KR101848102B1 - 콘드로이틴의 박테리아 생산을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

콘드로이틴의 박테리아 생산을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 박테리아 발효와 발효 후 황산화의 조합을 통한 콘드로이틴 설페이트의 생산을 비롯한, 콘드로이틴의 생산을 위한 재조합 DNA 기술 분야에 관한 것이다.

Description

콘드로이틴의 박테리아 생산을 위한 조성물 및 방법{Compositions and Methods for Bacterial Production of Chondroitin}
본 발명은 재조합 박테리아 발효 및 발효-후 황산화의 조합을 통해 콘드로이틴 설페이트를 생산함을 포함하는, 콘드로이틴의 생산을 위한 재조합 DNA 기술의 분야에 관한 것이다.
콘드로이틴은 글리코스아미노글리칸이라고 불리는 헤테로다당류의 계열에 속한다. 글리코스아미노글리칸(GAG)은, 둘 중 하나는 산성 당이고 다른 것은 황산화될 수 있는 아미노 당(N-아세틸글루코스아민 또는 N-아세틸갈락토스아민)인, 반복되는 이당류 단위로 구성된 분지되지 않은, 음성으로 하전된 다당류 쇄이다. 이들의 유연하지 않은 특성 및 높은 음성 전하로 인하여, GAG는 다량의 공간을 점유하고, 양이온과 물을 끌어들여 세포외 매트릭스 속에서 다공성 겔을 형성하는 고도로 연장된 형태를 나타낸다. 따라서, 대부분의 동물에서 발견되는 GAG는, 조직이 수화되어 확장하는 것을 돕고 매트릭스가 압축력을 견디도록 할 수 있게 돕는다. 예를 들어, 무릎 관절을 라이닝(lining)하는 연골 매트릭스는 이러한 메카니즘에 의해 수백의 대기압을 지지할 수 있다.
콘드로이틴 설페이트는 연골 강도 및 탄성의 유지에 중요하며 관절 통증을 감소시키고 건강한 연골과 관절 기능을 촉진시키기 위한 영양 보조제로서 시판된다. 임상 연구는 골관절염(참조: 예를 들면, Kahan et al ., Arthritis and Rheumatism 2009;60:524-533; Michel et al ., Arthritis and Rheumatism 2005;52:779-786 및 Uebelhardt et al ., Osteoarthritis and Cartilage 2004;12:269-276), 사이질 방광염(참조: 예를 들면, Nickel et . al., BJU Int . 2009;103:56-60 and Cervigni et al ., Int. Urogynecol. J. Pelvic Floor Dysfunct. 2008;19:943-947), 및 윤활막염[참조: 예를 들면, Hochberg and Clegg, Osteoarthritis and Cartilage 2008;16(Suppl. 3):S22-S24 and Moller, Osteoarthritis and Cartilage 2009;17(Suppl. 1):S32-S33]의 치료를 위한 콘드로이틴 설페이트의 용도를 지지한다. 이들 문헌들은, 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
콘드로이틴 설페이트는 현재 단백질로부터 다당류를 분해하여 다양한 품질의 다당류 생성물을 생산하기 위한 화학적 및 효소적 처리를 사용하여, 소, 돼지, 상어 및 가금류를 포함하는 동물의 연골로부터 추출함으로써 생산된다(참조: Barnhill et al ., J. Am. Pharm. Assoc . 2006;46:14-24, Volpi, J. Pharm . Pharmacol . 2009;61:1271-1280).
콘드로이틴은 D-글루쿠론산(GlcUA) 및 N-아세틸-D-갈락토스아민(GalNAc)을 함유한다. 이는 이당류 반복 단위 β3GalNAc-β4GlcUA로 구성된다. 전형적으로, GalNAc 잔기는 4 및 6번 위치에서 다양하게 황산화된다. 콘드로이틴 설페이트는 천연적으로 사람 및 다른 동물에서 관절과 같은, 연골 조직의 구조 성분인 프로테오글리칸의 성분으로서 발생한다. 프로테오글리칸은 코어 단백질 및, 도 1에 나타낸 바와 같이 올리고사카라이드 링커를 통해 단백질에 공유결합으로 부착된, 콘드로이틴 설페이트와 같은 다당류 성분으로 구성된다. 코어 단백질은 다수의 다당류 쇄로 장식된다. 프로테오글리칸은 세포 막내에서 세포외 공간에 존재하는 단백질의 다당류-함유 부위를 사용하여 고정(anchor)될 수 있거나 세포외 매트릭스내에 분비되어 국재화할 수 있다(참조: Prydz and Dalen, J. Cell Sci. 2000;113:193-205).
콘드로이틴 골격을 합성하는데 관여하는 글리코실트랜스퍼라제 효소(콘드로이틴 신타제)는 수용하는 기질에 UDP-GalNAc 및 UDP-GlcUA 공여체로부터의 GalNAc 및 GlcUA의 교번되는 단당류 단위를 가함으로써 이를 수행한다. 이들 효소는 사람에서 확인되어 있으며(참조: Kitagawa et al., J. Biol. Chem. 2001;276:43894-43900; Yada et al., J. Biol. Chem. 2003;278:39711-39725), 사람 콘드로이틴 신타제의 상동체는 말, 소, 설치류, 개, 닭, 제브라 피쉬(zebra fish), 선충, 및 곤충을 포함하는 각종의 다른 동물에서 확인되어 왔다(참조: www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene/8950).
일부 박테리아는 또한 이들의 캡슐 성분으로서 콘드로이틴 또는 콘드로이틴-유사 다당류 중합체를 생산한다. 척추동물에서 발견된 콘드로이틴 설페이트와는 달리, 미생물 콘드로이틴은 프로테오글리칸으로서 존재하지 않으며, 오히려 박테리아 세포 표면에 지질-결합된 다당류로서 및 배양 배지 속에서 유리된(즉, 세포-연합되지 않은) 다당류로서 존재한다(참조: Whitfield, Annu. Rev. Biochem. 2006;75:39-68; DeAngelis, Glycobiol. 2002;12:9R-16R).
2개의 박테리아, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) K4(참조: Rodriguez et al., Eur. J. Biochem. 1988;177:117-124) 및 파스퇴렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 혈청형 F(참조: Rimler, Vet. Rec. 1994;134:191-192)은 화학적으로 변형되어 콘드로이틴 설페이트를 잠재적으로 생산할 수 있는 황산화되지 않은, 콘드로이틴-유사, 캡슐 다당류(capsular polysaccharide)를 생산하는 것으로 보고되었다. 에스케리키아 콜라이 K4는 로드리게즈(Rodriguez) 등에 의해 캡슐 중합체 성분으로서 프럭토즈 측쇄(K4 항원)를 지닌 황산화되지 않은 콘드로이틴 골격을 생산하는 것으로 밝혀졌다. 니노미야(Ninomiya) 등(참조: J. Biol. Chem. 2002;277:21567-21575)은 에스케리키아 콜라이 K4내에서 콘드로이틴-유사 캡슐 다당류의 생합성에 필요한 주요 유전자를 확인하고 서열분석하였다. 이들 서열은 수탁 번호 AB079602로 GenBankTM에 기탁되었다. 니노미야 등에 의해 기재된 서열은 에스케리키아 콜라이 K4의 "2 군(group 2)" 캡슐 유전자 클러스터의 소위 "영역 2" 부위를 포함한다. 에스케리키아 콜라이내 캡슐 유전자 클러스터의 구성의 상세한 설명은 휘트필드(Whitfield)(참조: Annu. Rev. Biochem. 2006;75:39-68)에 의해 제공된다. 에스케리키아 콜라이 2 군 캡슐 유전자 클러스터의 영역 2 유전자는 캡슐 다당류의 구조를 결정하는 단백질을 코딩(encoding)한다. AB079602 서열은 에스케리키아 콜라이 K4 콘드로이틴 폴리머라제를 인코딩하는 kfoC로 명명된 서열을 포함한다. 에스케리키아 콜라이 K4 콘드로이틴 폴리머라제는 GlcUA 및 GalNAc를 교번적으로 콘드로이틴 당 쇄 및 관련된 올리고사카라이드의 비-환원 말단에 이전시켜, K4 항원 다당류의 콘드로이틴 골격을 생산하는 이기능성 글리코실트랜스퍼라제이다. 에스케리키아 콜라이 K4에 의해 생산된 콘드로이틴-유사 캡슐 다당류는 콘드로이틴의 GlcUA 잔기에 연결된(β1,3), 프럭토즈를 함유한다. 파스퇴렐라 물토시다 F형은 또한 황산화되지 않은 콘드로이틴 캡슐 성분을 생산하며 당해 유기체내에서 콘드로이틴 중합에 관여하는 글리코실트랜스퍼라제는 또한 문헌(참조: DeAngelis & Padgett-McCue, J. Biol. Chem. 2000;275:24124-29)에 보고된 바와 같이 클로닝되어 있다. K4 콘드로이틴 폴리머라제와 유사하게, 파스퇴렐라 콘드로이틴 신타제(pmCS, Genbank 수탁 번호 AAF97500)는 적절한 수용체 기질과 함께 제공되는 경우, UDP-GlcUA 및 UDP-GalNAc로부터 콘드로이틴 중합체를 합성할 수 있는 단일 폴리펩타이드 효소이다.
동물 조직으로부터의 정제를 포함하는 콘드로이틴 설페이트 생산의 전통적인 방법은 노동 및 비용 집약적일 수 있다. 또한, 동물 조직으로부터 콘드로이틴 설페이트의 생산은, 감염성 제제가 콘드로이틴 설페이트 생성물내에 존재할 가능성과 필수적으로 관련되어 있다. 이러한 잠재적인 감염성 제제의 경향성을 최소화하기 위해 동물 조직으로부터 생산 동안 주의를 기울여야만 한다. 이러한 단점들은 콘드로이틴의 생산을 위해 재조합 DNA 기술을 이용하는 대체 시도를 사용함으로써 해결될 수 있다. 최근에, 콘드로이틴의 미생물 생산은 데안젤리스(DeAngelis)(미국 특허출원 공개 제20030109693호) 및 시미니(Cimini) 등[참조: Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010;85(6):1779-87 (Epub Oct. 1, 2009)]에 의해 제안되어 있다. 그러나, 콘드로이틴{파스퇴렐라 물토시다} 또는 콘드로이틴-유사(에스케리키아 콜라이 K4) 다당류를 생산하는 공지된 미생물은 각종 포유동물에 대한 공지된 병원균이므로 대규모 발효에 적합하지 않다. 이들은 또한 다당류의 비교적 낮은 생산자이다.
특히, 파스퇴렐라 물토시다는 이의 저 수율, 고가의 배지의 요구, 및 특수하고 고가의 시설을 요구하는 생물학적 위험 수준 2(Biohazard Level 2: BL2) 상태로 인하여 콘드로이틴의 상업적인 생산에 적합하지 않은 것으로 고려된다. 미생물로부터의 고 수율은 콘드로이틴의 상업적으로 수익성이 있는 생산에 필수적일 수 있다. 데안젤리스(DeAngelis)(미국 특허출원 공개 제20030109693호)는 식품 등급 락토코쿠스(Lactococcus) 또는 바실러스(Bacillus)와 같은 숙주 세포내에서 pmCS를 발현하여 재조합 콘드로이틴을 합성할 가능성을 언급하고 있다. 그러나, 바실러스는 그람 양성 박테리아이며, 따라서 에스케리키아 콜라이 및 파스퇴렐라 물토시다와 같은 그람 음성 유기체보다 매우 상이한 막/세포벽 구조를 갖는다. 따라서, 중합체의 효과적인 분비는 바실러스에서 문제가 될 것으로 예측될 수 있다.
에스케리키아 콜라이 K4는 또한 사람 병원체인 것으로 공지되어 있으므로 콘드로이틴의 생산에 적합하지 않다. 또한, 이는 콘드로이틴 그 자체를 생산하지 않으나, 위에 주목한 바와 같이 콘드로이틴의 프럭토실화된(fructosylated) 형태를 대신 생산한다. 이러한 다당류의 집중적인 화학적 또는 효소적 변형이 콘드로이틴을 생산하기 위해 필요하다. 이러한 변형은 공정의 전체 비용을 증가시킨다. 또한, 이는, 이러한 변형이 완료되어 일관된 생성물을 생성하는 것을 측정하기 위한 추가의 과정 및 품질 조절 측정의 도입을 필요로 한다.
따라서, 콘드로이틴을 생산하기 위한 효율적이고, 안전하며 비용 효과적인 공정이 요구되고 있다. 본 발명은 콘드로이틴 설페이트를 생산하기 위해 후속적으로 황산화될 수 있는 콘드로이틴의 재조합 미생물 생산을 위한, 작제물(construct) 및 숙주 세포 및 방법을 제공함으로써 이러한 요구를 해결한다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kfoA, kfoC, 및 kfoF를 포함하는 유전자 클러스터를 포함하는 작제물에 관한 것이며, 여기서 유전자 클러스터는 kfoD, orf3(kfoI), kfoE, 또는 orf1(kfoH) 중 하나 이상의 기능성 유전자를 함유하지 않으며, 여기서 작제물은 비-병원성 박테리아 숙주 세포에서 콘드로이틴을 생산하는데 적합하다. 일부 양태에서, 콘드로이틴은 프럭토실화되지 않는다. 일부 양태에서, 콘드로이틴은 숙주 세포로부터 분비된다. 일부 양태에서, 유전자 클러스터는 또한 kfoG, kfoB, 또는 kfoG 및 　kfoB 둘다를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 유전자 클러스터는 kfoM 및 　kfoT를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 작제물은 pDD66, pDD67, pCX040, pCX041, pCX042, pCX043, pCX096, 또는 pBR1052를 포함한다.
본 발명은 kfoA, kfoC, 및 kfoF를 포함하는 유전자 클러스터를 포함하는 작제물에 관한 것이며, 여기서 유전자 클러스터는 kpsM, kpsT, kpsE, kpsD, kpsC, 또는 kpsS 중 하나 이상의 기능성 유전자를 함유하지 않으며, 여기서 작제물은 비-병원성 박테리아 숙주 세포내에서 콘드로이틴을 생산하기에 적합하다. 일부 양태에서, 콘드로이틴은 숙주 세포로부터 분비되지 않는다. 일부 양태에서, 작제물은 또한 kfoD, orf3, kfoE, 또는 orf1 중 하나 이상의 기능성 유전자를 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 콘드로이틴은 비-프럭토실화된다. 일부 양태에서, 유전자 클러스터는 또한 kfoG, kfoB, 또는 kfoG 및 kfoB 둘다를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 작제물은 kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, 및 kfoG를 포함한다. 일부 양태에서, 작제물은 pCX039, pCX044, 또는 pCX092를 포함한다. 일부 양태에서, 작제물은 pCX045 또는 pCX048을 포함한다.
본 발명은 kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 포함하는 작제물에 관한 것이며, 여기서 작제물은 kpsM, kpsT, kpsE, kpsD, kpsC, 또는 kpsS 중 하나 이상의 기능성 유전자를 함유하지 않으며, 작제물은 비-병원성 박테리아 숙주 세포내에서 콘드로이틴을 생산하거나 콘드로이틴의 양을 증가시키기에 적합하다. 일부 양태에서, 콘드로이틴은 숙주 세포로부터 분비되지 않는다. 일부 양태에서, 작제물은 또한 kfoD, orf3, kfoE, 또는 orf1 중 하나 이상의 기능성 유전자를 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 콘드로이틴은 프럭토실화되어 있지 않다. 일부 양태에서, 작제물은 kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, 및 kfoG를 포함한다. 일부 양태에서, 작제물은 pCX075, pCX081, pCX082, pCX092, pCX101, pBR1102, pBR1100 또는 pBR1101을 포함한다. 일부 양태에서, 작제물은 pCX045 또는 pCX048을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 작제물 중 어느 것에서 하나 이상의 유전자는 박테리아 숙주 세포내에서 최적의 코돈 사용빈도(codon usage)를 위해 변형된다.
일부 양태에서, 본 발명의 작제물 중 임의의 것은 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 프로모터는 Pm, Plac, Ptrp, Ptac, λpL, PT7, PphoA, ParaC, PxapA, Pcad, 및 PrecA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 프로모터는 Pm이다.
일부 양태에서, 본 발명의 작제물 중 임의의 것은 제2 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 제2 프로모터는 Pm, Plac, Ptrp, Ptac, λpL, PT7, PphoA, ParaC, PxapA, Pcad, 및 PrecA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 제2 프로모터는 Pm이다.　 일부 양태에서, 제2 프로모터는 작제물내 하나 이상의 유전자에 작동적으로 연결된다. 일부 양태에서, 제2 프로모터는 kpsFEDUCS에 작동적으로 연결된다.
일부 양태에서, 작제물은 xylS 조절 유전자를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 작제물 중 임의의 것은 항생제 내성 유전자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 항생제 내성 유전자는 클로람페니콜(CamR), 카나마이신(KanR), 암피실린(AmpR), 테트라사이클린(TetR), 블레오마이신(BleR), 스펙티노마이신(SpcR), 설폰아미드(SuR), 스트렙토마이신(StrR), 카르베니실린(CbR), 및 에리트로마이신(EryR)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 본 발명의 작제물 중 임의의 것은 K4 유전자 클러스터를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 작제물 중 임의의 것은 비-병원성 박테리아 숙주 세포내에서 콘드로이틴을 생산하기에 적합하며, 여기서, 박테리아 숙주 세포는 에스케리키아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 잔토모나스(Xanthomonas), 메틸로모나스(Mehtylomonas), 악시네토박터(Acinetobacter) 및 스핑고모나스(Sphingomonas)로 이루어진 군으로부터 선택된 비-병원성 유기체이거나 이로부터 유래된다.
본 발명은 본 발명의 작제물 중 어느 것을 포함하는 비-병원성 박테리아 숙주 세포에 관한 것이다. 일부 양태에서, 박테리아 숙주 세포는 에스케리키아, 슈도모나스, 잔토모나스, 메틸로모나스, 악시네토박터, 및 스핑고모나스로 이루어진 군으로부터 선택된 비-병원성 유기체이거나 이로부터 유래한다. 일부 양태에서, 박테리아 숙주 세포는 MSC279, MSC280, MSC315, MSC316, MSC317, MSC319, MSC322, MSC323, MSC324, MSC325, MSC326, MSC328, MSC346, MSC347, MSC348, MSC350, MSC356, MSC359, MSC392, MSC402, MSC403, MSC404, MSC405, MSC410, MSC411, MSC436, MSC437, MSC438, MSC439, MSC458, MSC459, MSC460, MSC461, MSC466, MSC467, MSC469, MSC480, MSC494, MSC498, MSC499, MSC500, MSC510, MSC511, MSC522, MSC526, MSC537, MSC551, MSC561, MSC562, MSC563, MSC564, MSC566, MSC567, MSC619, MSC625, MSC627, MSC640, MSC641, MSC643, MSC646, MSC650, MSC656, MSC657, MSC658, MSC659, MSC660, MSC669, MSC670, MSC671, MSC672, MSC673, MSC674, MSC675, MSC676, MSC677, MSC678, MSC679, MSC680, MSC681, MSC682, MSC683, MSC684, MSC687, MSC688, MSC689, MSC690, MSC691, MSC692, MSC693, MSC694, MSC700, MSC701, MSC702, MSC722, MSC723 및 MSC724로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아 균주이다.
본 발명은 본 발명의 작제물 중 어느 것을 비-병원성 박테리아 숙주 세포로 이전시키고, 당해 박테리아 숙주 세포를 콘드로이틴이 박테리아 숙주 세포에 의해 생산되는 발효 조건하에서 배양함을 포함하는, 콘드로이틴을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 작제물 중 어느 것을 포함하는 비-병원성 박테리아 숙주 세포를 콘드로이틴의 생산에 충분한 발효 조건하에서 배양함을 포함하는, 콘드로이틴을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 작제물 중 어느 것을 비-병원성 박테리아 숙주 세포로 전달함을 포함하는, 비-병원성 박테리아 숙주 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명의 작제물 중 어느 것의 유전자 또는 유전자 클러스터는 본 발명의 방법 중 어느 것에서 박테리아 숙주 세포의 염색체 내로 통합된다.
일부 양태에서, 본 발명의 작제물 중 어느 것의 유전자 또는 유전자 클러스터의 2개 이상의 카피가 본 발명의 방법 중 어느 것에서 박테리아 숙주 세포의 염색체 내로 통합된다. 일부 양태에서, 유전자 클러스터 또는 유전자의 2개 이상의 카피는 동일한 유전자 또는 유전자 클러스터 중 2개 이상의 카피를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법 중 어느 것에 의해 생산된 콘드로이틴은 프럭토실화되지 않는다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법은 콘드로이틴을 황산화시키는 것을 추가로 포함한다.
본 발명은 본 발명의 방법 중 어느 것에 의해 콘드로이틴을 생산하고; 콘드로이틴을 황산화시키는 것을 포함하는, 콘드로이틴 설페이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법 중 어느 것에서 콘드로이틴을 황산화하는 공정은 설퍼트라이옥사이드-트라이에틸아민 복합체 또는 클로로설폰산을 포름아미드 내의 콘드로이틴과 혼합함을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법 중 어느 것에서 박테리아 숙주 세포는 에스케리키아, 슈도모나스, 잔토모나스, 메틸로모나스, 악시네토박터, 및 스핑고모나스로 이루어진 군으로부터 선택된 비-병원성 유기체이거나 이로부터 유래된다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법 중 어느 것에서 박테리아 숙주 세포는 그람-음성 유기체이거나 이로부터 유래된다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법 중 어느 것에서 박테리아 숙주 세포는 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris)이다.　 일부 양태에서, 잔토모나스 캄페스트리스는 MSC255, MSC256, MSC257, MSC225, 및 MSC226으로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아 균주이다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법 중 어느 것에서 박테리아 숙주 세포는 비-병원성 에스케리키아 콜라이이다. 일부 양태에서, 비-병원성 에스케리키아 콜라이는 에스케리키아 콜라이 K-12 및 에스케리키아 콜라이 B로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 에스케리키아 콜라이 K-12는 MSC188 및 MSC175로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아 균주이다. 일부 양태에서, 에스케리키아 콜라이 B는 박테리아 균주 MSC364이다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법 중 어느 것에서 박테리아 숙주 세포의 내인성 유전자는 상동성 재조합에 의해 결실되거나 불활성화된다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법 중 어느 것에서 박테리아 숙주 세포는 숙주 세포에 대해 내인성인 세포외 다당류를 발현하지 않는다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법 중 어느 것에서 박테리아 숙주 세포는 실험실 클로닝 균주로부터 접합 전달(conjugal transfer)에 적합하다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법은 박테리아 숙주 세포로부터 콘드로이틴을 회수하는 것을 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법은 세포외 배양 배지로부터 콘드로이틴을 회수함을 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 1 g/L 내지 50 g/L의 콘드로이틴이 24 내지 72시간내에 본 발명의 방법 중 어느 것에서 박테리아 숙주 세포로부터 분비된다. 일부 양태에서, 5 g/L 내지 50 g/L의 콘드로이틴이 24 내지 72시간내에 박테리아 숙주 세포로부터 분비된다. 일부 양태에서, 15 g/L 내지 50 g/L의 콘드로이틴이 24 내지 72시간내에 박테리아 숙주 세포로부터 분비된다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법 중 임의의 것은 콘드로이틴을 정제함을 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법 중 어느 것에서 박테리아 숙주 세포는 25℃ 내지 37℃에서 배양된다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법 중 어느 것에서 박테리아 숙주 세포는 글리세린을 포함하는 배지 속에서 배양된다.
본 발명은 본 발명의 방법 중 어느 것에 의해 생산된 콘드로이틴에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 방법 중 어느 것에 의해 생산된 콘드로이틴을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 KpsF의 서열 번호 92, KpsE의 서열 번호 93, KpsD의 서열 번호 94, KpsU의 서열 번호 95, KpsC의 서열 번호 96, KpsS의 서열 번호 97, KpsT의 서열 번호 91, KfoA의 서열 번호 83, KfoB의 서열 번호 84, KfoC의 서열 번호 85, KfoI(Orf3)의 서열 번호 86, KfoE의 서열 번호 87, KfoH(Orf1)의 서열 번호 88, KfoF의 서열 번호 89, 및 KfoG의 서열 번호 90의 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 결합하는 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
본 발명은 콘드로이틴의 생산을 위한 작제물 및 재조합 세포, 콘드로이틴을 생산하는 방법, 이러한 방법으로 생산된 콘드로이틴, 및 콘드로이틴의 용도에 관한 것이다. 본원에 기술된 대로, 본 발명은 콘드로이틴 및 콘드로이틴 설페이트의 생산을 허용하는 신규 기술을 기초로 한다. 본 발명은 보다 저렴한 비용으로 콘드로이틴 및 콘드로이틴 설페이트의 안전하고, 일관되며 신뢰할만한 공급을 제공하면서, 우수한 생성물 품질을 제공함으로써 당해 분야의 중요한 요구를 충족한다. 당해 공정은 또한 채식주의자 및 유대교인 제품을 제공할 수 있다. 재조합적으로 생산된 콘드로이틴은 공지된 방법을 사용하여 황산화함으로써 콘드로이틴 설페이트를 형성시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 재조합적으로 생산된 콘드로이틴의 황산화 방법, 재조합적으로 생산된 콘드로이틴 설페이트 생성물, 및 재조합적으로 생산된 콘드로이틴 설페이트 생성물의 용도를 포함한다.
도 1a는 콘드로이틴 및 콘드로이틴 설페이트의 구조를 나타낸다. 도 1b는 콘드로이틴 설페이트와 프로테오글리칸의 코어 단백질 사이의 연결을 나타낸다.
도 2는 본 발명 이전에 제안된 바와 같은, 에스케리키아 콜라이 K4 캡슐의 합성에 관여하는 유전자 클러스터의 구성을 나타낸다. 당해 도에 나타낸 영역 2의 구성은 문헌(참조: Ninomiya et al., J. Biol. Chem. 2002;277:21567-21575)에 기술된 바와 같다. 에스케리키아 콜라이 K4 캡슐 유전자 클러스터의 영역 1 및 3은 본 발명 이전에 서열분석되지 않았으므로, 이들의 구조는 본 발명 이전에 공지되어 있지 않았다.
도 3은 문헌(참조: Ninomiya et al., J. Biol. Chem. 2002;277:21567-21575)에 기술된 바와 같이 에스케리키아 콜라이 K4 캡슐 영역 2 서열(AB079602)의 본 발명의 발명자들에 의한 분석을 나타낸다. 도 3a는 추가의 추정된 코딩 서열 orf1, orf2 및 orf3의 존재를 나타내며, 에스케리키아 콜라이 K4로부터의 영역 2와 파스퇴렐라 물토시다 혈청형 B 및 E의 서열 정렬을 기초로 하여, 에스케리키아 콜라이 K4로부터의 유전자(도 3b에 나타낸 정렬 데이타), kfoD, orf3, kfoE, orf1이 파스퇴렐라 물토시다 M1404 혈청형 B 유전자 bcbDEFG 및 파스퇴렐라 물토시다 P1234 혈청형 E 유전자 ecbDEFG 중에서 상동체를 가짐을 추가로 나타낸다. 상동체는 쌍두 화살표로 연결되어 있다.
도 4는 본 발명자들에 의해 측정된 것으로서 에스케리키아 콜라이 K4 균주 ATCC 23502의 영역 2 유전자의 서열에 관한 것이다. 도 4a는 니노미야(Ninomiya) 등에 의해 앞서 보고된 서열과 비교하여 본 발명자들에 의해 측정된 서열들 사이의 차이를 나열한다. 도 4b는 본 발명자들에 의해 측정된 것으로서, 영역 2 유전자의 서열(도 4b에서 서열 번호 30; 서열 번호 32; 서열 번호 26; 서열 번호 24; 및 서열 번호 20으로 나타냄)에 의해 인코딩된 예측된 아미노산 서열과 니노미야 등에 의해 보고된 서열(도 4b에서 K4 Kfo putORF2 및 K4 KfoG_BAC00518; K4 Kfo putORF_1; K4 KfoE_BAC00520; K4 KfoD_BAC00521; K4 KfoB_BAC00524로 나타냄)에 의해 인코딩된 것들의 비교를 나타낸다.
도 5는 에스케리키아 콜라이 K4 균주 U1-41로부터의 K4 캡슐 유전자 클러스터의 구성을 나타낸다. 유전자 클러스터는 단백질을 인코딩하는 것으로 예측된 17개의 개방 판독 프레임(open reading frame)(IS2 배제)을 함유한다.
도 6은 3개의 분절, kpsFEDUCS("FS 분절"), kpsMTkfoABCFG("MG 분절") 및 kfoDIEH("DH 분절")로 작제된 합성 유전자의 구조를 도표로 나타낸다. 묘사한 바와 같이, 제한 부위는 전략적 위치에서 혼입되어 합성 단편이 하나 이상의 오페론내로 조립되도록하고 개개 유전자의 조작을 촉진하였다.
도 7a는 특정 유전자 또는 유전자 클러스터의 결실에 의해 유도체 박테리아 균주를 작제하기 위한 팝 인(pop in), 팝-아웃(pop-out) 전략을 나타낸다. 도 7b는 당해 전략에서 잔토모나스 캄페스트리스내에서 당해 전략을 사용하기 위해 사용된 자살 벡터 pCX027(서열 번호 141)의 지도를 나타낸다.
도 8a 내지 8u는 본 발명의 플라스미드 및 DNA 단편 pBHR1, pDD39, pDD42, pDD47, pREZ6, pDD49, pJ201:11352, pDD50, pDD54, pJ241:10662, pJ241:10664, pJ241:10663, pDD37, pDD38, pDD51, pDD52, pDD57, pDD58, pDD61, pDD62, pDD63, pDD59, pDD67, pDD60, pDD66, pBR1052, pMAK-CL, pDD74, pDD76, pDD73, pDD77, pDD79, pDD80, pCX045, pCS048, pCX039, pCX044, pCX040, pCX042, pCX041, pCX043, MSC467, MSC561, 및 pBR1087에 대한 DNA 지도를 나타낸다.
도 9는 에스케리키아 콜라이 K4 2 군 캡슐 유전자 클러스터에 의해 인코딩된 단백질에 대해 지시된 항혈청을 사용하여 수행된 웨스턴 블롯으로부터의 결과의 예를 나타낸다.
도 10a 내지 10d는 잔토모나스 캄페스트리스내로 클로닝된 에스케리키아 콜라이 K4 콘드로이틴 생합성 유전자를 도입시키기 위해 사용된 플라스미드 작제물의 DNA 지도를 나타낸다.
도 11a는 억제성 ELISA에서 측정된 K4 프럭토실화된 콘드로이틴 캡슐 다당류("K4P")에 대한 대표적인 교정 곡선을 나타낸다. 도 11b는 콘드로이틴을 위한 콘드로이티나제/HPLC에서 측정된, 이당류, 2-아세트아미도-2-데옥시-3-O-(β-D-글루코-4-에네피라노실우론산)-D-갈락토즈("△di-0S")의 대표적인 표준 곡선을 나타낸다.
도 12는 재조합 콘드로이틴의 콘드로이티나제 분해능을 나타낸다.
도 13은 K4 프럭토실화된 콘드로이틴 캡슐 다당류(K4P) 및 탈푸럭토실화된(defructosylated) K4P(DFK4P) 둘다의 콘드로이티나제 분해능을 나타낸다.
도 14a 내지 14x는 본 발명의 플라스미드 작제물 pCX096, pCX097, pCX100, pCX101, pCS102, pCX075, pCX082, pCX081, pCX092, pBR1077, pBR1082, pCX050, pCX070, pCX093, pCX094, pCX095, pMAK705p1, pBR1103, pBR1093lacZ, pBR100-lac, pBR1094mt1, pBR1101-mt1, pBR1095fru, 및 pBR1102-fru에 대한 DNA 지도를 나타낸다.
도 15는 콘드로이틴-생산 에스케리키아 콜라이 균주의 가계수 및 균주 유도체화에 사용된 단계들을 나타낸다.
하기 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 에스케리키아 콜라이 K4 프럭토실화된 콘드로이틴 캡슐 다당류(K4P)의 생합성에 관여된 단백질을 인코딩하는 에스케리키아 콜라이 K4 유전자를 서열분석하고, 천연 서열을 기초로 하여, DNA 분절을 합성하고 조립하였으며, 이들 유전자를 대규모 발효에 적합한 대체 숙주 세포내로 이전시켜, 이들 숙주 세포내에서 재조합 프럭토실화된 콘드로이틴 캡슐 다당류의 생산을 입증하였다. 대안의 숙주 세포는 비-프럭토실화된 콘드로이틴을 생산하여야 하는 것이 바람직하므로, 에스케리키아 콜라이 K4에 의한 콘드로이틴의 프럭토실화에 관여하는 유전자를 확인하고 대체 숙주로 전달된 에스케리키아 콜라이 K4 콘드로이틴 생합성 유전자 세트로부터 결실시켰다. 그 결과, 당해 유전자 세트를 함유하는 대체 숙주는 비-프럭토실화된 콘드로이틴을 생산하였다. 대체 숙주에 의해 생산된 이러한 재조합 콘드로이틴(rCH)은 황산화되어 콘드로이틴 설페이트 생성물을 생산할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "K4P"는 야생형 에스케리키아 콜라이 K4 균주에 의해 합성된 천연의 또는 천연적으로 존재하는 프럭토실화된 콘드로이틴 캡슐 다당류를 말한다. 용어 "콘드로이틴"은 콘드로이틴 골격을 말한다. 콘드로이틴은 프럭토실화되거나 프럭토실화되지 않을 수 있다(또는 비-프럭토실화 될 수 있다). 본원에 사용된 것으로서, 용어 "콘드로이틴"은 구체적으로 나타내지 않는 한 프럭토실화된 형태 및 프럭토실화되지 않은 형태 둘다를 포함한다. 또한, 본원에 사용된 것으로서, 용어 콘드로이틴은 황산화되지 않은 콘드로이틴을 말한다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 콘드로이틴은 하기 상세히 설명한 바와 같이 효소적 수단 또는 화학적 수단에 의해 황산화될 수 있으며, 여기서 이는 콘드로이틴 설페이트로 언급된다.
하나의 국면에서, 본 발명은 에스케리키아 콜라이 K4 유전자 세트 또는 유전자 클러스터를 포함하는 DNA 작제물을 포함한다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "K4 유전자 클러스터"는 콘드로이틴-유사 캡슐 다당류(K4P)의 생합성에 관여하는 에스케리키아 콜라이 K4로부터의 유전자 세트를 말한다. 용어 "K4 유전자 클러스터"는 콘드로이틴-유사 캡슐 다당류의 생합성에 관여한 에스케리키아 콜라이 K4로부터의 모든 유전자 또는 이들 유전자의 서브세트를 말할 수 있다.
실시예 1에 기술된 바와 같이, 에스케리키아 콜라이 K4는 K4P로서 언급된 콘드로이틴-유사 캡슐 다당류의 합성에 관여된 다수 유전자의 세트를 함유한다. 위에 나타낸 바와 같이, 당해 다당류는 프럭토즈 잔기의 첨가에 의해 변형된 콘드로이틴 골격으로 이루어진다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 이들 유전자는 3개의 주요 영역[영역 1("R1"), 영역2("R2") 및 영역 3("R3")]으로 구성된다. 문헌[참조: Ninomiya et al. (2002)](GenBank 수탁 번호 AB079602)]에 기술된 영역 2의 서열을 기초로 하여, 영역 2는 캡슐 생합성과 관련된 7개의 유전자, kfoA, kfoB, kfoC, kfoD, kfoE, kfoF 및 kfoG를 포함하는 것으로 예측되었다. 니노미야 등은 에스케리키아 콜라이 K4 캡슐 유전자 클러스터의 예측된 영역 1 및 영역 3 부분의 서열을 기재하지 않았다. 그러나, 다른 에스케리키아 콜라이 캡슐 유전자 클러스터의 공지된 구성을 기초로 하여, 영역 1은 6개의 유전자, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS를 포함하는 것으로 예측될 수 있으며 영역 3은 2개의 유전자, kpsM 및 kpsT를 포함하는 것으로 예측될 수 있다. kpsM, kpsT, kpsD, kpsE, kpsC 및 kpsS 유전자는 세포 세포질로부터 세포 표면으로 캡슐 다당류의 전좌에 요구된 단백질을 인코딩하며, 여기서 성숙한 캡슐 다당류는 이러한 막의 지질 성분에의 공유 결합을 통해 외부 세포 막에 고정되는 것으로 여겨진다(참조: Whitfield, 2006). kpsF 및 kpsU 유전자는 CMP-Kdo의 생합성에서 단계들을 촉매하는 것으로 예측된 단백질을 인코딩한다. 에스케리키아 콜라이내에서 콘드로이틴 캡슐의 생합성시 CMP-Kdo의 역활은 제안되어 있지만(참조: Roberts, Annu. Rev. Microbiol. 1996;50:285-315) 실험적으로 입증되어 있지는 않다(참조: Whitfield, 2006). 따라서, 본 발명의 기재내용 이전에, 전체 K4 유전자 클러스터는 15개 유전자를 포함하는 것으로 고려되었다.
니노미야 등에 의해 보고된 서열(GenBank 수탁 번호 AB079602)을 확인하기 위해, 본 발명자들은 에스케리키아 콜라이 K4 균주 ATCC 23502로부터의 K4 캡슐 유전자 클러스터의 영역 2를 서열분석하였다. 본 발명자들에 의해 측정된 서열 및 AB079602 서열을 비교했을 때, 26번 위치에서 치환, 결실 및 삽입을 포함하는, 단일 염기 쌍 차이가 발견되었다. 실시예 1에 상세히 설명된 바와 같이, 이들 차이들 중 일부는 유전자 클러스터에 의해 코딩된 영역 2 단백질의 예측된 아미노산 서열에서 상당한 차이를 생성한다. 또한, 본 발명자들은 유전자를 분리하는 유전자간 서열로서 니노미야 등에 의해 확인된 영역을 시험하고, 앞서 확인되지 않았던 영역 2내 3개의 추가의 개방 판독 프레임 orf1(또한 본원에서 kfoH로 언급됨), orf2 및 orf3(또한 본원에서 kfoI으로 언급됨)을 확인하였다.
모든 3개 영역으로부터의 유전자를 포함하는 전체 K4 유전자 클러스터의 정확한 서열을 측정하기 위하여, 에스케리키아 콜라이 혈청형 K4 균주 U1-41을 Statens Serum Institut(덴마크 코펜하겐 소재)로부터 입수하였다. U1-41은 ATCC 23502 균주의 조상이며 배양물 속에 K4 캡슐 다당류를 생산하는 것으로 보고되어 있다. 이는 또한 에스케리키아 콜라이 혈청형구분(serotyping)을 위한 K4 참조 균주이며 문헌[참조: Rodriguez et al. (1988)]에 의해 K4P 구조적 측정에 사용된 다당류 제제를 생산하는데 사용되었다. 에스케리키아 콜라이 U1-41내 K4 캡슐 유전자 클러스터에 걸친(spanning) 총 약 23kb의 DNA를 서열분석하였다. 당해 서열(서열 번호 117)은 영역 1내 kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC 및 kpsS 유전자의 존재 및 영역 3내 kpsM 및 kpsT 유전자의 존재를 확인하였다. U1-41의 영역 2 서열 및 ATCC 23502의 영역 2에 대해 본 발명자들에 의해 측정된 서열은 동일한 것으로 밝혀졌다.
실시예 1에 상세히 기재되어 있는 바와 같이, U1-41로부터의 유전자 클러스터는 콘드로이틴의 생합성에 관련된 단백질을 인코딩하는 것으로 예측되는 (IS2 서열 배제) 17개의 개방 판독 프레임(Nonomiya 등에 의해 앞서 기술된 바와 같은 15개 대신)을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이들 유전자의 정렬은 에스케리키아 콜라이 2 군 캡슐 유전자 클러스터에 대해 전형적이다. 보존된 유전자 kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC 및 kpsS을 포함하는 영역 1, 및 보존된 유전자 kpsM 및 kpsT를 포함하는 영역 3은 영역 2의 9개의 개방 판독 프레임을 플랭킹(flanking)한다. 영역 1 및 영역 3 유전자는 에스케리키아 콜라이내 모든 2 군 캡슐의 합성 및 전좌에 요구되는 단백질을 포함한다. 영역 1은 또한 상기 나타낸 바와 같이, CMP-Kdo의 생합성에서 단계들을 촉매하는 것으로 예측된, 효소를 인코딩하는 2개의 유전자(kpsF 및 kpsU)를 포함한다. 영역 2내에 확인된 9개 유전자 중에서, 3개는 캡슐 생합성과 관련된 명확하게 정의된 활성을 지닌 단백질: kfoA(UDP-GlcNAc를 UDP-GalNAc 전구체로 전환하는 UDP-GlcNAc 에피머라제), kfoF(UDP-Glc를 UDP-GlcUA 전구체로 전환하는 UDP-Glc 데하이드로게나제) 및 kfoC(콘드로이틴 신타제, 즉, 전구체 UDP-GalNAc 또는 UDP-GlcUA 중 하나를 수용체 콘드로이틴 분자에 가할 수 있는 폴리머라제)를 인코딩한다.
K4 캡슐 유전자 클러스터의 영역 2내에 존재하는 다른 유전자, kfoB, kfoG, kfoD, kfoE, kfoH(orf1) 및 kfoI(orf3)에 의해 인코딩된 단백질의 기능은 알려져 있지 않았다. kfoB 및 kfoG 유전자는 파스퇴렐라 물토시다 혈청형 A, F 및 D(참조: Townsend et al., J. Clin. Microbiol. 2001;39:924-929) 및 에스케리키아 콜라이 혈청형 K5(참조: Petit et al., Mol. Microbiol. 1995;4:611-620)와 같은 다른 글리코사미노글리칸(GAG) 캡슐을 생산하는 것으로 공지된 박테리아의 캡슐 클러스터내에 존재하는 유전자에 의해 인코딩된 것들과 상동성인 단백질을 인코딩한다. 이러한 상황 증거는, kfoB 및 kfoG가 GAG-함유 K4 캡슐의 생합성에서 역활을 할 수 있음을 제안하였다. 실시예 7에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명자들은, kfoB 및 kfoG 유전자가 에스케리키아 콜라이내 콘드로이틴의 생산에 필수적이지 않지만, kfoG 유전자는 콘드로이틴의 최적 생산에 필요함을 발견하였다.
본 발명 이전에, kfoD, kfoE, kfoH(또는 orf1) 및 kfoI(또는 orf3)가 K4 캡슐의 생합성시 관여되는 것으로 시사한 증거는 없었다. 흥미롭게도, 4개의 연속된 K4 유전자, kfoD, kfoI(또는 orf3), kfoE, 및 kfoH(또는 orf1)는 인접한 파스퇴렐라 물토시다 혈청형 B 유전자 bcbDEFG 및 파스퇴렐라 물토시다 혈청형 E 유전자 ecbDEFG 중에서 상동체를 가짐이 밝혀졌다. 그러나, 이들 2개의 파스퇴렐라 균주는 콘드로이틴 생산자인 것으로 알려져 있지 않으며, 에스케리키아 콜라이 K4내 이들 유전자의 역활은 본 발명 이전에 알려져 있지 않았다. 따라서, kfoD, kfoI(orf3), kfoE 및 kfoH(orf1)는 콘드로이틴의 합성시 관여되지 않을 수 있는 것으로 여겨졌다. 실시예 6 및 7에 나타나 있는 바와 같이, 이들 유전자들 중 어느 것도 콘드로이틴의 생합성에 요구되지 않지만, 이들 유전자들 중 하나 이상은 K4 유전자 세트에 의해 생산된 콘드로이틴의 프럭토실화에 필수적이다.
기초로서 U1-41 K4 캡슐 유전자 클러스터의 서열을 사용하여, 본 발명자들은 에스케리키아 콜라이, 잔토모나스 캄페스트리스, 스핑고모나스 엘로데아(Sphingomonas elodea) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 숙주내에서 발현을 위해 코돈-최적화되는 합성 유전자를 추가로 설계하였다. 이들 코돈-최적화된 유전자의 설계 및 합성은 실시예 2에 상세히 설명되어 있다. 실시예 4는 이종 박테리아내에서 이들 유전자의 발현을 위한 플라스미드 벡터의 작제를 기술한다.
본 발명의 코돈-최적화된 유전자의 완전한 뉴클레오타이드 서열, 및 이들에 의해 인코딩된 아미노산 서열은 다음과 같다. 본 발명에서 사용된 kpsF에 대한 완전한 뉴클레오타이드 서열은 본원에서 서열 번호 1로 나타나 있다. kpsF는 서열 번호 2로서 본원에 나타낸, 327개 아미노산 서열을 인코딩하는 981개 뉴클레오타이드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. kpsE에 대한 완전한 뉴클레오타이드 서열은 본원에서 서열 번호 3으로 나타낸다. kpsE는 본원에서 서열 번호 4로 나타낸, 382개 아미노산 서열을 인코딩하는 1146개 뉴클레오타이드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. kpsD에 대한 완전한 뉴클레오타이드 서열은 본원에 서열 번호 5로서 나타나 있다. kpsD는 본원에서 서열 번호 6으로 나타낸, 558개 아미노산 서열을 코딩하는 1674개 뉴클레오타이드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. kpsU에 대한 완전한 뉴클레오타이드 서열은 본원에서 서열 번호 7로 나타낸다. kpsU는 본원에서 서열 번호 8로 나타낸, 246개 아미노산 서열을 인코딩하는 738개 뉴클레오타이드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. kpsC에 대한 완전한 뉴클레오타이드 서열은 본원에서 서열 번호 9로 나타나 있다. kpsC는 본원에서 서열 번호 10으로 나타낸, 675개 아미노산 서열을 인코딩하는 2025개 뉴클레오타이드 서열(정지 코돈은 포함하지 않음)이다. kpsS에 대한 완전한 뉴클레오타이드 서열은 본원에서 서열 번호 11로 나타나 있다. kpsS는 본원에서 서열 번호 12로 나타낸, 403개 아미노산 서열을 인코딩하는 1209개 뉴클레오타이드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. kpsM에 대한 완전한 뉴클레오타이드 서열은 본원에서 서열 번호 13으로 나타나 있다. kpsM은 본원에서 서열 번호 14로 나타낸, 258개 아미노산 서열을 인코딩하는 774개 뉴클레오타이드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. kpsT에 대한 완전한 뉴클레오타이드 서열은 본원에서 서열 번호 15로 나타나 있다. kpsT는 본원에서 서열 번호 16으로 나타낸, 222개 아미노산 서열을 코딩하는 666개 뉴클레오타이드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. kfoA에 대한 완전한 뉴클레오타이드 서열은 본원에서 서열 번호 17로 나타나 있다. kfoA는 본원에서 서열 번호 18로 나타낸, 339개 아미노산 서열을 인코딩하는 1017개 뉴클레오타이드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. kfoB에 대한 완전한 뉴클레오타이드 서열은 본원에서 서열 번호 19로 나타나 있다. kfoB는 본원에서 서열 번호 20으로 나타낸, 546개 아미노산 서열을 인코딩하는 1638개 뉴클레오타이드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. kfoC에 대한 완전한 뉴클레오타이드 서열은 본원에서 서열 번호 21로 나타나 있다. kfoC는 본원에서 서열 번호 22로 나타낸, 686개 아미노산 서열을 인코딩하는 2058개 뉴클레오타이드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. kfoD에 대한 완전한 뉴클레오타이드 서열은 본원에서 서열 번호 23으로 나타나 있다. kfoD는 본원에서 서열 번호 24로 나타낸, 477개 아미노산 서열을 코딩하는 1431개 뉴클레오타이드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. kfoE에 대한 완전한 뉴클레오타이드 서열은 본원에서 서열 번호 25로 나타나 있다. kfoE는 본원에서 서열 번호 26으로 나타낸, 522개 아미노산 서열을 인코딩하는 1566개 뉴클레오타이드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. kfoF에 대한 완전한 뉴클레오타이드 서열은 본원에서 서열 번호 27로 나타나 있다. kfoF는 본원에서 서열 번호 28로 나타낸, 389개 아미노산 서열을 인코딩하는 1167개 뉴클레오타이드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. kfoG에 대한 완전한 뉴클레오타이드 서열은 본원에서 서열 번호 29로 나타나 있다. kfoG는 본원에서 서열 번호 30으로 나타낸, 488개 아미노산 서열을 인코딩하는 1464개 뉴클레오타이드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다.
orf1(본원에서 또한 kfoH로 언급됨)에 대한 완전한 뉴클레오타이드 서열은 본원에서 서열 번호 31로 나타나 있다. orf1은 본원에서 서열 번호 32로 나타낸, 241개 아미노산 서열을 인코딩하는 723개 뉴클레오타이드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다. orf3(또한 본원에서 kfoI로 언급됨)에 대한 완전한 뉴클레오타이드 서열은 본원에서 서열 번호 33으로 나타나 있다. orf3는 본원에서 서열 번호 34로 나타낸, 126개 아미노산 서열을 인코딩하는 378개 뉴클레오타이드 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)이다.
각종 양태에서, 본 발명은 에스케리키아 콜라이 K4 유전자 클러스터, 에스케리키아 콜라이 K4 유전자 클러스터의 하나 이상의 영역, 에스케리키아 콜라이 K4 유전자 클러스터로부터의 유전자의 하나 이상의 서브세트, 에스케리키아 콜라이 K4 유전자 클러스터로부터의 하나 이상의 개개 유전자, 또는 이의 조합을 포함하는 작제물을 포함하며, 여기서 작제물은 박테리아 숙주 세포내에서 콘드로이틴을 생산하거나 이의 양을 증가시키는데 유용하다. 각종 양태에서, 작제물은 위에 기술된 전체 17개의 유전자 클러스터 또는 위에 기술된 17개 유전자 클러스터 중 하나 이상의 유전자, 즉, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT, kfoA, kfoB, kfoC, kfoD, kfoE, kfoF, kfoG, kfoH 및 kfoI를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 작제물은 K4 클러스터의 하나 이상의 영역(즉, 본원에 기술된 바와 같은 영역 1, 2, 및/또는 3)을 포함한다. 일부 양태에서, 작제물은 K4 클러스터로부터의 유전자의 하나 이상의 서브세트(본원에 기술된 바와 같은 영역 1, 2 및/또는 3으로부터의 유전자의 서브세트를 포함함)를 포함한다. 작제물은, 클러스터내 유전자가 클러스터내 어떠한 다른 유전자에 대해 어떠한 순서로도 존재하는 유전자 클러스터를 포함할 수 있다. 따라서, 작제물내의 유전자 클러스터내 유전자의 순서는 K4 클러스터내의 천연적으로 존재하는 유전자의 순서와는 상이할 수 있다. 유사하게, 작제물은 K4 클러스터로부터의 어떠한 다른 영역, 유전자 서브세트, 또는 개개 유전자와 관련하여 작제물내에 어떠한 순서로도 존재할 수 있는 K4 클러스터로부터의 영역, 유전자의 서브세트, 또는 유전자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 유전자는 작제물내에 규정된 순서로 존재한다. 작제물은 상기 언급된 에스케리키아 콜라이 혈청형 K4 균주 U1-41로부터 분리된 하나 이상의 천연 유전자(즉, 에스케리키아 콜라이 K4 U1-41 또는 다른 혈청형 K4 균주내에 존재하는 서열을 갖는 유전자) 및/또는 하나 이상의 합성 유전자, 즉, U1-41로부터 분리된 천연 유전자를 기초로 하지만, 여기서 DNA 서열이 이들 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열을 변경시키지 않고, 박테리아 숙주 세포내에서 최적의 코돈 사용빈도를 위해 변형된 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 합성 유전자의 설계 및 제조는 실시예 2에 설명되어 있다.
위에서 주목하고 실시예 6 및 7에서 상세히 추가로 설명한 바와 같이, kfoD, kfoI, kfoE 및 kfoH 유전자 중 하나 이상은 에스케리키아 콜라이내 콘드로이틴의 프럭토실화에 필수적이지만, 이들 유전자중 어느 것도 콘드로이틴의 합성에 필요하지 않다. 이들 유전자들 중 4개 모두의 동시 누락 또는 불활성화는 프럭토실화되지 않은 콘드로이틴의 생산을 야기한다. 일부 양태에서, 본 발명의 작제물은 kfoD, kfoI, kfoE 및 kfoH 중 하나 이상의 기능성 유전자를 함유하지 않는다. 다시 말해서, kfoD, kfoI, kfoE 및 kfoH 중 하나 이상의 기능성 유전자는 이들 양태에서 작제물로부터 부재한다. 기능성 유전자를 함유하지 않는 작제물(즉, 기능성 유전자가 부재한 작제물)은, 전체 유전자가 부재한 작제물 및 또한 유전자 또는 이의 일부가 존재하지만 비-기능성(즉, 불활성)인 작제물을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 작제물은 변형되어 kfoD, kfoI, kfoE 및 kfoH 중 하나 이상을 불활성화시킨 유전자 클러스터를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kfoA, kfoC, 및 kfoF를 포함하는 유전자 클러스터를 포함하는 작제물을 포함하며, 여기서 작제물은 kfoD, kfoI, kfoE 및 kfoH 중 하나 이상의 기능성 유전자를 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 작제물은 본원에 기술된 바와 같이 비-병원성 박테리아 숙주 세포내에서 콘드로이틴을 생산하기에 적합하다. 일부 양태에서, 콘드로이틴은 비-프럭토실화된다. 일부 양태에서, 작제물은 kfoG 및/또는 kfoB를 추가로 포함할 수 있다. 위에 주목한 바와 같이, kfoB 및 kfoG 유전자는 콘드로이틴의 생산을 위해 필수적인 것으로 밝혀지지 않았으나, kfoG 유전자는 콘드로이틴의 최적 생산에 필요한 것으로 밝혀졌다(참조: 실시예 7). 일부 양태에서, 본 발명의 작제물은 kpsM 및/또는 kpsT를 추가로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 작제물은 세포로부터 분비된 재조합 콘드로이틴의 생산에 유용하다.
일부 양태에서, 이들 작제물은 발현 벡터 pDD66(kpsMT-kfoABCFG-kpsFEDUCS를 함유하는 발현 벡터), pDD67(kpsFEDUCS-kpsMT-kfoABCFG를 함유하는 발현 벡터), pCX040(kpsMT-kfoACFG-kpsFEDUCS를 함유하는 발현 벡터), pCX041(kpsMT-kfoABCF-kpsFEDUCS를 함유하는 발현 벡터), pCX042(kpsFEDUCS-kpsMT-kfoACFG를 함유하는 발현 벡터), pCX043(kpsFEDUCS-kpsMT-kfoABCF를 함유하는 발현 벡터), 및 pCX096(kpsFEDUCS-kfoABCFG를 함유하는 발현 벡터)를 포함한다. 다른 양태는 발현 플라스미드 pBR1052이다. 실시예 4에 기술된 바와 같이, pBR1052는 pDD66(kpsMT-kfoABCFG-kpsFEDUCS)과 동일한 K4 유전자 세트를 함유하고 추가로 kpsF 유전자의 바로 상부(upstream)에 삽입된 Pm 프로모터 서열의 제2 카피를 갖는다. pDD66의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 35로 나타내며; pDD67의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 36로 나타내고; pCX040의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 37로 나타내고; pCX041의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 38로 나타내며; pCX042의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 39로 나타내고; pCX043의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 40으로 나타내며; pCX096의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 149로 나타내고; pBR1052의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 41로 나타낸다. 이들 DNA 작제물의 설계 및 작제는 실시예 4에서 상세히 설명된다.
일부 양태에서, 본 발명은 세포내 콘드로이틴, 즉, 숙주 세포로부터 분비되지 않는 콘드로이틴을 생산하는 목적에 유용한 작제물을 포함한다. 콘드로이틴의 세포내 생산은, 배양 배지내 높은 수준의 다당류로부터 생성되는 발효의 점도를 제거하기 위해 요구될 수 있다. 또한, 세포내 생산이 분비보다 더 높은 수준의 콘드로이틴을 달성할 수 있는 것이 가능하다. 일부 양태에서, 작제물은 영역 3의 kpsM 및 kpsT 중 적어도 하나의 기능성 유전자를 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 작제물은 영역 3의 kpsM 및 kpsT 중 적어도 하나를 함유하지 않거나 불활성화시키기 위해 변형시킨 유전자 클러스터를 포함한다. 일부 양태에서, 작제물은 영역 1의 kpsE, kpsD, kpsC 및 kpsS 중 적어도 하나의 기능성 유전자를 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 작제물은 영역 1의 kpsE, kpsD, kpsC 및 kpsS 중 적어도 하나를 함유하지 않거나 이를 불활성화시키기 위해 변형된 유전자 클러스터를 포함한다. 일부 양태에서, 작제물은 영역 3의 kpsM 및 kpsT 중 적어도 하나 및 영역 1의 kpsE, kpsD, kpsC 및 kpsS 중 적어도 하나의 기능성 유전자를 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 작제물은 영역 3의 kpsM 및 kpsT 중 적어도 하나 및 영역 1의 kpsE, kpsD, kpsC 및 kpsS 중 적어도 하나를 함유하지 않거나 이를 불활성화시키기 위해 변형된 유전자 클러스터를 포함한다. 이들 작제물은 실시예 4 및 9에 기술되어 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 kfoA, kfoC, 및 kfoF를 포함하는 유전자 클러스터를 포함하는 작제물을 포함하며, 여기서 유전자 클러스터는 kpsM, kpsT, kpsE, kpsD, kpsC 및 kpsS 중 하나 이상의 기능성 유전자를 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 작제물은 본원에 기술된 바와 같은 비-병원성 박테리아 숙주 세포내에서 콘드로이틴을 생산하기에 적합하다. 일부 양태에서, 콘드로이틴은 숙주 세포로부터 분비되지 않는다. 일부 양태에서, 콘드로이틴은 비-프럭토실화된다. 일부 양태에서, 작제물은 또한 kfoD, orf3, kfoE, 및 orf1 중 하나 이상의 기능성 유전자를 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 작제물은 kfoG 및/또는 kfoB를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 작제물은 kfoA, kfoB, kfoC, kfoF 및 kfoG를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 작제물은 kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 포함하며, 여기서 작제물은 kpsM, kpsT, kpsE, kpsD, kpsC 및 kpsS 중 하나 이상의 기능성 유전자를 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 작제물은 본원에 기술된 바와 같이 비-병원성 박테리아 숙주 세포내에서 콘드로이틴을 생산하는데 적합하다. 일부 양태에서, 작제물은 본원에 기술된 바와 같은 비-병원성 박테리아 숙주 세포내에서 콘드로이틴의 양을 증가시키는데 적합하다. 일부 양태에서, 작제물은 에스케리키아 콜라이 K4 유전자 클러스터, 클러스터의 영역, 클러스터의 유전자의 서브세트, 또는 숙주 염색체 내로 통합된 클러스터의 유전자의 하나 이상의 존재하는 카피를 포함하는 박테리아 숙주 세포로 이전된다. 일부 양태에서, 콘드로이틴은 프럭토실화되어 있지 않다. 일부 양태에서, 작제물은 또한 kfoD, orf3, kfoE, 및 orf1 중 하나 이상의 기능성 유전자를 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 작제물은 kfoA, kfoB, kfoC, kfoF 및 kfoG를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 작제물은 발현 벡터 pCX039(kfoABCFG를 함유하는 발현 벡터), pCX044(kfoACFG를 함유하는 발현 벡터), pCX092(kfoABCF를 함유하는 발현 벡터), pCX045(kpsMT-kfoABCFG-kpsFEDUS를 함유하는 발현 벡터), 및 pCX048(kpsM-kfoABCFG-kpsFEDUCS를 함유하는 발현 벡터)를 포함한다. pCX039의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 42로 나타내며; pCX044의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 43로 나타내고; pCX092의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 154로 나타내고; pCX045의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 44로 나타내고; pCX048의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 45로 나타낸다. 이들 DNA 작제물의 설계 및 작제는 실시예 4에 상세히 설명되어 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 작제물은 발현 벡터 pCX075(kfoABFG를 함유하는 발현 벡터), pCX081(kfoABCG를 함유하는 발현 벡터), pCX082(kfoBCFG를 함유하는 발현 벡터), pCX101(kfoABCFG-kpsMT를 함유하는 발현 벡터), pBR1102(kfoABCFG를 함유하는 발현 벡터), pBR1100(kfoABCFG를 함유하는 발현 벡터), 및 pBR1101(kfoABCFG를 함유하는 발현 벡터)를 포함한다. pCX075의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 153으로 나타내고; pCX081의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 151로 나타내고; pCX082의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 152로 나타내고; pCX101의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 150으로 나타내고; pBR1102의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 170으로 나타내고; pBR1100의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 171로 나타내고; pBR1101의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 172로 나타낸다. 이들 DNA 작제물의 설계 및 작제는 실시예 18 및 20에 상세히 설명되어 있다.
본 발명의 작제물은 본원에 기술된 바와 같이 박테리아 숙주 세포내에서 최적의 코돈 사용빈도를 위해 변형된 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 작제물은 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 프로모터는 본원에 기술된 바와 같은 박테리아 숙주 세포내에서 유전자 클러스터의 발현을 구동할 수 있어야 한다. 바람직한 박테리아 숙주 세포내에서 발현을 구동하는데 유용한, 다수의 이러한 프로모터는 당해 분야의 숙련가에게 친숙하며 본 발명에서 사용될 수 있다. 이종 단백질을 발현하는데 일반적으로 사용된 프로모터의 예는 Pm, lac, trp, tac, λpL, T7, phoA, araC, xapA, cad 및 recA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다(참조: 예를 들면, Weikert et al ., Curr . Opin . Biotechnol . 1996;7:494-499). 이러한 프로모터는 구성적이거나 유도성일 수 있다. 종결 제어 영역은 또한 바람직한 숙주에 대해 천연인 다양한 유전자로부터 유래될 수 있다. 임의로, 종결 부위는 불필요할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 작제물은 xylS 조절 유전자와 함께 Pm 프로모터를 포함한다(참조: Mermod et al ., J. Bacteriol . 1986;167:447-54).　 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida ) TOL 플라스미드로부터 분리된 Pm 프로모터 및 이의 조절 유전자 xylS는 각종 그람 음성 박테리아에서 기능하는 것으로 밝혀진 강력하고, 잘 조절된 프로모터를 제공한다(참조: Blatny et al., 플라스미드 1997;38:35-51). XylS 단백질은 단량체 또는 이량체로서 존재할 수 있다. 이량체 형태에서, XylS 단백질은 Pm 프로모터에 결합하여 전사를 자극할 수 있다. XylS 단백질의 이량체화, 및 이에 따른 Pm 프로모터에서 전사 개시는 XylS에 직접 결합하여 단백질의 이량체화를 촉진하는 메타-톨루산(3-메틸벤조에이트)와 같은 특정의 효과인자(effector) 분자에 의해 향상된다(참조: Dominguez-Cuevas et al ., J. Bact . 2008; 190:3118-3128). 프로모터는 유전자 클러스터의 하나 이상의 유전자에 작동적으로 연결될 수 있다.
본 발명의 작제물은 제2 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 대체 숙주내에서 클로닝된 K4 유전자의 발현의 분석이, 특정 유전자, 또는 유전자 세트의 발현 수준이 최적 미만임을 나타내는 경우, 제2 프로모터가, 최적 수준에서 발현되지 않는 유전자 또는 유전자 세트의 전사를 향상시키기 위해 선택된 위치에서 발현 작제물에 추가될 수 있다. 전형적으로, 추가된 프로모터는 목적한 유전자 또는 유전자 세트 바로 상부(즉, 유전자 또는 유전자 세트에 대해 5')에 삽입될 수 있다. 제2 프로모터는 Pm, 또는 K4 유전자 세트를 발현시키는데 유용한 프로모터의 예로서 상기 나열된 프로모터 중 어느 것일 수 있다. 일부 양태에서, 제2 프로모터는 Pm일 수 있다. 제2 프로모터는 유전자 클러스터의 하나 이상의 유전자에 작동적으로 연결될 수 있다. 하나의 양태에서, 제2 프로모터는 kpsFEDUCS 유전자 세트에 작동적으로 연결될 수 있다. 예를 들면, 실시예 4에 기술된 바와 같은 발현 벡터 pBR1052를 참조한다. 제2 프로모터의 사용에 의해 유전자 또는 유전자들의 조합을 발현시키거나, 증강시키는데 유리할 수 있는 유전자, 또는 유전자들의 조합은 어떠한 제공된 플라스미드, 또는 웨스턴 블롯 분석에 의해 설정된 염색체의 유전자에 대해 실험적으로 측정될 수 있다.
본 발명의 작제물은 특수 항생제에 대해 내성을 부여하는 항생제 내성 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 유전자는 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 항생제 내성 유전자의 예는 클로람페니콜 내성 유전자(CamR), 카나마이신 내성 유전자(KanR), 암피실린 내성 유전자(AmpR), 테트라사이클린 내성 유전자(TetR), 스펙티노마이신 내성 유전자(SpcR), 설폰아미드 내성 유전자(SuR), 블레오마이신 내성 유전자(BleR), 스트렙토마이신 내성 유전자(StrR), 카르베니실린 내성 유전자(CbR) 및 에리트로마이신 내성 유전자(EryR)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 작제물은 박테리아 숙주 세포내에서 콘드로이틴을 생산하는데 유용하다. 어떠한 박테리아 세포도 본 발명에서 숙주 세포로서 사용될 수 있으며, 일부 양태에서, 숙주는 그람-음성 박테리아이다. 그람 음성 박테리아의 예는 에스케리키아, 슈도모나스, 잔토모나스, 메틸로모나스, 악시네토박터 및 스핑고모나스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 양태에서 숙주는 비-병원성 그람-음성 박테리아이다. 비-병원성 그람-음성 박테리아의 예는 비-병원성 에스케리키아 콜라이, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이 K-12 또는 에스케리키아 콜라이 B, 잔토모나스 캄페스트리스, 스핑고모나스 엘로데아 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 것으로서 박테리아 숙주 세포의 내인성 유전자는 상동성 재조합에 의해 결실되거나 불활성화된다.
자체의 천연의 세포외 다당류를 제조할 수 없는 숙주의 유도체가 바람직하다. 이러한 유도체 숙주를 사용하면 재조합 콘드로이틴(rCH)의 생합성의 가시적이고 화학적인 확인, 및 또한 K4 유전자 세트가 도입되는 경우 숙주에 의해 생산된 rCH의 정제를 촉진할 수 있다. 또한, 적절하게 설계된 유도체 숙주내에서 rCH의 생합성은 천연의 다당류 합성과의 경쟁에 의해 제한되지 않을 것이다. 예를 들면, 천연의 다당류 생합성 경로의 제1의 글리코실트랜스퍼라제 유전자의 불활성화 또는 결실은, 천연의 경로에 의한 임의의 잠재적인 지질 담체의 이용을 방지하고 천연의 경로의 효소와 K4 효소 사이의 지질 담체, 또는 초기 다당류 쇄에서 작용하여 이용가능성을 제한할 수 있는 어떠한 다른 세포 성분(들)에 대한 경쟁을 방지할 수 있다. 전체 천연의 생합성 유전자 클러스터의 불활성화(예를 들면, 결실에 의함)는 대부분의 경쟁적 성분을 제거할 수 있지만, 생리학 및/또는 막 구조에 대한 바람직하지 않은 효과를 잠재적으로 가질 수 있다.
실시예 3에 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 작제물의 발현을 위한 숙주로서, 에스케리키아 콜라이 K-12("K-12"), 에스케리키아 콜라이 B("EcB"), 및 잔토모나스 캄페스트리스 피브이. 캄페스트리스(Xanthomonas campestris pv. campestris)("Xcc")를 예로서 사용하였으나, 이들 예에 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 천연의 세포외 다당류의 합성을 위한 효소를 인코딩하는 유전자 클러스터의 하나 이상의 유전자내 결실을 포함하는 유도체 숙주의 생성은 실시예 3에 상세히 기술된 바와 같이 2-단계, "팝-인/팝-아웃" 상동성-유도된 방법을 사용하여 수행하였다. 예를 들면, 콜란산(M 항원)은 많은 장 박테리아에 의해 생산된 세포외 다당류이다. 콜란산 생합성에서 결핍성이거나 결함이 있는 에스케리키아 콜라이 K-12 및 에스케리키아 콜라이 B 균주가 생성되었다. 균주 MSC188 및 MSC175는 전체 콜란산 오페론, 및 콜란산 생합성 동안 지질 담체 위로의 제1 당의 로딩(loading)에 관여하는 글리코실트랜스퍼라제 효소를 인코딩하는 wcaJ 유전자 각각의 결실을 포함하는 에스케리키아 콜라이 K-12의 유도체이다. 균주 MSC364는 전체 콜란산 오페론의 결실을 포함하는 에스케리키아 콜라이 B의 유도체이다. 유사하게, 세포외 다당류 크산탄 검의 생합성에 있어 결핍성이거나 결함이 있는 잔토모나스 캄페스트리스 피브이. 캄페스트리스 균주가 생성되었다. 균주 MSC225 및 MSC226은 글리코실트랜스퍼라제 I 효소를 인코딩하는 gumD 유전자의 결실을 포함하는 Xcc 균주의 유도체이며 균주 MSC255, MSC256, 및 MSC257은 전체 크산탄 검 오페론의 결실을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 임의의 하나 이상의 작제물을 비-병원성 박테리아 숙주 세포로 이전시킴을 포함하는, 본 발명의 작제물의 임의의 하나 이상을 포함하는 비-병원성 박테리아 숙주 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 작제물은 작제물내에 존재하는 유전자의 발현을 위한 어떠한 공지된 방법에 의해 박테리아 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 이러한 방법은, 제한하지 않고 형질전환, 전기천공(electroporation), 접합 또는 형질도입을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 작제물 중 어느 하나 이상을 포함하는 비-병원성 박테리아 숙주 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 작제물을, 결실을 포함하는 유도체 균주를 포함하는 숙주 균주내로 도입시킴으로써 생성된 각종 균주를 포함한다. 특정의 예들은 실시예 6 내지 9, 11, 13 및 14에 상세히 기술되어 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 작제물내에 함유된 유전자는 수용체 숙주 균주의 염색체 내로 도입됨으로써 유전자가 숙주 염색체내에 통합되도록 한다. 염색체내에 클로닝된 유전자를 위치시키면 콘드로이틴 생합성 유전자를 수반하는 플라스미드(들) 또는 벡터(들)을 유지하기 위한 선택적인 압력을 유지하기 위한 요건을 제거하는 장점을 제공함으로써 임의의 선택적인 압력의 부재하에서 안정한 발현 균주 또는 보다 안정한 발현 균주를 잠재적으로 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 이들의 염색체 내로 통합된 본 발명의 작제물내에 함유된 유전자들중 임의의 하나 이상의 하나 이상의 카피를 포함하는 박테리아 균주를 포함한다.
예로서, 본 발명자들은 이들의 염색체 내로 통합된 콘드로이틴의 생합성을 위한 합성 유전자들 중 하나 이상을 포함하는 에스케리키아 콜라이 K-12 및 Xcc 균주를 생성하였다. 본 발명은 또한 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 작제물을, 그들의 염색체 내로 통합된 작제물의 하나 이상의 카피를 포함하는 본 발명의 균주내로 도입시킴으로써 생성된 균주를 포함한다.
일부 양태에서, K4 유전자 클러스터, 당해 클러스터의 하나 이상의 영역, 당해 클러스터의 유전자의 하나 이상의 서브세트, 또는 클러스터의 하나 이상의 유전자를 본원에 기술된 본 발명의 작제물 및 방법을 사용하여 본원에 기술된 바와 같은 비-병원성 박테리아 숙주 세포의 염색체 내로 통합시킨다. 일부 양태에서, 유전자 클러스터, 영역, 서브세트 또는 유전자의 2개 이상의 카피를 비-병원성 박테리아 숙주 세포의 염색체 내로 통합시킨다. 일부 양태에서, 유전자 클러스터, 영역, 서브세트 또는 유전자의 2 내지 20; 2 내지 19; 2 내지 18; 2 내지 17; 2 내지 16; 2 내지 15; 2 내지 14; 2 내지 13; 2 내지 12; 2 내지 11; 2 내지 10; 2 내지 9; 2 내지 8; 2 내지 7; 2 내지 6; 2 내지 5; 2 내지 4; 또는 2 내지 3개의 카피를 비-병원성 박테리아 숙주 세포의 염색체 내로 통합시킨다. 일부 양태에서, 유전자 클러스터, 영역, 서브세트, 또는 유전자의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 카피를 비-병원성 박테리아 숙주 세포의 염색체 내로 통합시킨다. 일부 양태에서, 2개 이상의 카피를 동일한 작제물을 사용하여 숙주 염색체 내로 통합시킨다. 일부 양태에서, 2개 이상의 카피를 상이한 작제물을 사용하여 숙주 염색체 내로 통합시킨다. 일부 양태에서, 프로모터를 또한 숙주 염색체 내로 통합시켜 숙주 염색체 내로 통합된 유전자 클러스터, 영역, 서브세트 또는 유전자의 발현을 조절한다. 일부 양태에서, 숙주 염색체 내로 통합된 2개 이상의 카피는 동일한 프로모터 또는 상이한 프로모터로부터 발현된다. 일부 양태에서, kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 영역 2 유전자의 2개 이상의 카피가 숙주 염색체 내로 통합된다. 일부 양태에서, kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, 및 kfoG의 2개 이상의 카피는 숙주 염색체 내로 통합된다. 일부 양태에서, 영역 1, 영역 3, 또는 영역 1 또는 영역 3으로부터 하나 이상의 유전자의 2개 이상의 카피는 숙주 염색체 내로 통합된다. 일부 양태에서, 본 발명의 작제물내에 함유된 유전자는 염색체 내로 통합되지 않은 유전자를 포함하는 본 발명의 하나 이상의 작제물을 또한 함유하는 박테리아 숙주 세포의 염색체 내로 통합된다.
이러한 균주의 예는 실시예 10 내지 13, 20 및 21에 상세히 기술되어 있다. 기술된 작제물 및 균주는 콘드로이틴의 생산에 사용될 수 있다.
본 발명의 균주의 예는, 제한되지 않고, 에스케리키아 콜라이 K-12 균주 MSC279, MSC280, MSC322, MSC323, MSC324, MSC325, MSC328, MSC346, MSC356, MSC359, MSC392, MSC402, MSC403, MSC404, MSC405, MSC410, MSC411, MSC436, MSC437, MSC438, MSC439, MSC458, MSC459, MSC460, MSC466, MSC467, MSC498, MSC499, MSC500, MSC510, MSC511, MSC522, MSC526, MSC537, MSC551, MSC561, MSC562, MSC563, MSC564, MSC566, MSC567, MSC619, MSC625, MSC627, MSC640, MSC641, MSC643, MSC646, MSC650, MSC656, MSC657, MSC658, MSC659, MSC660, MSC669, MSC670, MSC671, MSC672, MSC673, MSC674, MSC675, MSC676, MSC677, MSC678, MSC679, MSC680, MSC681, MSC682, MSC683, MSC684, MSC687, MSC688, MSC689, MSC690, MSC691, MSC692, MSC693, MSC694, MSC700, MSC701, MSC702, MSC722, MSC723, 및 MSC724; 에스케리키아 콜라이 B 균주 MSC315, MSC316, MSC317, MSC319, 및 MSC347; 잔토모나스 캄페스트리스 균주 MSC326, MSC348, MSC350, MSC480, MSC461, MSC469 및 MSC494를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 작제물 중 어느 하나 이상을 비-병원성 박테리아 숙주 세포내로 이전시키고, 박테리아 숙주 세포를, 콘드로이틴이 박테리아 숙주 세포에 의해 생산되는 발효 조건하에서 배양함을 포함하는, 콘드로이틴의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 작제물 중 어느 하나 이상을 포함하는 비-병원성 숙주 세포를 콘드로이틴의 생산에 충분한 발효 조건하에서 배양함을 포함하는, 콘드로이틴을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 황산화되지 않은 콘드로이틴을 생산하는 방법을 포함한다. 당해 방법은 본 발명의 비-병원성 박테리아 숙주 세포를 황산화되지 않은 콘드로이틴의 생산에 충분한 발효 조건하에서 배양함을 포함한다. 일부 양태에서, 당해 방법은 본 발명의 작제물을 비-병원성 박테리아 숙주 세포로 이전시키고 박테리아 숙주 세포를 박테리아 숙주 세포에 의해 황산화되지 않은 콘드로이틴이 생산되는 발효 조건하에서 배양함을 포함한다.
각종 양태가 실시예 7 내지 15에 기술되어 있다. 구체적으로, 실시예 6 내지 9, 11, 13 및 14는, 본 발명의 작제물이 숙주 세포내로 형질전환되는 경우 콘드로이틴의 생산을 입증하는 데이타를 제공하며 실시예 10 내지 15는, 본 발명의 작제물이 숙주 세포의 염색체 내로 통합되는 경우 콘드로이틴의 생산을 입증하는 데이타를 제공한다.
구체적인 작제물 및 그안의 유전자들의 조합에 따라, 프럭토실화되거나 비-프럭토실화된 콘드로이틴을 생산하는 것이 가능하다(참조: 실시예 6 및 7). 또한, 구체적인 작제물 및 그안의 유전자들의 조합에 따라, 재조합 콘드로이틴을 배양 배지내로 분비시키거나 세포내 위치에 유지시킬 수 있다(참조: 실시예 9).
박테리아 세포를 배양하는 방법 및 배양 배지의 조성은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 본 발명에서 사용될 수 있다. 재조합 콘드로이틴의 최적의 생산을 위해, 온도, pH, 용존 산소 농도, 유도인자 농도 및 유도-후 배양 기간, 및 또한 그안의 영양물 및 염의 내용물을 포함하는 배지의 조성과 같은 각종 배양 매개변수는 최적화되어야 한다. 실시예 8은 각종 성장 배지, 온도 및 유도 조건에서 콘드로이틴의 재조합 생산을 기술한다. 당해 정보를 기초로 하여, 이러한 매개변수의 추가의 최적화는 당해 분야의 숙련가에게 매우 명백할 것이다. 일부 양태에서, 박테리아 숙주 세포는 20℃ 내지 37℃, 예를 들면, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃ 또는 37℃에서 배양된다. 일부 양태에서, 배양 배지는 효모 추출물, 단백질 분해물, 인산칼륨, 및 물을 포함한다. 일부 양태에서, 배양 배지는 글리세린(또한 글리세롤로 공지됨)을 포함한다. 일부 양태에서, 1 g/L 내지 50 g/L, 5 g/L 내지 50 g/L 또는 15 g/L 내지 50 g/L의 황산화되지 않은 콘드로이틴이 24 내지 72시간내에 박테리아 숙주 세포로부터 분비된다.
일부 양태에서, 본 발명의 콘드로이틴을 생산하는 방법은 박테리아 숙주 세포로부터 콘드로이틴을 회수함을 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 콘드로이틴을 생산하는 방법은 세포외 배양 배지로부터 콘드로이틴을 회수함을 추가로 포함한다. 콘드로이틴은 배양 브로쓰로부터 알코올 침전 또는, 무수 분말을 수득하기 위한 동결건조를 포함하나, 이에 한정되지 않는 당해 분야에 공지된 임의의 기술에 의해 발효 브로쓰로부터 회수될 수 있다.
일부 양태에서, 콘드로이틴을 생산하는 방법은 회수된 콘드로이틴을 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 콘드로이틴의 정제는 예를 들면, 알칼리 처리, 산 처리, 프로테이나제 처리, 크로마토그래피, 추출, 용매 추출, 막 분리, 전기분해, 역 삼투압, 증류, 침전, 화학적 유도체화, 결정화, 한외여과 및/또는 유기 용매를 사용한 다당류의 침전을 포함하는 당해 분야에 공지된 어떠한 기술에 의해서도 달성할 수 있다[참조: 예를 들면, Taniguchi, N., 1982. Isolation and analysis of glycosaminoglycans. Pages 20-40 in: Glycosaminoglycans and Proteoglycans in Physiological and Pathological Process of Body Systems. R. S. Varma and R. Varma, ed. Karger, Basel, Switzerland; Fraquharson et al., Oral. Microbiol. Immunol. 2000;15:151-157; Manzoni et al., J. Bioact. Comp. Polm. 1993;8:251-257; Manzoni et al., Biotechnol. Letters 2000;22:759-766; Johns et al., Aust. J. Biotechnol. 1991;5:73-77; 이들 문서들 각각은, 본원에 이의 전문이 참조로 혼입되어 있다]. 침전 용매의 예는, 제한되지 않고, 아세톤, 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 콘드로이틴을 생산하는 방법은 콘드로이틴을 황산화함을 추가로 포함한다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 콘드로이틴을 생산하여 콘드로이틴을 황산화함을 포함하는, 콘드로이틴 설페이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.
황산화는 화학적으로 또는 효소적으로 수행될 수 있다. 다당류의 화학적 황산화를 위한 여러 과정이 당해 분야에 공지되어 있으며, 이중 어느 하나가 본원에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 황산화는 다당류를 유기 용매내로 가용화시킨 후 황산화제와 조절된 온도하에서 반응시켜 달성할 수 있다. 가용화 용매의 예는 포름아미드, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 피리딘, 또는 디메틸설폭사이드를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 황산화제의 예는 클로로설폰산, 설퍼트라이옥사이드 및 각종 설퍼트라이옥사이드-아민 복합체를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 설퍼트라이옥사이드-아민 복합체에 적합한 아민의 예는 피리딘, DMF, 트리메틸아민, 트라이에틸아민(TEA) 및 피페리딘을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 양태에서, 재조합 콘드로이틴의 황산화시, 황산화된 생성물은 천연의 콘드로이틴 설페이트의 것에 상응하는 5.0 내지 7.5%의 황 함량을 함유한다. 추가의 양태에서, 황산화된 생성물은 유의적인 해중합(depolymerization)을 겪지 않는다. 실시예 15는 재조합 콘드로이틴의 화학적 황산화 방법을 기술한다. 일부 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 콘드로이틴의 황산화는 설퍼트라이옥사이드-트라이에틸아민 복합체 또는 클로로설폰산을 포름아미드 속에서 콘드로이틴과 혼합시킴을 포함한다.
본 발명은 본원에 기술된 방법 중 어느 것에 의해 생산된 재조합 콘드로이틴 또는 재조합 콘드로이틴 설페이트에 관한 것이다.
본 발명은 본원에 기술된 방법 중 어느 것에 의해 생산된 재조합 콘드로이틴 또는 재조합 콘드로이틴 설페이트를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일부 양태에서, 조성물은 글루코스아민, 글루코스아민 설페이트 또는 글루코스아민 하이드로클로라이드와 같은 보충물을 포함할 수 있다. 글루코스아민(2-아세트아미도-2-데옥시글루코즈)는 연골에서 발견된 천연적으로 존재하는 화합물이다. 글루코스아민 설페이트는 연골 매트릭스 및 윤활액내 글리코스아미노글리칸의 일반적인 성분이다. 일부 임상 시험은 골관절염, 특히 무릎의 골관절염의 치료시 글루코스아민 설페이트의 용도를 지지한다(참조: Herrero-Beaumont et al ., Arthritis Rheum . 2007;56:555-67; Bruyere et al ., Osteoarthritis Cartilage 2008;16:254-60). 설페이트 잔기는 연골을 강화시키고 글루코스아미노글리칸 합성을 보조함으로써 윤활액에 있어 임상적 잇점을 제공함이 제안되었다(참조: Silbert Glycobiology 2009;19:564-567). 글루코스아민은 일반적으로 관절 건강을 촉진시키기 위해 의도된 영양 보충물내 콘드로이틴 설페이트와 함께 및 골관절염 치료로서 일반적으로 제공된다.
일부 양태에서, 본 발명은 대상체에서 건강한 관절 기능을 유지시키는 방법을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 골관절염, 사이질 방광염 및/또는 윤활막염을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 포함한다. 이들 방법은 상기 기술한 재조합 콘드로이틴 설페이트를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함을 포함한다. 본 발명의 조성물은 일반적으로 치료학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다.
본 발명은 K4 콘드로이틴 생합성 유전자 클러스터의 유전자에 의해 인코딩된 단백질에 선택적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다. 이들 항체 및 항체 단편을 사용하여 박테리아 숙주내에서 K4 콘드로이틴 생합성 유전자 클러스터의 유전자의 발현을 확인할 수 있다. 일부 양태에서, 항체 또는 항체 단편은 KpsF의 서열 번호 92, KpsE의 서열 번호 93, KpsD의 서열 번호 94, KpsU의 서열 번호 95, KpsC의 서열 번호 96, KpsS의 서열 번호 97, KpsT의 서열 번호 91, KfoA의 서열 번호 83, KfoB의 서열 번호 84, KfoC의 서열 번호 85, KfoI(Orf3)의 서열 번호 86, KfoE의 서열 번호 87, KfoH(Orf1)의 서열 번호 88, KfoF의 서열 번호 89, 및 KfoG의 서열 번호 90로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 결합한다. 항체의 생성은 실시예 5에 상세히 기술되어 있다.
발효 배지 및 조건
콘드로이틴의 생산 방법에서, 본원에 기술된 유전적 변형을 갖는 미생물을 발효 배지 속에서 배양하여 콘드로이틴을 생산한다. 적절한, 또는 효과적인 발효 배지는, 본 발명의 유전적으로 변형된 미생물이, 배양되는 경우 콘드로이틴을 생산할 수 있는 특정 배지를 말한다. 이러한 배지는 전형적으로 동화할 수 있는 탄소, 질소 및 인산염 공급원을 포함하는 수성 배지이다. 이러한 배지는 또한 적절한 염, 무기물, 금속 및 다른 영양소를 포함할 수 있다. 예시적인 배지는 하기 및 실시예 단락에 기술되어 있다. 그러나, 각종 발효 조건이 적합하며 당해 분야의 숙련가에 의해 선택될 수 있음이 인식되어야 한다.
적합한 발효 배지 속에 사용될 수 있는 동화가능한 탄소의 공급원은 당 및 이들의 중합체, 예를 들면, 덱스트린, 슈크로즈, 말토즈, 락토즈, 글루코즈, 프럭토즈, 만노즈, 소르보즈, 아라비노즈 및 크실로즈; 지방산; 유기산, 예를 들면, 아세테이트; 1급 알코올, 예를 들면, 에탄올 및 n-프로판올; 및 다가알코올, 예를 들면, 글리세린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 탄소원은 다가알코올, 단당류, 이당류, 및 삼당류를 포함한다. 일부 양태에서, 탄소원은 글리세린이다.
발효 배지속에서 글리세린과 같은 탄소원의 농도는 세포 성장을 촉진하여야 하지만, 사용된 미생물의 성장을 억제하는 정도로 높지 않아야 한다. 전형적으로, 발효는 목적하는 수준의 성장 및 생물량을 달성하기 위한 수준에서 첨가되지만 유기 산, 특히 아세테이트의 축적을 피하기 위한 낮은 농도 수준(1 g/L 미만)에서 유지되는 글리세린과 같은 탄소원을 사용하여 수행된다. 다른 양태에서, 발효 배지 속의 글리세린과 같은 탄소원의 농도는 1 g/L 초과, 2 g/L 초과, 또는 5 g/L 초과이다. 또한, 발효 배지 속에서 글리세린과 같은 탄소원의 농도는 전형적으로 100 g/L 미만, 50 g/L 미만, 또는 20 g/L 미만이다. 발효 성분 농도에 대한 참조는 초기 및/또는 진행하는 성분 농도 둘다를 언급할 수 있다. 일부 경우에, 발효 배지에서 발효 동안 탄소원이 고갈되도록 하는 것이 바람직할 수 있다.
적합한 발효 배지 속에서 사용될 수 있는 동화가능한 질소원은 단순 질소원, 유기 질소원 및 복합 질소원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 질소원은 무수 암모니아, 암모늄 염 및, 동물, 야채 및/또는 미생물 유래된 물질을 포함한다. 적합한 질소원은 단백질 가수분해물, 미생물 생물량 가수분해물, 펩톤, 효모 추출물, 황산암모늄, 수산화암모늄, 우레아, 및 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 전형적으로, 발효 배지속의 질소원의 농도는 0.1 g/L 초과, 0.25 g/L 초과, 또는 1.0 g/L 초과이다. 그러나, 특정 농도 초과시, 발효 배지에 질소원의 첨가는 미생물 성장에 유리하지 않다. 그 결과, 발효 배지속 질소원의 농도는 20 g/L 미만, 10 g/L 미만, 또는 5 g/L 미만이다. 또한, 일부 경우에 발효 배지에서 발효 동안 질소원이 고갈되도록 하는 것이 바람직할 수 있다.
효과적인 발효 배지는 소포제, 무기 염, 비타민, 미량 금속 및/또는 성장 촉진제와 같은 다른 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 다른 화합물들은 효과적인 배지 속에 탄소, 질소 또는 광물원 속에 존재할 수 있거나 배지에 구체적으로 첨가될 수 있다.
발효 배지는 또한 적합한 인산염 공급원을 함유할 수 있다. 이러한 인산염 공급원은 무기 및 유기 인산염 공급원 둘다를 포함한다. 인산염 공급원은 일염기성 또는 이염기성 인산나트륨, 인산칼륨, 인산암모늄과 같은 인산염, 및 이의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 전형적으로, 발효 배지 속의 인산염의 농도는 1.0 g/L 초과, 2.0 g/L 초과, 또는 5.0 g/L 초과이다. 그러나, 특정 농도를 초과하여, 발효 배지에 대한 인산염의 첨가는 미생물의 성장에 유리하지 않다. 따라서, 발효 배지 중의 인산염의 농도는 전형적으로 20 g/L 미만, 15 g/L 미만, 또는 10 g/L 미만이다.
적합한 발효 배지는 또한 마그네슘 공급원을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 마그네슘 공급원은, 비록 유사한 양의 마그네슘에 기여하는 농도의 다른 마그네슘 공급원이 사용될 수 있다고 해도, 생리학적으로 허용되는 염의 형태, 예를 들면, 황산마그네슘 오수화물이다. 전형적으로, 발효 배지 중의 마그네슘의 농도는 0.5 g/L 초과, 1.0 g/L 초과, 또는 2.0 g/L 초과이다. 그러나, 특정 농도를 초과하여, 발효 배지에 대한 마그네슘의 첨가는 미생물의 성장에 유리하지 않다. 따라서, 발효 배지 중의 마그네슘의 농도는 전형적으로 10 g/L 미만, 5 g/L 미만, 또는 3 g/L 미만이다. 또한, 일부 경우에, 발효 배지에서 발효 동안 마그네슘 공급원이 고갈되도록 하는 것이 바람직할 수 있다.
발효 배지는 또한 생물학적으로 허용되는 킬레이트제, 예를 들면, 시트르산삼나트륨 또는 시트르산의 이수화물을 포함할 수 있다. 이러한 예에서, 발효 배지 속 킬레이트제의 농도는 0.1 g/L 초과, 0.2 g/L 초과, 0.5 g/L 초과, 또는 1 g/L 초과이다. 그러나, 특정 농도를 초과하는, 발효 배지에 대한 킬레이트제의 첨가는 미생물의 성장에 유리하지 않다. 따라서, 발효 배지중의 킬레이트제의 농도는 전형적으로 10 g/L 미만, 5 g/L 미만, 또는 2 g/L 미만이다.
발효 배지는 또한 초기에 발효 배지의 목적하는 pH를 유지하기 위한 생물학적으로 허용되는 산 또는 염기를 포함할 수 있다. 생물학적으로 허용되는 산은 염산, 황산, 질산, 인산 및 이의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 생물학적으로 허용되는 염기는 무수 암모니아, 수산화암모늄, 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 이의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일부 양태에서, 사용된 염기는 수산화암모늄이다.
발효 배지는 또한 염화칼슘을 포함하나, 이에 한정되지 않는 생물학적으로 허용되는 칼슘원을 포함할 수 있다. 전형적으로, 발효 배지 속의 염화칼슘 이수화물과 같은 칼슘원의 농도는 5 mg/L 내지 2000 mg/L, 20 mg/L 내지 1000 mg/L, 또는 50 mg/L 내지 500 mg/L의 범위내이다.
발효 배지는 또한 염화나트륨을 포함할 수 있다. 전형적으로, 발효 배지 중의 염화나트륨의 농도는 0.1 g/L 내지 5 g/L, 1 g/L 내지 4 g/L, 또는 2 g/L 내지 4 g/L의 범위내이다.
앞서 논의한 바와 같이, 발효 배지는 또한 미량의 금속을 포함할 수 있다. 이러한 미량의 금속은 편의상 발효 배지의 나머지로부터 별도로 제조될 수 있는 스톡 용액(stock solution)으로서 발효 배지에 가해질 수 있다. 발효 배지에서 사용하기 위한 적합한 미량 금속 스톡 용액은 하기 표 1a 및 1b에 나타낸다. 전형적으로, 발효 배지에 첨가된 미량의 이러한 금속 용액의 양은 1 mL/L 초과, 5 mL/L 초과, 또는 10 mL/L 초과이다. 그러나, 특정 농도를 초과하여, 발효 배지에 대한 미량 금속의 첨가는 미생물의 성장에 유리하지 않다. 따라서, 발효 배지에 첨가된 이러한 미량 금속 용액의 양은 전형적으로 100 mL/L 미만, 50 mL/L 미만, 또는 30 mL/L 미만이다. 스톡 용액 속에 미량의 금속을 첨가하는 것 외에, 개개 성분들은 미량의 금속 용액의 상기 범위로 나타낸 성분의 양에 독립적으로 상응하는 범위내에서 각각 별도로 첨가될 수 있다.
하기 표 1a에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 사용하기 위한 적합한 미량 금속 용액은 황산제1철, 칠수화물; 황산구리, 오수화물; 황산아연, 칠수화물; 몰리브덴산나트륨, 이수화물; 염화코발트, 육수화물; 및 황산마그네슘, 일수화물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 염산을 스톡 용액에 가하여 용액 속 미량 금속 염을 유지시킨다.
[표 1a]
미량 금속 스톡 용액 A
Figure 112016019550472-pct00162
본 발명에서 사용하기 위한 다른 적합한 미량 금속 용액은 표 1b에 나타내며 킬레이트제로서 염화제1철, 육수화물; 염화아염; 염화코발트, 육수화물; 몰리브덴산나트륨; 염화망간; 붕산; 및 시트르산을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
[표 1b]
미량 금속 스톡 용액 B
Figure 112012080180037-pct00002
발효 배지는 또한 비타민을 포함할 수 있다. 이러한 비타민은 발효 배지에 편의상 발효 배지의 나머지로부터 별도로 제조될 수 있는 스톡 용액으로서 가할 수 있다. 발효 배지에 사용하기 위한 적합한 비타민 스톡 용액은 하기 표 2에 나타낸다. 전형적으로, 발효 배지에 첨가된 이러한 비타민 용액의 양은 1 ml/L 초과, 5 ml/L 초과, 또는 10 ml/L 초과이다. 그러나, 특정 농도를 초과하는, 발효 배지에 대한 비타민의 첨가는 미생물의 성장에 유리하지 않다. 따라서, 발효 배지에 첨가된 이러한 비타민 용액의 양은 전형적으로 50 ml/L 미만, 30 ml/L 미만, 또는 20 ml/L 미만이다. 스톡 용액 속에 비타민을 첨가하는 것 외에, 개개 성분들은 각각 비타민 스톡 용액의 상기 범위로 나타낸 성분들의 양에 독립적으로 상응하는 범위내에서 별도로 첨가될 수 있다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 사용하기 위한 적합한 비타민 용액은 바이오틴, 판토텐산칼슘, 이노시톨, 피리독신-HCl 및 티아민-HCl을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
[표 2]
비타민 스톡 용액
Figure 112012080180037-pct00003
본 발명의 미생물은 뱃치(batch), 유가-뱃치(fed-batch), 세포 재순환(cell recycle), 및 연속을 포함하나, 이에 한정되지 않는 통상의 발효 양식으로 배양할 수 있다. 일부 양태에서, 발효는 유가-뱃치 방식으로 수행된다. 이러한 경우에, 발효 동안 배지 중 성분의 일부가 고갈된다. 발효를 비교적 높은 농도의 이러한 성분들을 사용하여 개시함으로써 성장이, 첨가가 요구되기 전 일정 시간의 기간 동안 지지되도록 할 수 있다. 이들 성분의 바람직한 범위는 발효에 의해 농도가 고갈될 때 첨가함으로써 발효 전체에서 유지된다. 발효 배지 속 성분들의 수준은 예를 들면, 발효 배지를 주기적으로 시료채취하여 농도를 검정함으로써 모니터링할 수 있다. 대안적으로, 일단 표준 발효 과정이 전개되면, 첨가를 발효 전체에서 특정 시간에 공지된 수준에 상응하는 시간 간격에서 이룰 수 있다. 당해 분야의 숙련가에 의해 인식될 바와 같이, 영양물 소비 속도는, 배지의 세포 밀도가 증가함에 따라, 발효 동안 증가한다. 또한, 발효 배지내로 외부 미생물의 도입을 피하기 위하여, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 첨가를 혐기성 첨가 방법을 사용하여 수행한다. 또한, 소량의 소포제를 발효 동안 가할 수 있다.
발효 배지의 온도는 콘드로이틴의 성장 및 생산에 적합한 임의의 온도일 수 있다. 예를 들면, 발효 배지에 접종물로 접종하기 전에, 발효 배지를 20℃ 내지 45℃, 25℃ 내지 40℃, 또는 28℃ 내지 32℃의 범위내의 온도에서 유지시킬 수 있다.
발효 배지의 pH는 발효 배지에 산 또는 염기를 첨가함으로써 조절할 수 있다. 암모니아를 사용하여 pH를 조절하는 경우, 이는 발효 배지 속에서 질소원으로서 편리하게 작용한다. 일부 양태에서, pH는 3.0 내지 8.0, 5.5 내지 7.5, 또는 6.0 내지 7에서 유지된다.
발효 배지는 또한 발효 과정 동안 일정한 용존 산소 함량을 갖도록 유지함으로써 세포 성장을 유지하고 콘드로이틴의 생산을 위한 세포 대사를 유지할 수 있다. 발효 배지 중 산소 농도는 산소 전극의 사용을 통해서와 같은, 공지된 방법을 사용하여 모니터링할 수 있다. 산소는 발효 배지에 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들면, 교반, 진탕 또는 살포(sparging)에 의한 배지의 교반 및 통기를 통해 가할 수 있다. 일부 양태에서, 발효 배지 중의 산소 농도는 대기압 및 20℃ 내지 40℃ 범위의 온도에서 발효 배지 중의 산소의 용해도를 기준으로 하여 배지 속 산소의 포화 값의 10% 내지 200%의 범위내에 있다. 그러나, 발효에 부정적으로 영향을 미치지 않으면서, 발효 동안 산소 농도가 주기적으로 당해 범위 미만으로 내려갈 수 있다.
배지의 통기가 공기의 사용과 관련하여 본원에 기술되어 있다고 해도, 다른 산소원을 사용할 수 있다. 주변 공기 중의 산소의 용적분률보다 높은 산소의 용적분률을 함유하는 통기 가스의 사용이 특히 유용하다. 또한, 이러한 통기 가스는 발효에 부정적으로 영향을 미치지 않는 다른 가스를 포함할 수 있다.
본 발명의 발효 공정의 양태에서, 발효 배지는 위에서 기술한 바와 같이 제조된다. 당해 발효 배지는 합리적인 성장 기간 후, 고 세포 밀도를 생산하기에 충분한 양의, 본 발명의 유전적으로 변형된 미생물의 활성적으로 성장하는 배양물로 접종된다. 대표적인 접종 세포 밀도는, 세포의 무수 중량을 기준으로 하여, 0.001 g/L 내지 10 g/L, 0.01 g/L 내지 5 g/L, 또는 0.05 g/L 내지 1.0 g/L의 범위이내이다. 그러나, 생산 규모 발효기에서, 보다 높은 접종 세포 밀도가 바람직하다. 이후에, 세포를 10 g/L 내지 150 g/L, 20 g/L 내지 80 g/L, 또는 50 g/L 내지 70 g/L 범위의 세포 밀도로 성장시킨다. 발효 동안 목적하는 세포 밀도에 이르기 위한 미생물에 대한 잔류 시간은 전형적으로 200 시간 미만, 120 시간 미만, 또는 96시간 미만이다.
본 발명의 작동 중 하나의 방식에서, 발효 배지 속 글리세린 농도와 같은 탄소원 농도는 발효 동안 모니터링된다. 발효 배지 속 글리세린 농도는 예를 들면, 발효 배지의 무세포(cell-free) 성분인, 상층액 중 글리세린 농도를 모니터하는데 사용될 수 있는, 예를 들면, 고압 액체 크로마토그래피의 사용과 같은 공지된 기술을 사용하여 모니터링할 수 있다. 앞서 기술한 바와 같이, 탄소원 농도는, 세포 성장 억제가 일어나는 수준 미만에서 유지되어야 한다. 비록 이러한 농도가 유기체간에 변할 수 있다고 해도, 탄소원으로서 글리세린의 경우, 세포 성장 억제는 약 60 g/L 보다 큰 글리세린 농도에서 발생하며, 시도에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 따라서, 글리세린이 탄소원으로 사용되는 경우 글리세린은 바람직하게는 발효기에 공급되어 검출 한계 미만에서 유지된다. 대안적으로, 발효 배지 속 글리세린 농도는 1 g/L 내지 100 g/L, 2 g/L 내지 50 g/L, 또는 5 g/L 내지 20 g/L의 범위에서 유지된다. 비록 탄소원 농도가 예를 들면, 실질적으로 순수한 글리세린 용액의 첨가에 의해 목적한 수준내에서 유지될 수 있다고 해도, 원래의 발효 배지의 분취량의 첨가에 의해 발효 배지의 탄소원 농도를 유지하는 것이 허용될 수 있다. 원래의 발효 배지의 분취량의 사용은, 배지 속 다른 영양물(예를 들면, 질소 및 인산염 공급원)의 농도가 동시에 유지될 수 있으므로 바람직할 수 있다. 유사하게, 미량의 금속 농도는 미량의 금속 용액의 분취량을 가함에 의해 발효 배지 속에서 유지될 수 있다.
콘드로이틴 회수
일단 콘드로이틴이 발효 방법에 의해 생산되면, 이는 후속적인 사용을 위해 회수할 수 있다. 본 발명자들은, 콘드로이틴이 배양 배지 속에 무세포 형태("분비된 콘드로이틴")으로 존재할 수 있고/있거나 세포와 연합될 수 있음을 밝혀내었다. 세포와 연합되는 콘드로이틴은 세포 표면("세포-표면 콘드로이틴")과 연합될 수 있고/있거나 세포내에("세포내 콘드로이틴") 유지될 수 있다.
"분비된 콘드로이틴"과 관련하여, 콘드로이틴의 회수는 세포 제거 후 무세포 배양 배지의 알코올 침전에 의해, 또는 무수 분말을 수득하기 위한 무세포 배양 배지의 동결건조를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당해 분야에 공지된 어떠한 기술에 의해 달성될 수 있다.
"세포-표면 콘드로이틴'과 관련하여, 콘드로이틴의 회수는 세포 표면으로부터 콘드로이틴을 탈착시키는 단계 후 유리 콘드로이틴을 함유하는 배양 배지로부터 세포를 제거하는 세포 제거 단계를 추가로 포함할 수 있다. "세포내 콘드로이틴"과 관련하여, 회수는 또한 세포를 침투시키거나 분해하는 단계 후, 분해되거나 침투된 세포를 유리된 콘드로이틴을 이제 함유하는 배양 배지로부터 제거함을 달성하는 단계를 포함할 수 있다. 콘드로이틴은 배양 배지의 알코올 침전, 또는 무수 분말을 수득하기 위한 배양 배지의 동결건조를 포함하나, 이에 한정되지 않는 당해 분야에 공지된 어떠한 기술에 의해 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
또한, 회수된 콘드로이틴 중합체를 해중합하여 중합체의 분자량을 감소시킬 수 있다. 콘드로이틴의 해중합은 산성 해중합을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당해 분야에 공지된 어떠한 기술에 의해서도 달성할 수 있다(참조: 예를 들면, Tommeraas and Melander, Biomacromolecules 2008;9:1535-1540). 회수된 콘드로이틴은 예를 들면, 해중합되어 동물-유래된 콘드로이틴과 유사하거나 동일한 분자량을 갖는 콘드로이틴을 생산하고/하거나 회수된 황산화되지 않은 콘드로이틴의 황산화를 보조할 수 있다. 예를 들면, 회수된 콘드로이틴은 해중합되어 분자량이 5 kDa 내지 100 kDa, 바람직하게는, 10 kDa 내지 70 kDa, 보다 바람직하게는, 20 kDa 내지 40 kDa인 중합체를 수득할 수 있다.
다음의 정의 및 약어는 특허청구범위 및 명세서의 해석에 사용되어야 한다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "유전자"는, 선택적으로 코딩 서열의 선행(5' 비-코딩 서열) 및 후행(3' 비코딩 서열) 조절서열을 포함하는, 특정 단백질로 발현될 수 있는 핵산 단편(또는 폴리뉴클레오타이드)을 말한다. "천연 유전자"는 이의 자체의 조절 서열과 함께 천연에서 발견되는 유전자를 말한다. "내인성 유전자"는 유기체의 게놈내 이의 천연 위치내 천연 유전자를 말한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "코딩 서열"은 특정 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 말한다.
"적합한 조절 서열"은 코딩 서열의 상부(5' 비-코딩 서열), 당해 서열내, 또는 하부(downstream)(3' 비-코딩 서열)에 위치하며 전사, RNA 프로세싱 또는 안전성, 또는 연합된 코딩 서열의 해독에 영향을 미치는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 조절 서열은 프로모터, 해독 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 프로세싱 부위, 효과기 결합 부위 및 스템-루프 구조(stem-loop structure)를 포함할 수 있다.
용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 말한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대해 3'에 위치한다. 프로모터는 천연 유전자로부터 그 전체가 유래될 수 있거나, 천연에서 발견된 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 성분으로 구성되거나, 심지어 합성 DNA 분절을 포함할 수 있다. 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형, 또는 발달의 상이한 단계, 또는 상이한 환경적 또는 생리학적 상태에 대한 반응시 유전자의 발현을 지시할 수 있음은 당해 분야의 숙련가에 의해 이해된다. 유전자가 대부분의 시간에 대부분의 세포 유형에서 발현되도록 하는 프로모터는 "구성적 프로모터"로 일반적으로 언급된다. 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계는 완전히 정의되지 않으므로, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있음이 또한 인식된다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "발현"은 본 발명의 핵산 단편으로부터 유래된 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 말한다. 발현은 또한 mRNA의 폴리펩타이드로의 해독을 말할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "형질전환"은 숙주 유기체 내로 핵산 단편이 전달되어 유전적으로 안정한 유전을 생성함을 말한다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉" 또는 "재조합" 또는 "형질전환된" 유기체로 언급된다.
용어 "작제물", "플라스미드", "벡터" 및 "카세트"는 세포의 중심 대사의 일부가 아니며, 일반적으로 환형, 또는 선형, 이본쇄 DNA 단편의 형태인 유전자를 흔히 수반하는 염색체외 성분을 말한다. 이러한 성분은 어떠한 공급원으로부터 유래된, 일본쇄 또는 이본쇄 DNA 또는 RNA의 자가 복제하는 게놈 서열, 통합 서열, 파아지 또는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 여기서 다수의 뉴클레오타이드 서열은 적절한 3' 해독되지 않은 서열과 함께 선택된 유전자 생성물에 대한 프로모터 단편 및 DNA 서열을 세포내로 도입할 수 있는 유일한 작제물로 결합되거나 재조합된다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "코돈 축퇴성(codon degeneracy)"은 인코딩된 폴리펩타이드의 아미노산 서열내 변화없이 뉴클레오타이드 서열의 변이를 허용하는 유전 코드의 특성을 말한다. 당해 분야의 숙련가는 주어진 아미노산을 특정하기 위하여 뉴클레오타이드 코돈의 사용시 특정 숙주 세포에 의해 나타난 "코돈-성향(condon-bias)"을 잘 인식한다. 따라서, 숙주 세포내에서 개선된 발현을 위해 유전자를 합성하는 경우, 코돈 사용빈도의 이의 빈도가 숙주 세포의 바람직한 코돈 사용빈도의 빈도에 근접하도록 유전자를 설계하는 것이 바람직할 수 있다.
용어 "코돈-최적화된"은, 이것이 각종 숙주의 형질전환을 위한 핵산 분자의 유전자 또는 코딩 영역을 언급할 경우, DNA에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 변경하지 않고 숙주 유기체의 대표적인 코돈 사용빈도를 반영하기 위한 핵산 분자의 유전자 또는 코딩 영역내 코돈의 변형을 말한다.
용어 "작동적으로 연결된"은 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향받도록 하는 단일 핵산 단편위의 핵산 서열의 연합을 말한다. 예를 들면, 프로모터는, 이것이 이러한 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우(즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 조절하에 있음) 코딩 서열과 작동적으로 연결되어 있다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다.
본원에 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 문헌[참조: Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) (hereinafter "Maniatis"); and by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with 유전자 Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)]에 기술되어 있다. 이들 문헌 각각은, 이의 전문이 본원에 참조로 통합된다.
본 발명의 추가의 목적, 이점 및 신규 특징은 본원의 다음 실시예들의 시험시 당해 분야의 숙련가에게 명백해질 것이며, 이들 실시예는 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1
K4 캡슐 생합성의 유전학
에스케리키아 콜라이 K4 캡슐은 "2 군" 캡슐로 분류된다. 휘트필드(Whitfield)에 의해 고찰된 바와 같이(참조: Annu Rev Biochem. 2006; 75:39-68), 에스케리키아 콜라이 2 군 캡슐의 합성은 3개 영역으로 이루어진 일반적인 유전적 구조를 지닌 유전자 클러스터에 의해 인코딩된 단백질의 세트에 의해 지시된다. 에스케리키아 콜라이 K4 캡슐 유전자 클러스터의 예측된 구조(본 발명 이전)은 도 2에 나타낸다. 영역 1은 6개의 유전자, kpsFEDUCS를 함유하는 것으로 예측되었으며, 영역 3은 2개의 유전자, kpsM 및 kpsT를 함유하는 것으로 예측되었다. 공지된 단백질과의 서열 상동성을 기초로 하여, kpsF 및 kpsU 유전자는 당 뉴클레오타이드 CMP-Kdo의 생합성시 단계들을 촉매하는 단백질을 인코딩하는 것으로 예측되었다. 에스케리키아 콜라이내 2 군 캡슐의 CMP-Kdo 생합성의 역활이 제안되어 왔으나(참조: Roberts, Annu. Rev. Microbiol. 1996; 50:285-315) 실험적으로 입증되어 있지 않다(참조: Whitfield, Annu Rev Biochem. 2006; 75:39-68). kpsM, kpsT, kpsD, kpsE, kpsC 및 kpsS 유전자는 당 전구체의 중합이 발생하는 세포 세포질로부터 성숙한 캡슐 다당류가 외부 세포 막의 지질 성분에 대한 공유 결합을 통해 외부 세포 막에 고정된 것으로 여겨지는 세포 표면으로의 캡슐 다당류의 전좌에 요구되는 단백질을 인코딩하는 것으로 예상되었다(참조: Roberts, Annu. Rev. Microbiol. 1996;50:285-315; Whitfield, Annu Rev Biochem. 2006;75:39-68). 에스케리키아 콜라이 K4 캡슐의 경우, 대부분 에스케리키아 콜라이 2 군 캡슐에 대해서와 같이, 다당류와 캡슐의 지질 성분 사이의 공유 결합의 구조는 실험적으로 측정되지 않았다. 더우기, 지질 성분의 실체는 알려져 있지 않다. 영역 1 및 영역 3 유전자, 및 이들이 인코딩하는 단백질은 매우 다양한 다당류 조성 및 구조를 갖는 캡슐을 생산하는 에스케리키아 콜라이 균주 중에서 고도로 보존된다(참조: Whitfield, Annu Rev Biochem. 2006;75:39-68). 에스케리키아 콜라이내 2 군 캡슐 클러스터의 영역 2에 함유된 유전자는 당 뉴클레오타이드 전구체 생합성 및 이들 전구체의 중합을 위한 효소를 코딩하는 유전자를 포함함으로써, 영역 2는 캡슐 다당류의 구조를 결정한다. 에스케리키아 콜라이내 2 군 캡슐 클러스터의 영역 2내 다른 유전자는, 기능이 공지되어 있지 않고 캡슐 생합성에 있어 역활을 갖는 것으로 입증되어 있지 않은 단백질을 인코딩한다. 니노미야(Ninomiya) 등이 기술한 바와 같이(참조: J. Biol. Chem. 2002;277:21567-21575, GenBank AB079602), 에스케리키아 콜라이 K4 캡슐 유전자 클러스터의 영역 2의 서열은 단백질을 인코딩하는 것으로 예측된 7개의 주석이 달린 개방 판독 프레임(kfoABCDEFG)을 함유한다. 삽입 성분, IS2는 유전자 kfoC와 kfoD 사이에 위치한다.
K4 캡슐 생합성 유전자에 대한 합성 코딩 서열의 설계시 예비 단계로서, 각각의 유전자 쌍을 분리하는 유전자간 서열을 검사하였다. 당해 서열 분석을 기초로 하여, 당해 영역내에, 발현되고 캡슐 생합성에 잠재적으로 관련될 가능성이 있는 단백질을 인코딩하는 적어도 2개의 추가의 개방-판독-프레임(open-reading-frames: ORF)이 존재한 것으로 여겨졌다. 니노미야 등의 서열을 기본으로 하여, 다음의 유전자간 거리를 수득하였다: kfoA-kfoB: 186 bp; kfoB-kfoC: 297 bp; kfoC-IS2: 29 bp; IS2-kfoD: 9 bp; kfoD-kfoE: 389 bp; kfoE-kfoF: 818 bp; kfoF-k foG: 431 bp. 하나의 개방 판독 프레임은 각각의 3개의 최대 유전자간 영역내에서 확인되었다.
대부분의 kfoD-kfoE 영역은 kfoD의 정지 코돈 후 10개 뉴클레오타이드에서 개시하여 kfoE의 코딩 영역내에서 종결하는, "ORF3"로 명명된 390 bp ORF에 의해 포함된다. 즉, 추정적인 orf3 유전자는 10개 뉴클레오타이드에 의해 kfoE 유전자와 중첩한다. 당해 ORF는 ATG에 의해 개시하며 제2의 가능한 ATG 출발점은 9bp 하부에 인프레임으로(in frame) 위치한다. 이들 가능한 출발 둘다는 인식가능한 샤인-달가노(Shine-Dalgarno: SD) 서열(참조: Shine and Dalgarno Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1974;71:1342-6)을 결실하고 있다. orf3의 단백질 생성물이 BLAST 조사에서 사용된 경우, 8개의 "우수한" 히트(hit), 즉, > 138의 점수, < 3e-31의 E 값이 수득되었다. 이들 히트 중 2개는 캡슐 생합성을 위한 유전자 클러스터내에 위치한 파스퇴렐라 물토시다 유전자(bcbF & ecbF)에 의해 인코딩된 단백질에 대한 것이었다. 이들 파스퇴렐라 물토시다 캡슐 유전자 클러스터는 도 3a에 본 발명자에 의해 분석된 대로 니노미야 등의 서열에 따라 K4 영역 2 유전자와 함께, 도표화되어 있다. Orf3, BcbF 및 EcbF 단백질에 대한 단백질 서열의 정렬은 도 3b에 나타낸다. 이들 파스퇴렐라 물토시다 서열은 혈청형 B 균주(M1404) 및 혈청형 E 균주(P1234) 각각으로부터 온다. 혈청형 E 캡슐의 조성은 알려져 있지 않지만 혈청형 B 캡슐은 만노즈, 갈락토즈 및 아라비노즈로 구성된 것으로 보고되어 있으나 구조는 보고되어 있지 않다(참조: Townsend et al., J. Clin. Microbiol. 2001;39:924-929).
kfoE-kfoF 영역내에서, "ORF1"으로 명명된 630 bp ORF가 도 3a에 나타난 대로 존재한다. 당해 ORF에 대한 ATG 출발 코돈은 kfoE 유전자의 상부의 TGA 정지 코돈과 중첩된다. KfoE에 대한 코딩 서열내 당해 ATG의 상부의 7개 염기 쌍, 강력한 SD 서열(AGGAGG)이 존재한다. 따라서, 당해 ORF가 발현되어야 하는 환경적 증거는 강력하다. ORF1에 의해 코딩된 단백질에 대한 BLAST 결과는 ORF3를 사용하여 수득된 파스퇴렐라 물토시다 유전자 히트에 근접한 파스퇴렐라 물토시다 유전자(bcbE & ecbE)에 대한 강력한 히트를 포함한다. 즉, K4 클러스터의 추정적인 ORF 1 및 3 둘 다는 캡슐 다당류를 인코딩하는 2개의 파스퇴렐라 물토시다 유전자 클러스터내에 상동체를 갖는다. ORF1, BcbE 및 EcbE 단백질 서열의 정렬은 도 3b에 나타낸다.
kfoF-kfoG 영역에서, "ORF2"로 명명된 384 bp ORF가 존재한다. 당해 ORF의 ATG 개시 코돈은 약한 SD 서열을 제공할 수 있는 GG 서열 15 bp 상부 이후에 온다. 당해 단백질 서열을 사용한 BLAST 조사에서 유의적인 히트는 발견되지 않았다. 이는, 당해 ORF가 실제 생산되는 폴리펩타이드를 인코딩하지 않을 수 있음을 제안하였다.
영역 2로부터의 2개의 다른 K4 캡슐 클러스터 유전자(kfoD 및 kfoE)는 파스퇴렐라 물토시다 P1234 및 파스퇴렐라 물토시다 M1404 캡슐 유전자 클러스터내에 위치하는 피, 물토시다 유전자에 대해 상동성을 갖는 것에 주목하는 것이 흥미롭다. kfoD에 의해 인코딩된 단백질은 EcbD 및 BcbD와 상동성을 공유하며 유사하게 kfoE 유전자 생성물은 EcbG 및 BcbG와 상동성을 공유한다. 따라서, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 4개의 인접한 K4 유전자(kfoD, orf3, kfoE, 및 orf1)는 인접한 파스퇴렐라 물토시다 혈청형 B 유전자 bcbDEFG 및 파스퇴렐라 물토시다 혈청형 E 유전자 ecbDEFG 중에서 상동체를 갖는다. 위에 나타낸 바와 같이, 이들 2개의 파스퇴렐라 균주는 콘드로이틴 생산자가 아니며 K4 유전자 kfoD, orf3, kfoE, 및 orf1이 콘드로이틴 생합성에 역활을 하는 경우 역활은 본 발명 이전에 알려져 있지 않았다.
K4내의 kfoD, orf3, kfoE, orf1 유전자 세트는 IS2가 바로 앞에(9bp) 선행한다는 사실은 이들의 기원 및 콘드로이틴 캡슐 합성시 역활과 관련된 다수의 가능성을 유발한다. 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은, K4 영역 2 유전자 클러스터가 IS2-매개된 재조합/삽입을 통해 kfoABCFG로 구성된 모(parental) 콘드로이틴-생산 클러스터로 유발되는 것으로 고려한다. 또한, 본 발명자들은, kfoD, orf3, kfoE 및 orf1 유전자가 콘드로이틴 골격의 프럭토실화에 관여할 수 있다고 가설을 세웠다. 프럭토실화는 파스퇴렐라 물토시다 혈청형 F 캡슐과 에스케리키아 콜라이 K4 캡슐 사이의 하나의 명백한 구조적 차이이다. 2개 사이의 유전적 구조에 있어서 유의적인 차이, 즉, kfoD, orf3, kfoE, orf1 유전자 세트의 존재 또는 부재는 이러한 구조적 차이의 반영임이 가능하다. 파스퇴렐라 물토시다 콘드로이틴-생산 혈청형 F 균주 P4182의 캡슐 생합성 유전자 클러스터와 유사하게(참조: Townsend et al., J. Clin. Microbiol. 2001;39:924-929), 콘드로이틴 골격의 생산을 위한 유일한 관련된 K4 영역 2 유전자가 kfoA, kfoB, kfoC, kfoF 및 kfoG일 수 있음은 가능할 수 있다. 실시예 6 및 7에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은, kfoD, orf3, kfoE 및 orf1 유전자가 콘드로이틴의 생산에 필요하지 않으며 이들 유전자들 중 하나 이상은 콘드로이틴의 프럭토실화에 필수적임을 확인하였다.
K4 캡슐 생합성 유전자에 대한 합성 코딩 서열을 설계하기 전에 니노미야 등의 서열을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 ATCC로부터 입수한 에스케리키아 콜라이 K4 균주 ATCC 23502로부터의 K4 캡슐 유전자 클러스터의 영역 2를 서열분석하였다. 게놈 DNA를 퀴아젠 게놈 DNA 키트(Qiagen Genomic DNA Kit)(제조원: Qiagen Inc., 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 ATCC 균주 23502의 새로운 밤새 배양물로부터 판매회사의 프로토콜에 따라 제조하였다. 20 게이지 바늘을 통한 통과(5회)에 의해 전단된 게놈 DNA의 분취량을 PCR 반응에서 주형으로 사용하여 크기가 2.2 kB 내지 2.7 kB의 범위인 6개의 중첩된 PCR 생성물의 시리즈를 생산하였다. PCR 반응의 생성물을 퀴아젠 퀴아퀵 PCR 정제 키트(Qiagen QIAquick PCR Purification Kit)를 사용하여 판매회사 프로토콜에 따라 정제하여 상업적 판매회사(Biotechnology Resource Center, DNA Sequencing Facility, Cornell University, 미국 뉴욕 이타카 소재)에 DNA 서열 측정을 위해 보냈다. 이들 6개의 중첩 PCR 생성물의 서열은 니노미야 등(2002)에 의해 측정된 대로 영역 2 서열에 걸쳐 있었다. 전체적으로 본 발명자들에 의해 측정된 서열과 니노미야 등에 의해 보고된 서열이 99.8% 유사성으로 일치하였다. 그러나, 26번 위치에서 치환, 결실 및 삽입을 포함하는 단일 염기쌍 차이가 존재하였다. 이들 차이들 중의 일부는 유전자 클러스터에 의해 코딩된 영역 2 단백질의 예측된 아미노산 서열내 실질적인 차이를 초래하였다. 관찰된 뉴클레오타이드 서열 차이 및 예측된 단백질 서열에서 수득되는 효과는 도 4a 및 4b에 나타낸다.
K4 캡슐 생합성 유전자의 정확한 서열을 결정하기 위하여, 에스케리키아 콜라이 혈청형 K4 균주 U1-41을 스타텐스 혈청 연구소(Statens Serum Institut)(덴마크 코펜하겐 소재)로부터 입수하였다. U1-41은 ATCC 23502 균주의 조상이며 K4 다당류의 구조적 측정을 위해 사용된 다당류 제제를 생산하기 위해 사용되었다(참조: Rodriguez et al., 1988). 에스케리키아 콜라이 U1-41내 K4 캡슐 유전자 클러스터의 영역 1, 2 및 3에 걸친 대략 23 kb의 DNA의 서열을 측정하였다. 당해 서열(서열 번호 117)은 영역 1의 kpsF 유전자의 ATG 해독 개시 코돈 상부의 125bp로부터 영역 3의 kpsM 유전자의 ATG 해독 개시 코돈 상부의 110bp 까지의 영역에 걸친 23,230개 염기 쌍으로 이루어진다.
서열 결정을 위해, 게놈 DNA를 에스케리키아 콜라이 U1-41의 새로운 밤샘 배양물로부터 퀴아젠 게놈 DNA 키트(Qiagen Genomic DNA Kit)(제조원: Qiagen Inc., 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 판매회사의 프로코콜에 따라 제조하였다. 20 게이지 바늘을 통한 통과(5회)에 의해 전단된 게놈 DNA의 분취량을 PCR 반응에서 주형으로 사용하여 크기가 2.1 kB 내지 2.8 kB 범위의 11개의 중첩된 PCR 생성물의 시리즈를 생산하였다. 본원에서 반응물 1 내지 11로 명명된 이들 PCR 반응은 다음 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하였다: 반응 1; (DHD089 및 DHD090), 반응 2; (DHD091 및 DHD092), 반응 3; (DHD093 및 DHD175), 반응 4; (DHD120 및 DHD096), 반응 5; (DHD097 및 DHD098), 반응 6; (DHD099 및 DHD100), 반응 7; (DHD101 및 DHD102), 반응 8; (DHD103 및 DHD104), 반응 9; (DHD105 및 DHD106), 반응 10; (DHD162 및 DHD108), 반응 11; (DHD169 및 DHD110). 이들 프라이머의 서열은 하기 나타낸다.
DHD089 5> GCACCTCCATGAGACATTGC >3 (서열 번호 118)
DHD090 5> CCACTGCCATACGGTTTAGC >3 (서열 번호 119)
DHD091 5> GCTTGCCTTTGCAGAAACGG >3 (서열 번호 120)
DHD092 5> CCAACAATATCGAGCAGTGG >3 (서열 번호 121)
DHD093 5> GTCATTCGTCAGAACGGTGC >3 (서열 번호 122)
DHD175 5> CCAGTGCCTGATAATCAGC >3 (서열 번호 123)
DHD120 5> GGCTTAACGCTGTGGAAGTC >3 (서열 번호 124)
DHD096 5> ATATTGGGATTCCTGGTCGC >3 (서열 번호 125)
DHD097 5> ACGACATCAAAGGCTTGACG >3 (서열 번호 126)
DHD098 5> ATAGCCCTGAAGCTGAAGCC >3 (서열 번호 127)
DHD099 5> CGAGTGATTGCTTGGTATCC >3 (서열 번호 128)
DHD100 5> AAACGATTGAGCGGGTTAGC >3 (서열 번호 129)
DHD101 5> AGAGTGGTTCAATCCTCTGG >3 (서열 번호 130)
DHD102 5> TGTCTTGGCTAATGCTGACG >3 (서열 번호 131)
DHD103 5> CGAGTAGTTATCTGGCTCTG >3 (서열 번호 132)
DHD104 5> GTCAGTTAGACTCTGATGAC >3 (서열 번호 133)
DHD105 5> CTTGAACGGTCCAACTTCAC >3 (서열 번호 134)
DHD106 5> AGTTCAGGAGCTTGAATGCG >3 (서열 번호 135)
DHD162 5> TTCGCACGCATTTATAGCCG >3 (서열 번호 136)
DHD108 5> TCATCTTGCGAGAGCATTCG >3 (서열 번호 137)
DHD169 5> CTTCCGCTAAATCCATTACG >3 (서열 번호 138)
DHD110 5> AGATCTATTTATCCCTGCGG >3 (서열 번호 139)
PCR 반응 1, 2, 3, 7, 8, 9, 10 및 11은 PfuUltra II 폴리머라제(제조원: Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 사용하여 판매회사 프로토콜에 따라 수행하였다. 각각의 100μL 반응물에서, Pfu 반응 완충액(판매회사에 의해 공급됨)을 1X의 최종 농도로 가하고, 프라이머를 각각 0.4μM의 최종 농도로 가하고, dNTP를 각각 250μM의 최종 농도에서 가하고 100 ng의 U1-41 게놈 DNA를 주형으로서 가하였다. PCR 반응을 Perkin-Elmer GeneAmp 2400 열순환기 속에서 다음 주기 매개변수를 사용하여 수행하였다: 95℃에서 2분의 1 주기; 95℃에서 20초, 55℃에서 20초, 및 72℃에서 40초의 35 주기; 72℃에서 3분의 1주기; 및 4℃에서 유지. PCR 반응 4, 5 및 6을 하기의 예외들과 함께 상기와 같이 수행하였다. 반응 5 및 6의 경우에, 프라이머를 각각 0.5μM의 최종 농도로 가하고 어닐링 단계(annealing step)를 55℃ 대신 60℃에서 수행하였다. 반응 4의 경우에, 프라이머를 각각 0.5μM의 최종 농도로 가하고 PCR 반응을 RoboCycler® 구배 96 열순환기(제조원: Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재) 속에서 다음의 주기 매개변수를 사용하여 수행하였다: 95℃에서 1분의 1 주기; 95℃에서 30초, 52℃에서 30초, 및 72℃에서 1분의 35 주기; 72℃에서 5분의 1 주기; 및 6℃에서 유지.
PCR 반응 1, 2, 3, 7, 8, 9, 10 및 11의 생성물을 퀴아젠 퀴아퀵 PCR 정제 키트(Qiagen QIAquick PCR Purification Kit)(제조원: QIAGEN, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 판매회사의 프로토콜에 따라 정제하고, 100μL의 EB 용출 완충액 속에 회수한 후, 서열분석 반응용 주형으로 사용하였다. PCR 반응 4, 5 및 6의 생성물을 퀴아젠 퀴아퀵 PCR 정제 키트(제조원: QIAGEN, 미국 캘리포니아주 발렌시아가 소재)를 사용하여 판매회사 프로토콜에 따라 정제한 후 예비(preparative) 아가로즈 겔 전기영동에 의해 추가로 정제하였다. 단편들을 퀴아퀵 겔 추출 키트(QIAquick Gel Extraction Kit)(제조원: QIAGEN Inc., 미국 캘리포니아주 발렌시아가 소재)를 사용하여 판매회사 프로토콜에 따라 겔 슬라이스(gel slice)로부터 용출하고 100μL의 EB 용출 완충액 속에 회수하였다. 겔-정제된 단편을 서열분석 반응을 위한 주형으로 제공하였다. 반응 1 내지 11의 정제된 PCR 생성물을 상업 판매회사(Cornell University Life Sciences Core Laboratories Center, Cornell University, 미국 뉴욕주 이타카 소재)로 DNA 서열분석 측정을 위해 보냈다. 이들 11개의 중첩 PCR 생성물로부터 수득된 서열은 니노미야 등(2002)에 의해 측정된 바와 같이 영역 2 서열에 걸쳐 있고 또한 영역 1 및 영역 3 유전자 모두를 포함하였다.
U1-41로부터의 K4 캡슐 유전자 클러스터의 서열은 에스케리키아 콜라이내 2 군 캡슐 유전자 클러스터에 대해 전형적인 것으로서 영역 1내 kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC 및 kpsS 유전자의 존재를 입증한다. U1-41 KpsF, KpsE, KpsD, KpsU, KpsC 및 KpsS 단백질의 예측된 아미노산 서열은 다른 에스케리키아 콜라이 2 군 캡슐 생산인자에 의해 인코딩된 이들 단백질의 서열에 대해 상동성이다. 이들은 모두 이들 단백질에 대한 컨센수스(consensus) 서열에 대해 및 에스케리키아 콜라이 니슬(Escherichia coli Nissle) 1917(혈청형 K5) KpsF, KpsE, KpsD, KpsU, KpsC 및 KpsS 서열에 대해 >95% 동일성을 나타낸다(참조: Grozdanov et al., J. Bacteriol. 2004;186:5432-41). 당해 서열은 또한 에스케리키아 콜라이내 2 군 캡슐 유전자 클러스터에 대해 전형적인 것으로서 영역 3내 kpsM 및 kpsT 유전자의 존재를 나타낸다. U1-41 KpsM 및 KpsT 단백질의 예측된 아미노산 서열은 다른 에스케리키아 콜라이 2 군 캡슐 생산인자에 의해 인코딩된 이들 단백질의 서열에 대해 상동성이다. 이들은 모두 이들 단백질에 대한 컨센수스 서열에 대해 및 에스케리키아 콜라이 니슬 1917(혈청형 K5) KpsM 및 KpsT 서열에 대해 >90% 동일성을 나타낸다.
U1-41 DNA 서열은 니노미야 등의 영역 2 서열에 대해 및 ATCC 23502의 영역 2에 대해 본 발명자들에 의해 결정된 서열에 대해 정렬될 수 있는 대략 13.5 kb 영역 2 분절을 포함한다. U1-41 서열 및 ATCC 23502의 영역 2에 대해 본 발명자들에 의해 결정된 서열은 이들 스패닝 영역에 걸쳐 동일하다. 폴리펩타이드로서 발현될 것으로 예측된 9개의 개방 판독 프레임(ORF)은 IS2 서열을 배제하고, 확인된 영역 2내에 존재한다. 이들 9개는 상기 상세한, 앞서 확인되지 않은 2개의 ORF를 포함한다. 이들 ORF를 인코딩하는 유전자는 초기에 본원에서 orf1 및 orf3로 명명되었으며 이제 각각 kfoH 및 kfoI로 지정되는 것으로 제안된다. 도 5는 ATCC 23502 및 U1-41의 DNA 서열로부터 본 발명자들에 의해 결정된 바와 같은 K4 캡슐 유전자 클러스터의 정렬을 나타낸다. 상기 언급된 Orf2는 본 발명자들에 의해 결정된 영역 2의 서열내 별도의 개방 판독 프레임으로서 존재하는 것으로 밝혀지지 않았다. 본 발명자들에 의해 측정된 서열내에서, orf2를 포함하는 서열은 kfoG의 코딩 서열의 일부이다. 니노미야 등에 의해 발표된 서열내 프레임쉬프트(frameshift)는 kfoG 서열을 2개의 보다 작은 개방 판독 프레임인, 니노미야 등에 의해 주석이 달린 것으로서 kfoG 유전자 및 본 발명자들에 의해 주석이 달린 것으로서 orf2 서열로 분할한다. 따라서, orf2는 니노미야 등에 의해 발표된 잘못된 서열의 인공물이었다.
IS2 서열을 배제하고, 유전자 클러스터는 단백질을 인코딩하는 것으로 예측된 17개의 개방 판독 프레임을 함유한다. 이들 유전자의 정렬은 에스케리키아 콜라이 2 군 캡슐 유전자 클러스터(참조: Whitfield 2006)에 대해 전형적이다. 보존된 유전자 kpsFEDUCS를 포함하는 영역 1, 및 보존된 유전자 kpsMT를 포함하는 영역 3은 영역 2의 9개의 개방 판독 프레임(및 IS2)을 플랭킹한다. 영역 1 및 영역 3 유전자는 에스케리키아 콜라이내 모든 2 군 캡슐의 합성 및 전좌에 필요한 단백질을 포함한다. 영역 1은 또한 CMP-Kdo의 생합성시 단계들을 촉매하는 것으로 예측된 효소를 코딩하는 2개의 유전자(kpsF 및 kpsU)를 포함하다. 위에 주목한 바와 같이, 에스케리키아 콜라이내 2 군 캡슐의 생합성시 CMP-Kdo의 역활은 제안되어 있지만, 실험적으로 입증되어 있지 않았다. 2 군 캡슐 유전자 클러스터에서, 영역 2 유전자는 전형적으로 캡슐 다당류의 구조를 결정하는 혈청형-특이적인 단백질을 인코딩하는 것들을 포함한다. 영역 2내에서 확인된 9개의 유전자들 중에서, 3개는 캡슐 생합성과 관련된 명확하게 정의된 활성을 갖는 단백질: kfoC(콘드로이틴 신타제, 즉 폴리머라제), kfoA(UDPGlcNAc 에피머라제, UDPGlcNAc를 UDPGalNAc 전구체로 전환함) 및 kfoF(UDPGlc-데하이드로게나제, UDPGlc를 UDPGlcUA 전구체로 전환함)를 인코딩한다.
K4 캡슐 유전자 클러스터의 영역 2에 존재하는 다른 유전자에 대해 기능이 미지이다: kfoB, kfoG, kfoD, kfoE, kfoH 및 kfoI. kfoB는 다른 글리코스아미노글리칸(GAG) 캡슐, 파스퇴렐라 물토시다 혈청형 A, F 및 D 및 에스케리키아 콜라이 혈청형 K5를 생산하는 것으로 공지된 박테리아의 캡슐 클러스터내에 존재하는 유전자에 의해 인코딩된 단백질에 대해 상동성인 단백질을 인코딩한다. 유사하게, KfoG 단백질은 또한 파스퇴렐라 물토시다 혈청형 A, F 및 D의 캡슐 클러스터내에 존재하는 유전자에 의해 코딩된 단백질에 대해 상동성이다. 이러한 환경적 증거는, kfoB 및 kfoG가 GAG-함유 K4 캡슐의 생합성에 역활을 할 수 있음을 제안한다.
KfoB 및 KfoG와는 대조적으로, 본 발명 이전에, kfoD, kfoE, kfoH 및 kfoI가 GAG 생합성에 관련되는 것으로 나타낸 증거는 없었다. 위에 나타내고 실시예 6 및 7에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은, 이들 유전자(즉, 유전자 kfoD, kfoE, kfoH 및 kfoI) 중 하나 이상이 K4 캡슐 다당류의 콘드로이틴 골격의 프럭토실화에 필수적이지만, 이들 유전자들 중 어느 것도 콘드로이틴 골격의 생산에 필요하지 않음을 본원에서 나타낸다.
삽입 성분 IS2는 U1-41 및 ATCC 23502내의 유전자 kfoC 및 kfoD 사이에 존재한다. 관찰된 배향에서 IS2의 삽입은 IS2내에서 기원하는 전사로 인하여 하부 유전자의 발현을 활성화시키는 것으로 보고되었다(참조: Glansdorf et al ., Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol ., 1981;45:153-156). 따라서, 이론에 얽메이지 않고, IS2의 존재는 하부 유전자 kfoD, kfoI, kfoE, kfoH, kfoF 및 kfoG의 발현을 조절할 수 있지만, 이들 유전자의 발현을 방지하는 것으로 예측되지 않음이 제안된다.
실시예 2
코돈-최적화된 에스케리키아 콜라이 4 캡슐 생합성 유전자의 합성
본 발명자에 의해 결정된 U1-41 K4 캡슐 유전자 클러스터의 서열을 대체 숙주에서 발현에 사용할 합성 유전자의 설계를 위한 기초로 사용하였다. 합성 작제물을 설계하여 K4 캡슐 생합성 유전자를 함유하는 하나 이상의 합성 오페론의 발현을 허용하고 에스케리키아 콜라이, 잔토모나스 캄페스트리스, 스핑고모나스 엘로데아 및 바실러스 서브틸리스에서 발현을 위해 허용가능한 코돈을 사용하는 컨센수스 바람직한 코돈 표에 기초하여 코돈 사용빈도에 대해 최적화하였다. 표 3a는 에스케리키아 콜라이, 잔토모나스 캄페스트리스 및 바실러스 서브틸리스 게놈에 대한 및 K4P 캡슐 생합성과 관련된 에스케리키아 콜라이 K4 영역 2 유전자, 및 또한 젤란 생합성과 관련된 것들을 포함하는 53개의 스핑고모나스 엘로데아 유전자에 대한 코돈 사용빈도 표를 제공한다. 당해 표는 K4 영역 2 생합성 유전자에서 선호하지 않는 코돈의 현저한 사용을 설명한다. 이들 코돈은 잔토모나스 캄페스트리스 또는 스핑고모나스 엘로데아 발현에 극도로 불리할 뿐 아니라 에스케리키아 콜라이내 발현도 불리하다. 에스케리키아 콜라이내에서 최적 발현을 위해, 유의적인 코돈 최적화가 필수적일 수 있음이 예측될 수 있다. 이들 코돈 사용빈도 표의 비교에 기초하여, 컨센수스 바람직한 코돈 사용빈도 표를 설계하여, 합성 콘드로이틴 생합성 유전자에 대해 표 3b에 나타낸다. 당해 코돈 사용빈도 패턴은 광범위한 잠재적인 대체 숙주에서 효과적인 해독을 제공하는 것으로 예측된다.
[표 3a]
Figure 112016019550472-pct00163
Figure 112012080180037-pct00005
나타낸 값들은, 코돈이 인코딩하는 주어진 아미노산을 규정하는 전체 코돈의, 각각의 코돈에 대한 퍼센트로서 발생을 반영한다. 코돈 사용빈도는 바실러스 서브틸리스 균주 168, 잔토모나스 캄페스트리스 피브이. 캄페스트리스 ATCC33913, 에스케리키아 콜라이 K-12 W3110의 게놈 및 20,972개의 코돈을 함유하는 스핑고모나스 엘로데아의 53개의 CDS로부터 계산하였다.
표 3b에서 하기 나타낸 코돈 사용빈도는 합성 유전자의 설계시 사용된 컨센수스 코돈 사용빈도 표 및 하기 작제된 바와 같은 합성 유전자 세트의 최종 코돈 사용빈도이다. 합성 유전자에서 실제 사용빈도는 DNA 및 mRNA 2차 구조, 제한 부위의 포함 및 배제, 및 전체 GC 함량과 같은 설계 고려사항을 반영한다.
[표 3b]
Figure 112012080180037-pct00006
2 값은 합성된 것으로서 합성 유전자 세트내 코돈의 총 수이다.
합성 유전자 세트를 3개의 분절, kpsFEDUCS("FS 분절"), kpsMTkfoABCFG("MG 분절") 및 kfoDIEH("DH 분절")로서 작제하였다. 도 6은 이들 3개의 합성 분절의 구조를 도해로 나타낸다. 도 6에 나타낸 유일한 제한 부위를 전략적 위치에 혼입하여 합성 단편이 플라스미드 발현 벡터내로 삽입될 수 있는 하나 이상의 오페론으로 조립되도록 하였다. 초기 전략은 유전자를 발현 실험용 단일 오페론으로서 조립하기 위한 것이었다. 다른 제한 부위는 또한 어떠한 제공된 유전자(들)에 대해서도 비-극성 결실의 작제를 허용하는 위치에서 합성 서열 전체에 전략적으로 위치하였다. 이는 K4 캡슐 클러스터에 의해 인코딩된 단백질의 기능 뿐만 아니라 플라스미드 서열의 다른 변형의 유전적 분석도 용이하게 할 수 있다. 컨센수스 강력한 리보소옴 결합 부위(AGGAGGttaataaATG, 서열 번호 46)를 kpsC, kpsT, kfoE, 및 kfoH를 제외하고는 모두의 합성 유전자 대부분에 대해 사용하였다. 에스케리키아 콜라이 K4 U1-41 서열에서, 이들 유전자의 해독 개시 부위를 바로 상부의 유전자의 해독 정지에 커플링하며 그 결과 리보소옴 결합 부위는 이들 상부 유전자의 코딩 영역과 중첩된다.
위에 정의한 것으로서 FS, MG 및 DH 분절을 포함하는 합성 서열은 상업적 판매회사, DNA2.0(미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재)에 의해 3개의 별도의 단편으로 합성하였다. 3개의 합성 분절의 뉴클레오타이드 서열을 FS 분절(서열 번호 47), MG 분절(서열 번호 48) 및 DH 분절(서열 번호 49)로서 나열한다.
실시예 3
대체 숙주 균주의 작제
K4 생합성 유전자의 발현을 위해 선택한 초기 대체 숙주는 에스케리키아 콜라이 K-12("K-12"), 에스케리키아 콜라이. 비("EcB"), 스핀고모나스 엘로데아("Sph"), 및 잔토모나스 캄페스트리스 피브이. 캄페스트리스("Xcc")를 포함하였다. K-12 균주 W3110 및 MG1655를 예일대의 콜리 유전 스톡 센터(Coli 유전자tic Stock Center)로부터 입수하였다. Sph 균주 ATCC 31461을 ATCC로부터 입수하였다. Xcc 균주 NRRL B-1459(ATCC 13951)를 미국 일리노이주 페오리아 소재의 ARS 컬쳐 컬렉션(NCUAR)으로부터 입수하였다. 에스케리키아 콜라이 B(ATCC 11303)를 ATCC로부터 입수하였다.
일반적으로, 대체 숙주는 K4 유전자의 도입을 위해 2가지 방식으로 제조하였다. 이동하는(mobilizing) 플라스미드 pRK2013을 함유하는 에스케리키아 콜라이와 3-부모 교차(tri-parental cross)하는 에스케리키아 콜라이의 실험실 클로닝 균주로부터의 접합 전달에 의해 특정의 대체 숙주로 유전자/플라스미드를 전달할 수 있는 것이 유리할 수 있다. 접합 환경 중에서 대체 숙주의 피전달접합균주(transconjugant)를 선택하기 위하여, 대체 숙주의 항생제-내성 유도체(전형적으로 스트렙토마이신 내성)가 요구된다. 대안적으로, 에스케리키아 콜라이 균주 S17-1(참조: Simon et al., BioTechnology 1983;1:784-791)을 사용할 수 있다. 당해 균주는 플라스미드 RP4의 염색체 통합된 형태를 가지며 적절한 플라스미드를 새로운 숙주로 직접 이동시킬 것이다. 그러나, 당해 균주는 스트렙토마이신 내성이므로, 스트렙토마이신은 접합완료체(exconjugant) 중에서 당해 균주에 대해 선택하는데 사용될 수 없다.
Sph, Xcc, 및 K-12에서 유전자 또는 유전자 클러스터 결실의 생성은 2-단계, "팝-인/팝-아웃" 상동성-구동된(driven) 방법을 사용하여 수행하였다(참조: 도 7a). 제 1 단계에서, 목적하는 결실 구조의 클로닝된 버젼(결실을 플랭킹하는 상동성 영역)을 함유하는 플라스미드를 플랭킹 영역 중 하나에서의 재조합(및 벡터 상의 마커에 대한 선택)에 의해 염색체(팝-인)내로 통합시켜 상동성 플랭킹 영역의 중복을 생성하였다. 제2 단계에서, 재조합이 반대쪽 플랭킹 영역내에서 발생하여 클로닝 벡터(및 마커)와 표적화된 염색체 영역을 제거하지만[팝핑-아웃(popping-out); "분해하는"], 설계된 결실은 남겼다. 이러한 균주는 마커 선택의 부재하에서의 다-세대 성장에 이은, 마커 및 목적하는 표현형(콜로니 형태학 및/또는 PCR에 의해 측정됨)의 손실에 대한 스크리닝에 의해 수득하였다. 에스케리키아 콜라이 외의 그람-음성 유기체의 경우, 목적하는 결실은 표적(비-에스케리키아 콜라이) 숙주 균주로 접합에 의해 이전할 수 있지만, 이것 내에서 복제할 수 없는 "자살(suicide)" 벡터내에서 전형적으로 창조된다. 본 발명의 목적을 위해, 본 발명자들은 pCM184(참조: 도 7b; Marx and Lidstrom, BioTechniques 2002;33(5):1062-1067)를 변형시킴으로써 "자살" 벡터를 생성하였다. 카나마이신-내성 유전자 및 플랭킹 loxP 부위들은 NotI 및 SacII로 분해하고, 말단을 T4 DNA 폴리머라제로 폴리싱(polishing)하여 연결시킴으로써 제거하였다. 도 7b에 나타낸 바와 같이, 수득되는 플라스미드, pCX027(서열 번호 141)은 통합체(integrant)(Sph 또는 Xcc내) 및 거대한 다중-클로닝 부위의 선택을 위한 테트라사이클린-내성을 함유하였다. 에스케리키아 콜라이내에서 결실을 생성시키기 위해, 플라스미드 pMAK705[참조: Hamilton et al., J. Bacteriol. 1989;171 (9):4617-4622]를 사용하였다. 당해 플라스미드는 온도-민감성 pSC101 레플리콘을 함유함으로써, 제1 단계 통합의 생성 및 제2 ("분해") 단계에서 플라스미드 서열의 손실이 고온에서 용이하게 되었다. "세포외 다당류(EPS) 마이너스" 돌연변이체의 유전자 구조는 PCR 및 서던 블롯 분석으로 확인하였다.
결실 작제물을 생성하기 위한 시도는 위에서 기술한 모든 표적에 대해 동일하였다. 상동성의 상부 및 하부 영역은 적절한 게놈 DNA를 주형으로 사용하는 PCR에 의해 유래되었다. 제한 부위를 PCR 프라이머내로 설계함으로써, 수득되는 DNA 단편이 목적하는 플라스미드내로 클로닝될 수 있도록 하거나, 하기 기술된 Xcc 검D 유전자(gumD gene)의 경우, 게놈내에 천연적으로 존재하는 제한 부위를 사용하였다. 결실(및 클로닝에 사용된 제한 부위)를 설계함으로써 인프레임 융합체를 표적 유전자(들)의 N-말단 및 C-말단 코딩 영역의 짧은 영역들 사이에 생성시켰다. 실제로, 표적화된 코딩 영역을 제한 효소 인식 서열로 대체하였다. 상부 단편과 하부 단편 사이의 가공된 제한 부위 서열은 2 내지 3개의 비-천연 코돈을 융합된 코딩 영역에 추가하였다. 당해 과정은 하부 유전자의 발현시 아주 적은 극성 효과/비 극성 효과의 예측과 함께 잘-정의된 돌연변이를 생성하였다.
에스케리키아 콜라이 K-12
콜란산(M 항원)은 많은 장 박테리아에 의해 생산된 세포외 다당류이며(참조: Grant, W.D., et al., J. Bacteriol.1969;100:1187-1193), 보다 많은 생산이 전형적으로 저 성장 온도에서 발견되었다(참조: Stout, V., J. Bacteriol. 1996;178:4273-4280). 콜란산 생합성에 있어 결함이 있는 에스케리키아 콜라이 K-12 균주의 생성은 당해 실시예에 기술되어 있다. 이러한 균주는, 이들이 30℃ 이하에서 수행할 수 있는 재조합 콘드로이틴의 생산을 위해 추가로 가공되는 경우, 방해하거나 오염되는 콜란산을 생산하지 않는다. 플라스미드 pMAK705(참조: Hamilton, C.M., et al., J. Bacteriol. 1989;171:4617-4622)를 사용하여 염색체 콜란산 생합성 유전자 클러스터내에 정밀한 결실을 생성하였다. 당해 플라스미드는 온도 민감성 레플리콘(replicon)을 함유하며 고온에서 염색체외 상태로 존재할 수 없다. 일반적으로, 표적 유전자자리에서 정밀한 돌연변이를 생성하기 위한 단계는 "팝-인/팝-아웃" 메카니즘으로부터 생성되며 문헌[Hamilton et al.(상기 참조)]에 기술되어 있다. 설계된 돌연변이를 함유하는 플라스미드 클론은 통상적으로 표적 유전자자리에서 상동성 재조합을 통해, 허용되지 않는 온도에서 형질전환체의 성장 및 플라스미드-코딩된 항생제(클로람페니콜; Cm) 내성에 대한 선택에 의해 염색체 내로 구동된다("팝-인"). 클로람페니콜의 부재하에서 이들 구성요소의 후속적인 다-세대 성장은, 플라스미드가 염색체로부터 재조합되어 세포 분열 동안 세포로부터 손실되어 원래의 야생형 구조 또는 돌연변이체 구조를 남긴 세포의 소-집단을 생성한다. 이들 "팝-아웃"은 Cm 민감성으로 확인된다. 목적하는 돌연변이체 구조를 갖는 균주를 이후에 표현형(가능하게는) 및 PCR 또는 서던 블롯팅으로 확인한다.
에스케리키아 콜라이 K-12에서 콜란산 생합성 오페론은 약 24kb를 포함하는 19 또는 20개의 연속된 유전자로 이루어진다(참조: Stevenson, G., et al., J. Bacteriol. 1996;178:4885-4893). 20번째 유전자, wcaM은 오페론/전사 단위의 일부인 것으로 여겨지지만 콜란산 생산을 위해 요구되지 않는다. 여기에 포함된 것은 제1 당을 콜란산 생합성 동안 지질 담체 위로 로딩하는데 관여하는 글리코실트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 wcaJ 유전자이다. 당해 실시예는 전체 20-유전자 오페론 또는 wcaJ 유전자만의 결실을 함유하는 에스케리키아 콜라이 K-12 균주의 생성을 기술한다. 에스케리키아 콜라이 K-12 균주 W3110의 게놈의 서열은 GenBank AP009048로서 발표되어 있다(참조: Blattner, F.R., et al., Science 1997;277:1453-1462).
콜란산 오페론의 결실: PCR 프라이머를 W3110 콜란산 오페론의 제1 유전자(wza) 상부의 대략 950 bp 상부 및 마지막 유전자(wcaM) 하부의 대략 950 bp를 증폭시키기 위해 설계하였다. 이들 단편은 염색체내에서 목적하는 재조합 부위에 대해 상동성을 제공하였다. PCR 프라이머는 후속적인 클로닝에 사용될 증폭된 PCR 생성물의 말단에 비-천연 제한 부위를 생성하도록 설계하였다. 상부 영역을 프라이머 CAX129(밑줄친 HindIII 부위) 및 CAX128(밑줄친 AscI 부위)를 사용하여 증폭시켰다. 하부 영역을 프라이머 CAX130(밑줄친 AscI 부위) 및 CAX131(밑줄친 XbaI 부위)를 사용하여 증폭시켰다.
CAX128 GGCGCGCCAGCGTCCTGCTGTTTGATGACG (서열 번호 50)
CAX129 AAGCTTGCCAGGAGATTGACGCCAGC (서열 번호 51)
CAX130 GGCGCGCCGGAATCCTCAGTTGGACCCGC (서열 번호 52)
CAX131 TCTAGAACTTTACCCTCACGGTCCAGCG (서열 번호 53)
PCR은 Pfu 폴리머라제(제조원: Stratagene)를 사용하여 95℃에서 변성, 57℃에서 어닐링 및 72℃에서 연장(각 단계에서 20초)의 30 주기 동안 수행하였다. 주형은 100 ng의 에스케리키아 콜라이 K-12 W3110 게놈 DNA로 이루어져 있다. PCR 단편을 pCR-Blunt II-TOPO(제조원: Invitrogen)내로 클로닝하고 에스케리키아 콜라이 TOP10(제조원: Invitrogen)내로 형질전환하고, 선택된 클로닝된 삽입체의 서열을 발표된 데이타와 일치하는지 확인하였다. 상부 클론을 HindIII 및 AscI으로 분해하고, 하부 클론을 XbaI 및 AscI으로 분해하였다. 목적하는 단편을 겔-정제(유전자 Clean Turbo, 제조원: Q-BIO유전자)하고 HindIII 및 XbaI으로 분해한 후 안트악틱 포스파타제(Antarctic phosphatase)(제조원: New England Biolabs)로 처리한 pMAK705와 연결시켰다. 에스케리키아 콜라이 DH5α의 Cm-내성(LB Cm 34㎍/mL, 30℃) 형질전환체(제조원: Invitrogen)를 플라스미드 구조에 대해 분석하고, 목적하는 구조를 갖는 것을 pMAK-CL로 명명하였다. 당해 플라스미드(및 이로부터 궁극적으로 유래된 염색체 결실)에서, AscI 부위에서 상부 및 하부 단편의 통합은 wza 유전자의 5' 말단 및 wcaM 유전자의 3' 말단으로 이루어진 작은 345bp 개방 판독 프레임을 생성하였다. 이러한 특징은 wcaM 하부의 더 먼 임의의 유전자의 콜란산 오페론 프로모터로부터의 잠재적인 발현의 파괴를 최소화하기 위해 설계되었다.
플라스미드 pMAK-CL을 에스케리키아 콜라이 W3110내로 30℃(허용되는 온도)에서 17㎍/mL에서 Cm을 함유하는 LB(참조: Maniatis, 1989) 아가 플레이트(agar plate) 상에 플레이팅함으로써 Cm 내성에 대한 선택과 함께 전기영동으로 형질전환시켰다. 몇가지 형질전환 콜로니를 M9(참조: Maniatis, 1989) Cm 17㎍/mL 아가 플레이트에 스트리킹(streaking)하고 43℃(허용되지 않는 온도)에서 항온처리하였다. 2일 후, 다수 콜로니(추정상의 통합체)가 존재하였으며, 이들을 M9 Cm에 43℃에서 확인을 위해 재-스트리킹하였다. 2개의 추정상의 통합체를 약 25 세대 동안 LB 배지 속에서 37℃로 성장시키고, 희석물을 제조하여 실온(22 내지 24℃)에서 성장시키기 위해 LB 플레이트에 스프레딩하였다. 3일 후, 콜로니를, 하나는 30℃에서 성장을 위해 Cm 17㎍/mL를 함유하는 2개의 LB 아가 플레이트로 이전시켰다. Cm-민감성 분리체는 2개의 원래의 구성요소의 유도체 중에 62% 및 94%의 빈도로 존재하였다. 이들은 아마도 "팝-아웃" 및 pMAK-CL 플라스미드의 손실로부터 생성되었다. "콜로니 PCR"을 사용하여 이들 균주내 콜란산 오페론에서 구조를 평가하였다. 소량의 콜로니를 PCR과 양립할 수 있는 튜브 내의 10μL의 멸균 탈-이온수 속에 현탁시켰다. 여기에 20μL의 "태크 마스터(Taq Master)(에펜도르프) 성분의 1.5배 농축된 혼합물을 가함으로써 반응물 중 최종 농도/양이 1X 태크 폴리머라제 완충액, 1X "태크 마스터" 시약, 0.33 mM 각각의 dNTP, 0.4μM 각각의 프라이머, 및 0.5 단위의 태크 폴리머라제가 되도록 하였다. PCR을 95℃에서 8분으로 개시하여, 95℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안의 어닐링, 및 68℃에서 3분의 연장의 35 주기로 지속하고, 68℃에서 7분 동안 연장시켜 종료하였다. 초기 특성화를 상부 상동성 영역내 전방 프라이머(CAX132) 및 하부 상동성 영역내 역방 프라이머(CAX135)를 사용하여 수행하였다.
CAX132 CCGAATTGTTATCTTGCCTGC (서열 번호 54)
CAX135 GGTAGCATCTCTTTGGGTATCG (서열 번호 55)
바람직한 오페론 결실을 함유하는 균주의 PCR은 1000 bp 단편을 생산하는 것으로 예측되었으며, 이는 분석된 23개 "팝-아웃" 균주 중 9개에서 발견되었다. 바람직하지 않은 재배열이 이들 균주에서 발생하지 않았는지를 보증하기 위해, 상동체의 영역 외부의 프라이머를 이용한 "콜로니 PCR"을 사용하였다: CAX162(전방) 및 CAX163(역방).
CAX162 GAACAGCGGTTGAGTCAGGG (서열 번호 56)
CAX163 GGCAGAAAGCACATAGCGACC (서열 번호 57)
이들 외부 프라이머는 바람직한 구조의 결실시 2065 bp의 PCR 생성물을 제공하였으며, 9개 균주 중 4개는 당해 PCR 생성물을 생성하였으며; 이들 중 하나는 MSC188로 지정되었다. 균주 MSC188내 결실의 구조의 추가 확인은 서던 블롯팅으로 달성하였다. "DIG"-표지된 프로브(제조원: Roche)를 프라이머 CAX128 및 CAX129(1000 bp)로 pMAK-CL을 주형으로서 사용하여 생성시켰다. 야생형 에스케리키아 콜라이 W3110 및 MSC188로부터의 염색체 DNA를 제한 효소 KpnI, PstI 및 BglII로 분해하고, 분해물을 겔 전기영동 및 블롯팅에 적용시켰다. 프로빙(probing)은 MSC188 및 W3110 각각에서 예측된 밴드 패턴을 나타내었다: KpnI, 5921 bp 대 9431 bp; PstI, 3902 bp 대 12893 bp, 및 BglII, 9361 bp 대 6201 bp.
wca J의 결실: 에스케리키아 콜라이 K-12 W3110내에서 wcaJ 유전자의 결실을 위한 전략은 전체 콜란산 생합성 오페론의 결실에 대해 위에 기술된 바에 따랐다. PCR 프라이머를 설계하여 W3110 콜란산 오페론의 wcaJ 유전자 상부 및 하부의 대략 500bp를 증폭시켰다. 상부 영역을 프라이머 CAX126(밑줄친 HindIII 부위) 및 CAX125(밑줄친 PacI 부위)로 증폭시켰다. 하부 영역은 프라이머 CAX124(밑줄친 PacI 부위) 및 CAX127(밑줄친 XbaI 부위)로 증폭시켰다.
CAX124 TTAATTAACAAAGGTTTCGTTAACAAAGCGG (서열 번호 58)
CAX125 TTAATTAAATTGGTTTTCGCTCGCTCGC (서열 번호 59)
CAX126 AAGCTTGGAAGACGCCATCTATGGTGG (서열 번호 60)
CAX127 TCTAGAGAAGCCCGCCAGCACCGC (서열 번호 61)
상부 및 하부 PCR 생성물의 제한 단편을 pMAK705내로 클로닝하여 pMAK-wca를 수득하였다. 당해 플라스미드 및 이로부터 궁극적으로 유래된 염색체 결실에 있어서, PacI 부위에서 상부 및 하부 단편의 통합은 wcaJ 유전자의 5' 및 3' 말단으로 이루어진 작은 75bp 개방 판독 프레임을 생성하였다. 당해 특징은 이들이 콘드로이틴의 생산에 유리한 상황에서 모든 다른 오페론 유전자의 방해되지 않은 발현을 허용하도록 설계하였다. 콜로니 PCR에 의한 에스케리키아 콜라이 W3110의 추정적 wcaJ 결실 유도체의 초기 특성화는 프라이머 CAX126 및 CAX127을 사용하여 수행하였으며, 23개의 유망한 "팝-아웃"중 11개는 바람직한 시그날을 제공하였다. 외부 프라이머 CAX160(전방) 및 CAX161(후방)을 사용하여 추정적 wcaJ 결실을 확인하였고, 시험한 4개 균주 중 3개는 예측된 생성물(1188 bp)을 함유하였다. 바람직한 DNA 구조를 갖는 하나의 균주를 MSC175로 지정하였다.
CAX160 CCGTTGATGTGGTGACTGCC (서열 번호 62)
CAX161 AAACAGCAGCGTTCTCACCG (서열 번호 63)
서던 블롯 확인을 위해, "DIG"-표지된 프로브를 프라이머 CAX124 및 CAX127(514 bp)로 pMAK-wca를 주형으로서 사용하여 생성시켰다. 야생형 에스케리키아 콜라이 W3110 및 MSC175로부터의 염색체 DNA를 제한 효소 PacI, DraIII 및 NdeI로 분해하고, 분해물을 겔 전기영동 및 블롯팅에 적용시켰다. 프로빙은 MSC175 및 W3110 각각에서 예측된 밴드 패턴을 나타내었다: PacI, 8456 bp 대 >28000 bp; DraIII, 4502 bp 대 5819 bp, 및 NdeI, 8512 bp 대 9829 bp.
잔토모나스 캄페스트리스
잔토모나스 캄페스트리스 피브이. 캄페스트리스(Xcc)는 상업적으로 사용되어 다양한 산업 및 식품 적용을 위한 세포외 탄수화물 중합체 크산탄 검을 생산한다(참조: Baird, J., et al., BioTechnology 1983;1:778-783). 당해 균주 및 콘드로이틴의 생산 방법을 사용하기 위해서는, 크산탄 검을 생합성할 수 없는 Xcc 균주가 요구된다. 에스케리키아 콜라이용으로 사용된(상기) 것과 유사한 전략을 사용하여 NRRL B-1459로서 또한 공지된(참조: Capage, M.R. et al., World Patent WO87/05938; Katzen, F., et al., J. Bacteriol. 1998;180(7):1607-1617), 잔토모나스 캄페스트리스 피브이. 캄페스트리스 균주 ATCC13951 내에서 전체 크산탄 검 생합성 오페론 또는 제1 글리코실트랜스퍼라제용 유전자, gumD 만을 결실시켰다. 우선, 30℃에서 영양 아가 속에서 100㎍/mL 스트렙토마이신 설페이트에 대해 내성인 자발적으로-생성된 유도체를 수득하고 MSC116으로 명명하였다. PCR 프라이머를 균주 NRRL B-1459(GenBank 수탁번호 #U22511)의 크산탄 검 생합성 클러스터의 서열 및, 필요에 따라 잔토모나스 캄페스트리스 피브이. 캄페스트리스 ATCC33913(GenBank 수탁번호 AE008922)에 대한 게놈 서열에 대해 설계하였다.
gum D 의 결실: gumD 유전자의 결실을 위한 전략은 코딩 영역의 대략 1650 bp 상부(5') 및 1000 bp 하부(3')를 이용한다. PCR 프라이머를 이들 제한 부위의 외부에 설계하고, 이들을 gumD 코딩 서열의 바로 내부의 PCR 프라이머 표적화 영역과 쌍을 지어 상동성의 상부 및 하부 영역을 생성하였다. 대략 1800 bp의 상부 상동성을 증폭시키기 위해, 프라이머 CAX114 및 CAX116을 사용하였다. 대략 1100 bp의 하부 상동성을 증폭시키기 위해, 프라이머 CAX115 및 CAX117을 사용하였다. gumD 코딩 영역의 말단내 2개의 중앙 프라이머를 SbfI 제한 부위(하기 밑줄침)를 사용하여 정정하였다.
CAX114 CCTGCAGGGTCGAACACTCGCAAGACCAGG (서열 번호 64)
CAX115 CCTGCAGGTATCCGCATCATCGTGCTGACG (서열 번호 65)
CAX116 CCTTGGTGATGGTGTGGCG (서열 번호 66)
CAX117 GCCCATCCACGACTCGAACG (서열 번호 67)
PCR을 Pfu Ultra II 폴리머라제(제조원: Stratagene)를 사용하여 95℃에서 변성(20초), 62℃에서 어닐링(20초) 및 72℃에서 연장(30초)의 30 주기 동안 수행하였다. 주형은 100 ng의 잔토모나스 캄페스트리스 피브이. 캄페스트리스(균주 ATCC13951; "Xcc") 게놈 DNA로 이루어졌다. PCR 단편을 pCR-Blunt II-TOPO(제조원: Invitrogen)내로 클로닝하고 에스케리키아 콜라이 TOP10(제조원: Invitrogen)내로 클로닝시켰다. 상부 상동성 클론의 관련 서열은 PCR 생성물의 서열과 일치하였으나, 이는 당해 영역에 대한 발표된 Xcc 서열(프라이머는 배제됨)로부터 2개의 염기 쌍에 의해 상이하다. 발표된 서열은 소수의 부정확한 지정(assignment)을 함유하는 것으로 여겨진다. 하부 상동성 클론의 관련 서열은 이의 PCR 생성물의 서열 및 당해 영역에 대한 발표된 Xcc 서열(프라이머는 배제됨)의 것과 일치하였다.
잔토모나스에서 "팝-인/팝-아웃" 메카니즘을 사용한 특이적인 유전자 결실을 생성하기 위한 전략은 플라스미드 pCM184의 유도체를 기초로 한다(참조: Marx, C.J., and Lidstrom, M.E., BioTechniques 33(5):1062-1067, 2002). 플라스미드 pCM184는, 에스케리키아 콜라이내에서 플라스미드의 복제를 허용하지만, 잔토모나스(또는 다른 비-장내 박테리아)에서는 허용하지 않는 ColE1 레플리콘(replicon), 그람 음성 박테리아 중에서 접합성 전달을 위한 oriT 영역, 암피실린 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자, 및 loxP 서열에 의해 플랭킹된 카나마이신(Kanr)에 대한 내성 유전자로 이루어졌다. 당해 플라스미드를 설계하여 비-에스케리키아 콜라이 균주에서 표지되지 않은(나머지 항생제 내성 유전자가 없는) 결실을 생성하였지만, 기술된 과정은 결실 부위에 작은 loxP 서열을 남겼다. 그러나, 본 발명에서 생성된 균주의 경우 loxP와 같은 불필요한 서열을 함유하지 않는 것이 바람직하였다. 따라서, pCM184를 변형시켜 loxP 부위 및 개재된 카나마이신 내성 유전자를 제거하였다. 이는 위에서 기술한 "팝-인/팝-아웃" 메카니즘에 있어서의 변이에 의해 잔토모나스내에서 바람직한 표지되지 않은 결실의 생성을 허용하였다.
약 1.8㎍의 플라스미드 pCM184를 NotI 및 SacII 제한 효소(loxP/Kanr/loxP 영역을 제거하기 위해 선택하지만 추가의 사용을 위해 제한 부위 대부분은 남긴다)로 분해하고, 완료된 반응물을 75℃에서 15분 동안 가열하여 효소를 불활성화시켰다. 이후에, 시료(20μL)를 T4 DNA 폴리머라제(1.8 U, 제조원: New England Biolabs) 및 100μM의 각각의 dNTP로 15분 동안 12℃에서 처리하여 NotI 분해로부터 일본쇄 오버행(overhang)을 채우고(fill-in) SacII 분해로부터의 오버행을 역으로 잘라내었다(즉, 평활 말단을 생성). 반응은 EDTA를 10 mM까지 첨가하고 75℃에서 20분 동안 가열하여 종결하였다. 약 170㎍의 처리된 플라스미드를 400 U T4 DNA 리가제(제조원: New England Biolabs)와 10μL 용적 속에서 16℃로 4시간 동안 반응시켰다. 연결 반응물을 2.5 U SbfI로 90분 동안 후속적으로 처리하여 원치않는 DNA 구조를 분해하였다(예를 들면, 재형성된 pCM184). 0.5μL 용적의 당해 반응물을 사용하여 에스케리키아 콜라이 TOP10(제조원: Invitrogen)을 형질전환시키고, LB Tc5에 플레이팅하여 37℃에서 밤새 항온처리한 후 다수의 콜로니를 생성하였다. 선택된 콜로니로부터의 세포내에 함유된 플라스미드는 제한 효소 분석 및 DNA 서열 분석에 의해 바람직한 구조인 것으로 나타났다: 당해 플라스미드는 pCX027(서열 번호 141)로 명명되었으며 도 7b에 도해되어 있다.
gumD 상부 및 하부 영역(상기)에 대한 클로닝된 PCR 생성물을 함유하는 플라스미드(각각 약 2㎍)를 10 U SbfI로 2시간 동안 37℃에서 분해한 후, 10 U EcoRI(효소-특이적인 완충액)으로 동일한 조건하에서 분해하였다. 열처리(70℃에서 20분 동안)한 후, 분해물을 아가로즈 겔 전기영동에 적용시키고, 바람직한 단편(약 1.6 kb의 상부 단편; 약 1.1 kb의 하부 단편)을 QIAGEN 미니-용출 키트(Mini-Elute kit)로 정제하였다. 플라스미드 pCX027(약 3.5㎍)을 20 U EcoRI을 사용하여 50μL 반응물 속에서 2.5 시간 동안 37℃에서 분해하고, 약 18U 안트악틱 포스파타제(제조원: New England Biolabs)으로 60μL 반응물 속에서 15분 동안 37℃에서 처리한 후, 70℃에서 20분 동안 가열하였다. 3-방식 연결(ligation)을 각각 약 100ng의 처리된 pCX027 및 정제된 gumD 상부 및 하부 단편으로 10pL 반응물 속에서 16℃에서 약 20시간 동안 수행하였다. 당해 반응물의 1/2을 에스케리키아 콜라이 DH5α(제조원: Stratagene)내로 형질전환한 후 LB Ap100 또는 LB Tc5에 37℃에서 플레이팅하였다. 콜로니 PCR을 수행하여(위에서 기술한 바와 같이) 각각 상부 및 하부 서열에서 영역에 대해 상동성인 프라이머 CAX122 및 CAX119를 사용하여 바람직한 구조를 가진 클론을 확인하였다.
CAX119 GACCAATGACACGATGATCG (서열 번호 68)
CAX122 GCATCCGCTACAACATGCTC (서열 번호 69)
예상한 크기(1169bp)의 PCR 생성물을 수개의 콜로니에서 검출하고, 목적하는 구조를 제한 분석으로 확인하였다. 쌍을 이룬 상동성 영역의 배향(gum 유전자 판독 프레임으로서 제공됨)이 벡터 Tetr 유전자에 대한 배향과 동일하거나 반대인 플라스미드를 각각 pCX030 및 pCX031로 명명하였다.
잔토모나스 캄페스트리스 피브이. 캄페스트리스["Xcc"; ARS 컬쳐 컬렉션(NCUAR), 미국 일리노이아주 페오리아 소재; 또한 ATCC13951로서 공지됨]를 영양 브로쓰(NB, 제조원: Difco) 속에서 밤새 30℃에서 성장시키고(달리 나타내지 않는 한 30℃에서 Xcc 균주 모두 성장), 새로운 NB 속에서 1:5로 희석시키고, 100μL의 분취량을 스트렙토마이신(str)을 100㎍/mL로 함유하는 영양 아가(NA, 제조원: Difco) 플레이트에 스프래딩(spreading)시킨 후 30℃에서 항온처리하였다. 수일 후, 콜로니가 약 1/107개의 원래-플레이팅된 세포의 빈도로 검출되었다. 수개의 자발적으로-발생된 스트렙토마이신-내성 Xcc 균주를 NA str50 플레이트에 스트리킹하여 정제하고, 이러한 분리체 하나를 MSC116로 명명하였다.
플라스미드 pCX030 또는 pCX031을 전기영동에 의해 Xcc 균주 MSC116으로 전달하였다(참조: Oshiro et al., J. Microbiol. Method 2006;65:171-179). 테트라사이클린-내성 콜로니(TcR)를 pCX030(4.1 x 104/㎍) 및 pCX031(3.1 x 104/㎍) 각각으로부터 수득하였다. 게놈 DNA를 pCX031 형질전환으로부터 유래된 분리된 TcR 균주로부터 제조하고 PCR에 의해 pCX031 통합 부위에 대해 평가하였다. 프라이머 쌍을 선택하여 하부 영역에 대한 pCX031내에서 사용된 상부 영역의 외부의 게놈 서열 및 상부 영역에 대한 pCX031에서 사용된 하부 영역의 외부의 서열의 연결을 측정하였다. 구체적으로, 프라이머 CAX116(상부 영역에 대한 "외부 프라이머") 및 CAX119(하부 상동성 영역; 상기 참조)를 사용하여 상부 연결을 시험하고 CAX117("하부 여역에 대한 '외부 프라이머"; 상기 참조) 및 CAX122(상부 상동성 영역내; 상기 참조)를 사용하여 하부 연결을 시험하였다. PCR을 Go Taq DNA 폴리머라제(제조원: Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 0.5μM의 각각의 프라이머, 250μM의 각각의 dNTP, 1000 ng의 DNA 주형, 및 0.5 U 효소를 사용하여 수행하였다. 반응 조건은 94℃에서 4분 동안의 초기 변성, 94℃에서, 30초 동안 15초 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링, 및 72℃에서 4분 동안 연장 및 2분 동안의 최종 연장의 30 주기를 포함한다. "팝-인" 분리체를 pCX031의 상부 및 하부 통합 둘다에 대해 확인하였다. 2개의 분리된 "팝-인" 균주를 MSC221 및 MSC222로 지정하였다. 이들 균주를 LBLS(10 g/L 박토 펩톤, 5 g/L NaCl, 5 g/L 효모 추출물, 항생제 포함하지 않음) 속에서 30℃에서 성장시키기 위해 접종한 후, 동일한 배지내로 48시간 간격에서 1:1000 희석을 사용하여 3회 서브-배양(sub-culturing)하였다. 수득되는 배양물을 희석시키고, 분취량을 NA Str50 플레이트에 스프레딩하였다. 수득되는 콜로니를 NA 및 NA Tc5 플레이트에 전달하였다. TcS 균주는 균주 둘다로부터 2%의 빈도로 발견되었다. 상기 기술된 바와 같이, 선택된 TcS 균주에 대해 프라이머 쌍(CAX116와 CAX119 및 CAX117와 CAX122)를 사용한 콜로니 PCR 분석은, 시험된 모든 균주가 gumD 결실과 일치하였음을 입증하였다. MSC221 및 MSC222로부터의 이들 분리된 "팝-아웃" 균주를 각각 MSC225 및 MSC226으로 지정하였다. 아가 플레이트 상의 MSC225 및 MSC226의 콜로니는 MSC116 모 균주의 콜로니와 비교하여 명확하게 비점액성이었다.
크산탄 검 생합성 유전자 클러스터의 결실: gumB 내지 gumM 생합성 클러스터의 결실은 주로 gumD 유전자의 결실에 대해 상세히 설명한 동일한 단계에 따른다. gumB의 상부 및 gumM의 하부의 상동성의 영역을 PCR에 의해 프라이머 CAX136 x CAX137(1434 bp) 및 CAX138 x CAX139(1420 bp) 각각을 사용하여 생성시킴으로써, pCX027 내로 클로닝하기 위한 BglII 제한 부위 및 상부 단편과 하부 단편 사이의 융합을 위한 NotI 부위를 혼입시켰다. NotI 부위의 융합은 gumB의 5' 말단 및 gumM 코딩 서열의 3' 말단으로 이루어진 53 아미노산 폴리펩타이드에 대한 개방 판독 프레임을 생성시킬 것이다. 제한 부위는 밑줄쳐져 있다: CAX136 및 CAX139내 BglII; CAX137 및 CAX138내 NotI.
CAX136 AGATCTGGCGGTAACAGGGGATTGGC (서열 번호 70)
CAX137 GCGGCCGCCAAGACGGTATTCGGGCTGC (서열 번호 71)
CAX138 GCGGCCGCGATCTGCTGGTGTTCTTCCGC (서열 번호 72)
CAX139 AGATCTCCTACCGACCAGGCATTGGC (서열 번호 73)
PCR을 상부 및 하부 단편의 증폭을 위해 Pfu Ultra II 폴리머라제(제조원: Stratagene)를 사용하여 수행하였다. 반응 조건은 94℃에서 4분 동안의 초기 변성, 95℃에서 20초 변성, 57℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 30분 연장 및 72℃에서 5분 동안 최종 연장의 30 주기를 포함한다. 주형은 100 ng의 잔토모나스 캄페스트리스 피브이. 캄페스트리스(균주 ATCC13951; "Xcc") 게놈 DNA로 이루어졌다. PCR 단편을 pCR-Blunt II-TOPO(제조원: Invitrogen)내로 클로닝하고 에스케리키아 콜라이 TOP10(제조원: Invitrogen)내로 형질전환하였다. 상부 상동성 클론의 관련 서열은 PCR 생성물의 서열과 일치하나, 이러한 공유된 서열은 당해 영역(프라이머 배제됨)에 대한 Xcc 균주 ATCC33913의 발표된 서열과 14개 염기 쌍이 상이하다. 이들 서열 변이는 B-1459/ATCC13951과 ATCC33913 게놈 사이의 미묘한 차이를 반영하는 경향이 있다. 하부 상동성 클론의 관련 서열은 PCR 생성물의 서열과 일치하며 당해 서열은 당해 영역(프라이머는 배제됨)에 대해 발표된 Xcc ATCC33913 서열과 상이하지 않다. gumB의 상부 영역(상기) 및 gumM의 하부 영역(상기)에 대한 클로닝된 PCR 생성물을 함유하는 플라스미드(각각 약 1㎍)를 7.5 U NotI 및 7.5 U BglII을 사용하여 37℃에서 2시간 동안 분해하였다. 분해물을 아가로즈 겔 전기영동에 적용시키고 목적하는 단편(각각 약 1.4 kb)을 QIAGEN 미니-용출 키트로 정제하였다. 플라스미드 pCX027(약 1.0㎍)을 15U BglII를 사용하여 15μL의 반응물 속에서 37℃에서 2시간 동안 분해하고, 약 5U의 안트악틱 포스파타제(제조원: New England Biolabs)로 75μL의 반응물 속에서 15분 동안 37℃로 처리한 후 65℃에서 10분 동안 가열하였다. BglII 분해된 pCX027의 정제 후, 3-방식 연결을 20μL의 반응물 속에서 정제된 pCX027, gumB의 상부 단편, 및 gumM의 하부 단편을 이용하여 실온으로 3시간 동안 수행하였다. 반응 혼합물의 1/2을 에스케리키아 콜라이 TOP10(제조원: Invitrogen)내로 형질전환한 후 LB Ap100 또는 LB Tc5에 37℃에서 플레이팅하였다. 콜로니 PCR을 수행하여(위에서 기술한 바와 같음) CAX140(상부 상동성 영역내) 및 CAX145(하부 상동성 영역내)를 사용하여 바람직한 구조를 갖는 클론을 확인하였다.
CAX140 CCGAATTTCCGAGCCTGG (서열 번호 74)
CAX145 GCCCGCTCGCTTCGTCG (서열 번호 75)
플라스미드를 PCR 양성 클론으로부터 퀴아젠 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAGEN Qiaprep Spin Miniprep Kit)를 사용하여 제조하고 BglII, NdeI 또는 NcoI를 사용하여 분해함으로써 상부 및 하부 서열내 상동성 영역의 이의 배향을 포함하는 플라스미드의 구조를 확인하였다. 쌍을 이룬 상동성 영역의 배향이 벡터 Tetr 유전자에 대한 배향과 동일하거나 반대인 플라스미드를 각각 pKM001 및 pKM002로 지정하였다.
플라스미드 pKM001 또는 pKM002를 Xcc 균주 MSC116에 전기천공에 의해 전달하였다(참조: Oshiro et al., J. Microbiol. Method 2006;65:171-179). TcR 콜로니를 pKM001(5.3 x 103/㎍) 및 pKM00(5.0 x 103 /㎍)의 형질전환체 각각으로부터 수득하였다. 게놈 DNA를 pKM001 형질전환체로부터 유래된 분리된 TcR 균주로부터 제조하고 PCR에 의해 pKM001 통합의 부위에 대해 평가하였다. 프라이머 쌍을 선택하여 하부 영역에 대한 pKM001에 사용된 상부 영역 외부의 게놈 서열 및 상부 영역에 대해 pKM001에서 사용된 하부 영역 외부의 서열의 연결을 측정하였다. 구체적으로, 프라이머 prKM001(상부 영역에 대한 "외부 프라이머"; 하기 참조) 및 CAX145(하부 상동성 영역내; 상기 참조)를 사용하여 상부 연결 및 prKM002(하부 영역에 대한 "외부 프라이머"; 하기 참조)와 CAX142(상부 상동성 영역내; 하기 참조)를 사용하여 하부 연결을 시험하였다.
prKM001 ACGTGGATGCGGTCGTCGC (서열 번호 76)
prKM003 GGGGCTTGCGGGTCGGC (서열 번호 77)
CAX142 CGTATGCTGAGAATGACGACC (서열 번호 78)
PCR을 Go Taq DNA 폴리머라제(제조원: Promega)를 사용하여 0.5μM의 각각의 프라이머, 250μM의 각각의 dNTP, 600 내지 1000ng의 DNA 주형, 및 0.5 U 효소로 수행하였다. 반응 조건은 94℃에서 5분 동안의 초기 변성, 94℃에서 15초의 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃에서 4분 연장 및 2분 동안 최종 연장의 30 주기를 포함한다. "팝-인" 분리체를 pKM001의 상부 통합을 위해 확인하였다. 이들 분리된 균주를 MSC242, MSC247 및 MSC248로 지정하였다.
MSC242, MSC247 및 MSC248을 LBLS 배지 속에 30℃에서 성장을 위해 접종한 후, 동일한 배지내로 48시간 간격에서 1:1000 희석을 사용하여 3회 서브-배양하였다. 수득되는 배양물을 희석시키고, 분취량을 NA Str50 플레이트에 스프래딩시켰다. 수득되는 콜로니를 NA 및 NA Tc5 플레이트에 전달하였다. TcS 균주는 3개 균주로부터 1 내지 2%의 빈도로 관찰되었다. 선택된 TcS 균주에서 게놈 구조를 PCR에 의해 평가하여 상부 연결에 대해 prKM001과 CAX145 및 하부 연결에 대해 prKM003와 CAX142를 사용하여 gumB로부터 gumM까지의 크산탄 검 합성 유전자의 결실을 확인하였다(상기 참조). PCR을 헤르쿨라제 II 융합 DNA 폴리머라제(제조원: Stratagene)를 사용하여 0.25μM의 각각의 프라이머, 250μM의 각각의 dNTP, 500 내지 700 ng의 DNA 주형 및 0.5 U 효소로 수행하였다. 반응 조건은 98℃에서 4분 동안의 초기 변성, 98℃에서 20초의 변성, 60℃에서 20초 어닐링, 및 72℃에서 2분 연장 및 3분 동안의 최종 연장의 30주기를 포함하였다. 3개의 "팝-아웃" 균주(1개는 각각의 "팝-인" 균주로부터)는 크산탄 검 생합성 유전자 클러스터의 결실과 일치하는 PCR 생성물을 나타내었다. MSC242, MSC247 및 MSC248로부터의 이들 크산탄 검 생합성 유전자 결실 "팝-아웃" 균주를 각각 MSC255, MSC256 및 MSC257로 지정하였다. 아가 플레이트 상의 MSC255, MSC256, 및 MSC257의 콜로니는 MSC116 모 균주의 콜로니와 비교하여 명확하게 비-점액성이었다.
에스케리키아 콜라이 B
야생형 에스케리키아 콜라이 B의 유도체(ATCC11303)인 에스케리키아 콜라이 BL21(DE3)의 게놈이 불활성인 2 군 캡슐 유전자 클러스터를 함유하는 것으로 보고되었으며, 여기서 영역 1 및 3은 완전(및 기능성)하였지만, 영역 2는 파괴되어 비-기능성이었다(참조: Andreishcheva, E.N., and Vann, W.F., Gene 2006;384:113-119). 영역 2의 유전자가 중합체-특이적이지만 영역 1 및 3은 유전적이고 거의 특이적이 아님을 고려할 때, 에스케리키아 콜라이 B를 가공하여 플라스미드 상에 단지 K4 영역 2개 유전자를 제공함으로써 콘드로이틴을 합성하거나 염색체 내로 통합시킬 수 있다(하기 참조). 콘드로이틴 생산용 숙주로서 에스케리키아 콜라이 B의 유용성을 개선시키기 위해, 콜란 산의 생산을 상기 에스케리키아 콜라이 K-12에 대해 기술된 바와 같은 유전적 돌연변이로 제거하였다.
콜란산 오페론의 결실: 에스케리키아 콜라이 B 콜란산 오페론의 결실을 위한 공정은 위에서 기술한 K-12 균주에 대해 사용된 것을 따른다. 본 발명의 시점에, 에스케리키아 콜라이 B 게놈 서열은 공공 이용가능하지 않았다. 비록 K-12 및 B 균주가 밀접하게 관련되어 있지만, DNA 서열내 일부 차이가 예측된다. 따라서, 새로운 상부 및 하부 상동성 영역의 생성이 요구되었으며, 균주 K-12에 대해 사용된 기존의 프라이머를 사용하였다. 구체적으로, 프라이머 쌍 CAX128xCAX129 및 CAX130xCAX131 및 에스케리키아 콜라이 B 게놈 DNA 주형을 사용한 PCR을 사용하여 상부 및 하부 상동성 영역 각각을 생성하였다. 크기가 약 1kb인 생성물을 수득하고, 클로닝하며, 서열분석하였다. 비-프라이머 서열에서, 상부 상동성 영역(944 bp)은 K-12 상부 영역과 단지 2개 염기(전이) 만이 상이하며, 하부 상동성 영역(911 bp)은 30개 염기(24개의 전이, 6개의 변위)가 상이하다. 상부 및 하부 단편을 pMAK705내로 클로닝하여 pMAK-BCL을 생성하였다.
플라스미드 pMAK-BCL을 에스케리키아 콜라이 B내로 전기천공에 의해 도입하였다. LB 배지에 새로운 콜로니를 접종하고 밤새 37℃에서 격렬하게 진탕하면서 항온처리하였다. 새로운, 예비-가온된 LB의 용적을 밤샘 배양물에 접종하여 0.03의 초기 OD600 판독값(암순응측정기(BioPhotometer), 에펜도르프)를 수득하였다. 배양물을 OD600 ~0.8까지 성장시킨 후 빙상에서 30 내지 40분 동안 급냉시켰다. 세포를 원심분리(10분, 4000g)에 의해 수집하고, 세포를 원래의 용적의 빙-냉 탈이온수 속에서 재-현탁한 후 재-원심분리시켜 2회 세척하였다. 최종 원심분리로부터의 세포를 1/500th 용적의 빙-냉수 속에 현탁시켰다. pMAK-BCL(200 ng)을 50μL의 제조된 에스케리키아 콜라이 B 현탁액에 가하고 빙상에서 약 20분 동안 항온처리하였다. 전기천공을 Gene Pulser Xcell(제조원: BioRad)을 사용하여 0.1 mm 갭 큐베트(gap cuvette) 속에서 25μP, 200Ω, 및 1.8 kV의 셋팅으로 수행하여 4.5 내지 5.0 msec의 기간을 수득하였다. 펄스화된 세포를 350μL의 SOC 배지로 희석시키고(참조: Maniatis, 1989) 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 후; 5 내지 10μL를 LB Cm34 아가 플레이트에 43℃에서 항온처리와 함께 스프래딩시켰다. 2일 후 나타나는 콜로니("팝-인" 후보물을 나타냄)를 LB Cm34 아가 플레이트에 43℃에서 스트리킹하고, 수득되는 콜로니를 LB 배지(Cm 없음)에 성장 및 일련 계대를 위해 30℃에서 접종하였다. 이들 배양물로부터 유래된 콜로니를 Cm-민감성에 대해 시험하고, "팝-아웃" 후보물을 확인하였다. 콜로니 PCR을 사용하여 후보물 균주를 특성화하였다. 하나의 분리체가 프라이머 쌍 CAX129 x CAX132, CAX131 x CAX132, CAX132 x CAX135, CAX129 x CAX135, 및 CAX162 x CAX163을 사용하여 예측된 PCR 생성물을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 콜란산 유전자 클러스터를 결실한 당해 에스케리키아 콜라이 B 분리체는 MSC364로 명명하였다.
실시예 4
발현 벡터의 작제
에스케리키아 콜라이에 대해 특이적인 잘 특성화된 고-카피-수(hig-copy-number) 및 저-카피-수 플라스미드 벡터가 기술되어 있다(참조: Balbas and Bolivar, Methods Enzymol. 1990;185:14-37, Das, Methods Enzymol. 1990;182:93-112, Mardanov et al. 유전자 2007;15(395):15-21). 이러한 벡터는 에스케리키아 콜라이내에서 조절된 유전자 발현을 위한 다양한 잘 특성화된 프로모터 시스템을 사용한다. 또한, 에스케리키아 콜라이, 엑스 캄페스트리스 및 광범위한 다른 그람 음성 박테리아에서 기능하는 RK2(저 카피 수 IncP) 및 RSF1010(고 카피 수 IncQ)와 같은 광범위한 숙주 범위 플라스미드를 기초로 한 접합적으로(conjugally)-전파가능한 플라스미드 벡터가 또한 이용가능하다[참조: Franklin and Spooner, Promiscuous plasmids in Gram-negative bacteria Academic Press (London) 1989 pp247-267, Mather et al. Gene 1995;15:85-88, Haugen et al., Plasmid 1995;33:27-39. Mermod et al., J Bact. 1986;167:447-454]. 합성 콘드로이틴 생합성 유전자 세트를 이들 다용도의(versatile) 광범위한 숙주 범위 벡터내로 클로닝함으로써 동일한 플라스미드가 잔토모나스 캄페스트리스, 스핑고모나스 엘로데아, 슈도모나스 푸티다, 및 비-병원성 에스케리키아 콜라이를 포함하는 광범위한 배열의 그람-음성 박테리아내에서 유전자 전달 및 발현을 위해 사용될 수 있다[참조: Guiney and Lanka, Promiscuous plasmids in Gram-negative bacteria Academic Press (London) 1989 pp27-54].
많은 유용한 IncP-계 벡터가, 임상 슈도모나스 분리체로부터 원래 분리된 후 시험한 거의 모든 그람 음성 박테리아내로 자가 전달되어 당해 박테리아내에서 기능할 수 있음이 밝혀진 접합적으로 자가-전파가능한 플라스미드인 RK2로부터 유래된다. "헬퍼(helper)" 기능이 제2 플라스미드로부터 인 트랜스(in trans)로 공급되는 경우, 안정한 레플리콘(replicon)이며 접합적으로 전달될 수 있는, RK2의 보다 작은 유도체가 작제되었다. 하나의 이러한 플라스미드는 pFF1이다(참조: Durland et al., J. Bact. 1990;172:3859-3867). 당해 플라스미드의 일부 유용한 유도체가 기술되어 있으며; 이들 중 하나는 슈도모나스 TOL 플라스미드의 Pm 프로모터 및 조절 유전자 xylS를 가하여 다양한 그람 음성 박테리아내에서 기능하는 것으로 밝혀진 강력하고, 잘 조절된 프로모터를 제공하는 pJB653(참조: Blatny et al., Appl. Enviorn. Micro. 1997;63:370-379)이다. 이러한 벡터 및 관련된 작제물은 미국 특허 제6,258,565호의 대상이다. 다양한 IncQ-계 플라스미드 벡터가 슈도모나스 푸티다로부터 원래 분리된 8.7kb 플라스미드인 RSF1010로부터 유래된다. RSF1010은 에스케리키아 콜라이 및 광범위한 그람 음성 박테리아내에서 증식할 수 있다. Pm 프로모터 및 xylS 조절 단백질을 수반하는 RSF1010의 유도체가 작제되고 기술되어 있다. 플라스미드 pNM185(참조: Mermod et al., J. Bact. 1986;167:447-454)는 Pm 프로모터 및 xylS 조절 유전자를 수반하는 RSF1010 유도체이다.
슈만(Schumann) 등의 문헌(참조: Plasmid 2005;54:241-248)은 재조합 단백질의 안정한 세포내 발현을 허용하는 바실러스 서브틸리스를 위한 일련의 플라스미드-계 발현 벡터를 기술하였다. 이들 발현 벡터는 쎄타 환(theta circle)으로서 바실러스 서브틸리스내에서 복제하는 에스케리키아 콜라이-바실러스 서브틸리스 셔틀 벡터 pMTLBS72를 기초로 하며 결과적으로 롤링 환 메카니즘(rolling circle mechanism)을 통해 복제하는 pUB110과 같은 전형적인 바실러스 서브틸리스 플라스미드보다 더 안정하다. 구성적 프로모터 PlepA, 열 및 산 쇼크에 의해, 및 에탄올에 의해 유도될 수 있는 프로모터 PgsiB, 및 크실로즈 및 IPTG 각각의 첨가에 반응하는 PxylA 및 Pspac 프로모터를 함유하는 당해 플라스미드의 유도체가 기술되어 있다.
IhcP 및 IncQ 플라스미드와 양립성인 것으로 보고된 광범위한 숙주 범위 플라스미드 pBHR1(참조: Szpirer et al ., J. Bacteriol. 2001;183:2101-10)은 MoBiTec GmbH(독일 괴팅겐 소재)에서 구입하였다. 당해 플라스미드를 변형시켜 상기 참조된 Pm / xylS 발현 시스템을 사용하는 벡터(pDD54)를 생성하였다. pBHR1-계 발현 벡터를 작제하는데 있어서 제1 단계는 당해 플라스미드에 존재하는 카나마이신 내성(KanR) 유전자를 제거하는 것이었다. 이는, pBHRI 및 유도체의 접합적 전달을 지시하기 위해 사용될 수 있는 플라스미드인 pRK201301이, 또한 KanR 유전자를 보유하므로 바람직하였다. 또한, 이러한 유전자, 및 플랭킹 서열의 결실은 하기 설명한 특정의 후속적인 클로닝 단계를 촉진하였다. pBHR1은 또한 클로람페니콜-내성(CamR)을 부여하는 유전자를 보유하며 이 항생제가 당해 플라스미드를 선택하기 위해 카나마이신대신 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA를 SbfI로 분해한 pBHR1(도 8a에 도해됨)으로부터 제조하고, 분해 생성물을 연결시키고 클로람페니콜-내성, 카나마이신-민감성 형질전환체에 대해 스크리닝함으로써 KanR 유전자를 함유하는 1.2 kb SbfI 단편을 결실시켰다. 하나의 이러한 형질전환체로부터의 플라스미드를 pDD39(참조: 도 8a)로 지정하고 추가의 작제 단계에서 사용하였다.
Pm 프로모터로부터의 발현을 양성적으로 조절하는, xylS 유전자를 PCR에 의해, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) ATCC 33015로부터 제조된 pWW0(TOL 플라스미드) DNA로부터 증폭시켰다. 판매회사의 프로토콜에 따라 퀴아젠 플라스미드 미니 키트(제조원: QIAGEN Inc., 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여, 4㎍의 pWW0 DNA를 슈도모나스 푸티다 ATCC 33015의 20 mL의 새로운 밤샘 배양물로부터 분리하였다. 당해 DNA 제제를, xylS 유전자 및 플랭킹 DNA 서열을 후속적인 PCR 스플라이싱 반응에 의해 함께 후속적으로 연결되는 2개의 단편으로서 증폭시키는 PCR 반응을 위한 주형으로서 사용하였다. 당해 과정은 xylS의 해독 정지 코돈의 하부의 NsiI 부위 9개 염기 쌍의 첨가를 촉진하였다. PCR의 초기 라운드에서 1개의 반응(반응 A)은 프라이머 DHD197(서열 번호 103) 및 DHD201(서열 번호 104)을 사용하였고 제2 반응(반응 B)은 프라이머 DHD200(서열 번호 105) 및 DHD198(서열 번호 106)을 사용하였다. 이들 프라이머의 서열은 다음과 같다;
DHD197 5> GCACTGCAGATCCCCTTTATCCGCC >3 (서열 번호 103)
DHD198 5> GCACTGCAGATCCACATCCTTGAAGGC >3 (서열 번호 106)
DHD200 5> GATTACGAACGATGCATAGCCGAAGAAGGGATGGGTTG >3 (서열 번호 105)
DHD201 5> CTTCTTCGGCTATGCATCGTTCGTAATCAAGCCACTTCC >3 (서열 번호 104)
PCR 반응을 PfuUltra II 폴리머라제(제조원: Stratagene, 미국 캘리포니아 라 졸라 소재)를 사용하여 판매회사 프로토콜에 따라 수행하였다. 각각의 100μL의 반응물에서, 프라이머를 각각 0.4μM의 최종 농도로 가하고, dNTP를 각각 200μM의 최종 농도로 가하고 10 나노그람의 pWW0 DNA를 주형으로서 가하였다. PCR 반응을 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) GeneAmp 2400 열순환기 속에서 다음 주기 매개변수를 이용하여 수행하였다: 95℃에서 2분의 1 주기; 95℃에서 20초, 60℃에서 20초, 및 72℃에서 40초의 30 주기; 72℃에서 3분의 1주기를 사용하여 수행하고; 4℃에서 유지. 이들 반응의 생성물을 아가로즈 겔 전기영동으로 분석하였다. 관찰된 PCR 생성물의 크기는 반응 A(1259 bp) 및 반응 B(422 bp) 둘다의 생성물에 대해 예측된 크기와 일치하였다.
이들 반응의 생성물을 퀴아젠 퀴아퀵 PCR 정제 키트(Qiagen QIAquick PCR Purification Kit)(제조원; QIAGEN, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 판매회사의 프로토콜에 따라 정제하고, 각각 1μL를 1 mL의 멸균 증류된 탈이온수에 가하였다. 50μL의 당해 혼합물에 10μL의 10X PfuUltra II 반응 완충액, 10μL의 dNTPS의 스톡 용액(각각 10 mM), 10μL의 DHD197의 스톡 용액(4μM), 10μL의 DHD198의 스톡 용액(4μM), 16μL의 멸균 증류된 탈이온수 및 2μL의 PfuUltra II 폴리머라제를 가하였다. 당해 PCR 반응을 반응 A 및 B에 대해 위에서 기술한 과정을 사용하여 수행하였다. 당해 반응의 생성물을 퀴아젠 퀴아퀵 PCR 정제 키트(제조원: QIAGEN, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 판매회사 프로토콜에 따라 정제하고 아가로즈 겔 전기영동으로 분석하였다. 강력한 밴드가 PCR 스플라이싱 반응의 생성물의 예측된 크기, 1610 bp와 일치하는 위치에서 관찰되었다. 당해 밴드를 겔로부터 퀴아퀵 겔 추출 키트(QIAquick Gel Extraction Kit)(제조원: QIAGEN Inc., 미국 캘리포니아주 발렌시아가 소재)를 사용하여 판매회사 프로토콜에 따라 잘라냈다.
당해 PCR 단편을 pCR-Blunt II-TOPO 클로닝 벡터(제조원: Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)내로 판매회사 프로토콜에 따라 클로닝하였다. 수득되는 플라스미드를 pDD42로 지정하였으며 도 8a에 도해한다. PCR 프라이머 DHD197 및 DHD198은 1610 bp PCR 단편의 각각의 말단으로부터 3개 염기쌍에 PstI 부위를 가하였다. pDD42내 PstI 단편의 서열을 측정하였다(서열 번호 107). 당해 서열은 보고된 pWWO 서열(GenBank, AJ344068)에 기초하여 xylS 유전자에 대해 예측된 서열과 일치하였으며, xylS의 해독 정지 코돈의 하부(3') 9개 염기 쌍에서 Nsil 부위를 생성하는, 프라이머 DHD200 및 DHD201로부터 유래된 5개 염기 쌍의 첨가를 나타내었다. xylS의 하부 비-코딩 영역에서, 2개의 서열 차이가 pDD42내 클로닝된 PstI 단편과 GenBank, AJ344068에서 보고된 서열 사이에서 관찰되었다. G 잔기의 삽입은 xylS 유전자의 TGA 정지 코돈에 대해 3' 방향으로 119 및 181 bp에서 관찰된다. 이들 서열 차이는 xylS 유전자와 xylH 유전자 사이의 유전자간 영역내에서 발생한다.
xylS 유전자를 함유하는 PstI 단편을 pDD42으로부터 절개하고, 젤-정제하고 pDD39의 SbfI 부위내로 클로닝하였다. PstI 및 SbfI 효소는 함께 연결될 수 있는 동일한 4bp의 오버행(overhang)을 갖는 분해 생성물을 생성하지만, SbfI 인식 부위는 생성되는 재조합체내에서 파괴된다. pDD42로부터의 PstI 단편 위에 함유된 xylS 유전자를 함유하는 pDD39 유도체는 pDD47로 명명하며 도 8a에 나타낸다.
RNA 폴리머라제의 결합에 요구되는 최소의 Pm 프로모터 서열 및 XylS 단백질(참조: Dominguez-Cuevas et al., 2008)과 합성 상부 및 하부 전사 종결인자 및 Pm 프로모터의 바로 하부의 유전자를 클로닝하기 위한 다수의 제한 부위에 걸친 대략 90bp의 TOL 플라스미드 DNA 서열을 포함하는 470bp DNA 단편(서열 번호 79)을 DNA 2.0(Carlsbad, CA)에 의해 새로이(de novo) 합성하였다. 도 8b는 DNA 2.0 pJ201 벡터내에 클로닝된 당해 470bp 단편을 함유하는 pJ201:11352를 나타낸다. 프로모터-함유 단편을 플랭킹 AccI 부위로 설계하여 pBHR1 및 유도체 pDD47 플라스미드내에 위치한 양립성의, 및 추정상, 유일한 BstB I 부위내로 클로닝되도록 하였다. 그러나, pDD47, 및 후속적으로 pBHR1의 분해는 2개의 BstBI 부위의 존재를 나타내었다. 분명히, 문헌(참조: GenBank: Y14439.1)에 보고된 pBHR1의 서열은 전체적으로 정확하지 않다. 이러한 차이로 인하여, 클로닝된 Pm 프로모터를 pDD47에 가하기 위해 추가의 클로닝 단계가 요구되었다.
도 8a에 나타낸 바와 같이, pDD47은 프로모터의 삽입을 위해 표적화된 주석이 달린 BstBI 부위를 플랭킹하는 유일한 EcoRI 및 AgeI 부위를 함유한다. 이는 또한 AgeI 부위의 하부의 NgoM IV 부위를 함유한다. pDD47의 763 bp EcoRI-NgoMIV 단편을 잘라내어 pREZ6를 절단한 EcoRI-NgoMIV내로 클로닝함으로써 pDD49를 생성하였다(도 8b). 또한 도 8b에 도해된 pREZ6은 pBluescript SK+(제조원: Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)의 유도체이며, 여기서 짧은 폴리링커 서열(ttaattaagggtttaaactac(서열 번호 142))은 pBluescript SK+의 유일한 DraIII 부위에서 삽입되었다. 당해 작제물에서, 목적한 BstBI는 유일하므로, Pm 프로모터를 함유하는 pJ201:11352의 AccI 단편을 잘라내어 pDD49의 BstBI 부위내로 클로닝함으로써 pDD50을 생성하였다. 후속적으로, pDD50의 EcoRI-AgeI 단편을 잘라내어 pDD47의 5055 bp EcoRI-AgeI 단편에 연결함으로써 도 8c에 나타낸 발현 벡터 pDD54를 생성하였다. pDD54를 하기 및 실시예 6, 7, 8 및 9에 기술된 바와 같이 대체 숙주로 전달하여 발현시키기 위한 K4 캡슐 유전자의 초기 클로닝에서 발현 벡터로서 사용하였다.
3개의 합성 유전자 단편 kpsFEDUCS(FS 분절), kpsMTkfoABCFG(MG 분절) 및 kfoDIEH(DH 분절)은 합성 판매회사, DNA2.0(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)로부터 입수하였다. 합성 DNA는 플라스미드 벡터, pJ241내에서 클로닝된 단편으로서 제공되었다. 도 8d는 이들 작제물의 플라스미드 도해를 나타낸다. 합성 유전자를 pDD54내에 후속적으로 클로닝되는 단일 오페론으로 조립하였다. 당해 공정에서 제1 단계는 FS 및 MG 분절을 단일 단편으로 조합시키는 것이었다. FS 분절과 MG 분절을 플라스미드 벡터, pJ241 상에 상이한 순열로 조합시킨 2개의 플라스미드를 작제하였다.
플라스미드 pJ241:10662 및 pJ241:10664의 분취량을 SbfI + BglII로 분해하고, 알칼린 포스파타제로 처리하고 QIAEX II 겔 추출 키트(제조원: Qiagen Inc., 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 판매업자의 프로토콜에 따라 겔-정제하였다. 이와 동시에, pJ241:10662 및 pJ241:10664 DNA의 분취량을 SbfI 및 BamHI로 분해하고 수득되는 합성 MG 및 FS 유전자 분절을 각각 함유하는 대략 9.1 kb 및 대략 8.0 kb의 SbfI-BamHI 단편을 상기와 같이 겔-정제하였다. 겔-정제된 대략 9.1 kb의 SbfI-BamHI MG 분절을 FS 유전자 분절을 함유하는 SbfI 및 BglII 분해되고 포스파타제처리된 pJ241:10664 벡터내로 연결하였다. 비록 BamH I 및 BglII 효소는 상이한 서열, GGATCC 대 AGATCT 각각을 인식하지만, 이들은 동일한 4 bp 오버행(GATC) 을 생산하므로 분해 생성물을 함께 연결할 수 있으나 수득되는 연결 생성물은 후속적으로 효소에 의해 인식될 수 없다. pDD37로 지정된, 수득되는 재조합 플라스미드는 도 8e에 나타낸다. 당해 작제물은 합성 유전자에 대해 5'에 SbfI 및 합성 유전자에 대해 3'에 pJ241:10664내에 존재하는 BamHI 부위를 보유한다. 따라서, 합성 유전자 세트 kpsMTkfoABCFGkpsFEDUCS(MGFS 분절)을 대략 17.1kb의 SbfI-BamHI 단편으로 잘라낼 수 있다. 유사하게, 겔-정제된 SbfI-BamHI 대략 8.0 kb FS 분절을, MG 유전자 분절을 함유하는, SbfI 및 BglII 분해되고, 포스파타제 처리된 pJ241:10662 벡터내로 연결하였다. pDD38로 지정된 수득되는 재조합 플라스미드는 도 8e에 나타낸다. 다시, 당해 작제물은 합성 유전자에 대해 5' 에 SbfI 부위 및 합성 유전자에 대해 3'에 pJ241:10662내에 존재하는 BamHI를 보유한다. 따라서, 당해 합성 유전자 세트, kpsFEDUCSkpsMTkfoABCFG(FSMG 분절)은 대략 17.1kb의 SbfI-BamHI 분절로 잘라낼 수 있다.
pJ241:10663에 함유된 합성 유전자 kfoD, kfoI(또는 orf3), kfoE 및 kfoH(또는 orf1)(DH 분절)(참조: 도 8d)를 플라스미드 pDD37 및 pDD38내로 클로닝하였다. 플라스미드 pDD37 및 pDD38을 EcoRI으로 분해하고, 알칼린 포스파타제로 처리하고 QIAEX II 겔 추출 키트(제조원: Qiagen Inc., 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 판매회사 프로토콜에 따라 겔-정제하였다. 이들 플라스미드 각각에서 유일한 EcoRI 부위는 kfoC 및 kfoF를 분리하는 유전자간 영역내에 위치한다. 합성 유전자 kfoD, kfoI, kfoE 및 kfoH를 함유하는 DH 분절은 pJ241:10663로부터 대략 4.2 kb EcoRI 단편으로서 잘라내고 겔-정제하였다. 당해 단편을 EcoRI-절단되고 포스파타제 처리된 pDD37 및 pDD38 플라스미드 둘다내로 연결시켰다. 수득되는 재조합체를 진단 제한 효소로 절단함으로써 대략 4.2 kb EcoRI 단편의 배향에 대해 시험하였다. 정확한 배향으로 첨가된 DH 분절을 함유한 재조합체가 용이하게 수득되었다. 수득되는 플라스미드, pDD37로부터 유래된 pDD51, 및 pDD38로부터 유래된 pDD52를 도 8f에 나타낸다. 이들 작제물 각각은 K4 캡슐 클러스터 유전자 모두를 함유하지만, 나타낸 바와 같이, 유전자 순서는 2개 플라스미드에 대해 상이하다: pDD51에서 유전자 순서는 kpsMTkfoABCDIEHFGkpsFEDUCS이고, pDD52에서 그 순서는 kpsFEDUCSkpsMTkfoABCDIEHFG이다. 둘다의 경우에서 전체 K4 유전자 세트는 대략 21kb의 SbfI-BamHI 단편으로서 잘라낼 수 있다. 이들 플라스미드로부터의 K4 캡슐 유전자를 위에서 기술한 발현 벡터 pDD54내로 서브클로닝하여 발현 플라스미드 pDD57 및 pDD58을 각각 생성하였다. 이들 플라스미드 둘다는 도 8g에 나타낸다. 전체 합성 K4 캡슐 유전자 세트를 pDD51 및 pDD52로부터 대략 21 kb SbfI-BamHI 단편으로서 잘라내고, QIAEX II 겔 추출 키트(제조원: Qiagen Inc., 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 판매업자의 프로토콜에 따라 겔-정제하고 SbfI-BamHI 분해된 pDD54내로 클로닝하였다.
pDD57 및 pDD58에서 전체 K4 캡슐 유전자 세트(17개 유전자)는 Pm 프로모터 및 xylS 유전자에 의해 코딩된 XylS 조절 단백질의 조절하에 있다. pDD54 및 pDD58 플라스미드는, 유전자 클로닝을 위한 이의 용도를 향상시키는 다수의 돌연변이를 포함하는 시판되는 에스케리키아 콜라이 "TOP10" 균주"(제조원: Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)내에서 원래 작제되었다. 당해 플라스미드를 또한 일반적으로 재조합 DNA 실험에 사용되는 다른 에스케리키아 콜라이 숙주("DH5a")내로 후속적으로 전달하였다. 이들 에스케리키아 콜라이 균주는 생산 플랫포옴(platform)으로서 개발을 위한 이상적인 후보물이 아니다. 따라서, 초기 실험에서, pDD54 및 pDD58을 보다 적합한 에스케리키아 콜라이-12 균주내로 형질전환시키고 수득되는 균주를 실시예 6에서 하기 기술된 바와 같이 콘드로이틴 생산에 대해 시험하였다.
추가의 발현 플라스미드를 또한 pDD57 및 pDD58의 변형으로 작제하였다. 테트라사이클린-내성 유전자를 하기 설명한 바와 같이 발현 플라스미드 pDD57 및 pDD58에 가하였다. 테트라사이클린-내성은 플라스미드 도입 및 유지를 위한 선택으로서 잠재적으로 2가지 장점을 갖는다. 첫째는, 테트라사이클린-내성(TcR)은, 내성 메카니즘이 세포 밖으로 항생제의 수송에 기초하며, 클로람페니콜 및 많은 다른 항생체의 경우에서와 같이, 항생제의 불활성화에 기초하지 않기 때문에 플라스미드 유지에 대한 전형적으로 더욱 엄격한 선택이다. 따라서, 배양 배지 속에서 선택제의 효과적인 농도는 세포 성장 및 대사에 의해 변경되지 않는다. 둘째로, 테트라사이클린에 대해 내성을 부여하는 자발적인 염색체 돌연변이는 일반적이지 않으며, 잔토모나스 캄페스트리스에서 관찰되지 않았다. 대조적으로, 클로람페니콜에 대해 내성을 부여하는 자발적인 염색제 돌연변이가 실시예 6에 기술된 것들과 같은 플라스미드 전달 실험에서 잔토모나스 캄페스트리스에서 관찰되었다. 이들 돌연변이는 pDD57 또는 pDD58와 같은, 목적한 플라스미드를 획득한 CmR 형질전환체/외부-접합체를 잠재적으로 모호하게 할 수 있다.
발현 플라스미드 pDD57 및 pDD58은 테트라사이클린-내성(TcR)의 특성을 부여하는 유전자의 첨가로 변형된 반면, 당해 플라스미드의 클로람페니콜-내성(CmR) 특성은 유지되었다. 플라스미드 pCX027(실시예 3 및 상기 도 7b에 기술됨)에 존재하고, 에스케리키아 콜라이 플라스미드 벡터 pBR322내에 존재하는 테트라사이클린-내성 유전자(tetR)를 PCR로 증폭시켜 pDD57 및 pDD58에 존재하는 유일한 BamHI 부위내로 클로닝하였다. tetR 유전자를 증폭시키고 클로닝하는 공정에서, 당해 유전자를 다음과 같이 변형시켰다. PCR 프라이머는 프로모터의 상부의 tetR 유전자의 5' 말단에서 BglII 부위를, 그리고 tetR 정지 코돈의 3'에 BamHI 부위를 추가하였다. 프라이머는 유전자를 추가로 변형시켜 내부 BamHI 부위(단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않음)를 제거하고 증폭되었던 단편에 일반적으로 존재하는 소위 "항-tet" 프로모터를 제거하였다. 당해 프로모터는 tetR 프로모터 근처에 위치하나 반대 방향으로 전사를 지시한다(참조: Balbas et al., Gene 1986;50:3-40). 이러한 변형된 tetR 유전자는 tetR 유전자의 2개의 중첩 분절을 증폭시켜 바람직한 서열 변화를 도입한 2회의 PCR 반응을 수행함으로써 생성하였다. 후속적으로, 이들 2개 단편을 후속적인 PCR 스플라이싱(splicing) 반응에 의해 함께 결합하여, tetR 유전자 및 프로모터의 상부의 tetR 유전자의 5' 말단에서 BglII 부위를 갖는 바람직한 서열의 프로모터 영역, 및 tetR 해독 정지 코돈에 대해 3'에 BamHI 부위를 생성하였다.
제1 PCR 반응(반응 A)은 프라이머 DHD218(서열 번호 113) 및 DHD219(서열 번호 114)를 사용하여 tetR 코딩 서열 및 상부 프로모터 서열의 아미노-말단 부위를 포함하는 대략 400 bp의 DNA를 증폭시켰다. 제2 반응(반응 B)은 프라이머 DHD220(서열 번호 115) 및 DHD221(서열 번호 116)을 사용하여 tetR 코딩 서열의 나머지 및 해독 정지 코돈을 포함하는 대략 900 bp의 DNA를 증폭시켰다. 이들 프라이머의 서열들은 다음과 같이 하기에 나타낸다. DHD218내에 나타낸 밑줄친 서열은 pCX027내에 존재하는 서열 ATCGATAAGCTT(서열 번호 141의 핵산 2843 내지 2854)을 대체하며, 이를 수행함으로써 tetR 프로모터 영역내에 위치한 ClaI 및 HindIII 부위를 제거하고 항-tet 프로모터의 -10 영역의 서열을 변화시킨다. DHD219 및 DHD220의 상보적인 밑줄친 서열은 pCX027의 tetR 유전자의 BamHI 부위를 제거하는 사일런트 돌연변이를 생성한다. 당해 돌연변이는 CTC 루이신 코돈을 TTG 루이신 코돈으로 변화시키므로 TetR 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다.
DHD218 5> GCGAGATCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGCTCGGCTTTAATGC
GGTAGTTTATCAC >3 (서열 번호 113)
DHD219 5> CCGGCGTACAAGATCCACAGGACGGGTGTG >3 (서열 번호 114)
DHD220 5> CTGTGGATCTTGTACGCCGGACGCATCGTG >3 (서열 번호 115)
DHD221 5> GCGGATCCTTCCATTCAGGTCGAGGTG >3 (서열 번호 116)
PCR 반응 A 및 B를 PfuUltra II 폴리머라제(제조원: Stratagnen, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 사용하여 수행하였다. 각각 40μL의 반응물에, Pfu 반응 완충액(판매회사에 의해 제공됨)을 1X의 최종 농도로 가하고, 프라이머를 각각 0.4μM의 최종 농도로 가하고, dNTP를 각각 200μM의 최종 농도로 가하며, 1 ng의 pCX027 플라스미드 DNA를 주형으로 가하고 2.5 단위의 PfuUltra II 폴리머라제를 가하였다. PCR 반응 A 및 B를 RoboCycler® 구배 96 열순환기(제조원: Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재) 속에서 다음의 주기 매개변수를 사용하여 수행하였다: 95℃에서 1분의 1주기; 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 30초의 30 주기; 및 72℃에서 5분의 1 주기; 및 6℃에서 유지. 이들 반응의 생성물을 퀴아젠 퀴아퀵 PCR 정제 키트(제조원: QIAGEN, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 판매회사 프로토콜에 따라 정제하고, 아가로즈 겔 전기영동으로 분석하였다. 관찰된 PCR 생성물의 크기는 반응 A(395 bp) 및 반응 B(920 bp) 둘다의 생성물에 대한 예측된 크기와 일치하였다. 이들 단편을 겔로부터 잘라내고 겔 슬라이스로부터 퀴아퀵 겔 추출 키트(제조원: QIAGEN Inc., 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 판매회사 프로토콜에 따라 용출시키고 30μL의 EB 용출 완충액 속에 회수하였다. 겔-정제된 단편을 후속적인 PCR 스플라이싱 반응: 반응 SP에서 주형으로 제공하였다. 50 μL의 반응물에서, Pfu 반응 완충액을 1X의 최종 농도로 가하고, 프라이머를 각각 0.4μM의 최종 농도로 가하고, dNTP를 각각 200μM의 최종 농도에서 가하고, 반응물 A 및 B의 3μL의 겔-정제된 반응 생성물 각각을 주형으로서 가하고 2.5 단위의 PfuUltra II 폴리머라제를 가하였다. PCR 반응 SP를 RoboCycler® 구배 96 열순환기(제조원: Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재) 속에서 다음의 주기 매개변수를 사용하여 수행하였다: 95℃에서 1분의 1 주기; 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 30초의 30 주기; 72℃에서 5분의 1 주기; 및 6℃에서 유지. 당해 반응의 생성물을 퀴아젠 퀴아퀵 PCR 정제 키트(제조원: QIAGEN, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 판매회사의 프로토콜에 따라 정제하고 아가로즈 겔 전기영동으로 분석하였다. 강력한 밴드가 PCR 스플라이싱 반응의 생성물의 예측된 크기, 1295bp와 일치하는 위치에서 관찰되었다.
당해 PCR 생성물을 BglII 및 BamHI로 분해하고 BamHI-분해된 pDD57 및 pDD58과 연결하였다. 연결 생성물을 사용하여 에스케리키아 콜라이 TOP10(제조원: Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 형질전환시키고 테트라사이클린 내성을 획득한 형질전환체를 10㎍/mL 테트라사이클린을 함유하는 LB 플레이트 위에서 30℃에서 플레이팅하여 선택하였다. 수득되는 테트라사이클린-내성 형질전환체를 진단 PCR 반응으로 스크리닝하고 제한 분해하여 tetR 유전자의 존재를 확인하고 이의 배향을 측정하였다. 바람직한 구조를 갖는 플라스미드를 확인하고 pDD61(pDD57::tetR)(서열 번호 143) 및 pDD62(pDD58::tetR)(서열 번호 144)로 지정하였다. 당해 플라스미드의 도해는 도 8h에 나타낸다. tetR 유전자의 유사한 삽입을 벡터 pDD54의 BamHI 부위내로 수행하여 pDD63을 생성하였으며; 도 8i에 나타내었다. 당해 플라스미드는 클로닝된 K4 유전자를 발현하는 TcR 플라스미드 중 어느 것을 사용한 실험을 위한 TcR 벡터-유일 대조군으로서 제공할 수 있다.
합성 유전자 세트는 생성시킬 목적한 임의의 유전자(들)의 비-극성 결실을 허용하는 제한 부위를 함유한다. 4개 유전자 kfoDIEH의 세트는 단일의 4.2 kb EcoRI 단편의 결실에 의해 결실시켰다. 당해 4.2 kb EcoRI 단편을 발현 플라스미드 pDD57 및 pDD58로부터 및 상기 기술된 이들의 각각의 TcR 유도체, pDD61 및 pDD62로부터 결실시켰다. 도 8g 및 8h에 나타낸, 이들 4개의 플라스미드 모두는 3개의 EcoRI 부위를 함유한다. 2개 부위는 목적한 4.2 kb 단편을 정의하며 제3 부위는 클로람페니콜-내성(CmR)을 부여하는 플라스미드 유전자의 코딩 서열내에서 분해한다. 이들 플라스미드 각각을 EcoRI를 사용하여 완전히 분해하고 수득되는 분해 생성물을 재연결하였다. 연결 생성물을 사용한 형질전환 후, CmR 형질전환체를 선택하고 제한 엔도뉴클레아제 분해로 분석하였다. 4.2 kb EcoRI 단편을 결실한 플라스미드를 모든 예에서 용이하게 수득하였다. 플라스미드 pDD59, pDD60, pDD67 및 pDD66은 각각 pDD57, pDD58, pDD61 및 pDD62의 4.2 kb EcoRI 단편 결실 유도체이며, 모두는 kfoDIEH 유전자가 결실되어 있다. 이들 플라스미드는 도 8j에 묘사한다.
클로닝된 K4 유전자의 발현의 웨스턴 블롯 분석(하기 실시예 5 참조)은, pDD66을 함유하는 에스케리키아 콜라이 균주에서, kpsFEDUCS 유전자의 발현이 최적 미만이었음을 나타내었다. 따라서, pDD66을 변형시켜 kfoG와 kpsF 사이의 유전자내 영역내에 프로모터(Pm)를 혼입시켰다. pDD66에서, 당해 유전자간 영역은 도 8k에 나타낸 바와 같이 유일한 PacI 부위 및 2개의 ClaI 부위를 함유한다. PacI 및 ClaI를 사용한 분해는 2개 단편인 34 bp ClaI 단편 및 12 bp ClaI-PacI 단편을 절개하여 ClaI 및 PacI 말단을 갖는 보다 큰 벡터 단편을 남긴다. 다음 서열:
TTAATTAATGTTTCTGTTGCATAAAGCCTAAGGGGTAGGCCTTTCTAGAGATAGCCATTTTTTGCACTCCTGTATCCGCTTCTTGCAAGGCTGGACTTATCCCTATCAAACCGGACACTGCATCGAT(서열 번호 80)을 갖는 127 bp PacI-ClaI DNA 단편을 ClaI-PacI 분해된 pDD66 벡터 단편내로 삽입하여 pBR1052를 생성하였다. 추가된 127 bp PacI-ClaI 단편은 Pm 프로모터 서열의 카피를 포함한다. 도 8k에 나타낸 바와 같이, pBR1052에서 Pm 프로모터의 첨가된 카피는, 당해 프로모터에서 전사 개시가 kpsFEDUCS 유전자를 포함하는 RNA 전사체를 생성할 수 있도록 배향된다.
발현 플라스미드인 pDD66 및 pBR1052는 하기 기술되어 있다. K4 콘드로이틴 생합성 유전자를 염색체 내로 삽입시키기 위한 유전자 대체 벡터를 작제하기 위하여(하기 실시예 10에서 기술된 바와 같음), pDD66 및 pBR1052로부터의 K4 콘드로이틴 생합성 유전자를 실시예 3에서 상기 기술된 pMAK-CL 대체 벡터내로 클로닝하였다. 도 8l에 도해된 pMAK-CL 벡터는 콜란산(CA) 유전자 클러스터의 상부 및 하부의 클로닝된 DNA 영역 및 이들 영역의 연결부에서 유일한 AscI 클로닝 부위를 함유한다. 실시예 3에 설명되어 있는 바와 같이, 당해 벡터를 사용하여 에스케리키아 콜라이 K-12 W3110내에서 전체 CA 유전자 클러스터의 결실을 작제하여 균주 MSC188을 생성하였다. K4 유전자 발현 카세트를 잘라내고 QIAEX II 겔 추출 키트(제조원: Qiagen Inc., 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 판매회사 프로토콜에 따라 pDD66 및 pBR1052로 부터 대략 19 kb AscI 단편으로서 겔-정제하고 이들 단편을 AscI-분해되고, 포스파타제-처리되며 겔-정제된 pMAK-CL DNA와 연결하였다. 형질전환체를 테트라사이클린에 대한 내성에 대해 선택하였다. 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 유전자는 pDD66 및 pBR1052의 AscI 단편 상에, Pm 프로모터 및 상부와 하부 전사 종결인자 서열과 함께 존재한다. pBR1052 또는 pDD66의 AscI 단편을 함유한 pMAK-CL의 유도체를 확인하여 각각 pDD74 및 pDD76으로 지정하였다. 이들 플라스미드는 도 8l에 도해되어 있다.
에스케리키아 콜라이 fhuA 유전자의 상부(5') 및 하부(3')의 DNA 영역을 PCR로 클로닝하고, 조립하고 서열분석하였으며, 당해 결실 단편을 pMAK705 자살 플라스미드내로 이동시켜 pMAK705-△fluA, 또는 pDD73으로 명명된 fluA 유전자좌에 대한 대체 벡터를 생성하였다(도 8m). fhuA 유전자의 상부 및 하부의 DNA 분절을 에스케리키아 콜라이 K-12 균주 W3110로부터 제조한 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭시키고(참조: 실시예 3) 이들 2개 단편을 후속적인 PCR 스플라이싱 반응에 의해 후속적으로 함께 결합시켰다. 당해 과정은 DNA 분절의 상부 및 하부의 연결부에서 PstI 부위의 첨가를 촉진시켰다.
PCR의 초기 라운드에서 1개의 반응(반응 A)는 프라이머 DHD236(서열 번호 108) 및 DHD237-S(서열 번호 109)를 사용하여 fhuA 유전자의 상부 대략 800 bp DNA를 증폭시켰으며 제2 반응(반응 B)은 프라이머 DHD238-S(서열 번호 110) 및 DHD239(서열 번호 111)를 사용하여 fhuA 유전자의 하부 대략 950 bp의 DNA를 증폭시켰다. 이들 프라이머의 서열은 다음과 같다:
DHD236 5>CGCAAGCTTCGTACCGAAAGATCAGTTGC>3 (서열 번호 108)
DHD237-S 5>CCAAAAGAGAAATCTGCAGTAGATGGGATGTTATTTTACCG>3 (서열 번호109)
DHD238-S 5>ACATCCCATCTACTGCAGATTTCTCTTTTGGGGCACGG>3 (서열 번호110)
DHA239 5> GCTCTAGACATCTGCCATAACAACGGAG >3 (서열 번호 111)
PCR 반응 A를 PfuUltra II 폴리머라제(제조원: Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 사용하여 수행하였다. 50μL의 반응물에서, Pfu 반응 완충액(판매회사에 의해 공급됨)을 1X의 최종 농도로 가하고, 프라이머를 0.4μM 각각의 최종 농도로 가하며, dNTP를 200μM 각각의 최종 농도로 가하고, 50 ng의 W3110 게놈 DNA를 주형으로서 가하고 2.5 단위의 PfuUltra II 폴리머라제를 가하였다. PCR 반응 A를 RoboCycler® 구배 96 열순환기(제조원: Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재) 속에서 다음의 주기 매개변수를 사용하여 수행하였다: 95℃에서 1분의 1주기; 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 및 72℃에서 1분의 30 주기; 72℃에서 4분의 1주기; 및 6℃에서 유지.
PCR 반응 B는 헤르큘라제 폴리머라제(제조원: Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 사용하여 수행하였다. 50μL의 반응물 속에, 헤르쿨라제 반응 완충액(판매회사에 의해 공급됨)을 1X의 최종 농도로 가하고, 프라이머를 각각 0.4μM의 최종 농도로 가하고, dNTP를 각각 200μM의 최종 농도로 가하며, 25 ng의 W3110 게놈 DNA를 주형으로서 가하고 2.5 단위의 헤르쿨라제 폴리머라제를 가하였다. PCR 반응 B를 RoboCycler® 구배 96 열순환기(제조원: Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재) 속에서 다음의 주기 매개변수를 사용하여 수행하였다: 92℃에서 2분의 1주기; 95℃에서 30초, 50℃에서 30초, 및 72℃에서 1분의 33 주기; 68℃에서 10분의 1 주기; 및 6℃에서 유지.
이들 반응의 생성물을 퀴아젠 퀴아퀵 PCR 정제 키트(제조원: QIAGEN, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)을 사용하여 판매회사의 프로토콜에 따라 정제하고, 아가로즈 겔 전기영동으로 분석하였다. 관찰된 PCR 생성물의 크기는 반응 A(832 bp) 및 반응 B(949 bp) 둘다의 생성물에 대한 예측된 크기와 일치하였다. 이들 단편을 겔로부터 잘라내고 퀴아퀵 겔 추출 키트(제조원: QIAGEN Inc., 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 판매회사 프로토콜에 따라 용출시키고 30μL의 EB 용출 완충액 속에 회수하였다. 겔-정제된 단편을 후속적인 PCR 스플라이싱 반응; 반응 SP에서 주형으로 제공하였다. 50μL의 반응물에서, Pfu 반응 완충액을 1X의 최종 농도로 가하고, 프라이머를 각각 0.4 μM의 최종 농도로 가하며, dNTP를 각각 200μM의 최종 농도로 가하고, 반응 A 및 B의 3μL의 각각의 겔-정제된 반응 생성물을 주형으로 가하고 2.5 단위의 PfuUltra II 폴리머라제를 가하였다. PCR 반응 SP를 RoboCycler® 구배 96 열순환기(제조원: Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재) 속에서 다음의 주기 매개변수를 사용하여 수행하였다. 95℃에서 1분의 1주기; 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 및 72℃에서 40초의 33 주기; 72℃에서 5분의 1주기; 및 6℃에서 유지. 당해 반응 생성물을 아가로즈 겔 전기영동으로 분석하였다. 강력한 밴드가 PCR 스플라이싱 반응의 생성물의 예측된 크기, 1750 bp와 일치하는 위치에서 관찰되었다. 당해 밴드를 겔로부터 퀴아퀵 겔 추출 키트(QIAGEN Inc., 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 판매회사 프로토콜에 따라 잘라냈다. 이후에, 당해 단편을 pCR-Blunt II-TOPO 클로닝 벡터(제조원: Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)내로 판매회사 프로토콜에 따라 클로닝하고 클로닝된 PstI 단편의 서열을 측정하였다(서열 번호 112).
당해 서열은 W3110(GenBank, AP009048)에 대한 보고된 게놈 서열을 기초로 fhuA 유전자의 상부 및 하부 DNA 분절에 대한 예측된 서열과 일치하였으며, 상부 및 하부 분절의 연결부에서 프라이머 DHD237-S 및 DHD238-S로부터 유래된 6 bp PstI 부위의 첨가를 나타내었다. 프라이머 DHD236 및 DHD239 각각으로부터 유래된, 상부 DNA 분절의 5' 말단에서 HindIII 부위 및 하부 DNA 분절의 3' 말단에서 XbaI 부위의 첨가가 또한 확인되었다. 서열-확인된 PCR 단편을 pCR-Blunt II-TOPO 벡터로부터 잘라내고 1739 bp의 HindIII-XbaI 단편으로서 겔-정제하고 온도-민감성 pMAK705 벡터(참조: 실시예 3)에 연결하고 이를 HindIII 및 XbaI로 분해하여 안트악틱 포스파타제(제조원: New England BioLabs, 미국 메사추세츠주 입스위치 소재)로 판매회사 프로토콜에 따라 처리하였다. 연결 생성물을 사용하여 에스케리키아 콜라이 NEB5α(제조원: New England BioLabs, 미국 메사추세츠주 입스위치 소재)를 형질전환시키고 pMAK705 복제를 위해 허용된 온도인, 30℃에서의 플레이팅으로부터 수득된 클로람페니콜-내성 형질전환체를 PstI, 및 XbaI와 HindIII로 분해하여 분석함으로써, 에스케리키아 콜라이 fhuA 유전자의 상부 및 하부의 클로닝된 DNA 영역을 함유하는 1739 XbaI-HindIII bp 단편을 보유하는 재조합체를 확인하였다. 하나의 이러한 재조합 플라스미드를 pDD73(도 8m)로 지정하고 후속적인 실험에 사용하였다.
xylS 조절 유전자를 다음과 같이 pDD73 대체 벡터내로 클로닝하였다. xylS 유전자를 pDD42로부터 PstI 단편으로서 잘라내고 pDD73의 PstI 부위내로 클로닝하여 pDD77를 생성시키고, 이를 도 8n에 도해한다. xylS 유전자를 함유하는 pDD77의 PstI 단편은 발현 플라스미드 pDD66 및 pBR1052, 모벡터 pDD54 및 pDD54의 테트라사이클린 내성 유도체인 pDD63내에 존재하는 xylS-함유 PstI 단편과 동일하다.
하기 실시예 10에 설명되어 있는 바와 같이, xylS 유전자 프로모터의 합성 최적화된 버젼, 리보소옴 결합 부위, 및 5' 해독되지 않은 영역(UTR)을 설계하여 합성하고, 이들 변형된 서열을 xylS 대체 벡터 pDD77내로 도입한 후 염색체 내로 도입하였다. 257 bp BlpI-BglII 단편(서열 번호 140)은 상업적인 판매회사(DNA2.0)에 의해 합성되었으며, 변형된 서열을 함유하는 합성 DNA를, 천연의 xylS 조절 서열을 함유하는 천연의 Blp I-Bgl II 단편 대신 Blp I-Bgl II 단편으로서, xylS 대체 벡터, pDD77내로 클로닝하였다. 변형된 xylS를 함유하는 플라스미드를 pDD79(도 8n)로 명명하였다.
대체 벡터는 kfoABCFG 유전자 분절의 카피를 에스케리키아 콜라이 K-12 염색체 내로 fhuA 유전자좌에서 삽입시키기 위해 작제하였다. kfoABCFG 유전자 분절(Pm 프로모터 부재)을 pCX039로부터 PstI 단편상에서 잘라내고 당해 단편을 당해 플라스미드내에 유일한 pDD79의 양립성 NsiI 부위내로 클로닝하였다. 수득되는 플라스미드, pDD80(도 8o)에서, kfoABCFG 유전자는 강력한 구성적 프로모터가 되도록 설계되었던, 합성 xylS 프로모터에 의해 전사된다.
pDD66 및 pDD67 발현 플라스미드의 결실 유도체를 작제하여 개개 유전자 또는 유전자 군의 역활을 평가하였다. 이들 유도체의 작제는 위에서 기술한 바와 같이 합성 K4 유전자 단편내로 설계된 플랭킹 제한 효소 부위를 이용하였다. kpsC 유전자(K4 영역 1)은 0.6㎍의 DNA를 10 U SacI로 2시간 동안 10μL의 반응물 속에서 분해한 후 12μL의 반응물 속에서 반응물의 열처리(효소를 불활성화시키기 위해) 및 연결(1 mM ATP 및 T4 DNA 리가제 사용)하여 pDD66으로부터 결실시켰다. 당해 반응물의 1/2를 에스케리키아 콜라이 DH5α(제조원: Invitrogen)내로 LB Tc5에 30℃에서 플레이팅하면서 형질전환시켰다. pDD66에서, kpsC 유전자는 SacI 부위에 의해 플랭킹되지만, 또한 벡터내에 제3의 SacI 부위가 존재하여, 분해는 tetR 유전자를 함유하지만 플라스미드의 복제 오리진을 함유하지 않는 제3의 단편을 생성한다. 따라서, TcR 형질전환체는 적어도 벡터/오리진 단편과 tetR 단편으로 구성된 플라스미드를 함유하는 것으로 예측되었다. 형질전환체를 이들 2개의 SacI 단편을 함유하지만 kpsC SacI 단편을 결여한 플라스미드에 대해 스크리닝하고, 후보 pDD66△kpsC 클론을 또한 SalI 분해에 의해 전자의 2개의 SacI 단편의 바람직한 배향을 갖는 것들에 대해 추가로 스크리닝하였다. 하나의 이러한 플라스미드는 pCX045로 명명되었다(도 8p).
pDD66 내 kpsT 유전자(K4 영역 3)는 MluI 제한 부위에 의해 플랭킹되며, 플라스미드내에 다른 MluI 부위는 존재하지 않는다. 상기 기술한 것과 유사한 단계를 사용하여, pDD66을 MluI로 분해한 후 재-연결하여 pCX048로 명명된 pDD66△kpsT 유도체를 생성하였다(도 8p).
플라스미드 pCX039는 K4 영역 1 및 3 유전자의 결실에 의해 pDD67(위에서 기술됨, 참조: 도 8j)로부터 생성시켰다. 플라스미드 pDD67(1.5㎍)을 효소 PmlI 및 MluI(각각 10U)로 동시에 분해한 후, T4 DNA 폴리머라제(1.5 U) 및 dNTP(각각 150μM)로 12℃에서 15분 동안 처리하여 MluI에 의해 생성된 오버행을 채웠다(평활 말단을 남김). PmlI 분해는 평활 말단을 남긴다. 처리된 pDD67을 후속적으로 T4 DNA 리가제와 함께 항온처리하고 에스케리키아 콜라이 TOP10(제조원: Invitrogen)내로 형질전환시킨 후 Tet-내성에 대해 선택하고 Cm-내성에 대해 스크리닝하였다. 48개의 이중 항생제 내성 콜로니 상에서 콜로니 PCR을 프라이머 DHD229 및 DHD231을 사용하여 수행하였다.
DHD229 AAGGCGACAAGGTGCTGATG (서열 번호 81)
DHD231 CAATGCGACGGATGCTTTCG (서열 번호 82)
48개의 분리체 중 14개는 아가로즈 겔 전기영동에 의해 측정할 때 바람직한 작제물에 대해 예측된 678 bp에 근접하는 PCR 생성물을 수득하였다. 8개의 선택된 후보물 중 6개에서의 플라스미드는 (아가로즈 겔 전기영동에 의해) 예측된 크기였고, 2개의 선택된 플라스미드 분리체는 PmlI/MluI 연결부에서 바람직한 DNA 서열을 함유하였다. 하나의 플라스미드를 pCX039(도 8q)로 명명하였다. 이는 Pm 프로모터에 의해 구동된 xylS 및 K4 영역 2 유전자 kfoABCFG를 함유한다.
pCX039내 kfoB 유전자(및 이의 리보소옴 결합 부위)는 BstBI 제한 부위에 의해 밀접하게 플랭킹되며, 벡터 골격내에 제3의 BstBI 부위가 존재한다. 따라서, BstBI를 사용한 pCX039의 분해는 kfoB 유전자 단편, 플라스미드 복제 오리진, Tet-내성 유전자, 및 kfoCFG 유전자를 포함하는 거대 단편, 및 Cm-내성 유전자 및 Pm/kfoA를 포함하는 단편의 3개 단편을 생성한다(참조: 도 8q). kfoB 유전자가 결여된 pCX039의 유도체를 생성하기 위하여, 플라스미드(600 ng)를 BstBI(10 U)로 90분 동안 65℃에서 완전히 분해하였다. 효소를 반응물로부터 MinElute 키트(제조원: QIAGEN)을 사용하여 12μL 용출 완충액 중 최종 용출로 제거하였다. 대략 250 ng(5μL)의 당해 분해물을 T4 DNA 리가제와 함께 항온처리하고 에스케리키아 콜라이 DH5α(제조원: Invitrogen)내로 Cm-내성에 대한 선택과 함께 형질전환시켰다. Cm-내성에 대해 선택함으로써, 적어도 거대 벡터 단편(즉, kfoCFG/오리진)과 Cm/Pm/kfoA 단편을 함유하는 플라스미드를 수득할 수 있다. 8개의 선택된 형질전환체 내의 플라스미드를 제한 분해에 의해 분석하였으며, 5개는 kfoB BstBI 단편이 결여되고 바람직한 상대적 배향으로 다른 2개의 단편을 갖는 것으로 밝혀졌다. 하나의 이러한 분리체내의 플라스미드는 pCX044(도 8q; xylS 및 kfoACFG)로 명명되었다. 당해 분야의 숙련가는, 동일한 플라스미드 구조가 BstBI 효소를 사용한 부분 플라스미드 분해에 의해 수득될 수 있었음을 인식할 것이다.
당해 실시예에서 위에 기술된 바와 같이, 플라스미드 pDD66 및 pDD67은 상이한 배열로 13개의 K4 유전자를 함유한다: pDD66-Pm/kpsMT/kfoABCFG/kpsFEDUCS; pDD67-Pm/kpsFEDUCS/kpsMT/kfoABCFG. 이들 플라스미드내 K4 유전자(이들의 각각의 리보소옴 결합 부위와 함께) 중 대부분은 플라스미드내에서 단지 2 또는 3회 절단하는 제한 효소 부위의 쌍에 의해 밀접하게 플랭킹된다. 이러한 특징(및 위에서 기술한 다른 서열 성분)은 개개의 K4 유전자의 선택적인, 비-극성 결실을 허용한다. pCX039로부터의 pCX044의 생성을 위해 위에서 기술한 단계들을 사용하여, pDD66 및 pDD67의 △kfoB 유도체를 생성시키고, 도 8r에 묘사한 이들 플라스미드를 각각 pCX040, 및 pCX042로 지정하였다. pDD66 및 pDD67내 kfoG 유전자는 NheI 제한 부위에 의해 밀접하게 플랭킹되어 있으나 각각의 플라스미드내에서 테트라사이클린 내성 유전자에 대한 코딩 영역내 제3의 NheI 부위가 존재한다. pDD66 및 pDD67의 △kfoG 유도체의 생성을 위해, △kfoB 유도체의 생성을 위한 것과 유사한 시도를 이용하였다: NheI을 사용한 완전한 분해, 연결 및, 에스케리키아 콜라이의 Tet-내성 형질전환체에 대한 선택. 당해 시도는 플라스미드 복제 오리진과 함께 테트라사이클린 내성 유전자의 재생에 대해 선택한다. 생성되는 형질전환체내 플라스미드를 kfoG NheI 단편의 부재에 대해 스크리닝하고, pCX041(pDD66 △kfoG) 및 pCX043(pDD67 △kfoG)를 확인하여 도 8s에 나타낸다. 당해 분야의 숙련가는, 동일한 플라스미드 구조가 BstBI 또는 NheI 효소를 사용한 부분 플라스미드 분해에 의해 수득될 수 있었음을 인식할 것이다.
실시예 5
K4 캡슐 생합성 단백질을 인식하는 항체
항체의 생산: K4 콘드로이틴 생합성 유전자 클러스터에 의해 인코딩된 단백질 중 15개에 대해 지시된 항체를 하기 기술된 바와 같이 생산하였다. 이들 항체를 사용하여 대체 숙주 및 천연 에스케리키아 콜라이 K4 균주내에서 클로닝된 K4 콘드로이틴 생합성 유전자의 발현을 평가하였다. 이들을 또한 사용하여 다른 2 군 캡슐을 생산하는 에스케리키아 콜라이내에서 영역 1 및 영역 3 유전자 발현을 평가하고, 다른 혈청군 K4 에스케리키아 콜라이와 함께 잠재적으로 사용하여 영역 2 유전자 발현을 평가하였다. 항체는 다음과 같이 생성하였다.
PCR 프라이머를 설계하여, K4 캡슐 유전자 클러스터내에서 확인된 17개 유전자에 상응하는, 크기가 각각 약 20 내지 30kDa인 일련의 폴리펩타이드 또는 완전한 단백질을 증폭시켰다. PCR 프라이머의 초기 세트는 실시예 1에서 결정된 U1-41 K4 캡슐 유전자 클러스터의 서열을 기초로 하였다. 일부 예에서, 클로닝된 PCR 단편을 서열을 확인한 후 에스케리키아 콜라이 플라스미드 벡터인, pQE30(제조원: Qiagen, Inc., 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재) 내로, 에스케리키아 콜라이내 고 수준 발현을 위해 서브클로닝하였다. 다르게는, PCR 단편을 발현 벡터내로 직접 클로닝한 후 서열분석하였다. pQE30 벡터는 강력한 박테리오파아지 T5 프로모터를 LacI 억제인자 단백질의 조절하에 사용하여 에스케리키아 콜라이내에서 고 수준의 IPTG 유도성 발현을 달성하였다. 정제를 촉진시키기 위해 클로닝된 폴리펩타이드의 아미노-말단에서 폴리-His 태그를 융합시키도록 당해 벡터를 설계하였다. 초기에, KpsM, KpsF, KpsE, KpsS, KfoC, KfoH 및 KfoC로부터 유래된 항원을 pQE30 벡터내에서 His-태그된 폴리펩타이드로서 발현시키고, KpsD, KpsU, KpsC, KfoD, KfoI, KfoE 및 KfoF로부터 유래된 항원을 His-태그없이 발현시켰다. His 태그가 없는 작제물은, His 잔기를 코딩하는 서열이 결실된, pQE30-dH으로 명명된, pQE30의 유도체 내로 클로닝시켜 생성하였다. 후속되는 발현 실험은, His 태그가 KfoC, KfoH 및 KfoG로부터 유래된 폴리펩타이드 항원의 효율적인 발현을 위해 필요하지만, 다른 항원은 태그되지 않은 형태로서 pQE30-dH내에서 효율적으로 발현되었음을 나타내었다. 따라서, 대부분의 항원은 주사된 항원에 존재하지만 천연의 표적 단백질내에 존재하지 않는 에피토프를 인식하는 항혈청을 수득하는 가능성을 피하기 위하여 태그되지 않은 형태로 발현되었다.
항원의 발현을 위해, pQE30 또는 pQE30-dH내로 클로닝된 항원 서열을 함유하는 배양물을 37℃에서 루리아 브로쓰(Luria Broth) 속에서 중기-로그 상(mid-log phase)까지 성장시킨 후, 1 mM의 IPTG를 첨가하여 유도시켰다. 전형적으로, 유도 후 4시간에, 세포를 수거하고 BugBuster® 단백질 추출 시약(제조원: Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨 소재), 세제-계 분해 시스템을 사용하여, 판매회사 프로토콜에 따라 가용성 및 불용성 분획으로 분획화하였다. 전형적으로, T5 프로모터 시스템에서의 과-발현은, 비록 일부 발현된 폴리펩타이드가 가용성 형태로 축적된다고 해도, 에스케리키아 콜라이 세포질내에 불용성 형태로 발현된 폴리펩타이드의 축적을 초래한다. KpsU-유래된 항원은 불용성 형태로 발현되었고; 모든 다른 항원은 불용성 분획으로 분할됨이 밝혀졌다. 종종, 재조합 단백질은 BugBuster® 분해 및 추출 과정에 의해 생성된 불용성 분획내에서 우세한 폴리펩타이드이다. 면역화 목적을 위해, 이들 폴리펩타이드 항원의 발현을 100 ㎖들이의 진탕-플라스크 배양물 속에서 수행하였다. 유도된 배양물의 분해에 이어서, 모든 배양물(KpsU 항원-발현 배양물 제외)의 불용성 분획을 예비 겔에서 이동시켰다. KpsU 항원의 경우에, 폴리펩타이드 항원은 세포 분해물의 가용성 분획으로 분할되므로 이러한 가용성 분획을 예비 겔 위에서 이동시켰다. 목적한 단백질을 함유하는 겔 영역을 잘라내고 추가 가공 및 토끼의 후속적인 면역화로 항혈청을 생산하기 위해 상업적 판매회사, Open Biosystems(미국 알라바마주 헌트스빌 소재)에 보냈다.
초기 실험에서, 12개 항원은 충분히 잘 발현되어 항원의 정제를 보장하는 것으로 여겨졌다. 이들 12개의 항원은 KpsE, KpsD, KpsU, KpsC, KpsS, KpsT, KfoA, KfoB, KfoI(Orf3), KfoE, KfoH(Orf1) 및 KfoF로부터 유래되었다. KpsF, KpsM, KfoC, KfoD, 및 KfoG의 단백질 서열로부터 유래된 항원은 발현되지 않거나 불량하게 발현되었다. 불량하게 발현된 항원의 폴리펩타이드 서열을 코돈 사용빈도, 및 소수성과 같은 물리적 특성과 관련하여 분석하고 pI를 계산하였다. 잘-발현된 폴리펩타이드 항원에 대해 결정된 것으로서 이들 동일한 특성에 대한 비교는 어떠한 명확한 상관관계도 나타내지 않았다. 코돈 사용빈도는 KfoG와 같은, 일부 불량하게 발현된 항원에서 불리하였지만, 다른 잘-발현된 항원에서도 불리하였다. KpsM 항원은 극도로 소수성이며 이는 발현된 항원의 안정성에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있으나, KpsM이 필수적인 막 단백질이므로, 이의 전체 서열은 매우 소수성이며 KpsM로부터 유래된 유의적인 크기의 어떠한 폴리펩타이드도 고도로 소수성일 것이다.
추가의 항원 코딩 서열은 합성의, 코돈-최적화된, KpsM, KpsF, KfoC, 및 KfoG에 대한 유전자로부터 실시예 2에 기술된 합성 K4 유전자 세트를 사용하여 유래되었다. 합성 DNA 주형으로부터 유래된 PCR 생성물을 pQE-30, 6X-His 태그 벡터내로 클로닝하고, 발현에 대해 시험하였다. 합성 서열 KfoC, KfoG, 및 KpsF 항원은 6X-His 태그를 지닌 pQE-30 벡터내에서 발현되는 경우, 고도로, 또는 중간으로 높게 축적되는 것으로 밝혀졌다. 이들 항원은 유도된 배양물로부터 위에서 기술한 바와 같이 겔-정제하였고 토끼에서 항혈청 생산을 위해 Open Biosystems(미국 알라바마주 헌트스빌 소재)에 보냈다. 6X-His 태그를 지닌 합성 서열 KpsM 항원은 유도된 배양물의 쿠마시 염색(Coomassie staining)에 의해 측정된 것으로서 검출가능한 수준에서 발현되지 않았다.
면역 토끼로부터의 항혈청을 유도된 항원을 발현하는 에스케리키아 콜라이 균주로부터의 세포 추출물을 사용하여 역가 및 특이성에 대해 웨스턴 블롯으로 시험하였다. 모든 항혈청은 이러한 웨스턴 블롯에서 그들의 각각의 항원을 인식하였다. 사용하기 위한 역가는 허용가능한 비-특이적인 배경과 전형적으로 1:1500이었다. 이들 항혈청을 사용하여 수행된 웨스턴 블롯으로부터의 결과의 예는 도 9에 나타낸다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 일부 항혈청(예를 들면, 항-KfoA, 항-KpsD 및 항-KpsS)은 다른 에스케리키아 콜라이 단백질에 대해 관측가능한 비특이적인 반응성을 거의 또는 전혀 갖지 않는 클로닝된 K4 유전자를 수반하는 균주내에서 표적 단백질 밴드를 확인하였다. 다른 항혈청(예를 들면, 항-KpsC 및 항-KpsF)에서, 보다 비-특이적인 결합이 관찰되었지만, 표적 단백질은 클로닝된 K4 유전자를 결여하고 있는 에스케리키아 콜라이 대조군 균주와 비교함에 의해 명확하게 확인될 수 있었다. 대부분의 항혈청은 웨스턴 블롯에서 이들의 특이적인 표적으로서 단일 단백질 밴드를 확인하였지만, 일부 예(예를 들면, KfoC)에서 다수의 밴드가 특이적으로 인식되었다. KfoC 폴리펩타이드는 웨스턴 블롯 전에 추출물의 가공 동안 또는 세포내적으로 일부 단백질분해적 파괴 또는 프로세싱을 겪는 것으로 여겨졌으며, 도 9에 나타낸 바와 같이, 이중 밴드가 지속적으로 관찰되었다.
따라서, 에스케리키아 콜라이 K4 균주 및 클로닝된 K4 캡슐 유전자 클러스터를 발현하는 재조합 균주, 및 이들 유전자 중 일부 또는 모두를 함유할 수 있는 천연의 에스케리키아 콜라이 균주에서 KpsF, KpsE, KpsD, KpsU, KpsC, KpsS, KpsT, KfoA, KfoB, KfoC, KfoI(Orf3), KfoE, KfoH(Orf1), KfoF 및 KfoG를 검출할 수 있는 항혈청이 성공적으로 생성되었다.
표시된 단백질을 인식하는 항혈청을 생성하기 위하여 토끼를 면역화하기 위하여 재조합적으로-발현된 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 하기 제공된다. pQE30-dH 벡터내에서 발현된 항원은 플라스미드 발현 벡터로부터 유래되지만 표적 단백질의 서열내에는 존재하지 않는, 발현된 폴리펩타이드의 아미노-말단에서 첨가된 MGS 서열을 함유한다. BamHI 부위내로 클로닝함에 의해 pQE30 벡터내에서 발현된 항원은 플라스미드 발현 벡터로부터 유래되지만 표적 단백질에 존재하지 않는 아미노-말단에서 첨가된 MRGSHHHHHHGS(서열 번호 85의 아미노산 1 내지 12번) 서열을 함유한다. SacI 부위내로 클로닝함으로써 pQE30 벡터내에서 발현된 항원은 플라스미드 발현 벡터로부터 유래되지만 표적 단백질에 존재하지 않는 아미노-말단에서 첨가된 MRGSHHHHHHGSACEL(서열 번호 93의 아미노산 1 내지 16번) 서열을 함유한다. 발현 벡터 DNA 서열로부터 유래된 폴리펩타이드 항원의 아미노-말단 서열은 하기에 밑줄로 표시되어 있다.
KfoA-유래된 항원(서열 번호 83):
MGSLNKGYNVVIIDNLINSSCESIRRIELIAKKKVTFYELNINNEKEVNQILKKHKFDCIMHFAGAKSVAESLIKPIFYYDNNVSGTLQLINCAIKNDVANFIFSSSATVYGESKIMPVTEDCHIGGTLNPYGTSKYISELMIRDIAKKYSDTNFLCLRYFNPTGAHESG MIGESPADIPSNLVPYILQVAMGKLEKLMVFGGDYPTKDGT
KfoB-유래된 항원(서열 번호 84):
MGSWLAYNTALLHFFLNNRGRCLLVSSEQVKRNAEDCIQQLQHKLKLKFGLSFSNTINHSLEQSVNDFKTAEASITLEKEHQEIMSLSGIDIGTGDIIFKQSETEEYLIFNVLNDYPDCKELYFELQSNANTPLRVLEKENYKPSFIWETFIKQRQITLDIVNGLYQSSKKIILDNELHTSKQLNAYQAILKELSDSKEELIQYDLIIKNKTIQVQELEC
KfoC-유래된 항원(서열 번호 85):
MRGSHHHHHHGSAISLNEVEKNEIISKYREITAKKSERAELKEVEPIPLDWPSDLTLPPLPESTNDYVWAGKRKELDDYPRKQLIIDGLSIVIPTYNRAKILAITLACLCNQKTIYDYEVIVADDGSKENIEEIVREFESLLNIKYVRQKDYGYQLCAVRNLGLRAAKYNYVAILDCDMKLN
KfoI(Orf3)-유래된 항원(서열 번호 86):
MGSVDLDNTISFNLSGKYSHATPNKKLIEKLYEYKLNGFYIVIFTARNMRTYKENIGKINIHTLPVIIDWLNENRVPYDEVIVGKPWCGDEGFYVDDRAIRPSELCNMTLEE ISNMLEQEKKCF
KfoE-유래된 항원(서열 번호 87):
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KfoH(Orf1)-유래된 항원(서열 번호 88):
MRGSHHHHHHGSASLGINSYTLITLDKETRGQAETVYLAISKLFNIEQPITIFNIDTIRPNFIFTKFE유전자CYIEVFRGDGDNWSFVMPSNDVKNEVIATSEKKQISNLCCTGLYHFSTIKNFISAYEHYKNLPQENWDAGELYIAPIYNYLISNGIKVYYTEINKSDVIFCGTPREYENLQG
KfoF-유래된 항원(서열 번호 89):
MGSVGFTERLKRDLNTNNIIFSPEFLREGKALYDNLYPSRIVVGESSERARKFAELLSEGAIKKDIPILLTDSPEAEAIKLFANTYLAMRIAYFNELDTYASVHGLDTKQIIEGVSLDPRIGQHYNNPSFGYGGYCLPKDTKQLLANYRDVPQNLIQAIVDANTTRKDFVAEDILSRKPKVVGIYRLIMKAGSDN
KfoG-유래된 항원(서열 번호 90):
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KpsT-유래된 항원(서열 번호 91):
MGSMIKIENLTKSYRTPVGRHYVFKNLNIEIPSGKSVAFIGRNGAGKSTLLRMIGGIDRPDSGKIITNKTISWPVGLAGGFQGSLTGRENVKFVARLYAKQEELKEKIEFVEEFAELGKYFDMPIKTYSSGMRSRLGFGLSMAFKFDYYIVDEVTAVGDARFKEKCAQLFKERHKESSFLMVSHSLNSLKEFCDVAIVFKDDNAVSFHEDVQEGIEEYITEQ NNY
KpsF-유래된 항원(서열 번호 92):
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KpsE-유래된 항원(서열 번호 93):
MRGSHHHHHHGSACELPEFALKFNQTVLKESERFINEMSHRIARDQLAFAETEMEKARQRLDASKAELLSYQDNNNVLDPQAQAQAASTLVNTLMGQKIQMEADLRNLLTYLREDAPQVVSARNAIQSLQAQIDEEKSKITAPQGDKLNRMAVDFEEIKSKVEFNTELYKLTLTSIEKTRVEAARKLK
KpsD-유래된 항원(서열 번호 94):
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KpsU-유래된 항원(서열 번호 95):
MGSMSKAVIVIPARYGSSRLPGKPLLDIVGKPMIQHVYERALQVAGVAEVWVATDDPRVEQAVQAFGGKAIMTRNDHESGTDRLVEVMHKVEADIYINLQGDEPMIRPRDVETLLQGMRDDPALPVATLCHAISAAEAAEPSTVKVVVNTRQDALYFSRSPIPYPRNAEKARYLKHVGIYAYRRDVLQNYSQLPESMPEQAESLEQLRLMSAGINIRTFEVAATGPGVDTPACLEKVRALMAQELAENA
KpsC-유래된 항원(서열 번호 96)
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KpsS-유래된 항원(서열 번호 97):
MRGSHHHHHHGSACELCFGDCRLLHKEAKRWAKSKGIRFLAFEEGYLRPQFITVEEGGVNAYSSLPRDPDFYRKLPDMPTPHVENLKPSTMKRIGHAMWYYLMGWHYRHEFPRYRHHKSFSPWYEARCWVRAYWRKQLYKVTQRKVLPRLMNELDQRYYLAVLQVYNDSQIRNHSNYNDVRDYINEVMYSFSRKAPKESYLVIKHHPMDRGH RLYRPLIKRLSKEYGLDERVIYVHDLPMPELLRHASLIS
실시예 6
합성 유전자 세트[kpsFEDUCS+kpsMT+kfoABCDIEHFG]는 에스케리키아 콜라이 K-12에서 발현되는 경우에 프럭토실화된 콘드로이틴을 생산한다.
상기 실시예 4에 기재된 플라스미드 pDD54 및 pDD58을 MSC188(실시예 3에 기재된 바와 같이 콜란산 생합성 유전자 클러스터에 대해 결실된 에스케리키아 콜라이 K-12 균주 W3110)로 형질전환시켰다. 생성된 균주 MSC204[MSC188(pDD54)] 및 MSC206 [MSC188(pDD58)]를 진탕 플라스크 배양물에서 성장시키고, 콘드로이틴 생산에 대해 시험했다. 균주를 30℃에서 CYG 배지(20 g/L 카스아미노산, 5 g/L 효모 추출물, 2 g/L 글루코즈, pH 7.2) + 클로람페니콜(20 ㎍/mL) 중의 신선한 콜로니로부터 밤새 성장시키고, 이들 배양물을 동일한 배지에서 OD A600=0.05로 희석시켰다. 약 0.1의 OD A600(대략 1시간 후)에서, 유도인자 m-톨루엔산을 최종 농도 2 mM까지 첨가했다. 유도후 4, 8 및 24시간에서, OD A600 값을 측정하고, 샘플을 분석을 위해 취했다. 배양물 OD는 하기 표 6-1에 제공되어 있다. 각 시점에서 각 균주에 대해, 다당류 분석을 위한 10 mL 샘플을 오토클레이빙(121℃, >15psi, 5분)한 다음, 동결 저장했다. 각 시점에서 각 균주의 5 ml 2개 분취량을 원심분리하고, 생성된 세포 펠렛을 후속 웨스턴 블롯 분석을 위해 동결 저장했다.
표 4a에 제시된 바와 같이, 에스케리키아 콜라이 K-12 균주, MSC204 및 MSC206은 유도후 잘 성장했다: 유도후 24시간에서 이들 배양물 둘 다의 OD는 대략 7이었다. 이들 실험으로부터의 배양물 샘플을, 실시예 14에 상세히 기재된 바와 같이, 콘드로이틴 및 프럭토실화된 콘드로이틴에 대한 HPLC 기반 콘드로이티나제-의존성 분석을 사용하여 분석했다. 배양물 샘플은 이들 분석에서 효소적 분해 전에 탈프럭토실화 단계(산 처리)로 처리했다. 배양물 샘플은 또한 프럭토실화된 콘드로이틴에 특이적인 ELISA 분석으로 분석했다(실시예 14). 분석 결과는 표 4a에 제시되어 있다.
[표 4a]
Figure 112012080180037-pct00007
이들 결과는 pDD58 함유 재조합 에스케리키아 콜라이 K12(균주 MSC206)이 프럭토실화된 콘드로이틴을 생산함을 명백히 입증한다. ELISA에 의한 다당류의 검출은 이들 균주에서 생산된 재조합 다당류가 프럭토실화된 콘드로이틴임을 입증하는데, 이는 ELISA 분석에 사용된 항혈청이 콘드로이틴의 프럭토실화된 형태에 특이적이고 프럭토실화되지 않은 콘드로이틴을 인지하지 않기 때문이다. 이 실험에서 관찰된 최고 수준의 프럭토실화된 콘드로이틴 생산은 약 25 ㎍/mL이었다. 프럭토실화된 콘드로이틴 생산은 벡터-단독 플라스미드, pDD54를 함유하는 대조군 균주 MSC204에서 일관되게 검출불가능했다. 4시간 및 8시간 샘플에서 MSC206에 대한 ELISA 및 HPLC 분석 사이에서 측정된 프럭토실화된 콘드로이틴 값에 정량적 차이가 있다. 이들 차이는 아마도 ELISA 분석의 보다 낮은 감도를 반영한다. 전형적으로, 제공된 샘플에서 프럭토실화된 콘드로이틴 농도가 높을수록, ELISA 및 HPLC 분석 사이의 일치는 보다 근접하다.
후속 실험은, MSC206에 의한 프럭토실화된 콘드로이틴의 생산을 확인하고 생산된 콘드로이틴의 수준에 대한 유도인자 농도의 효과를 시험하기 위해 수행했다. MSC206의 신선한 밤새 배양물을 0.05 OD A600으로 희석시키고, 약 0.1의 OD A600까지 CYG 배지 + 클로람페니콜(10 ㎍/mL)에서 30℃로 성장시켰다. 이어서, 배양물의 분취량은 m-톨루엔산을 0, 0.5, 1.0 또는 2.0 mM의 최종 농도까지 첨가하여 유도했다. 배양물을 유도후 24시간 동안 성장시키고, 이 시점에서의 OD를 측정하고, 샘플을 다당류 분석을 위해 상기한 바와 같이 취했다. 또한, 유도후 24시간에서, 각 배양물의 분취량을 희석시키고, LB 상에 플레이팅하여 전체 생존 세포를 정량화하고, LB + 클로람페니콜(17 ㎍/mL) 상에 플레이팅하여 플라스미드 함유 생존 세포를 정량화했다. 이들 배양물의 성장 및 콘드로이틴 생산은 표 4b에 요약되어 있다.
[표 4b]
Figure 112012080180037-pct00008
표 4b에 제시된 바와 같이, 최고 수준의 유도인자만이 24시간에서 성장 및 생존 세포수에 대한 네가티브 효과를 가졌다. 이 실험에서, 발현 플라스미드 pDD58은, 당해 균주가 선택적 항생제인 클로람페니콜의 존재하에 성장했지만, 안정하게 유지되지 않았다. LB 플레이트와 비교하여 샘플을 LB+Cm17 플레이트 상에 플레이팅한 경우에 수득한 콜로니-형성 단위의 보다 낮은 역가에 의해 입증된 바와 같이 24시간 시점에서 플라스미드가 현저히 소실되는 것 같다. 그러나, 플라스미드 함유 세포의 분획은 유도인자 농도에 의해 현저한 영향을 받지 않았다. ELISA 분석의 결과는 MSC206에서 프럭토실화된 콘드로이틴의 생산을 확인시켜 주고, 탈프럭토실화 단계가 포함될 경우 HPLC 분석을 사용하여 수득한 결과와 일치한다. 최고 콘드로이틴 역가를 갖는 샘플은 ELISA 및 HPLC 분석 사이에 최상의 일치를 나타냈다. 이들 결과는 또한 m-TA 첨가에 의한 유도의 부재하에도 프럭토실화된 콘드로이틴의 생산을 입증한다. 그러나, 유도된 모든 배양물은 비유도된 배양물보다 많은 프럭토실화된 콘트로이틴을 생산하였으며, 최고 수준의 프럭토실화된 콘드로이틴은 1.0 mM m-TA로 유도된 배양물에 의해 생산되었다.
실시예 7
유전자 세트[kpsFEDUCS+kpsMT+kfoABCFG]은 에스케리키아 콜라이 K-12 또는 에스케리키아 콜라이 B에서 발형되는 경우에 비프럭토실화된 콘드로이틴을 생산한다. kfoB 및 kfoG은 비프럭토실화된 콘트로이틴의 생산에 필수적이지는 않지만, kfoG은 최적 생산을 위해 요구된다.
이 연구 전에, K4 캡슐 다당류의 프럭토실화에 관여하는 단백질을 인코딩하는 유전자는 동정되지 않았다. K4 캡슐 유전자 클러스터의 영역 2에 존재하는 다수의 유전자에 의해 인코딩된 단백질에 대한 어떠한 기능도 동정되지 않았다:kfoB, kfoG, kfoD, kfoE, kfoH(orf1) 및 kfoI(orf3).
2군 에스케리키아 콜라이 캡슐의 영역 2내에 존재하는 유전자는 다당류 또는 다당류의 당 뉴클레오티드 전구체의 합성에 모두 통상적으로 관련된다(Whitfield 2006). 상기 언급된 바와 같이(실시예 1), kfoB 및 kfoG 유전자는, 다른 글리코스아미노글리칸 캡슐을 생산하는 것으로 공지된 박테리아의 캡슐 클러스터에 존재하는 유전자에 의해 인코딩된 것들과 상동성이다. 이러한 부수적 증거는 글리코스아미노글리칸 캡슐의 생합성에서 kfoB 및 kfoG에 대한 잠재적 역활을 시사한다. 대조적으로, 본 발명 이전에는 kfoD, kfoI, kfoE 및 kfoH 유전자가 K4 캡슐 다당류의 콘드로이틴 골격의 생합성에 관여하는 것과 관련된 어떠한 증거도 없었다. 다른 연구자들은 kfoD 및 kfoE 유전자가 아마도 프럭토실화에 관련되지 않음을 가정했지만[참조: Ninomiya et al., 2002 and Krahulec et al., Molec. Biotech., 2005;30:129-134.], 본 발명자들은 kfoD, kfoI, kfoE 및 kfoH 유전자가 콘드로이틴의 프럭토실화에 관련되는 단백질을 인코딩할 수 있음을 가정했다. 당해 가정을 시험하기 위해, kfoDIEH 유전자 세트를 함유하지 않지만 kpsFEDUCS, kpsMT 및 kfoABCFG 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드를 작제했다. pDD66 및 pDD67로 명명된 이러한 2개 플라스미드는 상기 실시예 4에 기재된 바와 같이 작제했다. 이들 2개의 플라스미드는 또한 테트라사이클린 내성을 부여하는 유전자를 함유하여, 테트라사이클린을 세포 배양물에 사용하여 플라스미드 유지에 대해 선별할 수 있다. pDD62로 명명된 pDD58의 유도체는 대조군 플라스미드로서 또한 작제했다. 상기 실시예 4에 상세히 기재된 pDD62 플라스미드는 kpsFEDUCS, kpsMT 및 kfoABCDIEHFG 유전자를 함유하고, 또한 테트라사이클린 내성을 제공하는 유전자를 함유한다.
kfoDIEH 유전자의 결실이 프럭토실화된 콘드로이틴의 생합성에 영향을 주는지를 측정하기 위해, pDD62, pDD66 및 pDD67를 MSC188 또는 MSC175(상기 실시예 3에 기재된 W3110△wcaJ) 내로 형질전환시키고, 생성 균주를 배양하고, 프럭토실화된 콘드로이틴 및 비프럭토실화된 콘드로이틴의 생산에 대해 분석했다. 균주 MSC274(MSC175 + pDD62), MSC279(MSC188 + pDD66) 및 MSC280(MSC188 + pDD67)를 진탕 플라스크 중의 CYG 배지에서 30℃로 2 ㎛/mL 테트라사이클린(Tc)와 함께 성장시키고, 지시된 바와 같이 1 mM m-TA로 유도했다. 배양물은 상기한 바와 같이 유도후 24시간에서 샘플링하고, 오토클레이빙하고, 원심분리하고, 생성 상청액을 탈프럭토실화 단계의 존재 또는 부재하에 HPLC 분석에 의해 분석했다.
하기 표 5a에 제시된 바와 같이, 모든 균주는 콘드로이틴을 생산했지만, 플라스미드 pDD66 또는 pDD67를 함유하는 균주에 의해 생산된 콘드로이틴 다당류는 프럭토실화 증거를 나타내지 않는다. 즉, MSC279 및 MSC280 샘플에 대해 HPLC에 의해 측정된 콘드로이틴 역가는 탈프럭토실화 단계로 처리하지 않은 샘플과 비교하여 탈프럭토실화 단계로 처리한 샘플에 있어서 현저히 상이하지 않다. 대조적으로, MSC274 샘플을 탈프럭토실화 단계의 부재하에 분석하는 경우에는 매우 적은 콘드로이틴이 관찰된다. 상당한 콘드로이틴은 탈프럭토실화 단계로 처리한 MSC274 샘플에서만 검출된다. 실시예 14에서 상세한 바와 같이, 프럭토실화된 콘드로이틴은 HPLC 분석에 사용되는 콘드로이티나제에 의해 분해되지 않고, 따라서 당해 분석에 의해 검출할 수 없다. 이들 데이타는 kfoDIEH 유전자 중 하나 이상이 콘드로이틴의 프럭토실화에 요구되지만 이들 유전자중 어떤 유전자도 콘드로이틴 생합성에 요구되지 않음을 명백히 입증한다. 이들 결과는 또한, 콘드로이틴이 m-TA에 의한 유도의 부재하에 생산되지만 유도된 배양물은 비유도된 배양물보다 많은 콘드로이틴을 생산했음을 입증한다. 놀랍게도, MSC279 및 MSC280 둘 다에 의해 생산된 비프럭토실화된 콘드로이틴의 역가는 MSC274에 의해 생산된 프럭토실화된 콘드로이틴의 역가보다 (2.5 내지 4배) 크다. 이 결과는 프럭토실화 사건이 콘드로이틴 생산 효율을 감소시킴을 시사한다. 이는, 시험관내에서 프럭토실화된 콘드로이틴이 비프럭토실화된 콘드로이틴과 비교하여 KfoC 효소(콘드로이틴 폴리머라제)에 대한 불량한 기질이라는 관찰과 일치한다[참조: Lidholt and Fjelstad, J. Biol . Chem . 1997;272:2682-2687].
[표 5a]
Figure 112016019550472-pct00164
이들 균주는 균주 MSC206과 비교하여 개선된 플라스미드 보유, 즉 항생제 내성의 보유를 나타낸다. MSC206 플라스미드 보유 데이타에 대한 상기 실시예 6의 표 4b를 참조한다. 이는 아마도 플라스미드의 선별을 위한 테트라사이클린 대 클로람페니콜의 사용을 반영한다. 추가의 실험은, 최대 콘드로이틴 생산을 달성하기 위해, 세포 성장의 손상 없이, 플라스미드 보유를 최대화하기 위해 사용된 테트라사이클린 또는 기타 바람직한 항생제의 농도를 최적화하기 위해 수행될 수 있다.
플라스미드 pDD66 및 pDD67을 MSC139, 에스케리키아 콜라이(ATCC11303) 내로 형질전환시키고, 생성 균주를 콘드로이틴 생산에 대해 시험했다. 대조군 플라스미드, pDD63을 또한 MSC139 내로 형질전환시켰다. 상기 실시예 4에 기재된 이 플라스미드는 테트라사이클린-내성 유전자가 부가된 pDD54 벡터의 유도체이다. 이는 어떠한 K4 콘드로이틴 생합성 유전자도 함유하지 않는다. pDD63(MSC314), pDD66(MSC315) 또는 pDD67(MSC316)를 함유하는 에스케리키아 콜라이 B에서의 콘드로이틴 생산을 진탕 플라스크에서 평가했다.
이 실험에서, 배양물은 5 ㎍/mL 테트라사이클린(Tc5)을 함유하는 TB 배지에서 30℃에서 성장시켰다. 하기 실시예 8에 기재된 바와 같이, TB 배지에서의 성장은 CYG 배지와 비교하여 에스케리키아 콜라이에서 콘드로이틴의 재조합 생산을 향상시키는 것으로 밝혀졌고, Tc5는 세포 성장의 손상 없이 플라스미드 유지를 위해 유효 농도인 것으로 밝혀졌다. 배양물은 0.05 OD A600으로 접종했고, 2 mM m-TA의 첨가에 의해 0.10 내지 0.13에서 유도했다. 유도 후, 배양물은 3일 이하 동안 30℃에서 성장시켰다. 균주 MSC315는 초기에 다른 균주보다 서서히 성장했고, MSC314 및 MSC316 배양물보다 수시간 후에 유도되었다. 유도후 48시간(MSC315의 경우에 유도후 42시간)에서, 테트라사이클린의 존재 또는 부재하에서의 생존 세포 계수 및 HPLC 방법에 의한 콘드로이틴 분석을 위해 샘플을 취했다.
하기 표 5b에 제시된 분석 결과는 pDD66 또는 pDD67 중의 하나가 존재하는 경우에 에스케리키아 콜라이에서 상당한 수준의 콘드로이틴 생산을 입증한다. pDD63을 함유하는 균주 MSC314, "공 벡터(empty vector)" 대조군에서는 어떠한 콘드로이틴도 검출되지 않았다. 이 실험에서 플라스미드 보유(% Tcr)는 pDD66 및 pDD67에 대해 대략 50%인 반면, 대조군 벡터 pDD63의 검출가능한 소실은 없었다.
[표 5b]
Figure 112016019550472-pct00165
에스케리키아 콜라이는 캡슐을 생산하지 않지만, 영역 2 유전자가 삽입 요소에 의해 파괴되어 있고 영역 1 및 3 유전자가 작용성인 것처럼 보이는 미소(cryptic) 그룹 2 캡슐 유전자를 함유한다[참조: Andreishcheva and Vann, Gene 2004;484:113-119]. 에스케리키아 콜라이 K4 유전자가 에스케리키아 콜라이 B 영역 2 결함을 "보충"할 수 있는지를 측정하기 위해, kfoABCFG 유전자만을 함유하는 플라스미드를 작제했다. 이 플라스미드, pCX039는 실시예 4에 기재되어 있다. 플라스미드 pCX039를 MSC139, 에스케리키아 콜라이 B(ATCC11303)에 형질전환시키고, MSC317로서 명명된 생성 균주에서의 콘드로이틴 생산을 진탕 플라스크에서 평가했다. 당해 균주를 30℃에서 TB 배지 + 5 ㎍/mL Tc에서 성장시켰다. 배양물을 대략 0.05 OD A600으로 접종시키고, 대략 0.10의 OD에서 2 mM m-TA로 유도했다. 유도후 48시간에서, 테트라사이클린의 존재 또는 부재하의 생존 세포 계수 및 HPLC 방법에 의한 콘드로이틴 분석을 위해 샘플을 취했다.
LB 플레이트에서 분석하는 경우, 5.9 x 109 cfu/mL가 수득되었고, 5 ㎍/mL Tc를 함유하는 LB 플레이트 상에의 병행 플레이팅으로부터 수득된 cfu의 역가는 현저히 상이하지 않았다. 이는, pCX039 플라스미드가 당해 실험에서 정량적으로 유지됨을 나타낸다. HPLC 기반 콘드로이틴 분석은 탈프럭토실화 단계 없이 수행했다. 이 분석에서 측정된 콘드로이틴 역가는 205 ㎍/mL이었다. 이 결과는 영역 2 K4 유전자 kfoABCFG만이 에스케리키아 콜라이 B에서 콘드로이틴 생합성을 달성하는데 요구됨을 입증한다. 하기 실시예 9에서, 에스케리키아 콜라이 B 중의 영역 1 및 3 유전자는 K4 영역 2 유전자와 함께 작용하여 콘드로이틴 분비를 야기하는 것으로 밝혀졌고, 이러한 발견은 문헌[참조: Andreishcheva and Vann (2004)]의 것과 일치한다.
상기 주목한 바와 같이, KfoB 및 KfoG 상동체는 다른 글리코스아미노글리칸-생산 박테리아의 유전자 클러스터에 인코딩되어 있지만, 이들 단백질의 기능은 알려져 있지 않은 상태이다. 실시예 4에 기재된 바와 같이, kfoB 또는 kfoG 유전자는 pDD66 및 pDD67로부터 결실되어 플라스미드 pCX040, pCX041, pCX042 및 pCX043을 생성하며, 이들은 하기 표 5c에 요약되어 있다. 이들 플라스미드를 숙주 균주 MSC188 내로 형질전환시키고, 생성 균주의 배양물을 콘드로이틴 생합성에 대해 시험했다. 배양물을 30℃로 TB 배지에서 성장시키고, OD A600 약 0.2에서 2 mM m-TA로 유도하고, 유도후 48시간에서 생존 세포 계수 및 콘드로이틴 분석을 위해 샘플링했다. 하기 제시된 이들 분석의 결과는 어떠한 유전자도 재조합 에스케리키아 콜라이 K-12에서 콘드로이틴 생합성에 절대적으로 필수적인 것은 아님을 시사했다.
[표 5c]
Figure 112012080180037-pct00011
이들 결과에 기반하여, KfoB 단백질 활성은 이들 성장 조건하에 이들 균주에서 콘드로이틴 생산에 필수적이지 않은 것 같다. 사실, 이들 실험에서, pDD66으로부터 kfoB의 결실을 함유하는 균주는 pDD66을 함유하는 균주보다 대략 20% 더 많은 콘드로이틴을 생산했다; MSC279 대 MSC322 참조. 이러한 차이는 유의적일 수 있지만, 재조합 에스케리키아 콜라이에서 콘드로이틴 생산에 대해 관찰된 일상의 편차 내이다. MSC279와 MSC322를 비교하는 반복 실험에서, kfoB 결실 균주에 의한 콘드로이틴의 생산 향상은 콘드로이틴 생산에 거의 효과가 없거나 전혀 효과가 없는 것으로 나타났다.
kfoG를 불활성화시키기 위해 돌연변이된 에스케리키아 콜라이 K4 균주의 이전 공개된 연구는 생산된 프럭토실화된 콘드로이틴의 수준에 대한 kfoG 돌연변이의 어떠한 효과도 보고하지 않았다[참조: Krahulec et al., 2005]. 대조적으로, 본 발명자들의 결과는 KfoG 단백질이, 콘드로이틴의 생산에 절대적으로 필수적이지는 않지만, 이러한 실험의 이들 성장 조건하에 에스케리키아 콜라이에서 재조합 콘드로이틴의 생산의 최적 수준을 위해 요구되는 것을 입증한다. kfoG 유전자의 결실은 pDD66 및 pDD67에 의한 콘드로이틴의 생산을 매우 감소시켰다. pDD66 배경에서, kfoG가 결실된 균주(MSC323)는 야생형 대조군 균주 MSC279가 생산한 콘드로이틴의 대략 20%만을 생산했다. 유사하게는, pDD67 배경에서, kfoG가 결실된 균주(MSC325)는 야생형 대조군 균주 MSC280이 생산한 콘드로이틴의 대략 5%만을 생산했다.
실시예 8
본 실시예는 다양한 성장 배지, 온도 및 유도 조건에서 콘드로이틴의 재조합 생산을 입증한다.
각종 상이한 성장 배지는 에스케리키아 콜라이 K4 콘드로이틴 생합성 유전자를 함유하는 재조합 에스케리키아 콜라이 균주에 의한 콘드로이틴의 생산을 뒷받침할 수 있다. 재조합 콘드로이틴의 최적 생산을 위해, 배지 조성, 온도, 유도인자 농도 및 유도후 배양 기간 등의 배양 조건을 최적화시킬 필요가 있다.
에스케리키아 콜라이에서 콘드로이틴의 재조합 생산에 대한 초기 연구는 CYG 성장 배지(20 g/L 카스아미노산, 5 g/L 효모 추출물, 2 g/L 글루코즈, pH 7.2)를 사용했다. 각종 대체 성장 배지 및 배양 조건을 사용하여, 콘드로이틴을 생산할 수 있는 재조합 에스케리키아 콜라이 균주를 배양하고 콘드로이틴 생산을 달성할 수 있다.
에스케리키아 콜라이의 성장을 뒷받침하는 것으로 공지된 한 가지 대체 배양 배지는 TB 배지이다[참조: Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. 이 배지를 시험했고, 재조합 에스케리키아 콜라이에 의한 콘드로이틴의 생산을 뒷받침하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 콘드로이틴 생산에 대한 연장된 배양 시간(유도후 72시간 이내)의 효과를 또한 시험했다. 또한, 1 mM 대 2 mM m-TA를 사용한 유도에 대한 콘드로이틴 생산의 효과를 또한 시험했다.
균주 MSC279 및 MSC280는 테트라사이클린을 5 ㎍/mL로 함유하는 TB에서 30℃로 진탕 플라스크에서 성장시켰다. 배양물은 0.05 OD A600에서 접종하고, 대략 (0.1 내지 0.2) OD A600에서 1 mM 또는 2 mM m-TA의 첨가에 의해 유도했다. 유도후 24 및 48시간에서, 배양물을 콘드로이틴 분석 및 생존 세포 계수를 위해 샘플링했다. 이 실험의 결과는 하기 표 6a에 요약되어 있다.
[표 6a]
Figure 112012080180037-pct00012
이 결과는 TB 배지가 현저한 수준의 콘드로이틴 생산을 뒷받침할 수 있음을 입증한다. 또한, 배양 시간의 연장은 콘드로이틴 역가를 현저히 증가시켰고; 콘드로이틴 수준은 유도후 24 내지 48시간에서 대략 2배가 되었다. 0.4 내지 0.5 g/L의 최종 콘드로이틴 역가는 유도후 48시간에서 달성되었다. 이들 데이타는 또한 보다 높은 유도인자 농도가, 효과의 정도가 크지는 않지만, 보다 큰 생산능을 제공할 수 있음을 시사한다.
CYG 및 TB 둘 다는 가수분해된 카세인 생성물 및 자가분해된 효소를 함유하는 "복합" 성장 배지이고, 여기서 배지의 성분들은 화학적으로 규정되지 않는다. 일부 상황에서, 세포 배양을 위해 최소 또는 규정 성장 배지를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 가능한 규정 또는 최소 배지의 일부 예는 효모 추출물(YE)의 보충하에 또는 보충 없이 "2XM9" + 글루코즈 또는 글리세린을 포함한다. "2XM9"의 기본 무기 염은 22.6 g/L Na2HPO4·H2O, 6 g/L KH2PO4, 1 g/L NaCl, 2mM MgSO4, 0.2 mM CaCl2, 및 2.0 g/L NH4Cl(pH 7.4)이다. 이러한 제형에 탄소원을 첨가하고, 기타 보충제를 지시된 바와 같이 첨가할 수 있다. 균주 MSC279 및 MSC280은 탄소원으로서 10 g/L 글루코즈 또는 글리세린을 함유하는 2XM9에서 30℃로 진탕 플라스크에서 배양했다. YE와 함께 1 g/L로 글루코즈 함유 배지의 보충 효과를 또한 시험했다. 이 실험을 위해, 접종물로서 사용된 밤새 배양물을 LB 배지에서 성장시켰다. 배양물은 0.05 OD A600으로 접종시키고, 대략 0.1 내지 0.2 OD A600에서 1 mM m-TA의 첨가에 의해 유도했다. 탄소원으로서 글루코즈를 함유하는 배양물을 생존 세포 계수 및 콘드로이틴 분석을 위해 유도후 24 및 48시간에서 샘플링했다. 그러나, 글리세린 배양물은 초기 및 유도후 24시간에서 비교적 서서히 성장했고, 미약한 성장만이 있었기 때문에, 글리세린 배양물의 성장은 72시간까지 연장했고 샘플은 48 및 72시간에서 취했다. 하기 표 6b는 이 실험의 결과를 요약한 것이다.
[표 6b]
Figure 112012080180037-pct00013
균주 둘 다는 모든 3개 배지 조성물에서 대략 5 내지 6의 최종 OD A600에 도달했고, 플라스미드 보유는 대략 75 내지 90%로 비교적 양호했다. 콘드로이틴은 시험된 모든 배지에서 상당량으로 생산되었다. 수거시의 역가는 대략 100 내지 350 ㎍/mL 범위였다. 2XM9 + 글루코즈 배지에 대한 효모 추출물의 첨가는 최종 콘드로이틴 역가에 대한 적절한 효과를 대부분 갖는다. 초기 성장 지연에도 불구하고, 글리세린 배양물은 글루코즈로 관찰된 것과 유사한 최종 세포 밀도까지 성장했다. 콘드로이틴의 최종 역가는 글루코즈 배양물과 비교하여 글리세린 배양물에서 (1.5 내지 3배) 더 높았다. 이들 결과는 현저한 수준의 콘드로이틴 생산을 뒷받침할 수 있는 최소/규정 배지의 예를 제공한다. 추가의 배지 개발 및 최적화는 미생물 발효 공정 개발 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
또 다른 실험은 콘드로이틴 축적에 대한 성장 온도 및 유도후 연장된 성장 시간의 효과를 입증한다. MSC280의 배양물을 CYG 배지 + 2 ㎍/mL Tc에서 성장시켰다. 플라스크를 20℃, 25℃, 30℃ 및 37℃에서 배양했다. 배양물을 대략 0.05 OD A600으로 접종시키고, 지시된 온도에서 대략 0.1 내지 0.2 OD A600으로 성장시키고, 이 시점에서 배양물을 지시된 1 mM m-TA의 첨가에 의해 유도했다. 30℃에서 한 가지 대조군 배양물은 유도하지 않았다. 샘플은 콘드로이틴 분석 및 생존 세포 계수를 위해 유도후 24, 48 및 72시간에서 수집했다. 말기 수거 시점으로부터의 결과는 표 6c에 하기 제시되어 있다. 이들 조건하에, 콘드로이틴 생산은 시험된 모든 온도에서 달성되었지만, 최고의 콘드로이틴 역가는 25℃ 및 30℃에서 달성되었다. 콘드로이틴 축적은 시험된 모든 온도에서 성장 2일차 및 3일차 동안 현저히 증가했다(데이타는 도시하지 않음). 37℃에서, 콘드로이틴 생산은 30℃에서보다 실질적으로 낮았고(대략 10배), 37℃ 배양물의 생존률은 불량했다. 추가의 최적화는 20℃ 내지 30℃ 범위의 추가 온도를 시험함으로써 콘드로이틴 생산에 대한 바람직한 온도 범위의 정의를 밝힘으로써 달성할 수 있다. 유사하게는, 추가의 최적화는 콘드로이틴 역가에 대한 유도후 배양 시간의 효과를 밝힘으로써 달성할 수 있다.
[표 6c]
Figure 112012080180037-pct00014
배양 시간을 연장함으로써 배양 시간을 최적화하기 위한 추가의 연구는 콘드로이틴 생산을 추가로 증가시킬 수도 있다. 유사하게는, 유도인자의 추가 농도를 시험하여 콘드로이틴 생산에 대한 최적 농도를 확인할 수 있다.
실시예 9
본 실시예는 재조합 콘드로이틴이 에스케리키아 콜라이 K-12 및 에스케리키아 콜라이 B에서 배양 배지로 분비될 수 있음을 입증한다. 본 실시예는 추가로 콘드로이틴이 또한 세포내에서 고도로 생산될 수 있음을 입증한다.
에스케리키아 콜라이 K4를 액체 배지에서 배양하는 경우, 캡슐 다당류(K4P), 프럭토실화된 콘드로이틴은 배양 배지에 무세포 형태로 및 세포 결합 형태로서 축적되는 것으로 보고되어 있다[참조: Manzoni et al., Biotech. Lett. 1996;18:383-386, Cimini at al. Appl. Mocrobiol. Biotechnol. E-Publication, E-Pub. October 2009]. 다른 2군 캡슐 다당류, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이 혈청형 K1 및 에스케리키아 콜라이 혈청형 K5에 의해 생산된 것들과 유사하게, 세포 결합 형태는 주로 지질 앵커(anchor)에 의해 세포의 외막의 외엽과 결합하는 것으로 믿어진다[참조: Whitfield, 2006]. 다당류와 지질 앵커 사이의 연결의 성질은 구조 수준에서 정의되어 있지 않고, 지질 앵커가 무엇인지도 측정된 바 없다. 상기 실시예 6 내지 8에 기재된 바와 같이 생산 및 검출된 재조합 콘드로이틴은 배양 배지에 명백하게 존재한다. 저속 원심분리(3500g에서 10분)는 콘드로이틴에 대해 분석되는 샘플의 배양 배지로부터 세포를 제거하기에 충분하고, 상당량의 콘드로이틴 무세포 상청액에서 검출되었다. 그러나, 상기 실시예 6 내지 8에서 콘드로이틴에 대해 분석된 모든 샘플은 박테리아를 사멸시켜 샘플 취급을 용이하게 하기 위해 원심분리 전에 오토클레이빙시켰다. 오토클레이빙 단계는 임의의 세포 결합된 콘드로이틴의 연결을 잠재적으로 분쇄하고, 세포로부터 이러한 세포 결합 콘드로이틴을 방출시킬 것이다. 재조합 콘드로이틴이 무세포 및/또는 세포 결합 형태로 생산되는지를 측정하기 위해, 이어서 콘드로이틴 생산 배양물로부터의 샘플의 원심분리 후 상청액 및 펠렛 분획 내로의 재조합 콘드로이틴의 분배에 대한 오토클레이빙의 효과를 시험하는 실험을 수행했다.
균주 MSC279를 30℃에서 TB 배지 5 ㎍/mL Tc에서 진탕 플라스크에서 성장시켰다. 배양물은 대략 0.03 OD A600으로 접종하고, 대략 0.1 내지 0.2 A600으로 성장시켰으며, 이 시점에서 2 mM m-TA의 첨가에 의해 유도했다. 유도후 48시간에서 샘플을 취하고, 콘드로이틴에 대해 분석했다. 이 배양물의 하나의 분취량을 원심분리 전에 오토클레이빙시키고, 생성된 상청액 및 세포 펠렛 분획을 실시예 14의 HPLC 방법에 따라 콘드로이틴에 대해 분석했다. 또 다른 분취량을 오토클레이빙 없이 원심분리하고, 생성된 상청액 및 세포 펠렛 분획을 실시예 14의 HPLC 방법에 따라 콘드로이틴에 대해 분석했다. 비-오토클레이빙 샘플로부터의 세포 펠렛은 THB(50 mM 나트륨 아세테이트와 함께 50 mM 트리스-HCl, pH 8.0)에 재현탁시키고, 콘드로이티나제 ABC("CHase")로 직접 처리하고, 다시 원심분리하여 분석용 상청액 및 펠렛 분획을 생성했다. 잔류 배양 배지에 함유된 무세포 콘드로이틴을 시험하기 위해, 비-오토클레이빙 샘플로부터의 또 다른 세포 펠렛을 THB에서 천천히 세척한 다음, 재원심분리했다. 세척으로부터의 상청액(샘플 #7) 및 세척액으로부터 세포 펠렛(용해 없음)(샘플 #8)을 상기와 같이 콘드로이틴에 대해 분석했다. 이 실험의 결과는 하기 표 7a에 제시되어 있다.
[표 7a]
Figure 112012080180037-pct00015
오토클레이빙 샘플에서, 전체 콘드로이틴 중의 11%만이 세포 펠렛(샘플 #2)에 존재하는 반면, 원심분리 전에 오토클레이빙하지 않은 샘플(샘플 #4) 에서는 전체 콘드로이틴 중의 45%가 세포 펠렛에 존재했다. 이 결과는 MSC279에 의해 생산된 콘드로이틴의 상당 분획이 세포 결합 상태로 존재하고 오토클레이빙 단계가 세포와 콘드로이틴의 결합을 파괴함을 나타낸다. 비오토클레이빙 균주의 펠렛 중의 세포 결합 콘드로이틴은 용해 처리 부재하에 재현탁된 세포의 직접 CHase 처리에 의해 분해되는 것으로 밝혀졌다. 방출된 이당류의 양에 기반한 표면 결합된 콘드로이틴의 계산된 양은 본래 배양물에서 130 내지 154 ㎍/ml(샘플 #5 및 샘플 #8)인 것으로 밝혀졌다. 이 값은 실시예 14의 "세포 용해" 기술에 의해 측정된 세포 결합 콘드로이틴 역가(178 ㎍/mL)(샘플 #4)보다 다소 낮은데, 이는 내부 콘드로이틴 폴리머를 반영할 수 있다(샘플 #2 및 샘플 #6에서 측정된 바와 같음). 그러나, 분석 방법 둘 다로부터의 데이타는 상당히 높은 콘드로이틴 분획이 오토클레이빙 샘플과 비교하여 비오토클레이빙 샘플에서 세포 결합되어 있음을 나타내는 것과 정량적으로 일치한다. 세포 결합된 콘드로이틴이 전체 세포 현탁액의 CHase 처리에 의해 이당류로 분해되었다는 사실은, 다당류가 세포 외부 및 배양 배지 내에 잔류하는 방식으로, 이러한 콘드로이틴 분획이 세포의 외막과 결합되는 것을 나타낸다. 이는 캡슐의 예상된 구조와 일치한다.
이들 결과는 균주 MSC279에 의해 생산된 재조합 콘드로이틴의 상당 분획(≥50%)이 세포 결합되지 않은 형태로 배양 배지 내에 존재함을 입증한다. MSC279에 의해 생산된 세포 결합된 콘드로이틴의 벌크는 세포에 부착하지만, 첨가된 CHase에 의한 분해에 의해 입증된 바와 같이 주위 배지에 접근가능하다. 천연 에스케리키아 콜라이 K4에 의한 무세포 및 세포 결합된 형태의 K4P의 생산은 이미 문헌[참조: Manzoni et al., Biotechnol. Lett. 1996;18(4):383-386 and Cimini et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. E-Publication, October 2009]에 보고되어 있다. 재조합체 생산 동안 두 형태의 관찰은 MSC279에서 재조합 콘드로이틴의 합성 및 분비가 천연 균주에서 작용하는 동일한 경로에 의해 진행된다는 관찰과 일치한다. 이는 MSC279 내로 도입된 클로닝된 유전자 모두가 에스케리키아 콜라이 K4에서와 동일한 방식으로 작용하고 캡슐 다당류의 합성 및 이출에 대한 완전한 경로가 재조합 균주에서 작용하는 것을 시사한다.
박테리아 발효에 의해 콘드로이틴을 생산하기 위해, 대규모 발효기를 사용하는 것이 바람직하고, 이는 너무 커서, 세포 결합 콘드로이틴을 배양 배지로 방출하는 방법으로서 가능할 오토클레이빙을 실시할 수 없는 배양 배지의 용적을 생성한다. 산 또는 염기 처리와 조합하여 승온을 사용하는 또 다른 처리를 대규모 제조에 사용할 수 있다.
콘드로이틴을 배양 배지로 분비하는 유사한 결과는 콘드로이틴을 생산하는 재조합 에스케리키아 콜라이 B 균주로 수득되었다. 본 발명자들은 재조합 에스케리키아 콜라이 K-12에서 kfoB 유전자가 콘드로이틴 생산에 필수적이지 않음을 이미 관찰했다. 에스케리키아 콜라이 B에서 콘드로이틴의 분비를 시험하기 위해, MSC347(MSC139 pCX044, 즉 pCX039△kfoB)을 30℃로 TB/Tc5 배지에서 성장시키고, 2 mM m-TA로 대략 0.15의 OD A600에서 유도했다. 48시간에서, 브로쓰 샘플을 취하고, 오토클레이빙의 존재 및 부재하에 원심분리하여 상청액 및 세포 펠렛 분획을 생성했다. 이 실험의 콘드로이틴 분석 결과는 하기 표 7b에 제시되어 있다. 오토클레이빙은 상청액 분획에서 90% 초과의 전체 측정가능한 rCH를 생성했다. 그러나, 비오토클레이빙 샘플에서는, 대략 30%의 콘드로이틴만이 상청액에서 관찰되었다. 이들 결과는 상기 상세한 바와 같은 재조합 에스케리키아 콜라이 K-12를 사용한 발견과 일치하며, 이는 오토클레이빙 단계(5분, 121℃, 15 psi)가 실질적으로 모든 rCH를 배지로 방출함을 시사한다. 이들 결과는 에스케리키아 콜라이 B 중의 영역 1 및 3 유전자가, 영역 2 유전자가 존재하는 경우, 콘드로이틴을 분비하도록 작용함을 추가로 나타낸다.
[표 7b]
Figure 112012080180037-pct00016
세포 배양 배지 내로 콘드로이틴의 분비 및 배양 배지 내로 세포 결합 콘드로이틴의 방출은, 무세포이고 원심분리 또는 여과에 의해 세포로부터 분리된 후에 정제될 수 있는 콘드로이틴을 수득하는 방법을 제공한다. 또한, 콘드로이틴 생합성 유전자의 유전자 조작에 의해 세포내 콘드로이틴을 생산할 수 있다. 콘드로이틴의 세포내 생산은 배양 배지에서 고도의 다당류로부터 발생하는 발현 점도를 제거하기 위해 요구될 수 있다. 또한, 에스케리키아 콜라이에서 콘드로이틴 생산 및 콘드로이틴 생합성의 생화학에 대한 본질적인 제한은 불완전하게 이해되고 있다. 세포내 생산은 분비보다는 콘드로이틴의 보다 높은 수준을 달성할 수 있다. 따라서, 배양 배지로의 분비의 부재하에 현저한 수준의 콘드로이틴을 축적하는 재조합 유전자 세트가 동정되었다.
특정한 조건하에 다른 에스케리키아 콜라이 캡슐 다당류를 합성하고 세포내에 축적할 수 있다는 것은 문헌에 입증되어 있다. 브로너 등[참조: J. Bact. 1993;175:5984-5992]의 전자 현미경(EM) 결과는 kpsC 및 kpsS 내의 돌연변이체 결함에 의해 에스케리키아 콜라이 혈청형 K5 캡슐 다당류(헤파로산)의 일부 세포내 축적이 존재함을 시사했다. 유사한 관찰은, kpsC, kpsS, kpsE 또는 kpsT 중의 돌연변이체 결함을 EM으로 검사하는 경우, 에스케리키아 콜라이 K1의 폴리시알산 캡슐 다당류에 대해 시에스레비츠 및 빔르(Cieslewicz and Vimr)에 의해 보고되었다[참조: J. Bact. 1996;178:3212-3220]. 세포내 K1 및 K5 다당류의 수준은 이들 연구에서 정량화되지 않았다.
영역 1 또는 영역 3 유전자의 돌연변이가 에스케리키아 콜라이 K-12에서 재조합에 의해 생산된 콘드로이틴의 분비를 차단할 수 있는지를 측정하기 위해, kpsC 또는 kpsT 유전자가 결실된 플라스미드 pDD66의 유도체(각각 pCX045 및 pCX048)를 실시예 4에 기재된 바와 같이 작제했다. 이들 플라스미드를 MSC188에 형질전환시키고, 생성된 균주는 콘드로이틴을 생산하여 배양 배지로 분비하는 능력에 대해 MSC279(MSC188은 비변형된 pDD66을 함유한다)과 함께 시험했다.
배양물을 30℃에서 TB + Tc5 배지에서 성장시키고, 대략 0.15의 OD A600에서 2 mM m-TA로 유도하고, 48시간 후에 샘플링했다. 48시간 시점에서 각 균주에 대해, 콘드로이틴을 오토클레이빙 및 비오토클레이빙 샘플 둘 다로부터의 상청액 및 세포 펠렛에서 분석했다. 하기 표 7c에 제시된 바와 같이, 48시간에서의 OD는 동등했다. 각각 kpsC 및 kpsT 유전자가 결실된 균주 MSC356 및 MSC359로부터의 비오토클레이빙 샘플에서, 콘드로이틴은 주로(대략 85 내지 90%) 세포 펠렛으로 국지화되었다. 이는, 콘드로이틴의 대략 50%가 세포 펠렛으로 국지화되고 대략 50%가 상청액에 존재하는 MSC279(야생형 대조군)의 결과와 대조적이다.
[표 7c]
Figure 112012080180037-pct00017
균주 MSC279에서 상기(표 7c) 기재된 바와 같이, MSC270 배양물의 비오토클레이빙 샘플에서 세포 펠렛으로 국지화된 콘드로이틴의 대부분은 세포 외막의 외엽에서 지질 앵커에 공유 부착되는 것 같다. 오토클레이빙은, 오토클레이빙의 부재하에 세포 결합되는 콘드로이틴과 세포 막의 결합을 파괴하는 것 같지만, 세포의 오토클레이빙 처리 효과는 완전히 이해되지 않는다. kpsC 또는 kpsT 결함 균주의 세포 펠렛으로 국지화되는 콘드로이틴 및 세포 사이의 결합 성질은 이들 데이타에 의해 해결되지 않는다. 원칙적으로, 이러한 콘드로이틴은 세포 세포질, 주변세포질 공간에 존재할 수 있거나, 세포 외막에 여전히 부착될 수 있다. 그러나, 이들 돌연변이 균주에 대한 결과는 kpsC 및 kpsT 에서 돌연변이가 콘드로이틴의 분비를 차단하고 콘드로이틴의 세포내 축적을 생성한다는 관찰과 일치한다. 세포 표면 상에 이러한 콘드로이틴의 존재는 비오토클레이빙 세포 펠렛을 재현탁시키고 재현탁된 세포를 CHase 효소로 처리하고 콘드로이틴 특이적 이당류의 생산을 측정함으로써 시험할 수 있다. 또는, 전자 현미경을 사용하여, MSC356 및 MSC359에 의해 생산된 세포 결합된 콘드로이틴의 세포 위치를 측정할 수 있다.
하기 상세한 추가의 실험은, 야생형 균주 MSC279를 이용하여 세포로부터 콘드로이틴의 방출에서 오토클레이빙의 역할을 확인하고 K4 영역 2 유전자만을 함유하는 에스케리키아 콜라이 K-12(MSC346; MSC188 pCX039)가 세포내 콘드로이틴을 생산할 수 있는지를 측정하기 위해 설계되었다. 균주 MSC279 및 MSC346은 30℃에서 TB/Tc5에서 성장시키고, 2 mM m-TA로 대략 0.15의 OD A600에서 유도했다. 48시간 후, 이중 브로쓰 샘플을 취하여, 원심분리 전에 오토클레이빙의 존재 및 부재하에 상청액 및 세포 펠렛 분획을 생성했다. 이들 샘플로부터의 콘드로이틴 분석 결과는 하기 표 7d에 제시되어 있다. 완전 콘드로이틴 생합성 유전자 세트를 함유하는 균주 MSC279로부터의 비오토클레이빙 샘플에서, 콘드로이틴은 상청액(55%) 및 펠렛(45%) 사이에서 대략 균일하게 분포되어 있었다. 대조적으로, 영역 2 유전자만을 함유하는 균주 MSC346으로부터 비오토클레이빙 펠렛은 당해 배양물에 의해 생산된 콘드로이틴의 대략 90%를 함유했고, 상청액에서는 거의 발견되지 않았다. 두 균주의 경우, 오토클레이빙은 주로(>90%) 상청액 내로의 CH의 분배를 생성했다.
[표 7d]
Figure 112012080180037-pct00018
이들 결과는 오토클레이빙(5분, 121℃, 15 psi)이 배지 내로 모든 세포 결합된 콘드로이틴을 거의 방출함을 입증한다. 결과적으로, MSC279의 비오토클레이빙 세포 펠렛에서 검출된 콘드로이틴은 원칙적으로 외막에 결합할 수 있거나 세포내 위치를 갖는다. 오토클레이빙의 부재하에, 콘드로이틴은 균주 MSC346 배양물의 상청액에서 거의 발견되지 않았다. 이 결과는, 모든 영역 1 및 영역 3 기능을 결여하여 세포내 콘드로이틴만을 생성하는 MSC346과 일치한다. 보다 낮은 양의 콘드로이틴이 MSC279와 비교하여 MSC346에 의해 생산되지만, 생산된 콘드로이틴의 양은 여전히 현저하고, 이는 콘드로이틴이 재조합 에스케리키아 콜라이 K-12 중의 클로닝된 유전자 kfoABCFG만을 사용하여 성공적으로 생산될 수 있음을 입증한다. 이들 결과는 또한 이러한 콘드로이틴이 오토클레이빙에 의해 세포로부터 유리되고, 원심분리하여 세포 파편을 제거한 후에 오토클레이빙 배양물의 상청액에서 수득될 수 있음을 입증한다. 또는, MSC346의 세포는 공지된 다양한 방법(예: 균질화, 세정 및/또는 효소 용해, 기계적 분쇄, 초음파 등)에 의해 용해될 수 있고, 이들 방법에 의해 방출된 콘드로이틴은 또한 원심분리 후에 상청액에서 회수될 수 있다. 이렇게 회수된 콘드로이틴은 당해 기술분야에 공지된 알콜 침전 등의 방법으로 추가로 정제할 수 있다.
실시예 10
본 실시예는, 염색체에 삽입된 콘드로이틴 생합성 유전자를 함유하는 에스케리키아 콜라이 K-12 균주의 작제를 기재하며, 이들 균주에서 콘드로이틴 생산을 입증한다.
상기 실시예 6 내지 9는, 콘드로이틴 생합성 단백질을 인코딩하는 클로닝된 유전자를 이종성 숙주 균주로 도입하기 위해 플라스미드 벡터를 사용하여 재조합 에스케리키아 콜라이 균주에서 콘드로이틴을 생산하는 것을 기재한다. 몇몇 상황에서, 수용체 숙주 균주의 염색체 내로 클로닝된 콘드로이틴 생합성 유전자를 도입하는 것이 요구될 수 있다. 염색체내에 클로닝된 유전자를 위치시키는 것은, 콘드로이틴 생합성 유전자를 함유하여, 선택된 압력의 부재하에 안정한 발현 균주 또는 보다 안정한 발현 균주를 잠재적으로 제공할 수 있는 플라스미드(들)를 유지하기 위해 선택 압력을 유지하는 요구를 제거한다. 따라서, 콘드로이틴 생합성을 위한 에스케리키아 콜라이 K4 유전자가 숙주 염색체 내로 안정하게 통합되어 있는 에스케리키아 콜라이 K-12 균주를 작제하였다. 이들 "염색체 발현 균주"는 콜란산 생합성 유전자좌에서 통합된 pDD66 및 pBR1052로부터의 Pm 프로모터 및 K4 유전자 세트를 사용한다. 또한, xylS 조절 유전자가 별도의 유전자좌인 fhuA 유전자좌에서 염색체 내로 통합되었다. 생성된 작제물은 진탕 플라스크 및 발효조에서 높은 수준의 콘드로이틴을 생산하는 것으로 밝혀졌다(실시예 14 및 15).
발현 플라스미드 pDD66 및 pBR1052는 실시예 4에 기재되어 있다. pDD66 및 pBR1052로부터의 K4 콘드로이틴 생합성 유전자를, 실시예 3에 또한 기재되어 있는 pMAK-CL 치환 벡터 내로 클로닝하였다. 도 8l에 도시된 이러한 벡터는 콜란산(CA) 유전자 클러스터의 상부 및 하부에 클로닝된 DNA 영역을 함유하고, 이들 영역의 연결부에 유일한 AscI 클로닝 부위를 함유한다. 실시예 3에 상세한 바와 같이, 이러한 벡터를 사용하여, 에스케리키아 콜라이 K-12 W3110 중의 전체 CA 유전자 클러스터의 결실을 작제함으로써 균주 MSC188을 생성했다. K4 유전자 발현 카세트를 잘라내고, pDD66 및 pBR1052로부터 판매자 프로토콜에 따라 QIAEX II 겔 추출 키트(QIAGEN Inc., Valencia, CA)를 사용하여 대략 19 kb AscI 단편으로서 겔 정제하고, 이들 단편을, AscI-분해되고 포스파타제 처리되고 겔 정제된 pMAK-CL DNA와 연결시켰다. 형질전환체는 Pm 프로모터 및 상부 및 하부 전사 터미네이터와 함께 pDD66 및 pDD1052의 AscI 단편 상에 함유되는 테트라사이클린의 내성에 대해 선별했다. pBR1052 또는 pDD66의 AscI 단편을 함유하는 pMAK-CL의 유도체를 동정하고, 각각 pDD77 및 pDD76으로 명명했다. 이들 플라스미드는 도 8l에 도시되어 있다.
플라스미드 pDD74 및 pDD76을 MSC188에 형질전환시켜 각각 균주 MSC373 및 MSC377을 생성하고, K4 유전자 세트가 염색체 내로 통합된 이들 균주의 유도체를 다음과 같이 수득했다. MSC373 및 MSC377을 LB + 5 ㎍/mL 테트라사이클린(Tc5)에서 30℃로 밤새 성장시키고, 대략 20 μL의 분취량을 스폿팅하고, LB + Tc5 플레이트 내로 스트리킹하여 밤새 41℃에서 배양했다. 이 플레이트 상에 발생한 콜로니를 골라내고, 43℃에서 LB + Tc5 플레이트 상에 재스트리킹했다. 고온에서 플라스미드 함유 항생제 내성의 유지에 대한 선택은 염색체 내로 플라스미드의 재조합에 대해 선택하는데, 이는 pDD74 및 pDD76 플라스미드가 pMAK705 벡터의 유도체로서 복제에 대한 온도 민감성이기 때문이다[참조: Hamilton et al ., J Bact . 1989;171:4617-4622]. 테트라사이클린 상에서 43℃로 성장할 수 있는 MSC373 및 MSC377의 유도체를 30℃에서 LB + Tc5 액체 배지에서 밤새 한번 2차 배양하고, 이어서 30℃에서 LB 액체 배지(테트라사이클린 부재)에서 밤새 한번 2차 배양했다. 이어서, 이들 밤새 배양물을 희석하고, 30℃에서 LB 플레이트 상에 플레이팅하고, 분리된 콜로니를 30℃에서 LB, LB + Tc5 및 LB + 34 ㎍/mL 클로람페니콜(Cm34) 상에 이쑤시개로 찍어 넣었다. 하나의 테트라사이클린 내성(TcR), 클로람페니콜 민감성(CmS) 유도체가 각각의 MSC377 및 MSC373으로부터 동정되었다. 각각 MSC391 및 MSC392로 명명된 이들 TcR, CmS 유도체는 추정의 치환 균주였고, 여기서 재조합은 K4 DNA 서열이 CA 유전자좌에서 염색체에 잔류하는 방식으로 발생하는 반면, 플라스미드 서열의 나머지는 상동성 재조합에 의해 잘려지고 플라스미드가 후속적으로 소실되었다. 이들 분리물의 PCR 분석은 대략 19 kb K4 DNA 단편의 5' 및 3' 말단이 콜란산 유전자좌에 플랭킹하는 염색체 DNA 서열과 관련하여 예상된 위치에 존재함을 보여주었다.
실시예 4에서 상세한 바와 같이, 에스케리키아 콜라이 fhuA 유전자의 상부 및 하부의 DNA 영역을 PCR에 의해 클로닝하고, 조립하고, 서열분석하고, 이러한 결실 단편을 pMAK705 자살 플라스미드로 옮겨 pMAK705-△fhuA 또는 pDD73(도 8m)으로 명명된 fhuA 유전자좌에 대한 치환 벡터를 생성했다. xylS 조절 유전자를 다음과 같이 이 치환 벡터 내로 클로닝시켰다. xylS 유전자를 PstI 단편으로서 pDD42로부터 잘라내고, pDD73의 PstI 부위에 클로닝시켜 pDD77을 생성했고, 이는 도 8n에 도시되어 있다. pDD77의 PstI 단편은 발현 플라스미드 pDD66 및 pBR1052 및 모 벡터 pDD54에 존재하는 xylS 함유 PstI 단편과 동일하다. 상기한 바와 같은 K4 유전자 클러스터 치환 균주, MSC391 및 MSC392를 pDD77에 형질전환시켰다. pDD77에 의한 MSC391 및 MSC392로부터의 각각 2개 분리물을 선별하고 다음과 같이 명명했다:
MSC402 = MSC391 pDD77 "분리물 A"
MSC403 = MSC391 pDD77 "분리물 B"
MSC404 = MSC392 pDD77 "분리물 A"
MSC405 = MSC392 pDD77 "분리물 B"
이들 균주를 모두 콘드로이틴 생합성에 대해 진탕 플라스크에서 시험하였다. 균주를 30℃의 TB 배지 + CM34에서 성장시켜 pDD77 플라스미드의 유지에 대해 선별했다. 대략 0.2의 OD A600에서, 배양물을 2 mM m-톨루엔산(m-TA)의 첨가에 의해 유도했다. 샘플은 유도후 24 및 48시간에서 취하고, 콘드로이틴에 대해 분석했다. 4개의 모든 균주는 콘드로이틴을 생산했다. 이들 분석 결과는 하기 표 8a에 제시되어 있다. 유도된 MSC404 및 MSC405에 대한 콘드로이틴 수준은 MSC402 및 MSC403보다 대략 2.5배 높았다. 이 실험에서, MSC404 및 MSC405는 이들 배양 조건하에 진탕 플라스크에서 MSC279(MSC188 pDD66)으로 통상 관찰된 양(대략 0.5 g/L)의 약 65 내지 70%를 생산했다. 이들 결과는 K4 콘드로이틴 생합성 유전자의 단일 염색체 카피를 함유하는 재조합 에스케리키아 콜라이가 현저한 양의 콘드로이틴을 생산할 수 있음을 나타낸다.
[표 8a]
Figure 112012080180037-pct00019
pBR1052로부터 유도된 균주(MSC404 및 MSC405)는 pDD66으로부터 유도된 균주보다 더욱 생산적인 것처럼 보였지만, 염색체 유전자 세트 둘 다는 콘드로이틴을 생산하기에 충분히 양호하게 작용했다. pBR1052로부터 유래된 염색체 K4 유전자는 kpsF 유전자 바로 상부에 삽입된 Pm 프로모터의 제2 카피를 함유한다. 이러한 부가된 프로모터는 pDD66에서의 발현과 비교하여 플라스미드 pBR1052에서 하부 유전자(kpsFEDUCS)의 발현을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 추가의 Pm 프로모터는 또한 염색체 환경에서 하부 유전자 발현을 증가시키고 이들 유전자의 향상된 발현은 CH 생산을 현저히 증가시킬 수 있다.
다음과 같이 2단계 "팝-인(pop-in)/팝-아웃(pop-out)" 방법을 사용하여 pDD77의 플라스미드-함유(plasmid-borne) xylS 유전자가 fhuA 유전자좌에서 염색체 내로 통합된 MSC403 및 MSC405의 유도체를 수득했다. MSC403 및 MSC405를 LB + Cm34에서 30℃로 밤새 성장시켰다. 이들 배양물을 104배로 희석시키고, 0.1mL 분취량을 43℃에서 LB + Cm34 상에 플레이팅시켰다. 밤새 배양한 후, 상이한 크기의 대략 100개 콜로니를 수득했다. 분리된 콜로니를 골라내고, LB + Cm34 플레이트 상에 스트리킹하고, 43℃에서 밤새 성장시켰다. 이들 플레이팅으로부터 분리된 콜로니를 골라내고, 임의의 항생제 없이 LB의 5 mL 배양물을 접종하는데 사용했다. 이들 배양물을 30℃에서 밤새 성장시키고, 이어서 1000배 희석하여 2회 계대 배양하고, 30℃로 LB에서 밤새 성장시켰다. 이어서, 이러한 3차 계대를 106배로 희석하고, 0.1 mL 분취량을 30℃ 및 37℃에서 LB 상에 플레이팅시켰다. 이들 플레이팅으로부터의 개개 콜로니를 LB 및 LB + Cm34 상에 이쑤시개로 찍어 넣어 플라스미드의 소실을 시험했다. 클로람페닐콜-민감성(CmS) 분리물은 용이하게 수득되었고, 이들을 PCR에 의해 스크리닝하여, xylS 함유 DNA 서열이 fhuA 유전자좌에서 염색체에 유지되면서 플라스미드 서열의 나머지가 잘라져서 플라스미드가 후속적으로 소실되는 방식으로 재조합이 발생하는 목적하는 "팝-아웃" 치환 균주를 동정했다. 이 작업은 또한 에스케리키아 콜라이 염색체로부터 전체 fhuA 유전자를 결실시켰다. 이들 분리물의 PCR 분석은 xylS DNA 단편의 5' 및 3' 말단이 fhuA 유전자좌에 플랭킹하는 염색체 DNA 단편에 대하여 예상된 위치에 존재함을 나타냈다. MSC403로부터 유도된 MSC410 및 MSC405로부터 유도된 MSC411은 fhuA 유전자좌에 삽입된 xylS 유전자를 함유하고, 콜란산 유전자좌에 삽입된 K4 유전자를 보유한다.
MSC410 및 MSC411을 콘드로이틴 생합성에 대해 시험했다. 균주를 30℃로 TB 배지 및 대략 0.2의 OD A600으로 성장시키고, 배양물을 2 mM m-TA의 첨가에 의해 유도했다. 샘플을 유도후 24시간 및 48시간에서 취하고, 콘드로이틴에 대해 분석했다. 하기 표 8b에 제시된 바와 같이, 이들 균주 모두는 매우 낮은 수준의 콘드로이틴을 생산했다.
[표 8b]
Figure 112012080180037-pct00020
이러한 낮은 생산능은 예상치 못한 것인데, 이는 직전 조상 균주가 동일한 배양 조건하에서 필적하는 세포 밀도로 상당량의 콘드로이틴을 생산했기 때문이다. 먼저, 이들 결과는 xylS 유전자의 염색체 삽입이 유도인자 m-TA의 존재하에서도 Pm 프로모터를 활성화시키기에 충분한 양의 SylS 단백질을 생산하지 못하는 것을 나타낼 수 있다. 또는, 이들 균주에서 삽입된 K4 및/또는 xylS 유전자의 추정된 DNA 구조가 정확하지 않을 수도 있다. 상동성 콜란산 유전자좌 및 fhuA 유전자좌 서열에 플랭킹하는 염색체 서열과 관련하여 두 절편의 5' 및 3' 말단의 연결 관계는 PCR에 의해 입증되었다. 그러나, 이들 데이타는 단독으로 이들 균주에서 삽입된 DNA의 정확한 구조 및 서열을 확증하지 못한다. K4 또는 xylS DNA 절편 내의 재배열, 결실 또는 돌연변이가 이들의 개개 CH 생산 모균주(MSC403 및 MSC405)로부터 MSC410 및 MSC411의 유도 과정에서 발생되었을 수 있고, CH 생합성의 손상을 발생시켰을 수 있다.
이들 가설을 시험하기 위해 실험을 수행하였다. 플라스미드 pDD77을 MSC410 및 MSC411에 형질전환시켜 이들 두 균주에서 염색체 K4 유전자의 작용을 시험했다. 생성되는 균주는 MSC436(MSC410 pDD77 "분리물 A"), MSC437(MSC410 pDD77 "분리물 B"), MSC438(MSC411 pDD77 "분리물 A") 및 MSC439(MSC411 pDD77 "분리물 B")로서 명명하였다. 이들 균주는 30℃의 TB 배지 및 대략 0.2의 OD A600으로 성장시키고, 배양물은 2 mM m-TA의 첨가에 의해 유도했다. 샘플은 유도후 24 및 48시간에서 취하고, 콘드로이틴에 대해 분석했다. 하기 표 8c에 제시된 바와 같이, 이들 4개 균주는 이들의 선조 균주 MSC403 및 MSC405에서 관찰된 역가와 매우 유사하고 이들의 직전 조상 균주 MSC410 및 MSC411보다 훨씬 높은 콘드로이틴의 현저한 역가를 생성했다. 이들 결과는 균주 MSC410 및 MSC411에서 콘드로이틴 생합성의 결함은 K4 콘드로이틴 생합성 유전자 자체로부터 발생하지 않음을 나타냈다.
[표 8c]
Figure 112012080180037-pct00021
이들 발견은 균주 MSC410 및 MSC411에서 콘드로이틴 생합성이 낮을 수 있음을 시사하며, 이는 (각각 MSC403 및 MSC405로부터) MSC410 및 MSC411의 생성 동안 발생할 수 있는 유전자 코딩 서열의 일부 구조적 오차로부터 발생하는 XylS 단백질 기능의 결함에 기인하거나, xylS 유전자 서열은 정확할 수 있지만 이들 작제물에서 염색체 xylS 유전자의 발현 수준이 K4 유전자의 최적 발현을 달성하는데 불충분할 수 있기 때문임을 제안한다.
MSC410 및 MSC411의 염색체 중 xylS 유전자를 이들 가설을 시험하기 위해 서열분석했다. xylS 유전자 삽입을 함유하는 에스케리키아 콜라이 염색체의 영역은 통합 부위의 측면에 위치하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고, 증폭된 DNA 절편을 서열분석했다. xylS 프로모터 및 코딩 영역의 서열은 예상된 서열과 정확히 일치했다. 이 결과는 MSC410 및 MSC411에서 xylS 기능의 결함이 염색체 유전자로부터의 XylS 단백질의 불충분한 발현에 기인함을 시사했다. 따라서, xylS 유전자의 발현을 향상시키기 위해 실험을 수행하였다. 이를 위해, xylS 유전자 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 5' 비해독된 영역(UTR)의 합성 최적화 버젼을 설계 및 합성했고, 이들 변형된 서열을 xylS 치환 벡터 pDD77 및 이어서 염색체로 도입했다.
합성된 단편은 pDD77의 BlpI-PstI 서열과 일치하는 134bp의 서열, 이어서 xylS의 ATG 개시 코돈까지의 86bp의 합성 서열을 함유하고, 유일한 BglII 부위를 통해 xylS 코딩 서열 내로 추가로 37bp 연장한다. ATG로부터 BglII 부위까지의 서열은 pDD77에 존재하는 서열과 일치한다. BlpI-BglII 단편은 pDD77 내로 용이하게 도입될 수 있는데, 이는 이들 제한 부위가 이 플라스미드에서 유일하기 때문이다. 86bp 합성 서열(하기 제시됨)(서열 번호 98)은 컨센수스 에스케리키아 콜라이 프로모터[참조: Hawley and McClure, Gene 1983;11:2237-2255.] 및 컨센수스 샤인-달가노(Shine-Dalgarno)(S-D) 서열[참조: Shine and Dalgarno Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1974;71:1342-6]을 포함한다. 당해 서열은 또한 예상된 mRNA의 5' 말단에 스템-루프(stem-loop) 구조(밑줄친 문자로 나타냄)를 도입한다. 이들 특징 모두는 XylS 단백질의 충분한 발현을 촉진시킬 것으로 예상된다.
Figure 112012080180037-pct00022

BlpI-BglII 단편(서열 번호 140)은 상업적 판매자(DNA2.0)에 의해 합성되었고, 변형된 서열을 함유하는 합성 DNA는, 천연 xylS 조절 서열을 함유하는 천연 BlpI-BglII 단편 대신에 BlpI-BglII 단편으로서 xylS 치환 벡터, pDD77 내로 클로닝되었다. 변형된 xylS를 함유하는 플라스미드(pDD79(도 8n)로 명명됨)는, Pm 프로모터를 활성화시키고 콘드로이틴 생산을 유도하는 변형된 xylS 유전자의 능력을 시험하기 위해 MSC392 내로 형질전환시켰다. pDD79를 함유하는 3개 MSC392 형질전환체를 골라내고, MSC458, MSC459 및 MSC460으로 지정했다. 이들 균주는, MSC392 모체와 함께, 표준 진탕 플라스크 실험으로 콘드로이틴 생산에 대해 시험했다. 균주를 30℃에서 TB 배지(MSC392) 또는 TB + Cm34(MSC458-460)에서 성장시키고 대략 0.2의 OD A600에서 배양물을 2 mM m-TA의 첨가에 의해 유도했다. 샘플은 유도후 24, 48 및 72시간에서 취했다. 48시간 샘플을 콘드로이틴에 대해 분석했다. pDD79 함유 균주 모두는 유도된 및 비유도된 배양물 둘 다에서 대략 300 ㎍/mL를 생산했다. 대조적으로, xylS 유전자를 결여하는 MSC392는 유도된 및 비유도된 배양물 둘 다에서 4 ㎍/mL 콘드로이틴만을 생산했다. 이들 결과는 하기 표 8d에 제시되어 있다.
[표 8d]
Figure 112012080180037-pct00023
대략 300 ㎍/mL 콘드로이틴의 관찰된 값은, 플라스미드 pDD77 상에 천연 xylS 유전자를 함유하는 MSC405 및 MSC438의 유도된 배양물에서 관찰된 역가와 유사하다. 그러나, MSC458, MSC459 및 MSC460의 비유도된 및 유도된 배양물 둘 다는 실질적으로 동등한 CH 역가를 생성했다. 이 결과는 pDD79의 변형된 xylS 유전자에 의한 XylS의 증가된 생산과 일치하며, 이는 XylS의 과생성이 임의의 첨가된 유도인자의 부재하에 Pm 프로모터를 활성화시키는 것으로 보고되었기 때문이다[참조: Dominguez-Cuevas et al ., J. Bact . 2008;190:3118-3128.].
염색체 내로 삽입되는 경우, 변형된 xylS 유전자의 기능성을 시험하기 위해, 상기 실시예 3에 상세한 바와 같이 2단계 "팝-인/팝-아웃" 방법을 사용하여 pDD79의 플라스미드-함유 xylS 유전자가 fhuA 유전자좌에서 염색체 내로 통합된 MSC459의 유도체를 수득했다. MSC459를 30℃로 LB + 34 ㎍/mL 클로람페니콜(Cm34)에서 밤새 성장시키고, 43℃에서 LB + Cm34 상에 플레이팅시켰다. 밤새 배양한 후, 분리된 콜로니를 골라내고, LB + Cm34 상에 스트리킹시키고, 43℃에서 다시 밤새 성장시켰다. 이들 플레이팅으로부터 분리된 콜로니를 골라내고, 콜로니 PCR에 의해 시험하여 염색체 내로 플라스미드의 통합을 확인했다.
PCR에 의해 양성으로 시험된 2개 콜로니를 사용하여, 임의의 항생제 없이 LB의 5 mL 배양물을 접종시켰다. 이들 배양물을 30℃에서 밤새 성장시키고, 이어서 1000배 희석하여 계대하고, 30℃로 LB에서 밤새 성장시켰다. 이어서, 이들 배양물을 106배 희석하고, 0.1 mL 분취량을 37℃에서 LB 상에 플레이팅했다. 이들 플레이팅으로부터의 개개 콜로니를 LB 및 LB + Cm34 상에 이쑤시개로 찍어 넣어 플라스미드의 소실에 대해 시험했다. 클로람페니콜 민감성(CmS) 분리물은 용이하게 수득되었고, 각 배양물로부터 이러한 6개 분리물을 PCR에 의해 스크리닝하여, xylS 함유 DNA 서열이 fhuA 유전자좌에서 염색체 중에 잔류하면서 플라스미드 서열의 나머지가 잘려나가 플라스미드가 소실되는 방식으로 재조합이 발생한 목적하는 "팝-아웃" 치환 균주를 동정했다. 이 결과는 에스케리키아 콜라이 염색체로부터 전체 fhuA 유전자를 결실시켰다. 이들 분리물의 PCR 분석은 xylS DNA 단편의 5' 및 3' 말단이 fhuA 유전자좌의 측면에 위치하는 염색체 DNA 서열과 관련하여 예상된 위치에 존재함을 나타냈다. MSC459로부터 유도된 이러한 2개 균주, MSC466 및 MSC467은 이제 fhuA 유전자좌에 삽입된 xylS 유전자(합성 프로모터를 가짐) 및 콜란산 유전자좌에 삽입된 K4 유전자를 보유한다.
MSC466 및 MSC467을 진탕 플라스크에서 콘드로이틴 생합성에 대해 시험했다. 균주는 30℃의 TB 배지에서 성장시키고 대략 0.2의 OD A600에서 배양물을 0, 1, 2 또는 4 mM m-TA의 첨가에 의해 유도했다. 샘플은 유도후 24, 48 및 72시간에서 취했다. 48시간 샘플로부터의 콘드로이틴 분석 데이타는 하기 표 8e에 제시되어 있다. 두 균주는, 1 또는 2 mM m-TA로 유도하는 경우, 콘드로이틴의 상당한 역가(> 400 ㎍/mL)를 생성했다. 4 mM m-TA로 유도된 배양물은 다소 낮은 콘드로이틴 역가를 생성했다. 비유도된 배양물은 보다 적은 양의 콘드로이틴, 대략 160 내지 170 ㎍/mL를 생성했다. 이들 결과는, 합성 프로모터 및 최적화된 리보솜 결합 부위 및 5' UTR 헤어핀 구조를 갖는 변형된 xylS 유전자가 천연 xylS 유전자보다 효율적으로 발현되어, Pm 프로모터에 의한 K4 콘드로이틴 생합성 유전자의 전사 자극시에 더욱 효과적이라는 가설과 일치한다. 염색체 균주 MSC467 및 MSC466은 K4 콘드로이틴 생합성 유전자 또는 조절 xylS 유전자를 함유하는 어떠한 플라스미드도 포함하지 않고, 둘 다 상당량의 콘드로이틴을 생성할 수 있다.
[표 8e]
Figure 112012080180037-pct00024
MSC467은 염색체 K4 유전자 클러스터의 kpsS 유전자의 바로 하부(3')의 염색체에 삽입된, pDD74(도 8l 참조)로부터 유도된 테트라사이클린 내성 유전자를 함유한다(도 8t 참조). 특정 플라스미드의 도입 및 유지를 위한 선별로서 플라스미드-함유 유전자에 의해 인코딩된 테트라사이클린 내성을 사용하기 위해, 이러한 염색체 테트라사이클린 내성 유전자를, 하기 상세한 바와 같이, 실시예 3에 기재된 "팝-인/팝 아웃" 방법을 사용하여 MSC467의 염색체로부터 결실시켰다. MSC467의 생성된 테트라사이클린 민감성 유도체는 MSC561로서 지정했다. MSC561의 작제는 다음과 같이 수행했다.
MSC467 및 pDD74에서 tetR 유전자의 바로 하부의 염색체 서열의 대략 900 염기쌍을 주형으로서 pDD74 DNA 및 프라이머 BLR476 및 BLR478을 사용하여 증폭시켰다:
BLR476 5> CGTCAAGCTTGTGAACGCCTATAGCAGCTTG >3 (서열 번호 101)
BLR478 5> CAGTGGCGCGCCGAGCGATGATAAGCTGTC >3 (서열 번호 102)
생성된 PCR 생성물을 HindIII 및 AscI으로 분해시키고, HindIII 및 AscI로 분해시켜 판매자 프로토콜에 따라 안타르틱 포스파타제(New England BioLabs, 미국 메사추세츠주 입스위치 소재)로 처리한 pMAK-CL(실시예 3 및 도 8l에 기재됨)에 연결시켰다. 연결 생성물을 에스케리키아 콜라이 NEB5α(New England BioLabs, 미국 메사추세츠주 입스위치 소재)로 형질전환시키고, 생성 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 진단 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해, 클로닝된 PCR 단편의 존재에 대해 스크리닝했다. 이러한 하나의 형질전환체로부터의 재조합 플라스미드를 pBR1087로 지정하고, 유전자 치환 실험에 사용하여 MSC467 염색체로부터 tetR 유전자를 결실시켰다. pBR1087의 구조는 도 8u에 도시되어 있다. 이 플라스미드를 30℃(mPAK705 기반 레플리콘의 복제에 허용되는 온도)에서 클로람페니콜 내성에 대해 선택하면서 MSC467로 형질전환시켰다. 이어서, 30℃에서 성장시킨 배양물을 34 ㎍/mL(Cm34)의 클로람페니콜의 존재하에 43℃에서 플레이팅시키고, 생성된 콜로니를 골라내고, 43℃에서 LB + Cm34 플레이트 상에 스트리킹시켰다. 생성된 콜로니는 표적 유전자좌에서 pBR1087의 통합에 대해 PCR에 의해 스크리닝하고, 당해 유전자좌에서 통합된 플라스미드 서열을 함유하는 것으로 동정된 분리물은 클로람페니콜의 부재하에 30℃에서 LB 액체 배지에서 2차 배양했다. 이어서, 이렇게 2차 배양된 분리물은 클로람페니콜의 부재하에 30℃에서 LB 상에 플레이팅시키고, 생성된 콜로니는 클로람페니콜 및 테트라사이클린에 대한 민감성에 대해 시험했다. 통합된 플라스미드가 잘려진 결과로서 tetR 유전자가 결실되어 있는 클로람페니콜 민감성, 테트라사이클린 민감성 유도체인 추정의 유전자 치환 균주가 수득되었고, 이러한 추정의 염색체 구조를 확인하기 위해 PCR에 의해 스크리닝했다.
tetR 유전자가 결실된 것으로 동정된 하나의 균주는 MSC561로서 지정했고, MSC561의 염색체 K4 유전자 클러스터의 구조는 도 8t에 제시되어 있다. 당해 결실은 kpsS 코딩 서열 하부의 71 bp로부터 콜란산 유전자좌 하부 서열의 5' 말단의 AscI 부위까지이다. 당해 결실은 전체 tetR 유전자를 포함한다.
실시예 11
본 실시예는 영역 1 및 3 유전자에 대한 K4 영역 2 유전자(kfoABCFG)의 유전자 용량을 증가시키면 에스케리키아 콜라이 K-12 진탕 플라스크 배양물에서 상당히 더 많은 콘드로이틴 생산을 유도한다는 것을 입증한다.
에스케리키아 콜라이 K-12 균주 MSC467(실시예 10)은 Pm 프로모터의 조절하에 콜란산 유전자좌에서 영역 1, 2 및 3을 그리고 합성 컨센수스 프로모터의 조절하에 fhuA 유전자좌에서 xylS를 함유한다. 플라스미드 pCX039(실시예 4)는 Pm 프로모터의 조절하에 영역 2 kfoABCFG 유전자를 함유하고, 또한 천연 xylS 유전자를 함유한다. pCX039는 균주 MSC499를 생성하기 위해 MSC467로 형질전환시켰다. 대조군 균주 MSC498은 pDD63(실시예 4)을 MSC467로 형질전환시켜 생성했다. 가변성 유도인자 농도를 갖는 진탕 플라스크 배양물(TB/Cm34 배지, 30℃, 72hr) 중에서 콘드로이틴 생산을 이러한 두 균주에 대해 측정했다(표 9a).
[표 9a]
Figure 112012080180037-pct00025
이들을 플라스미드 상에 제시함으로써 영역 2 유전자 용량을 증가시키면 명백하게 높은 콘드로이틴 생산을 유도했다. 비교적 높은 수준의 생산은 유도 없이 균주 MSC499에서 나타났다. 이는 아마 MSC499 염색체 중에 존재하는 변형된 xylS 유전자의 향상된 발현에 기인하는 K4 유전자의 비유도 발현에 기인하였다. 상기 주목된 바와 같이, 높은 수준의 XylS 단백질은 첨가된 유도인자의 부재하에서도 Pm 프로모터를 활성화시킬 수 있다고 공지되었다[참조: Dominguez-Cuevas et al., 2008]. 추가의 플라스미드-인코딩된 XylS가 이 플라스미드 시스템 중에서 최적의 콘드로이틴 생산에 필요한지의 여부를 측정하기 위해, xylS 유전자가 결실된 플라스미드 pDD63 및 pCX039의 유도체를 작제했다. 이들 플라스미드는 각각 1049 bp 단편 내의 전체 xylS 유전자 코딩 서열의 측면에 위치하는 2개의 Nsi I 제한 부위를 함유한다(참조: 실시예 4). 이러한 플라스미드의 샘플을 NsiI로 분해시키고, 효소를 불활성화시키기 위해 가열 처리한 다음, T4 DNA 리가아제로 처리하여 xylS 유전자 단편이 결여된 환상 플라스미드를 생성하였다. pDD63ΔNsi를 먼저 에스케리키아 콜라이 MSC188(실시예 3)로 형질전환시켰다. 특성화된 pDD63ΔxylS 플라스미드는 pCX069라 명명했다. 이 플라스미드를 후속적으로 에스케리키아 콜라이 MSC467(실시예 10)로 형질전환시켜 균주 MSC510을 생성시켰다. pCX039ΔNsi 샘플을 직접 MSC467로 형질전환시키고, 특성화된 ΔxylS 플라스미드를 pCX074라 명명했다. 이들 균주 + MSC498 및 MSC499 대조군 균주에 의한 콘드로이틴 생산은 본 실시예에서 이미 기술된 바와 같이 측정하였고, 결과는 표 9b에 제시된다.
[표 9b]
Figure 112012080180037-pct00026
pCX039로부터 xylS의 결실은 생산된 콘드로이틴의 최대량을 감소시키지 않았지만, 높은 유도인자 수준이 최고 수준을 달성하는데 필요했고, 표 9b에서 MSC511 대 MSC499를 참조한다. 이 결과는 XylS 수준, 유도인자 수준, K4 유전자 보충 및 콘드로이틴 생산능의 상호관련성을 예시한다.
상기 실시예 4는 fhuA 유전자좌에서, 모두 합성 컨센수스 프로모터로부터 발현된, xylS 및 영역 2 kfoABCFG 유전자의 에스케리키아 콜라이 염색체로의 삽입용으로 설계된 pMAK705-기반 치환 플라스미드인 플라스미드 pDD80 유도를 기술한다. 하기 표 9c는 과잉 염색체 요소로서 pDD80을 함유하는 MSC467(염색체 xylS) 및 MSC392(xylS 없음) 균주(실시예 10)에서 콘드로이틴 생산을 기술한다.
[표 9c]
Figure 112012080180037-pct00027
pCX039를 사용하는 경우와 유사하게, 플라스미드 pDD80은 K4 콘드로이틴 생합성 유전자(영역 1, 2 및 3)의 전체 보충의 염색체 카피를 함유하는 에스케리키아 콜라이 숙주 균주에서 콘드로이틴 생산을 향상시켰다. 유도는 염색체 중에 xylS 카피의 존재 또는 부재와 무관하게 pDD80을 함유하는 균주에서 콘드로이틴 생산에 대해 거의 효과가 없었다. 이는 아마도 강한 합성 프로모터에 의해 유도되고, mRNA 5-프라임 말단에 첨가된 최적화된 리보솜 결합 부위 및 헤어핀 구조를 함유하는 변형된 xylS 유전자의, 다중카피 플라스미드로부터의, 발현에 기인하는, 이들 균주에서의 비교적 높은 수준의 XylS의 결과이다.
실시예 12
본 실시예는 균주 MSC467 의 염색체에 kfo ABCFG 유전자의 단일 추가 카피의 부가가 콘드로이틴 생산을 증가시킴을 입증한다.
상기 실시예 11은 진탕 플라스크 중에서 균주 MSC467에 의한 콘드로이틴 생산이 Pm 프로모터의 조절하에 K4 영역 2 유전자 kfoABCFG의 과잉 카피를 플라스미드 pCX039 상의 MSC467에 도입시킬 경우에 크게 향상되었다는 것을 입증한다. 유사한 결과가 플라스미드 pDD80을 MSC467에 도입할 경우에 수득되었다. 실시예 4에 기술된 플라스미드 pDD80은 상기 실시예 10에 기술된 합성 xylS 프로모터의 전사 조절하에 kfoABCFG 유전자를 함유한다. 이들 결과는 kfoABCFG 유전자로 인코딩된 하나 이상의 단백질의 수준을 증가시키면 콘드로이틴 생산을 상당히 증가시킨다는 것을 나타낸다. 다중-카피 플라스미드 상에서 이들 유전자의 클로닝은 이들 단백질의 생산을 증가시키는 하나의 방법을 제공한다. 플라스미드 발현 플랫폼을 사용하지 않고 이러한 단백질의 생산을 증가시키는 또 다른 방법은 이들 유전자의 다수의 카피를 숙주 유기체의 염색체에 삽입시키는 것이다.
kfoABCFG 유전자 세트의 제2 카피를 합성 xylS 프로모터의 전사 조절하에, 변형된 xylS 유전자의 바로 하부의, fhuA 유전자좌에서 MSC467의 염색체로 삽입했다. 이러한 목적을 위해 치환 벡터를, 실시예 4에 상세한 바와 같이 pDD79의 양립성 NsiI 내로 pCX039로부터 분해된 PstI 단편 상의 kfoABCFG 유전자를 클로닝함으로써 작제했다. 생성되는 플라스미드, pDD80에서, kfoABCFG 유전자는 강한 구성적 프로모터인 것으로 설계된 합성 xylS 프로모터에 의해 전사된다. pDD80을 MSC467로 형질전환시켜 상기 실시예 10에서 진탕 플라스크에서 약 1g/L 콘드로이틴을 생산하는 것으로 밝혀진 균주 MSC522를 제조했다. 치환 균주(MSC537)는 상기 실시예 3 및 실시예 10에 상세한 바와 같은 pMAK705-기본 플라스미드 치환 공정을 통해 MSC522로부터 유도했다. 이 균주는 MSC467 염색체 중에 xylS 유전자의 바로 하부의, fhuA 유전자좌에서 삽입된 kfoABCFG 유전자의 하나의 추가의 카피를 보유한다.
MSC537을 콘드로이틴 생산에 대해 MSC467과 병행하여 시험했다. 배양물을 30℃로 TB 배지에서 0.01 OD A600에서 접종시켰다. 약 0.10의 OD에서, 배양물을 1 mM m-TA를 첨가하여 유도하였고, 추가의 72시간 동안 배양시켰다. 샘플을 유도후 48시간 및 72시간에 콘드로이틴 분석용으로 취했다. 유도후 72시간에서 MSC537은 0.57 g/L의 콘드로이틴을 생성한 반면, MSC467은 0.45 g/L를 수득했고; MSC 467에 대해 MSC537의 경우 약 25% 증가했다. 추가의 양태에서, MSC537 및 MSC467을 진탕 플라스크에서 콘드로이틴 생산에 대해 동시에 시험했을 경우, MSC537이 일관적으로 MSC467보다 많은 콘드로이틴(20 내지 30%)을 생산했다. 이 결과는 K4 영역 2 유전자 kfoABCFG의 단일 추가 카피를 MSC467 염색체에 부가하면, kfoABCFG 유전자의 다중 카피의 부가가 균주 MSC499 및 MSC522 중의 콘드로이틴 생산을 증가시키는 정도와 동일하지는 않지만 콘드로이틴 생산을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 다중-카피 플라스미드 상에 클로닝된 kfoABCFG 유전자를 함유하는 이들 두 균주는 MSC467보다 약 2배 이상의 콘드로이틴을 생산한다(참조: 실시예 10). 플라스미드 pCX039를 MSC537로 형질전환시켜 균주 MSC551을 생성했다.
MSC467과 같이, MSC537 균주는 MSC537에 존재하는 염색체 K4 유전자 클러스터의 kpsS 유전자의 바로 하부(3')에서 염색체에 삽입된 pDD74(참조: 도 8l)로부터 유래된 테트라사이클린 내성 유전자를 함유한다. 상기 주목된 바와 같이, 일부 양태에서, 균주가 테트라사이클린 민감성인 것이 바람직하다. 따라서, tetR 유전자는 동일한 공정 및 MSC467의 염색체로부터 tetR 유전자를 결실시키기 위한 실시예 10에서 상기 기재한 바와 같은 치환 플라스미드(pBR1087)를 사용하여 MSC537의 염색체로부터 결실시켰다. 생성되는 MSC537의 테트라사이클린-민감성 유도체는 MSC562로 지정했다. 진탕 플라스크 실험에서, MSC562 및 MSC537를 30℃에서 TB 배지에서 성장시켰고, 1 mM의 m-TA를 첨가하여 유도했다. 유도 후 72시간에서 수거한 배양 샘플의 콘드로이틴 역가를 측정하고, MSC562의 경우 0.51 g/L 대 MSC537의 경우 0.57 g/L로 서로 견줄만한 것으로 밝혀졌다.
도 8q에 도시된 바와 같은 kfoABCFG 유전자를 함유하는 플라스미드 pCX039, 및 도 8i에 도시된 백터-단독 대조군 플라스미드 pDD63을 균주 MSC562 내에 형질전환시켜 각각 MSC564 및 MSC563을 생성했다. 진탕 플라스크 실험에서, MSC563 및 MSC564를 플라스미드 선별을 위해 테트라사이클린 함유 TB 배지(5㎍/mL)에서 30℃로 성장시키고, 1 mM m-TA로 유도했다. 유도후 72시간에서, MSC564 및 MSC563의 배양물은 각각 0.81g/L 및 0.29 g/L의 역가의 콘드로이틴을 생성했다.
배양물이 테트라사이클린의 존재하에 성장된 이 실험에서, MSC564에서 pCX039의 플라스미드 보유가 매우 효율적이었다. MSC564의 72시간 배양물로부터의 샘플을 희석시키고, LB 플레이트 및 5㎍/mL 테트라사이클린을 함유하는 LB 플레이트 상에 플레이팅시켰다. 콜로니 형성 단위(CFU)의 역가는 이들 두 플레이팅 조건하에 유의하게 상이하지 않았다: LB 상의 1.16 x 109 CFU/mL 대 LB + 테트라사이클린 상의 1.28 x 109 CFU/mL. 따라서, 이 실험 조건하에, 어떤 플라스미드의 소실도 검출되지 않았다.
kfoABCFG 유전자의 추가 카피의 MSC537의 염색체로의 후속적인 부가는 이 균주에서 콘드로이틴 생산을 추가로 증가시킬 것으로 기대된다. 이들 유전자의 추가의 카피는 실시예 3에 상세한 유전자 표적화 공정을 사용하여 기타 염색체 유전자좌에 삽입시킬 수 있다. 이들 유전자의 통합을 위한 추가의 부위로서 작용할 수 있는 광범위한 종류의 비필수 유전자좌가 에스케리키아 콜라이에서 공지되었다. 또한, kfoABCFG 유전자 세트의 둘 이상의 카피로 구성된 직렬 어레이를 유전자 치환 플라스미드 상에서 작제하여 단일 유전자 치환 사건으로 염색체에 도입할 수 있었다.
또한, kfoABCFG 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 생산을 증가시키는 추가의 방법은 단백질 코딩 서열의 코돈 최적화, 및 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 이들 유전자의 mRNA의 5-프라임 비해독 영역의 최적화를 포함한다. 이러한 서열 최적화는 플라스미드 벡터로부터 발현된 유전자 및 염색체에 삽입된 유전자에 적용할 수 있었다.
실시예 13
본 실시예는 플라스미드 벡터 및 염색체 통합을 사용하여 잔토모나스 캄페스트리스로의 콘드로이틴 생합성 유전자의 도입을 기재하고, 진탕 플라스크 중에서 잔토모나스 캄페스트리스에서 재조합 DNA 매개된 콘드로이틴 생합성을 입증한다.
구체적으로, K4 생합성 유전자의 조합물을 함유하는 플라스미드의 작제 및 잔토모나스 캄페스트리스 균주 MSC255로의 이들의 도입이 본원에서 기재된다. 콘드로이틴 생합성 유전자 및 이의 서브세트를 크산탄 검 오페론의 결실 부위에서 잔토모나스 캄페스트리스 균주 MSC255 염색체에 안정하게 삽입하기 위한 플라스미드 pKM001 및 pKM002(실시예 3에 기술됨)의 유도체의 용도가 추가로 기술된다.
과잉 염색체 요소로서 콘드로이틴 생합성 유전자의 잔토모나스 캄페스트리스로의 도입
본 발명자들은 거대한 플라스미드를 에스케리키아 콜라이 공여체로부터 직접(예: 삼조 크로스를 통해) 또는 에스케리키아 콜라이 균주로부터 정제된 플라스미드로서(예: 전기천공을 통해 - 이하 참조) 잔토모나스 캄페스트리스에 도입하면, 잔토모나스 캄페스트리스 중의 생성되는 플라스미드에서 구조적 변칙성을 유도할 수 있다는 것을 발견했다. 비교적 작은 플라스미드는 이 현상에 덜 민감한 것으로 나타나고, 이는 거대한 DNA 분자에 비교적 큰 효과를 갖는 잔토모나스 캄페스트리스에 고유한 제한 시스템에 기인할 수 있다[참조: Feyter and Gabriel, J. Bact. 1991;173:6421-6427, da Silva et al., Nature 2002;417:459, Roberts et al., Nuc. Acid Res. 2010;38:D234]. 본 발명자들은 이 효과를 성공적으로 극복한 두 접근법을 사용했다. 하나의 접근법에서, 영역 1, 2 및 3 유전자를 포함하는 거대한 플라스미드를 잔토모나스 캄페스트리스 형질전환체로부터 정제된 작은 플라스미드로부터 재작제하였다. 제2 접근법에서, 영역 1, 2 및 3 유전자를 두(소형) 적합성 플라스미드 사이에서 분할하였다.
전기천공을 사용하여 플라스미드를 잔토모나스 캄페스트리스 세포에 도입했다[참조: Oshiro et al, J. Microbiol. Method 65:171-179, 2006]. 플라스미드 pDD67(실시예 4에 기술됨)을 제한 효소 BamHI 및 RsrII(이는 영역 2 유전자에 결합됨)로 분해하고, 이어서 (블런트 말단을 생성하기 위해) T4 DNA 폴리머라제와 반응시키고 연결시켰다. 생성되는 혼합물을 에스케리키아 콜라이로 형질전환시키고, 테트라사이클릭-내성 분리물을 특성화했다. 이어서, Pm 구동된(driven) 영역 1 및 3 유전자를 함유하는, 도 10a에 도시된 생성되는 플라스미드, pKM005를 전기천공에 의해 잔토모나스 캄페스트리스로 형질전환시켜 균주 MSC338을 생성했다. 또한, pCX039(실시예 4)를 잔토모나스 캄페스트리스로 형질전환시켜 MSC326을 생성했다. MSC338로부터 정제된 플라스미드 pKM005, 및 MSC326으로부터 정제된 pCX039를 각각 HindIII + AvrII로 분해시키고, pKM005로부터 영역 1, 3 단편을 pCX039의 벡터/영역 2 단편과 연결시켰다. 생성되는 혼합물을 테트라사이클린-내성에 대한 선별과 함께 MSC255로 직접 형질전환시켰다. 하나의 잔토모나스 캄페스트리스 형질전환체, MSC348은 에스케리키아 콜라이로 역 이전되었던 플라스미드의 제한 분해에 의해 pDD67로부터 구별되지 않는 플라스미드 pKM007(도 10a)을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 대조군 목적으로, 잔토모나스 캄페스트리스 균주 MSC255를 pDD63 벡터로 형질전환시켜 균주 MSC397을 생성했다.
플라스미드 pJAK15(ATCC77290, ATCC로부터 수득)는 IncQ 부적합성 그룹에 속하고, 카나마이신 내성을 인코딩한다. pKM005(Pm-구동 영역 1 및 3 함유; 상기 참조)로부터의 HindIII/AvrII 단편을 pJAK15로부터의 벡터/카나마이신 내성 HindIII/XbaI 단편과 연결시켰다. 도 10b에 도시된 바와 같은 생성되는 플라스미드 pKM006은 각종 pBHR1-유래 플라스미드와 양립성인 벡터 상에 유도성 영역 1 및 3 유전자를 함유한다. 균주 MSC326(MSC255 pCX039)을 카나마이신 및 테트라사이클린 내성에 대해 동시 선택성을 가진 pKM006으로 형질전환시켜 균주 MSC350을 생성했다.
AscI, SbfI, SwaI 및 XhoI 클로닝 부위를 함유하는 짧은 DNA 올리고뉴클레오티드 링커를 pKM001 및 pKM002에서 상동성의 상부 및 하부 영역의 접합부를 규정하는 NotI 제한 부위에 도입시켜 녹-아웃 벡터 pKM001 및 pKM002를 먼저 변형시켰다. 링커는, pKM001 및 pKM002의 NotI 분해에 의해 생성된 것들과 양립성인 일본쇄 오버행이 존재하도록, 어닐링된 올리고뉴클레오티드 prKM015 및 prKM016으로부터 제조하였다. 각각 pKM008 및 pKM009로 지정된 생성 플라스미드는, AscI 제한 부위가 상부 영역에 인접하도록 배향된 링커를 함유한다.
Figure 112016019550472-pct00166
K4 영역 2 유전자(kfoA, kfoB, kfoC, kfoF 및 kfoG)만을 갖는 치환 벡터는 다음과 같이 작제했다: pKM008을 SbfI-XhoI 또는 AscI-XhoI로 분해시키고, pCX039를 SbfI-SalI 또는 AscI-SalI로 분해시켰다. SbfI-SalI 처리는 pCX039로부터 kfoABCFG-함유 단편을 생산하고, AscI-SalI 처리는 Pm 프로모터-kfoABCFG-함유 단편을 생산한다. 이들 단편은, 먼저 SbfI-XhoI 또는 AscI-XhoI로 분해시킨 pKM008로 클로닝하여 각각 플라스미드 pKM010(kfoABCFG: Pm-) 및 pKM011(kfoABCFG: Pm+)을 생성하였다. 플라스미드 pKM010(서열 번호 145) 및 pKM011(서열 번호 146)를 사용하여, K4 영역 3(kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC 및 kpsC) 및 영역 1(kpsM 및 kpsT) 유전자를 또한 도입한 추가의 치환 벡터를 작제했다. pKM010 및 pKM011를 SbfI-AvrII로 분해시키고, 선형화된 이들 벡터를 pDD67의 SbfI-AvrII 분해에 의해 생산된 kpsFEDUCSMT-함유 단편과 연결시켰다. 생성된 플라스미드를 pKM012(Pm-) 및 pKM013(Pm+)로 지정했다. 플라스미드 pKM010(서열 번호 145) 및 pKM012(서열 번호 147)의 유도체화는 도 10c에 도시되어 있다. 플라스미드 pKM011(서열 번호 146) 및 pKM013(서열 번호 148)의 유도체화는 도 10d에 도시되어 있다.
pKM008 - pKM013 작제물 모두에 클로닝된 크산탄 검 유전자 클러스터의 상부 영역은 gum 유전자 클러스터 프로모터를 포함하는 것으로 보고되어 있다[참조: Federico et al; J. Bact. 1996;178:4313-4318]. 따라서, 염색체 내로 재조합된 pKM010 또는 pKM012로부터 유래된 서열을 함유하는 잔토모나스 캄페스트리스 균주는 내인성 gum 프로모터로부터 K4 유전자를 전사할 것으로 예상된다. 대조적으로, pKM011 및 pKM013은 gum 프로모터 및 Pm 프로모터 사이에 위치된 터미네이터 서열(pDD67로부터 유래됨)을 갖는다. 따라서, pKM011 또는 pKM013 서열을 함유하는 재조합 잔토모나스 캄페스트리스에서 K4 유전자의 발현은 Pm/XylS 시스템에 의해 조절될 것으로 예상된다.
각각의 이들 치환 플라스미드에 있어서, (결실된) gum 유전자좌에서 잔토모나스 캄페스트리스 균주 MSC255의 염색체 내로 각 K4 유전자를 재조합하기 위해 (상기 상세한) "팝-인/팝-아웃" 방법을 사용하였다. 당해 플라스미드를 테트라사이클린 내성의 선별과 함께 전기천공에 의해 MSC255 내로 도입시켰다. 중간 및 최종 균주는 하기 표 10a에 제시되어 있다. gum 유전자좌에서 "팝-인"이 발생한 재조합체를 PCR에 의해 동정하였다. 통합체의 분리(resolution)는 항생제 선택의 부재하에 배양함으로써 발생했고, 이어서 테트라사이클린 민감성("팝-인") 유도체를 동정하였다. 이어서, PCR을 사용하여, 각각의 K4 유전자 클러스터가 목적하는 배향으로 gum 유전자좌 내로 성공적으로 통합된 "팝-아웃" 유도체를 동정했다. 이어서, 플라스미드 pDD63(xylS 유도인자 유전자를 함유)를, Pm 프로모터가 K4 유전자 세트를 구동하는 재조합체 내로 형질전환시켰다. 4개 주요 잔토모나스 염색체 삽입 균주(플라스미드 인코딩된 K4 유전자를 함유하지 않음)인, MSC480, MSC469, MSC461 및 MAC494의 유전자 구조는 표 10a에 요약되어 있다.
[표 10a]
Figure 112012080180037-pct00029
재조합 잔토모나스 캄페스트리스의 진탕 플라스크에서의 콘드로이틴 생산
달리 언급하지 않는 한, 콘드로이틴 생산의 평가를 위한 진탕 플라스크에서의 잔토모나스 캄페스트리스 균주의 성장은 YMG 배지(5g/L 프로테오스 펩톤, 3 g/L 효모 추출물, 3 g/L 맥아 추출물, 10 g/L 글루코즈)에서 수행했다. 배양물은 통상 48시간 동안 선별에 요구된 항생제(예: 2 내지 5 ㎍/mL 테트라사이클린, 10 ㎍/mL 카나마이신)과 함께 200 내지 225 rpm으로 250 mL 성장 플라스크 중의 50 mL 배지에서 30℃로 성장시켰다. Pm-구동된 유전자 세트의 유도를 위해, 배양물 밀도가 대략 OD600=0.5에 도달할 때 2 mM m-Ta를 첨가했다.
염색체외 K4 생합성 유전자를 갖는 균주. 다양한 플라스미드로 형질전환시킨 잔토모나스 캄페스트리스 균주 MSC255(ΔgumB-gumM)에서 콘드로이틴 생산은 상기한 바와 같이 배양 및 분석함으로써 측정했다. 결과는 표 10b에 제시되어 있다.
[표 10b]
Figure 112012080180037-pct00030
공 벡터를 함유하는 대조군 균주 MSC397은 검출가능한 콘드로이틴이 없었다. 영역 1, 2 및 3 유전자를 함유하는 균주 MSC348 및 MSC350은 이들 조건하에 약 40 ㎍/mL 콘드로이틴을 생산했다. 영역 2 유전자만을 함유하는 균주 MSC326은 약 100 ㎍/mL 콘드로이틴을 생산했다.
또 다른 실험에서, kfoABCFG 유전자를 함유하는 균주 MSC326(MSC255 pCX039)에서 콘드로이틴 생산은 48시간 후에 166 ㎍/mL이었고, 대조군 균주 MSC397(MSC255 pDD63 - 벡터 대조군)은 검출가능한 콘드로이틴을 생산하지 못했다. MSC326 배양물의 비오토클레이빙 샘플로부터의 분획에서, 무세포 상청액 및 세포 펠렛 분획은 각각 100 ㎍/mL 및 71 ㎍/mL 콘드로이틴을 함유했다. 이들 결과는 K4 영역 2 유전자(프럭토실화 개시 유전자 제외)가 잔토모나스 캄페스트리스에서 콘드로이틴 생산에 충분함을 시사하고, 콘드로이틴이 일부 특성화되지 않은 내인성 메카니즘 또는 세포 파괴 또는 용해에 의해 세포로부터 이출되는 것을 추가로 시사한다.
염색체에 의해 인코딩된 K4 생합성 유전자를 갖는 균주. 상기 기재된 염색체외 플라스미드는, 상이한 빈도로, 항생제 내성의 소실에 의해 규정된 바와 같이 배양물 중의 박테리아 세포로부터 소실된다. 잔토모나스 캄페스트리스 염색체 내로 K4 생합성 유전자의 통합은 이들 균주의 대규모 배양을 촉진시킬 뿐만 아니라 이러한 불안정성을 최소화시켜야 한다. 염색체 통합된 K4 유전자(상기 참조)를 갖는 4개 균주에서의 콘드로이틴 생산은 하기 표 10c에 제시되어 있다. 당해 균주를 48시간 동안 변형된 YMG 배지(YMGM(5): 80 mM MOPS(pH 7.0)로 완충된 YMG, 5 g/L 글루코즈) 또는 TB 배지에서 성장시켰다. 테트라사이클린은 pDD63를 갖는 균주에서 5 ㎍/mL로 존재한다. 콘드로이틴은 프로모터 둘 다 및 배지 둘 다로부터 생산되었다. 중요하게는, 콘드로이틴은 영역 2 유전자만이 존재하는 경우에 생산되었다. 표 10c 참조.
[표 10c]
Figure 112012080180037-pct00031
또 다른 실험에서, 선택된 균주는 상이한 글루코즈 농도로 YMGM 배지에서 성장시켰다. 콘드로이틴은 생합성 유전자의 세트를 함유하는 균주에서 모든 글루코즈 농도에서 생산되었다(그러나, 이러한 유전자를 결여하는 대조군 균주에서는 생산되지 않음). 이들 조건하의 최대 생산은 Pm/xylS 유도의 조절하에 영역 2 유전자만을 함유하는 균주 MSC469에서 390 ㎍/mL였다. MSC469의 YMGM + 10 g/L 글루코즈 배양물의 비오토클레이빙 무세포 상청액 및 세포 펠렛의 분석은 각각 167 ㎍/mL 및 150 ㎍/mL 콘드로이틴인 것으로 밝혀졌다. 전과 같이, 이들 결과는 콘드로이틴이 세포로부터 이출되는 것을 시사한다. 표 10d 참조.
[표 10d]
Figure 112012080180037-pct00032
실시예 14
본 실시예는 프럭토실화된 및 비프럭토실화된 콘드로이틴을 분석하는 방법을 기재한다.
박테리아로부터 콘드로이틴의 제조
재조합 콘드로이틴(rCH)는 음이온-교환기 DEAE-셀룰로즈 DE52 컬럼을 사용하여 포획했다. 5용적의 100 mM NaCl로 세척한 후, 컬럼을 5용적의 300 mM NaCl로 용출시켰다. 용출물을 농축시키고, 10용적의 증류수에 투석했다. 투석된 용액을 동결건조시켰다. 동결건조 분말을 rCH로서 사용했다.
프럭토실화된 콘드로이틴 캡슐 다당류(K4P)를 문헌[참조: Manzoni, M. et al ., Biotechnology Letters 1996;18:383-386]의 방법에 따라 균주 U1-41(Escherichia coli O5:K4:H4)의 배양물로부터 정제했다. K4P로부터 탈프럭토실화된 K4P(DFK4P)의 제조는 문헌[참조: Lidholt, K., et al ., J. Biol . Chem. 1997;272: 2682]의 방법에 따라 수행했다.
샘플 제조 및 HPLC 에 의한 콘드로이틴 분석
플라스크 배양물 샘플(통상 5 mL)을 5분 동안 > 15 psi에서 121℃로 오토클레이빙시키고, 냉각시켰다. 이어서, 샘플을 오토클레이빙 동안의 소실에 기인하여 필요한 만큼의 물로 본래 용적까지 재조절했다. 샘플(1.5 내지 5 mL)을 원심분리(통상 세포 밀도가 보다 낮은 플라스크 배양물의 경우에 10분 동안 3500g; 발효 또는 보다 고밀도 배양물의 경우에 5분 동안 12000g)하여 상청액 및 펠렛 분획을 수득했다. 몇몇 경우, 나타낸 바와 같이, 샘플을 사전 오토클레이빙 없이 원심분리했다. 배양물 샘플 또는 분리된 상청액 및 펠렛은 통상 분석할 때까지 -20℃에서 저장했다.
세포 결합된 콘드로이틴의 분석을 위해, 세포 펠렛을 본래 용적의 50mM 인산나트륨 완충제(pH 7.2)에 재현탁시키고, 5 내지 10mg/mL 리소자임(Sigma L-7561) 및 60 U/mL 데옥시리보뉴클레아제 I(Sigma D-4527)로 37℃에서 2시간 동안, 이어서 100 ㎍/mL 프로테이나제 K(Promega V3021)로 37℃에서 1시간 동안 가수분해했다. 반응을 종결한 후(90℃, 5분), 용액을 원심분리하여 세포 파편을 제거했다.
프럭토실화된 콘드로이틴 캡슐 다당류(K4P)의 분석을 위해, 샘플(플라스크/발효조 상청액 또는 원심분리 가수분해된 세포 펠렛)을 먼저 온화한 산 가수분해(즉, HCl로 pH 1.5까지 조절됨)를 사용하여 탈프럭토실화시키고; 80℃에서 30분 동안 배양한 다음, 0.5 M 탄산나트륨으로 중화시켰다. 동결건조 전에, DFK4P 샘플 및 비프럭토실화된 rCH 샘플(발효조 상청액, 동결건조된 세포 펠렛 또는 재구성된 침전물)을 탈이온수에 대해 밤새 투석하거나(PPierce Biotechnology Slide-A-LyzerR, 분자량 컷-오프 7 kD), 탈이온수로 용출시키는 원심분리 한외여과(Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Device, 10kD 명목상 분자량 컷-오프)로 부분 정제했다.
프럭토실화되지 않은 콘드로이틴은, 콘드로이티나제 ABC(Seikagaku Biobusiness, Japan)으로 명명된 콘드로이틴-분해 효소에 의해 불포화 비설페이트화 이당류인 2-아세트아미도-2-데옥시-3-O-(β-D-글루코-4-엔피라노실루론산)-D-갈락토즈(Δdi-0S)로 완전히 가수분해될 수 있다. 결과적으로, 프럭토실화되지 않은 샘플 용액 중의 콘드로이틴의 양은 HPLC 시스템을 사용하여 다당류로부터 효소에 의해 생산된 당해 이당류를 정량화함으로써 측정할 수 있다.
동결건조 후의 잔사를 THB(50 mM 나트륨 아세테이트를 갖는 50 mM 트리스-HCl 완충제, pH 8.0)에 용해시키고, 콘드로이틴 ABC(2 단위/mL, 3시간 동안 37℃)로 가수분해시켰다. 90℃에서 5분 동안 가열시켜 효소 반응을 종결시킨 후, 혼합물을 5분 동안 10000 rpm으로 원심분리하여 불용성 침전물을 제거했다. 상청액은 마이크로콘 원심분리 필터(Ultracel YM-10; Millipore)를 사용하여 여과하여 효소 및 비-콘드로이틴 다당류를 제거했다. 생성된 불포화 이당류(2-아세트아미도-2-데옥시-3-O-(β-D-글루코-4-엔피라노실루론산)-D-갈락토즈; Δdi-0S)는 역상 이온쌍 HPLC(Senshu Pak Docosil, 4.6 x 150 mm; 입자 크기, 5 ㎛)로 분리하고, 2-시아노아세트아미드로 컬럼후 표지하고, 형광[참조: Toyoda, H., et al . J. Biol . Chem., 2000; 275:2269]으로 검출하고, 상업적으로 입수가능한 콘드로이틴(Seikagaku Biobusiness, Japan) 또는 rCH로부터 제조된 외부 표준에 대해 정량화했다. 이당류에 대한 통상의 보정 곡선은 도 11b에 도시되어 있다. 이당류에 대한 보정 곡선은 2 내지 200 ㎍/mL 범위에서 선형이었고, 이당류의 검출 한계는 1 ㎍/mL이었다. 콘드로이틴 다당류의 농도는 다음 식을 사용하여 계산할 수 있다.
농도; ㎍/mL = [A] / [S] ×[D],
여기서, [A]는 샘플 크로마토그램에서 Δdi-0S의 피크 면적이고, [S]는 Δdi-0S 농도에 대한 보정 곡선의 기울기이고, [D]는 희석 계수이다.
프럭토실화된 콘드로이틴의 정량화를 위한 ELISA 방법
K4P의 카복실기를 통한 비오티닐화 결합은 문헌[참조: Osmond, R. I.W. et al ., Analytical Biochemistry 2002;310: 199-207]의 방법에 따라 수행했다. 100 ㎕의 비오티닐화 K4P(1 ㎍/ml)를 실온에서 30분 동안 스트렙토아비딘 코팅된 96-웰 미세역가 플레이트(Thermo Scientific, Japan)에 접합시켰다. 플레이트를 0.05 % 트윈R 20 및 0.05% 프로클린(pH 7.5)으로 보충된 50 mM 트리스-HCl 완충된 염수(NaCl 100 mM)을 사용하여 세척한 후, 50 ㎕의 배양 상청액 또는 표준 K4P 용액, 및 50 ㎕의 2.5 x 106로 희석도의 항-K4P 혈청(Statens Serum Institut, Denmark)을 웰에 첨가하고, 60분 동안 항온처리하였다. 웰을 다시 세척한 후, 2000배 희석도의 HRP-표지된 항-래빗 면역글로불린(P0448, DAKO JAPAN, Japan)을 첨가하고, 60분 동안 항온처리하였다. 웰을 다시 세척한 후, H2O2를 함유하는 TMB 용액(TMBW-1000-01, BioFX Laboratories Inc., Owings Mills, MD)을 기질로서 첨가하고, 실온에서 30분 동안 배양했다. 50 ml의 정지 시약(STRP-1000-01, BioFX Laboratories Inc., Owings Mills, MD)을 첨가하고, 450 nm에서의 흡광도를 측정했다. 이들 분석 조건하에, 다른 다당류, 예를 들면, 프럭토실화되지 않은 콘드로이틴, 헤파로산 및 DFK4P는 K4P와 경쟁하지 않는다. 통상의 표준 곡선은 도 11a에 도시되어 있다.
rCH , K4P 및 DFK4P 의 SEC - HPLC 분석
다당류의 중량 평균 분자량("Mw") 및 콘드로이티나제-분해능은, 굴절률 검출기 및 TSK-겔 PWXL-4000, PWXL-3000 및 PWXL-2500(TOSOH, Japan)의 직렬 컬럼이 구비된 TOSOH HLC-8220GPC 시스템을 사용하여 0.6 mL/분의 일정 유속에서 0.2 M NaCl로 SEC-HPLC 상에서 분석함으로써 측정했다. 50 ㎕의 다당류 용액을 컬럼 상에 0.6 mg/mL의 농도로 주입했다. 컬럼 및 검출기 구획은 40℃로 유지시켰다. Mw 규정 콘드로이틴 설페이트(Mw: 52.2, 31.4, 20.0, 10.0, 6.6 및 1.0 kDa)를 분자량 기준으로 사용했다.
콘드로이티나제 ABC 분해 전후의 rCH(프럭토실화되지 않음)의 전형적인 용출 프로파일은 도 12에 도시되어 있다. rCH의 계산된 중량 평균 분자량은 120 kDa였다.
K4P 및 DFK4P의 콘드로이티나제 분해능의 측정은 다음과 같이 수행했다. K4P 및 DFK4P를 50 mM THB(50 mM 나트륨 아세테이트를 갖는 트리스-HCl, pH 8.0)에 용해시켜 1 mg/mL의 최종 농도를 수득하고, 동일한 부분으로 나누었다. 용액 부분은 상기한 바와 같이 SEC-HPLC 상에서 직접 분석했다. 또 다른 부분은 동일한 시스템 상에서 분석한 다음, 콘드로이티나제 ABC(최종 농도: 2 단위/mL)로 37℃에서 3시간 동안 처리했다. 결과는 도 13에 도시되어 있다. 에스케리키아 콜라이 K4 U1-41의 배양물로부터 제조한 K4P 및 DFK4P의 분자량 값은 각각 33 kDa 및 28 kDa이었다. DFK4P는 콘드로이티나제 처리에 의해 이당류, Δdi-0S로 완전히 분해된 반면, K4P는 효소로 부분 분해되었다(도 13). 이들 결과는 K4P가 상기한 바와 같은 탈프럭토실화 처리에 의해 K4P의 콘드로이틴 골격 구조에 영향을 미치지 않고서 탈프럭토실화 형태로 전환되었음을 나타냈다. 결과적으로, 샘플 중의 K4P의 양은 또한, 샘플이 효소 분해 전에 탈프럭토실화 처리로 처리되는 경우, 콘드로이티나제/HPLC 방법을 사용하여 다당류로부터 효소에 의해 생산된 이당류를 정량화함으로써 측정할 수 있다.
실시예 15
본 실시예는 콘드로이틴의 황산화를 설명한다.
실시예 14에서 제조된 콘드로이틴을 부분 해중합화시켜 분자량 약 30 kDa의 콘드로이틴을 수득했다. 30 mg의 이 콘드로이틴을 60℃에서 교반시키면서 0.6 mL의 무수 포름아미드(FA)에 용해시켰다. 용액이 완전히 균질화되면, 고형 황 트리옥사이드-TEA 복합체(5당량의 콘드로이틴 이당류 단위)를 첨가하고, 교반을 120분 동안 지속했다. 황산화 반응은 3용적의 1M 나트륨 아세테이트의 첨가에 의해 중단시키고, 실온에서 30분 동안 추가로 정치시켰다. 용액을 3일 동안 증류수에 대해 투석하고, NaOH로 중화시키고, 백색 분말(32 mg, 107%)로 동결건조시켰다. 재조합 콘드로이틴 설페이트의 추가 분석은 분자량 29 kDa, 5.2%의 황을 입증했다.
또 다른 실험에서, 상기한 콘드로이틴(50 mg)을 주위 온도에서 1.0 mL의 무수 포름아미드(FA)에 용해시켰다. 용액이 투명해지면, 클로로설폰산(5당량의 CH 이당류 단위)를 서서히 첨가하고, 20분 동안 연속 교반하면서 유지시켰다. 황산화 반응은 3배 용적의 1M 나트륨 아세테이트 용액을 첨가하여 중단시키고, 추가로 10분 동안 실온에서 정치시켰다. 용액을 3일 동안 증류수에 대해 투석하고, NaOH로 중화시키고, 동결건조시켜 백색 분말(47 mg, 94%)을 수득했다. 재조합 콘드로이틴 설페이트의 분석은 분자량 33 kDa, 5.2 %의 황을 나타냈다.
실시예 16
본 실시예는 콘드로이틴 생합성 영역 2 유전자 세트(kfoABCFG)가 에스케리키아 콜라이 균주 MSC562에서 콘드로이틴 생산의 최대 향상에 충분함을 설명한다.
영역 1, 2 및 3(R1, R2 및 R3) 유전자 세트의 조합을 함유하는 플라스미드 세트는 pBR1052(도 8k) 및 pDD67(도 8j)로부터 제조했다. 상기한 바와 같이, 유전자 세트는 출발 플라스미드를 특정 제한 효소로 분해시켜 결실시켰다; 예를 들면, T4 폴리머라제를 사용한 블런트 말단의 생성; 및 생성 벡터 단편의 연결. 에스케리키아 콜라이 균주 MSC188(실시예 3)을 연결 반응물로 형질전환시키고, 선택된 항생제 내성 형질전환체를 목적하는 특성에 대해 평가했다. pBR1052가 영역 1 유전자 세트에 선행하는 제2 Pm 프로모터를 함유하는 사실에 기인하여, 여기에 기재된 플라스미드 중의 일부는 제2 Pm 프로모터를 함유한다. 이들 기재된 플라스미드 모두는 xylS를 함유한다. 하기 표 11에서, R1 = kpsFEDUCS, R2 = kfoABCFG, 및 R3 = kpsMT이다. "Pm:R2" 플라스미드는 미리 작제되었음에 주목한다(pCX039; 실시예 4). 플라스미드 pCX096(서열 번호 149), pCX097, pCX100, pCX101(서열 번호 150) 및 pCX102에 대한 DNA 맵은 도 14a, 14b, 14c, 14d 및 14e에 각각 도시되어 있다. 플라스미드 pCX097 및 pCX101은 각각 pCX100 및 pCX102에 대한 출발 플라스미드로서 사용되었다.
[표 11]
Figure 112012080180037-pct00033
최종 플라스미드 각각을 숙주 균주 MSC562에 형질전환시켜 하기 표 12에 제공된 균주를 생성했다. 이들 균주 및 기존 대조군 균주를 2xM9/tet5 배지를 갖는 진탕 플라스크에서 성장시키고, 대략 0.1 내지 0.12의 OD600 값에서 1 mM 메타-톨루엔산으로 유도하고, 성장(OD600) 및 72시간 후의 rCH 생산에 대해 평가했다.
[표 12]
Figure 112012080180037-pct00034
최대 생산능은 영역 2(MSC564) 단독 또는 영역 2와 1의 조합(MSC683)을 함유하는 플라스미드를 갖는 균주에서 관찰되었다. 영역 2 및 3의 조합(MSC688)은 보다 낮은 생산능을 나타냈다. 사실, 플라스미드-함유 영역 3의 존재는 다른 관련 균주 대조군에서 억제를 나타냈다(예를 들면, MSC683 vs MSC690). 이들 발견은 균주 MSC562에서 영역 2 카피 수만을 증가시킴으로써 rCH 생산능의 증가 방법을 뒷받침한다.
실시예 17
본 실시예는 콘드로이틴 생합성 유전자 영역 2의 포지티브 카피 수 효과가 kfo ABCDG 유전자 5개 모두를 필요함을 설명한다.
플라스미드 pCX039(도 8q; 영역 2 유전자 kfoABCFG 함유)는 숙주 에스케리키아 콜라이 균주 MSC562에 존재하는 경우에 rCH 생산의 거대한(8 내지 10배) 증가를 유도했다(공 벡터 pDD63을 함유하는 MSC562와 비교하여). pDD66 및 pDD67로부터의 유전자 결실에 대한 상기한 방법(실시예 4 참조)을 사용하여, 2개 세트의 플라스미드를 pCX039로부터 유도하여, pCX039에 의해 생산된 rCH의 자극에 대한 개개 영역 2 유전자의 역할을 입증했다.
5개 플라스미드 중의 1개 세트는 영역 2 유전자 중 1개 제거의 효과를 평가하기 위해 설계되었다. MSC562 등의 에스케리키아 콜라이 숙주에서, 이들 유전자의 1개 카피가 여전히 존재할 것이다(염색체 내로 통합됨). 이 세트의 플라스미드는 각각의 kfoABCFG가 개별적으로 결실된 pCX039 유도체를 포함했다. 하기 표 13은 kfo 유전자의 결실에 사용된 제한 효소 및 생성 플라스미드의 명칭을 수록한다. 상기 실시예 4는 pCX044의 유도체화를 상세히 기재한다. 모든 플라스미드는 xylS를 함유한다.
[표 13]
Figure 112016019550472-pct00167
이들 플라스미드를 숙주 균주 MSC562(영역 1, 2 및 3 + xylS의 염색체 카피) 내로 형질전환시켜 하기 표 14에 제시된 균주를 생성했다. 배양물은 30℃에서 2xM9 배지(10 g/L 글리세롤 및 2 ㎍/mL Tet를 가짐)에서 성장시키고, 대략 0.1의 OD600 값에서 1 mM mTA로 유도하고, 성장 72시간 후에 rCH 생산에 대해 분석했다.
[표 14]
Figure 112012080180037-pct00036
이들 결과는 모든 5개의 영역 2 유전자(kfoABCFG)가 이들 조건하에 최대 생산능을 달성하는데 요구됨을 나타낸다. 또한, MSC563에 대한 결과는 염색체 삽입으로부터 kfoABCFG 유전자의 발현이 플라스미드 함유 유전자 카피의 부재하에 현저한 rCH 생산을 뒷받침하기에 충분함을 나타낸다.
제2 세트의 pCX039 유도체는 숙주 균주 MSC562에서 rCH 역가의 향상에 대한 개개 플라스미드-함유 영역 2 유전자의 존재 효과를 평가하기 위해 설계되었다. 생성 플라스미드 중에서 견줄만한 발현 수준을 유지하는 수단으로서, 프로모터-인접 kfoA 유전자가 모든 작제물에 유지되었다. 이러한 설계 전략은 완전 분리시에 플라스미드 인코딩된 kfoB, C, F 또는 G 유전자의 평가를 허용하지 않지만, kfoA 유전자의 보유, 및 모든 이들 플라스미드에서 Pm 프로모터와 제1 판독 프레임 사이의 생성된 고정 관계는 Pm 프로모터로부터의 발현 수준을 필적하게 할 것으로 예상된다. 상기와 동일한 전략을 사용하여, 다음 유도체화(표 15)를 수행했다. 모든 플라스미드는 xylS를 함유한다.
[표 15]
Figure 112012080180037-pct00037
최종 세트의 플라스미드 각각을 숙주 균주 MSC562 내로 형질전환시켜 하기 표 16에 제공된 균주를 수득했다. 이들 균주 및 MSC563 및 MSC564 대조군을 2xM9/tet2 배지를 갖는 진탕 플라스크에서 성장시키고, 0.08 내지 0.18의 OD600 값에서 1 mM meta-톨루엔산에 의해 유도하고, 성장(OD600) 및 68시간 후의 rCH 생산에 대해 평가했다.
[표 16]
Figure 112012080180037-pct00038
이들 데이타는 K4 영역 2 유전자(kfoABCFG)의 어떤 것도 개별적으로는 MSC562 숙주 균주에서 rCH 생산을 최대로 자극하는데 충분하지 않음을 입증한다. 상기한 발견(예: 실시예 16)과 함께 고려하면, 영역 2 유전자 세트의 모든 5개 유전자를 포함하는 것은 rCH 생산을 최대로 향상시킨다는 것이 명백하다.
실시예 18
본 실시예는 보다 많은 콘드로이틴 생산을 위해 콘드로이틴 생합성 유전자 영역 2의 증가된 염색체 카피 수를 위한 작제물을 설명한다.
실시예 12는, 영역 1, 2 및 3의 단일 염색체 카피를 이미 함유하는 에스케리키아 콜라이 숙주에서 영역 2 유전자 세트(kfoABCFG)의 단일 염색체 카피의 부가가 rCH 생산에 있어서 상당한 20 내지 30% 증가를 유도함을 입증한다. 실시예 11은, 영역 2 유전자 세트를 함유하는 복수 카피 플라스미드를 함유하는 유사한 숙주가 rCH 생산에 있어서 300% 증가를 유도함을 입증한다. 높은 생산능의 플라스미드 비함유 균주를 생성하는 목적에 따라, 본 실시예는, 이러한 삽입체의 동정을 촉진하기 위해 특이적으로 선택된 다양한 비필수 염색체 유전자 내로 이들을 삽입함으로써 영역 2 카피(Pm 프로모터에 의해 유도됨)의 염색체 상보성을 증가시키도록 설계된 플라스미드의 작제 및 용도를 기재한다. 상동성 구동된 "팝-인/팝-아웃" 방법(실시예 4 및 12 참조)을 사용하여 영역 2 유전자 세트의 카피를 숙주 에스케리키아 콜라이 염색체 내의 상이한 유전자좌로 성공적으로 삽입함에 있어서 목적하는 유전자좌 대신에 기존의 영역 2 삽입체 내로의 바람직하지 않은 표적화(방법 유도된 재조합)에 대한 경쟁이 증가한다. 따라서, 보다 많은 노력 및 시간 소비적인 PCR 대신에 단순한 콜로니 스크리닝에 의해 목적하는 유전자좌에서 삽입체 함유 균주를 초기에 동정하는 수단을 가지면 숙주 균주에서 영역 2 카피의 수가 상승함에 따라 점차 유리해진다.
본 실시예에서, 3개의 에스케리키아 콜라이 표적 유전자좌가 기재되어 있다. 이들은, 각각 당 락토즈, 만니톨 및 프럭토즈 상에서의 성장에 필수적이지만 글루코즈 또는 글리세린 등의 다른 탄소원 상에서의 성장에는 필수적이지 않은 유전자 lacZ, mtlA 및 fruBKA 오페론(일부 경우에 단순화를 위해 "fruA"로 지칭됨)이다. 이들 유전자에 대해 파괴된 균주의 콜로니는 콜로니 색차에 의해 맥콘키(MacConkey)[참조: Miller, JH, Experiments in Molecular Genetics, 1972] 등의 표시 아가 상에서 시각적으로 동정될 수 있다: 도입된 당을 이용할 수 있는 균주의 경우에 분홍색/적색 및 유전자 파괴(예: 삽입체)를 갖는 균주의 경우에 백색/연분홍색. 또는, LB/Xgal/IPTG 아가 배지(ibid.)를 사용하여 락토즈 대사에서 결함을 검출할 수 있다: 락토즈를 이용할 수 있는 균주의 경우에 청색 콜로니 및 락토즈를 이용할 수 없는 균주(예: lacZ 유전자 내에 삽입체를 갖는 균주)의 경우에 백색/담황색 콜로니. 색차를 사용하는 이와 같은 방법은 삽입체를 갖는 콜로니 모집단 중에서 목적하는 유전자좌 내로의 삽입체를 갖는 균주를 시각적으로 동정하게 한다. 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 삽입체 성과의 스크리닝 또는 선별을 가능하게 하는 다른 표적 유전자좌가 에스케리키아 콜라이에 존재함을 인지할 것이다: 비제한적 예는 pepP, pepQ, feuA(cirA), malB(lamB), nupA(tsx)을 포함한다.
fruBKA, lacZ 및 mtlA 유전자 내로 영역 2("R2")의 삽입을 위해 플라스미드 pMAK705의 사용을 촉진하기 위해, 다중 클로닝 부위를 함유하는 pMAK705의 유도체를 먼저 개발했다. 프라이머 DHD266c 및 DHD267c는 다중 제한(클로닝) 부위(NotI, XhoI, AscI, SalI, BglII, HindIII)의 일본쇄 절반을 함유하고, AseI 및 ClaI을 사용한 pMAK705의 분해에 의해 생성된 오버행에 적합한(어닐링되는 경우) 2-염기 일본쇄 말단을 제외하고 상보성이다. AseI 또는 ClaI 제한 부위 어떠한 것도 이들 적합한 말단의 결찰시에 재생되지 않는다.
Figure 112016019550472-pct00168
플라스미드 pMAK705를 AseI 및 ClaI로 분해시키고, 벡터 단편을 겔 정제했다. 인산화된 올리고뉴클레오티드 DHD266c 및 DHD267c를 어닐링시키고(각각 200 nM 올리고뉴클레오티드, 5분 동안 90℃, 30분 동안 50℃로 완만한 냉각), 이어서 pMAK705 벡터 단편에 연결시켰다. 연결 반응물을 클로람페니콜 내성에 대한 선별과 함께 에스케리키아 콜라이 NEB10β 내로 형질전환시켰다. 분리된 형질전환체로부터의 플라스미드를 PCR에 의해 및 MCS 제한 효소 부위의 존재에 대해 스크리닝했다. MCS 영역의 서열분석은 목적하는 구조를 갖는 플라스미드를 동정했다. 이 플라스미드는 pMAK705pl(서열 번호 157; 도 14q)로 명명되었다.
R2를 fruBKA, lacZ 및 mtlA 유전자좌 내로 삽입하기 위한 3개 벡터의 작제는 모두 동일한 2단계 방법을 취했다. 제1 단계에서, 상부 및 하부 상동성 영역은 PCR 생성물의 "내부" 말단 사이의 어닐링을 허용하는 PCR 프라이머를 사용하여 각 표적 유전자좌에 대해 생성했다. 이러한 상동성 영역은 R2의 부가를 위해 이후에 사용된 다중 제한 부위를 포함한다. 제2 단계에서, 각 유전자좌에 대한 상부 및 하부 PCR 생성물을, 개개 주형 구성원을 합성하기 위해 본래 사용된 2개의 "외부" 프라이머와 PCR 반응에서 혼합했다. 상부 및 하부 PCR 생성물(단계 2에서 이제 주형) 내에 설계된 말단 상동성으로 인해, 단계 2 반응의 결과는 다중 클로닝 부위 측면에 위치하는 상부 및 하부 영역의 적절한 배향을 포함하는 DNA 단편이었다. 단계 2로부터의 PCR 생성물을 효소로 분해시켰으며, 효소의 인지 서열은 "외부" 프라이머로 설계되었다: 상부 말단의 경우에 NotI 및 하부 말단의 경우에 HindIII. 이어서, 이들 단편을 NotI 및 HindIII로 분해시킨 pMAK705pl(서열 번호 157) 내로 각각 클로닝시켰다. 생성된 3개의 플라스미드는, R2 카피의 수용에 사용되는 다중 클로닝 부위(MCS)의 측면에 위치하는 적절히 배향된 상부(UP) 및 하부(DN) 영역 약 900 내지 1000bp를 함유했다. pBR1093의 경우, MCS는 약 20bp의 lacZ 코딩 영역을 치환했다. pBR1094의 경우, MCS는 mtlA 코딩 영역 내로 삽입되었다. pBR1095의 경우, MCS는 fruB의 3-프라이머 말단, fruK 모두, 및 fruA의 5-프라이머 말단을 치환했다. 이들 중간 작제물의 제조에 사용된 프라이머는 하기 표 25에 수록되어 있다.
pBR1093, pBR1094 및 pBR1095 내로 클로닝하는 영역 2 유전자 세트를 제조하기 위해, kfoABCFG 유전자를 PacI + ClaI을 사용하여 pCX074(실시예 11 참조)로부터 (Pm 프로모터 없이) 분해시켰다. 이어서, 정제된 R2 단편을 동일한 효소로 분해된 pJ201:11352(도 8b 참조) 내로 클로닝시켰다. 이는 kfoABCFG 유전자가 Pm 프로모터 뒤에 다시 배향되어 있는 플라스미드 pBR1096을 생성했다. 이제, 그러나, Pm:R2는 pBR1093(도 14s), pBR1094(도 14v) 및 pBR1095(도 14w) 내로 클로닝하기 위한 XhoI/AscI 단편으로서 pBR1096으로부터 분리할 수 있다. 표 17은 최종 치환 pMAK705-기반 Pm:R2 삽입 플라스미드pBR1100(lacA 유전자좌의 경우), pBR1101(mtlA 유전자좌의 경우) 및 pBR1102(fruBKA 유전자좌의 경우)의 설계를 제공한다. 프라이머 DHD280c, DHD281c, DHD283, DHD285, DHD268c, DHD269c, DHD271, DHD273, DHD274c, DHD275c, DHD277 및 DHD279의 서열은 각각 서열 번호 158 내지 169에 제시되어 있다.
[표 17]
Figure 112016019550472-pct00169
상기한 "팝-인/팝-아웃" 방법을 플라스미드 pBR1100(서열 번호 171; 도 14t), pBR1101(서열 번호 172; 도 14v) 및 pBR1102(서열 번호 170; 도 14x)에 사용하여 선택된 에스케리키아 콜라이 균주에 추가의 Pm:R2 카피를 제공했다. 균주를 클로람페니콜 내성에 대해 선택하면서 30℃에서 pBR1100, pBR1101 또는 pBR1102에 형질전환시켰다. 이어서, 형질전환체를 43℃에서 맥콘키(MacConkey)/프럭토즈/Cm 아가(pBR1102 형질전환체의 경우), 맥콘키/만니톨/Cm 아가(pBR1101 형질전환체의 경우) 또는 LB/Xgal/IPTG/Cm 아가(pBR1100 형질전환체의 경우)에 플레이팅시켰다. 뚜렷하게 착색되지 않은 콜로니를 추가의 분석을 위해 선택했다. 이들 중에서, 표적 유전자좌 내로 통합된 플라스미드를 갖는 균주를 PCR에 의해 동정했다. 이어서, 성공적으로 통합된 플라스미드를 갖는 균주를 클로람페니콜 선택의 부재하에 다중(예: 20 내지 30) 세대용으로 성장시켰다. 이들 배양물로부터 유래된 콜로니를 클로람페니콜 민감성(플라스미드의 절단 반영) 및 당 대사의 결함(표적화 Pm:R2 삽입의 보유 반영)에 대해 스크리닝했다. 목적하는 표현형을 갖는 분리물을 정확한 염색체 구조에 대해 PCR에 의해 평가했다. 도 15는 본 실시예 및 다른 실시예에 기재된 방법을 사용하는 균주 유도에서의 다중 단계를 도시한다. 설명 및 요약으로서, 균주 MSC702는 다음과 같은 주요 요소를 함유한다: 콜란산 유전자좌에 삽입된 Pm[kpsMTkfoABCFG]Pm[kpsFEDUCS], fhuA 유전자좌에 삽입된 Psyn[xylS], fruBKA, lacZ 및 mtlA에 삽입된 Pm[kfoABCFG], 및 (MSC691로부터의 이의 유도에 기인하여 추정됨; 실시예 19 참조) leuB 유전자 내의 8 염기쌍 변화.
실시예 19
본 실시예는 에스케리키아 콜라이 균주에서 자발적-발생 영양요구체의 동정 및 교정을 설명한다.
최소 성장 배지에서 rCH 생산에 대한 재조합 에스케리키아 콜라이 균주를 평가하는 과정 동안, 특정 균주가 성장하지 않음이 발견되었다. 이어서, 균주 MSC561는 류신 공급원으로 수정되는 경우에만 최소 배지 상에서 성장하는 것으로 측정되었다; 즉, 이 균주는 류신 영양요구체이다. MSC561에서 류신 생합성 오페론 leuABCD의 서열분석은 당해 균주가 류신 원영양체 MSC467로부터 이의 유도 동안 leuB 유전자 코딩 영역 내의 단일 염기쌍 결실(코딩 영역의 위치 383에서 C/G 염기쌍)을 동시에 획득했음을 나타냈다(실시예 10 참조). 이러한 결실은 판독 프레임 쉬프트 및 조기 해독 종결을 생성했다. 이러한 결함은, 유전자 조작 및 초기 생산 시험이 복합체 배지에서 수행되었기 때문에 초기에는 검출되지 않았다. 이러한 돌연변이는 fhuA 및 콜란산 유전자좌에서 이전 표적화 재조합의 결과인 것 같지는 않은데, 이는 이들이 leuB에 친밀하게 연결되어 있지 않기 때문이다(fhuA 및 leuB은 약 85 Kb 떨어져 있다; 콜란산 오페론 및 leuB은 약 2Mb 떨어져 있다). R2 카피(예: MSC627, MSC650, MSC646, MSC679 및 MSC700; 도 15 참조)의 부가에 의해 MSC561로부터 즉시 또는 순차로 유래된 모든 균주는 또한 류신 영양요구체이고, leuB 서열에서 동일한 결실을 함유했다. MSC467의 별개 계통의 균주(MSC537, MSC562 및 MSC619)는 류신 원영양체이다(도 15 참조).
2개 방법을 사용하여 선별된 류신 영양요구체를 원영양체로 전환시켰다(따라서 류신의 부가 없이 최소 배지에서 성장함). 한 가지 방법에서, 영양요구체 균주의 다수(약 106 내지 107)의 세포를 최소 배지 아가 플레이트에 적용한 다음, 30℃에서 3 내지 7일 동안 배양했다. 통상적으로, 몇몇 콜로니는 이들 조건하에 성장했다. 이들 콜로니로부터 분리된 균주("자발성 회복체")는 류신 없이 고체 및 액체 최소 배지에서 재현가능하게 성장했다. 선별된 회복체의 leuB 유전자의 서열 분석은, 정확한 leuB 판독 프레임의 회복을 생성하는 본래 단일 염기쌍 결실 부위 부근에서 적은 삽입 또는 결실을 나타냈다(대부분의 경우). 하기 표 18은 leuB 코딩 영역의 상대적 동조와 함께 뉴클레오티드 변화 위치를 제공한다. 이들 자발성 회복체 균주 중의 LeuB 효소는 이들 영역 내에 변경된 아미노산 서열을 갖지만, 천연 구조로부터의 변화는 류신 비함유 배지에서의 성장을 뒷받침하는 충분한 기능을 하는 것 같다. 자발성 회복체 MSC692에서, leuB에서 어떠한 보상 뉴클레오티드 변화도 검출되지 않았다. 이들 균주에서 유전자 변화의 성질은 특성화되지 않는다.
류신 영양요구체를 원영양체로 전환시키는 제2 방법에서, 선별된 균주의 leuB에서의 자발성 돌연변이는 천연 서열로 특이적으로 수정되었다. PCR 프라이머 BLR513(서열 번호 173) 및 BLR516(서열 번호 174)을 사용하여, 야생형 에스케리키아 콜라이 W3110로부터의 gDNA를 주형으로서 사용하여 646 염기쌍 영역을 증폭시켰다. MSC561에서 결실이 발견된 염기쌍 부위는 이 PCR 단편의 상부 말단으로부터 288 bp였고, PCR 프라이머는 pMAK705pl(실시예 18; 서열 번호 157; 도 14q) 내로 클로닝시켜 pBR1103(서열 번호 175; 도 14r)을 생성하는 HindIII 및 XhoI 말단을 생성한다. pBR1103 중의 leuB 유전자 단편은 서열 번호 175의 bp = 5059 내지 5064에 있는 HindIII 제한 부위로부터 서열 번호 175의 bp = 5712 내지 5717에 있는 XhoI 제한 부위까지 연장한다. 이들 제한 부위는 천연 leuB 서열의 일부는 아니지만, 프라이머 BLR513 및 BLR516을 사용하여 PCR에 의한 클로닝 목적으로 도입되었다.
이어서, 표준 "팝-인/팝-아웃" 방법을 사용하여 영양요구체 균주 MSC650, MSC679 및 MSC700에서 천연 영역으로 결함 leuB 영역을 치환함으로써 각각 원영양체 균주 MSC722, MSC723 및 MSC724를 수득했다. 요약하면, pBR1103을 갖는 MSC650, MSC679 및 MSC700의 초기 형질전환체를 30℃에서 LB/Cm34 상에서 선택했다. 선택된 형질전환체를 43℃에서 LB/Cm34에 플레이팅시키고, 분리된 생존체는 leuB 유전자좌에서 통합된 pBR1103l을 갖는 것으로 PCR에 의해 확인되었다. 선택된 통합체를 약 10세대 동안 30℃에서 LB(Cm 부재) 상에서 성장시킨 다음, 약 15 세대 동안 2xM9 배지(Cm 부재, 류신 부재)에서 성장시켰다. 이들 배양물로부터 분리된 LB 플레이트 상의 콜로니로부터 유래된 균주를 클로람페니콜-민감성 및 원영양체에 대해 스크리닝했다. 3개의 초기 모 균주 각각으로부터 유래된 원영양성 클로람페니콜-민감성 균주 중의 leuB 유전자의 DNA 서열분석은 본래 야생형 서열이 회복되었음을 확인시켰다. 도 15는 본원에 기재된 다른 균주와 비교하여 이들 균주의 유도를 나타낸다.
[표 18]
Figure 112012080180037-pct00041
균주 MSC722, MSC723 및 MSC724에서 rCH 생산(특이적으로 수정된 Leu+ 원영양체)을, 동일한 K4 유전자 상보성 및 배열을 갖지만 원영양체: 각각 MSC677, MSC692 및 MSC702로의 자발적 전환에 의해 유도된 균주에서의 생산과 비교했다. 6개 균주를 30℃에서 이중 2xM9 플라스크에서 성장시키고, 대략 0.1의 OD600 값에서 1 mM mTA에 의해 유도했다. 유도후 72시간에서 배양조의 샘플을 상기한 바와 같이 rCH 함량에 대해 분석했다. 평균 OD600 및 rCH 농도는 표 19에 제시되어 있다.
[표 19]
Figure 112012080180037-pct00042
3개 균주 쌍중의 2개에서, rCH 생산은 leuB로의 특이적 수정을 갖는 균주에서 더욱 크지만, 최종 세포 밀도(말기 OD600에 의해 측정됨)은 유사했다. 이들 결과는 에스케리키아 콜라이 균주 개발 과정 동안 발견된 자발성 돌연변이를 특이적으로 수정하는 것의 rCH 생산 측면에서의 잇점을 입증한다.
실시예 20
본 실시예는 발효조에서 에스케리키아 콜라이 중의 콘드로이틴의 재조합 DNA-매개 생산을 기재한다.
1. 에스케리키아 콜라이(MSC537)의 10-L 발효
통상적인 발효 조건하에 10-L 발효조를 사용하여, 에스케리키아 콜라이 균주 MSC537의 배양물을 탄소원으로서 글리세린을 사용하여 배양했다. 발효조를 탈이온수를 사용하여 6L 용적으로 다음 배지(표 20a)를 사용하여 일괄 처리(batch)했다.
[표 20a]
Figure 112012080180037-pct00043
상기 배지를 함유하는 발효조의 오토클레이빙 후, 다음 성분(표 20b)을 무균 상태로 첨가했다.
[표 20b]
Figure 112012080180037-pct00044
발효조를 통상적인 씨드(seed) 배양물로 접종하고, 4.25시간 후 2mM m-TA로 유도한 다음, 69시간 동안 배양하고, 배양 동안 탄소원(625g/L 글리세린 용액으로 구성됨)을 공급했다. 69시간 후, 발효조를 오토클레이빙하고, 원심분리로 수거했다. 발효 조절 조건 및 생성물 수율은 표 20c 및 20d에 각각 제시한다.
[표 20c]
Figure 112012080180037-pct00045
[표 20d]
Figure 112012080180037-pct00046
2. 에스케리키아 콜라이(MSC564)의 2-L 발효
통상적인 발효 조건하에 2ℓ 발효조를 사용하여, 에스케리키아 콜라이 균주 MSC564의 배양물을 탄소원으로서 글리세린을 사용하여 배양했다. 발효조를 탈이온수를 사용하여 1.5L 용적으로 다음 배지(표 21a)를 사용하여 일괄 처리했다.
[표 21a]
Figure 112012080180037-pct00047
상기 배지를 함유하는 발효조의 오토클레이빙 후, 다음 성분(표 21b)을 무균 상태로 첨가했다.
[표 21b]
Figure 112012080180037-pct00048
발효조를 통상적인 씨드 배양물로 접종하고, 66시간 동안 배양하고, 배양 동안 170mL의 탄소원(625g/L 글리세린 용액으로 구성됨)을 공급했다. 5시간 배양 후, 이를 2mM m-TA로 유도했다. 발효조를 pH, 용해된 산소, 온도, 글리세린 농도 및 아세테이트 농도(탄소 대사 부산물)에 대해 조절했다. 글리세린 공급 속도는 < 2g/L 아세테이트의 표적으로 아세테이트 농도에 기초하여 조정했다. 표적 글리세린 농도는 < 5g/L였다. 발효를 66시간 동안 작동시키고, 그 시점에서 글리세린 소비는 < 1.5g/L/h로 감퇴되었다. 샘플링 및 증발에 기인하여, 최종 용적은 1.35L였다. 조절 조건 및 생성물 수율은 이하 나열된다. 66시간 후, 발효조를 오토클레이빙하고, 원심분리 수거했다. 원심분리 후 회수된 용적은 상청액 약 1L였다. 발효 조절 조건 및 생성물 수율은 표 21c 및 21d에 각각 제시한다.
[표 21c]
Figure 112012080180037-pct00049
[표 21d]
Figure 112012080180037-pct00050
3개의 10L 반응기가 숙주 염색체(참조: 실시예 19; 도 15) 중의 영역 2 유전자의 상이한 수 및 배열을 함유하는 균주 MSC619, MSC677 및 MSC702를 비교하면서 동일한 조건하에 나란히 작동된 하나의 실험으로부터 다음 3개의 발효(3 내지 5)를 취했다. 요약하면, MSC619 및 MSC677은 각각 영역 2의 3개 총 카피를 갖지만, MSC619 중의 하나의 카피는 Pm 프로모터 대신 Psyn 프로모터로 구동된다. 균주 MSC702는 모두 Pm에 의해 구동되는 영역 2 유전자 세트의 4개의 카피를 갖는다.
3. 에스케리키아 콜라이(MSC619)의 10-L 발효
통상적인 발효 조건하에 10-L 발효조를 사용하여, 에스케리키아 콜라이 균주 MSC619의 배양물을 각각 주요 탄소원 및 질소원으로서 글리세린, 카제인 가수분해물 및 수산화암모늄을 사용하여 배양했다. 발효조를 탈이온수를 사용하여 6L 용적으로 다음 배지(표 22a)를 사용하여 일괄 처리했다.
[표 22a]
Figure 112012080180037-pct00051
상기 배지를 함유하는 발효조의 오토클레이빙 후, 다음 성분(표 22b)을 무균 상태로 첨가했다.
[표 22b]
Figure 112012080180037-pct00052
발효조를 통상적인 씨드 배양물로 접종하고, 4.2시간 후 2mM m-TA로 유도한 다음, 80시간 동안 배양하고, 탄소원(625g/L 글리세린 용액으로 구성됨) 및 4N 수산화암모늄 형태의 질소원을 공급했다. 탄소원 및 질소원을 NOVA 300A 생물분석기 상에서 오프라인으로 취한 샘플 판독에 기초하여 수동으로 조정했다. 글리세린의 농도를 1g/L 미만을 유지하도록 표적화하고, 공급률을 아세테이트 축적의 존재하에 추가로 감소시켰다. 암모니아 농도 표적은 배양액 중의 암모니아 100mg/L 이하였다. 2N 황산 형태의 산 및 4N 수산화나트륨 형태의 염기를 배양 동안 자동적으로 첨가하여 pH를 조절했다. 소포제를 또한 발효조에 자동적으로 공급하여 배양액의 발포를 조절했다. 발효조 조절 조건 및 생성물 수율은 이하 표 22c 및 22d에 각각 제시한다.
[표 22c]
Figure 112016019550472-pct00170
[표 22d]
Figure 112012080180037-pct00054
4. 에스케리키아 콜라이(MSC677)의 10-L 발효
통상적인 발효 조건하에 10-L 발효조를 사용하여, 에스케리키아 콜라이 균주 MSC677의 배양물을 각각 주요 탄소원 및 질소원으로서 글리세린, 카제인 가수분해물 및 수산화암모늄을 사용하여 배양했다. 발효조를 탈이온수를 사용하여 6L 용적으로 다음 배지(표 23a)를 사용하여 일괄 처리했다.
[표 23a]
Figure 112012080180037-pct00055
상기 배지를 함유하는 발효조의 오토클레이빙 후, 다음 성분(표 23b)을 무균 상태로 첨가했다.
[표 23b]
Figure 112012080180037-pct00056
발효조를 통상적인 씨드 배양물로 접종하고, 4.2시간 후 2mM m-TA로 유도한 다음, 80시간 동안 배양하고, 탄소원(625g/L 글리세린 용액으로 구성됨) 및 4N 수산화암모늄 형태의 질소원을 공급했다. 탄소원 및 질소원을 NOVA 300A 생물분석기 상에서 오프라인으로 취한 샘플 판독에 기초하여 수동으로 조정했다. 글리세린의 농도를 1g/L 미만을 유지하도록 표적화하고, 공급률을 아세테이트 축적의 존재하에 추가로 감소시켰다. 암모니아 농도 표적은 배양액 중의 암모니아 100mg/L 이하였다. 2N 황산 형태의 산 및 4N 수산화나트륨 형태의 염기를 배양 동안 자동적으로 첨가하여 pH를 조절했다. 소포제를 또한 발효조에 자동적으로 공급하여 배양액의 발포를 조절했다. 발효조 조절 조건 및 생성물 수율은 이하 표 23c 및 23d에 각각 제시한다.
[표 23c]
Figure 112016019550472-pct00171
[표 23d]
Figure 112012080180037-pct00058
5. 에스케리키아 콜라이(MSC702)의 10-L 발효
통상적인 발효 조건하에 10-L 발효조를 사용하여, 에스케리키아 콜라이 균주 MSC702의 배양물을 각각 주요 탄소원 및 질소원으로서 글리세린, 카제인 가수분해물 및 수산화암모늄을 사용하여 배양했다. 발효조를 탈이온수를 사용하여 6L 용적으로 다음 배지(표 24a)를 사용하여 일괄 처리했다.
[표 24a]
Figure 112012080180037-pct00059
상기 배지를 함유하는 발효조의 오토클레이빙 후, 다음 성분(표 24b)을 무균 상태로 첨가했다.
[표 24b]
Figure 112012080180037-pct00060
발효조를 통상적인 씨드 배양물로 접종하고, 4.2시간 후 2mM m-TA로 유도한 다음, 80시간 동안 배양하고, 탄소원(625g/L 글리세린 용액으로 구성됨) 및 4N 수산화암모늄 형태의 질소원을 공급했다. 탄소원 및 질소원을 NOVA 300A 생물분석기 상에서 오프라인으로 취해진 샘플 판독에 기초하여 수동으로 조정했다. 글리세린의 농도를 1g/L 미만을 유지하도록 표적화하고, 공급률을 아세테이트 축적의 존재하에 추가로 감소시켰다. 암모니아 농도 표적은 배양액 중의 암모니아 100mg/L 이하였다. 2N 황산 형태의 산 및 4N 수산화나트륨 형태의 염기를 배양 동안 자동적으로 첨가하여 pH를 조절했다. 소포제를 또한 발효조에 자동적으로 공급하여 배양액의 발포를 조절했다. 발효조 조절 조건 및 생성물 수율은 이하 표 24c 및 24d에 각각 제시한다.
[표 24c]
Figure 112012080180037-pct00061
[표 24d]
Figure 112012080180037-pct00062
실험 3 내지 5를 요약하기 위해, 균주 MSC619, MSC677 및 MSC702는 각각 3.45, 4.3 및 5.3g/L 콘드로이틴을 수득하여, 콘드로이틴 생산능을 향상시키는데 영역 2 배열(배경) 및 카피 수의 효과를 입증한다.
6. 에스케리키아 콜라이(MSC702)의 10-L 발효
통상적인 발효 조건하에 10-L 발효조를 사용하여, 에스케리키아 콜라이 균주 MSC702의 배양물을 각각 주요 탄소원 및 질소원으로서 글리세린, 카제인 가수분해물 및 수산화암모늄을 사용하여 배양했다. 발효조를 탈이온수를 사용하여 6L 용적으로 다음 배지(표 25a)를 사용하여 일괄 처리했다.
[표 25a]
Figure 112012080180037-pct00063
상기 배지를 함유하는 발효조의 오토클레이빙 후, 다음 성분(표 25b)을 무균 상태로 첨가했다.
[표 25b]
Figure 112012080180037-pct00064
발효조를 통상적인 씨드 배양물로 접종하고, 4시간 후 2mM m-TA로 유도한 다음, 82시간 동안 배양하고, 탄소원(625g/L 글리세린 용액으로 구성됨) 및 4N 수산화암모늄 형태의 질소원을 공급했다. 탄소원 및 질소원을 NOVA 300A 생물분석기 상에서 오프라인으로 취해진 샘플 판독에 기초하여 수동으로 조정했다. 글리세린의 농도를 1g/L 미만을 유지하도록 표적화하고, 공급률을 아세테이트 축적의 존재하에 추가로 감소시켰다. 암모니아 농도 표적은 배양액 중의 암모니아 100mg/L 이하였다. 2N 황산 형태의 산 및 4N 수산화나트륨 형태의 염기를 배양 동안 자동적으로 첨가하여 pH를 조절했다. 소포제를 또한 발효조에 자동적으로 공급하여 배양액의 발포를 조절했다. 발효조 조절 조건 및 생성물 수율은 이하 표 25c 및 25d에 각각 제시한다.
[표 25c]
[표 25d]
Figure 112012080180037-pct00066
이 작동은 발효 실험 5(상기)의 반복으로서 고안되었지만, 콘드로이틴 수율에서 상당한 증가를 달성했다. 수율의 차이는 적어도 부분적으로 증가된 수준의 아세테이트 축적과 함께 실험 5에 사용된 과량의 소포제에 기인하는 것으로 간주되지만, 이들 둘 다 콘드로이틴 수율에 부정적으로 영향을 미치는 것으로 간주된다.
7. 에스케리키아 콜라이(MSC702)의 50-L 발효
통상적인 발효 조건하에 50-L 발효조를 사용하여, 에스케리키아 콜라이 균주 MSC702의 배양물을 각각 주요 탄소원 및 질소원으로서 글리세린 및 수산화암모늄을 사용하여 규정된 배지 중에서 배양했다. 발효조를 탈이온수를 사용하여 40L 용적으로 다음 배지(표 26a)를 사용하여 일괄 처리했다.
[표 26a]
Figure 112012080180037-pct00067
상기 배지를 함유하는 발효조의 오토클레이빙 후, 다음 성분(표 26b)을 무균 상태로 첨가했다.
[표 26b]
Figure 112012080180037-pct00068
발효조를 통상적인 씨드 배양물로 접종하고, 4시간 후 2mM m-TA로 유도한 다음, 91시간 동안 배양하고, 탄소원(625g/L 글리세린 용액으로 구성됨) 및 6N 수산화암모늄 형태의 질소원을 공급했다. 탄소원 및 질소원을 NOVA 300A 생물분석기 상에서 오프라인으로 취해진 샘플 판독에 기초하여 수동으로 조정했다. 글리세린의 농도를 1g/L 미만을 유지하도록 표적화하고, 공급률을 아세테이트 축적의 존재하에 추가로 감소시켰다. 암모니아 농도 표적은 배양액 중의 암모니아 100mg/L 이하였다. 3N 황산 형태의 산 및 4N 수산화나트륨 형태의 염기를 배양 동안 자동적으로 첨가하여 pH를 조절했다. 소포제를 발효조에 수동으로 공급하여 배양액의 발포를 조절했다. 발효조 조절 조건 및 생성물 수율은 표 26c 및 26d에 각각 제시한다.
[표 26c]
Figure 112012080180037-pct00069
[표 26d]
Figure 112012080180037-pct00070
이 발효 실험은 높은 콘드로이틴 생산이 중간 발효 규모에서 규정된 (최소) 성장 배지에서 달성되었다는 것을 입증한다.
다음 두 발효(8 및 9)는 2개의 10L 반응기가 균주 MSC702 및 MSC724를 비교하면서 동일한 조건하에 나란히 작동된 하나의 실험으로부터 취했다.
8. 에스케리키아 콜라이(MSC702)의 10-L 발효
통상적인 발효 조건하에 10-L 발효조를 사용하여, 에스케리키아 콜라이 균주 MSC702의 배양물을 각각 주요 탄소원 및 질소원으로서 글리세린, 카제인 가수분해물 및 수산화암모늄을 사용하여 배양했다. 발효조를 탈이온수를 사용하여 6L 용적으로 다음 배지(표 27a)를 사용하여 일괄 처리했다.
[표 27a]
Figure 112012080180037-pct00071
상기 배지를 함유하는 발효조의 오토클레이빙 후, 다음 성분(표 27b)을 무균 상태로 첨가했다.
[표 27b]
Figure 112012080180037-pct00072
발효조를 통상적인 씨드 배양물로 접종하고, 4시간 후 2mM m-TA로 유도한 다음, 92시간 동안 배양하고, 탄소원(625g/L 글리세린 용액으로 구성됨) 및 황산암모늄 형태의 질소원을 공급했다. 탄소원 및 질소원을 NOVA 300A 생물분석기 상에서 오프라인으로 취해진 샘플 판독에 기초하여 수동으로 조정했다. 배양액 중의 글리세린의 농도를 1g/L 미만을 유지하도록 표적화하고, 공급률을 아세테이트 축적의 존재하에 추가로 감소시켰다. 암모니아 농도 표적은 배양액 중의 암모니아 100mg/L 이하였다. 2N 황산 형태의 산 및 4N 수산화나트륨 형태의 염기를 배양 동안 자동적으로 첨가하여 pH를 조절했다. 소포제를 또한 발효조에 자동적으로 공급하여 배양액의 발포를 조절했다. 발효조 조절 조건 및 생성물 수율은 표 27c 및 27d에 각각 제시한다.
[표 27c]
Figure 112012080180037-pct00073
[표 27d]
Figure 112012080180037-pct00074
9. 에스케리키아 콜라이(MSC724)의 10-L 발효
통상적인 발효 조건하에 10-L 발효조를 사용하여, 에스케리키아 콜라이 균주 MSC724의 배양물을 각각 주요 탄소원 및 질소원으로서 글리세린, 카제인 가수분해물 및 황산암모늄을 사용하여 배양했다. 발효조를 탈이온수를 사용하여 6L 용적으로 다음 배지(표 28a)를 사용하여 일괄 처리했다.
[표 28a]
Figure 112012080180037-pct00075
상기 배지를 함유하는 발효조의 오토클레이빙 후, 다음 성분(표 28b)을 무균 상태로 첨가했다.
[표 28b]
Figure 112012080180037-pct00076
발효조를 통상적인 씨드 배양물로 접종하고, 4시간 후 2mM m-TA로 유도한 다음, 92시간 동안 배양하고, 탄소원(625g/L 글리세린 용액으로 구성됨) 및 황산암모늄 형태의 질소원을 공급했다. 탄소원 및 질소원을 NOVA 300A 생물분석기 상에서 오프라인으로 취해진 샘플 판독에 기초하여 수동으로 조정했다. 배양액 중의 글리세린의 농도를 1g/L 미만을 유지하도록 표적화하고, 공급률을 아세테이트 축적의 존재하에 추가로 감소시켰다. 암모니아 농도 표적은 배양액 중의 암모니아 100mg/L 이하였다. 2N 황산 형태의 산 및 4N 수산화나트륨 형태의 염기를 배양 동안 자동적으로 첨가하여 pH를 조절했다. 소포제를 또한 발효조에 자동적으로 공급하여 배양액의 발포를 조절했다. 발효조 조절 조건 및 생성물 수율은 표 28c 및 28d에 각각 제시한다.
[표 28c]
Figure 112012080180037-pct00077
[표 28d]
Figure 112012080180037-pct00078
본 실시예에서 발효 8 및 9는 복합 배지 중의 MSC702에 비해 균주 MSC724의 향상된 rCH 수율을 입증한다. 이는 MSC702 중의 작용성이지만, 변경된 LeuB 효소(참조: 실시예 19)와 비교하여, MSC724 중의 천연 LeuB 효소의 보다 큰 대사 효율 결과일 수 있다.
실시예 21
본 실시예는 발효조에서 잔토모나스 캄페스트리스에서 콘드로이틴의 재조합 DNA-매개 생산을 기술한다.
잔토모나스 캄페스트리스(MSC480)의 10-L 발효
통상적인 발효 조건하에 10-L 발효조를 사용하여, 잔토모나스 캄페스트리스 균주 MSC480의 배양물을 탄소원으로서 글루코즈를 사용하여 배양했다. 발효조를 탈이온수를 사용하여 7.5L 용적으로 다음 배지(표 29a)를 사용하여 일괄 처리했다.
[표 29a]
Figure 112012080180037-pct00079
상기 배지를 함유하는 발효조의 오토클레이빙 후, 60g의 글루코즈(가열-멸균됨)를 무균 상태로 첨가했다.
발효조를 통상적인 씨드 배양물로 접종한 다음, 70시간 동안 배양하고, 배양 동안 탄소원(871g/L 글루코즈 용액으로 구성됨)을 공급했다. 70시간 후, 발효조를 오토클레이빙하고, 원심분리로 수거했다. 발효조 조절 조건 및 생성물 수율은 표 29b 및 29c에 각각 제시한다.
[표 29b]
Figure 112012080180037-pct00080
[표 29c]
Figure 112016019550472-pct00173
실시예 22
본 실시예는 개량된 에스케리키아 콜라이 성장 배지를 예시한다.
상기 실시예 4, 7, 및 8은 rCH-생산 재조합 에스케리키아 콜라이 K-12 균주의 성장을 위한 복합 TB 배지의 용도를 기술한다. 통상적으로 제형화된 바와 같이, TB 배지는 제1 탄소원으로서 5g/L 글리세린을 함유한다. 본 실시예는 진탕 플라스크에서 rCH 용적 측정 및 특정 생산능을 향상시키는 TB 배지에 대한 변형을 기술한다.
균주 MSC564의 작은 배양물을 접종물로서 사용하기 위해 30℃에서 TB/Tc5 배지에서 성장시켰다. 표준 TB 배지[참조: Sambrook et al., 1989; Difco "Terrific Broth"]를 0.1M MOPS 완충제(4-모르폴린프로판설폰산; NaOH로 7.2로 pH 조정된 1.0M 스톡 용액으로부터 제조됨), 10vg/L 글리세린(2X 표준 TB 처방), 또는 둘 다로 변형시켰다. 각 배지 50mL를 함유하는 삼각 진탕 플라스크(250mL)를 MSC564 배양물로 접종하여 OD600 = 0.03을 달성했다. 플라스크를 OD600 값이 약 0.125에 도달할 때까지 30℃에서 진탕시켰고(225rpm), 그 시간에 메타-톨루엔산을 1mM로 첨가하여 rCH 생산을 유도했다. 72시간 동안 계속 진탕 후, pH 및 OD600을 측정하고, 5mL 분취량을 5 내지 7분 동안 오토클래이빙하고, 냉각시키고 동결 저장했다. rCH 함량을 실시예 14에 기술된 바와 같이 측정했다. 최종 OD600 및 rCH 농도는 표 30에 제시한다.
[표 30]
Figure 112012080180037-pct00082
완충되고 과잉 글리세린(2X 표준)으로 수정된 TB 배지는 추가의 세포 밀도(더 큰 특정 생산능) 없이 rCH 역가(더 큰 용적 생산능)의 50% 초과 증가를 유도했다. 2X 글리세린을 포함하지만 완충제가 없는 배지 중의 성장 및 생산능은 글리세린으로부터 과량의 산 생산에 기인할 것 같은 불량한 생산능을 유도했다. 이는 재조합 균주에서 증가된 생산 용량을 입증하고, 신규 에스케리키아 콜라이 균주를 평가하기 위해 보다 높은 생산능 성장 조건을 제공한다.
본 발명의 상기 설명은 예시 및 설명 목적으로 제시되었다. 또한, 설명은 본 발명은 본원에 기술된 형태로 제한하고자 하지 않는다.
본원에 기술된 각종 국면, 양태 및 선택안 모두를 임의의 모든 변화에서 결합시킬 수 있다.
본 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허 및 특허원은 각각 개별 공보, 특허 또는 특허원이 본원에 참조되는 것으로 구체적이고 개별적으로 기술되는 것처럼 동일한 정도로 참조로 인용된다.
<110> DSIM IP Assets B.V. SEIKAGAKU CORPORATION <120> Compositions and Methods for Bacterial Production of Chondroitin <130> IPA120861 <150> US 61/309,407 <151> 2010-03-01 <160> 175 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 981 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 1 atgagcgaac gccacttgcc ggatgaccag tcctcgacca ttgatccgta tctgattacg 60 agcgtccgcc agaccctggc cgaacaaagc gcggcactgc aaaacctgtc caaacaactg 120 gatagcggtc agtaccagcg cgtcctgaat ctcatcatga attgtaaagg gcacgtcatc 180 ctgagcggca tgggtaaaag cggccatgtg ggccgcaaga tgtcggcgac cttggcctcg 240 accgggacgc cctccttctt tattcatccg gcggaagcgt tccatggtga tctgggcatg 300 atcaccccgt atgacctgct catcttgatt tcggcgagcg gtgagacgga cgagatcctg 360 aaactggtgc cgagcctgaa gaacttcggc aatcgcatca tcgcaatcac caataacggg 420 aatagcaccc tggccaaaaa tgcagatgcg gtcctggagc tgcacatggc gaacgaaacg 480 tgcccgaaca atctcgcccc gaccacctcc acgacgctca cgatggcgat cggggacgcg 540 ctggccatcg cgatgattca ccagcgtaag tttatgccca atgactttgc acgctaccac 600 cccggtggca gcctgggtcg 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110 Ser Gly Glu Thr Asp Glu Ile Leu Lys Leu Val Pro Ser Leu Lys Asn 115 120 125 Phe Gly Asn Arg Ile Ile Ala Ile Thr Asn Asn Gly Asn Ser Thr Leu 130 135 140 Ala Lys Asn Ala Asp Ala Val Leu Glu Leu His Met Ala Asn Glu Thr 145 150 155 160 Cys Pro Asn Asn Leu Ala Pro Thr Thr Ser Thr Thr Leu Thr Met Ala 165 170 175 Ile Gly Asp Ala Leu Ala Ile Ala Met Ile His Gln Arg Lys Phe Met 180 185 190 Pro Asn Asp Phe Ala Arg Tyr His Pro Gly Gly Ser Leu Gly Arg Arg 195 200 205 Leu Leu Thr Arg Val Ala Asp Val Met Gln His Asp Val Pro Ala Val 210 215 220 Gln Leu Asp Ala Ser Phe Lys Thr Val Ile Gln Arg Ile Thr Ser Gly 225 230 235 240 Cys Gln Gly Met Val Met Val Glu Asp Ala Glu Gly Gly Leu Ala Gly 245 250 255 Ile Ile Thr Asp Gly Asp Leu Arg Arg Phe Met Glu Lys Glu Asp Ser 260 265 270 Leu Thr Ser Ala Thr Ala Ala Gln Met Met Thr Arg Glu Pro Leu Thr 275 280 285 Leu Pro Glu Asp Thr Met Ile Ile Glu Ala Glu Glu Lys Met Gln Lys 290 295 300 His Arg Val Ser Thr Leu Leu Val Thr Asn Lys Ala Asn Lys Val Thr 305 310 315 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attatcgcga cgtcccgcaa aacctgatcc aggccatcgt ggatgcgaat 840 acgacccgta aggacttcgt ggccgaggac atcctgtccc gtaagcccaa agtggtcggt 900 atctatcgcc tgatcatgaa ggcgggtagc gacaatttcc gggccagcag catccagggg 960 gtcatgaaac gtttgaaggc caagggtatc gagattgtgg tgtacgagcc ggtcctgaaa 1020 gaaccctact tcttcggttc ctacgtcgag cgcgacatca attcctttaa ggagcgcgtc 1080 gatgtcattg tggcgaatcg ccgcaccagc gaactggaag atgtctcgga gaaagtctac 1140 acccgcgacc tgttcggcgt cgattcg 1167 <210> 28 <211> 389 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 28 Met Lys Ile Ala Val Ala Gly Val Gly Tyr Val Gly Ile Ser Ile Ala 1 5 10 15 Ile Leu Leu Ser Gln Lys His Asp Ile Ile Ala Leu Asp Ile Asp Pro 20 25 30 Lys Lys Val Gln Leu Ile Asn Lys Lys Ile Ser Pro Ile Cys Asp Pro 35 40 45 Glu Ile Gln Lys Phe Leu Ser Asn Arg Lys Leu Asn Leu Tyr Ala Thr 50 55 60 Thr Glu Lys Tyr Glu Ala Tyr Arg Asp Ala Asp Tyr Val Ile Ile Ala 65 70 75 80 Thr Pro Thr Asn Tyr Asp Pro Ile Asn Asn Asn Phe Asp Thr Leu Ser 85 90 95 Val Glu Ser Val Ala Cys Asp Val Leu Ser Ile Asn 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Tyr Arg Arg Asp Val Leu Gln Asn Tyr Ser Gln 180 185 190 Leu Pro Glu Ser Met Pro Glu Gln Ala Glu Ser Leu Glu Gln Leu Arg 195 200 205 Leu Met Ser Ala Gly Ile Asn Ile Arg Thr Phe Glu Val Ala Ala Thr 210 215 220 Gly Pro Gly Val Asp Thr Pro Ala Cys Leu Glu Lys Val Arg Ala Leu 225 230 235 240 Met Ala Gln Glu Leu Ala Glu Asn Ala 245 <210> 96 <211> 256 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 96 Met Gly Ser Gln Arg Val Arg Leu Ile Ala Glu Asn Val Ser Pro Gln 1 5 10 15 Ser Leu Leu Arg His Val Ser Arg Val Tyr Val Val Thr Ser Gln Tyr 20 25 30 Gly Phe Glu Ala Leu Leu Ala Gly Lys Pro Val Thr Cys Phe Gly Gln 35 40 45 Pro Trp Tyr Ala Gly Trp Gly Leu Thr Asp Asp Arg His Pro Gln Ser 50 55 60 Ala Leu Leu Ser Ala Arg Arg Gly Ser Ala Thr Leu Glu Glu Leu Phe 65 70 75 80 Ala Ala Ala Tyr Leu Arg Tyr Cys Arg Tyr Ile Asp Pro Gln Thr Gly 85 90 95 Glu Val Ser Ala Leu Phe Thr Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Gln Arg 100 105 110 Arg His Leu Gln Gln Arg Asn Gly Tyr Leu Trp Val Pro Gly Leu 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Tyr Ser Ser 50 55 60 Leu Pro Arg Asp Pro Asp Phe Tyr Arg Lys Leu Pro Asp Met Pro Thr 65 70 75 80 Pro His Val Glu Asn Leu Lys Pro Ser Thr Met Lys Arg Ile Gly His 85 90 95 Ala Met Trp Tyr Tyr Leu Met Gly Trp His Tyr Arg His Glu Phe Pro 100 105 110 Arg Tyr Arg His His Lys Ser Phe Ser Pro Trp Tyr Glu Ala Arg Cys 115 120 125 Trp Val Arg Ala Tyr Trp Arg Lys Gln Leu Tyr Lys Val Thr Gln Arg 130 135 140 Lys Val Leu Pro Arg Leu Met Asn Glu Leu Asp Gln Arg Tyr Tyr Leu 145 150 155 160 Ala Val Leu Gln Val Tyr Asn Asp Ser Gln Ile Arg Asn His Ser Asn 165 170 175 Tyr Asn Asp Val Arg Asp Tyr Ile Asn Glu Val Met Tyr Ser Phe Ser 180 185 190 Arg Lys Ala Pro Lys Glu Ser Tyr Leu Val Ile Lys His His Pro Met 195 200 205 Asp Arg Gly His Arg Leu Tyr Arg Pro Leu Ile Lys Arg Leu Ser Lys 210 215 220 Glu Tyr Gly Leu Asp Glu Arg Val Ile Tyr Val His Asp Leu Pro Met 225 230 235 240 Pro Glu Leu Leu Arg His Ala Ser Leu Ile Ser 245 250 <210> 98 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence 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caatcagtga ccacttttcc aagcaaaaat 1500 aacgccaagc agaacgaaga cgttcttttt aagaagcgag aacaccagaa gttcgtgctg 1560 tcggggcatg cggcgacgaa ttggcggata aaggggatct gcag 1604 <210> 108 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 108 cgcaagcttc gtaccgaaag atcagttgc 29 <210> 109 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 109 ccaaaagaga aatctgcagt agatgggatg ttattttacc g 41 <210> 110 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 110 acatcccatc tactgcagat ttctcttttg gggcacgg 38 <210> 111 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 111 gctctagaca tctgccataa caacggag 28 <210> 112 <211> 1750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 112 gctctagaca tctgccataa caacggagaa agcgccatcg ccgttaacag tcgacggcgc 60 gaaataagag gtaagccgct catcaataaa caaaactcac aggtgcagca cccgccggat 120 gcggcaaaat acccatcggg atgccataaa tcatttcgag ggtttcgccg cgcataattt 180 ccgcaggcgt tccctgagca atcatttcac cgccgcgcag ggcgaccaga taatcacagt 240 agcgtgccgc catattgata tcgtgcaaca cggcaatgac cgtcaggcca cgctcctgac 300 ttaaacggtg caccagcgac agcacatcaa cctggtgggc gatatccagc gccgaggtcg 360 gttcgtcgag caacagacaa cggctatcct gcgccaccag catggcgatc cacgcccgct 420 gacgttcgcc gccagagaga ctatcgacca gccgatgcgc cagcggtttt aagccaacca 480 gcgagatagc ttcctcgact ttttcgcgat ctgccgcccc aaagcgcccc agcgcgccat 540 gccacgggta acgaccaatc gccaccagtt cacgcacggt catcccttct gccggaggaa 600 gctgctgcgg caaataagcc actttgcggg caaacgcttt gctgctccag ctttccagcg 660 gttgggcatc aagaagaatc tccccttccg acggcggctg atgacggcca agcattttga 720 gcagagtgga tttaccagaa ccgttgtgac caatcagacc ggtcactttc ccggcaggaa 780 aggttaacga cagcggatgc aaaagcgtgc gcccgggcac acgaaaggag atattacgca 840 gtgcaaaagt ggtatcggaa tgattcgtgt attcctgcat aacagccaac ttgtgaaatg 900 ggcacggaaa tccgtgcccc aaaagagaaa tctgcagtag atgggatgtt attttaccgg 960 atggcaactc gccatccggt atttcacgct tagatgttaa ttactaccaa acatatcctt 1020 gatccaaccg gctacaccgt cgctgtcttt ctgctcttgc tgagcaggtt gctgttgcgg 1080 ctgttgctgc ggctgagaag actgatcaaa cggattgcct gacggctgct gctgcatctc 1140 gctctgctgg cacagcgatt gcggatcgct ggtccagacc ggcaagatac gcatgccacc 1200 gctgcaaaca aagttgccgt cgtagtccac gcccatatct gcaatatctt ctggcggaac 1260 aagattcagc ggcgttggcg tctggttagc cagataacgc tgataaatcg acattgcccc 1320 gctggcacca tacagtttgg tcggctggtt gttatcacgg ccgacccagg tgatggtcac 1380 cgtgctgccg tcaatgcccg caaaccaggt atctacgtta ttgttggtag tccctgtttt 1440 ccctgccaga tgcaggttcg ggtatttcgc cccaagctga cgacccgtac cgcgttgtac 1500 cacctgctgc atggtccata gtgtcagata cgccgcctgc gccggaacag cgcgttccgc 1560 ctgcgggaag ctctgataca gcactttgcc atcttccgcg attaccgaac gcagcgcaga 1620 aagcggtgca cggttaccac cgctggcgat ggtctggaat gcctgcgcca cttcgattgg 1680 cgttaagttc aacgccccca gcagcattgc cggaaccgga tgcaactgat ctttcggtac 1740 gaagcttgcg 1750 <210> 113 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 113 gcgagatctc atgtttgaca gcttatcatc gctcggcttt aatgcggtag tttatcac 58 <210> 114 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 114 ccggcgtaca agatccacag gacgggtgtg 30 <210> 115 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 115 ctgtggatct tgtacgccgg acgcatcgtg 30 <210> 116 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 116 gcggatcctt ccattcaggt cgaggtg 27 <210> 117 <211> 23230 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 117 gcatggactg accatggttt tatattcatt aaaaattttg ttacaaccca ttgatttagc 60 ataaataaat tatagtgggt tcgggtttgt tgtgactgtg gcattatttc cgtgcaaagg 120 agctgatatg tctgaaagac atttacctga tgaccagagc agtactatcg atccatatct 180 aattacctct gttcgccaga ctctggcaga acaaagcgca gcattacaaa acttgtctaa 240 acaactggat tccgggcagt accagcgtgt ccttaatttg ataatgaact gtaaagggca 300 cgttattctt tcgggaatgg gtaaatcagg gcatgtcggt cgtaaaatgt cagcgacgct 360 ggcctctacg ggtacgccta gtttctttat tcatcctgca gaagctttcc atggcgatct 420 gggcatgatt acgccttacg atcttctgat ccttatttct gccagcggtg aaacggatga 480 aatcctcaag ctagttcctt cactgaaaaa tttcggcaac cgaattatcg ccattaccaa 540 taatggaaat tccacgctgg cgaaaaatgc tgatgccgtg ctggaactcc acatggcgaa 600 tgaaacctgc ccgaataatc ttgcaccaac aacgtctacc acgctgacga tggcgatcgg 660 cgatgcgctg gcgattgcca tgatccacca acgcaaattt atgccgaatg attttgcgcg 720 ctatcacccg ggcggttcat taggtcgtcg cctgctgacc cgcgttgctg atgtcatgca 780 gcatgatgtt cctgcggtac agctggatgc gtcatttaaa accgtgattc aacgtatcac 840 cagcggatgc cagggaatgg tgatggtaga agacgcagaa ggtgggctag cgggcattat 900 caccgacggt gacctgcgtc gctttatgga aaaagaggat tctctgacat ccgccacggc 960 tgcgcagatg atgacacgtg aaccgctgac gctaccggaa gacaccatga tcattgaagc 1020 ggaagaaaaa atgcaaaagc accgcgtctc aacgttattg gtgaccaaca aggcaaataa 1080 agtcactggc cttgtgcgca ttttcgacta attaagcaac ggggtgcgag aggttagtct 1140 ctcattgagt ttgcgcccca ctgaaacttt gataatcgtt acatgttgat aaaagtgaag 1200 tctgccgtat cctggatgcg tgctcgtctg tctgccatct cactggcaga tatccaaaaa 1260 cacctggcga aaatcatcat tctggcaccg atggcggtgc tgctgatcta tctggctatc 1320 ttcagccagc ctcgctatat gagcgagtcg aaagtcgcca ttaaacgctc ggatgattta 1380 aacagcggca gcctgaattt tggtctgctt ctgggtgcct ctaaccccag ttccgcagaa 1440 gatgcgttgt atctgaaaga gtacatcaac tcgccggata tgctggcggc gctggataag 1500 caactaaatt ttcgtgaagc gtttagccac agcgggctcg attttcttaa tcatcttagc 1560 aaggatgaaa ccgcagaagg cttcctgaag tactacaagg accgtatcaa cgtctcgtat 1620 gacgataaaa ccggattact gaatattcag acgcagggct ttagcccgga gtttgcgctt 1680 aagtttaacc aaaccgtgct gaaagagtca gagcgcttta tcaatgagat gtcacatcgc 1740 atcgcgcgtg accagcttgc ctttgcagaa acggagatgg aaaaggcacg ccagcgtctg 1800 gacgccagca aagcggaatt gctctcttat caggacaaca acaacgttct ggatccacag 1860 gcacaggcac aggcggcgag cacgttagtg aatacgctga tgggccagaa gatccagatg 1920 gaagcggacc tgcggaactt gctgacgtat ctgcgtgagg acgccccgca agttgtgagt 1980 gcgcgtaatg cgattcagtc attgcaggca caaattgacg aagaaaaaag caaaatcact 2040 gcgccacagg gtgacaagct aaaccgtatg gcagtggatt ttgaagaaat caaatcaaaa 2100 gtagagttca acaccgagct gtacaaactg 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ttccagcacc 12720 gaataacctt tacccgtgcc caaattaaag acgtggtagt tggtgttatt gtcgcggaag 12780 agataggaca gcgctgcgac gtgcccttcg gccaggtcca tcacatggat atagtcacgg 12840 acccccgtgc cgtctttggt gggataatca ccaccgaaca ccatcagttt ttccagtttc 12900 cccatcgcga cctgcaagat gtacggcacc aagttggagg ggatgtctgc cgggctttca 12960 ccaatcatac cggattcgtg ggcgcccgtc ggattaaagt agcgcaagca gaggaaattc 13020 gtgtcggagt atttcttggc gatgtcgcgg atcatcagct ccgagatgta cttggacgta 13080 ccatacggat tcagcgtgcc accaatatgg cagtcttcgg tgacgggcat gatcttgctt 13140 tccccataca ccgtcgccga cgagctaaag atgaagttgg cgacgtcgtt cttgatggcg 13200 caattgatga gttgcagggt gccgctcacg ttgttgtcat agtagaagat gggcttgatc 13260 aggctttctg cgaccgattt cgcacctgca aagtgcatga tgcagtcgaa tttgtgtttc 13320 ttcaggatct ggttcacttc cttctcgttg ttgatattga gttcgtagaa cgtgactttc 13380 ttctttgcga tcagctcaat gcgacggatg ctttcgcagc tgctgttgat gagattgtca 13440 atgatgacga cattgtagcc tttgttcagc aggcagagcg acgtgtggct gccgatgtag 13500 cctgcaccgc cggtgaccag gatgttcatt tattaacctc ctcggtccga attaacctag 13560 gttatgaggt cagcattgct tcttcacgcg gtgttaatta atagacctgc aggattattg 13620 tttctgttgc ataaagccta aggggtaggc ctttctagag atagccattt tttgcactcc 13680 tgtatccgct tcttgcaagg ctggacttat ccctatcaaa ccggacactg caggctgaca 13740 agctttcatt acatatgaag agtttgtaga aacgcaaaaa ggccatccgt caggatggcc 13800 ttctaagaag gctcgagcag tacagcaagg atagaacccg gagatgccgg agaaaccaga 13860 ccaccgccca ggatagtcag cgtgaacacg ccagtcatac cgccgaggat gactgcgagg 13920 atcagacgcg gattcatcag cacatacggg aagtagattt cgtggatacc ccccaggaag 13980 tggatgattg ccgcaccgcc cgcagactgt ttagcgctac cacgaccaaa gaacatgtac 14040 gccagcagca cgcccatacc tggacctggg ttagcttcaa tcaggaagaa gattgattta 14100 cccagttcat gggactgctg aatacccagc ggcgagaaga taccgtggtt aatggcgttg 14160 ttgaggaaca ggattttcgc cggttcaaca aagatagacg ccagcggcag catgtcatgg 14220 acaaccatga agttaacgcc cgcagccagc attttggaca gggcttcaac aatcgggcca 14280 atgccgagga atgccagaat agcgaggatc atcccgatga tgcctgcgga gaagttattc 14340 accagcatct caaaaccgga tttgatctta ccgtctaccc agcggtcgaa gtgcttaatg 14400 caccagccgc ccagcggacc tgcaatcata gaaccgagga acatcggcat gtctgcgccg 14460 acgataacgc ccatggtggt gatggcaccg actacgccgc cacgttcgcc gcctaccagc 14520 ttaccaccgg tataaccgat cagcagcggc aggagataag tgatcatcgg cccgaccagc 14580 ttcgccagcg tctcgttcgg taaccaccct gttggaattt attagcggcc gctaatgaat 14640 cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattggcacc attccttgcg gcggcggtgc 14700 tcaacggcct caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc 14760 gtc 14763 <210> 173 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer BLR513 <400> 173 tcatcaagct tgtccggaag tgatgaccc 29 <210> 174 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer BLR516 <400> 174 gtagcctcga gcatggtggc gttgtcgatg 30 <210> 175 <211> 5859 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic plasmid pBR1103 <400> 175 gatccccgac agtaagacgg gtaagcctgt tgatgatacc gctgccttac tgggtgcatt 60 agccagtctg aatgacctgt cacgggataa tccgaagtgg tcagactgga aaatcagagg 120 gcaggaactg ctgaacagca aaaagtcaga tagcaccaca tagcagaccc gccataaaac 180 gccctgagaa gcccgtgacg ggcttttctt gtattatggg tagtttcctt gcatgaatcc 240 ataaaaggcg cctgtagtgc catttacccc cattcactgc cagagccgtg agcgcagcga 300 actgaatgtc acgaaaaaga cagcgactca ggtgcctgat ggtcggagac aaaaggaata 360 ttcagcgatt tgcccgagct tgcgagggtg ctacttaagc ctttagggtt ttaaggtctg 420 ttttgtagag gagcaaacag cgtttgcgac atccttttgt aatactgcgg aactgactaa 480 agtagtgagt tatacacagg gctgggatct attcttttta tcttttttta ttctttcttt 540 attctataaa ttataaccac ttgaatataa acaaaaaaaa cacacaaagg tctagcggaa 600 tttacagagg gtctagcaga atttacaagt tttccagcaa aggtctagca gaatttacag 660 atacccacaa ctcaaaggaa aaggactagt aattatcatt gactagccca tctcaattgg 720 tatagtgatt aaaatcacct agaccaattg agatgtatgt ctgaattagt tgttttcaaa 780 gcaaatgaac tagcgattag tcgctatgac ttaacggagc atgaaaccaa gctaatttta 840 tgctgtgtgg cactactcaa ccccacgatt gaaaacccta caaggaaaga acggacggta 900 tcgttcactt ataaccaata cgttcagatg atgaacatca gtagggaaaa tgcttatggt 960 gtattagcta aagcaaccag agagctgatg acgagaactg tggaaatcag gaatcctttg 1020 gttaaaggct ttgagatttt ccagtggaca aactatgcca agttctcaag cgaaaaatta 1080 gaattagttt ttagtgaaga gatattgcct tatcttttcc agttaaaaaa attcataaaa 1140 tataatctgg aacatgttaa gtcttttgaa aacaaatact ctatgaggat ttatgagtgg 1200 ttattaaaag aactaacaca aaagaaaact cacaaggcaa atatagagat tagccttgat 1260 gaatttaagt tcatgttaat gcttgaaaat aactaccatg agtttaaaag gcttaaccaa 1320 tgggttttga aaccaataag taaagattta aacacttaca gcaatatgaa attggtggtt 1380 gataagcgag gccgcccgac tgatacgttg attttccaag ttgaactaga tagacaaatg 1440 gatctcgtaa ccgaacttga gaacaaccag ataaaaatga atggtgacaa aataccaaca 1500 accattacat cagattccta cctacataac ggactaagaa aaacactaca cgatgcttta 1560 actgcaaaaa ttcagctcac cagttttgag gcaaaatttt tgagtgacat gcaaagtaag 1620 tatgatctca atggttcgtt ctcatggctc acgcaaaaac aacgaaccac actagagaac 1680 atactggcta aatacggaag gatctgaggt tcttatggct cttgtatcta tcagtgaagc 1740 atcaagacta acaaacaaaa gtagaacaac tgttcaccgt tacatatcaa agggaaaact 1800 gtccatatgc acagatgaaa acggtgtaaa aaagatagat acatcagagc ttttacgagt 1860 ttttggtgca tttaaagctg ttcaccatga acagatcgac aatgtaacag atgaacagca 1920 tgtaacacct aatagaacag gtgaaaccag taaaacaaag caactagaac atgaaattga 1980 acacctgaga caacttgtta cagctcaaca gtcacacata gacagcctga aacaggcgat 2040 gctgcttatc gaatcaaagc tgccgacaac acgggagcca gtgacgcctc ccgtggggaa 2100 aaaatcatgg caattctgga agaaatagcg ctttcagccg gcaaaccggc tgaagccgga 2160 tctgcgattc tgataacaaa ctagcaacac cagaacagcc cgtttgcggg cagcaaaacc 2220 cgtacttttg gacgttccgg cggttttttg tggcgagtgg tgttcgggcg gtgcgcgcaa 2280 gatccattat gttaaacggg cgagtttaca tctcaaaacc gcccgcttaa caccatcaga 2340 aatcctcagc gcgattttaa gcaccaaccc ccccccgtaa cacccaaatc catactgaaa 2400 gtggctttgt tgaataaatc gaacttttgc tgagttgaag gatcagatca cgcatcctcc 2460 cgacaacaca gaccattccg tggcaaagca aaagttcaga atcaccaact ggtccaccta 2520 caacaaagct ctcatcaacc gtggctccct cactttctgg ctggatgatg aggcgattca 2580 ggcctggtat gagtcggcaa caccttcatc acgaggaagg ccccagcgct attctgatct 2640 cgccatcacc accgttctgg tgattaaacg cgtattccgg ctgaccctgc gggctgcgca 2700 gggttttatt gattccattt ttgccctgat gaacgttccg ttgcgctgcc cggattacac 2760 cagtgtcagt aagcgggcaa agtcggttaa tgtcagtttc aaaacgtcca cccggggtga 2820 aatcgcacac ctggtgattg attccaccgg gctgaaggtc tttggtgaag gcgaatggaa 2880 agtcagaaag cacggcaaag agcgccgtcg tatctggcga aagttgcatc ttgctgtggg 2940 gatcaacacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 3000 aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 3060 aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 3120 gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 3180 gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 3240 tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 3300 ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 3360 aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc ttcgaataaa tacctgtgac ggaagatcac 3420 ttcgcagaat aaataaatcc tggtgtccct gttgataccg ggaagccctg ggccaacttt 3480 tggcgaaaat gagacgttga tcggcacgta agaggttcca actttcacca taatgaaata 3540 agatcactac cgggcgtatt ttttgagtta tcgagatttt caggagctaa ggaagctaaa 3600 atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 3660 cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat 3720 attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt 3780 cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaattcc gtatggcaat gaaagacggt 3840 gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa 3900 acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat 3960 tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag 4020 aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg 4080 gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc 4140 gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatcatg ccgtttgtga tggcttccat 4200 gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag tactgcgatg agtggcaggg cggggcgtaa 4260 tttttttaag gcagttattg gtgcccttaa acgcctggtt gctacgcctg aataagtgat 4320 aataagcgga tgaatggcag aaattcgaaa gcaaattcga cccggtcgtc ggttcagggc 4380 agggtcgtta aatagccgct tatgtctatt gctggtttac cggtttattg actaccggaa 4440 gcagtgtgac cgtgtgcttc tcaaatgcct gaggccagtt tgctcaggct ctccccgtgg 4500 aggtaataat tgacgatatg atcatttatt ctgcctccca gagcctgata aaaacggtga 4560 atccgttagc gaggtgccgc cggcttccat tcaggtcgag gtggcccggc tccatgcacc 4620 gcgacgcaac gcggggaggc agacaaggta tagggcggcg cctacaatcc atgccaaccc 4680 gttccatgtg ctcgccgagg cggcataaat cgccgtgacg atcagcggtc caatgatcga 4740 agttaggctg gtaagagccg cgagcgatcc ttgaagctgt ccctgatggt cgtcatctac 4800 ctgcctggac agcatggcct gcaacgcggg catcccgatg ccgccggaag cgagaagaat 4860 cataatgggg aaggccatcc agcctcgcgt cgcgaacgcc agcaagacgt agcccagcgc 4920 gtcggccgcc atgccggcga taatggcctg cttctcgccg aaacgtttgg tggcgggacc 4980 agtgacgaag gcttgagcga gggcgtgcaa gattccgaat accgcaagcg acaggccatg 5040 tttgacagct tatcatcgaa gcttgtccgg aagtgatgac ccaggcgctg aaagtgctgg 5100 atgccgtgcg caaccgcttt gcgatgcgca tcaccaccag ccattacgat gtaggcggcg 5160 cagccattga taaccacggg caaccactgc cgcctgcgac ggttgaaggt tgtgagcaag 5220 ccgatgccgt gctgtttggc tcggtaggcg gcccgaagtg ggaacattta ccaccagacc 5280 agcaaccaga acgcggcgcg ctgctgcctc tgcgtaagca cttcaaatta ttcagcaacc 5340 tgcgcccggc aaaactgtat caggggctgg aagcattctg tccgctgcgt gcagacattg 5400 ccgcaaacgg cttcgacatc ctgtgtgtgc gcgaactgac cggcggcatc tatttcggtc 5460 agccaaaagg ccgcgaaggt agcggacaat atgaaaaagc ctttgatacc gaggtgtatc 5520 accgttttga gatcgaacgt atcgcccgca tcgcgtttga atctgctcgc aagcgtcgcc 5580 acaaagtgac gtcgatcgat aaagccaacg tgctgcaatc ctctatttta tggcgggaga 5640 tcgttaacga gatcgccacg gaatacccgg atgtcgaact ggcgcatatg tacatcgaca 5700 acgccaccat gctcgagtat gcggccgcta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 5760 tttgcgtatt ggcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa cggcctcaac ctactactgg 5820 gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg gagagcgtc 5859

Claims (64)

  1. kfoA 유전자, kfoC 유전자 및 kfoF 유전자를 포함하되, kfoD, orf3(kfoI), kfoE 및 orf1(kfoH) 중 하나 이상의 기능성 유전자를 함유하지 않고, 비-병원성 박테리아 숙주 세포에서 콘드로이틴을 생산하기에 적합한 작제물(construct).
  2. 제1항에 있어서,
    kfoG 유전자, kfoB 유전자 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 작제물.
  3. 제1항에 있어서,
    콘드로이틴이 프럭토실화되지 않은(non-fructosylated), 작제물.
  4. 제1항에 있어서,
    kpsF 유전자, kpsE 유전자, kpsD 유전자, kpsU 유전자, kpsC 유전자 및 kpsS 유전자를 추가로 포함하는 작제물.
  5. 제4항에 있어서,
    kpsM 유전자 및 kpsT 유전자를 추가로 포함하는 작제물.
  6. 제4항에 있어서,
    콘드로이틴이 숙주 세포로부터 분비되는, 작제물.
  7. 제1항에 있어서,
    kpsM, kpsT, kpsE, kpsD, kpsC 및 kpsS 중 하나 이상의 기능성 유전자를 또한 함유하지 않는 작제물.
  8. 제7항에 있어서,
    콘드로이틴이 숙주 세포로부터 분비되지 않는, 작제물.
  9. 제1항에 있어서,
    하나 이상의 유전자가 박테리아 숙주 세포에서의 최적의 코돈 사용빈도(codon usage)를 위해 변형되는, 작제물.
  10. 제1항에 있어서,
    K4 유전자 클러스터를 포함하는 작제물.
  11. 제1항에 따른 작제물을 포함하는 비-병원성 박테리아 숙주 세포.
  12. 제11항에 있어서,
    에스케리키아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 잔토모나스(Xanthomonas), 메틸로모나스(Methylomonas), 아시네토박터(Acinetobacter) 및 스핑고모나스(Sphingomonas)로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-병원성 유기체이거나 이로부터 유도되는 비-병원성 박테리아 숙주 세포.
  13. 제12항에 있어서,
    MSC279, MSC280, MSC315, MSC316, MSC317, MSC319, MSC322, MSC323, MSC324, MSC325, MSC326, MSC328, MSC346, MSC347, MSC348, MSC350, MSC356, MSC359, MSC392, MSC402, MSC403, MSC404, MSC405, MSC410, MSC411, MSC436, MSC437, MSC438, MSC439, MSC458, MSC459, MSC460, MSC461, MSC466, MSC467, MSC469, MSC480, MSC494, MSC498, MSC499, MSC500, MSC510, MSC511, MSC522, MSC526, MSC537, MSC551, MSC561, MSC562, MSC563, MSC564, MSC566, MSC567, MSC619, MSC625, MSC627, MSC640, MSC641, MSC643, MSC646, MSC650, MSC656, MSC657, MSC658, MSC659, MSC660, MSC669, MSC670, MSC671, MSC672, MSC673, MSC674, MSC675, MSC676, MSC677, MSC678, MSC679, MSC680, MSC681, MSC682, MSC683, MSC684, MSC687, MSC688, MSC689, MSC690, MSC691, MSC692, MSC693, MSC694, MSC700, MSC701, MSC702, MSC722, MSC723 및 MSC724로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아 균주인 비-병원성 박테리아 숙주 세포.
  14. 제1항에 따른 작제물을 포함하는 비-병원성 박테리아 숙주 세포의 생산 방법으로서, 상기 작제물을 비-병원성 박테리아 숙주 세포에 전달하는 단계를 포함하는, 생산 방법.
  15. 프럭토실화되지 않은 콘드로이틴을 생산할 수 있고 kfoA 유전자, kfoC 유전자 및 kfoF 유전자를 포함하는 박테리아 세포의 생산 방법으로서, 세포에서 kfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자를 불활성화시키는 단계를 포함하는 생산 방법.
  16. kfoA 유전자, kfoC 유전자 및 kfoF 유전자를 포함하되, kfoD, orf3(kfoI), kfoE 및 orf1(kfoH) 중 하나 이상의 기능성 유전자를 함유하지 않고, 콘드로이틴을 생산할 수 있는 재조합 박테리아 세포.
  17. 제16항에 있어서,
    kfoA 유전자, kfoC 유전자, kfoF 유전자 또는 이들의 조합이 Pm, Plac, Ptrp, Ptac, λpL, PT7, PphoA, ParaC, PxapA, Pcad 및 PrecA로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터로부터 발현되는, 재조합 박테리아 세포.
  18. kfoA 유전자, kfoC 유전자 및 kfoF 유전자를 포함하고, 유전적으로 변형되어 kfoD, orf3(kfoI), kfoE 및 orf1(kfoH) 중 하나 이상의 유전자를 결실시키거나 불활성화시키고, 콘드로이틴을 생산할 수 있는 유전적으로 변형된 미생물.
  19. 콘드로이틴의 생산에 충분한 발효 조건하에서 제16항에 따른 재조합 박테리아 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 콘드로이틴의 생산 방법.
  20. 콘드로이틴의 생산에 충분한 발효 조건하에서 제18항에 따른 유전적으로 변형된 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 콘드로이틴의 생산 방법.
  21. 콘드로이틴의 생산에 충분한 발효 조건하에서 제1항에 따른 작제물을 포함하는 비-병원성 박테리아 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 콘드로이틴의 생산 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    작제물의 유전자가 박테리아 숙주 세포의 염색체 내로 통합되는, 생산 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    작제물의 유전자의 2개 이상의 카피가 박테리아 숙주 세포의 염색체 내로 통합되는, 생산 방법.
  24. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    콘드로이틴이 프럭토실화되지 않은, 생산 방법.
  25. (a) 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 생산 방법에 의해 콘드로이틴을 생산하는 단계; 및
    (b) 콘드로이틴을 황산화시키는 단계
    를 포함하는, 콘드로이틴 설페이트의 생산 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    황산화시키는 단계가 설퍼트라이옥사이드-트라이에틸아민 복합체 또는 클로로설폰산을 포름아미드 내의 콘드로이틴과 혼합하는 것을 포함하는, 생산 방법.
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KR1020127025916A 2010-03-01 2011-03-01 콘드로이틴의 박테리아 생산을 위한 조성물 및 방법 KR101848102B1 (ko)

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