KR101326865B1 - 독성이 제거된 외막소포체를 생산하는 재조합 ｇ(-) 박테리아 및 이를 이용한 독성이 제거된 외막소포체의 제조방법 - Google Patents

독성이 제거된 외막소포체를 생산하는 재조합 ｇ(-) 박테리아 및 이를 이용한 독성이 제거된 외막소포체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 외독소 및 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 G(-) 박테리아에서 독성과 관련된 유전자가 결실되어 독성이 제거된 외막소포체를 생산하는 재조합 G(-) 박테리아 및 이를 이용한 독성이 제거된 외막소포체의 제조방법에 관한 것이다. 상기 독성이 제거된 외막소포체를 생성하는 재조합 G(-) 박테리아의 제조방법은 (a) 외독소 및 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 G(-) 박테리아에서, 상기 외막소포체가 내포하는 리포폴리사카라이드(LPS)의 리피드(lipid) A 생합성에 관여하는 유전자를 결실시킨 G(-) 박테리아 변이주를 제작하는 단계; 및 (b) 상기 G(-) 박테리아 변이주에서 상기 외독소의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자를 결실시키는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 재조합 G(-) 박테리아에서 생성된 외막소체(OMV)는 LPS (lipopolysaccharide)의 내독성(endotoxicity) 및 외독성이 제거되어 안전하면서도, 다가항원(multi-valent epitope) 전달능을 보유하고 있어, 첨단 바이오 나노소재 백신물질로 유용하다.
시가톡신, 외막소포체, OMV, 외독성, 내독성, 병원성 대장균, O157:H7, 백신전달체, 변이주

Description

독성이 제거된 외막소포체를 생산하는 재조합 Ｇ(-) 박테리아 및 이를 이용한 독성이 제거된 외막소포체의 제조방법{Recombinant Gram-negative Bacteria Producing Detoxificated Outer Membrane Vesicles and Method for Preparing Detoxificated Outer Membrane Vesicles Using the Same}
본 발명은 독성이 제거된 외막소포체를 생산하는 재조합 G(-) 박테리아 및 이를 이용한 독성이 제거된 외막소포체의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 외독소 및 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 G(-) 박테리아에서 독성과 관련된 유전자가 결실되어 독성이 제거된 외막소포체를 생산하는 재조합 G(-) 박테리아 및 이를 이용한 독성이 제거된 외막소포체의 제조방법에 관한 것이다.
차세대 비세포성 (acellular) 비복제성 (non-replicating) 백신 후보물질중의 하나로 최근 외막소포체 (OMV)에 대한 관심이 커지고 있다. 외막소포체 (OMV)가 주목받는 이유는 바이오-나노 천연입자이면서, 한꺼번에 여러 항원들을 동시에 전달할 수 있는 전달체로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 구형의 막소포체인 특성을 지 녀 부가적 기능을 도입할 수 있는 기반이 되어 다기능성 외막소포체 (OMV) 백신전달체로 개발 될 수 있기 때문이다. 그러나, 아직까지 OMV 백신이 상용화 되지 못하고 특정 뇌수막염균에서 자연 생산된 것만이 임상단계 시험 (효능 및 안전성 검사)을 거치고 있다. 그 이유는 외막소포체 (OMV)를 생산하여 백신으로 개발하는 데에 있어 극복해야 할 가장 중요한 문제는 외막소포체의 독성 때문에 발생하는 안전성 문제이다. 외막소포체의 독성은 크게 두 가지 요인으로부터 기인된다고 볼 수 있다. 그 중 하나는 외막소포체 (OMV)에 내포된 리포폴리사카라이드 (LPS) 성분 때문에 생기는 내독성 (endotoxicity) 이며, 이 내독성을 제거하거나 충분히 낮추지 않으면 패혈증 (septicemia)과 같은 생명을 위협하는 부작용이 생길 수 있다. 또 다른 독성은 세균이 생산하여 외부로 분비하는 독성 단백질 (톡신 또는 외독소) 때문에 기인하며, 이러한 톡신은 보통 그람음성 병원균에서는 외막소포체에 내포되어 외부로 분비되는 경우가 흔하다. 그러므로 외막소포체에 의한 독성을 제거하여 안전한 백신전달체로 사용하려면 LPS에 의한 내독성 뿐 만 아니라, 톡신 단백질에 의한 외독소 (exotoxin)를 또한 안전하게 제거하여야만 한다.
이에, 본 발명자들은 이러한 안전성에 관한 문제점들을 해결하기 위하여, msbB (lpxM) 유전자 이외에 pagP라는 유전자를 추가로 결실시켜 외막소포체(OMV) 내독성을 충분히 낮추었고, 이 변이주에서 생성된 OMV의 LPS가 정상적인 hexa-acyl lipid A가 아닌 변형된 penta-acyl lipid A 분자로 대체되도록 하였다. 이러한 외막소포체(OMV)가 내포하는 리포폴리사카라이드의 내독성 (LPS endotoxicity)을 충분히 낮추도록 penta-acylated lipid A 만을 생성케 하는 병원성 대장균 O157:H7 균의 변이주 (msbB1 +msbB2 +pagP::FLAG)를 제작하는 방법의 개발에 대하여는 본 발명자들이 먼저 특허출원(출원번호: 10-2008-0072858)한 바 있다.
따라서 본 발명에서는 LPS에 의한 내독성 문제가 아닌, 나머지 하나의 외독소(단백질 톡신)에 의한 독성문제를 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 외독소 및 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 G(-) 박테리아에서, 외독소의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자를 결실시킬 경우, 독성이 제거된 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아를 제조할 수 있다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 독성이 제거되어 안전하게 백신물질 전달체로 이용 가능한 외막소포체를 분비하는 재조합 G(-) 박테리아 및 상기 재조합 G(-) 박테리아의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 독성이 제거되어 안전하고, 다양한 외부항원이 융합·발현되어 있어 백신물질 전달체로 이용 가능한 외막소포체를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 외독소(exotoxin) 및 외막소포 체(OMV) 생성능을 가지는 G(-) 박테리아에서, 상기 외독소의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자를 결실시키는 것을 특징으로 하는 외독소의 독성이 제거된 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 외독소 및 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 G(-) 박테리아에서, 상기 외막소포체가 내포하는 리포폴리사카라이드(LPS)의 리피드(lipid) A 생합성에 관여하는 유전자를 결실시킨 G(-) 박테리아 변이주를 제작하는 단계; 및 (b) 상기 G(-) 박테리아 변이주에서 상기 외독소의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자를 결실시키는 단계를 포함하는 외독소(exotoxin) 및 내독소(endotoxin)의 독성이 제거된 외막소포체를 생성하는 재조합 G(-) 박테리아의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 외독소의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 외독소의 독성이 제거된 외막소포체의 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아를 제공한다.
본 발명은 또한, 외독소의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, G(-) 박테리아의 외독소중 독성을 나타내지 않는 부위에 외부항원이 융합·발현되도록 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위를 코딩하는 유전자에 외부항원을 코딩하는 유전자가 융합된 재조합 DNA가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 외독소의 독성이 제거된 외막소포체의 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아를 제공한다.
본 발명은 또한, 외독소의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자 및 리포 폴리사카라이드(LPS)의 리피드(lipid) A 생합성에 관여하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 외독소 및 내독소의 독성이 제거된 외막소포체의 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아를 제공한다.
본 발명은 또한, 외독소의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자 및 리포폴리사카라이드(LPS)의 리피드(lipid) A 생합성에 관여하는 유전자가 결실되어 있고, G(-) 박테리아의 외독소중 독성을 나타내지 않는 부위에 외부항원이 융합·발현되도록 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위를 코딩하는 유전자에 외부항원을 코딩하는 유전자가 융합된 재조합 DNA가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 외독소 및 내독소의 독성이 제거된 외막소포체의 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 G(-) 박테리아를 배양하여 외독소의 독성이 제거된 외막소포체를 분비·생산하는 단계; 및 상기 분비·생산된 외막소포체를 회수하는 단계를 포함하는 외독소의 독성이 제거된 외막소포체(OMV)의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 G(-) 박테리아를 배양하여 외독소 및 내독소의 독성이 제거된 외막소포체를 분비·생산하는 단계; 및 상기 분비·생산된 외막소포체를 회수하는 단계를 포함하는 외독소 및 내독소의 독성이 제거된 외막소포체(OMV)의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 재조합 G(-) 박테리아에서 생성된 외막소체(OMV)는 LPS (lipopolysaccharide)의 내독성(endotoxicity) 및 외독성이 제거되어 안전하면서도, 다가항원(multi-valent epitope) 전달능을 보유하고 있어, 첨단 바이오 나노소재 백신물질로 유용하다.
본 발명에서는 G(-) 박테리아에서 분비되는 외독소의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자를 결실시킬 경우, 외막소포체(OMV)의 외독성이 제거될 것으로 예측하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 시가톡신 및 외막소포체 생성능을 가지는 E. coli O157:H7 Sakai 균주를 대상으로 상동성 재조합(homologous recombination)을 이용한 방법으로 시가톡신 A 서브유닛을 코딩하는 stx1A 및 stx2A 유전자를 결실시킨 재조합 균주를 제조하고, 이로부터 분비된 외막소포체(OMV)의 독성을 확인한 결과, 정상균주에서 분비된 외막소포체와 달리 독성이 현저히 제거된 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 외독소(exotoxin) 및 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 G(-) 박테리아에서, 상기 외독소의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자를 결실시키는 것을 특징으로 하는 외독소의 독성이 제거된 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 외막소포체 (OMV)는 G(-) 박테리아의 외막으로부터 자연생성되어, 소량 분비되는 나노 크기의 막소포체 (membrane vesicle)이므로, 외막(outer membrane)에 존재하는 다양한 항원성분들이 자연적으로 내포되어 있다.
본 발명에 있어서, 상기 외독소의 독성을 나타내는 부위는 시가톡신 A 서브유닛, 열 불안정 독소 (heat-labile toxin) LT톡신의 A 서브유닛, 콜레라 톡신 (Cholera toxin)의 A 서브유닛, 세포독성 괴사인자1 (cytotoxic necrotizing factor1; CNF1) 톡신의 촉매작용 부위 (catalytic region), 류코톡신 (leukotoxin)의 촉매작용 부위 및 VacA 톡신의 촉매작용 부위로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 시가톡신 A 서브유닛을 코딩하는 유전자는 stx1A 및 stx2A이고, 상기 열 불안정 독소인 LT톡신의 A 서브유닛을 구성하는 유전자는 lt-A 이며, 콜레라 톡신의 A 서브유닛을 코딩하는 유전자는 ct-A이고, 상기 세포독성 괴사인자 1를 코딩하는 유전자는 cnf1이고, 상기 류코톡신을 코딩하는 유전자는 ltx이며, 상기 VacA 톡신을 코딩하는 유전자는 vacA를 예시할 수 있다.
상기 외독소는 G(-) 박테리아에서 생성되는 독소로써, 일반적으로 독성을 나타내는 부위와 독성을 나타내지 않는 부위로 구성된다. 시가톡신을 예로들어 설명하면, 시가톡신은 독성을 가지는 A 서브유닛(subunit)과 host 세포막의 Gb3 성분에 결합하는 역할을 하는 B 서브유닛(subunit)으로 구성된다. 시가톡신 서브유닛 단백질은 세균의 세포질에서 생합성되어 페리플라즘(periplasm)으로 이동된 다음, 다섯 개의 B 서브유닛이 합체하여 B-pentamer를 이루고 여기에 독성을 보유한 A 서브유닛 하나가 결합되어 완전한 형태의 시가톡신 구조를 형성한다(도 1).
따라서, 외독소에 의한 외막소포체의 독성을 제거하기 위해서는 외독소의 독 서을 나타내는 부위의 합성을 차단하는 것이 필요하다.
본 발명에 있어서, "결실"은 염색체의 일부가 없어진 것을 의미는 것으로서 유전자의 부분결실 또는 전체결실을 포함한다. 세균세포에서 특정 유전자의 기능을 없애는 방법들은 다양하게 연구되어 왔으나, 최근 비교적 간단하고 효율적인 방법으로 주목받고 있는 Datsenko & Wanner가 고안한 one-step PCR inactivation system (PNAS, 97:6640~6645, 2000)을 이용하면 원하는 유전자를 homologous recombination을 이용한 타겟팅으로 용이하게 결실시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 외독소 및 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 G(-) 박테리아는 상기 외독소를 생산한 후, 외막소포체(OMV)를 통하여 분비하는 박테리아라면 제한없이 이용할 수 있다. 상기 외독소 및 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 G(-) 박테리아는 열 불안정 독소(heat-labile toxin) (LT)를 생산하는 장독소성 대장균(enterotoxigenic E. coli, ETEC), 시가톡신을 생산하는 장출혈성 대장균(enterohemorrhagic E. coli, EHEC), 세포독성 괴사인자 1(cytotoxic necrotizing factor; CNF1)를 생산하는 뇨 병원성 대장균(uropathogenic E. coli, UPEC), 시가톡신을 생산하는 시겔라 디젠테리(Shigella dysenteriae), 콜레라 독소(cholera toxin)를 생산하는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 류코톡신(leukotoxin)을 생산하는 액티노바실러스(Actinobacillus), VacA 톡신을 생산하는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 등을 예시할 수 있으며, 외막소체(OMV)를 구성하는 리포폴리사카라이드(LPS)의 리피드(lipid) A 생합성에 관여하는 유전자가 결실되어 있는 상기 균주들의 재조합 변이주를 이용하는 것이 바람직 하다.
본 발명에 있어서, 상기 외독소의 독성이 제거된 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아의 제조방법은 상기 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위에 외부항원이 융합·발현되도록 상기 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위를 코딩하는 유전자에 외부항원을 코딩하는 유전자가 융합된 재조합 DNA를 도입하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위는 시가톡신 B 서브유닛, 열 불안정 독소인 LT톡신의 B 서브유닛, 콜레라 톡신의 B 서브유닛, 세포독성 괴사인자1 (cytotoxic necrotizing factor1; CNF1) 톡신의 촉매작용 부위 (catalytic region)중 부분결실에 의하여 잔존하는 부위, 류코톡신 (leukotoxin)의 촉매작용 부위중 부분결실에 의하여 잔존하는 부위 및 VacA 톡신의 촉매작용 부위중 부분결실에 의하여 잔존하는 부위 등을 예시할 수 있다.
상기 시가톡신 B 서브유닛을 코딩하는 유전자는 stx1B 및 stx2B이고, 상기 열 불안정 독소인 LT톡신의 B 서브유닛을 코딩하는 유전자는 lt-B 이며, 콜레라 톡신 B 서브유닛을 코딩하는 유전자는 ct-B를 예시할 수 있다. 상기 시가톡신, LT톡신, 콜레라 톡신의 B 서브유닛은 모두 B-pentamer 형태로 되어 있다. 반면에, 상기 세포독성 괴사인자1 (cytotoxic necrotizing factor1; CNF1) 톡신, 류코톡신 (leukotoxin), VacA(Vacuolating Cytotoxin A) 톡신은 상기 시가톡신, LT톡신, 콜레라 톡신 등과는 다른 구조로 되어 있으므로, 유전자중 독성 발현과 관련된 촉매 작용 부위를 부분결실시켜 독성 발현을 불활화 시키고, 잔존하는 부위에 외부항원을 융합시킬 수 있다. 상기 유전자의 부분결실 부위는 부분결실을 통하여 상기 CNF1 톡신, 류코톡신 (leukotoxin), VacA 톡신 등의 독성발현이 불활화 된다면 특별한 제한없이 임의적으로 선택할 수 있다.
상기 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위는 페리플라즘에서 합체되어 외막소포체내로 포함되더라도, 독성이 없기 때문에 안전성에 영향을 주지 않을 뿐 만 아니라, 오히려 시가톡신에 대한 항원 제시나 외부 항원과 융합발현시 외부항원을 외막소포체에 내포되게 하는 운반체 (carrier) 역할을 수행 할 수 있다.
상기 외부항원은 (a) 인간 또는 동물에서 다양한 감염성 질병을 일으키는 바이러스 또는 병원성 미생물의 주요 단백질 항원성분, (b) 면역세포 또는 암세포에 발현하는 특이적인 세포표면 마커 및 (c) 면역세포 또는 암세포의 표면에 존재하는 특정 리셉터에 결합하는 리간드 (ligand)로 구성된 군에서 선택되는 것을 사용할 수 있다. 상기 외부항원은 특별한 제한없이 이용할 수 있으며, 예를들면 human papilloma virus의 E7 epitope 등과 같은 예방하고자 하는 병원체의 항원을 이용할 수 있다.
상기 유전자 융합을 이용한 외부항원 도입 방법은 본 연구자들의 선행특허(한국특허 출원번호: 10-2008-0072858) 및 논문 (Kim et al., BBA-Biomembranes 1788: 2150-2159, 2009)에서 설명된 것과 같은 방법을 사용하였다. 즉, 외독소중 시가톡신을 예로들어 설명하면, 독성을 나타내지 않는 시가톡신의 B 서브유닛 유전자의 N-말단 부위 또는 C-말단 부위에 선정된 외부항원 유전자의 코딩 시퀀스를 in-frame 되도록 융합시킨 다음, 이와 연결된 항생제 저항성 마커가 삽입된 재조합 플라스미드 DNA를 제작한다. 이러한 재조합 플라스미드의 insert 부분의 5'과 3'영역에 상동성 재조합 반응을 유도할 수 있도록 염색체 상의 타겟 유전자 (stx1B 또는 stx2B)와 상동성 DNA 단편을 각각 삽입하여 유전자 타겟팅을 위한 주형 플라스미드를 구축한다. 이렇게 구성된 상동성 DNA를 가진 타겟팅 DNA 단편을 PCR로 증폭시킨 다음, 이를 변이주를 제작을 위해 세균 내부로 electroporation을 이용하여 도입시킬 수 있다.
본 발명은 다른관점에서, 상기 방법에 의해 제조되고, 외독소의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 외독소의 독성이 제거된 외막소포체의 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른관점에서, 상기방법에 의해 제조되고, 외독소의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, G(-) 박테리아의 외독소중 독성을 나타내지 않는 부위에 외부항원이 융합·발현되도록 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위를 코딩하는 유전자에 외부항원을 코딩하는 유전자가 융합된 재조합 DNA가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 외독소의 독성이 제거된 외막소포체의 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아에 관한 것이다.
한편, 본발명에서는 외독성 뿐만 아니라, 내독성까지 제거된 외막소포 체(OMV)를 생성하는 재조합 균주를 제조하고, 이를 배양할 경우, 독성이 더욱 제거되어 안전하게 사용할 수 있는 외막소포체를 제조할 수 있을 것으로 예측하였다.
본 발명자들은 이전 연구에서 상기 내독성이 제거된 외막소포체를 생성하는 재조합 균주에 대하여 보고한 바 있다(한국특허 출원번호: 10-2008-0072858).
본 발명의 다른 실시예에서는 시가톡신 및 외막소포체 생성능을 가지며, 리피드 A 생합성에 관여하는 lpxM(msbB) 유전자가 결실된 E. coli O157:H7 Sakai-DM 균주를 대상으로 상동성 재조합(homologous recombination)을 이용한 방법으로 시가톡신 A 서브유닛을 코딩하는 stx1A 및 stx2A 유전자를 결실시킨 재조합 균주를 제조하고, 이로부터 분비된 외막소포체(OMV)의 독성을 확인한 결과, 정상균주에서 분비된 외막소포체와 달리 독성이 현저히 제거된 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 다른관점에서, (a) 외독소 및 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 G(-) 박테리아에서, 상기 외막소포체가 내포하는 리포폴리사카라이드(LPS)의 리피드(lipid) A 생합성에 관여하는 유전자를 결실시킨 G(-) 박테리아 변이주를 제작하는 단계; 및 (b) 상기 G(-) 박테리아 변이주에서 상기 외독소의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자를 결실시키는 단계를 포함하는 외독소(exotoxin) 및 내독소(endotoxin)의 독성이 제거된 외막소포체를 생성하는 재조합 G(-) 박테리아의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 외막소체 (OMV)는 G(-) 박테리아의 외막으로부터 자연생성되어, 소량 분비되는 나노 크기의 막소체 (membrane vesicle)이므로, 외막(outer membrane)에 존재하는 다양한 항원성분들이 자연적으로 내포되어 있다. 이러한 항 원 성분들 중에서 리포폴리사카라이드 (LPS)는 내독성(endotoxicity)을 가지므로, 내독성 부작용이 없는 안전한 백신을 개발하려면 LPS의 구조를 변화시켜서, 내독성을 충분히 낮추도록 해야 한다. 따라서, 본 발명에서는 리포폴리사카라이드 (LPS)의 리피드 (lipid) A 생합성에 관여하는 msbB 유전자를 우선 결실시키고, 이 msbB 변이주에서 PagP 외막효소의 활성화로 인하여 발생하는 palmitated hexa-acyl lipid A 종류의 형성을 차단하는 pagP 유전자를 불활화 (inactivation)하는 변이주를 제작하여 온전히 penta-acyl lipid A만을 생성하게 함으로써 LPS의 내독성을 충분히 낮추는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에 있어서, 상기 리포폴리사카라이드 (LPS)의 리피드 (lipid) A 생합성에 관여하는 유전자는 lpxL (htrB), lpxM (msbB) 및 pagP로 구성된 군에서 선택되며, msbB 유전자를 포함하는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 PagP는 뇌수막염 균에는 존재하지 않으나, 대장균, 이질균 (Shigella spp.), 살모넬라 등의 세포외막(outer membrane)에 위치하는 효소 단백질로서, lipid A 분자에 팔미테이트(palmitate)를 첨가하는 lipid A palmitoylation 반응을 촉매하는 효소이다(Bishop RE., Mol. Microbiol., 57:900-912, 2005). 상기 PagP는 hexa-acyl lipid A를 가지는 정상균주에서는 효소활성이 매우 낮으나, 외막의 구조적 부실을 초래하는 (penta-acyl lipid A를 가진) msbB(lpxM) 결실 변이주가 만들어지면 그에 따른 외막의 취약성을 보상하기 위해 이 PagP가 특이적으로 활성화되어 penta-acyl lipid A (기질)에 myristate (MsbB에 의한 촉매) 대신 palmitate를 부가시켜 주는 활성이 증가된다.
만약 상기의 lipid A 합성에 관여하는 효소 유전자들을 불활화 하여도 LPS의 내독성이 충분히 제거되지 않는다면 lipid A에 대한 부가적인 구조를 변화시키는 (lipid A structural modification)데 관여하는 lpxXL, lpxF 및 lpxE로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 발현벡터에 클로닝하여, 이를 상기 재조합 G(-) 박테리아 변이주에 추가로 융합(도입)·발현시킬 수 있다.
즉, Brucella abortus 균이나 Helicobacter pylori 균으로부터 lpxE 유전자 (lipid A-1 phosphatase)를 발현벡터에 클로닝하여, 본 발명의 일 실시예에서 제작한 변이주(msbB -/pagP -)에 융합·발현시키면, penta-acyl lipid A로의 변환 뿐 만 아니라, lipid A 분자의 글루코사민 1번 탄소에 연결된 phosphate를 부가적으로 제거한 mono-phosphoryl lipid A (penta-acyl)를 창출 할 수 있으므로 내독성을 완전히 제거할 수 있다.
상기 유전자중 msbB는 세균의 세포질에서 lipid A를 합성하는 마지막 단계에서 미리스테이트 (myristate) 지방산을 전구물질 (lipid IVA)에 첨가하는데 관여하는 효소이다. 따라서, 이 유전자를 불활성화 (inactivation) 시킨 변이주 (ΔmsbB mutant)에서 생성된 LPS는 wild type 균주의 LPS와 달리 내독성이 거의 소실된다고 보고 된 바 있다 (Raetz CRH & Whitfield C., Annu. Rev. Biochem., 71:635~700, 2002).
LPS의 내독성은 lipid A라고 불리는 LPS의 한 부분의 특이적 분자구조에서 기인되며, 이 정상 lipid A의 특이적인 분자구조 중에서 인산화 (bis- phosphorylated) 및 순차적 아실레이션 (acylation) 반응으로 첨가되는 라우레이트 (laurate)와 미리스테이트 (myristate)로 구성된 여섯 개의 지방산 (hexa-acyl chain) 잔기의 존재가 내독성 (endotoxicity)을 결정하는 필수요소라는 사실이 이미 밝혀진 바 있다 (Alexander C. & Rietschel ET., J. Endotoxin. Res., 7:167~202, 2001). 그러므로 msbB 변이주에서 생성되는 lipid A 분자는 myristate 지방산이 부가되지 않아, 다섯 개의 지방산 (penta-acyl chain) 잔기를 가지는 lipid A 구조가 만들어 짐으로, 이 변형된 구조의 lipid A는 사람이나 동물의 선천면역 리셉터(innate immunity receptor)인 toll-like receptor 4 (TLR4)를 자극하는 어고니스트 (agonist)로 작용하지 못한다. 그러나, 병원성 대장균 O157:H7, 이질균 (Shigella spp.) 및 살모넬라 균 등에서는 MsbB 효소 불활성화 만으로는 뇌수막염균 변이주와 같이 penta-acyl lipid A 종류만 생성하지 않으므로, 이들 균종들은 PagP 효소를 추가적으로 불활성화 하는 변이주를 제작하여야 온전히 penta-acyl lipid A를 가진 LPS가 만들어 진다. 이러한 penta-acyl lipid A를 가진 LPS는 정상적인 hexa-acyl lipid A와 TLR4가 결합하여 일어나는 신호전달의 결과 (과도한 염증매개인자들 (pro-inflammatory cytokines)의 발현 자극) 보다 현저히 낮게 TLR4 리셉터를 자극하기 때문에, 염증매개인자들의 과도한 분비로 인한 내독성의 부작용을 제거할 수 있다. 흥미로운 점은 msbB 변이주에서 만들어진 penta-acyl lipid A는 pro-inflammatory cytokine의 과도한 발현을 자극하는 위험신호 (danger signal)로서의 신호전달 작용은 억제되지만, adjuvancity에 관여하는 dendritic cells의 B7 분자들의 발현을 촉진하는 co-stimulatory signal로서의 신호작용은 그 대로 유지한다는 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법에 의해 제조되고, 외독소의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자 및 리포폴리사카라이드(LPS)의 리피드(lipid) A 생합성에 관여하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 외독소 및 내독소의 독성이 제거된 외막소포체의 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법에 의해 제조되고, 외독소의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자 및 리포폴리사카라이드(LPS)의 리피드(lipid) A 생합성에 관여하는 유전자가 결실되어 있고, G(-) 박테리아의 외독소중 독성을 나타내지 않는 부위에 외부항원이 융합·발현되도록 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위를 코딩하는 유전자에 외부항원을 코딩하는 유전자가 융합된 재조합 DNA가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 외독소의 독성이 제거된 외막소포체의 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 G(-) 박테리아를 배양하여 외독소의 독성이 제거된 외막소포체를 분비·생산하는 단계; 및 상기 분비·생산된 외막소포체를 회수하는 단계를 포함하는 외독소의 독성이 제거된 외막소포체(OMV)의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 G(-) 박테리아를 배양하여 외독소 및 내독소의 독성이 제거된 외막소포체를 분비·생산하는 단계; 및 상기 분비·생산된 외막소포체를 회수하는 단계를 포함하는 외독소 및 내독소의 독성이 제거된 외막소포체(OMV)의 제조방법에 관한 것이다.
상기 분비된 외막소포체는 본 연구자의 선행특허(한국특허 출원번호: 10-2008-0072858) 및 논문 (Kim et al., BBA-Biomembranes, 1788: 2150~2159, 2009)에서 설명된 것과 같은 방법을 사용하여 회수할 수 있다. 즉, 재조합 G(-) 박테리아 배양액을 원심분리하여 배양 상청액을 분리한 후, ammonium sulfate를 가하여 외막소포체를 침전시키고, 이를 다시 PBS에 부유시키고 원심분리함으로써 회수 할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 G(-) 박테리아 변이주로부터 생성된 외막소체(OMV)는 내독성이 낮아 안전하고, 다양한 외부항원을 전달할 수 있다. 또한, 본 발명에서 생성시킨 외막소체(OMV)는 보통의 바이러스 particle과 유사한 nano-scale 크기 (평균 약 60~70nm)의 막소체 (membrane vesicle)로서, 인공적으로 형성시킨 liposome과 유사하므로 바이오 나노공학 분야에서 주목할만한 운반체 (vehicle)로 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
하기 실시예에서는 시가톡신 및 외막소체를 분비하는 병원성 대장균 O157:H7 Sakai 균주 및 msbB (lpxM) mutant (Sakai-DM)를 대상으로 시가톡신의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자를 결실시켰으나, 다른 외독소 및 외막소체를 분비하는 박테리아를 이용하여 외독소의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자를 결실시키고, 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위를 코딩하는 유전자에 외부항원을 코딩하는 유전자가 융합된 재조합 DNA를 도입하는 것 역시 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시 예 1: Sakai/Δ stx1A /Δ stx2A (Sakai 변이주) 및 Sakai-DM/Δ stx1A /Δ stx2A (Sakai-DM 변이주) 제작
외독소를 분비하는 대장균 (Escherichia spp.)에서 백신개발이 우선 요구되는 병원성 대장균 E. coli O157:H7를 이용하여 실험을 수행하였다. E. coli O157:H7균은 세균성 이질을 유발하는 쉬겔라 균 (Shigella dysenteriae.)과 같이 시가톡신을 생산하는 유전자를 가지고 있으며, 특이하게도 두 가지 타입의 시가톡신 유전자 (stx1 및 stx2)가 염색체(chromosome)에 존재하므로, 시가톡신에 의한 외막소포체의 독성을 완전히 배제하기 위하여 도 2에 도시된 전략에 따라 정상 Sakai 균 (KCTC 11344BP) 및 Sakai-DM (KCTC 11346BP)의 stx1A 및 stx2A 유전자를 동시에 결실시켰다.
상기 Sakai-DM (KCTC 11346BP)은 msbB (lpxM)가 결실된 mutant 이며, 이는 본 연구자의 선행특허(한국특허 출원번호: 10-2008-0072858)를 참조하여 제작이 가능하다.
먼저, stx1A 와 stx2A 서브유닛 유전자를 각각 결실시키기 위하여 각기 stxA 서브유닛을 포함하는 DNA를 PCR로 증폭시킨 다음, 증폭된 DNA 단편을 정제하여 pUC18 플라스미드에 클로닝하였다. stx1A 유전자 부분을 PCR로 증폭시키기 위하여 STx1-Fw 프라이머 (서열번호 1: GTCGCAT GAATTC TGACCAGATA) 와 STx1-Rev 프라이머 (서열번호 2: TGTATA CTGCAG CTTTCCAGTTAC)를 제작하여 사용하였다. 또한 stx2A 유전자 부분을 PCR로 증폭시켜 pUC18 플라스미드에 클로닝하기 위하여 STx2-Fw 프라이머 (서열번호 3: GGTCCATTATCT GAATTC TGCGT)과 STx2-Rev 프라이머 (서열번호 4: CCGCCATAAA AAGCTT CTTCATG)를 제작하여 사용하였다. 클로닝에 필요한 제한효소 인식부위는 각 프라이머에서 밑줄로 표시한 바와 같이 내포되도록 프라이머를 디자인 할 때 고려하였다.
PCR 수행 조건은 template DNA로서 정상 Sakai 균주의 genomic DNA를 사용하여, 각각의 프라이머를 30 pico mole농도로 첨가한 다음, AccuPrime Taq DNA polymeraseⓡ (Invitrogen)와 kit에 첨가된 reaction buffer를 혼합하여, 94℃에서 1분간 denaturing, 57℃에서 30초간 annealing, 70℃에서 1분간 extension하는 반복 주기를 한 사이클 삼아 32 사이클 까지 반응시켰다.
다음으로, PCR 산물을 정제하여 pUC18 벡터에 클로닝한 후, 삽입된 DNA 단편 을 agarose gel (1%) 전기영동을 통해 정확한 insert의 존재를 확인하였다.
다음으로, stx1A 및 stx2A 유전자의 클론에서 각 유전자의 ORF (open reading frame) 중간 부분에 약 310-bp 및 330-bp 크기의 DNA를 결실시키기 위하여 내부적인 DNA시퀀스에 annealing하는 프라이머 세트를 제작하고 각기 stx1A 및 stx2A 유전자가 pUC18 벡터에 삽입된 클론을 주형으로 하여 inverse PCR을 수행하였다.
Inverse PCR을 위하여 STx1A-Fw 프라이머 (서열번호 5: GGATTT GGTACC ACACTGGATGAT) 와 STx1A-Rev 프라이머 (서열번호 6: TTTCG GTCGAC AATAAGCCGTA) 및 STx2A-Fw 프라이머 (서열번호 7: TTCGTCA GGTACC GTCTGAAACT) 와 STx2A-Rev 프라이머 (서열번호 8: GAAGATG GTCGAC ACGCGCCTGAT) 세트를 제작하여 사용하였다. 이렇게 수행한 inverse PCR 산물을 정제하여 프라이머에 도입한 제한효소를 처리하여 DNA 단편의 말단을 자르고 이를 pKD3 플라스미드 유래 항생제 카세트 (FRT-Cm-FRT)와 연결시키도록 DNA ligation 반응을 진행시켜, stx1A 및 stx2A 유전자의 클론에서 중간 부분에 약 310-bp 및 330-bp 크기의 DNA를 결실시킨 대신 FRT-Cm-FRT 카세트가 결실부위에 삽입되어 구성된 타겟팅 플라스미드 클론들 (pStx1A-Cm 및 pStx2A-Cm)을 제작하였다.
그 결과, 재구성된 pUC18 유래 타겟팅 플라스미드 클론 (pStx1A-Cm 및 pStx2A-Cm)의 insert 부분은 5-프라임 말단쪽의 toxin A subunit와 상동성을 가지는 DNA 부분과 이에 연결된 FRT-Cm-FRT 카세트와 계속해서 3-프라임 말단 쪽의 toxin A subunit 상동성 부분이 존재하는 구조를 가지는 것을 확인하였다.
따라서, 변이주 제작을 위한 타겟팅 DNA 단편으로써, 상기 pStx1A-Cm 및 pStx2A-Cm 클론의 insert 부분을 PCR로 증폭시키고, 정제하여 5'-stx1A-Cm cassette-3'-stx1A DNA 단편 및 5'-stx2A-Cm cassette-3'-stx2A DNA 단편을 각각 획득하였다. 상기 타겟팅 DNA 단편을 증폭시키기 위한 PCR을 위한 primer 및 조건은 상기 STx1-Fw 프라이머 (서열번호 1) 과 STx1-Rev 프라이머 (서열번호 2) 및 STx2-Fw 프라이머 (서열번호 3)과 STx2-Rev 프라이머 (서열번호 4)를 각각 사용하였으며, PCR 수행 조건은 template DNA로서 정상 Sakai 균주의 genomic DNA를 사용하여, 각각의 프라이머를 30 pico mole농도로 첨가한 다음, AccuPrime Taq DNA polymeraseㄾ (Invitrogen)와 kit에 첨가된 reaction buffer를 혼합하여, 94℃에서 1분간 denaturing, 57℃에서 30초간 annealing, 70℃에서 1분간 extension하는 반복 주기를 한 사이클 삼아 33 사이클 까지 반응시켰다.
다음으로, 상기 제조된 PCR 산물(5'-stx1A-Cm cassette-3'-stx1A DNA 단편 및 5'-stx2A-Cm cassette-3'-stx2A DNA 단편)을 정제 후, 이를 pKD46 플라스미드를 함유하는 형질전환 Sakai 균과 Sakai-DM 속에 도입하기 위하여 electroporation을 실시하였다.
Electroporation를 위하여 우선 Sakai 균과 Sakai-DM 균을 배양한 다음, 차가운 10% glycerol solution으로 균체를 washing하여 electro-competent cell을 만들고, pKD46 플라스미드 1㎍을 혼합하여 얼음 속에서 10분간 방치한 다음, electroporation용 cuvette에 옮겨 GenePulserⓡ Xcell (BioRad) 기기를 사용하여 2.5 kV, 200Ω의 조건으로 전기자극을 가하여 Sakai 및 Sakai-DM을 각각 형질전환 시켰다.
그런 후, 상기와 동일한 방법으로 pKD46 플라스미드를 함유하는 형질전환 Sakai-DM을 모체로하는 새로운 electro-competent cell로 만들고, 5'-stx1A-Cm cassette-3'-stx1A DNA 단편을 혼합한 후, electroporation을 수행하였다.
상기 Sakai(pKD46) 및 Sakai-DM(pKD46)에 들어있는 플라스미드 pKD46에는 상동성을 지닌 DNA 단편끼리 재조합시키는 효소인 Red recombinase가 존재하므로, 도입된 targeting DNA 단편 (5'-stx1A-Cm cassette-3'-stx1A DNA 단편)이 염색체에 존재하는 stx1A 유전자를 표적화 (targeting) 시키고, Cm에 내성을 지닌 변이체를 제조할 수 있다.
이러한 유전자 표적화 (gene targeting)는 상동성 재조합 (homologous recombination)에 의하여 일어나므로, Sakai 및 Sakai-DM genome상의 상동성 부분 (stx1A)을 제외한 다른 부분에서는 변이가 생기지 않는다.
따라서, 인위적으로 특정 유전자를 변이시키고자 할 때 그 유전자와 상동성이 있는 DNA 단편을 도 2와 같이 제작하여 균체내부로 전달하면 타겟 DNA 단편과 염색체 상의 유전자가 서로 교체되어 LB-Cm plate에 콜로니를 형성하는 변이주가 탄생하게 된다. 이러한 Cm 저항성 콜로니들을 다시 한번 순수 분리하여 의도한 대로 stx A subunit 유전자의 타겟 부분에 변이가 도입되었는지를 변이주를 주형으로 한 genomic PCR로 확인하였다. 즉, 변이주의 genomic DNA를 분리하여 변이를 도입한 부분의 외부에서 프라이머를 작성하여 PCR로 증폭된 DNA산물의 크기를 확인하였다 (도 2에서 예상크기 만큼의 증가로 확인). 그런 다음, 최종적으로 genome에 삽 입한 Cm-cassette를 다시 잘라내어(excision) Cm 저항성 마커를 제거하였다. 이를 위하여 변이주를 41˚C의 고온에 배양시켜 온도-민감(temperature-sensitive)형인 pKD46 (AmpR) 플라스미드를 소실시킨 다음, pCP20 (AmpR) 플라스미드를 변이주 내로 도입시켰다. 그 결과, pCP20에 포함된 FLP recombinase에 의해 Cm-cassette 내부 말단에 포함된 FRT (FLP recognition target) 시퀀스가 인식되므로, Cm-cassette가 FLP에 의하여 절단(excision)되어 탈락하는 효소반응이 일어났다. 이렇게 Cm-cassette를 소실시킨 Sakai/Δstx1A 및 Sakai-DM/Δstx1A 변이주를 PCR로 다시 확인하고 (도 2의 lane 3번에서와 같이 예상크기 만큼의 감소), 이를 새로이 첨가하여야 할 stx2A 결실 변이를 위한 parental strain으로 사용하였다. 즉, stx1A 결실 변이주를 먼저 제작하고, 앞서 설명한 것과 동일한 상동성 재조합 방법을 이용하여 stx2A 결실 변이를 새로이 도입하는 방법으로 시가톡신의 독성을 완전히 제거한 Sakai/Δstx1A/Δstx2A 변이체와 Sakai-DM/Δstx1A/Δstx2A 변이체를 제작하였다. 그러므로 Sakai-DM (KCTC 11346BP) 및 정상 Sakai 균 (KCTC 11344BP)을 모체로 사용한 변이체들 (Sakai/Δstx1A/Δstx2A 및 Sakai-DM/Δstx1A/Δstx2A)에서 생산된 OMV는 LPS endotoxicity와 관련된 MsbB 아실전이효소의 불활화로 인한 lipid A 부분의 구조적 차이외에는 서로 동일할 것으로 사료되며, 기능적으로는 시가톡신 A 서브유닛이 포함되지 않는 외막소포체 형태로 생성될 것이므로 이를 검정하기 위해 하기 실험예 1와 같이 각 변이주에서 생산한 OMV의 분석을 시도하였다.
실험예 1: Sakai/Δ stx1A /Δ stx2A (Sakai 변이주) 및 Sakai-DM/Δ stx1A /Δ stx2A (Sakai-DM 변이주)에서 생산한 OMV의 분석
실시예 1에서 제작된 Sakai/Δstx1A/Δstx2A (Sakai 변이주), Sakai-DM/Δstx1A/Δstx2A (Sakai-DM 변이주) 및 Sakai-DM (KCTC 11346BP)에서 생성되어 분비된 외막소포체(OMV)를 수집하여 전자현미경, immunoprecipitation (IP) 및 SDS-PAGE를 통한 immunoblotting (IB) 방법으로 분석하였다 (Kim et al., BBA-Biomembranes, 1788: 2150~2159, 2009). 즉, 분리정제한 OMV의 단백질 함량을 측정하기 위해서 BCA protein assay kit (PIERCE)를 사용하여 동량의 단백질 함량을 가진 OMV를 SDS-PAGE well에 로딩하여 전개한 다음, nitrocellulose membrane에 블로팅 하였다. IB 실험을 위하여 사용한 단클론 항체는 시가톡신1형-B 서브유닛 (STx1B)에 특이적인 항체 (clone 13C4; Santa Cruz Biotechnology) 와 STx2A에 특이적인 항체 (clone 11E10; Santa Cruz Biotechnology)를 구입하여 사용하였고, 또한 STx2B에 특이적인 단클론 항체는 Biodesign 제품을 구매하여 사용하였다. 웨스턴블롯 시그널을 찾기 위한 2차 항체 (peroxidase-conjugated rabbit anti-mouse IgG)는 Sigma 제품을 구매하여 제조사의 사용법에 의거하여 실험에 사용하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 시가톡신의 A 서브유닛 부위만을 특이적으로 결실시킨 변이주인 Sakai-DM/Δstx1A/Δstx2A로부터 생산된 STx(-) OMV에 STxA 단백질이 결여되어 있는 지를 확인하기 위하여, western blotting을 수행한 결과, STx(-) OMV에서는 B 서브유닛에 해당하는 단백질은 존재하지만 A 서브유닛은 존재하지 않음을 확인 할 수 있었다 (도 3의 A).
또한 시가톡신 B 서브유닛의 B-pentamer 구조를 확인하기 위하여 STx(+) OMV(lane 1) 및 STx(-) OMV(lane 2)의 native gel을 수행한 결과, 시가톡신 A 서브유닛이 제거된 OMV (STx(-) OMV)에 존재하는 B 서브유닛 단백질은 하나의 monomer가 아닌 다섯 개가 서로 합체되어 구성된 B-pentamer 형태로 존재하고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 3의 B).
그리고 상기 B-pentamer 형태의 단백질이 외막소포체 내부의 공간 (lumen)에 위치하는 지를 검증하기 위하여, intact vesicular OMV와 ruptured OMV 샘플을 각각 톡신 B-subunit에 특이적인 단클론 항체를 사용하여 IP하여 웨스턴 블롯으로 확인한 결과, 시가톡신 B 서브유닛은 OMV의 내부에 위치하고 있음을 알 수 있었다 (도 3의 C). 즉, 정상적인 시가톡신 A 서브유닛과 B-pentamer가 합체되어 holotoxin 형태로 존재하는 OMV vesicle (lane 1)과 시가톡신 A 서브유닛이 제거된 OMV (lane 2)를 각각 sonication으로 ruptured vesicle lysate 샘플을 준비한 다음, 여기에 STx2B에 특이적인 단클론 항체 (anti-STx2B)을 첨가하여 항원항체 반응이 일어나도록 한 후, 항체의 Fc부분과 결합하는 protein G-coupled agarose bead를 첨가하여 항원-항체 복합체를 원심시켜 분리시키고, 웨스턴 블롯을 수행하였다.
그 결과, lane 1에서는 ruptured vesicle 외부로 노출된 STx2가 검출되며 이를 anti-STx2A 항체로 확인하였고, lane 2에서는 Stx2A가 제거되어 있기 때문에 STx2A 밴드가 나타나지 않음을 확인할 수 있었다. 또한 vesicle rupture를 시행하지 않은 intact OMV를 사용하여 동일한 방법으로 IP할 경우 (control 실험) 두 경우 모두에서 STx2A 밴드가 나타나지 않는 것을 확인하였다 (결과 미도시). 따라서 이러한 결과들을 종합하여 볼 때 STx 시가톡신이 OMV 내부에 위치한다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2: Sakai/Δ stx1A /Δ stx2A (Sakai 변이주) 및 Sakai-DM/Δ stx1A /Δ stx2A (Sakai-DM 변이주)에서 생산한 OMV의 세포독성 (cytotoxicity) 실험
실시예 1에서 제작된 Sakai/Δstx1A/Δstx2A (Sakai 변이주), Sakai-DM/Δstx1A/Δstx2A (Sakai-DM 변이주) 및 Sakai-DM (KCTC 11346BP)에서 분비된 외막소체를 분리하고, 이에 대한 세포독성을 실험하였다.
Sakai-DM에서 생성된 외막소포체는 DM/STx(+) OMV라고 명명하였고, 이는 시가톡신(STx)을 보유한다. Sakai-DM 균에서 시가톡신 A 서브유닛을 제거시킨 Sakai-DM/Δstx1A/Δstx2A (Sakai-DM 변이주)에서 생성된 외막소포체는 DM/STx(-) OMV라고 명명하였고, 이는 시가톡신이 존재하지 않는다. Sakai/Δstx1A/Δstx2A (Sakai 변이주)에서 생성된 외막소포체는 WT/STx(-) OMV라고 명명하였고, 이는 시가톡신을 보유한다. 상기 WT/STx(-) OMV는 LPS의 내독성 (endotoxicity)이 낮춰지지 않고 자연상태 그대로 인 것이므로 외막소포체에 존재하는 LPS의 내독성에 의하여 야기되는 세포독성 및 생쥐 치사율에 LPS에 의한 영향이 얼마나 미치는 지를 비교 평가하는데 사용되었다.
우선 세포표면에서 시가톡신 B subunit과 결합하는 수용체로 알려진 Gb3 분자를 발현하는 세포주로서 ACHN (human renal tubular epithelial carcinoma-derived) 세포주 (한국세포주은행: KCLB)를 사용하여 세포독성 실험을 수행하였다. 세포독성을 측정하기 위하여 Sulforhodamine B (SRB) assay 기법을 사용하였다. 즉, 96-well 플레이트에 ACHN 세포를 분주한 다음, 정제한 DM/STx(+) 및 DM/STx(-) OMV를 각각 1㎍ 및 10㎍ 농도로 처리한 후, 48시간 동안 혼합 배양하였다.
배양 후, 세포를 차가운 50% TCA용액으로 고정시킨 다음, 0.4% SRB (Sigma) 시약을 각 well에 첨가하여 30분간 반응시켰다. 반응 후 플레이트를 1% acetic acid로 가볍게 수세 (rinse)한 다음, 세포의 단백질 성분과 결합된 SRB dye를 10 mM unbuffered Tris-base solution (pH 10.5)을 사용하여 5분간 용해시켰다. 이렇게 세포로부터 용해된 SRB 염료의 량을 측정하기 위하여 490 nm에서 각 well에서 유래한 샘플의 흡광도를 측정하고, 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 시가톡신의 A 서브유닛을 제거시킨 DM/STx(-) OMV는 톡신의 독성을 보유한 OMV 대조군에 비하여 크게 ACHN 세포주에 대한 세포독성이 감소되었음을 확인할 수 있었다.
실험예 3: Sakai/Δ stx1A /Δ stx2A (Sakai 변이주) 및 Sakai-DM/Δ stx1A /Δ stx2A (Sakai-DM 변이주)에서 생산한 OMV의 마우스 치사율 측정 실험
실험예 2의 결과를 바탕으로 생체내 (in vivo)에서 보다 실질적인 독성평가를 위해 마우스 치사율과 평균 치사량을 결정하는 실험을 수행하였다.
실험예 2에서 분리된 DM/STx(+), DM/STx(-) OMV 및 WT/STx(-) OMV를 각 그룹으로 구분하여 약 8 주령의 생쥐 (BALB/c)에 복강내로 접종하여 치사율 정도를 시험하였다. 또한 각 외막소포체의 평균 치사량 (median lethal dose; LD50)을 측정하기 위하여 각 OMV 그룹을 농도별(시가톡신 A서브유닛이 존재하는 경우: 0.01, 0.1, 1, 10㎍ 와 존재하지 않는 경우: 0.1, 1, 10, 100㎍)로 세분하여 각 세부 농도별로 10마리의 생쥐를 할당하여 OMV를 복강내에 접종한 다음, 치사율을 결정하고, 그 결과를 표 1 및 도 5에 나타내었다.
[표 1]
OMV group LD50(mg/kg)a
DM/STx(+) 0.274
DM/STx(-) 7.712
WT/STx(-) 2,127
a LD50은 복강내로 접종한 OMV 함량(dose)으로 결정됨.
표 1 및 도 5에 나타난 바와 같이, 시가톡신의 A 서브유닛을 제거시킨 OMV (DM/STx(-) 또는 WT/STx(-))는 톡신의 독성을 보유한 OMV 대조군 (DM/STx(+)에 비하여 마우스의 생존율과 평균 치사량이 크게 감소되었으며, 또한 OMV에 내포된 LPS에 의한 내독성이 전체적인 생체내 독성에 미치는 영향도 분명한 차이가 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서는 외막소포체의 독성(안전성)에 가장 크게 작용하는 것은, O157 균 유래 OMV의 경우, 시가톡신의 존재 유무였으며, LPS에 의한 내독성도 외독소(exotoxin)에 의한 독성보다는 낮지만 분명히 OMV의 독성에 영향을 주는 것으로 확인하였다. 그러므로 보다 안전한 외막소포체를 생산하여 이를 백신(약물)전달체로 사용하기 위해서는 LPS에 의한 내독성 뿐 만 아니라 톡신 단백질에 의한 독 성도 제거하여야 함을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 외독소 및 외막소포체를 생성능을 가지는 G(-) 박테리아의 일예인 병원성 대장균 O157:H7 균에서 외막소포체가 외막으로부터 분출되어 나온 그림 및 전자현미경 사진이다 (STx(+)OMV): 외독소의 독성을 함유하는 외막소포체, STx(-)OMV: 외독소의 독성이 제거된 외막소포체).
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 Sakai 및 Sakai-DM 모 균주로부터 각각 Δstx1A/Δstx2A 변이주를 제작하기 위한 전략을 나타낸 모식도 및 제작된 Sakai-DM 유래 Δstx1A/Δstx2A 변이주의 chromosomal DNA 상에서의 유전자 변이를 PCR로 확인한 전기영동 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 외막소포체(OMV)와 시가톡신의 관계를 확인한 SDS-PAGE 및 Native gel 사진이다 ( A : 상기 제작한 stxA-inactive 변이체 (Sakai-DM/Δstx1A/Δstx2A)로부터 생산된 STx(-) OMV에 STxA 단백질이 결여되어 있는 지를 확인하기 위하여 western blotting 한 결과로서, 1은 DM/STx(+) OMV이고, 2는 DM/STx(-) OMV를 의미함; B : 시가톡신 B 서브유닛의 B-pentamer 구조 확인을 위한 native gel 사진으로서, 1은 STx(+) OMV, 2는 STx(-) OMV를 의미함; C : 시가톡신 B subunit에 특이적인 단 클론 항체를 이용하여 Immunoprecipitation(IP) 후, western blotting 한 결과로서, 1은 STx(+) OMV, 2는 STx(-) OMV를 의미함).
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 외막소포체(OMV)의 독성을 확인하기 위한 ACHN 세포를 이용한 SRB 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 외막소포체(OMV)의 독성을 확인하기 위한 마우스 치사율 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Recombinant Gram-negative Bacteria Producing Detoxificated Outer Membrane Vesicles and Method for Preparing Detoxificated Outer Membrane Vesicles Using the Same <130> P09-B215 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gtcgcatgaa ttctgaccag ata 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tgtatactgc agctttccag ttac 24 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggtccattat ctgaattctg cgt 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ccgccataaa aagcttcttc atg 23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggatttggta ccacactgga tgat 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tttcggtcga caataagccg ta 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ttcgtcaggt accgtctgaa act 23 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gaagatggtc gacacgcgcc tgat 24

Claims (31)

  1. 시가톡신 A 서브유닛, 열 불안정 독소인 LT톡신의 A 서브유닛 및 콜레라 톡신의 A 서브유닛으로 구성된 군에서 선택되는 독성을 나타내는 부위와 시가톡신 B 서브유닛, 열 불안정 독소인 LT톡신의 B 서브유닛 및 콜레라 톡신의 B 서브유닛으로 구성된 군에서 선택되는 독성을 나타내지 않는 부위로 이루어진 외독소 및 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 G(-) 박테리아에서, 상기 외독소의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자만을 결실시키고, 상기 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위에 외부항원이 융합·발현되도록 상기 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위를 코딩하는 유전자에 외부항원을 코딩하는 유전자가 융합된 재조합 DNA를 도입시키는 것을 특징으로 하는 외독소의 독성이 제거된 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 외독소 및 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 G(-) 박테리아에서, 상기 외독소를 코딩하는 유전자중 세포독성 괴사인자1 (cytotoxic necrotizing factor1; CNF1) 톡신의 촉매작용 부위 (catalytic region), 류코톡신 (leukotoxin)의 촉매작용 부위 및 VacA 톡신의 촉매작용 부위로 구성된 군에서 선택되는 독성 발현과 관련된 촉매작용 부위를 부분 결실시켜 독성 발현을 불활화시키는 것을 특징으로 하는 외독소의 독성이 제거된 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아의 제조방법.
  5. 삭제
  6. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 외독소 및 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 G(-) 박테리아는 상기 외독소를 생산한 후, 외막소포체(OMV)를 통하여 분비하는 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 외독소 및 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 G(-) 박테리아는 열 불안정 독소(heat-labile toxin) (LT)를 생산하는 장독소성 대장균(enterotoxigenic E. coli), 시가톡신을 생산하는 장출혈성 대장균(enterohemorrhagic E. coli), 세포독성 괴사인자1 (cytotoxic necrotizing factor1; CNF1)를 생산하는 뇨 병원성 대장균(uropathogenic E. coli), 시가톡신을 생산하는 시겔라 디젠테리(Shigella dysenteriae), 콜레라 독소(cholera toxin)를 생산하는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 류코톡신(leukotoxin)을 생산하는 액티노바실러스(Actinobacillus) 및 VacA 톡신을 생산하는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제4항에 있어서, 세포독성 괴사인자1 (cytotoxic necrotizing factor1; CNF1) 톡신의 촉매작용 부위 (catalytic region)중 부분결실에 의하여 잔존하는 부위, 류코톡신 (leukotoxin)의 촉매작용 부위중 부분결실에 의하여 잔존하는 부위 및 VacA 톡신의 촉매작용 부위중 부분결실에 의하여 잔존하는 부위로 구성된 군에서 선택되는 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위에 외부항원이 융합·발현되도록 상기 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위를 코딩하는 유전자에 외부항원을 코딩하는 유전자가 융합된 재조합 DNA를 도입하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
  10. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 외부항원은 (a) 인간 또는 동물에서 다양한 감염성 질병을 일으키는 바이러스 또는 병원성 미생물의 주요 단백질 항원성분; (b) 면역세포 또는 암세포에 발현하는 특이적인 세포표면 마커; 및 (c) 면역세포 또는 암세포의 표면에 존재하는 특정 리셉터에 결합하는 리간드 (ligand)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 다음의 단계를 포함하는 외독소 및 내독소의 독성이 제거된 외막소포체를 생성하는 재조합 G(-) 박테리아의 제조방법:
    (a) 외독소 및 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 G(-) 박테리아에서, lpxL (htrB), lpxM (msbB) 및 pagP로 구성된 군에서 선택되며, msbB 유전자를 포함하는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 상기 외막소포체가 내포하는 리포폴리사카라이드(LPS)의 리피드(lipid) A 생합성에 관여하는 유전자를 결실시킨 G(-) 박테리아 변이주를 제작하는 단계; 및
    (b) 상기 G(-) 박테리아 변이주에서, 시가톡신 A 서브유닛, 열 불안정 독소인 LT톡신의 A 서브유닛 및 콜레라 톡신의 A 서브유닛으로 구성된 군에서 선택되고, 상기 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위는 시가톡신 B 서브유닛, 열 불안정 독소인 LT톡신의 B 서브유닛 및 콜레라 톡신의 B 서브유닛으로 구성된 군에서 선택되는 독성을 나타내는 부위와 세포독성 괴사인자1 (cytotoxic necrotizing factor1; CNF1) 톡신의 촉매작용 부위 (catalytic region)중 부분결실에 의하여 잔존하는 부위, 류코톡신 (leukotoxin)의 촉매작용 부위중 부분결실에 의하여 잔존하는 부위 및 VacA 톡신의 촉매작용 부위중 부분결실에 의하여 잔존하는 부위로 구성된 군에서 선택되는 독성을 나타내지 않는 부위로 이루어진 외독소중 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자만을 결실시켜 외독소의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자를 결실시키는 단계.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서, 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위에 외부항원이 융합·발현되도록 상기 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위를 코딩하는 유전자에 외부항원을 코딩하는 유전자가 융합된 재조합 DNA를 도입하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 다음의 단계를 포함하는 외독소 및 내독소의 독성이 제거된 외막소포체를 생성하는 재조합 G(-) 박테리아의 제조방법:
    (a) 외독소 및 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 G(-) 박테리아에서, lpxL (htrB), lpxM (msbB) 및 pagP로 구성된 군에서 선택되며, msbB 유전자를 포함하는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 상기 외막소포체가 내포하는 리포폴리사카라이드(LPS)의 리피드(lipid) A 생합성에 관여하는 유전자를 결실시킨 G(-) 박테리아 변이주를 제작하는 단계; 및
    (b) 상기 G(-) 박테리아 변이주에서, 상기 외독소를 코딩하는 유전자중 세포독성 괴사인자1 (cytotoxic necrotizing factor1; CNF1) 톡신의 촉매작용 부위 (catalytic region), 류코톡신 (leukotoxin)의 촉매작용 부위 및 VacA 톡신의 촉매작용 부위로 구성된 군에서 선택되는 독성 발현과 관련된 촉매작용 부위를 부분 결실시켜 외독소의 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자를 결실시키는 단계.
  15. 삭제
  16. 제11항 또는 제14항에 있어서, 상기 외독소 및 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 G(-) 박테리아는 상기 외독소를 생산한 후, 외막소포체(OMV)를 통하여 분비하는 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제11항 또는 제14항에 있어서, 상기 외독소 및 외막소포체(OMV) 생성능을 가지는 G(-) 박테리아는 열 불안정 독소(heat-labile toxin) (LT)를 생산하는 장독소성 대장균(enterotoxigenic E. coli), 시가톡신을 생산하는 장출혈성 대장균(enterohemorrhagic E. coli), 세포독성 괴사인자1 (cytotoxic necrotizing factor1; CNF1)를 생산하는 뇨 병원성 대장균(uropathogenic E. coli), 시가톡신을 생산하는 시겔라 디젠테리(Shigella dysenteriae), 콜레라 독소(cholera toxin)를 생산하는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 류코톡신(leukotoxin)을 생산하는 액티노바실러스(Actinobacillus), VacA 톡신을 생산하는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제14항에 있어서, 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위에 외부항원이 융합·발현되도록 상기 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위를 코딩하는 유전자에 외부항원을 코딩하는 유전자가 융합된 재조합 DNA를 도입하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 삭제
  20. 제13항 또는 제18항에 있어서, 상기 외부항원은 (a) 인간 또는 동물에서 다양한 감염성 질병을 일으키는 바이러스 또는 병원성 미생물의 주요 단백질 항원성분; (b) 면역세포 또는 암세포에 발현하는 특이적인 세포표면 마커; 및 (c) 면역세포 또는 암세포의 표면에 존재하는 특정 리셉터에 결합하는 리간드 (ligand)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 삭제
  22. 제1항의 방법에 의해 제조되고, 시가톡신 A 서브유닛, 열 불안정 독소인 LT톡신의 A 서브유닛 및 콜레라 톡신의 A 서브유닛으로 구성된 군에서 선택되는 독성을 나타내는 부위와 시가톡신 B 서브유닛, 열 불안정 독소인 LT톡신의 B 서브유닛 및 콜레라 톡신의 B 서브유닛으로 구성된 군에서 선택되는 독성을 나타내지 않는 부위로 이루어진 외독소중 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자만 결실되어 있고, 상기 독성을 나타내지 않는 부위에 외부항원이 융합·발현되도록 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위를 코딩하는 유전자에 외부항원을 코딩하는 유전자가 융합된 재조합 DNA가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 외독소의 독성이 제거된 외막소포체의 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아.
  23. 제4항의 방법에 의해 제조되고, G(-) 박테리아의 외독소를 코딩하는 유전자중 세포독성 괴사인자1 (cytotoxic necrotizing factor1; CNF1) 톡신의 촉매작용 부위 (catalytic region), 류코톡신 (leukotoxin)의 촉매작용 부위 및 VacA 톡신의 촉매작용 부위로 구성된 군에서 선택되는 독성 발현과 관련된 촉매작용 부위가 부분 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 외독소의 독성이 제거된 외막소포체의 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아.
  24. 삭제
  25. 제8항의 방법에 의해 제조되고, 세포독성 괴사인자1 (cytotoxic necrotizing factor1; CNF1) 톡신의 촉매작용 부위 (catalytic region), 류코톡신 (leukotoxin)의 촉매작용 부위 및 VacA 톡신의 촉매작용 부위로 구성된 군에서 선택되는 G(-) 박테리아의 외독소를 코딩하는 유전자중 독성 발현과 관련된 촉매작용 부위가 부분 결실되어 있고, 세포독성 괴사인자1 (cytotoxic necrotizing factor1; CNF1) 톡신의 촉매작용 부위 (catalytic region)중 부분결실에 의하여 잔존하는 부위, 류코톡신 (leukotoxin)의 촉매작용 부위중 부분결실에 의하여 잔존하는 부위 및 VacA 톡신의 촉매작용 부위중 부분결실에 의하여 잔존하는 부위로 구성된 군에서 선택되는 독성을 나타내지 않는 부위에 외부항원이 융합·발현되도록 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위를 코딩하는 유전자에 외부항원을 코딩하는 유전자가 융합된 재조합 DNA가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 외독소의 독성이 제거된 외막소포체의 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아.
  26. 제11항의 방법에 의해 제조되고, 시가톡신 A 서브유닛, 열 불안정 독소인 LT톡신의 A 서브유닛 및 콜레라 톡신의 A 서브유닛으로 구성된 군에서 선택되는 G(-) 박테리아의 외독소중 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자 및 lpxL (htrB), lpxM (msbB) 및 pagP로 구성된 군에서 선택되며, msbB 유전자를 포함하는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 리포폴리사카라이드(LPS)의 리피드(lipid) A 생합성에 관여하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 외독소 및 내독소의 독성이 제거된 외막소포체의 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아.
  27. 제14항의 방법에 의해 제조되고, 세포독성 괴사인자1 (cytotoxic necrotizing factor1; CNF1) 톡신의 촉매작용 부위 (catalytic region), 류코톡신 (leukotoxin)의 촉매작용 부위 및 VacA 톡신의 촉매작용 부위로 구성된 군에서 선택되는 G(-) 박테리아의 외독소를 코딩하는 유전자중 독성 발현과 관련된 촉매작용 부위가 부분 결실되어 있고, lpxL (htrB), lpxM (msbB) 및 pagP로 구성된 군에서 선택되며, msbB 유전자를 포함하는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 리포폴리사카라이드(LPS)의 리피드(lipid) A 생합성에 관여하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 외독소 및 내독소의 독성이 제거된 외막소포체의 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아.
  28. 제13항의 방법에 의해 제조되고, 시가톡신 A 서브유닛, 열 불안정 독소인 LT톡신의 A 서브유닛 및 콜레라 톡신의 A 서브유닛으로 구성된 군에서 선택되는 G(-) 박테리아의 외독소중 독성을 나타내는 부위를 코딩하는 유전자만 결실되어 있고, lpxL (htrB), lpxM (msbB) 및 pagP로 구성된 군에서 선택되며, msbB 유전자를 포함하는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 리포폴리사카라이드(LPS)의 리피드(lipid) A 생합성에 관여하는 유전자가 결실되어 있으며, 세포독성 괴사인자1 (cytotoxic necrotizing factor1; CNF1) 톡신의 촉매작용 부위 (catalytic region)중 부분결실에 의하여 잔존하는 부위, 류코톡신 (leukotoxin)의 촉매작용 부위중 부분결실에 의하여 잔존하는 부위 및 VacA 톡신의 촉매작용 부위중 부분결실에 의하여 잔존하는 부위로 구성된 군에서 선택되는 G(-) 박테리아의 외독소중 독성을 나타내지 않는 부위에 외부항원이 융합·발현되도록 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위를 코딩하는 유전자에 외부항원을 코딩하는 유전자가 융합된 재조합 DNA가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 외독소 및 내독소의 독성이 제거된 외막소포체의 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아.
  29. 제18항의 방법에 의해 제조되고, G(-) 박테리아의 외독소를 코딩하는 유전자중 세포독성 괴사인자1 (cytotoxic necrotizing factor1; CNF1) 톡신의 촉매작용 부위 (catalytic region), 류코톡신 (leukotoxin)의 촉매작용 부위 및 VacA 톡신의 촉매작용 부위로 구성된 군에서 선택되는 독성 발현과 관련된 촉매작용 부위가 부분 결실되어 있고, lpxL (htrB), lpxM (msbB) 및 pagP로 구성된 군에서 선택되며, msbB 유전자를 포함하는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 리포폴리사카라이드(LPS)의 리피드(lipid) A 생합성에 관여하는 유전자가 결실되어 있으며, 세포독성 괴사인자1 (cytotoxic necrotizing factor1; CNF1) 톡신의 촉매작용 부위 (catalytic region)중 부분결실에 의하여 잔존하는 부위, 류코톡신 (leukotoxin)의 촉매작용 부위중 부분결실에 의하여 잔존하는 부위 및 VacA 톡신의 촉매작용 부위중 부분결실에 의하여 잔존하는 부위로 구성된 군에서 선택되는 G(-) 박테리아의 외독소중 독성을 나타내지 않는 부위에 외부항원이 융합·발현되도록 외독소의 독성을 나타내지 않는 부위를 코딩하는 유전자에 외부항원을 코딩하는 유전자가 융합된 재조합 DNA가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 외독소 및 내독소의 독성이 제거된 외막소포체의 생성능을 가지는 재조합 G(-) 박테리아.
  30. 제22항, 제23항 및 제25항 중 어느 한 항의 재조합 G(-) 박테리아를 배양하여 외독소의 독성이 제거된 외막소포체를 분비·생산하는 단계; 및 상기 분비·생산된 외막소포체를 회수하는 단계를 포함하는 외독소의 독성이 제거된 외막소포체(OMV)의 제조방법.
  31. 제26항 내지 제29항중 어느 한 항의 재조합 G(-) 박테리아를 배양하여 외독소 및 내독소의 독성이 제거된 외막소포체를 분비·생산하는 단계; 및 상기 분비·생산된 외막소포체를 회수하는 단계를 포함하는 외독소 및 내독소의 독성이 제거된 외막소포체(OMV)의 제조방법.
KR1020090109108A 2009-11-12 2009-11-12 독성이 제거된 외막소포체를 생산하는 재조합 ｇ(-) 박테리아 및 이를 이용한 독성이 제거된 외막소포체의 제조방법 KR101326865B1 (ko)

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Biochim. Biophys. Acta. Vol.1788(10):2150-2159 (2009. 10.) *
Chinese J. Biotechnol. Vol.23(2):211-217 (2007) *
J. Microbiol. Biotechnol. Vol.19(10):2171-2179 (2009. 10.) *
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