CN115697396A - 志贺氏菌-四价（Shigella4V）生物缀合物 - Google Patents
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Abstract
一种包含志贺氏菌四价(4价志贺氏菌)生物缀合物的组合物。其包含与载体蛋白共价连接的福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)血清型2a、3a、6和宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)的志贺氏菌O‑多糖抗原。
Description
序列表
本申请包含一份序列表，该序列表以ASCII格式以电子方式提交，并且其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII副本创建于2021年05月13日，名称为VU66948_SL.txt，大小为81,530字节。
发明领域
本发明涉及包含志贺氏菌四价(4价志贺氏菌)生物缀合物的组合物。更具体地，本发明包含与载体蛋白共价连接的福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)血清型2a、3a、6和宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)的志贺氏菌O-多糖抗原。
这四种生物缀合物可以通过从细胞底物开始的过程单独生产。所有四种细胞底物的共同点是相同类型的原始宿主，使用O-多糖簇替代多糖生物合成(rfb)簇，引入编码载体蛋白的质粒和编码寡糖基转移酶PgIB或PgIL的质粒。
背景技术
腹泻病(DD)是中低收入国家(LMIC)儿童/婴儿的一种重要疾病。根据《2015年全球疾病负担》，腹泻是儿童死亡的第四大原因，占五岁以下儿童死亡总数的8.6％。尽管LMIC中的儿童需要针对志贺氏菌的疫苗，但目前市场上没有疫苗。
志贺氏菌是导致LMIC中1岁以上儿童DD的主要病原体，也是导致1岁以下儿童腹泻的六大病原体之一(1-3)。约11％的腹泻死亡是由志贺氏菌引起的，导致每年55,900至65,000人死亡，其中大部分是儿童。志贺氏菌是一种革兰氏阴性非产孢、兼性厌氧菌和灵长类限制性病原体。传播可通过粪口途径，通过受污染的水、霉菌、食物或直接接触发生。低细菌负荷(100至1000之间的菌落形成单位)可导致有症状的感染。
在1至4天之间的潜伏期后，志贺氏菌病通常被诊断为发烧、水样腹泻、肠道症状，如厌食、腹部痉挛和呕吐，以及痢疾(急性结肠/直肠远端结肠炎，粪便中有血)。这些临床表现通常在免疫能力强的成年人中自我限制，而在5岁以下的儿童中，其可能导致肠道或代谢并发症，中毒性巨结肠和溶血性尿毒症综合征是主要并发症(即肠穿孔、直肠脱垂或低血糖、低钠血症、脱水)。
与志贺氏菌感染急性期相关的临床结局，特别是如果反复和长期感染，也会导致感染后并发症，如反应性关节炎和肠易激综合征，以及认知能力降低和年龄身高Z(HAZ)评分下降的发育并发症。事实上，DD的无形影响对儿童和家庭产生了长期影响，沉重的负担导致家庭层面的进一步贫困，失去上学机会导致潜在收入减少。
目前的疾病负担估计可能仍然不能充分反映DD的发病率，这受到不同研究中使用的各种方法以及所使用的诊断技术的敏感性的影响。志贺氏菌通常通过粪便培养分离，随后的标准生化检测和通过血清凝集进行血清分型来诊断。从粪便中分离病原体菌落是耗时且困难的，特别是如果使用抗生素或细菌在培养时仍处于非分裂状态时。传统培养诊断方法报告的这些挑战突出了对非培养依赖性新方法(如定量PCR)的需求。事实上，对来自(全球肠道多中心研究)和MAL-ED(肠道感染和营养不良的病因、风险因素和相互作用以及对儿童健康和发展的后果)研究的样本子集进行重新分析的结果表明，此前对儿童志贺氏菌引起的腹泻的研究可能低估了真实发病率至少两倍。
该疾病的一般临床治疗包括补液(口服或静脉内)、补锌和抗生素治疗。然而，对传统一线和二线抗生素如氨苄青霉素/甲氧苄啶-磺胺甲噁唑或环丙沙星/阿奇霉素的耐药性的报道越来越多。因此，由于最初的治疗可能失败，耐药感染可能比易感细菌感染持续更长时间，从而导致更严重的临床结局和更高的医疗系统成本。
通过引入有效和负担得起的疫苗来预防志贺氏菌引起的DD，在LMIC中尤为重要，在LMIC中，其他干预措施，即医疗保健服务、安全用水、卫生和个人卫生很难在短期内实现。
对志贺氏菌的免疫似乎具有菌株特异性。志贺氏菌属有四个种：福氏菌种、宋内氏菌种、鲍氏菌种和痢疾菌种，其分别具有19、20、1和15个血清型(O抗原结构不同)。重要的疫苗研发考虑因素是志贺氏菌血清型的分布。发展中国家儿童中导致中度至重度疾病的主要血清型是福氏志贺氏菌2a型、S.sonnei和S.flexneri 3a型和6型。[1][2]特别是，全球志贺氏菌种分布的长期趋势表明，与S.flexneri水平居高不下且地理分布极不均匀的农村地区相比，在经历了显著工业化的地区，S.sonnei的数量有所增加。
提供针对志贺氏菌的疫苗的需求仍未得到满足。合成具有特定还原性末端糖的生物偶联物也存在困难。
发明内容
利用生物缀合技术开发了多价志贺氏菌缀合物。疫苗候选物志贺氏菌四价(Shigella4V(S-4V))是一种免疫原组合物，其由四种不同志贺氏菌菌株的O-抗原多糖(PS)生物缀合物组成，这四种不同的志贺氏菌菌株代表了最具流行病学相关性的菌株：S.sonnei(SsE)，S.flexneri 2a、3a和6(Sf2E、Sf3E、Sf6E)。在一个实施方式中，每种PS缀合物至重组铜绿假单胞菌外蛋白A，rEPA。候选物包含与蛋白载体共价连接的福氏志贺氏菌血清型2a、3a、6和宋内志贺氏菌的志贺氏菌O-多糖抗原。
例如，对于Sf2E、Sf3E和Sf6E，多糖通过O-抗原的还原末端共价连接至天冬酰胺残基(4)的侧链氮原子上，天冬酰胺的残基位于N-糖基化的共有序列中(见表3)。信号肽(带下划线的字母)在易位至胞质过程中被切割。N-糖基化共有位点用粗体字母标记。Leu-Glu至Val的突变(斜体)导致EPA显著解毒。
对于SsE，多糖通过O-抗原的还原末端共价连接至位于O-糖基化位点的丝氨酸残基的侧链氧原子(见表4)。信号肽(带下划线的字母)在易位至胞质过程中被切割。O-糖基化共有位点用粗体表示，假定O-糖基化丝氨酸用下划线表示。Leu-Glu至Val的突变(斜体)导致EPA显著解毒。
生物缀合技术是一种多用途的工具，可以以高收率提供安全、明确和免疫原性的糖缀合物疫苗。对于基于O-抗原的疫苗，由于使用了常见的生物合成途径，该技术特别适合。生物缀合能够在工程化E.coli中合成具有复杂多糖结构的缀合物疫苗。生物缀合物是多糖和蛋白的免疫原性复合物，使用适当工程化的细菌细胞在体内直接合成。
空肠弯曲杆菌中N-连接糖蛋白的鉴定表明，原核生物可以将其蛋白N-糖基化。当位于蛋白载体的多肽链内的特定共有序列中时，特定弯曲杆菌酶(寡糖基转移酶PgIB)能够将寡糖从脂质连接载体转移到氨基酸天冬酰胺的侧链。[19]这种蛋白糖基化系统已在功能上转移到大肠杆菌中，使糖蛋白能够在一个特征良好且经常使用的细菌表达宿主中产生。使用重组DNA技术，这种糖基化机制可以被改进以产生各种多糖，可以将这些多糖转移到不同的受体蛋白上。开发了用于生产新型生物缀合物的相应糖工程策略，允许生产可以作为新型疫苗的生物缀合物。
总之，在生物缀合过程中，PgIB以及最近发现的类似寡糖基转移酶[20]，即PgIL，用于将多种多糖转移到存在于大肠杆菌胞质中的蛋白载体(例如，铜绿假单胞菌外毒素A，EPA)，随后使用胞质提取和随后的纯化从中收获所得的生物缀合物，图1A和图1B。[21]
生物缀合技术的优势包括：(1)由于不存在缀合化学修饰和由于PS抗原构型，缀合的抗原(PS和蛋白)具有更好的免疫原性，(2)生物缀合物的质量是可复制的：生物缀合物在原料药水平上具有详细的结构表征，并且通过高分辨率技术对任何质量问题进行检测，(3)生物缀合物不会引起竞争性的化学接头衍生的免疫反应(不存在化学接头)(对化学缀合物的免疫反应通常遭受抗交联接头应答，而抗交联接头应答占抗原特异性应答的优势)，(4)简化了生产过程，得到了可重复的高质量产品，生物缀合物完全在重组非致病性大肠杆菌中产生，不需要病原生物生长来提取物抗原多糖，从而提高了产品和生产的安全性，(5)所定义的结构能够在原料药和药品水平上进行详细的分析测试，以及产品冷冻(如果需要的话)，(6)在生产后不存在游离多糖和仅存在少量与产品相关的杂质，体内酶促缀合不会使蛋白载体变性，因此保留重要的B细胞表位和正确的蛋白折叠，从而有可能开发含有来自同一生物的蛋白和糖表位的生物缀合物，可能扩大每种疫苗的保护范围，因为不需要化学处理，如去除内毒素和交联，并且多糖的长度在体内得到控制(缀合物含有明确且可重复的糖模式)，和(7)生物缀合技术可以产生由于抗原多糖的化合物不稳定性而不能用现有技术产生的抗原。
附图说明
图1A：使用重组大肠杆菌的体内生物缀合方法：将多糖(PS)和载体蛋白转移至大肠杆菌。将工程化细菌发酵。在发酵过程中，产生PS链和载体蛋白并缀合。一旦发酵完成，从细菌胞质中纯化缀合蛋白。
图1B：缀合方法：弯曲杆菌寡糖基转移酶(PgIB)将多糖从脂质载体转移到胞质中的铜绿假单胞菌胞外蛋白A(EPA)载体蛋白。
图2：体内蛋白糖基化过程的详细示意图。
图3：S.flexneri 2a-抗原多糖(PS)的结构性质。合成的还原末端和生物学起点是GlcNAc。L-Rha：L-鼠李糖,Rha；D-Glc：D-葡萄糖，Glc；D-GlcNAc：D-N-乙酰基-葡糖胺，GlcNAc。
图4：S.flexneri 3a-抗原多糖(PS)的结构性质。合成的还原末端和生物学起点是GlcNAc。L-Rha：L-鼠李糖,Rha；D-Glc：D-葡萄糖，Glc；D-GlcNAc：D-N-乙酰基-葡糖胺，GlcNAc。
图5：S.flexneri 6-抗原多糖(PS)的结构性质。合成的还原末端和生物学起点是GlcNAc。L-Rha：L-鼠李糖,Rha；D-Glc：D-葡萄糖，Glc；D-GlcNAc：D-N-乙酰基-葡糖胺，GlcNAc。
图6：S.sonnei-抗原多糖(PS)的结构性质。合成的还原末端和生物学起点是D-FucNAc4N。D-FucNAc4N：2-乙酰胺基-4-氨基-2、4-二脱氧-D-岩藻糖，FucNAc4N；LAltNAcA：2-乙酰胺基-2-脱氧-L-阿楚糖醛酸(altruronic acid)，AltNAcA。
图7：通过SDS-PAGE对Sf2E ENG和GMP API批次进行糖基化程度表征。
图8：通过SDS-PAGE对Sf3E ENG和GMP API批次进行糖基化程度表征。
图9：通过SDS-PAGE对Sf6E ENG和GMP API批次进行糖基化程度表征。
图10：通过HPAEC-PAD对Sf2E GMP API批次进行单糖组分分析。
图11：通过HPAEC-PAD对Sf3E GMP API批次进行单糖组分分析。
图12：通过HPAEC-PAD对Sf6E GMP API批次进行单糖组分分析。
图13：通过HPAEC-PAD对Sf6E GMP API批次进行单糖组分分析，放大叠加。
图14：通过肼解法对SsE ENG API批次进行聚糖结构表征。*FucNAc4N在肼解法期间去乙酰化，并且在位置2和4的氨基基团在该过程中均被重新乙酰化。
图15：通过肼解法对SsE GMP API批次进行聚糖结构表征。*FucNAc4N在肼解法期间去乙酰化，并且在位置2和4的氨基基团在该过程中均被重新乙酰化。
图16：通过肼解法对Sf2E ENG API批次进行聚糖结构表征。
图17：通过肼解法对Sf2E GMP API批次进行聚糖结构表征。
图18：通过肼解法对Sf3E ENG API批次进行聚糖结构表征。
图19：通过肼解法对Sf3E GMP API批次进行聚糖结构表征。
图20：通过肼解法对Sf6E ENG API批次进行聚糖结构表征。
图21：通过肼解法对Sf6E GMP API批次进行聚糖结构表征。
图22A：在600MHz(313K)下记录的SsE的1H-NMR谱。完整的1H-NMR谱。标记特征性异头和环信号。小峰来自终端RU。
图22B：在600MHz(313K)下记录的SsE的1H-NMR谱。异头区和环区的1D DOSY放大。小峰来自末端RU。
图23：左图：在600MHz(313K)下记录的SsE HSQC/HMBC的2D 1H-13C叠加；HMBC被优化为J＝6Hz。质子/碳交叉峰已根据相应的残基标记(A＝AltNAcA和B＝FucNAcN)。标记了主要的交叉峰，关键的残差间相关性以方块表示。小交叉峰来自末端RU(tRU)。右图：在600MHz(313K)下记录的SsE HSQC谱的放大，谱中甲基区的交叉峰如插图所示。关键的二糖重复单位质子/碳交叉峰以及来自末端AltNAcA的小交叉峰已经被标记。
图24：在不同缓冲液中配制的Shigella4V IMP O-乙酰基基团的稳定性。将样品在+37℃下储存四周。针对四种不同配方显示的通过离子色谱法测定的游离乙酸盐、总乙酸盐和结合乙酸盐的浓度。游离乙酸盐的增加，伴随结合乙酸盐的减少表明O-乙酰基基团的损失。配方基于10mM磷酸钠，150mM和S4V DP-18：pH 6.5w/o聚山梨醇酯80，S4V DP-19：pH 6.50.015％聚山梨醇酯80，S4V DP-20：pH 7.0w/o聚山梨醇酯80和S4V DP-21：pH 7.0 0.015％聚山梨醇酯80。
图25A：治疗组免疫接种前和免疫接种后的家兔血清中Sf2a-LPS、Sf3a-LPS、Sf6-LPS、Ss-LPS和EPA特异性血清IgG滴度。线条表示GMT+/-95％置信区间。
图25B：治疗组免疫接种前和免疫接种后的家兔血清中Sf2a-LPS、Sf3a-LPS、Sf6-LPS、Ss-LPS和EPA特异性血清IgG滴度。线条表示GMT+/-95％置信区间。
图25C：治疗组免疫接种前和免疫接种后的家兔血清中Sf2a-LPS、Sf3a-LPS、Sf6-LPS、Ss-LPS和EPA特异性血清IgG滴度。线条表示GMT+/-95％置信区间。
图25D：治疗组免疫接种前和免疫接种后的家兔血清中Sf2a-LPS、Sf3a-LPS、Sf6-LPS、Ss-LPS和EPA特异性血清IgG滴度。线条表示GMT+/-95％置信区间。
图25E：治疗组免疫接种前和免疫接种后的家兔血清中Sf2a-LPS、Sf3a-LPS、Sf6-LPS、Ss-LPS和EPA特异性血清IgG滴度。线条表示GMT+/-95％置信区间。
图26：EPA剂量的EPA特异性IgG应答。
具体实施方式
定义
为了促进对本发明的理解，下面定义了许多术语和短语。本文中也涵盖这些术语和短语的替代形式(时态)。除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可以在Benjamin Lewin,Genes V，由Oxford University出版，1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew等(编著)，The Encyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(编著)，Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference，由VCRPublishers,Inc.,199出版(ISBN 1-56081-569-8)中找到。
如本文所用的“包含(Comprise)”(“包含(comprising)”或“包含(comprises)”)是开放式的，并且意指“包括但不限于”。“具有”在本文中用作包含的同义词。应理解的是，无论在何处用语言“包含”描述实施方式，此类实施方式涵盖在“由...组成”和/或“基本上由...组成”的方面描述的那些。
“在其中包含(Comprises therein)”或“在其中包含(comprising therein)”意指所引用的分子、氨基酸序列或核苷酸序列在其中已经分别并入O-连接糖基化位点分子、氨基酸序列或核苷酸序列。关于例如“其中包含O-连接糖基化位点的载体蛋白”，编码该载体蛋白的核苷酸序列在5’和3’末端之间具有编码O-连接糖基化位点的核苷酸序列，同样，该载体蛋白氨基酸序列在N-末端和C-末端之间具有O-连接糖基化位点氨基酸序列。“蛋白载体”或“载体蛋白”是指包含寡聚糖所附着的共有序列和革兰氏阴性菌的外膜的蛋白。
如说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。
“约”或“近似”意指大致的，周围的或在其区域中。术语“约”或“近似”进一步意指如本领域普通技术人员所确定的在特定值的可接受的上下文误差范围内，这将部分取决于如何测量该值，即测量系统的限制或特定目的所需的精确度。当术语“约”或“近似”与数值范围结合使用时，它通过在所阐述的数值之上和之下延伸边界来修改该范围。
如在诸如“A和/或B”的短语中所用的术语“和/或”意欲包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中所用的术语“和/或”意欲涵盖每个以下实施方式：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
除非特别说明，否则包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不需要任何特定的混合顺序。可以以任何顺序混合组分。在存在三种组分的情况下，则可以将两种组分与彼此组合，且然后可以将该组合与第三组分组合，依此类推。类似地，尽管可以将方法的步骤编号(诸如(1)、(2)、(3)等或(i)、(ii)、(iii))，但步骤的编号本身并不意味着必须以该顺序进行步骤(即，步骤1，然后步骤2，然后步骤3，等)。在某些实施方式中，单词“然后”用于指定方法的步骤的顺序。
本文中的“基本上相同”意指至少两个分子(包括结构或功能)或数值之间的高度相似性，使得本领域技术人员会认为该差异是不重要的，可忽略的和/或统计上无关紧要的。例如，第一多肽、缀合物、抗体、多核苷酸、载体、细胞、组合物或分子与本文的第二多肽、缀合物、抗体、多核苷酸、载体、细胞、组合物或分子“基本上相同”，如果第一者与第二者相比在结构和功能上仅具有非实质性的差异的话。本文中的“基本上相同”涵盖“相同”。
“有效量”意指足以引起所提及的作用或结果的量。相对于所述目的，“有效量”可以使用已知技术凭经验和以常规方式确定。在某些实施方式中，组合物包含免疫有效量的抗原、佐剂或两者。在某些实施方式中，在向受试者施用治疗(例如，本发明的免疫原性组合物或疫苗)的背景中的"有效量"是指具有预防和/或治疗效应的治疗的量。在某些实施方式中，“有效量”是指足以实现一种、两种、三种、四种或更多种以下效应的治疗的量：(i)降低或改善细菌感染或与其相关的症状的严重度；(ii)缩短细菌感染或与其相关的症状的持续时间；(iii)预防细菌感染或与其相关的症状的进展；(iv)引起细菌感染或与其相关的症状的消退；(v)预防细菌感染或与其相关的症状的发生或发作；(vi)预防细菌感染或与其相关的症状的复发；(vii)减少与细菌感染相关的器官衰竭；(viii)减少具有细菌感染的受试者的住院；(ix)缩短具有细菌感染的受试者的住院长度；(x)提高具有细菌感染的受试者的存活；(xi)消除受试者的细菌感染；(xii)抑制或减少受试者中的细菌复制；和/或(xiii)增强或改善另一治疗的预防或治疗效应。
“受试者”是指动物，特别是哺乳动物，诸如灵长类动物(例如，人)。
如“基本上不含…(essentially free from)”或“基本上不含…(essentiallyfree of)”中的“基本上不含(Essentially free)”意指包含低于可检测水平的所提及物质或仅包含不可避免水平的所提及物质(痕量)。
单词“基本上”不排除“完全地”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。“基本上纯”是指至少50％纯(即，不含污染物)、至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯的物质。
如常规，名称“NH2”或“N-”是指氨基酸序列的N-末端，且名称“COOH”或“C-”是指氨基酸序列的C-末端。
就蛋白、残基或氨基酸序列而言，如本文所用的“内部(Internal)”、“内部(Interior)”意指位于N-末端和C-末端之间。
“片段”是分别包含参考序列的“n”个连续核酸或氨基酸的核苷酸或多肽，并且其中“n”是小于参考序列中的氨基酸总数的任何整数。在某些实施方式中，“n”是1和100之间的任何整数。以这种方式，假设的100个残基长的参考序列(SeqX)的“其片段”可以由SeqX的任何1至99个连续氨基酸组成。在某些实施方式中，片段由全长序列的10、20、30、40或50个连续氨基酸组成。通过从全长参考多肽序列的N-末端和C-末端中的一个或两个中除去“n”个连续氨基酸，可以容易地获得片段。通过从编码全长参考多肽序列的核苷酸序列的3’和5’末端中的一个或两个中除去“n”个连续核酸，可以容易地获得片段。
如本文所用的“免疫原性片段”由抗原序列的“n”个连续氨基酸组成，并且能够在哺乳动物中引发抗体或免疫应答。多肽的片段例如可以使用本领域中已知的技术，例如重组，通过蛋白水解消化、水解、能量(微波、电子和其他离子(MS))或通过化学合成来产生。多肽的内部或末端片段可以通过如下生成：从编码多肽的全长氨基酸序列的核苷酸序列的3’或5’末端除去一个或多个核酸(对于末端片段)，或者从编码多肽的全长氨基酸序列的核苷酸序列3’和5’末端除去一个或多个核酸(对于内部片段)。
“可操作地连接的(Operably linked)”或“可操作地连接的(operativelylinked)”意指被连接以便是“可操作的”，例如，用于重组蛋白表达的多核苷酸序列的配置。在某些实施方式中，“可操作地连接的”是指例如核酸组分的本领域公认的定位，使得实现预期的功能(例如，表达)。本领域普通技术人员将认识到，在某些情况下(例如切割位点或纯化标签)，“可操作地连接”在一起的两个或更多个组分在核酸或氨基酸序列中不一定与彼此相邻(连续连接的)。与“控制序列”(例如，启动子、增强子或IRES)“可操作地连接”的编码序列以使得编码序列的表达在控制序列的影响或控制下的方式连接。本领域普通技术人员将认识到，各种配置是功能性的并且被涵盖。
“重组的”意指人工的或合成的。在某些实施方式中，“重组的”指示所提及的氨基酸、多肽、缀合物、抗体、核酸、多核苷酸、载体、细胞、组合物或分子通过两个或更多个分子(例如，异源核酸或氨基酸序列)的人工组合来制备。这种人工组合包括但不限于化学合成和基因工程改造技术。在某些实施方式中，“重组多肽”是指已经使用重组核酸(引入宿主细胞的核酸)制备的多肽。在某些实施方式中，重组核酸不是异源的(例如，其中重组核酸是宿主细胞中固有存在的核酸的第二拷贝)。本文中的“转基因”意指引入细胞中的多核苷酸，因此转基因是重组的。
术语“重组N-糖基化蛋白”是指在宿主细胞中产生的不天然包含编码所述蛋白的核酸的任何异源多肽或寡肽。在本发明的上下文中，该术语指在任何宿主细胞中重组产生的蛋白，例如，真核或原核宿主细胞，优选原核宿主细胞，例如，大肠杆菌属、弯曲杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、幽门螺杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属，更优选地大肠杆菌、空肠弯曲杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等，其中已将编码所述蛋白的核酸引入所述宿主细胞，并且其中编码的蛋白被来自弯曲杆菌属(优选空肠弯曲杆菌(C.jejuni))的OTase N-糖基化，所述转移酶天然存在于所述宿主细胞中或被重组引入所述宿主。
“突变的”和“修饰的”被给予其充分理解和惯用的含义，并且至少表示所提及的分子与对照(例如，野生型分子或其天然存在对应物)相比在相当的条件下被改变(结构和/或功能)或表示所提及的数值与对照的值相比在相当的条件下被改变(增加或减少)。
“保守”氨基酸取代或突变是指具有相似侧链的残基的互换性，且因此通常涉及用相同或相似定义的氨基酸类别内的氨基酸取代多肽中的氨基酸。然而，如本文所用，在某些实施方式中，保守突变不包括从亲水至亲水、从疏水至疏水、从含羟基至含羟基或从小残基至小残基的取代，如果保守突变可以反而是从脂族至脂族、从非极性至非极性、从极性至极性、从酸性至酸性、从碱性至碱性、从芳族至芳族或受约束至受约束残基的取代的话。此外，如本文所用，A、V、L或I可以被保守地突变为另一个脂族残基或另一个非极性残基。下表显示了示例性的保守替代。
表1：保守性替代
如本文所用，术语“缺失”是从蛋白序列中去除一个或多个氨基酸残基。通常，在蛋白分子内的任何一个位点处缺失不超过约1至6个残基(例如，1至4个残基)。
如本文所用，术语“插入”是在蛋白序列中添加一个或多个非天然氨基酸残基。通常，在蛋白分子内的任何一个位点插入不超过约1至10个残基(例如，1至7个残基、1至6个残基或者1至4个残基)。
本文中的亲水性氨基酸包括精氨酸(R)、赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、组氨酸(H)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)和色氨酸(W)。
术语“任何氨基酸”是指涵盖常见和罕见的天然氨基酸以及合成的氨基酸衍生物和类似物，其仍然允许优化的共有序列被OTase N-糖基化。X和Z优选天然存在的常见和罕见氨基酸。X和Z可以是相同的或不同的。
本文中的“分离的”或“纯化的”意指呈自然界中未发现的形式的多肽、缀合物、抗体、多核苷酸、载体、细胞、组合物或分子。这包括例如已经从宿主细胞或生物体(包括粗提物)分离或以其他方式从其天然环境中移取的多肽、缀合物、抗体、多核苷酸、载体、细胞、组合物或分子。在某些实施方式中，分离或纯化的蛋白是基本上不含该蛋白与其先天缔合(或与其先天接触)的所有其他多肽的蛋白。例如，“分离的PgIL”或“纯化的PgIL”包括基本上不含其他周质多肽的重组PgIL蛋白，否则该PgIL蛋白将与宿主细胞内部与所述其他周质多肽缔合(接触)。例如，“分离的O-糖基化的修饰的载体蛋白”或“纯化的O-糖基化的修饰的载体蛋白”可能已经与未-O-糖基化的修饰的载体蛋白分离(例如，在体外缀合步骤之后)。在某些实施方式中，“分离的”或“纯化的”还意指蛋白不与抗体或抗体片段结合。在某些实施方式中，分离或纯化的蛋白不包括蛋白的组分(子部分)的集合。例如，在蛋白是蛋白组分的复合物的情况下，“分离的/纯化的复合物”可能不包括在例如应用十二烷基硫酸钠(SDS)或2-巯基乙醇(其两者分解复合物中蛋白组分之间的键)后获得的复合物的组分(与彼此未结合)的复合物。
“药物级”或“药学上可接受的”多肽、缀合物、抗体、多核苷酸、载体、细胞、组合物或分子被分离、纯化或以其他方式配制为基本上不含杂质(例如，基本上不含组分(例如，天然存在的组分)，所述组分(例如，天然存在的组分)对于可向其施用多肽、缀合物、抗体、多核苷酸、载体、细胞、组合物或分子的受试者具有不可接受的毒性)。药物级多肽、缀合物、抗体、多核苷酸、载体、细胞、组合物或分子不是粗制多肽、缀合物、抗体、多核苷酸、载体、细胞、组合物或分子。
如本文所用的“同源物”意指尽管源自不同的生物体的属或物种和/或具有不同的结构但具有基本上相同的功能的两个或更多个分子。为了表示在本文中类似的功能性，即使在本领域中使用替代名称，“PgIL”或“PilE”也可以分别用于指寡糖基转移酶或菌毛蛋白。
如本文所用的“内源的”意指源自相同生物体物种的两种或更多种多肽、缀合物、抗体、多核苷酸、载体、细胞、组合物或分子，或者在例如合成或重组多肽的情况下，基本上由与源自相同生物体物种的结构和功能组成。关于PgIL，例如，“内源的”是指受试PgIL与受试菌毛蛋白(或来自其的O-连接的糖基化位点)的关系，并且意味着它们源自相同生物体物种，或者基本上由作为源自相同生物体物种的那些的结构和功能组成。作为一个实例，脑膜炎奈瑟氏菌PgIL对于N.meningitidis PilE是“内源的”(并且以该方式，PgIL可以被称为对于所提及的菌毛蛋白是“内源的”)。作为一个进一步实例，脑膜炎奈瑟氏菌PgIL对于N.meningitidis细胞(特别是对照或野生型N.meningitidis细胞)是“内源的”。
如本文所用的“异源的”意味着所提及的两个或更多个事物本质上彼此不相关。在某些实施方式中，如果可比较的天然存在的细胞(例如在可比较的条件下的野生型细胞)不会产生蛋白，则该蛋白对于细胞是“异源的”。在某些实施方式中，周质信号序列对于蛋白(或对于蛋白的氨基酸序列)是“异源的”，因为可比较的天然存在的蛋白(例如，野生型蛋白)不会与该信号序列可操作地连接。
“核酸”、“核苷酸”、“多核苷酸”用于指核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、多核糖核酸分子或多脱氧核糖核酸分子，无论是否修饰、未修饰或合成。因此，如本文所定义的多核苷酸可以包括单链和双链DNA，包括单链和双链区域的DNA，单链和双链RNA，以及包括单链和双链区域的RNA，包含可以是单链或更通常是双链或包括单链和双链区域的DNA和DNA的杂合分子。因此，具有出于稳定性或出于其他原因而修饰的主链的DNA或RNA是该术语在本文中意指的“多核苷酸”。DNA或RNA可以是合成的(包括但不限于一起形成多核苷酸的核酸亚基)。此外，如本文所定义的术语“多核苷酸”内包括包含不寻常的碱基、诸如肌苷或修饰的碱基、诸如氚化碱基的DNA或RNA。
通常，术语“多核苷酸”包括未修饰的多核苷酸的所有化学、酶促和/或代谢修饰的形式。可以通过各种方法，包括体外重组DNA介导的技术以及通过DNA在细胞和生物体中的表达，来制备多核苷酸。多核苷酸包括基因组和质粒核酸。DNA包括但不限于具有例如内含子的基因组(核)DNA，以及重组DNA，诸如cDNA(例如，除去内含子)。RNA包括但不限于mRNA和tRNA。预见的是，密码子优化用于本发明的多核苷酸分子的任何重组表达。
“载体”是指核酸分子由其包含并从一种环境转移至另一种环境或促进核酸分子的操作的媒介物。媒介物可以是例如克隆载体、表达载体或质粒。载体包括例如BAC或YAC载体。术语“表达载体”包括但不限于含有适合于由细胞表达的编码序列的任何载体(例如，质粒、粘粒或噬菌体染色体)(例如，其中编码序列与转录控制元件、诸如启动子可操作地连接)。载体可以包含两个或更多个核酸分子，在某些实施方式中，那两个或更多个核酸分子各自均包含编码蛋白的核苷酸序列。
“多肽”和“蛋白”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸的聚合物。“肽”可以用于指由1至50个氨基酸组成的氨基酸的聚合物。所述聚合物可以是直链或支链的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经天然修饰或通过干预(例如，二硫键形成，糖基化(除了修饰的载体蛋白的O-糖基化)，脂化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/封闭基团衍生化，蛋白水解切割，通过非天然存在的氨基酸修饰或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分缀合)修饰的氨基酸聚合物。该定义内还包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域中已知的其他修饰的多肽。
“聚糖”是含有小糖分子的大碳水化合物分子，并且在本文的某些实施方式中，是指“糖蛋白”(包含共价附接至氨基酸侧链的聚糖的蛋白)的寡糖链。“O-聚糖”或“O-连接的聚糖”在本文中用于指共价附接至另一分子的丝氨酸或苏氨酸残基的聚糖(即，该聚糖参与o-连接的糖基化)。聚糖可以是免疫原性的。聚糖是任何可以转移(例如，共价附接)到载体蛋白上的糖。聚糖包括单糖、寡糖和多糖。寡糖是具有2至10个单糖的聚糖。多糖是具有超过10个单糖的聚糖。多糖可以选自O-抗原、荚膜和胞外多糖。
用于本发明的聚糖是PgIL Otase底物。[3]，[29]，[30]，[31]，[32]和[33]。在某些实施方式中，聚糖可操作地连接至脂质载体。在某些实施方式中，聚糖可以是但不限于己糖、己糖的N-乙酰基衍生物、寡糖和聚糖。在某些实施方式中，在聚糖的还原末端处的单糖是己糖或己糖的N-乙酰基衍生物。在某些实施方式中，聚糖在其还原末端包含己糖单糖，如葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖醇、岩藻糖或甘露糖。在某些实施方式中，在还原末端处的己糖单糖是葡萄糖或半乳糖。在某些实施方式中，聚糖的还原末端是己糖的N-乙酰基衍生物。在通常情况下，己糖的N-乙酰基衍生物(或“己糖单糖衍生物”)在2位处包含乙酰胺基。在某些实施方式中，己糖的N-乙酰基衍生物选自N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰基己糖胺(HexNAc)、脱氧HexNAc、和2,4-二乙酰胺基-2,4,6-三脱氧己糖(DATDH)、N-乙酰基岩藻糖胺(FucNAc)和N-乙酰基奎诺糠胺(QuiNAc)。在某些实施方式中，己糖的N-乙酰基衍生物选自N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰基岩藻糖胺(FucNAc)、2,4-二乙酰胺基-2,4,6-三脱氧己糖(DATDH)、甘油酰胺-乙酰胺基三脱氧己糖(GATDH)和N-乙酰基己糖胺(HexNAc)。在某些实施方式中，聚糖具有N,N-二乙酰杆菌胺(diNAcBac)或假氨基酸(Pse)的还原末端。在某些实施方式中，聚糖是具有葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖醇、岩藻糖、甘露糖、呋喃半乳糖、鼠李糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、脱氧、HexNAc、QuiNAc、diNAcBac或Pse的还原末端的聚糖。在某些实施方式中，聚糖是具有葡萄糖、半乳糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、脱氧HexNAc或diNAcBac的还原末端的聚糖。在某些实施方式中，聚糖是具有葡萄糖、半乳糖、呋喃半乳糖、鼠李糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH或diNAcBac的还原末端的聚糖。在某些实施方式中，聚糖是具有葡萄糖、半乳糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH或diNAcBac的还原末端的聚糖。在某些实施方式中，聚糖是具有选自以下的还原末端的聚糖：DATDH、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、半乳糖和葡萄糖。在某些实施方式中，聚糖是具有GlcNAc、GalNAc、FucNAc或葡萄糖的还原末端的聚糖。在某些实施方式中，聚糖是具有半乳糖-β1,4-葡萄糖；葡萄糖醛酸-β1,4-葡萄糖；N-乙酰基-葡糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；半乳糖-β1,4-葡萄糖；鼠李糖-β1,4-葡萄糖；呋喃半乳糖-β1,3-葡萄糖；N-乙酰基-阿楚糖醛酸-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-葡糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的S-2至S-1还原末端的聚糖。
在某些实施方式中，聚糖对奈瑟氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、链球菌、大肠杆菌、假单胞菌、耶尔森氏菌、弯曲杆菌或螺杆菌细胞是内源性的。在某些实施方式中，聚糖对志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌或假单胞菌细胞是内源性的。在某些实施方式中，聚糖对福氏志贺氏菌、副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)或大肠杆菌细胞是内源性的。在某些实施方式中，聚糖来自空肠弯曲杆菌、N.meningitidis、P.aeruginosa、S.enterica LT2或E.coli。参见[4]、[29]、[3]、[34]。
在某些实施方式中，聚糖是免疫原聚糖(抗原)。在某些实施方式中，聚糖是O-抗原。在某些实施方式中，聚糖是对奈瑟氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、链球菌、大肠杆菌、假单胞菌、耶尔森氏菌、弯曲杆菌或螺杆菌细胞内源性的免疫原O-抗原。在进一步的实施方式中，PgIL聚糖底物是宋内志贺氏菌聚糖抗原，例如，S.sonnei O-抗原，福氏志贺氏菌聚糖抗原，例如，福氏志贺氏菌2a CPS，志贺痢疾杆菌聚糖抗原，肺炎链球菌聚糖抗原，例如，肺炎链球菌sp.12F CPS、S.pneumoniae sp.8CPS、S.pneumoniae sp.14CPS、S.pneumoniae sp.23ACPS、S.pneumoniae sp.33F CPS或S.pneumoniae sp.22A CPS。在某些实施方式中，聚糖是肺炎链球菌聚糖，其具有葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖醇、岩藻糖、甘露糖、呋喃半乳糖、鼠李糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、脱氧HexNAc、QuiNAc、diNAcBac或Pse的还原末端。在某些实施方式中，聚糖是肺炎链球菌聚糖，其具有半乳糖-β1,4-葡萄糖；葡萄糖醛酸-β1,4-葡萄糖；N-乙酰基-葡糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；半乳糖-β1,4-葡萄糖；鼠李糖-β1,4-葡萄糖；呋喃半乳糖-β1,3-葡萄糖；N-乙酰基-阿楚糖醛酸-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-葡糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的S-2至S-1还原末端。桑格研究所已对全部90种S.pneumoniae血清型的CP基因簇进行了测序(可在WorldWideWeb(www).sanger.ac.uk/Projects/S_pneumoniae/CPS/获得)。在NCBI以Genbank CR931632–CR931722提供了序列。S.pneumoniae的荚膜生物合成基因在来自肺炎链球菌菌株1196/45(血清型23A)的血清型23A中进一步描述为NCBI GenBank登录号：CR931683.1。来自肺炎链球菌菌株1039/41的血清型23B，NCBI GenBank登录号：CR931684.1。来自肺炎链球菌菌株Dr.Melchior的血清型23F，NCBI GenBank登录号：CR931685.1。
在某些实施方式中，聚糖是S.sonnei O-抗原。在某些实施方式中，S.sonnei O-抗原由wbgT蛋白、wbgU蛋白、wzx蛋白、wzy蛋白、wbgV蛋白、wbgW蛋白、wbgX蛋白、wbgY蛋白和wbgZ蛋白组成。在某些实施方式中，S.sonnei O-抗原由以下组成：与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的wbgT蛋白，与SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的wbgU蛋白，与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的wzx蛋白，与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的wzy蛋白，与SEQ IDNO:7具有至少90％同一性的wbgV蛋白，与SEQ ID NO:8具有至少90％同一性的wbgW蛋白，与SEQ ID NO:9具有至少90％同一性的wbgX蛋白，与SEQ ID NO:10具有至少90％同一性的wbgY蛋白和与SEQ ID NO:11具有至少90％同一性的wbgZ蛋白。
“同质性”指聚糖长度和可能的糖基化位点数量的可变性。上述方法可用于此目的。SE-HPLC能够测量流体动力学半径。与糖基化位点较少的载体相比，载体中糖基化位点的数量越多，流体力学半径的变化越大。然而，当分析单聚糖链时，由于长度更可控，其可能具有更高同质性。通过肼解、SDS PAGE和CGE测量聚糖长度。此外，同质性也可以指某些糖基化位点的使用模式改变到更宽/更窄的范围。这些因素可通过糖肽LC-MS/MS测量。
“生物缀合物同质性”指附着的糖残基的同质性，可以使用测量聚糖长度和流体动力学半径的方法进行评估。
寡糖或多糖的“还原末端”是具有游离异头碳的单糖，所述游离异头碳不参与糖苷键，且因此能够转化为开链形式。本文中的第一糖(“S-1”)是包含还原末端的糖，且第二糖(“S-2”)是与S-1相邻的糖。S-2糖可以通过例如α-(1→3)、β-(1→3)、β-(1→4)或α-(1→6)连接附接至S-1糖。
“糖基转移酶”(GTFs，Gtfs)是形成糖苷键的酶。糖基转移酶是催化糖苷键形成以形成糖苷的酶。例如，其催化糖部分从活化的核苷酸糖(也成为“糖基供体”)转移至亲核糖基受体分子，其亲核试剂可以是氧基-碳基、氮基或硫基。
“O-抗原”(也称为O-特异性多糖或O-侧链)是革兰氏阴性菌表面脂多糖(LPS)的一种成分。实例包括来自铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的O-抗原。
“O-糖基化修饰载体蛋白”是指修饰的载体蛋白被糖基化，特别是参与O-连接的糖基化(例如，与PgIL聚糖底物O-连接的修饰的载体蛋白)。
O-糖基化修饰的载体蛋白可以直接或间接连接到两种或多种不同的免疫原聚糖上，并且以这种方式可用于诱导对两种或更多种免疫原多糖(即，多价)的免疫或抗体应答。
设想在一个载体蛋白内使用多个O-连接的糖基化位点(参见实施例)，任选地，多个O-链接的糖基基化位点彼此相邻。两个或多个O-连接的糖基化位点可以通过由一个或多个氨基酸组成的“氨基酸接头”分离，例如，一个或多个甘氨酸([26])、一个或多个丝氨酸和/或其组合(参见[27])。此处的“氨基酸接头”是“接头”的一种类型。
位于载体蛋白的N末端或C末端的O-连接的糖基化位点的O-糖基化效率可以通过在O-连接的糖基化位点(即，位于朝向O-连接的糖基化位点的N末端和/或朝向O-连接的糖基化位点的C末端)侧翼使用一个或多个“侧翼肽”(包含亲水性氨基酸的肽，比如，例如，DPRNVGGDLD(SEQ ID NO:12的残基599-608)或QPGKPPR(SEQ ID NO:12的残基628-634))增加。[28]。这种侧翼肽可以与O-连接的糖基化位点相邻(即，在O-连接的糖化位点和侧翼肽之间没有氨基酸)，或者可以在其和O-连接的糖基化位点之间具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。可以使用两个或更多个侧翼肽的插入。侧翼肽可用于增加较短O-连接的糖基化位点的O-糖基化效率，例如具有序列SEQ ID NO:13、14、15或16(全部12个氨基酸长)的那些。
“脂多糖”(LPS)，也称为脂聚糖，是由脂质和多糖组成的大分子，通过共价键连接；其存在于革兰氏阴性菌的外膜中，作为内毒素，在动物体内引起强烈的免疫应答。
N-聚糖或N-连接寡糖是指通过N-糖苷连接与蛋白中天冬酰胺残基的ε-酰胺氮连接的可变组成的单糖、寡糖或多糖。
N-连接蛋白糖基化是指将“聚糖”(单糖、寡糖或多糖)共价连接到目标蛋白上天冬酰胺(N)侧链的氮的过程或途径。
O-抗原指LPS中含有的重复聚糖聚合物，也称为O-多糖。O抗原附着于核心寡糖，并包含LPS分子的最外层结构域。
寡糖或多糖是指由共价结合的碳水化合物(单糖)形成的同聚物或异聚物，由通过糖苷键连接在一起的重复单元(单糖、二糖、三糖等)组成。
OTase或OST是指低聚糖基转移酶，其催化低聚或多糖(糖基化)在新生或折叠蛋白的共有序列上向天冬酰胺(N)残基的机械独特和选择性转移。
“荚膜多糖”(CP)是一种存在于细菌细胞壁上的多糖。实例包括来自肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌和金黄色葡萄球菌的荚膜多糖。
“wzy”是多糖聚合酶基因，其编码催化多糖聚合的酶。编码的酶将寡糖单元转移到非还原端，形成糖苷键。
“waaL”是编码膜结合酶的O抗原连接酶基因。编码的酶将十一碳二磷酸(UPP)结合的O抗原转移到脂质A核心寡糖上，形成脂多糖。
如本文所用，术语“生物缀合物”是指在宿主细胞背景中制备的蛋白(例如，载体蛋白)和抗原(例如，糖类抗原，如细菌多糖抗原)之间的缀合物，其中宿主细胞机制将抗原与蛋白连接(例如，N-连接的糖基化)。
如本文所用，术语“修饰的蛋白”指与野生型相比改变的(以一种或多种方式)的蛋白(例如，“修饰的EPA蛋白”不包括野生型EPA蛋白)。
如本文所用，术语受试者指动物，特别是哺乳动物，如灵长类(例如，人)。
本文中的“抗原”或“免疫原”是指能够诱导受试者中的免疫应答的物质，通常是蛋白或聚糖。在某些实施方式中，抗原是具有“免疫学活性”的蛋白(例如，糖蛋白)，意味着一旦施用于受试者(直接或通过向受试者施用编码该蛋白的核苷酸序列或载体)，其能够引发针对该蛋白的体液和/或细胞类型的免疫应答。“O-抗原”由寡糖单元(O-单元)的重复组成，所述寡糖单元(O-单元)通常具有两个至六个糖残基。O-抗原是革兰氏阴性细菌的外膜的组分。在某些实施方式中，所述聚糖是O-抗原。
“佐剂”是增强抗原的免疫学作用的诱导、幅度和/或寿命的非抗原物质。
佐剂的具体实例包括但不限于铝盐(alum)(如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝)、3脱O-酰基单磷酸脂质A(MPL)(参见英国专利GB2220211)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)，聚山梨醇酯80(吐温80；ICL Americas,Inc.)、咪唑吡啶化合物[35]和皂苷，如QS21[36]。适宜的佐剂包括铝盐，如氢氧化铝凝胶(alum)或磷酸铝，但也可以是钙、镁、铁或锌的盐，或可以是酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生的多糖或聚磷腈的不溶性混悬液。
“缀合”是指载体蛋白与糖的偶联(例如，通过共价键)。
本文的“缀合物”意指与彼此连接的两个或更多个分子(例如，蛋白)。所述两个或更多个分子任选地是重组分子和/或与彼此异源。在某些实施方式中，所述缀合物包含两个或更多个分子，第一个是载体蛋白，例如修饰的载体蛋白，且剩余的一个或多个分子是共价附接至载体蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基的聚糖。在某些实施方式中，缀合物包含糖基化的载体蛋白，诸如O-糖基化的载体蛋白，包括O-糖基化的修饰的载体蛋白。结合物可以是化学缀合或体外缀合(生物缀合)的结果。
“抗体”意指通过免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合靶标、诸如蛋白、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述物质的组合的免疫球蛋白分子。如本文所用，术语“抗体”涵盖完整的多克隆抗体，完整的单克隆抗体，多特异性抗体，诸如由至少两种完整的抗体生成的双特异性抗体，嵌合抗体，人源化抗体，人抗体，包含抗体的融合蛋白和任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要抗体表现出期望的生物学活性即可。基于其重链恒定结构域的身份(分别称为α、δ、ε、γ和μ)，抗体可以是免疫球蛋白的五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)中的任一种。不同类别的免疫球蛋白具有不同且众所周知的亚基结构和三维构型。抗体可以是裸露的或与其他分子(诸如毒素、放射性同位素等)缀合。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分。“抗原结合片段”是指完整抗体的结合抗原的部分。抗原结合片段可以含有完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、线性抗体和单链抗体。
“抗体应答”意指抗抗原抗体的产生。“诱导抗体应答”或“产生抗体应答”意指在体内刺激抗抗原抗体、例如抗O-抗原抗体或抗聚糖抗体的产生。
“序列同一性的百分比”、“同一性百分比”和“相同性百分比”在本文中用于指多核苷酸序列或多肽序列之间的比较，并通过在比较窗上比较两个最佳比对的序列来确定，其中与参考序列相比，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可包括添加或缺失(即，空位)，以实现两个序列的最佳比对。通过确定在两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基或核酸碱基或核酸残基与空位对齐以产生匹配位置的数目来计算百分比，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100，得到序列同一性的百分比。使用BLAST和BLAST 2.0算法确定最佳比对和序列同一性百分比(参见，例如，Altschul等，1990,J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等，1977,Nucleic Acids Res.3389-3402)。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心网站公开获得。
简言之，BLAST分析首先涉及通过识别查询序列中长度为W的短单词来识别高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中长度相同的单词对齐时，短单词匹配或满足某个正值阈值分数T。T被称为邻近词得分阈值(Altschul等，同上)。这些最初的邻近词命中作为启动搜索的种子，以找到包含其的较长HSP。然后，单词命中沿着每个序列在两个方向上延伸，直到累积对齐分数可以增加为止。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；总是>0)和N(失配残基的惩罚分数；总是<0)计算累积分数。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积分数。在以下情况下，单词命中在每个方向上的扩展将停止：累积对齐分数从其最大实现值下降了数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积分数变为零或更低；或者到达任一序列的末尾。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(针对核苷酸序列)使用默认的单词长度(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认的单词长度(W)为3，期望值(E)为10，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,1989,Proc Natl Acad Sci USA 89:10915)。
在提供两个序列的同一性百分比方面，许多其他算法的功能类似于BLAST。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith和Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482的局部同源算法，通过Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443的同源比对算法，通过Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索方法，通过计算机实现这些算法(在GCG Wisconsin软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或者通过目测检查(一般参见，Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等(编著)，Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,(1995年增补)(Ausubel))进行。此外，使用提供的默认参数，可以使用GCG Wisconsin软件包(Accelrys,Madison WI)中的BESTFIT或GAP程序来确定序列比对和序列同一性百分比。ClustalW程序也适于确定同一性。
作为非限制性实例，任何特定的多核苷酸或多肽是否具有特定百分比序列同一性(例如，至少80％同一性，至少85％同一性，至少90％同一性，并且在一些实施方式中，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)可以使用已知方法、诸如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8for Unix,GeneticsComputer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,WI 53711)来确定。Bestfit使用Smith和Waterman(Advances in Applied Mathematics 2:482 489(1981))的局部同源性算法来查找两个序列之间的同源性最佳区段。当使用Bestfit或任何其他序列比对程序来确定特定序列是否例如与根据本发明的参考序列具有95％同一性时，设置参数，使得在参考核苷酸序列的全长上计算同一性百分比，并且允许同源性最多达参考序列中核苷酸总数的5％的空位。
在一些实施方式中，本发明的两种核酸或多肽是基本上相同的，意味着当如使用序列比较算法或通过目视检查和比较以获得最大对应性时，其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、并且在一些实施方式中至少95％，96％、97％、98％、99％核苷酸或氨基酸残基同一性。同一性可以存在于长度为至少约10、约20、约40-60个残基或它们之间的任何整数值的序列区域上，并且可以在比60-80个残基更长的区域上，例如，在至少约90-100个残基，并且在一些实施方式中，序列在所比较的序列(诸如核苷酸序列的编码区)的“全长”上基本上相同。
“相对于...编号”、“与...相比”、“根据...编号”在本文中用于指氨基酸序列中的位置，但不限于所提及的氨基酸序列。因此，应理解，例如，残基“相对于SEQ ID NO:17编号的I28”可以涵盖SEQ ID NO:18的I29以及SEQ ID NO:19的I28(如下所示)。
SEQ_ID_NO_17 SAVTEYYLNHGEWPGNNTSAGVATS-SEIK------29
SEQ_ID_NO_18 SAVTGYYLNHGTWPKDNTSAGVASSPTDIK------30
SEQ_ID_NO_19 GAVTEYEADKGVFPTSNASAGVAAA-ADINGK----31
如本文所用的“宿主细胞”是指向其中引入、已经引入或将引入分子(通常是异源或非天然核酸分子)的细胞。本文的宿主细胞不涵盖整个人生物体。
寡糖基转移酶(OST或OTases)是将寡糖从脂质载体转移到新生蛋白(一种糖基转移酶)的膜包埋酶。O-连接糖基化由糖分子(聚糖)共价连接到蛋白靶点(例如，菌毛)中氨基酸残基(例如，丝氨酸或苏氨酸)的侧链羟基组成。
如本文所用“载体蛋白”指适合用作生物缀合疫苗生产中的载体蛋白的蛋白(例如，[32])。如本文所用“载体蛋白”不同于“脂质载体”(或“脂质连接载体”)，后者包括但不限于焦磷酸十一碳壬酯(UndPP)。“载体蛋白”可以共价附接至抗原(例如，糖类抗原，如细菌多糖抗原)上，以形成缀合物(例如，生物缀合物)。载体蛋白激活与其结合的抗原相关的T细胞介导的免疫。
本文中可以使用适合于生产缀合物疫苗的任何载体蛋白(例如，用于疫苗的生物缀合物)，例如，可以将编码载体蛋白的核酸引入本文提供的宿主中，以生产包含与假单胞菌抗原连接的载体蛋白的生物缀合物。示例性载体蛋白包括但不限于铜绿假单胞菌的解毒外毒素A(“EPA”；参见，例如Ihssen等，(2010)Microbial cell factories 9,61)，CRM197，麦芽糖结合蛋白(MBP)，白喉类毒素，破伤风类毒素，金黄色葡萄球菌的解毒溶血素A，凝集因子A，凝集因子B，大肠杆菌FirmH，大肠杆菌FirmHC，大肠杆菌热不稳定肠毒素，大肠杆菌热不稳定肠毒素的解毒变体，霍乱毒素B亚基(CTB)，霍乱毒素，霍乱毒素的解毒变体，大肠杆菌Sat蛋白，大肠杆菌Sat蛋白的过客结构域，肺炎链球菌肺炎球菌溶血素及其解毒变体，空肠弯曲杆菌AcrA，铜绿假单胞菌PcrV蛋白和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白。
如本文所用的“修饰的载体蛋白”意指与野生型相比被改变(以一种或多种方式)的载体蛋白(即，“修饰的载体蛋白”不包括野生型菌毛蛋白)。修饰的载体蛋白包括但不限于并入一个或多个O-连接的糖基化位点、纯化标签、缺失(例如，跨膜结构域的至少一部分的缺失)、插入和/或突变(例如，AcrA突变)的载体蛋白([22])。在某些实施方式中，修饰的载体蛋白与对照载体蛋白(例如，野生型)相比被改变，使得修饰的载体蛋白可以是PgIL聚糖底物的“受体”(即，从没有菌毛蛋白中间体的PgIL直接接受PgIL聚糖底物)。在某些实施方式中，一种此类修饰的载体蛋白通过包含一个或多个O-连接的糖基化位点而改变。在某些实施方式中，一种此类修饰的载体蛋白在其N-末端、C-末端和/或内部残基包含一个或多个O-连接的糖基化位点。为了清楚起见，“包含在其N-末端和/或C-末端具有一个或多个O-连接的糖基化位点的载体蛋白的修饰的载体蛋白”意指“其N-末端和/或C-末端与一个或多个O-连接的糖基化位点可操作地连接的载体蛋白的修饰的载体蛋白”。
在某些实施方式中，修饰的载体蛋白直接(例如，通过O-连接的糖苷键)或间接(例如，通过接头)共价偶联到聚糖上，其中偶联是在一个或多个O-连接的糖基化位点处。在进一步的实施方式中，聚糖是PgIL聚糖底物。
在某些实施方式中，修饰的载体蛋白偶联至志贺氏菌聚糖(例如，宋内志贺氏菌聚糖(如S.sonnei O-抗原)，或者例如，福氏志贺氏菌聚糖(如福氏志贺氏菌2a CPS)或志贺痢疾杆菌聚糖)。
在某些实施方式中，修饰的载体蛋白偶联至链球菌聚糖(例如，肺炎链球菌(如肺炎链球菌sp.12F CPS、S.pneumoniae sp.8CPS、S.pneumoniae sp.14CPS、S.pneumoniaesp.23A CPS、S.pneumoniae sp.33F CPS或S.pneumoniae sp.22A CPS))。
在某些实施方式中，PgIL OTase是脑膜炎奈瑟氏菌PgIL、淋病奈瑟氏菌PgIL、乳糖奈瑟球菌020-06PgIL、乳糖奈瑟球菌ATCC 23970PgIL、淋病奈瑟氏菌F62 PgIL、灰色奈瑟球菌ATCC 14685PgIL、粘液奈瑟球菌PgIL、金黄奈瑟氏球菌NRL30031/H210PgIL、粘液奈瑟球菌ATCC 25996PgIL、奈瑟氏菌属口腔分类单元014菌株F0314PgIL、弓形奈瑟氏菌PgIL、沙耶加尼奈瑟氏菌871PgIL、沙耶加尼奈瑟氏菌871PgIL、奈瑟氏菌属83E34PgIL、瓦氏奈瑟氏菌PgIL、长形奈瑟氏菌亚种糖酵解菌ATCC 29315PgIL、杆状奈瑟氏菌ATCC BAA-1200PgIL、奈瑟氏菌属口腔分类单元020菌株F0370PgIL、奈瑟氏菌74A18PgIL、韦氏奈瑟氏菌ATCC51223PgIL或猕猴奈瑟氏菌ATCC 33926PgIL OTase。
在某些实施方式中，PgIL聚糖底物是O-抗原。在某些实施方式中，PgIL聚糖底物是S.sonnei O-抗原。
示例性载体蛋白包括但不限于铜绿假单胞菌的解毒外毒素A(“EPA”；参见，例如[6])，CRM197，麦芽糖结合蛋白(MBP)，白喉类毒素(DT)，破伤风类毒素(TT)，破伤风毒素C片段(TTc)，金黄色葡萄球菌的解毒溶血素A，凝集因子A，凝集因子B，大肠杆菌FirmH，大肠杆菌FirmHC，大肠杆菌热不稳定肠毒素，大肠杆菌热不稳定肠毒素的解毒变体，霍乱毒素B亚基(CTB)，霍乱毒素，霍乱毒素的解毒变体，大肠杆菌Sat蛋白，大肠杆菌Sat蛋白的过客结构域，肺炎链球菌肺炎球菌溶血素及其解毒变体，空肠弯曲杆菌吖啶黄抗性蛋白A(CjAcrA)，大肠杆菌吖啶黄抗性蛋白A(EcAcrA)，铜绿假单胞菌PcrV蛋白(PcrV)，空肠弯曲杆菌天然糖蛋白，肺炎链球菌NOX，肺炎链球菌PspA，肺炎链球菌PcpA，肺炎链球菌PhtD，肺炎链球菌PhtE，肺炎链球菌ply(例如，解毒ply)，肺炎链球菌LytB，流感嗜血杆菌D(PD)。[24]，[25]，[26]。在某些实施方式中，所述载体蛋白选自CTB、TT、TTc、DT、CRM197、EPA、EcAcrA、CjAcrA和PcrV。在某些实施方式中，所述载体蛋白选自EPA、EcAcrA、CjAcrA和PcrV。在某些实施方式中，所述载体蛋白是EPA。在某些实施方式中，所述载体蛋白是EcAcrA。
如本文所用的“纯化标签”是指用例如大小排阻色谱、离子交换色谱和/或亲和色谱法帮助蛋白纯化的配体。纯化标签及其用途是本领域众所周知的，并且可以是例如聚组氨酸(HIS)，谷胱甘肽S-转移酶(GST)，c-Myc(Myc)，血凝素(HA)，FLAG或麦芽糖结合蛋白(MBP)。在某些实施方式中，纯化标签是表位标签(其包括例如组氨酸，FLAG，HA，Myc，V5，绿色荧光蛋白(GFP)，GSK，β-半乳糖苷酶(b-GAL)，萤光素酶，麦芽糖结合蛋白(MBP)或红色荧光蛋白(RFP)标签)。在某些实施方式中，多肽可操作地连接至一个或多个纯化标签(包括纯化标签的组合)。因此，纯化、收集、获得或分离蛋白的步骤可以包括大小排阻色谱、离子交换色谱或亲和色谱。在某些实施方式中，纯化修饰的载体蛋白(或包含其的缀合物)的步骤利用亲和色谱，例如，σ28亲和柱或包含结合修饰的载体蛋白或包含其的缀合物的抗体的亲和柱(任选地，通过结合聚糖(glycn))。在某些实施方式中，纯化包含至少一个可操作地连接至纯化标签的修饰的载体蛋白的融合蛋白的步骤利用亲和色谱和例如结合纯化标签的亲和柱。
“细胞底物”是指用于生产所需生物技术/生物产品的细胞。
将“产率”测量为在控制和优化的条件下从在生物反应器中生长的1升细菌生产培养物衍生的碳水化合物量。纯化生物缀合物后，碳水化合物产率可以通过蒽酮测定或使用碳水化合物特异性抗血清的ELISA直接测量。间接测量是可以的，这通过使用蛋白量(通过BCA、Lowry或bardford测定测量)和聚糖长度和结构来计算每克蛋白的理论碳水化合物量。另外，还可以通过从挥发性缓冲液中干燥糖蛋白制剂并使用天平来测量重量来测量产率。
“免疫原性组合物”、“疫苗组合物”或“药物组合物”是经配制为允许活性成分的生物活性有效的制剂，并且其不含对会向其施用组合物的受试者具有不可接受的毒性的额外组分。免疫原性、疫苗或药物组合物包含药物级活性成分(例如，药物级抗原)，因此，本发明的免疫原性、疫苗或药物组合物不同于任何例如天然存在的组合物。参见[34]。在某些实施方式中，所述免疫原性、疫苗或药物组合物是无菌的。在某些实施方式中，所述组合物是包含“免疫原性缀合物”(例如，与免疫原性聚糖共价连接的修饰的载体蛋白)的免疫原性组合物。在某些实施方式中，所述免疫原性聚糖是O-抗原。免疫原性组合物包含免疫学有效量的免疫原性聚糖或免疫原性缀合物。
“免疫有效量”可以作为单剂量或作为系列的一部分施用于个体。在某些实施方式中，所述免疫原性组合物进一步包含药学上可接受的佐剂、赋形剂、载体或稀释剂。佐剂、赋形剂、载体和稀释剂本身不诱导抗体或免疫应答，但是其提供引发或增强对抗原(例如，免疫原性聚糖)的抗体或免疫应答的技术效果。
“缀合物疫苗”是指通过将多糖抗原共价连接到载体蛋白上而产生的疫苗。缀合物疫苗可引发抗菌免疫应答和免疫记忆。在婴儿和老年人中，如果多糖抗原与诱导T细胞依赖性应答的蛋白结合，则可以诱导针对多糖抗原的保护性免疫应答。
共有序列指氨基酸的序列-D/E-X-N-Z-S/T-其中X和Z可以是除脯氨酸以外的任何天然氨基酸，在脯氨酸中发现碳水化合物与N-连接糖蛋白的连接位点。
荚膜多糖指一层厚的、粘液状的多糖。荚膜多糖是水溶性的；通常是酸性的，由一个到几个单糖/单体的规律重复单元组成。
糖缀合物疫苗指由与抗原寡糖连接的蛋白载体组成的疫苗。
糖基转移酶指作为单糖单元从活化的核苷酸糖转移到糖基受体分子的催化剂的酶。
革兰氏阳性菌株是指用革兰氏染色(一种有价值的诊断工具)染成紫色的细菌菌株。革兰氏阳性菌有一个由肽聚糖(50-90％的细胞壁)构成的厚网状细胞壁。
革兰氏阴性菌株是指具有较薄层(10％的细胞壁)的细菌菌株，其染色呈粉红色。革兰氏阴性菌也有一个额外的外膜，其含有脂质，并通过周质空间与细胞壁分离。
被动免疫是以已经产生的抗体的形式将主动体液免疫从一个人转移到另一个人。
RU是指重复单元，由特定的杂多糖组成，这些杂多糖是通过在磷酸十一辛酯(Und-P)载体上将单个单糖组装成寡糖，然后聚合成寡糖而合成的。
信号序列是指蛋白质N端的短肽(例如，约3-60个氨基酸长)，其将蛋白引导到不同的位置。
本文所用的“多糖”包括包含至少两个单糖的糖。多糖包括寡糖、三糖、包含一种或多种单糖(或单体)的重复单元以及本领域普通技术人员公认为多糖的其他糖。N-聚糖在本文中定义为通过N-糖苷键与蛋白中天冬酰胺残基的ε-酰胺氮连接的可变组成的单糖、寡糖或多糖。
本文所述的核酸包括重组DNA和合成(例如，化学合成)DNA。核酸可以是双链或单链。在单链核酸的情况下，核酸可以是有意义链或反义链。如本领域技术人员根据本说明书所知，核酸可以使用寡核苷酸类似物或衍生物合成。
术语“药学上可接收的载体”指无毒载体。适宜的药学上可接收的载体包括，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及其组合。药学上可接受的载体可进一步包含少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强抗体的保质期或有效性。此类药学上可接受的载体包括，例如，用作药物载体、赋形剂或介质的液体、半固体或固体稀释剂。可以使用本领域公知的任何稀释剂。示例性稀释剂包括但不限于聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯、硬脂酸镁、甲基和丙基羟基苯甲酸酯、滑石、藻酸盐、淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、阿拉伯树胶、磷酸钙、矿物油、可可脂和可可油。
将术语“上游过程”定义为从早期细胞分离和培养到细胞库和细胞培养扩增直至最终收获(培养终止和活细胞批次收集)的整个过程。生物过程的上游部分是指微生物/细胞在生物反应器中生长的第一步，例如，细菌或哺乳动物细胞系。上游加工涉及与接种物开发、培养基开发、通过基因工程工艺改进接种物、优化生长动力学相关的所有步骤，从而使产品开发得到极大改善。
术语“下游工艺”是指对上游的细胞质量进行处理以满足纯度和质量要求的部分。下游处理通常分为三个主要部分：细胞破坏、纯化部分和精制部分。挥发性产物可以在不进行预处理的情况下通过蒸馏收获的培养物来分离。蒸馏在减压下在连续蒸馏器中进行。在减压下，可以直接从发酵罐中蒸馏产品。
“SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)”是一种广泛应用于生物化学和分子生物学的技术，根据蛋白的电泳迁移率(多肽链长度或分子量的函数，以及更高阶的蛋白折叠、翻译后修饰和其他因素)来分离蛋白。该技术的分辨率使其能够区分不同程度糖基化的蛋白(例如，单糖基化、二糖基化或三糖基化形式)。通过SDS-PAGE分离志贺氏菌EPA生物缀合物后，将凝胶用胶体考马斯蓝染色进行检测。随后通过使用凝胶评估软件(例如，Image Quant TL)在带像素体积上确定不同糖型的比率(糖基化程度)。测试包括对几个系统适用性标准以及产品特定参考标准的评估，以确保正确的测定性能。
“PgIL；”寡糖基转移酶(OST或OTases)是将寡糖从脂质载体转移到新生蛋白的膜包埋酶(与细胞质中的糖基转移酶不同，糖基转移酶类通过顺序作用组装寡糖，OTases将聚糖整体转移到蛋白[5])。O-连接糖基化由糖分子(聚糖)共价连接到蛋白靶(例如，菌毛)中氨基酸残基(例如，丝氨酸或苏氨酸)的侧链羟基组成。来自例如脑膜炎奈瑟氏菌的菌毛糖基化基因L(PgIL)蛋白是参与O-连接糖基化的OTase。在革兰氏阴性菌的胞质中，PgIL将聚糖从Und-PP聚糖转移到菌毛蛋白([3])。与PgIB(N-糖基化)不同，PgIL不需要2-乙酰胺基位于C-2的还原末端的基团，或前两种糖之间的β1,4连接，因此能够转移几乎任何聚糖(脑膜炎奈瑟菌PgIL转移，例如，空肠弯曲杆菌七糖、大肠杆菌O7抗原、大肠杆菌K30荚膜结构、肠杆菌O抗原和大肠杆菌O16肽聚糖亚基转移到大肠杆菌和沙门氏菌细胞中的菌毛蛋白)([3]，[4]，[37]，[38])。NmPgIL及其同源物，例如来自淋病奈瑟菌的PgIL(称为“PglO”，[39]和[40])和来自铜绿假单胞菌的PilO([16])，因此是“混杂的”底物(即，其具有松弛的底物特异性，因此能够转移不同的寡聚和多糖)。[3]和[37](根据[4]和[38])。脑膜炎奈瑟菌PgIL(NmPgIL)同源物在本文中描述(参见实施例)，并且是本领域已知的：[41]，[42]，[43])。
本文中的“PgIL OTase”包括脑膜炎奈瑟菌PgIL OTase以及NmPgIL OTase同源物。因此，本文的术语“PgIL OTases“包括，例如，脑膜炎奈瑟氏菌PgIL(NmPgIL)寡糖基转移酶(OTase)、淋病奈瑟氏菌PgIL(NgPgIL)OTase、内酰胺奈瑟氏菌(Neisseria lactamica)020-06(NlPgIL)OTase、内酰胺奈瑟氏菌ATCC 23970PgIL(NlATCC23970PgIL)OTase和淋病奈瑟氏菌F62PgIL(NgF62PgIL)OTase。
本文所用的“PgIL聚糖底物”、“PgIL底物”是指可通过PgIL Otase转移的聚糖(即，作为PgIL底物的聚糖)。参见[3]，[44]，[45]，[4]，[46]。在某些实施方式中，PgIL聚糖底物附着于脂质载体(“脂质载体连接的PgIL聚糖底物”)。在某些实施方式中，脂质载体是焦磷酸十一癸烯醇(UndPP)、焦磷酸多立醇或其合成等效物。在某些实施方式中，脂质载体是UndPP。在某些实施方式中，聚糖是“UndPP连接的PgIL底物”。可以设想，脂质载体连接的聚糖在革兰氏阴性宿主细胞内被膜结合。膜结合的脂质载体连接的PgIL底物可以称为位于“周质”。在某些实施方式中，特别是NmPgIL聚糖底物、NgPgIL聚糖底物、NlPgIL聚糖底物或NsPgIL聚糖底物。在某些实施方式中，PgIL聚糖底物包含具有葡萄糖、半乳糖、呋喃半乳糖、鼠李糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、脱氧HexNAc、diNAcBac或Pse还原末端的聚糖。在某些实施方式中，聚糖是免疫原性(例如，“免疫原性PgIL聚糖底物”)。在某些实施方式中，聚糖是O-抗原(例如，“PgIL O-抗原底物”)。参见[3]，[44]，[45]，[46]，[47]，[48]。
本文描述了在异源宿主细胞内重组表达奈瑟菌PgIL，这是本领域公知的(参见[50]，[51]，[52]，[53](例如，表1)，[12]，[3]，[44]，[7]，[4]，[49]；其全部内容通过引用并入本文)。
缩略语
表2：缩略语
发明/一般信息介绍
图1A、图1B和图2说明了一种技术，该技术能够使用适当工程化的细菌细胞在体内直接合成糖缀合物疫苗。该技术用于生产基于生物缀合物的志贺氏菌疫苗。为了使生产菌株能够生产多糖，将S.flexneri 2a、3a、6和S.sonnei的多糖合成酶转移至共表达载体蛋白EPA和寡糖基转移酶的大肠杆菌。对于Sf2E、Sf3E和Sf6E，低聚糖基转移酶PgIB(任选来自空肠弯曲杆菌)用于将多糖转移到大肠杆菌中铜绿假单胞菌(EPA)解毒外毒素A载体蛋白上的共有序列，从而产生糖蛋白。对于S.sonnei，PgIL任选地来自脑膜炎奈瑟氏菌或淋病奈瑟氏菌，用于将多糖转移到大肠杆菌中铜绿假单胞菌(EPA)解毒外毒素A载体蛋白上的不同共有序列，从而产生糖蛋白。
S-4V候选疫苗是一种四价生物缀合物，由S.sonnei和S.flexneri 2a、3a和6的O抗原多糖组成，与重组铜绿假单胞菌外蛋白A(rEPA)缀合。
结构
四价志贺氏菌生物缀合物疫苗的免疫原性组分是来自S.flexneri 2a、S.flexneri 3a、S.flexneri 6和S.sonnei的O-抗原多糖链，其与解毒蛋白载体EPA共价连接。
对于Sf2E、Sf3E和Sf6E，多糖通过O-抗原的还原末端共价连接到天冬酰胺残基的侧链氮原子上，天冬酰胺的侧链碳原子位于N-糖基化的共有序列中(见表3)。信号肽(带下划线的字母)在易位至胞质的过程中被切割。N-糖基化共有位点用粗体字母标记。Leu-Glu向Val突变(斜体)导致EPA显著解毒。
表3：用于Sf2E、Sf3E和Sf6E的改良解毒铜绿假单胞菌外毒素A(EPA)蛋白载体
对于SsE，多糖通过O-抗原的还原末端共价连接至在O-糖基化位点残留的丝氨酸残基的侧链氧原子(见表4)。信号肽(带下划线的字母)在易位至胞质的过程中被切割。O-糖基化共有位点用粗体表示，假定O-糖基化丝氨酸用下划线表示。Leu-Glu向Val突变(斜体)导致EPA显著解毒。
表4：用于SsE的改良解毒铜绿假单胞菌外毒素A(EPA)蛋白载体
解毒铜绿假单胞菌外毒素A(EPA)蛋白载体
野生型铜绿假单胞菌外毒素A是ADP核糖转移酶毒素家族的成员，其包含超过600个氨基酸残基，分子量超过65kDa。
用于志贺氏菌4V候选疫苗的无毒(重组)突变体与野生型毒素至少在两个残基上有所不同：Leu552被改为Val，Glu553(在催化结构域中)缺失。据报道，Glu553缺失可显著降低毒性，预计不会可逆。除了减毒突变以外，引入糖基化位点共有需要(参见表2和表3)。
S.flexneri 2a-抗原多糖(PS)
S.flexneri 2a抗原由平均约16个重复单元(RU)组成，并通过D-GlcNAc还原末端连接到N-糖基化共有位点之一的天冬酰胺残基的ε-氮原子。单个重复单元通过β-1,2键连接。在生物缀合物上存在的RU结构已被解析并且存在于图3中。由于缺乏O-乙酰化，其偏离了天然表位。Perepelov报道了S.flexneri 2a O-抗原的非随机O-乙酰化[54]。(O-乙酰基在第6位与GlcNAc相连(约60％)，在第3位和第4位与Rha III相连(约60％/约25％)(14))和Kubler[55]。(GlcNAc第6位为30-60％，Rha III第3位为30-50％)。选择抗原结构的基本原理是i)对合成的非O-乙酰化寡糖的研究将分支葡萄糖确定为重要的表位，并发现其具有免疫原性，ii)在临床试验中测试的化学S.flexneri 2a生物缀合物疫苗可能缺乏O-乙酰基基团，由于相当苛刻的处理，和iii)用非O-乙酰化寡糖生物缀合物免疫的动物的血清识别从S.flexneri 2a野生型菌株中提取的LPS，并显示出血清杀菌活性。
PS链长度的自然变化导致具有不同分子量的生物缀合物，可以使用适当的方法进行解析和分析。
S.flexneri 3a-抗原多糖(PS)
S.flexneri 3a抗原由平均约16个RU组成，并通过D-GlcNAc还原末端连接到N-糖基化共有位点之一的天冬酰胺残基的ε-氮原子。福氏志贺氏菌3a的O-乙酰化RU的全质子和碳归属已发表，表明1位的鼠李糖完全O-乙酰化，GlcNAc上的乙酰化约为40％(图4)，认为其是血清型决定因素。单个重复单元通过β-1,2键连接。该菌株已被工程化为代表野生型O-乙酰化模式，生物缀合物上存在的RU结构通过核磁共振(NMR)解析。分析证实鼠李糖在位置1上100％O-乙酰化，在GlcNAc上约50％乙酰化。
S.flexneri 6-抗原多糖(PS)
S.flexneri 6抗原由平均约14个RU组成，并通过D-GalNAc还原末端连接到N-糖基化共有位点之一的天冬酰胺残基的ε-氮原子。单个重复单元通过β-1,2键连接。福氏志贺氏菌6的O-乙酰化RU的全质子和碳归属已发表[56]，以及附接到核心图5的终末RU，表明Rha 3的位置3处的OAc占比约60％，位置4处的OAc占比约30％。该菌株已被工程化，以代表野生型结构和O-乙酰化模式，以及生物缀合物上存在的RU结构，如核磁共振(NMR)所证实的。
S.sonnei-抗原多糖(PS)
S.sonnei抗原由平均约29个RU组成，并通过D-FucNAc4N还原端连接至O-糖基化共有位点中丝氨酸的羟基。单个重复单元通过β-1,4键连接。宋内志贺氏菌的双糖RU的全质子和碳归属已发表，图6。该菌株已被工程化为代表野生型结构，生物缀合物上存在的RU结构已通过核磁共振(NMR)证实。
实施方式
本发明的实施方式包括但不限于：
1.一种组合物，其包含来自福氏志贺氏菌(S.flexneri)2a(Sf2E)、福氏志贺氏菌(S.flexneri)3a(Sf3E)、福氏志贺氏菌(S.flexneri)6(Sf6E)和宋内志贺氏菌(S.sonnei)(SsE)的每一种的O-抗原多糖链；其中来自S.flexneri 2a(Sf2E)、S.flexneri 3a(Sf3E)、S.flexneri 6(Sf6E)的所述O-抗原多糖分别共价连接至蛋白载体，所述蛋白载体已被修饰以包含N-糖基化共有序列；其中所述N-糖基化共有序列是D/E-X-N-Z-S/T(SEQ ID NO:31)，其中X和Z可以是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，并且任选地其中PgIB用于将所述多糖转移到所述N-糖基化共有序列D/E-X-N-Z-S/T(SEQ ID NO:31)，其中X和Z可以是除了脯氨酸以外的任何氨基酸；其中SsE共价连接至蛋白载体，所述蛋白载体含有O-糖基化共有序列，所述O-糖基化共有需要能够被PgIL糖基化，任选地其中PgIL用于将所述多糖转移到针对SsE的所述共有序列TWPKDNTSAGVASSPTDIK(SEQ ID NO:29)。
2.一种载体蛋白，其选自以下：霍乱毒素b亚单位(CTB)、破伤风类毒素(TT)、破伤风毒素C片段(TTc)、白喉类毒素(DT)、CRM197、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(EPA)、空肠弯曲杆菌吖啶黄抗性蛋白A(CjAcrA)、E.coli吖啶黄抗性蛋白A(EcAcrA)和铜绿假单胞菌PcrV(PcrV)。
3.根据实施方式2所述的蛋白载体，其是铜绿假单胞菌A(EPA)。
4.根据实施方式3所述的EPA，其是无毒性(重组)突变体；其中EPA的Leu552残基被Val替代；其中Glu552残基被缺失。
5.根据实施方式2所述的载体蛋白，其包含3个N-糖基化共有序列；其中所述蛋白载体在一个(单糖基化)、两个(双糖基化)或所有三个N-糖基化位点(三糖基化)处糖基化。
6.根据实施方式1所述的多糖，其中Sf2E、Sf3E和Sf6E通过O抗原的还原末端与天冬酰胺残基的侧链氮原子共价连接；其中所述天冬酰胺残基在D/E-X-N-Z-S/T(SEQ ID NO:31)N-糖基化共有序列。
7.根据实施方式1所述的组合物，其中S.flexneri 2a、S.flexneri 3a、S.flexneri 6抗原通过D-GlcNAc还原末端连接至N-糖基化共有位点中的一个的天冬酰胺残基的ε-氮原子。
8.SsE的多糖通过O-抗原的还原末端共价连接；其中所述聚糖具有以下还原末端结构
ο葡萄糖、半乳糖、呋喃半乳糖、鼠李糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、脱氧HexNAc、diNAcBac或Pse的还原末端结构；
οDATDH、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、半乳糖或葡萄糖的还原末端结构；
οGlcNAc、GalNAc、FucNAc或葡萄糖的还原末端结构；或者
ο半乳糖-β1,4-葡萄糖；葡萄糖醛酸-β1,4-葡萄糖；N-乙酰基-葡糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；半乳糖-β1,4-葡萄糖；鼠李糖-β1,4-葡萄糖；呋喃半乳糖-β1,3-葡萄糖；N-乙酰基-阿楚糖醛酸-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-葡糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的S-2至S-1还原末端结构。
9.免疫原性组合物SsE的多糖通过O-抗原的还原末端共价连接至侧链丝氨酸残基。
10.在免疫原性组合物中，丝氨酸残基残留在O-糖基化位点中。
11.在免疫原性组合物中，S.flexneri 2a–抗原由平均约16个重复单元组成。
12.在免疫原性组合物中，重复单元通过β-1,2-键连接。
13.一种革兰氏阴性宿主细胞，其包含免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含来自S.flexneri 2a(Sf2E)、S.flexneri 3a(Sf3E)、S.flexneri 6(Sf6E)和S.sonnei(SsE)的O-抗原多糖链；其中所述O-抗原多糖链共价连接至蛋白载体，所述蛋白载体已被修饰以包含蛋白糖基化的共有序列D/E-X-N-Z-S/T(SEQ ID NO:31)，其中X和Z可以是除了脯氨酸以外的任何氨基酸；其中PgIB用于将多糖转移至Sf2E、Sf3E和Sf6E的共有序列；并且其中PgIL用于将多糖转移至SsE的共有序列。
14.一种革兰氏阴性宿主细胞，其不是S.sonnei，其包含来自S.sonnei(SsE)的O-抗原多糖链。在一个实施方式中，宿主细胞是奈瑟氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌、假单胞菌或耶尔森氏菌细胞；其中宿主细胞是大肠杆菌；其中大肠杆菌是基因修饰的。
15.宿主细胞包含载体蛋白EPA编码的质粒，任选地包含适于被PgIL糖基化的至少一个O-糖基化共有序列，任选地包含氨基酸序列TWPKDNTSAGVASSPTDIK(SEQ ID NO:29)。
16.宿主细胞包含编码寡糖基转移酶PgIL的质粒。
17.在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的多糖生物合成(rfb)簇被O-多糖簇替代；其中O-抗原连接酶waaL被缺失。
18.宿主细胞包含编码载体蛋白EPA的质粒；其中所述宿主细胞包含编码寡糖基转移酶PgIB(SEQ ID NO:1)或PgIL(SEQ ID NO:2)的质粒，其中阿拉伯糖代谢所需的araBAD基因已被缺失；其中大肠杆菌O16糖转移酶gtrS被S.flexneri 2a糖转移酶gprll取代；其中gtrll基因被来自s.flexneri 3a的gtrX替代；其中yeaS基因被OAcA替代；其中yahL基因被OAcD替代。
19.一种生产四价生物缀合物疫苗的方法，所述四价生物缀合物疫苗包含来自S.flexneri 2a(Sf2E)、S.flexneri 3a(Sf3E)、S.flexneri 6(Sf6E)和S.sonnei(SsE)的O-抗原多糖链；其包括以下步骤：a)在适于生物缀合物生产的条件下培养四个单独的宿主细胞(任选地E.coli宿主细胞)，所述宿主细胞被工程化以产生生物缀合物，b)从每个培养物中纯化选自以下的一种生物缀合物：Sf2E-EPA、Sf3E-EPA、Sf6E-EPA和SsE-EPA，和c)任选地以1:1:1:1的比例混合所述Sf2E-EPA、Sf3E-EPA、Sf6EEPA和SsE-EPA生物缀合物；其中空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)酶(PgIB)将所述多糖转移到E.coli中针对所述生物缀合物Sf2E、Sf3E和Sf6E的所述载体蛋白铜绿假单胞菌的解毒外毒素A(EPA)上的共有序列；其中所述方法PgIL(任选地淋病奈瑟菌)将所述多糖转移到E.coli中针对所述生物缀合物SsE的所述载体蛋白铜绿假单胞菌的解毒外毒素A(EPA)上的共有序列。
20.根据实施方式21所述的方法，其中Sf2E的宿主菌株是通过以下基因修饰的：使用S.flexneri 2a O-多糖簇替代所述多糖生物合成(rfb)簇，缺失所述O-抗原连接酶waaL，缺失阿拉伯糖代谢所需的araBAD基因以及使用S.flexneri 2a糖基转移酶gtrll替代E.coli O16糖基转移酶gtrS。
21.根据实施方式21所述的方法，其中Sf3E的宿主菌株是通过以下基因修饰的：使用S.flexneri 3a特异性O-多糖簇替代所述多糖生物合成(rfb)簇，缺失所述O-抗原连接酶waaL，缺失阿拉伯糖代谢所需的araBAD基因以及使用flexneri 2a糖基转移酶gtrll替代E.coli O16糖基转移酶gtrS。
22.根据实施方式21所述的方法，其中使用S.flexneri 3a糖基转移酶gtrX替代S.flexneri 2a糖基转移酶gtrll；其中使用O-乙酰基转移酶基因替代yeaS基因；其中使用O-乙酰基转移酶OAcD基因替代yahL基因；其中宿主菌株的SsE是通过以下基因修饰的：使用类志贺邻单胞菌O17替代O16 O-多糖生物合成(rfb)簇，缺失wecA-wzzE，使用淋球菌(N.gonorrhoeae)的O-寡糖基转移酶PgIL替代O-抗原waaL以及使用鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)LT2的wzzB多糖链长调节物替代E.coli O16wzz多糖链长调节物。
23.本发明的修饰的EPA蛋白可通过参照SEQ ID NO:30的氨基酸序列(或氨基酸序列中与SEQ ID NO:30至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的等同位置)将亮氨酸552替换为缬氨酸(L552V)来修饰。本发明的经修饰的EPA蛋白可以通过参照SEQ ID NO:30的氨基酸序列(或氨基酸序列中与SEQ ID NO:30至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的等同位置)缺失谷氨酰胺553(ΔE553)来修饰。优选地，通过参照SEQ ID NO:30的氨基酸序列(或氨基酸序列中与SEQ ID NO:30至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的等同位置)将亮氨酸552替换为缬氨酸(L552V)并缺失谷氨酰胺553(ΔE553)来修饰本发明的修饰EPA蛋白；其中术语“修饰的EPA蛋白”指EPA氨基酸序列(例如，具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列或与SEQ ID NO:30至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列)，其EPA氨基酸序列已被一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失修饰(例如，通过添加选自D/E-X-N-Z-S/T(SEQ ID NO:31)和K-D/E-X-N-Z-S/T-K(SEQ ID NO:32)的共有序列；或通过用选自D/E-X-N-Z-S/T(SEQ ID NO:31)或K-D/E-X-N-Z-S/T-K(SEQ ID NO:32)中的共有序列取代一个或多个氨基酸)。如本文中所用，在本发明的共有序列中，X和Z独立地是除脯氨酸之外的任何氨基酸；优选X是Q(谷氨酰胺)并且Z是A(丙氨酸)。修饰的EPA蛋白还可以包含进一步的修饰(添加、取代、缺失)。在一个实施方式中，本发明的修饰的EPA蛋白是非天然存在的EPA蛋白(即，不是天然的)。
24.一种修饰的EPA(铜绿假单胞菌的外毒素A)蛋白，其具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列或与SEQ ID NO:30至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其修饰在于所述氨基酸序列包含一个(或多个)共有序列，所述共有序列选自：D/E-X-N-Z-S/T(SEQ ID NO:31)和K-D/E-X-Z-S/T-K(SEQ ID NO:32)，其中所述一个(或多个)共有序列各自被添加到EPA蛋白内的一个或多个选自特定氨基酸残基的氨基酸(共有序列位点)旁边或被其取代；其中所述共有序列位点选自SEQ ID NO:1的(i)氨基酸残基198-218之间的一个或多个氨基酸(例如，氨基酸残基203-213之间的一个或多个氨基酸，例如，氨基酸残基Y208)，(ii)氨基酸残基264-284之间的一个或多个氨基酸(例如，氨基酸残基269-279之间的一个或多个氨基酸，例如，氨基酸残基R274)，(iii)氨基酸残基308-328之间的一个或多个氨基酸残基(例如，氨基酸残基313-323之间的一个或多个氨基酸残基，例如，氨基酸残基S318)，和(iv)氨基酸残基509-529之间的一个或多个氨基酸残基(例如，氨基酸残基514-524之间的一个或多个氨基酸残基；例如，氨基酸残基A519)，或者在与SEQ ID NO:30具有至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列内的等效位置处。
25.已知天然EPA由三个不同结构域组成[73]：
ο结构域I是反向平行的β结构。其包含残基1-252和残基365-404。其具有17条β-链。前13条链形成细长的β-桶的结构核心。在结构域I的第13条链之后，肽链穿过桶的一面，进入第二个结构域。
ο结构域II(残基253-364)由六个连续的α螺旋组成，其中一个二硫键连接螺旋A和螺旋B。螺旋B和E的长度约为
螺旋C和D约为
长。
ο结构域III由分子的羧基末端三分之一残基405-613组成。结构域III最显著的结构特征是其扩展的裂缝。该结构域具有比结构域I和II更不规则的二级结构。
26.本发明的EPA蛋白的免疫原性片段可通过去除和/或修饰这些结构域中的一个或多个而产生。
27.SEQ ID NO:30的免疫原片段可以包含SEQ ID NO:30的结构域1的氨基酸序列(残基1-252和残基365-404)；SEQ ID NO:30的免疫原片段可以包含SEQ ID NO:30的结构域II的氨基酸序列(残基253-364)；SEQ ID NO:30的免疫原片段至少可以包含SEQ ID NO:30的结构域III的氨基酸残基(残基405-612)；SEQ ID NO:30的免疫原片段可以包含SEQ IDNO:30的结构域1(残基1-252和残基365-404)和SEQ ID NO:30的结构域II(残基253-364)的氨基酸残基；SEQ ID NO:30的免疫原片段至少可以包含SEQ ID NO:30的结构域II(残基253-364)和SEQ ID NO:30的结构域III(残基405-612)的氨基酸残基。
28.本文所指的氨基酸数对应于SEQ ID NO:30中的氨基酸，如上所述，本领域技术人员可以通过比对确定与SEQ ID NO:30至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列中的等效氨基酸位置。从SEQ ID NO:30的变体和/或片段中添加或缺失氨基酸可能导致突变序列中共有序列的实际氨基酸位置的差异，然而，通过将突变序列与参考序列对齐，可以识别与参考序列中的相应氨基酸处于等同位置的氨基酸，因此可以确定添加或替换共有序列的适当位置。
29.本发明的修饰的EPA蛋白可以是分离的修饰的EPA蛋白。本发明的修饰的EPA蛋白可以是重组的修饰的EPA蛋白。本发明的修饰的EPA蛋白可以是分离的重组修饰的EPA蛋白。
30.缀合物包含含有(或由……组成)与抗原(例如，糖类抗原，任选地细菌多糖抗原)共价连接的本发明的修饰的EPA蛋白的缀合物(例如，生物缀合物)，其中抗原被连接(直接或通过接头连接)。
31.抗原直接连接至本发明的修饰的EPA蛋白。
32.抗原直接连接至修饰的EPA蛋白的氨基酸残基。
33.一种宿主细胞，包含：
一种或多种核苷酸序列，其编码多糖合成基因，其任选地用于生产细菌多糖抗原(例如，来自革兰氏阳性细菌的O-抗原，任选地来自志贺氏痢疾杆菌、福氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌，或者来自革兰氏阳性细菌的荚膜多糖，任选地来自肺炎链球菌或金黄色葡萄球菌)或者酵母多糖抗原或哺乳动物多糖抗原，其任选地整合至宿主细胞基因组；任选地在质粒内编码异源寡糖基转移酶的核苷酸序列；任选地在质粒内编码本发明修饰的EPA蛋白的核苷酸序列。
34.宿主细胞可被修饰以缺失或修饰宿主细胞遗传背景(基因组)中竞争或干扰目标多糖合成的基因(例如，竞争或干扰重组引入宿主细胞的一个或多个异源多糖合成基因)。这些基因可以在宿主细胞背景(基因组)中以使其失活/功能失调的方式被缺失或修饰(即，被缺失/修饰的宿主细胞核苷酸序列不编码功能性蛋白或不编码任何蛋白)。在一个实施方式中，当核苷酸序列从本发明的宿主细胞的基因组中缺失时，其被期望的序列所取代，例如用于糖蛋白生产的序列。可以在宿主细胞中缺失的示例性基因(并且在一些情况下，用其他所需的核酸序列替换)包括参与糖脂生物合成的宿主细胞的基因，如waaL[80]，O抗原簇(rfb或wb)，肠道细菌共同抗原簇(wec)、脂质A核心生物合成簇(waa)、，半乳糖簇(gal)、阿拉伯糖簇(ara)、结肠酸簇(wc)、荚膜多糖簇、十一碳壬醇焦磷酸生物合成基因(例如，uppS(十一碳壬基焦磷酸合酶)、uppP(十一碳癸基二磷酸酶))、Und-P循环基因、参与核苷酸活化糖生物合成的代谢酶、肠道细菌共同抗原簇和gtrABS簇等原噬菌体O抗原修饰簇。在一个实施方式中，将waaL基因、gtrA基因、gtrB基因、gtrS基因的一个或多个，或来自wec簇的一个或多个基因，或来自结肠酸簇(wc)的一个或多个基因，或来自rfb基因簇的一个或多个基因从本发明的原核宿主细胞的基因组中缺失或功能失活。在另一个实施方式中，将waaL基因、gtrA基因、gtrB基因、gtrS基因的一个或多个，或来自wec簇的一个或多个基因，或来自rfb基因簇的基因从本发明的原核宿主细胞的基因组中缺失或功能失活。在一个特定实施方式中，本发明的宿主细胞是大肠杆菌，其中天然肠道细菌共同抗原簇(ECA，wec)(wecA除外)、胆酸簇(wca)和O16抗原簇(wbb)已被缺失。此外，可以将天然脂多糖O-抗原连接酶waaL从本发明的宿主细胞中缺失。此外，可以将天然gtrA基因、gtrB基因和gtrS基因从本发明的宿主细胞中缺失。
35.一种生物缀合物，其包含连接至抗原(例如，细菌多糖抗原)的本发明的修饰的EPA蛋白。在一个特定实施方式中，所述抗原是O-抗原或荚膜多糖。在一个实施方式中，抗原是来自革兰氏阴性细菌的O-抗原。在一个实施方式中，本发明提供了一种生物缀合物，其包含连接至抗原的本发明的修饰的EPA蛋白，其中抗原是糖类，任选地细菌多糖(例如，来自志贺氏痢疾杆菌、福氏志贺氏菌、宋内志贺杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌或金黄色葡萄球菌)。抗原与修饰的EPA蛋白上的选自天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸或色氨酸(例如，天冬酰胺)的氨基酸连接。如本文所述，生物缀合物具有比抗原载体蛋白的化学缀合物更有利的性质，因为其在制备中需要更少的化学物质，并且在生成的最终产物方面更一致。
36.一种用于生产生物缀合物的方法，所述生物缀合物包含(或由……组成)与多糖连接的修饰的EPA蛋白，所述方法包括(i)在适于生产糖蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞和(ii)分离所述宿主细胞产生的生物缀合物，任选地从宿主细胞的周质提取物中分离生物缀合物。
37.组合物(免疫原性)还包含缓冲剂如Tris(三甲胺)、磷酸盐(例如，磷酸钠、蔗糖磷酸盐谷氨酸盐)、乙酸盐、硼酸盐(例如，硼酸钠)、柠檬酸盐、甘氨酸、组氨酸和琥珀酸盐(例如，琥珀酸钠)，适宜的氯化钠、组氨酸、磷酸钠或琥珀酸钠。在一个实施方式中，缓冲剂是磷酸钠。在一个实施方式中，pH大于5.5。在免疫原组合物的一个实施方式中，pH是5.5–7.0。在一个实施方式中，pH是6.5。在一个实施方式中，组合物包含盐。在一个实施方式中，免疫原组合物包含NaCl。在一个实施方式中，组合物包含非离子表面活性剂。在一个实施方式中，组合物包含聚山梨醇酯80(v/v)。在免疫原组合物的一个实施方式中，组合物还包含佐剂。在免疫原组合物的一个实施方式中，包含佐剂氢氧化铝。
38.一种针对志贺氏菌病进行免疫的方法，包括向患者施用一剂免疫原组合物的步骤。在一种针对志贺氏菌病进行免疫的方法的一个实施方式中，一剂包含小于20μg、0–50μg、40–50μg、0–20μg、0–10μg、0–6μg、10–20μg或10–15μg四种志贺氏菌O-抗原的每一种的多糖。在一个实施方式中，一剂包含12μg四种抗原的每一种。在一个实施方式中，一剂包含6μg四种抗原的每一种。在一个实施方式中，一剂包含3μg四种抗原的每一种。在一个实施方式中，一剂包含1μg四种抗原的每一种。
39.一种针对志贺氏菌病进行免疫的方法，包括向哺乳动物施用免疫学有效量的免疫原组合物。在一个实施方式中，一种方法包括向哺乳动物施用免疫学有效量的免疫原组合物。
40.免疫原组合物用于在哺乳动物中诱导抗体应答的用途。在一个实施方式中包括免疫原组合物在制备在哺乳动物中诱导抗体应答的药物中的用途。
41.四种生物缀合物中的每一种都是通过从特定的细胞底物开始的过程产生的。所有四种细胞底物的共同点是原始宿主菌株大肠杆菌W3110[57]，多糖生物合成(rfb)簇被特定的O-多糖簇替代，O-抗原连接酶waaL缺失，引入编码载体蛋白的质粒，例如EPA和编码低聚糖基转移酶PgIB或PgIL的质粒。
42.修饰的载体蛋白可用于生物缀合。在某些实施方式中，修饰的载体蛋白可用于革兰氏阴性细菌宿主细胞内的体内生物缀合。在某些实施方式中，修饰的载体蛋白可以通过任选地在适宜的缓冲液中将修饰的载体蛋白质与奈瑟氏菌PgIL和PgIL聚糖底物孵育来用于缀合物生产。
43.使用体内方法和系统生产O-糖基化修饰的载体蛋白。在某些实施方式中，制备O-糖基化修饰的载体蛋白(或生物偶联物)，然后从宿主细胞的胞质中分离。本发明的体内缀合(“生物缀合”)利用已知方法在革兰氏阴性细菌细胞内表达重组蛋白并从中分离，包括序列选择和优化、载体设计、克隆质粒、培养参数和周质纯化技术。参见，例如，[58]、[4]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[3]、[44]、[6]、[59]和[60]。例如[61]和[62]中描述了使用宿主细胞生产生物缀合物的方法。生物缀合比体外化学缀合具有优势，因为生物缀合需要更少的化学品来制备，并且在生成的最终产品方面更为一致。
44.用于本发明的革兰氏阴性细菌细胞包括但不限于来自奈瑟氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、大肠杆菌属、假单胞菌属、耶尔森氏菌属、弯曲杆菌属、弧菌属、克雷伯菌属或幽门螺杆菌属的细胞。在某些实施方式中，宿主细胞选自以下：奈瑟氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌、耶尔森氏菌、弯曲杆菌和幽门螺杆菌细胞。在某些实施方式中，宿主细胞选自以下：志贺氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌细胞。在一个实施方式中，革兰氏阴性细菌细胞被分类为奈瑟氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、大肠杆菌属、假单胞菌属、耶尔森氏菌属、弯曲杆菌属、弧菌属、克雷伯氏菌属或幽门螺杆菌属细胞。革兰氏阴性细菌宿主可以分类为除了长形奈瑟氏菌以外的奈瑟氏菌属细胞。在一个进一步的实施方式中，革兰氏阴性细菌细胞是福氏志贺氏菌、副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌或铜绿假单胞菌细胞。在一个实施方式中，宿主细胞选自以下：福氏志贺氏菌、副伤寒沙门氏菌和大肠杆菌细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是霍乱弧菌细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是大肠杆菌细胞。在一个实施方式中，革兰氏阴性细菌细胞来源于大肠杆菌菌株K12、Top10、W3110、CLM24、BL21、SCM6或SCM7。在某些实施方式中，宿主细胞是福氏志贺氏菌细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是肠炎沙门氏菌细胞。在一个实施方式中，革兰氏阴性细菌细胞来源于S.enterica菌株SL3261、SL3749、SL326iδwaaL或SL3749。在某些实施方式中，宿主细胞是副伤寒沙门氏菌细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是铜绿假单胞菌细胞。参见[10]、[9]、[10]、[63]，例如，在表1中，和[12]；[6]、[64]、[7]、[3]、[44]。
45.对革兰氏阴性细菌细胞进行修饰，使细胞的内源性(周质)O-抗原连接酶(或“内源性PgIL同源物”)与对照(例如，野生型)相比在表达或功能上减少(缺失或“敲低”)或敲除(KO)。在某些实施方式中，“内源性PgIL同源物的减少”或“内源性PgIL同源物减少”用于表示内源性PgIL同源物的表达或功能的减少(例如，敲低)，包括敲除。这样，本发明的革兰氏阴性细菌细胞可能缺乏其内源性PgIL同源物。例如，大肠杆菌的WaaL基因和肠炎沙门氏菌的WaaR基因是脑膜炎奈瑟菌PgIL的功能同源物([65]、[66]和[62])。因此可以设想，例如，对用于本发明的大肠杆菌或沙门氏菌宿主细胞进行修饰，使得与基本相同条件下的对照(任选地野生型)大肠杆菌或沙门氏菌细胞相比，WaaL的表达或功能至少降低。在某些实施方式中，宿主细胞的内源性PgIL基因(例如，waaL基因)已被编码寡糖基转移酶的异源核苷酸序列所取代。敲低或敲除内源性PgIL同系物的技术是已知的，包括例如，编码内源性PgIL同源物的基因的突变或缺失。参见实施例以及例如[4]；亦参见[67]。用于本发明的革兰氏阴性细菌细胞包括但不限于奈瑟氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、大肠杆菌属、假单胞菌属、耶尔森氏菌属、弯曲杆菌属、弧菌属、克雷伯菌属或幽门螺杆菌属的细胞。在某些实施方式中，宿主细胞选自以下：奈瑟氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌、耶尔森氏菌、弯曲杆菌和幽门螺杆菌细胞。在某些实施方式中，宿主细胞选自以下：志贺氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌细胞。在一个实施方式中，革兰氏阴性细菌细胞被分类为奈瑟氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、大肠杆菌属、假单胞菌属、耶尔森氏菌属、弯曲杆菌属、弧菌属、克雷伯氏菌属或幽门螺杆菌属细胞。革兰氏阴性细菌宿主可以分类为除了长形奈瑟氏菌以外的奈瑟氏菌属细胞。在一个进一步的实施方式中，革兰氏阴性细菌细胞是福氏志贺氏菌、副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌或铜绿假单胞菌细胞。在一个实施方式中，宿主细胞选自以下：福氏志贺氏菌、副伤寒沙门氏菌和大肠杆菌细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是霍乱弧菌细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是大肠杆菌细胞。在一个实施方式中，革兰氏阴性细菌细胞来源于大肠杆菌菌株K12、Top10、W3110、CLM24、BL21、SCM6或SCM7。在某些实施方式中，宿主细胞是福氏志贺氏菌细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是肠炎沙门氏菌细胞。在一个实施方式中，革兰氏阴性细菌细胞来源于S.enterica菌株SL3261、SL3749、SL326iδwaaL或SL3749。在某些实施方式中，宿主细胞是副伤寒沙门氏菌细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是铜绿假单胞菌细胞。
46.结合本发明的糖基转移酶、修饰的载体蛋白、PgIL Otase或PgIL聚糖底物的革兰氏阴性细菌细胞可以使用本领域公知的各种方法生长，例如，在肉汤培养中生长。细胞产生的修饰载体蛋白或O-糖基化修饰载体蛋白可以使用本领域公知的各种方法分离，例如，凝集素亲和层析([3])。
47.O-糖基化修饰的载体蛋白可以被纯化(以去除宿主细胞杂质和非糖基化的载体蛋白)，并且任选地通过本领域公知的技术来表征(参见，例如，[6]、[68]；亦参见[11]、[9]、[69]、[70]和[12])。生物缀合物的纯化可以通过细胞裂解(包括例如一个或多个离心步骤)，然后是一个或多个分离步骤(包括例如，一个或一个以上色谱步骤或分馏、差异溶解度、离心和/或色谱步骤的组合)。所述一个或多个色谱步骤可以包括离子交换、阴离子交换、亲和性和/或大小筛分柱色谱，例如Ni2+亲和色谱和/或体积排阻色谱。在某些实施方式中，一个或多个色谱步骤包括离子交换色谱。因此，一种或多种纯化的多肽可以可操作地连接至标签(纯化标签)。例如，亲和柱IMAC(固化金属离子亲和层析)可用于结合与载体蛋白可操作地连接的聚组氨酸标签，随后进行阴离子交换色谱和体积排阻色谱(SEC)。例如，生物缀合物的纯化可以通过渗透冲击萃取，然后通过阴离子和/或体积排阻色谱法([8])；或通过渗透冲击萃取，然后进行Ni-NTA亲和和氟磷灰石色谱法([6])。
48.本发明的实施方式涉及修饰的蛋白、免疫原组合物和包含修饰的蛋白的疫苗的领域。蛋白糖基化是细菌中常见的翻译后修饰，通过这种修饰，聚糖共价连接到表面蛋白、鞭毛或菌毛上，例如。[3]。糖蛋白在粘附、稳定蛋白抵抗蛋白水解和逃避宿主免疫应答中发挥作用。[3]。两种蛋白糖基化机制通过聚糖转移到蛋白的方式来区分：一种机制涉及碳水化合物直接从核苷酸活化糖转移到受体蛋白(例如，用于真核细胞高尔基体中的蛋白O-糖基化和一些细菌中的鞭毛蛋白O-糖基化)。第二种机制涉及将多糖预装配到脂质载体上(通过糖基转移酶)，然后通过寡糖基转移(OTase)将其转移到蛋白受体上。[3]。该第二种机制用于，例如，真核细胞内质网中的N-糖基化，空肠弯曲杆菌的特征良好的N-连接糖基化系统，以及脑膜炎奈瑟菌、淋球菌奈瑟菌和铜绿假单胞菌的最近表征的O-连接糖基化系统。[3]。对于O-连接的糖基化(O-糖基化)，聚糖通常附接在蛋白受体上的丝氨酸或苏氨酸残基上。对于N-连接的糖基化(N-糖基化)，聚糖通常附着在蛋白受体上的天冬酰胺残基上。通常参见[13]。
49.最为人所知的两种糖基化系统是空肠弯曲杆菌N-连接的糖基化系统和奈瑟氏菌O-连接的糖基化系统。[3]，[4]。在这两个系统中，与十一碳烯基焦磷酸(UndPP)脂质载体相连的多糖(聚糖供体)通过翻转酶转移(翻转)到外周。[5]，[4]。在外周中，寡糖基转移酶(OTase)将聚糖转移到蛋白受体(菌毛蛋白)。[5]，[4]。空肠弯曲杆菌(PgIB)的OTase将聚糖转移到保守的菌毛蛋白五肽基序D/E-X-N-Z-S/T(SEQ ID NO:31)中的天冬酰胺(N)(其中X和Z是除脯氨酸以外的任何残基)。[6]。N.meningitidis的OTase(NmPgIL)将聚糖转移到N.meningitidis菌毛蛋白-PilE序列(“sequeon”)(N)-SAVTEYYLNHGEWPGNNTSAGVATSSEIK-(C)中的Ser63(SEQ ID NO:17，对应于成熟N.meningitidis PilE序列SEQ ID NO:21的残基45-73)。[3]，[4]，[7]。在本公开之前，其他OTase(例如来自淋球菌、N.lactamica或N.shayeganii)转移聚糖的菌毛蛋白序列尚不清楚(参见[39])。
50.缀合物疫苗(包含与免疫原聚糖共价连接的载体蛋白)已成为预防多种细菌感染的成功方法。然而，常规生产其的化学方法复杂且效率相对较低([6]中的图1)。为了提高缀合物疫苗的生产效率，体内方法(即“生物缀合物疫苗”)正在开发中。这些体内方法利用上文讨论的N-糖基化和O-糖基化系统，特别是OTase序列，使得未被OTase糖基化的蛋白(载体蛋白)在体内糖基化。
51.载体蛋白AcrA和EPA在大肠杆菌中使用异源多糖作为聚糖供体和空肠弯曲杆菌PgIB进行N-糖基化，这是因为AcrA与EPA首先被修饰以包含适当的周质信号序列和至少一个拷贝的PgIB sequon序列D/E-X1-N-X2-S/T(O-连接的糖基化位点)。[6]；亦参见[8]，[9]，[10]，[11]，[12](其全部内容通过引用并入本文)。基于PgIB的生物缀合生产的使用受到限制，因为PgIB只接受某些糖底物：那些在还原末端C-2位含有乙酰胺基的糖和那些在前两种糖之间不具有β1,4键的糖(即，糖“S-2”和“S-1”之间的连接，第一糖(S-1)包含还原末端，S-2与S-1相邻)。[4]，[11]，[14]。为了克服基于PgIB的系统的局限性，并且由于奈瑟氏菌PgIL与糖底物“混杂”([3])，使用脑膜炎奈瑟菌的PgIL OTase的O-糖基化系统一直是最近工作的重点([3]，[15]，[16]，[17]；亦参见[18])。
52.在福氏志贺氏菌中N.meningitidis PgIL使用福氏志贺氏菌宿主细胞内源性多糖作为聚糖供体(“内源性多糖”)将载体蛋白EPA、TTc和CTB O-糖基化，因为每个载体蛋白都经过修饰，以包含一个周质信号序列和一个拷贝的N.meningitidis PilE序列
53.可以使用各种方法来分析本发明的聚糖和缀合物，包括，例如，SDS-PAGE或毛细管凝胶电泳。O-抗原聚合物长度由线性组装的重复单元的数量定义。这意味着典型的阶梯状模式是组成聚糖的不同重复单元数的结果。因此，SDS PAGE(或其他按尺寸分离的技术)中相邻的两个条带只相差一个重复单元。在分析糖蛋白聚糖尺寸时，利用了这些离散的差异：非糖基化载体蛋白和具有不同聚合物链长度的生物缀合物根据其电泳迁移率而分离。测量生物缀合物上存在的第一个可检测重复单元数(n1)和平均重复单元数(n-平均)。例如，这些参数可用于证明批间一致性或多糖稳定性。
54.一种生产O-糖基化的修饰的载体蛋白的方法，其包括培养革兰氏阴性细菌宿主细胞，其中革兰氏阴性细菌宿主细胞：(a)生产脂质-载体-连接的PgIL聚糖，(b)表达编码修饰的载体蛋白的核苷酸序列，其可操作地连接到编码周质信号序列的多核苷酸序列，和(c)表达编码PgIL OTase的核苷酸序列，从而产生O-糖基化修饰的载体蛋白。
55.一种生产O-糖基化的修饰的载体蛋白的方法，其包括培养革兰氏阴性细菌宿主细胞，其中革兰氏阴性细菌宿主细胞：(a)表达编码PgIL聚糖的核苷酸序列；(b)表达一种或多种编码糖基转移酶的核苷酸序列，其能够组装脂质载体连接的PgIL聚糖；(c)表达编码修饰的载体蛋白的核苷酸序列，其可操作地连接到编码周质信号序列的多核苷酸序列，和(d)表达编码PgIL OTase的核苷酸序列，从而产生O-糖基化的修饰的载体蛋白。
56.脂质-载体-连接的PgIL聚糖是O-抗原。在某些实施方式中，O-抗原是S.sonneiO-抗原。
57.一种生产O-糖基化的修饰的载体蛋白的方法，其包括培养革兰氏阴性细菌宿主细胞，其中革兰氏阴性细菌宿主细胞：(a)包含脂质-载体-连接的PgIL聚糖底物，(b)在周质中包含修饰的载体蛋白，所述修饰的载体蛋白的特征在于载体蛋白包含至少一个O-连接的糖基化位点，和(c)包含奈瑟氏菌PgIL OTase。在某些实施方式中，脂质-载体-连接的PgIL聚糖底物在还原末端包含葡萄糖、半乳糖、呋喃半乳糖、鼠李糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、脱氧HexNAc、diNAcBac或Pse。在某些实施方式中，脂质-载体-连接的PgIL聚糖底物对于宿主细胞是内源性的。在某些实施方式中，该方法还包括从细胞中分离O-糖基化修饰的载体蛋白。
58.组合物用于在哺乳动物中诱导抗体应答的用途，所述组合物包含来自S.flexneri 2a(Sf2E)、S.flexneri 3a(Sf3E)、S.flexneri 6(Sf6E)和S.sonnei(SsE)的O-抗原多糖链。某些实施方式包括组合物用于在哺乳动物中诱导免疫应答的用途，所述组合物包含来自S.flexneri 2a(Sf2E)、S.flexneri 3a(Sf3E)、S.flexneri 6(Sf6E)和S.sonnei(SsE)的O-抗原多糖链。某些实施方式包括组合物在制备用于在哺乳动物中诱导抗体应答的药物的用途，所述组合物包含来自S.flexneri 2a(Sf2E)、S.flexneri 3a(Sf3E)、S.flexneri 6(Sf6E)和S.sonnei(SsE)的O-抗原多糖链。某些实施方式包括组合物在制备用于在哺乳动物中诱导抗体应答的药物的用途，所述组合物包含来自S.flexneri2a(Sf2E)、S.flexneri 3a(Sf3E)、S.flexneri 6(Sf6E)和S.sonnei(SsE)的O-抗原多糖链。
59.生物缀合物技术用于生产基于生物缀合物的志贺氏菌疫苗。为了使生产菌株能够生产多糖，将S.flexneri 2a、3a、6和S.sonnei的多糖合成酶转移到共表达载体蛋白EPA和寡糖基转移酶的大肠杆菌中。对于Sf2E、Sf3E和Sf6E，空肠弯曲杆菌酶(PgIB)用于将多糖转移到大肠杆菌中的载体蛋白绿脓杆菌(EPA)的解毒外毒素A上的共有序列中，从而产生糖蛋白(图1和图2)。对于宋内志贺氏菌，PgIB催化的多糖转移到载体蛋白上的效率不高。因此，决定使用淋病奈瑟氏菌的PgIL，其先前已被证明可将多糖转移到载体蛋白上，导致O-连接的糖基化。
60.生物缀合物疫苗在大肠杆菌的胞质中表达，在简化的过程中提取和纯化。
61.将本文所述的组合物配制成适合于对受试者的预期施用途径。例如，本文所述的组合物可配制成适合于皮下、肠外、口服、皮内、经皮、结肠直肠、腹腔和直肠施用。在一个特定实施方式中，药物组合物可配制用于静脉内、口服、腹腔内、鼻内、气管内、皮下、肌内、局部、皮内、经皮或肺部施用。
62.本文所述的组合物另外包含一种或多种缓冲剂，例如，磷酸盐缓冲剂和蔗糖磷酸盐谷氨酸缓冲剂。在其他实施方式中，本文所述的组合物不包含缓冲剂。
63.本文所述的组合物另外包含一种或多种盐，例如，氯化钠、氯化钙、磷酸钠、谷氨酸单钠和铝盐(例如，氢氧化铝、磷酸铝、alum(硫酸铝钾)或者这些铝盐的混合物)。在其他实施方式中，本文所述的组合物不包含盐
64.药学上可接受的赋形剂可由本领域技术人员选择。例如，药学上可接受的赋形剂可以是缓冲剂，例如Tris(三甲胺)、磷酸盐(例如，磷酸钠、蔗糖磷酸盐谷氨酸盐)、乙酸盐、硼酸盐(例如，硼酸钠)、柠檬酸盐、甘氨酸、组氨酸和琥珀酸盐(例如，琥珀酸钠)，适宜的氯化钠、组氨酸、磷酸钠或琥珀酸钠。药学上可接受的赋形剂可以包括盐，例如氯化钠、氯化钾或氯化镁。任选地，药学上可接受的赋形剂包含至少一种稳定溶解度和/或稳定性的组分。增溶/稳定剂的实例包括去垢剂，例如，月桂肌氨酸和/或聚山梨醇酯(例如，TWEEN 80(聚山梨醇酯-80))。稳定剂的实例还包括泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407)。药学上可接受的赋形剂可包括非离子表面活性剂，例如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、TWEEN 80(聚山梨醇酯-80)、TWEEN 60(聚山梨醇酯-60)、TWEEN 40(聚山梨醇酯-40)和TWEEN 20(聚山梨醇酯-20)，或聚氧乙烯烷基醚(合适的聚山梨醇酯80)。替代的增溶/稳定剂包括精氨酸和玻璃形成多元醇(如蔗糖、海藻糖等)。药用赋形剂可以是防腐剂，例如苯酚、2-苯氧基乙醇或硫柳汞。其他药学上可接受的赋形剂包括糖(例如，乳糖、蔗糖)和蛋白(例如，明胶和白蛋白)。用于本发明的药学上可接受的赋形剂包括盐水溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液(在本领域中也称为“载体”或“填充剂”)。
65.如果是本发明的话，免疫原组合物还可以包含稀释剂，如盐水和甘油。此外，免疫原组合物可包含辅助物质，如润湿剂、乳化剂、pH缓冲物质和/或多元醇。
66.如果是本发明的话，免疫原组合物还可以包含一种或多种盐，例如氯化钠、氯化钙、磷酸钠、谷氨酸单钠和铝盐(例如，氢氧化铝、磷酸铝、alum(硫酸铝钾)或此类铝盐的混合物)。
67.本发明的免疫原组合物或疫苗可用于诱导免疫或抗体应答和/或保护或治疗易受感染的哺乳动物，方法是通过全身或粘膜途径向所述哺乳动物施用所述免疫原组合物或疫苗组合物。这些施用可以包括通过肌内(IM)、腹腔内、皮内(ID)或皮下途径注射；或通过口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道的粘膜施用。例如，可以使用鼻内(IN)施用。尽管本发明的免疫原组合物或疫苗可以单剂量施用，但其组分也可以在同一时间或不同时间共同施用。对于供体施用，任选的佐剂，例如，然而在本发明的一个特定方面中，其与免疫原性O-糖基化修饰的载体蛋白组合存在。除单一施用途径外，还可使用两种不同的施用途径。对于初始免疫接种，受试者可接受一次或多次间隔充分的强化免疫。
实施例
应理解的是，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且将向本领域技术人员提示鉴于此的各种修饰或变化并且将其包括在本申请的精神和范围之内。
实施例1：Sf2E细胞底物E.coli的产生
对于Sf2E，通过将多糖生物合成(rfb)簇替换为S.flexneri 2a特异性O-多糖簇、缺失O-抗原连接酶waaL、缺失阿拉伯糖代谢所需的araBAD基因、将E.coli O16糖基转移酶gtrS与S.flexneri 2a糖基转移酶gtrII交换，对宿主菌株进行基因修饰。用编码载体蛋白EPA的质粒和编码低聚糖基转移酶PgIB的质粒转化最终宿主菌株。
用于生产Sf2E的细菌细胞底物是大肠杆菌K-12菌株W3110的衍生物，具有以下修改：O-抗原连接酶基因waaL(ΔwaaL)的全长染色体缺失，阿拉伯糖代谢所需的araBAD基因的染色体缺失，gtrS基因被来自S.flexneri 2a的gtrII替代，染色体rfb簇被S.flexneri2a的rfb簇替代(导致基因型ΔrfbW3110::rfbCCUG29416)，并且引入PgIB质粒和引入EPA质粒。
实施例2：Sf3E细胞底物E.coli的产生
对于Sf3E，通过将多糖生物合成(rfb)簇替换为S.flexneri 2a特异性O-多糖簇、缺失O-抗原连接酶waaL、缺失阿拉伯糖代谢所需的araBAD基因以及E.coli O16糖基转移酶gtrS与S.flexneri 2a葡萄糖苷转移酶gtrII交换，后者随后与S.flexneri 3a葡萄基转移酶gtrX交换，对宿主菌株进行基因修饰。用编码载体蛋白EPA的质粒和编码寡糖基转移酶PgIB和O-乙酰基转移酶OAcD的质粒转化最终宿主菌株(第二拷贝)。
用于生产Sf3E的细菌细胞底物是大肠杆菌K-12菌株W3110的衍生物，具有以下修饰：O-抗原连接酶基因waaL(ΔwaaL)的全长染色体缺失、阿拉伯糖代谢所需的araBAD基因的染色体缺失、来自S.flexneri 2a的gtrII替代gtrS基因、S.flexneri 2a菌株的rfb簇替代染色体rfb簇(导致基因型ΔrfbW3110::rfbCCUG29416)，用S.flexneri 3a的gtrX替代gtrII基因，用OAcA替代yeaS基因，用OAcD替代yahL基因，引入PgIB质粒和引入EPA质粒。
实施例3：Sf6E细胞底物E.coli的产生
Sf6E生产菌株是通过对宿主E.coli W3110进行基因修饰而产生的。多糖生物合成(rfb)簇(rfbX-glf-rfc-wbb-wbb-wbj-wbbK-wbbL_2-insH_8-wbbL_1)的一部分被产生S.flexneri 6O-抗原所需的多糖生物合成基因的组合所替代(S.flexneri 6wzx-wzy-wfbY-wfbZ；携带HAtag的E.coli O157:H45 UDP半乳糖4-差向异构酶Z3206；E.coli W3110UDP葡萄糖6-脱氢酶ugd；R.ornithinolytica UDP半乳糖醛酸酯4-差向异构酶uge)。rfbW3110簇基因rmlB、rmlD、rfbA和rfbC保留在宿主基因组中，并用于L-鼠李糖的生物合成，这是合成S.flexneri 6O抗原所需的糖。进一步的修饰包括缺失O-抗原连接酶waaL，将密码子使用优化(cuo)大肠杆菌O157:H45 UDP半乳糖4-差向异构酶Z3206co插入waaL基因座，并通过S.flexneri 6O-乙酰基转移酶C OAcC交换yeaS基因。用编码寡糖基转移酶PgIB和载体蛋白EPA的质粒和携带载体蛋白EPA第二拷贝的质粒转化最终宿主菌株。
用于生产Sf6E的细菌细胞底物是大肠杆菌K-12菌株W3110的衍生物，具有以下修饰：O-抗原连接酶基因waaL(ΔwaaL)的全长染色体缺失，染色体rfb簇基因rfbX-glf-rfc-wbb-wbb-wbJ-wbbK-wbbL_2-isH_8-wbbL_1被S.flexneri 6O-抗原构建多糖生物合成基因S.flexneri 6wzx-wzy-wfbY-wfbZ替代；E.coli O157:H45 UDP半乳糖4-差向异构酶Z3206-HA标签；E.coli W3110 UDP-葡萄糖6-脱氢酶ugd；R.ornithinolytica UDP半乳糖醛酸酯4-差向异构酶uge，将UDP半乳糖4-差向异构酶Z3206cuo插入waaL基因座，用S.flexneri 6O-乙酰基转移酶C基因OAcC替代染色体yeaS基因，引入PgIB质粒和引入EPA质粒。
实施例4：SsE细胞底物E.coli的产生
对于SsE，通过将O16 O-多糖生物合成(rfb)簇替换为类志贺邻单胞菌O17(＝S.sonnei)特异性O-多糖簇(GenBank AF285970.1，核苷酸1178-12270，缺乏天然wzz多糖链长调节物功能)，缺失wecA-wzzE，其是干扰重组S.sonnei O-抗原生物合成的成分，用N.gonorrhoeae(Genbank CNT56492)的O-寡糖基转移酶PgIL交换O-抗原连接酶waaL，以及用鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)LT2的wzzB多糖链长调节物交换E.coli O16wzz多糖链长度调节物(Genbank NC_003197)，对宿主菌株进行基因修饰。最终宿主菌株用编码载体蛋白EPA的质粒和编码来自N.gonorrhoeae的O-寡糖基转移酶PgIL的一个拷贝和来自S.typhimurium LT2的多糖链长度调节物wzzB的一个拷贝的质粒转化。
实施例5
材料和方法
使用缺乏O抗原脂多糖连接酶基因waaL的大肠杆菌(E.coli W3110ΔwaaL,ΔwecA-wzzE,ΔO16::wbgT-wbgZ P.shigelloides O17(S.sonnei)的簇(后文称为“E.coliW3110ΔwaaL”))，其包含多糖生物合成簇(O-抗原或荚膜多糖)的染色体拷贝以及表达PgIL和修饰的载体蛋白的两个质粒。将单个菌落接种在50ml TBdev培养基中[酵母提取物24g/L，大豆蛋白胨12g/L，甘油100％4.6ml/L，K2HPO4 12.5g/L，KH2PO4 2.3g/L，MgCl2x6H2O2.03g/L]，并在30℃下生长至OD 0.8。此时，加入0.1mM IPTG和0.1％阿拉伯糖作为诱导剂。将培养物进一步孵育o/n，并收获用于进一步分析(参见[00119])。在生物反应器评价的情况下，使用50mL(未诱导)o/n培养物在21生物反应器中接种11培养物。以500-1000rpm搅拌生物反应器，通过自动控制添加2M KOH或20％ H3PO4将pH值保持在7.2，并将培养温度设置为30℃。溶解氧(pO2)的水平保持在10％氧气。分批阶段细胞在如上所述但含有50g/L甘油的TBdev培养基中生长。使用补充有250g/L甘油和0.1％ IPTG(单质粒系统)或0.1％ IPTG和2.5％阿拉伯糖(双质粒系统)的TBdev作为加料培养基。在开始分批进料生长阶段之前，用0.1mM IPTG(单质粒系统)以及0.1mM IPTG和0.1％阿拉伯糖(2-质粒系统)在OD＝35下进行诱导。线性进料速率持续24h，然后是16h的饥饿期。生物反应器培养物在总共≈培养40h后收获，此时OD600应达到±80。
如前所述，通过考马斯亮蓝染色或Western印记分析生产过程([71])。在硝酸纤维膜上印迹后，用抗His、抗聚糖或抗载体蛋白对样品进行免疫染色。将抗家兔IgG-HRP(Biorad)作为二抗。用ECLTM Western印记检测试剂(Amersham Biosciences,LittleChalfont Buchinghamshire)进行检测。
对于周质蛋白提取，通过10,000g离心20min收获细胞，并将其重新悬浮在1体积0.9％NaCl中。在25-30min内以7,000g离心沉淀细胞。将细胞重悬在混悬缓冲液(25％蔗糖，100mM EDTA 200mM Tris HCl pH 8.5,250OD/ml)中，并在4-8℃下搅拌下培养混悬液30min。将混悬液在4-8℃下以7,000-10,000g离心30min。丢弃上清液，将细胞重新悬浮在相同体积的冰冷的20mM Tris-HCl pH 8.5中，并在4-8℃下搅拌培养30min。将成球细胞在4-8℃下以10,000g离心25-30min，收集上清液并通过0.2g膜。将周质提取物装载在7.5％ SDS-PAGE上，并用考马斯染色进行鉴定。
对于生物缀合物纯化，将从100,000OD细胞中获得的含有周质蛋白的上清液加载到Source Q阴离子交换柱(XK 26/40≈180ml床材料)，用缓冲液A(20mM Tris-HCl pH 8.0)平衡。在用5个柱体积(CV)缓冲液A洗涤后，用15CV的线性梯度洗脱蛋白至50％缓冲液B(20mM Tris-HCl+1M NaCl pH 8.0)中，然后用2CV洗脱至100％缓冲液B。通过SDS-PAGE分析蛋白，并通过考马斯染色。生物缀合物可以在6-17mS之间的电导率下洗脱。将样品浓缩10次，将缓冲液交换至20mM Tris HCl pH 8.0。
将生物缀合物装载在Source Q柱(XK 16/20≈28ml床材料)，用缓冲液A：20mMTris-HCl pH 8.0平衡。使用上述相同的梯度洗脱生物缀合物。通过SDS-PAGE分析蛋白，并通过考马斯染色。通常，生物缀合物在6-17mS之间的电导率下洗脱。将样品浓缩10次，将缓冲液交换至20mM Tris HCl pH 8.0。
将生物缀合物上样到Superdex 200(Hi Load 26/60，制备级)上，用pH 8.0的20mMTris HCl平衡。通过SDS-PAGE分析来自Superdex 200柱的蛋白级分，并通过考马斯染色进行染色。
通过SDS-PAGE分析来自不同纯化步骤的生物缀合物，并通过考马斯染色。使用该方法将生物缀合物纯化至98％以上的纯度。使用该技术可以成功地生产生物缀合物。
载体蛋白的优化
假单胞菌外毒素A(EPA)载体蛋白(SEQ ID NO:12)经修饰以包含一个或多个来自脑膜炎奈瑟菌菌毛蛋白PilE的O-连接的糖基化位点(野生型序列，提供为SEQ ID NO:20)(对于方法参见[29]；[6]；[6]；和[31]，其全部内容通过引用并入本文)。对重组EPA(rEPA，SEQ ID NO:12)进行修饰以制备其他三个重组EPA蛋白：
第一个已被修饰以在其N末端引入NmPilE O-连接的糖基化位点SEQ ID NO:20(对应于SEQ ID NO:21的残基45-73)；二十九(29)个氨基酸长(rEPA1，SEQ ID NO:37)。
第二个已被修饰以在相对于SEQ ID NO:12()的内部残基A375处引入NmPilE O-连接的糖基化位点SEQ ID NO:20(rEPA2，SEQ ID NO:53)
第三个已被修饰以在其C末端引入NmPilE O-连接的糖基化位点SEQ ID NO:20(rEPA3，SEQ ID NO:38)。
实施例6：糖基化程度分析
用于血清型Sf2E、Sf3E和Sf6E的载体蛋白EPA含有三个糖基化位点。因此，蛋白可以同时在一个(单-)、两个(双-)或所有三个位点(三-糖基化)被糖基化。为了表征不同糖基化形式的分布，通过基于高分辨率SDS-PAGE的方法分析了Sf2E、Sf3E和Sf6E的ENG(放大)和GMP API批次。由于用于宋内志贺氏菌的EPA载体蛋白仅含有一个糖基化位点，因此该方法未分析SsE生物缀合物，因而只有单糖基化形式是可能的。
整合糖型条带并计算相对强度以表达糖基化程度。CMO进行了表征的所有SDS-PAGE分析，作为批放行的支持数据。
Sf2E ENG和GMP API批次显示出几乎相同的糖基化程度，主要为二糖基化和三糖基化形式，证明了两个批次的可比性(图7)。
Sf3E ENG和GMP API批次的糖基化程度略有不同，其中单糖基化形式的量存在主要差异(图8)。这种糖型分布差异的主要原因，尤其是单糖基化形式的减少，归因于Sf3EGMP API批次的DSP汇集标准。两批中最主要的是二糖基化形式。
Sf6E ENG和GMP API批次的糖基化程度几乎相同，主要为单糖基化和二糖基化形式，证明了两个批次的可比性(图9)。
三种福氏志贺氏菌GMP API的Sf2E、Sf3E和Sf6E的单糖组成通过高效阴离子交换色谱结合脉冲安培检测(HPAEC-PAD)进行测定，并通过与市售单糖标准品进行比较来鉴定单个单糖。通过TFA水解从生物缀合物中释放单糖。通过用NaOH/NaOAc洗脱并随后通过脉冲安培检测(PAD)进行检测，通过柱色谱分离得到的未衍生化单糖。对于Sf2E和Sf3E，单糖Rha、GlcNAc(TFA水解后的GlcN)和Glc可以通过与商业参比溶液(RS)的相应单糖标准品和Rha单糖标准品重叠来验证(图10和图11)。发现的单糖证实了Sf2a和Sf3a多糖的单糖组成。对于Sf6E，单糖Rha、GalNAc(TFA水解后的GalN)和GalA通过与参比溶液(RS)和Gal A单糖标准品进行比较来确认(图12)。除了确定的单糖峰外，Sf6E样品还显示EPA相关的蛋白和Sf6PS相关的聚糖峰(最可能是在乙酸盐梯度期间洗脱的氨基酸、肽和未完全水解的PS物质)，这些峰通过与u-EPA和Sf6 PS样品平行分析来归属(图13)。
实施例7：通过肼解、正相(NP)-HPLC，随后通过MALDI MS/MS分析确认聚糖结构
为了确定与载体蛋白结合的聚糖的多糖组成、序列和长度，对ENG和GMP API批次进行肼解。这种处理允许多糖链从载体蛋白中化学释放。无水肼在聚糖和肽骨架之间的连接处反应并释放聚糖。肼解过程涉及几个反应步骤，包括游离氨基的再-N-乙酰化和酸不稳定的β-乙酰酰肼衍生物的酸水解，以产生游离聚糖。聚糖通过ENVI Carb SPE柱纯化，在其还原末端用2-AB标记，并通过NP-HPLC分离。收集所得的目标峰并通过MALDI进行MS/MS分析。
进行再乙酰化是因为N-乙酰基在肼解过程中丢失。此外，O-乙酰基将丢失，因此，尽管Sf3E和Sf6E生物缀合物预期存在O-乙酰基，但肼解结果预期只有没有O-乙酰基的结构。
对于SsE ENG API批次(图14)，在59.1和87.5min的RT下，确认了源自Ss聚糖结构的两种聚糖物质的峰值。确认的结构分别对应于3RU的–AltNAcA(m/z 1257)和5RU的–AltNAcA(m/z 2169)。FucNAc4N在位置2的氨基上仅携带一个N-乙酰基基团，在肼解过程中丢失。肼解样品处理过程中的再乙酰化步骤不仅在位置2而且在位置4中使糖再N-乙酰化。2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-D-半乳吡喃糖(DFucNAc4N)变为2,4-二乙酰氨基-2,4,6-脱氧-D-吡喃糖，其对应于MALDI测量中确认的质量。完整的蛋白MS测量结果通过质量证实了FucNAc4N存在于生物缀合物中，并且SsE ENG API批次的RU平均数量约为29(数据未显示)。SsE多糖被肼解强烈降解，在HPLC色谱图中不再观察到多糖物质。确认的物质类似于较长多糖链的片段。事实上，仅在非还原末端发现了修饰的FucNAc4N的形式，这表明RU内的α-1,3键弱于RU之间的β-1,4键。
对于SsE GMP API批次(图15)收集并测量RT 59.1和87.6min时的相同两个峰值。确认了与ENG API批次相同的结构，分别为3RU的–AltNAcA(m/z 1257，H加合物)和5RU的–AltNA cA(m/z 2169，Na加合物)。对于SsE ENG批次2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧-D-半乳吡喃糖确认取代2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧D-半乳吡喃葡萄糖(D-FucNAc4N)，因为在肼解和再乙酰化步骤期间发生了再乙酰化。此外，对于GMP API批次完整蛋白MS测量证实了生物缀合物中FucNAc4N的存在，并且确定的RU的平均数量约为29(数据未显示)。GMP批次的HPLC痕迹与ENG批次相当，显示多糖的降解同样强烈。
对于Sf2E ENG API批次(图16)，分别在59.0(m/z 964，Na加合物)和92.4min(m/z1767，Na加合物)的RT下确认了1RU和2RU的峰。在RT 49.1和94.6处，确认了另外两个片段的峰，分别对应于HexNAc-dHexdHex-dHex(Hex)-2AB(m/z 964，Na加合物)和HexNAc-2[dHex-dHex-dHex(Hex-)-HexNAc]-2AB(2RU+HexNAc Sf2a)(m/z 1970，Na加合物)。这两种物质类似于在肼解过程中降解的较长多糖链的片段。此外，对于ENG批次，收集了几个非常低丰度的峰，并进行了MALDI测量，但无法确认目标结构。
对于Sf2E GMP API批次的HPLC运行(图17)，获得了与ENG批次相当的色谱图。此外，在RT 59.0(m/z 964，Na加合物)和92.4min(m/z 1767，Na加合物)分别确认了1RU和2RU的峰。此外，RT 84.9(m/z 1767，Na加合物)处的峰确认了片段>2RU，(HexNAc-dHexdHex-dHex(Hex-))2-2AB。而且，对于GMP批次，收集了几个较低丰度的峰，并进行了MALDI测量，但MALDI-MSMS不能完全确认这些结构。
对于Sf3E ENG API批次(图18)，证实了源自Sf3E多糖结构的三种聚糖在42.4、86.7和92.6min的RT下的峰。确认的结构对应于1和3RU的片段。在RT 42.4下的dHex-dHex-dHex-Hex-HexNAc-2AB(m/z 780，H加合物)、在RT 86.7下的dHex-dHex-dHex-Hex-NAc-dHex(Hex-)-dHex-dHex-Hex-HexNAc-dHex-dHex-2AB(m/z 2043，Na加合物)和在RT 92.6下的dHex(Hex-)-dHex-dHex-HexNAc-dHexd-dHexdHex-HexNAc-dHex(Hex)-dHex-dHex-2AB(m/z2206，Na加合物)已被确证。MALDI-MS/MS无法确认收集的两种级分。假设观察到的碎片是在肼解过程中产生的，这是一个非常苛刻的反应，导致Sf3E多糖结构的部分降解。
对于Sf3E GMP API批次(图19)，色谱图看起来与ENG批次相当，通过MALDI-MS/MS确认了源自Sf3E多糖的几种聚糖物质，包括在RT 56.0下的1RU(m/z 964，Na加合物)。所有其他确认的结构都是Sf3E多糖的片段，dHex-dHex-dHex-HexNAc-2AB确认在RT 42.6下(m/z780，H加合物)，dHex-dHex-dHex-HexNAc-dHex-dHex-dHex-2AB在RT 57.6下(m/z 1240，Na加合物)，HexNAc-(Hex-)-dHex-dHex-dHex-HexNAc-2AB(1RU+HexNAc Sf2a)(m/z 1167，Na加合物)，dHexdHex-dHex-HexNAc-dHex-dHexdHex-HexNAc-2AB在RT 72.4下(m/z 1443，Na加合物)和dHex-dHexdHex-HexNAc-dHex-dHexdHex-HexNAc-2AB在RT 78.1下(m/z 1646，Na加合物)。
对于Sf6E ENG API批次(图20)，在56.5(m/z 810，H加合物)、124.5(m/z 2846，Na加合物，和133.3(m/z 3517，Na加合物)min的RT下，确认了1RU、4RU和5RU聚糖物质的峰。
对于Sf6E GMP API批次(图21)，在56.5(m/z 810，H加合物)、92.6(m/z 1481，H加合物)和111.9(m/z 2174，H加合物)min的RT下，确认了1RU、2RU和3RU聚糖物质的峰。此外，对于RT 67.7和RT 96.9处的两个小峰，确认了片段dHex-dHex-HexAHexNAc-dHex-d-dHex-2AB(m/z 1124，Na加合物)和dHex-dHex-HexA-HexNAc-dHex-dHex-HexAHexNAc-dHex-dHex2AB(m/z 1795，Na加合物)。需要指出的是，ENG和GMP批次的HPLC色谱图看起来非常相似。
实施例8：S.sonnei NMR数据
相对于β-FucNAc4N的H6/C6，参考了光谱：1.33ppm时的1H，16.31ppm时的13C。SsE生物缀合物的1H NMR谱(图22A)包含由于来自EPA蛋白的低强度宽峰上叠加的S.sonnei双糖RU而产生的尖锐信号。糖峰是S.sonini RU的特征：一个α和一个β连接的糖、环质子、两个N-乙酰基和一个甲基(来自β-FucNAc4N)。1D DOSY放大(图22B)去除了大HOD信号，允许在异头区和环区归属双糖S.sonini RU的所有信号。
HMBC实验有助于证实两个自旋系统的归属。图23中HSQC/HMBC(黑色)的叠加图(左图)显示了双糖RU的2键和3键相关性以及关键的残基间相关性，这些相关性证实了S.sonnei双糖RU中残基的连接和序列。甲基区(数据未显示)给出了从FucNAcN的H6到相同残基的C5和C4的相关性，而N-乙酰基的甲基给出了对应的C＝O基团的交叉峰。最后，AltNAcA的H5在172.8ppm处与C6(羧基碳)形成交叉峰。
NMR分析证实了S.sonnei生物合成的二糖RU的结构为→4)-α-AltpNAcA-(1→3)-β-FucpNAcN-(1→。本研究中指定的1D质子和2D 1H-1H(TOCSY)和1H-13C(HSQC)光谱构成了S.sonnei抗原的同一性图谱。
实施例9：生产工艺
全部四种原料药Sf2E、Sf3E、Sf6E和SsE的生产工艺都是从相应的主细胞库的单个小瓶开始的。
上游加工(USP)工艺步骤包括接种、补料分批发酵、离心收获和洗涤以及储存。
对于Sf2E、Sf3E、Sf6E和SsE的下游工艺(DSP)工艺步骤相似。步骤包括渗透冲击、离心、柱色谱、切向流过滤、体积排阻色谱或离子交换色谱以及储存。
实施例10：免疫原组合物的描述和组成
将在本临床试验中评价的四价生物缀合物疫苗候选物用于肌内施用，并且其由四种免疫原组合物组分Sf2E、Sf3E、Sf6E和SsE组成，其以1:1:1:1比例在10mM磷酸钠pH 6.5，150mM氯化钠0.015％聚山梨醇酯80(PBS pH 6.5+0.015％聚山梨醇酯80)中配制成液体剂型，并在2-8℃下储存。用稀释剂或佐剂现场稀释后，每个血清型的聚糖含量在1至48μg之间。佐剂可以是在注射用水(WFI)中的150mM NaCl中稀释的氢氧化铝(1.6mg铝/mL)。稀释剂可以是10mM磷酸钠，pH 6.5，150mM NaCl。
实施例11：处方研发
由于O-乙酰基在碱性pH下不稳定，因此选择了制剂pH。此外，载体蛋白EPA在pH低于5.5时不稳定。因此，将pH设置为6.5。使用150mM氯化钠来实现等渗性。
进行了处方实验，包括不同的相关压力条件，如温度、冻融、剪切力、搅拌应力以及容器密封吸附。不同的研究表明，处方10mM磷酸钠，pH 6.5，150mM NaCl在温度压力、吸附和O-乙酰基稳定性方面充分稳定免疫原组合物。然而，冻融和搅拌应力导致颗粒尺寸增加，这在添加聚山梨醇酯80时被阻止。这一行为在不同的实验中得到了补充分析技术的证实。与聚山梨醇酯80相比，迄今为止测试的其他处方没有产生优异的稳定性。因此，决定通过添加0.015％聚山梨醇酯80来进一步稳定制剂。聚山梨醇酯80是疫苗处方中广泛使用的赋形剂，浓度相似(例如，Prevnar 13含有0.02％w/w)。O-乙酰基的稳定性在较高的pH下以时间和温度依赖的方式降低，因此pH 6.5优于pH 7.0(图24)。
实施例12：动物研究
使用雌性新西兰白兔进行研究。给动物腹腔注射1μg PS剂量的每种疫苗组分(含或不含Al(OH)3)或1μg PS剂量的单一疫苗组分。一个对照组只接受处方缓冲液注射，另一个对照组完全不接受注射。在第0天、第14天和第28天进行测试项目，并在第一次注射之前以及第二次注射(第28天)和第三次注射(第42天)之后的14天从所有动物收集血清。
实施例13：抗LPS IgG ELISA
通过ELISA测量Sf2a-LPS、Sf3a-LPS、Sf6-LPS和Ss-LPS特异性血清IgG滴度。
微量96孔板(MAXISORPTM,Nunc,Thermo Scientific)用每孔100μl的在PBS中的5μg/ml LPS和10μg/ml甲基化BSA包被。在4℃下孵育过夜后，用PBS 0.05％
20洗涤板。洗涤后，将所有孔用300μl PBS 5％脱脂奶粉孵育2小时。洗涤后，将板在-24℃下储存，直到进一步使用。从冷冻室取出平板，用PBS 0.05％
20洗涤。然后将连续三倍稀释(在PBS
20 0.05％中)的测试血清一式两份加入。在振荡下将板在室温下孵育1小时。洗涤后，在摇动山羊抗兔IgG(Fc)抗体的条件下加入过氧化物酶缀合的IgG特异性抗体，在室温下作用1小时。如上所述洗涤板，向每孔中添加TMB底物溶液(Sigma T4444)，作用6min。通过加入100μl H2SO4 1N终止反应，并在450nm处读取光密度(OD)。将单个终点滴度确定为高于仅缓冲液对照的平均OD值+3S.D.的最高稀释度。
实施例14：抗EPA IgG ELISA
通过ELISA测量EPA特异性血清IgG滴度。
微量96孔板用每孔100μl的在PBS中的2μg/ml uEPA(批次：E-7)包被。在4℃下孵育过夜后，用PBS 0.05％
20洗涤板。洗涤后，将所有孔用300μl PBS 5％脱脂奶粉孵育2小时。洗涤后，将板在-24℃下储存，直到进一步使用。从冷冻室取出平板，用PBS 0.05％
20洗涤。然后将连续三倍稀释(在PBS
200.05％中)的测试血清一式两份加入。在振荡下将板在室温下孵育1小时。洗涤后，在摇动山羊抗兔IgG(Fc)抗体的条件下加入过氧化物酶缀合的IgG特异性抗体，在室温下作用1小时。如上所述洗涤板，向每孔中添加TMB底物(100μl/孔)，作用6min。通过加入100μl H2SO4 1N终止反应，并在450nm处读取光密度(OD)。将单个终点滴度确定为高于仅缓冲液对照的平均OD值+3S.D.的最高稀释度。
实施例15：SBA
在微量滴定法中评估了血清抗体在补体存在下介导不同志贺氏菌血清型的杀死(SBA)能力。SBA滴度报告在内源性补体源存在下与测试血清孵育后使特定细菌接种物杀灭50％的血清稀释度。
确定血清杀菌活性。对于该测定，用Shigella4V和仅缓冲液免疫的家兔免疫前和免疫后血清混合物在SBA中用S.flexneri 2a、S.flexneri 3a、S.flexneri 6和S.sonnei进行测试。
为了进行测定，免疫血清中的补体通过在56℃下孵育30分钟而被灭活。将补体灭活免疫血清一式两份在微量滴定板上连续三倍稀释。为控制补体的灭活，制备最低血清稀释度的一式两份样品，用于与(补体对照，CC)和不与(活细胞计数，VCC)家兔补体孵育。将热灭活的家兔补体添加到VCC和补体独立对照(CIC)中。将S.flexneri 2a、S.flexneri 3a、S.flexneri 6和S.sonnei在37℃、5％CO2的条件下在Tryptone大豆琼脂(TSA)平板上培养过夜，收获并混悬在缓冲液中，并调节至0.1OD600的浓度。将该混悬液进一步以1:5000稀释，并将10μl该混悬液添加到稀释的血清中，并在37℃下振荡孵育60分钟(iEMS微量滴定板培养箱/摇床)。在微量滴定板的孔中以25％的体积加入家兔补体，并在37℃下进一步孵育60-75分钟，同时振荡。在孵育结束时，将每个孔中的10μl分散到预先标记的TSA上。将每个样品一式两份置于TSA板上，并在26℃下用5％CO2孵育过夜(16-18小时)。使用公式测试血清的CFU/活细胞计数(VCC)对照的CFUx100计算存活细菌％。
SBA滴度是通过测定每个测定中活性补体对照孔的平均值并将平均绝对滴度除以2来计算的；建立50％的截止值。将滴度确定为菌落计数为≤50％截止值的最后一个样品稀释度的倒数。使用50％的截止值确定内插滴度，并通过曲线拟合计算。Opsotiter软件通过应用以下算法，使用两种连续稀释血清的菌落计数，一种杀死少于50％，另一种杀死超过50％：
实施例16：LPS特异性IgG应答
随着时间变化的GMT如图25A、图25B、图25C、图25D和图25E中所示。
在免疫前血清混合物的一部分中，可以检测到Sf2a-、Sf3a-和Sf6-LPS特异性IgG滴度，这表明一些动物已经具有与这些LPS结合的血清IgG。类似地，仅用PBS缓冲液处理的家兔以及未处理的家兔的一部分III后免疫血清含有与这些LPS结合的IgG。
PBS处理的动物和未处理的动物的III后IgG滴度无统计学差异(p≥0.7932)，但Sf2a-LPS特异性IgG滴度在PBS处理的动物中高出10.7倍(p＝0.0136)。
用Shigella4V接种家兔可引发针对所有4种O-抗原成分的IgG应答。与仅注射PBS的家兔相比，接种Shigella4V的家兔对所有4种LPS的III后滴度显著更高(p≤0.0004)。Shigela4V和PBS组之间的GMR，针对Sf2a-LPS为9.7，针对Sf3a-LPS为151.7，针对Sf6-LPS为27.0以及针对Ss-LPS滴度为191.9。
当与Al(OH)3配制时，Shigella4V疫苗也具有免疫原性。与PBS处理组相比，III后血清滴度显著升高(p≤0.001)。Shigella4V Alum组和PBS组之间的GMR，针对Sf2a-LPS为11.4，针对Sf3a-LPS为64.0，针对Sf6-LPS为29.2以及针对Ss-LPS为207.5。
含有Al(OH)3的Shigella4V制剂对LPS特异性疫苗应答没有显著影响(p≥0.2108)。Shigella4V和Shigella4V Alum组之间的GMR，针对Sf2a-LPS为0.9，针对Sf3a-LPS为2.4，针对Sf6-LPS为0.9以及针对Ss-LPS为0.9。
此外，每种单价疫苗都引发了强烈的疫苗特异性抗LPS IgG应答。III后血清滴度显著高于PBS处理组(p≤0.0001)。单价处理组和PBS组之间的GMR，针对Sf2a-EPA为24.9，针对Sf3a-EPA为129.7，针对Sf6-EPA为69.2以及针对Ss-EPA为284.4。
4价组的LPS特异性IgG应答与单价组的应答水平无显著差异(p≥0.7735)，表明多价制剂没有主要干扰作用。Shigella4V免疫组和用单价疫苗免疫组的LPS特异性III后IgG滴度之间的GMR，针对Sf2a-EPA为0.4，针对Sf3a-EPA为1.2，针对Sf6-EPA为0.4和针对Ss-EPA为0.7。
实施例17：接种Shigella4V诱导的抗体的血清杀菌活性
图26中描述了使用单价疫苗以及含佐剂和不含佐剂的Shigela4V配制的家兔的III前和III后血清中SBA滴度的结果。
对照组
来自空白处理对照组的样品在所有志贺氏菌血清型中具有相似的SBA滴度，但S.flexneri 6除外，其在免疫后、免疫前和免疫后混合物中发现SBA活性增加了3倍。家兔对照样品(PBS免疫组)在所有志贺氏菌血清型的免疫前和免疫后时间点通常也具有低SBA滴度，S.flexneri 2a除外。
实验组
用单价或四价疫苗免疫的所有组在III后均表现出良好的SBA滴度/应答。与同佐剂联合施用的四价疫苗相比，四价疫苗接种后获得了相似的SBA滴度，表明佐剂对杀菌抗体的产生没有正面或负面影响。用单价制剂免疫后获得的SBA滴度与用四价疫苗制剂免疫后的SBA效价相当(在2倍以内)，表明在杀菌活性方面的免疫干扰最小。S.sonnei单价疫苗的滴度是四价疫苗的4倍。抗S.flexneri 2a SBA结果表明，单价Sf3a疫苗诱导了与Sf2a的一些交叉反应，尽管其水平低于用Sf2a生物缀合物免疫后的水平。有趣的是，用Sf2a免疫的家兔血清不具有可比的Sf3a特异性杀菌活性水平。
实施例18：针对其用宋内志贺氏菌的糖糖基化天冬酰胺残基的能力对PgIB寡糖基
转移酶的突变形式的评价
使用与宋内志贺氏菌O抗原相对应的多糖，测试PgIB变体催化来自含有D/E-Z1-N-Z2-S/T糖基化位点(其中Z1和Z2不是P)的铜绿假单胞菌(EPA)的外蛋白A的糖基化的能力。因此，用编码糖基转移酶基因的质粒转化大肠杆菌宿主细胞，所述基因是构建S.sonnei O-抗原、变体PgIB基因和含有糖基化位点的EPA所需的。使用IPTG和阿拉伯糖诱导基因的表达，并将大肠杆菌宿主细胞培养过夜，以允许糖基转移酶、PgIB和EPA的表达以及EPA的糖基化，如下所示。
用1ml TB培养基填充96深孔板的孔，用单个宿主细胞大肠杆菌菌落接种每个孔，并在37℃下培养过夜。每个孔的样品用于接种96深孔板中的主要培养物，该板含有1ml TB，补充10mM MgCl2和适当的抗生素，并生长至OD600达到1.3-1.5。将细胞与1mM IPTG和0.1％阿拉伯糖在37℃孵育过夜。
通过离心板，去除上清液并加入0.2ml 50mM Tris-HCl pH7.5、175mM NaCl、5mMEDTA，然后在4℃下振荡以混悬细胞，制备周质提取物。向每个孔中加入10μl 10mg/ml多粘菌素B，将细胞在4℃下孵育1小时。离心板并除去上清液。
为了从周质提取物中分离糖基化蛋白，将120μl 25％ IMAC树脂在30mM Tris pH8.0、10mM咪唑和500mM NaCl中的浆液添加到96孔滤板(Acroprep Advance)的每个孔中，并放置在Nunc ELISA板的顶部。将板离心，并丢弃流过的液体。向每个孔中加入150μl周质提取物和37.5ml 5x结合缓冲液(150mM Tris pH 8.0，50mM咪唑，2.5M NaCl)。将样品在室温下孵育30分钟。将板离心，并丢弃流过的液体，然后再进行三个洗涤步骤。最后，糖基化蛋白用30mM Tris pH 8.0、500mM咪唑、200mM NaCl洗脱，准备用于ELISA测定。
通过用在PBS中稀释的识别糖基化蛋白的糖部分的抗体(例如，抗S.aureus荚膜多糖5型的单克隆抗体)包被96孔板的孔来进行夹心ELISA。将板在4℃下孵育过夜以允许包被。然后使用含0.1％吐温的PBS洗涤板。然后使用含5％牛血清白蛋白的PBST在室温下封闭板2小时。在PBST中洗涤板。将样品在含有1％BSA的PBST中稀释，并在室温下在包被的孔中孵育1小时。洗涤检测抗体后，将例如在含有1％BSA的PBST中稀释的抗His标签-辣根过氧化物酶添加到每个孔中，并在室温下孵育1小时。然后在加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺液体底物(超灵敏，用于ELISA(Sigma-Aldrich))之前洗涤板。几分钟后，加入2M硫酸终止反应。通过读取450nm处的OD获得结果。
结果
作为起点，在已经包含N311V和Y77H突变的PgIB中产生突变。对包含N311V和Y77H突变的PgIB进行突变，并如上所述选择、测序和分析有前景的变体，以检测OST活性。计算每种变体寡糖基转移酶活性的增加倍数，并且结果如表5中所示。
表5：如通过ELISA确定的在将S.sonnei O-抗原转移至蛋白中工程化PgIB OST活性的增加
| PgIB变体突变 | 氨基酸取代 | OST活性的增加倍数 |
| G55 | M | M-1.972 |
| Y78R | R | R-1.503 |
| I101 | C | C-2.508 |
| R125 | T | T-3.296 |
| T153 | P | P-1.857 |
| Y155 | H | H-1.664 |
| Y191 | T | T-1.473 |
| W192 | R | R-1.437 |
| I273 | R | R-1.436 |
| D282 | L,P | L-2.184 |
| L300 | P | P-1.612 |
| Q315 | Y | Y-3.516 |
| L371 | H | H-2.36 |
| Y425 | T,P | T-1.863,P-1.799 |
| Q435 | L | L-1.491 |
| Y466 | T | T-1.466 |
| V474 | A | A-1.52 |
| G477 | A | A-1.759 |
| F513 | Y | Y-1.542 |
| R570 | G,A,D | G-1.467,A-1.439 |
| I581 | G,A | G-1.459 |
| S610 | W | W-2.057 |
| Y645 | P | P-2.167 |
选择位置X的PgIB突变以及X的组合用于在更多的培养物中进行评价。
结论
Shigella4V，Shigella4V Al(OH)3，Sf2a-、Sf3a-、Sf6-、Ss-EPA在家兔中均具有免疫原性并且激发高水平的LSP特异性IgG。Shigella4V和Shigella4V Al(OH)3针对全部四种O-抗原激发IgG应答。用Al(OH)3配制Shgiella4V对O-抗原或EPA特异性IgG应答没有显著影响。Shigella4V疫苗和单价疫苗之间的O-抗原特异性IgG应答水平没有统计学显著差异。没有观察到由于多价性引起的干扰。EPA特异性IgG应答呈剂量依赖性。
在仅注射处方缓冲液的家兔和未经处理的动物中检测到微弱和异质的LPS特异性应答。这些应答显著低于注射任何检测疫苗的家兔。脂质A核心特异性抗体可能是在研究过程中家兔暴露于革兰氏阴性菌激发的。
SBA测定显示，通过用Shigella4V和单一血清型接种家兔激发的应答，诱导了对全部四种血清型Sf2a、Sf3a、Sf6和Ss的良好杀菌活性。佐剂与四价疫苗的共同施用对抗菌抗体的产生没有影响。福氏志贺氏菌2a、3a、6在用含和不含佐剂的单价和多价制剂免疫后获得的SBA滴度相当(相差2倍以内)。宋内志贺氏菌单价免疫血清显示SBA滴度比四价疫苗高4倍。
序列
SEQ ID NO:1：用于Sf2E、Sf3E和Sf6E的改良的解毒铜绿假单胞菌外毒素A(EPA)蛋白载体。信号肽(带有下划线的字母)在易位到胞质的过程中被切割。N-糖基化共有位点用粗体字母标记。Leu-Glu至Val的突变(斜体)导致EPA显著的解毒。MW：分子量；pI：等电点。
SEQ ID NO:2：用于SsE的改良的解毒铜绿假单胞菌外毒素A(EPA)蛋白载体。信号肽(带有下划线的字母)在易位到胞质的过程中被切割。O-糖基化共有位点是粗体，推定的O-糖基化丝氨酸是粗体/下划线。Leu-Glu至Val的突变(斜体)导致EPA显著的解毒。MW：分子量；pI：等电点。
SEQ ID NO:3
rEPA30多核苷酸序列-GlycoTag序列SEQ ID NO:20，在N末端。
SEQ ID NO:4
rEPA30氨基酸序列-GlycoTag序列SEQ ID NO:20，在N末端(DsbA信号序列和6xHis标签(SEQ ID NO:22)带下划线，GlycoTag带双下划线)。
SEQ ID NO:5
rEPA31多核苷酸序列-GlycoTag序列SEQ ID NO:19，在N末端。
SEQ ID NO:6
rEPA31_氨基酸序列-GlycoTag序列SEQ ID NO:19，在N末端(DsbA信号序列和6xHis标签(SEQ ID NO:22)带下划线，GlycoTag带双下划线)。
SEQ ID NO:7
rEPA32多核苷酸序列-GlycoTag序列SEQ ID NO:18，在残基R274处。
SEQ ID NO:8
rEPA32氨基酸序列-GlycoTag序列SEQ ID NO:18，在残基R274处(DsbA信号序列和GlycoTag带下划线)。
MKKIWLALAGLVLAFSASAAEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVRSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVLEGGNDALKLAIDNALSITSDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHEKPSNIKVFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLARDATFFVRAHESNEMQPTLAISHAGVSVVMAQAQPRREKRWSEWASGKVLCLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLDIKPTVISHRLHFPEGGSLAALTAHQACHLPLEAFTSAVTGYYL NHGTWPKDNTSAGVASSPTDIKHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAASADVVSLTCPVAAGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRWSLPGFYRTGLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRVTILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK
SEQ ID NO:9
rEPA33多核苷酸序列-GlycoTag序列SEQ ID NO:18，在残基S408处。
SEQ ID NO:10
rEPA33氨基酸序列-GlycoTag序列SEQ ID NO:18，在残基S408处(DsbA信号序列和GlycoTag带下划线)。
MKKIWLALAGLVLAFSASAAEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVRSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVLEGGNDALKLAIDNALSITSDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHEKPSNIKVFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLARDATFFVRAHESNEMQPTLAISHAGVSVVMAQAQPRREKRWSEWASGKVLCLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLDIKPTVISHRLHFPEGGSLAALTAHQACHLPLEAFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAASADVVSLTCPVAAGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSAVTGYYLNHGTWPKDNTSAGVASSPTD IKFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRWSLPGFYRTGLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRVTILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK
SEQ ID NO:11
rEPA34多核苷酸序列-GlycoTag序列SEQ ID NO:18，在残基A519处。
SEQ ID NO:12
假单胞菌外毒素A(EPA)氨基酸序列(成熟序列/去除信号肽)。对应于NCBI参考序列WP_016851883.1。
SEQ ID NO:13
脑膜炎奈瑟氏菌PilE GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:21的残基55-56；12个氨基酸长)。例如，Gly Glu Trp Pro Gly Asn Asn Thr Ser Ala Gly Val
SEQ ID NO:14
淋病奈瑟氏菌GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:23的残基62-73；12个氨基酸长)。例如，Gly Thr Trp Pro Lys Asp Asn Thr Ser Ala Gly Val
SEQ ID NO:15
乳糖奈瑟球菌020-06GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:24的残基62-73；12个氨基酸长)。例如，Gly Thr Phe Pro Ala Gln Asn Ala Ser Ala Gly Ile
SEQ ID NO:16
Neisseria shayeganii 871GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:25的残基63-74；12个氨基酸长)。例如，Gly Val Phe Pro Thr Ser Asn Ala Ser Ala Gly Val
SEQ ID NO:17
脑膜炎奈瑟氏菌PilE GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:21的残基45-73；29个氨基酸长)。例如，Ser Ala Val Thr Glu Tyr Tyr Leu Asn His Gly Glu Trp ProGly Asn Asn Thr Ser Ala Gly Val Ala Thr Ser Ser Glu Ile Lys
SEQ ID NO:18
淋病奈瑟氏菌GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:23的残基52-81；30个氨基酸长)。例如，Ser Ala Val Thr Gly Tyr Tyr Leu Asn His Gly Thr Trp Pro Lys AspAsn Thr Ser Ala Gly Val Ala Ser Ser Pro Thr Asp Ile Lys
SEQ ID NO:19
Neisseria shayeganii 871GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:25的残基53-83；31个氨基酸长)。例如，Gly Ala Val Thr Glu Tyr Glu Ala Asp Lys Gly Val PhePro Thr Ser Asn Ala Ser Ala Gly Val Ala Ala Ala Ala Asp Ile Asn Gly Lys
SEQ ID NO:20
粘液奈瑟球菌ATCC 25996GlycoTag氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:26的残基52-92；41个氨基酸长)。
SEQ ID NO:21
脑膜炎奈瑟氏菌MC58 PilE氨基酸序列(成熟序列；去除信号序列)。对应于NCBI登录号NP_273084.1。
SEQ ID NO:22
6xHis-标签
SEQ ID NO:23
淋病奈瑟氏菌Pilin(NgPilin)氨基酸序列。对应于NCBI GenBank CNT62005.1。
SEQ ID NO:24
乳糖奈瑟球菌020-06Pilin(NlPilin)氨基酸序列。对应于NCBI GenBankCBN86420.1。
SEQ ID NO:25
Neisseria shayeganii 871(NsPilin)氨基酸序列。对应于NCBI GenBankEGY51595.1。与SEQ ID NO:27和28具有100％同一性。
SEQ ID NO:26
粘液奈瑟球菌ATCC 25996(NmuPilin)氨基酸序列。对应于NCBI GenBankEFC89512.1。
SEQ ID NO:27
Neisseria shayeganii 871Pilin氨基酸序列。对应于NCBI GenBankEGY51595.1。与SEQ ID NO:25和28具有100％同一性。
SEQ ID NO:28
Neisseria shayeganii 871Pilin氨基酸序列。对应于NCBI GenBankEGY51595.1。与SEQ ID NO:25和27具有100％同一性。
SEQ ID NO:29
TWPKDNTSAGVASSPTDIK
SEQ ID NO:30来自铜绿假单胞菌的EPA序列
AEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVRSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVLEGGNDALKLAIDNALSITSDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHEKPSNIKVFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLARDATFFVRAHESNEMQPTLAISHAGVSVVMAQAQPRREKRWSEWASGKVLCLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLDIKPTVISHRLHFPEGGSLAALTAHQACHLPLEAFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAASADVVSLTCPVAAGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRWSLPGFYRTGLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRVTILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK
SEQ ID NO:31共有序列(人工序列)
D/E-X-N-Z-S/T
SEQ ID NO:32共有序列(人工序列)
K-D/E-X-N-Z-S/T-K
SEQ ID NO:33
粘液奈瑟球菌PgIL核苷酸序列。
SEQ ID NO:34
粘液奈瑟球菌PgIL氨基酸序列，对应于NCBI GenBank登录号KGJ31457.1。
SEQ ID NO:35
Neisseria shayeganii 871PgIL(NsPgIL)氨基酸序列。对应于NCBI GenBank登录号EGY51593.1。
SEQ ID NO:36
奈瑟氏菌属83E34 PgIL多核苷酸序列。
SEQ ID NO:37
rEPA1氨基酸序列-GlycoTag序列SEQ ID NO:140，在N末端处(DsbA信号序列带下划线，GlycoTag和6xHis标签(SEQ ID NO:22)带双下划线)
SEQ ID NO:38
rEPA3氨基酸序列-GlycoTag序列SEQ ID NO:20，在C末端处(DsbA信号序列和GlycoTag带下划线，6xHis标签(SEQ ID NO:22)带双下划线)。
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Claims (47)
1.一种免疫原组合物，其包含来自福氏志贺氏菌2a(Sf2E)、福氏志贺氏菌3a(Sf3E)、福氏志贺氏菌6(Sf6E)和宋内志贺氏菌(SsE)的每一种的O-抗原多糖链；其中来自福氏志贺氏菌2a(Sf2E)、福氏志贺氏菌3a(Sf3E)、福氏志贺氏菌6(Sf6E)的所述O-抗原多糖分别共价连接至蛋白载体，所述蛋白载体已被修饰以包含N-糖基化共有序列。
2.根据权利要求1所述的免疫原组合物，其中所述N-糖基化共有序列是D/E-X-N-Z-S/T(SEQ ID NO:31)，其中X和Z可以是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，并且任选地其中PgIB用于将所述多糖转移到所述N-糖基化共有序列D/E-X-N-Z-S/T(SEQ ID NO:31)，其中X和Z可以是除了脯氨酸以外的任何氨基酸。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的免疫原组合物，其中SsE共价连接至蛋白载体，所述蛋白载体包含能够被PgIL糖基化的O-糖基化共有序列，任选地其中PgIL用于将所述多糖转移到针对SsE的所述共有序列TWPKDNTSAGVASSPTDIK(SEQ ID NO:29)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的免疫原组合物，其中所述蛋白载体选自以下：霍乱毒素b亚单位(CTB)、破伤风类毒素(TT)、破伤风毒素C片段(TTc)、白喉类毒素(DT)、CRM197、铜绿假单胞菌外毒素A(EPA)、空肠弯曲杆菌吖啶黄抗性蛋白A(CjAcrA)、E.coli吖啶黄抗性蛋白A(EcAcrA)和铜绿假单胞菌PcrV(PcrV)。
5.根据权利要求4所述的免疫原组合物，其中所述蛋白载体是铜绿假单胞菌A(EPA)。
6.根据权利要求5所述的免疫原组合物，其中所述蛋白载体包含至少两个N-糖基化共有序列。
7.根据权利要求6所述的免疫原组合物，其中所述蛋白载体在一个(单糖基化)、两个(双糖基化)或所有三个N-糖基化位点(三糖基化)处糖基化。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的免疫原组合物，其中Sf2E、Sf3E和Sf6E的所述多糖通过所述O-抗原的还原末端共价连接至天冬酰胺残基的侧链氮原子。
9.根据权利要求8所述的免疫原组合物，其中所述天冬酰胺残基在所述D/E-X-N-Z-S/T(SEQ ID NO:31)N-糖基化共有序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的免疫原组合物，其中SsE的所述多糖通过所述O-抗原的所述还原末端共价连接；其中聚糖具有以下还原末端结构
(i)葡萄糖、半乳糖、呋喃半乳糖、鼠李糖、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、脱氧HexNAc、diNAcBac或Pse的还原末端结构；
(ii)DATDH、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、半乳糖或葡萄糖的还原末端结构；
(iii)GlcNAc、GalNAc、FucNAc或葡萄糖的还原末端结构；或者
(iv)半乳糖-β1,4-葡萄糖；葡萄糖醛酸-β1,4-葡萄糖；N-乙酰基-葡糖胺-α1,3-N-乙酰基-半乳糖胺；半乳糖-β1,4-葡萄糖；鼠李糖-β1,4-葡萄糖；呋喃半乳糖-β1,3-葡萄糖；N-乙酰基-阿楚糖醛酸-α1,3-4-氨基-N-乙酰基-葡糖胺；或鼠李糖-β1,4-N-乙酰基半乳糖胺的S-2至S-1还原末端结构。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的免疫原组合物，其中所述福氏志贺氏菌2a、福氏志贺氏菌3a、福氏志贺氏菌6抗原通过D-GlcNAc还原末端连接至所述N-糖基化共有位点中的一个的天冬酰胺残基的ε-氮原子。
12.一种革兰氏阴性宿主细胞，其不是宋内志贺氏菌，其包含来自宋内志贺氏菌(SsE)的所述O-抗原多糖。
13.根据权利要求12的宿主细胞，其是奈瑟氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌、假单胞菌或耶尔森氏菌细胞。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其是大肠杆菌(E.coli)。
15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其中所述E.coli是基因修饰的。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的宿主细胞，其包含编码所述载体蛋白EPA的质粒，任选地包含至少一个适于被PgIL糖基化的O-糖基化共有序列，任选地包含所述氨基酸序列TWPKDNTSAGVASSPTDIK(SEQ ID NO:29)。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的宿主细胞，其包含编码寡糖基转移酶PgIL的质粒。
18.一种生产四价生物缀合物疫苗的方法，所述生物缀合物疫苗包含来自福氏志贺氏菌2a(Sf2E)、福氏志贺氏菌3a(Sf3E)、福氏志贺氏菌6(Sf6E)和宋内志贺氏菌(SsE)的所述O-抗原多糖链；其包括以下步骤：a)在适于生物缀合物生产的条件下培养四个单独的宿主细胞(任选地E.coli宿主细胞)，所述宿主细胞被工程化以产生生物缀合物，b)从每个培养物中纯化选自以下的一种生物缀合物：Sf2E-EPA、Sf3E-EPA、Sf6E-EPA和SsE-EPA，和c)任选地以1:1:1:1的比例混合所述Sf2E-EPA、Sf3E-EPA、Sf6EEPA和SsE-EPA生物缀合物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中空肠弯曲杆菌酶(PgIB)将所述多糖转移到E.coli中针对所述生物缀合物Sf2E、Sf3E和Sf6E的所述载体蛋白铜绿假单胞菌的解毒外毒素A(EPA)上的共有序列。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的方法，其中PgIL(任选地淋病奈瑟菌)将所述多糖转移到E.coli中针对所述生物缀合物SsE的所述载体蛋白铜绿假单胞菌的解毒外毒素A(EPA)上的共有序列。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中宿主菌株生产的Sf2E是通过以下基因修饰的：使用福氏志贺氏菌2a O-多糖簇替代所述多糖生物合成(rfb)簇，缺失所述O-抗原连接酶waaL，缺失阿拉伯糖代谢所需的araBAD基因以及使用福氏志贺氏菌2a糖基转移酶gtrll替代E.coli O16糖基转移酶gtrS。
22.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中宿主菌株生产的Sf3E是通过以下基因修饰的：使用福氏志贺氏菌3a特异性O-多糖簇替代所述多糖生物合成(rfb)簇，缺失所述O-抗原连接酶waaL，缺失阿拉伯糖代谢所需的araBAD基因以及使用福氏志贺氏菌2a糖基转移酶gtrll替代E.coli O16糖基转移酶gtrS。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中使用福氏志贺氏菌3a糖基转移酶gtrX替代福氏志贺氏菌2a糖基转移酶gtrll。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中使用O-乙酰基转移酶基因替代yeaS基因。
25.根据权利要求18-24中任一项所述的方法，其中使用O-乙酰基转移酶OAcD基因替代yahL基因。
26.根据权利要求18-25中任一项所述的方法，其中宿主菌株的SsE是通过以下基因修饰的：使用类志贺邻单胞菌O17替代O16 O-多糖生物合成(rfb)簇，缺失wecA-wzzE，使用O-寡糖基转移酶PgIL(任选地淋球菌)替代O-抗原waaL以及使用鼠伤寒沙门氏菌LT2的wzzB多糖链长调节物替代E.coli O16wzz多糖链长调节物。
27.根据权利要求1-11中任一项所述的免疫原组合物，其还包含缓冲剂如Tris(三甲胺)、磷酸盐(例如，磷酸钠、蔗糖-磷酸盐-谷氨酸盐)、乙酸盐、硼酸盐(例如，硼酸钠)、柠檬酸盐、甘氨酸、组氨酸和琥珀酸盐(例如，琥珀酸钠)，适宜的氯化钠、组氨酸、磷酸钠或琥珀酸钠。
28.根据权利要求27所述的免疫原组合物，其中所述缓冲剂是磷酸钠。
29.根据权利要求27或权利要求28所述的免疫原组合物，其中pH大于5.5。
30.根据权利要求29所述的免疫原组合物，其中所述pH 5.5–7.0。
31.根据权利要求29所述的免疫原组合物，其中所述pH是6.5。
32.根据权利要求27所述的免疫原组合物，其还包含盐。
33.根据权利要求27-32中任一项所述的免疫原组合物，其还包含非离子性表面活性剂。
34.根据权利要求27-33中任一项所述的免疫原组合物，其还包含佐剂。
35.根据权利要求34所述的免疫原组合物，其中所述佐剂是氢氧化铝。
36.一种针对志贺氏菌病进行免疫的方法，其包括向患者施用一剂权利要求1-11或权利要求27-35中任一项所述的免疫原组合物的步骤。
37.根据权利要求36所述的方法，其中一剂包含0-50μg四种志贺氏菌O-抗原的每一种的多糖。
38.根据权利要求37所述的方法，其中一剂包含40-50μg四种志贺氏菌O-抗原的每一种的多糖。
39.根据权利要求36所述的方法，其中一剂包含0-20μg四种志贺氏菌O-抗原的每一种的多糖。
40.根据权利要求39所述的方法，其中一剂包含0-10μg四种志贺氏菌O-抗原的每一种的多糖。
41.根据权利要求40所述的方法，其中一剂包含0-6μg四种志贺氏菌O-抗原的每一种的多糖。
42.根据权利要求39所述的方法，其中一剂包含10-20μg四种志贺氏菌O-抗原的每一种的多糖。
43.根据权利要求39所述的方法，其中一剂包含10-15μg四种志贺氏菌O-抗原的每一种的多糖。
44.一种在哺乳动物中诱导抗体应答的方法，其包括向哺乳动物施用免疫学有效量的权利要求1-11或权利要求27-35中任一项所述的免疫原组合物。
45.根据权利要求1-11或权利要求27-35中任一项所述的免疫原组合物，其用于在哺乳动物中诱导抗体应答。
46.权利要求1-11或权利要求27-35中任一项所述的免疫原组合物在哺乳动物中诱导抗体应答的用途。
47.权利要求1-11或权利要求27-35中任一项所述的免疫原组合物在制备用于在哺乳动物中诱导抗体应答的药物中的用途。
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