KR20230164108A - E. coli O18 생물접합체의 생산 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 담체 단백질에 접합된 E. coli O18 항원 다당류의 생물접합체의 생산을 위한 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는, 이들이 서열번호 1의 야생형 Wzy O-항원 중합효소와 비교할 때 위치 199, 377 및 395 중 하나 이상에서 아미노산 치환의 특정 조합을 갖는 변형된 Wzy O-항원 중합효소를 포함하는 것을 특징으로 하고, 변형된 Wzy O-항원 중합효소는 상기 숙주 세포에 의해서 생산되는 O18 생물접합체의 수율 및 글리코실화 패턴을 개선시킨다. 본 발명은 추가로 상기 숙주 세포를 사용하여 담체 단백질에 접합된 E. coli O18 항원 다당류의 생물접합체를 생산하는 방법, 추가적인 O 항원 다당류-혈청형의 생물접합체를 포함하는 다가 조성물을 포함하는, 이들 생물접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

E. coli O18 생물접합체의 생산
본 발명은 의료 미생물학, 면역학 및 백신 분야에 관한 것이다. 특히 본 발명은 수율이 증가되고 글리코실화도가 증가된 E. coli O18 항원 다당류의 생물접합체(bioconjugate)를 생산하기 위한 개선된 Wzy O-항원 중합효소를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 생물접합체를 포함하는 조성물 및 E. coli 감염, 특히 침습성 장외 병원성 E. coli(ExPEC) 질환을 갖는 감염의 예방 또는 치료를 위해서 E. coli에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 이러한 조성물의 용도에 관한 것이다.
장외 병원성 에쉐리키아 콜라이(ExPEC: Extraintestinal pathogenic Escherichia coli) 균주는 일반적으로 공생 E. coli 균주와 함께 인간 위장관에 무해한 서식자이다. ExPEC 단리물은 혈청형에 의해서는 공생 단리물로부터 쉽게 구별될 수 없지만, 다수의 클론성 계통은 O-항원, 캡슐 및 편모 항원 혈청형(O:K:H, 예를 들어, O25:K1:H4로 약칭됨)에 의해서 정의된 바와 같이, ExPEC가 지배적이다. 공생 E. coli와 상반되게, ExPEC 균주는 위장관에 집락화할 수 있을 뿐만 아니라 광범위한 장외 감염을 일으킬 수 있는 광범위한 병독성 인자를 발현하며, 이는 입원 및 사망으로 인한 상당한 의료 비용 부담과 연관된다. 신생아, 노인 및 면역저하 환자는 특히 침습성 ExPEC 질환(IED: invasive ExPEC disease)을 포함한 ExPEC 감염에 취약하다.
O-항원은 E. coli를 비롯한 그램-음성 박테리아의 세포벽 지질다당류(LPS)의 면역우세 성분을 포함한다. 현재 180개 초과의 혈청학적으로 고유한 E. coli O-항원이 확인되었으며, 대부분의 ExPEC 단리물은 20개 미만의 O-항원 혈청형으로 분류되었다. 전장 E. coli O-항원은 전형적으로 고도로 보존된 LPS 코어 구조에 부착된 약 10 내지 25개의 반복 당 단위로 구성되며, 각각의 성분은 각각 rfb 및 rfa 유전자 클러스터에서 주로 인코딩된 효소에 의해 별도로 합성된다. O-항원의 중합 후, O-항원 다당류 골격은 전형적으로 아세틸 또는 글루코스 잔기의 첨가를 통해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 공통 다당류 골격을 공유하지만 측면 분지가 상이한 항원적으로 구별되는 혈청형을 생성함으로써 혈청형 다양성을 효과적으로 증가시킨다. O-항원 변형 효소를 인코딩하는 유전자는 전형적으로 염색체 상의 rfb 클러스터 외부에 존재하며, 일부 경우에, 이러한 유전자는 용해성 박테리오파지 내에서 발견된다.
ExPEC 감염을 예방하기 위한 백신 개발을 위한 노력은 O-항원 다당류 접합체에 집중되어 왔다. 12가 O-항원 접합 백신은 O-항원 다당류의 추출 및 정제, 및 해독된 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A에 대한 화학적 접합을 통해 합성되었으며, 1상 임상 연구에서 안전성 및 면역원성에 대해 시험되었다(문헌[Cross et al., J. Infect. Dis. (1994) v.170, pp.834-40]). 이 후보 백신은 임상용으로 허가되지 않았다. E. coli에서의 생물접합 시스템이 최근 개발되었는데, 여기서 항원 다당류 및 담체 단백질 둘 다가 생체내에서 합성되고 이후에 E. coli에서 발현되는 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 효소인 올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglB의 활성을 통해서 생체내에서 접합된다(문헌[Wacker et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (2006) v. 103, pp. 7088-93]). 이러한 N-연결된 단백질 글리코실화 시스템은 다양한 다당류를 담체 단백질로 전달할 수 있어서, 이것이 발현되는 박테리아로부터 생물접합체를 정제하는 방법을 가능하게 한다. 생물접합은 E. coli 4가 O-항원 후보 백신을 위한 접합 다당류를 생산하는 데 성공적으로 사용되어 왔다(문헌[Poolman and Wacker, J. Infect. Dis. (2016) v.213(1), pp. 6-13]; WO 2015/124769; WO 2017/035181).
10개의 생물접합체(O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75, 이 조성물은 ExPEC10V라고 지칭됨)를 포함하는 조성물이 기재되어 있고, 이것은 임상 시험 중이다(예를 들어, WO2020/191082A1).
O18A 항원 다당류를 갖는 생물접합체에 대한 생성물 수율은 ExPEC10V에 대해 제조된 다른 9개의 생물접합체에 비해 가장 낮은 것으로 관찰되었다(WO2020/191082A1). 더욱이, 이렇게 생산된 O18A 생물접합체는 'sEPA'로 지칭되는, 제한된 수의 O18A 항원 다당류 반복 단위로 구성된 상대적으로 많은 양의 글리칸을 함유하는 것으로 나타났는데(즉, 단지 약 1 내지 3개의 반복 단위를 갖는 다당류 사슬을 갖는 EPA 담체 단백질, 이것은 O18A 생물접합체 약물 물질의 생산 공정에서 주변세포질 분획 중 O18A 생물접합체의 20% 초과에 해당하는 양임), sEPA 생성물은 주로 글리칸을 포함하는 바람직한 생물접합체로부터 쉽게 분리되지 않고, 여기서 O18A 항원 다당류는 적어도 5개의 반복 단위로 구성된다. O18 혈청군에 속하는 ExPEC 단리물은 미국 및 유럽 혈액 단리물의 현대 감시 연구에서 일반적으로 확인되었으며, 따라서 O18 접합체는 ExPEC 백신의 관련 성분인 것으로 간주된다. 따라서 O18 항원 다당류의 접합체의 수율을 개선시키는 것이 바람직할 것이다.
따라서 본 발명의 목적은 생산 동안 O18 항원 다당류를 포함하는 생물접합체의 생성물 수율을 증가시키기 위한 물질 및 방법을 제공하고/하거나 이전에 기재된 생산 공정을 사용하여 얻은 O18 생물접합체에 비해서 감소된 상대적 양의 sEPA를 갖는 O18 생물접합체를 얻기 위한 물질 및 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 이전에 기재된 물질 및 방법을 사용하여 얻은 O18 생물접합체에 비해서 글리코실화도가 증가된 E. coli O18A 항원 다당류의 생물접합체를 생산하기 위한 물질 및 방법을 제공하는 것이다.
제1 양태에서, 본 발명은 (a) 적어도 하나의 글리코실화 공통 서열을 포함하는 담체 단백질; (b) E. coli O18 rfb 유전자좌; 및 (c) 올리고사카릴트랜스퍼라제를 포함하는 그램-음성 박테리아 숙주 세포에 관한 것이며; 여기서 세포는 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 폴리펩티드는 서열번호 1과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 서열은 i) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 아이소류신(Ile, I), 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신(Lys, K) 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 알라닌 (Ala, A); ii) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 트레오닌(Thr, T), 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 발린(Val, V); iii) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 트레오닌, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 알라닌; iv) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 아이소류신, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 발린; 또는 v) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 아이소류신, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 메티오닌(Met, M), 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 알라닌을 포함한다.
일 실시형태에서, 숙주 세포에서, Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드는, 아미노산 서열이 i) 위치 199의 Ile, 위치 377의 Lys 및 위치 395의 Ala; ii) 위치 199의 Thr, 위치 377의 Lys 및 위치 395의 Val; iii) 위치 199의 Thr, 위치 377의 Lys 및 위치 395의 Ala; iv) 위치 199의 Ile, 위치 377의 Lys 및 위치 395의 Val; 또는 v) 위치 199의 Ile, 위치 377의 Met 및 위치 395의 Ala을 포함하는 것을 제외하고는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 모든 위치는 서열번호 1의 것에 상응한다.
일 실시형태에서, 숙주 세포에서, Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 위치 199의 Ile, 위치 377의 Lys 및 위치 395의 Ala를 포함하며, 여기서 위치는 서열번호 1의 것에 상응한다.
일 실시형태에서, 숙주 세포는 숙주 세포의 게놈에 통합되는 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함한다.
일 실시형태에서, 숙주 세포는 에쉐리키아 콜라이 숙주 세포이다. 바람직한 실시형태에서, 숙주 세포는 E. coli K-12 균주, 보다 바람직하게는 E. coli K-12 균주 W3110이다.
일 실시형태에서, 숙주 세포에서, 다음 중 적어도 하나이다: a) 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 서열번호 6과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함; b) 담체는 서열번호 3을 포함함; 및 c) E. coli O18 rfb 유전자좌는 혈청형 O18A를 갖는 E. coli 균주의 rfb 유전자좌임. 바람직하게는 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 숙주 세포는 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 Wzy O-항원 중합효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 E. coli O18 rfb 유전자좌를 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 담체 단백질에 접합된 E. coli O18 항원 다당류의 생물접합체의 생산 방법에 관한 것이며, 이 방법은 (a) 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 숙주 세포를 배양하여 생물접합체를 생산하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 이 방법은 생물접합체의 회수를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 이 방법은 회수된 생물접합체를 약제학적 조성물로 제형화하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 방법은 담체 단백질에 접합된 E. coli O-항원 다당류의 하나 이상의 추가적인 생물접합체를 약제학적 조성물에 첨가하여 다가 생물접합체 조성물을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 하나 이상의 추가적인 생물접합체는, E. coli 혈청형 O1, O2, O4, O6, O8, O15, O16, O25 및 O75로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 O-항원 다당류를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 이 방법으로 생산된 다가 생물접합체 조성물은 (i) 담체 단백질에 접합된 E. coli O18A 항원 다당류의 생물접합체; (ii) 담체 단백질에 접합된 E. coli O1A 항원 다당류의 생물접합체; (iii) 담체 단백질에 접합된 E. coli O2 항원 다당류의 생물접합체; (iv) 담체 단백질에 접합된 E. coli 글리코실화된 O4 항원 다당류의 생물접합체; (v) 담체 단백질에 접합된 E. coli O6A 항원 다당류의 생물접합체; (vi) 담체 단백질에 접합된 E. coli O15 항원 다당류의 생물접합체; (vii) 담체 단백질에 접합된 E. coli O16 항원 다당류의 생물접합체; (viii) 담체 단백질에 접합된 E. coli O25B 항원 다당류의 생물접합체; 및 (ix) 담체 단백질에 접합된 E. coli O75 항원 다당류의 생물접합체를 포함하며, 여기서 바람직하게는 각각의 생물접합체 내의 담체 단백질은 서열번호 3을 포함한다. 보다 바람직한 실시형태에서, 이 방법으로 생산된 다가 생물접합체 조성물은 (x) 담체 단백질에 접합된 E. coli O8 항원 다당류의 생물접합체를 추가로 포함하며, 여기서 바람직하게는 담체 단백질은 서열번호 3을 포함한다.
도 1. O18A 다당류 생물접합체 발현을 위해서 유도된 서열번호 1(레인 1 및 3) 또는 아미노산 치환 199I, 377K, 395A(레인 2 및 4)를 갖는 Wzy 변이체를 함유하는 O18A 생물접합체에 대한 E. coli 생산 균주 W3110의 진탕 플라스크 배양물로부터의 주변세포질 추출물이 로딩된 쿠마시-염색 SDS-PAGE. 레인 1 및 레인 2에 로딩된 샘플에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제 효소 PglB는 크기-감소된 발현 플라스미드로부터 발현되는 반면, 레인 3 및 4에서 PglB 발현 플라스미드의 벡터 골격은 비-코딩 DNA 및 lac 억제자 유전자 lacI를 포함하는 추가적인 4500 bp의 DNA 서열을 함유하였고, 이는 생성물 발현에 최적인 것으로 나타났다. O18A 다당류 생물접합체 물질을 나타내는 밴드는 화살표로 표시되어 있는데, 이는 모노-글리코실화된 EPA(M), 디-글리코실화된 EPA(D) 및 트리-글리코실화된 EPA(T)의 대략적인 크기를 도시한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그렇지 않으면, 본 명세서에 언급된 소정의 용어는 본 명세서에 제시된 바와 같은 의미를 갖는다. 본 명세서에 인용된 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 간행물은 마치 본 명세서에 완전히 기재되어 있는 것처럼 참고로 포함된다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태(부정 관사 및 정관사)는, 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 유의해야 한다.
본 설명 및 후술되는 청구범위 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 필요로 하지 않는 한, 단어 "포함하다" 및 변형 형태, 예컨대 "포함한다" 및 "포함하는"은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 군을 포함하지만, 어떠한 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 배제하지는 않음을 내포하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "포함하는"은 용어 "함유하는" 또는 "구비하는"으로 치환될 수 있거나, 경우에 따라서는 본 명세서에서 사용될 때 용어 "갖는"으로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "~로 이루어진"은 청구범위 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 구성성분을 배제한다. 본 명세서에서 사용될 때, "~로 본질적으로 이루어진"은 청구범위의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 주지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다. 본 발명의 양태 또는 실시형태와 관련하여 본 명세서에 사용되는 모든 경우에, 임의의 전술한 용어 "포함하는", "함유하는", "구비하는" 및 "갖는"은 본 발명의 범주를 변동시키기 위해 용어 "~로 이루어진" 또는 "~로 본질적으로 이루어진"으로 대체될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 다수의 언급된 요소들 사이의 접속 용어 "및/또는"은 개별 선택지 및 조합된 선택지 둘 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 2개의 요소들이 "및/또는"에 의해 결합되는 경우, 제1 선택지는 제2 요소 없이 제1 요소의 적용가능성을 지칭한다. 제2 선택지는 제1 요소 없이 제2 요소의 적용가능성을 지칭한다. 제3 선택지는 제1 요소와 제2 요소가 함께 적용가능함을 지칭한다. 이들 선택지 중 어느 것이든 하나는 이 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 이에 따라 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다. 이들 선택지 중 하나 초과의 동시 적용가능성 또한 이 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 이에 따라 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다.
수치 값과 관련하여 사용될 때 단어"약"또는"대략"은 그 값이 그 값의 +/- 20%, 바람직하게는 그 값의 +/- 10%, 보다 바람직하게는 값의 +/- 5%인 소정의 값일 수 있음을 의미한다.
서열 동일성은 본 명세서에서 서열을 비교함으로써 결정된 바와 같이 2개 이상의 아미노산(폴리펩티드 또는 단백질) 서열 또는 2개 이상의 핵산(폴리뉴클레오티드) 서열 사이의 관계로서 정의된다. 2개의 아미노산 서열 사이의 "유사성"은 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열과 이의 보존된 아미노산 치환체를 제2 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정된다. "동일성" 및 "유사성"은 공지된 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다.
"서열 동일성" 및 "서열 유사성"은 두 서열의 길이에 따라, 전체 또는 국부적 정렬 알고리즘을 사용하여 2개의 펩티드 또는 2개의 뉴클레오티드 서열의 정렬에 의해 결정될 수 있다. 유사한 길이의 서열은 바람직하게는 서열을 전체 길이에 걸쳐 최적으로 정렬시키는 글로벌 정렬 알고리즘(예컨대, Needleman Wunsch)을 사용하여 정렬되는 반면, 실질적으로 상이한 길이의 서열은 바람직하게는 국부적 정렬 알고리즘(예컨대, Smith Waterman)을 사용하여 정렬된다. 이어서, (예를 들어, 디폴트 파라미터를 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬되는 경우) 이들이 (하기에 정의된 바와 같은) 적어도 특정 최소 백분율의 서열 동일성을 공유할 때 서열들은 "실질적으로 동일한" 또는 "본질적으로 유사한"으로 지칭될 수 있다. 가장 바람직하게는, 서열 정렬은 디폴트 설정을 사용하여 ClustalW (1.83) 서열 정렬에서 수행된다.
대안적으로, FASTA, BLAST 등과 같은 알고리즘을 사용하여 공개 데이터베이스를 검색함으로써 백분율 유사성 또는 동일성이 결정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 예를 들어, 다른 패밀리 구성원 또는 관련 서열을 식별하기 위해 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "쿼리 서열"로서 추가로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403―10]의 BLASTn 및 BLASTx 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색을 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어 길이 = 12로 수행하여 본 발명의 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 검색을 BLASTx 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행하여 본 발명의 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 얻기 위해, 문헌[Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402]에 기재된 바와 같이 Gapped BLAST가 활용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우, 각각의 프로그램(예를 들어, BLASTx 및 BLASTn)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. 미국 국립생물공학정보센터 홈페이지 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/를 참조한다.
달리 나타내지 않는 한, 일련의 요소 앞의 용어 "적어도"는 그 일련의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
본 출원의 발명자들은 놀랍게도 하나 이상의 특정 위치에서 참조 서열과 상이한 Wzy O-항원 중합효소를 사용하는 것이 O18 항원 다당류 생물접합체의 생산 수율의 상당한 개선을 초래한다는 것을 발견하였다. 또한, 이러한 중합효소의 사용은 놀랍게도 증가된 글리칸 대 단백질 비율 및/또는 글리코실화 부위의 증가된 점유율을 갖는 O18 항원 다당류 접합체의 생산을 촉진한다는 것을 발견하였다.
따라서, 제1 양태에서 본 발명은 담체 단백질에 접합된 E. coli O18 항원 다당류의 생물접합체의 생산을 위한 숙주 세포를 제공하는 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 숙주 세포는 적어도 (a) 적어도 하나의 글리코실화 공통 서열을 포함하는 담체 단백질; (b) E. coli O18 rfb 유전자좌; (c) 올리고사카릴트랜스퍼라제; 및 (d) Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드를 포함한다.
숙주 세포에서, Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖고 추가로 O-항원 중합효소 활성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 본 발명의 폴리펩티드가 O-항원 중합효소 활성을 갖는지 또는 갖지 않는지의 여부는 적합한 숙주 세포에서 Wzy O-항원 중합효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현시키고 당업자에게 공지된 방법에 의해서 또는 예를 들어, 전문이 본 명세서에 포함된 Woodward 등의 문헌[2010, Nat Chem Biol. 2010 Jun; 6(6): 418―423]에 기재된 바와 같이 생산된 중합된 O-항원의 양을 결정함으로써 검정될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 숙주 세포는 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 이러한 폴리펩티드는 서열번호 1과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 아미노산 서열은
i) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 아이소류신, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 알라닌;
ii) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 트레오닌, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 발린;
iii) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 트레오닌, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 알라닌;
iv) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 아이소류신, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 발린; 또는
v) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 아이소류신, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 메티오닌, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 알라닌을 포함한다.
각각 서열번호 1에서 아미노산 위치 199, 377 또는 395 중 하나에 상응하는 아미노산 위치는, 본 명세서에서 바람직하게는 디폴트 설정을 사용하여, 바람직하게는 서열번호 1과의 ClustalW (1.83) 서열 정렬에서, 서열번호 1 이외의 해당 서열과 서열번호 1의 서열 정렬 시에 각각 서열번호 1에서 위치 199, 377 또는 395 중 하나와 정렬되는 서열번호 1 이외의 아미노산 서열에서의 위치를 지칭하는 것으로 이해된다. 당업자는 본 명세서에 정의된 바와 같은 아미노산 서열 정렬 알고리즘을 사용하여 서열번호 1 이외의 Wzy O-항원 중합효소 아미노산 서열에서 상응하는 아미노산 위치를 식별하는 방법을 알고 있을 것이다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 숙주 세포는 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 이 폴리펩티드는, 아미노산 서열이 i) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 아이소류신, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 알라닌; ii) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 트레오닌, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 발린; iii) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 트레오닌, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 알라닌; iv) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 아이소류신, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 발린; 또는 v) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 아이소류신, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 메티오닌, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 알라닌을 포함하는 것을 제외하고는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 이러한 실시형태에서, 본 발명의 숙주 세포는 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 이 폴리펩티드는, 아미노산 서열이 i) 서열번호 1의 위치 199의 아이소류신, 서열번호 1의 위치 377의 라이신 및 서열번호 1의 위치 395의 알라닌; ii) 서열번호 1의 위치 377의 라이신; iii) 서열번호 1의 위치 377의 라이신 및 서열번호 1의 위치 395의 알라닌; iv) 서열번호 1의 위치 199의 아이소류신 및 서열번호 1의 위치 377의 라이신; 또는 v) 서열번호 1의 위치 199의 아이소류신 및 서열번호 1의 위치 395의 알라닌을 포함하는 것을 제외하고는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.
특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 숙주 세포는 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 이 폴리펩티드는 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 아이소류신, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 알라닌을 포함한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 일 실시형태에서, Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 위해, 본 발명의 숙주 세포는 바람직하게는 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다. 폴리뉴클레오티드는 이에 작동 가능하게 연결된 프로모터가 선행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 Wzy O-항원 중합효소 코딩 서열에 대해 내인성이다. 특정 바람직한 실시형태에서, 프로모터는 엔테로박테리아세에 패밀리의 박테리아, 바람직하게는 에쉐리키아 속의 박테리아, 보다 바람직하게는 E. coli 종의 박테리아에서 Wzy O-항원 중합효소의 발현을 유도하는 내인성 프로모터이다. 다른 실시형태에서, 프로모터는 Wzy 코딩 서열에 이종성이며, 예를 들어 재조합 발현 시스템에 사용하기 위해 당업자에게 알려진 강력한 프로모터가 사용된다. 예를 들어, 프로모터는 유도성 또는 구성적 원핵 프로모터, 예컨대, ara, phoA, tac, tet, trc, trp, PBAD, λPL, T5 또는 T7 프로모터이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 숙주 세포의 작제에 사용될 수 있는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리펩티드는 재조합, 합성 또는 인공 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 형태의 핵산, 예를 들어, DNA 또는 RNA, 바람직하게는 DNA일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 자연 발생 Wzy 인코딩 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 서열번호 2의 자연 발생 Wzy 인코딩 폴리뉴클레오티드에 존재하지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1에서 위치 199, 377 및 395에 상응하는 코돈 중 하나 이상에서 서열번호 2와 같은 자연 발생 Wzy 인코딩 폴리뉴클레오티드와 적어도 상이할 것이다. 또한, 본 발명에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1에서 위치 199, 377 및 395 중 적어도 하나에 상응하는 위치 이외의 코돈에서 자연 발생 Wzy 인코딩 폴리뉴클레오티드와 상이할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 5'-단부 및/또는 3'-단부에서 자연 발생 Wzy-인코딩 폴리뉴클레오티드에 존재하지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 당업자는 통상적인 기술을 사용하여, 폴리펩티드가 발현되는 임의의 특정 숙주 생물의 코돈 사용을 반영하는 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드 서열에 영향을 주지 않는 뉴클레오티드 치환을 달성할 수 있다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴 버전인 그리고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
당업자에 의해 추가로 이해되는 바와 같이, 일 실시형태에서, 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현 작제물 또는 벡터에 포함될 수 있다. 바람직하게는 발현 작제물에서, Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 숙주 세포에서, 예를 들어 발현 카세트에서 폴리펩티드의 발현을 위해서 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 이러한 발현 제어 서열은 상기에 명시된 바와 같은 프로모터를 포함할 수 있고, Shine―Dalgarno 서열, 전사 종결 서열 등을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 발현 작제물은 벡터에 포함된다. 일 실시형태에서, 벡터는 에피솜 벡터, 예컨대, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 바람직하게는 플라스미드이다. 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 또는 발현 작제물은 숙주 세포의 게놈에 통합된다. 특정 실시형태에서, 벡터 또는 발현 작제물은 바람직하게는 DNA 형태이다. 특정 실시형태에서, 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 이는 폴리뉴클레오티드가 프로모터의 제어 하에 있음을 의미한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 분자 생물학 분야의 통상의 기술자에게 알려진 동종 재조합-기반 유전자 변형 기술을 사용하여, 부위-지향 돌연변이발생에 의해서 생성된, 숙주 세포의 게놈 내의 rfb 유전자좌에서 이의 자연 위치에 통합된다.
담체 단백질에 접합된 E. coli O18 항원 다당류의 생물접합체를 생산하는 데 사용하기 위한 본 발명의 숙주 세포는 박테리아 숙주 세포이다. 일 실시형태에서, 숙주 세포는 그램-음성 박테리아 숙주 세포이다. E. coli O18 항원을 포함하는 생물접합체를 생산하는 데 사용하기에 적합한 박테리아 또는 원핵생물 숙주 세포는 에쉐리키아 종, 쉬겔라(Shigella) 종, 클레브시엘라 (Klebsiella) 종, 잔토모나스(Xhantomonas) 종, 살모넬라(Salmonella) 종, 에르시니아(Yersinia) 종, 락토코커스(Lactococcus) 종, 락토바실러스(Lactobacillus) 종. 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 코리네박테리엄(Corynebacterium) 종, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종, 스트렙토코커스(Streptococcus) 종, 스타필로코커스(Staphylococcus) 종, 바실러스(Bacillus) 종, 및 클로스트리디엄(Clostridium) 종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 숙주 세포는 에쉐리키아 콜라이 숙주 세포, 보다 바람직하게는 E. coli K-12 균주, 예컨대, 균주 W3110이고, 후자가 특히 바람직하다.
일 실시형태에서, 숙주 세포는 비자연 발생 숙주 세포이다. 따라서, 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하도록 변형되었고, 바람직하게는 i) 본 명세서 정의된 바와 같은 O18 rfb 유전자좌, ii) 본 명세서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 글리코실화 공통 서열을 포함하는 담체 서열(의 발현을 위한 핵산 작제물) 및 iii) 본 명세서에 정의된 올리고사카릴 트랜스퍼라제(의 발현을 위한 핵산 작제물) 중 하나 이상 또는 모두를 포함하도록 추가로 변형된 자연 발생 단리물, 예를 들어, 임상 단리물로부터 유래될 수 있다.
담체 단백질에 접합된 E. coli O18 항원 다당류의 생물접합체를 생산하는 데 사용하기 위한 본 발명의 숙주 세포는 추가로 바람직하게는 담체 단백질 상의 N-글리코실화 부위에 올리고당류를 전달하기 위해서 올리고사카릴 트랜스퍼라제(OST: oligosaccharyl transferase)를 포함한다. 따라서 바람직하게는 본 명세서에 제공된 바와 같은 숙주 세포는 올리고사카릴 트랜스퍼라제(OST)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 글리코실화 공통 모티프를 포함하는 초기 폴리펩티드 사슬의 잔기, 예를 들어, N-글리코실화 공통 모티프(이러한 N-글리코실화 공통 모티프의 예는 서열번호 4 또는 Asn-X-Ser(Thr)임)를 포함하는 초기 폴리펩티드 사슬의 아스파라긴(Asn, N) 잔기에 지질-연결된 올리고당류를 전달하는 효소이다. 본 출원 전체에 걸쳐, N-글리코실화 모티프 Asn-X-Ser(Thr)에 대해, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있음을 이해해야 한다. 바람직하게는, 이러한 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 담체 단백질의 폴리펩티드 사슬에서 올리고당류를 서열번호 4의 아스파라긴 잔기로 전달한다. 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 인코딩하는 핵산은 숙주 세포에 고유할 수 있거나, 유전적 접근법을 사용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 숙주 세포에 이종성이다. E. coli는 자연에서 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 포함하지 않고, 따라서 E. coli가 생물접합체의 생산을 위한 숙주 세포로서 사용되는 경우 이종 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 예를 들어, 유전자 조작에 의한 도입 시에 이러한 숙주 세포에 포함된다. 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 본 개시를 고려하여 본 기술 분야에 알려진 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다.
특정 바람직한 실시형태에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 캄필로박터로부터의 올리고사카릴 트랜스퍼라제이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 캄필로박터 제주니(즉, PglB; 예를 들어, 문헌[Wacker et al., 2002, Science 298:1790-1793] 참조; 또한, 예를 들어, NCBI 유전자 ID: 3231775, UniProt 수탁 번호 O86154 참조)로부터의 올리고사카릴 트랜스퍼라제이다. 또 다른 실시형태에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 캄필로박터 라리(예를 들어, NCBI 유전자 ID: 7410986 참조)로부터의 올리고사카릴 트랜스퍼라제이다.
구체적인 실시형태에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 자연(야생형) 단백질 또는 이의 임의의 변이체, 예컨대 국제 특허 출원 공개 제WO 2016/107818호 및 제WO 2016/107819호에 기재된 것을 비롯한, 캄필로박터 제주니로부터 유래되는 PglB이다. PglB는 공통 서열 서열번호 4 및 Asn-X-Ser(Thr)에서 지질-연결된 올리고당류를 아스파라긴 잔기로 전달할 수 있다. 특정 실시형태에서, pglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 본 명세서에 정의된 바와 같은 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 갖는 폴리펩티드이며, 이 폴리펩티드는 서열번호 6과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 서열번호 6과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 야생형 PglB에서 하나 이상의 내인성 글리코실화 공통 서열은 PglB 오토글리코실화를 피하도록, 예를 들어, 돌연변이 N534Q를 포함하는 서열번호 6으로 돌연변이되었다. 본 명세서에 제공된 숙주 세포에 사용하기에 적합한 변이체 PglB의 예는 돌연변이 N311 V를 포함하는 서열번호 6의 PglB를 포함한다.
담체 단백질에 접합된 E. oli O18 항원 다당류의 생물접합체의 생산에 사용하기 위한 본 발명의 숙주 세포는 바람직하게는 글리코실화 공통 서열 an-X-Ser(Thr)을 포함하는 적어도 하나의 글리코실화 부위, 더욱 바람직하게는 서열번호 4를 갖는 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하는 담체 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 담체 단백질은 피. 애루지노사(P. aeruginosa)의 해독된 외독소(EPA), E. coli 플라겔린(FliC), CRM197, 말토스 결합 단백질(MBP), 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 에스. 아우레우스(S. aureus)의 해독된 용혈소 A, 응집 인자 A, 응집 인자 B, E. coli 이열성 엔테로톡신(heat labile enterotoxin), E. coli 이열성 엔테로톡신의 해독된 변이체, 콜레라 독소 B 소단위(CTB), 콜레라 독소, 콜레라 독소의 해독된 변이체, E. coli Sat 단백질, E. coli Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니아에, 뉴몰라이신(Pneumolysin), 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH: Keyhole limpet hemocyanin), 피. 애루지노사 PcrV, 니세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 외부 막 단백질(OMPC) 및 비피막형 헤모필루스 인플루엔자(non-typeable Haemophilus influenzae)의 단백질 D로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 담체 단백질은 슈도모나스 애루지노사(EPA)의 해독된 엔도톡신 A 또는 CRM197이고, 바람직하게는 담체 단백질은 EPA이다. EPA의 경우, 다양한 해독된 단백질 변이체가 문헌에 기재되어 있고 담체 단백질로서 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 접합체에 사용되는 EPA 담체 단백질은 단백질이 덜 독성이고/이거나 글리코실화에 더 민감하도록 하는 방식으로 변형된다. 예를 들어, 해독은 문헌[Lukac et al., 1988, Infect Immun, 56: 3095-3098] 및 문헌[Ho et al., 2006, Hum Vaccin, 2:89-98]에 따라서 촉매적으로 필수적인 잔기 L552V 및 ΔE553을 돌연변이시키고 결실시킴으로써 달성될 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 접합체의 생산에 사용되는 담체 단백질은 담체 단백질의 글리코실화 부위의 수가 예를 들어, 이의 생물접합체 형태로 면역원성 조성물로 투여될 단백질의 더 낮은 농도를 허용하는 방식으로 최적화되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 서열번호 4를 갖는 글리코실화 공통 서열을 포함하는 1 내지 10개, 바람직하게는 2 내지 4개, 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위를 포함하는 EPA를 인코딩한다. 일 실시형태에서, 담체 단백질은 서열번호 3과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 글리코실화 공통 서열 Asn-X-Ser(Thr)을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열번호 4를 갖는 1 내지 10개, 바람직하게는 2 내지 4개, 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 담체 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 EPA를 포함한다.
특정 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 숙주 세포는 서열번호 6을 포함하는 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 3을 포함하는 담체 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
담체 단백질에 접합된 E. coli O18 항원 다당류의 생물접합체를 생산하는 데 사용하기 위한 본 발명의 숙주 세포는 바람직하게는 O18-항원 다당류 구조의 합성을 위한 E. coli O18 rfb 유전자좌를 포함한다.
E. coli에서, O-항원 생물발생에 관련된 유전자 생성물은 rfb 유전자좌에 의해서 인코딩된다. 따라서 본 명세서에 제공된 바와 같은 숙주 세포는 추가로 바람직하게는 E. coli O18 rfb 유전자좌, 바람직하게는 혈청형 O18A를 갖는 E. coli 균주의 rfb 유전자좌의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "O18 rfb 유전자좌" 및 "O18 rfb 유전자 클러스터"는 O18-항원 다당류 구조를 합성할 수 있는 효소 기구를 함께 인코딩하는 유전자의 클러스터를 포함하는 그램-음성 박테리아 게놈의 유전자좌를 지칭한다. 용어 rfb 유전자좌는 바람직하게는 에쉐리키아 속, 특히, E. coli로부터의 게놈 유전자좌를 지칭한다.
특정 실시형태에서, O18 rfb 유전자좌는 숙주 세포에 대해 이종성이고, 예를 들어, 숙주 세포의 전구체 세포에 도입되고, 바람직하게는 이의 게놈에 통합된다. 바람직하게는 본래 rfb 유전자 클러스터는 이것이 전구체 세포에 존재하는 경우, O18의 생물접합체의 생산을 가능하게 하기 위해서, O18 rfb 유전자 클러스터에 의해서 대체되었다.
특정 실시형태에서, E. coli O18 항원 다당류에 대한 rfb 클러스터는 E. coli O18A 항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터이다. 따라서, 바람직하게는, E. coli O18A 항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터는 서열번호 5와 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이 뉴클레오티드 서열은 E. coli O18A 항원 다당류를 생산하는 효소를 인코딩하고, 바람직하게는 Wzy O-항원 중합효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 특정 실시형태에서, rfb 유전자 클러스터는 상기 본 명세서에 정의된 바와 같이 본 발명의 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열인 Wzy O-항원 중합효소를 인코딩하는 서열을 제외하고는, 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. E. coli O18A 항원 다당류에 대한 반복 단위의 구조는 표 1에 항목(O18A)으로 나타나 있다.
따라서, 특정 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 숙주 세포는 E. coli rfb 유전자 클러스터를 포함하며, Wzy O-항원 중합효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 따라서, 특정 바람직한 실시형태에서, 내인성 Wzy O-항원 중합효소 코딩 서열은 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 Wzy 중합효소인 본 발명의 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해서 대체되었다. 내인성 Wzy 코딩 서열의 제거 및 본 발명의 Wzy 중합효소를 코딩하는 서열로의 대체는 당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이 유전자 편집 기술을 사용함으로써 달성될 수 있다.
일 실시형태에서, waaL 유전자는 본 발명의 숙주 세포의 게놈으로부터 결실되거나 기능적으로 불활성화된다. 용어 "waaL" 및 "waaL 유전자"는 주변세포질에 위치된 활성 부위를 갖는 막 결합 효소를 인코딩하는 O-항원 리가제 유전자를 지칭한다. 상기 waaL 유전자 인코딩된 효소는 운데카프레닐포스페이트(UPP)-결합된 O 항원을 지질 A 코어로 전달하여, 지질다당류를 형성한다. 내인성 waaL 유전자(예를 들어, ΔwaaL 균주)의 결실 또는 파괴는 O-항원의 지질 A로의 전달을 방해하고, 대신에 본 발명의 숙주 세포에서 발현되는 담체 단백질과 같은 또 다른 이용 가능한 생체분자로의 O-항원의 전달을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 숙주 세포의 일 실시형태에서, O16 O-항원 글루코실화를 담당하는 E. coli gtrABS 유전자는 숙주 세포의 게놈으로부터 결실되거나 기능적으로 불활성화된다. 바람직한 실시형태에서, E. coli gtrABS 유전자는 E. coli W3110 숙주 세포의 게놈으로부터 결실되거나 기능적으로 불활성화된다. 상이한 혈청형에서의 gtrA 및 gtrB 유전자는 매우 상동성이고 상호 교환 가능하며, gtrS 유전자는 혈청형-특이적 O-항원 글리코실 트랜스퍼라제를 인코딩한다. E. coli에서 W3110 GtrS는 글루코스(Glc) 잔기를 E. coli O16 O-항원의 a-L-Rha-(1→3)-D-G1cNAc 모티프에서 GlcNAc 당에 전달할 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 본 발명의 숙주 세포, 예컨대 담체 단백질, 올리고사카릴트랜스퍼라제, Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드 및 rfb 유전자 클러스터의 다른 효소에 포함되는 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 형태로 숙주 세포에 편리하게 제공된다. 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 바람직하게는 핵산 작제물, 구체적으로 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 발현 작제물이며, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 숙주 세포에서 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 적합한 발현 제어 서열은 상기에서 언급되며, 통상적으로 프로모터를 적어도 포함한다. 프로모터는 구성적 프로모터일 수 있거나, 이것은 특정 조건, 예를 들어, 당업계에 널리 알려진 것과 같은 온도 변화 또는 세포 내의 특정 화학물질 또는 단백질의 존재에 대해 활성이 조절, 예를 들어, 억제되거나 유도될 수 있는 촉진제일 수 있다. 핵산 작제물은 염색체외, 예를 들어, 플라스미드 또는 다른 벡터일 수 있거나, 핵산 작제물은 본 발명의 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 본 발명의 숙주 세포에서 폴리펩티드의 발현을 위한 핵산 작제물의 작제 및/또는 합성을 위한 분자 생물학적 방법은 일반적으로 당업계에 잘 알려져 있다.
선택적으로, O-항원의 사슬 길이는 네이티브 Wzz O-항원 사슬 길이 조절인자 기전을 조작함으로써, 예를 들어, Wzz O-항원 사슬 조절인자를 과발현시키거나 보충함으로써, 예를 들어, E. coli wzzB 유전자를 살모넬라 및 쉬겔라 내의 종 또는 피. 애루지노사로부터의 이의 대응물 또는, 예를 들어, 살모넬라 엔테리카 대응물, fepE 또는 다른 wzz 동족체 중 하나로 대체함으로써 조작될 수 있고(예를 들어, US 2018/0099038, WO 2020/039359), 이에 의해서 예를 들어, O-항원의 반복 단위의 수는 Wzy 단백질의 추가적인 과별현의 존재 또는 부재 하에서 증가될 수 있다. wzz-유사 유전자의 효과는 이들 종에 대해 문헌에 기재되어 있다. 그러나, 이것은 양호한 면역원성을 갖는 생물접합체를 수득하는 데 필요하지 않으며, 바람직한 실시형태에서 본 발명에 따른 생물접합체는 Wzz 사슬 길이 조절인자 기전의 조작 없이 제조된다.
일 실시형태에서, Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드 및 상기 본 명세서에 정의된 바와 같이 제시된 위치에 특정 아미노산을 포함하는 본 발명의 숙주 세포로 생산된 E. coli O18 항원 생물접합체의 수율은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 참조 Wzy O-항원 중합효소를 발현하는 다른 동일한 숙주 세포에서 동일한 조건을 사용할 때 생성된 수율의 적어도 105%, 110%, 120%, 150% 또는 200%이다.
일 실시형태에서, Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드 및 상기 본 명세서에 정의된 바와 같이 제시된 위치에 특정 아미노산을 포함하는 본 발명의 숙주 세포로 생산된 E. coli O18 항원 생물접합체의 글리코실화 부위의 점유율은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 참조 Wzy O-항원 중합효소를 발현하는 다른 동일한 숙주 세포에서 동일한 조건을 사용할 때 생성된 생물접합체의 글리코실화 부위의 점유율보다 개선된다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 숙주 세포로 생산되고 담체 단백질이 4개의 글리코실화 부위를 포함하는 E. coli O18 항원 생물접합체를 포함하는 조성물에서, 생물접합체 분자의 적어도 50, 55, 60, 65 또는 70%가 디-, 트리- 또는 테트라-글리코실화되고, 즉, 글리코실화 부위 중 2 내지 4개가 점유되어 있다. 바람직하게는, 일 실시형태에서, 담체 단백질은 서열번호 3과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 이는 글리코실화 공통 서열 Asn-X-Ser(Thr)을 포함하고, 보다 바람직하게는 서열번호 4를 갖는 4개의 글리코실화 부위를 포함한다. 가장 바람직하게는, 이러한 실시형태에서, 담체 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 EPA를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 조성물은 O18 생물접합체를 생산하는 숙주 세포의 세포질 분획이다. 바람직하게는 이러한 조성물은 O18 항원('sEPA')의 평균 약 1 내지 3개의 반복 단위 수를 갖는 생물접합체를 20%, 15%, 10% 이하로 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 추가로 담체 단백질에 접합된 E. coli O18 항원 다당류의 생물접합체를 생산하기 위해 본 발명의 숙주 세포를 사용하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 일 실시형태는 담체 단백질에 접합된 E. coli O18 항원 다당류의 생물접합체를 생산하는 방법에 관한 것이며, 바람직하게는 이 방법은 적어도 a) 본 발명의 숙주 세포를 배양하여 생물접합체를 생산하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 단계 a)에서 본 발명의 숙주 세포는 생물접합체의 생산에 도움이 되는 조건 하에서 배양된다. 특정 실시형태에서, 이 방법은 O18A 생물접합체의 생산에 관한 것이다. 본 발명의 숙주 세포는 E. coli O18 항원 다당류에 공유 커플링된 담체 단백질을 포함하는 생물접합체의 발현에 적합한 조건 하에서 배양되며, 이러한 조건은 예를 들어, WO 2015/124769 또는 WO 2020/191082에 이미 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 당업자에게 공지되어 있다.
일 실시형태에서, O18 생물접합체를 생산하는 방법은 b) 생물접합체의 회수 단계를 추가로 포함한다. O18 생물접합체는 본 개시의 관점에서 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 재조합 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 단리, 분리 및/또는 정제될 수 있다. 예를 들어, O18 생물접합체는 단백질 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 음이온 교환, 친화성 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도 또는 단백질 정제를 위한 다른 표준 기술을 사용함으로써 정제될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Saraswat et al., 2013, Biomed. Res. Int., (p. 1-18)] 참조; 또한 WO 2009/104074에 기재된 방법 참조. 또한, 생물접합체는 정제를 용이하게 하기 위해 이종 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있다. 생물접합체를 정제 및 특징규명하는 방법은 예를 들어, 상기 문헌[Ihssen et al., 2010], 및 WO 2006/119987, WO 2009/104074, 및 특히 WO 2015/124769 및 WO 2017/035181, 및 WO 2020/191082 A1에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시는 본 명세서에 참고로 포함된다.
일 실시형태에서, O18 생물접합체를 생산하는 방법은 c) 회수된 생물접합체를 약제학적 조성물로 제형화하는 단계를 추가로 포함한다. 약제학적 조성물 중의 생물접합체의 제형은 통상적으로 본 발명의 생물접합체 및 하기 본 명세서에서 보다 상세하게 기재된 바와 같은 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물을 제조하는 것을 포함할 것이다. 일 실시형태에서, O18 생물접합체를 생산하는 방법은 생물접합체를 포함하는 약제학적 조성물에 아주반트를 첨가하는 것을 추가로 포함한다. 약제학적 조성물에 혼입하기에 적합한 아주반트는 하기 본 명세서에서 더 상세히 기재된다.
일 실시형태에서, O18 생물접합체를 생산하는 방법은 담체 단백질에 접합된 E. coli O-항원 다당류의 하나 이상의 추가 접합체 또는 생물접합체를 약제학적 조성물에 첨가하여 다가 조성물, 바람직하게는 다가 생물접합체 조성물을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 따라서 담체 단백질에 접합된 E. coli O-항원 다당류의 하나 이상의 추가 접합체는 바람직하게는 O18, 또는 보다 바람직하게는 O18A 이외의 혈청형의 E. coli O-항원 다당류의 생물접합체이다. 바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 추가 접합체 또는 생물접합체는 E. coli 혈청형 O1, O2, O4, O6, O8, O15, O16, O25 및 O75로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개 전부의 O-항원 다당류를 포함한다. E. coli O-항원 다당류 혈청형의 상세한 설명은 하기 본 명세서에 제공된다(또한 표 1 참조). 이러한 추가적인 접합체 또는 생물접합체는 예를 들어 WO 2020/191082 A1에서와 같이 기재된 바와 같이 수득될 수 있다.
따라서, 바람직한 일 실시형태에서, O18 생물접합체의 생산 방법은 추가의 담체 단백질에 접합된 E. coli O-항원 다당류의 생물접합체를 약제학적 조성물에 첨가하여 다가 조성물을 수득하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 다가 생물접합체 조성물은 (i) 담체 단백질에 접합된 E. coli O18A 항원 다당류의 생물접합체; (ii) 담체 단백질에 접합된 E. coli O1A 항원 다당류의 생물접합체; (iii) 담체 단백질에 접합된 E. coli O2 항원 다당류의 생물접합체; (iv) 담체 단백질에 접합된 E. coli 글리코실화된 O4 항원 다당류의 생물접합체; (v) 담체 단백질에 접합된 E. coli O6A 항원 다당류의 생물접합체; (vi) 담체 단백질에 접합된 E. coli O15 항원 다당류의 생물접합체; (vii) 담체 단백질에 접합된 E. coli O16 항원 다당류의 생물접합체; (viii) 담체 단백질에 접합된 E. coli O25B 항원 다당류의 생물접합체; 및 (ix) 담체 단백질에 접합된 E. coli O75 항원 다당류의 생물접합체를 포함한다. 일 실시형태에서, 다가 생물접합체 조성물은 (x) 담체 단백질에 접합된 E. coli O8 항원 다당류의 생물접합체를 포함한다. 바람직하게는, 이들 실시형태에서, 각각의 생물접합체 (i) 내지 (ix) 내의 담체 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 E. coli O18 항원 생물접합체의 글리코실화 부위를 개선시키기 위한, Wzy O-항원 중합효소 활성 및 상기 본 명세서에 정의된 바와 같이 제시된 위치에 특정 아미노산을 갖는(즉, (i) I199, K377, 및 A395; 또는 (ii) T199, k377 및 V395; 또는 (iii) T199, k377, 및 A395; 또는 (iv) I199, k377 및 V395; 또는 (v) I199, m377 및 A395를 가짐; 여기서, 각각의 경우에 위치는 서열번호 1의 위치에 상응함) 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. E. coli O18 항원 생물접합체의 글리코실화 부위의 점유율 개선은 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 참조 Wzy O-항원 중합효소를 발현하는 다른 동일한 숙주 세포에서 동일한 조건을 사용하는 경우 생산되는 생물접합체의 글리코실화 부위의 점유율과 비교할 때, 짧은 반복 단위(여기서 표 1의 O18 구조에서 n은 단지 약 1 내지 3임)를 갖는 생물접합체 양의 감소에 의해서 그리고/또는 바람직하게는 담체 단백질(바람직하게는 표 1의 O18 구조에서 n은 적어도 5임) 내의 적어도 2개 이상의 N-글리코실화 공통 서열에 접합된 O18 항원 다당류를 포함하는 담체 단백질로 이루어진 생물접합체의 양의 증가에 의해서 관찰될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 숙주 세포를 사용하여 생물접합체를 생산하기 위한 본 발명의 방법에서 얻어진 또는 얻을 수 있는 담체 단백질에 접합된 E. coli O18 항원 다당류의 생물접합체에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "접합체", "당접합체" 및 "생물접합체"는 담체 단백질에 공유 결합된 E. coli O-항원을 함유하는 접합 생성물을 지칭한다. 본 발명의 접합체는 바람직하게는 숙주 세포에서 생산된 접합 생성물인 생물접합체이고, 여기서 O-항원 및 담체 단백질은 숙주 세포의 기구에 의해서 생합성에 의해서 생산되고 O-항원은 또한 예를 들어, 숙주 세포의 효소에 의해서 N-연결부를 통해서 담체 단백질에 효소에 의해서 공유 부착된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 숙주 세포를 사용하여 생물접합체를 생산하기 위한 본 발명의 방법에서 얻어진 또는 얻을 수 있는 담체 단백질에 접합된 E. coli O18 항원 다당류의 생물접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 담체 단백질에 접합된 E.coli O18 항원의 생물접합체를 포함하는 조성물은 생물접합체를 포함하는 조성물이고, 여기서 담체 단백질은 4개의 글리코실화 부위를 포함하고, 조성물 중의 담체 단백질 분자의 적어도 50, 55, 60, 65, 또는 70%는 N-글리코실화 서열 중 적어도 2개에서 E.coli O18 항원 반복부로 글리코실화되고, 즉, 디-, 트리- 또는 테트라-글리코실화되고, 따라서 2개 내지 4개의 점유된 글리코실화 부위를 갖는다. 일 실시형태에서, 담체 단백질은 서열번호 3과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 이는 글리코실화 공통 서열 Asn-X-Ser(Thr)을 포함하고, 보다 바람직하게는 서열번호 4를 갖는 4개의 글리코실화 부위를 포함한다. 가장 바람직하게는, 이러한 실시형태에서, 담체 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 EPA를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 조성물은 O18 생물접합체를 생산하는 숙주 세포의 세포질 분획이다. 바람직하게는 이러한 조성물은 E. coli O18 항원 다당류('sEPA')의 평균 약 1 내지 3개의 반복 단위 수를 갖는 생물접합체를 20%, 15%, 10% 이하로 포함한다.
일 실시형태에서, 담체 단백질에 접합된 E. coli O18 항원의 생물접합체를 포함하는 조성물은 생물접합체 이외에 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 발명의 (약제학적) 조성물은 담체, 충전제, 보존제, 가용화제 및/또는 희석제를 포함하는 임의의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 특히 주사용 용액의 경우에, 식염 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 적합한 약제학적 담체의 추가의 예는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 교과서에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 본 발명에 따른 조성물의 유효성 또는 본 발명에 따른 조성물의 생물학적 활성을 방해하지 않는 비독성 물질을 지칭한다. "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 오일, 지질, 지질 함유 소포, 미소구체, 리포좀 캡슐화, 또는 약제학적 제형에 사용하기 위한 당업계에 잘 알려진 다른 물질을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체의 특성은 특정 응용을 위한 투여 경로에 좌우될 것임이 이해될 것이다. 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용을 고려하여, 백신에 사용하기에 적합한 임의의 약제학적으로 허용 가능한 담체가 본 발명에 사용될 수 있다. 적합한 부형제는 멸균수, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합뿐만 아니라 안정화제, 예를 들어, Human Serum Albumin(HSA) 또는 다른 적합한 단백질 및 환원당을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
적합한 완충제는 Tris-완충 식염수, 포스페이트 완충제, 및 수크로스 포스페이트 글루타메이트 완충제를 포함한다. 예를 들어, Tris-완충 식염수(TBS) pH 7.4(예를 들어, 각각 25 mM, 137 mM 및 2.7 mM에서 Tris, NaCl 및 KCl을 함유함); 약 10 mM의 KH2PO4/Na2HPO4 완충제(pH 약 7.0), 약 5%(w/v)의 소르비톨, 약 10 mM의 메티오닌 및 약 0.02%(w/v)의 폴리소르베이트 80을 포함하는 포스페이트 완충제; 약 10 mM의 KH2PO4/Na2HPO4 완충제(pH 약 7.0), 약 8%(w/v)의 수크로스, 약 1 mM의 EDTA 및 약 0.02%(w/v)의 폴리소르베이트 80을 포함하는 포스페이트 완충제.
적합한 염은 예를 들어, Tris-하이드로클로라이드, 염화나트륨, 염화칼슘, 염화칼륨, 인산나트륨, 모노소듐 글루타메이트, 및 알루미늄 염(예를 들어, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산칼륨알루미늄, 또는 이러한 알루미늄염의 혼합물) 중 하나 이상을 포함한다.
적합한 보존제는 보존제의 0.001% 내지 0.01%(w/v)의 페놀, 벤즈에토늄 클로라이드, 2-페녹시에탄올, 또는 티메로살을 포함한다. 다른 실시형태에서, 보존제는 포함되지 않는다.
약제학적 조성물은 대상체에 대한 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 피하, 비경구, 경구, 피내, 경피, 결장직장, 복강내, 질내, 직장, 정맥내, 협측, 비강내, 기관내, 근육내, 국소, 경피 또는 폐 투여, 바람직하게는 근육내 투여에 적합하도록 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 투여를 위한 설명서와 함께 용기, 팩 또는 분배기에 포함될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 사용 전에 저장될 수 있으며, 예를 들어 조성물은 냉동(예를 들어, 약 -20℃ 또는 약 -70℃)에서 저장될 수 있거나; 냉장 조건(예를 들어, 약 2 내지 8℃, 예를 들어 약 4℃에서) 저장될 수 있거나; 또는 실온에서 저장될 수 있다.
약제학적 조성물은 선택적으로 아주반트를 포함할 수 있거나, 또는 선택적으로 아주반트와 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물과 조합하여 투여하기 위한 아주반트는 면역원성 조성물의 투여 전, 동시에 또는 후에 투여될 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 아주반트를 포함하지 않고, 아주반트와 조합하여 투여되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "아주반트"는 본 발명의 조성물과 함께 또는 그의 일부로서 투여될 때 담체 단백질에 커플링된 E. coli O18-항원을 포함하는 접합체에 대한 면역 반응을 증강시키고/시키거나, 향상시키고/시키거나 부스팅하지만, 아주반트 화합물이 단독으로 투여되는 경우 접합체에 대한 면역 반응을 생성하지 않는 화합물을 지칭한다. 아주반트는 예를 들어, 림프구 동원, B 및/또는 T 세포의 자극, 및 항원 제시 세포의 자극을 포함하는 몇몇 기전에 의해 면역 반응을 향상시킬 수 있다.
아주반트의 구체적인 예는 알루미늄 염(알룸)(예컨대, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄 및 산화알루미늄, 알룸 또는 나노알룸 제형을 포함하는 나노입자를 포함함), 인산칼슘, 모노포스포릴 지질 A(MPL) 또는 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)(예를 들어, 영국 특허 GB2220211, EP0971739, EP1194166, US6491919), AS01, AS02, AS03 및 AS04(모두 GlaxoSmithKline; 예를 들어, AS04에 대해서는 EP1126876, US7357936, AS02에 대해서는 EP0671948, EP0761231, US5750110 참조), 이미다조피리딘 화합물(WO2007/109812 참조), 이미다조퀴녹살린 화합물(WO2007/109813 참조), 델타-인슐린, STING-활성화 합성 사이클릭-다이-뉴클레오티드(예를 들어, US20150056224), 레시틴과 카르보머 단독중합체의 조합물(예를 들어, US6676958), 및 사포닌, 예컨대, 선택적으로 QS7(예를 들어, US 5,057,540)와 조합된 Quil A 및 QS21을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 아주반트는 프로인트 아주반트(완전 또는 불완전)이다. 특정 실시형태에서, 아주반트는 예를 들어, Brenntag(현재 Croda) 또는 Invivogen으로부터 상업적으로 입수 가능한 Quil-A를 포함한다. QuilA는 퀼라자 사포나리아 몰리나 나무(Quillaja saponaria Molina tree)로부터의 사포닌의 수-추출 가능한 분획을 함유한다. 이들 사포닌은 일반적인 트라이테르페노이드 골격 구조를 갖는 트라이테르페노이드 사포닌의 군에 속한다. 사포닌은 T-의존성 항원뿐만 아니라 T-비의존성 항원에 대한 강한 아주반트 반응뿐만 아니라 강력한 세포독성 CD8+ 림프구 반응을 유도하고, 점막 항원에 대한 반응을 강화하는 것으로 알려져 있다. 이들은 또한 콜레스테롤 및 인지질과 조합되어 면역자극 복합체(ISCOM: immunostimulatory complex)를 형성할 수 있으며, 여기서 QuilA 아주반트는 상이한 기원으로부터의 광범위한 항원에 대한 항체 매개 및 세포 매개 면역 반응 둘 다를 활성화할 수 있다. 특정 실시형태에서, 아주반트는 AS01, 바람직하게는 AS01B이다. AS01은 MPL(3-O-데아실-4'-모노포스포릴 지질 A), qS21(퀼라자 사포나리아 모닐라 분획 21) 및 리포좀을 함유하는 아주반트 시스템이다. 특정 실시형태에서, AS01은 상업적으로 입수 가능하거나(GSK), 본 명세서에 참조로 포함된 WO 96/33739에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 특정 아주반트는 2개의 비혼화성 유체, 예를 들어, 오일과 물의 혼합물인 에멀젼을 포함하며, 이들 중 하나는 다른 것의 내부에 작은 액적으로서 현탁되고 표면 활성제에 의해 안정화된다. 수중유 에멀젼은 오일의 작은 액적을 둘러싸는 연속상을 형성하는 물을 갖는 반면, 유중수 에멀젼은 연속상을 형성하는 오일을 갖는다. 특정 에멀젼은 스쿠알렌(대사 가능한 오일)을 포함한다. 특정 아주반트는 2개의 단량체가 함께 클러스터링되고 반복 단위의 블록을 형성할 때 형성된 공중합체인 블록 공중합체를 포함한다. 블록 공중합체, 스쿠알렌 및 미립자 안정화제를 포함하는 유중수 에멀젼의 예는 Sigma-Aldrich로부터 상업적으로 입수 가능한 TiterMax®이다. 선택적으로, 에멀젼은 면역자극 성분, 예컨대, TLR4 효능제와 조합될 수 있거나 이를 추가로 포함할 수 있다. 특정 아주반트는 선택적으로 면역 자극제, 예컨대, 모노포스포릴 지질 A와 조합하여 MF59(예를 들어, EP0399843, US 6299884, US6451325 참조) 및 AS03 및/또는 Q21, 예컨대, AS02에서 또한 사용되는 수중유 에멀젼(예컨대, 스쿠알렌 또는 땅콩유)이다(문헌[Stoute et al., 1997, N. Engl. J. Med. 336, 86-91] 참조). 아주반트의 추가 예는 면역자극제 함유 리포좀, 예컨대, AS01E 및 AS01B에서와 같은 MPL 및 QS21(예를 들어, US 2011/0206758)이다. 아주반트의 다른 예는 CpG, 및 이미다조퀴놀린(예컨대, 이미퀴모드 및 R848)이다. 예를 들어, 문헌[Reed G, et al., 2013, Nature Med, 19: 1597-1608]을 참조한다. 특정 실시형태에서, 아주반트는 Th1 아주반트이다.
특정 실시형태에서, 아주반트는 사포닌을 포함하며, 바람직하게는 퀼라자 사포나리아로부터 얻은 사포닌의 수-추출 가능한 분획을 포함한다. 특정 실시형태에서, 아주반트는 QS-21을 포함한다.
특정 실시형태에서, 아주반트는 톨-유사 수용체 4(toll-like receptor 4: TLR4) 효능제를 함유한다. TLR4 효능제는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Ireton GC and SG Reed, 2013, Expert Rev Vaccines 12: 793-807]을 참조한다. 특정 실시형태에서, 아주반트는 지질 A를 포함하는 TLR4 효능제, 또는 이의 유사체 또는 유도체이다.
예를 들어, TLR4 효능제를 포함하는 아주반트는 다양한 방식으로, 예를 들어, 에멀젼, 예컨대, 유중수(w/o) 에멀젼 또는 수중유(o/w) 에멀젼(예는 MF59, AS03), 안정적인 (나노-)에멀젼(SE), 지질 현탁액, 리포좀(중합체) 나노입자, 비로좀, 알룸 흡착된, 수성 제형(AF) 등으로 제형화될 수 있는데, 이들은 아주반트에서의 면역조절 분자 및/또는 면역원을 위한 다양한 전달 시스템을 나타낸다.
면역자극 TLR4 효능제는 선택적으로 다른 면역조절 성분, 예컨대, 사포닌(예를 들어, QuilA, QS7, QS21, Matrix M, Iscoms, Iscomatrix 등), 알루미늄 염, 다른 TLR에 대한 활성화제(예를 들어, 이미다조퀴놀린, 플라젤린, dsRNA 유사체, TLR9 효능제, 예컨대, CpG 등) 등과 조합될 수 있다(예를 들어, 상기 문헌[Reed et al, 2013] 참조).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "지질 A"는 글루코사민을 포함하고 케토사이드 결합을 통해 LPS 분자의 내부 코어에서 케토-데옥시옥툴로소네이트에 연결된 LPS 분자의 소수성 지질 모이어티를 지칭하며, 이는 그램-음성 박테리아의 외부 막의 외부 리플렛에 LPS 분자를 고정한다. LPS 및 지질 A 구조의 합성의 개요에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Raetz, 1993, J. Bacteriology 175:5745-5753], 문헌[Raetz CR and C Whitfield, 2002, Annu Rev Biochem 71: 635-700]; US 5,593,969 및 US 5,191,072를 참조한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 지질 A는 자연 발생 지질 A, 혼합물, 유사체, 유도체 및 이의 전구체를 포함한다. 이 용어는 단당류, 예를 들어, 지질 X로 지칭되는 지질 A의 전구체; 이당류 지질 A; 헵타-아실 지질 A; 헥사-아실 지질 A; 펜타-아실 지질 A; 테트라-아실 지질 A, 예를 들어, 지질 IVA로 지칭되는 지질 A의 테트라-아실 전구체; 탈인산화된 지질 A; 모노포스포릴 지질 A; 다이포스포릴 지질 A, 예컨대, 에쉐리키아 콜라이 및 로도박터 스패로이데스(Rhodobacter sphaeroides)로부터의 지질 A를 포함한다. 몇몇 면역 활성화 지질 A 구조는 6개의 아실 사슬을 함유한다. 글루코사민 당에 직접 부착된 4개의 1차 아실 사슬은 일반적으로 길이가 10 내지 16개의 탄소인 3-하이드록시 아실 사슬이다. 2개의 추가적인 아실 사슬이 종종 1차 아실 사슬의 3-하이드록시기에 부착된다. 예로서 E. coli 지질 A는 전형적으로 당에 부착된 4개의 C14 3-하이드록시 아실 사슬 및 각각 2' 및 3' 위치에서 1차 아실 사슬의 3-하이드록시기에 부착된 하나의 C12 및 하나의 C14를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "지질 A 유사체 또는 유도체"는 지질 A의 구조 및 면역학적 활성과 유사하지만 본질적으로 자연적으로 발생하지는 않는 분자를 지칭한다. 지질 A 유사체 또는 유도체는, 위치 4'에서 포스페이트 대신에 갈락투론산 모이어티를 보유하기 위해서, 환원 단부에서 글루코사민-1-포스페이트 대신에 2-데옥시-2-아미노글루코네이트를 함유하기 위해서, 또 다른 아민 당 잔기, 예를 들어, 갈락토사민 잔기로 치환된 이의 글루코사민 잔기를 갖도록 변형, 예를 들어, 단축 또는 축합될 수 있다. 지질 A 유사체 또는 유도체는, 예를 들어, 화학적 유도체화에 의해서 박테리아로부터 단리된 지질 A로부터 제조될 수 있거나, 예를 들어, 바람직한 지질 A 및 이의 합성 유사체 또는 유도체의 구조를 먼저 결정하고 이의 유사체 또는 유도체를 화학적으로 합성함으로써 화학적으로 합성될 수 있다. 지질 A 유사체 또는 유도체는 또한 TLR4 효능제 아주반트로서 유용하다(예를 들어, 문헌[Gregg KA et al, 2017, MBio 8, eDD492-17, doi: 10.1128/mBio.00492-17] 참조).
예를 들어, 지질 A 유사체 또는 유도체는 예를 들어, 알칼리 처리에 의해 야생형 지질 A 분자의 탈아실화에 의해 얻어질 수 있다. 지질 A 유사체 또는 유도체는 예를 들어, 박테리아로부터 단리된 지질 A로부터 제조될 수 있다. 이러한 분자는 또한 화학적으로 합성될 수 있다. 지질 A 유사체 또는 유도체의 또 다른 예는 지질 A 생합성 및/또는 지질 A 변형에 관여하는 효소의 돌연변이, 결실 또는 삽입을 보유하는 박테리아 세포로부터 단리된 지질 A 분자이다.
MPL 및 3D-MPL은 지질 A 독성을 감쇠시키도록 변형된 지질 A 유사체 또는 유도체이다. 지질 A, MPL 및 3D-MPL은 긴 지방산 사슬이 부착되어 있는 당 골격을 갖고, 여기서 골격은 글리코사이드 연결부에 2개의 육탄당 및 4 위치에 포스포릴 모이어티를 포함한다. 전형적으로, 5 내지 8개의 장쇄 지방산(일반적으로 12 내지 14개 탄소 원자)이 당 골격에 부착된다. 자연 공급원의 유도체화로 인해서, MPL 또는 3D-MPL은 다수의 지방산 치환 패턴, 예를 들어, 헵타-아실, 헥사-아실, 펜타-아실 등의 복합체 또는 혼합물로서 존재할 수 있으며, 지방산 길이가 다양하다. 이것은 또한 본 명세서에 기재된 다른 지질 A 유사체 또는 유도체의 일부에 대해서도 마찬가지이지만, 합성 지질 A 변이체는 또한 정의되어 있고, 균질할 수 있다. MPL 및 이의 제조는 예를 들어, US 4,436,727에 기재되어 있다. 3D-MPL은 예를 들어, US 4,912,094B1에 기재되어 있고, 위치 3에서 환원-단부 글루코사민에 연결된 에스테르인 3-하이드록시미리스트산 아실 잔기의 선택적 제거에 의해 MPL과 상이하다(예를 들어, US 4,912,094B1호의 컬럼 1의 MPL 대 컬럼 6에서 3D-MPL의 구조를 비교함). 당업계에서 종종 3D-MPL이 사용되지만, 때때로 MPL로서 지칭된다(예를 들어, 상기 문헌[Ireton GC 및 SG Reed, 2013]의 표 1의 첫 번째 구조는 이러한 구조를 MPL®로서 지칭하지만 실제로 3D-MPL의 구조를 실제로 도시한다).
지질 A(유사체, 유도체)의 예는 MPL, 3D-MPL, RC529(예를 들어, EP1385541), PET-지질 A, GLA(글리코피라노실 지질 아주반트, 합성 이당류 당지질; 예를 들어, US20100310602, US8722064), SLA(예를 들어, 문헌[Carter D et al, 2016, Clin Transl Immunology 5: e108 (doi: 10.1038/cti.2016.63]), 이것은 인간 백신을 위해서 TLR4 리간드를 최적화하기 위한 구조-기능 접근법을 기재함), PHAD(인산화 헥사아실 이당류; 이의 구조는 GLA의 구조와 동일함), 3D-PHAD, 3D-(6-아실)-PHAD(3D(6A)-PHAD)(PHAD, 3D-PHAD 및 3D(6A)PHAD는 합성 지질 A 변이체이며, 예를 들어, avantilipids.com/divisions/adjuvants 참조하고, 이것은 이들 분자의 구조를 또한 제공함), E6020(CAS 번호 287180-63-6), ONO4007, OM-174 등을 포함한다. 3D-MPL, RC529, PET-lipid A, GLA/PHAD, E6020, ONO4007 및 OM-174의 예시적인 화학 구조에 대해서는, 예를 들어, 상기 문헌[Ireton GC and SG Reed, 2013]의 표 1을 참조한다. SLA의 구조에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Reed SG et al, 2016, Curr Opin Immunol 41: 85-90]의 도 1을 참조한다. 특정 바람직한 실시형태에서, TLR4 효능제 아주반트는 3D-MPL, gLA, 또는 SLA로부터 선택된 지질 A 유사체 또는 유도체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 지질 A 유사체 또는 유도체는 리포솜 중에 제형화된다.
지질 A 유사체 또는 유도체를 포함하는 예시적인 아주반트는 GLA-LSQ(합성 MPL[GLA], QS21, 리포좀으로서 제형화된 지질), SLA-LSQ(합성 MPL[SLA], qS21, 지질, 리포좀으로서 제형화됨), GLA-SE(합성 MPL[GLA], 스쿠알렌 오일/물 에멀젼), SLA-SE(합성 MPL[SLA], 스쿠알렌 오일/물 에멀젼), SLA-나노알룸(합성 MPL[SLA], 알루미늄 염), GLA-나노알룸(합성 MPL[GLA], 알루미늄 염), SLA-AF(합성 MPL[SLA], 수성 현탁액), GLA-AF(합성 MPL[GLA], 수성 현탁액), SLA-알룸(합성 MPL[SLA], 알루미늄 염), GLA-알룸(합성 MPL[GLA], 알루미늄 염) 및 AS01 (MPL, QS21, 리포좀), AS02(MPL, QS21, 오일/물 에멀젼), AS25(MPL, 오일/물 에멀젼), AS04(MPL, 알루미늄 염) 및 AS15(MPL, QS21, CpG, 리포좀)을 비롯한 몇몇 GSK ASxx 시리즈의 아주반트를 포함한다. 예를 들어, WO 2013/119856, WO 2006/116423, US 4,987,237, U.S. 4,436,727, US 4,877,611, US 4,866,034, US 4,912,094, US 4,987,237, US5191072, US5593969, US 6,759,241, US 9,017,698, US 9,149,521, US 9,149,522, US 9,415,097, US 9,415,101, US 9,504,743, 상기 문헌[Reed G, et al., 2013] 참조.
비-당지질 분자가 또한 TLR4 효능제 아주반트, 예를 들어, 합성 분자, 예컨대, 네오셉틴-3 또는 자연 분자, 예컨대, LeIF로서 사용될 수 있고, 예를 들어, 상기 문헌[Reed SG et al, 2016]을 참조한다.
일 실시형태에서, 담체 단백질에 접합된 E. coli O18 항원의 생물접합체를 포함하는 본 발명의 조성물은 담체 단백질에 공유 커플링된 E. coli O-항원 다당류를 포함하는 적어도 하나의 추가적인 접합체를 추가로 포함한다. 담체 단백질에 접합된 E. coli O-항원 다당류의 하나 이상의 추가적인 생물접합체는 바람직하게는 O18 이외의, 또는 보다 바람직하게는 O18A 이외의 혈청형의 E. coli O-항원 다당류의 생물접합체이다. 바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 추가적인 접합체 또는 생물접합체는 E. coli 혈청형 O1, O2, O4, O6, O8, O15, O16, O25 및 O75로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개 모두의 O-항원 다당류를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 추가적인 접합체(들) 내의 하나 이상의 추가적인 E. coli O-항원은 E. coli O1 항원 다당류(예를 들어, O1A 항원 다당류), E. coli O2 항원 다당류, E. coli O4 항원 다당류(예를 들어, E. coli 글리코실화된 O4 항원 다당류), E. coli O6 항원 다당류(예를 들어, O6A 항원 다당류), E. coli O8 항원 다당류, E. coli O15 항원 다당류, E. coli O16 항원 다당류, E. coli O25 항원 다당류(예를 들어, O25A 또는 O25B 항원 다당류, 바람직하게는 O25B 항원 다당류) 및 E. coli O75 항원 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 추가적인 O-항원 다당류 각각은 담체 단백질에 공유 연결된다. 특정 실시형태에서, 담체 단백질 각각, 즉, 각각의 접합체에 대한 담체 단백질은 EPA 담체 단백질이다. 바람직하게는, 추가적인 접합체 중 하나 이상, 바람직하게는 모두는 생물접합체이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "O18"은 E. coli의 O18 항원(E. coli 혈청형 O18)을 지칭하고, O18A, O18B, O18A1, 또는 O18B1 항원(E. coli 혈청형 O18의 4개의 하위혈청형 각각) 중 하나일 수 있고, 바람직한 실시형태에서 O18은 O18A를 지칭한다. O18A 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 구조식(O18A)의 구조를 포함할 수 있고, 여기서 n은 1 내지 100, 예를 들어, 3 내지 50, 바람직하게는 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20이다. 용어 "O1A"는 E. coli의 O1A 항원(E. coli 혈청형 O1의 하위혈청형)을 지칭한다. 용어 "O2"는 E. coli의 O2 항원(E. coli 혈청형 O2)을 지칭한다. 용어 "O4"는 E. coli의 O4 항원(E. coli 혈청형 O4)를 지칭하고, 이것은 각각 글루코스 측면-분지(각각 글리코실화된 O4 항원 다당류(O4-Glc+), 및 비-글리코실화된 O4 항원 다당류(O4-Glc-)이라고 지칭됨; 바람직한 실시형태에서 O4는 O4-Glc+임)를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 용어 "O6A"는 E. coli의 O6A 항원(E. coli 혈청형 O6의 하위혈청형)을 지칭한다. 용어 "O8"는 E. coli의 O8 항원(E. coli 혈청형 O8)을 지칭한다. 용어 "O15"는 E. coli의 O15 항원(E. coli 혈청형 O15)을 지칭한다. 용어 "O16"는 E. coli의 O16 항원(E. coli 혈청형 O16)을 지칭한다. 용어 "O25B"는 E. coli의 O25B 항원(E. coli 혈청형 O25의 하위혈청형)을 지칭한다. 용어 "O75"는 E. coli의 O75 항원(E. coli 혈청형 O75)을 지칭한다.
본 출원 전체에 지칭되는 E. coli O-항원 다당류의 구조는 하기 표 1에 제시되어 있다. 각각의 E. coli O-항원 다당류에 대한 단일 반복 단위가 제시되어 있다.
[표 1]
Figure pct00001
Figure pct00002
본 명세서에 기재된 모든 단당류는 당업계에 알려진 일반적인 의미를 갖는다. 단당류는 D 또는 L 배위를 가질 수 있다. D 또는 L이 명시되지 않은 경우, 당은 D 배위를 갖는 것으로 이해된다. 단당류는 전형적으로 당업계에 일반적으로 알려지고 사용되는 약어로 지칭된다. 예를 들어, Glc는 글루코스를 지칭하고; D-Glc는 D-글루코스를 지칭하며; L-Glc는 L-글루코스를 지칭한다. 단당류에 대한 다른 일반적인 약어는 다음을 포함한다: Rha, 람노스; GlcNAc, N-아세틸글루코사민; GalNAc, N-아세틸갈락토사민; Fuc, 푸코스; Man, 만노스; Man3Me, 3-O-메틸-만노스; Gal, 갈락토스; FucNAc, N-아세틸푸코사민; 및 Rib, 리보스. 접미사 "f"는 푸라노스를 의미하고 접미사 "p"는 피라노스를 지칭한다.
본 발명에 따른 E. coli O18 항원 다당류에 공유 커플링된 담체 단백질의 생물접합체를 포함하는 조성물은 적어도 하나의 추가적인 E. coli O-항원 다당류에 공유 커플링된 담체 단백질의 접합체를 추가로 포함할 수 있고, 특정 실시형태에서 적어도 하나의 추가적인 접합체는 E. coli O1A 항원 다당류, E. coli O2 항원 다당류, E. coli O4 항원 다당류, E. coli O6A 항원 다당류, E. coli O8 항원 다당류, E. coli O15 항원 다당류, E. coli O16 항원 다당류, E. coli O25B 항원 다당류, 및 E. coli O75 항원 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 E. coli O-항원 다당류를 포함한다. 이러한 조성물은 접합체를 함께 첨가하여 다가 접합체 조성물을 수득함으로써 제조될 수 있다. 바람직하게는 추가적인 접합체 중 하나 이상 및 바람직하게는 전부가 또한 생물접합체이다.
특정 실시형태에서, O1A 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 당접합체, 바람직하게는 생물접합체의 일부로서)는 본 명세서에 제공된 바와 같은 (약제학적) 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 의해서 얻어진 E. coli O18 생물접합체를 포함하는 조성물)로 존재한다. O1A 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 구조식(O1A)의 구조를 포함할 수 있고, 여기서 n은 1 내지 100, 예를 들어, 3 내지 50, 바람직하게는 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20이다. 바람직하게는, O1A 항원 다당류는 접합체, 보다 바람직하게는 생물접합체의 일부이고, 담체 단백질, 예를 들어, EPA에 공유 연결된다.
특정 실시형태에서, O2 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 당접합체, 바람직하게는 생물접합체의 일부로서)는 본 명세서에 제공된 바와 같은 (약제학적) 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 의해서 얻어진 E. coli O18 생물접합체를 포함하는 조성물)로 존재한다. O2 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 구조식(O2)의 구조를 포함할 수 있고, 여기서 n은 1 내지 100, 예를 들어, 3 내지 50, 바람직하게는 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20이다. 바람직하게는, O2 항원 다당류는 접합체, 보다 바람직하게는 생물접합체의 일부이고, 담체 단백질, 예를 들어, EPA에 공유 연결된다.
특정 실시형태에서, O4 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 당접합체, 바람직하게는 생물접합체의 일부로서)는 본 명세서에 제공된 바와 같은 (약제학적) 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 의해서 얻어진 E. coli O18 생물접합체를 포함하는 조성물)로 존재한다. O-항원 구조 변형은 E. coli O4 혈청형 내에 존재하는 것으로 알려져 있다. 특히, 일부 O4 혈청형은 분지화 글루코스 단위를 갖는 변형된 O-항원을 발현한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "글리코실화된 O4 항원", "글리코실화된 O4 항원 다당류", "글루코스-분지화 O4", "O4-Glc+ 항원 다당류", "Glc+ O4", 및 "O4-Glc+ 항원"은 글루코스 분지를 갖는 O4 항원을 지칭한다. 일부 O4 혈청형은 이러한 분지화된 글루코스 단위를 갖지 않는 O4 항원을 가지며, 이것은 본 명세서에서 "비-글리코실화된 O4 항원", "비-글리코실화된 O4 항원 다당류, "O4-Glc- 항원", 또는 "O4-Glc-"라고 지칭된다. 본 명세서에서 "O4 항원"을 지칭하는 경우, 이것은 O4-Glc+ 항원 또는 O4-Glc- 항원일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, O4는 O4-Glc+ 항원을 지칭한다. E. coli 비-글리코실화된 O4 항원 및 E. coli 글리코실화된 O4 항원의 구조는 표 1에서 각각 구조식 (O4-Glc-) 및 (O4-Glc+)로 표현되며, 여기서 n은 1 내지 100, 예를 들어, 3 내지 50, 바람직하게는 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다. 구체적으로 O4-Glc+ 생물접합체를 생산하는 방법은 전문이 본 명세서에 포함된 WO2020/191082A1에 기재되어 있다. 바람직하게는, O4 항원 다당류는 접합체, 보다 바람직하게는 생물접합체의 일부이고, 담체 단백질, 예를 들어, EPA에 공유 연결된다.
특정 실시형태에서, O6A 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 당접합체, 바람직하게는 생물접합체의 일부로서)는 본 명세서에 제공된 바와 같은 (약제학적) 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 의해서 얻어진 E. coli O18 생물접합체를 포함하는 조성물)로 존재한다. O6A 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 구조식(O6A)의 구조를 포함할 수 있고, 여기서 n은 1 내지 100, 예를 들어, 3 내지 50, 바람직하게는 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20이다. 바람직하게는, O6A 항원 다당류는 접합체, 보다 바람직하게는 생물접합체의 일부이고, 담체 단백질, 예를 들어, EPA에 공유 연결된다.
특정 실시형태에서, O8 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 당접합체, 바람직하게는 생물접합체의 일부로서)는 본 명세서에 제공된 바와 같은 (약제학적) 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 의해서 얻어진 E. coli O18 생물접합체를 포함하는 조성물)로 존재한다. O8 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 구조식(O8)의 구조를 포함할 수 있고, 여기서 n은 1 내지 100, 예를 들어, 3 내지 50, 바람직하게는 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20이다. 바람직하게는, O8 항원 다당류는 접합체, 보다 바람직하게는 생물접합체의 일부이고, 담체 단백질, 예를 들어, EPA에 공유 연결된다.
특정 실시형태에서, O15 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 당접합체, 바람직하게는 생물접합체의 일부로서)는 본 명세서에 제공된 바와 같은 (약제학적) 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 의해서 얻어진 E. coli O18 생물접합체를 포함하는 조성물)로 존재한다. O15 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 구조식(O15)의 구조를 포함할 수 있고, 여기서 n은 1 내지 100, 예를 들어, 3 내지 50, 바람직하게는 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20이다. 바람직하게는, O15 항원 다당류는 접합체, 보다 바람직하게는 생물접합체의 일부이고, 담체 단백질, 예를 들어, EPA에 공유 연결된다.
특정 실시형태에서, O16 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 당접합체, 바람직하게는 생물접합체의 일부로서)는 본 명세서에 제공된 바와 같은 (약제학적) 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 의해서 얻어진 E. coli O18 생물접합체를 포함하는 조성물)로 존재한다. O16 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 구조식(O16)의 구조를 포함할 수 있고, 여기서 n은 1 내지 100, 예를 들어, 3 내지 50, 바람직하게는 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20이다. 바람직하게는, O16 항원 다당류는 접합체, 보다 바람직하게는 생물접합체의 일부이고, 담체 단백질, 예를 들어, EPA에 공유 연결된다. 담체 단백질에 공유 연결된 E. coli O16 항원 다당류의 접합체는 L-Rha 당의 위치 2에 특정 아세틸화도를 가질 수 있다. 접합체에서 O16 항원 다당류의 이러한 O-아세틸화도는 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 예컨대, 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%이다.
특정 실시형태에서, O25B 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 당접합체, 바람직하게는 생물접합체의 일부로서)는 본 명세서에 제공된 바와 같은 (약제학적) 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 의해서 얻어진 E. coli O18 생물접합체를 포함하는 조성물)로 존재한다. O25B 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 구조식(O25B)의 구조를 포함할 수 있고, 여기서 n은 1 내지 100, 예를 들어, 3 내지 50, 바람직하게는 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20이다. 바람직하게는, O25B 항원 다당류는 접합체, 보다 바람직하게는 생물접합체의 일부이고, 담체 단백질, 예를 들어, EPA에 공유 연결된다. 상기에 기재된 바와 같은 O16 항원 다당류와 유사하게, 담체 단백질에 공유 연결된 E. coli O25B 항원 다당류의 접합체는 L-Rha 당의 위치 2에 특정 아세틸화도를 가질 수 있다. 접합체에서 E. coli O25B 항원 다당류의 이러한 O-아세틸화도는 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 예컨대, 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%이다.
특정 실시형태에서, (예를 들어, 단리된 형태로 또는 당접합체, 바람직하게는 생물접합체의 일부로서) O75 항원 다당류는 본 명세서에 제공된 바와 같은 (약제학적) 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법으로 얻은 E. coli O18 생물접합체를 포함하는 조성물)로 존재한다. O75 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 구조식(O75)의 구조를 포함할 수 있고, 여기서 n은 1 내지 100, 예를 들어, 3 내지 50, 바람직하게는 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, O75 항원 다당류는 접합체, 보다 바람직하게는 생물접합체의 일부이고, 담체 단백질, 예를 들어, EPA에 공유 연결된다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 조성물은 본 발명에 따른 E. coli O18 항원 다당류에 공유 커플링된 담체 단백질을 포함하는 생물접합체를 포함하고, E. coli O-항원 다당류에 공유 커플링된 담체 단백질을 포함하는 하나 이상의 추가적인 접합체, 바람직하게는 4 내지 25개의 이러한 추가적인 접합체를 추가로 포함한다. 바람직하게는 추가적인 접합체는 상기에 기재된 바와 같은 E. coli O-항원 다당류, 가장 바람직하게는 적어도 O25B, O1A, O2 및 O6 중 하나 이상을 포함한다. 특히 바람직한 것은 적어도 7개, 바람직하게는 적어도 8개의 추가적인 접합체를 포함하는 조성물이고, 바람직하게는 이들 추가적인 접합체 중 일부, 가장 바람직하게는 모두는 생물접합체이다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 조성물은 적어도 E. coli O1A, O2, O4(바람직하게는 글리코실화된 O4), O6A, O15, O16, O18(바람직하게는 O18A), O25B 및 O75 항원 다당류, 바람직하게는 각각 독립적으로 담체 단백질, 예를 들어, EPA(즉, 적어도 9가 조성물)에 공유 연결된 O1A, O2, 글리코실화된 O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 항원 다당류의 접합체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 조성물은 바람직하게는 접합체, 바람직하게는 생물접합체의 형태의 E. coli O8 항원 다당류를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 조성물(O8 항원 다당류를 갖거나 갖지 않음)은 예를 들어, 2 내지 10개의 추가적인 혈청형으로부터의, 바람직하게는 담체 단백질에 접합된 다른 혈청형으로부터의 추가적인 E. coli O-항원 다당류, 바람직하게는 생물접합체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 적어도 9개의 생물접합체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공되며, 여기서 각각의 생물접합체는 상이한 혈청형으로부터의 E. coli O-항원 다당류에 공유 연결된 담체 단백질을 포함하고, 여기서 혈청형은 O18A(그리고 O18A 생물접합체는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조된 본 발명에 따른 생물접합체임), O1A, O2, O4-Glc+, O6A, O15, O16, O25B, 및 O75를 포함한다. 특정 실시형태에서, 담체 단백질은 EPA, 예를 들어, 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 EPA이다.
본 발명에 따른 조성물은 선택적으로 면역 반응이 요구되는 추가의 단백질, 탄수화물 및 지질당류를 선택적으로 포함하거나, 이와 조합되거나 이와 함께 투여될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 E. coli에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약제로서의 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역원" 또는 "면역원성" 또는 "항원"은 수용자에게 단독으로, 아주반트와 함께 또는 디스플레이 비히클에 제시되어 투여 시에 면역학적 반응이 생성될 수 있는 분자를 기술하기 위해 상호 교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 항원 또는 조성물에 대한 "면역학적 반응" 또는 "면역 반응"은 체액성 대상체 및/또는 조성물에 존재하는 항원 또는 항원에 대한 세포 면역 반응의 발생을 지칭한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물은 E. coli 감염에 의해서 유발되는 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것이다. 바람직한 실시형태에서, E. coli 감염에 의해서 유발되는 질환은 침습성 장외 병원성 E. coli(ExPEC) 질환(IED)이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "장외 병원성 E. coli" 또는 "ExPEC"는 일반적으로 위장관 외부의 신체 부위에 침입하고, 군집하여 질환을 유도하는 유전적으로 관련된 병원성 E. coli 균주를 지칭한다. ExPEC 박테리아는 요로병원성(UPEC) E. coli, 신생아 수막염(NMEC) E. coli, 패혈증 연관(SePEC) E. coli, 부착성 침습성(AIEC) E. coli, 조류병원성(APEC) E. coli를 포함한다. ExPEC 또는 ExPEC 감염과 연관된 질환은 요로 감염(UTI), 수술 부위 감염, 균혈증, 복부 또는 골반 감염, 예컨대, 복강 내 감염(IAI), 폐렴, 원내 폐렴, 골수염, 봉와직염, 신우신염, 상처 감염, 수막염, 신생아 수막염, 복막염, 담관염, 연조직 감염, 화농근염, 패혈성 관절염 및 패혈증을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
추가 양태에서, 본 발명은 E. coli 감염에 의해서 유발되는 질환, 특히 침습성 장외 병원성 E. coli(ExPEC) 질환(IED)의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 이러한 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "유효량"은 대상체에서 원하는 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 활성 성분 또는 성분의 양을 지칭한다. 유효량은 언급된 목적에 관하여 경험적으로 그리고 일상적인 방식으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 최적의 투여량 범위의 확인을 돕기 위해 시험관내 검정이 임의로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "대상체" 또는 "환자"는 본 발명의 실시형태에 따른 방법 또는 조성물에 의해 백신접종될 것이거나 백신접종된 적이 있는 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "포유동물"은 임의의 포유동물을 포괄한다. 포유동물의 예는 암소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 원숭이, 인간, 등, 가장 바람직하게는 인간을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간 성인이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 성인"은 18세 이상인 인간을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 대상체는 (i) 약 16 내지 약 50세, 예를 들어, 약 16 내지 약 35세 사이의 인간 여성;
(ii) 50세 초과, 또는 55세 초과, 또는 60세 초과, 또는 65세 초과의 성인 인간;
(iii) 재발 UTI를 앓고 있는 인간 대상체;
(iv) E. coli 균혈증 또는 패혈증을 갖거나 이를 획득할 위험이 있는 인간 대상체;
(v) 카테터 사용을 필요로 하는 병태를 갖는 인간 대상체;
(vi) 예정된 수술을 겪는 인간 대상체;
(vii) 폐경 후 여성 인간; 또는
(viii) 당뇨병을 갖는 인간 대상체 중 하나 이상이다.
더 추가의 양태에서, 본 발명은 또한 E. coli 감염에 의해서 유발되는 질환, 특히 침습성 장외 병원성 E. coli(ExPEC) 질환(IED)을 예방 또는 치료하기 위한 백신 또는 약제의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
다양한 간행물, 논문, 및 특허가 배경기술에 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되어 있거나 기재되어 있으며; 이들 참고문헌 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행동, 재료, 장치, 물품 등에 대한 논의는 본 발명에 대한 상황을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러한 논의는 이들 대상 중 임의의 것 또는 모든 것이 개시되거나 청구된 임의의 발명에 대하여 종래 기술의 일부를 형성하는 것을 인정하는 것은 아니다.
서열의 설명
[표 2]
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
실시예
본 발명의 하기 실시예는 본 발명의 성질을 추가로 예시하기 위한 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 제한하지 않으며, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해 결정됨이 이해되어야 한다.
E. coli에서의 생물접합 시스템이 최근 개발되었는데, 여기서 항원 다당류 및 담체 단백질 둘 다가 생체내에서 합성되고 이후에 E. coli에서 발현되는 캄필로박터 제주니 효소인 올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglB의 활성을 통해서 생체내에서 접합된다(문헌[Wacker et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 2006, 103, 7088―93]). 이러한 N-연결된 단백질 글리코실화 시스템은 다양한 다당류를 담체 단백질로 전달할 수 있어서, 이것이 발현되는 박테리아로부터 생물접합체를 정제하는 방법을 가능하게 한다. 생물접합은 E. coli 4가 O-항원 후보 백신을 위한 접합 다당류를 생산하는 데 성공적으로 사용되었다(문헌[Poolman and Wacker, J. Infect. Dis. (2016) v.213(1), pp. 6-13]; WO 2015/124769 WO 2017/035181). 10개의 생물접합체를 포함하는 조성물(O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75, 이 조성물은 ExPEC10V라고 지칭됨)이 기재되어 있고, 이것은 임상 시험 중이다(예를 들어, WO2020/191082A1). 각각의 생물접합체는 O-혈청형 의존적 수율 변동을 나타내는 별도의 생산 균주에 의해 생산된다. 몇몇 O-혈청형의 O-항원 생산 균주의 경우, 수율 개선은 변형된 기질 특이성을 갖는 씨. 제주니 글리코실 트랜스퍼라제 PglB(예를 들어, WO 2016/107818, WO 2016/107819 참조)의 변이체를 발현시킴으로써 얻을 수 있다. 그러나, ExPEC10V 조성물에 대해 생물접합체가 만들어진 10개의 혈청형 중에서 가장 낮은 생물접합체 생산 수율을 나타낸 O18 O-혈청형의 경우, 씨. 제주니 PglB 단백질의 변이체 사용 및 대체 PglB 동족체의 사용은 수율 개선으로 이어지지 않았다. 추가로, O18 생물접합 수율을 증가시키는 것을 목표로 하는 추가 플랫폼 변형은 이 목표에 도달하는 데 성공적이지 않았다. 이러한 변형 중에는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)-1-포스페이트를 운데카프레닐 포스페이트(Und-P)로 전달하여 Und-P-P-GlcNAc를 형성하는 것을 촉매함으로써 O-단위 생합성을 개시하는 단백질인 WecA의 과발현이 있었다. 또한 E. coli K-12 생물접합 플랫폼 균주에 존재하는 천연 Wzz O-항원 사슬 길이 조절인자를, O18A O-항원 사슬 길이를 증가시키는 그램-음성 박테리아 종의 O-항원 사슬 길이 조절인자로 대체하는 것은 생성물 수율을 상당히 증가시키지는 않았다.
실시예 1: 개선된 수율을 갖는 O18 생물접합체 생산 균주
그러나 본 발명자들은 O18 생물접합체 생성물 수율이 증가된 균주를 얻었고, 이들 균주의 Wzy O-항원 중합효소는 기존 O18 생물접합체 생산 균주(서열번호 1을 갖는 Wzy O-항원 중합효소를 가짐)의 Wzy와 비교할 때 아미노산 돌연변이를 가졌다는 것을 발견하였다. 이에 기초하여, 본 발명자들은 O18 생물접합체에 대한 신규한 생산 균주를 생성하였는데, 이는 이전에 기재된(WO 2020/191082 참조) O18 생물접합체 생산 균주와 비교하여 Wzy O-항원 중합효소의 3개의 아미노산 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 특히, 이전에 기재된 균주의 Wzy O-항원 중합효소는 각각 위치 199, 377 및 395에 아미노산 트레오닌(T), 메티오닌(M) 및 발린(V)을 가지고 있었지만(즉, 이전에 기재된 균주의 Wzy O-항원 중합효소는 서열번호 1에 제시되어 있음), 새로운 생산 균주는 각각의 해당 위치에 아미노산 아이소류신(I), 라이신(K) 및 알라닌(A)을 가졌다.
삼투압 충격 후 실행된 200L 생물반응기의 여과된 주변세포질 분획에서 O18 생물접합체의 수율은(즉, 수율의 합리적인 정량화가 가능한 공정의 초기 지점에서) 이전에 기술된 균주에 비해 새로운 균주의 경우 약 2.4배 더 높았다.
4개의 N-글리코실화 공통 서열을 갖는 EPA 담체 단백질의 글리코실화 부위 점유는 이전에 기재된 균주에 비해 새로운 균주에서 증가되었고, 즉, 새로운 균주는 더 많은 디-, 트리, 및 테트라-글리코실화된 EPA 담체 단백질을 유도하였다(예를 들어, 도 1).
실시예 2: 변형된 Wzy O-항원 중합효소의 작제
다음으로 본 발명자들은 Wzy O-항원 중합효소 아미노산 서열의 돌연변이발생 연구에 착수하였고, 본 발명자들은 O18 생물접합체의 수율 및 글리코실화 패턴에 미치는 서열번호 1의 Wzy O-항원 중합효소 서열의 이러한 3개의 위치에서 아미노산 치환의 특정 조합을 확인하였다.
Wzy O-항원 중합효소의 서열번호 1의 아미노산 서열의 위치 199, 377 및 395 중 하나 이상에서 아미노산 치환의 다양한 조합을 표준 절차를 사용하여 부위 지정 돌연변이발생을 사용하여 생성하였다. 생성된 다양한 조합을 표 3에 제시한다.
실시예 3: 변형된 Wzy O-항원 중합효소를 사용한 O-항원 다당류의 생산
E. coli K-12 생물접합체 생산 균주 W3110의 염색체에 삽입된 E. coli 혈청형 O18A(예를 들어, 서열번호 5로서 제공됨)로부터의 rfb 클러스터에 존재하는 wzy 유전자는 상동 재조합 기반 유전자 변형 기술에 의해서 표 3에 제시된 바와 같은 돌연변이를 갖는 서열번호 1을 갖는 변형된 Wzy O-항원 중합효소를 코딩하는 유전자 변이체에 의해서 대체되었다. E. coli 혈청형 O18A로부터의 rfb 클러스터 이외에, E. coli 생물접합체 생산 균주 W3110은 EPA 담체 단백질을 인코딩하는 핵산(서열번호 3을 가짐) 및 올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglB를 인코딩하는 핵산(서열번호 6를 가짐)을 추가로 포함하였다. 예를 들어, WO 2020/191082에 이미 기재된 바와 같이, O18A 다당류 생물접합체를 진탕 플라스크 배양물에서 생산하였고 삼투압 충격을 사용하여 추출하였다.
실시예 4: O18- 생물접합체의 특징규명
O18A 다당류 생물접합체 발현을 위해 유도된 Wzy 변이체(표 3에 표시된 돌연변이 포함)를 함유하는 E. coli K-12 생물접합체 생산 균주 W3110의 진탕 플라스크 배양물로부터의 주변세포질 추출물을 생물접합체의 면역검출을 위해서 O18A 특이적 단클론성 항체를 사용하여 모세관 전기영동 면역검정에 적용하였다. 전체 생성물 신호에 대해서 MW로 결정된 sEPA, 모노글리코실화된 EPA 및 더 높은 형태의 글리코실화된 EPA(디-/트리-/테트라-글리코실화된 EPA)에 해당하는 피크의 신호 강도에 기초하여 각각의 샘플에 대해 상대 정량을 수행하였다(표 3).
[표 3]
Figure pct00008
실시예 5: 신규 생산 균주를 사용한 O18 생물접합체의 생산, 및 면역원성 활성을 갖는 ExPEC9V 및 ExPEC10V 다가 생성물의 생산
O18A 생물접합체의 생산을 위한 새로운 균주를 사용하여 O18A 생물접합체를 생산하고, O18A 생물접합체를 삼투압 충격 후 주변세포질로부터 추출하고, 크로마토그래피를 수행하여 숙주 세포 단백질을 제거하고, 추출된 생물접합체를 사용하여 이러한 O18A 생물접합체를 포함하는 약제학적 조성물을 본질적으로 WO 2020/191082(이 특허의 실시예 8)에 설명된 바와 같은 약물 물질로서 제조하였다.
새로운 O18A 약물 물질을 또한 일부 경우에 O8을 포함하는 E. coli O-항원 O1A, O2, O4(glc+), O6A, O15, O16, O25B, 및 O75의 다른 생물접합체 약물 물질과 혼합하여 다가(9가, 각각 10가) 약물 제품을 얻었다. 이들 약물 제품은 토끼에 투여하는 경우 O-항원이 조성물에 존재하는 E. coli 혈청형에 대한 항체를 유도하였다. 따라서, 본 발명(의 방법)에 따라 (얻어진) 생물접합체 및 조성물은 E. coli에 대한 면역 반응을 유도하는데 적합한 것으로 입증되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Janssen Pharmaceuticals, Inc. <120> Production of E.coli O18 bioconjugates <130> CRU6060EPEPA1 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 396 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Ile Tyr Ile Leu Thr Leu Thr Leu Leu Leu Val Ile Ala Ile Met 1 5 10 15 Phe Ser Leu Leu Gly Thr Lys Ser Arg Ile Thr Ser Pro Leu Pro Leu 20 25 30 His Phe Leu Pro Trp Leu Leu Thr Leu Ile Val Gly Ile Ser Asn Tyr 35 40 45 Asp Gln Phe Tyr Glu Phe Asn Glu Arg Ser Phe Tyr Ser Leu Leu Ile 50 55 60 Trp Phe Thr Val Ile Phe Ile Phe Tyr Phe Ile Gly Glu Leu Val Asn 65 70 75 80 Tyr Lys Arg Glu Asn Ile Asn Val Tyr Tyr Gly Leu Ser His Ile Lys 85 90 95 Tyr Glu Cys Lys Lys Tyr Trp Ile Ile Val Ile Pro Ile Ser Leu Tyr 100 105 110 Thr Ile Phe Glu Ile Tyr Met Val Gly Met Gly Gly Ala Asp Gly Phe 115 120 125 Phe Leu Asn Leu Arg Leu Ala Asn Thr Leu Glu Gly Tyr Thr Gly Lys 130 135 140 Lys Phe Ile Leu Met Pro Ala Val Tyr Pro Leu Met Met Ala Met Phe 145 150 155 160 Ala Ile Val Cys Leu Thr Lys Thr Ser Lys Leu Asn Lys Tyr Ser Ile 165 170 175 Tyr Phe Trp Met Phe Leu Tyr Cys Ile Gly Thr Met Gly Lys Phe Ser 180 185 190 Ile Leu Thr Pro Ile Leu Thr Tyr Leu Ile Ile Tyr Asp Phe Lys His 195 200 205 Arg Leu Lys Val Lys Lys Thr Ile Lys Phe Thr Leu Leu Ile Ile Ile 210 215 220 Leu Ala Leu Thr Leu His Phe Thr Arg Met Ala Glu Asn Asp His Ser 225 230 235 240 Thr Phe Leu Ser Ile Leu Gly Leu Tyr Ile Tyr Ser Pro Ile Ile Ala 245 250 255 Leu Gly Gln Leu Asn Glu Val Asn Ser Ser His Phe Gly Glu Tyr Thr 260 265 270 Phe Arg Phe Ile Tyr Ala Ile Thr Asn Lys Ile Gly Leu Ile Lys Glu 275 280 285 Leu Pro Val Asn Thr Ile Leu Asp Tyr Ser Tyr Val Pro Val Pro Thr 290 295 300 Asn Val Tyr Thr Ala Leu Gln Pro Phe Tyr Gln Asp Phe Gly Tyr Thr 305 310 315 320 Gly Ile Ile Phe Gly Ala Val Leu Tyr Gly Leu Ile Tyr Val Ser Leu 325 330 335 Tyr Thr Ala Gly Val Arg Gly Asn Asn Thr Gln Ala Leu Leu Ile Tyr 340 345 350 Ala Leu Phe Ser Val Ser Ser Ala Thr Ala Phe Phe Ala Glu Thr Leu 355 360 365 Val Thr Asn Leu Ala Gly Asn Val Met Leu Val Leu Cys Thr Ile Leu 370 375 380 Leu Trp Arg Phe Thr Val Ile Cys Lys Pro Val Gln 385 390 395 <210> 2 <211> 1191 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 atgatatata tattaacttt aactcttctt ctagttatag ccataatgtt ttctcttctc 60 ggcacaaaaa gtaggatcac atctccatta cctttgcatt ttttaccatg gttactaact 120 ttaattgtcg ggataagtaa ttacgatcaa ttttacgagt ttaatgaaag aagcttttac 180 tctttgttga tttggtttac agttattttt atattttatt tcatagggga actggttaat 240 tataaacgtg aaaatataaa tgtttattat ggtctttcac atattaaata tgaatgtaaa 300 aaatattgga tcattgtcat cccaatttca ttatatacca ttttcgaaat atatatggtt 360 ggtatggggg gagcagatgg attctttctc aatttacgtc ttgcaaatac attggagggc 420 tatacgggta aaaaatttat cttaatgcct gctgtatatc ctctaatgat ggctatgttc 480 gcaattgttt gtctaacaaa aacttccaaa ttaaataaat actccattta tttctggatg 540 tttttgtatt gtattggcac aatgggaaaa ttttcaatat taacgccaat attgacatat 600 ttaattattt atgacttcaa acatagatta aaagtaaaaa aaacaataaa gtttacattg 660 ttgataatta tattagcttt aactttgcat tttacacgta tggctgagaa tgaccactca 720 acatttttat ctattttagg gctctatatt tattcaccaa taattgcttt aggccagttg 780 aatgaagtaa atagtagtca ttttggtgag tatacgttta gattcatata tgctataact 840 aataaaattg gccttattaa agaattgcca gtaaatacta ttcttgacta ttcatacgtt 900 cctgtaccaa caaatgtata tactgcactt caaccatttt accaggattt tggttatact 960 ggcatcatat ttggagcagt attatacgga ctaatatatg tgagtttata cacggccggt 1020 gttcgtggaa ataatacaca ggcattactg atttacgcat tgttttcagt tagcagtgca 1080 acggctttct tcgctgaaac gctagtaacg aatttagctg gaaatgtgat gttagtatta 1140 tgtaccatct tactatggcg atttacagta atatgcaaac cagtacagta a 1191 <210> 3 <211> 652 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Detoxified EPA protein comprising 4 optimized N-glycosylation sequences <400> 3 Gly Ser Gly Gly Gly Asp Gln Asn Ala Thr Gly Ser Gly Gly Gly Lys 1 5 10 15 Leu Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys 20 25 30 Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp 35 40 45 Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met 50 55 60 Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala 65 70 75 80 Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val 85 90 95 Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly 100 105 110 Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser 115 120 125 Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser 130 135 140 His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala 145 150 155 160 Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn 165 170 175 Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val 180 185 190 Met Ala Gln Ala Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala 195 200 205 Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn 210 215 220 Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys 225 230 235 240 Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile 245 250 255 Lys Asp Asn Asn Asn Ser Thr Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His 260 265 270 Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys 275 280 285 His Leu Pro Leu Glu Ala Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp 290 295 300 Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu 305 310 315 320 Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg 325 330 335 Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile 340 345 350 Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala 355 360 365 Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly 370 375 380 Ala Ala Ser Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Lys Asp 385 390 395 400 Gln Asn Arg Thr Lys Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp 405 410 415 Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp 420 425 430 Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val 435 440 445 Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val 450 455 460 Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val 465 470 475 480 Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg 485 490 495 Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln 500 505 510 Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu 515 520 525 Arg Val Tyr Val Pro Arg Trp Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Gly 530 535 540 Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile 545 550 555 560 Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu 565 570 575 Glu Gly Gly Arg Val Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr 580 585 590 Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly 595 600 605 Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala 610 615 620 Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu 625 630 635 640 Lys Leu Gly Ser Gly Gly Gly Asp Gln Asn Ala Thr 645 650 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized N-glycosylation consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any natural amino acid except Pro <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any natural amino acid except Pro <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be Ser or Thr <400> 4 Xaa Xaa Asn Xaa Xaa 1 5 <210> 5 <211> 13039 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 5 atgacgaatt taaaagcagt tattcctgta gcgggtcttg ggatgcatat gttgcctgcc 60 actaaggcga ttcccaaaga gatgctaccg atcgtcgaca agccaatgat tcagtacatc 120 gttgacgaga ttgtggctgc agggatcaaa gaaatcctcc tggtaactca cgcgtccaag 180 aacgcggtcg aaaaccactt cgacacctct tatgaattag aatctctcct tgaacagcgc 240 gtgaagcgtc aactgctggc ggaagtacag tccatttgcc cgccgggcgt gacaattatg 300 aacgtgcgtc agggcgaacc tttaggtttg ggccactcca ttttatgtgc acgacctgcc 360 attggtgaca atccatttgt cgtggtgctg ccagacgttg tgatcgacga cgccagcgcc 420 gacccgctgc gctacaacct tgctgccatg attgcgcgct ttaacgaaac tggccgcagc 480 caggttctgg caaaacgcat gccgggcgat ctctctgaat actccgtcat ccagactaaa 540 gaaccgcttg atcgcgaagg taaagtcagc cgcattgttg aatttatcga aaaaccggat 600 cagccgcaga ccctggactc agacatcatg gctgtagggc gttatgtgct ttctgccgat 660 atttggcctg aactggagcg tactcaacct ggagcatggg gacgtattca gttgactgat 720 gccattgctg agttggcaaa aaaacaagca gttgacgcaa tgctgatgac tggggacagt 780 tacgactgcg gaaagaaaat gggttatatg caagcgtttg tgaagtatgg gctgcgtaac 840 ctaaaagaag gggcgaagtt ccgtaaaggg attgagaagc tgttaagcga ataatgaaaa 900 tctgaccgga tgtaacggtt gataagaaaa ttataacggc agtgaagatt agcggcgaaa 960 gtaatttgtt gcgaattttc ctgccgttgt tttatataaa caatcagaat aacaacgagt 1020 tagcaacagg attatcgtca aagttttcca ggattttcct tgtttccaga gcggattggt 1080 aagacaatta gcttctgaat ttttcgggtt tagcgcgagt gggtaacact cgtcacatcg 1140 taggcatgca tgcagtgctc tggtagctgt aaagccaggg gcggtagcgt gcattaatac 1200 ctctattaat caaactgaga gccgcttatt tcacagcatg ctctgaagta atatggaata 1260 aattaagtga aaatacttgt tactggtggc gcaggattta ttggttctgc tgtagttcgt 1320 cacattataa atgatacgca ggatagtgtt gttaatgtcg ataaattaac gtacgccgga 1380 aacctggaat cacttgcaga tgtttctgat tctgaacgct atttctttga acatgcggat 1440 atttgtgatg cagctgcaat ggcacggatt tttgctcagc atcagccgga tgcagtgatg 1500 cacctggcag ctgaaagcca tgttgaccgt tcaattacag gccctgcggc atttattgaa 1560 accaatattg ttggtactta tgtcctttta gaagcggctc ggaattactg gtctgcactt 1620 gatggcgaca agaaaaacag cttccgtttt catcatattt ctactgacga agtctatggt 1680 gatttgcctc atcctgacga ggtaaataat aaagaaggat tacccttatt tactgagacg 1740 acagcctacg caccaagcag cccttattct gcatcaaaag cgtccagcga tcatttagtc 1800 cgtgcgtgga aacgtaccta tggtttaccg accattgtga ctaattgctc taacaattat 1860 ggtccttatc atttcccgga aaaattgatt ccattggtta ttctgaatgc tctggaaggt 1920 aaaggattac ctatttatgg aaaaggcgat caaattcgcg actggctgta tgttgaagat 1980 catgcgcgtg cgttatatac cgtcgtaacc gaaggtaaag cgggtgaaac ttataacatt 2040 ggtggacaca acgaaaagaa aaacatcgat gtagtgctca ctatttgtga tttgttggat 2100 gagattgtcc cgaaagagaa atcttaccgc gagcaaatta cttatgttgc cgatcgtccg 2160 ggacacgatc gacgttatgc gattgatgct gagaagattg gtcgcgaatt gggatggaaa 2220 ccacaggaaa cgtttgagag cgggattcgt aaaactgtgg aatggtatct gtccaataca 2280 aaatgggttg ataatgtgaa aagtggtgcc tatcaatcgt ggattgaaca gaactatgag 2340 ggccgccact aatgaatatc ctcctttttg gcaaaacagg gcaggttggt tgggaactac 2400 agcgtgctct ggcacctctg ggtaatttga ttgctcttga tgttcactcc actgattact 2460 gtggtgattt tagtaaccct gaaggtgtgg ctgaaaccgt tagaagcatt cggcctgata 2520 ttattgtcaa cgcagccgct cacaccgcag tagacaaagc agaatcagaa ccggagtttg 2580 cacaattact gaacgcgacg agtgtcgaag cgatcgcgaa agcagccaat gaagtcggcg 2640 cttgggttat tcactactct actgactacg tatttccggg gaccggtgaa ataccatggc 2700 aggaggagga tgcaaccgca ccgctaaatg tttacggtga aaccaagtta gcaggagaaa 2760 aagcattaca agagcattgt gcgaagcacc ttattttccg gaccagctgg gtctatgcag 2820 gtaaaggaaa taacttcgcc aaaacgatgt tgcgtctggc aaaagagcgt gaagaattag 2880 ccgttattaa tgatcagttt ggtgcgccaa ctggcgcaga gttgctggct gattgtacgg 2940 cacatgccat tcgtgtggca ctgaataaac cggaagtcgc aggtttgtac catctggtag 3000 ccagtggtac cacaacctgg cacgattatg ctgcgctggt ttttgaagag gcgcgcaaag 3060 caggcattcc ccttgcactc aacaagctca acgcagtacc aacaacagtc tatcctacac 3120 cagctcgtcg tccacataac tctcgcctta atacagaaaa atttcagcag aactttgcgc 3180 ttgtcttgcc tgactggcag gttggtgtga aacgcatgct caacgaatta tttacgacta 3240 cagcaattta atagtttttg catcttgttc gtgatggtgg aacaagatga attaaaagga 3300 atgatggaat gaaaacgcgt aaaggtatta ttttagcggg tggttctggt acacgtcttt 3360 atcctgtgac tatggctgtc agtaaacagc tgttaccgat ttatgataaa ccgatgatct 3420 attacccgct ctctacactg atgttggcgg gtattcgcga tattttgatt atcagcacgc 3480 cacaggatac tcctcgtttt caacaactgc tgggtgatgg gagccagtgg gggctaaatc 3540 ttcactacaa agtgcaaccg agtccggatg gtcttgcgca ggcatttatc atcggtgaag 3600 agtttatcgg tggtgatgat tgtgctttgg tacttggtga taatatcttc tacggtcacg 3660 acctgcctaa gttaatggat gccgctgtta acaaagaaag tggtgcaacg gtatttgcct 3720 atcacgttaa tgatcctgaa cgctatggtg tcgttgagtt tgataaaaac ggtacggcaa 3780 ttagcctcga agaaaaaccg ctacaaccaa aaagtaatta tgcagtaacc gggctttatt 3840 tctatgataa ctacgttgtg gaaatggcga aaaatcttaa gccttctgcc cgcggtgaac 3900 tggaaattac cgatattaac cgtatttata tggaacaggg gcatttatct gttgccatga 3960 tgggacgtgg ttatgcatgg ctggacacgg ggacacatca gagtcttatt gaagcaagca 4020 acttcattgc caccattgaa gagcgccagg gactaaaggt ttcctgccca gaagaaattg 4080 cttatcgtaa aggatttatt gacgcagagc aggttaaggt attagccgaa ccgctgaaga 4140 aaaacgctta tggtcagtat ttgctgaaaa tgattaaagg ttagtaataa aatgaatgtt 4200 attaaaacag aaattccaga cgtactgatt tttgaaccga aagtttttgg tgacgagcgc 4260 ggtttctttt tcgaaagcta taaccagagg gtttttgagg aagctgtagg tcgcaaagtt 4320 gagtttgttc aggataacca ttctaaatcg agaaaaggag tattgcgggg attgcattat 4380 caattagagc cgtatgcgca agcaaaactt gtgcgttgca ttgagggtga agtatttgat 4440 attgctgtag atatacggaa gtcatctcca ttttttggta aatgggttgg tgtaacatta 4500 tccgctgaaa ataaacgtca attatggatc cctgaagggt ttgctcatgg ttttgtggtg 4560 attagtgata ctgcggaatt tgtctataaa acgaacaatt attacagtca acaagcagag 4620 cgaagcataa tttttgatga taaagactta gggattgctt ggccattgaa tactcattat 4680 attctttcag aaaaagattt aaatgcgcca acatttaaga aaatatcgag taatgagtat 4740 tttaaatgag tttaatcaaa aacagttttt ggaacctttg cgggtatgta cttccagcta 4800 ttgtgacact accagctttg ggtattatgg ggcgaaaatt aggcccagaa ttatttggtg 4860 tattcacttt ggcattagct gttgtgggtt atgcaagcat ttttgatgca ggccttactc 4920 gcgcagtgat acgagaagtc gcaattgaaa aagataatga agaaaataag ttgaaaatta 4980 tttcttcagc gacagttgta attatttatt tgagtttggc cgcctcactc ttattatttt 5040 tttttagtgg tcatatcgca ttgctactga acattagtga gacttttttt cataatgtaa 5100 gtgtctcgct taaaattctc gcagcatcca taccattatt tttgattact caaatatggt 5160 tgtcaatttt agaaggtgaa gaaagatttg gtttacttaa tatctacaaa tcaattacgg 5220 gagtgatatt agcaatctca ccggcattat ttatacttat taaaccctct ttgatgtatg 5280 cgataatagg cttagttcta gcaaggtttt tatgttttat tttggctttt ataatttgtc 5340 acgataaagt gcttaaagct aaactaacaa tcgatatacc aacaattaaa agattgttta 5400 tgttcggtgg ttggattaca gtaagtaata tcatcagccc tgtgctatca tattttgata 5460 ggtttattgt ttcaaatcaa cttggggctg ctaatgttgc tttttatact gcaccatcag 5520 aaattatttc tcggcttagt ataattccag gtgcgttttc aagagcctta tttccaagat 5580 tagctaatgc aaataattcc gctgaaagat ataaaacgaa aagattaatt acaatttcac 5640 ttttaataat catcacccct attttttgta ttggcgtgtt attttcagag aagataatgg 5700 ttttatggat gggggcatca ttttttggtg agcctggttt ggtattatca atattactga 5760 ttggctttat ttttaatgga ttggcacaag taccatttgc cagtattcaa tcccgaggtc 5820 atgctaagat aactgcattt gttcatctct tagagttgtt tccttattta ttacttttat 5880 tttacctcat aaaagcacat ggggttgttg gcgcgggtat tgcgtggtca gtgaggatga 5940 tagtagatta tatagcatta agtcttttgg acggtaagta tattaataaa taaaattcaa 6000 aatgcaagtt aataactcat ggctttattt gggtaggtga caatttataa tgatatatat 6060 attaacttta actcttcttc tagttatagc cataatgttt tctcttctcg gcacaaaaag 6120 taggatcaca tctccattac ctttgcattt tttaccatgg ttactaactt taattgtcgg 6180 gataagtaat tacgatcaat tttacgagtt taatgaaaga agcttttact ctttgttgat 6240 ttggtttaca gttattttta tattttattt cataggggaa ctggttaatt ataaacgtga 6300 aaatataaat gtttattatg gtctttcaca tattaaatat gaatgtaaaa aatattggat 6360 cattgtcatc ccaatttcat tatataccat tttcgaaata tatatggttg gtatgggggg 6420 agcagatgga ttctttctca atttacgtct tgcaaataca ttggagggct atacgggtaa 6480 aaaatttatc ttaatgcctg ctgtatatcc tctaatgatg gctatgttcg caattgtttg 6540 tctaacaaaa acttccaaat taaataaata ctccatttat ttctggatgt ttttgtattg 6600 tattggcaca atgggaaaat tttcaatatt aacgccaata ttgacatatt taattattta 6660 tgacttcaaa catagattaa aagtaaaaaa aacaataaag tttacattgt tgataattat 6720 attagcttta actttgcatt ttacacgtat ggctgagaat gaccactcaa catttttatc 6780 tattttaggg ctctatattt attcaccaat aattgcttta ggccagttga atgaagtaaa 6840 tagtagtcat tttggtgagt atacgtttag attcatatat gctataacta ataaaattgg 6900 ccttattaaa gaattgccag taaatactat tcttgactat tcatacgttc ctgtaccaac 6960 aaatgtatat actgcacttc aaccatttta ccaggatttt ggttatactg gcatcatatt 7020 tggagcagta ttatacggac taatatatgt gagtttatac acggccggtg ttcgtggaaa 7080 taatacacag gcattactga tttacgcatt gttttcagtt agcagtgcaa cggctttctt 7140 cgctgaaacg ctagtaacga atttagctgg aaatgtgatg ttagtattat gtaccatctt 7200 actatggcga tttacagtaa tatgcaaacc agtacagtaa ccattctaat ggccacctac 7260 aatggcgagg ccttcatcaa aaatcagatt ttgtcactac aacaacaaac attttctaac 7320 tggcggttat ttattcagga tgatgggtct acagacaata ctatatctat aataaaaaac 7380 ttccaaaaat ctgactccag aattcggcta gttgatgata atttgaaagg tcaaggtgca 7440 ggaaaaaatt ttttatcgct gataaagtac agcgagacag attatacaat ttattgtgac 7500 caagatgata tttggttaga aaacaaaata tttgaattag taaagtatgc aaatgaaatt 7560 aaattgaatg tatcagatgc gccttcgcta gtttatgctg atggctatgc ttatatggat 7620 ggtgagggta caatcgattt ttctgggata tctaacaatc atgctgatca attaaaggat 7680 tttctttttt ttaatggtgg ataccaagga tgttctatta tgttcaatcg tgcaatgacc 7740 aaatttcttc tgaattatcg aggatttgta tatctacatg acgatatcac aacattagct 7800 gcatacgctc ttggtaaagt ttattttctc ccgaaatacc ttatgttata tagacagcac 7860 acgaatgcgg taactggtat caaaacattc cgcaatggat tgacttctaa atttaaatca 7920 ccagtaaact atcttttatc acgaaaacat tatcaggtaa aaaaatcttt ttttgaatgt 7980 aacagctcta tcttatcaga gacgaataaa aaagtttttt tggattttat ttcattttgt 8040 gaatcaaata ataaatttac agattttttt aagttatggc gaggtgggtt tagattaaat 8100 aacagtagaa ctaaattatt attaaaattc ttaatacgga gaaaatttag cgaatgattt 8160 caatacttac acctactttt aatcggcaac atactttatc aaggctattc aattctctta 8220 tattacaaac tgataaagat tttgagtgga taataattga tgatggtagt atagatgcaa 8280 cagcggtact tgtagaagat tttagaaaaa aatgtgattt tgacttgatt tattgctatc 8340 aggaaaataa tggtaagccc atggctttaa acgctggtgt taaagcttgt agaggcgatt 8400 atatctttat tgttgacagt gatgatgcac taactcccga tgccataaaa ttaattaaag 8460 aatcaataca tgattgctta tctgagaagg aaagtttcag cggagtcggt tttagaaaag 8520 catatataaa aggggggatt attggtaatg atttaaataa ttcttcagaa catatatact 8580 atttaaatgc gactgagatt agcaatttaa taaatggtga tgttgcatat tgttttaaaa 8640 aagaaagttt ggtaaaaaat ccattccccc gtatagaaga tgaaaaattt gttccagaat 8700 tatatatttg gaataaaata actgacaagg cgaagattcg atttaacata agcaaagtta 8760 tatatctttg tgagtatctt gatgatggtc tttctaaaaa tttccataac cagcttaaaa 8820 aatacccaaa ggggtttaag atttattaca aagatcaaag aaaacgagag aaaacttata 8880 taaaaaaaac aaagatgcta attagatatt tgcaatgttg ttattatgag aaaataaaat 8940 gaaaatacta tttgtcatta caggtttagg ccttggaggt gctgagaagc aggtttgtct 9000 tttagctgat aaattaagtt taagcgggca ccatgtaaag attatttcac ttggacatat 9060 gtctaataat aaagtctttc ctagcgaaaa taatgttaat gtcattaatg taaatatgtc 9120 aaaaaacatt tctggagtta taaaaggttg tgtcagaatt agagatgtta tagctaattt 9180 caaaccagac attgtacaca gtcatatgtt tcatgcaaac attatcacta gattgtctgt 9240 aattggaatc aaaaacagac ctggtattat atcaactgca cataataaaa atgaaggtgg 9300 gtatttcaga atgctcacat atagaataac cgattgttta agtgattgtt gtacaaatgt 9360 tagcaaagaa gcagtggatg agtttttacg gataaaagcc tttaatcccg ctaaagcaat 9420 tactatgtat aatgggatag ataccaataa atttaaattt gatttattgg caaggaggga 9480 aattcgagac ggtattaata taaaaaatga tgatatatta ttacttgctg caggtcgttt 9540 aacgttagct aaagattatc ctaatttatt gaatgcaatg actctgcttc ctgaacactt 9600 taaacttatt attattggtg atggtgaatt gcgtgacgaa attaatatgc ttataaaaaa 9660 attgcaatta tctaataggg tgtccttgtt gggagttaaa aaaaatattg ctccctattt 9720 ttctgcatgt gatatttttg ttctctcttc tcgttgggaa ggatttggat tagtcgtggc 9780 agaagctatg tcatgtgagc gaattgttgt tggcacggat tcagggggag taagagaagt 9840 tattggtgac gatgattttc ttgtacccat atctgattca acacaacttg caagcaaaat 9900 tgaaaaattg tctttgagcc agatacgtga tcacattggt tttcggaatc gtgagcgtat 9960 tttaaaaaat ttctcaatag atactattat tatgcagtgg caagaactct atggaactat 10020 aatttgctca aaacatgaaa ggtagattta tatttggaac gtgtcttttg tttgaattta 10080 attcaatctc aattgagatt tttgtatttc aaaaatacca tcatagctaa cgatgattgg 10140 tatttatttt aagatgcttt ctataaatat attgacgttt ttaatgcgcc gaaacgattg 10200 ggctgggaac agagaagtaa aactgttttg agaatgaaga gtttttgaga tgtttatgga 10260 tattaaaaat tgatccagtg aattaattat ttataataaa tcaagattta atgttaataa 10320 atgataatct tttctgacac tcatattaat tatgagtggt acgtttggta aacggtaaac 10380 tattatatga cagctagaac aactaaagtt ttgcacttac aattactccc actcttaagt 10440 ggcgttcaaa gggtaacatt aaacgaaatt agtgcgttat atactgatta tgattataca 10500 ctagtttgct caaaaaaagg tccactaaca aaagcattgc tggaatatga tgtcgattgt 10560 cattgtatcc ccgaacttac gagagaaatt accgtaaaga atgattttaa agcattgttc 10620 aagctttata agttcataaa aaaagaaaaa tttgacattg tgcatacaca ttcttcaaaa 10680 acaggtattt tggggcgagt tgctgccaaa ttagcacgtg ttggaaaggt gatccacact 10740 gtacatggtt tttcttttcc agccgcatct agtaaaaaaa gttattacct ttattttttc 10800 atggaatgga tagcaaagtt ctttacggat aagttaatcg tcttgaatgt agatgatgaa 10860 tatatagcaa taaacaaatt aaaattcaag cgggataaag tttttttaat tcctaatgga 10920 gtagacactg ataagttttc tcctttagaa aataaaattt atagtagcac cttgaatcta 10980 gtaatggttg gtagattatc caagcaaaaa gatcctgaga cattattgct tgctgttgaa 11040 aaactgctga atgaaaatgt taatgttaag ctgacacttg taggagatgg tgaactaaaa 11100 gaacagttag aaagcaggtt caaacggcaa gatggacgta taatttttca tggatggtca 11160 gataacattg ttaatatttt aaaagttaat gatcttttta tattaccttc tctttgggag 11220 ggtatgccat tagcaatttt agaagcattg agctgtggac ttccatgtat agtcactaat 11280 attccaggta ataatagctt aatagaagat ggctataatg gttgtttgtt tgaaattaga 11340 gattgtcagt tattatctca aaaaatcatg tcatatgttg gtaagccaga actgattgca 11400 cagcaatcta ccaatgcacg atcatttatt ctgaaaaatt atggattagt taaaagaaat 11460 aataaggtca gacagctata 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Lys Glu Tyr Leu Lys Asn Pro Tyr Leu Val Leu Phe Ala 1 5 10 15 Met Ile Ile Leu Ala Tyr Val Phe Ser Val Phe Cys Arg Phe Tyr Trp 20 25 30 Val Trp Trp Ala Ser Glu Phe Asn Glu Tyr Phe Phe Asn Asn Gln Leu 35 40 45 Met Ile Ile Ser Asn Asp Gly Tyr Ala Phe Ala Glu Gly Ala Arg Asp 50 55 60 Met Ile Ala Gly Phe His Gln Pro Asn Asp Leu Ser Tyr Tyr Gly Ser 65 70 75 80 Ser Leu Ser Ala Leu Thr Tyr Trp Leu Tyr Lys Ile Thr Pro Phe Ser 85 90 95 Phe Glu Ser Ile Ile Leu Tyr Met Ser Thr Phe Leu Ser Ser Leu Val 100 105 110 Val Ile Pro Thr Ile Leu Leu Ala Asn Glu Tyr Lys Arg Pro Leu Met 115 120 125 Gly Phe Val Ala Ala Leu Leu Ala Ser Ile Ala Asn Ser Tyr Tyr Asn 130 135 140 Arg Thr Met Ser Gly Tyr Tyr Asp Thr Asp Met Leu Val Ile Val Leu 145 150 155 160 Pro Met Phe Ile Leu Phe Phe Met Val Arg Met Ile Leu Lys Lys Asp 165 170 175 Phe Phe Ser Leu Ile Ala Leu Pro Leu Phe Ile Gly Ile Tyr Leu Trp 180 185 190 Trp Tyr Pro Ser Ser Tyr Thr Leu Asn Val Ala Leu Ile Gly Leu Phe 195 200 205 Leu Ile Tyr Thr Leu Ile Phe His Arg Lys Glu Lys Ile Phe Tyr Ile 210 215 220 Ala Val Ile Leu Ser Ser Leu Thr Leu Ser Asn Ile Ala Trp Phe Tyr 225 230 235 240 Gln Ser Ala Ile Ile Val Ile Leu Phe Ala Leu Phe Ala Leu Glu Gln 245 250 255 Lys Arg Leu Asn Phe Met Ile Ile Gly Ile Leu Gly Ser Ala Thr Leu 260 265 270 Ile Phe Leu Ile Leu Ser Gly Gly Val Asp Pro Ile Leu Tyr Gln Leu 275 280 285 Lys Phe Tyr Ile Phe Arg Ser Asp Glu Ser Ala Asn Leu Thr Gln Gly 290 295 300 Phe Met Tyr Phe Asn Val Asn Gln Thr Ile Gln Glu Val Glu Asn Val 305 310 315 320 Asp Leu Ser Glu Phe Met Arg Arg Ile Ser Gly Ser Glu Ile Val Phe 325 330 335 Leu Phe Ser Leu Phe Gly Phe Val Trp Leu Leu Arg Lys His Lys Ser 340 345 350 Met Ile Met Ala Leu Pro Ile Leu Val Leu Gly Phe Leu Ala Leu Lys 355 360 365 Gly Gly Leu Arg Phe Thr Ile Tyr Ser Val Pro Val Met Ala Leu Gly 370 375 380 Phe Gly Phe Leu Leu Ser Glu Phe Lys Ala Ile Met Val Lys Lys Tyr 385 390 395 400 Ser Gln Leu Thr Ser Asn Val Cys Ile Val Phe Ala Thr Ile Leu Thr 405 410 415 Leu Ala Pro Val Phe Ile His Ile Tyr Asn Tyr Lys Ala Pro Thr Val 420 425 430 Phe Ser Gln Asn Glu Ala Ser Leu Leu Asn Gln Leu Lys Asn Ile Ala 435 440 445 Asn Arg Glu Asp Tyr Val Val Thr Trp Trp Asp Tyr Gly Tyr Pro Val 450 455 460 Arg Tyr Tyr Ser Asp Val Lys Thr Leu Val Asp Gly Gly Lys His Leu 465 470 475 480 Gly Lys Asp Asn Phe Phe Pro Ser Phe Ala Leu Ser Lys Asp Glu Gln 485 490 495 Ala Ala Ala Asn Met Ala Arg Leu Ser Val Glu Tyr Thr Glu Lys Ser 500 505 510 Phe Tyr Ala Pro Gln Asn Asp Ile Leu Lys Thr Asp Ile Leu Gln Ala 515 520 525 Met Met Lys Asp Tyr Asn Gln Ser Asn Val Asp Leu Phe Leu Ala Ser 530 535 540 Leu Ser Lys Pro Asp Phe Lys Ile Asp Thr Pro Lys Thr Arg Asp Ile 545 550 555 560 Tyr Leu Tyr Met Pro Ala Arg Met Ser Leu Ile Phe Ser Thr Val Ala 565 570 575 Ser Phe Ser Phe Ile Asn Leu Asp Thr Gly Val Leu Asp Lys Pro Phe 580 585 590 Thr Phe Ser Thr Ala Tyr Pro Leu Asp Val Lys Asn Gly Glu Ile Tyr 595 600 605 Leu Ser Asn Gly Val Val Leu Ser Asp Asp Phe Arg Ser Phe Lys Ile 610 615 620 Gly Asp Asn Val Val Ser Val Asn Ser Ile Val Glu Ile Asn Ser Ile 625 630 635 640 Lys Gln Gly Glu Tyr Lys Ile Thr Pro Ile Asp Asp Lys Ala Gln Phe 645 650 655 Tyr Ile Phe Tyr Leu Lys Asp Ser Ala Ile Pro Tyr Ala Gln Phe Ile 660 665 670 Leu Met Asp Lys Thr Met Phe Asn Ser Ala Tyr Val Gln Met Phe Phe 675 680 685 Leu Gly Asn Tyr Asp Lys Asn Leu Phe Asp Leu Val Ile Asn Ser Arg 690 695 700 Asp Ala Lys Val Phe Lys Leu Lys Ile 705 710

Claims (16)

  1. 그램-음성 박테리아 숙주 세포로서,
    (a) 적어도 하나의 글리코실화 공통 서열을 포함하는 담체 단백질;
    (b) E. coli O18 rfb 유전자좌; 및
    (c) 올리고사카릴트랜스퍼라제를 포함하되;
    상기 세포는 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은,
    i) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 아이소류신, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 알라닌;
    ii) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 트레오닌, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 발린;
    iii) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 트레오닌, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 알라닌;
    iv) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 아이소류신, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 발린; 또는
    v) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 아이소류신, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 메티오닌, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 알라닌을 포함하는, 그램-음성 박테리아 숙주 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드는, 상기 아미노산 서열이
    i) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 아이소류신, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 알라닌;
    ii) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 트레오닌, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 발린;
    iii) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 트레오닌, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 알라닌;
    iv) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 아이소류신, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 발린; 또는
    v) 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 아이소류신, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 메티오닌, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 알라닌을 포함하는 것을 제외하고는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 숙주 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 1의 위치 199에 상응하는 위치의 아이소류신, 서열번호 1의 위치 377에 상응하는 위치의 라이신, 및 서열번호 1의 위치 395에 상응하는 위치의 알라닌을 포함하는, 숙주 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터가 상기 숙주 세포의 게놈에 통합되는, 숙주 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 에쉐리키아 콜라이 숙주 세포인, 숙주 세포.
  6. 제5항에 있어서, 상기 숙주 세포는 E. coli K-12 균주, 바람직하게는 균주 W3110인, 숙주 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 상기 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 서열번호 6과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
    b) 상기 담체 단백질은 서열번호 3을 포함함; 및
    c) E. coli O18 rfb 유전자좌는 혈청형 O18A를 갖는 E. coli 균주의 rfb 유전자좌임 중 적어도 하나인, 숙주 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 숙주 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 Wzy O-항원 중합효소 활성을 갖고 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 Wzy O-항원 중합효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 E. coli O18 rfb 유전자좌를 포함하는, 숙주 세포.
  10. 담체 단백질에 접합된 E. coli O18 항원 다당류의 생물접합체(bioconjugate)의 생산 방법으로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 배양하여 상기 생물접합체를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 생물접합체의 회수를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 회수된 생물접합체를 약제학적 조성물로 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 담체 단백질에 접합된 E. coli O-항원 다당류의 하나 이상의 추가적인 생물접합체를 약제학적 조성물에 첨가하여 다가 생물접합체 조성물을 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 생물접합체는, E. coli 혈청형 O1, O2, O4, O6, O8, O15, O16, O25 및 O75로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 O-항원 다당류를 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 다가 생물접합체 조성물은,
    (i) 담체 단백질에 접합된 E. coli O18A 항원 다당류의 생물접합체;
    (ii) 담체 단백질에 접합된 E. coli O1A 항원 다당류의 생물접합체;
    (iii) 담체 단백질에 접합된 E. coli O2 항원 다당류의 생물접합체;
    (iv) 담체 단백질에 접합된 E. coli 글리코실화된 O4 항원 다당류의 생물접합체;
    (v) 담체 단백질에 접합된 E. coli O6A 항원 다당류의 생물접합체;
    (vi) 담체 단백질에 접합된 E. coli O15 항원 다당류의 생물접합체;
    (vii) 담체 단백질에 접합된 E. coli O16 항원 다당류의 생물접합체;
    (viii) 담체 단백질에 접합된 E. coli O25B 항원 다당류의 생물접합체; 및
    (ix) 담체 단백질에 접합된 E. coli O75 항원 다당류의 생물접합체를 포함하되,
    바람직하게는 각각의 생물접합체 내의 상기 담체 단백질은 서열번호 3을 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 다가 생물접합체 조성물은,
    (x) 담체 단백질에 접합된 E. coli O8 항원 다당류의 생물접합체를 추가로 포함하되,
    바람직하게는 상기 담체 단백질은 서열번호 3을 포함하는, 방법.
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