JP2018507693A - アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）Ｏ−オリゴサッカリルトランスフェラーゼおよびその使用 - Google Patents

Abstract

本願は、ワクチンを作製するための方法およびＯ−オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（Ｏ−ＯＴａｓｅ）の使用を提供する。本願は特に、ＰｇｌＬＣｏｍＰＯ−ＯＴａｓｅを用いるピリン様タンパク質ＣｏｍＰのグリコシル化を含む、糖タンパク質の合成方法を提供する。このほか、ＰｇｌＬＣｏｍＰＯ−ＯＴａｓｅを用いるＣｏｍＰのグリコシル化によって合成した糖タンパク質の、特にストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に対するワクチンを含めたワクチンの調製などへの使用が提供される。【選択図】なし

Description

本願は分子微生物学の分野に関する。より具体的には、本願はＯ−オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、具体的にはワクチン用途へのＰｇｌＬ_ＣｏｍＰＯ−オリゴサッカリルトランスフェラーゼの使用に関する。

アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）およびＡ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）は、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）−Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）（Ａｃｂ）複合体の臨床的に重要なメンバーであり、重要な日和見性の院内病原菌である（Ｗｉｓｐｌｉｎｇｈｏｆｆら，２０１２）。両菌株とも、消毒、乾燥に対する顕著な耐性のほか、いずれも病院での菌の生存率を高める多剤耐性表現型を獲得する能力を示すことなどの理由から、厄介な病原菌として出現した。さらに、世界中の病院でＡｃｂ内に汎耐性菌株が分離される例が後を絶たない（Ａｒｒｏｙｏら，２００９；Ｇｏｔｔｉｇら，２０１４）。Ａｃｂのメンバーの抗生物質耐性の機序が精力的に研究されている（Ｇｏｒｄｏｎら，２０１０）が、その病原性機序に関してはよくわかっていない。特定されている病原性因子としては、外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）、バイオフィルム形成能、菌体外多糖、リポ多糖（ＬＰＳ）、タンパク質グリコシル化系および莢膜が挙げられる（Ｃｈｏｉら，２００８；Ｃｈｏｉら，２００９；Ｇｏｒｄｏｎら，２０１０；Ｉｗａｓｈｋｉｗら，２０１２；Ｌｅｅｓ−Ｍｉｌｌｅｒら，２０１３）。このほかＶＩ型分泌系（Ｔ６ＳＳ）が特定されているが、病理発生機序での役割は明らかにされていない（Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓら，２０１３；Ｗｅｂｅｒら，２０１３）。

Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）は、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属の非病原性のメンバーであり、遺伝子が取り扱いやすく天然のコンピテンスを示すことを特徴とする。このような特性から、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）はアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属の分子学的研究および遺伝学的研究のモデル微生物として広く用いられている（Ｖａｎｅｅｃｈｏｕｔｔｅら，２００６；ｄｅ Ｂｅｒａｒｄｉｎｉｓら，２００８；Ｂｒｚｏｓｋａら，２０１３）ほか、バイオレメディエーションにも利用されている（Ａｂｄ−Ｅｌ−Ｈａｌｅｅｍら，２００２；Ｍａｒａら，２０１２）。アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属のメンバーはいずれも、その病原性に関係なく、タンパク質グリコシル化系を有する（Ｉｗａｓｈｋｉｗら，２０１２）。

炭水化物部分とタンパク質基質の共有結合であるタンパク質グリコシル化は、最も多くみられるタンパク質の翻訳後修飾であり（Ｖａｒｋｉ，１９９３）、生命のあらゆる領域で起こる（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，１９３８；Ｓｌｅｙｔｒ，１９７５；ＭｅｓｃｈｅｒおよびＳｔｒｏｍｉｎｇｅｒ，１９７６）。タンパク質グリコシル化の主な種類にはＮ−グリコシル化およびＯ−グリコシル化がある。両過程とも、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）依存性のものとＯＴａｓｅ非依存性のものとに分けられる（ＮｏｔｈａｆｔおよびＳｚｙｍａｎｓｋｉ，２０１０；Ｉｗａｓｈｋｉｗら，２０１３）。ＯＴａｓｅｓは、細胞質内のグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）によって予めウンデカプレニルピロリン酸脂質キャリア上に集合したグリカンの標的タンパク質への転移を触媒する酵素である。高感度の分析技術の開発によって、多数の細菌種にＯＴａｓｅ依存性タンパク質グリコシル化が確認されている。このような細菌種としては、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属およびバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属が挙げられる（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉら，１９９９；Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒら，２００７；Ｅｇｇｅ−Ｊａｃｏｂｓｅｎら，２０１１；Ｂａｌｏｎｏｖａら，２０１２；Ｇｅｂｈａｒｔら，２０１２；Ｃｏｙｎｅら，２０１３；Ｌｉｔｈｇｏｗら，２０１４）。グリコシル化は一般に、タンパク質の安定性、細菌の接着、鞭毛繊維の集合、バイオフィルムの形成および病原性に影響を及ぼすことが多い（Ｌｏｇａｎ，２００６；Ｉｗａｓｈｋｉｗら，２０１３）。最近、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属にＯＴａｓｅ依存性で遍在性のＯ結合タンパク質グリコシル化系が発見されている。この系は、Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）のバイオフィルム形成および病原性に必要なものであった（Ｉｗａｓｈｋｉｗら，２０１２）。Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）のいくつかの菌株では、グリカン構造の特徴も明らかにされているほか、多岐にわたる炭水化物の多様性が確認されている（Ｓｃｏｔｔら，２０１４）。

Ｏ−グリコシル化に関与するＯＴａｓｅ（Ｏ−ＯＴａｓｅ）は一次アミノ酸配列に高い相同性を共有しないが、Ｏ−Ｏｔａｓｅには例外なくＷｚｙ＿Ｃスーパーファミリーのドメインが含まれている（ＰｏｗｅｒおよびＪｅｎｎｉｎｇｓ，２００３）。ＰｇｌＬの汎用的な９０のＯ−ＯｔａｓｅおよびＷａａＬ Ｏ−抗原リガーゼのオルソログは、Ｗｚｙ＿Ｃ スーパーファミリーの最もよく特徴付けられた２種類の酵素である。Ｏ−ＯＴａｓｅとＷａａＬリガーゼは類似した反応、すなわち、脂質結合グリカンをそれぞれアクセプタータンパク質またはリピドＡに転移させる反応を触媒するため、バイオインフォマティクス法のみに基づいてＯ−ＯＴａｓｅを同定するのは困難であることが明らかにされている（ＨｕｇおよびＦｅｌｄｍａｎ，２０１１）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ−抗原リガーゼ（Ｈ３３７）と髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＯ−ＯＴａｓｅ（Ｈ３４９）のトポロジーが類似した保存されたヒスチジン残基に変異を誘発するとグリカン転移活性が消失することから、上記の２つの酵素は進化的にも機構的にも近縁であると思われる（Ｐｅｒｅｚら，２００８；Ｒｕａｎら，２０１２；Ｍｕｓｕｍｅｃｉら，２０１４）。最近、ＰｇｌＬ Ｏ−ＯＴａｓｅのオルソログとＷｚｙ＿Ｃ スーパーファミリーの他の酵素とを上手く分けるＰｇｌＬ＿ＡおよびＰｇｌＬ＿Ｂの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）が明らかにされた（Ｐｏｗｅｒら，２００６；Ｓｃｈｕｌｚら，２０１３）。

Ｏ−ＯＴａｓｅは多くの場合、そのコグネイト標的タンパク質の下流にコードされている。この遺伝子配置はＩＶ型線毛（Ｔｆｐ）系をコードするグラム陰性微生物によくみられ、この場合、主要ピリンサブユニット遺伝子はコグネイトＯＴａｓｅ遺伝子のすぐ５’側にある（Ｓｃｈｕｌｚら，２０１３）。例えば、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）１２４４菌株の主要ピリンであるＰｉｌＡは、ｐｉｌＡのすぐ下流にコードされているＯ−ＯＴａｓｅ、ＰｉｌＯ（のちにＴｆｐＯに改名）によってグリコシル化される（Ｃａｓｔｒｉｃ，１９９５；Ｋｕｓら，２００４）。グリコシル化欠失変異株は、マウス呼吸器感染症モデルでは収縮運動が低下し、野生型によって打ち負かされることから、この修飾は病原性に何らかの役割を担っているものと考えられる（Ｋｕｓら，２００４；Ｓｍｅｄｌｅｙら，２００５）。Ｐ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）にもこれと同じ遺伝子配置およびグリコシル化表現型がみられる（Ｎｇｕｙｅｎら，２０１２）。

アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）種にはこのほか、ピリンの翻訳後修飾が確認されている。Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１では、ゲノム内にＷｚｙ＿Ｃスーパーファミリードメイン含有タンパク質２種類がコードされている。一方の遺伝子は、ピリン様タンパク質ＣｏｍＰをコードする遺伝子のすぐ下流にみられるのに対し、もう一方の遺伝子は遠位のグリカン生合成遺伝子クラスター内にみられる。ｃｏｍＰ遺伝子の下流にコードされていると予測されるＯＴａｓｅの変異がＣｏｍＰの電気泳動移動度に影響を及ぼしたことから、この遺伝子がＣｏｍＰ特異的ＯＴａｓｅをコードしている可能性が示唆される（Ｐｏｒｓｔｅｎｄｏｒｆｅｒら，２０００；Ｓｃｈｕｌｚら，２０１３）。さらに、医学的に重要なＡ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株によるＴｆｐの機能的産生を明らかにしたこれまでの研究の過程ではほかにも、見かけの分子量が異なる２種類の分子形態のＰｉｌＡが同定され、Ａｃｂメンバーのピリンも翻訳後修飾を受けるとする仮説を立てるに至った（Ｈａｒｄｉｎｇら，２０１３；Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓら，２０１３）。

ＯＴａｓｅは糖鎖工学コンジュゲートワクチンの強力なツールとなる。酵素によるグリカンとタンパク質と結合には、糖の化学的結合に比べていくつかの利点がある。ＯＴａｓｅは緩い特異性を示すが、現時点で知られているＯＴａｓｅにはいくつかの制約がある。例えば、ＰｇｌＢおよびＰｇｌＬなどの既知の酵素はいずれも、還元末端にグルコースを含むグリカンの転移に成功を収めた例がない。ＰｇｌＢは還元末端にアセチル化糖が必要であることがわかっている（Ｗａｃｋｅｒら，２００６）。ＰｇｌＬでは還元末端にガラクトースを有する糖を転移させることができたが（Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒら，２００８）、還元末端にグルコースを含む糖をタンパク質に転移させることは示されていない。このことは、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に対するワクチンの合成に極めて重要である。ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の莢膜多糖体は、ほとんどが還元末端にグルコースを含むものである（Ｂｅｎｔｌｅｙら，２００６）。Ｐｒｅｖｎａｒ １３などの認可されている肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のワクチンには莢膜血清型が最大１３種類含まれている。さらに多くの血清型を含む優れたワクチンが必要とされている。現在用いられているＯＴａｓｅで、還元末端にグルコースを含む上記の細菌の莢膜を含有するコンジュゲートの作製に有用なものはなく、このため、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に対するワクチンの生産への用途はほとんどない。

以上の背景に関する情報は、本出願者が本発明と関連する可能性があると考える既知の情報を提供することを目的として記載したものである。上記の情報がいずれも本発明に対する先行技術をなすものであることを認めることが、必ずしも意図されることも、そのように解釈されるべきであることもない。

本発明の目的は、ワクチン用途のための糖タンパク質の作製へのＯ−ＯＴａｓｅの使用を提供することである。

本発明の一態様では、ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰＯ−オリゴサッカリルトランスフェラーゼを用いるＣｏｍＰのグリコシル化を含む、糖タンパク質の合成方法が提供される。この方法は、（例えばＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）、Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）またはＡ．カルコアセティカス（Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）を含めた）アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのグラム陰性菌で実施することができる。グリコシル化には、Ｏ−グリコシル化により得られる糖、Ｎ−グリカン、Ｏ抗原、莢膜多糖体などを用いることができる。特定の一実施形態では、Ｎ−グリカンはカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）に由来するもの、例えばカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）のＮ−ヘパタサッカリド（ｈｅｐａｔａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）などである。これまでに知られているＯＴａｓｅとは異なり、ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰを用いて還元末端にグルコースを含有する莢膜多糖体とタンパク質キャリアとを効率的に結合させることができる。このような莢膜はストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属によくみられる。本願は、ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰの活性により得られ適切なキャリアと結合させた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来莢膜を含有する糖タンパク質を用いる、マウスの免疫応答の発生を提供する。別の実施形態では、ＣｏｍＰを任意選択で第二のタンパク質、アジュバントまたはキャリアと融合させることができる。本発明の別の態様では、タンパク質のグリコシル化、例えば、特にストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）がストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であるストレプトッコカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ）莢膜によるタンパク質のグリコシル化へのＰｇｌＬ_ＣｏｍＰの使用が提供される。

本発明の別の態様では、ＣｏｍＰのグリコシル化のためのＯ−オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（Ｏ−ＯＴａｓｅ）が提供される。グリコシル化は、（例えばＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）、Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）またはＡ．カルコアセティカス（Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）を含めた）アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのグラム陰性菌で組換えにより生じさせることができる。グリコシル化には、Ｏ−グリコシル化により得られる糖、Ｎ−グリカン、Ｏ−抗原、莢膜多糖体などを用いることができる。特定の一実施形態では、Ｎ−グリカンはカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）に由来するもの、例えばカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）のＮ−ヘパタサッカリド（ｈｅｐａｔａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）またはストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来の莢膜多糖体などである。特定の一実施形態では、Ｏ−ＯＴａｓｅはＰｇｌＬ_ＣｏｍＰである。別の実施形態では、莢膜多糖体はストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などのストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の莢膜である。したがって、本願はストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、より具体的にはストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対するワクチンを提供する。

本発明のさらなる態様では、本明細書に記載される方法に従って合成した糖タンパク質を含む、ワクチンを提供する。

本発明のさらなる態様では、ＣｏｍＰまたはグリコシル化部位を有するＣｏｍＰのフラグメントを含む融合タンパク質である、糖タンパク質が提供される。

本発明ならびにそのほかの態様およびさらなる特徴の理解をさらに深めるため、添付図面とともに用いる以下の説明を参照する。

アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌種の２つのＯＴａｓｅ遺伝子をコードする推定Ｏ−ＯＴａｓｅのゲノムおよびドメインの構造を示す図である。（Ａ）Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株の染色体がコードするＯＴａｓｅのゲノムコンテキスト。（Ｂ）ＴｆｐＯ_Ｍ２およびＰｇｌＬ_Ｍ２に存在するＷｚｙ＿Ｃスーパーファミリー（ｃｌ０４８５０）およびＤＵＦ３３６６のドメイン。（Ｃ）Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１の染色体がコードするＯＴａｓｅのゲノムコンテキスト。（Ｄ）ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰおよびＰｇｌＬ_ＡＤＰ１に存在するＷｚｙ＿Ｃスーパーファミリー（ｃｌ０４８５０）およびＤＵＦ３３６６のドメイン。ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰの下の長方形はＤＵＦ３３６６ドメインの一部分を表す。 （ＨｅｘＮＡｃ）２、ヘキソースおよびＮ−アセチル−デオキシヘキソースを含有する四糖によるＴｆｐＯ依存性のＰｉｌＡＭ２グリコシル化を示す図である。（Ａ）材料および方法に記載される通りに、図示される菌株の表面タンパク質を剪断によって調製し、次いで、全細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離およびウエスタンブロット解析を実施した。ウサギ抗ＰｉｌＡＭ２を用いてＭ２菌株のＰｉｌＡＭ２を同定した。Ｍ２ΔｔｆｐＯ：：ｋａｎ変異株のＰｉｌＡＭ２は低分子形態としてのみ存在し、ＰｉｌＡＭ２の翻訳後修飾にはＴｆｐＯが必要であることが示された。Ｍ２ ｐｉｌＡ＋菌株およびＭ２ ｔｆｐＯ＋菌株は、それぞれ補完されたｐｉｌＡ変異株およびｔｆｐＯ変異株であった。「Ｇｌｙ」はグリコシル化型のタンパク質を表す。（Ｂ）Ｍ２菌株および超線毛型変異株の表面からＰｉｌＡＭ２を剪断し、沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クーマシー染色により可視化した。ＰｉｌＡＭ２によるバンドを切り出し、トリプシン処理してＭＳ／ＭＳ解析に供した。 ＰｉｌＡＭ２様グリコシル化の保存されたカルボキシ末端セリンへの依存性を示す図である。（Ａ）緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）１２４４菌株および選択したアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌株のＰｉｌＡタンパク質のカルボキシ末端領域のアライメント。ｔｆｐＯホモログをコードするアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌株はいずれも、それぞれのＰｉｌＡタンパク質にカルボキシ末端セリンが含まれている。（Ｂ）ＰｉｌＡＭ２発現および電気泳動移動度を調べた全細胞抽出物のウエスタンブロット解析。ＰｉｌＡ［Ｓ１３２Ａ］およびＰｉｌＡ［Ｓ１３６Ａ］を発現するＭ２菌株誘導体を構築し、抽出物の特徴を明らかにした。セリン１３２はグリコシル化に不要であったが、Ｃ末端セリンであるセリン１３６はグリコシル化に必要であった。（Ｃ）Ｍ２菌株の自然形質転換にはピリングリコシル化は必要ではない。ＰｉｌＡＭ２をグリコシル化することができなかった変異株でも自然形質転換が可能であった。 ピリングリコシル化には主要多糖抗原遺伝子座（ＭＰＡ）が必要であったことを示す図である。（Ａ）Ｍ２菌株の保存されたｆｋｐＡ遺伝子とｌｌｄＰ遺伝子との間に位置するＭＰＡ遺伝子座の遺伝子構成。Ｈｕら，２０１３を改変。（Ｂ）ＭＰＡ遺伝子座変異株のＰｉｌＡＭ２発現および電気泳動移動度を調べた全細胞抽出物のウエスタンブロット解析。ΔｗｅｅＨ：：ｋａｎ変異株のＰｉｌＡＭ２はｔｆｐＯ：：ｋａｎ変異株のＰｉｌＡＭ２と同じ電気泳動移動度で泳動し、これがグリコシル化ではないことが示された。ほかの３種類のグリコシルトランスフェラーゼの欠失では、ＰｉｌＡＭ２タンパク質の電気泳動移動度は中間の値であった。ＷＴ ＰｉｌＡに最も近い移動度で移動したのはｗａｆＹ：：ｋａｎ変異株のＰｉｌＡであり、ｗａｆＺ：：ｋａｎ変異株のＰｉｌＡ、ｗａｇＢ：：ｋａｎ変異株のＰｉｌＡがこれに次いだ。補完された変異株はいずれもＰｉｌＡＭ２をグリコシル化した。 ＰｇｌＬＭ２は汎用Ｏ−ＯＴａｓｅであり、ＴｆｐＯＭ２と同じ脂質結合グリカンドナーを用いることを示す図である。（Ａ）ＯｍｐＡ−Ｈｉｓ発現および電気泳動移動度を調べた全細胞抽出物のウエスタンブロット解析。ＯｍｐＡ−Ｈｉｓは、Ｍ２菌株ならびに同系のｔｆｐＯＭ２：：ｋａｎ変異株およびｐｇｌＬＭ２：：ｋａｎ変異株によるグリコシル化のベイトタンパク質としての役割を果たした。いずれの菌株もＯｍｐＡ−Ｈｉｓを発現したが、ｐｇｌＬＭ２：：ｋａｎ変異株のＯｍｐＡ−Ｈｉｓは高い電気泳動移動度で泳動し、グリコシル化がみられないことが示された。（Ｂ）ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いてグリコシル化ＯｍｐＡ−Ｈｉｓを可溶化膜から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クーマシー染色によって可視化した。ＯｍｐＡ−Ｈｉｓをゲルから切り取り、ＭＳ／ＭＳ解析によって特徴を明らかにした。 Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１のＯ−ＯＴａｓｅの活性を示す図である。（Ａ）Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１ならびに同系のΔｐｇｌＬ_ＣｏｍＰ変異株およびΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１変異株の全細胞溶解物のＣｏｍＰ−Ｈｉｓ発現を調べたウエスタンブロット解析。ΔｐｇｌＬ_ＣｏｍＰ変異株にＣｏｍＰ−Ｈｉｓの電気泳動移動度の増大がみられ、この菌株にはピリングリコシル化が起こらないことがわかる。（Ｂ）バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１、同系のΔｐｇｌＬ_ＣｏｍＰ変異株およびΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１変異株ならびに青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）から得たＬＰＳの銀染色。青枯病菌（Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）ＬＰＳに観察されたラダー形成がないことからわかるように、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）にはＯ抗原がない。（Ｃ、Ｄ）ｈｉｓタグ化タンパク質であるＤｓｂａ１（Ｃ）またはＯｍｐＡ−Ｈｉｓ（Ｄ）を組換え発現するＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１、同系のΔｐｇｌＬ_ＣｏｍＰ変異株およびΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１変異株の全細胞溶解物のウエスタンブロット解析。ΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１バックグランドで産生されるＨｉｓタグ化タンパク質の相対移動度が増大していることから、ＰｇｌＬ_ＡＤＰ１の発現にはこれらのタンパク質のグリコシル化が必要であったことがわかる。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＴｆｐＯおよびＰｇｌＬ ＯＴａｓｅの異種発現を示す図である。図のようにＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）またはＡ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＴＣＣ１９６０６ ＯＴａｓｅとともにＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）脂質結合オリゴ糖（ＣｊＬＬＯ）およびＨｉｓタグ化ＤｓｂＡ１を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＬＭ２４の全細胞溶解物のウエスタンブロット解析。ポリクローナル抗ｈｉｓ抗体（緑色）を用いてＨｉｓタグ化ＤｓｂＡ１を検出し、ｈＲ６抗体（赤色）を用いてＣｊＬＬＯを検出した。黄色に見える両シグナルの共局在は、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）オリゴ糖によるＤｓｂＡ１のグリコシル化を示している。これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＬＭ２４にＰｇｌＬ_ＡＤＰ１またはＰｇｌＬ_{１９６０６}がＣｊＬＬＯおよびＨｉｓタグ化ＤｓｂＡ１とともに発現した場合にのみ認められる。 Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１糖タンパク質のＺＩＣ−ＨＩＬＩＣ濃縮を用いて同定されたＯ−グリカン構造を示す図である。ＩＴＭＳ−ＣＩＤで断片化することによって、ほぼもっぱらＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１糖ペプチドのグリカン断片化が起こり、以下のものに対応する複数のタンパク質基質に関して固有のグリカンが４種類同定することが可能である；ＡおよびＤ）２８６−２１７−ＨｅｘＮＡｃ３からなる五糖（１１１２．４１Ｄａ、Ｑ６ＦＣＶ１＿ＡＣＩＡＤの９２ＤＡＡＨＤＡＡＡＳＶＥＫ１０３）；Ｂ、ＦおよびＧ）２８６−２１７−２４５−ＨｅｘＮＡｃ２および２８６−２１７−ＨｅｘＮＡｃ−２４５−ＨｅｘＮＡｃからなる２つの同重体グリコフォーム（１１５４．４１Ｄａ、Ｑ６Ｆ８１４＿ＡＣＩＡＤの３４４ＮＴＡＡＳＳＶＡＡＴＨＫＫ３５６）ならびにＣおよびＥ）２８６−２１７−２４５２−ＨｅｘＮＡｃからなる五糖（１１９６．４１Ｄａ、Ｑ６Ｆ８１４＿ＡＣＩＡＤの３４４ＮＴＡＡＳＳＶＡＡＴＨＫＫ３５６）。 ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰはそのコグネイトピリンタンパク質に対して特異的であるが、ＴｆｐＯＭ２はそうではないことを示す図である。（Ａ）異種ＰｉｌＡＭ２発現および電気泳動移動度を調べた全細胞抽出物のウエスタンブロット解析。Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＴＣＣ１９６０６およびＡ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）２７４１３はともにｔｆｐＯホモログをコードし、ＰｉｌＡＭ２がグリコシル化された。ｔｆｐＯホモログを欠く菌株（Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＴＣＣ１７９７８およびＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１）はＰｉｌＡＭ２をグリコシル化することができなかった。（Ｂ）異種ＣｏｍＰ−Ｈｉｓ発現および電気泳動移動度を調べたウエスタンブロット解析。ＣｏｍＰ−Ｈｉｓが修飾されたのはＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１のみであり、ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰがＣｏｍＰに特異的であることが示された。（Ｃ）異種ＰｉｌＡ１７９７８発現および電気泳動移動度を調べたウエスタンブロット解析。ＰｉｌＡ１７９７８は、その天然の菌株ではＰｇｌＬ１７９７８によってグリコシル化され、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１ではＰｇｌＬ_ＡＤＰ１によってグリコシル化されたが、ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰによってグリコシル化されることはなかった。 Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株の脂質結合オリゴ糖の合成、ＴｆｐＯＭ２依存性ピリングリコシル化およびＰｇｌＬＭ２による一般的なＯ−グリコシル化のモデルを示す図である。主要多糖抗原遺伝子座の遺伝子がコードするタンパク質がウンデカプレニル脂質キャリア上に四糖（ＨｅｘＮＡｃ）−（ヘキサ）−（デオキシ−ヘキサ）−（ＨｅｘＮＡｃ）を合成し、次いで、これが周辺質に転移される。次いで、脂質結合オリゴ糖は、ピリン特異的ＯＴａｓｅであるＴｆｐＯによって主要なピリンタンパク質であるＰｉｌＡに転移されるか、汎用ＯＴａｓｅであるＰｇｌＬＭ２によってさらにプロセシングされてＯｍｐＡなどのほかのタンパク質に転移され得る。 本願に用いたグリカンの構造を示す図である。構造はＦａｒｉｄｍｏａｙｅｒら，２００８およびｖａｎ Ｓｅｌｍら，２００３を改変したものである。 ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰがＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＬＬＯおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７抗原をＣｏｍＰに転移させることを示す図である。（Ａ）Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＬＬＯおよび（Ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７抗原を共発現したＰｇｌＬ_ＣｏｍＰを伴って、または伴わずにＣｏｍＰを発現する全大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＬＭ２４の全細胞溶解物に関するウエスタンブロット解析。レーン１は、ＯＴａｓｅを共発現しない非グリコシル化ＣｏｍＰに対応する。レーン２では、ＣｏｍＰとＰｇｌＬ_ＣｏｍＰが共発現している。（Ａ）抗ｈｉｓ抗体および抗グリカン抗体に反応し電気泳動移動度の小さいバンドは、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＬＬＯによるＣｏｍＰのグリコシル化を示している。（Ｂ）抗ｈｉｓに反応し電気泳動移動度の小さいバンドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７抗原サブユニットによるグリコシル化を示している。プロテイナーゼＫで消化すると糖タンパク質シグナルが消失する（レーン３）。モノクローナル抗ｈｉｓ抗体を用いて発現を調べた。 ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰは肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１４由来のＣＰＳサブユニットをＣｏｍＰに転移させることができるが、ＮｍＰｇｌＬもＣｊＰｇｌＢもこれを転移させることができないことを示す図である。ｈｉｓタグ化した（Ａ）ＣｏｍＰを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＬＭ２４の細胞溶解物（レーン１）のウエスタンブロット解析。レーン２は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１４のＣＰＳ合成遺伝子座とＰｇｌＬ_ＣｏｍＰを共発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＬＭ２４由来のＮｉ−ＮＴＡ精製タンパク質に対応する。パネルＡにおいて、抗Ｈｉｓ抗体と抗グリカン抗体の両方に反応しレーン１と比較して電気泳動移動度が小さいレーン２のバンドは、ＣｏｍＰがＣＰＳサブユニットによってＰｇｌＬ_ＣｏｍＰ依存性にグリコシル化されたことを示している。 ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰは肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１４由来のＣＰＳサブユニットをＣｏｍＰに転移させることができるが、ＮｍＰｇｌＬもＣｊＰｇｌＢもこれを転移させることができないことを示す図である。ｈｉｓタグ化した（Ｂ）ＤｓｂＡおよび（Ｃ）ＡｃｒＡを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＬＭ２４の細胞溶解物（レーン１）のウエスタンブロット解析。レーン２は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１４のＣＰＳ合成遺伝子座とＰｇｌＬ_ＣｏｍＰを共発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＬＭ２４由来のＮｉ−ＮＴＡ精製タンパク質に対応する。パネルＢおよびＣのレーン２にはレーン１と比較して電気泳動移動度が小さいバンドはみられず、ＮｍＰｇｌＬおよびＣｊＰｇｌＢがＣＰＳサブユニットをそれぞれＤｓｂＡ１およびＡｃｒＡに転移させることができないことを示している。モノクローナル抗ｈｉｓ抗体およびポリクローナル抗グリカン抗体を用いて発現を調べた。 ２１日後に採取した免疫後マウス血清に実施した全細胞ＥＬＩＳＡの視覚的結果を示す図である。ＥＬＩＳＡは、（Ａ）非グリコシル化タンパク質に感作させ、二次ＨＲＰコンジュゲート抗ＩｇＭ抗体で調べたマウス、（Ｂ）グリコシル化タンパク質に感作させ、二次ＨＲＰコンジュゲート抗ＩｇＭ抗体で調べたマウスまたは（Ｃ）非グリコシル化タンパク質に感作させ、二次ＨＲＰコンジュゲート抗ＩｇＧ抗体で調べたマウスの血清を用いて実施した。 ＣＰＳコンジュゲートＣｏｍＰを注射し、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）全細胞に対して反応させた場合のマウスの血清のグラフである。熱で死滅させ固定化した全細胞肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１４を含む９６ウェルプレートのウェルでマウス１０個体（免疫前および免疫後第２１日）の血清をインキュベートした。陰性対照として、非グリコシル化タンパク質を注射したマウス１０個体の血清を試験した。使用した二次ＨＲＰコンジュゲート抗体は、非グリコシル化タンパク質を注射したマウスのマウスＩｇＧ抗体またはＣＰＳコンジュゲートＣｏｍＰを注射したマウスのマウスＩｇＭ抗体およびマウスＩｇＧ抗体に対するものであった。次いで、発色基質ＴＭＢによる処理を実施した。ＨＲＰコンジュゲートマウスＩｇＧ抗体で調べたマウスの血清では、非グリコシル化タンパク質を注射したマウスと比較して６５０ｎｍでの吸光度値の増大がみられた。 免疫応答を表すグラフである。パネル（Ａ）は、マウス血清に対する全細胞ＥＬＩＳＡのデータをまとめて示したものである。パネル（Ｂ）は、ＴＭＢ処理陰性対照（一次抗体無し）または陽性対照（肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１４の莢膜多糖体に対する市販のウサギ抗体）のウェルの６５０ｎｍでの吸光度値を示したものである。 観察されたＩｇＧ免疫応答が肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１４由来のＣＰＳに対するものであることを示す図である。マウス血清、次いで二次蛍光マウス抗ＩｇＧ抗体を用いて肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１４のＣＰＳの発現を調べた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＬＭ３７から得たＬＰＳのウエスタンブロット解析。（Ａ）非グリコシル化タンパク質を注射した陰性対照マウスの血清はＣＰＳに対する反応を示さなかった。（Ｂ）ＣＰＳコンジュゲートＣｏｍＰに感作させたマウスから採取しＥＬＩＳＡプレートで反応させた血清は、ウエスタンブロットでＣＰＳに対する反応を示した。陽性対照として市販の抗ＣＰＳウサギ抗体を用いた。 現時点でＣｊＰｇｌＢおよびＮｍＰｇｌＬによってアクセプタータンパク質に転移されることがわかっているグリカンをＰｇｌＬ_ＣｏｍＰと比較してまとめたものを示す図である。 Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１ ＷＴ、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１およびＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ｃｏｍＰにジメチル標識を用いたグリコシル化の定量解析を示す図である。ジメチル標識およびＺＩＣ−ＨＩＬＩＣを用いて、個々の糖ペプチドのグリコシル化を担うＯ−ＯＴａｓｅを確認した。Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１ ＷＴに由来し軽い標識で標識された糖ペプチドとＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ｃｏｍＰに由来し重い標識で標識された糖ペプチドがほぼ１：１のレベルで観察されたのに対し、中間の重さの標識で標識されたＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１の糖ペプチドは試料中に検出されなかった。これとは逆に、非グリコシル化ペプチドは全３種類の菌株にほぼ１：１：１のレベルで観察された。ＡおよびＤ）糖ペプチド１１３ＫＬＡＥＰＡＡＳＡＶＡＤＱＮＳＰＬＳＡＱＱＱＬＥＱＫ１３８（Ｑ６Ｆ８２５＿ＡＣＩＡＤ）および非グリコシル化ペプチド１６６ＡＱＳＶＡＮＹＬＳＧＱＧＶＳＳＳＲ１８２（Ｑ６ＦＤＲ２＿ＡＣＩＡＤ）の軽い同位体置換分子、中間の重さの同位体置換分子および重い同位体置換分子のＭＳスペクトルによって、全３種類の菌株のグリコシル化を比較することができた。ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１では、糖ペプチドは観察されなかったが、非グリコシル化ペプチドはほぼ１：１：１の比で観察された。ＢおよびＥ）軽い同位体置換分子、中間の重さの同位体置換分子および重い同位体置換分子の抽出イオンクロマトグラムを比較することにより、ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１由来糖ペプチドが存在せず、非グリコシル化ペプチドが１：１：１の比であることが裏付けられる。Ｃ）糖ペプチド１１３ＫＬＡＥＰＡＡＳＡＶＡＤＱＮＳＰＬＳＡＱＱＱＬＥＱＫ１３８の重い同位体置換分子の同定を裏付け、同分子がＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ｃｏｍＰに由来することを裏付けるＨＣＤ断片化。Ｆ）非グリコシル化ペプチド１６６ＡＱＳＶＡＮＹＬＳＧＱＧＶＳＳＳＲ１８２の中間の重さの同位体置換分子の同定を裏付け、同分子がＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１に由来することを裏付けるＨＣＤ断片化。 （Ａ）Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＴＣＣ１７９７８および（Ｂ）Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＴＣＣ１９６０６のＯＴａｓｅ（１つまたは複数）のゲノム構造を示す図である。 Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１で同定された定量的糖ペプチドを示す図である。 Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１で同定された定量的糖ペプチドを示す図である。

（詳細な説明）
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はいずれも、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。

本明細書および請求項で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の意味を表す場合を除き、複数形の指示対象を包含する。

本明細書で使用される「含む」という用語は、後に列挙されるものが非網羅的なものであり、必要に応じて、ほかにも任意の適切な追加の項目、例えば１つまたは複数のさらなる特徴（１つまたは複数）、構成要素（１つまたは複数）および／または成分（１つまたは複数）が含まれても、含まれなくてもよいことを意味することが理解されよう。

配列決定されたアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌種のゲノムの解析（遺伝情報の解明）から、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属には、ＯＴａｓｅを２種類コードする菌株がＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１に加えて複数存在することが明らかになっている。本願では、ＯＴａｓｅは２種類とも機能的であり、その一方の酵素がピリン特異的ＯＴａｓｅとして作用するのに対し、もう一方のＯＴａｓｅは多岐にわたるタンパク質をグリコシル化することが可能であったことを示す遺伝学的技術およびプロテオミクス技術を提供する。さらに、質量分析を用いて、Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株のグリカン構造の特徴を明らかにし、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）のグリコプロテオームを明らかにした。

近年、細菌のグリコシル化経路が多数確認されている。用いる経路に関係なく、グラム陰性、グラム陽性菌ともにＮ−グリカンおよびＯ−グリカンの両方が細胞表面アドヘジンを修飾する場合が多い。グリコシル化された表面結合タンパク質の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＡＩＤＡ−ＩおよびＴｉｂＡのＯ−グリコシル化（Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕら，２００７；Ｃｏｔｅら，２０１３）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ディケロバクター・ノドーサス（Ｄｉｃｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｎｏｄｏｓｕｓ）およびフランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｓｉｃｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）のＩＶ型ピリン（Ｃａｓｔｒｉｃら，１９９５、Ａａｓら，２００６；Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒら，２００７、Ｖｏｉｓｉｎら，２００７、Ｃａｇａｔａｙら，２００８、Ｅｇｇｅ−Ｊａｃｏｂｓｅｎら，２０１１）、複数の細菌種のフラジェリン（ＮｏｔｈａｆｔおよびＳｚｙｍａｎｓｋｉ，２０１０；Ｉｗａｓｈｋｉｗら，２０１３）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）菌種のセリンリッチアドヘジン（ＺｈｏｕおよびＷｕ，２００９）ならびにヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｇｒｏｓｓら，２００８）およびアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）（ＴａｎｇおよびＭｉｎｔｚ，２０１０）のＨＭＷＧのＮ−グリコシル化が挙げられる。医学的に重要なＡｃｂメンバーも例外ではなく、これまでの研究のほか本願でも、ピリンおよび複数の外膜タンパク質がＯ−グリコシル化され、細菌集団内での宿主細胞への付着または非生物表面への付着に有利になり得ることを示す。しかし、これまでのところ、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）のピリンサブユニットのグリコシル化が担う生物学的役割は明らかにされていない。特に、Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株ΔｔｆｐＯ：：ｋａｎ変異株は、親菌株と同程度に形質転換が可能であり（図３Ｃ）、親菌株と同じ収縮運動表現型を示したほか、表面４２８露出ＰｉｌＡも同レベルで含まれていた（データ不掲載）。このほか、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１が非生物表面に付着したり、バイオフィルムを形成したりする条件は明らかにされていない。

既に記載したように、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびＰ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）では、それぞれＰｉｌＯおよびＴｆｐＯを介するピリングリコシル化が運動性、バイオフィルム形成および毒性に不可欠なものであった（Ｓｍｅｄｌｅｙら，２００５；Ｎｇｕｙｅｎら，２０１２）。ピリングリコシル化は、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）（Ｐｏｒｓｔｅｎｄｏｒｆｅｒら，２０００）でもＡ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）でも、天然のコンピテンスに影響を及ぼすことはなかった（図３Ｃ）。とはいえ、Ｏ結合タンパク質のグリコシル化がアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に遍在するという性質から、この翻訳後修飾には重要ではあるが未だ明らかにされていない役割があることが示唆される。

本明細書に記載されるように、一部のアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌株はＯＴａｓｅホモログを２種類コードし、そのうちの一方は一般的なＯ−グリコシル化を必要とするものであり、もう一方はピリンを特異的に修飾するものである。Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株を含めた医学的に重要なアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌株の大部分は、ＩＶａ型主要ピリンサブユニット遺伝子のすぐ下流に位置する連続した２種類のＯＴａｓｅをコードする。本出願の時点で、全ゲノムを有するＡ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）分離株の７６％がカルボキシ末端セリンを含むＰｉｌＡタンパク質をコードしていた。カルボキシ末端セリンを有するＰｉｌＡタンパク質をコードする遺伝子を含む分離株はいずれも、ｐｉｌＡのすぐ下流にあるｔｆｐＯホモログもコードしている。この知見は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）にみられるグループＩピリン（ＰｉｌＡＩ）で報告されている知見（Ｋｕｓら，２００４）と一致する。したがって、ピリン遺伝子には複数の系統、具体的には、カルボキシ末端セリンを有するＰｉｌＡをコードする対立遺伝子と下流のアクセサリー遺伝子ｔｆｐＯとを含む系統およびＴｆｐＯ様活性によってグリコシル化されない系統があるものと思われる。ＡＴＣＣ１７９７８を含めた主要ピリンタンパク質にカルボキシ末端セリンがない分離株はいずれもｔｆｐＯホモログをコードせず、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）のピリン系統が別々に進化したことと一致する。

医学的に重要なアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌種のＯＴａｓｅが連続して構成されているのに対し、環境分離株Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１の２種類のＯＴａｓｅは染色体上の遠く離れた位置にある。Ｓｃｈｕｌｚら（２０１３）は、ｃｏｍＰに隣接してコードされるＯＴａｓｅホモログのｐｇｌＬ_ＣｏｍＰがＣｏｍＰ修飾を担っていることを明らかにした。ｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化アッセイと組み合わせた変異解析およびグリコプロテオームの特徴付けから、ｐｇｌＬ_ＣｏｍＰがＣｏｍＰ特異的ＯＴａｓｅであることがわかっている。一方、２つ目のＯＴａｓｅであるＰｇｌＬ_ＡＤＰ１は、以前示唆されたＯ抗原リガーゼではなく、複数のタンパク質標的をグリコシル化する汎用Ｏ−ＯＴａｓｅである。

本願には、Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２がＯｍｐＡ−Ｈｉｓをグリコシル化することが可能であることから、Ｍ２１５＿１０４７５がコードするＰｇｌＬＭ２は、他のあらゆるＡ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）菌株にみられる汎用Ｏ−ＯＴａｓｅであるＰｇｌＬが認識するものと同じモチーフを認識することが可能であることを記載する。Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株のＰｇｌＬＭ２およびＴｆｐＯＭ２はともに、その標的タンパク質を修飾するのに同じ脂質結合四糖を用いる。本願には、ＰｇｌＬＭ２がグリカンの２つのサブユニットを転移させることが可能であったのに対し、ＴｆｐＯＭ２は単一のグリカン鎖のみを転移させたことを記載する。これまでの研究では、汎用ＯＴａｓｅによってグリカンの２つのサブユニットが転移され（Ｓｃｏｔｔら，２０１４）、ＴｆｐＯは長い糖鎖を緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ピリンに転移させることができない（Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒら，２００７）ことが明らかにされている。さらに、ＭＰＡ遺伝子座は、共通の脂質結合四糖の合成を担うタンパク質をコードする遺伝子の供給源であることが確認されている。図１０に、ＭＰＡクラスターによってＯ−グリカンが合成されることおよびＴｆｐＯＭ２とＰｇｌＬＭ２がこの脂質結合グリカンを共通に用いていることを図示する例示的なモデルを示す。

これまでに多数のタンパク質グリコシル化系が確認されているが、Ｏ−ＯＴａｓｅ、例えばＡ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）菌種およびバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）菌種のＯ−ＯＴａｓｅなどがそのタンパク質標的のアクセプター配列を認識する仕組みは未だ明らかにされていない。ＯＴａｓｅがセリン、アラニンおよびプロリンに富む低複雑性領域（ＬＣＲ）を認識することが確認されている（Ｖｉｋら，２００９）。ここに記載されているピリン特異的ＴｆｐＯ酵素は、セリン残基およびプロリン残基を多数含む約１５個のアミノ酸からなるペプチドを認識する。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＴｆｐＯと同じように、本願によれば、ＰｉｌＡＭ２のカルボキシ末端セリンがＴｆｐＯＭ２依存性グリコシル化の部位としての役割を果たすことがうかがえる。これまでにＰｇｌＬ−汎用ＯＴａｓｅおよびピリン特異的ＯＴａｓｅといった２種類の機能的Ｏ−ＯＴａｓｅを有する細菌種は確認されていない。ＴｆｐＯはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）にみられる唯一のＯＴａｓｅであり（Ｓｍｅｄｌｅｙら，２００５；Ｎｇｕｙｅｎら，２０１２）、ＰｇｌＬはＮｅｉｓｓｅｒｉａ（Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒら，２００７）、Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＴＣＣ１７９７８（Ｉｗａｓｈｋｉｗら，２０１２）、Ｂ．セノセパシア（Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）Ｋ５６−２（Ｌｉｔｈｇｏｗら，２０１４）および青枯病菌（Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）（Ｅｌｈｅｎａｗｙら，ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ）で確認されている唯一のＯＴａｓｅである。コレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）ではＯ−ＯＴａｓｅと考えられるものが３種類確認されているが、このうち大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で活性が示されたのは１種類のみであり（Ｇｅｂｈａｒｔら，２０１２）、糖タンパク質はコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）では確認されていない。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）および淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）では、ＯＴａｓｅのＰｇｌＬがピリンおよび数種類の他のタンパク質をグリコシル化することが可能である（Ａａｓら，２００６；Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒら，２００７）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で系を再構築させると、ＰｇｌＬはピリンの３つのグリコシル化部位を認識することができるが、その部位のうち残りのナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）糖タンパク質にみられる典型的なＬＣＲドメインを含むものはなく、ＰｇｌＬが２つ以上のモチーフを認識し得ることがわかる（Ｍｕｓｕｍｅｃｉら，２０１４）。

フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）菌種では、ＯＴａｓｅはＰｉｌＯ／ＴｆｐＯと近縁であり、ピリングリコシル化および一般的なグリコシル化の両方担っているものと思われる（Ｂａｌｏｎｏｖａら，２０１２）。Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）の一部の病原性菌株は、最適なバイオフィルム形成および毒性に必要なＰｇｌＬを１種のみ有することから、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌株がピリンをはじめとするタンパク質をグリコシル化するのに２種類の異なるＯＴａｓｅを必要とする理由は未だ明らかにされていない（Ｉｗａｓｈｋｉｗら，２０１２）。非病原性Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１もＯ−ＯＴａｓｅを２種類有することに留意することが重要である。しかし、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）のＣｏｍＰ特異的ＯＴａｓｅであるＰｇｌＬ_ＣｏｍＰおよび医学的に重要なアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌種のピリン特異的ＯＴａｓｅであるＴｆｐＯとの間にはいくつか違いがある両ＯＴａｓｅともそのコグネイトタンパク質アクセプターのすぐ下流にコードされている（図１のパネルＡおよびＣ）が、カルボキシ末端のセリンがアラニンになっている点変異株はグリコシル化ピリンを産生することができなかったことから、ＴｆｐＯ ＯＴａｓｅはＰｉｌＡに存在するカルボキシ末端セリンに特異的であるとする仮説が立てられる。ｔｆｐＯ遺伝子ホモログをコードするアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）の菌株はいずれも、それぞれのＰｉｌＡ配列にカルボキシ末端セリンも含まれているのは興味深い。さらに、本願では、試験した各ｔｆｐＯコード菌株によってＰｉｌＡＭ２が修飾された（図９Ａ）ことから、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）ＴｆｐＯホモログには機能的に互換性があることがわかる。ＰｉｌＡＭ２の電気泳動移動度に差があるのは、これらの菌株間でグリカンが異なっていることに起因する可能性がある（Ｓｃｏｔｔ，ら，２０１４）。

ＣｏｍＰグリコシル化の部位は特定されていないが、ＣｏｍＰがカルボキシ末端セリンも翻訳後修飾に関連するいかなるカルボキシ末端残基も含まないことから、内部残基にあると予想される。このほか、ＣｏｍＰ特異的ＯＴａｓｅのＢＬＡＳＴ解析から、ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰがＴｆｐＯよりも汎用ＯＴａｓｅであるＰｇｌＬＭ２に近縁であることが明らかになった。ピリン特異的ＴｆｐＯ ＯＴａｓｅはカルボキシ末端セリンを含む様々なピリンを交差的にグリコシル化することが可能であったが、ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰはＴｆｐＯによって認識されるピリンをグリコシル化することができなかった。

本願によれば、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）には３種類の異なるクラスのＯＴａｓｅ、つまり、カルボキシ末端セリン残基を含むピリンをグリコシル化するピリン特異的ＴｆｐＯ酵素、複数のタンパク質のＬＣＲを認識する汎用ＰｇｌＬ ＯＴａｓｅおよびもっぱらＣｏｍＰのグリコシル化を担うと思われるＰｇｌＬ_ＣｏｍＰが存在する。これらの酵素は生化学的特徴が異なっており、生物工学に応用される新規な複合糖質の合成に関する有用な情報が得られる。これらの酵素間の差はわずかなものとは言えず、ｐｆａｍドメインの存在だけで正確に予測できるものではない。例えば、配列類似性が最も高く、機能的にも相同ではあるものの、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）１２４４菌株のＰｉｌＯ／ＴｆｐＯにはｐｆａｍ０４９３２ドメインが含まれているのに対し、Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株のｔｆｐＯにはｐｆａｍ１３４２５ドメインが含まれている。さらに、Ｍ２菌株およびＡ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＴＣＣ１７９７８を含めた医学的に重要なアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌種の汎用ＰｇｌＬ ＯＴａｓｅにはｐｆａｍ０４９３２ファミリーのドメインが含まれており、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）の汎用ＰｇｌＬ_ＡＤＰ１ ＯＴａｓｅにはｐｆａｍ１３４２５ドメインが含まれている。問題をさらに複雑にしているのが、医学的に重要なアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌種の汎用ＰｇｌＬ ＯＴａｓｅとＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）のＣｏｍＰ特異的ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰは同じｐｆａｍ０４９３２ドメインを含んでいるが、認識するシークオンが異なるという事実である。さらに、このｐｆａｍドメインはＷａａＬ Ｏ抗原リガーゼに存在する。バイオインフォマティクス解析は、最初にグリカン転移事象に関与することが予想されるタンパク質をコードするＯＲＦをその位置とともに特定するのに強力なツールとなり得るが、本願は、バイオインフォマティクスによって同定したＯ−ＯＴａｓｅの活性を実験的に求める必要があり、これにより細菌Ｏ−ＯＴａｓｅの複雑で興味深い進化の道筋が明らかになるという考えを補強するものである。

本願によれば、既知のＯＴａｓｅとは異なり、ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰを用いて、還元末端にグルコース残基を含む莢膜多糖体をＣｏｍＰなどの担体タンパク質に効率的に結合させることができる。このような莢膜はストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属によくみられるものである。肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のＣｏｍＰおよび莢膜多糖体を発現するプラスミドの存在下で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にＰｇｌＬ_ＣｏｍＰを発現させたところ、前記多糖体によるＣｏｍＰのグリコシル化がみられた。この糖タンパク質をマウスに注射したところ、莢膜多糖体に対する特異的ＩｇＧ免疫応答が生じ、ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰをストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に対する組換えコンジュゲートワクチンの作製に応用可能であることが示された。

本明細書に記載される本発明がさらに理解されるように、以下の実施例を記載する。これらの実施例は単に例示を目的とするものであることを理解するべきである。したがって、これらがいかなる形でも本発明の範囲を限定することがあってはならない。

実施例１：
材料および方法
菌株、プラスミドおよび増殖条件。
本明細書で使用した細菌株およびプラスミドを以下に挙げる。

特に言及されない限り、いずれの細菌もＬ寒天またはＬＢブロスで３７℃にて増殖させた。必要に応じて、Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）またはＡ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）の培養物に抗生物質を添加し、その濃度は特に言及されない限り以下の通りであった：１００μｇアンピシリン／ｍＬ，２０μｇカナマイシン／ｍＬまたは１２．５μｇクロラムフェニコール／ｍＬ。必要に応じて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物に抗生物質を以下の濃度で添加した：ｐＧＥＭ誘導体以外のプラスミドを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株に５０μｇアンピシリン／ｍＬ、ｐＧＥＭ誘導体を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株に１００μｇアンピシリン／ｍＬ、または２０μｇカナマイシン／ｍＬ。青枯病菌（Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）はＢＧ培地で３０℃にて増殖させた（Ｂｏｕｃｈｅｒら，１９８５）。

アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）ＯＴａｓｅのバイオインフォマティクス解析。
ＮＣＢＩのＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を用いてアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）特異的ＯＴａｓｅのタンパク質配列を解析し、タンパク質のアノテーションにＣｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅを用いてタンパク質ドメインを同定した（Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒら，２００４、Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒら，２００９、Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒら，２０１１）。

ｐｉｌＡのインフレーム欠失を有する菌株の作製。本発明者らのグループが既に公開した方法論（Ｈａｒｄｉｎｇら，２０１３）に従い、ｐｉｌＡのインフレーム欠失を生じさせてΔｐｉｌＡ変異株を構築した。プライマーセット１および２を使用し、これらは補足資料のプライマーの表に記載されている。

ｔｆｐＯ：：ｋａｎ変異株の構築。ｔｆｐＯ：：ｋａｎ変異株は既に構築されている（Ｈａｒｄｉｎｇら，２０１３）が、当時の遺伝子の名称はｔｆｐＯ遺伝子ではなくｐｇｙＡ遺伝子であった。

ΔｔｆｐＯ：：ｋａｎ変異株の補完。ΔｔｆｐＯ：：ｋａｎ変異株を補完するため、ｔｆｐＯ遺伝子を予測ｐｉｌＡプロモーターとともに、既に記載したミニＴｎ７エレメントにクローン化した。簡潔に述べれば、ΔｐｉｌＡ変異株由来のｇＤＮＡを鋳型とし、プライマーセット３とともに用いて、予測ｐｉｌＡプロモーター、ｐｉｌＡオープンリーディングフレームの開始コドンＡＴＧ、ＦＬＰ痕、ｐｉｌＡの最後の２１ｂｐ、５３ｂｐの遺伝子間領域およびｔｆｐＯオープンリーディングフレーム全体を含むアンプリコンを作製した。既に記載されている通りに、４ペアレンタルメイティング戦略を用いて、予測ｐｉｌＡプロモーターから離れたところで駆動されるｔｆｐＯを含むミニＴｎ７エレメントをΔｔｆｐＯ：：ｋａｎ変異株に導入した（Ｈａｒｄｉｎｇら，２０１３）。シーケンシングによって正しいクローンを検証し、ｔｆｐＯ＋補完と命名した。

プラスミドの構築および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）への移入。プライマーセット４を用いてＭ２菌株由来のｐｉｌＡ遺伝子をＰＣＲによりｇＤＮＡから増幅し、ｐＷＨ１２６６のＥｃｏＲＶ部位にクローン化した。制限消化およびシーケンシングによりｐＷＨ−ｐｉｌＡＭ２プラスミドを含む正しいクローンを検証した。プラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からｐＷＨ−ｐｉｌＡＭ２を精製し、次いでアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）分離株内にエレクトロポレートした。既に記載されている方法（Ａｒａｎｄａら，２０１０）に従ってアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）分離株をエレクトロコンピテントにした。プライマーセット３２を用いてｐＢＡＶ−ｃｏｍＰ−Ｈｉｓプラスミドを構築した。付着末端アンプリコンをそれぞれの制限酵素で消化し、ベクターｐＢＡＶｍｃｓの同じ部位にライゲートした。次いで、ライゲート産物をＤＨ５α−Ｅ内にエレクトロポレートし、カナマイシンを添加したＬ寒天プレート上で形質転換細胞を選択した。プライマーセット３３、３４、３５および３６を用いて、それぞれｐＥＸＴ−ｐｇｌＬ_ＣｏｍＰ、ｐＥＸＴ−ｐｇｌＬ_ＡＤＰ１、ｐＥＸＴ−ｔｆｐＯ１９６０６およびｐＥＸＴ−ｐｇｌＬ１９６０６のプラスミドを構築した。得られたアンプリコンをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、ｐＥＸＴ２０の同じ部位に挿入した。ライゲート産物をＤＨ５α−Ｅ内にエレクトロポレートし、アンピシリンを添加したＬ寒天プレート上で形質転換細胞を選択した。

ｐＷＨ−ｐｉｌＡ１７９７８−Ｈｉｓの構築およびウエスタンブロット解析。プライマーセット３７を用いてＡ．バウマニイ（Ａ．ｂａｕｍａｎｉｉ）ＡＴＣＣ１７９７８由来のｐｉｌＡ対立遺伝子をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、Ｅｎｄ−ｉｔで修復して５’末端をリン酸化した。ベクターｐＷＨ１２６６をＥｃｏＲＩで直線化し、Ｅｎｄ−ｉｔで修復した後、アルカリホスファターゼで処理した。直線化したｐＷＨ１２６６とＰＣＲで精製したｐｉｌＡ対立遺伝子をライゲートし、ＤＨ５α内に形質転換し、アンピシリンを添加したＬ寒天上で形質転換細胞を選択した。ｐＷＨ−ｐｉｌＡ１７９７８プラスミドをシーケンシングにより検証し、これを逆ＰＣＲの鋳型とし、プライマーセット３８を用いてＣ末端ヘキサ−ヒスチジンタグを付加した。ＰＣＲ産物を精製し、ＤｐｎＩで処理し、Ｅｎｄ−ｉｔで修復した後、ライゲートした。ライゲーション産物をＤＨ５α内にエレクトロポレートし、アンピシリンを添加したＬ寒天プレート上で形質転換細胞を選択した。本発明者らが既に記載したＡ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株を形質転換させる方法に従って、ｐＷＨ−ｐｉｌＡ１７９７８−Ｈｉｓを既に記載したＡ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）菌株内にエレクトロポレートし、自然にＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）菌株に形質転換させた。アンピシリンを添加したＬ寒天上でアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）の形質転換細胞を選択した。以下に記載する点を除き、上記の通りに全細胞溶解物のウエスタンブロット解析を実施した。菌株はＮａＣｌを含まないＬＢブロスで増殖させ、ＯＤ６００＝２．０に正規化した。

Ｍ２菌株のΔｐｇｌＬ：：ｋａｎ変異株の構築。プライマーセット６を用いて、Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株由来のｐｉｌＡ−ｔｆｐＯ−ｐｇｌＬ遺伝子座全体を約１ｋｂの隣接ＤＮＡとともに増幅した。ＰＣＲ産物をｐＣＣ１（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）にライゲートし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＰＩ３００内に形質転換した。制限消化およびシーケンシングによりｐＣＣ１−ｐｉｌＡ−ｔｆｐＯ−ｐｇｌＬベクターを含む正しいクローンを検証した。ｐｇｌＬ遺伝子をカナマイシンカセットで置換するため、既に記載されている改変リコンビニアリングプロトコル（Ｈａｒｄｉｎｇら，２０１３）を用いた。Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株に変異を導入するため、プラスミドｐＣＣ１−Δｐｇｌ：：ｋａｎを直線化し、自然形質転換により形質転換させた。カナマイシンを添加したＬ寒天上で形質転換細胞を選択した。変異株のＭ２ΔｐｇｌＬ：：ｋａｎ領域をシーケンシングにより検証した。

Ｍ２菌株のｐｉｌＡに点変異を有する菌株の作製。Ｍ２菌株のｐｉｌＡ遺伝子にカルボキシ末端のセリンからアラニンへの点変異を有する菌株を作製するため、カルボキシ末端のセリンがアラニンに変異したｐｉｌＡ対立遺伝子のバリアントを含むミニＴｎ７エレメント（ｐＲＳＭ３５１０−ｐｉｌＡ［Ｓ１３６Ａ］）でＭ２ΔｐｉｌＡ変異株を補完した。Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を製造業者のプロトコルに従って用い、プライマーセット８を用いてｐＲＳＭ３５１０−ｐｉｌＡ［Ｓ１３６Ａ］プラスミドを構築した。制限消化およびシーケンシングによりｐＲＳＭ３５１０−ｐｉｌＡ［Ｓ１３６Ａ］プラスミドを保有する正しいクローンを検証した。既に上に記載した４ペアレンタルメイティング戦略により、ｐｉｌＡ［Ｓ１３６Ａ］対立遺伝子を含むミニＴｎ７構築物をＭ２菌株のａｔｔＴｎ７内に転位させた。プライマーセット３９を用いた以外は同じプロトコルを用いてｐｉｌＡ［Ｓ１３２Ａ］を作製した。

Ｍ２菌株バックグラウンドのグリコシルトランスフェラーゼ変異株の作製。各グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子をカナマイシン耐性カセットで置換するため、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＥｃｏＤｒｙクローニングキットを製造業者のプロトコル（ＣｌｏｎＴｅｃｈ社）に従って用いた。各グリコシルトランスフェラーゼ変異株にはＭ２ΔｗｅｅＨ：：ｋａｎ変異の構築を説明した以下のプロトコルを用いた。ただし、それぞれの遺伝子の５’隣接領域および３’隣接領域を増幅したプライマーに１５ｂｐのオーバーハングを付加した。簡潔に述べれば、ｗｅｅＨ付近の隣接ＤＮＡ領域の上流および下流をそれぞれプライマーセット９および１０を用いてＰＣＲで増幅した。Ｔｎ５カナマイシンカセットおよびｐＧＥＭベクターを、それぞれプライマーセット１１および１２を用いて組み換えるＤＮＡに相同な１５ｂｐのオーバーハングとともにＰＣＲで増幅した。ＰＣＲアンプリコンをゲル抽出し、エタノールで沈殿させた。各産物１００ナノグラムをＩｎ−ｆｕｓｉｏｎ ＥｃｏＤｒｙクローニングチューブに製造業者のプロトコルに従って加え、３７℃で１５分間、次いで５０℃で１５分間インキュベートした。新たに作製したベクターを化学的にコンピテントなＳｔｅｌｌａｒ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）内に製造業者のプロトコルに従って形質転換させた。カナマイシンを添加したＬ寒天プレート上で形質転換細胞を選択した。ｐＧＥＭ−ｗｅｅＨ：：ｋａｎプラスミドを含む正しいクローンの配列を検証した。ｗｅｅＨ：：ｋａｎカセットをプライマーセット９の順方向プライマーおよびプライマーセット１０の逆方向プライマーを用いてＰＣＲで増幅した。アンプリコンをＤｐｎＩで処理し、エタノールで沈殿させた後、既に公開されている方法論に従ってＭ２菌株内に形質転換した。Ｍ２ΔｗｅｅＨ：：ｋａｎと命名される正しいクローンの配列を検証した。

プライマーセット１７および１８を用いてｗａｆＹの上流および下流の領域を増幅し、直線化したｐＧＥＭをプライマーセット１５を用いて増幅し、カナマイシンカセットをプライマーセット１６で増幅した。上記のプロトコルを用いて全４種類のＰＣＲ産物にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎを実施した。ｐＧＥＭ−ｗａｆＹ：：ｋａｎをＥｃｏＲＩで直線化し、既に記載した自然形質転換によりＡ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株に導入した。Ｍ２ｗａｆＹ：：ｋａｎと命名される正しいクローンの配列を検証した。

プライマーセット１９および２０を用いてｗａｆＺの上流および下流の領域を増幅し、プライマーセット２１および２２を用いてｗａｇＢの上流および下流の領域を増幅した。次いで、ｗａｆＹ変異株について記載した通りに変異株を構築した。Ｍ２ΔｗａｆＺ：：ｋａｎおよびＭ２ ｗａｇＢ：：ｋａｎと命名されるクローンを同定し、配列を検証した。

ｐＲＳＭ４０６３の構築。ｐＲＳＭ４０６３ベクターを作製するため、最初に空のミニＴｎ７エレメントを既に記載した４ペアレンタルメイティング戦略によりＭ２菌株に導入した。空のミニＴｎ７エレメントのａｔｔＴｎ７内への転位を配列により検証し、Ｍ２菌株ａｔｔＴｎ７：：ＭＣＳ＿Ｅｍｐｔｙを得た。この菌株からゲノムＤＮＡを精製し、プライマーセット１３を用いたＰＣＲの鋳型として使用した。プライマーセット１３の順方向プライマーはミニＴｎ７エレメントの約２ｋｂ上流にあり、プライマーセット１３の逆方向プライマーはミニＴｎ７エレメントの約２ｋｂ下流にある。得られたＰＣＲ産物をｐＳＭＡＲＴ−ＬＣＫａｎベクター内にライゲートし、配列を検証し、ｐＲＳＭ４０６３と命名した。

ｗｅｅＨ補完変異株の構築。ｗｅｅＨ：：ｋａｎ変異株を補完するため、プライマーセット１４を用いてｗｅｅＨと３７５ｂｐの上流ＤＮＡをＰＣＲで増幅した。アンプリコンをＸｍａＩおよびＫｐｎＩで消化し、ｐＲＳＭ４０６３にクローン化し、ＤＨ５α内にエレクトロポレートした。ΔｗｅｅＨ：：ｋａｎ変異株を補完するため、ｐＲＳＭ４０６３−ｗｅｅＨをＮｄｅＩで直線化し、既に公開されている手順（Ｈａｒｄｉｎｇら，２０１３）に従って自然形質転換によりＭ２ΔｗｅｅＨ：：ｋａｎに導入した。

ｗａｆＹ補完変異株、ｗａｆＺ補完変異株およびｗａｇＢ補完変異株の構築。各グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を駆動する明らかなプロモーターがなく、オープンリーディングフレームが重複していることを考慮し、３種類の遺伝子の発現をそれぞれ駆動するのに上流ｗｘｙプロモーターを選択した。予測ｗｘｙプロモーターから離れたところで駆動される欠失遺伝子をミニＴｎ７系を用いて染色体に戻すことによって各グリコシルトランスフェラーゼ変異株を補完した。簡潔に述べれば、プライマーセット２３を用いてグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子座をＰＣＲで増幅し、Ｅｎｄ−Ｉｔで修復し（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）、ｐＣＣ１（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）にライゲートした。クロラムフェニコールで形質転換細胞を選択し、ｐＣＣ１−ＧＴプラスミドを制限消化により検証した。ｐＣＣ１−ＧＴプラスミドにはｗｘｙ遺伝子の予測プロモーター（３２９ｂｐ上流）、ｗｘｙ、ｗａｆＹ、ｗａｆＺ、ｗａｇＡ、ｇｎａＢおよびｗａｇＢが含まれていた。

ｗｘｙプロモーター−ｗａｆＹ構築物を作製するため、逆ＰＣＲ戦略にプライマーセット２４および鋳型のｐＣＣ１−ＧＴを用いて、ｗｘｙ遺伝子を除去し、ｗｘｙプロモーターをｗａｆＹ遺伝子の開始コドンＡＴＧに連結した。得られたＰＣＲ産物をＥｎｄ−Ｉｔで修復し（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）、それ自体にライゲートし、ｐＣＣ１−ｗｘｙＰ−ｗａｆＹ構築物を得た。プライマーセット２７を用いて、ＸｍａＩおよびＫｐｎＩの制限オーバーハングが含まれるｗｘｙＰ−ｗａｆＹ ＤＮＡフラグメントをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物を消化し、予め消化したｐＲＳＭ３５１０にライゲートした後、ＥＣ１００Ｄ細胞内に形質転換した。カナマイシンを添加したＬ寒天上で形質転換細胞を選択した。既に記載した４ペアレンタルメイティング戦略を用いて、ｗｘｙＰｗａｆＹを含むミニＴｎ７エレメントをＭ２ΔｗａｆＹ：：ｋａｎ変異株に導入した。

プライマーセット２５およびプライマーセット２８を用いた以外は同じ工程を用いて、ｐＲＳＭ３５１０−ｗｘｙＰ−ｗａｆＹを作製した。４ペアレンタルメイティング戦略によりｗｘｙＰ−ｗａｆＹを含むミニＴｎ７エレメントをＭ２ｗａｆＺ：：ｋａｎ変異株に導入した。プライマーセット２６およびプライマーセット２９を用いてｗｘｙＰ−ｗａｇＢフラグメントを作製したが、ｐＲＳＭ４０６３にクローン化した。ｐＲＳＭ４０６３−ｗｘｙＰ−ｗａｇＢベクターをＸｈｏＩで直線化し、既に記載した自然形質転換によりＭ２ΔｗａｇＢ：：ｋａｎに導入した。

ｐ４０６３−Ａ１Ｓ＿１１９３−５Ｘの構築およびアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌株への移入。プライマーセット３０を用いて、Ｃ末端５×ＨｉｓタグのほかにもＸｍａＩおよびＫｐｎＩの制限オーバーハングを含むように、Ａ１Ｓ＿１１９３オープンリーディングフレームをその予測プロモーターとともにＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物を消化し、予め消化したｐＲＳＭ４０６３にライゲートした。ｐＲＳＭ４０６３−Ａ１Ｓ＿１１９３−５ＸベクターをＸｈｏＩで直線化し、既に記載した自然形質転換によりアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌株に導入した。

ｐＥＴ−１５ｂ−ｒｓＰｉｌ_ＡＭ２の構築。Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株由来のｇＤＮＡを鋳型とし、ＰｉｌＡタンパク質の最初の２８個のアミノ酸を欠失させるプライマーセット３１とともに用いて、ｐｉｌＡの短縮Ｈｉｓタグ化組換え可溶性誘導体（ｒｓＰｉｌＡＭ２）を増幅した。次いでこのＰＣＲ産物を、プライマーセット１５の順方向プライマーがＮｄｅＩ部位を含み、逆方向プライマーがｐＥＴ−１５ｂへの指向性クローン化を補助するＢａｍＨＩ部位を含む第二のＰＣＲの鋳型として使用した。アンプリコンをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化した後、発現ベクターｐＥＴ−１５ｂ内にライゲートし、これをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｔ７プロモーターから離れたところで駆動され、Ｎ末端Ｈｉｓタグの後にトロンビン切断部位が続く第一のコドン融合体を作製した。ライゲーション産物をＤＨ５α−Ｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内にエレクトロポレートし、形質転換細胞をサブクローン化し、制限消化およびシーケンシングによりインサートを有するベクターを含むかどうかを検証した。正しいクローンを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ菌株（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に形質転換し、組換えタンパク質を発現させた。

ｒｓＰｉｌＡＭ２の精製。ｐＥＴ１５ｂ−ｒｓＰｉｌＡＭ２を含むＯｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）をＬＢブロス１００ｍＬにＡ６００ｎｍの吸光度０．０５まで播種し、３７℃、１８０ｒｐｍで対数中期まで増殖させ、その時点で、最終濃度５００μＭのＩＰＴＧでｒｓＰｉｌＡＭ２発現を誘導した。細胞を１８０ｒｐｍで１９℃まで移行させ、１８時間増殖させた。細胞を遠心分離により回収して２つの等しいペレットにし、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ社）を含む１×Ｎｉ−ＮＴＡ Ｂｉｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）４ｍＬ中でそれぞれ分解した。再懸濁したペレットをＴｅｅｎＰｒｅｐ Ｌｙｓｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ Ｂチューブ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）１５ｍＬに加え、Ｆａｓｔ Ｐｒｅｐ ２４ホモジナイザー（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）により６．０ｍ／秒で４０秒間、２ラウンドで溶解させ、各ラウンドの間に氷上での５分間のインキュベーションを実施した。４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間の遠心分離により、溶解していない細菌および溶解マトリックスから上清を分離した。１００，０００×ｇ、４℃で１時間の超遠心分離により上清をさらに清澄化した。清澄化した上清をＮｉ−ＮＴＡ Ｈｉｓ結合レジン（Ｎｏｖａｇｅｎ社）１ｍＬと４℃で２時間、穏やかに振盪しながらインキュベートした後、１×Ｎｉ−ＮＴＡ洗浄緩衝液４ｍＬで２回洗浄した。Ｎｉ−ＮＴＡ溶離緩衝液で３回洗浄してＨｉｓタグｒｓＰｉｌＡ_Ｍ２をレジンから溶離させ、リン酸緩衝生理食塩水で一晩透析した。ｒｓＰｉｌＡＭ２のＮ末端Ｈｉｓタグを０．０４単位／μＬのビオチン化トロンビン（Ｎｏｖａｇｅｎ社）により室温で２時間、トロンビン切断した。ビオチン化トロンビンをストレプトアビジン−アガロースビーズで３０分間捕捉し、５００×ｇで５分間、スピンフィルターで遠心分離してｒｓＰｉｌＡ_Ｍ２を収集した。切断されたＨｉｓタグまたは未切断のＨｉｓタグｒｓＰｉｌＡＭ２を含む小さいペプチドを除去するため、ろ液をＮｉ−ＮＴＡ結合レジンに流し、フロースルーを純粋な切断ｒｓＰｉｌＡ_Ｍ２として収集した。５０％グリセロールを含むリン酸緩衝生理食塩水で純粋なタンパク質を透析した後、ＢＣＡ総タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて１ｍｇ／ｍＬに正規化した。

ｒｓＰｉｌＡＭ２に対するポリクローナル抗血清の作製。本発明者らが既に記載した方法（Ａｃｔｉｓら，１９８５）に従ってｒｓＰｉｌ_ＡＭ２に対するポリクローナル抗血清を作製した。簡潔に述べれば、フロイント完全アジュバント１ミリリットルに乳化させた精製ｒｓＰｉｌ_ＡＭ２１００μｇを６か月齢の雌ニュージーランド白ウサギ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、ウィルミントン、マサチューセッツ州）の臀部の皮内１０か所に２３ゲージ針を用いて注射した。次いで、フロイント不完全アジュバントに乳化させたｒｓＰｉｌ_ＡＭ２１００μｇからなる注射を１５日間隔で実施し、最初の注射から１０日間隔で血清を採取した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質をサイズ分画した後、ｒｓＰｉｌ_ＡＭ２とＡ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株の全細胞溶解物のイムノブロッティングにより、抗ｒｓＰｉｌ_ＡＭ２抗体の特異性および反応性を確認した。

形質転換効率アッセイ。既に記載されている通りに（Ｈａｒｄｉｎｇら，２０１３）、自然形質転換をアッセイした。形質転換細胞のＣＦＵを総ＣＦＵで除することにより形質転換効率を算出した。実験を別個に少なくとも３回実施した。

Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１膜抽出物の定量的ジメチル化。既に概略が記載されている通りに（Ｂｏｅｒｓｅｍａら，２００９）、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１、ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＣｏｍＰ変異株およびＡＤＰ１ｐｇｌＬ_ＡＤＰ１変異株のライセートの定量的ジメチル化を実施した。簡潔に述べれば、各菌株のペプチドライセート１ｍｇを１００ｍＭ臭化テトラエチルアンモニウム３０μｌに再懸濁させ、以下の２００ｍＭホルムアルデヒド（３０μｌ）と１Ｍナトリウムシアノボロヒリド（ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｒｉｄｅ）（３μｌ）同位体置換分子の組合せと混合した：ＡＤＰ１試料を軽いホルムアルデヒド（ＣＨ_２Ｏ）および軽いナトリウムシアノボロヒリド（ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｒｉｄｅ）（ＮａＢＨ_３ＣＮ）で標識し、ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１試料を中間の重さのホルムアルデヒド（ＣＤ_２Ｏ）および軽いナトリウムシアノボロヒリド（ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｒｉｄｅ）で標識し、ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＣｏｍＰを重いホルムアルデヒド（^１３ＣＤ_２Ｏ）および重いシアノ重水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＤ_３ＣＮ）で標識した。試薬を混合し、試料を室温で１時間インキュベートした。アミン基が全部標識されるようにジメチル化反応を２回繰り返した。１Ｍ ＮＨ_４Ｃｌ ３０μｌを室温で２０分間加えることによりジメチル化反応を停止させた。５％（ｖ／ｖ）酢酸を加えることにより試料を酸性化し、暗所で１時間平衡化させた後、３種類の試料を１：１：１の比でプールした。次いで、プールした試料をＳＴＡＧＥチップで精製し、凍結乾燥させ、−２０℃で保管した。

ウエスタンブロット解析。
既に記載されている方法論（Ｈａｒｄｉｎｇら，２０１３）に従ってウエスタンブロット解析を実施した。使用した一次抗体は抗ｒｓＰｉｌＡＭ２またはペンタ−Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社）であった。使用した二次抗体はヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、アルカリホスファターゼ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）およびヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、アルカリホスファターゼ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）であった。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ社）で膜を発色させた。

線毛剪断調製物。
既に記載されているものに以下の修正を加えて線毛剪断調製物を調製した。簡潔に述べれば、寒天表面から菌叢を取り出し、１×プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ社）を添加した氷冷ＤＰＢＳ ５ｍＬに再懸濁させた。細菌懸濁液をＡ６００ｎｍでの吸光度７０に正規化した。表面に露出したタンパク質を剪断するため、細菌懸濁液を高速で１分間ボルテックス処理した。細菌を１０，０００×ｇ、４℃で１０分間ペレット化した。上清を収集し、再び１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を収集し、２０，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離することによりさらに清澄化した。剪断された表面タンパク質を最終濃度３０％の硫酸アンモニウムで沈殿させた。沈殿したタンパク質を２０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離することによりペレット化した。上清を捨て、ペレットを１×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液１００μＬに再懸濁させた。調製物を１０分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、クーマシー染色を実施し、バンドを切り出し、Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏら（２００６）に従って質量分析用に調製した。簡潔に述べれば、バンドを水で洗浄し、アセトニトリル（ＡＣＮ）で繰り返し脱水した。ジスルフィド結合を３７℃で６０分間、５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３に溶かした１０ｍＭ ＤＴＴで還元した後、室温の暗所で６０分間、５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３に溶かした５０ｍＭヨードアセトアミドでシステインチオール基をアルキル化した。次いで、ゲル片を５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３で洗浄し、１００％ＡＣＮで脱水し、乾燥させた。ピリンを３７℃で１６時間、５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３に溶かした０．０２ｍｇ／ｍＬトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で消化した。１００％ＡＣＮおよび水でペプチドを溶離し、凍結乾燥させた。トリプシンペプチドを０．１％トリフルオロ酢酸に再懸濁させ、Ｃ１８ ＺｉｐＴｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、米国）で脱塩した。６０％ＡＣＮを用いてペプチドを溶離し、これをｓｐｅｅｄｖａｃで乾燥させ、０．１％ギ酸に再懸濁させた。既に記載されている通りに（Ｗａｎｇら，２００７）、ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ（Ｗａｔｅｒｓ社）超高速液体クロマトグラフィーシステムと接続したＱ−ＴＯＦ Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｗａｔｅｒｓ社、マンチェスター、イギリス）を用いて解析を実施した。ＭａｓｓＬｙｎｘ、ｖ．４．１（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いてデータを解析した。Ｍ２菌株からＯｍｐＡ−Ｈｉｓを精製し、上記のようにＥＳＩ−ＱＴＯＦ ＭＳ／ＭＳ解析用に調製した。

ＬＰＳの抽出および銀染色
既に記載されているＴＲＩ試薬法（ＹｉおよびＨａｃｋｅｔｔ，２０００）により、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）および青枯病菌（Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）のＬＰＳを一晩培養物から抽出した。既に記載されている通りに（ＴｓａｉおよびＦｒａｓｃｈ，１９８２）、等量のＬＰＳを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷してＬＰＳを分離した後、銀染色を実施した。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＤｓｂＡ１グリコシル化
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＬＭ２４細胞を３種類のプラスミド、すなわち、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のグリコシル化遺伝子座をコードするプラスミド、単一のＯ−ＯＴａｓｅ遺伝子をコードするプラスミドおよびｄｓｂＡ１−ＨｉｓをコードするプラスミドｐＡＭＦ２２で形質転換した。プラスミドを選択するため、必要に応じてアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、トリメトプリム（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）を添加した。細胞を３７℃でＯＤ６００が０．４〜０．６になるまで増殖させ、次いで０．１ｍＭ ＩＰＴＧおよび／または０．２％アラビノースで誘導した。アラビノース誘導を必要とする培養物には、４時間後に２回目の誘導を実施した。定常期に全細胞溶解物を入手し、ウエスタンブロット解析を用いてＤｓｂＡ１の修飾を判定した。

Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１の膜濃縮試料の消化
若干修正を加えたＬｉｔｈｇｏｗら（２０１４）に従って、糖ペプチド濃縮および定量解析に供するペプチドライセートを調製した。簡潔に述べれば、乾燥させた膜濃縮タンパク質試料２ｍｇを６Ｍ尿素、２Ｍチオウレア、４０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３で可溶化し、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元した。還元し可溶化したペプチドを光の不在下、２５ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で１時間アルキル化した。得られたアルキル化タンパク質混合物を２５℃で４時間、Ｌｙｓ−Ｃ（１／１００ ｗ／ｗ）で消化し、４０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３で１：５に希釈した後、２５℃で一晩、トリプシン（１／５０ ｗ／ｗ）で消化した。１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えて消化を停止させた。Ｃ１８ ｅｍｐｏｒｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州）ＳＴｏｐ Ａｎｄ Ｇｏ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ＳＴＡＧＥ）チップ（Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒら，２００７）を用いて一級アミドおよび塩を除去し、ペプチド消化物を精製した。

ＺＩＣ−ＨＩＬＩＣ精製を用いたＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１糖ペプチドの濃縮
若干修正を加えた（Ｓｃｏｔｔら，２０１１）に従ってＺＩＣ−ＨＩＬＩＣ濃縮を実施した。１ｍｍ^２に切り取ったＣ８ Ｅｍｐｏｒｅ（商標）ディスク（Ｓｉｇｍａ社）を含むｐ１０チップに充填した１０μｍ ＺＩＣ−ＨＩＬＩＣレジン（Ｓｅｑｕａｎｔ社、ウメオ、スウェーデン）からなるマイクロカラムをベッド長が０．５ｃｍになるまで充填した。使用前、カラムを超純水、次いで９５％アセトニトリル（ＡＣＮ）で洗浄し、次いで８０％ＡＣＮおよび５％ギ酸（ＦＡ）で平衡化した。試料を８０％ＡＣＮ／５％ＦＡに再懸濁させ、１６，１００×ｇ、４℃で５分間遠心分離することにより不溶性物質を除去した。試料の濃度を３μｇ／μＬに調整し、ペプチド物質１５０μｇをカラムに負荷し、１０負荷体積の８０％ＡＣＮ、５％ＦＡで洗浄した。未結合画分を収集してプールし、真空遠心分離により乾燥させた。ＺＩＣ−ＨＩＬＩＣ結合ペプチドを３負荷体積の超純水で溶離させ、真空遠心分離を用いて濃縮した。新たに調製した試薬を用いて、別個にバイオロジカルレプリケートをＺＩＣ−ＨＩＬＩＣ濃縮に供した。

逆相ＬＣ−ＭＳ、ＣＩＤ ＭＳ−ＭＳおよびＨＣＤ ＭＳ−ＭＳを用いた糖ペプチドの同定
精製した糖ペプチド／ペプチドを緩衝液Ａ（０．５％酢酸）に再懸濁させ、糖ペプチドの定性分析にはＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、サンノゼ、カリフォルニア州）と接続したＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ミシサガ、オンタリオ州）、定量試験にはＱ−ｅｘａｃｔｉｖｅと接続したＥＡＳＹ−ｎＬＣ１０００システムで逆相クロマトグラフィーを用いて分離した。Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１糖ペプチドの定性分析には、社内で充填した２０ｃｍ、内径７５μｍ、外径３６０μｍのＲｅｐｒｏＳｉｌ−Ｐｕｒ Ｃ１８ ＡＱ１．９μｍ（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ社、アンマーブーフ−エントリンゲン、ドイツ）カラムを用いた。定量試験には、社内で充填した４５ｃｍ、内径５０μｍ、外径３６０μｍのＲｅｐｒｏＳｉｌ−Ｐｕｒ Ｃ１８ ＡＱ１．９μｍカラムを用いた。両システムとも、試料をトラップカラム、すなわち、社内で充填した２ｃｍ、内径１００μｍ、外径３６０μｍでＡｑｕａ ５μｍ Ｃ１８を含むカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社、トーランス、カリフォルニア州）に５μＬ／分で負荷した後、グラジエント分離を実施し、質量分析用に注入した。０％の緩衝液Ｂ（８０％ＡＣＮ、０．５％酢酸）から３２％のＢまで１４０分、次いで３２％のＢから４０％のＢまで５分、次いで１００％のＢまで２．５分かけて上昇させ、１００％のＢで２．５分間保持し、次いで、さらに２０分かけて０％のＢまで低下させる１８０分間のグラジエントをかけた。ＺＩＣ−ＨＩＬＩＣ糖ペプチド濃縮で得た未結合画分を糖ペプチドの定性分析と同じ機器設定を用いた分析に供した。両機器とも、定性分析には、既に記載されている通りに（Ｓｃｏｔｔら，２０１１）、Ｘｃａｌｉｂｕｒ ｖ２．２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、ＭＳ、ＣＩＤ ＭＳ−ＭＳおよびＨＣＤ ＭＳ−ＭＳの間で自動的に切り替わるデータ依存モードでキャピラリー温度２７５℃にて稼働させ、定量試験には、ＭＳ（分解能７０ｋ、ＡＧＣ標的１×１０^６）とＨＣＤ ＭＳ−ＭＳイベント（分解能１７．５ｋ、ＡＧＣ標的１×１０^６、最大注入時間６０ミリ秒、２０％ステップのＮＣＥ２８）との間で切り替わる上位１０のデータに依存する方法を用いて稼働させた。

Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１糖ペプチドの同定
定性的グリコシル化分析の未処理ファイルを既に記載されている通りに（Ｓｃｏｔｔら，２０１１，２０１２）処理した。簡潔に述べれば、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ｖ．１．２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用い、得られた糖ペプチドに関するデータをＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１のデータベース（ＵＮＩＰＲＯＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／、６８１ ２０１４−０６−１０から入手、Ｔａｘｏｎ識別番号：３２６３個のタンパク質配列を含む６２９７７）にＭＡＳＣＯＴ ｖ２．４を用いて検索した。以下のパラメータ：ペプチド質量精度２０ｐｐｍ；フラグメント質量精度０．０２Ｄａ；酵素特異性無し、固定修飾（カルバミドメチル）、可変修飾（メチオニン酸化および脱アミドＮ、Ｑ）を用いてＭａｓｃｏｔ検索を実施した。以前の研究でＨＣＤスペクトル内に四極子様断片化が示されていることから（Ｏｌｓｅｎら，２００７）、ＭＡＬＤＩ−ＱＵＡＤ−ＴＯＦの機器設定を選択した。ＭＡＳＣＯＴ検索からペプチドが同定されなかったスキャンイベントをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社、レイモンド、ワシントン州）にエクスポートした。エクスポートしたマッチしないスキャンの中に糖ペプチドの可能性のある物質を同定するため、「ｍｇｆグラフ」と称するＧＰＭＡＷ８．２のＭＳ−ＭＳモジュールを用いて、２０４．０８ｍ／ｚのＨｅｘＮＡｃのオキソニウムが含まれるＨＣＤスキャンイベントを洗い出した。オキソニウム２０４．０８ｍ／ｚイオンが含まれる全スキャンイベントを手動で調べ、糖ペプチドの可能性のある物質を同定した。糖ペプチドの帰属を容易にするため、２０４．０８オキソニウムが含まれるＨＣＤスキャンイベントを手動で調べ、脱グリコシル化ペプチドイオンの可能性のある物質を同定した。Ｘｃａｌｉｂｕｒ ｖ２．２のスペクトルリスト機能を用いて、これらのＨＣＤスキャンのうち、脱グリコシル化ペプチドの質量を下回る質量に対応するＭＳ特性（ｍ／ｚ、電荷および強度）を抽出した。検出されたＭＳ特性に関して得られた数値をｍｇｆファイルに書き込み、ペプチドの質量を脱グリコシル化ペプチドの質量に設定した。次いで、上記のＭＡＳＣＯＴ設定を用いて、得られたｍｇｆファイルを検索した。デコイオプションを起動して全スペクトルを検索したところ、このデータベースにマッチするものは検出されず、偽発見率（ＦＤＲ）は０％であった。

ジメチル化Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１および変異株糖ペプチドの定量解析を既に報告されている通りに（Ｌｉｔｈｇｏｗら，２０１４）実施した。簡潔に述べれば、ジメチル化Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１糖ペプチドを上記の通りに同定し、Ｘｃａｌｉｂｕｒ ｖ２．２．Ｔｒｉｐｌｅｘを用いてモノアイソトピックピークの曲線下面積を手動で抽出することにより定量化した（野生型ＡＤＰ１対ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＣｏｍＰ対ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１）。

結果
アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）がコードする２種類のＯＴａｓｅホモログは異なるｐｆａｍドメインを含む
これまでに、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１がＷｚｙ＿Ｃスーパーファミリーのドメインを含むタンパク質を２種類コードすることが報告されている（Ｓｃｈｕｌｚら，２０１３）。本発明者らはバイオインフォマティクス解析により、主要ＩＶａ型ピリンサブユニットｐｉｌＡのすぐ下流に進化的に関係のあるＷｚｙ＿Ｃスーパーファミリーのドメインを含むタンパク質をコードすると予想される２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌種を数種類同定した（図１、パネルＡ）。

Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株では、ｐｉｌＡ遺伝子が２種類の遺伝子、Ｍ２１５＿１０４８０およびＭ２１５＿１０４７５のすぐ上流にあり、これらの遺伝子はともにＷｚｙ＿Ｃスーパーファミリーのメンバーをコードするものである。Ｍ２１５＿１０４８０およびＭ２１５＿１０４７５にはそれぞれｐｆａｍ１３４２５ドメインおよびｐｆａｍ０４９３２ドメインが含まれている（図１、パネルＡおよびＢ）。この研究の時点で、同じ遺伝子配置がみられたのは、Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）菌株では１７の全ゲノムのうち１２ゲノム、Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）では８ゲノムのうち７ゲノム、Ａ．ピッティ（Ａ．ｐｉｔｔｉｉ）では５ゲノムのうち３ゲノムであり、医学的に重要なＡｃｂ複合体のメンバーの間でこの遺伝子座が保存されていることがわかった（データ不掲載）。本発明者らは以前、ｐｆａｍ１３４２５ドメインを含むタンパク質（ＯＲＦ Ｍ２１５＿１０４８０）をコードする遺伝子を推定グリコシラーゼＡ（ｐｇｙＡ）と命名した（Ｈａｒｄｉｎｇら，２０１３）。本発明者らは、Ｍ２１５＿１０４８０をコードする遺伝子がｐｉｌＡのすぐ下流にあることと、このタンパク質がピリングリコシラーゼであることを示す本明細書に記載の機能データとを考慮に入れ、ＯＲＦ Ｍ２１５＿１０４８０をコードする遺伝子を４型ピリン特異的Ｏ−オリゴサッカリルトランスフェラーゼ遺伝子（ｔｆｐＯ）に改名した。

第二のＯＲＦであるＭ２１５＿１０４７５は、ｐｆａｍ０４９３２ファミリーのドメインであって、これまでに特徴が明らかにされている全ＰｇｌＬオルソログおよびＯ抗原リガーゼにみられるドメインを含む予測タンパク質をコードする。ＰｇｌＬ＿ＡドメインおよびＰｇｌＬ＿ＢドメインはＭ２１５＿１０４７５でも確認されている。このタンパク質はＰｇｌＬ汎用ＯＴａｓｅのオルソログの１つであると思われるため、本発明者らはＯＲＦ Ｍ２１５＿１０４７５をｐｇｌＬＭ２と命名した（図１、パネルＡおよびＢ）。

ＲＮＡ−ｓｅｑを用いて対数中期Ｍ２細胞のトランスクリプトーム解析を実施した（データ不掲載）。ｐｉｌＡＭ２の転写は容易に観察された。ｔｆｐＯＭ２の転写も観察されたが、そのレベルはｐｉｌＡＭ２とｔｆｐＯＭ２の間の遺伝子間領域から急激に低下していた。ｔｆｐＯＭ２の開始コドンＡＴＧのすぐ上流には予測Ｒｈｏ非依存性ターミネーターがある。ｐｉｌＡＭ２とｔｆｐＯＭ２は、１つのオペロンの中に漏出性の転写ターミネーターによって隔てられて存在する可能性がある。以上の知見は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）１２４４のｐｉｌＡおよびｐｉｌＯ（ｔｆｐＯ）の転写に関する研究（Ｃａｓｔｒｉｃ，１９９５）と一致する。ｔｆｐＯＭ２遺伝子の下流にｐｇｌＬＭ２遺伝子がある。両ＯＴａｓｅをコードする遺伝子は極めて接近しており、同じ脂質結合オリゴ糖を基質に用いることから、これらの遺伝子は同時に転写されるものと推測された。何らかの転写リードスルーが確かに存在するものと思われるが、ｐｇｌＬＭ２遺伝子の転写産物レベルはｔｆｐＯＭ２のレベルよりも著明に高く、ｔｆｐＯＭ２とｐｇｌＬＭ２の間の遺伝子間領域にはプロモーターが含まれており、これもｐｇｌＬＭ２の転写を駆動することが示唆される。

Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１ゲノムでは、ピリン様タンパク質をコードするｃｏｍＰ遺伝子の後に、ＳｃｈｕｌｚらがｐｇｌＬと命名した（２０１３）ｐｆａｍ０４９３２含有ＯＴａｓｅ様タンパク質をコードするＡＣＩＡＤ３３３７が存在する。これは、ｃｏｍＰに近接している（図１、パネルＣおよびＤ）ほか、ＣｏｍＰによる翻訳後修飾が必要であることを示す証拠がこれまでに報告されている（Ｓｃｈｕｌｚら，２０１３）ことから、ＡＣＩＡＤ３３３７と同時にｐｇｌＬ_ＣｏｍＰとも呼ばれている。

このほか、ＷａａＬリガーゼオルソログをコードすると予測されるＯＲＦ（ＡＣＩＡＤ０１０３）を含む第二のｐｆａｍ１３４２５ドメインが同定された。ＡＣＩＡＤ０１０３の位置はピリン遺伝子ホモログの近くではなかったが、代わりにグリカン生合成遺伝子座の中にみられた。本明細書では、これをＡＣＩＡＤ０１０３と同時にｐｇｌＬ_ＡＤＰ１とも命名する（図１、パネルＣおよびＤ）。Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）は、隣接する遺伝子がコードしないＷｚｙ＿Ｃスーパーファミリーのドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子を２種類含む唯一の菌株であった。

グリコシル化に関して十分に研究されている菌株、Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＴＣＣ１７９７８では、汎用Ｏ−ＯＴａｓｅが１種のみ同定され、これは既にＰｇｌＬと命名されている（Ｉｗａｓｈｋｉｗら，２０１２；Ｌｅｅｓ−Ｍｉｌｌｅｒら，２０１３）。

Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株ではピリンの翻訳後修飾にＴｆｐＯが必要である。
図２Ａは、同系のｐｉｌＡ変異株であるＭ２菌株の全細胞溶解物のウエスタンブロット解析を示しており、その補完されたｐｉｌＡ変異菌株から、ＰｉｌＡが見かけの分子量の異なる２つの分子形態で存在するという本発明者らのそれまでの知見が裏付けられた。存在量が多く分子量が大きい方の形態のＰｉｌＡは翻訳後修飾されたＰｉｌＡ種であると考えられ、分子量が小さい方の形態のＰｉｌＡは未修飾種であった。ＴｆｐＯがＰｉｌＡの翻訳後修飾に及ぼす影響を明らかにするため、同系のｔｆｐＯ変異株を構築し、ＰｉｌＡの発現を調べた。ｔｆｐＯを欠く菌株のＰｉｌＡは分子量が小さい方の形態でのみ存在していた（図２Ａ）。ＰｉｌＡの電気泳動移動度の増大と翻訳後修飾の喪失とで一致がみられる。さらに、補完されたｔｆｐＯ変異菌株のＰｉｌＡは主として分子量の大きい方の形態で存在し、ＰｉｌＡの翻訳後修飾にはＴｆｐＯが必要であることが裏付けられた。

Ｍ２菌株のｔｆｐＯのすぐ下流にはｐｇｌＬＭ２が存在し、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）およびＮ．メニンギジティス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ）の多くの膜結合タンパク質のグリコシル化を担う汎用Ｏ−ＯＴａｓｅのホモログをコードしている（Ｖｉｋら，２００９；Ｂｏｒｕｄら，２０１１）。ＰｇｌＬＭ２もＰｉｌＡの翻訳後修飾に何らかの役割を担っているかどうかを明らかにするため、ｐｇｌＬＭ２を欠く同系変異菌株を作製した。ｐｇｌＬＭ２変異株の全細胞溶解物のウエスタンブロット解析から、ＰｉｌＡが主として修飾型で存在することが明らかになり、ＰｉｌＡの翻訳後修飾には観察されたようにＰｇｌＬＭ２を必要としないことがわかる（図２Ａ）。

ＰｉｌＡ_Ｍ２が（ＨｅｘＮＡｃ）_２、ヘキソースおよびＮ−アセチル−デオキシヘキソースを含む四糖によりＴｆｐＯ_Ｍ２依存性にグリコシル化された。
ＰｉｌＡがＴｆｐＯによってグリコシル化されることを裏付けるため、Ｍ２菌株、超線毛型Ｍ２ΔｐｉｌＴ変異株および超線毛型Ｍ２ΔｔｆｐＯ：：ｋａｎΔｐｉｌＴ：：ｓｔｒｅｐ変異株の表面剪断調製物からＰｉｌＡを精製した。ｐｉｌＴ遺伝子は予測収縮ＡＴＰアーゼをコードし、したがって、ｐｉｌＴを欠く変異株は超線毛型の表現型を呈し、表面に露出したＰｉｌＡの量が多くなる。剪断調製物中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クーマシー染色を実施し、切出し、質量分析に供した。図２Ｂは、Ｍ２およびＭ２ΔｐｉｌＴの両菌株のＰｉｌＡのＭＳ／ＭＳ解析により、ＰｉｌＡにＨｅｘＮＡｃ残基２つ、ヘキソースおよびＮ−アセチルデオキシヘキソースからなる四糖が存在することが確認されたことを示している。ＭＳ／ＭＳ解析から、この四糖がカルボキシ末端のトリプシン１１９ＮＳＧＴＤＴＰＶＥＬＬＰＱＳＦＶＡＳ１３６ペプチド上に存在することがわかった。Ｍ２ΔｔｆｐＯ：：ｋａｎΔｐｉｌＴ：：ｓｔｒｅｐ変異株のＰｉｌＡには修飾がみられず、ＰｉｌＡグリコシル化にはＴｆｐＯが必要であることが裏付けられた（データ不掲載）。

ピリン修飾にはＰｉｌＡＭ２のカルボキシ末端セリン１３６が必要とされた。
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）１２４４では、ピリンタンパク質ＰｉｌＡがＴｆｐＯ依存性にグリコシル化される（Ｃａｓｔｒｉｃ，１９９５）。のちにグリコシル化部位がカルボキシ末端セリン１４８の位置にあることが明らかにされた（Ｃｏｍｅｒら，２００２）。Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２を含めたアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌種のＰｉｌＡタンパク質のアミノ酸配列を緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）１２４４ ＰｉｌＡと比較した。配列の相同性は低いが、Ｍ２菌株のＰｉｌＡ配列にもＣ末端セリンが含まれており、これはＭＳによって同定された糖ペプチドに含まれていたものである（図２Ｂ）。

図３Ａは、実際に、Ｏ−ＯＴａｓｅホモログをコードする２種類の連続する遺伝子を含むアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌種はいずれも、それぞれのＰｉｌＡアミノ酸配列にカルボキシ末端セリンが含まれていることを示している。

カルボキシ末端セリン１３６がＰｉｌＡの翻訳後修飾に必要であるかどうかを明らかにするため、Ｍ２（ｐｉｌＡ［Ｓ１３６Ａ］）＋菌株を作製した。最初に、下流のｔｆｐＯ遺伝子の転写が影響を受けないように、ｐｉｌＡ遺伝子のインフレーム欠失がある菌株を作製した。次いで、カルボキシ末端のセリンがアラニン残基に変異したｐｉｌＡの対立遺伝子遺伝子でＭ２ΔｐｉｌＡ菌株を補完し、Ｍ２（ｐｉｌＡ［Ｓ１３６Ａ］）＋菌株を作製した。

図３ＢはＭ２（ｐｉｌＡ［Ｓ１３６Ａ］）＋菌株の全細胞溶解物のウエスタンブロット解析を示しており、この解析から、ＰｉｌＡが未修飾で分子量が小さい方の形態でのみ存在することが明らかになり、ＰｉｌＡの翻訳後修飾にはカルボキシ末端セリンが必要であることがわかった。高度に保存されたセリンがほかにも１３２位にみられた。この部位もグリコシル化に必要であるかどうかを明らかにするため、本発明者らはＭ２（ｐｉｌＡ［Ｓ１３２Ａ］）＋菌株を構築した。Ｍ２（ｐｉｌＡ［Ｓ１３２Ａ］）＋菌株の全細胞溶解物のウエスタンブロット解析から、ＰｉｌＡが修飾形態で存在することが明らかになり、セリン１３２はグリコシル化に必要ではないことがわかった（図３Ｂ）。Ｍ２（ｐｉｌＡ［Ｓ１３６Ａ］）＋菌株は自然形質転換が可能であり（図３Ｃ）、親菌株と同じ収縮運動を示した（データ不掲載）ことから、カルボキシ末端のセリンからアラニンへの点変異はＴｆｐの機能に影響を及ぼすことはなかった。

ＰｉｌＡＭ２の翻訳後修飾には主要多糖抗原（ＭＰＡ）遺伝子座が必要である。
Ｈｕらは最近、主要多糖抗原（ＭＰＡ）遺伝子座を含むアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌種の血清型を分子レベルで判定するスキームを開発した。保存されたｆｋｐＡ遺伝子とｌｌｄＰ遺伝子の間に存在するＭＰＡ遺伝子座は、研究対象に含めシーケンシングを実施した全アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌株に確認されたほか、Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株にもみられた（Ｈｕら，２０１３，Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓら，２０１３）。Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株のＭＰＡ遺伝子座には、予測グリコシルトランスフェラーゼ３種類（ｗａｆＹ、ｗａｆＺおよびｗａｇＢと呼ばれる）および予測開始グリコシルトランスフェラーゼ１種類（ｗｅｅＨまたはｐｇｌＣと呼ばれる）が含まれている（図４Ａ）。ＭＰＡ遺伝子座がＰｉｌＡＭ２の翻訳後修飾に必要であるかどうかを明らかにするため、予測グリコシルトランスフェラーゼをそれぞれ欠く同系変異株を個別に構築した。図４ＢはｗｅｅＨを欠く菌株の全細胞溶解物のウエスタンブロット解析を示しており、この解析から、ＰｉｌＡが分子量の小さい方の形態で存在することが明らかになり、ＰｉｌＡのグリコシル化にはＷｅｅＨが必要であることがわかった。ほかの３種類のグリコシルトランスフェラーゼの欠失では、中間の電気泳動移動度を示すＰｉｌＡタンパク質が得られた。ｗａｆＹ：：ｋａｎ変異株のＰｉｌＡはＷＴ ＰｉｌＡの移動度に最も近い位置に移動し、これにｗａｆＺ：：ｋａｎ変異株のＰｉｌＡ、ｗａｇＢ：：ｋａｎ変異株のＰｉｌＡがこの順に次いだ（図４Ｂ）。ｗａｆＺ：：ｋａｎ変異株およびｗａｇＢ：：ｋａｎ変異株のバックグラウンドから部分的に修飾された形態および未修飾の形態のＰｉｌＡがともに同定されたのは興味深い。いずれの変異菌株も補完に成功し、完全に修飾されたＰｉｌＡの産生にはｗａｆＹ遺伝子、ｗａｆＺ遺伝子、ｗａｇＢ遺伝子およびｗｅｅＨ遺伝子の産物がいずれも必要であることがわかった。

Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株では、ｐｇｌＬＭ２がＰｇｌＬ様Ｏ−ＯＴａｓｅをコードし、一般的なタンパク質グリコシル化のドナーとして同じ四糖前駆物質を用いる。
図２Ａでは、Ｗｚｙ＿Ｃドメインを含む第二のＯＲＦであるｐｇｌＬＭ２はピリングリコシル化に必要ではないことが示された。ｐｇｌＬＭ２は、Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＴＣＣ１７９７８で既に特徴が明らかにされているＰｇｌＬと同じように汎用Ｏ−ＯＴａｓｅであり、ピリン以外の標的タンパク質をグリコシル化するのではないかと考えられる。本発明者らは最近、タンパク質ＯｍｐＡをコードするＡ１Ｓ＿１１９３−Ｈｉｓが様々な菌株ＰｇｌＬによって認識されることから、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌株特異的グリカンを単離および同定するベイトアクセプタータンパク質としての役割を果たす可能性があることを明らかにした（Ｓｃｏｔｔら，２０１４）。本発明者らは、菌株Ｍ２、Ｍ２ΔｔｆｐＯ：：ｋａｎ、Ｍ２ΔｐｇｌＬ：：ｋａｎおよびＭ２ΔｗｅｅＨ：：ｋａｎの各菌株でカルボキシ末端Ｈｉｓタグを含むＯｍｐＡ−Ｈｉｓを発現させた。

図５Ａは、４菌株ともＯｍｐＡ−Ｈｉｓを発現したことを示すウエスタンブロット解析であるが、Ｍ２ΔｐｇｌＬ：：ｋａｎおよびＭ２ΔｗｅｅＨ：：ｋａｎのバックグラウンドのＯｍｐＡ−Ｈｉｓは高い電気泳動移動度で移動し、翻訳後修飾がみられないことと一致している。Ｍ２菌株から精製したＯｍｐＡ−ＨｉｓのＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ解析では、分岐四糖の２つのサブユニットによるグリコシル化が明らかになった。以上の結果は、Ｍ２１５＿１０４７５が汎用Ｏ−ＯＴａｓｅであることを示唆するものであり、ＰｇｌＬＭ２という名称の機能的証拠となる。さらに、この分岐四糖はＰｉｌＡにみられたものと同じ四糖であり、ＴｆｐＯＭ２およびＰｇｌＬＭ２がともに同じ脂質結合グリカン前駆物質をタンパク質グリコシル化の基質として用いることがわかった（図５Ｂ）。この観察結果は、ＰｉｌＡの翻訳後修飾にもＯｍｐＡ−Ｈｉｓの翻訳後修飾にもＷｅｅＨが必要であることを考慮し予測されたものであり、共通のグリカン前駆物質経路の存在を示している。

ＡＣＩＡＤ０１０３はＷａａＬ Ｏ抗原リガーゼではなく、ＣｏｍＰの修飾に必要なものでもない。
上記の通り、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１のゲノムでは、Ｗｚｙ＿Ｃスーパーファミリーのドメインを含むＯＴａｓｅ様タンパク質が２種類コードされている。そのうちの１つであるｐｇｌＬ_ＣｏｍＰ（ＡＣＩＡＤ３３３７）はｃｏｍＰに隣接している。Ｓｃｈｕｌｚら（２０１３）は、ＣｏｍＰの修飾にｐｇｌＬ_ＣｏｍＰ（ＡＣＩＡＤ３３３７）が必要であることを明らかにしており、これとは別に本発明者らもこれを確認している（図６Ａ）。さらに、同系のｐｇｌＬ_ＡＤＰ１（ＡＣＩＡＤ０１０３）変異菌株のＣｏｍＰ−Ｈｉｓ発現を調べたウエスタンブロット解析では、ＣｏｍＰの翻訳後修飾にＰｇｌＬ_ＡＤＰ１は必要ではないことが明らかになった（図６Ａ）。

Ｓｃｈｕｌｚら（２０１３）は、もう一方のＷｚｙ＿Ｃスーパーファミリードメイン含有タンパク質、ＰｇｌＬ_ＡＤＰ１（ＡＣＩＡＤ０１０３）がＷａａＬ Ｏ抗原リガーゼをコードすると推測した。ＬＰＳ生合成の際には、内膜の細胞質側にあるＯ−グリカンと同じ脂質キャリア上にＯ抗原反復単位が順次集合し、周辺質へ反転し、重合してＯ抗原鎖を形成し、Ｏ抗原リガーゼによってリピドＡコア多糖に転移される（ＨｕｇおよびＦｅｌｄｍａｎ，２０１１）。ＬＰＳ分子中のＯ抗原サブユニット反復の数の差がＬＰＳ銀染色のラダー様のバンドパターンとして現れる（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，１９９５）。ｐｇｌＬ_ＡＤＰ１がＯ抗原リガーゼとして作用するかどうかを明らかにするため、本発明者らは、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１、ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＣｏｍＰ：：ｋａｎ変異株およびＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１：：ｋａｎ変異株からＬＰＳを精製し、ＳＤＳ ＰＡＧＥで分離した調製物を銀染色した。

図６Ｂに示されるように、ＬＰＳの銀染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルは同じバンドパターンを示し、植物病原菌である青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）から得たＯ抗原含有ＬＰＳと比較してもＬＯＳにＯ抗原サブユニットは観察されなかった。ＰｇｌＬ_ＡＤＰ１がＯ抗原リガーゼとして作用しなかったことを考えると、ＰｇｌＬ_ＡＤＰ１は第二のＯ−ＯＴａｓｅをコードしている可能性がある。

Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１ではＡＣＩＡＤ０１０３が汎用Ｏ−ＯＴａｓｅであるＰｇｌＬ_ＡＤＰ１をコードする。
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＤｓｂＡ１およびＡ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＴＣＣ１７９７８のＯｍｐＡは、それぞれの菌株で汎用Ｏ−ＯＴａｓｅによっても修飾され、以前はグリコシル化を研究するためのモデルとして用いられた（Ｖｉｋら，２００９；Ｉｗａｓｈｋｉｗら，２０１２；Ｇｅｂｈａｒｔら，２０１２；Ｌｉｔｈｇｏｗら，２０１４）ものであり、ＰｇｌＬ_ＡＤＰ１がこれをグリコシル化することができるかどうかを検討した。この２種類のタンパク質を野生型、ΔｐｇｌＬ_ＣｏｍＰおよびΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１のＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）菌株で別個に発現させた。ＤｓｂＡ１−Ｈｉｓ（図６Ｃ）およびＯｍｐＡ−Ｈｉｓ（図６Ｄ）は、野生型およびΔｐｇｌＬ_ＣｏｍＰバックグラウンドよりもΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１バックグラウンドの方が電気泳動移動度が大きかった。以上の実験は、ＰｇｌＬ_ＡＤＰ１が汎用Ｏ−ＯＴａｓｅとしての役割を果たすことを裏付けるものである。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いてＰｇｌＬ_ＡＤＰ１のＯＴａｓｅ活性をさらに裏付けるｉｎ ｖｉｖｏのグリコシル化アッセイが実施されている（Ｇｅｂｈａｒｔら，２０１２）。本発明者らは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＬＭ２４を用いた。この菌株はＷａａＬ Ｏ抗原リガーゼを欠くため、脂質結合グリカン前駆物質が蓄積して、異種Ｏ−ＯＴａｓｅ活性の基質としての役割を果たすことができる（Ｆｅｌｄｍａｎら，２００５）。既に記載されている通りに（Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒら，２００７；ＩｅｌｍｉｎｉおよびＦｅｌｄｍａｎ，２０１１）、アクセプタータンパク質（ＤｓｂＡ１）、グリカンドナー（カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）の脂質結合オリゴ糖（ＣｊＬＬＯ））および１種類のＯＴａｓｅをコードするプラスミドで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＬＭ２４を形質転換させた。本発明者らはほかにもＰｇｌＬ_ＣｏｍＰを含めたほか、Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＴＣＣ１９６０６のピリン特異的Ｏ−ＯＴａｓｅおよび汎用Ｏ−ＯＴａｓｅをコードするＴｆｐＯ１９６０６およびＰｇｌＬ１９６０６を対照として用いた。抗ヒスチジン抗体でＤｓｂＡｌ−Ｈｉｓを検出し、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）七糖に反応するｈＲ６抗体を用いてグリコシル化を検出した。

図７に示されるように、両抗体と反応しＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）七糖によって修飾されたＤｓｂＡ１−Ｈｉｓに対応するバンドがみられたのは、ＤｓｂＡ１−Ｈｉｓ、ＣｊＬＬＯおよびＰｇｌＬ_ＡＤＰ１または汎用Ｏ−ＯＴａｓｅのＰｇｌＬ_{１９６０６}を共発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に限られた。このデータからも、ＰｇｌＬ_ＡＤＰ１の汎用Ｏ−ＯＴａｓｅとしての役割が裏付けられる。

Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１の野生型菌株、ΔｐｇｌＬ_ＣｏｍＰ菌株およびΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１菌株の比較プロテオーム解析。
Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）のＡＤＰ１グリコシル化での両推定Ｏ−ＯＴａｓｅの役割を明らかにするため、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１のグリコプロテオームをＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＣｏｍＰ変異株またはＡＰＤ１ΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１変異株のいずれかと比較した。糖ペプチド濃縮のためのＺＩＣ−ＨＩＬＩＣ（Ｉｗａｓｈｋｉｗら，２０１２；Ｎｏｔｈａｆｔら，２０１２；Ｓｃｏｔｔら，２０１４；Ｌｉｔｈｇｏｗら，２０１４）および複数のＭＳ／ＭＳ断片化法（Ｓｃｏｔｔら，２０１１）を用いて、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１に８種類のタンパク質基質に由来する２１種類の固有の糖ペプチドが３６０個同定された。ほかのアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌種に観察されている多様性（Ｓｃｏｔｔら，２０１４）と同じく、２８６−２１７−ＨｅｘＮＡｃ３（１１１２．４１Ｄａ、図８Ａおよび８Ｄ）、２８６−２１７−２４５−ＨｅｘＮＡｃ２（１１５４．４１Ｄａ、図８Ｂおよび８Ｆ）、２８６−２１７−ＨｅｘＮＡｃ−２４５−ＨｅｘＮＡｃ（１１５４．４１Ｄａ、図８Ｂおよび８Ｇ）および２８６−２１７−２４５２−ＨｅｘＮＡｃ（１１９６．４１Ｄａ、図８Ｃおよび８Ｅ）からなる４種類の五糖グリコフォームのうちの１種類で修飾された糖ペプチドを有する固有のグリカンがＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１で得られた。Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＣｏｍＰの膜タンパク質の糖ペプチド解析によって同じ糖ペプチドが同定され、グリコプロテオームはこの遺伝子の欠失による影響を受けないことが示唆された。これに対し、野生型Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１に観察された２１種類の糖ペプチドのうちＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１の抽出物中に検出されたものはなく、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１ではｐｇｌＬ_ＡＤＰ１が一般的なタンパク質グリコシル化を担っていることが示唆された。

糖ペプチドの定量的標識
図１９は、ジメチル標識を用いたＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１ ＷＴ、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１およびＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＣｏｍＰのグリコシル化の定量解析を示している。

定量的ジメチル化標識により、全３種類の菌株を同時に比較して糖ペプチド濃縮の内部陽性対照を得ることができ、糖ペプチドが７種類検出された（表２）。グリコシル化にＰｇｌＬ_ＡＤＰ１が必要であるのと同じく、ΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１変異株由来の糖ペプチド（図１９Ａ〜１９Ｃ）は検出されなかったが、試料中の非グリコシル化ペプチドが約１：１：１の比で観察された（図１９Ｄ〜１９Ｅ、表２）。ΔｐｇｌＬ_ＣｏｍＰでは野生型（範囲４６％〜１７０％、図２１）と比較してグリコシル化がほぼ１：１の比で観察され、ＭＳ／ＭＳによる同定から、糖ペプチドがΔｐｇｌＬ_ＣｏｍＰ菌株に由来することが確認された（図１９Ｃ）。以上のデータから、ＰｇｌＬ_ＡＤＰ１は汎用Ｏ結合ＯＴａｓｅであり、ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰはグリコプロテオームの特異的サブセットのグリコシル化を担っていることが示唆され、このことが検出されなかったのは、用いた方法の感度によるものであると考えられる。

ジメチル標識およびＺＩＣ−ＨＩＬＩＣを用いて、個々の糖ペプチドのグリコシル化を担うＯ−ＯＴａｓｅを確認した。Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１ ＷＴに由来し軽い標識で標識された糖ペプチドとＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＣｏｍＰに由来し重い標識で標識された糖ペプチドがほぼ１：１のレベルで観察されたのに対し、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１に由来し中間の重さの標識で標識された糖ペプチドは試料中に検出されなかった。これとは逆に、非グリコシル化ペプチドは全３種類の菌株にほぼ１：１：１のレベルで観察された。ＡおよびＤ）糖ペプチド１１３ＫＬＡＥＰＡＡＳＡＶＡＤＱＮＳＰＬＳＡＱＱＱＬＥＱＫ１３８（Ｑ６Ｆ８２５＿ＡＣＩＡＤ）および非グリコシル化ペプチド１６６ＡＱＳＶＡＮＹＬＳＧＱＧＶＳＳＳＲ１８２（Ｑ６ＦＤＲ２＿ＡＣＩＡＤ）の軽い同位体置換分子、中間の重さの同位体置換分子および重い同位体置換分子のＭＳスペクトルによって、全３種類の菌株のグリコシル化を比較することができた。ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１では、糖ペプチドは観察されなかったが、非グリコシル化ペプチドはほぼ１：１：１の比で観察された。ＢおよびＥ）軽い同位体置換分子、中間の重さの同位体置換分子および重い同位体置換分子の抽出イオンクロマトグラムを比較することにより、ＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１由来糖ペプチドが存在せず、非グリコシル化ペプチドが１：１：１の比であることが裏付けられる。Ｃ）糖ペプチド１１３ＫＬＡＥＰＡＡＳＡＶＡＤＱＮＳＰＬＳＡＱＱＱＬＥＱＫ１３８の重い同位体置換分子の同定を裏付け、同分子がＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＣｏｍＰに由来することを裏付けるＨＣＤ断片化。Ｆ）非グリコシル化ペプチド１６６ＡＱＳＶＡＮＹＬＳＧＱＧＶＳＳＳＲ１８２の中間の重さの同位体置換分子の同定を裏付け、同分子がＡＤＰ１ΔｐｇｌＬ_ＡＤＰ１に由来することを裏付けるＨＣＤ断片化。

表２に、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１で同定されたジメチル化糖ペプチドを示す。Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１の野生型（軽）およびＯＴａｓｅ変異株（重）で同定されたジメチル化糖ペプチド。識別番号は対応するＵｎｉｐｒｏｔ番号に従って分類されている。同定された各糖ペプチドのタンパク質名、親ｍ／ｚ、荷電状態、グリカンの質量、ペプチドの質量、グリカンの組成、ペプチドの配列およびｍａｓｃｏｔイオンスコアが記載されている。同定された各ペプチドには、観察された糖ペプチドを野生型（ジメチルＮ末端およびＫを含む）および補完（ジメチルＮ末端２Ｈ（６）１３Ｃ（２）およびＫ２Ｈ（６）１３Ｃ（２）を含む）と区別できるように、観察されたジメチル化が記載されている。

図２１（配列番号：７９〜８２）は、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１で同定された定量的糖ペプチドを示している。Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１の野生型（軽）およびＯＴａｓｅ変異株（重）で同定されたジメチル化糖ペプチド。識別番号は対応するＵｎｉｐｒｏｔ番号に従って分類されている。同定された各糖ペプチドのタンパク質名、親ｍ／ｚ、荷電状態、グリカンの質量、ペプチドの質量、グリカンの組成、ペプチドの配列およびｍａｓｃｏｔイオンスコアが記載されている。同定された各ペプチドには、観察された糖ペプチドを野生型（ジメチルＮ末端およびＫを含む）および補完（ジメチルＮ末端２Ｈ（６）１３Ｃ（２）およびＫ２Ｈ（６）１３Ｃ（２）を含む）と区別できるように、観察されたジメチル化が記載されている。

ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰアクセプタータンパク質の特異性によって同タンパク質がＴｆｐＯおよび汎用Ｏ−ＯＴａｓｅと区別される
アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）染色体上の主要ＩＶａ型ピリン遺伝子と下流のＯ−ＯＴａｓｅ遺伝子との間に強い遺伝的連鎖があることから、これらのＯ−ＯＴａｓｅがそのコグネイトピリンタンパク質に対して特異的でるかどうかを明らかにしようとした。Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２菌株のＰｉｌＡＭ２を発現するプラスミドを異なるアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）種で発現させた後、ウエスタンブロット解析を実施し、ピリンタンパク質の発現および電気泳動移動度を調べた。分子量が大きい方の形態のＰｉｌＡＭ２および分子量が小さい方の形態のＰｉｌＡＭ２の両方が存在することからわかるように、ＰｉｌＡＭ２は、ともにｔｆｐＯホモログおよび末端セリン残基を含むピリンをコードするＡ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＴＣＣ１９６０６および臨床分離株のＡ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）２７４１３によって修飾された（図９Ａ）。Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＴＣＣ１９６０６のグリカンは、Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＴＣＣ１７９７８で同定された五糖と同じものであることがわかった。Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＴＣＣ１９６０６で発現したＰｉｌＡＭ２は電気泳動の移動速度が最も遅く、大きいグリカンがＰｉｌＡＭ２と結合していることが示された（Ｓｃｏｔｔら，２０１４）。ｔｆｐＯホモログを欠くＡ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＴＣＣ１７９７８およびＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１はともに、ＰｉｌＡＭ２をグリコシル化することができなかった。

これとは対照的に、ＣｏｍＰ−Ｈｉｓを様々なアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌種で異種発現させたところ、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１でのみＣｏｍＰ−Ｈｉｓがグリコシル化されることがわかった。ｔｆｐＯホモログをコードする菌株はＣｏｍＰ−Ｈｉｓを修飾することができなかったが、Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＴＣＣ１９６０６は例外で、ＣｏｍＰ−Ｈｉｓを修飾する限界の能力を有するものと思われた（図９Ｂ）。ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰが、末端セリン残基を持たないＡ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＴＣＣ１７９７８のピリンを修飾することができるかどうかを明らかにするため、ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰを分析した。ＰｉｌＡ１７９７８はＰｇｌＬ_ＣｏｍＰによってグリコシル化されることはなかったが、そのコグネイトＰｇｌＬ１７９７８およびＰｇｌＬ_ＡＤＰ１汎用Ｏ−ＯＴａｓｅの両方によってグリコシル化された。以上の結果から、ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰは、末端セリン残基を認識するほかのピリン特異的ＴｆｐＯ ＯＴａｓｅおよび汎用ＰｇｌＬ Ｏ−ＯＴａｓｅから区別される。ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰの配列はＰｇｌＬ様ＯＴａｓｅの方が類似しているが、その活性は末端セリン残基を持たないピリン様タンパク質であるＣｏｍＰに特異的であるのは意外なことである。ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰはＯ−ＯＴａｓｅの新たなクラスに属するものと思われる。

アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属には、世界中で重要性が増しつつある日和見性の院内病原菌が複数存在する。これらの細菌が用いる病原性因子にＩＶ型線毛およびタンパク質Ｏ−グリコシル化系がある。グリコシル化は、グリカンを脂質キャリアから標的タンパク質に転移させる酵素、Ｏ−オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（Ｏ−ＯＴａｓｅ）を介するものである。Ｏ−ＯＴａｓｅは、ＬＰＳ合成の最終段階を触媒するＷａａＬリガーゼに類似しているため同定するのが難しい。バイオインフォマティクス解析から、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属のほとんどの菌株に推定Ｏ−ＯＴａｓｅまたはＷａａＬリガーゼをコードする遺伝子が２種類存在することが明らかにされている。本願では、モデル系にＡ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）Ｍ２およびＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１を用いて、上記の遺伝子が２種類のＯ−ＯＴａｓｅをコードすることを記載し、一方のＯ−ＯＴａｓｅはＩＶ型ピリンを特異的に担うものであり、もう一方のＯ−ＯＴａｓｅは複数のタンパク質のグリコシル化を担うものである。ＡＤＰ１を除くアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）のピリン特異的ＯＴａｓｅは、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＴｆｐＯ／ＰｉｌＯ Ｏ−Ｏｔａｓｅに類似している。ＡＤＰ１では代わりに、この２種類のＯ−ＯＴａｓｅは、最初にナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）で発見された汎用Ｏ−ＯＴａｓｅであるＰｇｌＬと深く関係している。しかし、一方のＯ−ＯＴａｓｅは、もっぱらピリン様タンパク質であるＣｏｍＰのグリコシル化を担っている。

Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）ＡＤＰ１野生型で同定された糖ペプチドを表３に示す。識別番号は対応するＵｎｉｐｒｏｔ番号に従って分類されている。同定された各糖ペプチドのタンパク質名、親ｍ／ｚ、荷電状態、グリカンの質量、ペプチドの質量、グリカンの組成、ペプチドの配列およびｍａｓｃｏｔイオンスコアが記載されている。

実施例２
材料および方法：
菌株およびプラスミド
本研究に使用した細菌株およびプラスミドを表４に記載する。ＤＮｅａｓｙ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＡ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）のゲノムＤＮＡを単離した。遺伝子ａｃｉａｄ３３３７（ｐｇｌＬ_ＣｏｍＰ）およびその上流の非コード領域の増幅には、プライマーｉｇｒＦ（ＡＣＴＧＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＧＴＡＣＴＡＴＡＴＧＧＣＴＴＴＡＡＡ；配列番号８９）およびｉｇｒＲ（ＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＴＡＴＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＴＴＴＡＡＣ；配列番号９０）を用いた。得られたＰＣＲ産物をＳａｌＩおよびＰｓｔＩで消化しｐＥＸＴ２０の同じ部位に挿入してｐＭＮ８を作製した。ＣｏｍＰをｐＢＡＶ−ＣｏｍＰ−ｈｉｓからｐＥＸＴ２０のＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位にサブクローン化することによってプラスミドｐＭＮ１を構築した。ｐｇｌＬ_ＣｏｍＰおよびその上流領域をｐＭＮ８のＳａｌＩおよびＰｓｔＩ部位からｐＭＮ１にサブクローン化することによってプラスミドｐＭＮ２を構築した。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのグリコシル化
Ｄｏｗｅｒらによって記載されているプロトコル（Ｄｏｗｅｒら，１９８８）に従って、エレクトロコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＬＭ２４、ＣＬＭ３７またはＳＤＢ１を調製した。グリカン合成遺伝子座、アクセプタータンパク質およびＯＴａｓｅをコードするプラスミドで細胞を形質転換させた。プラスミドの選択には、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（２０μｇ／ｍｌ）、トリメトプリム（５０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（１２．５μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）およびスペクチノマイシン（８０μｇ／ｍｌ）を必要に応じて添加した。細胞をＬＢブロス中、３７℃でＯＤ_６０００．４〜０．６まで増殖させ、必要に応じて０．０５ｍＭもしくは０．１ｍＭ ＩＰＴＧまたは０．２％アラビノースで誘導し、３７℃で一晩放置した。アラビノース誘導が必要な培養物には４時間後に２回目のアラビノース投与を実施した。定常期に全細胞溶解物を入手し、そのうち０．１ＯＤを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、次いでニトロセルロース膜に転写した。ウエスタンブロット解析を用いてタンパク質修飾を判定した。使用した抗体を表５にまとめる。Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬｉＣｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国）を用いてニトロセルロース膜を可視化した。

全膜調製物
テリフィックブロス中３７℃で一晩増殖させた細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液で洗浄し、同緩衝液に再懸濁させた。フレンチプレスを２０ｋｐｓｉ（１．４×１０^５ｋＰａ）で用いて細胞の破壊を２回実施した後、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ社）を加えることにより細胞を溶解させた。ライセートを１００００×ｇで３０分間遠心分離して細胞残屑を除去し、次いで上清を１０００００×ｇで６０分間超遠心分離して全膜をペレット化した。ＰＢＳ １０ｍｌに０．１％Ｔｒｉｔｏｎ×１００または１％ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）を含有する緩衝液にペレットを再懸濁させ、一晩回転させることにより膜タンパク質を可溶化した。この懸濁液に等体積のＰＢＳを加えて界面活性剤の濃度を低下させ、１０００００Ｇで６０分間超遠心分離した。可溶化膜タンパク質に対応する上清をニッケルアフィニティータンパク質精製用のカラムに負荷した。

ニッケルアフィニティータンパク質精製
ニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより可溶化全膜からヘキサ−ヒスチジンタグ化タンパク質を精製した。簡潔に述べれば、２０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液で予め平衡化させたニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）アガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ社）に全膜を負荷した。未結合タンパク質を除去するため、カラムを４回、それぞれ２０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液および３０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液で洗浄した。２５０ｍＭイミダゾールを含有する溶離緩衝液でカラムに結合したＨｉｓタグ化タンパク質を６つの画分に溶離させた。

別法として、ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン）をタンパク質精製に用いた。最初に可溶化膜タンパク質を０．４５μｍフィルターおよび０．２２μｍフィルターでろ過し、次いで、２０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液で予め平衡化させたＨｉｓ−Ｔｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に負荷した。カラムを１０回、それぞれ２０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液および３０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液で洗浄することにより、未結合タンパク質を除去した。カラムに結合したタンパク質の溶離には、溶離緩衝液のイミダゾール濃度を漸増させた勾配溶離を用いた。

マウスの免疫感作：
透析を一晩実施した後、０．２５％ＤＤＭを含有するＰＢＳ ２５０ｍｌからなる透析緩衝液で２時間の透析を２回実施することによりイミダゾールを除去した。ＤＣキット（ｂｉｏｒａｄ社）を用いてタンパク質を定量化した後、試料を約６μｇ／ｍｌに希釈し、マウス１匹当たり０．６μｇ注射した。マウス１０匹からなる２つのグループに非グリコシル化ＣｏｍＰまたはＣＰＳコンジュゲートＣｏｍＰのいずれかを注射した。免疫感作前および免疫感作から７日後と２１日後にマウスから血清を採取した。第１４日に追加免疫を実施した。

全細胞ＥＬＩＳＡ。
肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１４（Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ社、デンマーク）をＢＨＩブロス中、３７℃、５％ＣＯ_２好気条件下で一晩増殖させた。細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、ＯＤを０．６に調節した。次いで、細胞を６０℃で２時間インキュベートすることによって熱不活化した後、Ｃｏｒｎｉｎｇ高結合９６ウェルプレートに固定化した（５０μＬ／ウェル）。プレートを４℃で一晩インキュベートした。翌日、ウェルを１×ＰＢＳ（１００μＬ／ウェル）で３回洗浄した後、５％脱脂乳で２時間ブロックした。ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。次いで、ＰＢＳＴに溶かした２．５％脱脂乳で１：５００に希釈したマウス血清（１００μＬ／ウェル）をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。陽性対照には、血清型１４のＣＰＳに対する市販のウサギポリクローナル抗体を用いた（Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社）。陰性対照ウェルは一次抗体の代わりに脱脂乳で処理した。一次抗体とインキュベートした後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。次いで、二次ＨＲＰコンジュゲート抗体（１００μＬ／ウェル）と１時間インキュベートした。使用した抗体は、ＰＢＳＴに溶かした２．５％脱脂乳で希釈した抗マウスＩｇＭ（１：１００００）、抗マウスＩｇＧ（１：１００００）および抗ウサギ（１：５０００）ＨＲＰコンジュゲート抗体であった。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、各ウェルに発色基質ＴＭＢ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１００μＬを加え、プレートを室温で５分間インキュベートした後、ＢｉｏＴｅｋ（商標）プレートリーダーを用いて６５０ｎｍでの吸光度を測定した。

莢膜多糖体（ＣＰＳ）およびＯ抗原などの細菌表面グリカンは、グリカン特異的防御を生じさせることが明らかにされていることから、優れたワクチン候補である。前記グリカンを単独で使用すると、Ｔ細胞依存性免疫応答が誘発されるが記憶細胞は形成されず、防御を維持するにはのちに追加免疫を実施する必要がある。その結果、５５歳未満の成人にグリカン単独ワクチンの効果が十分に報告されている。しかし、５歳未満の小児のこれらのワクチンに対する応答は、仮にあるとしても不十分なものであり、これは、この年齢では脾臓および血液中のＢ細胞表面のＣＤ２１発現量が少ないことが原因であると考えられている。高齢者では、生理的な加齢に伴って造血組織および一次リンパ器官が萎縮し、Ｂ細胞およびＴ細胞の産生の低下が起こるため、多糖体ワクチンの効果が減少する（Ｇｒｉｆｆｉｏｅｎら，１９９１；Ｓｉｍｅｌｌら，２００８）（Ｐａｃｅによる概説，２０１３）。

表面グリカンと免疫原性タンパク質とを結合させたコンジュゲートワクチンでは、グリカン単独のワクチンと比較して疾患の発生率の大幅な低下が認められている。コンジュゲートワクチンは、表面グリカンが免疫原性タンパク質とコンジュゲートされており、これにより、のちの感染に対して記憶細胞の発生にも関連するより強力な免疫応答であるＴ細胞依存性免疫応答が誘発される。コンジュゲートワクチンは５歳未満の小児にその効果が認められており、これは、幼児のＴ細胞が、成人の免疫表現型を呈し、コンジュゲートワクチン抗原に対して同程度に堅固な免疫応答を示すことに起因するものと考えられる（Ｔｉｍｅｎｓら，１９８９）。以上の理由から、コンジュゲートワクチンはワクチン市場で勢いを増している（Ｐａｃｅによる概説，２０１３）。

現在市場に出ているコンジュゲートワクチンの大部分は、グリカンとタンパク質とを化学的にコンジュゲートさせることによって合成されるものであるが、その工程には費用が掛かり、多数の欠点がみられる（ＤｉｃｋおよびＢｅｕｒｒｅｔ，１９８９；Ｐｅｅｔｅｒｓら，２００３；Ｌｅｅｓら，２００６）。ワクチンの製造コストを削減し工程の効率を向上させる方法の１つとして、ＯＴａｓｅを利用してこのコンジュゲーションを細菌で実施することが提案されている（Ｔｅｒｒａら，２０１２）。細菌発現系（通常、設計された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株）で異種発現させたＯＴａｓｅにより脂質結合グリカンをアクセプタータンパク質に転移させた後、糖タンパク質を精製する。ＯＴａｓｅコンジュゲートワクチンの例としては、特に限定されないが、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）および志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）に対するワクチンが挙げられる（Ｈｏｒｚｅｍｐａら，２００８；Ｃｕｃｃｕｉら，２０１３；Ｇａｒｃｉａ−Ｑｕｉｎｔａｎｉｌｌａら，２０１４；Ｋａｍｐｆら，２０１５；Ｒａｖｅｎｓｃｒｏｆｔら，２０１５）。

コンジュゲートワクチンを作製するためＯＴａｓｅのうち現時点で最も特徴が明らかにされているものとして、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）Ｎ−ＯＴａｓｅ ＰｇｌＢ（ＣｊＰｇｌＢ）のほか、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯ−ＯＴａｓｅｓ ＴｆｐＯ／ＰｉｌＯおよび髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＮｍＰｇｌＬがある。上に挙げたＯＴａｓｅは、転移されるグリカンおよびそれがグリコシル化する範囲のアクセプタータンパク質に対して特異的であることがわかっている。

アクセプタータンパク質に関して、ＣｊＰｇｌＢは、グリカンをアクセプタータンパク質のシークオンＤ／ＥＸ_１ＮＸ_２Ｓ／Ｔ内にあるＡｓｎ残基に転移させ、ここでは、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸であり、−２位の残基は酸性アミノ酸、すなわちグルタミン酸（Ｄ）またはアスパラギン酸（Ｅ）である（Ｋｏｗａｒｉｋら，２００６）。ＣｊＰｇｌＢのグリコシル化にはＤＱＮＡＴシークオンが最適なものであることが明らかにされている（Ｃｈｅｎら，２００７）。この「グリコタグ」と呼ばれるシークオンを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）マルトース結合タンパク質ＭａｌＥなどの非グリコシル化タンパク質のＮ末端またはＣ末端に挿入することにより、ＣｊＰｇｌＢによるグリコシル化が誘導された（Ｆｉｓｈｅｒら，２０１０）。

これまでにＯ−ＯＴａｓｅのグリコシル化部位のコンセンサス配列は確認されていない。代わりに、同定されたグリコシル化残基は低複雑性領域にあり、セリン残基、プロリン残基およびアラニン残基が多数含まれている（Ｖｉｋら，２００９）。このことは、アクセプタータンパク質はＯ−ＯＴａｓｅの天然の基質に限定されることを意味し、ＴｆｐＯの場合、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）１２４４菌株のＩＶ型ピリンＰｉｌＡであり、ＮｍＰｇｌＬの場合、様々なタンパク質であるということになる。しかし、Ｎ−グリコシル化グリコタグに対する同様の考え方が緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に用いられており、この場合、ＴｆｐＯは、ＰｉｌＡのＣ末端の１５残基（グリコシル化部位がある場所）をタンパク質のＣ末端に融合してほかのタンパク質をグリコシル化することができた（Ｑｕｔｙａｎら，２０１０）。

グリカン特異性に関して、ＣｊＰｇｌＢは、グリカンをアクセプタータンパク質に転移させるのに、還元末端のＣ−２の位置にアセトアミド基を必要とする。さらに、ＣｊＰｇｌＢは、グリカンの還元末端にＦｕｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃおよびＢａｃなどのＮ−アセチル化糖残基を有するグリカンのみを転移させることが明らかにされている（Ｆｅｌｄｍａｎら，２００５；Ｗａｃｋｅｒら，２００６）。さらにＣｊＰｇｌＢは、Ｏ抗原に相当する類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）のＯ多糖ＩＩを転移させることがわかっている。このグリカンは、グルコースとＯ−アセチルデオキシタロースとからなる二糖反復サブユニットのポリマーである（Ｇａｒｃｉａ−Ｑｕｉｎｔａｎｉｌｌａら，２０１４）。

ＴｆｐＯ／ＰｉｌＯは複数のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｏ抗原をＰｉｌＡに転移させることが明らかにされており、そのＯ抗原はいずれも還元末端にＦｕｃＮＡｃを有する三糖または四糖である。ＴｆｐＯはほかにも、還元末端にＧａｌＮＡｃを有する四糖である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７抗原を転移させた（ＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏら，２００２；Ｈｏｒｚｅｍｐａら，２００６）。さらに、ＴｆｐＯは、還元末端にＧｌｃＮＡｃを有する五糖である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７抗原の短鎖オリゴ糖のみを転移させることが明らかにされており、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）コンジュゲートワクチンは別として、そのコンジュゲートワクチンワクチン産業への可能性は大幅に限定される（Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒら，２００７）。

その一方で、ＮｍＰｇｌＬはＴｆｐＯよりもグリカン特異性が緩く、還元末端にＮ−アセチル化グリカンを有する糖のほかにも、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）Ｓ．チフィリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）Ｏ抗原（ＣｊＰｇｌＢのよって転移されなかった）に特徴的な還元末端にＧａｌ残基を有するグリカンを転移させることが明らかにされている。Ｏ−ＯＴａｓｅのＮｍＰｇｌＬとＴｆｐＯは、グリカン特異性およびタンパク質特異性が異なっていることに加え、配列および系統も異なっており、両酵素が２種類の異なるクラスのＯ−ＯＴａｓｅを構成していることが示唆される。ＰｇｌＬ様ＯＴａｓｅは、ＴｆｐＯ様ＯＴａｓｅよりも転移させることが可能なオリゴ糖が長く、グリカン特異性も緩いことを考えると、ＴｆｐＯ様ＯＴａｓｅよりもはるかに優れたものであり、糖鎖工学に秘める可能性も大きいものと思われる。

これまでに特徴が明らかにされているＯＴａｓｅはいずれも、還元末端にグルコース残基を有するグリカンを転移させることはできないという制約がある。このようなグリカンは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を一例とするストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属のメンバーの莢膜ポリサカリド（ｐｏｌｙｓａｃｈａｒｉｄｅ）に特徴的なものである。

ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）または肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）は、幼児および小児の細菌性髄膜炎の主な原因の１つである。５歳未満の小児、高齢者および易感染患者は、市中肺炎球菌感染症に感染するリスクが特に高い（Ｗａｔｓｏｎらによる概説，１９９３）。２０００年の肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）感染症の内輪の見積もりでは、１４５０万例と予測されている。５歳未満の小児では、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）を原因とする死亡率が毎年８２６０００人にのぼると推定されており、これは５歳未満の小児の死亡例の約１１％を占める（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，２００９）。肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）には９０を超える血清型が同定されており、肺炎球菌ワクチンの土台となる多糖体莢膜の構造および免疫原性はそれぞれ異なっている（Ｌｕｎｄ，１９７０；Ｋａｄｉｏｇｌｕら，２００８）。市販されている肺炎球菌コンジュゲートワクチンは、ＣＰＳと修飾ジフテリア毒素ＣＲＭ_１９７とを化学的にコンジュゲートすることによって製造され、その効果は極めて高いものの、ＣＤＣワクチン価格リストによれば、多糖体単独のワクチンよりもはるかに価格が高い。このため、外国からの支援がない低所得国では肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）ワクチン計画の実現が遅れている（Ｗｅｎｇｅｒ，２００１；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら，２０１１）。

したがって、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）のＣＰＳと肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）などのアクセプタータンパク質とを生物学的にコンジュゲートさせることが可能なＯＴａｓｅがあれば、この細菌に対する予防接種に革命がもたらされ、ワクチンの価格が大幅に下がり、最終的には、特に低所得国での病苦が軽減され、小児死亡数が減少するものと考えられる。

本実施例では、新規なクラスのＯ−ＯＴａｓｅを構成すると思われるＯ−ＯＴａｓｅが提供される。このＯＴａｓｅはＰｇｌＬ_ＣｏｍＰと呼ばれ、非病原性菌株であるアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）ｂａｙｌｙｉで同定されたものである（Ｈａｒｄｉｎｇら，２０１５）。このＯＴａｓｅは、ＰｇｌＬ様ＯＴａｓｅと系統および配列が類似しており、転移させるグリカンも類似している（図１２）。しかし、アクセプタータンパク質はＩＶ型ピリンＣｏｍＰの１つのみであり、これはＴｆｐＯ様ＯＴａｓｅに類似した特徴である。本実施例は、ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰが肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１４のＣＰＳ（還元末端にグルコース残基を有する）をＣｏｍＰに転移させることが可能であるのに対し、これまでに同定されているＯＴａｓｅはいずれも、還元末端にグルコースを含む糖を転移させることができないことを示すものである（図１３）。この知見は、特に限定されないが、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ブタ病原菌のブタ連鎖球菌（Ｓ．ｓｕｉｓ）およびウシ病原菌のＳ．ウベリス（Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ）などの他の連鎖球菌を含めたストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）のコンジュゲートワクチンの製造へのＰｇｌＬ_ＣｏｍＰの様々な応用に道を開くものである。

実施例３
本実施例では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いＰｇｌＬ_ＣｏｍＰを介してＣｏｍＰとコンジュゲートさせたＣＰＳ１４を注射することにより、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１４の莢膜に対するＩｇＧ免疫応答が生じることを示す証拠が提供される。

この実施例では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１４の莢膜多糖体とコンジュゲートしたＣｏｍＰがマウスモデルに免疫原性応答を生じさせるかどうかを明らかにしようとした。ＣＰＳとコンジュゲートしたｈｉｓタグＣｏｍＰまたは非グリコシル化形態のｈｉｓタグＣｏｍＰを過剰発現させ、界面活性剤で可溶化した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＤＢ１全膜からニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。免疫感作には、ＣＰＳコンジュゲートＣｏｍＰをマウス（ｎ＝１０）１匹当たり６０ｎｇ使用し、対照群として、各マウスを（ｎ＝１０）非グリコシル化ＣｏｍＰ ６０ｎｇで感作させた。第１４日に追加免疫の糖タンパク質を投与し、（第７日および第２１日に）免疫前および免疫後の血清を採取した。免疫原性応答の有無を判定するため、熱殺菌した肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１４を９６ウェルプレートに固定化することにより全細胞ＥＬＩＳＡを実施した。第７日の免疫前および免疫後の血清には全細胞に対する免疫応答がみられなかった。ＣＰＳコンジュゲートＣｏｍＰを注射したマウスの第２１日の免疫後の血清は、この血清型に対してＩｇＭ主体のわずかな免疫応答およびＩｇＧ主体の強い免疫応答を示した。グリコシル化ＣｏｍＰを注射した陰性対照マウスにはＩｇＧ免疫応答はみられなかった（図１４、１５、１６Ａ）。（一次抗体で処理しなかった）陰性対照ウェルには反応性がみられなかったのに対し、市販の抗ＣＰＳ１４抗体（ＳＳＩ社、Ｄｅｎｍａｒｋ）で処理したウェルには強い反応性がみられた（図１６Ｂ）。マウス血清を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＬＭ３７からの肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＣＰＳの発現を調べたウエスタンブロットでも同様の結果がみられた（図１７）。

Ａａｓ，Ｆ．Ｅ．， Ｅｇｇｅ−Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｗ．， Ｗｉｎｔｈｅｒ−Ｌａｒｓｅｎ，Ｈ．Ｃ．， Ｌｏｖｏｌｄ，Ｃ．， Ｈｉｔｃｈｅｎ，Ｐ．Ｇ．， Ｄｅｌｌ，Ａ．， ＆ Ｋｏｏｍｅｙ，Ｍ．（２００６）．Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ｔｙｐｅ ＩＶ ｐｉｌｉ ｕｎｄｅｒｇｏ ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ，ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ ａｎ ｅｎｚｙｍｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８１（３８）：２７７１２−２３．
Ａｂｄ−Ｅｌ−Ｈａｌｅｅｍ，Ｄ．， Ｍｏａｗａｄ，Ｈ．， Ｚａｋｉ，Ｅ．Ａ．， ＆ Ｚａｋｉ，Ｓ．（２００２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｅｎｏｌ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｅｇｙｐｔｉａｎ ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ ４３（２）：２１７−２４．
Ａｒｒｏｙｏ，Ｌ．Ａ．， Ｍａｔｅｏｓ，Ｉ．， Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｖ．， ＆ Ａｚｎａｒ，Ｊ．（２００９）．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎｅ，ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ，ａｎｄ ｃｏｌｉｓｔｉｎ−ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｌｔｉ−ａｎｄ ｐａｎｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ｇｒｏｕｐ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ５３（３）：１２９５−６．

Ｂａｌｏｎｏｖａ，Ｌ．， Ｍａｎｎ，Ｂ．Ｆ．， Ｃｅｒｖｅｎｙ，Ｌ．， Ａｌｌｅｙ，Ｗ．Ｒ．， Ｃｈｏｖａｎｃｏｖａ，Ｅ．， Ｆｏｒｓｌｕｎｄ，Ａ．−Ｌ．， ．．． Ｓｔｕｌｉｋ，Ｊ．（２０１２）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ＭＣＰ １１（７）：Ｍ１１１．０１５０１６．
Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｓ．Ｄ．， Ａａｎｅｎｓｅｎ，Ｄ．Ｍ．， Ｍａｖｒｏｉｄｉ，Ａ．， Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｄ．， Ｒａｂｂｉｎｏｗｉｔｓｃｈ，Ｅ．， Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｍ．， ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｐｓｕｌａｒ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｏｃｕｓ ｆｒｏｍ ａｌｌ ９０ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ．ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ ２：ｅ３１．
Ｂｏｒｕｄ，Ｂ．， Ｖｉｂｕｒｉｅｎｅ，Ｒ．， Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｍ．Ｄ．， Ｐａｕｌｓｅｎ，Ｂ．Ｓ．， Ｅｇｇｅ−Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｗ．， Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ，Ｂ．， ＆ Ｋｏｏｍｅｙ，Ｍ．（２０１１）．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｅｓ ｒｅｖｅａｌ ａｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ ｆｏｒ ｇｌｙｃａｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０８（２３）：９６４３−８．
Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｃ．Ａ．， Ｂａｒｂｅｒｉｓ，Ｐ．Ａ．， ＆ Ｄｅｍｅｒｙ，Ｄ．Ａ．（１９８５）．Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｎ５−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｖｉｒｕｌｅｎｔ Ｍｕｔａｎｔｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １３１（９）：２４４９−２４５７．
Ｂｒｚｏｓｋａ，Ａ．Ｊ．， Ｈａｓｓａｎ，Ｋ．Ａ．， ｄｅ Ｌｅｏｎ，Ｅ．Ｊ．， Ｐａｕｌｓｅｎ，Ｉ．Ｔ．， ＆ Ｌｅｗｉｓ，Ｐ．Ｊ．（２０１３）．Ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｅｐ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ ＡＤＰ１ ｍｕｔａｎｔｓ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｅｆｆｌｕｘ ｓｙｓｔｅｍｓ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ８（２）：ｅ５６０９０．

Ｃａｇａｔａｙ，Ｔ．Ｉ．， ＆ Ｈｉｃｋｆｏｒｄ，Ｊ．Ｇ．Ｈ．（２００８）．Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅ−ＩＶ ｆｉｍｂｒｉａｅ ｏｆ Ｄｉｃｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｎｏｄｏｓｕｓ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １２６（１−３）：１６０−７．

Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．， Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｐ．Ａ．， Ｔｒａｃｙ，Ｅ．Ｎ．， ＆ Ｍｕｎｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．（２０１３）．Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ Ｕｔｉｌｉｚｅｓ ａ Ｔｙｐｅ ＶＩ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（１２）：ｅ５９３８８．
Ｃａｓｔｒｉｃ，Ｐ．（１９９５）．ｐｉｌＯ，ａ ｇｅｎｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １２４４ ｐｉｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１：１２４７−５４．
Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ，Ｍ．−Ｅ．， Ｇｉｒａｒｄ，Ｖ．， Ｎｉｋｏｌａｋａｋｉｓ，Ａ．， Ｃａｍｐｏｓ，Ｍ．， Ｂｅｒｔｈｉａｕｍｅ，Ｆ．， Ｄｕｍａｓ，Ｆ．， ．．． Ｍｏｕｒｅｚ，Ｍ．（２００７）．Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｅｎｓｕｒｅｓ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ａｄｈｅｓｉｎ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｕｓｅ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８９（２４）：８８８０−９．
Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｍ．， Ｇｌｏｖｅｒ，Ｋ．Ｊ．， ａｎｄ Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ，Ｂ．（２００７）Ｆｒｏｍ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４６：５５７９−８５．
Ｃｈｏｉ，Ａ．Ｈ．Ｋ．， Ｓｌａｍｔｉ，Ｌ．， Ａｖｃｉ，Ｆ．Ｙ．， Ｐｉｅｒ，Ｇ．Ｂ．， ＆ Ｍａｉｒａ−Ｌｉｔｒａｎ，Ｔ．（２００９）．Ｔｈｅ ｐｇａＡＢＣＤ ｌｏｃｕｓ ｏｆ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ｅｎｃｏｄｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ−ｂｅｔａ−１−６−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｂｉｏｆｉｌｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １９１（１９）：５９５３−６３．
Ｃｈｏｉ，Ｃ．Ｈ．， Ｈｙｕｎ，Ｓ．Ｈ．， Ｌｅｅ，Ｊ．Ｙ．， Ｌｅｅ，Ｊ．Ｓ．， Ｌｅｅ，Ｙ．Ｓ．， Ｋｉｍ，Ｓ．Ａ．， ．．． Ｌｅｅ，Ｊ．Ｃ．（２００８）．Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｔａｒｇｅｔｓ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １０（２）：３０９−１９．
Ｃｏｍｅｒ，Ｊ．Ｅ．， Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｍ．Ａ．， Ｂｌａｎｃｈ，Ｖ．Ｊ．， Ｄｅａｌ，Ｃ．Ｄ．， ＆ Ｃａｓｔｒｉｃ，Ｐ．（２００２）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １２４４ ｐｉｌｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７０（６）：２８３７−４５．
Ｃｏｔｅ，Ｊ．−Ｐ．， Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ，Ｍ．−Ｅ．， ＆ Ｍｏｕｒｅｚ，Ｍ．（２０１３）．Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴｉｂＡ ｓｅｌｆ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｈｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ８（１１）：ｅ８０７３９．
Ｃｏｙｎｅ，Ｍ．Ｊ．， Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｃ．Ｍ．， Ｃｈａｔｚｉｄａｋｉ−Ｌｉｖａｎｉｓ，Ｍ．， Ｐｏｓｃｈ，Ｇ．， Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｃ．， ＆ Ｃｏｍｓｔｏｃｋ，Ｌ．Ｅ．（２０１３）．Ｐｈｙｌｕｍ−ｗｉｄｅ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ８８（４）：７７２−８３．
Ｃｕｃｃｕｉ，Ｊ．， Ｔｈｏｍａｓ，Ｒ．Ｍ．， Ｍｏｕｌｅ，Ｍ．Ｇ．， Ｄ’Ｅｌｉａ，Ｒ．Ｖ，Ｌａｗｓ，Ｔ．Ｒ．， Ｍｉｌｌｓ，Ｄ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ．Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ ３：１３０００２．

Ｄｅ Ｂｅｒａｒｄｉｎｉｓ，Ｖ．， Ｖａｌｌｅｎｅｔ，Ｄ．， Ｃａｓｔｅｌｌｉ，Ｖ．， Ｂｅｓｎａｒｄ，Ｍ．， Ｐｉｎｅｔ，Ａ．， Ｃｒｕａｕｄ，Ｃ．， ．．． Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ，Ｊ．（２００８）．Ａ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ ＡＤＰ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：１７４．
Ｄｉｃｋ，Ｗ．Ｅ．， ａｎｄ Ｂｅｕｒｒｅｔ，Ｍ．（１９８９）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ａ ｓｕｒｖｅｙ ａｎｄ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｏｎｔｒｉｂ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０：４８−１１４．
ＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ａ．， Ｍａｔｅｗｉｓｈ，Ｍ．Ｊ．， Ｂｉｓａｉｌｌｏｎ，Ａ．， Ｓｔｅｈｌｅ，Ｊ．Ｒ．， Ｌａｍ，Ｊ．Ｓ．， ａｎｄ Ｃａｓｔｒｉｃ，Ｐ．（２００２）Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １２４４ ｐｉｌｉｎ：ｇｌｙｃａｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４６：５１９−３０．

Ｅｇｇｅ−Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｗ．， Ｓａｌｏｍｏｎｓｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．， Ａａｓ，Ｆ．Ｅ．， Ｆｏｒｓｌｕｎｄ，Ａ．−Ｌ．， Ｗｉｎｔｈｅｒ−Ｌａｒｓｅｎ，Ｈ．Ｃ．， Ｍａｉｅｒ，Ｊ．， ．．． Ｋｏｏｍｅｙ，Ｍ．（２０１１）．Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰｉｌＡ ｐｉｌｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｉｖｅ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １９３（１９）：５４８７−９７．

Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒ，Ａ．， Ｆｅｎｔａｂｉｌ，Ｍ．Ａ．， Ｍｉｌｌｓ，Ｄ．Ｃ．， Ｋｌａｓｓｅｎ，Ｊ．Ｓ．， ＆ Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．（２００７）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｏ ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８９（２２）：８０８８−９８．
Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．， Ｗａｃｋｅｒ，Ｍ．， Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｍ．， Ｈｉｔｃｈｅｎ，Ｐ．Ｇ．， Ｍａｒｏｌｄａ，Ｃ．Ｌ．， Ｋｏｗａｒｉｋ，Ｍ．， ．．． Ａｅｂｉ，Ｍ．（２００５）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｉｖｅｒｓｅ Ｏ ａｎｔｉｇｅｎ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０２（８）：３０１６−２１．
Ｆｉｓｈｅｒ，Ａ．Ｃ．， Ｈａｉｔｊｅｍａ，Ｃ．Ｈ．， Ｇｕａｒｉｎｏ，Ｃ．， Ｃｅｌｉｋ，Ｅ．， Ｅｎｄｉｃｏｔｔ，Ｃ．Ｅ．， Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｃ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ａｎｄ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７７：８７１−８８１．

Ｇａｒｃｉａ−Ｑｕｉｎｔａｎｉｌｌａ，Ｆ．， Ｉｗａｓｈｋｉｗ，Ｊ．Ａ．， Ｐｒｉｃｅ，Ｎ．Ｌ．， Ｓｔｒａｔｉｌｏ，Ｃ．， ａｎｄ Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．（２０１４）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ．Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５：３８１．
Ｇｅｂｈａｒｔ，Ｃ．， Ｉｅｌｍｉｎｉ，Ｍ．Ｖ．， Ｒｅｉｚ，Ｂ．， Ｐｒｉｃｅ，Ｎ．Ｌ．， Ａａｓ，Ｆ．Ｅ．， Ｋｏｏｍｅｙ，Ｍ．， ＆ Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．（２０１２）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ ａｎｄ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２２（７）：９６２−７４．
Ｇｏｒｄｏｎ，Ｎ．Ｃ．， ＆ Ｗａｒｅｈａｍ，Ｄ．Ｗ．（２０１０）．Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ３５（３）：２１９−２６．
Ｇｏｔｔｉｇ，Ｓ．， Ｇｒｕｂｅｒ，Ｔ．Ｍ．， Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｐ．Ｇ．， Ｗａｃｈｓｍｕｔｈ，Ｍ．， Ｓｅｉｆｅｒｔ，Ｈ．， ＆ Ｋｅｍｐｆ，Ｖ．Ａ．Ｊ．（２０１４）．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎ ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ｉｎ Ｇｅｒｍａｎｙ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ６９（９）：２５７８−９．
Ｇｒｉｆｆｉｏｅｎ，Ａ．Ｗ．， Ｒｉｊｋｅｒｓ，Ｇ．Ｔ．， Ｊａｎｓｓｅｎｓ−Ｋｏｒｐｅｌａ，Ｐ．， ａｎｄ Ｚｅｇｅｒｓ，Ｂ．Ｊ．（１９９１）Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ Ｃ３ｄ ｂｉｎｄ ｔｏ ｈｕｍａｎ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｖｉａ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ２．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５９：１８３９−４５．
Ｇｒｏｓｓ，Ｊ．， Ｇｒａｓｓ，Ｓ．， Ｄａｖｉｓ，Ａ．Ｅ．， Ｇｉｌｍｏｒｅ−Ｅｒｄｍａｎｎ，Ｐ．， Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｒ．Ｒ．， ＆ Ｓｔ Ｇｅｍｅ，Ｊ．Ｗ．（２００８）．Ｔｈｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＭＷ１ ａｄｈｅｓｉｎ ｉｓ ａ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａｎ ｕｎｕｓｕａｌ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８３（３８）：２６０１０−５．

Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｃ．Ｍ．， Ｔｒａｃｙ，Ｅ．Ｎ．， Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．， Ｒａｔｈｅｒ，Ｐ．Ｎ．， Ａｃｔｉｓ，Ｌ．Ａ．， ＆ Ｍｕｎｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．（２０１３）．Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ｓｔｒａｉｎ Ｍ２ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｔｙｐｅ ＩＶ ｐｉｌｉ ｗｈｉｃｈ ｐｌａｙ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｗｉｔｃｈｉｎｇ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｂｕｔ ｎｏｔ ｓｕｒｆａｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｔｉｌｉｔｙ．ｍＢｉｏ ４（４）：ｅ００３６０−１３．
Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｃ．Ｍ．， Ｎａｓｒ，Ｍ．Ａ．， Ｋｉｎｓｅｌｌａ，Ｒ．Ｌ．， Ｓｃｏｔｔ，Ｎ．Ｅ．， Ｆｏｓｔｅｒ，Ｌ．Ｊ．， Ｗｅｂｅｒ，Ｂ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｃａｒｒｙ ｔｗｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ，ｏｎｅ ｄｅｖｏｔｅｄ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ ｔｏ ｔｙｐｅ ＩＶ ｐｉｌｉｎ，ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｏｎｅ ｄｅｄｉｃａｔｅｄ ｔｏ Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｈｏｒｚｅｍｐａ，Ｊ．， Ｄｅａｎ，Ｃ．Ｒ．， Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｊ．Ｂ．， ａｎｄ Ｃａｓｔｒｉｃ，Ｐ．（２００６）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １２４４ ｐｉｌｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ：ｇｌｙｃａｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８８：４２４４−５２．
Ｈｏｒｚｅｍｐａ，Ｊ．， Ｈｅｌｄ，Ｔ．Ｋ．， Ｃｒｏｓｓ，Ａ．Ｓ．， Ｆｕｒｓｔ，Ｄ．， Ｑｕｔｙａｎ，Ｍ．， Ｎｅｅｌｙ，Ａ．Ｎ．， ａｎｄ Ｃａｓｔｒｉｃ，Ｐ．（２００８）Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １２４４ ｐｉｌｉｎ ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｏ−ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：５９０−７．
Ｈｕ，Ｄ．， Ｌｉｕ，Ｂ．， Ｄｉｊｋｓｈｏｏｒｎ，Ｌ．， Ｗａｎｇ，Ｌ．， ＆ Ｒｅｅｖｅｓ，Ｐ．Ｒ．（２０１３）．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ８（７）：ｅ７０３２９．
Ｈｕｇ，Ｉ．， ＆ Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．（２０１１）．Ａｎａｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２１（２）：１３８−５１．
Ｉｅｌｍｉｎｉ，Ｍ．Ｖ，＆ Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．（２０１１）．Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ ＰｇｌＢ ｈｏｍｏｌｏｇ ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｘｅｄ ｇｌｙｃａｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２１（６）：７３４−４２．

Ｉｗａｓｈｋｉｗ，Ｊ．Ａ．， Ｓｅｐｅｒ，Ａ．， Ｗｅｂｅｒ，Ｂ．Ｓ．， Ｓｃｏｔｔ，Ｎ．Ｅ．， Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ，Ｅ．， Ｓｔｒａｔｉｌｏ，Ｃ．， ．．． Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．（２０１２）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ８（６）：ｅ１００２７５８．
Ｉｗａｓｈｋｉｗ，Ｊ．Ａ．， Ｖｏｚｚａ，Ｎ．Ｆ．， Ｋｉｎｓｅｌｌａ，Ｒ．Ｌ．， ＆ Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．（２０１３）．Ｐｏｕｒ ｓｏｍｅ ｓｕｇａｒ ｏｎ ｉｔ：ｔｈｅ ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｗｏｒｌｄ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ８９（１）：１４−２８．

Ｋａｄｉｏｇｌｕ，Ａ．， Ｗｅｉｓｅｒ，Ｊ．Ｎ．， Ｐａｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．， ａｎｄ Ａｎｄｒｅｗ，Ｐ．Ｗ．（２００８）Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｈｏｓｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６：２８８−３０１．
Ｋａｍｐｆ，Ｍ．Ｍ．， Ｂｒａｕｎ，Ｍ．， Ｓｉｒｅｎａ，Ｄ．， Ｉｈｓｓｅｎ，Ｊ．， Ｔｈｏｎｙ−Ｍｅｙｅｒ，Ｌ．， ａｎｄ Ｒｅｎ，Ｑ．（２０１５）Ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ １４：１２．
Ｋｏｗａｒｉｋ，Ｍ．， Ｙｏｕｎｇ，Ｎ．Ｍ．， Ｎｕｍａｏ，Ｓ．， Ｓｃｈｕｌｚ，Ｂ．Ｌ．， Ｈｕｇ，Ｉ．， Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ，Ｎ．， ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ＥＭＢＯ Ｊ ２５：１９５７−６６．
Ｋｕｓ，Ｊ．Ｖ，Ｔｕｌｌｉｓ，Ｅ．， Ｃｖｉｔｋｏｖｉｔｃｈ，Ｄ．Ｇ．， ＆ Ｂｕｒｒｏｗｓ，Ｌ．Ｌ．（２００４）．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｙｐｅ ＩＶ ｐｉｌｉｎ ａｌｌｅｌｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ（ＣＦ）ｖｅｒｓｕｓ ｎｏｎ−ＣＦ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５０：１３１５−２６．

Ｌｅｅｓ，Ａ．， Ｓｅｎ，Ｇ．， ａｎｄ ＬｏｐｅｚＡｃｏｓｔａ，Ａ．（２００６）Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｍｉｎｏｏｘｙ ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｏｘｉｍｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：７１６−７２９．
Ｌｅｅｓ−Ｍｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ｇ．， Ｉｗａｓｈｋｉｗ，Ｊ．Ａ．， Ｓｃｏｔｔ，Ｎ．Ｅ．， Ｓｅｐｅｒ，Ａ．， Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ，Ｅ．， Ｓｃｈｉｌｄ，Ｓ．， ＆ Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．（２０１３）．Ａ ｃｏｍｍｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃａｐｓｕｌｅ ｉｎ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ８９（５）：８１６−３０．
Ｌｉｔｈｇｏｗ，Ｋ．Ｖ．， Ｓｃｏｔｔ，Ｎ．Ｅ．， Ｉｗａｓｈｋｉｗ，Ｊ．Ａ．， Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．Ｓ．， Ｆｏｓｔｅｒ，Ｌ．Ｊ．， Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．， ＆ Ｄｅｎｎｉｓ，Ｊ．Ｊ．（２０１４）．Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ９２（１）：１１６−１３７．
Ｌｏｇａｎ，Ｓ．Ｍ．（２００６）．Ｆｌａｇｅｌｌａｒ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ−ａ ｎｅｗ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ？ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５２：１２４９−６２．
Ｌｕｎｄ，Ｅ．（１９７０）Ｏｎ ｔｈｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｔｙｐｅｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ２０：３２１−３２３．

Ｍａｒａ，Ｋ．， Ｄｅｃｏｒｏｓｉ，Ｆ．， Ｖｉｔｉ，Ｃ．， Ｇｉｏｖａｎｎｅｔｔｉ，Ｌ．， Ｐａｐａｌｅｏ，Ｍ．Ｃ．， Ｍａｉｄａ，Ｉ．， ．．． Ｆａｎｉ，Ｒ．（２０１２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｔｒａｉｎｓ ａｂｌｅ ｔｏ ｄｅｇｒａｄｅ ｄｉｅｓｅｌ ｆｕｅｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １６３（３）：１６１−７２．
Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ Ａ．， Ｂｒｙａｎｔ ＳＨ．（２００４）．ＣＤ−Ｓｅａｒｃｈ：ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｌｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２（Ｗ）：３２７−３３１．
Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００９）．ＣＤＤ：ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３７（Ｄ）：２０５−１０．
Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）．ＣＤＤ：ａ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９（Ｄ）：２２５−９．
Ｍｅｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｆ．， ＆ Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｌ．（１９７６）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ（ｓｈａｐｅ−ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ）ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｉｕｍ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ７３（８）：２６８７−９１．
Ｍｕｓｕｍｅｃｉ，Ｍ．Ａ．， Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒ，Ａ．， Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．， ＆ Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．（２０１４）．Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｂｙ ｉｎ ｖｉｖｏ，ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ａｓｓａｙｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２４（１）：３９−５０．

Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ａ．（１９３８）．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｅｇｇ ａｌｂｕｍｉｎ．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ３２（９）：１４３５−５１．
Ｎｇｕｙｅｎ，Ｌ．Ｃ．， Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｆ．， Ｔｒａｎ，Ｑ．Ｍ．， Ｎａｉｔｏ，Ｋ．， Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．， Ｏｈｎｉｓｈｉ−Ｋａｍｅｙａｍａ，Ｍ．， ．．． Ｉｃｈｉｎｏｓｅ，Ｙ．（２０１２）．Ｔｙｐｅ ＩＶ ｐｉｌｉｎ ｉｓ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｔａｂａｃｉ ６６０５ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １３（７）：７６４−７４．
Ｎｏｔｈａｆｔ，Ｈ．， Ｓｃｏｔｔ，Ｎ．Ｅ．， Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ，Ｅ．， Ｌｉｕ，Ｘ．， Ｈｕ，Ｒ．， Ｂｅａｄｌｅ，Ｂ．， ．．． Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ，Ｃ．Ｍ．（２０１２）．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｇｅｎｕｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ＭＣＰ １１（１１）：１２０３−１９．
Ｎｏｔｈａｆｔ，Ｈ．， ＆ Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ，Ｃ．Ｍ．（２０１０）．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ：ｓｗｅｅｔｅｒ ｔｈａｎ ｅｖｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ８（１１）：７６５−７８．

Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｋ．Ｌ．， Ｗｏｌｆｓｏｎ，Ｌ．Ｊ．， Ｗａｔｔ，Ｊ．Ｐ．， Ｈｅｎｋｌｅ，Ｅ．， Ｄｅｌｏｒｉａ−Ｋｎｏｌｌ，Ｍ．， ＭｃＣａｌｌ，Ｎ．， ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｙｏｕｎｇｅｒ ｔｈａｎ ５ ｙｅａｒｓ：ｇｌｏｂａｌ ｅｓｔｉｍａｔｅｓ．Ｌａｎｃｅｔ ３７４：８９３−９０２．
Ｏｌｓｅｎ，Ｊ．Ｖ，Ｍａｃｅｋ，Ｂ．， Ｌａｎｇｅ，Ｏ．， Ｍａｋａｒｏｖ，Ａ．， Ｈｏｒｎｉｎｇ，Ｓ．， ＆ Ｍａｎｎ，Ｍ．（２００７）．Ｈｉｇｈｅｒ−ｅｎｅｒｇｙ Ｃ−ｔｒａｐ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４（９）：７０９−１２．

Ｐａｃｅ，Ｄ．（２０１３）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １３：１１−３３．
Ｐｅｅｔｅｒｓ，Ｃ．Ｃ．Ａ．Ｍ．， Ｌａｇｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｒ．， Ｗｅｅｒｓ，Ｏ．ｄｅ，Ｏｏｍｅｎ，Ｌ．Ａ．， Ｈｏｏｇｅｒｈｏｕｔ，Ｐ．， Ｂｅｕｒｒｅｔ，Ｍ．， ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８７：１５３−７４．
Ｐｅｒｅｚ，Ｊ．Ｍ．， ＭｃＧａｒｒｙ，Ｍ．Ａ．， Ｍａｒｏｌｄａ，Ｃ．Ｌ．， ＆ Ｖａｌｖａｎｏ，Ｍ．Ａ．（２００８）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｒｇｅ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｌｏｏｐ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＷａａＬ Ｏ−ａｎｔｉｇｅｎ ｌｉｇａｓｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７０（６）：１４２４−４０．
Ｐｏｒｓｔｅｎｄｏｒｆｅｒ，Ｄ．， Ｇｏｈｌ，Ｏ．， Ｍａｙｅｒ，Ｆ．， ＆ Ａｖｅｒｈｏｆｆ，Ｂ．（２０００）．ＣｏｍＰ，ａ Ｐｉｌｉｎ−Ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｉｎ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ ＢＤ４１３：Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８２（１３）：３６７３−３６８０．
Ｐｏｗｅｒ，Ｐ．， ＆ Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｍ．（２００３）．Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２１８（２）：２１１−２２２．
Ｐｏｗｅｒ，Ｐ．Ｍ．， Ｓｅｉｂ，Ｋ．Ｌ．， ＆ Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｍ．Ｐ．（２００６）．Ｐｉｌｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ｏｃｃｕｒｓ ｂｙ ａ ｓｉｍｉｌａｒ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｗｚｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｏ−ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３４７（４）：９０４−８．

Ｑｕｔｙａｎ，Ｍ．， Ｈｅｎｋｅｌ，Ｍ．， Ｈｏｒｚｅｍｐａ，Ｊ．， Ｑｕｉｎｎ，Ｍ．， ａｎｄ Ｃａｓｔｒｉｃ，Ｐ．（２０１０）Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｉｌｉｎ ａｎｄ Ｎｏｎｐｉｌｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｂｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １２４４．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９２：５９７２−５９８１．

Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ，Ｊ．， Ｍａｎｎ，Ｍ．， ＆ Ｉｓｈｉｈａｍａ，Ｙ．（２００７）．Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏ−ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ，ｐｒｅ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ＳｔａｇｅＴｉｐｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２（８）：１８９６−９０６．
Ｒａｖｅｎｓｃｒｏｆｔ，Ｎ．， Ｈａｅｕｐｔｌｅ，Ｍ．Ａ．， Ｋｏｗａｒｉｋ，Ｍ．， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｆ．Ｓ．， Ｃａｒｒａｎｚａ，Ｐ．， Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ａ．， ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ，ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ｃｗｖ０７７−．
Ｒｕａｎ，Ｘ．， Ｌｏｙｏｌａ，Ｄ．Ｅ．， Ｍａｒｏｌｄａ，Ｃ．Ｌ．， Ｐｅｒｅｚ−Ｄｏｎｏｓｏ，Ｊ．Ｍ．， ＆ Ｖａｌｖａｎｏ，Ｍ．Ａ．（２０１２）．Ｔｈｅ ＷａａＬ Ｏ−ａｎｔｉｇｅｎ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｌｉｇａｓｅ ｈａｓ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｃｏｍｍｏｎ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｌ ｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２２（２）：２８８−９９．

Ｓｃｈｕｌｚ，Ｂ．Ｌ．， Ｊｅｎ，Ｆ．Ｅ．Ｃ．， Ｐｏｗｅｒ，Ｐ．Ｍ．， Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．Ｅ．， Ｆｏｘ，Ｋ．Ｌ．， Ｋｕ，Ｓ．Ｃ．， ．．． Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｍ．Ｐ．（２０１３）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｏ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ８（５）：ｅ６２７６８．
Ｓｃｏｔｔ，Ｎ．Ｅ．， Ｋｉｎｓｅｌｌａ，Ｒ．Ｌ．， Ｅｄｗａｒｄｓ，Ａ．Ｖ．Ｇ．， Ｌａｒｓｅｎ，Ｍ．Ｒ．， Ｄｕｔｔａ，Ｓ．， Ｓａｂａ，Ｊ．， ．．． Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．（２０１４）．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｏｆ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ＭＣＰ １３（９）：２３５４−７０．
Ｓｃｏｔｔ，Ｎ．Ｅ．， Ｎｏｔｈａｆｔ，Ｈ．， Ｅｄｗａｒｄｓ，Ａ．Ｖ．Ｇ．， Ｌａｂｂａｔｅ，Ｍ．， Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃ，Ｓ．Ｐ．， Ｌａｒｓｅｎ，Ｍ．Ｒ．， ．．． Ｃｏｒｄｗｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．（２０１２）．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃａｎ ｂｙ ＥｐｔＣ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８７（３５）：２９３８４−９６．
Ｓｃｏｔｔ，Ｎ．Ｅ．， Ｐａｒｋｅｒ，Ｂ．Ｌ．， Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ａ．Ｍ．， Ｐａｕｌｅｃｈ，Ｊ．， Ｅｄｗａｒｄｓ，Ａ．Ｖ．Ｇ．， Ｃｒｏｓｓｅｔｔ，Ｂ．， ．．． Ｃｏｒｄｗｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．（２０１１）．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｇｌｙｃａｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｐａｒａｌｌｅｌ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＩＤ，ｈｉｇｈｅｒ ｅｎｅｒｇｙ ｃｏｌｌｉｓｉｏｎａｌ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ＭＳ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅＮ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｍｅ ｏｆ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ＭＣＰ １０（２）：Ｍ００００３１−ＭＣＰ２０１．
Ｓｉｍｅｌｌ，Ｂ．， Ｌａｈｄｅｎｋａｒｉ，Ｍ．， Ｒｅｕｎａｎｅｎ，Ａ．， Ｋａｙｈｔｙ，Ｈ．， ａｎｄ Ｖａｋｅｖａｉｎｅｎ，Ｍ．（２００８）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｇｅｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｄｅｒ ｏｎ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃａｐｓｕｌａｒ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｎｄ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：１３９１−１３９７．
Ｓｌｅｙｔｒ，Ｕ．Ｂ．（１９７５）．Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒ ａｒｒａｙｓ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２５７（５５２５）：４００−４０２．
Ｓｍｅｄｌｅｙ，Ｊ．Ｇ．， Ｊｅｗｅｌｌ，Ｅ．， Ｒｏｇｕｓｋｉｅ，Ｊ．， Ｈｏｒｚｅｍｐａ，Ｊ．， Ｓｙｂｏｌｄｔ，Ａ．， Ｓｔｏｌｚ，Ｄ．Ｂ．， ＆ Ｃａｓｔｒｉｃ，Ｐ．（２００５）．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｉｌｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １２４４ ｐｉｌｕｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７３（１２）：７９２２−３１．
Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ，Ｃ．Ｍ．， Ｙａｏ，Ｒ．， Ｅｗｉｎｇ，Ｃ．Ｐ．， Ｔｒｕｓｔ，Ｔ．Ｊ．， ＆ Ｇｕｅｒｒｙ，Ｐ．（１９９９）．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３２（５）：１０２２−１０３０．

Ｔａｎｇ，Ｇ．， ＆ Ｍｉｎｔｚ，Ｋ．Ｐ．（２０１０）．Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｄｈｅｓｉｎ ＥｍａＡ ｏｆ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｕｐｏｎ ｔｈｅ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １９２（５）：１３９５−４０４．
Ｔｅｒｒａ，Ｖ．Ｓ．， Ｍｉｌｌｓ，Ｄ．Ｃ．， Ｙａｔｅｓ，Ｌ．Ｅ．， Ａｂｏｕｅｌｈａｄｉｄ，Ｓ．， Ｃｕｃｃｕｉ，Ｊ．， ａｎｄ Ｗｒｅｎ，Ｂ．Ｗ．（２０１２）Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃａｎ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ．Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６１：９１９−９２６．
Ｔｉｍｅｎｓ，Ｗ．， Ｂｏｅｓ，Ａ．， Ｒｏｚｅｂｏｏｍ−Ｕｉｔｅｒｗｉｊｋ，Ｔ．， ａｎｄ Ｐｏｐｐｅｍａ，Ｓ．（１９８９）Ｉｍｍａｔｕｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｓｐｌｅｎｉｃ ｍａｒｇｉｎａｌ ｚｏｎｅ ｉｎ ｉｎｆａｎｃｙ．Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｆａｎｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４３：３２００−６．
Ｔｓａｉ，Ｃ．Ｍ．， ＆ Ｆｒａｓｃｈ，Ｃ．Ｅ．（１９８２）．Ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１９（１）：１１５−９．

ｖａｎ Ｓｅｌｍ，Ｓ．， ｖａｎ Ｃａｎｎ，Ｌ．Ｍ．， Ｋｏｌｋｍａｎ，Ｍ．Ａ．Ｂ．， ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｉｊｓｔ，Ｂ．Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｐｕｔｔｅｎ，Ｊ．Ｐ．Ｍ．ｖａｎ（２００３）Ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｅｒｏｔｙｐｅ １５Ｂ ａｎｄ １５Ｃ ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７１：６１９２−８．
Ｖａｎｅｅｃｈｏｕｔｔｅ，Ｍ．， Ｙｏｕｎｇ，Ｄ．Ｍ．， Ｏｒｎｓｔｏｎ，Ｌ．Ｎ．， Ｄｅ Ｂａｅｒｅ，Ｔ．， Ｎｅｍｅｃ，Ａ．， Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｒｅｉｊｄｅｎ，Ｔ．， ．．． Ｄｉｊｋｓｈｏｏｒｎ，Ｌ．（２００６）．Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｂｌｅ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ ＡＤＰ１ Ｂｅｌｏｎｇｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｎｅｗｌｙ Ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７２（１）：９３２−９３６．
Ｖａｒｋｉ，Ａ．（１９９３）．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｉｅｓ ａｒｅ ｃｏｒｒｅｃｔ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ３（２）：９７−１３０．
Ｖｉｋ，Ａ．， Ａａｓ，Ｆ．Ｅ．， Ａｎｏｎｓｅｎ，Ｊ．Ｈ．， Ｂｉｌｓｂｏｒｏｕｇｈ，Ｓ．， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ａ．， Ｅｇｇｅ−Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｗ．， ＆ Ｋｏｏｍｅｙ，Ｍ．（２００９）．Ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０６（１１）：４４４７−５２．
Ｖｏｉｓｉｎ，Ｓ．， Ｋｕｓ，Ｊ．Ｖ，Ｈｏｕｌｉｓｔｏｎ，Ｓ．， Ｓｔ−Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｆ．， Ｗａｔｓｏｎ，Ｄ．， Ｃｖｉｔｋｏｖｉｔｃｈ，Ｄ．Ｇ．， ．．． Ｂｕｒｒｏｗｓ，Ｌ．Ｌ．（２００７）．Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｓｔｒａｉｎ Ｐａ５１９６ ｔｙｐｅ ＩＶ ｐｉｌｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｌｉｋｅ ａｌｐｈａ−１，５−ｌｉｎｋｅｄ ｄ−Ａｒａｆ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８９（１）：１５１−９．

Ｗａｃｋｅｒ，Ｍ．， Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．， Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ，Ｎ．， Ｋｏｗａｒｉｋ，Ｍ．， Ｃｌａｒｋｅ，Ｂ．Ｒ．， Ｐｏｈｌ，Ｎ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３：７０８８−９３．
Ｗａｎｇ，Ｎ．， Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，Ｌ．， Ｄｅ Ｓｏｕｚａ，Ａ．Ｇ．， Ｚｈｏｎｇ，Ｈ．， Ｇｏｓｓ，Ｇ．， ＆ Ｌｉ，Ｌ．（２００７）．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｌｉｖｅｒ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ＬＣ−ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｒｙｐｓｉｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６（１）：２６３−７２．
Ｗａｔｓｏｎ，Ｄ．Ａ．， Ｍｕｓｈｅｒ，Ｄ．Ｍ．， Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．， ａｎｄ Ｖｅｒｈｏｅｆ，Ｊ．（１９９３）Ａ Ｂｒｉｅｆ Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ａ Ｐａｎｏｐｌｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １７：９１３−９２４．
Ｗｅｂｅｒ，Ｂ．Ｓ．， Ｍｉｙａｔａ，Ｓ．Ｔ．， Ｉｗａｓｈｋｉｗ，Ｊ．Ａ．， Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ，Ｂ．Ｌ．， Ｓｋａａｒ，Ｅ．Ｐ．， Ｐｕｋａｔｚｋｉ，Ｓ．， ＆ Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．（２０１３）．Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｙｐｅ ＶＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ８（１）：ｅ５５１４２．
Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｄ．Ｍ．， Ｍａｌｌｅｙ，Ｒ．， ａｎｄ Ｌｉｐｓｉｔｃｈ，Ｍ．（２０１１）Ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ ａｆｔｅｒ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｌａｎｃｅｔ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）３７８：１９６２−７３．
Ｗｅｎｇｅｒ，Ｊ．（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｗｏｒｌｄ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ １９：１５８８−１５９１．
Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｃ．（１９９５）．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｏ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３（５）：１７８−１８５．
Ｗｉｓｐｌｉｎｇｈｏｆｆ，Ｈ．， Ｐａｕｌｕｓ，Ｔ．， Ｌｕｇｅｎｈｅｉｍ，Ｍ．， Ｓｔｅｆａｎｉｋ，Ｄ．， Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｐ．Ｇ．， Ｅｄｍｏｎｄ，Ｍ．Ｂ．， ．．． Ｓｅｉｆｅｒｔ，Ｈ．（２０１２）．Ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｄｕｅ ｔｏ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ，Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐｉｔｔｉｉ ａｎｄ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ６４（３）：２８２−２９０．

Ｙｉ，Ｅ．Ｃ．， ＆ Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｍ．（２０００）．Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ Ａ ｆｒｏｍ Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｔ １２５（４）：６５１−６５６．
Ｚｈｏｕ，Ｍ．， ＆ Ｗｕ，Ｈ．（２００９）．Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｄｈｅｓｉｎｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５５：３１７−２７．

Ａｃｔｉｓ，Ｌ．Ａ．， Ｐｏｔｔｅｒ，Ｓ．Ａ．， ＆ Ｃｒｏｓａ，Ｊ．Ｈ．（１９８５）．Ｉｒｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＯＭ２ ｏｆ Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ ｉｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＪＭ１．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１６１（２），７３６−４２．
Ａｒａｎｄａ，Ｊ．， Ｐｏｚａ，Ｍ．， Ｐａｒｄｏ，Ｂ．Ｇ．， Ｒｕｍｂｏ，Ｓ．， Ｒｕｍｂｏ，Ｃ．， Ｐａｒｒｅｉｒａ，Ｊ．Ｒ．， ．．． Ｂｏｕ，Ｇ．（２０１０）．Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｓｔａｂｌｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ．ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０（１），２７９．

Ｂｏｅｒｓｅｍａ，Ｐ．Ｊ．， Ｒａｉｊｍａｋｅｒｓ，Ｒ．， Ｌｅｍｅｅｒ，Ｓ．， Ｍｏｈａｍｍｅｄ，Ｓ．， ＆ Ｈｅｃｋ，Ａ．Ｊ．Ｒ．（２００９）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，４（４），４８４−９４．

Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．， Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｐ．Ａ．， Ｔｒａｃｙ，Ｅ．Ｎ．， ＆ Ｍｕｎｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．（２０１３）．Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ｕｔｉｌｉｚｅｓ ａ ｔｙｐｅ ＶＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，８（３），ｅ５９３８８．
Ｃｈｏｉ，Ｋ．−Ｈ．， Ｇａｙｎｏｒ，Ｊ．Ｂ．， Ｗｈｉｔｅ，Ｋ．Ｇ．， Ｌｏｐｅｚ，Ｃ．， Ｂｏｓｉｏ，Ｃ．Ｍ．， Ｋａｒｋｈｏｆｆ−Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｒ．Ｒ．， ＆ Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｈ．Ｐ．（２００５）．Ａ Ｔｎ７−ｂａｓｅｄ ｂｒｏａｄ−ｒａｎｇｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２（６），４４３−８．

Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．， ＆ Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．（２０００）．Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，９７（１２），６６４０−５．
Ｄｅ Ｂｅｒａｒｄｉｎｉｓ，Ｖ．， Ｖａｌｌｅｎｅｔ，Ｄ．， Ｃａｓｔｅｌｌｉ，Ｖ．， Ｂｅｓｎａｒｄ，Ｍ．， Ｐｉｎｅｔ，Ａ．， Ｃｒｕａｕｄ，Ｃ．， ．．． Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ，Ｊ．（２００８）．Ａ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ ＡＤＰ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４，１７４．
Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ，Ｄ．Ｍ．， Ｓｔ．Ｐｉｅｒｒｅ，Ｒ．， ＆ Ｌｉｎｎ，Ｔ．（１９９６）．Ａ ｓｅｔ ｏｆ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｔａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅ，１７７（１−２），１３３−１３６．

Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．， Ｗａｃｋｅｒ，Ｍ．， Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｍ．， Ｈｉｔｃｈｅｎ，Ｐ．Ｇ．， Ｍａｒｏｌｄａ，Ｃ．Ｌ．， Ｋｏｗａｒｉｋ，Ｍ．， ．．． Ａｅｂｉ，Ｍ．（２００５）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｉｖｅｒｓｅ Ｏ ａｎｔｉｇｅｎ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１０２（８），３０１６−２１．
Ｆｉｇｕｒｓｋｉ，Ｄ．Ｈ．， ＆ Ｈｅｌｉｎｓｋｉ，Ｄ．Ｒ．（１９７９）．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｉｇｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＲＫ２ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ａ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｉｎ ｔｒａｎｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，７６（４），１６４８−１６５２．

Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｃ．Ｍ．， Ｔｒａｃｙ，Ｅ．Ｎ．， Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．， Ｒａｔｈｅｒ，Ｐ．Ｎ．， Ａｃｔｉｓ，Ｌ．Ａ．， ＆ Ｍｕｎｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．（２０１３）．Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ｓｔｒａｉｎ Ｍ２ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｔｙｐｅ ＩＶ ｐｉｌｉ ｗｈｉｃｈ ｐｌａｙ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｗｉｔｃｈｉｎｇ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｂｕｔ ｎｏｔ ｓｕｒｆａｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｔｉｌｉｔｙ．ｍＢｉｏ，４（４），ｅ００３６０−１３．
Ｈｕｎｇｅｒ，Ｍ．， Ｓｃｈｍｕｃｋｅｒ，Ｒ．， Ｋｉｓｈａｎ，Ｖ．， ＆ Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．（１９９０）．Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｈｕｔｔｌｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｇｅｎｅ，８７（１），４５−５１．

Ｋｕｍａｒ，Ａ．， Ｄａｌｔｏｎ，Ｃ．， Ｃｏｒｔｅｚ−Ｃｏｒｄｏｖａ，Ｊ．， ＆ Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｈ．Ｐ．（２０１０）．Ｍｉｎｉ−Ｔｎ７ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐｙ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８２（３），２９６−３００．

Ｌｅｅ，Ｅ．Ｃ．， Ｙｕ，Ｄ．， Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｄｅ Ｖｅｌａｓｃｏ，Ｊ．， Ｔｅｓｓａｒｏｌｌｏ，Ｌ．， Ｓｗｉｎｇ，Ｄ．Ａ．， Ｃｏｕｒｔ，Ｄ．Ｌ．， ．．． Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｎ．Ｇ．（２００１）．Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ−ｂａｓｅｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ａｄａｐｔｅｄ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＢＡＣ ＤＮＡ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，７３（１），５６−６５．

Ｎａｋａｒ，Ｄ．， ＆ Ｇｕｔｎｉｃｋ，Ｄ．Ｌ．（２００１）．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗｅｅ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｂｉｏｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｏｉｌ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｌｗｏｆｆｉｉ ＲＡＧ−１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４７（７），１９３７−１９４６．
Ｎｉｕ，Ｃ．， Ｃｌｅｍｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．， Ｂｏｎｏｍｏ，Ｒ．Ａ．， ＆ Ｒａｔｈｅｒ，Ｐ．Ｎ．（２００８）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｒ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９０（９），３３８６−９２．

Ｓｃｏｔｔ，Ｎ．Ｅ．， Ｋｉｎｓｅｌｌａ，Ｒ．Ｌ．， Ｅｄｗａｒｄｓ，Ａ．Ｖ．Ｇ．， Ｌａｒｓｅｎ，Ｍ．Ｒ．， Ｄｕｔｔａ，Ｓ．， Ｓａｂａ，Ｊ．， ．．． Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．（２０１４）．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｏｆ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ＭＣＰ，１３（９），２３５４−７０．

Ｗａｃｋｅｒ，Ｍ．， Ｌｉｎｔｏｎ，Ｄ．， Ｈｉｔｃｈｅｎ，Ｐ．Ｇ．， Ｎｉｔａ−Ｌａｚａｒ，Ｍ．， Ｈａｓｌａｍ，Ｓ．Ｍ．， Ｎｏｒｔｈ，Ｓ．Ｊ．Ａｅｂｉ，Ｍ．（２００２）．Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），２９８（５５９９），１７９０−３．

本明細書の刊行物、特許および特許出願はいずれも、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示すものであり、個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示された場合と同様に参照により本明細書に組み込まれる。

ここまで本発明を記載してきたが、本発明の多くの点で変更し得ることは明らかであろう。このような変更は本発明の趣旨と範囲を逸脱するものと見なされるべきではなく、そのような修正はいずれも、当業者には明らかなように、のちの請求項の範囲に包含されるものとする。

独占的所有権または特権を請求する本発明の実施形態は以下の「特許請求の範囲」に定められる。

（配列番号１）プライマー
（配列番号２）プライマー
（配列番号３）プライマー
（配列番号４）プライマー
（配列番号５）プライマー
（配列番号６）プライマー
（配列番号７）プライマー
（配列番号８）プライマー
（配列番号９）プライマー
（配列番号１０）プライマー
（配列番号１１）プライマー
（配列番号１２）プライマー
（配列番号１３）プライマー
（配列番号１４）プライマー
（配列番号１５）プライマー
（配列番号１６）プライマー
（配列番号１７）プライマー
（配列番号１８）プライマー
（配列番号１９）プライマー
（配列番号２０）プライマー
（配列番号２１）プライマー
（配列番号２２）プライマー
（配列番号２３）プライマーセット１２Ｆ
（配列番号２４）プライマーセット１２Ｒ
（配列番号２５）プライマーセット１３Ｆ
（配列番号２６）プライマーセット１３Ｒ
（配列番号２７）プライマーセット１４Ｆ
（配列番号２８）プライマーセット１４Ｒ
（配列番号２９）プライマーセット１５Ｆ
（配列番号３０）プライマーセット１５Ｒ
（配列番号３１）プライマーセット１６Ｆ
（配列番号３２）プライマーセット１６Ｒ
（配列番号３３）プライマーセット１７Ｆ
（配列番号３４）プライマーセット１７Ｒ
（配列番号３５）プライマーセット１８Ｆ
（配列番号３６）プライマーセット１８Ｒ
（配列番号３７）プライマーセット１９Ｆ
（配列番号３８）プライマーセット１９Ｒ
（配列番号３９）プライマーセット２０Ｆ
（配列番号４０）プライマーセット２０Ｒ
（配列番号４１）プライマーセット２１Ｆ
（配列番号４２）プライマーセット２１Ｒ
（配列番号４３）プライマーセット２２Ｆ
（配列番号４４）プライマーセット２２Ｒ
（配列番号４５）プライマーセット２３Ｆ
（配列番号４６）プライマーセット２３Ｒ
（配列番号４７）プライマーセット２４Ｆ
（配列番号４８）プライマーセット２４Ｒ
（配列番号４９）プライマーセット２５Ｆ
（配列番号５０）プライマーセット２５Ｒ
（配列番号５１）プライマーセット２６Ｆ
（配列番号５２）プライマーセット２６Ｒ
（配列番号５３）プライマーセット２７Ｆ
（配列番号５４）プライマーセット２７Ｒ
（配列番号５５）プライマーセット２８Ｆ
（配列番号５６）プライマーセット２８Ｒ
（配列番号５７）プライマーセット２９Ｆ
（配列番号５８）プライマーセット２９Ｒ
（配列番号５９）プライマーセット３０Ｆ
（配列番号６０）プライマーセット３０Ｒ
（配列番号６１）プライマーセット３１Ｆ
（配列番号６２）プライマーセット３１Ｒ
（配列番号６３）プライマーセット３２Ｆ
（配列番号６４）プライマーセット３２Ｒ
（配列番号６５）プライマーセット３３Ｆ
（配列番号６６）プライマーセット３３Ｒ
（配列番号６７）プライマーセット３４Ｆ
（配列番号６８）プライマーセット３４Ｒ
（配列番号６９）プライマーセット３５Ｆ
（配列番号７０）プライマーセット３５Ｒ
（配列番号７１）プライマーセット３６Ｆ
（配列番号７２）プライマーセット３６Ｒ
（配列番号７３）プライマーセット３７Ｆ
（配列番号７４）プライマーセット３７Ｒ
（配列番号７５）プライマーセット３８Ｆ
（配列番号７６）プライマーセット３８Ｒ
（配列番号７７）プライマーセット３９Ｆ
（配列番号７８）プライマーセット３９Ｒ
（配列番号８９）プライマー ｉｇｒＦ
（配列番号９０）プライマー ｉｇｒＲ

Claims (26)

1. ＰｇｌＬ_ＣｏｍＰＯ−オリゴサッカリルトランスフェラーゼを用いるＣｏｍＰのグリコシル化を含む、糖タンパク質の合成方法。
2. 前記ＣｏｍＰを任意選択で第二のタンパク質、アジュバントまたはキャリアと融合させる、請求項１に記載の方法。
3. グラム陰性菌で実施する、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記細菌がアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項３に記載の方法。
5. 前記グリコシル化が、Ｏ−グリコシル化、Ｎ−グリカン、Ｏ抗原または莢膜多糖体に由来する糖を用いるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記莢膜多糖体がストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の莢膜である、請求項５に記載の方法。
7. 前記ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）がストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である、請求項６に記載の方法。
8. 前記Ｎ−グリカンが、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）に由来するものである、請求項５に記載の方法。
9. 前記Ｎ−グリカンがカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）のＮ−七糖である、請求項８に記載の方法。
10. 前記アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）が、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）、Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、Ａ．ノソコミアリス（Ａ．ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）またはＡ．カルコアセティカス（Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）である、請求項４に記載の方法。
11. ＣｏｍＰのグリコシル化のためのＯ−オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
12. 前記グリコシル化をグラム陰性菌で組換えにより生じさせる、請求項１１に記載のＯ−オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
13. 前記細菌がアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１２に記載のＯ−オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
14. 前記グリコシル化が、Ｏ−グリコシル化、Ｎ−グリカン、Ｏ抗原または莢膜多糖体に由来する糖を用いるものである、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のＯ−オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
15. 前記莢膜多糖体が、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来のものである、請求項１４に記載のＯ−オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
16. 前記ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）がストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である、請求項１５に記載のＯ−オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
17. 前記Ｎ−グリカンが、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）に由来するものである、請求項１４に記載のＯ−オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
18. 前記Ｎ−グリカンがカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）のＮ−七糖である、請求項１７に記載のＯ−オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
19. ＰｇｌＬ ＣｏｍＰである、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載のＯ−オリゴサッカリルトランスフェラーゼ。
20. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法に従って合成した糖タンパク質を含む、ワクチン。
21. ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）ワクチンである、請求項２０に記載のワクチン。
22. 前記ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）がストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である、請求項２１に記載のワクチン。
23. ＣｏｍＰまたはグリコシル化部位を有するＣｏｍＰのフラグメントを含む融合タンパク質である、糖タンパク質。
24. タンパク質のグリコシル化へのＰｇｌＬ_ＣｏｍＰの使用。
25. ストレプトッコカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ）莢膜によるタンパク質のグリコシル化への請求項２４に記載の使用。
26. 前記ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）がストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である、請求項２５に記載の使用。