JP5875531B2 - コンドロイチンの細菌生産のための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本発明は、組換え細菌発酵と発酵後硫酸化との組合せによるコンドロイチン硫酸の生産を含む、コンドロイチンを生産するための組換えDNA技術の分野に関する。
コンドロイチンは、グリコサミノグリカン(GAG)と呼ばれるヘテロ多糖のファミリーに属する。グリコサミノグリカン(GAG)は、一方が酸性糖であり、他方が硫酸化されうるアミノ糖(N-アセチルグルコサミンまたはN-アセチルガラクトサミン)である繰返し二糖単位で構成される、非分岐の負に帯電した多糖鎖である。GAGは、その不撓性と高い負電荷ゆえに、著しく伸びたコンフォメーションを示して、細胞外マトリックスにおいて大きな空間を占め、カチオンおよび水を引きつけ、多孔性ゲルを形成する。したがって、大半の動物に見いだされるGAGは、組織の水和と膨張を助け、マトリックスが圧縮力に耐えることを可能にする。例えば、膝関節を裏打ちする軟骨マトリックスは、この機序により、数百気圧の圧力を支えることができる。
[本発明1001]
kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC、kpsS、kfoA、kfoC、およびkfoFを含む遺伝子クラスターを含むコンストラクトであって、該遺伝子クラスターが、kfoD、orf3(kfoI)、kfoE、またはorf1(kfoH)の1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ該コンストラクトが非病原性細菌宿主細胞においてコンドロイチンを生産するのに適している、コンストラクト。
[本発明1002]
コンドロイチンが非フルクトシル化体である、本発明1001のコンストラクト。
[本発明1003]
コンドロイチンが宿主細胞から分泌される、本発明1001のコンストラクト。
[本発明1004]
遺伝子クラスターがkfoGをさらに含む、本発明1001のコンストラクト。
[本発明1005]
遺伝子クラスターがkfoBをさらに含む、本発明1001のコンストラクト。
[本発明1006]
遺伝子クラスターがkpsMおよびkpsTをさらに含む、本発明1001のコンストラクト。
[本発明1007]
pDD66、pDD67、pCX040、pCX041、pCX042、pCX043、pCX096、またはpBR1052を含む、本発明1001のコンストラクト。
[本発明1008]
kfoA、kfoC、およびkfoFを含む遺伝子クラスターを含むコンストラクトであって、該遺伝子クラスターが、kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、またはkpsSの1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ該コンストラクトが非病原性細菌宿主細胞においてコンドロイチンを生産するのに適している、コンストラクト。
[本発明1009]
kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG、およびそれらの組合せからなる群より選択される遺伝子を含むコンストラクトであって、kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、またはkpsSの1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ非病原性細菌宿主細胞においてコンドロイチンを生産するかまたはコンドロイチンの量を増加させるのに適している、コンストラクト。
[本発明1010]
コンドロイチンが宿主細胞から分泌されない、本発明1008または1009のコンストラクト。
[本発明1011]
kfoD、orf3、kfoE、またはorf1の1つまたは複数の機能的遺伝子も含有しない、本発明1008または1009のコンストラクト。
[本発明1012]
コンドロイチンが非フルクトシル化体である、本発明1008または1009のコンストラクト。
[本発明1013]
遺伝子クラスターがkfoG、kfoB、またはそれらの組合せをさらに含む、本発明1008のコンストラクト。
[本発明1014]
kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、およびkfoGを含む、本発明1008または1009のコンストラクト。
[本発明1015]
pCX039、pCX044、またはpCX092を含む、本発明1008または1009のコンストラクト。
[本発明1016]
pCX075、pCX081、pCX082、pCX101、pBR1102、pBR1100、またはpBR1101を含む、本発明1009のコンストラクト。
[本発明1017]
pCX045またはpCX048を含む、本発明1011のコンストラクト。
[本発明1018]
1つまたは複数の遺伝子が、細菌宿主細胞において最適なコドン使用頻度になるように修飾されている、本発明1001〜1017のいずれかのコンストラクト。
[本発明1019]
さらにプロモーターを含む、本発明1001〜1018のいずれかのコンストラクト。
[本発明1020]
プロモーターが、Pm、Plac、Ptrp、Ptac、λpL、PT7、PphoA、ParaC、PxapA、Pcad、およびPrecAからなる群より選択される、本発明1019のコンストラクト。
[本発明1021]
プロモーターがPmである、本発明1020のコンストラクト。
[本発明1022]
第2のプロモーターをさらに含む、本発明1001〜1021のいずれかのコンストラクト。
[本発明1023]
第2のプロモーターが、Pm、Plac、Ptrp、Ptac、λpL、PT7、PphoA、ParaC、PxapA、Pcad、およびPrecAからなる群より選択される、本発明1022のコンストラクト。
[本発明1024]
第2のプロモーターがPmである、本発明1023のコンストラクト。
[本発明1025]
第2のプロモーターが1つまたは複数の遺伝子に機能的に連結されている、本発明1022のコンストラクト。
[本発明1026]
第2のプロモーターがkpsFEDUCSに機能的に連結されている、本発明1025のコンストラクト。
[本発明1027]
xylS調節遺伝子をさらに含む、本発明1001〜1026のいずれかのコンストラクト。
[本発明1028]
抗生物質耐性遺伝子をさらに含む、本発明1001〜1027のいずれかのコンストラクト。
[本発明1029]
抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフェニコール(CamR)、カナマイシン(KanR)、アンピシリン(AmpR)、テトラサイクリン(TetR)、ブレオマイシン(BleR)、スペクチノマイシン(SpcR)、スルホンアミド(SuR)、ストレプトマイシン(StrR)、カルベニシリン(CbR)、およびエリスロマイシン(EryR)からなる群より選択される、本発明1028のコンストラクト。
[本発明1030]
K4遺伝子クラスターを含む、本発明1001〜1029のいずれかのコンストラクト。
[本発明1031]
細菌宿主細胞が、エシェリキア(Escherichia)、シュードモナス(Pseudomonas)、キサントモナス(Xanthomonas)、メチロモナス(Methylomonas)、アシネトバクター(Acinetobacter)、およびスフィンゴモナス(Sphingomonas)からなる群より選択される非病原性生物であるか、または該非病原性生物に由来する、本発明1001〜1030のいずれかのコンストラクト。
[本発明1032]
本発明1001〜1031のいずれかのコンストラクトを含む、非病原性細菌宿主細胞。
[本発明1033]
MSC279、MSC280、MSC315、MSC316、MSC317、MSC319、MSC322、MSC323、MSC324、MSC325、MSC326、MSC328、MSC346、MSC347、MSC348、MSC350、MSC356、MSC359、MSC392、MSC402、MSC403、MSC404、MSC405、MSC410、MSC411、MSC436、MSC437、MSC438、MSC439、MSC458、MSC459、MSC460、MSC461、MSC466、MSC467、MSC469、MSC480、MSC494、MSC498、MSC499、MSC500、MSC510、MSC511、MSC522、MSC526、MSC537、MSC551、MSC561、MSC562、MSC563、MSC564、MSC566、MSC567、MSC619、MSC625、MSC627、MSC640、MSC641、MSC643、MSC646、MSC650、MSC656、MSC657、MSC658、MSC659、MSC660、MSC669、MSC670、MSC671、MSC672、MSC673、MSC674、MSC675、MSC676、MSC677、MSC678、MSC679、MSC680、MSC681、MSC682、MSC683、MSC684、MSC687、MSC688、MSC689、MSC690、MSC691、MSC692、MSC693、MSC694、MSC700、MSC701、MSC702、MSC722、MSC723およびMSC724からなる群より選択される菌株である、本発明1032の非病原性細菌宿主細胞。
[本発明1034]
(a)本発明1001〜1031のいずれかのコンストラクトを非病原性細菌宿主細胞に移入する工程、および
(b)コンドロイチンが細菌宿主細胞によって生産される発酵条件下で細菌宿主細胞を培養する工程
を含む、コンドロイチンを生産するための方法。
[本発明1035]
本発明1001〜1031のいずれかのコンストラクトを含む非病原性細菌宿主細胞を、コンドロイチンの生産にとって十分な発酵条件下で培養する工程を含む、コンドロイチンを生産するための方法。
[本発明1036]
本発明1001〜1031のいずれかのコンストラクトを非病原性細菌宿主細胞に移入する工程を含む、本発明1001〜1031のいずれかのコンストラクトを含む非病原性細菌宿主細胞を作製するための方法。
[本発明1037]
コンストラクトの遺伝子クラスターまたは遺伝子が細菌宿主細胞の染色体中に組み込まれる、本発明1034〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
2コピーまたはそれ以上の遺伝子クラスターまたは遺伝子が細菌宿主細胞の染色体に組み込まれる、本発明1037の方法。
[本発明1039]
コンドロイチンが非フルクトシル化体である、本発明1034または1035の方法。
[本発明1040]
コンドロイチンを硫酸化する工程をさらに含む、本発明1034または1035の方法。
[本発明1041]
(a)本発明1034または1035の方法によってコンドロイチンを生産する工程、および
(b)コンドロイチンを硫酸化する工程
を含む、コンドロイチン硫酸を生産するための方法。
[本発明1042]
硫酸化する工程が、ホルムアミド中で三酸化硫黄-トリエチルアミン錯体またはクロロスルホン酸をコンドロイチンと混合することを含む、本発明1040または1041の方法。
[本発明1043]
細菌宿主細胞が、エシェリキア、シュードモナス、キサントモナス、メチロモナス、アシネトバクター、およびスフィンゴモナスからなる群より選択される非病原性生物であるか、または該非病原性生物に由来する、本発明1034〜1036のいずれかの方法。
[本発明1044]
細菌宿主細胞がグラム陰性生物であるか、またはグラム陰性生物に由来する、本発明1034〜1036のいずれかの方法。
[本発明1045]
細菌宿主細胞がキサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)である、本発明1043の方法。
[本発明1046]
キサントモナス・カンペストリス(X.campestris)が、MSC255、MSC256、MSC257、MSC225、およびMSC226からなる群より選択される菌株である、本発明1045の方法。
[本発明1047]
細菌宿主細胞が非病原性大腸菌(E.coli)である、本発明1043の方法。
[本発明1048]
非病原性大腸菌が大腸菌K-12および大腸菌Bからなる群より選択される、本発明1047の方法。
[本発明1049]
大腸菌K-12が、MSC188およびMSC175からなる群より選択される菌株である、本発明1048の方法。
[本発明1050]
大腸菌Bが菌株MSC364である、本発明1048の方法。
[本発明1051]
細菌宿主細胞の内因性遺伝子が、相同組換えによって欠失または不活化される、本発明1034〜1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
細菌宿主細胞が、該宿主細胞にとって内因性の細胞外多糖を発現しない、本発明1034〜1050のいずれかの方法。
[本発明1053]
細菌宿主細胞が実験室クローニング株からの接合伝達に適している、本発明1034〜1050のいずれかの方法。
[本発明1054]
細菌宿主細胞からコンドロイチンを回収する工程をさらに含む、本発明1034または1035の方法。
[本発明1055]
細胞外培養培地からコンドロイチンを回収する工程をさらに含む、本発明1034または1035の方法。
[本発明1056]
1g/L〜50g/Lのコンドロイチンが、24〜72時間で、細菌宿主細胞から分泌される、本発明1034または1035の方法。
[本発明1057]
5g/L〜50g/Lのコンドロイチンが、24〜72時間で、細菌宿主細胞から分泌される、本発明1056の方法。
[本発明1058]
15g/L〜50g/Lのコンドロイチンが、24〜72時間で、細菌宿主細胞から分泌される、本発明1057の方法。
[本発明1059]
コンドロイチンを精製する工程をさらに含む、本発明1034または1035の方法。
[本発明1060]
細菌宿主細胞が、25℃〜37℃で培養される、本発明1034または1035の方法。
[本発明1061]
細菌宿主細胞が、グリセリンを含む培地で培養される、本発明1034または1035の方法。
[本発明1062]
本発明1034〜1035または1037〜1061のいずれかの方法によって生産された、コンドロイチン。
[本発明1063]
本発明1062のコンドロイチンを含む、組成物。
[本発明1064]
KpsFのSEQ ID NO:92、KpsEのSEQ ID NO:93、KpsDのSEQ ID NO:94、KpsUのSEQ ID NO:95、KpsCのSEQ ID NO:96、KpsSのSEQ ID NO:97、KpsTのSEQ ID NO:91、KfoAのSEQ ID NO:83、KfoBのSEQ ID NO:84、KfoCのSEQ ID NO:85、KfoI(Orf3)のSEQ ID NO:86、KfoEのSEQ ID NO:87、KfoH(Orf1)のSEQ ID NO:88、KfoFのSEQ ID NO:89、およびKfoGのSEQ ID NO:90の群から選択されるアミノ酸配列に結合する、抗体または抗体フラグメント。
本発明は、コンドロイチンを生産するためのコンストラクトおよび組換え細胞、コンドロイチンを生産する方法、前記方法によって生産されたコンドロイチン、および前記コンドロイチンの使用に向けられる。本明細書において述べるように、本発明は、コンドロイチンおよびコンドロイチン硫酸の生産を可能にする新規技術に基づいている。本発明は、コンドロイチンおよびコンドロイチン硫酸の安全で一貫した信頼できる供給を、より低いコストで提供すると同時に、優れた製品品質を提供することにより、当技術分野における重要な必要を満たす。このプロセスはベジタリアン製品およびカーシェール(kosher)製品を提供することもできる。組換え生産されたコンドロイチンは、コンドロイチン硫酸を形成させるために、公知の方法を使って硫酸化することができる。したがって本発明は、組換え生産されたコンドロイチンを硫酸化する方法、組換え生産されたコンドロイチン硫酸製品、ならびに組換え生産されたコンドロイチン硫酸製品の使用を包含する。
コンドロイチンの生産方法では、本明細書に記載する遺伝子修飾を有する微生物を、コンドロイチンを生産するための発酵培地において培養する。適当なまたは有効な発酵培地とは、その中で培養したときに、本発明の遺伝子修飾微生物がコンドロイチンを生産する能力を持つような任意の培地を指す。そのような培地は、典型的には、同化可能な炭素源、窒素源およびリン酸源を含む水性培地である。そのような培地は、適当な塩類、ミネラル、金属その他の栄養素も含むことができる。例示的な培地を以下に述べ、実施例の項でも述べる。ただし、さまざまな発酵条件が適切であり、当業者はそれらを選択することができると認識するべきである。
コンドロイチンが発酵法によって生産されたら、それ以降の使用のために、それを回収することができる。本発明者らは、コンドロイチンが、培養培地中に無細胞型で存在する場合(「分泌コンドロイチン」)および/または細胞と会合して存在する場合がありうることを明らかにした。細胞と会合しているコンドロイチンは、細胞表面と会合している場合(「細胞表面コンドロイチン」)および/または細胞内に保持されている場合(「細胞内コンドロイチン」)がありうる。
大腸菌K4莢膜は「グループ2」莢膜に分類される。Whitfield(Annu Rev Biochem.2006; 75:39-68)によって概説されているとおり、大腸菌グループ2莢膜の合成は、3つの領域からなる共通の遺伝子構成を有する遺伝子クラスターによってコードされた一組のタンパク質によって指示される。大腸菌K4莢膜遺伝子クラスターの予想構造(本発明以前)を図2に示す。領域1は6つの遺伝子kpsFEDUCSを含有すると予期され、領域3は2つの遺伝子kpsMおよびkpsTを含有すると予期された。公知タンパク質との配列相同性に基づいて、kpsF遺伝子とkpsU遺伝子は、糖ヌクレオチドCMP-Kdoの生合成における段階を触媒するタンパク質をコードすると予想された。大腸菌におけるグループ2莢膜のCMP-Kdo生合成の役割は提唱されているものの(Roberts, Annu. Rev. Microbiol. 1996; 50:285-315)、実験的には実証されていない(Whitfield, Annu Rev Biochem.2006; 75:39-68)。kpsM、kpsT、kpsD、kpsE、kpsCおよびkpsS遺伝子は、糖前駆体の重合が起こる細胞質から、成熟莢膜多糖がその膜の脂質構成要素への共有結合によって細胞外膜に固定されると考えられる細胞表面への、莢膜多糖のトランスロケーションに必要とされるタンパク質をコードすると断定された(Roberts, Annu. Rev. Microbiol. 1996; 50:285-315;Whitfield, Annu Rev Biochem.2006; 75:39-68)。大腸菌K4莢膜については、大半の大腸菌グループ2莢膜と同様に、多糖と莢膜の脂質構成要素との間の共有結合の構造は、実験的には決定されていない。そのうえ、脂質構成要素の実体もわかっていない。領域1遺伝子および領域3遺伝子ならびにそれらがコードするタンパク質は、極めて多様な多糖組成および構造を有する莢膜を生産する大腸菌株間で高度に保存されている(Whitfield, Annu Rev Biochem. 2006; 75: 39-68)。大腸菌におけるグループ2莢膜クラスターの領域2に含有される遺伝子には、糖ヌクレオチド前駆体生合成のための酵素およびこれらの前駆体を重合するための酵素をコードする遺伝子が含まれ、それにより、領域2は莢膜多糖の構造を決定する。大腸菌におけるグループ2莢膜クラスターの領域2中の他の遺伝子は、その機能が不明なタンパク質をコードしており、莢膜生合成に役割を有することは実証されていない。Ninomiyaらによって記述された大腸菌K4莢膜遺伝子クラスターの領域2の配列(J. Biol. Chem. 2002; 277: 21567-21575、GenBank AB079602)は、タンパク質をコードすると予想される7つの注釈付きオープンリーディングフレーム(kfoABCDEFG)を含有する。挿入配列IS2が遺伝子kfoCとkfoDの間に位置する。
本発明者らによって決定されたU1-41 K4莢膜遺伝子クラスターの配列を、代替宿主における発現に使用するための合成遺伝子の設計の根拠として使用した。K4莢膜生合成遺伝子を含有する1つまたは複数の合成オペロンの発現が可能になるように合成コンストラクトを設計し、大腸菌、キサントモナス・カンペストリス、スフィンゴモナス・エロデア(S.elodea)および枯草菌(B.subtilis)における発現にとって許容されるコドンを使用するコンセンサス優先コドン表に基づいて、コドン使用頻度について最適化した。表3Aに、大腸菌、キサントモナス・カンペストリスおよび枯草菌ゲノムならびにK4P莢膜生合成に関係する大腸菌K4領域2遺伝子および53個のスフィンゴモナス・エロデア遺伝子(ゲラン生合成に関係するものを含む)に関するコドン使用頻度表を示す。この表は、K4領域2生合成遺伝子において好ましくないコドンが著しく使用されていることを例証している。これらのコドンは、キサントモナス・カンペストリス発現またはスフィンゴモナス・エロデア発現にとって極端に好ましくないだけでなく、大腸菌における発現にとっても好ましくない。大腸菌における最適な発現のためには、著しいコドン最適化が必要であるだろうことが予期されるであろう。これらのコドン使用頻度表の比較に基づいて、合成コンドロイチン生合成遺伝子用に、コンセンサス優先コドン使用頻度表を設計し、表3Bに示す。このコドン使用頻度パターンは、広範囲にわたるさまざまな潜在的代替宿主において、効率のよい翻訳を与えると予期される。
K4生合成遺伝子の発現のために選んだ最初の代替宿主には、大腸菌K-12(「K-12」)、大腸菌B(「EcB」)、スフィンゴモナス・エロデア(「Sph」)、およびキサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス(「Xcc」)を含めた。K-12 W3110株およびMG1655株は、Yale UniversityのColi Genetic Stock Centerから入手した。Sph株ATCC31461はATCCから入手した。Xcc株NRRL B-1459(ATCC13951)はイリノイ州ピオリアのARS Culture Collection(NCUAR)から入手した。大腸菌B(ATCC11303)はATCCから入手した。
コラン酸(M抗原)は、多くの腸内細菌が生産する細胞外多糖であり(Grant,W.D., et al., J. Bacteriol. 1969;100:1187-1193)、典型的には、低い成長温度において、より高い生産量が見いだされる(Stout,V.,J. Bacteriol. 1996; 178:4273-4280)。この実施例では、コラン酸生合成が欠損した大腸菌K-12株の作出を述べる。そのような株は、30℃以下で行うことができる組換えコンドロイチンの生産のためにそれらをさらに工学的に操作した場合に、妨害または夾雑コラン酸を生産しない。プラスミドpMAK705(Hamilton,CM., et al., J. Bacteriol. 1989;171:4617-4622)を使って、染色体コラン酸生合成遺伝子クラスター中に正確な欠失を作出した。このプラスミドは温度感受性レプリコンを含有し、高温においては染色体外状態で存在することができない。一般に、ターゲット遺伝子座における正確な変異を作出するための段階は、「ポップイン/ポップアウト」機序によってもたらされ、Hamiltonら(前記)によって記述されている。設計された変異を含有するプラスミドクローンは、染色体中に、典型的にはターゲット遺伝子座における相同組換えを介して、非許容温度における形質転換体の成長とプラスミドがコードする抗生物質(クロラムフェニコール;Cm)耐性での選択によって、組み入れられる(「ポップイン」)。その後、これらの組み込み体をクロラムフェニコールの非存在下で多世代にわたって成長させると、プラスミドが組換えによって染色体から除去され、細胞分裂時に細胞から失われて、元の野生型構造または変異体構造のどちらか一方を残すことになる。これらの「ポップアウト体」は、Cm感受性によって同定される。次に、所望の変異体構造を持つ株が、(可能であれば)表現型によって、およびPCRまたはサザンブロット法によって同定される。
キサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス(Xcc)は、さまざまな工業的応用および食品的応用のための細胞外糖質ポリマー、キサンタンガムを生産するために、商業的に使用されている(Baird, J., et al., BioTechnology 1983;1:778-783)。この株およびプロセスをコンドロイチンの生産に使用するには、キサンタンガムを生合成することができないXcc株が必要である。(上で)大腸菌に使用した戦略と類似する戦略を使って、NRRL B-1459としても知られているキサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリス株ATCC13951(Capage, M.R., et al., 国際公開WO87/05938; Katzen, F., et al., J. Bacteriol. 1998;180(7):1607-1617)におけるキサンタンガム生合成オペロン全体を、または第1グリコシルトランスフェラーゼの遺伝子gumDだけを、欠失させた。まず最初に、栄養寒天中の100μg/mL硫酸ストレプトマイシンに対して30℃において耐性な自然発生派生株を得て、これをMSC116と命名した。NRRL B-1459株のキサンタンガム生合成クラスターの配列(GenBankアクセッション番号U22511)に対して、また必要があれば、キサントモナス・カンペストリス病原型カンペストリスATCC33913のゲノム配列(GenBankアクセッションAE008922)に対して、PCRプライマーを設計した。
野生型大腸菌B(ATCC11303)の派生株である大腸菌BL21(DE3)のゲノムは、領域1および3は無傷(かつ機能的)であるが、領域2が破壊され非機能的である、不活性なグループ2莢膜遺伝子クラスターを含有すると報告された(Andreishcheva,E.N.and Vann,W.F.,Gene 2006; 384:113-119)。領域2の遺伝子はポリマー特異的であるが領域1および3は汎用であって特異性が低いことを考えると、大腸菌Bは、プラスミド上のまたは染色体に組み込まれたK4領域2遺伝子を与えるだけで、コンドロイチンを合成するように工学的に操作することができる(下記参照)。コンドロイチン生産用宿主としての大腸菌Bの有用性を改善するために、大腸菌K-12について上で述べた遺伝子変異によって、コラン酸の生産を排除した。
大腸菌に特異的な、明確に特徴づけられた、高コピー数および低コピー数プラスミドベクターが記述されている(Balbas and Bolivar,Methods Enzymol.1990;185:14-37、Das,Methods Enzymol.1990;182:93-112、Mardanov et al.Gene 2007; 15(395):15-21)。そのようなベクターでは、大腸菌における調節された遺伝子発現のために、明確に特徴づけられたさまざまなプロモーター系が使用される。加えて、大腸菌、キサントモナス・カンペストリスおよび多種多様な他のグラム陰性細菌において機能するRK2(低コピー数IncP)およびRSF1010(高コピー数IncQ)などの広宿主域プラスミドに基づく接合伝達性プラスミドベクターも利用できる(Franklin and Spooner「Promiscuous plasmids in Gram-negative bacteria」Academic Press(ロンドン)1989 pp247-267、Mather et al.Gene 1995;15:85-88、Haugen et al.,Plasmid 1995;33:27-39、Mermod et al,J.Bact. 1986;167:447-454)。キサントモナス・カンペストリス、スフィンゴモナス・エロデア、シュードモナス・プチダ(P.putida)、および非病原性大腸菌を含む多様な数多くのグラム陰性細菌における遺伝子移入および発現に同じプラスミドを使用することができるように、合成コンドロイチン生合成遺伝子セットを、これらの多用途広宿主域ベクター中にクローニングすることができる(Guiney and Lanka「Promiscuous plasmids in Gram-negative bacteria」Academic Press(ロンドン)1989 pp27-54)。
を有する127bp PacI-ClaI DNAフラグメントを、ClaI-PacI消化したpDD66ベクターフラグメントに挿入することで、pBR1052を作製した。付加された127bp PacI-ClaIフラグメントは、1コピーのPmプロモーター配列を含む。図8Kに示すように、pBR1052では、付加されたPmプロモーターのコピーが、このプロモーターにおける転写開始がkpsFEDUCS遺伝子を含むRNA転写産物をもたらしうるような方向を向いている。
抗体の生産:K4コンドロイチン生合成遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質のうち15個に対する抗体を以下に述べるように生産した。これらの抗体は、代替宿主およびネイティブ大腸菌K4株におけるクローン化K4コンドロイチン生合成遺伝子の発現を評価するために使用することができる。これらは、他のグループ2莢膜生産大腸菌における領域1および領域3遺伝子発現を評価するために使用することもでき、他の血清群K4大腸菌で、領域2遺伝子発現を評価するために使用することもできるかもしれない。抗体は次のように作製した。
上記実施例4に記載したプラスミドpDD54およびpDD58をMSC188(上記実施例3において述べたようにコラン酸生合成遺伝子クラスターを欠失させた大腸菌K-12W3110株)に形質転換した。その結果生じた株MSC204[MSC188(pDD54)]およびMSC206[MSC188(pDD58)]を振とうフラスコ培養で成長させ、コンドロイチン生産について調べた。株を新鮮なコロニーから、CYG培地(20g/Lカザミノ酸、5g/L酵母エキス、2g/Lグルコース、pH7.2)+クロラムフェニコール(20μg/mL)中、30℃で終夜成長させ、これらの培養物をOD A600=0.05になるように同じ培地で希釈した。OD A600がおよそ0.1の時点(およそ1時間後)で、誘導物質m-トルイル酸を2mMの最終濃度になるように加えた。誘導の4時間後、8時間後および24時間後にOD A600値を決定し、分析用に試料を採取した。培養ODを下記の表6-1に示す。各時点における各株について、多糖分析用の10mL試料をオートクレーブ処理(121℃、>15psi、5分)してから、凍結保存した。各時点における各株の5mlアリコート2つを遠心分離し、その結果生じた細胞ペレットを、以後のウェスタンブロット分析のために凍結保存した。
この研究以前に、K4莢膜多糖のフルクトシル化を担うタンパク質をコードする遺伝子は同定されていなかった。K4莢膜遺伝子クラスターの領域2に存在する遺伝子の多く(kfoB、kfoG、kfoD、kfoE、kfoH(orf1)およびkfoI(orf3))は、それらがコードするタンパク質について、機能が同定されていなかった。
大腸菌K4コンドロイチン生合成遺伝子を保有する組換え大腸菌株によるコンドロイチンの生産は、さまざまな異なる成長培地によって支持することができる。組換えコンドロイチンの最適な生産のためには、培地組成、温度、誘導物質濃度および誘導後の培養の継続期間などといった培養条件を最適化する必要がある。
大腸菌K4を液体培地中で培養すると、莢膜多糖(K4P)、フルクトシル化コンドロイチンが、培養培地中に無細胞型で蓄積すると共に、細胞会合型として蓄積すると報告されている(Manzoni et al., Biotech. Lett. 1996; 18: 383-386、Cimini et al. Appl. Mocrobiol. Biotechnol. E-Publication, E-Pub. October 2009)。他のグループ2莢膜多糖、例えば大腸菌血清型K1および大腸菌血清型K5によって生産されるものなどとの類似性により、細胞会合型は、主として、脂質アンカーを利用して細胞の外膜の外層(outer leaflet)と会合していると考えられている(Whitfield, 2006)。多糖と脂質アンカーの間の結合の性質は、構造レベルではまだ限定されていないし、脂質アンカーの実体も決定されていない。上記実施例6〜8で述べたように生産され検出された組換えコンドロイチンは、明らかに培養培地中に存在する。コンドロイチンについてアッセイするための試料の培養培地から細胞を除去するには、低速遠心分離(3500gで10分)で十分であり、無細胞上清中に相当量のコンドロイチンが検出された。しかし、上記実施例6〜8においてコンドロイチンについてアッセイした試料は全て、細菌を殺すことで試料の取扱を容易にするために、遠心分離に先だってオートクレーブ処理した。このオートクレーブ処理段階は潜在的に、いかなる細胞会合型コンドロイチンの結合も破壊して、そのような細胞会合型コンドロイチンを細胞から放出させることになりうる。組換えコンドロイチンが無細胞型および/または細胞会合型で生産されるかどうかを決定するために、コンドロイチン生産培養からの試料の遠心分離の結果として起こる組換えコンドロイチンの上清画分およびペレット画分への分配にオートクレーブ処理が及ぼす効果を調べる実験を行った。
上記実施例6〜9は、コンドロイチン生合成タンパク質をコードするクローン化遺伝子を異種宿主株に導入するためにプラスミドベクターを使用する、組換え大腸菌株におけるコンドロイチン生産を説明している。状況によっては、クローン化コンドロイチン生合成遺伝子を受容宿主株の染色体中に導入することが望ましい場合もあるだろう。クローン化遺伝子を染色体に入れると、コンドロイチン生合成遺伝子を保有するプラスミドを維持するための選択圧を維持する必要がなくなり、したがって、より安定な発現株または選択圧の不在下で安定な発現株を、潜在的に提供することができるであろう。そこで、コンドロイチン生合成のための大腸菌K4遺伝子を宿主染色体中に安定に組み込んだ大腸菌K-12株を構築した。これらの「染色体発現株」は、コラン酸生合成遺伝子座に組み込まれたpDD66およびpBR1052由来のPmプロモーターおよびK4遺伝子セットを使用する。xylS調節遺伝子も、別個の遺伝子座であるfhuA遺伝子座に組み込まれた。その結果得られたコンストラクトは、振とうフラスコおよび発酵槽において高レベルのコンドロイチンを生産することが示された(実施例14および15)。
MSC402≡MSC391 pDD77「分離株A」
MSC403≡MSC391 pDD77「分離株B」
MSC404≡MSC392 pDD77「分離株A」
MSC405≡MSC392 pDD77「分離株B」。
を使って、MSC467およびpDD74中のtetR遺伝子のすぐ上流にある約900塩基対の染色体配列を増幅した。
大腸菌K-12株MSC467(実施例10)は、コラン酸遺伝子座に、Pmプロモーターの制御下にある領域1、2、および3を含有し、fhuA遺伝子座に、合成コンセンサスプロモーターの制御下にあるxylSを含有する。プラスミドpCX039(実施例4)は、Pmプロモーターの制御下にある領域2kfoABCFG遺伝子を含有し、ネイティブxylS遺伝子も含有する。pCX039をMSC467に形質転換することで、MSC499株を作出した。対照株MSC498は、pDD63(実施例4)をMSC467に形質転換することによって作出した。さまざまな誘導物質濃度による振とうフラスコ培養(TB/Cm34培地、30℃、72時間)におけるコンドロイチン生産を、これら2つの株について決定した(表9A)。
上記実施例11は、Pmプロモーターの制御下にあるK4領域2遺伝子kfoABCFGの余分なコピーをプラスミドpCX039にのせてMSC467に導入すると、振とうフラスコにおけるMSC467株によるコンドロイチン生産が著しく強化されたことを実証している。プラスミドpDD80をMSC467に導入した場合にも類似する結果が得られた。実施例4で述べるプラスミドpDD80は、上記実施例10に記載の合成xylSプロモーターの転写制御下にあるkfoABCFG遺伝子を保有している。これらの結果は、kfoABCFG遺伝子によってコードされるタンパク質の1つまたは複数のレベルを増加させると、コンドロイチン生産が有意に増加することを示している。これらの遺伝子をマルチコピープラスミド上にクローニングすることは、これらのタンパク質の生産を増加させるための一方法になる。プラスミド発現プラットフォームを使用せずにこれらのタンパク質の生産を増加させるための代替的方法は、これらの遺伝子の複数コピーを宿主生物の染色体中に挿入することである。
具体的に述べると、ここで説明するのは、K4生合成遺伝子の組合せを含有するプラスミドの構築と、キサントモナス・カンペストリスMSC255株へのそれらの導入である。さらに、コンドロイチン生合成遺伝子およびそのサブセットをキサントモナス・カンペストリスMSC255株染色体の、キサンタンガムオペロンの欠失部位に安定に挿入するための、プラスミドpKM001およびpKM002(実施例3に記載)の誘導体の使用も説明する。
本発明者らは、大腸菌供与体からキサントモナス・カンペストリスへの大きなプラスミドの直接的な導入(例えば三親交雑によるもの)または大腸菌株から精製されたプラスミドとしての(例えばエレクトロポレーションによるもの-下記参照)が、その結果得られるキサントモナス・カンペストリス中のプラスミドにおける構造異常をもたらしうることを発見した。比較的小さいプラスミドはこの現象を起こしにくいようであり、これは、大きなDNA分子に対して比較的大きな効果を有するキサントモナス・カンペストリスにとってネイティブな制限系(Feyter and Gabriel,J.Bact. 1991;l73:6421-6427、da Silva et al.,Nature 2002; 417:459、Roberts et al.,Nuc.Acid Res.2010; 38:D234)によるのであろう。本発明者らは、この効果をうまく克服する2つのアプローチを使用した。一方のアプローチでは、領域1、2、および3遺伝子を包含する大きなプラスミドを、キサントモナス・カンペストリス形質転換体から精製された小さなプラスミドから再構築した。もう一つのアプローチでは、領域1、2、および3遺伝子を2つの(小さな)和合性プラスミドに分割した。
別段の表示がない限り、コンドロイチン生産を評価するための振とうフラスコにおけるキサントモナス・カンペストリス株の成育は、YMG培地(5g/Lプロテオースペプトン、3g/L酵母エキス、3g/L麦芽エキス、10g/Lグルコース)中で行った。培養物は、常法により、必要な選択用抗生物質(例えば2〜5μg/mLテトラサイクリン、10μg/mLカナマイシン)を含む250mL成長フラスコ中の50mL培地において、200〜225rpm、30℃で、48時間成長させた。Pmが駆動する遺伝子セットを誘導するために、培養密度がおよそOD600=0.5に到達したときに、2mM m-TAを加えた。
アニオン交換体DEAE-セルロースDE52カラムを使って組換えコンドロイチン(rCH)を捕捉した。5体積の100mM NaClで洗浄した後、カラムを5体積の300mM NaClで溶出させた。溶出液を濃縮し、10体積の蒸留水に対して透析した。透析された溶液を凍結乾燥した。その凍結乾燥粉末をrCHとして使用した。
フラスコ培養試料(典型的には5mL)を121℃、>15psiで、5分間オートクレーブ処理し、冷ました。次に、オートクレーブ中の喪失を補うために、必要に応じて、試料を水で元の体積に再調節した。試料(1.5〜5mL)を遠心分離(典型的には、低細胞密度フラスコ培養の場合は3500gで10分、発酵または高密度培養の場合は12000gで5分)することで、上清画分とペレット画分を得た。場合によっては、表示のとおり、事前のオートクレーブ処理なしで、試料を遠心分離した。培養試料または分離した上清およびペレットは、通常、アッセイするまで-20℃で保存した。
濃度;μg/mL=[A]/[S]×[D]
式中、[A]は試料クロマトグラムにおけるΔdi-0Sのピーク面積を表し、[S]はΔdi-0S濃度に関する検量線の傾きを表し、[D]は希釈係数を表す。
K4Pのカルボキシル基を介したビオチン化カップリングを、Osmond,R.I.W.らの方法(Analytical Biochemistry 2002; 310:199-207)に従って行った。100μlのビオチン化K4P(1μg/ml)を、ストレプトアビジンコート96ウェルマイクロタイタープレート(Thermo Scientific、日本)に、室温で30分間コンジュゲートした。0.05%TWEEN(登録商標)20および0.05%Proclinを補足した50mMトリス-HCl緩衝食塩水(NaCl 100mM)(pH7.5)を使ってプレートを洗浄した後、50μlの培養上清または標準K4P溶液と、希釈率2.5×106の抗K4P血清(Statens Serum Institut、デンマーク)50μlとを、ウェルに加え、60分間インキュベートした。ウェルを再び洗浄した後、HRP標識抗ウサギ免疫グロブリン(P0448、ダコジャパン、日本)を2000倍の希釈度で加え、60分間インキュベートした。ウェルを再び洗浄した後、H2O2を含有するTMB溶液(TMBW-1000-01、BioFX Laboratories Inc.、メリーランド州オウイングズ・ミルズ)を基質として加え、室温で30分間インキュベートした。50mlのStop Reagent(STRP-1000-01、BioFX Laboratories Inc.、メリーランド州オウイングズ・ミルズ)を加え、450nmにおける吸光度を測定した。これらのアッセイ条件下で、フルクトシル化されないコンドロイチン、ヘパロサンおよびDFK4Pなどの他の多糖は、K4Pと競合しない。典型的な標準曲線を図11Aに示す。
屈折率検出器ならびにTSKゲルPWXL-4000、PWXL-3000、およびPWXL-2500(東ソー、日本)のタンデムカラムを装備したTOSOH HLC-8220GPCシステムを0.2M NaClによる0.6mL/分の一定流速で使用するSEC-HPLCでの分析により、多糖の重量平均分子量(「Mw」)およびコンドロイチナーゼ消化性を決定した。50μLの多糖溶液を1mg/mLの濃度でカラムに注入した。カラムおよび検出器区画は40℃に維持した。Mw既知のコンドロイチン硫酸(Mw:52.2、31.4、20.0、10.0、6.6、および1.0kDa)を分子量標準として使用した。
実施例14で調製したコンドロイチンを、部分的解重合に付して、分子量がおよそ30kDaのコンドロイチンを得た。30mgのこのコンドロイチンを0.6mLの乾燥ホルムアミド(FA)に60℃で撹拌しながら可溶化した。溶液が完全に均一になったら、固形の三酸化硫黄-TEA錯体(コンドロイチン二糖単位の5当量)を加え、撹拌を120分間続けた。3倍体積の1M酢酸ナトリウム溶液を加えることによって硫酸化反応を停止し、室温でさらに30分間、静置した。その溶液を蒸留水に対して3日間透析し、NaOHで中和し、凍結乾燥して白色粉末(32mg、107%)を得た。組換えコンドロイチン硫酸のさらなる分析により、29kDaの分子量と5.2%の硫黄分が実証された。
領域1、2、および3(R1、R2、およびR3)遺伝子セットの組合せを含有する一組のプラスミドを、pBR1052(図8K)およびpDD67(図8J)から調製した。上述のように、遺伝子のセットが、特定の制限酵素による出発プラスミドの消化;例えばT4ポリメラーゼによる平滑端の生成;およびその結果生じたベクターフラグメントのライゲーションによって削除された。大腸菌MSC188株(実施例3)を、そのライゲーション反応で形質転換し、選ばれた抗生物質耐性形質転換体を、所望の特徴について評価した。pBR1052が領域1遺伝子セットの前に第2のPmプロモーターを含有しているという事実ゆえに、ここで述べるプラスミドの一部も、第2のPmプロモーターを含有している。これら記載のプラスミドは全て、xylSも含有している。下記の表11において、R1=kpsFEDUCS、R2=kfoABCFG、およびR3=kpsMTである。「Pm:R2」プラスミドは先に構築されたことに注意されたい(pCX039;実施例4)。プラスミドpCX096(SEQ ID NO:149)、pCX097、pCX100、pCX101(SEQ ID NO:150)、およびpCX102のDNAマップを、それぞれ図14A、14B、14C、14D、および14Eに示す。プラスミドpCX097およびpCX101を、それぞれpCX100およびpCX102のための出発プラスミドとして使用した。
プラスミドpCX039(図8Q;領域2遺伝子kfoABCFGを含有する)は、それが宿主大腸菌株MSC562中に存在する場合には(空ベクターpDD63を含有するMSC562と比較して)、rCH生産の大きな(8〜10倍の)増加をもたらした。pCX039によるrCH生産の刺激に対する個々の領域2遺伝子の役割を実証するために、pDD66およびpDD67からの遺伝子の欠失に関して上述した方法(実施例4参照)を使って、pCX039から2セットのプラスミドを誘導した。
実施例12は、領域1、2、および3の染色体コピーを既に1つ含有している大腸菌宿主における領域2遺伝子セット(kfoABCFG)の1染色体コピーの追加が、rCH生産の有意な20〜30%の増加につながることを実証している。実施例11は、領域2遺伝子セットを保有するマルチコピープラスミドを含有する類似の宿主が、rCH生産の2〜300%の増加につながることを実証している。高生産性プラスミド非含有株を作製することを目指して、この実施例では、(Pmプロモーターによって駆動され)領域2を補完する染色体コピーを増加させるために設計されたプラスミドの構築および使用を説明する(この増加は、それらのプラスミドをさまざまな非必須染色体遺伝子に挿入することによって達成され、それらの非必須染色体遺伝子は、そのような挿入の同定が容易になるように、特に選択されたものである)。留意すべき点は、相同性駆動的「ポップイン/ポップアウト」法(実施例4および12参照)を使って宿主大腸菌染色体の異なる遺伝子座に領域2遺伝子セットのコピーを次々と挿入する際には、所望の遺伝子座ではなく既存の領域2インサートへの望ましくないターゲティング(相同性駆動的組換え)との競合が増加することである。したがって、労力と時間を要するPCRによるのではなく簡単なコロニースクリーニングによって所望の遺伝子座にインサートを含有する株を最初に同定する手段を持つことは、宿主株中の領域2のコピーの数が増えるにつれて、ますます有益になる。
最少成長培地におけるrCH生産に関して組換え大腸菌株を評価する過程において、一定の株は成長しないことが発見された。その後、MSC561株は、ロイシンの供給源で補正した場合にのみ、最少培地で成長すること、すなわちこの株はロイシン要求体であることが決定された。MSC561中のロイシン生合成オペロンleuABCDを配列決定したところ、この株は、ロイシン原栄養体MSC467から派生した際に(実施例10参照)、leuB遺伝子コード領域における1塩基対欠失(コード領域の位置383におけるC/G塩基対)を自然に獲得していたことが明らかになった。この欠失は、読み枠のシフトと中途での翻訳終結をもたらす。この欠陥は、遺伝子操作と初期の生産試験が複合培地で行われたために、最初は検出されなかった。この突然変異がfhuAおよびコラン酸遺伝子座における先の標的組換えの結果であった可能性は極めて低い。なぜなら、それらはleuBとは密接には連鎖していないからである(fhuAとleuBは約85Kb離れており、コラン酸オペロンとleuBは約2Mb離れている)。R2コピーの付加によってMSC561から直接的または間接的に派生した株(MSC627、MSC650、MSC646、MSC679、およびMSC700;図15参照)も、全て、ロイシン栄養要求体であり、leuB配列中に同じ欠失を含有していた。別個のMSC467系統の株(MSC537、MSC562、およびMSC619)はロイシン原栄養体である(図15参照)。
*leuB領域には、leuB開始コドン(すなわちleuAの3'端)の約200bp上流からleuB停止コドンの約200bp上流まで(すなわち、leuBコード領域の合計1089塩基対のうちのleuB座標1からおよそ850まで)、補償的変化は何も検出されなかった。
1.大腸菌(MSC537)の10L発酵
典型的発酵条件下で10リットル発酵槽を使用し、グリセリンを炭素源として、大腸菌MSC537株の培養物を培養した。発酵槽は、脱イオン水を使って体積を6リットルにした下記の培地(表20A)で、回分処理した。
典型的発酵条件下で2リットル発酵槽を使用し、グリセリンを炭素源として、大腸菌MSC564株の培養物を培養した。発酵槽は、脱イオン水を使って体積を1.5リットルにした下記の培地(表21A)で、回分処理した。
典型的発酵条件下で10リットル発酵槽を使用し、グリセリン、カゼイン加水分解物および水酸化アンモニウムをそれぞれ主要炭素源および窒素源として、大腸菌MSC619株の培養物を培養した。発酵槽は、脱イオン水を使って体積を6リットルにした下記の培地(表22A)で、回分処理した。
典型的発酵条件下で10リットル発酵槽を使用し、グリセリン、カゼイン加水分解物および水酸化アンモニウムをそれぞれ主要炭素源および窒素源として、大腸菌MSC677株の培養物を培養した。発酵槽は、脱イオン水を使って体積を6リットルにした下記の培地(表23A)で、回分処理した。
典型的発酵条件下で10リットル発酵槽を使用し、グリセリン、カゼイン加水分解物および水酸化アンモニウムをそれぞれ主要炭素源および窒素源として、大腸菌MSC702株の培養物を培養した。発酵槽は、脱イオン水を使って体積を6リットルにした下記の培地(表24A)で、回分処理した。
典型的発酵条件下で10リットル発酵槽を使用し、グリセリン、カゼイン加水分解物および水酸化アンモニウムをそれぞれ主要炭素源および窒素源として、大腸菌MSC702株の培養物を培養した。発酵槽は、脱イオン水を使って体積を6リットルにした下記の培地(表25A)で、回分処理した。
典型的発酵条件下で50リットル発酵槽を使用し、グリセリンおよび水酸化アンモニウムをそれぞれ主要炭素源および窒素源として、大腸菌MSC702株の培養物を培養した。発酵槽は、脱イオン水を使って体積を40リットルにした下記の培地(表26A)で、回分処理した。
典型的発酵条件下で10リットル発酵槽を使用し、グリセリン、カゼイン加水分解物および硫酸アンモニウムをそれぞれ主要炭素源および窒素源として、大腸菌MSC702株の培養物を培養した。発酵槽は、脱イオン水を使って体積を6リットルにした下記の培地(表27A)で、回分処理した。
典型的発酵条件下で10リットル発酵槽を使用し、グリセリン、カゼイン加水分解物および硫酸アンモニウムをそれぞれ主要炭素源および窒素源として、大腸菌MSC724株の培養物を培養した。発酵槽は、脱イオン水を使って体積を6リットルにした下記の培地(表28A)で、回分処理した。
X. カンペストリス(MSC480)の10L発酵
典型的発酵条件下で10リットル発酵槽を使用し、グルコースを炭素源として、キサントモナス・カンペストリスMSC480株の培養物を培養した。発酵槽は、脱イオン水を使って体積を7.5リットルにした下記の培地(表29A)で、回分処理した。
上記実施例4、7および8では、rCH生産組換え大腸菌K-12株の成長のための複合TB培地の使用を述べた。通常処方されるTB培地は、5g/Lグリセリンを主要炭素源として含有する。この実施例では、振とうフラスコにおけるrCH体積生産性および比生産性を強化するTB培地の改変を述べる。
Claims (19)
- kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC、kpsS、kfoA、kfoC、およびkfoFを含む遺伝子クラスターを含むコンストラクトであって、該遺伝子クラスターが、kfoD、orf3(kfoI)、kfoE、またはorf1(kfoH)の1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ該コンストラクトが非病原性細菌宿主細胞においてコンドロイチンを生産するのに適している、コンストラクト。
- 遺伝子クラスターがkpsMおよびkpsTをさらに含む、請求項1記載のコンストラクト。
- SEQ ID NO:35によって表されるpDD66、SEQ ID NO:36によって表されるpDD67、SEQ ID NO:37によって表されるpCX040、SEQ ID NO:38によって表されるpCX041、SEQ ID NO:39によって表されるpCX042、SEQ ID NO:40によって表されるpCX043、SEQ ID NO:149によって表されるpCX096、またはSEQ ID NO:41によって表されるpBR1052を含む、請求項1記載のコンストラクト。
- kfoA遺伝子、kfoC遺伝子、およびkfoF遺伝子を含むコンストラクトであって、kfoD、orf3(kfoI)、kfoE、またはorf1(kfoH)の1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ該コンストラクトが細菌細胞においてコンドロイチンを生産するのに適している、コンストラクト。
- 遺伝子クラスターがkfoG、kfoB、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項1または4記載のコンストラクト。
- (a) kfoA、kfoC、およびkfoFを含む遺伝子クラスターを含むコンストラクトであって、該遺伝子クラスターが、kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、またはkpsSの1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ該コンストラクトが非病原性細菌宿主細胞においてコンドロイチンを生産するのに適している、コンストラクト; または
(b) kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG、およびそれらの組合せからなる群より選択される遺伝子を含むコンストラクトであって、kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、またはkpsSの1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ非病原性細菌宿主細胞においてコンドロイチンを生産するかまたはコンドロイチンの量を増加させるのに適している、コンストラクト、
であって、さらにここで、
SEQ ID NO:42によって表されるpCX039、SEQ ID NO:43によって表されるpCX044、またはSEQ ID NO:154によって表されるpCX092である、コンストラクト。 - kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG、およびそれらの組合せからなる群より選択される遺伝子を含むコンストラクトであって、kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、またはkpsSの1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ非病原性細菌宿主細胞においてコンドロイチンを生産するかまたはコンドロイチンの量を増加させるのに適しているコンストラクトであり、さらにここで、
SEQ ID NO:153によって表されるpCX075、SEQ ID NO:151によって表されるpCX081、SEQ ID NO:152によって表されるpCX082、SEQ ID NO:150によって表されるpCX101、SEQ ID NO:170によって表されるpBR1102、SEQ ID NO:171によって表されるpBR1100、またはSEQ ID NO:172によって表されるpBR1101である、コンストラクト。 - kfoD、orf3(kfoI)、kfoE、またはorf1(kfoH)の1つまたは複数の機能的遺伝子も含有しない、下記(a)または(b)のコンストラクトであって、
(a) kfoA、kfoC、およびkfoFを含む遺伝子クラスターを含むコンストラクトであって、該遺伝子クラスターが、kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、またはkpsSの1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ該コンストラクトが非病原性細菌宿主細胞においてコンドロイチンを生産するのに適している、コンストラクト;
(b) kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG、およびそれらの組合せからなる群より選択される遺伝子を含むコンストラクトであって、kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、またはkpsSの1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ非病原性細菌宿主細胞においてコンドロイチンを生産するかまたはコンドロイチンの量を増加させるのに適している、コンストラクト;
ここで、SEQ ID NO:44によって表されるpCX045またはSEQ ID NO:45によって表されるpCX048である、コンストラクト。 - 1つまたは複数の遺伝子が、細菌宿主細胞において最適なコドン使用頻度になるように修飾されている、請求項1〜8のいずれか一項記載のコンストラクト。
- K4遺伝子クラスターを含む、請求項1〜9のいずれか一項記載のコンストラクト。
- 請求項1〜10のいずれか一項記載のコンストラクトを含む、非病原性細菌宿主細胞。
- kfoA遺伝子、kfoC遺伝子、およびkfoF遺伝子を含む組換え細菌細胞であって、kfoD、orf3(kfoI)、kfoE、またはorf1(kfoH)の1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ非フルクトシル化コンドロイチンを生産することができる、組換え細菌細胞。
- kfoA遺伝子、kfoC遺伝子、およびkfoF遺伝子を含む遺伝子修飾大腸菌K4であって、kfoD、orf3(kfoI)、kfoE、またはorf1(kfoH)の1つまたは複数の遺伝子を欠失または不活性化するように遺伝子修飾され、非フルクトシル化コンドロイチンを生産することができる、遺伝子修飾大腸菌K4。
- 請求項12記載の組換え細菌細胞または請求項13記載の遺伝子修飾大腸菌K4を、非フルクトシル化コンドロイチンの生産にとって十分な発酵条件下で培養する工程を含む、非フルクトシル化コンドロイチンを生産するための方法。
- (a)請求項1〜10のいずれか一項記載のコンストラクトを非病原性細菌宿主細胞に移入する工程、および
(b)コンドロイチンが細菌宿主細胞によって生産される発酵条件下で細菌宿主細胞を培養する工程
を含む、コンドロイチンを生産するための方法。 - 請求項1〜10のいずれか一項記載のコンストラクトを含む非病原性細菌宿主細胞を、コンドロイチンの生産にとって十分な発酵条件下で培養する工程を含む、コンドロイチンを生産するための方法。
- 請求項1〜10のいずれか一項記載のコンストラクトを非病原性細菌宿主細胞に移入する工程を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載のコンストラクトを含む非病原性細菌宿主細胞を作製するための方法。
- 非フルクトシル化コンドロイチンを生産することができる、kfoA遺伝子、kfoC遺伝子、およびkfoF遺伝子を含む大腸菌K4細胞を作製するための方法であって、kfoD、orf3(kfoI)、kfoE、orf1(kfoH)、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される該細胞における遺伝子を不活性化する工程を含む、方法。
- (a)請求項14〜16のいずれか一項記載の方法によってコンドロイチンを生産する工程、および
(b)コンドロイチンを硫酸化する工程
を含む、コンドロイチン硫酸を生産するための方法。
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