JP2022541911A

JP2022541911A - バイオコンジュゲートグリコシル化の定量化

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Publication number: JP2022541911A
Application number: JP2022503918A
Authority: JP
Inventors: ビアジーニ，マッシミリアーノ; エレオノーラフォンターナ，ルチア; ガレア，アンナ; ノライス，ナタリー; スカーセッリ，マリア
Original assignee: グラクソスミスクラインバイオロジカルズソシエテアノニム
Priority date: 2019-07-23
Filing date: 2020-07-21
Publication date: 2022-09-28
Also published as: MX2022000880A; US20220257751A1; EP4004224A1; CA3147700A1; CN114302890A; WO2021013854A1; BR112022001034A2; EP3770269A1

Abstract

本発明は、バイオコンジュゲートの特徴付けのため、特にグリコシル化レベルの測定のための分析ツール、及びグリコシル化配列の絶対的な定量化のための方法、並びにそのような方法に用いられる配列及びグリコシル化部位を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、バイオコンジュゲートの特徴付け、特にグリコシル化レベルの測定のための分析ツールに関する。

複合糖質ワクチンは、莢膜のある細菌によって引き起こされる感染性疾患の予防において有効であり、かつ費用効果がよいことを証明されている。最近10年間で、複合糖質ワクチン製造のために、細菌のN-グリコシル化を利用する技術を含めた新しいアプローチがとられるようになっている。これら「バイオコンジュゲーション」技術のうち最も開発が進んでいるのは、大腸菌(Escherichia coli)での糖タンパク質の生産に基づくものであり、その際、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)のグリコシル化機構PglBが、病原体多糖鎖生合成に関与する酵素、及びPglBのコンセンサス配列を含有するように操作されている多糖のアクセプターである標的担体タンパク質(Wackerら、2002年、Science、298巻:1790～3頁)と同時発現される。

バイオコンジュゲーション技術の主な強みは、担体タンパク質配列の上のグリコシル化の部位の選択性である。これは、担体タンパク質配列特異的なアミノ酸を選択的に導入し、多糖鎖への選択的なコンジュゲーションのための1以上の有効なコンセンサス配列をつくることによって達成される。PglBのコアコンセンサス配列は、D/E-X-N-Z-S/Tであり、配列中、X及びZは、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸である(Wackerら、2002年、Science、298巻:1790～3頁参照)が、K-D/E-X-N-Z-S/T-Kという延長されたコンセンサス配列は、より高い効率でグリコシル化され、より広く使われている(例えばWO2019/121924及びWO2019/121926を参照)。

この技術は、特に担体タンパク質が、担体と抗原の二重の役割を有するように選択される場合、それが重要な防御エピトープを保存することができるので、ワクチンを開発する上で特に興味深い。さらに、バイオコンジュゲーションは、それが病原体を取り扱う必要性を減じ、生産プロセス工程の削減を可能にし、時間及び資源の消費が少ないので、化学コンジュゲーションと比較して、ワクチンを製造する際の大規模生産に、より高い適合性を示している。

最近、グラム陰性病原体感染(サルモネラ菌(Salmonella enterica)、シゲラ属種(Shigella spp)、病原性大腸菌)及びグラム陽性病原体感染(肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)及び黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus))の予防用にバイオコンジュゲートワクチン候補が提案されている(例えば、Wetterら、2013年、Glycoconj J. 30巻:511～22頁.Engineering, conjugation, and immunogenicity assessment of Escherichia coli O121 O antigen for its potential use as a typhoid vaccine component、Wackerら、2014年、J. Infect. Dis. 209巻:1551～1561頁、Van den Dobbelsteenら、2016年、Vaccine 34巻:4152～60頁)。このうち、黄色ブドウ球菌5型CP(Hla-CP5)とバイオコンジュゲートされた黄色ブドウ球菌アルファ毒素(Hla)は、グリカン及びタンパク質部分を認識するウサギ又はマウス防御抗体を誘導することが示され、これにより、担体として、及び防御抗原としてのHlaタンパク質の二重の役割が実証された(Wackerら、2014年、J. Infect. Dis. 209巻:1551～1561頁)。このデータは、院内及び地域関連感染症株を含めた、世界中でまん延している多剤耐性株の増加により戦うのが難しくなっている黄色ブドウ球菌の伝播を防ぐワクチンを開発するために特に重要である。

ワクチン開発分野におけるバイオコンジュゲートの重要性が増大しているにもかかわらず、担体グリコシル化の有効性を評価するのに必要な頑健な分析ツールが依然として不足している(Micoli、F.ら、2018年、Molecules 23巻:1451頁)。特に、グリコシル化の程度の正確な定量化は、この情報が潜在的な規制要求事項を満たし、抗原の生産及び特徴付けをモニターする上で基礎となるのにも関わらず、難しい課題のままである。したがって、当該技術分野には、バイオコンジュゲートにおけるグリコシル化部位占有の絶対レベルを正確に定量化する頑健で信頼できる方法の必要性がある。

本発明者らは、グリコシル化部位占有率の絶対的な定量化に適している、タンパク質N-グリコシル化の普遍的コンセンサス配列を設計した。具体的には、これらのコンセンサス配列の使用によって、タンデム質量分析(LC-MS/MS)付き液体クロマトグラフィーにおける重同位体標識された内部標準の使用により総タンパク質濃度及びタンパク質の非グリコシル化部分を同時に定量化すること及び部位占有の程度を正確に決定することが可能となる(Zhuら、2015年、J Am Soc Mass Spectrom. 25巻:1012～7頁)。

本発明者らは、配列番号40のグリコシル化コンセンサス部位KDQNRTKを含有するHla担体タンパク質をモデルとして用いてグリコシル化を定量化するためのZhuらの方法に基づく方法を考案した(WO2019/121924に記載)。この戦略は、同位体標識された内部標準を用いてグリコペプチドの元々の非グリコシル化型を定量化することに基づく。簡潔には、2セットの重同位体標識されたペプチド標準を、トリプシン消化前の試料に添加し、消化された試料をLC-MSで分析する。1セットのペプチド標準が総糖タンパク質量を決定するのに使用され、一方、他の標準は、糖タンパク質の非グリコシル化量をモニターする。このようにして、総タンパク質量から非グリコシル化タンパク質量を引くことによって、タンパク質のグリコシル化部分の量が計算され、次いで、部位占有率が決定される。

しかし、KDQNRTK(配列番号40)コンセンサス配列は、トリプシンペプチドを生じさせることが判明し、これは、LC-MS定量化が可能になるには過度に短く、過度に親水性だった。KDQNATK(配列番号41)などの他の一般的に用いられるコンセンサス配列についても同じ問題が起こるだろう。

それゆえ、本発明者らは、上記方法と適合性があるであろう、すなわち、以前に用いられた部位と少なくとも同じ効率でグリコシル化され、さらに、LC-MSによって検出可能なトリプシンペプチドを生じるであろう普遍的なコンセンサス部位の設計を始めた。Hlaを原理証明として用いて、本発明者らは、質量分析によってコンジュゲーションの程度を定量化するのに適したコンセンサス配列の設計に成功することができた。

本発明は、最終産物内の非グリコシル化担体の量を定量化すること、プロセス中にバイオコンジュゲーション率を追跡すること、並びに単一及び複数のコンセンサス部位におけるグリコシル化の程度を定量化することを可能にする。さらに、検出の選択性は、プロセス中及び最終産物の特徴付けを補助する大規模な試料精製の必要性を低減する。

したがって、第1の態様において、本発明は、アミノ酸配列:
K/R-Z_0-9-D/E-X-N-Y-S/T-Z_0-9-K/R
を含むか、又はそれからなるコンセンサス配列であって、
X及びYが、独立して、プロリン以外の任意のアミノ酸であり、Zが任意のアミノ酸を表すコンセンサス配列を提供する。

好ましい実施形態では、X及びYが、独立して、プロリン、リジン、又はアルギニン以外の任意のアミノ酸である。一実施形態において、Zは、リジン又はアルギニン以外の任意のアミノ酸を表す。一実施形態において、X、Y、及び/又はZは、芳香族アミノ酸でも疎水性アミノ酸でもない。好ましい実施形態では、Zはシステイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、リジン、又はアルギニン以外の任意のアミノ酸を表す(例えば配列番号47)。

特定の実施形態では、本発明は、アミノ酸配列K/R-D/E-X₁-N-X₂-S/T-Z₁-Z₂-K/R(配列番号19)を含むか、又はそれからなるコンセンサス配列であって、X₁及びX₂が、独立して、プロリン、リジン、又はアルギニンとは別の任意のアミノ酸であり、Z₁及びZ₂がリジン又はアルギニン又はシステインではないコンセンサス配列を提供する。一実施形態において、コンセンサス配列は、配列番号20のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態において、コンセンサス配列は、配列番号42、配列番号43、配列番号44、又は配列番号45、好ましくは配列番号42～44のいずれかのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。

一態様において、本発明は、それが本発明の1以上のコンセンサス配列を含むという点で改変されている改変された担体タンパク質を提供する。したがって、本発明は、それが、上で定義した通りのアミノ酸配列K/R-(Z)_0-9-D/E-X-N-Y-S/T-(Z)_0-9-K/R(配列番号46)、例えばアミノ酸配列K/R-D/E-X₁-N-X₂-S/T-Z₁-Z₂-K/R(配列番号19)を含むか、又はそれからなる1以上のコンセンサス配列を含み、X₁及びX₂が、独立して、プロリン、リジン又はアルギニンを除いた任意のアミノ酸であり、Z₁及びZ₂がリジン又はアルギニン又はシステインではないという点で改変されている改変された担体タンパク質を提供する。一実施形態において、コンセンサス配列は、配列番号20のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態において、コンセンサス配列は、配列番号42、配列番号43、配列番号44、又は配列番号45、好ましくは配列番号42～44のいずれかのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。

一実施形態において、前記コンセンサス配列は、担体タンパク質配列の1個以上のアミノ酸を置換している。別の実施形態において、前記コンセンサス配列は、担体タンパク質配列に挿入されている。

改変された担体タンパク質は、複数の前記コンセンサス配列、任意選択的に（場合により）少なくとも2つ、3つ、4つ、又は5つのコンセンサス配列を含む。改変された担体タンパク質が複数のコンセンサス配列を含有する好ましい実施形態では、前記コンセンサス配列の全てが異なる、すなわち、異なるアミノ酸配列を有する。

担体タンパク質は、任意のタンパク質、好ましくは、T依存性免疫応答を誘発できるタンパク質とすることができる。特定の実施形態では、担体タンパク質がCRM197、破傷風菌(Clostridium tetani)由来のTT、緑膿菌(P. aeruginosa)由来のEPA、緑膿菌由来のHcp1、黄色ブドウ球菌由来のHla、黄色ブドウ球菌由来のClfA、大腸菌由来のMBP、大腸菌由来のE., PspA、又は淋菌(N. gonorrhoeae)由来のMtrEである。

一実施形態において、担体タンパク質は、配列番号1～16のいずれか1つのアミノ酸配列又は配列番号1～16のいずれか1つに少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。

一実施形態において、改変された担体タンパク質は、配列番号1～16のいずれか1つに少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、又は97%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。

改変された担体タンパク質は、グリコシル化されていてもよい。本発明は、本発明のグリコシル化された担体タンパク質、及び多糖に連結された本発明の改変された担体タンパク質を含むコンジュゲート(例えばバイオコンジュゲート)も提供する。多糖は、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン、又はトリプトファン(好ましくはアスパラギン)から選択される改変された担体タンパク質上のアミノ酸に連結されている。一実施形態において、莢膜多糖は、担体タンパク質と同じ生物由来である。一実施形態において、莢膜多糖は、担体タンパク質と異なる生物由来である。

一実施形態において、多糖は、細菌莢膜多糖、例えば、黄色ブドウ球菌5型莢膜糖、黄色ブドウ球菌8型莢膜糖、髄膜炎菌(N. meningitidis)血清型A莢膜糖(MenA)、髄膜炎菌血清型C莢膜糖(MenC)、髄膜炎菌血清型Y莢膜糖(MenY)、髄膜炎菌血清型W莢膜糖(MenW)、インフルエンザ菌(H. influenzae)b型莢膜糖(Hib)、B群連鎖球菌(Streptococcus)I群莢膜糖、B群連鎖球菌II群莢膜糖、B群連鎖球菌III群莢膜糖、B群連鎖球菌IV群莢膜糖、B群連鎖球菌V群莢膜糖、チフス菌(Salmonella typhi)由来のVi糖、髄膜炎菌LPS(リポ多糖、例えばL3及び/又はL2)、カタラーリス菌(M. catarrhalis)LPS、インフルエンザ菌LPS、赤痢菌(Shigella)O抗原、緑膿菌O抗原、大腸菌O抗原、又は肺炎球菌(S. pneumoniae)莢膜多糖である。

本発明のさらなる態様によれば、本発明の改変された担体タンパク質又はバイオコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドが提供される。

本発明のさらなる態様によれば、本発明の改変された担体タンパク質又はバイオコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。

本発明のさらなる態様によれば、
i)グリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1以上の核酸、
ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
iii)本発明の改変された担体タンパク質をコードする核酸、及び任意選択的に
iv)ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸
を含む宿主細胞が提供される。

改変された担体タンパク質をコードする核酸は、宿主細胞内のプラスミド上に保持されていても、宿主細胞のゲノムに組み込まれていてもよい。宿主細胞は、好ましくは大腸菌である。

本発明のさらなる態様によれば、糖に連結された、改変された担体タンパク質を含む(又はそれからなる)バイオコンジュゲートを生産(生成)するプロセスが提供され、前記方法は、(i)タンパク質の生産に適した条件下で、本発明の宿主細胞を培養すること、及び(ii)前記宿主細胞によって生産されたバイオコンジュゲートを単離することを含む。前記プロセスによって得られるか、得ることができるバイオコンジュゲートであって、改変された担体タンパク質に連結された多糖を含むバイオコンジュゲートも提供される。

本発明のさらなる態様によれば、本発明の改変された担体タンパク質、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲート、及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む免疫原性組成物が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、本発明の免疫原性組成物を作る方法であって、本発明の改変された担体タンパク質又はコンジュゲート又はバイオコンジュゲートを薬学的に許容される賦形剤又は担体と混合する工程を含む方法が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、本発明の改変された担体タンパク質、コンジュゲート、又はバイオコンジュゲートを含む免疫原性組成物が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、本発明の改変された担体タンパク質、コンジュゲート、又はバイオコンジュゲートを含む免疫原性組成物を作る方法であって、本発明の改変された担体タンパク質又はコンジュゲート又はバイオコンジュゲートを薬学的に許容される賦形剤又は担体と混合する工程を含む方法が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、本発明の免疫原性組成物及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含むワクチンが提供される。

本発明のさらなる態様によれば、それを必要とする対象における細菌感染の治療又は予防のための方法であって、治療有効量の本発明の改変された担体タンパク質、コンジュゲート、又はバイオコンジュゲートを前記対象に投与することを含む方法が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、細菌感染に対してヒト宿主を免疫化する方法であって、本発明の改変された担体タンパク質、コンジュゲート、又はバイオコンジュゲートの免疫防御用量を宿主に投与することを含む方法が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、対象において細菌に対する免疫応答を誘導する方法であって、治療有効量又は予防有効量の本発明の改変された担体タンパク質、コンジュゲート、又はバイオコンジュゲートを投与することを含む方法が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、細菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防で使用するための、本発明の改変された担体タンパク質、コンジュゲート、又はバイオコンジュゲートが提供される。

本発明のさらなる態様によれば、細菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防のための医薬の製造における、本発明の改変された担体タンパク質、コンジュゲート、又はバイオコンジュゲートの使用が提供される。

特定の実施形態では、前記細菌又は細菌感染が、黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌、インフルエンザ菌、インフルエンザ菌b型、B群連鎖球菌、チフス菌、カタラーリス菌LPS、シゲラ・フレックスネリ(S. flexneri)、緑膿菌、大腸菌、又は肺炎球菌からなる群から選択される。

本発明のさらなる態様によれば、本発明の担体タンパク質のグリコシル化部位占有のレベルを測定する方法であって、プロテアーゼ、例えばトリプシンでグリコシル化された担体タンパク質を消化すること、消化されたタンパク質をLC-MSに供すること、改変されていない担体タンパク質の濃度Uを決定すること、総担体タンパク質の濃度Tを決定すること、及び以下の等式によってグリコシル化部位占有率を計算することを含む方法が提供される。

改変されていない担体タンパク質の濃度Uは、本発明のコンセンサス配列に対応するペプチド断片の濃度を決定することによって決定される。総担体タンパク質の濃度Tは、前記担体タンパク質に特有である1以上のペプチド断片の濃度を決定することによって適切に決定することができる。

実施される戦略のワークフローを示す図である。図Ａ及び２Ｂはコンセンサス配列のインシリコ設計を示す図である。(A)32種の天然C.ジェジュニ糖タンパク質で見出された、グリコシル化Asn残基の-6から+6までの領域のアミノ酸の出現の統計分析。この分析は、Kowarikら、EMBO J. 2006年、25巻9号:1957-66頁に報告されている。天然存在のコンセンサス配列におけるボックスの高さは、アミノ酸残基の頻度を反映している。効率的なグリコシル化に決定的に重要であることが実証されているAsn残基(位置0、グリコシル化部位)並びにそれぞれ位置-2及び+2のAsp残基及びThr残基が灰色のボックス内の太字で示されている。灰色のボックス内の太字で表示されている、それぞれ位置-3、-1、+1、+3、及び+4のアミノ酸残基が4つのコンセンサス配列(B)の設計のために選択された。図３Ａ及び２Ｂはウエスタンブロットによって評価された新しく設計された担体のバイオコンジュゲーションの有効性を示す図である。Hla-i-CP5、Hla-v-CP5、及びHla-s-CP5(レーン1～3、図3A)の発現用に操作された大腸菌から調製されたペリプラズム画分をウサギ抗Hla-CP5血清を用いたウエスタンブロットによって分析した。発現のレベルは、MS分析と適合しないコンセンサス配列KDQNRTKを有する最適化Hlaと比較した(レーン4、図3A)。陰性対照として、Hlaを発現しないそれぞれの株から調製されたペリプラズム画分のウエスタンブロット分析が示されている(レーン1～4、図3B)。観察された陽性シグナルは、プロセス中に生産され、アセンブルした反応中間体であるウンデカプレニル連結CP5分子に関係している可能性がある。用量応答線形性を示す図である。例として、PTP-iの用量応答線形性曲線が示されている。較正カーブを作成するために、y軸上に、トリプシン消化前に、大腸菌ペリプラズム画分50μgに重量型のPTPi(0.1pmol/μg)の一定量及び軽量PTPiのスカラー濃度(0.0125pmol/μgから1.6pmol/μgまでの範囲、x軸)を添加することで決定したL/H面積比応答をプロットした。医薬品規制ハーモナイゼーション国際会議(ICH)ガイドライン(www.ich.org/products/guidelines/quality/article/quality-guidelines.html)によると、各ペプチドの定量化の下限(LLOQ)は、定量的に検出することができる、近似曲線上の最低濃度点に設定され、これは10σ/Sと定義され、式中、σ=応答の標準偏差であり、S =較正曲線の傾斜であり、0.08pmoles/μgペリプラズムタンパク質と計算された。同じ方法で定義される、PTP-s及びPTP-vのLLOQは、それぞれ、0.11及び0.06pmoles/μgペリプラズムタンパク質であった。 (A):コンストラクトHla-N,131、Hla-N,C、及びHla-131,Cの模式図である。各コンストラクトは、担体タンパク質のN末端、C末端、又は位置131に選択的に配置された、黄色ブドウ球菌CP5へのバイオコンジュゲーション用の2つのコンセンサス配列を保持する。図には、CP5バイオコンジュゲートにおけるそれぞれのグリコシル化の程度の計算値も示されている。(B):ペリプラズム画分のタンパク質の総量の関数である、位置131に挿入されたコンセンサス配列のグリコシル化の割合(%)の曲線を示す図である。

定義
本明細書で使用される場合、用語「担体タンパク質」とは、多糖抗原(例えば糖抗原)と共有結合して、コンジュゲート(例えばバイオコンジュゲート)を形成するタンパク質を指す。担体タンパク質は、それがコンジュゲートする多糖抗原と関係して、T細胞性免疫を活性化する。
ClfA:ブドウ球菌、特に黄色ブドウ球菌由来の凝集因子A。
CRM197:ジフテリア毒素の無毒性突然変異体。
EPA:緑膿菌の外毒素A。
Hla:ブドウ球菌、特に黄色ブドウ球菌由来の溶血素A、アルファ毒素としても公知である
Hcp1:緑膿菌由来のタンパク質Hcp1
MBP:大腸菌由来のマルトース/マルトデキストリン結合タンパク質。
MtrE:淋菌由来の膜トランスポーターE。
PspA、大腸菌由来のファージショックプロテインA。
CP:莢膜多糖。

本明細書で使用される場合、用語「バイオコンジュゲート」とは、宿主細胞バックグラウンドで調製されたタンパク質(例えば担体タンパク質)と抗原(例えば糖)の間のコンジュゲートを指し、宿主細胞機構は、抗原をタンパク質に連結する(例えばN連結する)。通常、バイオコンジュゲートにおいて、多糖は、N-アセチルグルコサミンを介してアスパラギンに連結される。

本明細書で使用される場合、用語「グリコサイト」とは、細菌のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ、例えばジェジュニのPglBによって認識されるアミノ酸配列を指す。PglBの最小コンセンサス配列は、D/E-X-N-Z-S/T(配列番号17)であり、一方、延長されたコンセンサス配列K-D/E-X-N-Z-S/T-K(配列番号18)も明らかにされている。例示及び代替のグリコサイト配列は、本明細書に記載されている。

プロリン(プロ、P)とは別の任意のアミノ酸:アラニン(ala、A)、アルギニン(arg、R)、アスパラギン(asn、N)、アスパラギン酸(asp、D)、システイン(cys、C)、グルタミン(gln、Q)、グルタミン酸(glu、E)、グリシン(gly、G)、ヒスチジン(his、H)、イソロイシン(ile、I)、ロイシン(leu、L)、リジン(lys、K)、メチオニン(met、M)、フェニルアラニン(phe、F)、セリン(ser、S)、スレオニン(thr、T)、トリプトファン(trp、W)、チロシン(tyr、Y)、バリン(val、V)からなる群から選択されるアミノ酸を指す。

本明細書で使用される場合、治療薬(例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン)を対象に投与する文脈において、用語「有効量」とは、予防効果及び/又は治療効果(複数可)を有する治療薬の量を指す。

本明細書で使用される場合、用語「対象」は、動物、具体的には哺乳動物、例えば霊長類(例えば、ヒト)を指す。

本明細書で使用される場合、2つのアミノ酸又は核酸配列間の配列同一性パーセンテージへの言及は、整列された場合、そのアミノ酸又は塩基のパーセンテージは、2つの配列を比較する際に同じであることを意味する。このアラインメント及びパーセント相同性又は配列同一性は、当該技術分野において公知であるソフトウェアプログラム、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubelら、編集、1987年、Supplement 30)の7.7.18節に記載されているものを用いて決定することができる。好ましいアラインメントは、ギャップオープンペナルティが12であり、ギャップ拡張ペナルティが2であり、BLOSUMマトリックスが62であるアフィンギャップサーチを用いて、Smith-Waterman相同性サーチアルゴリズムによって決定される。Smith-Waterman相同性サーチアルゴリズムは、Smith & Waterman (1981年) Adv. Appl. Math. 2巻: 482～489頁に開示されている。任意の具体的な配列(例えば、具体的な配列番号)に対する同一性パーセンテージは、理想的には、その配列の全長にわたって計算される。異なる長さの2つの配列間の配列同一性パーセンテージは、好ましくは、より長い配列長にわたって計算される。大域又は局所アラインメントを使用することができる。好ましくは、大域アラインメント（グローバルアラインメント）が使用される。

本明細書で使用される場合、目的の融合タンパク質若しくはタンパク質又はそのコンジュゲート(例えばバイオコンジュゲート)の「精製を行う」又は「精製」という用語は、1以上の夾雑物からそれを分離することを意味する。夾雑物は、前記目的の融合タンパク質若しくはタンパク質又はそのコンジュゲート(例えばバイオコンジュゲート)とは異なる任意の物質である。夾雑物は、例えば、細胞片、核酸、脂質、目的の融合タンパク質若しくはタンパク質以外のタンパク質、多糖、及び他の細胞成分であり得る。

「組換え」ポリペプチドは、相同組換えの結果、当該ポリペプチドをコードする核酸で形質転換又はトランスフェクションされているか、当該ポリペプチドを生産する宿主細胞で生産されたものである。

本明細書で使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基のサイズ、極性、電荷、疎水性、又は親水性にほとんど影響ないか又は全く影響がなく、免疫原性の低下をもたらさないで、天然アミノ酸残基を非天然残基で置換することを伴う。例えば、これらは、以下の基:バリン、グリシン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、及びフェニルアラニン、チロシン内の置換であり得る。ポリペプチドの配列に対する保存的アミノ酸改変(及びコードするヌクレオチドに対する対応する改変)は、親ポリペプチドのものと類似する機能的及び化学的特徴を有するポリペプチドを生成し得る。

本明細書で使用される場合、用語「欠失」は、タンパク質配列からの1以上のアミノ酸残基の除去である。典型的には、1～6残基(例えば、1～4残基)以下が、タンパク質分子内の任意の1つの部位で欠失される。

本明細書で使用される場合、用語「挿入」は、タンパク質配列中の1以上の非天然アミノ酸残基の付加である。典型的には、約1～6残基(例えば、1～4残基)以下が、タンパク質分子内の任意の1つの部位に挿入される。

本明細書で使用される場合、用語「含む」は、指定された成分に加えて他の成分が存在し得ることを示し、一方、用語「からなる」は、他の成分が存在しないか、又は検出可能な量で存在しないことを示す。用語「含む」は、用語「からなる」を当然に含む。

担体タンパク質
担体タンパク質へのT非依存性抗原、例えば糖のコンジュゲーションは、T細胞援助（ヘルプ）が、通常はT非依存性である抗原に対する免疫応答の一部になることを可能にする方法としてかなり前に確立された。このようにして、免疫記憶及び応答のブースト可能性の発達を可能にすることによって、免疫応答を増強することができる。担体タンパク質は、T非依存性糖抗原を、免疫記憶応答を誘発することができるT依存性抗原に変える。担体タンパク質に細菌の莢膜糖を結合させることによって開発された好成績のコンジュゲートワクチンが当該技術分野で知られており、商品化されたワクチンで広範に使用されている担体タンパク質には、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197、及びインフルエンザ菌由来のタンパク質Dが含まれる。CRM197は、現在、肺炎球菌莢膜多糖コンジュゲートワクチンPREVENAR(商標)(Pfizer)で使用されており、タンパク質D、破傷風トキソイド、及びジフテリアトキソイドは、現在、肺炎球菌莢膜多糖コンジュゲートワクチンSYNFLORIX(商標)(GlaxoSmithKline)で莢膜多糖の担体として使用されている。当該技術分野で公知である他の担体タンパク質は、黄色ブドウ球菌血清型5及び8の莢膜多糖のEPA(緑膿菌外毒素A)を含む(Wackerら、2014年、J. Infect. Dis. 209巻:1551～1561頁)。

コンジュゲートの防御能力を増大するために、複合多糖と同じ生物由来のタンパク質抗原を担体タンパク質として使用することも可能である。例えば、黄色ブドウ球菌タンパク質抗原Hlaは、黄色ブドウ球菌莢膜多糖の担体タンパク質として好成績で使用されている。WO2019/121924、WO2019/121926、及びPCT/EP2019/053463に記載されているように、Hla-CP5とClfA-CP8のバイオコンジュゲートによるワクチン接種は、動物モデルで、莢膜多糖及びタンパク質抗原両方に対する機能的な抗体を誘導し、黄色ブドウ球菌感染症からの防御を与えることができた。したがって、いかなるタンパク質抗原も、多糖コンジュゲートワクチンの担体タンパク質として用いるための候補となり得る。好ましくは、前記タンパク質抗原は、多糖と同じ生物に由来するものである。しかし、例えば複数の病原体から防御するために、異なる生物に由来するタンパク質抗原を使用することもできる。

本発明で使用することのできる例示的な担体タンパク質は、下に記載されている。

EPA:緑膿菌の外毒素A。
一実施形態において、担体タンパク質は、緑膿菌(EPA)由来の外毒素Aである。前記EPAは、配列番号1のアミノ酸配列又は配列番号1に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含むことができる。

したがって、本発明の一態様では、それが、上で定義した通りのアミノ酸配列K/R-(Z)_0-9-D/E-X-N-Y-S/T-(Z)_0-9-K/R(配列番号46)、例えば、アミノ酸配列K/R-D/E-X₁-N-X₂-S/T-Z₁-Z₂-K/R(配列番号19)を有する1つ以上のコンセンサス配列を含むか、又はそれからなる1以上のコンセンサス配列を含むという点で改変されている配列番号1のアミノ酸配列又は配列番号1に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含む改変されたEPAタンパク質が提供され、配列中、X₁及びX₂は、独立して、プロリン、アルギニン及びリジンとは別の任意のアミノ酸であり、Z₁及びZ₂はリジン又はアルギニンではない。一実施形態において、前記コンセンサス配列は、配列番号20のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態において、前記コンセンサス配列は、配列番号42～45のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。好ましい実施形態では、前記コンセンサス配列が配列番号42～44のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。

EPAタンパク質は、それが、解毒突然変異、例えば配列番号1の位置L552に対応するアミノ酸位置のLからVへの置換及び/又は配列番号1のE553の欠失、若しくは配列番号1に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列(例えば配列番号2)内の同等の位置での欠失を含む、及び/又は1以上のコンセンサス配列K/R-D/E-X₁-N-X₂-S/T-Z₁-Z₂-K/R(配列番号19)によって1個以上のアミノ酸が置換されているという点でさらに改変されていてもよい。一実施形態において、前記置換は、配列番号1のA375、A376、又はK240の置換である。それゆえに、目的のタンパク質は、配列番号19、20、又は42～47のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列による1個以上のアミノ酸の挿入又は置換を有する、配列番号2のアミノ酸配列又は配列番号2に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含むことができる。

一実施形態において、前記改変されたEPAタンパク質は、複数の前記コンセンサス配列、例えば2、3、4、又は5つのコンセンサス配列を含む。複数のコンセンサス配列が存在する好ましい実施形態では、個々の部位のグリコシル化を識別することが可能となるように、コンセンサス配列が相互に異なる配列を有する。

ある実施形態では、本発明の改変されたEPAタンパク質は、配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列由来であり得、これは、免疫原性断片及び/又は配列番号1の変異体である。ある実施形態では、本発明の改変されたEPAタンパク質は、全長配列の少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約40個、又は少なくとも約60個の連続するアミノ酸残基を含む配列番号1又は2の免疫原性断片由来であり得、前記ポリペプチドは、前記アミノ酸配列に特異的な免疫応答を誘発することができる。

ある実施形態では、本発明の改変されたEPAタンパク質は、配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列に由来し得、これは、1個以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12個のアミノ酸)の欠失及び/又は付加及び/又は置換によって改変されている配列番号1の変異体である。アミノ酸置換は、保存的であるか又は非保存的であり得る。1つの態様では、アミノ酸置換は保存的である。置換、欠失、付加又はそれらの任意の組合せは、変異体が免疫原性ポリペプチドである限り、単一の変異体において組み合わせることができる。ある実施形態では、本発明の改変されたEPAタンパク質は、1～10個、5～10個、1～5個、1～3個、1～2個、又は1個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠失、又は付加される変異体に由来することができる。

ある実施形態では、本発明は、B細胞エピトープ又はT細胞エピトープを含む断片及び/又は変異体を含む。このようなエピトープは、例えば、PSIPREDプログラム(David Jones、Brunel Bioinformatics Group、Dept. Biological Sciences、Brunel University、Uxbridge UB8 3PH、UKによる)、及びJameson及びWolf (CABIOS 4巻:181～186頁[1988年])に記載される方法に基づいて計算される抗原性指標を用いて、2D構造予測の組合せを用いて予測することができる。

用語「改変されたEPAタンパク質」は、EPAアミノ酸配列(例えば、配列番号1のEPAアミノ酸配列又は配列番号1に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列を有する)であって、1個以上のアミノ酸の付加、置換、又は欠失(例えば、配列番号19若しくは46のアミノ酸配列によるコンセンサス配列の付加(挿入)、又は配列番号19若しくは46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列による1個以上のアミノ酸の置換)によって改変されている野生型成熟EPAアミノ酸配列(例えば、配列番号1の野生型アミノ酸配列)であってもよいEPAアミノ酸配列を指す。改変されたEPAタンパク質は、1以上のコンセンサス配列の付加又は置換の他に、さらなる改変(付加、置換、欠失)も含むことができる。例えば、シグナル配列及び/又はペプチドタグを付加することができる。クローニングの際の補助のため、N末端及び/又はC末端(例えば、存在する場合、シグナル配列の後又はペプチドタグの前)に付加したアミノ酸が含まれていてもよい。一実施形態において、本発明の改変されたEPAタンパク質は、天然に存在しないEPAタンパク質でもよい。

本発明の一実施形態において、改変されたEPAアミノ酸配列(例えば、配列番号1のアミノ酸配列又は配列番号1に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるEPAアミノ酸配列、例えば配列番号2を有する)の1個以上のアミノ酸(例えば1～7個のアミノ酸、例えば1個のアミノ酸)は、配列番号46又は配列番号19のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列、例えば配列番号20又は42～45又は47、特に配列番号42～44によって置換されている。例えば、EPAアミノ酸配列(例えば配列番号1)の1個のアミノ酸が前記コンセンサス配列で置き換えられていてもよい。あるいは、EPAアミノ酸配列(例えば配列番号1又は配列番号1に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるEPAアミノ酸配列)の2、3、4、5、6、又は7のアミノ酸が前記コンセンサス配列で置き換えられていてもよい。

コンセンサス配列の導入は、改変されたEPAタンパク質のグリコシル化を可能にする。したがって、本発明は、本発明の改変されたEPAタンパク質であって、グリコシル化されている改変されたEPAタンパク質も提供する。特定の実施形態では、コンセンサス配列は、EPAアミノ酸配列の特定の領域、例えばタンパク質の表面構造、タンパク質のN末端若しくはC末端、及び/又はジスルフィド架橋によって安定化されたループに導入される。

当業者ならば、EPAアミノ酸配列が配列番号2のアミノ酸配列の変異体及び/又は断片、例えば配列番号2に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列である場合、「...アミノ酸の間」への言及は、2つの配列間の配列同一性を最大化するためにこの配列が配列番号1のアミノ酸配列と並べられた場合、定義された位置に対して同等である位置を指すことを理解する。配列アラインメントツールについては上に記載されている。配列番号1の変異体及び/又は断片からのアミノ酸の付加又は欠失は、突然変異された配列中のコンセンサス配列の実際のアミノ酸位置の相違を導くことができるが、しかしながら、突然変異された配列を参照配列と並べることによって、参照配列中の対応するアミノ酸と同等の位置にあるアミノ酸を同定することができ、したがって、コンセンサス配列の付加又は置換に適切な位置を確立することができる。

このようなグリコシル化部位の導入は、例えば、タンパク質の一次構造に新しいアミノ酸を付加する(すなわち、グリコシル化部位が完全又は部分的に付加される)こと、又はグリコシル化部位を生じさせるためにタンパク質中に存在するアミノ酸を突然変異させる(すなわち、アミノ酸はタンパク質に付加されないが、タンパク質の選択されたアミノ酸が、グリコシル化部位を形成するように突然変異される)ことによって達成することができる。当業者ならば、当該技術分野で公知であるアプローチ、例えば、タンパク質をコードしている核酸配列の改変を含む組換えアプローチを用いてタンパク質のアミノ酸配列を容易に改変することができることを認識する。

一実施形態において、本発明の改変されたEPAタンパク質は、「ペプチドタグ」又は「タグ」、すなわち、改変されたEPAタンパク質の単離及び/又は同定を可能にする1配列のアミノ酸をさらに含む。例えば、本発明の改変されたEPAタンパク質にタグを付加することは、そのタンパク質の精製、したがって、タグ付けされた改変されたEPAタンパク質を含むコンジュゲートワクチンの精製に有用であり得る。本明細書で使用することができる例示的なタグは、限定されないが、ヒスチジン(HIS)タグを含む。一実施形態において、タグは、ヘキサヒスチジンタグである。特定の実施形態では、本明細書に使用されるタグは、もはや必要とされなくなった場合、例えばタンパク質が精製された後に、除去が可能、例えば化学薬品又は酵素的手段による除去が可能である。任意選択的に、ペプチドタグは、アミノ酸配列のC末端に位置される。任意選択的に、ペプチドタグは、アミノ酸配列のC末端に、6つのヒスチジン残基を含む。ペプチドタグは、1、2、又はそれより多くの追加のアミノ酸残基、例えばアラニン、セリン、及び/又はグリシン残基、例えばGSを含んでいても、それに先行されていてもよい。

Hla:黄色ブドウ球菌の溶血素A
一実施形態において、担体タンパク質は、Hla(黄色ブドウ球菌の溶血素A、アルファ毒素としても公知である)である。上述のように、Hlaは、黄色ブドウ球菌莢膜多糖の担体タンパク質として好成績で使用されている。Hlaの成熟野生型アミノ酸配列を配列番号13に示す。

したがって、本発明の一態様では、それが、上で定義した通りのアミノ酸配列K/R-(Z)_0-9-D/E-X-N-Y-S/T-(Z)_0-9-K/R(配列番号46)を含むか、又はそれからなる1以上のコンセンサス配列、例えば、K/R-D/E-X₁-N-X₂-S/T-Z₁-Z₂-K/R(配列番号19)から選択される1以上のコンセンサス配列を含むという点で改変されている、配列番号13のアミノ酸配列、又は配列番号13に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含む改変されたHlaタンパク質が提供され、配列中、X₁及びX₂は、独立して、プロリンを除いた任意のアミノ酸であり、Z₁及びZ₂はリジン又はアルギニンではない。一実施形態において、前記コンセンサス配列は、配列番号20のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態において、前記コンセンサス配列は、配列番号42～44のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。好ましい実施形態では、前記コンセンサス配列が配列番号42～44のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。

一実施形態において、前記改変されたHlaタンパク質は、複数の前記コンセンサス配列、例えば2、3、4、又は5つのコンセンサス配列を含む。複数のコンセンサス配列が存在する好ましい実施形態では、個々の部位のグリコシル化を識別することが可能となるように、コンセンサス配列が相互に異なる配列を有する。一実施形態において、前記改変されたHlaタンパク質は、Hla配列のN末端及び/又はC末端に複数のコンセンサス配列の少なくとも1つを含む。

Hlaは毒素であるため、それをインビボで投与し得る前に、解毒する必要がある(すなわち、保護に適した投薬量で提供された場合、哺乳動物、例えば、ヒトに対して毒性を示さない)。本発明の改変されたHlaタンパク質は、(すなわち、突然変異により)遺伝的に解毒され得る。遺伝的に解毒された配列は、ヒトへの投与後に抗Hla防御及び/又は中和抗体を誘導する能力を保持しながら、毒性を減少させるために、望ましくない活性、例えば、ヒト赤血球及び他の細胞に対する脂質二重層貫通孔、膜透過、細胞溶解、及び細胞溶解活性を形成する能力を除去し得る。例えば、本明細書に記載されるように、Hlaタンパク質は、その免疫原性エピトープをなおも維持しながら、それが生物学的に不活性であるように改変され得る。本発明の改変されたHlaタンパク質は、1以上の点突然変異によって遺伝的に解毒され得る。例えば、孔形成に関与する残基は、Hlaの溶菌活性に関係している。一態様では、本発明の改変されたHlaタンパク質は、Menzies及びKernodle(Menzies and Kernodle (Menzies and Kernodle、1994年、Infect Immun 62巻、1843～1847頁)に記載されるようなアミノ酸置換、例えば、H35、H48、H114及び/又はH259の別のアミノ酸、例えばリジンによる置換によって解毒され得る。例えば、本発明の改変されたHlaタンパク質は、配列番号13のアミノ酸配列に関して(又は配列番号13と少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列における同等の位置で)、H35L、H114L又はH259Lから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み得る。好ましくは、改変されたHlaタンパク質は、置換H35L(例えば、配列番号14)を含む。

したがって、前記改変されたHlaタンパク質は、アミノ酸配列が解毒突然変異、例えば配列番号13の位置H35(例えばH35L)又は配列番号13に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列(例えば配列番号14及び15)内の同等の位置でのアミノ酸置換を含むという点でさらに改変されていてもよい。代替の解毒突然変異は、例えば、配列番号16にあるような、PSGSによるHla単量体のステム領域の置き換えである。例示的な改変された配列は、配列番号31～34及び36～39、特に31～33及び36～38のものである。

一実施形態において、前記Hla配列は、アミノ酸配列が配列番号13の位置H48及びG122、又は配列番号13に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置でアミノ酸置換を含むという点で代替的に又は付加的に改変されていてもよく、前記置換は、それぞれHからC及びGからCである(例えば配列番号15)。

したがって、配列番号15のアミノ酸配列又は配列番号15に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含む改変されたHlaタンパク質であって、前記改変されたHlaタンパク質が以下の突然変異:H35L、H48C、及びG122Cを含有し、アミノ酸配列が、配列番号19、20、及び42～45、特に42～44から選択される1以上のコンセンサス配列を含むという点で改変されており、前記改変されたHlaタンパク質が以下の突然変異:H35L、H48C、及びG122Cを含有する、改変されたHlaタンパク質が提供される。例示的な配列は、配列番号31～34及び36～39、特に31～33及び36～38のものである。

これらの配列は、本明細書に記載のように、シグナル配列の付加並びに任意選択的にクローニングを目的としてN末端セリン及び/又はアラニンの挿入によって改変されていてもよい。配列は、解毒突然変異、例えば、本明細書に記載される解毒突然変異のいずれか1つ又は全てを含有するようにさらに改変されていてもよい。好ましい解毒突然変異は、配列番号14又は15のH35Lである。

一実施形態において、本発明の改変されたHlaタンパク質は、配列番号13の免疫原性断片及び/又は変異体である配列番号13に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列に由来するものでもよい。一実施形態において、本発明の改変されたHlaタンパク質は、全長配列の少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約40、又は、少なくとも約60の連続したアミノ酸残基を含む配列番号13、14、又は15の免疫原性断片に由来するものでもよく、前記ポリペプチドが前記アミノ酸配列に特異的な免疫応答を誘発することができる。

一実施形態において、本発明の改変されたHlaタンパク質は、1個以上のアミノ酸(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸)の欠失及び/又は付加及び/又は置換によって改変された配列番号13の変異体である配列番号13に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列に由来するものでもよい。アミノ酸置換は、保存的でも、非保存的でもよい。一態様において、アミノ酸置換は保存的である。置換、欠失、付加、又はこれらの任意の組合せは、変異体が免疫原性ポリペプチドである限り1つの変異体内に組み合わせてもよい。一実施形態において、本発明の改変されたHlaタンパク質は、1～10、5～10、1～5、1～3、1～2、又は1個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠失、又は付加されている変異体に由来するものでもよい。例えば、本発明の改変されたHlaタンパク質は、N末端に1又は2個の追加のアミノ酸、例えば最初のN末端SAを有するという点で配列番号13～16のいずれか1つの変異体であるアミノ酸配列に由来するもの(例えば配列番号36～39)でもよい。改変されたHlaタンパク質は、C末端に1以上の追加のアミノ酸、例えば1、2、3、4、5、又は6個のアミノ酸を付加的に又は代替的に有してもよい。そのような追加のアミノ酸は、精製を援助するためのペプチドタグを含んでもよく、例えばGSHRHR(例えば配列番号36～39)を含んでもよい。

一実施形態において、本発明は、B細胞又はT細胞エピトープを含む断片及び/又は変異体を含む。そのようなエピトープは、2D構造予測、例えばPSIPREDプログラム(David Jones、Brunel Bioinformatics Group、Dept. Biological Sciences、Brunel University、Uxbridge UB8 3PH、UKから)を用いるものとJameson及びWolf(CABIOS 4巻:181～186頁[1988年])に記載される方法に基づいて計算される抗原性インデックスの組合せを用いて予測することができる。

用語「改変されたHlaタンパク質」は、Hlaアミノ酸配列(例えば、配列番号13のHlaアミノ酸配列又は配列番号13に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列を有する)であって、Hlaアミノ酸配列が、野生型成熟Hlaアミノ酸配列(例えば、配列番号13の野生型アミノ酸配列)でもよく、1個以上のアミノ酸の付加、置換、若しくは欠失(例えば、システインによる配列番号13のH48及びG122の置換、リジンによる配列番号1のH35の置換、配列番号19又は46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列の付加(挿入)、又は1以上のアミノ酸の配列番号19又は46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列での置換)によって改変されているHlaアミノ酸配列を指す。改変されたHlaタンパク質は、1以上のコンセンサス配列の付加又は置換の他に、さらなる改変(付加、置換、欠失)も含むことができる。例えば、シグナル配列及び/又はペプチドタグを付加することができる。クローニングの際の補助のため、N末端及び/又はC末端(例えば、存在する場合、シグナル配列の後又はペプチドタグの前)に付加したアミノ酸が含まれていてもよい。一実施形態において、本発明の改変されたHlaタンパク質は、天然に存在しないHlaタンパク質でもよい。

本発明の一実施形態において、改変されたHlaアミノ酸配列(例えば、配列番号13のアミノ酸配列又は配列番号13に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるHlaアミノ酸配列、例えば配列番号14～16を有する)の1以上のアミノ酸(例えば1～7アミノ酸、例えば1アミノ酸)は、配列番号19又は配列番号46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列、例えば配列番号20又は42～44又は47、特に配列番号42～44によって置換されている。例えば、Hlaアミノ酸配列(例えば配列番号13)における単一のアミノ酸が前記コンセンサス配列(例えば配列番号30～39)で置き換えられていてもよい。一実施形態において、前記置換されたアミノ酸は、配列番号13の位置K131に対応する位置にある。あるいは、Hlaアミノ酸配列(例えば配列番号13又は配列番号13に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるHlaアミノ酸配列)中の2、3、4、5、6、又は7のアミノ酸が前記コンセンサス配列(例えば配列番号51～53)で置き換えられてもよい。一実施形態において、前記置換されたアミノ酸は、N末端、C末端、及び配列番号13の位置131のアミノ酸の中から選択される2以上のアミノ酸である。

コンセンサス配列の導入は、改変されたHlaタンパク質のグリコシル化を可能にする。したがって、本発明はまた、改変されたHlaタンパク質がグリコシル化された、本発明の改変されたHlaタンパク質を提供する。特定の実施形態では、コンセンサス配列は、Hlaアミノ酸配列の特定の領域、例えば、タンパク質の表面構造、タンパク質のN末端若しくはC末端、及び/又はジスルフィド架橋によって安定化されたループに導入される。本発明のある態様では、コンセンサス配列(複数可)の位置は、改善されたグリコシル化、例えば、収率の増加を提供する。一実施形態では、配列番号13のアミノ酸残基K131の位置に、若しくは配列番号13に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列、例えば配列番号30～39における同等の位置に(例えば配列番号14～16のアミノ酸配列の同等の位置に)、又は1以上のアミノ酸残基に、コンセンサス配列が付加されているか、又はコンセンサス配列がこれらの位置を置換している。

当業者ならば、Hlaアミノ酸配列が配列番号2のアミノ酸配列の変異体及び/又は断片、例えば、配列番号2に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列である場合、「...アミノ酸の間」への言及は、2つの配列間の配列同一性を最大化するためにこの配列を配列番号1のアミノ酸配列と並べられた場合に、定義された位置と同等であろう位置を指すことを理解する。配列アラインメントツールについては上に記載されている。配列番号13の変異体及び/又は断片におけるアミノ酸の付加又は欠失は、突然変異した配列中のコンセンサス配列の実際のアミノ酸位置の相違をもたらす可能性があるが、突然変異した配列を参照配列と並べることによって、参照配列中の対応するアミノ酸と同等の位置にあるアミノ酸を同定することができ、それゆえに、コンセンサス配列の付加又は置換に適切な位置を確立することができる。

このようなグリコシル化部位の導入は、例えばタンパク質の一次構造に新しいアミノ酸を付加する(すなわち、グリコシル化部位を完全又は部分的に付加する)ことによって、又はグリコシル化部位を生じさせるためにタンパク質中の既存のアミノ酸を突然変異させる(すなわち、タンパク質にアミノ酸が付加されないが、タンパク質の選択されたアミノ酸が、グリコシル化部位を形成するように突然変異する)ことによって達成することができる。当業者ならば、当該技術分野で公知であるアプローチ、例えば、タンパク質をコードしている核酸配列の改変を含む組換えアプローチを用いてタンパク質のアミノ酸配列を容易に改変することができることを認識する。したがって、一実施形態において、本発明は、配列番号13のH48及びG122に対応するアミノ酸又は配列番号13に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるHlaアミノ酸配列内の同等の位置がシステインによって置換されており、配列番号13のHlaアミノ酸配列又は配列番号13に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるHlaアミノ酸配列にグリコシル化部位が組換え導入されているアミノ酸配列を有する改変されたHlaタンパク質を提供する。

ある実施形態では、本発明の改変されたHlaタンパク質は、「ペプチドタグ」又は「タグ」、すなわち、改変されたHlaタンパク質の単離及び/又は同定を可能にするアミノ酸の配列をさらに含む。例えば、本発明の改変されたHlaタンパク質にタグを付加することは、そのタンパク質の精製、したがって、タグ化された、改変されたHlaタンパク質を含むコンジュゲートワクチンの精製において有用であり得る。本明細書で使用することができる例示的なタグは、限定されないが、ヒスチジン(HIS)タグを含む。一実施形態では、タグは、ヘキサヒスチジンタグである。別の実施形態では、タグは、HRタグ、例えば、HRHRタグである。ある種の実施形態では、本明細書で使用されるタグは、取り外し可能であり、例えば、タンパク質が精製された後に、もはや必要とされなくなった場合、例えば、化学剤によって又は酵素的手段によって除去される。任意選択的に、ペプチドタグは、アミノ酸配列のC末端に位置する。任意選択的に、ペプチドタグは、アミノ酸配列のC末端に6個のヒスチジン残基を含む。任意選択的に、ペプチドタグは、アミノ酸配列のC末端に4つのHR残基(HRHR)を含む。ペプチドタグは、1、2又はそれ以上の追加アミノ酸残基、例えば、アラニン、セリン及び/又はグリシン残基、例えばGSを含み得るか、又はそれらに先行され得る。例示的なそのような配列は、配列番号36～39である。

一実施形態において、本発明の改変されたHlaタンパク質は、担体タンパク質を宿主細胞(例えば細菌)のペリプラズムに向かうように指示することができるシグナル配列を含む。特定の実施形態では、シグナル配列は、シゲラ・フレックスネリのフラジェリン(FlgI)[MIKFLSALILLLVTTAAQA(配列番号21)]由来である。他の実施形態では、シグナル配列は、大腸菌外膜ポーリンA(OmpA)[MKKTAIAIAVALAGFATVAQA(配列番号22)]、大腸菌マルトース結合タンパク質(MalE)[MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA(配列番号23)]、軟腐病菌(Pectobacterium carotovorum)ペクチン酸リアーゼ(PelB)[MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA(配列番号24]、易熱性大腸菌エンテロトキシンLTIIb[MSFKKIIKAFVIMAALVSVQAHA(配列番号25)]、枯草菌(Bacillus subtilis)エンドキシラナーゼXynA[MFKFKKKFLVGLTAAFMSISMFSATASA(配列番号26)]、大腸菌DsbA[MKKIWLALAGLVLAFSASA(配列番号27)]、TolB[MKQALRVAFGFLILWASVLHA(配列番号28)]、又はS.アガラクチア(S. agalactiae)SipA[MKMNKKVLLTSTMAASLLSVASVQAS(配列番号29)]由来である。一実施形態において、シグナル配列は、配列番号21～29に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を有する。一態様において、シグナル配列は、大腸菌フラジェリンシグナル配列(FlgI)[MIKFLSALILLLVTTAAQA(配列番号21)]に少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を有する。シグナル配列を含む例示的な改変されたHla配列は、配列番号35～39である。

ある実施形態では、セリン及び/又はアラニン残基は、シグナル配列と成熟タンパク質、例えばSA又はS、好ましくはSの配列の開始の間に付加される。このような残基は、リーダー配列のより効率的な切断をもたらす利点を有する。

ClfA:黄色ブドウ球菌由来の凝集因子A
一実施形態において、担体タンパク質は、ブドウ球菌細菌、特に黄色ブドウ球菌由来の凝集因子A(ClfA)である。ClfAは、黄色ブドウ球菌莢膜多糖(CP8)の担体タンパク質として使用されており、ClfA-CP8コンジュゲートは、ClfAとCP8の両方に対する機能的な抗体を誘導することができ、動物モデルで防御効果を有した。ClfAは、3つの別々に折り畳まれたサブドメインN1、N2、及びN3を含む520アミノ酸のN末端Aドメイン(フィブリノーゲン結合領域)を含有する。Aドメインの後には、セリン-アスパラギン酸ジペプチド反復領域並びに細胞壁及び膜貫通領域が続き、細胞壁及び膜貫通領域は、細胞壁へのソルターゼ促進アンカーリングのためのLPDTGモチーフを含有する。抗原又は担体タンパク質として用いる場合、N1～N3(配列番号10)又はN2/N3(配列番号11)ドメインのみを用いる。

それゆえに、前記ClfAは、配列番号10若しくは11のアミノ酸配列又は配列番号10若しくは11に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列を含むことができる。

ClfAタンパク質は、そのフィブリノゲン結合活性を低減するようにさらに改変されていてもよい。したがって、ClfAタンパク質は、配列番号11のアミノ酸配列又は配列番号11に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列内の同等の位置に関してP116からS及びY118からA(配列番号10の配列における位置P336及びY338に対応する)から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換をさらに含んでもよい。

したがって、本発明の一態様では、それが、上で定義した通りのアミノ酸配列K/R-(Z)_0-9-D/E-X-N-Y-S/T-(Z)_0-9-K/R(配列番号46)、例えば、アミノ酸配列K/R-D/E-X₁-N-X₂-S/T-Z₁-Z₂-K/R(配列番号19)を有する1以上のコンセンサス配列を含むか、又はそれからなる1以上のコンセンサス配列を含むという点で改変されている配列番号10、11、若しくは12のアミノ酸配列又は配列番号10、11、若しくは12に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列を含む改変されたClfAタンパク質が提供され、配列中、X₁及びX₂は、独立して、プロリンを除いた任意のアミノ酸であり、Z₁及びZ₂はリジン又はアルギニンではない。一実施形態において、前記コンセンサス配列が配列番号20のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態において、前記コンセンサス配列が配列番号42～45のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。好ましい実施形態では、前記コンセンサス配列が配列番号42～44のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。

一実施形態において、前記改変されたClfAタンパク質は、複数の前記コンセンサス配列、例えば2、3、4、又は5つのコンセンサス配列を含む。複数のコンセンサス配列が存在する好ましい実施形態では、個々の部位のグリコシル化を識別することが可能となるように、コンセンサス配列が相互に異なる配列を有する。

一実施形態において、本発明の改変されたClfAタンパク質は、配列番号10、11又は12の免疫原性断片及び/又は変異体である配列番号10、11、又は12に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列に由来するものでもよい。一実施形態において、本発明の改変されたClfAタンパク質は、全長配列の少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約40、又は少なくとも約60の連続したアミノ酸残基を含む配列番号10、11、又は12の免疫原性断片に由来するものでもよく、前記ポリペプチドは、前記アミノ酸配列に特異的な免疫応答を誘発することができる。

一実施形態において、本発明の改変されたClfAタンパク質は、配列番号10、11、又は12の変異体であり、1個以上のアミノ酸(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸)の欠失及び/又は付加及び/又は置換によって改変された配列番号10、11、又は12に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列に由来するものでもよい。アミノ酸置換は、保存的でも、非保存的でもよい。一態様において、アミノ酸置換は保存的である。置換、欠失、付加、又はこれらの任意の組合せは、変異体が免疫原性ポリペプチドである限り1つの変異体内に組み合わせてもよい。一実施形態において、本発明の改変されたClfAタンパク質は、1～10、5～10、1～5、1～3、1～2、又は1個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠失、又は付加されている変異体に由来するものでもよい。

用語「改変されたClfAタンパク質」は、ClfAアミノ酸配列(例えば、配列番号10、11、若しくは12のClfAアミノ酸配列又は配列番号10、11、若しくは12に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列を有する)であって、1個以上のアミノ酸の付加、置換、又は欠失(例えば、配列番号19若しくは46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列の付加(挿入)、又は配列番号19若しくは46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列による1個以上のアミノ酸の置換)によって改変されているClfAアミノ酸配列を指す。改変されたClfAタンパク質は、1以上のコンセンサス配列の付加又は置換の他に、さらなる改変(付加、置換、欠失)も含むことができる。例えば、シグナル配列及び/又はペプチドタグを付加することができる。クローニングの際の補助のため、N末端及び/又はC末端(例えば、存在する場合、シグナル配列の後又はペプチドタグの前)に付加したアミノ酸が含まれていてもよい。一実施形態において、本発明の改変されたClfAタンパク質は、天然に存在しないClfAタンパク質でもよい。

本発明の一実施形態において、改変されたClfAアミノ酸配列(例えば、配列番号10、11、若しくは12のアミノ酸配列又は配列番号10、11、若しくは12に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるClfAアミノ酸配列を有する)の1個以上のアミノ酸(例えば1～7個のアミノ酸、例えば1個のアミノ酸)は、配列番号19又は配列番号46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列、例えば配列番号20又は42～45又は47、特に配列番号42～44によって置換されている。例えば、ClfAアミノ酸配列(例えば配列番号10、11、又は12)の1個のアミノ酸が前記コンセンサス配列で置き換えられていてもよい。あるいは、EPAアミノ酸配列(例えば配列番号10、11、若しくは12又は配列番号10、11、若しくは12に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるClfAアミノ酸配列)中の2、3、4、5、6、又は7のアミノ酸が前記コンセンサス配列で置き換えられていてもよい。

コンセンサス配列の導入は、改変されたClfAタンパク質のグリコシル化を可能にする。したがって、本発明は、改変されたClfAタンパク質がグリコシル化されている、本発明の改変されたClfAタンパク質も提供する。特定の実施形態では、コンセンサス配列は、ClfAアミノ酸配列の特定の領域、例えばタンパク質の表面構造、タンパク質のN末端若しくはC末端、及び/又はジスルフィド架橋によって安定化されたループに導入される。

当業者ならば、ClfAアミノ酸配列が配列番号10、11、又は12のアミノ酸配列の変異体及び/又は断片、例えば配列番号10、11、又は12に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列である場合、「...アミノ酸の間」への言及は、2つの配列間の配列同一性を最大化するためにこの配列を配列番号10、11、又は12のアミノ酸配列と並べられた場合に、定義された位置と同等であろう位置を指すことを理解する。配列アラインメントツールについては上に記載されている。配列番号10、11、又は12の変異体及び/又は断片におけるアミノ酸の付加又は欠失は、突然変異した配列中のコンセンサス配列の実際のアミノ酸位置の相違をもたらす可能性があるが、突然変異した配列を参照配列と並べることによって、参照配列中の対応するアミノ酸と同等の位置にあるアミノ酸を同定することができ、それゆえに、コンセンサス配列の付加又は置換に適切な位置を確立することができる。

このようなグリコシル化部位の導入は、例えばタンパク質の一次構造に新しいアミノ酸を付加する(すなわち、グリコシル化部位を完全又は部分的に付加する)ことによって、又はグリコシル化部位を生じさせるためにタンパク質中の既存のアミノ酸を突然変異させる(すなわち、タンパク質にアミノ酸が付加されないが、タンパク質の選択されたアミノ酸が、グリコシル化部位を形成するように突然変異する)ことによって達成することができる。当業者ならば、当該技術分野で公知であるアプローチ、例えば、タンパク質をコードしている核酸配列の改変を含む組換えアプローチを用いてタンパク質のアミノ酸配列を容易に改変することができることを認識する。

一実施形態において、本発明の改変されたClfAタンパク質は、「ペプチドタグ」又は「タグ」、すなわち、改変されたClfAタンパク質の単離及び/又は同定を可能にする配列のアミノ酸をさらに含む。例えば、本発明の改変されたEPAタンパク質にタグを付加することは、そのタンパク質の精製、それゆえ、タグ付けされた改変されたClfAタンパク質を含むコンジュゲートワクチンの精製に有用であり得る。本明細書で使用することができる例示的なタグは、限定されないが、ヒスチジン(HIS)タグを含む。一実施形態において、タグはヘキサヒスチジンタグである。特定の実施形態では、本明細書で使用されるタグは、もはや必要とされなくなった場合、例えばタンパク質が精製された後に除去が可能、例えば化学薬品又は酵素的手段による除去が可能である。任意選択的に、ペプチドタグはアミノ酸配列のC末端に位置する。任意選択的に、ペプチドタグはアミノ酸配列のC末端に6つのヒスチジン残基を含む。ペプチドタグは、1つ、2つ、又はそれより多くの追加のアミノ酸残基、例えばアラニン、セリン、及び/又はグリシン残基、例えばGSを含んでも、それに先行されてもよい。

CRM197:ジフテリア毒素の無毒性変異体。
一実施形態において、担体タンパク質は、CRM197であり、これは、ジフテリア毒素との比較で1つの点突然変異G52Eを有するジフテリア毒素の遺伝的に解毒された突然変異体である。CRM197は、いくつかの商業化されたワクチンで使用されている、広範に使用されており、詳細に試験されている担体タンパク質である。DTのアミノ酸配列を配列番号4に示し、CRM197の配列を配列番号5に示す。

したがって、本発明の一態様では、それが、上で定義した通りのアミノ酸配列K/R-(Z)_0-9-D/E-X-N-Y-S/T-(Z)_0-9-K/R(配列番号46)を含むか、又はそれからなる1以上のコンセンサス配列、例えば、アミノ酸配列K/R-D/E-X₁-N-X₂-S/T-Z₁-Z₂-K/R(配列番号19)を有する1以上のコンセンサス配列を含むという点で改変されている配列番号5のアミノ酸配列又は配列番号5に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列を含む改変されたCRM197タンパク質が提供され、配列中、X₁及びX₂は、独立して、プロリンを除いた任意のアミノ酸であり、Z₁及びZ₂はリジン又はアルギニンではない。一実施形態において、前記コンセンサス配列が配列番号20のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態において、前記コンセンサス配列が配列番号42～45のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。好ましい実施形態では、前記コンセンサス配列が配列番号42～44のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。

一実施形態において、前記改変されたCRM197タンパク質は、複数の前記コンセンサス配列、例えば2、3、4、又は5つのコンセンサス配列を含む。複数のコンセンサス配列が存在する好ましい実施形態では、個々の部位のグリコシル化を識別することが可能となるように、コンセンサス配列が相互に異なる配列を有する。

一実施形態において、本発明の改変されたCRM197タンパク質は、配列番号5の免疫原性断片及び/又は変異体である配列番号5に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列に由来するものでもよい。一実施形態において、本発明の改変されたCRM197タンパク質は、全長配列の少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約40、又は少なくとも約60の連続したアミノ酸残基を含む配列番号5の免疫原性断片に由来するものでもよく、前記ポリペプチドは、前記アミノ酸配列に特異的な免疫応答を誘発することができる。

一実施形態において、本発明の改変されたCRM197タンパク質は、1個以上のアミノ酸(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸)の欠失及び/又は付加及び/又は置換によって改変された配列番号5の変異体である配列番号5に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列に由来するものでもよい。アミノ酸置換は、保存的であるか又は非保存的であり得る。1つの態様では、アミノ酸置換は保存的である。置換、欠失、付加又はそれらの任意の組合せは、変異体が免疫原性ポリペプチドである限り、単一の変異体において組み合わせることができる。一実施形態において、本発明の改変されたCRM197タンパク質は、1～10、5～10、1～5、1～3、1～2、又は1個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠失、又は付加されている変異体に由来するものでもよい。

用語「改変されたCRM197タンパク質」は、1個以上のアミノ酸の付加、置換、又は欠失(例えば配列番号19若しくは46の、アミノ酸配列を有するコンセンサス配列の付加(挿入)、又は配列番号19若しくは46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列による1個以上のアミノ酸の置換)によって改変されているCRM197アミノ酸配列(例えば、配列番号5のCRM197アミノ酸配列又は配列番号5に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列を有する)を指す。改変されたCRM197タンパク質は、1以上のコンセンサス配列の付加又は置換の他に、さらなる改変(付加、置換、欠失)も含むことができる。例えば、シグナル配列及び/又はペプチドタグを付加することができる。クローニングの際の補助のため、N末端及び/又はC末端(例えば、存在する場合、シグナル配列の後又はペプチドタグの前)に付加したアミノ酸が含まれていてもよい。

本発明の一実施形態において、改変されたCRM197アミノ酸配列(例えば、配列番号5のアミノ酸配列を有する)の1個以上のアミノ酸(例えば1～7個のアミノ酸、例えば1個のアミノ酸)は、配列番号19又は配列番号46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列、例えば配列番号20又は42～45又は47、特に配列番号42～44によって置換されている。例えば、CRM197アミノ酸配列(例えば配列番号5)の1個のアミノ酸が前記コンセンサス配列で置き換えられていてもよい。あるいは、CRM197アミノ酸配列(例えば配列番号5)の2、3、4、5、6、又は7のアミノ酸が前記コンセンサス配列で置き換えられてもよい。

コンセンサス配列の導入は、改変されたCRM197タンパク質のグリコシル化を可能にする。したがって、本発明は、改変されたCRM197タンパク質がグリコシル化されている本発明の改変されたCRM197タンパク質も提供する。特定の実施形態では、コンセンサス配列は、CRM197アミノ酸配列の特定の領域、例えばタンパク質の表面構造、タンパク質のN末端若しくはC末端、及び/又はジスルフィド架橋によって安定化されたループに導入される。

当業者ならば、CRM197アミノ酸配列が配列番号5のアミノ酸配列の変異体及び/又は断片、例えば、配列番号5に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列である場合、「...アミノ酸の間」への言及は、2つの配列間の配列同一性を最大化するためにこの配列を配列番号5のアミノ酸配列と並べられた場合に、定義された位置と同等であろう位置（同等となる位置）を指すことを理解する。配列アラインメントツールについては上に記載されている。配列番号5の変異体及び/又は断片におけるアミノ酸の付加又は欠失は、突然変異した配列中のコンセンサス配列の実際のアミノ酸位置の相違をもたらす可能性があるが、突然変異した配列を参照配列と並べることによって、参照配列中の対応するアミノ酸と同等の位置にあるアミノ酸を同定することができ、それゆえに、コンセンサス配列の付加又は置換に適切な位置を確立することができる。

このようなグリコシル化部位の導入は、例えば、タンパク質の一次構造に新しいアミノ酸を付加する(すなわち、グリコシル化部位が全部又は一部に付加される)ことによって、又はグリコシル化部位を生じさせるためにタンパク質中の既存のアミノ酸を突然変異させること(すなわち、アミノ酸はタンパク質に付加されないが、タンパク質の選択されたアミノ酸が、グリコシル化部位を形成するように突然変異される)ことによって達成することができる。当業者は、タンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野において公知であるアプローチ、例えば、タンパク質をコードする核酸配列の改変を含む組換えアプローチを用いて容易に改変し得ることを認識する。

一実施形態において、本発明の改変されたCRM197タンパク質は、「ペプチドタグ」又は「タグ」、すなわち、改変されたCRM197タンパク質の単離及び/又は同定を可能にする1配列のアミノ酸をさらに含む。例えば、本発明の改変されたCRM197タンパク質にタグを付加することは、そのタンパク質の精製、それゆえ、タグ付けされた改変されたCRM197タンパク質を含むコンジュゲートワクチンの精製に有用であり得る。本明細書で使用することができる例示的なタグは、限定されないが、ヒスチジン(HIS)タグを含む。一実施形態において、タグは、ヘキサヒスチジンタグである。特定の実施形態では、本明細書で使用されるタグは、もはや必要とされなくなった場合、例えばタンパク質が精製された後に除去が可能、例えば化学薬品又は酵素的手段による除去が可能である。任意選択的に、ペプチドタグはアミノ酸配列のC末端に位置する。任意選択的に、ペプチドタグはアミノ酸配列のC末端に6つのヒスチジン残基を含む。ペプチドタグは、1、2、又はそれより多くの追加のアミノ酸残基、例えばアラニン、セリン、及び/又はグリシン残基、例えばGSを含んでも、それに先行されてもよい。

破傷風毒素
破傷風菌培養物によって生産される破傷風毒素(TT)は、ホルムアルデヒド不活性化による解毒の後、担体として広く用いられている。毒性が低下しているTTの断片も、組換え手段によって生産されている。

したがって、本発明の一態様では、それが、上で定義した通りのアミノ酸配列K/R-(Z)_0-9-D/E-X-N-Y-S/T-(Z)_0-9-K/R(配列番号46)を含むか、又はそれからなる1以上のコンセンサス配列、例えば、アミノ酸配列K/R-D/E-X₁-N-X₂-S/T-Z₁-Z₂-K/R(配列番号19)を有する1以上のコンセンサス配列を含むという点で改変されている、配列番号3のアミノ酸配列又は配列番号3に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含む改変されたTTタンパク質が提供され、配列中、X₁及びX₂は、独立して、プロリンを除いた任意のアミノ酸であり、Z₁及びZ₂はリジン又はアルギニンではない。一実施形態において、前記コンセンサス配列が配列番号20のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態において、前記コンセンサス配列が配列番号42～45のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。好ましい実施形態では、前記コンセンサス配列が配列番号42～44のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。

一実施形態において、前記改変されたTTタンパク質は、複数の前記コンセンサス配列、例えば2、3、4、又は5つのコンセンサス配列を含む。複数のコンセンサス配列が存在する好ましい実施形態では、個々の部位のグリコシル化を識別することが可能となるように、コンセンサス配列が相互に異なる配列を有する。

一実施形態において、本発明の改変されたTTタンパク質は、配列番号3の免疫原性断片及び/又は変異体である配列番号3に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列に由来するものでもよい。一実施形態において、本発明の改変されたTTタンパク質は、全長配列の少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約40、又は少なくとも約60の連続したアミノ酸残基を含む配列番号3又は2の免疫原性断片に由来するものでもよく、前記ポリペプチドは、前記アミノ酸配列に特異的な免疫応答を誘発することができる。

一実施形態において、本発明の改変されたTTタンパク質は、1個以上のアミノ酸(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸)の欠失及び/又は付加及び/又は置換によって改変された、配列番号3の変異体である配列番号3に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列に由来するものでもよい。アミノ酸置換は、保存的でも、非保存的でもよい。一態様において、アミノ酸置換は保存的である。置換、欠失、付加、又はこれらの任意の組合せは、変異体が免疫原性ポリペプチドである限り1つの変異体内に組み合わせてもよい。一実施形態において、本発明の改変されたTTタンパク質は、1～10、5～10、1～5、1～3、1～2、又は1個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠失、又は付加されている変異体に由来するものでもよい。

一実施形態において、本発明は、B細胞又はT細胞エピトープを含む断片及び/又は変異体を含む。そのようなエピトープは、2D構造予測の組合せを用いて、例えばPSIPREDプログラム(David Jones、Brunel Bioinformatics Group、Dept. Biological Sciences、Brunel University、Uxbridge UB8 3PH、UKから)とJameson及びWolf(CABIOS 4巻：181～186頁[1988年])に記載される方法に基づいて計算される抗原性インデックスとを用いて予測することができる。

用語「改変されたTTタンパク質」は、TTアミノ酸配列(例えば、配列番号3のTTアミノ酸配列又は配列番号3に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列を有する)であって、TTアミノ酸配列が、野生型成熟TTアミノ酸配列(例えば、配列番号3の野生型アミノ酸配列)でもよく、1個以上のアミノ酸の付加、置換、又は欠失(例えば、配列番号19若しくは46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列の付加(挿入)、又は配列番号19若しくは46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列による1個以上のアミノ酸の置換)によって改変されているTTアミノ酸配列を指す。改変されたTTタンパク質は、1以上のコンセンサス配列の付加又は置換の他に、さらなる改変(付加、置換、欠失)も含むことができる。例えば、シグナル配列及び/又はペプチドタグを付加することができる。クローニングの際の補助のため、N末端及び/又はC末端(例えば、存在する場合、シグナル配列の後又はペプチドタグの前)に付加したアミノ酸が含まれていてもよい。一実施形態において、本発明の改変されたTTタンパク質は、天然に存在しないTTタンパク質でもよい。

本発明の一実施形態において、改変されたTTアミノ酸配列(例えば、配列番号3のアミノ酸配列又は配列番号3に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるTTアミノ酸配列を有する)の1個以上のアミノ酸(例えば1～7個のアミノ酸、例えば1個のアミノ酸)は、配列番号19又は配列番号46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列、例えば配列番号20又は42～45又は47、特に配列番号42～44によって置換されている。例えば、TTアミノ酸配列(例えば配列番号3)の1個のアミノ酸が前記コンセンサス配列で置き換えられていてもよい。あるいは、TTアミノ酸配列の2、3、4、5、6、又は7のアミノ酸(例えば配列番号3又は配列番号3に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるTTアミノ酸配列)が前記コンセンサス配列で置き換えられているものでもよい。

コンセンサス配列の導入は、改変されたTTタンパク質のグリコシル化を可能にする。したがって、本発明は、改変されたTTタンパク質がグリコシル化されている本発明の改変されたTTタンパク質も提供する。特定の実施形態では、コンセンサス配列は、TTアミノ酸配列の特定の領域、例えばタンパク質の表面構造、タンパク質のN末端若しくはC末端、及び/又はジスルフィド架橋によって安定化されたループに導入される。

当業者ならば、TTアミノ酸配列が配列番号3のアミノ酸配列の変異体及び/又は断片、例えば、配列番号3に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列である場合、「...アミノ酸の間」への言及は、2つの配列間の配列同一性を最大化するためにこの配列を配列番号3のアミノ酸配列と並べられた場合に、定義された位置と同等であろう位置を指すことを理解する。配列アラインメントツールについては上に記載されている。配列番号3の変異体及び/又は断片におけるアミノ酸の付加又は欠失は、突然変異した配列中のコンセンサス配列の実際のアミノ酸位置の相違をもたらす可能性があるが、突然変異した配列を参照配列と並べることによって、参照配列中の対応するアミノ酸と同等の位置にあるアミノ酸を同定することができ、それゆえに、コンセンサス配列の付加又は置換に適切な位置を確立することができる。

一実施形態において、本発明の改変されたTTタンパク質は、「ペプチドタグ」又は「タグ」、すなわち、改変されたTTタンパク質の単離及び/又は同定を可能にする1配列のアミノ酸をさらに含む。例えば、本発明の改変されたTTタンパク質にタグを付加することは、そのタンパク質の精製、それゆえ、タグ付けされた改変されたTTタンパク質を含むコンジュゲートワクチンの精製に有用であり得る。本明細書で使用することができる例示的なタグは、限定されないが、ヒスチジン(HIS)タグを含む。一実施形態において、タグはヘキサヒスチジンタグである。特定の実施形態では、本明細書で使用されるタグは、もはや必要とされなくなった場合、例えばタンパク質が精製された後に除去が可能、例えば化学薬品又は酵素的手段による除去が可能である。任意選択的に、ペプチドタグはアミノ酸配列のC末端に位置する。任意選択的に、ペプチドタグはアミノ酸配列のC末端に6つのヒスチジン残基を含む。ペプチドタグは、1、2、又はそれより多くの追加のアミノ酸残基、例えばアラニン、セリン、及び/又はグリシン残基、例えばGSを含んでも、それに先行されてもよい。

Hcp1：緑膿菌由来のタンパク質Hcp1
一実施形態において、担体タンパク質は、緑膿菌由来のHcp1(Hcp1)である。前記Hcp1は、配列番号6のアミノ酸配列又は配列番号6に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含むものでもよい。

したがって、本発明の一態様では、それが、上で定義した通りのアミノ酸配列K/R-(Z)_0-9-D/E-X-N-Y-S/T-(Z)_0-9-K/R(配列番号46)を含むか、又はそれからなる1以上のコンセンサス配列、例えば、アミノ酸配列K/R-D/E-X₁-N-X₂-S/T-Z₁-Z₂-K/R(配列番号19)を有する1以上のコンセンサス配列を含むという点で改変されている、配列番号6のアミノ酸配列又は配列番号6に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含む改変されたHcp1タンパク質が提供され、配列中、X₁及びX₂は、独立して、プロリンを除いた任意のアミノ酸であり、Z₁及びZ₂はリジン又はアルギニンではない。一実施形態において、前記コンセンサス配列が配列番号20のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態において、前記コンセンサス配列が配列番号42～45のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。好ましい実施形態では、前記コンセンサス配列が配列番号42～44のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。

一実施形態において、前記改変されたHcp1タンパク質は、複数の前記コンセンサス配列、例えば2、3、4、又は5つのコンセンサス配列を含む。複数のコンセンサス配列が存在する好ましい実施形態では、個々の部位のグリコシル化を識別することが可能となるように、コンセンサス配列が相互に異なる配列を有する。

一実施形態において、本発明の改変されたHcp1タンパク質は、配列番号6の免疫原性断片及び/又は変異体である配列番号6に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列に由来するものでもよい。一実施形態において、本発明の改変されたHcp1タンパク質は、全長配列の少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約40、又は少なくとも約60の連続したアミノ酸残基を含む配列番号6の免疫原性断片に由来するものでもよく、前記ポリペプチドは、前記アミノ酸配列に特異的な免疫応答を誘発することができる。

一実施形態において、本発明の改変されたHcp1タンパク質は、1個以上のアミノ酸(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸)の欠失及び/又は付加及び/又は置換によって改変された、配列番号6の変異体である配列番号6に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列に由来するものでもよい。アミノ酸置換は、保存的でも、非保存的でもよい。一態様において、アミノ酸置換は保存的である。置換、欠失、付加、又はこれらの任意の組合せは、変異体が免疫原性ポリペプチドである限り1つの変異体内に組み合わせてもよい。一実施形態において、本発明の改変されたHcp1タンパク質は、1～10、5～10、1～5、1～3、1～2、又は1個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠失、又は付加されている変異体に由来するものでもよい。

用語「改変されたHcp1タンパク質」は、Hcp1アミノ酸配列(例えば、配列番号6のHcp1アミノ酸配列又は配列番号6に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列を有する)であって、1個以上のアミノ酸の付加、置換、又は欠失(例えば、配列番号19若しくは46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列の付加(挿入)、又は配列番号19若しくは46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列による1個以上のアミノ酸の置換)によって改変されているHcp1アミノ酸配列を指す。改変されたHcp1タンパク質は、1以上のコンセンサス配列の付加又は置換の他に、さらなる改変(付加、置換、欠失)も含むことができる。例えば、シグナル配列及び/又はペプチドタグを付加することができる。クローニングの際の補助のため、N末端及び/又はC末端(例えば、存在する場合、シグナル配列の後又はペプチドタグの前)に付加したアミノ酸が含まれていてもよい。一実施形態において、本発明の改変されたHcp1タンパク質は、天然に存在しないHcp1タンパク質でもよい。

本発明の一実施形態において、改変されたHcp1アミノ酸配列(例えば、配列番号6のアミノ酸配列又は配列番号6に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるHcp1アミノ酸配列を有する)の1個以上のアミノ酸(例えば1～7個のアミノ酸、例えば1個のアミノ酸)は、配列番号19又は配列番号46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列、例えば配列番号20又は42～45又は47、特に配列番号42～44によって置換されている。例えば、Hcp1アミノ酸配列(例えば配列番号6)の1個のアミノ酸が前記コンセンサス配列で置き換えられていてもよい。あるいは、HCP6アミノ酸配列の2、3、4、5、6、又は7のアミノ酸(例えば配列番号6又は配列番号6に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるHcp1アミノ酸配列)が前記コンセンサス配列で置き換えられているものでもよい。

コンセンサス配列の導入は、改変されたHcp1タンパク質のグリコシル化を可能にする。したがって、本発明は、改変されたHcp1タンパク質がグリコシル化されている、本発明の改変されたHcp1タンパク質も提供する。特定の実施形態では、コンセンサス配列は、Hcp1アミノ酸配列の特定の領域、例えばタンパク質の表面構造、タンパク質のN末端若しくはC末端、及び/又はジスルフィド架橋によって安定化されたループに導入される。

当業者ならば、Hcp1アミノ酸配列が配列番号6のアミノ酸配列の変異体及び/又は断片、例えば、配列番号6に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列である場合、「...アミノ酸の間」への言及は、2つの配列間の配列同一性を最大化するためにこの配列を配列番号6のアミノ酸配列と並べられた場合に、定義された位置と同等であろう位置を指すことを理解する。配列アラインメントツールについては上に記載されている。配列番号6の変異体及び/又は断片におけるアミノ酸の付加又は欠失は、突然変異した配列中のコンセンサス配列の実際のアミノ酸位置の相違をもたらす可能性があるが、突然変異した配列を参照配列と並べることによって、参照配列中の対応するアミノ酸と同等の位置にあるアミノ酸を同定することができ、それゆえに、コンセンサス配列の付加又は置換に適切な位置を確立することができる。

一実施形態において、本発明の改変されたHcp1タンパク質は、「ペプチドタグ」又は「タグ」、すなわち、改変されたHcp1タンパク質の単離及び/又は同定を可能にする1配列のアミノ酸をさらに含む。例えば、本発明の改変されたHcp1タンパク質にタグを付加することは、そのタンパク質の精製、それゆえ、タグ付けされた改変されたHcp1タンパク質を含むコンジュゲートワクチンの精製に有用であり得る。本明細書で使用することができる例示的なタグは、限定されないが、ヒスチジン(HIS)タグを含む。一実施形態において、タグはヘキサヒスチジンタグである。特定の実施形態では、本明細書で使用されるタグは、もはや必要とされなくなった場合、例えばタンパク質が精製された後に除去が可能、例えば化学薬品又は酵素的手段による除去が可能である。任意選択的に、ペプチドタグはアミノ酸配列のC末端に位置する。任意選択的に、ペプチドタグはアミノ酸配列のC末端に6つのヒスチジン残基を含む。ペプチドタグは、1、2、又はそれより多くの追加のアミノ酸残基、例えばアラニン、セリン、及び/又はグリシン残基、例えばGSを含んでも、それに先行されてもよい。

MBP：大腸菌由来のマルトース/マルトデキストリン結合タンパク質。
一実施形態において、担体タンパク質は、緑膿菌由来の外毒素A(MBP)である。前記MBPは、配列番号8のアミノ酸配列又は配列番号8に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含むものでもよい。

したがって、本発明の一態様では、それが、上で定義した通りのアミノ酸配列K/R-(Z)_0-9-D/E-X-N-Y-S/T-(Z)_0-9-K/R(配列番号46)を含むか、又はそれからなる1以上のコンセンサス配列、例えば、アミノ酸配列K/R-D/E-X₁-N-X₂-S/T-Z₁-Z₂-K/R(配列番号19)を有する1以上のコンセンサス配列を含むという点で改変されている、配列番号8のアミノ酸配列又は配列番号8に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含む改変されたMBPタンパク質が提供され、配列中、X₁及びX₂は、独立して、プロリンを除いた任意のアミノ酸であり、Z₁及びZ₂はリジン又はアルギニンではない。一実施形態において、前記コンセンサス配列が配列番号20のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態において、前記コンセンサス配列が配列番号42～45のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。好ましい実施形態では、前記コンセンサス配列が配列番号42～44のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。

一実施形態において、前記改変されたMBPタンパク質は、複数の前記コンセンサス配列、例えば2、3、4、又は5つのコンセンサス配列を含む。複数のコンセンサス配列が存在する好ましい実施形態では、個々の部位のグリコシル化を識別することが可能となるように、コンセンサス配列が相互に異なる配列を有する。

一実施形態において、本発明の改変されたMBPタンパク質は、配列番号8の免疫原性断片及び/又は変異体である配列番号8に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列に由来するものでもよい。一実施形態において、本発明の改変されたMBPタンパク質は、全長配列の少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約40、又は少なくとも約60の連続したアミノ酸残基を含む配列番号8の免疫原性断片に由来するものでもよく、前記ポリペプチドは、前記アミノ酸配列に特異的な免疫応答を誘発することができる。

一実施形態において、本発明の改変されたMBPタンパク質は、1個以上のアミノ酸(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸)の欠失及び/又は付加及び/又は置換によって改変された、配列番号8の変異体である配列番号8に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列に由来するものでもよい。アミノ酸置換は、保存的でも、非保存的でもよい。一態様において、アミノ酸置換は保存的である。置換、欠失、付加、又はこれらの任意の組合せは、変異体が免疫原性ポリペプチドである限り1つの変異体内に組み合わせてもよい。一実施形態において、本発明の改変されたMBPタンパク質は、1～10、5～10、1～5、1～3、1～2、又は1個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠失、又は付加されている変異体に由来するものでもよい。

用語「改変されたMBPタンパク質」は、MBPアミノ酸配列(例えば、配列番号8のMBPアミノ酸配列又は配列番号8に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列を有する)であって、MBPアミノ酸配列が、野生型成熟MBPアミノ酸配列(例えば、配列番号8の野生型アミノ酸配列)でもよく、1個以上のアミノ酸の付加、置換、又は欠失(例えば、配列番号19若しくは46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列の付加(挿入)、又は配列番号19若しくは46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列による1個以上のアミノ酸の置換)によって改変されている、MBPアミノ酸配列を指す。改変されたMBPタンパク質は、1以上のコンセンサス配列の付加又は置換の他に、さらなる改変(付加、置換、欠失)も含むことができる。例えば、シグナル配列及び/又はペプチドタグを付加することができる。クローニングの際の補助のため、N末端及び/又はC末端(例えば、存在する場合、シグナル配列の後又はペプチドタグの前)に付加したアミノ酸が含まれていてもよい。一実施形態において、本発明の改変されたMBPタンパク質は、天然に存在しないMBPタンパク質でもよい。

本発明の一実施形態において、改変されたMBPアミノ酸配列(例えば、配列番号8のアミノ酸配列又は配列番号8に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるMBPアミノ酸配列を有する)の1個以上のアミノ酸(例えば1～7個のアミノ酸、例えば1個のアミノ酸)は、配列番号19又は配列番号46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列、例えば配列番号20又は42～45又は47、特に配列番号42～44によって置換されている。例えば、MBPアミノ酸配列(例えば配列番号8)の1個のアミノ酸が前記コンセンサス配列で置き換えられていてもよい。あるいは、MBPアミノ酸配列の2、3、4、5、6、又は7のアミノ酸(例えば配列番号8又は配列番号8に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるMBPアミノ酸配列)が前記コンセンサス配列で置き換えられているものでもよい。

コンセンサス配列の導入は、改変されたMBPタンパク質のグリコシル化を可能にする。したがって、本発明は、改変されたMBPタンパク質がグリコシル化されている、本発明の改変されたMBPタンパク質も提供する。特定の実施形態では、コンセンサス配列は、MBPアミノ酸配列の特定の領域、例えばタンパク質の表面構造、タンパク質のN末端若しくはC末端、及び/又はジスルフィド架橋によって安定化されたループに導入される。

当業者ならば、MBPアミノ酸配列が配列番号8のアミノ酸配列の変異体及び/又は断片、例えば、配列番号8に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列である場合、「...アミノ酸の間」への言及は、2つの配列間の配列同一性を最大化するためにこの配列を配列番号8のアミノ酸配列と並べられた場合に、定義された位置と同等であろう位置を指すことを理解する。配列アラインメントツールについては上に記載されている。配列番号8の変異体及び/又は断片におけるアミノ酸の付加又は欠失は、突然変異した配列中のコンセンサス配列の実際のアミノ酸位置の相違をもたらす可能性があるが、突然変異した配列を参照配列と並べることによって、参照配列中の対応するアミノ酸と同等の位置にあるアミノ酸を同定することができ、それゆえに、コンセンサス配列の付加又は置換に適切な位置を確立することができる。

一実施形態において、本発明の改変されたMBPタンパク質は、「ペプチドタグ」又は「タグ」、すなわち、改変されたMBPタンパク質の単離及び/又は同定を可能にする1配列のアミノ酸をさらに含む。例えば、本発明の改変されたMBPタンパク質にタグを付加することは、そのタンパク質の精製、それゆえ、タグ付けされた改変されたMBPタンパク質を含むコンジュゲートワクチンの精製に有用であり得る。本明細書で使用することができる例示的なタグは、限定されないが、ヒスチジン(HIS)タグを含む。一実施形態において、タグはヘキサヒスチジンタグである。特定の実施形態では、本明細書で使用されるタグは、もはや必要とされなくなった場合、例えばタンパク質が精製された後に除去が可能、例えば化学薬品又は酵素的手段による除去が可能である。任意選択的に、ペプチドタグはアミノ酸配列のC末端に位置する。任意選択的に、ペプチドタグはアミノ酸配列のC末端に6つのヒスチジン残基を含む。ペプチドタグは、1、2、又はそれより多くの追加のアミノ酸残基、例えばアラニン、セリン、及び/又はグリシン残基、例えばGSを含んでも、それに先行されてもよい。

MtrE：淋菌由来の膜トランスポーターE。
一実施形態において、担体タンパク質は、淋菌由来の膜トランスポーターE(MtrE)である。前記MtrEは、配列番号9のアミノ酸配列又は配列番号9に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含むものでもよい。

したがって、本発明の一態様では、それが、上で定義した通りのアミノ酸配列K/R-(Z)_0-9-D/E-X-N-Y-S/T-(Z)_0-9-K/R(配列番号46)を含むか、又はそれからなる1以上のコンセンサス配列、例えば、アミノ酸配列K/R-D/E-X₁-N-X₂-S/T-Z₁-Z₂-K/R(配列番号19)を有する1以上のコンセンサス配列を含むという点で改変されている、配列番号9のアミノ酸配列又は配列番号9に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含む改変されたMtrEタンパク質が提供され、配列中、X₁及びX₂は、独立して、プロリンを除いた任意のアミノ酸であり、Z₁及びZ₂はリジン又はアルギニンではない。一実施形態において、前記コンセンサス配列が配列番号20のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態において、前記コンセンサス配列が配列番号42～45のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。好ましい実施形態では、前記コンセンサス配列が配列番号42～44のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。

一実施形態において、前記改変されたMtrEタンパク質は、複数の前記コンセンサス配列、例えば2、3、4、又は5つのコンセンサス配列を含む。複数のコンセンサス配列が存在する好ましい実施形態では、個々の部位のグリコシル化を識別することが可能となるように、コンセンサス配列が相互に異なる配列を有する。

一実施形態において、本発明の改変されたMtrEタンパク質は、配列番号9の免疫原性断片及び/又は変異体である配列番号9に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列に由来するものでもよい。一実施形態において、本発明の改変されたMtrEタンパク質は、全長配列の少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約40、又は少なくとも約60の連続したアミノ酸残基を含む配列番号9の免疫原性断片に由来するものでもよく、前記ポリペプチドは、前記アミノ酸配列に特異的な免疫応答を誘発することができる。

一実施形態において、本発明の改変されたMtrEタンパク質は、1個以上のアミノ酸(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸)の欠失及び/又は付加及び/又は置換によって改変された、配列番号9の変異体である配列番号9に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列に由来するものでもよい。アミノ酸置換は、保存的でも、非保存的でもよい。一態様において、アミノ酸置換は保存的である。置換、欠失、付加、又はこれらの任意の組合せは、変異体が免疫原性ポリペプチドである限り1つの変異体内に組み合わせてもよい。一実施形態において、本発明の改変されたMtrEタンパク質は、1～10、5～10、1～5、1～3、1～2、又は1個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠失、又は付加されている変異体に由来するものでもよい。

用語「改変されたMtrEタンパク質」は、MtrEアミノ酸配列(例えば、配列番号9のMtrEアミノ酸配列又は配列番号9に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列を有する)であって、MtrEアミノ酸配列が、野生型成熟MtrEアミノ酸配列(例えば、配列番号9の野生型アミノ酸配列)でもよく、1個以上のアミノ酸の付加、置換、又は欠失(例えば、配列番号19若しくは46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列の付加(挿入)、又は配列番号19若しくは46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列による1個以上のアミノ酸の置換)によって改変されているMtrEアミノ酸配列を指す。改変されたMtrEタンパク質は、1以上のコンセンサス配列の付加又は置換の他に、さらなる改変(付加、置換、欠失)も含むことができる。例えば、シグナル配列及び/又はペプチドタグを付加することができる。クローニングの際の補助のため、N末端及び/又はC末端(例えば、存在する場合、シグナル配列の後又はペプチドタグの前)に付加したアミノ酸が含まれていてもよい。一実施形態において、本発明の改変されたMtrEタンパク質は、天然に存在しないMtrEタンパク質でもよい。

本発明の一実施形態において、改変されたMtrEアミノ酸配列(例えば、配列番号9のアミノ酸配列又は配列番号9、例えば、配列番号9に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるMtrEアミノ酸配列を有する)の1個以上のアミノ酸(例えば1～7個のアミノ酸、例えば1個のアミノ酸)は、配列番号19又は配列番号46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列、例えば配列番号20又は42～45又は47、特に配列番号42～44によって置換されている。例えば、MtrEアミノ酸配列(例えば配列番号9)の1個のアミノ酸が前記コンセンサス配列で置き換えられていてもよい。あるいは、MtrEアミノ酸配列の2、3、4、5、6、又は7のアミノ酸(例えば配列番号9又は配列番号9に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるMtrEアミノ酸配列)が前記コンセンサス配列で置き換えられているものでもよい。

コンセンサス配列の導入は、改変されたMtrEタンパク質のグリコシル化を可能にする。したがって、本発明は、改変されたMtrEタンパク質がグリコシル化されている、本発明の改変されたMtrEタンパク質も提供する。特定の実施形態では、コンセンサス配列は、MtrEアミノ酸配列の特定の領域、例えばタンパク質の表面構造、タンパク質のN末端若しくはC末端、及び/又はジスルフィド架橋によって安定化されたループに導入される。

当業者ならば、MtrEアミノ酸配列が配列番号9のアミノ酸配列の変異体及び/又は断片、例えば、配列番号9に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列である場合、「...アミノ酸の間」への言及は、2つの配列間の配列同一性を最大化するためにこの配列を配列番号9のアミノ酸配列と並べられた場合に、定義された位置と同等であろう位置を指すことを理解する。配列番号9の変異体及び/又は断片におけるアミノ酸の付加又は欠失は、突然変異した配列中のコンセンサス配列の実際のアミノ酸位置の相違をもたらす可能性があるが、突然変異した配列を参照配列と並べることによって、参照配列中の対応するアミノ酸と同等の位置にあるアミノ酸を同定することができ、それゆえに、コンセンサス配列の付加又は置換に適切な位置を確立することができる。

一実施形態において、本発明の改変されたMtrEタンパク質は、「ペプチドタグ」又は「タグ」、すなわち、改変されたMtrEタンパク質の単離及び/又は同定を可能にする1配列のアミノ酸をさらに含む。例えば、本発明の改変されたMtrEタンパク質にタグを付加することは、そのタンパク質の精製、それゆえ、タグ付けされた改変されたMtrEタンパク質を含むコンジュゲートワクチンの精製に有用であり得る。本明細書で使用することができる例示的なタグは、限定されないが、ヒスチジン(HIS)タグを含む。一実施形態において、タグはヘキサヒスチジンタグである。特定の実施形態では、本明細書で使用されるタグは、もはや必要とされなくなった場合、例えばタンパク質が精製された後に除去が可能、例えば化学薬品又は酵素的手段による除去が可能である。任意選択的に、ペプチドタグはアミノ酸配列のC末端に位置する。任意選択的に、ペプチドタグはアミノ酸配列のC末端に6つのヒスチジン残基を含む。ペプチドタグは、1、2、又はそれより多くの追加のアミノ酸残基、例えばアラニン、セリン、及び/又はグリシン残基、例えばGSを含んでも、それに先行されてもよい。

PspA、大腸菌由来のファージショックプロテインA。
一実施形態において、担体タンパク質は、緑膿菌由来のファージショックプロテインA(PspA)である。前記PspAは、配列番号7のアミノ酸配列又は配列番号7に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含むものでもよい。

したがって、本発明の一態様では、それが、上で定義した通りのアミノ酸配列K/R-(Z)_0-9-D/E-X-N-Y-S/T-(Z)_0-9-K/R(配列番号46)を含むか、又はそれからなる1以上のコンセンサス配列、例えば、アミノ酸配列K/R-D/E-X₁-N-X₂-S/T-Z₁-Z₂-K/R(配列番号19)を有する1以上のコンセンサス配列を含むという点で改変されている、配列番号7のアミノ酸配列又は配列番号7に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含む改変されたPspAタンパク質が提供され、配列中、X₁及びX₂は、独立して、プロリンを除いた任意のアミノ酸であり、Z₁及びZ₂はリジン又はアルギニンではない。一実施形態において、前記コンセンサス配列が配列番号20のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態において、前記コンセンサス配列が配列番号42～45のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。好ましい実施形態では、前記コンセンサス配列が配列番号42～44のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。

一実施形態において、前記改変されたPspAタンパク質は、複数の前記コンセンサス配列、例えば2、3、4、又は5つのコンセンサス配列を含む。複数のコンセンサス配列が存在する好ましい実施形態では、個々の部位のグリコシル化を識別することが可能となるように、コンセンサス配列が相互に異なる配列を有する。

一実施形態において、本発明の改変されたPspAタンパク質は、配列番号7の免疫原性断片及び/又は変異体である配列番号7に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列に由来するものでもよい。一実施形態において、本発明の改変されたPspAタンパク質は、全長配列の少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約40、又は少なくとも約60の連続したアミノ酸残基を含む配列番号7の免疫原性断片に由来するものでもよく、前記ポリペプチドは、前記アミノ酸配列に特異的な免疫応答を誘発することができる。

一実施形態において、本発明の改変されたPspAタンパク質は、1個以上のアミノ酸(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸)の欠失及び/又は付加及び/又は置換によって改変された、配列番号7の変異体である配列番号7に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列に由来するものでもよい。アミノ酸置換は、保存的でも、非保存的でもよい。一態様において、アミノ酸置換は保存的である。置換、欠失、付加、又はこれらの任意の組合せは、変異体が免疫原性ポリペプチドである限り1つの変異体内に組み合わせてもよい。一実施形態において、本発明の改変されたPspAタンパク質は、1～10、5～10、1～5、1～3、1～2、又は1個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠失、又は付加されている変異体に由来するものでもよい。

用語「改変されたPspAタンパク質」は、PspAアミノ酸配列(例えば、配列番号7のPspAアミノ酸配列又は配列番号7に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列を有する)であって、PspAアミノ酸配列が、野生型成熟PspAアミノ酸配列(例えば、配列番号7の野生型アミノ酸配列)でもよく、1個以上のアミノ酸の付加、置換、又は欠失(例えば、配列番号19若しくは46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列の付加(挿入)、又は配列番号19若しくは46のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列による1個以上のアミノ酸の置換)によって改変されているPspAアミノ酸配列を指す。改変されたPspAタンパク質は、1以上のコンセンサス配列の付加又は置換の他に、さらなる改変(付加、置換、欠失)も含むことができる。例えば、シグナル配列及び/又はペプチドタグを付加することができる。クローニングの際の補助のため、N末端及び/又はC末端(例えば、存在する場合、シグナル配列の後又はペプチドタグの前)に付加したアミノ酸が含まれていてもよい。一実施形態において、本発明の改変されたPspAタンパク質は、天然に存在しないPSPAタンパク質でもよい。

本発明の一実施形態において、改変されたPspAアミノ酸配列(例えば、配列番号7のアミノ酸配列又は配列番号7に少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるPSPAアミノ酸配列を有する)の1個以上のアミノ酸(例えば1～7個のアミノ酸、例えば1個のアミノ酸)は、配列番号19のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列、例えば配列番号20又は42～45、特に配列番号42～44によって置換されている。例えば、PspAアミノ酸配列(例えば配列番号7)の1個のアミノ酸が前記コンセンサス配列で置き換えられていてもよい。あるいは、PspAアミノ酸配列の2、3、4、5、6、又は7のアミノ酸(例えば配列番号7又は配列番号7に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるPspAアミノ酸配列)が前記コンセンサス配列で置き換えられているものでもよい。

コンセンサス配列の導入は、改変されたPspAタンパク質のグリコシル化を可能にする。したがって、本発明は、改変されたPspAタンパク質がグリコシル化されている、本発明の改変されたPspAタンパク質も提供する。特定の実施形態では、コンセンサス配列は、PspAアミノ酸配列の特定の領域、例えばタンパク質の表面構造、タンパク質のN末端若しくはC末端、及び/又はジスルフィド架橋によって安定化されたループに導入される。

当業者ならば、PspAアミノ酸配列が配列番号7のアミノ酸配列の変異体及び/又は断片、例えば、配列番号7に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列である場合、「...アミノ酸の間」への言及は、2つの配列間の配列同一性を最大化するためにこの配列を配列番号7のアミノ酸配列と並べられた場合に、定義された位置と同等であろう位置を指すことを理解する。配列アラインメントツールについては上に記載されている。配列番号7の変異体及び/又は断片におけるアミノ酸の付加又は欠失は、突然変異した配列中のコンセンサス配列の実際のアミノ酸位置の相違をもたらす可能性があるが、突然変異した配列を参照配列と並べることによって、参照配列中の対応するアミノ酸と同等の位置にあるアミノ酸を同定することができ、それゆえに、コンセンサス配列の付加又は置換に適切な位置を確立することができる。

一実施形態において、本発明の改変されたPspAタンパク質は、「ペプチドタグ」又は「タグ」、すなわち、改変されたPspAタンパク質の単離及び/又は同定を可能にする1配列のアミノ酸をさらに含む。例えば、本発明の改変されたPspAタンパク質にタグを付加することは、そのタンパク質の精製、それゆえ、タグ付けされた改変されたPspAタンパク質を含むコンジュゲートワクチンの精製に有用であり得る。本明細書で使用することができる例示的なタグは、限定されないが、ヒスチジン(HIS)タグを含む。一実施形態において、タグはヘキサヒスチジンタグである。特定の実施形態では、本明細書で使用されるタグは、もはや必要とされなくなった場合、例えばタンパク質が精製された後に除去が可能、例えば化学薬品又は酵素的手段による除去が可能である。任意選択的に、ペプチドタグはアミノ酸配列のC末端に位置する。任意選択的に、ペプチドタグはアミノ酸配列のC末端に6つのヒスチジン残基を含む。ペプチドタグは、1、2、又はそれより多くの追加のアミノ酸残基、例えばアラニン、セリン、及び/又はグリシン残基、例えばGSを含んでも、それに先行されてもよい。

シグナル配列及び他の改変
一実施形態において、本発明の改変された担体タンパク質は、タンパク質を宿主細胞(例えば細菌)のペリプラズムに向かうように指示することができるシグナル配列を含む。特定の実施形態では、シグナル配列は、シゲラ・フレックスネリのフラジェリン(FlgI)［MIKFLSALILLLVTTAAQA(配列番号21)］由来である。他の実施形態では、シグナル配列は、大腸菌外膜ポーリンA(OmpA)［MKKTAIAIAVALAGFATVAQA(配列番号22)］、大腸菌マルトース結合タンパク質(MalE)［MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA(配列番号23)］、軟腐病菌ペクチン酸リアーゼ(PelB)［MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA(配列番号24］、易熱性大腸菌エンテロトキシンLTIIb［MSFKKIIKAFVIMAALVSVQAHA(配列番号25)］、枯草菌エンドキシラナーゼXynA［MFKFKKKFLVGLTAAFMSISMFSATASA(配列番号26)］、大腸菌DsbA［MKKIWLALAGLVLAFSASA(配列番号27)］、TolB［MKQALRVAFGFLILWASVLHA(配列番号28)］、又はS.アガラクチアSipA［MKMNKKVLLTSTMAASLLSVASVQAS(配列番号29)］由来である。一実施形態において、シグナル配列は、配列番号21～29に少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を有する。一態様において、シグナル配列は、大腸菌フラジェリンシグナル配列(FlgI)［MIKFLSALILLLVTTAAQA(配列番号21)］に少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を有する。

一実施形態では、シグナル配列と成熟タンパク質の配列の始まりの間にセリン及び/又はアラニン残基、例えば、SA又はS、好ましくはSが、付加されている。そのような1個又は複数個の残基は、リーダー配列のより効率的な切断をもたらす利点がある。

グリコシル化部位
本発明は、LC-MSによるグリコシル化部位占有率の定量化に適合性のグリコシル化部位の新規な普遍的PglB特異的コンセンサス配列を提供する。本発明者らは、そのような配列によって、したがって、本発明のコンセンサス配列によって共有されるいくつかの特徴を決定した：
長さが8アミノ酸から16アミノ酸の間、例えば8、9、10、11、12、13、14、15、又は16アミノ酸であるトリプシンペプチドを生成する。
質量分析で強い再生可能なシグナルを示す(親イオン及びトランジションイオン)。
アルギニン又はリジンで開始及び終了し(トリプシン切断のため)、システインを含有しない(トリプシンペプチドのイオン化能力を増大するため)
好ましくは、修飾されやすいアミノ酸(脱アミノを受けやすいアスパラギン及びグルタミンアミノ酸残基、又は酸化を受けやすいメチオニン、システイン、及びトリプトファンアミノ酸残基、又は疎水性若しくは芳香族アミノ酸)を含有しない。
オリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素(PglB)にアクセスできるようにタンパク質表面の十分に露出したループに局在し、また、少なくとも部分的に折り畳まれた分子内にあり、通常の折り畳みプロセスに干渉しない。

したがって、本発明は、以下のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるコンセンサス配列を提供する。
K/R-Z_0-9-D/E-X-N-Y-S/T-Z_0-9-K/R
[配列中、X及びYが、独立して、プロリン以外の任意のアミノ酸であり、Zが任意のアミノ酸を表す]。

好ましくは、前記コンセンサス配列の全長は、16アミノ酸以下、例えば8、10、11、12、13、14、15、又は16アミノ酸である。好ましくは、配列の全長は、8アミノ酸以上、例えば8、10、11、12、13、14、15、又は16アミノ酸である。

特定の実施形態では、本発明は、アミノ酸配列K/R-D/E-X₁-N-X₂-S/T-Z₁-Z₂-K/R(配列番号19)を含むか、又はそれからなるコンセンサス配列を提供し、X₁及びX₂は、独立して、プロリン、リジン、又はアルギニンとは別の任意のアミノ酸であり、Z₁及びZ₂はリジン又はアルギニン又はシステインではない。一実施形態において、コンセンサス配列が配列番号20のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態において、コンセンサス配列は、配列番号42、配列番号43、配列番号44、又は配列番号45、好ましくは配列番号42～44のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。

多糖
ある実施形態では、本発明のコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)中の抗原の1つは、糖、例えば、細菌莢膜糖、細菌リポ多糖又は細菌オリゴ糖である。ある実施形態では、抗原は、細菌莢膜糖である。

糖は、黄色ブドウ球菌5型莢膜糖、黄色ブドウ球菌8型莢膜糖、髄膜炎菌(N. meningitidis)血清群A莢膜糖(MenA)、髄膜炎菌血清群C莢膜糖(MenC)、髄膜炎菌血清群Y莢膜糖(MenY)、N髄膜炎菌血清群W莢膜糖(MenW)、インフルエンザ菌(H. influenzae)b型莢膜糖(Hib)、B群連鎖球菌I群莢膜糖、B群連鎖球菌II群莢膜糖、B群連鎖球菌III群莢膜糖、B群連鎖球菌IV群莢膜糖、B型連鎖球菌V群莢膜糖、チフス菌(Salmonella typhi)由来のVi糖、髄膜炎菌LPS(例えば、L3及び/又はL2)、カタラーリス菌(M. catarrhalis)LPS、インフルエンザ菌LPS、赤痢菌(Shigella)O抗原、緑膿菌O抗原、大腸菌O抗原又は肺炎連鎖球菌莢膜多糖からなる群から選択され得る。

ある実施形態では、抗原は、多糖又はオリゴ糖である。ある実施形態では、抗原は、2個以上の単糖、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の単糖を含む。ある実施形態では、抗原は、20、15、12、10、9又は8個以下の単糖を含有するオリゴ糖である。ある実施形態では、抗原は、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10又は5個以下の単糖を含有するオリゴ糖である。

宿主細胞
本発明はまた、以下:
i)グリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1以上の核酸、
ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
iii)本発明の改変された担体タンパク質をコードする核酸、及び任意選択的に
iv)ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸
含む宿主細胞を提供する。

本発明のバイオコンジュゲートを生成するために使用することができる宿主細胞には、古細菌、原核生物宿主細胞、及び真核生物宿主細胞が含まれる。本発明のバイオコンジュゲートの生成に使用するための例示的な原核宿主細胞には、限定されないが、エシェリキア属(Escherichia)種、シゲラ属(Shigella)種、クレブシエラ属(Klebsiella)種、キサントモナス属(Xhantomonas)種、サルモネラ属(Salmonella)種、エルシニア属(Yersinia)種、ラクトコッカス属(Lactococcus)種、ラクトバチルス属(Lactobacillus)種、シュードモナス属(Pseudomonas)種、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)種、ストレプトマイセス属(Streptomyces)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)種、バチルス属(Bacillus)種、及びクロストリジウム属(Clostridium)種が挙げられる。特定の実施形態では、宿主細胞は、大腸菌である。

ある実施形態では、本発明のバイオコンジュゲートを生成するために使用される宿主細胞は、異種核酸、例えば、1以上の担体タンパク質をコードする異種核酸、及び/又は1以上のタンパク質をコードする異種核酸、例えば、1以上のタンパク質をコードする遺伝子をコードする異種核酸を含むように操作される。特定の実施形態では、グリコシル化経路(例えば、原核生物及び/又は真核生物のグリコシル化経路)に関与するタンパク質をコードする異種核酸は、本発明の宿主細胞に導入され得る。このような核酸は、限定されないが、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、エピメラーゼ、フリッパーゼ、ポリメラーゼ、及び/又はグリコシルトランスフェラーゼを含むタンパク質をコードし得る。異種核酸(例えば、担体タンパク質をコードする核酸、及び/又は他のタンパク質、例えば、グリコシル化に関与するタンパク質をコードする核酸)は、方法、例えば、エレクトロポレーション、熱ショックによる化学的形質転換、天然の形質転換、ファージ形質導入、及びコンジュゲーションを用いて本発明の宿主細胞に導入することができる。特定の実施形態では、異種核酸は、プラスミドを用いて本発明の宿主細胞に導入され、例えば、異種核酸は、プラスミド(例えば、発現ベクター)によって宿主細胞内で発現される。別の特定の実施形態では、異種核酸は、国際特許出願第PCT/EP2013/068737号(WO14/037585号として公開)に記載される挿入方法を用いて、本発明の宿主細胞に導入される。

したがって、本発明はまた、以下:
i)グリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1以上の核酸、
ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
iii)本発明の改変された担体タンパク質をコードする核酸、
iv)ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸、及び
vi)フリッパーゼ(例えば、wxy)をコードする核酸
を含む宿主細胞を提供する。

ある実施形態では、さらなる改変は、本発明の宿主細胞に(例えば、組換え技術を用いて)を導入することができる。例えば、おそらく競合又は干渉するグリコシル化経路の一部を形成する(例えば、宿主細胞に組換え的に導入される、グリコシル化に関与する1以上の異種遺伝子と競合又は干渉する)タンパク質をコードする宿主細胞核酸(例えば、遺伝子)は、宿主細胞バックグラウンド(ゲノム)において、それらを不活性/機能不全にさせる方法で欠失又は改変され得る(すなわち、欠失/改変された宿主細胞核酸は、機能性タンパク質をコードしないか、又はタンパク質を全くコードしない)。ある実施形態では、核酸が本発明の宿主細胞のゲノムから欠失された場合、それらは、望ましい配列、例えば、糖タンパク質生成に有用である配列で置き換えられる。

宿主細胞において欠失され得る(及び、いくつかの場合では、他の所望の核酸配列と置き換えられ得る)例示的な遺伝子には、糖脂質生合成に関与する宿主細胞の遺伝子、例えば、waaL(例えば、Feldmanら、2005年、PNAS USA 102巻:3016～3021頁を参照されたい)、リピドAコア生合成クラスター(waa)、ガラクトースクラスター(gal)、アラビノースクラスター(ara)、コラン酸クラスター(wc)、莢膜多糖クラスター、ウンデカプレノール-ピロリン酸生合成遺伝子(例えば、uppS(ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ)、uppP(ウンデカプレニルジホスファターゼ))、Und-Pリサイクル遺伝子、ヌクレオチド活性化糖生合成に関与する代謝酵素、腸内細菌共通抗原クラスター、及びgtrABSクラスターのようなプロファージO抗原改変クラスターが含まれる。

このような改変された原核生物宿主細胞は、抗原、例えば、本発明の改変されたHla担体タンパク質に結合した糖抗原を含む生体コンジュゲートを生成することができる酵素をコードする核酸を含む。このような宿主細胞は、糖抗原の生成に特異的な核酸を自然に発現することができ、又は宿主細胞は、このような核酸を発現するように作製することができる。すなわち、ある種の実施形態では、前記核酸は、宿主細胞に対して異種である。ある種の実施形態では、糖抗原の生成に特異的な1以上の前記核酸は、宿主細胞に対して異種であり、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。ある種の実施形態では、本発明の宿主細胞は、タンパク質のN-グリコシル化において活性な追加の酵素をコードする核酸を含み、例えば、本発明の宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸及び/又は他のグリコシルトランスフェラーゼをコードする1以上の核酸をさらに含む。

莢膜多糖遺伝子クラスターを含む核酸配列は、本発明の宿主細胞に挿入され得る。特定の実施形態では、本発明の宿主細胞に挿入される莢膜多糖遺伝子クラスターは、大腸菌株、ブドウ球菌株(例えば、黄色ブドウ球菌)、連鎖球菌株(例えば、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌(S. pyrogenes)、S. アガラクティエ(S. agalacticae))、又はバークホルデリア菌株(例えば、鼻疽菌(B. mallei)、類鼻疽菌(B. pseudomallei)、バークホルデリア・タイランデンシス(B. thailandensis))由来の莢膜多糖遺伝子クラスターである。バイオコンジュゲートを生成することができるこのような宿主細胞を作製する方法の開示は、国際公開第WO06/119987号、同第WO09/104074号、同第WO11/62615号、同第WO11/138361号、同第WO14/57109号、同第WO14/72405号、及び同第WO16/20499号に見出される。

ある実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞中のプラスミドに本発明の改変された担体タンパク質をコードする核酸を含む。

グリコシル化機構
本発明の宿主細胞は、ハイブリッドオリゴ糖及び/又は多糖を生成することができる遺伝子機構(例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、フリッパーゼ、ポリメラーゼ、及び/又はオリゴサッカリルトランスフェラーゼ)をコードする核酸、並びに抗原を本発明の改変された担体タンパク質に連結することができる遺伝子機構を含み、及び/又は含むように改変することができる。

莢膜多糖は、グラム陰性菌におけるO多糖合成のポリメラーゼ依存性経路と相同性を共有する保存された経路によって、細菌膜担体脂質のウンデカプレニルピロリン酸にアセンブルされる。O抗原のアセンブルは、DPドナーからウンデカプレニルリン酸に、糖リン酸が転移することによって開始される。脂質連結O抗原は、異なるグリコシルトランスフェラーゼの連続的な作用によって、内膜の細胞質側でアセンブルされる。次に、糖脂質は、ペリプラズム腔に反転され、重合される。O抗原リガーゼWaaLをオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBで置き換えることによって、重合したO抗原は、脂質Aコアではなくむしろ、タンパク質担体に移すことができる。

グリコシルトランスフェラーゼ
本発明の宿主細胞は、オリゴ糖又は多糖のリピート単位を生成するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。ある実施形態では、前記リピート単位は、還元末端にヘキソースを含まず、前記オリゴ糖又は多糖のリピート単位は、還元末端にヘキソースを含むドナーオリゴ糖又は多糖のリピート単位に由来する。

ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、ヘキソース単糖誘導体をウンデカプレニルピロリン酸(Und-PP)上にアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含み得る。一態様では、Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼは、宿主細胞に対して異種であり、及び/又はグリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1以上の遺伝子に対して異種である。前記グリコシルトランスフェラーゼは、例えば、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属(Aeromonas)種、フランシセラ属(Francisella)種、ヘリコバクター属(Helicobacter)種、プロテウス属(Proteus)種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属(Enterococcus)種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属(Listeria)種、又はカンピロバクター属(Campylobacter)種由来であり得る。特定の実施形態では、Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼは、wecAであり、任意選択的に大腸菌由来のwecAである(wecAは、UDP-GlcNAcからGlcNAcをUndP上にアセンブルさせることができる)。ある実施形態では、ヘキソース単糖は、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノトール、フコース及びマンノース(例えば、ガラクトース)からなる群から選択される。

ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、Und-PP上にアセンブルされたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる1以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含み得る。特定の実施形態では、ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1以上のグリコシルトランスフェラーゼは、シゲラ・ボイディ(Shigella boyedii)由来のガラクトシルトランスフェラーゼ(wfeD)である。別の特定の実施形態では、ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1以上のグリコシルトランスフェラーゼは、大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)である。別の特定の実施形態では、ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1以上のグリコシルトランスフェラーゼは、大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)である。ガルフトランスフェラーゼ、例えば、wfdK及びwbeYは、Galf(ガラクトフラノース)をUDP-Galfから-GlcNAc-P-P-ウンデカカプレニルに転移することができる。別の特定の実施形態では、ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1以上のグリコシルトランスフェラーゼは、大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)及び大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)である。

ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、ドナーオリゴ糖又は多糖リピート単位をヘキソース単糖誘導体上にアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。

ある実施形態では、ドナーオリゴ糖又は多糖リピート単位をヘキソース単糖誘導体上にアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼは、ドナーオリゴ糖又は多糖の第1リピート単位の還元末端に存在するヘキソース単糖をヘキソース単糖誘導体に付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含む。例示的なグリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼ(wciP)、例えば、大腸菌O21由来のwciPを含む。

一実施形態では、ドナーオリゴ糖又は多糖リピート単位をヘキソース単糖誘導体上にアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼは、ドナーオリゴ糖又は多糖の第1のリピート単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に隣接する単糖を、ドナーオリゴ糖又は多糖の第1のリピート単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含む。例示的なグリコシルトランスフェラーゼは、グルコシルトランスフェラーゼ(wciQ)、例えば、大腸菌O21由来のwciQを含む。

ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、黄色ブドウ球菌CP5又はCP8遺伝子クラスターから選択されるオリゴ糖又は多糖のリピート単位を合成するためのグリコシルトランスフェラーゼを含む。特定の実施形態では、オリゴ糖又は多糖のリピート単位を合成するためのグリコシルトランスフェラーゼは、黄色ブドウ球菌CP5遺伝子クラスター由来である。黄色ブドウ球菌CP5及びCP8は、緑膿菌O11抗原合成遺伝子と類似の構造を有し、そのため、これらの遺伝子を大腸菌単糖合成遺伝子と組み合わせて、リピート三糖単位からなるウンデカプレニルピロリン酸連結されたCP5又はCP8ポリマーを合成することができる。

ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、ドナーオリゴ糖又は多糖リピート単位をヘキソース単糖誘導体上にアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼを含み、このグリコシルトランスフェラーゼは、ドナーオリゴ糖又は多糖の第1リピート単位の還元末端に存在するヘキソース単糖をヘキソース単糖誘導体に付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含む。

オリゴサッカリルトランスフェラーゼ
N-結合タンパク質のグリコシル化-標的タンパク質のポリペプチド鎖中のアスパラギン残基への炭水化物分子の付加-は、真核生物の小胞体で起こる翻訳後修飾の最も一般的なタイプである。このプロセスは、小胞体内の保存配列Asn-X-Ser/Thr(Xは、プロリンを除く任意のアミノ酸である)内の新生タンパク質のアスパラギン残基に、脂質担体(ドリコールリン酸)から予めアセンブルしたオリゴ糖の転移に関与する酵素オリゴサッカリルトランスフェラーゼ複合体(OST)によって達成される。

細菌、食物媒介性病原体カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)はまた、それ自身のグリコシル化機構を有するという事実に起因して、そのタンパク質をN-グリコシル化し得ることが示されている(Wackerら、Science、2002年、298巻(5599号):1790～3頁)。この反応に関与する機構は、「pgl」(タンパク質のグリコシル化に関して)と呼ばれるクラスターによってコードされる。

C.ジェジュニのグリコシル化機構は、大腸菌に伝達され、大腸菌細胞によって発現される組換えタンパク質のグリコシル化を可能にする。従前の研究は、N-グリコシル化を行うことができる大腸菌株を生じさせる方法を実証している(例えば、Wackerら、Science、2002年、298巻(5599号):1790～3頁; Nita-Lazarら、Glycobiology、2005年、15巻(4号):361～7頁; Feldmanら、Proc Natl Acad Sci U S A、2005年、102巻(8号):3016～21頁; Kowarikら、EMBO J. 2006年、25巻(9号):1957～66頁; Wackerら、Proc Natl Acad Sci U S A、2006年、103巻(18号):7088～93頁;国際特許出願公開第WO2003/074687号、同第WO2006/119987号、同第WO2009/104074号、同第WO/2011/06261号、及び同第WO2011/138361号を参照されたい)。最適化された特性を有するPglB突然変異体は、国際公開第WO2016/107818号に記載される。好ましい突然変異体は、PglB_{cuo N311V-K482R-D483H-A669V}である。

オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、N-グリコシル化コンセンサスモチーフ、例えばAsn-X-Ser(Thr)(Xは、Proを除く任意のアミノ酸であり得る)又はAsp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)(X及びZは、Proを除く任意の天然アミノ酸から独立して選択される)を含む新生ポリペプチド鎖のアスパラギン残基に、脂質結合されたオリゴ糖を転移させる(国際公開第WO2006/119987号を参照されたい)。例えば、国際公開第WO2003/074687号及び同第WO2006/119987号を参照されたい。これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ある実施形態では、本発明の宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸は、宿主細胞に対して天然であり得、又は上記される遺伝学的アプローチを用いて宿主細胞に導入され得る。特定の実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼはカンピロバクター由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼである。別の特定の実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニ由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(すなわち、pglB、例えば、Wackerら、2002年, Science 298巻:1790～1793頁、また、例えば、NCBI Gene ID: 3231775、UniProtアクセッション番号O86154を参照されたい)である。別の特定の実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼである(例えば、NCBI Gene ID: 7410986を参照されたい)。

特定の実施形態では、本発明の宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含み、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ由来のpglB)をコードする前記核酸配列は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。

特定の実施形態では、本発明の宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含み、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ由来のpglB)をコードする前記核酸配列は、プラスミド媒介性である。

別の特定の実施形態では、本明細書では、(i)黄色ブドウ球菌由来の莢膜多糖クラスターに由来するグリコシルトランスフェラーゼであって、前記グリコシルトランスフェラーゼは前記宿主細胞のゲノムに組み込まれるグリコシルトランスフェラーゼ、(ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ由来のpglB)をコードする核酸であって、前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸はプラスミド媒介性であり、及び/又は宿主細胞のゲノムに組み込まれる核酸、並びに(iii)本発明の改変された担体タンパク質であって、前記改変された担体タンパク質はプラスミド媒介性であるか又は宿主細胞のゲノムに組み込まれる改変された担体タンパク質を含む、改変された原核宿主細胞が提供される。また、(i)莢膜多糖クラスターに由来するグリコシルトランスフェラーゼを前記宿主細胞のゲノムに組み込み、(ii)プラスミド媒介性であり及び/又は宿主細胞のゲノムに組み込まれるオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ由来のpglB)をコードする1以上の核酸を宿主細胞に組み込み、並びに(iii)プラスミド媒介性であるか又は宿主細胞のゲノムに組み込む本発明の改変された担体タンパク質を宿主細胞に組み込むことを含む、改変された原核宿主細胞を作製する方法も提供される。

特定の実施形態では、本発明の宿主細胞は、宿主細胞の少なくとも1つの遺伝子が機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に、宿主細胞のwaaL遺伝子が機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に、宿主細胞のwaaL遺伝子がオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸で置き換えられており、任意選択的に、宿主細胞のwaaL遺伝子がC.ジェジュニpglBで置き換えられているものである。

ポリメラーゼ
ある実施形態では、ポリメラーゼ(例えば、wzy)は、本発明の宿主細胞に導入される(すなわち、ポリメラーゼは宿主細胞に対して異種である)。ある実施形態では、ポリメラーゼは、細菌ポリメラーゼである。ある実施形態では、ポリメラーゼは、莢膜多糖ポリメラーゼ(例えば、wzy)又はO抗原ポリメラーゼ(例えば、wzy)である。ある実施形態では、ポリメラーゼは、莢膜多糖ポリメラーゼ(例えば、wzy)である。

ある実施形態では、莢膜多糖生合成経路のポリメラーゼは、本発明の宿主細胞に導入される。

フリッパーゼ
ある実施形態では、フリッパーゼ(wzx又は相同体)は、本発明の宿主細胞に導入される(すなわち、フリッパーゼは宿主細胞に対して異種である)。したがって、本発明の宿主細胞は、フリッパーゼをさらに含むことができる。ある実施形態では、フリッパーゼは、細菌フリッパーゼである。フリッパーゼは、野生型リピート単位、及び/又はそれらに対応する操作された(ハイブリッド)リピート単位を細胞質から宿主細胞(例えば、大腸菌)のペリプラズムに移行させる。したがって、本発明の宿主細胞は、フリッパーゼ(wzx)をコードする核酸を含み得る。

特定の実施形態では、莢膜多糖生合成経路のフリッパーゼは、本発明の宿主細胞に導入される。

遺伝的バックグラウンド
本発明の宿主細胞を生じさせるために用いることができる例示的な宿主細胞には、限定されないが、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、及びクロストリジウム属種が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書で使用される宿主細胞は、大腸菌である。

ある実施形態では、宿主細胞の遺伝学的バックグラウンドは、例えば、1以上の遺伝子の欠失によって改変される。宿主細胞において欠失され得る(及び、いくつかの場合では、他の所望の核酸配列と置き換えられ得る)例示的な遺伝子は、糖脂質生合成に関与する宿主細胞の遺伝子、例えば、waaL(例えば、Feldmanら、2005年、PNAS USA 102巻:3016～3021頁を参照されたい)、O抗原クラスター(rfb又はwb)、腸内細菌共通抗原クラスター(wec)、リピドAコア生合成クラスター(waa)、及びgtrABSクラスターのようなプロファージO抗原改変クラスターを含む。特定の実施形態では、waaL遺伝子、gtrA遺伝子、gtrB遺伝子、gtrS遺伝子、又はwecクラスター由来の遺伝子若しくは複数の遺伝子、又はrfb遺伝子クラスター由来の遺伝子若しくは複数の遺伝子のうちの1以上は、本発明の原核生物宿主細胞のゲノムから欠失されるか又は機能的に不活化される。一実施形態では、本明細書で使用される宿主細胞は、大腸菌であり、waaL遺伝子、gtrA遺伝子、gtrB遺伝子、gtrS遺伝子は、宿主細胞のゲノムから欠失されるか又は機能的に不活化される。別の実施形態では、本明細書で使用される宿主細胞は、大腸菌であり、waaL遺伝子及びgtrS遺伝子は、宿主細胞のゲノムから欠失されるか又は機能的に不活化される。別の実施形態では、本明細書で使用される宿主細胞は、大腸菌であり、waaL遺伝子及びwecクラスター由来の遺伝子は、宿主細胞のゲノムから欠失されるか又は機能的に不活化される。

バイオコンジュゲート
本発明の宿主細胞は、糖抗原、例えば、本発明の改変された担体タンパク質に連結された細菌莢膜多糖抗原を含むバイオコンジュゲートを生産するのに用いることができる。一実施形態において、多糖は、改変された担体タンパク質中のアスパラギンに、例えばN-アセチルグルコサミンを介して連結されている。宿主細胞を用いてバイオコンジュゲートを生成する方法は、例えば、国際公開第WO2003/074687号、同第WO2006/119987号及び同第WO2011/138361号に記載されている。本明細書に記載されているように、バイオコンジュゲートは、それらが製造においてより少ない化学物質を必要とし、生じる最終生成物に関してより一貫性があるという点において、抗原-担体タンパク質の化学的コンジュゲートを上回る有利な特性を有する。

一実施形態では、多糖、特に多糖抗原に連結されている本発明の改変された担体タンパク質を含むバイオコンジュゲートを本明細書で提供する。一実施形態では、本発明の改変された担体タンパク質と、黄色ブドウ球菌5型莢膜糖、黄色ブドウ球菌8型莢膜糖、髄膜炎菌血清型A莢膜糖(MenA)、髄膜炎菌血清型C莢膜糖(MenC)、髄膜炎菌血清型Y莢膜糖(MenY)、髄膜炎菌血清型W莢膜糖(MenW)、インフルエンザ菌b型莢膜糖(Hib)、B群連鎖球菌I群莢膜糖、B群連鎖球菌II群莢膜糖、B群連鎖球菌III群莢膜糖、B群連鎖球菌IV群莢膜糖、B群連鎖球菌V群莢膜糖、チフス菌由来のVi糖、髄膜炎菌LPS(例えばL3及び/又はL2)、カタラーリス菌LPS、インフルエンザ菌LPS、赤痢菌O抗原、緑膿菌O抗原、大腸菌O抗原、又は肺炎球菌莢膜多糖から選択される抗原とを含むバイオコンジュゲートを本明細書で提供する。

本発明のバイオコンジュゲートは、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、陽イオン交換、陰イオン交換、アフィニティー、及びサイズカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差溶解度によって、又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって精製することができる。例えば、Saraswatら、2013年、Biomed. Res. Int. ID#312709 (1～18頁)を参照されたい。また、国際公開第WO2009/104074号に記載されている方法を参照されたい。さらに、精製を容易にするために、本明細書に記載されているか、又は当該技術分野において公知である異種ポリペプチド配列にバイオコンジュゲートを融合させることができる。具体的なバイオコンジュゲートを精製するために使用される実際の条件は、部分的には、合成戦略、並びに因子、例えば、バイオコンジュゲートの正味の電荷、疎水性、及び/又は親水性に依存し、当業者に明らかである。

本発明のさらなる態様は、多糖に連結された、改変された担体タンパク質を含む(又はそれからなる)バイオコンジュゲートを生成する方法であり、前記方法は、(i)タンパク質の生成に適した条件下で(及び任意選択的に糖の生成に適した条件下で)本発明の宿主細胞を培養すること、及び(ii)前記宿主細胞によって生成されたバイオコンジュゲートを単離することを含む。

本発明のさらなる態様は、本発明のプロセスによって生成されたバイオコンジュゲートであり、前記バイオコンジュゲートは、改変された担体タンパク質に連結された糖を含む。

質量分析法
本発明は、質量分析(LC-MS)につないだ液体クロマトグラフィーによるグリコシル化部位占有率の測定を可能にする分析駆動設計アプローチによる担体タンパク質を提供する。これは、(i)最終産物における非グリコシル化担体を定量化する、(ii)プロセス中にバイオコンジュゲーション率を追跡する、及び(iii)複数のグリコシル化部位を有するように設計された担体タンパク質の場合に、一部位のグリコシル化の程度を定量化して、グリコシル化率を増大させる上で特に重要である。

この戦略は、同位体標識された内部標準を用いてグリコペプチドの元々の非グリコシル化型を定量化することに基づく。特に、2セットの重同位体標識されたペプチド標準を、タンパク質分解前の試料に添加し、消化された試料をLC-MSで分析する。1セットのペプチド標準が総糖タンパク質量を決定するのに使用され、一方、他の標準は、糖タンパク質の非グリコシル化量をモニターする。このようにして、総タンパク質量から非グリコシル化タンパク質量を引くことによって、タンパク質のグリコシル化部分の量が計算され、次いで、部位占有率が決定される。

免疫原性組成物
本発明の改変された担体タンパク質及びコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)は、免疫原性組成物及びワクチンに含めるのに特に適している。本発明は、本発明の改変された担体タンパク質、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明のバイオコンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。

また、本発明の改変された担体タンパク質又はコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)を薬学的に許容される賦形剤又は担体と混合する工程を含む、本発明の免疫原性組成物を作製する方法が提供される。

免疫原性組成物は、本発明の改変された担体タンパク質又はコンジュゲート(例えば、バイオコンジュゲート)の免疫学的に有効な量、並びに任意の他の成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、その量の個体への投与が、単回投薬又は一連の一部のいずれかとして、治療又は予防に有効であることを意味する。この量は、治療される個体の健康状態及び身体状態、年齢、所望の防御の程度、ワクチンの処方、及び他の関連する因子に依存して変化する。その量は、日常的な試行を通じて判断することができる比較的幅広い範囲にあることが期待される。

本発明がまた希釈剤、例えば、水、生理食塩水、グリセロールなどを含有し得る場合の免疫原性組成物。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝物質、ポリオールなどが存在し得る。

本発明の改変された担体タンパク質又はコンジュゲート(又はバイオコンジュゲート)を含む免疫原性組成物は、医薬投与に使用するのに適した任意の追加の成分を含み得る。特定の実施態様では、本発明の免疫原性組成物は、一価の製剤である。他の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、多価製剤、例えば、二価、三価、及び四価の製剤である。例えば、多価製剤は、1を超える抗原、例えば、1を超えるコンジュゲートを含む。

ワクチン
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含むワクチンを提供する。

薬学的に許容される賦形剤及び担体は、当業者によって選択され得る。例えば、薬学的に許容される賦形剤又は担体は、緩衝液、例えば、Tris(トリメタミン)、リン酸塩(例えば、リン酸ナトリウム)、酢酸塩、ホウ酸塩(例えば、ホウ酸ナトリウム)、クエン酸塩、グリシン、ヒスチジン及びコハク酸塩(例えば、コハク酸ナトリウム)、適切には塩化ナトリウム、ヒスチジン、リン酸ナトリウム又はコハク酸ナトリウムを含むことができる。薬学的に許容される賦形剤は、塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム又は塩化マグネシウムを含むことができる。任意選択的に、薬学的に許容される賦形剤は、溶解性及び/又は安定性を安定化する少なくとも1つの成分を含有する。可溶化剤/安定化剤の例としては、洗剤、例えば、ラウレルサルコシン及び/又はポリソルベート(例えば、TWEEN(商標)80)が挙げられる。また、安定化剤の例には、ポロキサマー(例えば、ポロキサマー124、ポロキサマー188、ポロキサマー237、ポロキサマー338及びポロキサマー407)が含まれる。薬学的に許容される賦形剤には、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート-80(TWEEN(商標)80)、ポリソルベート-60(TWEEN(商標)60)、ポリソルベート-40(TWEEN(商標)40)及びポリソルベート-20(TWEEN(商標)20)、又はポリオキシエチレンアルキルエーテル(適切にはポリソルベート-80)が含まれ得る。代替の可溶化剤/安定化剤には、アルギニン、及びガラス形成ポリオール(例えば、スクロース、トレハロースなど)が挙げられる。薬学的賦形剤は、保存剤、例えば、フェノール、2-フェノキシエタノール、又はチオマーサルであり得る。他の薬学的に許容される賦形剤としては、糖(例えば、ラクトース、スクロース)、及びタンパク質(例えば、ゼラチン及びアルブミン)が挙げられる。薬学的に許容される担体としては、水、生理食塩水、水性デキストロース及びグリセロール溶液が挙げられる。多数の薬学的に許容される賦形剤及び担体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、E. W. Martin、Mack Publishing Co. Easton、PA、第5版(975)に記載されている。

ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、1以上の緩衝液、例えば、リン酸緩衝液及び/又はスクロースリン酸グルタミン酸緩衝液をさらに含む。他の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、緩衝液を含まない。

ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、1以上の塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸一ナトリウム、及びアルミニウム塩(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン(硫酸カリウムアルミニウム)、又はこのようなアルミニウム塩の混合物)をさらに含む。他の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、塩を含まない。

本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、保存剤、例えば、水銀誘導体チメロサールをさらに含むことができる。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、0.001%～0.01%のチメロサールを含む。他の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、保存剤を含まない。

本発明のワクチン又は免疫原性組成物はまた、典型的には、多用量フォーマットでパッケージされた場合、抗菌剤を含み得る。例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、2-フェノキシエタノールを含み得る。

本発明のワクチン又は免疫原性組成物はまた、洗剤、例えば、ポリソルベート、例えばTWEEN(商標)80を含み得る。洗剤は、一般的に、低レベル、例えば<0.01%で存在するが、抗原製剤を安定化させるために、より高いレベル、例えば、最大10%のレベルが示唆されている。

本発明の免疫原性組成物は、投与のための指示書とともに、容器、パック、又はディスペンサーに含めることができる。

本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、使用前に保存することができ、例えば、組成物は、(例えば、約-20℃又は約-70℃で)凍結保存することができ、冷蔵条件下(例えば、約4℃)で保存することができ、又は室温で保存することができる。

本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、溶液中に貯蔵するか又は凍結乾燥することができる。ある実施形態では、溶液は、糖、例えば、スクロース、トレハロース又はラクトースの存在下で凍結乾燥される。別の実施形態では、本発明のワクチンは凍結乾燥され、使用前に即席で再構成される。

ワクチン調製物は、一般的にVaccine Design (「The subunit and adjuvant approach」(Powell M.F. & Newman M.J.編) (1995年) Plenum Press New York)に記載されている。リポソーム内のカプセル化は、Fullerton、米国特許第4,235,877号に記載されている。

本発明は、本発明の免疫原性組成物及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含むワクチンも提供する。

アジュバント
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、アジュバントを含むか又はアジュバントと組み合わせて投与される。本発明の免疫原性組成物又はワクチンと組み合わせて投与するためのアジュバントは、前記免疫原性組成物又はワクチンの投与前、同時、又は投与後に投与することができる。一部の実施形態では、用語「アジュバント」とは、本発明のワクチンの免疫原性組成物と組み合わせて又はその一部として投与された場合、バイオコンジュゲートに対する免疫応答を増強し、増大し、及び/又は強化するが、化合物が単独で投与された場合には、改変された担体タンパク質/コンジュゲート/バイオコンジュゲートに対する免疫応答を生じさせない化合物を指す。一部の実施形態では、アジュバントは、改変された担体タンパク質、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートに対する免疫応答を生じさせ、アレルギー又は他の有害反応を生成しない。

ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、アジュバント化される。アジュバントは、例えば、リンパ球動員、B及び/又はT細胞の刺激、並びにマクロファージの刺激を含むいくつかのメカニズムによって免疫応答を増大することができる。アジュバントの具体的な例としては、限定されないが、アルミニウム塩(ミョウバン)(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及び硫酸アルミニウム)、3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA(MPL)(英国特許GB2220211を参照されたい)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、ポリソルベート80(TWEEN(商標)80、ICL Americas,Inc.)、イミダゾピリジン化合物(国際公開第WO2007/109812号として公開された国際出願第PCT/US2007/064857号を参照されたい)、イミダゾキノキサリン化合物(国際公開第WO2007/109813号として公開された国際出願第PCT/US2007/064858号を参照されたい)、及びサポニン、例えば、QS21などの(Kensilら、Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (編集、Powell & Newman、Plenum Press、NY、1995年)、米国特許第5,057,540号を参照されたい)が含まれる。一部の実施形態では、アジュバントは、フロイントアジュバント(完全又は不完全)である。他のアジュバントは、水中油型エマルジョン(例えば、スクアレン又はピーナッツ油)であり、任意選択的に、免疫刺激剤、例えば、モノホスホリルリピドAと組み合わせる(Stouteら、N. Engl. J. Med. 336巻、86～91頁(1997年)を参照されたい)。別のアジュバントは、CpGである(Bioworld Today、1998年11月15日)。

本発明の一態様では、アジュバントは、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムゲル(ミョウバン)又はリン酸アルミニウムである。

本発明の別の態様では、アジュバントは、TH1又はTH2型の応答のいずれかの優先的な誘導因子であるように選択される。高レベルのTh1型サイトカインは、所定の抗原に対する細胞性免疫応答の誘導に有利に働く傾向があり、一方、高レベルのTh2型サイトカインは、抗原に対する体液性免疫応答の誘導に有利に働く傾向がある。Th1型とTh2型の免疫応答の区別は絶対的なものではないことを覚えておくことが重要である。実際には、個体は、主にTh1又は主にTh2であると記載される免疫応答を支持する。しかしながら、Mosmann及びCoffman(Mosmann, T.R.及びCoffman、R.L. (1989年) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology、7巻、145～173頁)によってマウスCD4+ve T細胞クローンにおいて説明されているサイトカインのファミリーを考慮することは、しばしば好都合である。慣習的に、Th1型の応答は、Tリンパ球によるINF-γ及びIL-2サイトカインの生成と関連している。Th1型の免疫応答の誘導にしばしば直接的に関連する他のサイトカイン、例えばIL-12は、T細胞によって生成されない。対照的に、Th2型の応答は、Il-4、IL-5、IL-6、IL-10の分泌と関連している。主としてTh1応答を促進する適切なアジュバント系としては、モノホスホリルリピドA又はその誘導体、具体的には3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)(その調製については、英国特許出願公開第2220211A号を参照されたい)、MPL、例えば、リポソーム、例えば、コレステロール及びDPOCを含むリポソーム中の3D-MPL及びサポニンQS21、並びにモノホスホリルリピドA、例えば、3-脱O-アシル化モノホスホリルリピドAと、アルミニウム塩(例えば、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム)又は水中油型エマルジョンのいずれかとの組合せが挙げられる。このような組合せにおいて、抗原及び3D-MPLは、同じ粒子構造に含有することができ、抗原及び免疫刺激シグナルのより効率的な送達を可能にする。研究は、3D-MPLが、ミョウバン吸着した抗原の免疫原性をさらに増大させ得ることを示している(Thoelenら、Vaccine (1998年) 16巻:708～14頁;欧州特許第689454-B1号)。非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(国際公開第WO96/02555号)もまた、TH1応答の優先的な誘導因子であり、本発明における使用に適している。

本発明のワクチン又は免疫原性組成物は、アジュバント組成物(欧州特許出願公開第399843号、国際公開第WO95/17210号)として有用であることが示唆されているため、これらは水中油型エマルジョンを含有することができる。国際公開第WO95/17210号(2～10%スクアレン、2～10%アルファトコフェロール、及び0.3～3%Tween 80を含む水中油型エマルジョン、並びに単独又はQS21及び/又は3D-MPLと組み合わせたそれらの使用を開示する)、国際公開第WO99/12565号(代謝可能な油、サポニン及びステロール及びMPLを含む水中油型エマルジョン組成物を開示する)、又は国際公開第WO99/11241号に記載される水中油型エマルジョンを使用することができる。さらに、国際公開第WO09/127676号及び同第WO09/127677号に開示される水中油型エマルジョンもまた適している。WO 95/17210には、水中油型エマルジョン中のQS21、3DMPL、及びトコフェロールを用いる特に強力なアジュバント製剤が記載されている。特定の実施形態では、免疫原性組成物又はワクチンは、サポニン、例えばQS21をさらに含む。免疫原性組成物又はワクチンはまた、水中油型エマルジョン及びトコフェロール(国際公開第WO95/17210号)を含み得る。

予防的及び治療的使用
本発明はまた、本発明の改変された担体タンパク質、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートを対象に投与することを含む、対象の細菌感染を治療及び/又は予防する方法を提供する。改変された担体タンパク質、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートは、免疫原性組成物又はワクチンの形態であり得る。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、細菌による対象(例えば、ヒト対象)の感染の予防に使用される。本発明の改変された担体タンパク質、コンジュゲート、又はバイオコンジュゲートを用いて治療及び/又は予防することができる細菌感染症には、スタフィロコッカス属種、エシェリキア属種、シゲラ属種、ナイセリア属(Neisseria)種、モラクセラ属(Moraxella)種、ヘモフィルス属(Haemophilus)種、クレブシエラ属種、キサントモナス属(Xhantomonas)種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属、リステリア属種又はカンピロバクター属種、黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌、インフルエンザ菌、インフルエンザ菌b型、B群連鎖球菌、チフス菌、カタラーリス菌LPS、シゲラ・フレックスネリ、緑膿菌、大腸菌、又は肺炎球菌によって引き起こされるものが含まれる。

また、本明細書では、本発明の改変された担体タンパク質、又はコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲート(又は免疫原性組成物若しくはワクチン)を対象に投与することを含む、細菌に対する対象における免疫応答を誘導する方法が提供される。一実施形態では、前記対象は、投与時に細菌感染を有する。別の実施形態では、前記対象は、投与時に細菌感染を有しない。本発明の改変された担体タンパク質、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートを用いて、スタフィロコッカス属種、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種に対する免疫応答を誘導することができる。特定の実施形態では、本発明の改変されたHlaタンパク質、又はコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲートを用いて、スタフィロコッカス属種(例えば、黄色ブドウ球菌)に対する免疫応答を誘導する。

また、本明細書では、本発明の改変された担体タンパク質、又はコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲート(又は免疫原性組成物若しくはワクチン)を対象に投与することを含む、細菌に対する対象におけるオプソニン食作用性抗体の生成を誘導する方法が提供される。一実施形態では、前記対象は、投与時に細菌感染を有する。別の実施形態では、前記対象は、投与時に細菌感染を有しない。本明細書に提供される本発明の改変された担体タンパク質、又はコンジュゲート又はバイオコンジュゲート(又は免疫原性組成物若しくはワクチン)を用いて、スタフィロコッカス属種、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種に対するオプソニン食作用性抗体の生成を誘導することができる。特定の実施形態では、本発明の改変された担体タンパク質、又はコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲート(又は免疫原性組成物若しくはワクチン)を使用して、スタフィロコッカス属種(例えば、黄色ブドウ球菌)に対するオプソニン食作用性抗体の生成を誘導する。

本発明は、対象の細菌の感染症を治療及び/又は予防する方法であって、本発明の改変された担体タンパク質、コンジュゲート、又はバイオコンジュゲートを対象に投与することを含む方法も提供する。改変された担体タンパク質、コンジュゲート、又はバイオコンジュゲートは、免疫原性組成物又はワクチンの形態であってもよい。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、細菌による対象(例えばヒト対象)の感染症の予防に用いる。本発明の改変された担体タンパク質、コンジュゲート、又はバイオコンジュゲートを用いて治療及び/又は予防することができる細菌感染症には、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属、リステリア属種、又はカンピロバクター属種によって引き起こされるものが含まれる。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンを、ストレプトコッカス属種(例えば肺炎球菌)による感染症を治療又は予防するのに用いる。

細菌に対する免疫応答を対象において誘導する方法であって、本発明の改変された担体タンパク質、又はコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲート(又は免疫原性組成物若しくはワクチン)を対象に投与することを含む方法も本明細書で提供する。一実施形態において、前記対象は、投与時に細菌感染症を有する。別の実施形態において、前記対象は、投与時に細菌感染を有しない。本発明の改変された担体タンパク質、コンジュゲート、又はバイオコンジュゲートは、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属、リステリア属種、又はカンピロバクター属種に対する免疫応答を誘導するのに用いることができる。特定の実施形態では、本発明の改変された担体タンパク質、コンジュゲート、又はバイオコンジュゲートを用いて、ストレプトコッカス属種(例えば肺炎球菌)に対する免疫応答を誘導する。

細菌に対するオプソニン食作用性抗体の生産を対象において誘導する方法であって、本発明の改変された担体タンパク質、コンジュゲート、又はバイオコンジュゲート(又は免疫原性組成物若しくはワクチン)を対象に投与することを含む方法も本明細書で提供する。一実施形態において、前記対象は、投与時に細菌感染症を有する。別の実施形態において、前記対象は、投与時に細菌感染を有しない。本明細書で提供される本発明の改変された担体タンパク質、コンジュゲート、又はバイオコンジュゲート(又は免疫原性組成物若しくはワクチン)は、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属、リステリア属種、又はカンピロバクター属種に対するオプソニン食作用性抗体の産生を誘導するのに用いることができる。特定の実施形態では、本発明の改変された担体タンパク質、又はコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲート(又は免疫原性組成物若しくはワクチン)を用いて、ストレプトコッカス属種(例えば肺炎球菌)に対するオプソニン食作用性抗体の生産を誘導する。

ある実施形態では、本発明は、治療有効量の本発明の免疫原性組成物又はワクチン(小児用ワクチン)を投与することによって、乳児(本発明との関連では、0～2歳として定義される)において免疫応答を誘発する改良された方法である。ある実施形態では、ワクチンは、小児用ワクチンである。

ある実施形態では、本発明は、治療有効量の本発明の免疫原性組成物又はワクチンを投与することによって、高齢集団(本発明との関連では、患者は、年齢が50歳以上、典型的には55歳以上、より一般的には60歳以上である場合、高齢者とみなされる)において免疫応答を誘発する改良された方法である。ある実施形態では、ワクチンは、高齢者用のワクチンである。

本明細書中で引用される全ての参考文献又は特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明をよりよく理解し得るために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示のみを目的としており、本発明の範囲をいかなる方法でも限定するものと解釈されるべきではない。

[実施例]
物質と方法
細菌株、クローニング、及び増殖条件。
新しく設計された担体であるHla-i、Hla-s、Hla-v、及びHla-a担体(配列番号36～39)の配列を保持するプラスミドBcp218、Bcp233、Bcp234、及びBcp235を得るための突然変異生成及びクローニング実験に、ポリメラーゼ不完全プライマー伸長(PIPE)法(Klock HEら、2009年、Methods Mol Biol.、498巻:91～103頁)を適用した。Hla-i、Hla-s、Hla-v、及びHla-a担体では、Hlaの組換え型(WO2019/121924として公開されている特許PCT/EP2018/085854における配列番号9、プラスミド:pGVXN2872、Wacker, M.ら J. Infect. Dis. 2014年、209巻、1551～1561頁も参照)の位置131のバイオコンジュゲーションコンセンサス配列が、それぞれ、配列KDSNITSAR(配列番号42)、KDSNSTSAR(配列番号43)、KDSNVTSAR(配列番号44)、及びKDSNATSAR(配列番号45)で置換されている。位置131の代わりに、又は位置131に加えて、これらのグリコサイト配列をHlaタンパク質のN末端及び/又はC末端に付加して、3つのさらに新しく設計されたHla担体、Hla-N,131、Hla-131,C、及びHla-N,Cが得られている。Hla-N,131、Hla-131,C、及びHla-N,Cでは、N末端のグリコサイト（糖化部位）の前及び後には、いくつかのアミノ酸(GSGGG、配列番号50)が導入され、Flglシグナル配列とタンパク質配列の始めとの間のスペーサーとなっており、一方、C末端のグリコサイトは、スペーサー(配列番号51～53)が前にあるのみである。設計された二重部位コンストラクトの配列をコードしているDNAプラスミドは、GeneArt(登録商標)供給業者から入手し、HlaコンストラクトのDNAインサートは、上記のPIPE法によってクローニングした。そのような突然変異誘発PCRの反応産物を用いることによるケミカルコンピテント大腸菌topTEN(Thermo(登録商標))の形質転換により、特定のプラスミドコンストラクトを保持するコロニーを得ることができた(Klock HEら、2009年、Methods Mol Biol.、498巻:91～103頁)。目的のHlaコンストラクトを確認し、選択するため、選択されたクローンから得たプラスミドを精製し、配列決定した。

黄色ブドウ球菌Hla-i、Hla-v、Hla-s、Hla-N,131、Hla-131,C、又はHla-N,Cアイソフォーム及びC.ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBN311V-K482R-D483H-A669V(pGVXN1221)をコードするプラスミドを用いたエレクトロポレーションによって大腸菌W3110 StGVXN9268細胞を同時形質転換した。

形質転換された細菌を、それぞれHla及びPglBをコードするプラスミドを維持するために2つの抗生物質、カナマイシン[50μg/ml]及びスペクチノマイシン[80μg/ml]が補充された選択寒天プレート上で一晩培養した。抗生物質を含有する50mlの溶原ブロス(LB)中に細菌を接種し、三角フラスコ中、37℃、180rpmで一晩振とうした。0.1の600nm光学濃度(OD_600nm)の希釈液になるように、カナマイシン[50μg/ml]及びスペクチノマイシン[80μg/ml]が補充された50mlのHTMC培地の培養物の接種を行い、平均0.8～1.0のOD_600nmまで、180rpmの振とう機で37℃にインキュベートし、Hla発現誘導用の0.2%アラビノース及びPglB発現誘導用の1mM IPTGを用いて一晩誘導を行った。培養物を37℃、180rpmで一晩振とうし、20時間の誘導の後、OD_600nmが20の細菌を採取した。上清は捨て、ペレットは直ちにペリプラズム抽出用に用いた。

ペリプラズム抽出
ペリプラズム抽出(PPE)は、20分間の遠心分離(4℃で4000rcf)の後に回収したOD_600nmが20の細菌ペレットで行った。細菌ペレットを600μLの溶解緩衝液(30mM Tris HCl pH 8.5、1mM EDTA、20%(wt/vol)スクロース)に再懸濁し、次いで、回転振とう機で4℃で20分間、最終1mg/mLのリゾチームで処理した。16000rcf、4℃で20分間の遠心分離の後、すぐに上清を収集し、使用するまで-20℃で保存した。総タンパク質含有量は、ビシンコニン酸アッセイ(還元剤適合性キット、Thermo Fischer Scientific)によって評価した。

ウエスタンブロット分析
ペリプラズムHlaのグリコシル化状態は、SDS-PAGE(MES 1×中4～12%Bis Tris、150V、1時間)及びイムノブロッティングHla-CP5抗血清(1:1000)によって分析した。市販の二次ヤギ抗ウサギHRP結合抗体を1:5000希釈で用いた(DAKO Ab、Agilent、CA、USA)。

Hla総タンパク質量定量化のためのPTPの選択。
20μgの組換えHla H35Lを、5mM DTT及び0.1%(wt/vol)RapiGestSF(Waters、USA)を含有する50mM重炭酸アンモニウム中で95℃で5分間煮沸し、トリプシン[1/25(wt/wt)、酵素/基質比率](Promega)で37℃で一晩消化した。ペプチド混合物は、マイクロエレクトロスプレーESI源(Thermo)を備えたThermo Scientific Q Exactive Plus質量分析計と連結されたAcquity UPLCシステム(Waters(登録商標))で行ったLCM/MSで分析した。試料は、フルループ注入を用いて、移動相A(0.1%ギ酸FA)中40μL/分の流速でロードした。次いで、40μL/分の流速の3～98%移動相B(98%(vol/vol)アセトニトリル、0.1%(vol/vol)FA)の勾配60分間を用いて、ナノAcquity UPLCペプチドBEH C18カラム75μm×100mm(Waters(登録商標))でペプチドを分離した。

Xcaliburソフトウェアを用い、m/z上位10についての自動化されたデータ依存型取得(DDA)で溶出したペプチドを処理した。Hla H35L配列が挿入さているNCBInrデータベースからダウンロードした大腸菌K-12データベース上でPeaks Xソフトウェアを用いてペプチド同定を行った。可変的修飾としての検索パラメータは、メチオニン酸化、グルタミン及びアスパラギンのアミド分解、トリプシン切断(次の残基がPでない限り、K又はRのC末端側を切断する)、0.15 Daのペプチド質量許容度(peptide mass tolerance)、0.15DaのペプチドMS/MS許容度(peptide MS/MS tolerance)、切断失敗(missed cleavage)= 2、イオン荷電状態:+2、+3、+4)であった。

適したPTPは、以下の判定基準に基づいて選択した。(i)Hlaに特異的なペプチド、(ii)親イオン又は断片イオンのいずれかについて強いMSシグナル強度を示しているペプチド、(iii)酸化を受けやすいメチオニン及びトリプトファン残基、又は環化を回避するため、N末端グルタミンを含有しないペプチド。

SRM-MS法のセットアップ
ペプチドの検出及びクロマトグラフィー溶出最適化は、UPLC(Waters、USA)につながっているXevo TQトリプル四重極質量分析計に連結された逆相カラム(ACQUITY UPLC HSS T3カラム、100Å、1.8μm、2.1mm×30mm、Waters、USA)を用いて、軽量型及び重量型の混合物の0.1%(vol/vol)FA溶液中の1pmolの合成ペプチドで行った。溶出勾配は、移動相A 0.1%(vol/vol)FAの水溶液及びB 0.1%(vol/vol)FAのアセトニトリル溶液で展開した。合成ペプチドを用いて、衝突エネルギー(CE)値を、理論値から始めて最適化し、50μgマトリックス中のトランジションを検証した。理論値は、式:CE = 0.034×(ペアレントm/z) + 1.314 (MacLean B.ら、Anal. Chem. 2010年、82巻:10116～10124頁)を用いて計算するPinPointソフトウェアを用いてインシリコで算出した。クロマトグラフィー分離の最適化は、最適化されたCE及び選択されたトランジションを用いてニート(neat)バックグラウンド及びマトリックスバックグラウンドの両方でSRM取得モードで行った(表3参照)。

細菌のペリプラズム抽出物のLC-SRM分析のための試料調製。
50μgのPPE画分をPreOmics(Martinsried、ドイツ)によって供給されるin-Stage-Tip(iST)試料調製キットを用いて消化した。これは、1)溶解、変性、還元、及びアルキル化、2)LysC及びトリプシンによるタンパク質分解消化、3)提供業者の推薦に従って実施されるペプチド脱塩という、カートリッジ上で行われる3ステッププロトコルである。回収されたペプチドを減圧下、45℃で乾燥し、1μg/μLの最終濃度に0.1%(vol/vol)FA中に再懸濁し、MS分析まで-20℃で保存した。

SRM-MS分析。
SRMは、実行毎にIsT試料調製キットでカラム内で消化した10μgのペリプラズム画分を注射することによって行い、各試料を三重反復で分析した。以下のパラメータ:Q1単離ウインドウ1.0m/z、Q3単離ウインドウ0.7m/z、MSからMS/MSへのスイッチングタイム(滞留時間)0.03sを用い、衝突セルの出口及び入口電位を30Vに設定した。1700Vのスプレー電圧を、脱溶媒和のための加熱イオン輸送設定270℃で用いた。MassLynxソフトウェア(バージョン2.1.0、Waters)を用いてデータを取得した。滞留時間を30msに、走査幅を0.02m/zに設定した。ペプチドごとに全てのトランジションの共溶出を確認した後、Carrら、Mol Cell Proteomics 13巻3号:907～917頁(2014年)に報告されているベストプラクティスに従って、TargetLynxソフトウェア(バージョン1.0.0.1、Waters)でピーク面積の定量化を行った。

PTP用量範囲線形性応答及びHla定量化。
マトリックス効果を考慮するための参照バックグラウンドとして用いた大腸菌グリココンピテント細胞(PglBプラスミドで形質転換したstGVXN9268)から調製したペリプラズム細菌試料で、選択されたPTPの用量範囲線形性応答を評価した。IsT試料調製キットによる消化の前に、標識されたPTP(最終濃度0.1pmol/μL)及び標識されていないPTP(最終濃度1.6pmol/μlから0.0125pmol/μl)を50μgのペリプラズム画分に添加した。

各PTPについて、濃度をピーク面積軽(可変)/ピーク面積重(一定)の比率としてプロットし、近似曲線を用いて、選択された内在性PTPの濃度を得た。医薬品規制ハーモナイゼーション国際会議(ICH)ガイドライン(http://www.ich.org/products/guidelines/quality/article/quality-guidelines.html)に従って、各ペプチドの定量化の下限(LLOQ)を近似曲線上の最低濃度点に設定した。最低濃度点は、定量的に検出し、10σ/Sと定義することができ、式中、σ=応答の標準偏差であり、S=較正曲線の傾斜である。

Hla濃度は、Hla-i(34093.07Da)、Hla-s(34066.99Da)、Hla-v(34079.05Da)、Hla-N,131(36962.06Da)、Hla-131,C(36518.60Da)、及びHla-N,C(37390.51Da)アイソフォームの分子量平均を考慮して、総ペリプラズムタンパク質抽出物1マイクログラムあたりのピコグラムで示した。関係する用量応答線形性曲線における各ペプチド応答値の内挿により定量化を得た(図4)。

結果
バイオコンジュゲーション用の新しい担体タンパク質を設計するために着手したワークフローを図1に示す。

第1の工程は、MSによるグリコシル化の程度の定量化に適したトリプシンペプチド(プロテオタイプペプチドPTPと称する)を生じさせることができる(Zhuら、2014年、J Am Soc Mass Spectrom. 25巻:1012～7頁)PglB酵素の基質であると予測されるコンセンサス配列(Kowarikら、2006年、EMBO J. 25巻:1957～1966頁)のインシリコ(in silico)設計であった。

設計されたPTPを、天然型で、又は13C-15Nをアルギニン残基に取り入れることによって重標識型で化学合成し、トリプル四重極計器を用いたMS/MS分析におけるそれらの挙動について調査した。

MSによる定量化のための適したPTPが同定されたならば、対応する配列を担体タンパク質に導入し、新しい担体を認識し、グリコシル化するPglB酵素の効率を評価した。

次いで、各コンセンサス配列の部位占有率を、グリコペプチドの非グリコシル化型の絶対的定量化から、同位体標識された内部標準及びSRMアプローチを用いて決定した。タンパク質分解及びLC-SRM MSの前に、2セットの重同位体標識されたペプチド標準を試料に添加した。1セットのペプチド標準は、総担体濃度を決定するのに使用し、一方、他の標準セットは、担体の非グリコシル化部分をモニターした。このようにして、非グリコシル化タンパク質量を総タンパク質濃度から引くことによってタンパク質のグリコシル化された部分の量を計算し、次いで、部位占有率を決定した。このアプローチは、自然にグリコシル化された真核生物タンパク質の定量化に有効であることが証明されている(Zhuら、2014年、J Am Soc Mass Spectrom. 25巻:1012～7頁)。

概念実証として、黄色ブドウ球菌CP5のバイオコンジュゲーションの担体タンパク質として使用される基質である黄色ブドウ球菌Hlaの組換え型(WO2019/121924として公開されているPCT/EP2018/085854を参照)に新しく設計されたコンセンサス配列を導入した。この担体は、位置131におけるコンセンサス配列((-3)KDQNRTK(+3))の挿入によって効率的にグリコシル化されることが報告されている。配列中、Asn残基(位置0で)がグリカンアクセプターである。残念ながら、トリプシンによる担体の消化が、LC-MS/MSでモニターするには過度に短く、親水性である改変されていないペプチド(-2)DQNR(+1)を生成したため、この抗原設計はグリコシル化の程度の定量化に適合しなかったことが見出された。異なる樹脂及び勾配を試験したが、好成績は得られなかった。

コンセンサス配列のインシリコ設計
C.ジェジュニPglBのコンセンサス配列基質は、詳細に特徴付けられている(Kowarikら、2006年、EMBO J. 25巻:1957-1966頁)。この配列は、-2の位置(asp又はglu)にある負に荷電する側鎖アミノ酸残基及び糖のasnアクセプターの位置+2にあるser又はthrの存在によって特徴付けられる。さらに、効率的なバイオコンジュゲーションは、コンセンサス部位が担体タンパク質のアクセス可能かつ可撓性のループにあることも必要とする(Silvermanら、2016年、J. Biol. Chem. 291巻、22001～22010頁)。

32種の天然C.ジェジュニ糖タンパク質で見出されたグリコシル化されたasn残基の-6から+6までの領域におけるアミノ酸の出現の統計分析が、図2Aに示すKowarikら、EMBO J. 2006年、25巻9号:1957～66頁に報告されている。灰色のボックス内の太字で表示されている、それぞれ位置-3、-1、+1、+3、及び+4のアミノ酸残基を4つのコンセンサス配列(図2B)の設計のために選択した。これらの残基は、高頻度で見出され、セットアップ判定基準に応答しているものとして選択された。位置+5のアミノ酸arg(統計分析に報告されていない)及び位置-3のアミノ酸lysは、PTPの生成に必要であるトリプシンの基質である。これらのPTPは、位置+1のアミノ酸残基のみが相互に異なった。

これらの最小限の要件に留意して、PglBの基質であり、トリプシンペプチドを生成することができると予測される4つのコンセンサス配列を設計した(図2B)。詳細には、以下の判定基準を考慮に入れた。(i)担体構造に対して起こり得る干渉を回避するため、挿入されたコンセンサス配列は9アミノ酸残基を超えず、疎水性アミノ酸残基及び芳香族アミノ酸残基の挿入は制限され、(ii)過小評価の定量化を避けるために、翻訳後修飾例えば、酸化(met、cys、trp)及び脱アミノ(asn及びgln)を受けやすいアミノ酸残基は制限され、コンセンサス配列は、トリプシンの基質となるように設計され、その特異性、有効性（効力）、及びC末端が正に荷電されたペプチドを生じさせる能力が高いものが得られるように選択され、(iii)32種の活性C.ジェジュニNグリコシル化部位を含有するデータセットの比較から明らかになった、糖のアクセプターであるasn周囲の優先的アミノ酸残基を考慮に入れ(4)、(iv)新しく設計されたコンセンサス配列は、新しく設計された担体アイソフォームにユニークだった。

4つの設計されたコンセンサス配列は、XがIle、Ser、Val、又はAlaアミノ酸残基である(-3)KDSNXTSAR(+5)であった。LysC/トリプシン消化の後、位置+1に存在するアミノ酸残基によって、PTP-i(配列番号42)、PTP-s(配列番号43)、PTP-v(配列番号44)、及びPTP-a(配列番号45)と名付けられたPTPs(-2)DSNXTSAR(+5)が生成された(図2B)。

グリコシル化の程度の定量化のためのSRMアッセイ
化学的に合成されたPTP-i-s-v-aの挙動をSRMアッセイで評価した。4つのPTPを、1.65分間から5.74分間にわたる明確に識別される保持時間(0.5分間という最小の差が、ペプチドPTP-aとPTP-sの間で観察された)及び強いMSシグナルでトリプル四重極質量分析計とオンラインの逆相C18上で分離した。

各PTPについて、4つのトランジション(各グリコシル化部位に特異的な選択的アミノ酸残基を含有するプリカーサー/プロダクト対b4、y5、及びy6、並びに全てのペプチドに共通のy4)をPinPointソフトウェアで計算し、最初はインニート(in-neat)注入によって最適化した(表1)。

次いで、マトリックスの効果を評価するために、LysC/トリプシンで消化された大腸菌ペリプラズム画分で、トランジションを検証した(Langeら、2008年、Mol. Syst. Biol. 4巻:222頁)。マトリックスは、PTP-s、PTP-v、及びPTP-iのパフォーマンスには軽微な効果を有した(表1)が、PTP-aには悪影響を有し、PTP-aの保持時間もトランジションも反復的な分析を通して安定していなかった。この理由から、バイオコンジュゲーションコンセンサス配列(-5)KDSNATSAR(+3)についてはさらに調査しなかった。

PTP-s、PTP-v、及びPTP-iについて、衝突エネルギーを最適化し、トリプシン消化の前に、50μg大腸菌ペリプラズム画分に一定量のPTP(0.1pmol/μg)の重量型及びスカラー濃度の軽量PTP(0.0125pmol/μgから1.6pmol/μgの範囲)を添加して用量応答線形性曲線を確立した。医薬品規制ハーモナイゼーション国際会議(ICH)ガイドライン(http://www.ich.org/products/guidelines/quality/article/quality-guidelines.html)に従って、各ペプチドのLLOQを近似曲線上で最低濃度点として設定した。最低濃度点は、定量的に検出し、10σ/Sと定義することができ、式中、σ=応答の標準偏差であり、S=較正曲線の傾斜である。LODすなわち検出限界(LOD = 3.3σ/S)も、ICHガイドラインに基づき定義した(図4)。

選択されたコンセンサス配列はPglBの基質である
3つの新しく設計したコンセンサス配列PTP-i(配列番号42)、PTP-s(配列番号43)、及びPTP-v(配列番号44)を、最適化されたHla抗原(WO2019/121924として公開されているPCT/EP2018/085854を参照)の位置131に挿入して、バイオコンジュゲートHla-i-CP5、Hla-v-CP5、及びHla-s-CP5を生成した。これらは、LysC/トリプシンで消化されたならば、それぞれ、PTP-i、PTP-v、PTP-sペプチドを生成する。バイオコンジュゲーションに必要とされる機構を有するグリココンピテント大腸菌株のペリプラズムを単離し、Hla-CP5バイオコンジュゲートを認識するマウス血清を使用してHlaへのCP5のコンジュゲーションをウエスタンブロット解析によって評価した(図3)。担体は、3つの異なるコンストラクト間で比較可能な部分的なグリコシル化パターンによって特徴付けられる。しかし、グリコシル化の程度をウエスタンブロットから定量化することはできなかった。

Hla-CP5グリコシル化の程度の定量化
グリコシル化の程度は、SRMによって評価した。詳細には、部位占有率は、以下の等式(Zhuら、2015年、J Am Soc Mass Spectrom. 25巻:1012～7頁)によって決定した。

式中、改変されていない担体濃度は、内在性PTP-i、PTP-v、PTP-sの定量化によって決定され、総担体濃度は、Hlaに特異的なペプチドによって定量化された。

適したHla特異的ペプチドを同定するために、組換えHlaをトリプシンで消化し、生成したペプチドをLCM/MSによって分析した。それぞれPTP_-2及びPTP_-1と名付けた2つのペプチド、42T-50K(TGDLVTYK、配列番号48)及び225A-234K(AADNFLDPNK、配列番号49)を選択した。2つのペプチドに関する全ての情報(トランジション、最適化されたCE、保持時間、及びマトリックス中のLLOQ)を表3に示す。

さらに、SRMアッセイは、各々の選択されたPTPの定量化における一貫性を確実にするために、担体の有効なプロテアーゼ消化を必要とする。消化の効率をSDS/PAGEによって、そして、切断失敗(missed cleavages)の数が全同定ペプチドの2%より少ないことをLCM/MSによって評価することによってチェックした(Biagini Mら、2016年、Proc Natl Acad Sci USA. 113巻:2714～9頁)。

トリプシン消化の前に組換えHla及び既知量の各同位体標識PTPを大腸菌ペリプラズム画分に添加することによってPTP-i-v-sとPTP_-1-2の互換性が示された。

CP5と様々な新しく設計されたHla担体のバイオコンジュゲート(Hla-i-CP5、Hla-v-CP5、及びHla-s-CP5)を発現する大腸菌グリココンピテント株からペリプラズム画分を単離し、LysC/トリプシン消化及びLC-SRMによる分析の前に、既知量の各同位体標識PTPを添加した。実験は、3回の独立した3連の消化実施から行った。PTPの定量化は、異なる実施間で再現性が非常に高く、ほとんど全ての変動係数(CV)が10%未満だった。一方、消化の再現性関連するCV及びバイオコンジュゲーションの程度の定量化は14%未満だった(表1)。これらの値は、文献で報告されているCVと一致しており、分析に意図されている誤差を有していた(Huttenhainら、2009年、Curr. Opin. Chem. Biol. 13巻 518～525頁)。担体の総濃度及び非グリコシル化量の濃度は、Hla-i-CP5、Hla-v-CP5、及びHla-s-CP5が発現された担体の総量の41.47%、45.14%、及び42.73%に相当すると決定するのを可能にした(表4)。類似したグリコシル化の程度が、ウエスタンブロット解析(図3)で観察されたパターンと一致していた。コンセンサス配列中の可変アミノ酸残基(ser、val、又はile)の導入は、PglB酵素がHla担体にバイオコンジュゲートする有効性（効力）に有意に影響を与えなかった。3つの異なるコンセンサス配列の同定は、後述する、複数の定量化可能なコンジュゲーション部位を有するHla担体の設計を可能にした。

2つのグリコシル化部位を有するHlaコンストラクトの設計
グリコシル化の程度の定量化に適した複数のコンセンサス配列基質を有するHla担体を、PTP-iとPTP-vをHlaタンパク質のN末端、C末端、及び/又は位置131に代替的な組合せで挿入することによって設計した。コンセンサス配列挿入のそれらそれぞれの位置により、それらは、ここで、Hla-N,131(配列番号50)、Hla-131,C(配列番号51)、及びHla-N,C(配列番号52)と名付けられている。

3つの担体の定量化及び計算されたグリコシル化の程度を以下の表5に示し、図5Aにまとめる。

低量の担体Hla-N,131(2.90ng/μg総ペリプラズムタンパク質)をペリプラズム抽出物中で定量化し、グリコ配列を含有する両ペプチド(PTP-i及びPTP-v)とも、値が分析のLLOQ未満で検出され、定量化不能となった。この理由から、両方のコンセンサス配列とも、完全にコンジュゲートされたと考えられた。Hla-N,Cアイソフォームについては、10.66ng/μgペリプラズム抽出物と定量化された。N末端ドメインにグリコ配列を有するペプチド(PTP-v)は、完全にグリコシル化されているという結果になり、一方、C末端位置のグリコ配列(PTP-i)については、グリコシル化の程度が約19%にしか達しなかった。Hla-131,Cアイソフォームは、38.71ng/μg総ペリプラズムタンパク質であり、位置131(PTP-i)及びC末端(PTP-v)でのグリコシル化の程度が約19%であり、最も発現されたアイソフォームであるという結果になった。

これらのデータは、バイオコンジュゲーションの個々の部位について、いくつかの部位が同時に担体タンパク質に挿入されている場合にも、本発明の方法によるグリコシル化の程度の測定を評価することができることを示した。さらに、担体タンパク質のN末端ドメインに位置するグリコサイトは、分析した全てのアイソフォームで完全にグリコシル化されているという結果になった。その代わりに、Hlaの可撓性で溶媒に露出したループである位置131にグリコサイトが挿入された場合には、グリコシル化の第2の部位が存在するか否かにかかわらず、グリコシル化の程度が担体タンパク質量に反比例した(図5B)。最後に、より構造化されたC末端領域にグリコサイトが挿入された場合、グリコシル化の程度は、試験された2つの担体タンパク質Hla-131,C及びHla-N,Cで類似していた。これは、PglBは、折り畳まれたタンパク質部分でもある程度N-グリコシル化を行うことができたことを示している(Fisher A.C.ら、2011年、Applied and Environmental Microbiology、77巻3号 871～881頁)。

本発明の態様は、以下の番号付けされた段落に要約される。

1.改変された担体タンパク質であって、該担体タンパク質が、アミノ酸配列:
K/R-Z_0-9-D/E-X-N-Y-S/T-Z_0-9-K/R
を含むか、又はそれからなる1以上のコンセンサス配列を含むという点で改変されており、
X及びYが、独立して、プロリン以外の任意のアミノ酸であり、Zが任意のアミノ酸を表し、任意選択的に（場合により）、X及びYが、独立して、プロリン、リジン、又はアルギニン以外の任意のアミノ酸であり、Zが、リジン又はアルギニン以外は任意のアミノ酸を表し、好ましくはZがシステイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、リジン、又はアルギニン以外の任意のアミノ酸を表す、改変された担体タンパク質(例えば配列番号47)。

2.前記コンセンサス配列がアミノ酸配列K/R-D/E-X₁-N-X₂-S/T-Z₁-Z₂-K/R(配列番号19)であり、X₁及びX₂が、独立して、プロリンを除いた任意のアミノ酸であり、X₁及びX₂並びにZ₁及びZ₂が、好ましくは、リジン又はアルギニンではなく、任意選択的に、X₁及びX₂並びにZ₁及びZ₂が、システイン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、又はアルギニンではない、段落1に記載の改変された担体タンパク質。

3.前記コンセンサス配列が配列番号20、任意選択的に配列番号42～45、任意選択的に配列番号42～44のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、段落1又は段落2に記載の改変された担体タンパク質。

4.前記コンセンサス配列が(i)担体タンパク質配列の1個以上のアミノ酸について置換されているか、(ii)担体タンパク質配列に挿入されている、段落1～3のいずれか1つに記載の改変された担体タンパク質。

5.複数の前記コンセンサス配列、任意選択的に少なくとも2つ、3つ、4つ、又は5つのコンセンサス配列を含む、段落1～4のいずれか1つに記載の改変された担体タンパク質。

6.前記コンセンサス配列の全てが、異なるアミノ酸配列を有する、段落5に記載の改変された担体タンパク質。

7.担体タンパク質がCRM197、破傷風菌由来のTT、緑膿菌由来のEPA、緑膿菌由来のHcp1、黄色ブドウ球菌由来のHla、黄色ブドウ球菌由来のClfA、大腸菌由来のMBP、大腸菌由来のPspA、又は淋菌由来のMtrEである、段落1～6のいずれか1つに記載の改変された担体タンパク質。

8.担体タンパク質が、配列番号1～16のいずれか1つのアミノ酸配列又は配列番号1～16のいずれか1つに少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、段落7に記載の改変された担体タンパク質。

9.改変された担体タンパク質が、配列番号1～16のいずれか1つに少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、又は97%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、段落8に記載の改変された担体タンパク質。

10.改変された担体タンパク質がグリコシル化されている、段落1～9のいずれか1つに記載の改変された担体タンパク質。

11.段落1～10のいずれか1つに記載の改変された担体タンパク質を含むコンジュゲート(例えばバイオコンジュゲート)であって、改変された担体タンパク質が多糖に連結されている、コンジュゲート(例えばバイオコンジュゲート)。

12.多糖が、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン、又はトリプトファン(例えばアスパラギン)から選択される、改変された担体タンパク質上のアミノ酸に連結されている、段落11に記載のコンジュゲート(例えばバイオコンジュゲート)。

13.多糖が細菌莢膜多糖である、段落11又は12に記載のコンジュゲート(例えばバイオコンジュゲート)。

14.莢膜多糖が、黄色ブドウ球菌5型莢膜糖、黄色ブドウ球菌8型莢膜糖、髄膜炎菌血清型A莢膜糖(MenA)、髄膜炎菌血清型C莢膜糖(MenC)、髄膜炎菌血清型Y莢膜糖(MenY)、髄膜炎菌血清型W莢膜糖(MenW)、インフルエンザ菌b型莢膜糖(Hib)、B群連鎖球菌I群莢膜糖、B群連鎖球菌II群莢膜糖、B群連鎖球菌III群莢膜糖、B群連鎖球菌IV群莢膜糖、B群連鎖球菌V群莢膜糖、チフス菌由来のVi糖、髄膜炎菌LPS(例えばL3及び/又はL2)、カタラーリス菌LPS、インフルエンザ菌LPS、赤痢菌O抗原、緑膿菌O抗原、大腸菌O抗原、又は肺炎球菌莢膜多糖からなる群から選択される、段落13に記載のコンジュゲート(例えばバイオコンジュゲート)。

15.莢膜多糖が、担体タンパク質と同じ生物由来である、段落13又は14に記載のコンジュゲート(例えばバイオコンジュゲート)。

16.莢膜多糖が、担体タンパク質と異なる生物由来である、段落15に記載のコンジュゲート(例えばバイオコンジュゲート)。

17.段落1～10のいずれか一つに記載の改変された担体タンパク質をコードするポリヌクレオチド。

18.段落17に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

19.a)グリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1以上の核酸、
b)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
c)段落1～10のいずれか一つに記載の改変された担体タンパク質をコードする核酸、及び任意選択的に
d)ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸
を含む宿主細胞。

20.(a)ウンデカプレニルピロリン酸(Und-PP)上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルされたグリコシルトランスフェラーゼ、及び(b)Und-PP上にアセンブルされたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる1以上のグリコシルトランスフェラーゼを含む、段落19に記載の宿主細胞。

21.Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせる前記グリコシルトランスフェラーゼは、宿主細胞に対して異種であり、及び/又はグリコシルトランスフェラーゼ(複数可)をコードする1以上の遺伝子に対して異種であり、任意選択的に、Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせる前記グリコシルトランスフェラーゼは、エシェリキア属種、シゲラ属種、クレブシエラ属種、キサントモナス属種、サルモネラ属種、エルシニア属種、アエロモナス属種、フランシセラ属種、ヘリコバクター属種、プロテウス属種、ラクトコッカス属種、ラクトバチルス属種、シュードモナス属種、コリネバクテリウム属種、ストレプトマイセス属種、ストレプトコッカス属種、エンテロコッカス属種、スタフィロコッカス属種、バチルス属種、クロストリジウム属種、リステリア属種、又はカンピロバクター属種由来であり、任意選択的にwecA(例えば、大腸菌由来のwecA)である、段落20に記載の宿主細胞。

22.前記ヘキソース単糖誘導体が、C-2位がアセトアミド基で修飾される任意の単糖、例えばN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソース(DATDH)、N-アセチルフコサミン(FucNAc)、又はN-アセチルキノボサミン(QuiNAc)である、段落19～21のいずれか一つに記載の宿主細胞。

23.Und-PP上にアセンブルされたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1以上のグリコシルトランスフェラーゼが、大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)、若しくは大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)であり、又は大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)及び大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)である、段落19～22のいずれか一つに記載の宿主細胞。

24.グリコシルトランスフェラーゼが、ドナーオリゴ糖の第1リピート単位の還元末端に存在するヘキソース単糖又は多糖をヘキソース単糖誘導体に付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含み、任意選択的に、ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1以上のグリコシルトランスフェラーゼが、任意選択的に大腸菌O21由来でもよいガラクトシルトランスフェラーゼ(wciP)を含み、任意選択的に、ドナーオリゴ糖若しくは多糖の第1リピート単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に、ドナーオリゴ糖若しくは多糖の第1リピート単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に隣接する単糖を付加することができるグリコシルトランスフェラーゼ、任意選択的に、任意選択的に大腸菌O21でもよいグルコシルトランスフェラーゼ(wciQ)を含む、段落19～23のいずれか1つに記載の宿主細胞。

25.オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニに由来し、任意選択的に前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼはカンピロバクター・ジェジュニのpglBであり、任意選択的にカンピロバクター・ジェジュニのpglB遺伝子は宿主細胞ゲノムに組み込まれ、任意選択的に宿主細胞の少なくとも1つの遺伝子は機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子は機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子はオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸によって置き換えられており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子はカンピロバクター・ジェジュニpglBによって置き換えられている、段落19～24のいずれか一つに記載の宿主細胞。

26.改変された担体タンパク質をコードする核酸が宿主細胞内のプラスミド内にある、段落19～25のいずれか1つに記載の宿主細胞。

27.改変された担体タンパク質をコードする核酸が、宿主細胞のゲノムに組み込まれている、段落19～26のいずれか1つに記載の宿主細胞。

28.宿主細胞が大腸菌である、段落19～27のいずれか1つに記載の宿主細胞。

29.糖に連結された、改変された担体タンパク質を含むバイオコンジュゲートを生成する方法であって、(i)タンパク質の生成に適した条件下で、段落19～28のいずれか一つに記載の宿主細胞を培養すること、及び(ii)バイオコンジュゲートを単離することを含む方法。

30.改変された担体タンパク質に連結された多糖を含む、段落29に記載の方法によって生成されるバイオコンジュゲート。

31.段落1～10のいずれか1つに記載の改変された担体タンパク質又は段落11～16のいずれか1つに記載のコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲートを含む、免疫原性組成物。

32.改変された担体タンパク質又はコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲートを薬学的に許容される賦形剤又は担体と混合する工程を含む、段落31に記載の免疫原性組成物を作製する方法。

33.段落31に記載の免疫原性組成物及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含むワクチン。

34.それを必要とする対象における細菌感染の治療又は予防のための方法であって、治療有効量の段落1～10に記載のいずれか1つに記載の改変された担体タンパク質又は段落11～16のいずれか1つに記載のコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲートを前記対象に投与することを含む方法。

35.細菌感染に対してヒト宿主を免疫化する方法であって、段落1～10のいずれか1つに記載の改変された担体タンパク質又は段落11～16のいずれか1つに記載のコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲートの免疫防御用量を宿主に投与することを含む方法。

36.対象において細菌に対する免疫応答を誘導する方法であって、治療有効量又は予防有効量の段落1～10のいずれか1つに記載の改変された担体タンパク質又は段落11～16のいずれか1つに記載のコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲートを対象に投与することを含む方法。

37.細菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防で使用するための、段落1～10のいずれか1つに記載の改変された担体タンパク質又は段落11～16のいずれか1つに記載のコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲート。

38.細菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防のための医薬の製造における、段落1～10のいずれか1つに記載の改変された担体タンパク質又は段落11～16のいずれか1つに記載のコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲートの使用。

39.前記細菌又は細菌感染が、黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌、インフルエンザ菌、インフルエンザ菌b型、B群連鎖球菌、チフス菌、カタラーリス菌、シゲラ・フレックスネリ、緑膿菌、大腸菌、又は肺炎球菌からなる群から選択される、段落34～36のいずれか1つに記載の方法又は段落37に記載の使用若しくは段落38に記載の使用のための担体タンパク質、コンジュゲート、若しくはバイオコンジュゲート。

40.段落1～10のいずれか1つに記載の担体タンパク質のグリコシル化部位占有のレベルを測定する方法であって、グリコシル化された担体タンパク質をプロテアーゼで消化すること、消化されたタンパク質のLC-MSを行うこと、改変されていない担体タンパク質の濃度Uを決定すること、総担体タンパク質の濃度Tを決定すること、及び以下の等式によってグリコシル化部位占有を計算することを含む方法。

41.改変されていない担体タンパク質の濃度Uが、コンセンサス配列に対応するペプチド断片の濃度を決定することによって決定される、段落40に記載の方法。

42.総担体タンパク質の濃度Tが、前記担体タンパク質に特有である1以上のペプチド断片の濃度を決定することによって決定される、段落40又は段落41に記載の方法。

43.プロテアーゼがトリプシンである、段落40～42のいずれか1つに記載の方法。

配列リスト
配列番号1:成熟野生型EPAのアミノ酸配列。太字及び下線部は、解毒のために置換/除去された残基である。生物:緑膿菌。

配列番号2:L552V/ΔE553解毒突然変異(太字、下線部)を有するEPAのアミノ酸配列。人工配列。

配列番号3:開始メチオニンの無い破傷風毒素前駆体TT(AA 1～1315)。生物:破傷風菌

配列番号4:ジフテリア毒素(DT)。生物:ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriai)

配列番号5:CRM197、ジフテリア毒素の無毒性変異体。人工配列。

配列番号6:Hcp1。生物:緑膿菌

配列番号7:開始メチオニンの無いPspA、ファージショックプロテインA。生物:大腸菌

配列番号8:MBP、マルトース/マルトデキストリン結合タンパク質。生物:大腸菌

配列番号9:成熟mtrE、膜トランスポーターE。生物:淋菌

配列番号10:野生型成熟ClfAN1N2N3。生物:黄色ブドウ球菌。

配列番号11:野生型成熟ClfAN2N3。生物:黄色ブドウ球菌。

配列番号12:ClfAN2N3P116S/Y118A。人工配列。

配列番号13:成熟野生型Hlaのアミノ酸配列。生物:黄色ブドウ球菌。

配列番号14:成熟HlaH35Lのアミノ酸配列。人工配列。

配列番号15:成熟Hla H35L/H48C/G122Cのアミノ酸配列、人工配列。

配列番号16:HlaPSGS。人工配列。

配列番号17:最小PglBグリコサイトコンセンサス配列。人工配列。

X₁及びX₂は、プロリンとは別の任意のアミノ酸である。

配列番号18:完全なPglBグリコサイトコンセンサス配列。人工配列。

X₁及びX₂は、プロリンとは別の任意のアミノ酸である。

配列番号19:MS定量化適合性PglBグリコサイトコンセンサス配列。人工配列。

X₁及びX₂は、プロリンとは別の任意のアミノ酸であり、Z₁及びZ₂は、リジン又はアルギニンではない。

配列番号20:MS定量化適合性PglBグリコサイトコンセンサス配列。人工配列。

X₁及びX₂は、プロリンとは別の任意のアミノ酸である。

配列番号21:FlgIシグナル配列。生物:シゲラ・フレックスネリ

配列番号22:OmpAシグナル配列。生物:大腸菌

配列番号23:MalEシグナル配列。生物:大腸菌

配列番号24:PelBシグナル配列。生物:軟腐病菌(Erwinia carotovora)。

配列番号25:LTIIbシグナル配列。生物:大腸菌

配列番号26:XynAシグナル配列。生物:枯草菌

配列番号27:DsbAシグナル配列。生物:大腸菌

配列番号28:TolBシグナル配列。生物:大腸菌

配列番号29:SipAシグナル配列。生物:ストレプトコッカス・アガラクチア

配列番号30:N末端S、Flglシグナル配列、C末端GSHRHR、及び残基K131のKDQNRTK置換を有するHla H35L/H48C/G122Cのアミノ酸配列。人工配列。

配列番号31:N末端S、Flglシグナル配列、C末端GSHRHR、及び残基K131のKDSNITSAR置換を有する成熟Hla H35L/G122C/H48Cのアミノ酸配列。人工配列。

配列番号32:N末端S、Flglシグナル配列、C末端GSHRHR、及び残基K131のKDSNSTSAR置換を有する成熟Hla H35L/G122C/H48Cのアミノ酸配列。人工配列。

配列番号33:N末端S、Flglシグナル配列、C末端GSHRHR、及び残基K131のKDSNVTSAR置換を有する成熟Hla H35L/G122C/H48Cのアミノ酸配列。人工配列。

配列番号34:N末端S、Flglシグナル配列、C末端GSHRHR、及び残基K131のKDSNATSAR置換を有する成熟Hla H35L/G122C/H48Cのアミノ酸配列。人工配列。

配列番号35:残基K131のKDQNRTK置換を有する成熟Hla H35L/H48C/G122Cのアミノ酸配列。人工配列。

配列番号36:残基K131のKDSNITSAR置換を有する成熟Hla H35L/G122C/H48Cのアミノ酸配列。人工配列。

配列番号37:残基K131のKDSNSTSAR置換を有する成熟Hla H35L/G122C/H48Cのアミノ酸配列。人工配列。

配列番号38:残基K131のKDSNVTSAR置換を有する成熟Hla H35L/G122C/H48Cのアミノ酸配列。人工配列。

配列番号39:残基K131のKDSNATSAR置換を有する成熟Hla H35L/G122C/H48Cのアミノ酸配列。人工配列。

配列番号40:KDQNRTKグリコサイト。人工配列。

配列番号41:KDQNATKグリコサイト。人工配列。

配列番号42:KDSNITSARグリコサイト。人工配列。

配列番号43:KDSNSTSARグリコサイト。人工配列。

配列番号44:KDSNVTSARグリコサイト。人工配列。

配列番号45:KDSNATSARグリコサイト。人工配列。

配列番号46:MS定量化適合性PglBグリコサイトコンセンサス配列。人工配列。

X及びYが、独立して、プロリン、リジン、又はアルギニン以外の任意のアミノ酸であり、Zがシステイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、リジン、又はアルギニン以外の任意のアミノ酸を表す。

配列番号47:MS定量化適合性PglBグリコサイトコンセンサス配列。人工配列。

X及びYが、独立して、プロリン、システイン、メチオニン、アスパラギン若しくはグルタミン、リジン、又はアルギニン以外の任意のアミノ酸であり、Zがシステイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、リジン、又はアルギニン以外の任意のアミノ酸を表す。

配列番号48:PTP-2と名付けたペプチド42T-50K。生物:黄色ブドウ球菌。

配列番号49:PTP-3と名付けたペプチド225A-234K。生物:黄色ブドウ球菌。

配列番号50:スペーサー

配列番号51:N末端S、残基K131のKDSNITSARグリコサイト置換、N末端のグリコサイトKDSNVTSAR(このグリコサイトの前後にはGSGGGスペーサーが付いている)、FIglシグナル配列、及びC末端のHisタグを有する成熟Hla H35L/G122C/H48Cのアミノ酸配列(太字のAla-21から開始)。人工配列。

配列番号52:N末端S、残基K131のKDSNITSARグリコサイト置換、C末端のグリコサイトKDSNVTSAR(このグリコサイトの前にGSGGGスペーサーが付いている)、FIglシグナル配列、及びC末端のHisタグを有する成熟Hla H35L/G122C/H48Cのアミノ酸配列(太字のAla-21から開始)。人工配列。

配列番号53:N末端S、GSGGGスペーサーが前にあるC末端のKDSNITSARグリコサイト、N末端のグリコサイトKDSNVTSAR(このグリコサイトの前後にはGSGGGスペーサーが付いている)、FIglシグナル配列、及びC末端のHisタグを有する成熟Hla H35L/G122C/H48Cのアミノ酸配列(太字のAla-21から開始)。人工配列。

Claims

改変された担体タンパク質であって、該担体タンパク質が、アミノ酸配列:
K/R-Z_0-9-D/E-X-N-Y-S/T-Z_0-9-K/R
を含むか、又はそれからなる1以上のコンセンサス配列を含むという点で改変されており、
X及びYが、独立して、プロリン以外の任意のアミノ酸であり、Zが任意のアミノ酸を表し、任意選択的に、X及びYが、独立して、プロリン、リジン、又はアルギニン以外の任意のアミノ酸であり、Zが、リジン又はアルギニン以外の任意のアミノ酸を表し、好ましくは、Zがシステイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、リジン、又はアルギニン以外の任意のアミノ酸を表す、改変された担体タンパク質。
前記コンセンサス配列がアミノ酸配列K/R-D/E-X₁-N-X₂-S/T-Z₁-Z₂-K/R(配列番号19)であり、X₁及びX₂が、独立して、プロリンとは別の任意のアミノ酸であり、X₁及びX₂並びにZ₁及びZ₂が、好ましくはリジン又はアルギニンではなく、任意選択的に、X₁及びX₂並びにZ₁及びZ₂がシステイン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、又はアルギニンではない、請求項1に記載の改変された担体タンパク質。
前記コンセンサス配列が配列番号20、任意選択的に配列番号42～45、任意選択的に配列番号42～44のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項1又は2に記載の改変された担体タンパク質。
前記コンセンサス配列が(i)担体タンパク質配列の1個以上のアミノ酸を置換しているか、(ii)担体タンパク質配列に挿入されている、請求項1～3のいずれか一項に記載の改変された担体タンパク質。
複数の前記コンセンサス配列、任意選択的に少なくとも2つ、3つ、4つ、又は5つのコンセンサス配列を含む、請求項1～4のいずれか一項に記載の改変された担体タンパク質。
前記コンセンサス配列の全てが、異なるアミノ酸配列を有する、請求項5に記載の改変された担体タンパク質。
担体タンパク質がCRM197、破傷風(Clostridium tetani)菌由来のTT、緑膿菌(P. aeruginosa)由来のEPA、緑膿菌由来のHcp1、黄色ブドウ球菌(S. aureus)由来のHla、黄色ブドウ球菌由来のClfA、大腸菌(E. coli)由来のMBP、大腸菌由来のPspA、又は淋菌(N. gonorrhoeae)由来のMtrEである、請求項1～6のいずれか一項に記載の改変された担体タンパク質。
担体タンパク質が、配列番号1～16のいずれか1つのアミノ酸配列又は配列番号1～16のいずれか1つに少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項7に記載の改変された担体タンパク質。
改変された担体タンパク質が、配列番号1～16のいずれか1つに少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、96%、又は97%同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項8に記載の改変された担体タンパク質。
改変された担体タンパク質がグリコシル化されている、請求項1～9のいずれか一項に記載の改変された担体タンパク質。
請求項1～10のいずれか一項に記載の改変された担体タンパク質を含むコンジュゲート(例えばバイオコンジュゲート)であって、改変された担体タンパク質が多糖に連結されている、コンジュゲート(例えばバイオコンジュゲート)。
多糖が、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン、又はトリプトファン(例えばアスパラギン)から選択される改変された担体タンパク質上のアミノ酸に連結されている、請求項11に記載のコンジュゲート(例えばバイオコンジュゲート)。
多糖が細菌莢膜多糖である、請求項11又は12に記載のコンジュゲート(例えばバイオコンジュゲート)。
莢膜多糖が、黄色ブドウ球菌5型莢膜糖、黄色ブドウ球菌8型莢膜糖、髄膜炎菌(N. meningitidis)血清型A莢膜糖(MenA)、髄膜炎菌血清型C莢膜糖(MenC)、髄膜炎菌血清型Y莢膜糖(MenY)、髄膜炎菌血清型W莢膜糖(MenW)、インフルエンザ菌(H. influenzae)b型莢膜糖(Hib)、B群連鎖球菌(Streptococcus)I群莢膜糖、B群連鎖球菌II群莢膜糖、B群連鎖球菌III群莢膜糖、B群連鎖球菌IV群莢膜糖、B群連鎖球菌V群莢膜糖、チフス菌(Salmonella typhi)由来のVi糖、髄膜炎菌LPS(例えばL3及び/又はL2)、カタラーリス菌(M. catarrhalis)LPS、インフルエンザ菌LPS、赤痢菌(Shigella)O抗原、緑膿菌O抗原、大腸菌O抗原、又は肺炎球菌(S. pneumoniae)莢膜多糖からなる群から選択される、請求項13に記載のコンジュゲート(例えばバイオコンジュゲート)。
莢膜多糖が、担体タンパク質と同じ生物由来である、請求項13又は14に記載のコンジュゲート(例えばバイオコンジュゲート)。
莢膜多糖が、担体タンパク質と異なる生物由来である、請求項15に記載のコンジュゲート(例えばバイオコンジュゲート)。
請求項1～10のいずれか一項に記載の改変された担体タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
請求項17に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
a)グリコシルトランスフェラーゼをコードする1以上の核酸、
b)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、
c)請求項1～10のいずれか一項に記載の改変された担体タンパク質をコードする核酸、及び任意選択的に
d)ポリメラーゼ(例えば、wzy)をコードする核酸
を含む宿主細胞。
(a)ウンデカプレニルピロリン酸(Und-PP)上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせるグリコシルトランスフェラーゼ、及び(b)Und-PP上にアセンブルされたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる1以上のグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項19に記載の宿主細胞。
Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせる前記グリコシルトランスフェラーゼが、宿主細胞に対して異種であり、及び/又はグリコシルトランスフェラーゼをコードする1以上の遺伝子に対して異種であり、任意選択的に、Und-PP上にヘキソース単糖誘導体をアセンブルさせる前記グリコシルトランスフェラーゼが、エシェリキア属(Escherichia)種、シゲラ属(Shigella)種、クレブシエラ属(Klebsiella)種、キサントモナス属(Xhantomonas)種、サルモネラ属(Salmonella)種、エルシニア属(Yersinia)種、アエロモナス属(Aeromonas)種、フランシセラ属(Francisella)種、ヘリコバクター属(Helicobacter)種、プロテウス属(Proteus)種、ラクトコッカス属(Lactococcus)種、ラクトバチルス属(Lactobacillus)種、シュードモナス属(Pseudomonas)種、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)種、ストレプトマイセス属(Streptomyces)種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、エンテロコッカス属(Enterococcus)種、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)種、バチルス属(Bacillus)種、クロストリジウム属(Clostridium)種、リステリア属(Listeria)種、又はカンピロバクター属(Campylobacter)種由来であり、任意選択的にwecA(例えば、大腸菌由来のwecA)である、請求項20に記載の宿主細胞。
前記ヘキソース単糖誘導体が、C-2位がアセトアミド基で修飾される任意の単糖、例えばN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソース(DATDH)、N-アセチルフコサミン(FucNAc)、又はN-アセチルキノボサミン(QuiNAc)である、請求項19～21のいずれか一項に記載の宿主細胞。
Und-PP上にアセンブルされたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1以上のグリコシルトランスフェラーゼが、大腸菌(E. coli)O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)若しくは大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)であるか、又は大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wbeY)及び大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ(wfdK)である、請求項19～22のいずれか一項に記載の宿主細胞。
グリコシルトランスフェラーゼが、ドナーオリゴ糖の第1リピート単位の還元末端に存在するヘキソース単糖又は多糖をヘキソース単糖誘導体に付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含み、任意選択的に、ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる前記1以上のグリコシルトランスフェラーゼが、任意選択的に大腸菌O21由来でもよい、ガラクトシルトランスフェラーゼ(wciP)を含み、任意選択的に、ドナーオリゴ糖若しくは多糖の第1リピート単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に、ドナーオリゴ糖若しくは多糖の第1リピート単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に隣接する単糖を付加することができるグリコシルトランスフェラーゼ、任意選択的にグルコシルトランスフェラーゼ(wciQ)、任意選択的に大腸菌O21由来のグルコシルトランスフェラーゼ(wciQ)を含む、請求項19～23のいずれか一項に記載の宿主細胞。
オリゴサッカリルトランスフェラーゼがカンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)に由来し、任意選択的に前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼがカンピロバクター・ジェジュニのpglBであり、任意選択的にカンピロバクター・ジェジュニのpglB遺伝子が宿主細胞ゲノムに組み込まれ、任意選択的に宿主細胞の少なくとも1つの遺伝子が機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子が機能的に不活化又は欠失されており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子がオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸によって置き換えられており、任意選択的に宿主細胞のwaaL遺伝子がカンピロバクター・ジェジュニpglBによって置き換えられている、請求項19～24のいずれか一項に記載の宿主細胞。
改変された担体タンパク質をコードする核酸が宿主細胞内のプラスミド内にある、請求項19～25のいずれか一項に記載の宿主細胞。
改変された担体タンパク質をコードする核酸が、宿主細胞のゲノムに組み込まれている、請求項19～26のいずれか一項に記載の宿主細胞。
宿主細胞が大腸菌である、請求項19～27のいずれか一項に記載の宿主細胞。
糖に連結された、改変された担体タンパク質を含むバイオコンジュゲートを生産する方法であって、(i)タンパク質の生産に適した条件下で、請求項19～28のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養すること、及び(ii)バイオコンジュゲートを単離することを含む方法。
請求項29に記載の方法によって得られるバイオコンジュゲートであって、改変された担体タンパク質に連結された多糖を含む、バイオコンジュゲート。
請求項29に記載の方法によって得ることができるバイオコンジュゲートであって、改変された担体タンパク質に連結された多糖を含む、バイオコンジュゲート。
請求項1～10のいずれか一項に記載の改変された担体タンパク質又は請求項11～16のいずれか一項に記載のコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲートを含む、免疫原性組成物。
改変された担体タンパク質又はコンジュゲート又はバイオコンジュゲートを薬学的に許容される賦形剤又は担体と混合する工程を含む、請求項31に記載の免疫原性組成物を作製する方法。
請求項31に記載の免疫原性組成物、及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含むワクチン。
細菌感染の治療又は予防を必要とする対象における細菌感染の治療又は予防のための方法であって、治療有効量の請求項1～10のいずれか一項に記載の改変された担体タンパク質又は請求項11～16のいずれか一項に記載のコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲートを前記対象に投与することを含む方法。
細菌感染に対してヒト宿主を免疫化する方法であって、請求項1～10のいずれか一項に記載の改変された担体タンパク質又は請求項11～16のいずれか一項に記載のコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲートの免疫防御用量を宿主に投与することを含む方法。
対象において細菌に対する免疫応答を誘導する方法であって、治療有効量又は予防有効量の請求項1～10のいずれか一項に記載の改変された担体タンパク質又は請求項11～16のいずれか一項に記載のコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲートを対象に投与することを含む方法。
細菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防で使用するための、請求項1～10のいずれか一項に記載の改変された担体タンパク質又は請求項11～16のいずれか一項に記載のコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲート。
細菌感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項1～10のいずれか一項に記載の改変された担体タンパク質又は請求項11～16のいずれか一項に記載のコンジュゲート若しくはバイオコンジュゲートの使用。
前記細菌又は細菌感染が、黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌、インフルエンザ菌、インフルエンザ菌b型、B群連鎖球菌、チフス菌、カタラーリス菌、シゲラ・フレックスネリ(S. flexneri)、緑膿菌、大腸菌、又は肺炎球菌からなる群から選択される、請求項34～36のいずれか一項に記載の方法又は請求項37に記載の使用若しくは請求項38に記載の使用のための担体タンパク質、コンジュゲート、若しくはバイオコンジュゲート。
請求項1～10のいずれか一項に記載の担体タンパク質のグリコシル化部位占有のレベルを測定する方法であって、グリコシル化された担体タンパク質をプロテアーゼで消化すること、消化されたタンパク質のLC-MSを行うこと、改変されていない担体タンパク質の濃度Uを決定すること、総担体タンパク質の濃度Tを決定すること、及び以下の等式によってグリコシル化部位占有を計算することを含む方法。
改変されていない担体タンパク質の濃度Uが、コンセンサス配列に対応するペプチド断片の濃度を決定することによって決定される、請求項40に記載の方法。
総担体タンパク質の濃度Tが、前記担体タンパク質に特有である1以上のペプチド断片の濃度を決定することによって決定される、請求項40又は請求項41に記載の方法。
プロテアーゼがトリプシンである、請求項40～42のいずれか一項に記載の方法。