JP6764872B2 - アシネトバクター(Acinetobacter)O−オリゴサッカリルトランスフェラーゼおよびその使用 - Google Patents
アシネトバクター(Acinetobacter)O−オリゴサッカリルトランスフェラーゼおよびその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6764872B2 JP6764872B2 JP2017545671A JP2017545671A JP6764872B2 JP 6764872 B2 JP6764872 B2 JP 6764872B2 JP 2017545671 A JP2017545671 A JP 2017545671A JP 2017545671 A JP2017545671 A JP 2017545671A JP 6764872 B2 JP6764872 B2 JP 6764872B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- comp
- otase
- glycosylation
- protein
- pgll
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 title claims description 52
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 title claims description 11
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 title claims description 8
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 title claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 145
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 95
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 83
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 74
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 57
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 44
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 claims description 28
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 28
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 28
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 claims description 28
- 241000588626 Acinetobacter baumannii Species 0.000 claims description 25
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 24
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims description 22
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 19
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 9
- 241001528221 Acinetobacter nosocomialis Species 0.000 claims description 7
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 5
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000588624 Acinetobacter calcoaceticus Species 0.000 claims description 3
- 229940124858 Streptococcus pneumoniae vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 101150065984 Comp gene Proteins 0.000 description 123
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 88
- 241001377010 Pila Species 0.000 description 81
- 101100388296 Arabidopsis thaliana DTX51 gene Proteins 0.000 description 80
- 101100215626 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ADP1 gene Proteins 0.000 description 80
- 108010089072 Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycotransferase Proteins 0.000 description 73
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 53
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 53
- 108010000916 Fimbriae Proteins Proteins 0.000 description 47
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 38
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 30
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 29
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 28
- 241001165345 Acinetobacter baylyi Species 0.000 description 27
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 241000463450 Acinetobacter nosocomialis M2 Species 0.000 description 23
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 23
- 101150014100 pilA gene Proteins 0.000 description 23
- 241000897241 Acinetobacter sp. ADP1 Species 0.000 description 20
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 20
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 20
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 20
- 101100334784 Escherichia coli (strain K12) fimA gene Proteins 0.000 description 19
- 101150049376 ftsY gene Proteins 0.000 description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 18
- 101100463772 Acinetobacter baylyi (strain ATCC 33305 / BD413 / ADP1) pglL2 gene Proteins 0.000 description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 17
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 17
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 14
- 101100463771 Acinetobacter baylyi (strain ATCC 33305 / BD413 / ADP1) pglL1 gene Proteins 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 13
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 13
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 13
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 13
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 description 13
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 12
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 12
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 12
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 12
- 230000004576 lipid-binding Effects 0.000 description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 12
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 11
- 238000007625 higher-energy collisional dissociation Methods 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 11
- 241000568569 Acinetobacter baumannii ATCC 17978 Species 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 101710204495 O-antigen ligase Proteins 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000002013 hydrophilic interaction chromatography Methods 0.000 description 10
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 10
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 10
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 10
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 10
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 9
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 241001232615 Acinetobacter baumannii ATCC 19606 = CIP 70.34 = JCM 6841 Species 0.000 description 8
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 8
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 241000347881 Kadua laxiflora Species 0.000 description 7
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 7
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 102400001014 Adrenomedullin-2 Human genes 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 6
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acetylhexosamine Chemical compound CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 5
- 101710082149 Major fimbrial subunit Proteins 0.000 description 5
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 5
- 241000589771 Ralstonia solanacearum Species 0.000 description 5
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 5
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 4
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 4
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 4
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 108010059278 Pyrin Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 230000032770 biofilm formation Effects 0.000 description 4
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 4
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 3
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091006054 His-tagged proteins Proteins 0.000 description 3
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 102000005583 Pyrin Human genes 0.000 description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- NLEBIOOXCVAHBD-QKMCSOCLSA-N dodecyl beta-D-maltoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NLEBIOOXCVAHBD-QKMCSOCLSA-N 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-O oxonium Chemical compound [OH3+] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- -1 undecaprenylpyrophosphate lipid Chemical class 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 241000589601 Francisella Species 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- XOCCAGJZGBCJME-VAYLDTTESA-N N-Acetyl-L-Fucosamine Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](O)[C@@H]1O XOCCAGJZGBCJME-VAYLDTTESA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 2
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 description 2
- 241000194021 Streptococcus suis Species 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000001977 collision-induced dissociation tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 101150027203 fkpA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000037362 glycan biosynthesis Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 101150118338 lldP gene Proteins 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000003950 pathogenic mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- ZIJCGKYVZPZELZ-SSZNUFPPSA-N pgya Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 ZIJCGKYVZPZELZ-SSZNUFPPSA-N 0.000 description 2
- 101150020596 pilT gene Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UUDAMDVQRQNNHZ-UHFFFAOYSA-N (S)-AMPA Chemical compound CC=1ONC(=O)C=1CC(N)C(O)=O UUDAMDVQRQNNHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNLXNOZHXNSSPN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO)C=C1 HNLXNOZHXNSSPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FMYBFLOWKQRBST-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(carboxymethyl)amino]acetic acid;nickel Chemical compound [Ni].OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O FMYBFLOWKQRBST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 2-aminopropane-1,3-dithiol Chemical group SCC(N)CS DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- PZUPAGRIHCRVKN-UHFFFAOYSA-N 5-[5-[3,4-dihydroxy-6-[(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxymethyl]-5-[3,4,5-trihydroxy-6-[(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxymethyl]oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-[(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxymethyl]oxan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4-triol Chemical compound OCC1OC(O)C(O)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(COC4C(C(O)C(O)CO4)O)O3)O)C(COC3C(C(O)C(O)CO3)O)O2)O)C(COC2C(C(O)C(O)CO2)O)O1 PZUPAGRIHCRVKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical group CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000776564 Acetobacter cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000229113 Acinetobacter pittii Species 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000606749 Aggregatibacter actinomycetemcomitans Species 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 101100126043 Bacillus subtilis (strain 168) guaB gene Proteins 0.000 description 1
- 101000971127 Bartonella henselae Autotransporter adhesin BadA Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000371430 Burkholderia cenocepacia Species 0.000 description 1
- 241001136175 Burkholderia pseudomallei Species 0.000 description 1
- 241000589877 Campylobacter coli Species 0.000 description 1
- 101100297352 Campylobacter jejuni subsp. jejuni serotype O:2 (strain ATCC 700819 / NCTC 11168) pglC gene Proteins 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102100032768 Complement receptor type 2 Human genes 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241001333951 Escherichia coli O157 Species 0.000 description 1
- 108010081280 Ethanolaminephosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920002444 Exopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 241001076388 Fimbria Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000589602 Francisella tularensis Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000948258 Gila Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000941929 Homo sapiens Complement receptor type 2 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101001018085 Lysobacter enzymogenes Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 206010027202 Meningitis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N O-phosphoethanolamine Chemical compound NCCOP(O)(O)=O SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 208000035109 Pneumococcal Infections Diseases 0.000 description 1
- 229940124950 Prevnar 13 Drugs 0.000 description 1
- 101710178856 Protein opa Proteins 0.000 description 1
- 101100464097 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) pilO gene Proteins 0.000 description 1
- 101800001295 Putative ATP-dependent helicase Proteins 0.000 description 1
- 101800001006 Putative helicase Proteins 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 241000232299 Ralstonia Species 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 244000157378 Rubus niveus Species 0.000 description 1
- 235000010787 Rubus niveus Nutrition 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 241001522306 Serinus serinus Species 0.000 description 1
- 235000002634 Solanum Nutrition 0.000 description 1
- 241000207763 Solanum Species 0.000 description 1
- 235000019892 Stellar Nutrition 0.000 description 1
- 241000194054 Streptococcus uberis Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 239000012163 TRI reagent Substances 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 108091005588 alkylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000010065 bacterial adhesion Effects 0.000 description 1
- 201000009904 bacterial meningitis Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000001425 electrospray ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001781 electrospray-ionisation quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000010201 enrichment analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 229940118764 francisella tularensis Drugs 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003331 infrared imaging Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O phosphocholine Chemical compound C[N+](C)(C)CCOP(O)(O)=O YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229940031999 pneumococcal conjugate vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940031937 polysaccharide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 150000003140 primary amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000005211 primary lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 108010051423 streptavidin-agarose Proteins 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium bromide Chemical compound [Br-].CC[N+](CC)(CC)CC HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000013715 transcription antitermination Effects 0.000 description 1
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1081—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はいずれも、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
材料および方法
菌株、プラスミドおよび増殖条件。
本明細書で使用した細菌株およびプラスミドを以下に挙げる。
NCBIのBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)を用いてアシネトバクター(Acinetobacter)特異的OTaseのタンパク質配列を解析し、タンパク質のアノテーションにConserved Domain Databaseを用いてタンパク質ドメインを同定した(Marchler−Bauerら,2004、Marchler−Bauerら,2009、Marchler−Bauerら,2011)。
既に記載されている方法論(Hardingら,2013)に従ってウエスタンブロット解析を実施した。使用した一次抗体は抗rsPilAM2またはペンタ−His抗体(Qiagen社)であった。使用した二次抗体はヤギ抗ウサギIgG(H+L)、アルカリホスファターゼ抗体(Molecular Probes社)およびヤギ抗マウスIgG(H+L)、アルカリホスファターゼ抗体(Molecular Probes社)であった。BCIP/NBT Liquid Substrate System(Sigma社)で膜を発色させた。
既に記載されているものに以下の修正を加えて線毛剪断調製物を調製した。簡潔に述べれば、寒天表面から菌叢を取り出し、1×プロテアーゼ阻害剤(Roche社)を添加した氷冷DPBS 5mLに再懸濁させた。細菌懸濁液をA600nmでの吸光度70に正規化した。表面に露出したタンパク質を剪断するため、細菌懸濁液を高速で1分間ボルテックス処理した。細菌を10,000×g、4℃で10分間ペレット化した。上清を収集し、再び10,000×g、4℃で10分間遠心分離した。上清を収集し、20,000×g、4℃で5分間遠心分離することによりさらに清澄化した。剪断された表面タンパク質を最終濃度30%の硫酸アンモニウムで沈殿させた。沈殿したタンパク質を20,000×g、4℃で10分間遠心分離することによりペレット化した。上清を捨て、ペレットを1×Laemmli緩衝液100μLに再懸濁させた。調製物を10分間煮沸し、SDS−PAGEで泳動し、クーマシー染色を実施し、バンドを切り出し、Shevchenkoら(2006)に従って質量分析用に調製した。簡潔に述べれば、バンドを水で洗浄し、アセトニトリル(ACN)で繰り返し脱水した。ジスルフィド結合を37℃で60分間、50mM NH4HCO3に溶かした10mM DTTで還元した後、室温の暗所で60分間、50mM NH4HCO3に溶かした50mMヨードアセトアミドでシステインチオール基をアルキル化した。次いで、ゲル片を50mM NH4HCO3で洗浄し、100%ACNで脱水し、乾燥させた。ピリンを37℃で16時間、50mM NH4HCO3に溶かした0.02mg/mLトリプシン(Promega社)で消化した。100%ACNおよび水でペプチドを溶離し、凍結乾燥させた。トリプシンペプチドを0.1%トリフルオロ酢酸に再懸濁させ、C18 ZipTip(Millipore社、米国)で脱塩した。60%ACNを用いてペプチドを溶離し、これをspeedvacで乾燥させ、0.1%ギ酸に再懸濁させた。既に記載されている通りに(Wangら,2007)、nanoACQUITY(Waters社)超高速液体クロマトグラフィーシステムと接続したQ−TOF Premier(Waters社、マンチェスター、イギリス)を用いて解析を実施した。MassLynx、v.4.1(Waters社)を用いてデータを解析した。M2菌株からOmpA−Hisを精製し、上記のようにESI−QTOF MS/MS解析用に調製した。
既に記載されているTRI試薬法(YiおよびHackett,2000)により、A.バイリイ(A.baylyi)および青枯病菌(R.solanacearum)のLPSを一晩培養物から抽出した。既に記載されている通りに(TsaiおよびFrasch,1982)、等量のLPSを12.5%SDS−PAGEゲルに負荷してLPSを分離した後、銀染色を実施した。
大腸菌(E.coli)CLM24細胞を3種類のプラスミド、すなわち、C.ジェジュニ(C.jejuni)のグリコシル化遺伝子座をコードするプラスミド、単一のO−OTase遺伝子をコードするプラスミドおよびdsbA1−HisをコードするプラスミドpAMF22で形質転換した。プラスミドを選択するため、必要に応じてアンピシリン(100μg/ml)、トリメトプリム(50μg/ml)およびクロラムフェニコール(10μg/ml)を添加した。細胞を37℃でOD600が0.4〜0.6になるまで増殖させ、次いで0.1mM IPTGおよび/または0.2%アラビノースで誘導した。アラビノース誘導を必要とする培養物には、4時間後に2回目の誘導を実施した。定常期に全細胞溶解物を入手し、ウエスタンブロット解析を用いてDsbA1の修飾を判定した。
若干修正を加えたLithgowら(2014)に従って、糖ペプチド濃縮および定量解析に供するペプチドライセートを調製した。簡潔に述べれば、乾燥させた膜濃縮タンパク質試料2mgを6M尿素、2Mチオウレア、40mM NH4HCO3で可溶化し、10mMジチオスレイトール(DTT)で還元した。還元し可溶化したペプチドを光の不在下、25mMヨードアセトアミド(IAA)で1時間アルキル化した。得られたアルキル化タンパク質混合物を25℃で4時間、Lys−C(1/100 w/w)で消化し、40mM NH4HCO3で1:5に希釈した後、25℃で一晩、トリプシン(1/50 w/w)で消化した。1%トリフルオロ酢酸(TFA)を加えて消化を停止させた。C18 empore(Sigma−Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州)STop And Go Extraction(STAGE)チップ(Rappsilberら,2007)を用いて一級アミドおよび塩を除去し、ペプチド消化物を精製した。
若干修正を加えた(Scottら,2011)に従ってZIC−HILIC濃縮を実施した。1mm2に切り取ったC8 Empore(商標)ディスク(Sigma社)を含むp10チップに充填した10μm ZIC−HILICレジン(Sequant社、ウメオ、スウェーデン)からなるマイクロカラムをベッド長が0.5cmになるまで充填した。使用前、カラムを超純水、次いで95%アセトニトリル(ACN)で洗浄し、次いで80%ACNおよび5%ギ酸(FA)で平衡化した。試料を80%ACN/5%FAに再懸濁させ、16,100×g、4℃で5分間遠心分離することにより不溶性物質を除去した。試料の濃度を3μg/μLに調整し、ペプチド物質150μgをカラムに負荷し、10負荷体積の80%ACN、5%FAで洗浄した。未結合画分を収集してプールし、真空遠心分離により乾燥させた。ZIC−HILIC結合ペプチドを3負荷体積の超純水で溶離させ、真空遠心分離を用いて濃縮した。新たに調製した試薬を用いて、別個にバイオロジカルレプリケートをZIC−HILIC濃縮に供した。
精製した糖ペプチド/ペプチドを緩衝液A(0.5%酢酸)に再懸濁させ、糖ペプチドの定性分析にはLTQ−Orbitrap Velos(Thermo Scientific社、サンノゼ、カリフォルニア州)と接続したAgilent 1290 Series HPLC(Agilent Technologies社、ミシサガ、オンタリオ州)、定量試験にはQ−exactiveと接続したEASY−nLC1000システムで逆相クロマトグラフィーを用いて分離した。A.バイリイ(A.baylyi)ADP1糖ペプチドの定性分析には、社内で充填した20cm、内径75μm、外径360μmのReproSil−Pur C18 AQ1.9μm(Dr.Maisch社、アンマーブーフ−エントリンゲン、ドイツ)カラムを用いた。定量試験には、社内で充填した45cm、内径50μm、外径360μmのReproSil−Pur C18 AQ1.9μmカラムを用いた。両システムとも、試料をトラップカラム、すなわち、社内で充填した2cm、内径100μm、外径360μmでAqua 5μm C18を含むカラム(Phenomenex社、トーランス、カリフォルニア州)に5μL/分で負荷した後、グラジエント分離を実施し、質量分析用に注入した。0%の緩衝液B(80%ACN、0.5%酢酸)から32%のBまで140分、次いで32%のBから40%のBまで5分、次いで100%のBまで2.5分かけて上昇させ、100%のBで2.5分間保持し、次いで、さらに20分かけて0%のBまで低下させる180分間のグラジエントをかけた。ZIC−HILIC糖ペプチド濃縮で得た未結合画分を糖ペプチドの定性分析と同じ機器設定を用いた分析に供した。両機器とも、定性分析には、既に記載されている通りに(Scottら,2011)、Xcalibur v2.2(Thermo Scientific社)を用いて、MS、CID MS−MSおよびHCD MS−MSの間で自動的に切り替わるデータ依存モードでキャピラリー温度275℃にて稼働させ、定量試験には、MS(分解能70k、AGC標的1×106)とHCD MS−MSイベント(分解能17.5k、AGC標的1×106、最大注入時間60ミリ秒、20%ステップのNCE28)との間で切り替わる上位10のデータに依存する方法を用いて稼働させた。
定性的グリコシル化分析の未処理ファイルを既に記載されている通りに(Scottら,2011,2012)処理した。簡潔に述べれば、Proteome Discoverer v.1.2(Thermo Scientific社)を用い、得られた糖ペプチドに関するデータをA.バイリイ(A.baylyi)ADP1のデータベース(UNIPROT、http://www.uniprot.org/、681 2014−06−10から入手、Taxon識別番号:3263個のタンパク質配列を含む62977)にMASCOT v2.4を用いて検索した。以下のパラメータ:ペプチド質量精度20ppm;フラグメント質量精度0.02Da;酵素特異性無し、固定修飾(カルバミドメチル)、可変修飾(メチオニン酸化および脱アミドN、Q)を用いてMascot検索を実施した。以前の研究でHCDスペクトル内に四極子様断片化が示されていることから(Olsenら,2007)、MALDI−QUAD−TOFの機器設定を選択した。MASCOT検索からペプチドが同定されなかったスキャンイベントをMicrosoft Excel(Microsoft社、レイモンド、ワシントン州)にエクスポートした。エクスポートしたマッチしないスキャンの中に糖ペプチドの可能性のある物質を同定するため、「mgfグラフ」と称するGPMAW8.2のMS−MSモジュールを用いて、204.08m/zのHexNAcのオキソニウムが含まれるHCDスキャンイベントを洗い出した。オキソニウム204.08m/zイオンが含まれる全スキャンイベントを手動で調べ、糖ペプチドの可能性のある物質を同定した。糖ペプチドの帰属を容易にするため、204.08オキソニウムが含まれるHCDスキャンイベントを手動で調べ、脱グリコシル化ペプチドイオンの可能性のある物質を同定した。Xcalibur v2.2のスペクトルリスト機能を用いて、これらのHCDスキャンのうち、脱グリコシル化ペプチドの質量を下回る質量に対応するMS特性(m/z、電荷および強度)を抽出した。検出されたMS特性に関して得られた数値をmgfファイルに書き込み、ペプチドの質量を脱グリコシル化ペプチドの質量に設定した。次いで、上記のMASCOT設定を用いて、得られたmgfファイルを検索した。デコイオプションを起動して全スペクトルを検索したところ、このデータベースにマッチするものは検出されず、偽発見率(FDR)は0%であった。
アシネトバクター(Acinetobacter)がコードする2種類のOTaseホモログは異なるpfamドメインを含む
これまでに、A.バイリイ(A.baylyi)ADP1がWzy_Cスーパーファミリーのドメインを含むタンパク質を2種類コードすることが報告されている(Schulzら,2013)。本発明者らはバイオインフォマティクス解析により、主要IVa型ピリンサブユニットpilAのすぐ下流に進化的に関係のあるWzy_Cスーパーファミリーのドメインを含むタンパク質をコードすると予想される2つのオープンリーディングフレーム(ORF)を有するアシネトバクター(Acinetobacter)菌種を数種類同定した(図1、パネルA)。
図2Aは、同系のpilA変異株であるM2菌株の全細胞溶解物のウエスタンブロット解析を示しており、その補完されたpilA変異菌株から、PilAが見かけの分子量の異なる2つの分子形態で存在するという本発明者らのそれまでの知見が裏付けられた。存在量が多く分子量が大きい方の形態のPilAは翻訳後修飾されたPilA種であると考えられ、分子量が小さい方の形態のPilAは未修飾種であった。TfpOがPilAの翻訳後修飾に及ぼす影響を明らかにするため、同系のtfpO変異株を構築し、PilAの発現を調べた。tfpOを欠く菌株のPilAは分子量が小さい方の形態でのみ存在していた(図2A)。PilAの電気泳動移動度の増大と翻訳後修飾の喪失とで一致がみられる。さらに、補完されたtfpO変異菌株のPilAは主として分子量の大きい方の形態で存在し、PilAの翻訳後修飾にはTfpOが必要であることが裏付けられた。
PilAがTfpOによってグリコシル化されることを裏付けるため、M2菌株、超線毛型M2ΔpilT変異株および超線毛型M2ΔtfpO::kanΔpilT::strep変異株の表面剪断調製物からPilAを精製した。pilT遺伝子は予測収縮ATPアーゼをコードし、したがって、pilTを欠く変異株は超線毛型の表現型を呈し、表面に露出したPilAの量が多くなる。剪断調製物中のタンパク質をSDS−PAGEによって分離し、クーマシー染色を実施し、切出し、質量分析に供した。図2Bは、M2およびM2ΔpilTの両菌株のPilAのMS/MS解析により、PilAにHexNAc残基2つ、ヘキソースおよびN−アセチルデオキシヘキソースからなる四糖が存在することが確認されたことを示している。MS/MS解析から、この四糖がカルボキシ末端のトリプシン119NSGTDTPVELLPQSFVAS136ペプチド上に存在することがわかった。M2ΔtfpO::kanΔpilT::strep変異株のPilAには修飾がみられず、PilAグリコシル化にはTfpOが必要であることが裏付けられた(データ不掲載)。
緑膿菌(P.aeruginosa)1244では、ピリンタンパク質PilAがTfpO依存性にグリコシル化される(Castric,1995)。のちにグリコシル化部位がカルボキシ末端セリン148の位置にあることが明らかにされた(Comerら,2002)。A.ノソコミアリス(A.nosocomialis)M2を含めたアシネトバクター(Acinetobacter)菌種のPilAタンパク質のアミノ酸配列を緑膿菌(P.aeruginosa)1244 PilAと比較した。配列の相同性は低いが、M2菌株のPilA配列にもC末端セリンが含まれており、これはMSによって同定された糖ペプチドに含まれていたものである(図2B)。
Huらは最近、主要多糖抗原(MPA)遺伝子座を含むアシネトバクター(Acinetobacter)菌種の血清型を分子レベルで判定するスキームを開発した。保存されたfkpA遺伝子とlldP遺伝子の間に存在するMPA遺伝子座は、研究対象に含めシーケンシングを実施した全アシネトバクター(Acinetobacter)菌株に確認されたほか、A.ノソコミアリス(A.nosocomialis)M2菌株にもみられた(Huら,2013,Carruthersら,2013)。A.ノソコミアリス(A.nosocomialis)M2菌株のMPA遺伝子座には、予測グリコシルトランスフェラーゼ3種類(wafY、wafZおよびwagBと呼ばれる)および予測開始グリコシルトランスフェラーゼ1種類(weeHまたはpglCと呼ばれる)が含まれている(図4A)。MPA遺伝子座がPilAM2の翻訳後修飾に必要であるかどうかを明らかにするため、予測グリコシルトランスフェラーゼをそれぞれ欠く同系変異株を個別に構築した。図4BはweeHを欠く菌株の全細胞溶解物のウエスタンブロット解析を示しており、この解析から、PilAが分子量の小さい方の形態で存在することが明らかになり、PilAのグリコシル化にはWeeHが必要であることがわかった。ほかの3種類のグリコシルトランスフェラーゼの欠失では、中間の電気泳動移動度を示すPilAタンパク質が得られた。wafY::kan変異株のPilAはWT PilAの移動度に最も近い位置に移動し、これにwafZ::kan変異株のPilA、wagB::kan変異株のPilAがこの順に次いだ(図4B)。wafZ::kan変異株およびwagB::kan変異株のバックグラウンドから部分的に修飾された形態および未修飾の形態のPilAがともに同定されたのは興味深い。いずれの変異菌株も補完に成功し、完全に修飾されたPilAの産生にはwafY遺伝子、wafZ遺伝子、wagB遺伝子およびweeH遺伝子の産物がいずれも必要であることがわかった。
図2Aでは、Wzy_Cドメインを含む第二のORFであるpglLM2はピリングリコシル化に必要ではないことが示された。pglLM2は、A.バウマンニ(A.baumannii)ATCC17978で既に特徴が明らかにされているPglLと同じように汎用O−OTaseであり、ピリン以外の標的タンパク質をグリコシル化するのではないかと考えられる。本発明者らは最近、タンパク質OmpAをコードするA1S_1193−Hisが様々な菌株PglLによって認識されることから、アシネトバクター(Acinetobacter)菌株特異的グリカンを単離および同定するベイトアクセプタータンパク質としての役割を果たす可能性があることを明らかにした(Scottら,2014)。本発明者らは、菌株M2、M2ΔtfpO::kan、M2ΔpglL::kanおよびM2ΔweeH::kanの各菌株でカルボキシ末端Hisタグを含むOmpA−Hisを発現させた。
上記の通り、A.バイリイ(A.baylyi)ADP1のゲノムでは、Wzy_Cスーパーファミリーのドメインを含むOTase様タンパク質が2種類コードされている。そのうちの1つであるpglLComP(ACIAD3337)はcomPに隣接している。Schulzら(2013)は、ComPの修飾にpglLComP(ACIAD3337)が必要であることを明らかにしており、これとは別に本発明者らもこれを確認している(図6A)。さらに、同系のpglLADP1(ACIAD0103)変異菌株のComP−His発現を調べたウエスタンブロット解析では、ComPの翻訳後修飾にPglLADP1は必要ではないことが明らかになった(図6A)。
髄膜炎菌(N.meningitidis)のDsbA1およびA.バウマンニ(A.baumannii)ATCC17978のOmpAは、それぞれの菌株で汎用O−OTaseによっても修飾され、以前はグリコシル化を研究するためのモデルとして用いられた(Vikら,2009;Iwashkiwら,2012;Gebhartら,2012;Lithgowら,2014)ものであり、PglLADP1がこれをグリコシル化することができるかどうかを検討した。この2種類のタンパク質を野生型、ΔpglLComPおよびΔpglLADP1のA.バイリイ(A.baylyi)菌株で別個に発現させた。DsbA1−His(図6C)およびOmpA−His(図6D)は、野生型およびΔpglLComPバックグラウンドよりもΔpglLADP1バックグラウンドの方が電気泳動移動度が大きかった。以上の実験は、PglLADP1が汎用O−OTaseとしての役割を果たすことを裏付けるものである。
A.バイリイ(A.baylyi)のADP1グリコシル化での両推定O−OTaseの役割を明らかにするため、A.バイリイ(A.baylyi)ADP1のグリコプロテオームをADP1ΔpglLComP変異株またはAPD1ΔpglLADP1変異株のいずれかと比較した。糖ペプチド濃縮のためのZIC−HILIC(Iwashkiwら,2012;Nothaftら,2012;Scottら,2014;Lithgowら,2014)および複数のMS/MS断片化法(Scottら,2011)を用いて、A.バイリイ(A.baylyi)ADP1に8種類のタンパク質基質に由来する21種類の固有の糖ペプチドが360個同定された。ほかのアシネトバクター(Acinetobacter)菌種に観察されている多様性(Scottら,2014)と同じく、286−217−HexNAc3(1112.41Da、図8Aおよび8D)、286−217−245−HexNAc2(1154.41Da、図8Bおよび8F)、286−217−HexNAc−245−HexNAc(1154.41Da、図8Bおよび8G)および286−217−2452−HexNAc(1196.41Da、図8Cおよび8E)からなる4種類の五糖グリコフォームのうちの1種類で修飾された糖ペプチドを有する固有のグリカンがA.バイリイ(A.baylyi)ADP1で得られた。A.バイリイ(A.baylyi)ADP1ΔpglLComPの膜タンパク質の糖ペプチド解析によって同じ糖ペプチドが同定され、グリコプロテオームはこの遺伝子の欠失による影響を受けないことが示唆された。これに対し、野生型A.バイリイ(A.baylyi)ADP1に観察された21種類の糖ペプチドのうちA.バイリイ(A.baylyi)ADP1ΔpglLADP1の抽出物中に検出されたものはなく、A.バイリイ(A.baylyi)ADP1ではpglLADP1が一般的なタンパク質グリコシル化を担っていることが示唆された。
図19は、ジメチル標識を用いたA.バイリイ(A.baylyi)ADP1 WT、A.バイリイ(A.baylyi)ADP1ΔpglLADP1およびA.バイリイ(A.baylyi)ADP1ΔpglLComPのグリコシル化の定量解析を示している。
アシネトバクター(Acinetobacter)染色体上の主要IVa型ピリン遺伝子と下流のO−OTase遺伝子との間に強い遺伝的連鎖があることから、これらのO−OTaseがそのコグネイトピリンタンパク質に対して特異的でるかどうかを明らかにしようとした。A.ノソコミアリス(A.nosocomialis)M2菌株のPilAM2を発現するプラスミドを異なるアシネトバクター(Acinetobacter)種で発現させた後、ウエスタンブロット解析を実施し、ピリンタンパク質の発現および電気泳動移動度を調べた。分子量が大きい方の形態のPilAM2および分子量が小さい方の形態のPilAM2の両方が存在することからわかるように、PilAM2は、ともにtfpOホモログおよび末端セリン残基を含むピリンをコードするA.バウマンニ(A.baumannii)ATCC19606および臨床分離株のA.バウマンニ(A.baumannii)27413によって修飾された(図9A)。A.バウマンニ(A.baumannii)ATCC19606のグリカンは、A.バウマンニ(A.baumannii)ATCC17978で同定された五糖と同じものであることがわかった。A.バウマンニ(A.baumannii)ATCC19606で発現したPilAM2は電気泳動の移動速度が最も遅く、大きいグリカンがPilAM2と結合していることが示された(Scottら,2014)。tfpOホモログを欠くA.バウマンニ(A.baumannii)ATCC17978およびA.バイリイ(A.baylyi)ADP1はともに、PilAM2をグリコシル化することができなかった。
材料および方法:
菌株およびプラスミド
本研究に使用した細菌株およびプラスミドを表4に記載する。DNeasy blood and tissue kit(Qiagen社)を用いてA.バイリイ(A.baylyi)のゲノムDNAを単離した。遺伝子aciad3337(pglLComP)およびその上流の非コード領域の増幅には、プライマーigrF(ACTGGTCGACTAGTAGTACTATATGGCTTTAAA;配列番号89)およびigrR(ACTGCTGCAGTTAATATTCTATTGAACAAAATTTTAAC;配列番号90)を用いた。得られたPCR産物をSalIおよびPstIで消化しpEXT20の同じ部位に挿入してpMN8を作製した。ComPをpBAV−ComP−hisからpEXT20のBamHIおよびSalI部位にサブクローン化することによってプラスミドpMN1を構築した。pglLComPおよびその上流領域をpMN8のSalIおよびPstI部位からpMN1にサブクローン化することによってプラスミドpMN2を構築した。
Dowerらによって記載されているプロトコル(Dowerら,1988)に従って、エレクトロコンピテントな大腸菌(E.coli)CLM24、CLM37またはSDB1を調製した。グリカン合成遺伝子座、アクセプタータンパク質およびOTaseをコードするプラスミドで細胞を形質転換させた。プラスミドの選択には、アンピシリン(100μg/ml)、テトラサイクリン(20μg/ml)、トリメトプリム(50μg/ml)、クロラムフェニコール(12.5μg/ml)、カナマイシン(20μg/ml)およびスペクチノマイシン(80μg/ml)を必要に応じて添加した。細胞をLBブロス中、37℃でOD6000.4〜0.6まで増殖させ、必要に応じて0.05mMもしくは0.1mM IPTGまたは0.2%アラビノースで誘導し、37℃で一晩放置した。アラビノース誘導が必要な培養物には4時間後に2回目のアラビノース投与を実施した。定常期に全細胞溶解物を入手し、そのうち0.1ODを12.5%SDS−PAGEゲルに負荷し、次いでニトロセルロース膜に転写した。ウエスタンブロット解析を用いてタンパク質修飾を判定した。使用した抗体を表5にまとめる。Odyssey Infrared Imaging System(LiCor Biosciences社、米国)を用いてニトロセルロース膜を可視化した。
テリフィックブロス中37℃で一晩増殖させた細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液で洗浄し、同緩衝液に再懸濁させた。フレンチプレスを20kpsi(1.4×105kPa)で用いて細胞の破壊を2回実施した後、プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche社)を加えることにより細胞を溶解させた。ライセートを10000×gで30分間遠心分離して細胞残屑を除去し、次いで上清を100000×gで60分間超遠心分離して全膜をペレット化した。PBS 10mlに0.1%Triton×100または1%n−ドデシル−β−D−マルトシド(DDM)を含有する緩衝液にペレットを再懸濁させ、一晩回転させることにより膜タンパク質を可溶化した。この懸濁液に等体積のPBSを加えて界面活性剤の濃度を低下させ、100000Gで60分間超遠心分離した。可溶化膜タンパク質に対応する上清をニッケルアフィニティータンパク質精製用のカラムに負荷した。
ニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより可溶化全膜からヘキサ−ヒスチジンタグ化タンパク質を精製した。簡潔に述べれば、20mMイミダゾールを含有する緩衝液で予め平衡化させたニッケル−ニトリロ三酢酸(Ni−NTA)アガロースカラム(Qiagen社)に全膜を負荷した。未結合タンパク質を除去するため、カラムを4回、それぞれ20mMイミダゾールを含有する緩衝液および30mMイミダゾールを含有する緩衝液で洗浄した。250mMイミダゾールを含有する溶離緩衝液でカラムに結合したHisタグ化タンパク質を6つの画分に溶離させた。
透析を一晩実施した後、0.25%DDMを含有するPBS 250mlからなる透析緩衝液で2時間の透析を2回実施することによりイミダゾールを除去した。DCキット(biorad社)を用いてタンパク質を定量化した後、試料を約6μg/mlに希釈し、マウス1匹当たり0.6μg注射した。マウス10匹からなる2つのグループに非グリコシル化ComPまたはCPSコンジュゲートComPのいずれかを注射した。免疫感作前および免疫感作から7日後と21日後にマウスから血清を採取した。第14日に追加免疫を実施した。
肺炎球菌(S.pneumoniae)血清型14(Statens Serum Institut社、デンマーク)をBHIブロス中、37℃、5%CO2好気条件下で一晩増殖させた。細胞を1×PBSで洗浄し、ODを0.6に調節した。次いで、細胞を60℃で2時間インキュベートすることによって熱不活化した後、Corning高結合96ウェルプレートに固定化した(50μL/ウェル)。プレートを4℃で一晩インキュベートした。翌日、ウェルを1×PBS(100μL/ウェル)で3回洗浄した後、5%脱脂乳で2時間ブロックした。ウェルをPBSで3回洗浄した。次いで、PBSTに溶かした2.5%脱脂乳で1:500に希釈したマウス血清(100μL/ウェル)をプレートに加え、室温で1時間インキュベートした。陽性対照には、血清型14のCPSに対する市販のウサギポリクローナル抗体を用いた(Statens Serum institute社)。陰性対照ウェルは一次抗体の代わりに脱脂乳で処理した。一次抗体とインキュベートした後、ウェルをPBSで3回洗浄した。次いで、二次HRPコンジュゲート抗体(100μL/ウェル)と1時間インキュベートした。使用した抗体は、PBSTに溶かした2.5%脱脂乳で希釈した抗マウスIgM(1:10000)、抗マウスIgG(1:10000)および抗ウサギ(1:5000)HRPコンジュゲート抗体であった。インキュベーション後、ウェルをPBSで3回洗浄し、各ウェルに発色基質TMB(Cell Signaling Technology社)100μLを加え、プレートを室温で5分間インキュベートした後、BioTek(商標)プレートリーダーを用いて650nmでの吸光度を測定した。
本実施例では、大腸菌(E.coli)を用いPglLComPを介してComPとコンジュゲートさせたCPS14を注射することにより、肺炎球菌(S.pneumoniae)血清型14の莢膜に対するIgG免疫応答が生じることを示す証拠が提供される。
Abd−El−Haleem,D., Moawad,H., Zaki,E.A., & Zaki,S.(2002).Molecular characterization of phenol−degrading bacteria isolated from different Egyptian ecosystems.Microbial Ecology 43(2):217−24.
Arroyo,L.A., Mateos,I., Gonzalez,V., & Aznar,J.(2009).In vitro activities of tigecycline,minocycline,and colistin−tigecycline combination against multi−and pandrug−resistant clinical isolates of Acinetobacter baumannii group.Antimicrobial Agents and Chemotherapy 53(3):1295−6.
Bentley,S.D., Aanensen,D.M., Mavroidi,A., Saunders,D., Rabbinowitsch,E., Collins,M., et al.(2006)Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes.PLoS Genet 2:e31.
Borud,B., Viburiene,R., Hartley,M.D., Paulsen,B.S., Egge−Jacobsen,W., Imperiali,B., & Koomey,M.(2011).Genetic and molecular analyses reveal an evolutionary trajectory for glycan synthesis in a bacterial protein glycosylation system.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108(23):9643−8.
Boucher,C.A., Barberis,P.A., & Demery,D.A.(1985).Transposon Mutagenesis of Pseudomonas solanacearum:Isolation of Tn5−Induced Avirulent Mutants.Microbiology 131(9):2449−2457.
Brzoska,A.J., Hassan,K.A., de Leon,E.J., Paulsen,I.T., & Lewis,P.J.(2013).Single step selection of drug resistant Acinetobacter baylyi ADP1 mutants reveals a functional redundancy in the recruitment of multidrug efflux systems.PloS One 8(2):e56090.
Castric,P.(1995).pilO,a gene required for glycosylation of Pseudomonas aeruginosa 1244 pilin.Microbiology 141:1247−54.
Charbonneau,M.−E., Girard,V., Nikolakakis,A., Campos,M., Berthiaume,F., Dumas,F., ... Mourez,M.(2007).O−linked glycosylation ensures the normal conformation of the autotransporter adhesin involved in diffuse adherence.Journal of Bacteriology 189(24):8880−9.
Chen,M.M., Glover,K.J., and Imperiali,B.(2007)From peptide to protein:comparative analysis of the substrate specificity of N−linked glycosylation in C.jejuni.Biochemistry 46:5579−85.
Choi,A.H.K., Slamti,L., Avci,F.Y., Pier,G.B., & Maira−Litran,T.(2009).The pgaABCD locus of Acinetobacter baumannii encodes the production of poly−beta−1−6−N−acetylglucosamine,which is critical for biofilm formation.Journal of Bacteriology 191(19):5953−63.
Choi,C.H., Hyun,S.H., Lee,J.Y., Lee,J.S., Lee,Y.S., Kim,S.A., ... Lee,J.C.(2008).Acinetobacter baumannii outer membrane protein A targets the nucleus and induces cytotoxicity.Cellular Microbiology 10(2):309−19.
Comer,J.E., Marshall,M.A., Blanch,V.J., Deal,C.D., & Castric,P.(2002).Identification of the Pseudomonas aeruginosa 1244 pilin glycosylation site.Infection and Immunity 70(6):2837−45.
Cote,J.−P., Charbonneau,M.−E., & Mourez,M.(2013).Glycosylation of the Escherichia coli TibA self−associating autotransporter influences the conformation and the functionality of the protein.PloS One 8(11):e80739.
Coyne,M.J., Fletcher,C.M., Chatzidaki−Livanis,M., Posch,G., Schaffer,C., & Comstock,L.E.(2013).Phylum−wide general protein O−glycosylation system of the Bacteroidetes.Molecular Microbiology 88(4):772−83.
Cuccui,J., Thomas,R.M., Moule,M.G., D’Elia,R.V,Laws,T.R., Mills,D.C., et al.(2013)Exploitation of bacterial N−linked glycosylation to develop a novel recombinant glycoconjugate vaccine against Francisella tularensis.Open Biol 3:130002.
Dick,W.E., and Beurret,M.(1989)Glycoconjugates of bacterial carbohydrate antigens.A survey and consideration of design and preparation factors.Contrib Microbiol Immunol 10:48−114.
DiGiandomenico,A., Matewish,M.J., Bisaillon,A., Stehle,J.R., Lam,J.S., and Castric,P.(2002)Glycosylation of Pseudomonas aeruginosa 1244 pilin:glycan substrate specificity.Mol Microbiol 46:519−30.
Feldman,M.F., Wacker,M., Hernandez,M., Hitchen,P.G., Marolda,C.L., Kowarik,M., ... Aebi,M.(2005).Engineering N−linked protein glycosylation with diverse O antigen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102(8):3016−21.
Fisher,A.C., Haitjema,C.H., Guarino,C., Celik,E., Endicott,C.E., Reading,C.A., et al.(2010)Production of Secretory and Extracellular N−Linked Glycoproteins in Escherichia coli.Appl Environ Microbiol 77:871−881.
Gebhart,C., Ielmini,M.V., Reiz,B., Price,N.L., Aas,F.E., Koomey,M., & Feldman,M.F.(2012).Characterization of exogenous bacterial oligosaccharyltransferases in Escherichia coli reveals the potential for O−linked protein glycosylation in Vibrio cholerae and Burkholderia thailandensis.Glycobiology 22(7):962−74.
Gordon,N.C., & Wareham,D.W.(2010).Multidrug−resistant Acinetobacter baumannii:mechanisms of virulence and resistance.International Journal of Antimicrobial Agents 35(3):219−26.
Gottig,S., Gruber,T.M., Higgins,P.G., Wachsmuth,M., Seifert,H., & Kempf,V.A.J.(2014).Detection of pan drug−resistant Acinetobacter baumannii in Germany.The Journal of Antimicrobial Chemotherapy 69(9):2578−9.
Griffioen,A.W., Rijkers,G.T., Janssens−Korpela,P., and Zegers,B.J.(1991)Pneumococcal polysaccharides complexed with C3d bind to human B lymphocytes via complement receptor type 2.Infect Immun 59:1839−45.
Gross,J., Grass,S., Davis,A.E., Gilmore−Erdmann,P., Townsend,R.R., & St Geme,J.W.(2008).The Haemophilus influenzae HMW1 adhesin is a glycoprotein with an unusual N−linked carbohydrate modification.The Journal of Biological Chemistry 283(38):26010−5.
Harding,C.M., Nasr,M.A., Kinsella,R.L., Scott,N.E., Foster,L.J., Weber,B.S., et al.(2015)Acinetobacter strains carry two functional oligosaccharyltransferases,one devoted exclusively to type IV pilin,and the other one dedicated to O−glycosylation of multiple proteins.Mol Microbiol.
Horzempa,J., Dean,C.R., Goldberg,J.B., and Castric,P.(2006)Pseudomonas aeruginosa 1244 pilin glycosylation:glycan substrate recognition.J Bacteriol 188:4244−52.
Horzempa,J., Held,T.K., Cross,A.S., Furst,D., Qutyan,M., Neely,A.N., and Castric,P.(2008)Immunization with a Pseudomonas aeruginosa 1244 pilin provides O−antigen−specific protection.Clin Vaccine Immunol 15:590−7.
Hu,D., Liu,B., Dijkshoorn,L., Wang,L., & Reeves,P.R.(2013).Diversity in the major polysaccharide antigen of Acinetobacter baumannii assessed by DNA sequencing,and development of a molecular serotyping scheme.PloS One 8(7):e70329.
Hug,I., & Feldman,M.F.(2011).Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria.Glycobiology 21(2):138−51.
Ielmini,M.V,& Feldman,M.F.(2011).Desulfovibrio desulfuricans PglB homolog possesses oligosaccharyltransferase activity with relaxed glycan specificity and distinct protein acceptor sequence requirements.Glycobiology 21(6):734−42.
Iwashkiw,J.A., Vozza,N.F., Kinsella,R.L., & Feldman,M.F.(2013).Pour some sugar on it:the expanding world of bacterial protein O−linked glycosylation.Molecular Microbiology 89(1):14−28.
Kampf,M.M., Braun,M., Sirena,D., Ihssen,J., Thony−Meyer,L., and Ren,Q.(2015)In vivo production of a novel glycoconjugate vaccine against Shigella flexneri 2a in recombinant Escherichia coli:identification of stimulating factors for in vivo glycosylation.Microb Cell Fact 14:12.
Kowarik,M., Young,N.M., Numao,S., Schulz,B.L., Hug,I., Callewaert,N., et al.(2006)Definition of the bacterial N−glycosylation site consensus sequence.EMBO J 25:1957−66.
Kus,J.V,Tullis,E., Cvitkovitch,D.G., & Burrows,L.L.(2004).Significant differences in type IV pilin allele distribution among Pseudomonas aeruginosa isolates from cystic fibrosis(CF)versus non−CF patients.Microbiology 150:1315−26.
Lees−Miller,R.G., Iwashkiw,J.A., Scott,N.E., Seper,A., Vinogradov,E., Schild,S., & Feldman,M.F.(2013).A common pathway for O−linked protein−glycosylation and synthesis of capsule in Acinetobacter baumannii.Molecular Microbiology 89(5):816−30.
Lithgow,K.V., Scott,N.E., Iwashkiw,J.A., Thomson,E.L.S., Foster,L.J., Feldman,M.F., & Dennis,J.J.(2014).A general protein O−glycosylation system within the Burkholderia cepacia complex is involved in motility and virulence.Molecular Microbiology 92(1):116−137.
Logan,S.M.(2006).Flagellar glycosylation−a new component of the motility repertoire? Microbiology 152:1249−62.
Lund,E.(1970)On the nomenclature of the pneumococcal types.Int J Syst Bacteriol 20:321−323.
Marchler−Bauer A., Bryant SH.(2004).CD−Search:protein domain annotations on the fly.Nucleic Acids Research 32(W):327−331.
Marchler−Bauer A.et al.(2009).CDD:specific functional annotation with the Conserved Domain Database.Nucleic Acids Research 37(D):205−10.
Marchler−Bauer A.et al.(2011).CDD:a Conserved Domain Database for the functional annotation of proteins.Nucleic Acids Research 39(D):225−9.
Mescher,M.F., & Strominger,J.L.(1976).Structural(shape−maintaining)role of the cell surface glycoprotein of Halobacterium salinarium.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 73(8):2687−91.
Musumeci,M.A., Faridmoayer,A., Watanabe,Y., & Feldman,M.F.(2014).Evaluating the role of conserved amino acids in bacterial O−oligosaccharyltransferases by in vivo,in vitro and limited proteolysis assays.Glycobiology 24(1):39−50.
Nguyen,L.C., Taguchi,F., Tran,Q.M., Naito,K., Yamamoto,M., Ohnishi−Kameyama,M., ... Ichinose,Y.(2012).Type IV pilin is glycosylated in Pseudomonas syringae pv.tabaci 6605 and is required for surface motility and virulence.Molecular Plant Pathology 13(7):764−74.
Nothaft,H., Scott,N.E., Vinogradov,E., Liu,X., Hu,R., Beadle,B., ... Szymanski,C.M.(2012).Diversity in the protein N−glycosylation pathways within the Campylobacter genus.Molecular & Cellular Proteomics:MCP 11(11):1203−19.
Nothaft,H., & Szymanski,C.M.(2010).Protein glycosylation in bacteria:sweeter than ever.Nature Reviews.Microbiology 8(11):765−78.
Olsen,J.V,Macek,B., Lange,O., Makarov,A., Horning,S., & Mann,M.(2007).Higher−energy C−trap dissociation for peptide modification analysis.Nature Methods 4(9):709−12.
Peeters,C.C.A.M., Lagerman,P.R., Weers,O.de,Oomen,L.A., Hoogerhout,P., Beurret,M., et al.(2003)Preparation of polysaccharide−conjugate vaccines.Methods Mol Med 87:153−74.
Perez,J.M., McGarry,M.A., Marolda,C.L., & Valvano,M.A.(2008).Functional analysis of the large periplasmic loop of the Escherichia coli K−12 WaaL O−antigen ligase.Molecular Microbiology 70(6):1424−40.
Porstendorfer,D., Gohl,O., Mayer,F., & Averhoff,B.(2000).ComP,a Pilin−Like Protein Essential for Natural Competence in Acinetobacter sp.Strain BD413:Regulation,Modification,and Cellular Localization.Journal of Bacteriology 182(13):3673−3680.
Power,P., & Jennings,M.(2003).The genetics of glycosylation in Gram−negative bacteria.FEMS Microbiology Letters 218(2):211−222.
Power,P.M., Seib,K.L., & Jennings,M.P.(2006).Pilin glycosylation in Neisseria meningitidis occurs by a similar pathway to wzy−dependent O−antigen biosynthesis in Escherichia coli.Biochemical and Biophysical Research Communications 347(4):904−8.
Ravenscroft,N., Haeuptle,M.A., Kowarik,M., Fernandez,F.S., Carranza,P., Brunner,A., et al.(2015)Purification and characterization of a Shigella conjugate vaccine,produced by glycoengineering Escherichia coli.Glycobiology cwv077−.
Ruan,X., Loyola,D.E., Marolda,C.L., Perez−Donoso,J.M., & Valvano,M.A.(2012).The WaaL O−antigen lipopolysaccharide ligase has features in common with metal ion−independent inverting glycosyltransferases.Glycobiology 22(2):288−99.
Scott,N.E., Kinsella,R.L., Edwards,A.V.G., Larsen,M.R., Dutta,S., Saba,J., ... Feldman,M.F.(2014).Diversity Within the O−linked Protein Glycosylation Systems of Acinetobacter Species.Molecular & Cellular Proteomics:MCP 13(9):2354−70.
Scott,N.E., Nothaft,H., Edwards,A.V.G., Labbate,M., Djordjevic,S.P., Larsen,M.R., ... Cordwell,S.J.(2012).Modification of the Campylobacter jejuni N−linked glycan by EptC protein−mediated addition of phosphoethanolamine.The Journal of Biological Chemistry 287(35):29384−96.
Scott,N.E., Parker,B.L., Connolly,A.M., Paulech,J., Edwards,A.V.G., Crossett,B., ... Cordwell,S.J.(2011).Simultaneous glycan−peptide characterization using hydrophilic interaction chromatography and parallel fragmentation by CID,higher energy collisional dissociation,and electron transfer dissociation MS applied to theN−linked glycoproteome of Campylobacter jejuni.Molecular & Cellular Proteomics:MCP 10(2):M000031−MCP201.
Simell,B., Lahdenkari,M., Reunanen,A., Kayhty,H., and Vakevainen,M.(2008)Effects of Ageing and Gender on Naturally Acquired Antibodies to Pneumococcal Capsular Polysaccharides and Virulence−Associated Proteins.Clin Vaccine Immunol 15:1391−1397.
Sleytr,U.B.(1975).Heterologous reattachment of regular arrays of glycoproteins on bacterial surfaces.Nature 257(5525):400−402.
Smedley,J.G., Jewell,E., Roguskie,J., Horzempa,J., Syboldt,A., Stolz,D.B., & Castric,P.(2005).Influence of pilin glycosylation on Pseudomonas aeruginosa 1244 pilus function.Infection and Immunity 73(12):7922−31.
Szymanski,C.M., Yao,R., Ewing,C.P., Trust,T.J., & Guerry,P.(1999).Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni.Molecular Microbiology 32(5):1022−1030.
Terra,V.S., Mills,D.C., Yates,L.E., Abouelhadid,S., Cuccui,J., and Wren,B.W.(2012)Recent developments in bacterial protein glycan coupling technology and glycoconjugate vaccine design.J Med Microbiol 61:919−926.
Timens,W., Boes,A., Rozeboom−Uiterwijk,T., and Poppema,S.(1989)Immaturity of the human splenic marginal zone in infancy.Possible contribution to the deficient infant immune response.J Immunol 143:3200−6.
Tsai,C.M., & Frasch,C.E.(1982).A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels.Analytical Biochemistry 119(1):115−9.
Vaneechoutte,M., Young,D.M., Ornston,L.N., De Baere,T., Nemec,A., Van Der Reijden,T., ... Dijkshoorn,L.(2006).Naturally Transformable Acinetobacter sp.Strain ADP1 Belongs to the Newly Described Species Acinetobacter baylyi.Applied and Environmental Microbiology 72(1):932−936.
Varki,A.(1993).Biological roles of oligosaccharides:all of the theories are correct.Glycobiology 3(2):97−130.
Vik,A., Aas,F.E., Anonsen,J.H., Bilsborough,S., Schneider,A., Egge−Jacobsen,W., & Koomey,M.(2009).Broad spectrum O−linked protein glycosylation in the human pathogen Neisseria gonorrhoeae.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106(11):4447−52.
Voisin,S., Kus,J.V,Houliston,S., St−Michael,F., Watson,D., Cvitkovitch,D.G., ... Burrows,L.L.(2007).Glycosylation of Pseudomonas aeruginosa strain Pa5196 type IV pilins with Mycobacterium−like alpha−1,5−linked d−Araf oligosaccharides.Journal of Bacteriology 189(1):151−9.
Wang,N., Mackenzie,L., De Souza,A.G., Zhong,H., Goss,G., & Li,L.(2007).Proteome profile of cytosolic component of zebrafish liver generated by LC−ESI MS/MS combined with trypsin digestion and microwave−assisted acid hydrolysis.Journal of Proteome Research 6(1):263−72.
Watson,D.A., Musher,D.M., Jacobson,J.W., and Verhoef,J.(1993)A Brief History of the Pneumococcus in Biomedical Research:A Panoply of Scientific Discovery.Clin Infect Dis 17:913−924.
Weber,B.S., Miyata,S.T., Iwashkiw,J.A., Mortensen,B.L., Skaar,E.P., Pukatzki,S., & Feldman,M.F.(2013).Genomic and functional analysis of the type VI secretion system in Acinetobacter.PloS One 8(1):e55142.
Weinberger,D.M., Malley,R., and Lipsitch,M.(2011)Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.Lancet(London,England)378:1962−73.
Wenger,J.(2001)Vaccines for the developing world:current status and future directions.Vaccine 19:1588−1591.
Whitfield,C.(1995).Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens.Trends in Microbiology 3(5):178−185.
Wisplinghoff,H., Paulus,T., Lugenheim,M., Stefanik,D., Higgins,P.G., Edmond,M.B., ... Seifert,H.(2012).Nosocomial bloodstream infections due to Acinetobacter baumannii,Acinetobacter pittii and Acinetobacter nosocomialis in the United States.Journal of Infection 64(3):282−290.
Zhou,M., & Wu,H.(2009).Glycosylation and biogenesis of a family of serine−rich bacterial adhesins.Microbiology 155:317−27.
Aranda,J., Poza,M., Pardo,B.G., Rumbo,S., Rumbo,C., Parreira,J.R., ... Bou,G.(2010).A rapid and simple method for constructing stable mutants of Acinetobacter baumannii.BMC Microbiology,10(1),279.
Choi,K.−H., Gaynor,J.B., White,K.G., Lopez,C., Bosio,C.M., Karkhoff−Schweizer,R.R., & Schweizer,H.P.(2005).A Tn7−based broad−range bacterial cloning and expression system.Nature Methods,2(6),443−8.
De Berardinis,V., Vallenet,D., Castelli,V., Besnard,M., Pinet,A., Cruaud,C., ... Weissenbach,J.(2008).A complete collection of single−gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.Molecular Systems Biology,4,174.
Dykxhoorn,D.M., St.Pierre,R., & Linn,T.(1996).A set of compatible tac promoter expression vectors.Gene,177(1−2),133−136.
Figurski,D.H., & Helinski,D.R.(1979).Replication of an origin−containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans.Proceedings of the National Academy of Sciences,76(4),1648−1652.
Hunger,M., Schmucker,R., Kishan,V., & Hillen,W.(1990).Analysis and nucleotide sequence of an origin of an origin of DNA replication in Acinetobacter calcoaceticus and its use for Escherichia coli shuttle plasmids.Gene,87(1),45−51.
Niu,C., Clemmer,K.M., Bonomo,R.A., & Rather,P.N.(2008).Isolation and characterization of an autoinducer synthase from Acinetobacter baumannii.Journal of Bacteriology,190(9),3386−92.
(配列番号2)プライマー
(配列番号3)プライマー
(配列番号4)プライマー
(配列番号5)プライマー
(配列番号6)プライマー
(配列番号7)プライマー
(配列番号8)プライマー
(配列番号9)プライマー
(配列番号10)プライマー
(配列番号11)プライマー
(配列番号12)プライマー
(配列番号13)プライマー
(配列番号14)プライマー
(配列番号15)プライマー
(配列番号16)プライマー
(配列番号17)プライマー
(配列番号18)プライマー
(配列番号19)プライマー
(配列番号20)プライマー
(配列番号21)プライマー
(配列番号22)プライマー
(配列番号23)プライマーセット12F
(配列番号24)プライマーセット12R
(配列番号25)プライマーセット13F
(配列番号26)プライマーセット13R
(配列番号27)プライマーセット14F
(配列番号28)プライマーセット14R
(配列番号29)プライマーセット15F
(配列番号30)プライマーセット15R
(配列番号31)プライマーセット16F
(配列番号32)プライマーセット16R
(配列番号33)プライマーセット17F
(配列番号34)プライマーセット17R
(配列番号35)プライマーセット18F
(配列番号36)プライマーセット18R
(配列番号37)プライマーセット19F
(配列番号38)プライマーセット19R
(配列番号39)プライマーセット20F
(配列番号40)プライマーセット20R
(配列番号41)プライマーセット21F
(配列番号42)プライマーセット21R
(配列番号43)プライマーセット22F
(配列番号44)プライマーセット22R
(配列番号45)プライマーセット23F
(配列番号46)プライマーセット23R
(配列番号47)プライマーセット24F
(配列番号48)プライマーセット24R
(配列番号49)プライマーセット25F
(配列番号50)プライマーセット25R
(配列番号51)プライマーセット26F
(配列番号52)プライマーセット26R
(配列番号53)プライマーセット27F
(配列番号54)プライマーセット27R
(配列番号55)プライマーセット28F
(配列番号56)プライマーセット28R
(配列番号57)プライマーセット29F
(配列番号58)プライマーセット29R
(配列番号59)プライマーセット30F
(配列番号60)プライマーセット30R
(配列番号61)プライマーセット31F
(配列番号62)プライマーセット31R
(配列番号63)プライマーセット32F
(配列番号64)プライマーセット32R
(配列番号65)プライマーセット33F
(配列番号66)プライマーセット33R
(配列番号67)プライマーセット34F
(配列番号68)プライマーセット34R
(配列番号69)プライマーセット35F
(配列番号70)プライマーセット35R
(配列番号71)プライマーセット36F
(配列番号72)プライマーセット36R
(配列番号73)プライマーセット37F
(配列番号74)プライマーセット37R
(配列番号75)プライマーセット38F
(配列番号76)プライマーセット38R
(配列番号77)プライマーセット39F
(配列番号78)プライマーセット39R
(配列番号89)プライマー igrF
(配列番号90)プライマー igrR
Claims (17)
- 細菌細胞内のタンパク質をグリコシル化する方法であって、
PglLComPO−オリゴサッカリルトランスフェラーゼを用い、ComPを有するComP融合タンパク質を、還元末端にグルコース残基を含む細菌莢膜多糖体によってグリコシル化することを含む、方法。 - 前記PglLComPO−オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、前記ComP融合タンパク質、および前記細菌莢膜多糖体を一緒に細菌細胞内で発現させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ComP融合タンパク質が、アジュバントまたはキャリアを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記細菌細胞がアシネトバクター(Acinetobacter)または大腸菌(E.coli)である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記細菌莢膜多糖体がストレプトコッカス(Streptococcus)の莢膜である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細菌莢膜多糖体がストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)莢膜である、請求項5に記載の方法。
- 前記細菌細胞が大腸菌(E.coli)である、請求項4に記載の方法。
- 前記アシネトバクター(Acinetobacter)が、A.バイリイ(A.baylyi)、A.バウマンニ(A.baumannii)、A.ノソコミアリス(A.nosocomialis)またはA.カルコアセティカス(A.calcoaceticus)である、請求項4に記載の方法。
- ComPを含むグリコシル化融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、還元末端にグルコース残基を含む細菌莢膜多糖体によってグリコシル化されている、グリコシル化融合タンパク質。
- 前記細菌莢膜多糖体が、ストレプトコッカス(Streptococcus)由来である、請求項9に記載のグリコシル化融合タンパク質。
- 前記細菌莢膜多糖体が、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)由来である、請求項10に記載のグリコシル化融合タンパク質。
- 請求項9〜11のいずれか1項に記載のグリコシル化融合タンパク質を含む、コンジュゲートワクチン。
- ストレプトコッカス(Streptococcus)ワクチンである、請求項12に記載のコンジュゲートワクチン。
- 前記ストレプトコッカス(Streptococcus)ワクチンがストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)ワクチンである、請求項13に記載のコンジュゲートワクチン。
- 前記ワクチンがアジュバントまたはキャリアを含む、請求項12に記載のコンジュゲートワクチン。
- 還元末端にグルコース残基を含むストレプトッコカス(Streptoccocus)莢膜によるタンパク質のグリコシル化を行うためのPglL ComP O−オリゴサッカリルトランスフェラーゼの使用。
- 前記ストレプトコッカス(Streptococcus)がストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)である、請求項16に記載の使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562121439P | 2015-02-26 | 2015-02-26 | |
US62/121,439 | 2015-02-26 | ||
PCT/CA2016/050208 WO2016134485A1 (en) | 2015-02-26 | 2016-02-26 | Acinetobacter o-oligosaccharyltransferases and uses thereof |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018507693A JP2018507693A (ja) | 2018-03-22 |
JP2018507693A5 JP2018507693A5 (ja) | 2019-04-04 |
JP6764872B2 true JP6764872B2 (ja) | 2020-10-07 |
Family
ID=56787925
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017545671A Active JP6764872B2 (ja) | 2015-02-26 | 2016-02-26 | アシネトバクター(Acinetobacter)O−オリゴサッカリルトランスフェラーゼおよびその使用 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US10265391B2 (ja) |
EP (1) | EP3262077A4 (ja) |
JP (1) | JP6764872B2 (ja) |
AU (1) | AU2016224006B8 (ja) |
BR (1) | BR112017017930A2 (ja) |
CA (1) | CA2977561C (ja) |
WO (1) | WO2016134485A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6764872B2 (ja) | 2015-02-26 | 2020-10-07 | ヴァックスニューモ エルエルシーVaxnewmo Llc | アシネトバクター(Acinetobacter)O−オリゴサッカリルトランスフェラーゼおよびその使用 |
EP3359188A1 (en) * | 2015-10-07 | 2018-08-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Streptococcus suis polysaccharide-protein conjugate composition |
US10729763B2 (en) | 2017-06-10 | 2020-08-04 | Inventprise, Llc | Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds |
JP2021528059A (ja) * | 2018-06-16 | 2021-10-21 | ヴァックスニューモ エルエルシーVaxnewmo Llc | グリコシル化されたComPピリンバリアント、製造方法及びその使用 |
JP2022514704A (ja) * | 2018-12-21 | 2022-02-14 | ヴァックスニューモ エルエルシー | O結合型グリコシル化認識モチーフ |
WO2021217037A2 (en) * | 2020-04-23 | 2021-10-28 | Cornell University | Bacterial system for producing human o-glycoproteins |
US20240001155A1 (en) * | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Mechanobiologics, Inc. | Reversal of cellular senescence by treatment with low frequency ultrasound |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2007345975B2 (en) * | 2006-12-13 | 2014-04-24 | The Governors Of The University Of Alberta | Methods and systems for O-glycosylating proteins |
US20130196410A1 (en) | 2010-03-05 | 2013-08-01 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc | Compositions and methods for modifying the glycosylation pattern of a polypeptide |
US11193154B2 (en) | 2011-11-04 | 2021-12-07 | Cornell University | Prokaryote-based cell-free system for the synthesis of glycoproteins |
ES2720040T3 (es) | 2012-10-12 | 2019-07-17 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Procedimientos de modificación de células hospedadoras |
EA201590705A1 (ru) * | 2012-11-07 | 2016-05-31 | Гликоваксин Аг | ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ВАКЦИНЫ В E.coli ПОСРЕДСТВОМ ЭНЗИМАТИЧЕСКОЙ КОНЪЮГАЦИИ |
WO2014151878A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Abbvie Inc. | Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides |
WO2016044773A1 (en) | 2014-09-18 | 2016-03-24 | University Of Maryland, Baltimore | Broad spectrum conjugate vaccine to prevent klebsiella pneumoniae and pseudomonas aeruginosa infections |
HRP20220500T1 (hr) | 2014-12-30 | 2022-06-10 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Pripravci i postupci za glikoziliranje proteina |
JP6764872B2 (ja) | 2015-02-26 | 2020-10-07 | ヴァックスニューモ エルエルシーVaxnewmo Llc | アシネトバクター(Acinetobacter)O−オリゴサッカリルトランスフェラーゼおよびその使用 |
JP2021528059A (ja) | 2018-06-16 | 2021-10-21 | ヴァックスニューモ エルエルシーVaxnewmo Llc | グリコシル化されたComPピリンバリアント、製造方法及びその使用 |
JP2022514704A (ja) | 2018-12-21 | 2022-02-14 | ヴァックスニューモ エルエルシー | O結合型グリコシル化認識モチーフ |
-
2016
- 2016-02-26 JP JP2017545671A patent/JP6764872B2/ja active Active
- 2016-02-26 EP EP16754717.3A patent/EP3262077A4/en active Pending
- 2016-02-26 WO PCT/CA2016/050208 patent/WO2016134485A1/en active Application Filing
- 2016-02-26 CA CA2977561A patent/CA2977561C/en active Active
- 2016-02-26 US US15/553,733 patent/US10265391B2/en active Active
- 2016-02-26 BR BR112017017930A patent/BR112017017930A2/pt active Search and Examination
- 2016-02-26 AU AU2016224006A patent/AU2016224006B8/en active Active
-
2019
- 2019-04-22 US US16/390,833 patent/US10869918B2/en active Active
-
2020
- 2020-12-18 US US17/127,142 patent/US11497804B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2016224006B2 (en) | 2020-02-27 |
WO2016134485A1 (en) | 2016-09-01 |
US20210220460A1 (en) | 2021-07-22 |
AU2016224006A1 (en) | 2017-09-28 |
BR112017017930A2 (pt) | 2018-04-10 |
US10265391B2 (en) | 2019-04-23 |
US20190343945A1 (en) | 2019-11-14 |
AU2016224006B8 (en) | 2020-03-19 |
EP3262077A4 (en) | 2018-11-14 |
CA2977561C (en) | 2022-09-06 |
US11497804B2 (en) | 2022-11-15 |
JP2018507693A (ja) | 2018-03-22 |
US10869918B2 (en) | 2020-12-22 |
CA2977561A1 (en) | 2016-09-01 |
EP3262077A1 (en) | 2018-01-03 |
US20180050101A1 (en) | 2018-02-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6764872B2 (ja) | アシネトバクター(Acinetobacter)O−オリゴサッカリルトランスフェラーゼおよびその使用 | |
Harding et al. | A cinetobacter strains carry two functional oligosaccharyltransferases, one devoted exclusively to type IV pilin, and the other one dedicated to O‐glycosylation of multiple proteins | |
Wetter et al. | Engineering, conjugation, and immunogenicity assessment of Escherichia coli O121 O antigen for its potential use as a typhoid vaccine component | |
EP2142660B1 (en) | Methods and systems for o-glycosylating proteins | |
JP6682451B2 (ja) | 改変型宿主細胞およびその使用 | |
KR20150054800A (ko) | 변형된 항원을 포함하는 생체접합체 및 이의 용도 | |
KR20100123730A (ko) | 원핵생물 세포로부터의 n-당화된 재조합 단백질로부터 제조된 바이오컨쥬게이트 | |
Schell et al. | Outer membrane proteome of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei from diverse growth conditions | |
Duke et al. | Development and immunogenicity of a prototype multivalent group B Streptococcus bioconjugate vaccine | |
US20220054632A1 (en) | Modified carrier proteins for o-linked glycosylation | |
Knoot et al. | Discovery and characterization of a new class of O-linking oligosaccharyltransferases from the Moraxellaceae family | |
Cain et al. | Exploiting pglB oligosaccharyltransferase-positive and-negative Campylobacter jejuni and a multiprotease digestion strategy to identify novel sites modified by N-linked protein glycosylation | |
WO2024077205A2 (en) | Moraxellaceae o-linking oligosaccharyltransferases, glycosylation fragments, and uses thereof | |
Nasr | Exploiting novel Acinetobacter Oligosaccharyltransferases for the development of glycoconjugate vaccines against the Pneumococcus | |
Yogendirarajah | Elucidating the Importance of HopE and its Potential Lewis Glycosylation in Helicobacter pylori | |
Harding | Discovery and demonstration of functional type IV pili production and post-translational modification by a medically relevant Acinetobacter species | |
Corradin et al. | Michael Wetter, Michael Kowarik, Michael Steffen, Paula Carranza | |
Gebhart | Characterization of Novel OTases as Tools for Glycoengineering | |
Barre | Characterization of the bacterial oligosaccharyltransferase for N-linked protein glycosylation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190220 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190220 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20191108 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20191119 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20191120 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20191111 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191203 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200226 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200818 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200914 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6764872 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |