JP2020114232A - 改変型宿主細胞およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
シュードモナス属の感染に対して対象にワクチン接種するために用いることができるバイオコンジュゲートの製造で有用な改変型宿主細胞が、本明細書中に記載される。本明細書中に記載される改変型宿主細胞のゲノムは、タンパク質のグリコシル化に関与するタンパク質をコードする遺伝子ならびにシュードモナス属特異的抗原の産生に特異的な遺伝子を含む。
シュードモナス属の菌株(例えば、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa))による感染によって引き起こされる疾患は、世界的に重大な脅威を代表する。そのような感染に対するワクチンの開発が進行中であるが、安全かつ大量に製造できる、シュードモナス属感染に対する効果的なワクチンについての大きなニーズが残っている。
一態様では、シュードモナス属抗原を含むバイオコンジュゲートを生成することが可能な酵素をコードする核酸を含む改変型原核生物宿主細胞が、本明細書中に提供される。そのような宿主細胞は、シュードモナス属抗原の産生に特異的な核酸を天然に発現することができるか、または宿主細胞がそのような核酸を発現するようにすることができ、すなわち、特定の実施形態では、該核酸は宿主細胞に対して異種である。特定の実施形態では、シュードモナス属抗原の産生に特異的な該核酸のうちの1種以上が、宿主細胞に対して異種であり、かつ宿主細胞のゲノムにインテグレートされている。特定の実施形態では、本明細書中に提供される宿主細胞は、タンパク質のN-グリコシル化にて活性な追加の酵素をコードする核酸を含み、例えば、本明細書中に提供される宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸および/または他のグリコシルトランスフェラーゼをコードする1種以上の核酸をさらに含む。特定の実施形態では、本明細書中に提供される宿主細胞は、キャリアタンパク質、例えば、それに対してオリゴ糖および/または多糖が結合してバイオコンジュゲートを形成できるタンパク質をコードする核酸を含む。具体的な実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。
OPS:O多糖;グラム陰性細菌のO抗原。OPSはまた、本明細書中でO抗原とも称される。 LPS:リポ多糖。
rfbクラスター:O抗原骨格構造の合成が可能な酵素的機構をコードする遺伝子クラスター。
waaL:ペリプラズムに位置する活性部位を有する膜結合型酵素をコードするO抗原リガーゼ遺伝子。コードされる酵素は、ウンデカプレニルリン酸(undecaprenylphosphate;UPP)結合型O抗原をリピドAコアへと転移させ、リポ多糖を形成させる。
RU:反復単位。本明細書中で用いる場合、RUは、生物学的反復単位(BRU)と一致する。BRUとは、in vivoで合成される場合のO抗原のRUを表わす。
Und-PP:ウンデカプレニルピロリン酸(undecaprenyl pyrophosphate)。
LLO:脂質連結型オリゴ糖。
4.図面の簡単な説明
キャリアタンパク質に連結されたシュードモナス属抗原を含むバイオコンジュゲートを産生することが可能な宿主細胞、例えば、原核生物宿主細胞が、本明細書中に提供される。本明細書中に記載される宿主細胞は、1種以上のDNA配列が挿入されたゲノムを含み、該DNA配列は、タンパク質をコードするか、またはタンパク質のグリコシル化(例えば、タンパク質のN-グリコシル化)に関与するオペロンを含む。例えば、特定の実施形態では、本明細書中に記載される宿主細胞は、以下のうちの1種以上が挿入されたゲノムを含む:オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするDNA、グリコシルトランスフェラーゼをコードするDNA、キャリアタンパク質をコードするDNA、rfb遺伝子クラスターを含むDNA、莢膜多糖遺伝子クラスターを含むDNA、フリッパーゼをコードするDNA、エピメラーゼをコードするDNA、莢膜多糖遺伝子クラスターに関連するタンパク質をコードするDNA、莢膜多糖アセンブリに関与するタンパク質をコードするDNA、O抗原アセンブリに関与するタンパク質をコードするDNA、リポ多糖アセンブリに関与するタンパク質をコードするDNA、および/またはリポオリゴ糖アセンブリに関与するタンパク質をコードするDNA。具体的な実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。
別の態様では、シュードモナス属抗原を含むバイオコンジュゲートを生成することが可能な酵素をコードする核酸を含む、改変型原核生物宿主細胞が、本明細書中に提供される。そのような宿主細胞は、シュードモナス属抗原の産生に特異的な核酸を天然に発現することができるか、または宿主細胞がそのような核酸を発現するようにすることができ、すなわち、特定の実施形態では、該核酸は、宿主細胞に対して異種である。特定の実施形態では、シュードモナス属抗原の産生に特異的な該核酸のうちの1種以上が宿主細胞に対して異種であり、かつ宿主細胞のゲノムにインテグレートされている。特定の実施形態では、本明細書中に提供される宿主細胞は、タンパク質のN-グリコシル化にて活性を有する追加の酵素をコードする核酸を含み、例えば、本明細書中に提供される宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸および/または他のグリコシルトランスフェラーゼをコードする1種以上の核酸をさらに含む。特定の実施形態では、本明細書中に提供される宿主細胞は、キャリアタンパク質、例えば、オリゴ糖および/または多糖が結合してバイオコンジュゲートを形成できるタンパク質をコードする核酸を含む。具体的な実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。
本明細書中に記載される改変型宿主細胞を作製するために用いることができる例示的な宿主細胞としては、限定するものではないが、エシェリキア属(Escherichia)の種、シゲラ属(Shigella)の種、クレブシエラ属(Klebsiella)の種、キサントモナス属(Xhantomonas)の種、サルモネラ属(Salmonella)の種、エルシニア属(Yersinia)の種、ラクトコッカス属(Lactococcus)の種、ラクトバチルス属(Lactobacillus)の種、シュードモナス属(Pseudomonas)の種、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)の種、ストレプトマイセス属(Streptomyces)の種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)の種、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)の種、バチルス属(Bacillus)の種、およびクロストリジウム属(Clostridium)の種が挙げられる。具体的な実施形態では、本明細書中で用いられる宿主細胞は大腸菌である。
コンジュゲートワクチン(例えば、ワクチンとしての使用のためのバイオコンジュゲート)の生成での使用に好適ないずれかのキャリアタンパク質を本明細書中で用いることができ、例えば、キャリアタンパク質をコードする核酸を、シュードモナス属抗原と連結されたキャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲートの生成のために本明細書中に提供される宿主へと導入することができる。例示的なキャリアタンパク質としては、限定するものではないが、無毒化緑膿菌エキソトキシンA(EPA;例えば、Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61を参照されたい)、CRM197、マルトース結合性タンパク質(MBP)、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌(S.aureus)の無毒化溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化変異体、コレラトキシンBサブユニット(CTB)、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化変異体、大腸菌Satタンパク質、大腸菌Satタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎レンサ球菌ニューモリシン(Pneumolysin)およびその無毒化変異体、C.ジェジュニ(C.jejuni)AcrA、シュードモナス属PcrVタンパク質、およびC.ジェジュニ天然糖タンパク質が挙げられる。
オリゴサッカリルトランスフェラーゼ
オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、脂質連結型オリゴ糖を、N-グリコシル化コンセンサスモチーフ、例えば、Asn-X-Ser(Thr)(ここで、XはPro以外のいずれかのアミノ酸であり得る);またはAsp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)(ここで、XおよびZは独立に、Pro以外のいずれかの天然アミノ酸から選択される)(国際公開第2006/119987号を参照されたい)を含む新生ポリペプチド鎖のアスパラギン残基に転移させる。例えば、国際公開第2003/074687号および同第2006/119987号を参照されたい(これらの開示は、全体が参照により本明細書中に組み入れられる)。
特定の実施形態では、1種以上の補助的酵素をコードする核酸が、本明細書中に記載される改変型宿主細胞に導入される。1種以上の補助的酵素をコードするそのような核酸は、プラスミド担持であるか、または本明細書中に記載される宿主細胞のゲノムにインテグレートされることができる。例示的な補助的酵素としては、限定するものではないが、エピメラーゼ、分岐させる、修飾する、アミド化する、鎖長を調節する、アセチル化する、ホルミル化する、多量体化する酵素が挙げられる。
特定の実施形態では、本明細書中に提供される改変型宿主細胞にインテグレートされる遺伝子のコピー数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である。具体的な実施形態では、本明細書中に提供される改変型宿主細胞にインテグレートされる遺伝子のコピー数は、1または2である。
本明細書中に記載される改変型宿主細胞は、染色体に挿入されたDNAの安定性、ひいては、発酵中での対象となるDNAの発現の増大のために、より少ないリスクで、治療剤として(例えば、免疫原性組成物中、ワクチン中で)使用できるシュードモナス属抗原を含むバイオコンジュゲートの大規模発酵を可能にするので、特に商業上重要であり、関連がある。本明細書中に記載される改変型宿主細胞は、とりわけ、ひとたび異種DNAが宿主細胞ゲノム中に挿入されると、発酵の間の抗生物質選択は必要ではないので、本明細書中に記載されるバイコンジュゲートの生成に必要とされる核酸のプラスミド担持性の発現に頼る宿主細胞を上回って有利である。すなわち、挿入DNAが染色体中に挿入される場合には、宿主ゲノムの複製と共に増殖するので、選択される必要がない。さらに、世代(すなわち、宿主細胞複製のサイクル)毎に、プラスミドを失うリスクが増大することが、プラスミド担持の系における公知の不利点である。このプラスミドの喪失は、細胞分裂の際の細胞分離の段階での娘細胞へのプラスミドの不適当な分布によることもある。大きな規模では、細菌細胞培養物は、より小さい発酵規模におけるよりも多く複製して、高細胞密度に達する。したがって、より高い細胞安定性および挿入DNA発現が、より高い生産収率につながり、明白な利点を提供する。細胞安定性は、さらに、規制当局による承認のためのプロセス合否基準であり、また、抗生物質選択は、一般に、種々の理由のために、例えば、抗生物質が、最終医薬品中に不純物として存在し、アレルギー反応を引き起こすリスクを有し、かつ、抗生物質は、抗生物質耐性を促進し得る(例えば、遺伝子導入または耐性病原体の選択によって)ために、発酵の間は望ましくない。
当技術分野で公知の任意の方法を使用して、宿主細胞のゲノムに核酸(例えば、遺伝子またはオペロン、例としてrfbクラスター)をインテグレートすることができる。
本明細書に記載の改変型宿主細胞を使用して、キャリアタンパク質に連結されたシュードモナス属抗原を含むバイオコンジュゲートを製造することができる。宿主細胞を使用したバイオコンジュゲートの製造方法は当技術分野で公知である。例えば、WO 2003/074687号およびWO 2006/119987号を参照のこと。本明細書に記載されるようなバイオコンジュゲートは、抗原−キャリアタンパク質の化学的コンジュゲートと比べて有利な特性を有し、それは製造において必要な化学物質がより少ないこと、生成される最終生成物の点でより一貫性があることである。
本明細書に記載のバイオコンジュゲートの構造組成および糖鎖の長さを分析するために、種々の方法を使用することができる。
挿入される系とは対照的に、多プラスミド系において、特定のタンパク質中の部位利用が変更されることを示すために、グリコシル化部位利用を定量する必要がある。そうする方法を以下に列挙する。
バイオコンジュゲート均一性(すなわち、結合している糖残基の均一性)は、グリカンの長さおよび流体力学半径を測定する方法を使用して評価され得る。
収量。収量は、制御され、最適化された条件下、バイオリアクター中で増殖された1リットルの細菌産生培養物に由来する炭水化物量として測定される。バイオコンジュゲートを精製した後、炭水化物収量は、アンスロンアッセイまたは炭水化物特異的抗血清を使用するELISAのいずれかによって直接的に測定され得る。間接的測定は、タンパク質量(周知のBCA、ローリーまたはブラッドフォード(bardford)アッセイによって測定された)ならびにタンパク質1グラム当たりの理論上の炭水化物量を算出するためのグリカンの長さおよび構造を使用することによって可能である。さらに、収量はまた、揮発性バッファーから糖タンパク質調製物を乾燥させることおよび重量を測定するために天秤を使用することによって測定され得る。
宿主細胞を含む組成物
一態様では、本明細書において記載される宿主細胞(5.1節を参照のこと)を含む組成物が本明細書において提供される。このような組成物は、本明細書において記載されるバイオコンジュゲート(5.3節を参照のこと)を製造するための方法において使用され得、例えば、宿主細胞を含む組成物は、タンパク質の産生に適した条件下で培養され得る。その後、バイオコンジュゲートが、当技術分野で公知の方法を使用して、宿主細胞を含む前記組成物から単離され得る。
別の態様では、本明細書に記載するバイオコンジュゲートの1以上(5.3節を参照のこと)を含む組成物(例えば医薬組成物)を本明細書において提供する。本明細書に記載の組成物は、シュードモナス属(Pseudomonas)による対象(例えばヒト対象)の感染の治療および予防に有用である。5.6節を参照のこと。
一態様では、本明細書中に記載されるバイオコンジュゲート(5.3節を参照されたい)またはその組成物(5.5節を参照されたい)を対象に投与することを含む、対象でのシュードモナス属感染を治療する方法が、本明細書中に提供される。別の態様では、本明細書中に記載されるバイオコンジュゲート(5.3節を参照されたい)またはその組成物(5.5節を参照されたい)を対象に投与することを含む、対象でのシュードモナス属感染を予防する方法が、本明細書中に提供される。
免疫応答を誘導するバイオコンジュゲートの能力を評価するためのアッセイ
対象での免疫応答を生起する本明細書中に記載されるバイオコンジュゲート/組成物の能力は、当業者に公知であるかまたは本明細書中に記載されるいずれかのアプローチを用いて評価することができる。一部の実施形態では、対象での免疫応答を生起するバイオコンジュゲートの能力は、対象(例えば、マウス)または対象のセットを、本明細書中に記載されるバイオコンジュゲートを用いて免疫化し、かつ追加の対象(例えば、マウス)または対象のセットを、対照(PBS)を用いて免疫化することにより評価することができる。対象または対象のセットに、続いて、シュードモナス属を接種し、対象または対象のセットで疾患を引き起こすシュードモナス属の能力を決定することができる。対照を用いて免疫化された対象または対象のセットがシュードモナス属の接種に続いて疾患に罹患するが、本明細書中に記載されるバイオコンジュゲートまたはその組成物を用いて免疫化された対象または対象のセットが疾患にあまり罹患しないかまたは罹患しない場合に、バイオコンジュゲートは対象で免疫応答を生起できることを、当業者は理解するであろう。シュードモナス属抗原と交差反応する抗血清を誘導する本明細書中に記載されるバイオコンジュゲートまたはその組成物の能力は、例えば、ELISAなどの免疫アッセイにより試験することができる。
対象で免疫応答を生起する本明細書中に記載されるバイオコンジュゲートの能力は、血清殺菌アッセイ(SBA)またはオプソニン食作用殺菌アッセイ(opsonophagocytotic killing assay;OPK)を用いて評価することができ、このアッセイは、糖コンジュゲートに基づくワクチンの承認を得るために用いられてきた確立され受け入れられた方法を代表する。そのようなアッセイは当技術分野で周知であり、簡潔には、抗体を生起させる化合物を対象(例えば、マウス)に投与することにより、対象となる標的(例えば、シュードモナス属の抗原)に対する抗体を生成および単離するステップを含む。続いて、抗体の殺菌能を、例えば、該抗体および補体ならびに(アッセイによっては)好中球の存在下で当該細菌を培養するステップおよび例えば、標準的な微生物学的アプローチを用いて、細菌を死滅および/または中和する抗体の能力をアッセイするステップにより評価することができる。
本実施例は、(i) オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸および(ii) rfbクラスターをコードする核酸の挿入により遺伝的に改変された細菌宿主株により、バイオコンジュゲートが成功裏に産生され得ることを実証する。
本実施例は、緑膿菌O6ホルミルトランスフェラーゼの特定を記載する。
本実施例は、緑膿菌O6 wzyポリメラーゼの特定を記載する。
実施例1は、(i) オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸および(ii) rfbクラスターをコードする核酸の挿入により遺伝的に改変された細菌宿主菌株により、バイオコンジュゲートを成功裏に生成させることができることを実証する。本実施例では、キャリアタンパク質としてシュードモナス属タンパク質PcrVを用いて、実施例1に記載されるものに類似した実験が行なわれた。
本実施例は、緑膿菌O6抗原を含むバイオコンジュゲートの産生を記載する。
本実施例は、緑膿菌O6-EPAバイオコンジュゲートが免疫原性であることを実証する。
1.以下の核酸:
(i) 宿主細胞のゲノムに安定的に挿入されている、シュードモナス属のrfbクラスター由来のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸;
(ii) オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸;および
(iii) N-グリコシル化コンセンサス配列を含むキャリアタンパク質をコードする核酸を含む、宿主細胞。
2.以下の核酸:
(i) 宿主細胞のゲノムに安定的に挿入されている、シュードモナス属のrfbクラスターをコードする核酸;
(ii) オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸;および
(iii) N-グリコシル化コンセンサス配列を含むキャリアタンパク質をコードする核酸を含む、宿主細胞。
3.シュードモナス属が緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)である、実施形態1または2に記載の宿主細胞。
4.前記緑膿菌が、血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、またはO20である、実施形態3に記載の宿主細胞。
5.前記緑膿菌が血清型O6である、実施形態4に記載の宿主細胞。
6.前記緑膿菌が血清型O11である、実施形態4に記載の宿主細胞。
7.前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする前記核酸が、宿主細胞のゲノムに安定的に挿入されている、実施形態1〜6のいずれかに記載の宿主細胞。
8.前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする前記核酸が、宿主細胞により発現されるプラスミド上に存在する、実施形態1〜6のいずれかに記載の宿主細胞。
9.前記キャリアタンパク質をコードする前記核酸が、宿主細胞により発現されるプラスミド上に存在する、実施形態1〜8のいずれかに記載の宿主細胞。
10.前記キャリアタンパク質をコードする前記核酸が、宿主細胞のゲノムに安定的に挿入されている、実施形態1〜8のいずれかに記載の宿主細胞。
11.前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、原核生物に由来する、実施形態1〜10のいずれかに記載の宿主細胞。
12.前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、カンピロバクター属に由来する、実施形態11に記載の宿主細胞。
13.前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)に由来する、実施形態12に記載の宿主細胞。
14.前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、C.ジェジュニのpglB遺伝子である、実施形態13に記載の宿主細胞。
15.前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、真核生物に由来する、実施形態1〜10のいずれかに記載の宿主細胞。
16.前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸配列のコピー数が、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である、実施形態1〜15のいずれかに記載の宿主細胞。
17.前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸配列のコピー数が、1または2である、実施形態16に記載の宿主細胞。
18.キャリアタンパク質が、緑膿菌(P. aeruginosa)の無毒化エキソトキシンA(EPA)、CRM197、マルトース結合性タンパク質(MBP)、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌(S.aureus)の無毒化溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化変異体、コレラトキシンBサブユニット(CTB)、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化変異体、大腸菌Satタンパク質、大腸菌Satタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumoniae)ニューモリシンおよびその無毒化変異体、C.ジェジュニ(C.jejuni)AcrA、C.ジェジュニ天然糖タンパク質、PcrV(LcrV、EspA、SseBとしても知られる)、PopB(YopB、YopD、FliC)、またはOprF、OprIである、実施形態1〜17のいずれかに記載の宿主細胞。
19.前記宿主細胞が大腸菌である、実施形態1〜18のいずれかに記載の宿主細胞。
20.タンパク質の産生に好適な条件下で実施形態1〜19のいずれかに記載の宿主細胞を培養するステップを含む、前記キャリアタンパク質に連結されたシュードモナス属抗原を含むバイオコンジュゲートの製造方法。
21.バイオコンジュゲートが前記キャリアタンパク質に連結されたシュードモナス属抗原を含む、実施形態20に記載の方法により製造されるバイオコンジュゲート。
22.前記シュードモナス属抗原が緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)抗原である、実施形態21に記載のバイオコンジュゲート。
23.前記緑膿菌抗原が、緑膿菌血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、またはO20由来のO抗原である、実施形態22に記載のバイオコンジュゲート。
24.前記緑膿菌抗原が、緑膿菌血清型O6由来のO抗原である、実施形態23に記載のバイオコンジュゲート。
25.前記緑膿菌抗原が、緑膿菌血清型O11由来のO抗原である、実施形態23に記載のバイオコンジュゲート。
26.実施形態21〜25のいずれかに記載のバイオコンジュゲートを含む組成物。
27.実施形態26に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象でのシュードモナス属感染を治療または予防する方法。
28.実施形態26に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象でのシュードモナス属に対する免疫応答を誘導する方法。
29.対象がヒトである、実施形態27または28に記載の方法。
30.宿主細胞の少なくとも1種の遺伝子が機能的に不活性化または欠失されている、実施形態1〜19のいずれかに記載の宿主細胞。
31.前記遺伝子がwaaLである、実施形態30に記載の宿主細胞。
32.前記宿主細胞が原核生物宿主細胞である、実施形態1〜19のいずれかに記載の宿主細胞。
33.キャリアタンパク質に共有結合した抗原を含むバイオコンジュゲートであって、キャリアタンパク質が、PcrV、EPA、PopB、OprF、およびOprIからなる群より選択されるシュードモナス属タンパク質である、上記バイオコンジュゲート。
34.抗原がシュードモナス属抗原である、実施形態33に記載のバイオコンジュゲート。35.抗原が緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)O抗原である、実施形態34に記載のバイオコンジュゲート。
36.抗原が、緑膿菌血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20由来のO抗原である、実施形態35に記載のバイオコンジュゲート。
37.抗原が、緑膿菌血清型O6またはO11由来のO抗原である、実施形態36に記載のバイオコンジュゲート。
38.抗原が、緑膿菌血清型O6由来のO抗原である、実施形態36に記載のバイオコンジュゲート。
39.キャリアタンパク質がシュードモナス属PcrVである、実施形態33〜38のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
40.PcrVキャリアタンパク質がD/E-X-N-X-S/T(Xがプロリン以外のいずれかのアミノ酸である)の少なくとも1つのグリコシル化コンセンサス配列を含む、実施形態39に記載のバイオコンジュゲート。
41.抗原が、D/E-X-N-X-S/Tコンセンサス配列のN残基を介してPcrVキャリアタンパク質に共有結合している、実施形態40に記載のバイオコンジュゲート。
42.PcrVタンパク質が、1個、2個、3個、4個または5個のグリコシル化コンセンサス配列を含む、実施形態40または41に記載のバイオコンジュゲート。
43.キャリアタンパク質が緑膿菌EPAである、実施形態33〜38のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
44.EPAキャリアタンパク質がD/E-X-N-X-S/T(Xがプロリン以外のいずれかのアミノ酸である)の少なくとも1つのグリコシル化コンセンサス配列を含む、実施形態43に記載のバイオコンジュゲート。
45.抗原が、D/E-X-N-X-S/Tコンセンサス配列のN残基を介してEPAキャリアタンパク質に共有結合している、実施形態44に記載のバイオコンジュゲート。
46.EPAキャリアタンパク質が、1個、2個、3個、4個または5個のグリコシル化コンセンサス配列を含む、実施形態44または45に記載のバイオコンジュゲート。
47.ホルミルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子および/またはwzyポリメラーゼをコードする遺伝子が宿主細胞のゲノムに安定的に挿入されている、実施形態5に記載の宿主細胞。
48.ホルミルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子および/またはwzyポリメラーゼをコードする遺伝子が宿主細胞により発現されるプラスミド上に存在する、実施形態5に記載の宿主細胞。
49.キャリアタンパク質が、緑膿菌(P. aeruginosa)の無毒化エキソトキシンA(EPA)、CRM197、マルトース結合性タンパク質(MBP)、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌(S.aureus)の無毒化溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化変異体、コレラトキシンBサブユニット(CTB)、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化変異体、大腸菌Satタンパク質、大腸菌Satタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumoniae)ニューモリシンおよびその無毒化変異体、C.ジェジュニ(C.jejuni)AcrA、C.ジェジュニ天然糖タンパク質、PcrV(LcrV、EspA、SseBとしても知られる)、PopB(YopB、YopD、FliC)、またはOprF、OprIである、実施形態47または48に記載の宿主細胞。
50.以下の核酸:
(i) シュードモナス属のrfbクラスター由来のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸;
(ii) ホルミルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸であって、配列番号2に対して約または少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性または相同性を有するタンパク質をコードするか、あるいは配列番号2をコードする、上記核酸;
(ii) オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸;および
(iii) N-グリコシル化コンセンサス配列D/E-X-N-X-S/T(Xはプロリン以外のいずれかのアミノ酸である)を含むキャリアタンパク質をコードする核酸
を含む宿主細胞。
51.以下の核酸:
(i) シュードモナス属のrfbクラスター由来のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸;
(ii) wzyポリメラーゼをコードする核酸であって、配列番号3に対して約または少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性または相同性を有するタンパク質をコードするか、あるいは配列番号3をコードする、上記核酸;
(iii) オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸;および
(iv) N-グリコシル化コンセンサス配列D/E-X-N-X-S/T(Xはプロリン以外のいずれかのアミノ酸である)を含むキャリアタンパク質をコードする核酸
を含む宿主細胞。
52.グリコトランスフェラーゼ(glycotransferase)が緑膿菌のrfbクラスターに由来する、実施形態50または51に記載の宿主細胞。
53.グリコトランスフェラーゼ(glycotransferase)が緑膿菌血清型6のrfbクラスターに由来する、実施形態50〜52のいずれかに記載の宿主細胞。
54.シュードモナス属のrfbクラスター由来の少なくとも2種類、3種類、4種類、5種類のグリコシルトランスフェラーゼを含む、実施形態50〜53のいずれかに記載の宿主細胞。55.(i)および(ii)の核酸が宿主細胞中に局在する、実施形態50〜54のいずれかに記載の宿主細胞。
56.(i)の核酸が宿主細胞のゲノムに安定的に挿入されている、実施形態50〜55のいずれかに記載の宿主細胞。
57.前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする前記核酸が、宿主細胞のゲノムに安定的に挿入されている、実施形態50〜56のいずれかに記載の宿主細胞。
58.前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする前記核酸が、宿主細胞により発現されるプラスミド上に存在する、実施形態50〜56のいずれかに記載の宿主細胞。
59.前記キャリアタンパク質をコードする前記核酸が、宿主細胞により発現されるプラスミド上に存在する、実施形態50〜58のいずれかに記載の宿主細胞。
60.前記キャリアタンパク質をコードする前記核酸が、宿主細胞のゲノムに安定的に挿入されている、実施形態50〜58のいずれかに記載の宿主細胞。
61.前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、原核生物に由来する、実施形態50〜60のいずれかに記載の宿主細胞。
62.前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、カンピロバクター属に由来する、実施形態61に記載の宿主細胞。
63.前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)に由来する、実施形態62に記載の宿主細胞。
64.前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、C.ジェジュニのpglb遺伝子である、実施形態63に記載の宿主細胞。
65.前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、真核生物に由来する、実施形態50〜60のいずれかに記載の宿主細胞。
66.前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸配列のコピー数が、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である、実施形態1〜65のいずれかに記載の宿主細胞。
67.前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸配列のコピー数が、1または2である、実施形態66に記載の宿主細胞。
68.キャリアタンパク質が、緑膿菌(P. aeruginosa)の無毒化エキソトキシンA(EPA)、CRM197、マルトース結合性タンパク質(MBP)、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌(S.aureus)の無毒化溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化変異体、コレラトキシンBサブユニット(CTB)、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化変異体、大腸菌Satタンパク質、大腸菌Satタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumoniae)ニューモリシンおよびその無毒化変異体、C.ジェジュニ(C.jejuni)AcrA、C.ジェジュニ天然糖タンパク質、PcrV(LcrV、EspA、SseBとしても知られる)、PopB(YopB、YopD、FliC)、またはOprF、OprIである、実施形態50〜67のいずれかに記載の宿主細胞。
69.前記宿主細胞が大腸菌である、実施形態50〜68のいずれかに記載の宿主細胞。
70.タンパク質の産生に好適な条件下で実施形態50〜69のいずれかに記載の宿主細胞を培養するステップを含む、キャリアタンパク質に連結されたシュードモナス属抗原を含むバイオコンジュゲートの製造方法。
71.バイオコンジュゲートがキャリアタンパク質に連結されたシュードモナス属抗原を含む、実施形態70に記載の方法により製造されるバイオコンジュゲート。
72.少なくとも1つのN-グリコシル化コンセンサス配列D/E-X-N-X-S/T(Xはプロリン以外のいずれかのアミノ酸である)のN残基を介してキャリアタンパク質にコンジュゲート化されている緑膿菌血清型O6抗原を含む、バイオコンジュゲート。
73.キャリアタンパク質が、緑膿菌(P. aeruginosa)の無毒化エキソトキシンA(EPA)、CRM197、マルトース結合性タンパク質(MBP)、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌(S.aureus)の無毒化溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化変異体、コレラトキシンBサブユニット(CTB)、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化変異体、大腸菌Satタンパク質、大腸菌Satタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumoniae)ニューモリシンおよびその無毒化変異体、C.ジェジュニ(C.jejuni)AcrA、C.ジェジュニ天然糖タンパク質、PcrV(LcrV、EspA、SseBとしても知られる)、PopB(YopB、YopD、FliC)、OprF、およびOprIからなる群より選択される、実施形態71または72に記載のバイオコンジュゲート。
74.キャリアタンパク質が1個、2個、3個、4個または5個のN-グリコシル化コンセンサス配列D/E-X-N-X-S/T(Xがプロリン以外のいずれかのアミノ酸である)を含む、実施形態70〜73のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
75.前記シュードモナス属抗原が緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)抗原である、実施形態71に記載のバイオコンジュゲート。
76.前記緑膿菌抗原が、緑膿菌血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、またはO20由来のO抗原である、実施形態75に記載のバイオコンジュゲート。
77.前記緑膿菌抗原が、緑膿菌血清型O6由来のO抗原である、実施形態76に記載のバイオコンジュゲート。
78.O抗原がホルミル化される、実施形態77に記載のバイオコンジュゲート。
79.O6抗原が、少なくとも1個のGalNFmA残基に結合したホルミル基を含む、実施形態77に記載のバイオコンジュゲート。
80.O抗原反復単位のうちの少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、95または100%がホルミル化される、実施形態78または79に記載のバイオコンジュゲート。
81.実施形態21〜25、33〜46または71〜80のいずれかに記載のバイオコンジュゲートおよび製薬上許容される賦形剤を含む組成物。
82.実施形態81に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象でのシュードモナス属感染を治療または予防する方法。
83.実施形態81に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象でのシュードモナス属に対する免疫応答を誘導する方法。
84.対象がヒトである、実施形態82または83に記載の方法。
85.ヒト対象でのシュードモナス属感染により引き起こされる疾患の治療または予防での使用のための、実施形態21〜25、33〜46もしくは71〜80のいずれかに記載のバイオコンジュゲートまたは実施形態83に記載の組成物。
86.ヒト対象でのシュードモナス属により引き起こされる疾患の治療または予防のための医薬の製造での、実施形態21〜25、33〜46もしくは71〜80のいずれかに記載のバイオコンジュゲートまたは実施形態81に記載の組成物の使用。
87.wzyポリメラーゼをコードする核酸をさらに含み、該核酸は配列番号3に対して約または少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性または相同性を有するタンパク質をコードする、実施形態50に記載の宿主細胞。
88.ホルミルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子を含む改変型緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)血清型O6 rfbクラスターをコードする、単離された核酸配列。
89.wzyポリメラーゼをコードする遺伝子を含む改変型緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)血清型O6 rfbクラスターをコードする、単離された核酸配列。
90.wzyポリメラーゼをコードする遺伝子をさらに含む、実施形態90に記載の核酸配列。
91.前記ホルミルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子および/または前記wzyポリメラーゼをコードする遺伝子が、緑膿菌血清型O6 rfbクラスターの遺伝子の下流に挿入される、実施形態88〜90のいずれかに記載の核酸配列。
92.前記ホルミルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子および/または前記wzyポリメラーゼをコードする遺伝子が、緑膿菌血清型O6 rfbクラスターのwbpM遺伝子の下流に挿入される、実施形態91に記載の核酸配列。
93.前記ホルミルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子および/または前記wzyポリメラーゼをコードする遺伝子が、緑膿菌血清型O6 rfbクラスターの遺伝子の上流に挿入される、実施形態88〜90のいずれかに記載の核酸配列。
94.前記ホルミルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子および/または前記wzyポリメラーゼをコードする遺伝子が、緑膿菌血清型O6 rfbクラスターのwzz遺伝子の上流に挿入される、実施形態93に記載の核酸配列。
95.ホルミルトランスフェラーゼをコードする核酸が、rfbクラスターの上流に挿入される、実施形態50または52〜69のいずれかに記載の宿主細胞。
96.ホルミルトランスフェラーゼをコードする核酸が、rfbクラスターの下流に挿入される、実施形態50または52〜69のいずれかに記載の宿主細胞。
97.ホルミルトランスフェラーゼをコードする核酸が、rfbクラスターに対して時計回りの方向に挿入される、実施形態50、52〜69、95、または96のいずれかに記載の宿主細胞。
98.ホルミルトランスフェラーゼをコードする核酸が、rfbクラスターに対して反時計回りの方向に挿入される、実施形態50、52〜69、95、または96のいずれかに記載の宿主細胞。
99.wzyポリメラーゼをコードする核酸が、rfbクラスターの上流に挿入される、実施形態51または52〜69のいずれかに記載の宿主細胞。
100.wzyポリメラーゼをコードする核酸が、rfbクラスターの下流に挿入される、実施形態51または52〜69のいずれかに記載の宿主細胞。
101.wzyポリメラーゼをコードする核酸が、rfbクラスターに対して時計回りの方向に挿入される、実施形態51、52〜69、99、または100のいずれかに記載の宿主細胞。
102.wzyポリメラーゼをコードする核酸が、rfbクラスターに対して反時計回りの方向に挿入される、実施形態51、52〜69、99、または100のいずれかに記載の宿主細胞。
本開示は、本明細書中に記載される具体的な実施形態による範囲に限定されるものではない。実際、本明細書中に提供される対象の様々な改変物が、記載されるものに加えて、上記の説明および添付の図面から当業者には明らかになるであろう。そのような改変物は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
Claims (102)
- 以下の核酸:
(i) 宿主細胞のゲノムに安定的に挿入されている、シュードモナス属のrfbクラスター由来のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸;
(ii) オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸;および
(iii) N-グリコシル化コンセンサス配列を含むキャリアタンパク質をコードする核酸を含む、宿主細胞。 - 以下の核酸:
(i) 宿主細胞のゲノムに安定的に挿入されている、シュードモナス属のrfbクラスターをコードする核酸;
(ii) オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸;および
(iii) N-グリコシル化コンセンサス配列を含むキャリアタンパク質をコードする核酸を含む、宿主細胞。 - シュードモナス属が緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)である、請求項1または2に記載の宿主細胞。
- 前記緑膿菌が、血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、またはO20である、請求項3に記載の宿主細胞。
- 前記緑膿菌が血清型O6である、請求項4に記載の宿主細胞。
- 前記緑膿菌が血清型O11である、請求項4に記載の宿主細胞。
- 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする前記核酸が、宿主細胞のゲノムに安定的に挿入されている、請求項1〜6のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする前記核酸が、宿主細胞により発現されるプラスミド上に存在する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記キャリアタンパク質をコードする前記核酸が、宿主細胞により発現されるプラスミド上に存在する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記キャリアタンパク質をコードする前記核酸が、宿主細胞のゲノムに安定的に挿入されている、請求項1〜8のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、原核生物に由来する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、カンピロバクター属に由来する、請求項11に記載の宿主細胞。
- 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)に由来する、請求項12に記載の宿主細胞。
- 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、C.ジェジュニのpglB遺伝子である、請求項13に記載の宿主細胞。
- 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、真核生物に由来する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸配列のコピー数が、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸配列のコピー数が、1または2である、請求項16に記載の宿主細胞。
- キャリアタンパク質が、緑膿菌(P. aeruginosa)の無毒化エキソトキシンA(EPA)、CRM197、マルトース結合性タンパク質(MBP)、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌(S.aureus)の無毒化溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化変異体、コレラトキシンBサブユニット(CTB)、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化変異体、大腸菌Satタンパク質、大腸菌Satタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumoniae)ニューモリシンおよびその無毒化変異体、C.ジェジュニ(C.jejuni)AcrA、C.ジェジュニ天然糖タンパク質、PcrV(LcrV、EspA、SseBとしても知られる)、PopB(YopB、YopD、FliC)、またはOprF、OprIである、請求項1〜17のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が大腸菌である、請求項1〜18のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- タンパク質の産生に好適な条件下で請求項1〜19のいずれか1項に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、前記キャリアタンパク質に連結されたシュードモナス属抗原を含むバイオコンジュゲートの製造方法。
- バイオコンジュゲートが前記キャリアタンパク質に連結されたシュードモナス属抗原を含む、請求項20に記載の方法により製造されるバイオコンジュゲート。
- 前記シュードモナス属抗原が緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)抗原である、請求項21に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記緑膿菌抗原が、緑膿菌血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、またはO20由来のO抗原である、請求項22に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記緑膿菌抗原が、緑膿菌血清型O6由来のO抗原である、請求項23に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記緑膿菌抗原が、緑膿菌血清型O11由来のO抗原である、請求項23に記載のバイオコンジュゲート。
- 請求項21〜25のいずれか1項に記載のバイオコンジュゲートを含む組成物。
- 請求項26に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象でのシュードモナス属感染を治療または予防する方法。
- 請求項26に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象でのシュードモナス属に対する免疫応答を誘導する方法。
- 対象がヒトである、請求項27または28に記載の方法。
- 宿主細胞の少なくとも1種の遺伝子が機能的に不活性化または欠失されている、請求項1〜19のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記遺伝子がwaaLである、請求項30に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が原核生物宿主細胞である、請求項1〜19のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- キャリアタンパク質に共有結合した抗原を含むバイオコンジュゲートであって、キャリアタンパク質が、PcrV、EPA、PopB、OprF、およびOprIからなる群より選択されるシュードモナス属タンパク質である、上記バイオコンジュゲート。
- 抗原がシュードモナス属抗原である、請求項33に記載のバイオコンジュゲート。
- 抗原が緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)O抗原である、請求項34に記載のバイオコンジュゲート。
- 抗原が、緑膿菌血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20由来のO抗原である、請求項35に記載のバイオコンジュゲート。
- 抗原が、緑膿菌血清型O6またはO11由来のO抗原である、請求項36に記載のバイオコンジュゲート。
- 抗原が、緑膿菌血清型O6由来のO抗原である、請求項36に記載のバイオコンジュゲート。
- キャリアタンパク質がシュードモナス属PcrVである、請求項33〜38のいずれか1項に記載のバイオコンジュゲート。
- PcrVキャリアタンパク質がD/E-X-N-X-S/T(Xがプロリン以外のいずれかのアミノ酸である)の少なくとも1つのグリコシル化コンセンサス配列を含む、請求項39に記載のバイオコンジュゲート。
- 抗原が、D/E-X-N-X-S/Tコンセンサス配列のN残基を介してPcrVキャリアタンパク質に共有結合している、請求項40に記載のバイオコンジュゲート。
- PcrVタンパク質が、1個、2個、3個、4個または5個のグリコシル化コンセンサス配列を含む、請求項40または41に記載のバイオコンジュゲート。
- キャリアタンパク質が緑膿菌EPAである、請求項33〜38のいずれか1項に記載のバイオコンジュゲート。
- EPAキャリアタンパク質がD/E-X-N-X-S/T(Xがプロリン以外のいずれかのアミノ酸である)の少なくとも1つのグリコシル化コンセンサス配列を含む、請求項43に記載のバイオコンジュゲート。
- 抗原が、D/E-X-N-X-S/Tコンセンサス配列のN残基を介してEPAキャリアタンパク質に共有結合している、請求項44に記載のバイオコンジュゲート。
- EPAキャリアタンパク質が、1個、2個、3個、4個または5個のグリコシル化コンセンサス配列を含む、請求項44または45に記載のバイオコンジュゲート。
- ホルミルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子および/またはwzyポリメラーゼをコードする遺伝子が宿主細胞のゲノムに安定的に挿入されている、請求項5に記載の宿主細胞。
- ホルミルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子および/またはwzyポリメラーゼをコードする遺伝子が宿主細胞により発現されるプラスミド上に存在する、請求項5に記載の宿主細胞。
- キャリアタンパク質が、緑膿菌(P. aeruginosa)の無毒化エキソトキシンA(EPA)、CRM197、マルトース結合性タンパク質(MBP)、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌(S.aureus)の無毒化溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化変異体、コレラトキシンBサブユニット(CTB)、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化変異体、大腸菌Satタンパク質、大腸菌Satタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumoniae)ニューモリシンおよびその無毒化変異体、C.ジェジュニ(C.jejuni)AcrA、C.ジェジュニ天然糖タンパク質、PcrV(LcrV、EspA、SseBとしても知られる)、PopB(YopB、YopD、FliC)、またはOprF、OprIである、請求項47または48に記載の宿主細胞。
- 以下の核酸:
(i) シュードモナス属のrfbクラスター由来のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸;
(ii) ホルミルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸であって、配列番号2に対して約または少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性または相同性を有するタンパク質をコードするか、あるいは配列番号2をコードする、上記核酸;
(ii) オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸;および
(iii) N-グリコシル化コンセンサス配列D/E-X-N-X-S/T(Xはプロリン以外のいずれかのアミノ酸である)を含むキャリアタンパク質をコードする核酸
を含む宿主細胞。 - 以下の核酸:
(i) シュードモナス属のrfbクラスター由来のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸;
(ii) wzyポリメラーゼをコードする核酸であって、配列番号3に対して約または少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性または相同性を有するタンパク質をコードするか、あるいは配列番号3をコードする、上記核酸;
(iii) オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸;および
(iv) N-グリコシル化コンセンサス配列D/E-X-N-X-S/T(Xはプロリン以外のいずれかのアミノ酸である)を含むキャリアタンパク質をコードする核酸
を含む宿主細胞。 - グリコトランスフェラーゼ(glycotransferase)が緑膿菌のrfbクラスターに由来する、請求項50または51に記載の宿主細胞。
- グリコトランスフェラーゼ(glycotransferase)が緑膿菌血清型6のrfbクラスターに由来する、請求項50〜52のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- シュードモナス属のrfbクラスター由来の少なくとも2種類、3種類、4種類、5種類のグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項50〜53のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- (i)および(ii)の核酸が宿主細胞中に局在する、請求項50〜54のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- (i)の核酸が宿主細胞のゲノムに安定的に挿入されている、請求項50〜55のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする前記核酸が、宿主細胞のゲノムに安定的に挿入されている、請求項50〜56のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする前記核酸が、宿主細胞により発現されるプラスミド上に存在する、請求項50〜56のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記キャリアタンパク質をコードする前記核酸が、宿主細胞により発現されるプラスミド上に存在する、請求項50〜58のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記キャリアタンパク質をコードする前記核酸が、宿主細胞のゲノムに安定的に挿入されている、請求項50〜58のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、原核生物に由来する、請求項50〜60のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、カンピロバクター属に由来する、請求項61に記載の宿主細胞。
- 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)に由来する、請求項62に記載の宿主細胞。
- 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、C.ジェジュニのpglb遺伝子である、請求項63に記載の宿主細胞。
- 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、真核生物に由来する、請求項50〜60のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸配列のコピー数が、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である、請求項1〜65のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸配列のコピー数が、1または2である、請求項66に記載の宿主細胞。
- キャリアタンパク質が、緑膿菌(P. aeruginosa)の無毒化エキソトキシンA(EPA)、CRM197、マルトース結合性タンパク質(MBP)、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌(S.aureus)の無毒化溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化変異体、コレラトキシンBサブユニット(CTB)、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化変異体、大腸菌Satタンパク質、大腸菌Satタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumoniae)ニューモリシンおよびその無毒化変異体、C.ジェジュニ(C.jejuni)AcrA、C.ジェジュニ天然糖タンパク質、PcrV(LcrV、EspA、SseBとしても知られる)、PopB(YopB、YopD、FliC)、またはOprF、OprIである、請求項50〜67のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が大腸菌である、請求項50〜68のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- タンパク質の産生に好適な条件下で請求項50〜69のいずれか1項に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、キャリアタンパク質に連結されたシュードモナス属抗原を含むバイオコンジュゲートの製造方法。
- バイオコンジュゲートがキャリアタンパク質に連結されたシュードモナス属抗原を含む、請求項70に記載の方法により製造されるバイオコンジュゲート。
- 少なくとも1つのN-グリコシル化コンセンサス配列D/E-X-N-X-S/T(Xはプロリン以外のいずれかのアミノ酸である)のN残基を介してキャリアタンパク質にコンジュゲート化されている緑膿菌血清型O6抗原を含む、バイオコンジュゲート。
- キャリアタンパク質が、緑膿菌(P. aeruginosa)の無毒化エキソトキシンA(EPA)、CRM197、マルトース結合性タンパク質(MBP)、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌(S.aureus)の無毒化溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化変異体、コレラトキシンBサブユニット(CTB)、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化変異体、大腸菌Satタンパク質、大腸菌Satタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumoniae)ニューモリシンおよびその無毒化変異体、C.ジェジュニ(C.jejuni)AcrA、C.ジェジュニ天然糖タンパク質、PcrV(LcrV、EspA、SseBとしても知られる)、PopB(YopB、YopD、FliC)、OprF、およびOprIからなる群より選択される、請求項71または72に記載のバイオコンジュゲート。
- キャリアタンパク質が1個、2個、3個、4個または5個のN-グリコシル化コンセンサス配列D/E-X-N-X-S/T(Xがプロリン以外のいずれかのアミノ酸である)を含む、請求項70〜73のいずれか1項に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記シュードモナス属抗原が緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)抗原である、請求項71に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記緑膿菌抗原が、緑膿菌血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、またはO20由来のO抗原である、請求項75に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記緑膿菌抗原が、緑膿菌血清型O6由来のO抗原である、請求項76に記載のバイオコンジュゲート。
- O抗原がホルミル化される、請求項77に記載のバイオコンジュゲート。
- O6抗原が、少なくとも1個のGalNFmA残基に結合したホルミル基を含む、請求項77に記載のバイオコンジュゲート。
- O抗原反復単位のうちの少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、95または100%がホルミル化される、請求項78または79に記載のバイオコンジュゲート。
- 請求項21〜25、33〜46または71〜80のいずれか1項に記載のバイオコンジュゲートおよび製薬上許容される賦形剤を含む組成物。
- 請求項81に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象でのシュードモナス属感染を治療または予防する方法。
- 請求項81に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象でのシュードモナス属に対する免疫応答を誘導する方法。
- 対象がヒトである、請求項82または83に記載の方法。
- ヒト対象でのシュードモナス属感染により引き起こされる疾患の治療または予防での使用のための、請求項21〜25、33〜46もしくは71〜80のいずれか1項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項83に記載の組成物。
- ヒト対象でのシュードモナス属により引き起こされる疾患の治療または予防のための医薬の製造での、請求項21〜25、33〜46もしくは71〜80のいずれか1項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項81に記載の組成物の使用。
- wzyポリメラーゼをコードする核酸をさらに含み、該核酸は配列番号3に対して約または少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性または相同性を有するタンパク質をコードする、請求項50に記載の宿主細胞。
- ホルミルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子を含む改変型緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)血清型O6 rfbクラスターをコードする、単離された核酸配列。
- wzyポリメラーゼをコードする遺伝子を含む改変型緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)血清型O6 rfbクラスターをコードする、単離された核酸配列。
- wzyポリメラーゼをコードする遺伝子をさらに含む、請求項90に記載の核酸配列。
- 前記ホルミルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子および/または前記wzyポリメラーゼをコードする遺伝子が、緑膿菌血清型O6 rfbクラスターの遺伝子の下流に挿入される、請求項88〜90のいずれか1項に記載の核酸配列。
- 前記ホルミルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子および/または前記wzyポリメラーゼをコードする遺伝子が、緑膿菌血清型O6 rfbクラスターのwbpM遺伝子の下流に挿入される、請求項91に記載の核酸配列。
- 前記ホルミルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子および/または前記wzyポリメラーゼをコードする遺伝子が、緑膿菌血清型O6 rfbクラスターの遺伝子の上流に挿入される、請求項88〜90のいずれか1項に記載の核酸配列。
- 前記ホルミルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子および/または前記wzyポリメラーゼをコードする遺伝子が、緑膿菌血清型O6 rfbクラスターのwzz遺伝子の上流に挿入される、請求項93に記載の核酸配列。
- ホルミルトランスフェラーゼをコードする核酸が、rfbクラスターの上流に挿入される、請求項50または52〜69のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- ホルミルトランスフェラーゼをコードする核酸が、rfbクラスターの下流に挿入される、請求項50または52〜69のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- ホルミルトランスフェラーゼをコードする核酸が、rfbクラスターに対して時計回りの方向に挿入される、請求項50、52〜69、95、または96のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- ホルミルトランスフェラーゼをコードする核酸が、rfbクラスターに対して反時計回りの方向に挿入される、請求項50、52〜69、95、または96のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- wzyポリメラーゼをコードする核酸が、rfbクラスターの上流に挿入される、請求項51または52〜69のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- wzyポリメラーゼをコードする核酸が、rfbクラスターの下流に挿入される、請求項51または52〜69のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- wzyポリメラーゼをコードする核酸が、rfbクラスターに対して時計回りの方向に挿入される、請求項51、52〜69、99、または100のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- wzyポリメラーゼをコードする核酸が、rfbクラスターに対して反時計回りの方向に挿入される、請求項51、52〜69、99、または100のいずれか1項に記載の宿主細胞。
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