆菌株、在基因组上具有编码从144位的氨基酸到147位的氨基酸缺失的Pal(SEQ ID NO.47)的基因(SEQ ID NO.48)的大肠杆菌株。
所述具有部分突变的Pal在由SEQ ID NO.33、35、37、39、41、43、45和47中的任一者表示的氨基酸序列中，也可以是置换、缺失和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列。所谓“1个或多个，”例如为1～80个、优选为1～70个、优选为1～60个、优选为1～50个、优选为1～40个、优选为1～30个、优选为1～20个、优选为1～15个、优选为1～10个、优选为1～5个、优选为1～4个、优选为1～3个、优选为1～2个、优选为1个。
所述具有部分突变的Pal也可以与由SEQ ID NO.33、35、37、39、41、43、45和47中的任一者表示的氨基酸序列具有60％以上的序列相同性。所述序列相同性也可以为70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上或100％。
在本说明书中，氨基酸序列的序列相同性可以使用本领域技术人员广泛知晓的方法、序列解析软件等来获得。例如可举出BLAST算法的blastp程序、FASTA算法的fasta程序。在本发明中，一些评价对象氨基酸序列的所谓与氨基酸序列X的“序列相同性，”是指使氨基酸序列X与评价对象氨基酸序列对齐(alignment)，并根据需要导入间隙，在以使得两者的氨基酸一致度变得最高的方式进行时的、在包含间隙部分的氨基酸序列中相同部位上出现相同的氨基酸的频率用％来表示的值。
就大肠杆菌基因突变株而言，在lpp基因中具有突变的菌株的情况下，包含使大肠杆菌基因组上的编码Lpp(作为一个实例，具有SEQ ID NO.49的氨基酸序列的Lpp)的基因(作为一个实例，SEQ ID NO.3的碱基序列)发生了突变的大肠杆菌、使表达调节序列、例如编码Lpp的信号肽(作为一个实例，具有SEQ ID NO.60的氨基酸序列的信号肽)的基因(作为一个实例，SEQ ID NO.4的碱基序列)发生了突变的大肠杆菌。在SEQ ID NO.49的Lpp氨基酸序列中，突变方式没有特别限定，例如，可举出在Lpp的C末端侧区域中具有突变，具体而言，使Lpp的第58位的赖氨酸缺失的突变、或者将第57位的精氨酸置换为不带电荷的氨基酸、优选亮氨酸的突变。或者也可举出预测会部分性破坏Lpp的α-螺旋结构的突变，例如，在Lpp的氨基酸序列(SEQ ID NO.49)中，将第11-13位(包含信号肽则第31-33位)的氨基酸SSD置换为VNFS的突变，但没有特别地限定。在使信号肽突变的情况下，例如，也包含将Lpp信号肽的第14位的甘氨酸置换为天冬氨酸的突变、其他信号肽的置换、以及具有突变的其他信号肽的置换。
就大肠杆菌基因突变株而言，在ompA基因中具有突变的菌株的情况下，也包含使大肠杆菌基因组上的编码OmpA(作为一个实例，具有SEQ ID NO.50的氨基酸序列的OmpA)的基因(作为一个实例，SEQ ID NO.5的碱基序列)发生了突变的大肠杆菌，使表达调节序列、例如编码OmpA的信号肽(作为一个实例，具有SEQ ID NO.61的氨基酸序列的信号肽)的基因(作为一个实例，SEQ ID NO.6的碱基序列)发生了突变的大肠杆菌。在SEQ ID NO.50的OmpA氨基酸序列中，突变方式没有特别限定，例如，可举出OmpA的C末端侧区域中具有突变，具体而言，将第256位的精氨酸置换为不带电荷或带负电荷的氨基酸、优选谷氨酸或丙氨酸的突变、或者将第241位的天冬氨酸置换为不带电荷或带正电荷的氨基酸、优选天冬酰胺的突变。此外，可举出OmpA的C末端区域的缺失，例如，使从第241位的谷氨酸或第256位的谷氨酸或其上游的氨基酸到C末端的区域中缺失的突变，但没有特别限定。在使信号肽突变的情况下，也包含将SEQ ID NO.61的OmpA信号肽中的氨基酸置换为另一氨基酸的突变、其他信号肽的置换、以及具有突变的其他信号肽的置换。
就大肠杆菌基因突变株而言，在ybiS、ycfS和erfK基因中具有突变的菌株的情况下，也包含使大肠杆菌基因组上的编码YbiS，YcfS和ErfK的基因发生了突变的大肠杆菌、使编码各种信号肽的基因发生了突变的大肠杆菌。在各种氨基酸序列中，突变方式没有特别限定，可举出使所述3种基因中1个、2个或3个缺失的突变。也可举出表达调节序列的突变，在使信号肽使突变的情况下，也包含将各种信号肽中的氨基酸置换为另一氨基酸的突变、其他信号肽的置换，以及具有突变的其他信号肽的置换。
就大肠杆菌基因突变株而言，在参与Tol-Pal系统的tolA、tolB、tolQ、t olR基因中具有突变的菌株的情况下，也包含使大肠杆菌基因组上的编码Tol A、TolB、TolQ、TolR的基因、以及表达调节序列、例如编码信号肽的基因发生了突变的大肠杆菌。在各种Tol蛋白质的氨基酸序列中，突变方式没有特别地限定。也包含将信号肽中的氨基酸置换为另一氨基酸的突变、其他信号肽的置换、以及具有突变的其他信号肽的置换。
就大肠杆菌基因突变株而言，在与Lol机制有关的lolA、lolB、lolC、lol D和lolE基因中具有突变的菌株的情况下，也包含使大肠杆菌基因组上的编码LolA、LolB、LolC、LolD和LolE的基因、以及表达调节序列、例如编码信号肽的基因发生了突变的大肠杆菌。在各种Lol蛋白质的氨基酸序列中，突变方式没有特别限定。也包含将信号肽中的氨基酸置换为另一氨基酸的突变、其他信号肽的置换、以及具有突变的其他信号肽的置换。
就大肠杆菌基因突变株而言，在与Lpt机制有关的lptE、lptD、lptA、lpt B、lptF和lptG基因中具有突变的菌株的情况下，也包含使大肠杆菌基因组上的编码LptE、LptD、LptA、LptB、LptF和LptG的基因、以及表达调节序列、例如编码信号肽的基因发生了突变的大肠杆菌。在各种Lpt蛋白质的氨基酸序列中，突变方式没有特别限定，作为一个实例，可举出从LptD的氨基酸序列的第330位的氨基酸到第352位的氨基酸中部分缺失的LptDΔ330-352。也包含将(M.Braun and T.J.Silhavy著(2002年),Mol Microbiol.,45(5):1289-302)信号肽中的氨基酸置换为另一氨基酸的突变、其他信号肽的置换、以及具有突变的其他信号肽的置换。
就大肠杆菌基因突变株而言，在与Bam机制有关的bamD和bamA基因中具有突变的菌株的情况下，也包含使大肠杆菌基因组上的编码BamD和Ba mA的基因发生了突变的大肠杆菌、表达调节序列、例如编码信号肽的基因发生了突变的大肠杆菌。在各种Bam蛋白质的氨基酸序列中，突变方式没有特别限定，作为一个实例，可举出从BamA的起始密码子到23bp上游的位置上插入了EZ-Tn5的BamA的表达水平降低的突变株BamA101。在使信号肽突变的情况下，也包含将各种信号肽中的氨基酸置换为另一氨基酸的突变、其他信号肽的置换、以及具有突变的其他信号肽的置换。
除此之外，就大肠杆菌基因突变株而言，在nlpI、slyB、mrcA、mrcB、l poA或lpoB基因中具有突变的菌株的情况下，也包含使编码NlpI、SlyB、M rcA、MrcB、LpoA或LpoB的基因发生了突变的大肠杆菌、编码信号肽的基因发生了突变的大肠杆菌。在所述对象蛋白质中，可以使包含由1个氨基酸以上、整体的10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或95％以上的氨基酸数量的区域缺失或置换。或者可以使所述区域的100％缺失，但没有特别限定。
1-4保持质粒的大肠杆菌的制备工序(工序(a))
本发明的方法包含：
(a)制备在涉及外膜的特性维持的基因区域中具有突变，并且保持目标质粒的大肠杆菌的工序。
1-4-1质粒的制备
在工序(a)中，作为宿主的“涉及外膜的特性维持的基因区域中具有突变的”大肠杆菌可以通过所述方法进行制备。工序(a)包含在所述大肠杆菌基因突变株中，进一步地使质粒担载。
在本说明书中，所谓“质粒”和“质粒DNA，”是指存在于大肠杆菌的核外，通过细胞分裂传递给子细胞的DNA分子。在本发明中，特别地意指在菌体外人为地构建的DNA分子。作为质粒，可以使用任何已知的，例如，可以使用pBluescript载体、pET载体、pETduet载体、pGBM载体、pBAD载体、pUC载体等，但不限于此。在多数情况下，质粒以环状二重链的形状使用。
本发明的方法中由大肠杆菌担载的质粒(即复制/制造的质粒DNA)没有特别限定，优选可以利用于用于人或动物的基因疗法、DNA疫苗等。作为这样的质粒DNA，优选为具有对疾病、病情等的预防或治疗有用的DNA分子。例如，可举出包含作为DNA疫苗有用的碱基序列的质粒DNA、其本身是有用的质粒DNA、用于动物细胞的蛋白质表达质粒DNA等。此处作为所谓的对疾病、病情等的预防或治疗有用的DNA分子，例如，可举出编码反义寡核苷酸、适配体等的DNA分子。
本发明中使用的质粒的分子量没有特别限定，可以使用1～200kbp，特别是2～150kbp的。
1-4-2基因导入
在本发明的方法中，向大肠杆菌基因突变株导入所述质粒。将质粒导入到大肠杆菌株的方法没有特别限定，例如，可以通过电穿孔法、氯化钙法、感受态细胞法、原生质体法等基因导入法进行。
如上所述，在工序(a)中，制备保持目标质粒的大肠杆菌基因突变株。质粒由于在大肠杆菌的分裂的同时进行复制而传递到子细胞中，因此工序(a)相当于具有新的基因信息的大肠杆菌的育种。
1-5培养工序(工序(b))
本发明的方法包含将通过工序(a)制备的大肠杆菌基因突变株进行培养的工序(下文中也称为“工序(b)”)。
所述大肠杆菌基因突变株的培养可以使用锥形瓶、发酵罐等已知的培养系统来进行。也可以进行在大容量(例如，30L～10000L)的培养槽中的培养。此外，培养可以在适当的培养基中进行。培养方法也可以是分批培养、流加培养、连续培养中的任一种。培养基只要包含碳源、氮源、无机盐、维生素等对所述大肠杆菌基因突变株的增殖所必须的营养素，则也可以为合成培养基、天然培养基中的任一种。
作为碳源，若为所述大肠杆菌基因突变株可以同化的碳源则任一种均可，可举出葡萄糖、果糖这样的糖类、乙醇、甘油这样的醇类、乙酸这样的有机酸类等。
作为氮源，可举出氨、硫酸铵等铵盐、胺等氮化合物、蛋白胨这样的天然氮源等。
作为无机盐，可举出磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、碳酸钾等。
作为维生素，可举出生物素、硫胺素等。进一步地可以根据需要添加所述大肠杆菌基因突变株对生长增殖所需求的物质(例如若是氨基酸缺陷型菌株则为需求的氨基酸)。
在本发明的方法中，优选使用包含蛋白胨、酵母提取物和氯化钠的培养基。蛋白胨优选为大豆蛋白胨。作为包含蛋白胨、酵母提取物和氯化钠的培养基的实例，优选为2×YT培养基。
在本发明的方法中，培养条件没有特别限定，可举出优选为振荡培养、搅拌培养等。培养温度为20～50℃，优选为25～45℃，更优选为30～42℃。培养时间为3小时～5天，优选为5小时～3天。
1-6回收质粒DNA的工序(工序(c))
本发明的方法包含从通过工序(b)培养的大肠杆菌的菌体中，回收目标质粒DNA的工序。作为从大肠杆菌的菌体中回收质粒DNA的方法，也可以使用裂解(Lysis)法、密度梯度超速离心法等已知的方法、市售的纯化试剂盒(例如QIAprep Spin Mini prepkit(QIAGEN))。作为裂解法，没有特别限定，例如，可以使用在非专利文献1中记载的碱裂解法。
在非专利文献1中记载的碱裂解法的步骤总结如下。从菌体培养液中通过离心分离、过滤等已知的方法回收菌体。回收后的菌体用溶菌酶溶液处理后，在包含SDS等表面活性剂的强碱性溶液内裂解。在冰上向菌体裂解液中加入高浓度的乙酸钠溶液，使蛋白质、高分子RNA和染色体DNA沉淀后，进行离心分离，回收上清。向回收的上清中添加冷乙醇来沉淀质粒DNA，进行离心分离，除去上清。将沉淀物悬浮于乙酸钠/Tris-HCl，添加2倍量的乙醇在-20℃下冷却后，通过离心分离来回收沉淀。将沉淀悬浮于灭菌水后，使用琼脂糖凝胶电泳进行纯化。需要说明的是，碱裂解法没有特别限定于非专利文献1中记载的方法。材料、条件可以根据其目的，适宜地进行最优化。
作为裂解法，通常而言使用将菌体在碱性溶液和表面活性剂中进行溶菌，然后，通过中和与表面活性剂一起，使基因组DNA、蛋白质、高分子RNA共沉淀来除去的方法。使用的碱性材料、表面活性剂等种类、浓度、温度、p H等条件没有限定。在裂解法中，可以在溶菌时事前使用溶菌酶弱化膜结构而提高溶菌效率。此外，可以通过添加RNase分解作为杂质的RNA，提高质粒的纯度。此外，在中和时通过添加氯化钙来促进RNA的沉淀，提高质粒的纯度。
菌体裂解后的质粒DNA纯化方法不限于在非专利文献1中记载的通过琼脂糖凝胶电泳来纯化。例如，也可以使用专用柱等已知的纯化方法中的任一种。
在特定的方式中，就本发明的方法中使用的大肠杆菌基因突变株而言，直接涉及外膜的物理性和/或机械性特性维持的蛋白质的功能的减弱，即是由于蛋白质的表达量的抑制、突变、缺失而具有功能减弱的蛋白质的大肠杆菌基因突变株，可以将质粒DNA效率良好地提取至菌体外，由此，具有可以效率良好地回收质粒DNA的这样的优点。特别地，在碱提取法中，通过外膜结构稳定性的减弱，对于碱-SDS溶液的感受性升高，碱-SDS溶液的溶菌效果与野生株相比提高。在另一方式中，就本发明的方法中使用的大肠杆菌基因突变株而言，是通过在直接涉及外膜的物理性和/或机械性特性维持的蛋白质中具有突变，而与野生株相比质粒的生成量增加的大肠杆菌基因突变株，由于平均每菌体内生成的质粒数量比通常更多，因此具有可以效率良好地回收质粒DNA的这样的优点。可以通过使用所述方式的大肠杆菌基因突变株，通过处理体积的削减引起的空间缩小，即一次可处理的菌体量增大，处理体积降低所伴随的材料的削减和/或提取效率的改善，能够达到较高的质粒DNA回收量。
2.用于制造质粒DNA的大肠杆菌的制备方法
本发明的用于制造质粒DNA的大肠杆菌的制备方法(下文中也称为“本发明的大肠杆菌的制备方法”)包含下述(i)和(ii)的工序：
(i)在涉及大肠杆菌的外膜的特性维持的基因区域中添加突变的工序；
(ii)制备具有通过(i)得到的突变，并且保持目标质粒的大肠杆菌的工序。
通过本发明的大肠杆菌的制备方法所制造的大肠杆菌通过减弱外膜的物理性或机械性特性，而升高对于热等外部压力、质粒提取试剂等的感受性，与野生株相比溶菌效果提高，因此具有可以效率良好地回收质粒DNA的这样的优点。或者通过本发明的大肠杆菌的制备方法而制造的大肠杆菌通过增加平均每菌体的质粒生成量本身，而具有可以效率良好地回收质粒DNA的这样的优点。
2-1大肠杆菌的基因突变工序(工序(i))
本发明的大肠杆菌的制备方法包含使大肠杆菌的外膜特性维持相关基因突变的工序(下文中也称为“工序(i)”)。在本发明的大肠杆菌的制备方法中，使用的大肠杆菌株如所述“1质粒DNA的制造方法”的“1-1大肠杆菌株”的项中所记载。此外，成为突变的目标的外膜特性维持相关基因如所述“1-2外膜特性维持相关基因”的项中所记载。此外，使大肠杆菌的外膜特性维持相关基因改变的具体的方法、条件等如所述“1-3在外膜特性维持相关基因中具有突变的大肠杆菌株”的项中所记载。
2-2保持质粒的大肠杆菌的制备工序(工序(ii))
本发明的大肠杆菌的制备方法包含向通过工序(i)所得到的大肠杆菌基因突变株中导入目标质粒并制备保持质粒的大肠杆菌的工序(下文中也称为“工序(ii)”)。在工序(ii)中，使用的质粒、导入方法等如所述“1-4保持质粒的大肠杆菌的制备工序(工序(a))”的项中所记载。
3.用于质粒DNA的制造的大肠杆菌
本发明的用于质粒DNA的制造的大肠杆菌(下文中也称为“本发明的大肠杆菌”)在涉及外膜特性维持的基因区域中具有突变，并保持目标质粒。本发明的大肠杆菌具有可以在培养后的质粒纯化中，效率良好地回收质粒的这样的优点。
本发明的大肠杆菌的涉及外膜特性维持的基因区域的突变的详情如“1质粒DNA的制造方法”的“1-2外膜特性维持相关基因”的项中所记载。此外，本发明的大肠杆菌保持的质粒DNA的结构等详情如所述“1-4保持质粒的大肠杆菌的制备工序(工序(a))”的项中所记载。
4.质粒DNA
本发明提供使用大肠杆菌来制造的质粒DNA。具体而言，提供使用“1.质粒DNA的制造方法”来制造的质粒DNA。
实施例
举出以下的实施例来进一步地详细地说明本发明，本发明不被限定于这些实施例。
就本发明中使用的基因重组技术而言，例如，聚合酶链式反应(PCR)、基因合成、DNA的分离和纯化、限制性内切酶处理、修饰DNA的克隆、转化等由本领域技术人员已知。以下的实施例只要没有特别的记载，则根据试剂/仪器的制造商的附加手册中记载的步骤来实施。
在以下的实施例中，PCR使用了Prime STAR HSDNAPolymerase(TA KARABIO公司)。PCR产物、限制性内切酶反应液的纯化使用了QIAuick G el Extraction Kit(QIAGEN公司)。通过PCR以外技术的DNA片段的制备使用了通常的基因合成。
[实施例1]大肠杆菌W3110株的Pal突变株的研究
(实施例1-1)Pal突变株的制备
参考Link A.J.等(J.Bacteriol.，1997年179,6228-6237)的方法制备大肠杆菌W3110株的Pal部分缺失株。就包含编码具有表1所述的缺失区域的Pa l的碱基序列、具有对于分别在pal基因外的上游/下游约200bp的基因组上的同源重组所必要的同源臂的各种DNA片段而言，通过进行重叠PCR来得到。该DNA片段在5’末端侧具有EcoRI、在3’末端侧具有SalI的限制性内切酶识别序列。
将由所述而制备的DNA片段和克隆载体通过限制性内切酶EcoRI和Sal I来切断。使用各个切断的DNA片段进行连接。将这样制备的用于突变导入的质粒通过氯化钙法转化到W3110株，使用包含四环素的培养基来筛选保持用于突变导入的质粒的菌株。下文中，得到目标Pal突变株之前的基因重组操作是基于Link A.J.等的方法来实施的。
[表1]
菌株的名称 突变方式 SEQ ID NO.
PalΔ19-43 Δ19-43 52
PalΔ144-147 Δ144-147 53
(实施例1-2)质粒保持菌株的培养
通过电穿孔法将gWiz(商标)质粒(Genlantis)导入到Pal突变株。gWiz(商标)质粒保持菌株通过含有卡那霉素的培养基(50mg/L)来筛选。
向3mL的LB液体培养基(10g/L胰蛋白胨(Life Technologies Corporatio n)、5g/L酵母提取物(Dickinson and Company)、10g/L氯化钠(NACALAITE SQUE公司、特级))中以使得终浓度为50mg/L的方式添加卡那霉素，以使得OD为0.01的方式添加预培养液。以37℃，300rpm进行16小时培养。培养液中的菌量以OD600值进行定量。
(实施例1-3)提取试剂使用量对质粒提取量的影响
就质粒的提取而言，使用了QIAprep Spin Mini prepkit(QIAGEN)。通过将由实施例1-2得到的培养液1mL离心分离来回收菌体，使用了得到的颗粒(pellet)。本研究中，在将提取试剂的P1、P2、N3缓冲液按照实验方案(protocol)的容量来提取质粒的条件(x1条件)和按照1/4的容量来提取质粒的条件(x1/4条件)的2种条件下进行研究。对于其它操作按照实验方案进行。将得到的质粒溶出液使用Nanodrop进行定量。此外，根据OD和质粒DNA浓度来计算质粒DNA的菌体比收量(μg/mL/OD)。
各个条件的提取的质粒DNA(μg/mL)和质粒DNA的菌体比收量由表2所示。以在x1条件下提取的质粒DNA浓度作为100％，对在x1/4条件下提取的质粒DNA浓度进行比较时，在WT的情况下为84％，由于减少提取试剂量而降低提取效率。另一方面，在PalΔ19-43株的情况下为96％，在PalΔ144-147株的情况下为94％，表示了由与WT相比减少了提取试剂量而引起的提取效率的降低得到抑制。这表示了Pal突变株是一种容易从菌体内提取质粒的菌株，即使削减提取试剂也达成较高的收率。
[表2]
(实施例1-4)处理菌体量对质粒提取量的影响
与实施例1-3同样地，就质粒的提取而言使用了QIAprep Spin Mini pre pkit(QIAGEN)。在处理从培养液1mL中得到的菌体的条件(1mL条件)和处理从培养液4mL中得到的菌体的条件(4mL条件)的2种条件下进行了研究。
各个条件下提取的质粒DNA(μg/mL)和质粒DNA的菌体比收量由表3所示。以在1mL条件下提取的质粒DNA浓度作为100％，对在4mL条件下提取的质粒DNA浓度进行比较时，在WT的情况下为59％，由于处理菌体量增加而显著降低了提取效率。另一方面，在PalΔ19-43株的情况下为77％、在PalΔ144-147株的情况下为81％，表示了与WT相比增加了处理菌体量而引起的提取效率的降低得到抑制。此外，表示了在4mL条件下与WT相比P al突变株可以提取较多的质粒DNA。这表示了Pal突变株是一种容易从菌体内提取质粒的菌株，可以通过1次提取工序而处理较多的菌体。
[表3]
[实施例2]大肠杆菌DH10B株的OmpA+Lpp突变株、OmpA突变株和L pp突变株的研究
对于大肠杆菌DH10B株，通过使用了Lambda-Red系统(Thomason etal.Plasmid.2007Sep；58(2):148-58)的dsDNA重组，制备了OmpA+Lpp突变株(OmpA R256E+LppΔK58)、OmpA突变株(OmpA R256E)和Lpp突变株(LppΔK58)。具体而言，使用了以下的二阶段的重组法。首先，将cat-sacB整合到目标部位并通过氯霉素筛选。接着，通过Lambda-Red法，不改变周围的D NA区域，并将cat-sacB盒与突变基因座进行替换。对于OmpA，首先通过L ambda-Red法整合ompA::cat-sacB(PCR产物)，接着，以ompA::ompAR256E进行重组。对于Lpp，首先整合lpp::cat-sacB，接着，以lpp::lppΔK58进行重组。
对于各个突变株和未导入突变的DH10株(WT)，与实施例1同样地，通过电穿孔法将gWiz(商标)质粒(Genlantis)导入到各个突变株，使用含有卡那霉素的培养基(25mg/L)来筛选质粒保持菌株。
将各个菌株在LB培养基中进行了培养。将1mL的培养液离心分离来集菌，在冰上添加150μL的P1(50mM Tris-HCl，80mM EDTA，100μg/mL RN ase A，pH8.0)，接着添加150μL的P2(100mM NaOH，1％SDS)并数次倒转混和。在室温下孵化5分钟后，在冰上添加300μL的P3(3M乙酸钾，pH8.0)。在冰上静置10分钟后，在4℃，12500rpm下离心分离5分钟。回收上清、添加0.7倍容积的异丙醇进行混合，并在4℃，12500rpm下离心分离5分钟。除去上清、添加300μL的70％乙醇，在4℃，12500rpm下离心分离5分钟。除去上清使其干燥，在20μL的水中重悬。
由表6表示各个菌株中的培养液的吸光度、集菌时的菌体量、回收DNA量。与WT相比，在OmpA_R256E+Lpp_ΔK58、OmpA_R256E、Lpp_ΔK58的突变株中提高了质粒DNA的生成量。
[表4]
[实施例3]大肠杆菌DH10B+recA株的Pal突变株和Lpp突变株、以及大肠杆菌DH10B株的OmpA突变株的研究
通过以下的方法制备向大肠杆菌DH10B整合了recA基因的DH10B+rec A株。首先，制备编码recA的DNA片段。该DNA片段为在两末端侧具有A flII的限制性内切酶识别序列的。通过限制性内切酶AflII来切断制备的DNA片段和克隆载体。对于克隆载体而言限制性内切酶处理后，通过碱性磷酸酶进行了脱磷酸化处理。将通过使用了各个切断的DNA片段的连接而制备的用于突变导入的质粒通过氯化钙法转化至DH10B株，使用包含四环素的培养基来筛选保持用于突变导入的质粒的菌株。下文中，通过与实施例1同样的方法制备了DH10B+recA株。
使用得到的DH10B+recA株，通过与实施例1同样的方法来制备Pal突变株。制备具有与实施例1-1的PalΔ19-43相同缺失区域的菌株，作为PalΔ19-43’。此外，对于Pal，制备包含编码将Pal的信号肽(SEQ ID NO.31)的第14位的L置换为N的氨基酸序列的碱基序列、具有对于分别在pal基因外的上游/下游300bp的基因组上的同源重组所必要的同源臂的各种DNA片段，通过与实施例1同样的方法，制备了Pal信号肽点突变株(L14N)。此外，对于Lpp，制备包含编码Lpp的信号肽(SEQ ID NO.60)的第14位的G置换为D的氨基酸序列的碱基序列、具有对于分别在从Lpp信号碱基序列中的突变位点的上游/下游500bp的基因组上的同源重组所必要的同源臂的DNA片段，通过与实施例1同样的方法，制备了Lpp点突变株(G14D)。得到的Pal突变株和Lpp突变株的突变方式由表5表示。需要说明的是，确定了Lpp突变株具有所述的信号肽点突变、以及将Lpp的第11-13位(包含信号肽则第31-33位)的氨基酸SSD置换为VNFS的突变。大肠杆菌DH10B株的Omp突变株(R256E)、OmpA的点突变株(R256E)使用了通过实施例2制备的突变株。
[表5]
菌株的名称 突变方式
Pal L14N＊ L14N＊
Lpp G14D＊ G14D＊、S31_D33delinsVNFS＊
*包含信号肽的氨基酸编号
与实施例1同样地，通过电穿孔法将gWiz(商标)质粒(Genlantis)导入到各个突变株，使用含有卡那霉素的培养基(50mg/L)来筛选质粒保持菌株。对于所述突变株、以及作为对照的DH10B+recA株(下文中称为“WT”)进行了同样的质粒导入。
将得到的质粒保持菌株分别接种到3mL的LB培养基(添加50μg/mL的卡那霉素)，在37℃，300rpm下预培养8小时。接着，将预培养液添加到40mL的LB培养基(添加50μg/mL的卡那霉素)，在37℃，200rpm培养16小时培养。
就质粒的提取而言使用了QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN)。将得到的培养液35mL进行离心分离，回收菌体。就回收的菌体而言，测定全细胞重量(WCW)后，在同重量的P1缓冲液中悬浮，制备了菌体悬浮液。然后，使用在表4中的“x1”和“x4”的条件所记载的量的菌体悬浮液和各缓冲液，除此之外按照提取试剂的实验方案进行质粒提取。在表4中，表示在各个条件下提取的质粒DNA(mg/L)和质粒DNA的菌体比收量。
[表6]
[表7]
*包含信号肽的氨基酸编号
在PalΔ19-43’、Pal L14N中，与WT相比提取效率提高，与OmpA R256E同等。此外，在Lpp G14D中，与WT相比提取效率提高，与OmpA R256E同等。并且，确定了生产能力的显著提高。需要说明的是，在Pal突变株和Lpp突变株中，观察到与WT同样的良好的生长增殖。
[实施例4]将大肠杆菌MG1665株作为宿主的YbiS、YcsF和ErfK突变株的研究
对于大肠杆菌MG1665株，通过P1转导将来自Keio文库(Keio Collecti on)(Babaet al.,Mol Syst Biol.2006；2:2006.0008)的ybiS::kan、ycsF::kan或erfK::kan转导到MG1665株(Curr Protoc Mol Biol.2007Jul；Chapter 1:Unit1.17)。得到的突变株通过卡那霉素来筛选，然后，通过FLP重组酶除去卡那霉素抗药性基因。将由此得到的突变株作为宿主而重复P1转导和卡那霉素抗药性基因的除去，制备ΔybiSΔycsFΔerfK株。对于OmpAR256E+ΔybiSΔy csFΔerfK株的OmpA R256E的突变导入，通过与实施例2同样的方法进行。大肠杆菌MG1665株的OmpAR256E+LppΔK58株通过与实施例2同样的方法进行制备。
与实施例1同样地，通过电穿孔法将gWiz(商标)质粒(Genlantis)导入到各个突变株，使用含有卡那霉素的培养基(25mg/L)来筛选质粒保持菌株。对于所述突变株、以及作为对照的MG1665株(下文中称为“WT”)进行了同样的质粒导入。
将各个菌株在包含卡那霉素的LB培养基中进行培养，将得到的培养液以使得OD为1.0的方式进行了制备。将5mL的制备液进行离心分离并集菌，按照QIAuick GelExtraction Kit的实验方案，进行了提取和柱吸附/清洗操作。将150μL的溶出缓冲液(10mMTris-HCl，pH8.5)加载到柱上，在室温下静置1分钟后离心。接着，将溶出液再次加载到柱上，在室温下静置1分钟后离心。在表8中表示将WT的值设为1时的各个菌株中的吸光度和回收质粒DNA量的比例。
[表8]
在ΔybiSΔycsFΔerfK株和OmpA R256E+ΔybiSΔycsFΔerfK株中，与WT相比质粒DNA的生成量提高。此外，在OmpA R256E+ΔybiSΔycsFΔerfK株中，是与OmpA R256E+LppΔK58株同等的质粒DNA生成量。
[实施例5]将大肠杆菌BW25113株作为宿主的TolR和SlyB突变株的研究
向大肠杆菌BW25113株作为宿主的Keio文库(Keio Collection)中的tolR::kan(ΔtolR)和slyB::kan(ΔslyB)的各个突变株(从Horizon Discovery公司获得)中，通过电穿孔法导入了gWiz(商标)质粒(Genlantis)。本次使用的gWiz质粒使用了将卡那霉素抗药性基因置换为氨苄青霉素抗药性基因的gWiz-Ampr。目标质粒保持菌株使用含有氨苄青霉素的培养基进行了筛选。对于所述突变株、以及作为对照的BW25113株(下文中称为“WT”)进行了同样的质粒导入。
将得到的质粒保持菌株分别接种到3mL的LB培养基(添加50μg/mL的氨苄青霉素)，在37℃，300rpm下预培养8小时。接着，将预培养液添加到40mL的LB培养基(添加50μg/mL的氨苄青霉素)，在37℃，200rpm下培养16小时。
就质粒的提取而言使用了QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN)。将得到的培养液35mL进行离心分离，回收菌体。就回收的菌体而言，测定全细胞重量(WCW)后，在同重量的P1缓冲液中悬浮，制备了菌体悬浮液。然后，使用在表9中的“x1”的条件所记载的量的菌体悬浮液和各缓冲液，除此之外按照提取试剂的实验方案进行质粒提取。在表10中，表示将WT的值设为1时的各个菌株中的吸光度和回收质粒DNA量的比例。
[表9]
[表10]
在ΔtolR和ΔslyB中，表示了与WT相比分别约1.5倍、约1.7倍的质粒生成量。
[实施例6]将大肠杆菌BW25113株作为宿主的TolB和TolQ突变株的研究
对于突变株的取得、质粒导入、培养，通过与实施例5同样的操作来实施。就质粒的提取而言使用了QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN)。将得到的培养液35mL进行离心分离，回收菌。就回收的菌体而言，测定全细胞重量(WCW)后，在同重量的P1缓冲液中悬浮，制备了菌体悬浮液。然后，使用在表11中的“x1”和“x2”的条件所记载的量的菌体悬浮液和各缓冲液，除此之外按照提取试剂的实验方案进行质粒提取。在表12中表示在各个条件下提取的质粒DNA(mg/L)和将x1条件下回收的质粒DNA设为100％的情况下的提取效率。
[表11]
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[表12]
将在x1条件下回收的质粒DNA设为100％，比较x2条件下回收的质粒DNA时，在WT的情况下显示76％的提取效率。另一方面，ΔtolB和ΔtolQ分别为93％、85％，并且与WT相比，提取效率提高了。这表示了所述突变株是一种从菌体内容易回收质粒DNA的菌株。
[实施例7]将大肠杆菌BW25113株作为宿主的参与外膜结构维持的蛋白质突变株的研究
对于突变株的取得、质粒DNA导入、培养和质粒DNA提取方法，通过与实施例6同样的操作来实施。在表13中表示各个条件下提取的质粒DNA(m g/L)和将x1条件下回收的质粒DNA设为100％的情况下的提取效率。
[表13]
将在x1条件下回收的质粒DNA设为100％，比较x2条件下回收的质粒DNA时，在WT的情况下显示为62％的提取效率。另一方面，在ΔmrcA的情况下为77％、在ΔmrcB的情况下为86％、在ΔnlpI的情况下为109％、在ΔlpoA的情况下为77％、在ΔlpoB的情况下为73％、在ΔlolA的情况下为74％，表示出比WT更高的提取效率。这表示所述突变株是一种从菌体内容易回收质粒DNA的菌株。并且，在ΔnlpI以外的全部的突变株中，与WT相比在x1条件下回收更多质粒DNA。
[实施例8]将大肠杆菌MC4100株作为宿主的Lpt突变株的研究
大肠杆菌MC4100株的LptDΔ330-352突变株(M.Braun and T.J.Silhavy著，(2002年),Mol Microbiol.,45(5):1289-302)从论文作者处获得。质粒导入和培养通过与实施例5同样的操作来实施。对于所述突变株、以及作为对照的MC4100株(下文中称为“WT”)实施了同样的操作。
将得到的培养液以使得OD为5.0的方式进行制备，将1mL的制备液进行离心分离来集菌，通过实施例1-3的方法并使用QIAprep Spin Mini prepk it(QIAGEN)实施了质粒提取。在表14中表示在各个条件下提取的质粒DNA(m g/L)和将在x1条件下回收的质粒DNA设为100％的情况下的提取效率。
[表14]
将在x1条件下回收的质粒DNA设为100％，比较x1/4条件下回收的质粒DNA时，在WT的情况下显示为78％的提取效率。另一方面，在LptDΔ330-352的情况下，为95％，显示与WT相比较高的提取效率。这表示了所述突变株是一种从菌体内容易回收质粒DNA的菌株。
[实施例9]将大肠杆菌DH10B株作为宿主的L,D-转肽酶(Ldt)突变株和O mpA+Ldt二重突变株的研究
对于大肠杆菌DH10B株，通过使用了Lambda-Red系统的dsDNA重组，制备了与L,D-转肽酶相关的突变株(ΔerfK、ΔybiS、ΔycfS、ΔerfKΔybiS)、以及OmpA R256E与Ldt的二重和多重突变株(OmpA R256EΔerfK、OmpA R256EΔybiS、OmpA R256EΔycfS、OmpA R256EΔerfKΔybiS)。质粒导入、培养和质粒提取方法通过与实施例8同样的操作来实施。对于所述突变株、以及作为对照的DH10B株(下文中称为“WT”)实施了同样的操作。在表15中表示在各个条件下提取的质粒DNA(mg/L)和将x1条件下回收的质粒DNA设为100％的情况下的提取效率。
[表15]
将在x1条件下回收的质粒DNA设为100％，比较x1/4条件下回收的质粒DNA时，在WT的情况下显示为49％的提取效率。另一方面，在ΔerfK的情况下为62％、在ΔybiS的情况下为53％、在ΔycfS的情况下为52％、在ΔerfKΔybiS的情况下为69％、在OmpA R256EΔerfK的情况下为60％、在O mpA R256EΔybiS的情况下为68％、在OmpA R256EΔycfS的情况下为67％、在OmpA R256EΔerfKΔybiS的情况下为64％，显示了与WT相比较高的提取效率。ΔybiS和ΔycfS通过与OmpAR256E、ΔerfK组合突变，而提取效率提高，表示了由于突变的组合的协同效应。并且，在ΔycfS、OmpAR256EΔybiS、OmpAR256EΔycfS、OmpAR256EΔerfKΔybiS中，与WT相比质粒DNA生成量提高了。
[实施例10]将大肠杆菌DH10B株作为宿主的LppΔK58突变株的研究
对于大肠杆菌DH10B株，通过使用了Lambda-Red系统的dsDNA重组，制备了LppΔK58。质粒导入、培养和质粒提取方法通过与实施例6同样的操作来实施。对于所述突变株、以及作为对照的DH10B株(下文中称为“WT”)实施了同样的操作。在表16中表示在各个条件下提取的质粒DNA(mg/L)和将x1条件下回收的质粒DNA设为100％的情况下的提取效率。
[表16]
将在x1条件下回收的质粒DNA设为100％，比较x2条件下回收的质粒DNA时，在WT的情况下显示为74％的提取效率。另一方面，在LppΔK58的情况下，为92％，显示了与WT相比较高的提取效率。这表示了所述突变株是一种从菌体内容易回收质粒DNA的菌株。
[实施例11]将大肠杆菌DH10B株作为宿主的L,D-转肽酶(Ldt)突变株和P al+Ldt二重突变株的研究
对于大肠杆菌DH10B株，通过使用了Lambda-Red系统的dsDNA重组，制备了ΔybiSΔycfS、ΔerfKΔybiSΔycfS、Pal-s-L14N、Pal-s-L14NΔerfK、Pal-s-L14NΔybiS、Pal-s-L14NΔycfS、PalΔ19-43、PalΔ19-43ΔerfK、PalΔ19-43ΔybiS和PalΔ19-43ΔycfS。质粒导入、培养和质粒提取方法通过与实施例6同样的操作来实施。对于所述突变株、以及作为对照的DH10B株(下文中称为“WT”)实施了同样的操作。在表16中表示在各个条件下提取的质粒DNA(mg/L)和将x1条件下回收的质粒DNA设为100％的情况下的提取效率。
[表17]
将在x1条件下回收的质粒DNA设为100％，比较x2条件下回收的质粒DNA时，在WT的情况下为74％的提取效率。另一方面，在ΔybiSΔycfS的情况下为64％、在ΔerfKΔybiSΔycfS的情况下为99％、在Pal-s-L14N的情况下为80％、在Pal-s-L14NΔerfK的情况下为77％、在Pal-s-L14NΔybiS的情况下为70％、在Pal-s-L14NΔycfS的情况下为84％、在PalΔ19-43的情况下为71％、在PalΔ19-43ΔerfK的情况下为71％、在PalΔ19-43ΔybiS的情况下为78％、在PalΔ19-43ΔycfS的情况下为81％，显示与WT相比较高的提取效率。证实了在Pal-s-L14NΔycfS、PalΔ19-43ΔybiS和PalΔ19-43Δy cfS的情况下特别是Pal与Ldt的组合对于提取效率的协同效应。并且，在全部的突变株中，与WT相比质粒DNA生成量提高了。
[表18]
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本说明书引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用的方式原样并入本文。
序列表
<110> 株式会社钟化
卡尼卡欧洲遗传有限责任公司
天主教鲁汶大学
<120> 使用了大肠杆菌的质粒DNA的制造方法
<130> B210340
<150> JP 2021-117545
<151> 2021-07-16
<160> 83
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 459
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 1
tgttcttcca acaagaacgc cagcaatgac ggcagcgaag gcatgctggg tgccggcact 60
ggtatggatg cgaacggcgg caacggcaac atgtcttccg aagagcaggc tcgtctgcaa 120
atgcaacagc tgcagcagaa caacatcgtt tacttcgatc tggacaagta cgatatccgt 180
tctgacttcg ctcaaatgct ggatgcacat gcaaacttcc tgcgtagcaa cccgtcttac 240
aaagtcaccg tagaaggtca cgcggacgaa cgtggtactc cggaatacaa catctccctg 300
ggtgaacgtc gtgcgaacgc cgttaagatg tacctgcagg gtaaaggcgt ttctgcagac 360
cagatctcca tcgtttctta cggtaaagaa aaacctgcag tactgggtca tgacgaagcg 420
gcatactcca aaaaccgtcg tgcggtactg gtttactaa 459
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 2
atgcaactga acaaagtgct gaaagggctg atgattgctc tgcctgttat ggcaattgcg 60
gca 63
<210> 3
<211> 177
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 3
tgctccagca acgctaaaat cgatcagctg tcttctgacg ttcagactct gaacgctaaa 60
gttgaccagc tgagcaacga cgtgaacgca atgcgttccg acgttcaggc tgctaaagat 120
gacgcagctc gtgctaacca gcgtctggac aacatggcta ctaaataccg caagtaa 177
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 4
atgaaagcta ctaaactggt actgggcgcg gtaatcctgg gttctactct gctggcaggt 60
<210> 5
<211> 978
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 5
gctccgaaag ataacacctg gtacactggt gctaaactgg gctggtccca gtaccatgac 60
actggtttca tcaacaacaa tggcccgacc catgaaaacc aactgggcgc tggtgctttt 120
ggtggttacc aggttaaccc gtatgttggc tttgaaatgg gttacgactg gttaggtcgt 180
atgccgtaca aaggcagcgt tgaaaacggt gcatacaaag ctcagggcgt tcaactgacc 240
gctaaactgg gttacccaat cactgacgac ctggacatct acactcgtct gggtggcatg 300
gtatggcgtg cagacactaa atccaacgtt tatggtaaaa accacgacac cggcgtttct 360
ccggtcttcg ctggcggtgt tgagtacgcg atcactcctg aaatcgctac ccgtctggaa 420
taccagtgga ccaacaacat cggtgacgca cacaccatcg gcactcgtcc ggacaacggc 480
atgctgagcc tgggtgtttc ctaccgtttc ggtcagggcg aagcagctcc agtagttgct 540
ccggctccag ctccggcacc ggaagtacag accaagcact tcactctgaa gtctgacgtt 600
ctgttcaact tcaacaaagc aaccctgaaa ccggaaggtc aggctgctct ggatcagctg 660
tacagccagc tgagcaacct ggatccgaaa gacggttccg tagttgttct gggttacacc 720
gaccgcatcg gttctgacgc ttacaaccag ggtctgtccg agcgccgtgc tcagtctgtt 780
gttgattacc tgatctccaa aggtatcccg gcagacaaga tctccgcacg tggtatgggc 840
gaatccaacc cggttactgg caacacctgt gacaacgtga aacagcgtgc tgcactgatc 900
gactgcctgg ctccggatcg tcgcgtagag atcgaagtta aaggtatcaa agacgttgta 960
actcagccgc aggcttaa 978
<210> 6
<211> 63
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 6
atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60
gcc 63
<210> 7
<211> 1266
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 7
gtgtcaaagg caaccgaaca aaacgacaag ctcaagcggg cgataattat ttcagcagtg 60
ctgcatgtca tcttatttgc ggcgctgatc tggagttcgt tcgatgagaa tatagaagct 120
tcagccggag gcggcggtgg ttcgtccatc gacgctgtca tggttgattc aggtgcggta 180
gttgagcagt acaaacgcat gcaaagccag gaatcaagcg cgaagcgttc tgatgaacag 240
cgcaagatga aggaacagca ggctgctgaa gaactgcgtg agaaacaagc ggctgaacag 300
gaacgcctga agcaacttga gaaagagcgg ttagcggctc aggagcagaa aaagcaggct 360
gaagaagccg caaaacaggc cgagttaaag cagaagcaag ctgaagaggc ggcagcgaaa 420
gcggcggcag atgctaaagc gaaggccgaa gcagatgcta aagctgcgga agaagcagcg 480
aagaaagcgg ctgcagacgc aaagaaaaaa gcagaagcag aagccgccaa agccgcagcc 540
gaagcgcaga aaaaagccga ggcagccgct gcggcactga agaagaaagc ggaagcggca 600
gaagcagctg cagctgaagc aagaaagaaa gcggcaactg aagctgctga aaaagccaaa 660
gcagaagctg agaagaaagc ggctgctgaa aaggctgcag ctgataagaa agcggcagca 720
gagaaagctg cagccgacaa aaaagcagca gaaaaagcgg ctgctgaaaa ggcagcagct 780
gataagaaag cagcggcaga aaaagccgcc gcagacaaaa aagcggcagc ggcaaaagct 840
gcagctgaaa aagccgctgc agcaaaagcg gccgcagagg cagatgatat tttcggtgag 900
ctaagctctg gtaagaatgc accgaaaacg gggggagggg cgaaagggaa caatgcttcg 960
cctgccggga gtggtaatac taaaaacaat ggcgcatcag gggccgatat caataactat 1020
gccgggcaga ttaaatctgc tatcgaaagt aagttctatg acgcatcgtc ctatgcaggc 1080
aaaacctgta cgctgcgcat aaaactggca cccgatggta tgttactgga tatcaaacct 1140
gaaggtggcg atcccgcact ttgtcaggct gcgttggcag cagctaaact tgcgaagatc 1200
ccgaaaccac caagccaggc agtatatgaa gtgttcaaaa acgcgccatt ggacttcaaa 1260
ccgtaa 1266
<210> 8
<211> 1230
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 8
gaagtccgca ttgtgatcga cagcggtgta gattccggtc gtcctattgg tgttgttcct 60
ttccagtggg cggggcctgg tgcggcacct gaagatattg gcggcatcgt tgctgctgac 120
ttgcgtaaca gcggtaaatt taatccgtta gatcgcgctc gtctgccaca gcagccgggt 180
agtgcgcagg aagtacaacc agctgcatgg tccgcactgg gcattgacgc tgtagttgtc 240
ggtcaggtca ctccgaatcc ggatggttct tacaatgttg cttatcaact tgttgacact 300
ggcggcgcac cgggtactgt acttgctcag aactcgtaca aagtgaacaa gcagtggctg 360
cgttatgctg gtcataccgc cagtgatgaa gtgtttgaaa aactgaccgg cattaaaggt 420
gcgttccgta ctcgtattgc ctacgttgtt cagaccaacg gcggtcagtt cccgtatgaa 480
ctgcgcgtat ctgactatga cggttacaac cagtttgtcg ttcaccgttc accgcagccg 540
ctgatgtctc cggcgtggtc accagacggt tctaaactgg cttatgtgac cttcgaaagc 600
ggtcgttccg cgctggttat tcagacgctg gcaaatggcg ctgtacgtca ggtggcttca 660
ttcccgcgtc acaacggtgc acctgcattc tcgccagacg gcagcaaact ggcattcgcc 720
ttgtcgaaaa ccggtagtct gaacctgtac gtaatggatt tggcttctgg tcagatccgc 780
caggtgactg atggtcgcag taacaatacc gaaccgacct ggttcccgga tagccagaac 840
ctggcattta cttctgacca ggccggtcgt ccgcaggttt ataaagtgaa tatcaacggc 900
ggtgcgccac aacgtattac ctgggaaggt tcgcagaacc aggatgcgga tgtcagcagc 960
gacggtaaat ttatggtaat ggtcagctcc aatggtgggc agcagcacat tgccaaacaa 1020
gatctggcaa cgggaggcgt acaagttctg tcgtccacgt tcctggatga aacgccaagt 1080
ctggcaccta acggcactat ggtaatctac agctcttctc aggggatggg atccgtgctg 1140
aatttggttt ctacagatgg gcgtttcaaa gcgcgtcttc cggcaactga tggacaggtc 1200
aaattccctg cctggtcgcc gtatctgtga 1230
<210> 9
<211> 63
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 9
atgaagcagg cattacgagt agcatttggt tttctcatac tgtgggcatc agttctgcat 60
gct 63
<210> 10
<211> 489
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 10
tgtagtgcaa ataacaccgc aaagaatatg catcctgaga cacgtgcagt gggtagtgaa 60
acatcatcac tgcaagcttc tcaggatgaa tttgaaaacc tggttcgtaa tgtcgacgta 120
aaatcgcgaa ttatggatca gtatgctgac tggaaaggcg tacgttatcg tctgggcggc 180
agcactaaaa aaggtatcga ttgttctggt ttcgtacagc gtacattccg tgagcaattt 240
ggcttagaac ttccgcgttc gacttacgaa cagcaggaaa tgggtaaatc tgtttcccgc 300
agtaatttgc gtacgggtga tttagttctg ttccgtgccg gttcaacggg acgccatgtc 360
ggtatttata tcggcaacaa tcagtttgtc catgcttcca ccagcagtgg tgttattatt 420
tccagcatga atgaaccgta ctggaagaag cgttacaacg aagcacgccg ggttctcagc 480
cgcagctaa 489
<210> 11
<211> 78
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 11
atggtcaaat ctcaaccgat tttgagatat atcttgcgcg ggattcccgc gattgcagta 60
gcggttctgc tttctgca 78
<210> 12
<211> 831
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 12
tgcagtaata cttcctggcg taaaagtgaa gtcctcgcgg taccattgca accgacttta 60
cagcaggaag tgattctggc acgtatggaa caaatccttg ccagtcgggc tttaaccgat 120
gacgaacgcg cacagctttt atatgagcgc ggagtgttgt atgatagtct cggtctgagg 180
gcattagcgc gtaacgattt ttcgcaagcg ctggcaatcc gaccggatat gcctgaagta 240
ttcaattact taggcatata tttaacgcag gcaggcaatt ttgatgctgc ctatgaagcg 300
tttgattctg tacttgagct tgatccaact tacaactacg cgcacttgaa tcgcgggatc 360
gcattatatt acggcggtcg tgacaagtta gcgcaagatg atctgctggc gttttatcaa 420
gacgatccca atgatccttt ccgtagtctg tggctttatc tcgccgagca gaagctcgat 480
gagaagcagg ctaaagaagt gttgaaacag cacttcgaaa aatcggataa ggaacagtgg 540
ggatggaaca ttgtcgagtt ctacctgggc aacattagcg aacaaacgtt aatggaaagg 600
ctcaaggcgg acgcaacgga taacacctcg ctcgctgagc atctcagtga aaccaacttc 660
tatttaggta agtactacct aagtctgggg gatttggaca gcgccacggc actgttcaaa 720
ctggcggttg ccaacaacgt tcataacttt gttgagcacc gatacgcatt gttggaatta 780
tcgctcctgg gccaggacca agatgacctg gcagaatcgg accagcaata g 831
<210> 13
<211> 54
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 13
atgaagcctt ttttgcgctg gtgtttcgtt gcgacagcac ttacgcttgc agga 54
<210> 14
<211> 717
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 14
atgcagaccc cgcacattct tatcgttgaa gacgagttgg taacacgcaa cacgttgaaa 60
agtattttcg aagcggaagg ctatgatgtt ttcgaagcga cagatggcgc ggaaatgcat 120
cagatcctct ctgaatatga catcaacctg gtgatcatgg atatcaatct gccgggtaag 180
aacggtcttc tgttagcgcg tgaactgcgc gagcaggcga atgttgcgtt gatgttcctg 240
actggccgtg acaacgaagt cgataaaatt ctcggcctcg aaatcggtgc agatgactac 300
atcaccaaac cgttcaaccc gcgtgaactg acgattcgtg cacgcaacct actgtcccgt 360
accatgaatc tgggtactgt cagcgaagaa cgtcgtagcg ttgaaagcta caagttcaat 420
ggttgggaac tggacatcaa cagccgttcg ttgatcggcc ctgatggcga gcagtacaag 480
ctgccgcgca gcgagttccg cgccatgctt cacttctgtg aaaacccagg caaaattcag 540
tcccgtgctg aactgctgaa gaaaatgacc ggccgtgagc tgaaaccgca cgaccgtact 600
gtagacgtga cgatccgccg tattcgtaaa catttcgaat ctacgccgga tacgccggaa 660
atcatcgcca ccattcacgg tgaaggttat cgcttctgcg gtgatctgga agattaa 717
<210> 15
<211> 681
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 15
tgctcggggt caaaggaaga agtacctgat aatccgccaa atgaaattta cgcgactgca 60
caacaaaagc tgcaggacgg taactggaga caggcaataa cgcaactgga agcgttagat 120
aatcgctatc cgtttggtcc gtattcgcag caggtgcagc tggatctcat ctacgcctac 180
tataaaaacg ccgatttgcc gttagcacag gctgccatcg atcgttttat tcgccttaac 240
ccgacccatc cgaatatcga ttatgtcatg tacatgcgtg gcctgaccaa tatggcgctg 300
gatgacagtg cgctgcaagg gttctttggc gtcgatcgta gcgatcgcga tcctcaacat 360
gcacgagctg cgtttagtga cttttccaaa ctggtgcgcg gctatccgaa cagtcagtac 420
accaccgatg ccaccaaacg tctggtattc ctgaaagatc gtctggcgaa atatgaatac 480
tccgtggccg agtactatac agaacgtggc gcatgggttg ccgtcgttaa ccgcgtagaa 540
ggcatgttgc gcgactaccc ggatacccag gctacgcgtg atgcgctgcc gctgatggaa 600
aatgcatacc gtcagatgca gatgaatgcg caagctgaaa aagtagcgaa aatcatcgcc 660
gcaaacagca gcaatacata a 681
<210> 16
<211> 57
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 16
atgacgcgca tgaaatatct ggtggcagcc gccacactaa gcctgttttt ggcgggt 57
<210> 17
<211> 876
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 17
tgtaattctg cgctgttaga tcccaaagga cagattggtc tggagcaacg ttcactgata 60
ctgacggcat ttggcctgat gttgattgtc gttattcccg caatcttgat ggctgttggt 120
ttcgcctgga agtaccgtgc gagcaataaa gatgctaagt acagcccgaa ctggtcacac 180
tccaataaag tggaagctgt ggtctggacg gtacctatct taatcatcat cttccttgca 240
gtactgacct ggaaaaccac tcacgctctt gagcctagca agccgctggc acacgacgag 300
aagcccatta ccatcgaagt ggtttccatg gactggaaat ggttcttcat ctacccggaa 360
cagggcattg ctaccgtgaa tgaaatcgct ttcccggcga acactccggt gtacttcaaa 420
gtgacctcca actccgtgat gaactccttc ttcattccgc gtctgggtag ccagatttat 480
gccatggccg gtatgcagac tcgcctgcat ctgatcgcca acgaacccgg cacttatgac 540
ggtatctccg ccagctacag cggcccgggc ttctcaggca tgaagttcaa agctattgca 600
acaccggatc gcgccgcatt cgaccagtgg gtcgcaaaag cgaagcagtc gccgaacacc 660
atgtctgaca tggctgcgtt cgaaaaactg gccgcgccta gcgaatacaa ccaggtggaa 720
tatttctcca acgtgaaacc agacttgttt gccgatgtaa ttaacaagtt tatggctcac 780
ggtaagagca tggacatgac ccagccagaa ggtgagcaca gcgcacacga aggtatggaa 840
ggcatggaca tgagccacgc ggaatccgcc cattaa 876
<210> 18
<211> 72
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 18
atgagactca ggaaatacaa taaaagtttg ggatggttgt cattatttgc aggcactgta 60
ttgctcagtg gc 72
<210> 19
<211> 1524
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 19
aaaactctgg tttattgctc agaaggatct ccggaagggt ttaacccgca gctgtttacc 60
tccggcacca cctatgacgc ctcttccgtc ccgctttata accgtctggt tgaatttaaa 120
atcggcacca ccgaagtgat cccgggcctc gctgaaaagt gggaagtcag cgaagacggt 180
aaaacctata ccttccatct gcgtaaaggt gtgaagtggc acgacaataa agaattcaaa 240
ccgacgcgtg aactgaacgc cgatgatgtg gtgttctcgt tcgatcgtca gaaaaacgcg 300
caaaacccgt accataaagt ttctggcggc agctacgaat acttcgaagg catgggcttg 360
ccagagctga tcagtgaagt gaaaaaggtg gacgacaaca ccgttcagtt tgtgctgact 420
cgcccggaag cgccgttcct cgctgacctg gcaatggact tcgcctctat tctgtcaaaa 480
gaatatgctg atgcgatgat gaaagccggt acaccggaaa aactggacct caacccaatc 540
ggaaccggtc cgttccagtt acagcagtat caaaaagatt cccgtatccg ctacaaagcg 600
tttgatggct actggggcac caaaccgcag atcgatacgc tggttttctc tattacccct 660
gacgcttccg tgcgttacgc gaaattgcag aagaatgaat gccaggtgat gccgtacccg 720
aacccggcag atatcgctcg catgaagcag gataaatcca tcaatctgat ggaaatgccg 780
gggctgaacg tcggttatct ctcgtataac gtgcagaaaa aaccactcga tgacgtgaaa 840
gttcgccagg ctctgaccta cgcggtgaac aaagacgcga tcatcaaagc ggtttatcag 900
ggcgcgggcg tatcagcgaa aaacctgatc ccgccaacca tgtggggcta taacgacgac 960
gttcaggact acacctacga tcctgaaaaa gcgaaagcct tgctgaaaga agcgggtctg 1020
gaaaaaggtt tctccatcga cctgtgggcg atgccggtac aacgtccgta taacccgaac 1080
gctcgccgca tggcggagat gattcaggca gactgggcga aagtcggcgt gcaggccaaa 1140
attgtcacct acgaatgggg tgagtacctc aagcgtgcga aagatggcga gcaccagacg 1200
gtaatgatgg gctggactgg cgataacggg gatccggata acttcttcgc caccctgttc 1260
agctgcgccg cctctgaaca aggctccaac tactcaaaat ggtgctacaa accgtttgaa 1320
gatctgattc aaccggcgcg tgctaccgac gaccacaata aacgcgttga actgtacaaa 1380
caagcgcagg tggtgatgca cgatcaggct ccggcactga tcatcgctca ctccaccgtg 1440
tttgaaccgg tacgtaaaga agttaaaggc tatgtggttg atccattagg caaacatcac 1500
ttcgaaaacg tctctatcga ataa 1524
<210> 20
<211> 84
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 20
atgcgtattt ccttgaaaaa gtcagggatg ctgaagcttg gtctcagcct ggtggctatg 60
accgtcgcag caagtgttca ggct 84
<210> 21
<211> 84
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 21
tgcaacacca cgcgtggcgt tggtgaagac atttctgatg gcggtaacgc gatttctggc 60
gcagcaacga aagcgcagca ataa 84
<210> 22
<211> 63
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 22
atggtgaaga agacaattgc agcgatcttt tctgttctgg tgctttcaac agtattaact 60
gcc 63
<210> 23
<211> 2553
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 23
gtgaagttcg taaagtattt tttgatcctt gcagtctgtt gcattctgct gggagcaggc 60
tcgatttatg gcctataccg ctacatcgag ccacaactgc cggatgtggc gacattaaaa 120
gatgttcgcc tgcaaattcc gatgcagatt tacagcgccg atggcgagct gattgctcaa 180
tacggtgaga aacgtcgtat tccggttacg ttggatcaaa tcccaccgga gatggtgaaa 240
gcctttatcg cgacagaaga cagccgcttc tacgagcatc acggcgttga cccggtgggg 300
atcttccgtg cagcaagcgt ggcgctgttc tccggtcacg cgtcacaagg ggcaagtacc 360
attacccagc agctggcgag aaacttcttc ctcagtccag aacgcacgct gatgcgtaag 420
attaaggaag tcttcctcgc gattcgcatt gaacagctgc tgacgaaaga cgagatcctc 480
gagctttatc tgaacaagat ttaccttggt taccgcgcct atggtgtcgg tgctgcggca 540
caagtctatt tcggaaaaac ggtcgaccaa ctgacgctga acgaaatggc ggtgatagcc 600
gggctgccga aagcgccttc caccttcaac ccgctctact cgatggatcg tgccgtcgcg 660
cggcgtaacg tcgtgctgtc gcggatgctg gatgaagggt atatcaccca acaacagttc 720
gatcagacac gcactgaggc gattaacgct aactatcacg cgccggagat tgctttctct 780
gcgccgtacc tgagcgaaat ggtgcgccag gagatgtata accgttatgg cgaaagtgcc 840
tatgaagacg gttatcgcat ttacaccacc atcacccgca aagtgcagca ggccgcgcag 900
caggcggtac gtaataacgt gctggactac gacatgcgcc acggctatcg cggcccggca 960
aatgtgctgt ggaaagtggg cgagtcggcg tgggataaca acaagattac cgatacgctg 1020
aaggcgctgc caacctatgg tccgctgctg cctgccgcag tcaccagcgc caatcctcag 1080
caagcgacgg cgatgctggc ggacgggtcg accgtcgcat tgagtatgga aggcgttcgc 1140
tgggcgcgtc cttaccgttc ggatactcag caaggaccga cgccgcgtaa agtgaccgat 1200
gttctgcaaa cgggtcagca aatctgggtt cgtcaggttg gcgatgcatg gtggctggca 1260
caagtgccgg aagtgaactc ggcgctggtg tcgatcaatc cgcaaaacgg tgccgttatg 1320
gcgctggtcg gtggctttga tttcaatcag agcaagttta accgcgccac ccaggcactg 1380
cgtcaggtgg gttccaacat caaaccgttc ctctacaccg cggcgatgga taaaggtctg 1440
acgctggcaa gtatgttgaa cgatgtgcca atttctcgct gggatgcaag tgccggttct 1500
gactggcagc cgaagaactc accaccgcag tatgctggtc caattcgctt acgtcagggg 1560
ctgggtcagt cgaaaaacgt ggtgatggta cgcgcaatgc gggcgatggg cgtcgactac 1620
gctgcagaat atctgcaacg cttcggcttc ccggcacaaa acattgtcca caccgaatcg 1680
ctggcgctgg gttcagcgtc cttcacccca atgcaggtgg cgcgcggcta cgcggtcatg 1740
gcgaacggcg gcttcctggt ggacccgtgg tttatcagca aaattgaaaa cgatcagggc 1800
ggcgtgattt tcgaagcgaa accgaaagta gcctgcccgg aatgcgatat tccggtgatt 1860
tacggtgata cgcagaaatc gaacgtgctg gaaaataacg atgttgaaga tgtcgctatc 1920
tcccgcgagc agcagaatgt ttctgtacca atgccgcagc tggagcaggc aaatcaggcg 1980
ttagtggcga agactggcgc gcaggagtac gcaccgcacg tcatcaacac tccgctggca 2040
ttcctgatta agagtgcttt gaacaccaat atctttggtg agccaggctg gcagggtact 2100
ggctggcgtg caggtcgtga tttgcagcgt cgcgatatcg gcgggaaaac cgggaccact 2160
aacagttcga aagatgcgtg gttctcgggt tacggtccgg gcgttgtgac ctcggtctgg 2220
attggctttg atgatcaccg tcgtaatctc ggtcatacaa cggcttccgg agcgattaaa 2280
gatcagatct caggttacga aggcggtgcc aagagtgccc agcctgcatg ggacgcttat 2340
atgaaagccg ttcttgaagg tgtgccggag cagccgctga cgccgccacc gggtattgtg 2400
acggtgaata tcgatcgcag caccgggcag ttagctaatg gtggcaacag ccgcgaagag 2460
tatttcatcg aaggtacgca gccgacacaa caggcagtgc acgaggtggg aacgaccatt 2520
atcgataatg gcgaggcaca ggaattgttc tga 2553
<210> 24
<211> 2535
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 24
atggccggga atgaccgcga gccaattgga cgcaaaggga aaccgacgcg tccggtcaaa 60
caaaaggtaa gccgtcgtcg ttacgaagat gacgatgatt acgacgatta tgatgactat 120
gaggatgaag aaccgatgcc gcgcaaaggt aagggcaaag gcaaagggcg taagcctcgt 180
ggcaaacgcg gctggctatg gctactgcta aaactggcta tcgtttttgc cgtgctgatc 240
gccatttacg gcgtttatct cgatcaaaaa attcgtagcc gtattgatgg caaggtctgg 300
caactgcctg cggcagttta tggccgaatg gtcaatcttg agccagacat gaccatcagc 360
aagaacgaga tggtgaagct gctggaggcg acccagtatc gtcaggtgtc gaaaatgacc 420
cgtcctggcg aatttaccgt gcaggccaac agcattgaga tgattcgccg tccgtttgat 480
ttcccggaca gtaaagaagg acaggtgcgc gcgcgtctga cctttgatgg cgatcatctg 540
gcgacgatcg tcaatatgga gaacaaccgt cagttcggtt tcttccgtct tgatccgcgt 600
ctgatcacca tgatctcttc gccaaacggt gagcagcgtc tgtttgtgcc gcgcagtggt 660
ttcccggatt tgctggtgga tactttgctg gcgacagaag accgtcattt ttacgagcat 720
gatggaatca gtctctactc aatcggacgt gcggtgctgg caaacctgac cgccggacgc 780
acggtacagg gtgcgagtac gctgacgcaa cagctggtga aaaacctgtt cctctccagc 840
gagcgttctt actggcgtaa agcgaacgaa gcttacatgg cgctgatcat ggacgcgcgt 900
tacagcaaag accgtattct tgagctgtat atgaacgagg tgtatctcgg tcagagcggc 960
gacaacgaaa tccgcggctt cccgctggca agcttgtatt actttggtcg cccggtagaa 1020
gagctaagcc tcgaccagca ggcgctgtta gtcggtatgg tgaaaggggc gtccatctac 1080
aacccgtggc gtaacccaaa actggcgctg gagcgacgta atctggtgct gcgtctgctg 1140
caacagcaac agattattga tcaagaactc tatgacatgt tgagtgcccg tccgctgggg 1200
gttcagccgc gcggtggggt gatctctcct cagccagcct ttatgcaact ggtgcgtcag 1260
gagctgcagg caaaactggg cgataaggta aaagatctct ccggcgtgaa gatcttcact 1320
acctttgact cggtggccca ggacgcggca gaaaaagccg ccgtggaagg cattccggca 1380
ctgaagaaac agcgtaagtt gagcgatctt gaaactgcga ttgtggtcgt cgaccgcttt 1440
agtggtgaag ttcgtgcgat ggtcggaggt tctgagccgc agtttgcggg ctacaaccgt 1500
gcgatgcagg cgcgtcgttc gattggttcc cttgcaaaac cagcgactta tctgacggcc 1560
ttaagccagc cgaaaatcta tcgtctgaat acgtggattg cggatgcgcc aattgcgctg 1620
cgtcagccga atggccaggt ctggtcaccg cagaatgatg accgtcgtta tagcgaaagc 1680
ggcagagtga tgctggtgga tgcgttgacc cgttcgatga acgtgccgac ggtaaatctg 1740
gggatggcgc tggggctgcc tgcggttacg gagacctgga ttaaactggg cgtaccgaaa 1800
gatcagttgc atccggttcc ggcaatgctg ctgggggcgt tgaacttaac gccaatcgaa 1860
gtggcgcagg cattccagac catcgccagc ggtggtaacc gtgcaccgct ttctgcgctg 1920
cgttcggtaa tcgcggaaga tggcaaagtg ctgtatcaga gcttcccgca ggcggaacgc 1980
gctgttccgg cgcaggcggc gtatctgaca ctatggacca tgcagcaggt ggtacaacgc 2040
ggtacgggtc gtcagcttgg ggcgaaatac ccgaacctgc atctggcagg gaaaacaggg 2100
actaccaaca ataacgtaga tacctggttt gcgggcattg acggcagcac ggtgaccatc 2160
acctgggtcg gccgtgataa caaccagccg accaaactgt atggtgccag cggggcaatg 2220
tcgatttatc agcgttatct ggctaaccag acgccaacgc cgctgaatct tgttccgcca 2280
gaagatattg cagatatggg cgtggactac gacggcaact ttgtttgcag cggtggcatg 2340
cgtatcttgc cggtctggac cagcgatccg caatcgctgt gccagcagag cgagatgcag 2400
cagcagccgt caggcaatcc gtttgatcag tcttctcagc cgcagcaaca gccgcaacag 2460
caacctgctc agcaagagca gaaagacagc gacggtgtag ccggttggat caaggatatg 2520
tttggtagta attaa 2535
<210> 25
<211> 1554
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 25
gctgatgtac ccgcaggcgt cacactggcg gaaaaacaaa cactggtacg taacaatggt 60
tcagaagttc agtcattaga tccgcacaaa attgaaggtg ttccggagtc taatatcagc 120
cgagacctgt ttgaaggctt actggtcagc gatcttgacg gtcatccagc acctggcgtc 180
gctgaatcct gggataataa agacgcgaaa gtctggacct tccatttgcg taaagatgcg 240
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gttgatccga acactgcttc tccgtatgcc agttatctgc aatatgggca tatcgccggt 360
attgatgaaa ttcttgaagg gaaaaaaccg attaccgatc tcggcgtgaa agctattgat 420
gatcacacat tagaagtcac cttaagtgaa cccgttccgt acttctataa attacttgtt 480
cacccatcaa cttcaccggt gccaaaagcc gctatcgaga aattcggcga aaaatggacc 540
cagcctggta atatcgtcac caacggtgcc tataccttaa aagattgggt cgtaaacgaa 600
cgaatcgttc ttgaacgcag cccgacctac tggaacaacg cgaaaaccgt tattaaccag 660
gtaacctatt tgcctattgc ttctgaagtt accgatgtca accgctaccg tagtggtgaa 720
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ttgtggaaga aaaacattgg tgtaaacgtc aaactggtta accaggagtg gaaaacgttc 1200
ctcgacaccc gtcaccaggg tacttttgat gtggcccgtg caggctggtg tgctgactac 1260
aacgaaccaa cttccttcct gaacaccatg ctttcgaaca gctcgatgaa taccgcgcat 1320
tataagagcc cggcctttga cagcattatg gcggaaacgc tgaaagtgac tgacgaggcg 1380
cagcgcacag ctctgtacac taaagcagaa caacagctgg ataaggattc ggccattgtt 1440
cctgtttatt actacgtgaa tgcgcgtctg gtgaaaccgt gggttggtgg ctataccggc 1500
aaagatccgc tggataatac ctatacccgg aatatgtaca ttgtgaagca ctaa 1554
<210> 26
<211> 78
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 26
atgaccaaca tcaccaagag aagtttagta gcagctggcg ttctggctgc gctaatggca 60
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 27
tgtgttaata acgacaccct gtcaggggat gtttataccg cttctgaagc gaaacaagta 60
cagaatgtca gctatggcac catcgttaac gtacgtccgg tacagattca gggcggtgat 120
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 28
atgattaaac gcgtattggt tgtttcaatg gtaggtctgt ctcttgtcgg t 51
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 29
gtgactgaca tgaatatcct tgatttgttc ctgaaggcta gccttctggt taaacttatc 60
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attcttaacg cagcggcgcg cgaagccgaa gcgtttgaag ataaattctg gtctggaatc 180
gaactctctc gcctctatca agagagccag gggaaacggg ataatctgac tggttcggaa 240
caaatctttt acagcgggtt caaagagttt gtgcgcctgc atcgtgccaa tagccatgcg 300
ccggaagccg tagtggaagg ggcgtcgcgt gctatgcgta tctccatgaa ccgtgaactt 360
gaaaatctgg aaacgcacat tccgttcctc ggtacggttg gctccatcag cccgtatatt 420
ggtctgtttg gtacggtctg ggggatcatg cacgccttta tcgccctcgg ggcggtaaaa 480
caagcaacac tgcaaatggt tgcgcccggt atcgcagaag cgttgattgc gactgcaatt 540
ggtctgtttg ccgctatccc ggcagttatg gcctacaacc gcctcaacca gcgcgtaaac 600
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<210> 30
<211> 429
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 30
atggccagag cgcgtggacg aggtcgtcgc gatctcaagt ccgaaatcaa cattgtaccg 60
ttgctggacg tactgctggt gctgttgctg atctttatgg cgacagcgcc catcatcacc 120
cagagcgtgg aggtcgatct gccagacgct actgaatcac aggcggtgag cagtaacgat 180
aatccgccag tgattgttga agtgtctggt attggtcagt acaccgtggt ggttgagaaa 240
gatcgcctgg agcgtttacc accagagcag gtggtggcgg aagtgtccag ccgtttcaag 300
gccaacccga aaacggtctt tctgatcggt ggcgcaaaag atgtgcctta cgatgaaata 360
attaaagcac tgaacttgtt acatagtgcg ggtgtgaaat cggttggttt aatgacgcag 420
cctatctaa 429
<210> 31
<211> 152
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 31
Cys Ser Ser Asn Lys Asn Ala Ser Asn Asp Gly Ser Glu Gly Met Leu
1 5 10 15
Gly Ala Gly Thr Gly Met Asp Ala Asn Gly Gly Asn Gly Asn Met Ser
20 25 30
Ser Glu Glu Gln Ala Arg Leu Gln Met Gln Gln Leu Gln Gln Asn Asn
35 40 45
Ile Val Tyr Phe Asp Leu Asp Lys Tyr Asp Ile Arg Ser Asp Phe Ala
50 55 60
Gln Met Leu Asp Ala His Ala Asn Phe Leu Arg Ser Asn Pro Ser Tyr
65 70 75 80
Lys Val Thr Val Glu Gly His Ala Asp Glu Arg Gly Thr Pro Glu Tyr
85 90 95
Asn Ile Ser Leu Gly Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val Lys Met Tyr Leu
100 105 110
Gln Gly Lys Gly Val Ser Ala Asp Gln Ile Ser Ile Val Ser Tyr Gly
115 120 125
Lys Glu Lys Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Lys
130 135 140
Asn Arg Arg Ala Val Leu Val Tyr
145 150
<210> 32
<211> 21
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 32
Met Gln Leu Asn Lys Val Leu Lys Gly Leu Met Ile Ala Leu Pro Val
1 5 10 15
Met Ala Ile Ala Ala
20
<210> 33
<211> 137
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 33
Cys Ser Ala Gly Thr Gly Met Asp Ala Asn Gly Gly Asn Gly Asn Met
1 5 10 15
Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Leu Gln Met Gln Gln Leu Gln Gln Asn
20 25 30
Asn Ile Val Tyr Phe Asp Leu Asp Lys Tyr Asp Ile Arg Ser Asp Phe
35 40 45
Ala Gln Met Leu Asp Ala His Ala Asn Phe Leu Arg Ser Asn Pro Ser
50 55 60
Tyr Lys Val Thr Val Glu Gly His Ala Asp Glu Arg Gly Thr Pro Glu
65 70 75 80
Tyr Asn Ile Ser Leu Gly Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val Lys Met Tyr
85 90 95
Leu Gln Gly Lys Gly Val Ser Ala Asp Gln Ile Ser Ile Val Ser Tyr
100 105 110
Gly Lys Glu Lys Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu Ala Ala Tyr Ser
115 120 125
Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Val Tyr
130 135
<210> 34
<211> 414
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 34
tgttctgccg gcactggtat ggatgcgaac ggcggcaacg gcaacatgtc ttccgaagag 60
caggctcgtc tgcaaatgca acagctgcag cagaacaaca tcgtttactt cgatctggac 120
aagtacgata tccgttctga cttcgctcaa atgctggatg cacatgcaaa cttcctgcgt 180
agcaacccgt cttacaaagt caccgtagaa ggtcacgcgg acgaacgtgg tactccggaa 240
tacaacatct ccctgggtga acgtcgtgcg aacgccgtta agatgtacct gcagggtaaa 300
ggcgtttctg cagaccagat ctccatcgtt tcttacggta aagaaaaacc tgcagtactg 360
ggtcatgacg aagcggcata ctccaaaaac cgtcgtgcgg tactggttta ctaa 414
<210> 35
<211> 127
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 35
Cys Ser Ser Asn Lys Asn Ala Ser Asn Asp Gly Ser Glu Gly Met Leu
1 5 10 15
Gly Ala Leu Gln Gln Asn Asn Ile Val Tyr Phe Asp Leu Asp Lys Tyr
20 25 30
Asp Ile Arg Ser Asp Phe Ala Gln Met Leu Asp Ala His Ala Asn Phe
35 40 45
Leu Arg Ser Asn Pro Ser Tyr Lys Val Thr Val Glu Gly His Ala Asp
50 55 60
Glu Arg Gly Thr Pro Glu Tyr Asn Ile Ser Leu Gly Glu Arg Arg Ala
65 70 75 80
Asn Ala Val Lys Met Tyr Leu Gln Gly Lys Gly Val Ser Ala Asp Gln
85 90 95
Ile Ser Ile Val Ser Tyr Gly Lys Glu Lys Pro Ala Val Leu Gly His
100 105 110
Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Val Tyr
115 120 125
<210> 36
<211> 384
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 36
tgttcttcca acaagaacgc cagcaatgac ggcagcgaag gcatgctggg tgccctgcag 60
cagaacaaca tcgtttactt cgatctggac aagtacgata tccgttctga cttcgctcaa 120
atgctggatg cacatgcaaa cttcctgcgt agcaacccgt cttacaaagt caccgtagaa 180
ggtcacgcgg acgaacgtgg tactccggaa tacaacatct ccctgggtga acgtcgtgcg 240
aacgccgtta agatgtacct gcagggtaaa ggcgtttctg cagaccagat ctccatcgtt 300
tcttacggta aagaaaaacc tgcagtactg ggtcatgacg aagcggcata ctccaaaaac 360
cgtcgtgcgg tactggttta ctaa 384
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<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 37
Cys Ser Ser Asn Lys Asn Ala Ser Asn Asp Gly Ser Glu Gly Met Leu
1 5 10 15
Gly Ala Gly Thr Gly Met Asp Ala Asn Gly Gly Asn Gly Asn Met Ser
20 25 30
Ser Glu Glu Gln Ala Arg Leu Gln Met Gln Gln Phe Ala Gln Met Leu
35 40 45
Asp Ala His Ala Asn Phe Leu Arg Ser Asn Pro Ser Tyr Lys Val Thr
50 55 60
Val Glu Gly His Ala Asp Glu Arg Gly Thr Pro Glu Tyr Asn Ile Ser
65 70 75 80
Leu Gly Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val Lys Met Tyr Leu Gln Gly Lys
85 90 95
Gly Val Ser Ala Asp Gln Ile Ser Ile Val Ser Tyr Gly Lys Glu Lys
100 105 110
Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Lys Asn Arg Arg
115 120 125
Ala Val Leu Val Tyr
130
<210> 38
<211> 402
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 38
tgttcttcca acaagaacgc cagcaatgac ggcagcgaag gcatgctggg tgccggcact 60
ggtatggatg cgaacggcgg caacggcaac atgtcttccg aagagcaggc tcgtctgcaa 120
atgcaacagt tcgctcaaat gctggatgca catgcaaact tcctgcgtag caacccgtct 180
tacaaagtca ccgtagaagg tcacgcggac gaacgtggta ctccggaata caacatctcc 240
ctgggtgaac gtcgtgcgaa cgccgttaag atgtacctgc agggtaaagg cgtttctgca 300
gaccagatct ccatcgtttc ttacggtaaa gaaaaacctg cagtactggg tcatgacgaa 360
gcggcatact ccaaaaaccg tcgtgcggta ctggtttact aa 402
<210> 39
<211> 120
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 39
Cys Ser Ser Asn Lys Asn Ala Ser Asn Asp Gly Ser Glu Gly Met Leu
1 5 10 15
Gly Ala Gly Thr Gly Met Asp Ala Asn Gly Gly Asn Gly Asn Met Ser
20 25 30
Ser Glu Glu Gln Ala Arg Leu Gln Met Gln Gln Leu Gln Gln Asn Asn
35 40 45
Ile Val Tyr Phe Asp Leu Asp Lys Tyr Asp Ile Arg Ser Pro Glu Tyr
50 55 60
Asn Ile Ser Leu Gly Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val Lys Met Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Gly Lys Gly Val Ser Ala Asp Gln Ile Ser Ile Val Ser Tyr Gly
85 90 95
Lys Glu Lys Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Lys
100 105 110
Asn Arg Arg Ala Val Leu Val Tyr
115 120
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 40
tgttcttcca acaagaacgc cagcaatgac ggcagcgaag gcatgctggg tgccggcact 60
ggtatggatg cgaacggcgg caacggcaac atgtcttccg aagagcaggc tcgtctgcaa 120
atgcaacagc tgcagcagaa caacatcgtt tacttcgatc tggacaagta cgatatccgt 180
tctccggaat acaacatctc cctgggtgaa cgtcgtgcga acgccgttaa gatgtacctg 240
cagggtaaag gcgtttctgc agaccagatc tccatcgttt cttacggtaa agaaaaacct 300
gcagtactgg gtcatgacga agcggcatac tccaaaaacc gtcgtgcggt actggtttac 360
taa 363
<210> 41
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<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 41
Cys Ser Ser Asn Lys Asn Ala Ser Asn Asp Gly Ser Glu Gly Met Leu
1 5 10 15
Gly Ala Gly Thr Gly Met Asp Ala Asn Gly Gly Asn Gly Asn Met Ser
20 25 30
Ser Glu Glu Gln Ala Arg Leu Gln Met Gln Gln Leu Gln Gln Asn Asn
35 40 45
Ile Val Tyr Phe Asp Leu Asp Lys Tyr Asp Ile Arg Ser Asp Phe Ala
50 55 60
Gln Met Leu Asp Ala His Ala Asn Phe Leu Arg Ser Asn Pro Ser Tyr
65 70 75 80
Lys Val Thr Val Glu Gly His Ala Asp Glu Arg Gly Thr Ile Ser Ile
85 90 95
Val Ser Tyr Gly Lys Glu Lys Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu Ala
100 105 110
Ala Tyr Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Val Tyr
115 120
<210> 42
<211> 375
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 42
tgttcttcca acaagaacgc cagcaatgac ggcagcgaag gcatgctggg tgccggcact 60
ggtatggatg cgaacggcgg caacggcaac atgtcttccg aagagcaggc tcgtctgcaa 120
atgcaacagc tgcagcagaa caacatcgtt tacttcgatc tggacaagta cgatatccgt 180
tctgacttcg ctcaaatgct ggatgcacat gcaaacttcc tgcgtagcaa cccgtcttac 240
aaagtcaccg tagaaggtca cgcggacgaa cgtggtacta tctccatcgt ttcttacggt 300
aaagaaaaac ctgcagtact gggtcatgac gaagcggcat actccaaaaa ccgtcgtgcg 360
gtactggttt actaa 375
<210> 43
<211> 122
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 43
Cys Ser Ser Asn Lys Asn Ala Ser Asn Asp Gly Ser Glu Gly Met Leu
1 5 10 15
Gly Ala Gly Thr Gly Met Asp Ala Asn Gly Gly Asn Gly Asn Met Ser
20 25 30
Ser Glu Glu Gln Ala Arg Leu Gln Met Gln Gln Leu Gln Gln Asn Asn
35 40 45
Ile Val Tyr Phe Asp Leu Asp Lys Tyr Asp Ile Arg Ser Asp Phe Ala
50 55 60
Gln Met Leu Asp Ala His Ala Asn Phe Leu Arg Ser Asn Pro Ser Tyr
65 70 75 80
Lys Val Thr Val Glu Gly His Ala Asp Glu Arg Gly Thr Pro Glu Tyr
85 90 95
Asn Ile Ser Leu Gly Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val Lys Met Tyr Leu
100 105 110
Gln Gly Lys Gly Val Ser Ala Asp Gln Ile
115 120
<210> 44
<211> 369
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 44
tgttcttcca acaagaacgc cagcaatgac ggcagcgaag gcatgctggg tgccggcact 60
ggtatggatg cgaacggcgg caacggcaac atgtcttccg aagagcaggc tcgtctgcaa 120
atgcaacagc tgcagcagaa caacatcgtt tacttcgatc tggacaagta cgatatccgt 180
tctgacttcg ctcaaatgct ggatgcacat gcaaacttcc tgcgtagcaa cccgtcttac 240
aaagtcaccg tagaaggtca cgcggacgaa cgtggtactc cggaatacaa catctccctg 300
ggtgaacgtc gtgcgaacgc cgttaagatg tacctgcagg gtaaaggcgt ttctgcagac 360
cagatctaa 369
<210> 45
<211> 148
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 45
Cys Ser Ser Asn Lys Asn Ala Ser Asn Asp Gly Ser Glu Gly Met Leu
1 5 10 15
Gly Ala Gly Thr Gly Met Asp Ala Asn Gly Gly Asn Gly Asn Met Ser
20 25 30
Ser Glu Glu Gln Ala Arg Leu Gln Met Gln Gln Leu Gln Gln Asn Asn
35 40 45
Ile Val Tyr Phe Asp Leu Asp Lys Tyr Asp Ile Arg Ser Asp Phe Ala
50 55 60
Gln Met Leu Asp Ala His Ala Asn Phe Leu Arg Ser Asn Pro Ser Tyr
65 70 75 80
Lys Val Thr Val Glu Gly His Ala Asp Glu Arg Gly Thr Pro Glu Tyr
85 90 95
Asn Ile Ser Leu Gly Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val Lys Met Tyr Leu
100 105 110
Gln Gly Lys Gly Val Ser Ala Asp Gln Ile Ser Ile Val Glu Lys Pro
115 120 125
Ala Val Leu Gly His Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Lys Asn Arg Arg Ala
130 135 140
Val Leu Val Tyr
145
<210> 46
<211> 447
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 46
tgttcttcca acaagaacgc cagcaatgac ggcagcgaag gcatgctggg tgccggcact 60
ggtatggatg cgaacggcgg caacggcaac atgtcttccg aagagcaggc tcgtctgcaa 120
atgcaacagc tgcagcagaa caacatcgtt tacttcgatc tggacaagta cgatatccgt 180
tctgacttcg ctcaaatgct ggatgcacat gcaaacttcc tgcgtagcaa cccgtcttac 240
aaagtcaccg tagaaggtca cgcggacgaa cgtggtactc cggaatacaa catctccctg 300
ggtgaacgtc gtgcgaacgc cgttaagatg tacctgcagg gtaaaggcgt ttctgcagac 360
cagatctcca tcgttgaaaa acctgcagta ctgggtcatg acgaagcggc atactccaaa 420
aaccgtcgtg cggtactggt ttactaa 447
<210> 47
<211> 148
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 47
Cys Ser Ser Asn Lys Asn Ala Ser Asn Asp Gly Ser Glu Gly Met Leu
1 5 10 15
Gly Ala Gly Thr Gly Met Asp Ala Asn Gly Gly Asn Gly Asn Met Ser
20 25 30
Ser Glu Glu Gln Ala Arg Leu Gln Met Gln Gln Leu Gln Gln Asn Asn
35 40 45
Ile Val Tyr Phe Asp Leu Asp Lys Tyr Asp Ile Arg Ser Asp Phe Ala
50 55 60
Gln Met Leu Asp Ala His Ala Asn Phe Leu Arg Ser Asn Pro Ser Tyr
65 70 75 80
Lys Val Thr Val Glu Gly His Ala Asp Glu Arg Gly Thr Pro Glu Tyr
85 90 95
Asn Ile Ser Leu Gly Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val Lys Met Tyr Leu
100 105 110
Gln Gly Lys Gly Val Ser Ala Asp Gln Ile Ser Ile Val Ser Tyr Gly
115 120 125
Lys Glu Lys Pro Ala Val Leu Gly His Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Ala
130 135 140
Val Leu Val Tyr
145
<210> 48
<211> 447
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 48
tgttcttcca acaagaacgc cagcaatgac ggcagcgaag gcatgctggg tgccggcact 60
ggtatggatg cgaacggcgg caacggcaac atgtcttccg aagagcaggc tcgtctgcaa 120
atgcaacagc tgcagcagaa caacatcgtt tacttcgatc tggacaagta cgatatccgt 180
tctgacttcg ctcaaatgct ggatgcacat gcaaacttcc tgcgtagcaa cccgtcttac 240
aaagtcaccg tagaaggtca cgcggacgaa cgtggtactc cggaatacaa catctccctg 300
ggtgaacgtc gtgcgaacgc cgttaagatg tacctgcagg gtaaaggcgt ttctgcagac 360
cagatctcca tcgtttctta cggtaaagaa aaacctgcag tactgggtca tgacgaagcg 420
gcatactccg cggtactggt ttactaa 447
<210> 49
<211> 58
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 49
Cys Ser Ser Asn Ala Lys Ile Asp Gln Leu Ser Ser Asp Val Gln Thr
1 5 10 15
Leu Asn Ala Lys Val Asp Gln Leu Ser Asn Asp Val Asn Ala Met Arg
20 25 30
Ser Asp Val Gln Ala Ala Lys Asp Asp Ala Ala Arg Ala Asn Gln Arg
35 40 45
Leu Asp Asn Met Ala Thr Lys Tyr Arg Lys
50 55
<210> 50
<211> 325
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 50
Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Thr Gly Ala Lys Leu Gly Trp Ser
1 5 10 15
Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe Ile Asn Asn Asn Gly Pro Thr His Glu
20 25 30
Asn Gln Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr
35 40 45
Val Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Pro Tyr Lys
50 55 60
Gly Ser Val Glu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr
65 70 75 80
Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg
85 90 95
Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Thr Lys Ser Asn Val Tyr Gly
100 105 110
Lys Asn His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly Gly Val Glu
115 120 125
Tyr Ala Ile Thr Pro Glu Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr Gln Trp Thr
130 135 140
Asn Asn Ile Gly Asp Ala His Thr Ile Gly Thr Arg Pro Asp Asn Gly
145 150 155 160
Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Gly Glu Ala Ala
165 170 175
Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val Gln Thr Lys
180 185 190
His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn Lys Ala Thr
195 200 205
Leu Lys Pro Glu Gly Gln Ala Ala Leu Asp Gln Leu Tyr Ser Gln Leu
210 215 220
Ser Asn Leu Asp Pro Lys Asp Gly Ser Val Val Val Leu Gly Tyr Thr
225 230 235 240
Asp Arg Ile Gly Ser Asp Ala Tyr Asn Gln Gly Leu Ser Glu Arg Arg
245 250 255
Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Ile Ser Lys Gly Ile Pro Ala Asp
260 265 270
Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val Thr Gly Asn
275 280 285
Thr Cys Asp Asn Val Lys Gln Arg Ala Ala Leu Ile Asp Cys Leu Ala
290 295 300
Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Ile Lys Asp Val Val
305 310 315 320
Thr Gln Pro Gln Ala
325
<210> 51
<211> 421
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 51
Met Ser Lys Ala Thr Glu Gln Asn Asp Lys Leu Lys Arg Ala Ile Ile
1 5 10 15
Ile Ser Ala Val Leu His Val Ile Leu Phe Ala Ala Leu Ile Trp Ser
20 25 30
Ser Phe Asp Glu Asn Ile Glu Ala Ser Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Ser Ile Asp Ala Val Met Val Asp Ser Gly Ala Val Val Glu Gln Tyr
50 55 60
Lys Arg Met Gln Ser Gln Glu Ser Ser Ala Lys Arg Ser Asp Glu Gln
65 70 75 80
Arg Lys Met Lys Glu Gln Gln Ala Ala Glu Glu Leu Arg Glu Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Glu Gln Glu Arg Leu Lys Gln Leu Glu Lys Glu Arg Leu Ala
100 105 110
Ala Gln Glu Gln Lys Lys Gln Ala Glu Glu Ala Ala Lys Gln Ala Glu
115 120 125
Leu Lys Gln Lys Gln Ala Glu Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Asp
130 135 140
Ala Lys Ala Lys Ala Glu Ala Asp Ala Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala
145 150 155 160
Lys Lys Ala Ala Ala Asp Ala Lys Lys Lys Ala Glu Ala Glu Ala Ala
165 170 175
Lys Ala Ala Ala Glu Ala Gln Lys Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Leu Lys Lys Lys Ala Glu Ala Ala Glu Ala Ala Ala Ala Glu Ala Arg
195 200 205
Lys Lys Ala Ala Thr Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Ala Glu Ala Glu
210 215 220
Lys Lys Ala Ala Ala Glu Lys Ala Ala Ala Asp Lys Lys Ala Ala Ala
225 230 235 240
Glu Lys Ala Ala Ala Asp Lys Lys Ala Ala Glu Lys Ala Ala Ala Glu
245 250 255
Lys Ala Ala Ala Asp Lys Lys Ala Ala Ala Glu Lys Ala Ala Ala Asp
260 265 270
Lys Lys Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Glu Lys Ala Ala Ala Ala
275 280 285
Lys Ala Ala Ala Glu Ala Asp Asp Ile Phe Gly Glu Leu Ser Ser Gly
290 295 300
Lys Asn Ala Pro Lys Thr Gly Gly Gly Ala Lys Gly Asn Asn Ala Ser
305 310 315 320
Pro Ala Gly Ser Gly Asn Thr Lys Asn Asn Gly Ala Ser Gly Ala Asp
325 330 335
Ile Asn Asn Tyr Ala Gly Gln Ile Lys Ser Ala Ile Glu Ser Lys Phe
340 345 350
Tyr Asp Ala Ser Ser Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Thr Leu Arg Ile Lys
355 360 365
Leu Ala Pro Asp Gly Met Leu Leu Asp Ile Lys Pro Glu Gly Gly Asp
370 375 380
Pro Ala Leu Cys Gln Ala Ala Leu Ala Ala Ala Lys Leu Ala Lys Ile
385 390 395 400
Pro Lys Pro Pro Ser Gln Ala Val Tyr Glu Val Phe Lys Asn Ala Pro
405 410 415
Leu Asp Phe Lys Pro
420
<210> 52
<211> 25
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 52
Gly Thr Gly Met Asp Ala Asn Gly Gly Asn Gly Asn Met Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Gln Ala Arg Leu Gln Met Gln Gln
20 25
<210> 53
<211> 4
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 53
Ser Lys Asn Arg
1
<210> 54
<211> 849
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 54
gtaacttatc ctctgccaac cgacgggagt cgcctggttg gtcagaatca ggtgatcacc 60
attcctgaag gtaacactca gccgctggag tattttgccg ccgagtacca gatggggctt 120
tccaatatga tggaagcgaa cccgggtgtg gataccttcc tgccgaaagg cggtactgta 180
ctgaacattc cgcagcagct gatcctgccg gataccgttc atgaaggcat cgtcattaac 240
agtgctgaga tgcgtcttta ttactatccg aaagggacca acaccgttat cgtgctgccg 300
atcggcattg gtcagttagg caaagatacg cctatcaact ggaccaccaa agttgagcgt 360
aaaaaagcag gcccgacctg gacgccgacc gccaaaatgc acgcagagta ccgcgctgcg 420
ggcgaaccgc ttccggctgt cgttccggca ggtccggata acccgatggg gctgtatgca 480
ctctatatcg gtcgcctgta tgctatccat ggcaccaacg ccaacttcgg tatcggcctg 540
cgtgtaagtc atggttgtgt gcgtctgcgt aacgaagaca tcaaattcct gttcgagaaa 600
gtaccggtcg gtacccgcgt acagtttatt gatgagccgg taaaagcgac caccgagcca 660
gacggcagcc gttatattga agtccataac ccgctgtcta ccaccgaagc ccagtttgaa 720
ggtcaggaaa ttgtgccaat taccctgacg aagagcgtgc agacagtgac cggtcagcca 780
gatgttgacc aggttgttct tgatgaagcg attaaaaacc gctccgggat gccggttcgt 840
ctgaattaa 849
<210> 55
<211> 72
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 55
atgaatatga aattgaaaac attattcgca gcggccttcg ctgttgtcgg cttttgcagt 60
accgcctctg cg 72
<210> 56
<211> 894
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 56
ctaccggcaa aagccaacac ctggccgctg ccgccagcgg gcagtcgtct ggttggcgaa 60
aacaaatttc atgtggtgga aaatgacggt ggttctctgg aagccatcgc caaaaaatac 120
aacgtcggct ttctcgctct gttacaggct aaccccggcg ttgatcctta cgtaccgcgc 180
gcgggcagcg tgttaacgat cccgttgcaa accctacttc cagatgcgcc gcgcgaaggc 240
attgtgatca acattgcgga gctgcgtctc tattactacc cgccgggtaa aaattcggta 300
accgtgtatc caataggtat tggtcagtta ggtggtgaca cgctgacacc gacaatggtg 360
accaccgttt cagacaaacg tgcaaaccca acctggacgc caacggcaaa catccgcgcc 420
cgttataaag cacagggaat tgagttgcct gcggtagtgc cggctggact ggataaccca 480
atgggccatc atgcgattcg tctggcggcc tatggcggcg tttatttgct tcatggtacg 540
aacgccgatt tcggcattgg catgcgggta agttctggct gtattcgtct gcgggatgac 600
gatatcaaaa cactctttag ccaggtcacc ccaggcacca aagtgaatat catcaacact 660
ccgataaaag tctctgccga accaaacggt gcgcgtctgg ttgaagtaca tcagccgctg 720
tcagagaaga ttgatgacga tccgcagctg ctgccaatta cgctgaatag cgcaatgcaa 780
tcatttaaag atgcagcaca aactgacgct gaagtgatgc aacatgtgat ggatgtccgt 840
tccgggatgc cggtggatgt ccgccgtcat caagtgagcc cacaaacgct gtaa 894
<210> 57
<211> 69
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 57
gtgatgatca aaacgcgttt ttctcgctgg ctaacgtttt ttacgttcgc cgctgccgtg 60
gcgctggcg 69
<210> 58
<211> 870
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 58
gtaacttatc cattacctcc agagggtagc cgtttagtgg ggcagtcgtt tactgtaact 60
gttcctgatc acaataccca gccgctggag acttttgccg cacaatacgg gcaagggtta 120
agtaacatgc tggaagcgaa cccgggcgct gatgtttttt tgccgaagtc tggctcgcaa 180
ctcaccattc cgcagcaact gattttgccc gacactgttc gtaaagggat tgttgttaac 240
gtcgctgaga tgcgtcttta ttactaccca ccagacagta atactgtgga agtctttcct 300
attggtatcg gccaggctgg gcgagaaacc ccgcgtaact gggtgactac cgttgaacgt 360
aaacaagaag ctccaacctg gacgccaacg ccgaacactc ggcgcgaata tgcgaaacga 420
ggggagagtt tgcccgcatt tgttcctgcg ggccccgata atcccatggg gctgtacgcg 480
atttatattg gcaggttgta tgccatccat ggtaccaatg ccaattttgg tattgggctc 540
cgggtaagtc agggctgtat tcgtctgcgc aatgacgata tcaaatatct gtttgataat 600
gttcctgttg ggacgcgtgt gcaaattatc gaccagccag taaaatacac cactgaacca 660
gatggctcga actggctgga agttcatgag ccattgtcgc gcaatcgtgc agaatatgag 720
tctgaccgaa aagtgccatt gccggtaacc ccatctttgc gggcgtttat caacgggcaa 780
gaagttgatg taaatcgcgc aaatgctgcg ttgcaacgtc gatcgggaat gcctgtgcaa 840
attagttctg gttcaagaca gatgttttaa 870
<210> 59
<211> 63
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 59
atgcgtcgtg taaatattct ttgctcattt gctctgcttt ttgccagcca tactagcctg 60
gcg 63
<210> 60
<211> 20
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 60
Met Lys Ala Thr Lys Leu Val Leu Gly Ala Val Ile Leu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gly
20
<210> 61
<211> 21
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 61
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala
20
<210> 62
<211> 2373
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 62
gctgaagggt tcgtagtgaa agatattcat ttcgaaggcc ttcagcgtgt cgccgttggt 60
gcggccctcc tcagtatgcc ggtgcgcaca ggcgacacgg ttaatgatga agatatcagt 120
aataccattc gcgctctgtt tgctaccggc aactttgagg atgttcgcgt ccttcgtgat 180
ggtgataccc ttctggttca ggtaaaagaa cgtccgacca ttgccagcat tactttctcc 240
ggtaacaaat cggtgaaaga tgacatgctg aagcaaaacc tcgaggcttc tggtgtgcgt 300
gtgggcgaat ccctcgatcg caccaccatt gccgatatcg agaaaggtct ggaagacttc 360
tactacagcg tcggtaaata tagcgccagc gtaaaagctg tcgtgacccc gctgccgcgc 420
aaccgtgttg acctaaaact ggtgttccag gaaggtgtgt cagctgaaat ccagcaaatt 480
aacattgttg gtaaccatgc tttcaccacc gacgaactga tctctcattt ccaactgcgt 540
gacgaagtgc cgtggtggaa cgtggtaggc gatcgtaaat accagaaaca gaaactggcg 600
ggcgaccttg aaaccctgcg cagctactat ctggatcgcg gttatgcccg tttcaacatc 660
gactctaccc aggtcagtct gacgccagat aaaaaaggta tttacgtcac ggtgaacatc 720
accgaaggcg atcagtacaa gctttctggc gttgaagtga gcggcaacct tgccgggcac 780
tccgctgaaa ttgagcagct gactaagatc gagccgggtg agctgtataa cggcaccaaa 840
gtgaccaaga tggaagatga catcaaaaag cttctcggtc gctatggtta tgcctatccg 900
cgcgtacagt cgatgcccga aattaacgat gccgacaaaa ccgttaaatt acgtgtgaac 960
gttgatgcgg gtaaccgttt ctacgtgcgt aagatccgtt ttgaaggtaa cgatacctcg 1020
aaagatgccg tcctgcgtcg cgaaatgcgt cagatggaag gtgcatggct ggggagcgat 1080
ctggtcgatc agggtaagga gcgtctgaat cgtctgggct tctttgaaac tgtcgatacc 1140
gatacccaac gtgttccggg tagcccggac caggttgatg tcgtctacaa ggtaaaagag 1200
cgcaacaccg gtagcttcaa ctttggtatt ggttacggta ctgaaagtgg cgtgagcttc 1260
caggctggtg tgcagcagga taactggtta ggtacaggtt atgctgttgg tatcaacggg 1320
accaaaaacg attaccagac ctatgctgaa ctgtcggtaa ccaacccgta cttcaccgta 1380
gatggcgtaa gcctcggtgg tcgtctcttc tataatgact tccaggcaga tgacgccgac 1440
ctgtccgact ataccaacaa gagttatggt acagacgtga cgttgggctt cccgattaac 1500
gaatataact cgctgcgtgc aggtctgggt tatgtacata actccctgtc caacatgcag 1560
cctcaggttg cgatgtggcg ttatctgtac tctatgggtg aacatccgag cacctctgat 1620
caggataaca gcttcaaaac ggacgacttc acgttcaact atggttggac ctataacaag 1680
cttgaccgtg gttacttccc gacagatggt tcacgtgtca acctgaccgg taaagtgacc 1740
attcctggat cggataacga atactacaaa gtgacgttag acacggcgac ttatgtgccg 1800
atcgatgacg atcacaaatg ggttgttctg gggcgtaccc gctggggtta tggtgatggt 1860
ttaggcggca aagagatgcc gttctacgag aacttctatg ccggtggttc cagcaccgtg 1920
cgtggcttcc agtccaatac cattggtccg aaagcagttt acttcccgca tcaggccagt 1980
aattatgatc cggactatga ttacgaatgt gcgactcagg acggcgcgaa agacctgtgt 2040
aaatcggatg atgctgtagg cggtaacgcc atggcggttg ccagcctcga gttcatcacc 2100
ccgacgccgt ttattagcga taagtatgct aactcggttc gtacttcctt cttctgggat 2160
atgggtaccg tttgggatac aaactgggat tccagccaat attctggata tccggactat 2220
agtgatccaa gcaatatccg tatgtctgcg ggtatcgcat tacaatggat gtccccattg 2280
gggccgttgg tgttctccta cgcccagccg ttcaaaaagt acgatggaga caaggcagaa 2340
cagttccagt ttaacatcgg taaaacctgg taa 2373
<210> 63
<211> 60
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 63
atggcgatga aaaagttgct catagcgtcg ctgctgttta gcagcgccac cgtatacggt 60
<210> 64
<211> 549
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 64
gatgccgcaa gcgatctgaa aagccgcctg gataaagtca gcagcttcca cgccagcttc 60
acacaaaaag tgactgacgg tagcggcgcg gcggtgcagg aaggtcaggg cgatctgtgg 120
gtgaaacgtc caaacttatt caactggcat atgacacaac ctgatgaaag cattctggtt 180
tctgacggta aaacactgtg gttctataac ccgttcgttg agcaagctac ggcaacctgg 240
ctgaaagatg ccaccggtaa tacgccgttt atgctgattg cccgcaacca gtccagcgac 300
tggcagcagt acaatatcaa acagaatggc gatgactttg tcctgacgcc gaaagccagc 360
aatggcaatc tgaagcagtt caccattaac gtgggacgtg atggcacaat ccatcagttt 420
agcgcggtgg agcaggacga tcagcgcagc agttatcaac tgaaatccca gcaaaatggg 480
gctgtggatg cagcgaaatt taccttcacc ccgccgcaag gcgtcacggt agatgatcaa 540
cgtaagtag 549
<210> 65
<211> 63
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 65
atgaaaaaaa ttgccatcac ctgtgcatta ctctcaagct tagtagcaag cagcgtttgg 60
gct 63
<210> 66
<211> 561
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 66
tgttccgtta ccacgcccaa aggtcctggc aaaagcccgg attcgccaca atggcgtcag 60
catcagcaag acgtgcgcaa tcttaatcag tatcagactc gcggcgcgtt cgcttatatt 120
tctgaccaac aaaaagtgta cgcccgcttt ttctggcagc aaaccggcca ggatcgctac 180
cgtctgctgc tcactaaccc attgggcagc acggaactgg agctgaatgc tcaaccgggt 240
aacgtgcagt tagtcgacaa taaaggtcag cgttataccg ccgatgacgc cgaagagatg 300
attggcaaat tgaccggaat gccaattccg ctcaacagct tgcgccagtg gattttaggt 360
ttaccgggtg atgcaaccga ctacaaactg gacgaccagt accgcctgag cgaaattacc 420
tacagccaga atggcaaaaa ctggaaggtt gtttatggtg gttatgacac caaaacgcaa 480
cctgcgatgc cagccaatat ggaactcacc gacggtggtc aacgcatcaa gttaaaaatg 540
gataactgga tagtgaaata a 561
<210> 67
<211> 63
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 67
atgcccctgc ccgattttcg tcttatccgc ctgctaccgc tggctgctct tgtgctcact 60
gcc 63
<210> 68
<211> 1200
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 68
atgtaccaac ctgtcgctct atttattggc ctgcgttaca tgcgtgggcg tgcagcggat 60
cgcttcggtc gtttcgtctc ctggctttct accatcggca ttaccctcgg ggtgatggcg 120
ctggtcacag tattgtcagt gatgaacggc tttgagcgcg agctgcaaaa caacatcctt 180
ggcctgatgc cacaggcaat tctctcttct gagcatggct ctcttaaccc gcagcaactc 240
ccagaaacgg cagtcaaact ggacggcgtt aatcgcgtcg cacctattac taccggtgat 300
gtggtactgc aaagcgcgcg cagcgtggcg gtcggggtga tgctcggtat cgacccggcg 360
caaaaagatc cacttacacc gtatctggtc aatgtgaaac aaactgacct cgagccgggg 420
aaatataatg tcatcctcgg cgaacaactt gcctcacagc taggcgttaa tcgcggtgat 480
caaatccgcg tgatggtacc atctgccagc cagttcacgc cgatggggcg tattccaagc 540
cagcgcctgt tcaatgtgat tggcactttc gccgccaaca gtgaagtcga tggctatgaa 600
atgctggtga atattgagga tgcctcgcgt ctgatgcgtt atccggcagg caatattacc 660
ggctggcgtt tgtggctgga tgagccgctg aaagtcgact cattaagtca gcaaaaactg 720
cctgaaggca gcaaatggca ggactggcgt gatcgtaaag gcgagttgtt ccaggccgta 780
cgcatggaaa aaaatatgat gggtttactg ctgagcctga ttgtcgccgt tgcggcgttt 840
aacattatta cctcactagg gctgatggta atggagaagc agggcgaagt agcgatcctg 900
caaacgcaag gcttaactcc gcgacaaatc atgatggtct ttatggtgca aggggccagc 960
gccgggatta tcggtgcgat cctcggagcg gcgcttggcg ccctgcttgc cagccagtta 1020
aataatctga tgccgataat cggcgtcctg cttgatggcg cggcgctgcc ggtggctatc 1080
gaacctttac aggtcattgt tattgcgctg gtggcgatgg ctatcgcgct gctgtctacg 1140
ctttaccctt catggcgcgc tgccgccact caacccgctg aggctttacg ttatgaataa 1200
<210> 69
<211> 702
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 69
atgaataaga tcctgttgca atgcgacaac ctgtgcaaac gctatcagga aggcagtgtg 60
caaaccgatg tgctgcacaa tgtcagtttc agcgtcggcg aaggtgaaat gatggcgatc 120
gtcggtagct ctggttccgg taaaagtacc ttgctgcacc tgctgggcgg gctggatacg 180
ccaacctccg gcgatgtgat ttttaatggt cagccaatga gcaaactgtc gtcggcagcg 240
aaagctgaac tgcgcaacca gaagctgggc tttatttatc agtttcacca cctgctgccg 300
gattttaccg ccctggaaaa cgtggctatg ccgctgctga ttggcaagaa aaagcccgct 360
gaaatcaaca gccgtgcact tgagatgtta aaagcggtgg ggctggatca tcgtgcgaat 420
caccgcccat ctgaactttc tggcggcgaa cgccagcgtg tggcgattgc ccgtgcgctg 480
gtgaataacc cgcgcctggt actggcggat gaacctaccg gtaacctcga tgcgcgtaac 540
gccgacagca tcttccagtt gcttggggaa ttgaatcgct tgcagggcac cgccttcctg 600
gtggttactc acgacctgca actggcgaaa cgtatgagcc gccagttaga aatgcgtgat 660
ggtcgtctga cggcggaact gagcctgatg ggggcggagt aa 702
<210> 70
<211> 1245
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 70
atggcgatgc ctttatcgtt attaattggc ctgcgtttta gtcgcggacg gcggcgcggc 60
ggcatggtgt cgctgatctc cgttatttct accattggca ttgccctcgg cgtggcggta 120
ttgatcgtcg gcttaagcgc gatgaacggc tttgaacgcg aactgaacaa ccgtattctg 180
gcggtggtgc cgcatggtga aatcgaggcg gtggatcagc cgtggactaa ctggcaggaa 240
gcactggatc acgtgcaaaa agtgccgggt attgccgctg ccgcgccgta tatcaatttc 300
accgggctgg tggaaagtgg cgcgaatctt cgcgcaatcc aggtgaaggg cgttaacccg 360
caacaggaac agcgtctgag cgcattaccc tcgtttgtcc agggcgatgc gtggcgcaat 420
tttaaagcgg gcgaacagca aattatcatc ggcaaaggcg tggcggatgc gctgaaagtg 480
aagcaggggg attgggtgtc gattatgatc cccaactcga atcccgagca taaactgatg 540
cagccaaaac gtgtgcgttt gcacgttgcc ggtattttgc agttgagtgg tcaactcgat 600
cacagttttg ccatgatccc gctggcggat gcccaacaat atcttgatat gggttccagc 660
gtgtcaggta ttgcccttaa aatgacggat gttttcaacg ccaataagct ggtacgcgat 720
gcgggtgaag tgaccaacag ctatgtttat attaaaagct ggattggtac ttacggctat 780
atgtatcgcg atatccaaat gatccgcgcc attatgtatc tggcgatggt actggtgatt 840
ggcgtggcct gtttcaacat cgtctccacc ttagtgatgg cggtgaaaga caagagtggc 900
gatatcgcag tattaagaac gctgggggcg aaagatggtt taattcgcgc catctttgtc 960
tggtatggat tgctggcagg gctgttcggc agcctgtgtg gtgtgattat cggcgtagtg 1020
gtttcactgc aacttacccc gattattgag tggattgaaa agttgatcgg tcatcagttc 1080
ctctccagcg atatctattt tattgatttc ctgccatcgg aattgcactg gctggacgtc 1140
ttctacgtac tggtcacagc attgttgctg agtcttttgg caagttggta tccggcgcgg 1200
cgcgccagta atattgaccc tgcgcgagtc cttagcggcc agtaa 1245
<210> 71
<211> 528
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 71
tgtggctggc atctgcgtga taccacgcag gttccttcca ctatgaaggt catgatcctg 60
gactcaggcg atccgaacgg gccattaagc cgtgcggtgc gtaaccagtt acgtctgaat 120
ggtgtcgagt tgcttgataa agaaaccacg cgtaaggacg ttccatcctt gcgtttgggt 180
aaagtgagca tcgcgaaaga taccgcatcg gtattccgta acggtcaaac agcagagtat 240
cagatgatca tgacggttaa tgcgaccgtg ttgatccccg gccgtgatat ctacccgatt 300
agcgccaaag tcttccgttc gttcttcgat aacccgcaaa tggcgttagc gaaagataac 360
gaacaagaca tgatcgtaaa agagatgtac gaccgtgctg ccgaacagct gattcgtaag 420
ctgccaagca tccgtgctgc ggatattcgt tccgacgaag aacagacgtc gaccacaacg 480
gatactccgg caacgcctgc acgcgtctcc accacgctgg gtaactga 528
<210> 72
<211> 54
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 72
gtgcgatatc tggcaacatt gttgttatct ctggcggtgt taatcaccgc cggg 54
<210> 73
<211> 2283
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 73
gccgacctcg cctcacagtg catgttgggc gtgccaagct atgaccgtcc tctggtacag 60
ggcgatacca atgacttacc cgtgactatc aatgctgacc acgcgaaagg ggactacccg 120
gatgacgccg tgtttactgg cagcgtggat atcatgcagg gtaacagccg tctgcaggcc 180
gacgaagtgc agctccatca aaaagaggca ccaggacaac cggagccggt acgtaccgtt 240
gatgcgctcg gtaatgtcca ttacgacgat aaccaggtga tcctcaaagg gccgaaaggc 300
tgggcgaatc tgaacaccaa agataccaac gtctgggaag gtgattacca gatggtgggt 360
cgccagggtc gcggtaaagc ggacctgatg aaacaacgtg gcgaaaaccg ctataccatt 420
ctggataacg gtagctttac ctcctgtctg ccgggttctg acacctggag cgtggtaggt 480
agcgaaatta ttcatgaccg cgaagaacaa gttgcggaga tctggaacgc ccgctttaag 540
gtgggtccgg taccgatctt ttatagcccc tatttgcagt tgccggtggg tgacaaacgt 600
cgctctggtt tcttgatccc gaacgccaag tacaccacca ccaactactt tgagttctac 660
ctgccatatt actggaacat cgcgccaaat atggatgcca ccatcacgcc gcattatatg 720
catcgtcgtg gcaacatcat gtgggagaac gaattccgct acctctccca ggcgggcgct 780
ggcttgatgg aactggacta tctgccttca gataaagtct atgaagatga acacccgaac 840
gatgacagtt cacgtcgttg gttattctac tggaaccact ccggggtcat ggatcaggtg 900
tggcgtttca acgtcgacta caccaaggtc agcgatccta gctacttcaa tgatttcgat 960
aacaagtacg gttccagtac tgacggctac gcaacgcaaa aattcagcgt tggctatgcg 1020
gtgcaaaact tcaatgccac cgtttcaacc aagcagttcc aggttttcag cgaacagaac 1080
accagtagct actcggcaga gccgcagtta gacgttaatt actaccagaa tgatgttggt 1140
ccgtttgata cgcgtattta cggccaggca gtgcactttg ttaacaccag agacgacatg 1200
cctgaagcaa cccgtgttca cctggaaccg accatcaatt tgccgctctc taataactgg 1260
ggcagcatca ataccgaagc gaagttgctg gcaacccatt atcagcaaac caatcttgac 1320
tggtataact ccagaaacac gaccaagctg gacgaatccg ttaaccgcgt aatgccgcaa 1380
ttcaaagttg acggcaaaat ggtctttgaa cgcgatatgg aaatgctggc tccgggttat 1440
acccaaacgc tggaaccgcg cgcgcagtat ttgtacgtgc cgtatcgcga tcagagcgac 1500
atctataact acgactcgtc tctgctgcaa tctgactact ctggcctgtt ccgggaccgg 1560
acttacggcg gtcttgaccg tattgcctcc gctaaccagg tgacgaccgg tgtcacatct 1620
cgcatatatg atgatgctgc cgttgaacgt tttaatattt ccgttggtca aatctactat 1680
ttcacggagt ctcgcactgg cgatgacaac ataacatggg agaatgacga caaaacgggt 1740
tcactggtgt gggcaggcga tacttactgg cgtatctccg agcgttgggg attgcgtggc 1800
gggattcagt acgatacacg tctggataac gtagcgacca gtaactccag cattgaatac 1860
cgtcgggatg aagaccgtct ggtacagctg aattaccgtt acgccagccc ggaatatatt 1920
caggctacgc tgcctaagta ctattccact gctgagcaat ataagaatgg tatttcgcag 1980
gtaggtgctg tcgccagctg gccaattgcc gatcgttggt ccattgttgg ggcctactac 2040
tacgacacca atgctaacaa gcaagccgac tctatgttag gtgtgcaata cagctcctgc 2100
tgctatgcaa ttcgcgtcgg ttacgagcgg aagctgaacg gttgggataa cgataaacaa 2160
catgcggtat atgacaacgc aatcggcttt aacatcgaac ttcgcggcct gagctccaac 2220
tacggtctgg gtacgcaaga gatgctgcgt tcgaacattc tgccgtatca aaacactttg 2280
tga 2283
<210> 74
<211> 72
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 74
atgaaaaaac gtatccccac tctcctggcc accatgattg ccaccgccct ttatagtcaa 60
cagggactgg ca 72
<210> 75
<211> 477
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 75
gtaaccggag acactgatca gccgatccac attgaatcgg accagcaatc tcttgatatg 60
caaggcaacg tggttacctt taccggtaat gtcatcgtca cccagggcac catcaaaatt 120
aatgccgaca aagtggtcgt tacccgtccg ggcggcgaac aaggtaaaga agtgattgac 180
ggctacggta aaccggcaac gttctaccag atgcaggaca acggtaaacc cgttgaaggt 240
cacgcttccc agatgcacta cgaactggca aaagattttg tcgttctgac gggtaatgct 300
tatctgcagc aggtcgatag caacattaag ggcgataaga tcacttacct ggtgaaagag 360
cagaaaatgc aggctttcag cgacaaaggc aagcgcgtaa caaccgttct ggtgccgtcg 420
cagctgcagg acaaaaacaa caaaggccag accccggcac agaagaaggg taattaa 477
<210> 76
<211> 81
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 76
atgaaattca aaacaaacaa actcagcctt aatcttgtgc ttgccagctc acttctggcc 60
gccagcattc cggcatttgc c 81
<210> 77
<211> 726
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 77
atggcaacat taactgcaaa gaaccttgca aaagcctata aaggccgtcg cgtggtagaa 60
gacgtcagcc tgaccgtcaa ctccggggaa attgtcggtc tgctggggcc aaacggtgcc 120
ggtaagacca ccactttcta catggttgta ggcattgtgc cgcgcgatgc gggcaacatc 180
attattgatg atgacgatat cagtctgctg cctctgcatg cacgcgcgcg ccgcggtatc 240
ggctatctgc cacaggaagc ctccattttc cgtcgcctca gcgtttacga taacctgatg 300
gcggtactgc aaattcgtga cgacttgtct gctgaacaac gtgaagaccg cgcgaacgag 360
ctgatggaag agtttcacat tgagcacctg cgtgacagca tggggcagtc actctccggg 420
ggtgaacgtc gccgtgtaga aattgcccgc gcactggctg cgaatccgaa atttattctg 480
ctcgacgaac cgtttgccgg ggttgacccg atctcggtta tcgacattaa acgcatcatt 540
gagcacctgc gcgacagcgg cctgggcgtg ctgatcactg accacaacgt gcgtgaaaca 600
ctggcggttt gtgaacgcgc ttatatcgtc agtcaggggc atttgatcgc ccacggcacg 660
cctacagaaa tcttacaaga cgaacacgtt aagcgtgtat accttgggga agacttcaga 720
ctctga 726
<210> 78
<211> 1100
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 78
gtgataatca taagatatct ggtgcgggag acgctcaaaa gccagctggc gatactcttc 60
atcttgcttt tgatcttctt ctgtcaaaag ttagtgagga tcctcggcgc agcggttgac 120
ggcgatattc cggcgaatct ggtgctctcc cttctcgggt tgggcgtgcc ggaaatggcg 180
cagcttatcc tgccattaag cctgttcctc gggctgctga tgacgctggg caaactgtat 240
accgaaagtg aaattacggt aatgcatgcc tgcggcctga gcaaagcggt tctggtgaaa 300
gcggcaatga tccttgcggt attcacggca atcgtagcgg cggttaacgt gatgtgggcg 360
ggaccgtggt catcgcgtca tcaggatgaa gtgttagcag aagcgaaagc gaaccctggc 420
atggcggcgc tggcgcaagg gcaattccag caagcgacta atggcagctc ggtgctgttc 480
atcgaaagcg ttgacggcag cgatttcaaa gatgtgttcc tcgcgcaaat tcgaccaaaa 540
ggtaatgcac gtccttctgt ggtggtggcc gattccggac atttaaccca gctgcgcgac 600
ggctcccagg tcgtcactct caaccaggga acgcgcttcg aaggcactgc attgttacgt 660
gatttccgca ttacggactt ccaggattat caggcgatca ttggtcacca ggcggtggcg 720
ctcgacccga acgataccga ccagatggac atgcgcacat tgtggaacac tgacaccgat 780
cgtgctcgcg cagaactgaa ctggcgtatc acgttggtat tcaccgtgtt tatgatggca 840
cttatggtcg taccgctgag cgtggttaac ccacgtcagg gacgcgtact gtcgatgctg 900
ccagccatgc tgctgtatct acttttcttc ctgatccaga cctccctgaa atcgaacggc 960
ggtaaaggta agctggaccc gacgctgtgg atgtggaccg ttaacctgat ttatctggct 1020
ttagcgattg ttctcaacct ttgggacacc gtgccggtcc gccgcctgcg cgccagtttt 1080
tcgcgtaaag gagcggtgtg 1100
<210> 79
<211> 1083
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 79
atgcaacctt ttggcgtact tgaccgctat atcggtaaaa ctattttcac caccatcatg 60
atgacactgt tcatgctggt gtcgctgtcg ggcattatca agtttgtcga tcagctgaaa 120
aaagccgggc aggggagtta cgacgcgtta ggcgcaggaa tgtatacctt gctgagcgtg 180
ccgaaagatg tgcagatctt cttcccgatg gcggctctgc ttggggcgtt gcttggtctt 240
gggatgctgg cgcagcgcag cgaactggtg gtgatgcagg cttctggttt tacccgtatg 300
caggtggcgc tgtcggtgat gaaaaccgcc attccgctgg tcttgctgac gatggcgatt 360
ggcgaatggg tcgcgccgca gggcgagcag atggcgcgta actaccgtgc gcaggcgatg 420
tacggcggct cgttgctctc tacccagcaa ggcttatggg cgaaagatgg caacaacttc 480
gtctacattg agcgggttaa aggtgacgaa gagttaggtg gcatcagcat ttatgccttt 540
aacgagaatc gtcgtctgca atccgtacgc tatgccgcta ctgcgaagtt tgacccggaa 600
cataaagtct ggcgtctgtc gcaggttgat gaatctgatc tgaccaatcc gaaacagatt 660
accggttcgc agacggtgag cggcacctgg aaaaccaacc tcacgccgga caaactgggc 720
gtggtggcgc tggacccgga tgcactctct atcagcggtt tgcacaacta tgtgaagtat 780
ctgaagtcga gcggtcagga tgccggacgt tatcagctca acatgtggag caaaatcttc 840
cagccgctat ctgtggcggt gatgatgctg atggcgctgt cgttcatctt tggcccactg 900
cgtagcgtac cgatgggcgt gcgtgtggtc accggtatca gtttcggttt tgtcttctac 960
gtactggacc agatcttcgg cccgctgacg ttggtttatg gcatcccgcc gatcatcggc 1020
gcactgttgc caagcgccag cttcttctta atcagcctgt ggctgttaat gagaaaatcg 1080
taa 1083
<210> 80
<211> 1959
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 80
tgtggcaccc atactcccga tcagtccact gcttatatgc agggcacggc gcaggctgat 60
tctgcctttt atcttcagca gatgcagcaa agctctgatg ataccaggat caactggcaa 120
ttactcgcca ttcgtgcact ggtgaaagaa ggtaaaaccg ggcaggcggt tgagttgttt 180
aaccaactac cgcaagaact gaacgatgct cagcgtcgcg agaaaacact gctggcggta 240
gagattaaac tggcgcagaa agattttgct ggcgcgcaaa acttgctggc gaaaatcaca 300
cctgccgatt tagaacaaaa ccagcaagcg cgttactggc aggcaaaaat cgatgccagc 360
caggggcgtc cttccattga tttactgcgc gcgttaattg ctcaggaacc gctgcttggc 420
gcgaaagaaa aacagcagaa tattgatgcc acctggcagg cgctctcctc catgactcag 480
gaacaggcga atacgctggt gatcaacgcc gacgaaaata ttctgcaagg ctggctggat 540
ctgcagcgcg tctggtttga taaccgtaac gatcccgaca tgatgaaagc cgggatcgcc 600
gactggcaga aacgttatcc gaacaatccg ggcgcgaaaa tgctgccaac gcagttggtt 660
aacgtaaaag cgtttaaacc agcctcgacc aacaaaatcg ccctgctgtt gccactgaat 720
ggccaggcag cggtatttgg tcgcactatt cagcaaggct ttgaagcggc gaaaaatatc 780
ggcactcagc cagtggcagc tcaggtagct gccgcacctg ccgcagacgt agctgaacaa 840
cctcagccgc aaaccgtgga tggcgttgcc agcccggcac aagcctcggt tagcgatctg 900
accggtgaac agcctgcagc ccagccggtg cctgtaagcg ccccggcgac aagcaccgca 960
gcggtaagcg cacccgcaaa tccatccgca gagctgaaaa tctacgatac ctcatcacaa 1020
ccacttagcc agatcttaag ccaggttcag caggatggcg cgagtattgt ggtcggtccg 1080
ttgctgaaaa ataacgttga agagttgctg aagagcaaca ctccgctgaa cgtactggca 1140
ctgaaccagc cggagaatat cgaaaatcgc gtcaatattt gttacttcgc gctttcaccg 1200
gaagacgaag cgcgcgatgc agcgcgtcat attcgtgacc agggtaaaca agcgccgctg 1260
gtgctgatcc cacgcagttc attgggcgat cgcgtagcca atgcgtttgc gcaagagtgg 1320
cagaaactgg gcggcggcac cgttctgcaa caaaaatttg gttccaccag cgaattacgc 1380
gcgggtgtta acggcggttc tggtattgct ttaacgggta gcccgattac tctcagagcg 1440
acaaccgact ccggcatgac gaccaacaat ccaacgctgc aaaccacgcc aaccgatgac 1500
cagttcacca ataatggcgg tcgtgtcgat gcggtgtaca ttgtggcaac gccgggtgaa 1560
atcgctttta tcaaaccgat gatcgccatg cgtaacggta gccagagcgg tgcaacgctg 1620
tacgccagct cccgcagtgc gcaagggacc gctggcccgg atttccgact ggagatggaa 1680
ggcttgcagt acagcgaaat cccgatgctg gcaggcggta atctaccgtt aatgcagcag 1740
gcactcagcg cggtgaataa cgattattca ctggctcgca tgtatgcgat gggcgtcgat 1800
gcctggtcgc tggcaaatca tttctcacaa atgcgccagg ttcagggttt tgaaatcaac 1860
ggtaataccg gaagcctgac ggctaacccg gattgcgtga ttaacaggaa cttatcatgg 1920
ctacagtacc aacaaggtca ggtagtcccc gtcagttaa 1959
<210> 81
<211> 78
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 81
atggtaccct caacattttc tcgtttgaaa gccgcgcgtt gtctgcctgt tgttctggca 60
gccctgattt tcgccggt 78
<210> 82
<211> 585
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 82
tgtgtggggc aacgtgaacc tgcaccggta gaagaagtga aaccagcgcc ggaacaacca 60
gccgagccac aacagcctgt ccccacagtg ccctcggtgc cgacgatccc gcagcagcca 120
ggcccaattg agcacgaaga tcaaactgca ccgcctgcgc cgcatattcg ccattatgac 180
tggaatggcg caatgcagcc gatggtcagt aagatgcttg gggctgacgg ggtgactgcg 240
ggtagcgtcc tgctggttga tagcgttaac aaccgtacta acggttcgct gaatgccgca 300
gaagcgaccg aaacgctgcg aaatgcgctg gctaataacg ggaaatttac cctggtttcc 360
gcccagcaac tgtcgatggc gaagcaacag ttaggtttgt cgccgcagga cagtttaggc 420
acccgtagta aagccatagg cattgcccgc aatgtcggcg ctcattacgt gctgtactcc 480
agcgcctctg gcaacgttaa cgctccgacc ctacaaatgc agctgatgct ggtgcagacg 540
ggcgaaatta tctggtcagg taaaggtgcc gtttcgcagc aataa 585
<210> 83
<211> 57
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 83
atgacaaaaa tgagtcgcta cgccttgatt accgcgctgg cgatgtttct cgccggg 57

Claims (19)

1.一种质粒DNA的制造方法，其包含下述(a)～(c)的工序：
(a)制备在涉及外膜的特性维持的基因区域中具有突变，并且保持目标质粒的大肠杆菌的工序；
(b)培养(a)的大肠杆菌的工序；
(c)从培养后的菌体中回收目标质粒的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
涉及外膜的特性维持的基因区域是涉及外膜的物理性和/或机械性特性维持的基因区域。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，
涉及外膜的物理性和/或机械性特性维持的基因区域是直接涉及外膜的物理性和/或机械性特性维持的基因区域。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，
直接涉及外膜的物理性和/或机械性特性维持的基因区域是选自编码pal、lpp、ompA、ybiS、ycfS、erfK、tolA、tolB、nlpI、bamD、bamA、lolA、lol B、lolC、lolD、lolE、lptE、lptD、lptA、lptB、lptF、lptG、slyB、mrcA、mrcB、lpoA、lpoB、tolQ和tolR的结构蛋白质的序列、以及编码它们的信号肽的碱基序列、启动子序列和SD序列中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述大肠杆菌在选自Pal、Lpp、OmpA、YbiS、YcfS、ErfK、TolA、Tol B、NlpI、BamD、BamA、LolA、LolB、LolC、LolD、LolE、LptE、LptD、LptA、LptB、LptF、LptG、SlyB、MrcA、MrcB、LpoA、LpoB、TolQ和Tol R、以及它们的信号肽中的至少一种肽的氨基酸序列中具有突变。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，
所述大肠杆菌在选自Pal、Lpp、OmpA、YbiS、YcfS、ErfK和它们的信号肽中的至少一种肽的氨基酸序列中具有突变。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述突变为完全缺失。
8.根据权利要求1所述的方法，
所述突变为部分突变。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，
所述突变为信号肽的部分突变。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，
所述突变为结构蛋白质的部分突变。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，
所述结构蛋白质为以下的(A)～(E)中的任一种具有部分突变的结构蛋白质：
(A)结构蛋白质与外膜、肽聚糖层、内膜中的任一种相结合或接触，在其结合或接触的部分和/或其附近的氨基酸残基中具有置换或缺失的结构蛋白质；
(B)结构蛋白质具有使其他蛋白质与肽聚糖层相结合的酶活性，在其活性部位和/或其附近的氨基酸残基中具有置换或缺失的结构蛋白质；
(C)结构蛋白质是参与形成肽聚糖层的酶，在其活性部位和/或其附近的氨基酸残基中具有置换或缺失的结构蛋白质；
(D)结构蛋白质是参与存在于周质组分中的脂蛋白的外膜转运的蛋白质，在与脂蛋白的结合部位和/或其附近的氨基酸残基中具有置换或缺失的结构蛋白质；
(E)结构蛋白质是参与脂多糖的外膜转运的蛋白质，在与脂蛋白的结合部位和/或其附近的氨基酸残基中具有置换或缺失的结构蛋白质。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，
所述结构蛋白质为所述(A)的结构蛋白质，并且为选自Pal、Lpp、OmpA中的至少一种。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，
所述结构蛋白质为Pal，并且在其N末端侧的区域中具有所述突变。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，
所述结构蛋白质为Lpp，并且在其C末端侧的区域中具有所述突变。
15.根据权利要求12所述的方法，其中，
所述结构蛋白质为OmpA，并且在其C末端侧的区域中具有所述突变。
16.根据权利要求11所述的方法，其中，
所述结构蛋白质为所述(B)的结构蛋白质，并且为选自YbiS、YcfS、Erf K中的至少一种。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述大肠杆菌来源于B株或来源于K12株。
18.一种制备用于制造质粒DNA的大肠杆菌的方法，其包含下述(i)和(ii)的工序：
(i)在涉及大肠杆菌的外膜的特性维持的基因区域中添加突变的工序；和
(ii)制备具有通过(i)得到的突变，并且保持目标质粒的大肠杆菌的工序。
19.一种用于质粒DNA的制造的大肠杆菌，其在涉及外膜的特性维持的基因区域中具有突变，并且保持目标质粒。
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